TW201712340A - 腎臟病之病態生物標記 - Google Patents

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Takashi Wada
Kengo Furuichi
Norihiko Sakai
Yasunori Iwata
Akinori Hara
Yusuke Nakade
Kenji Hamase
Yurika Miyoshi
Maiko Nakane
Masashi Mita
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Univ Kanazawa
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Abstract

本發明之課題在於開發一種可實現早期或輕度之腎損傷之診斷的分析方法。 本發明係基於自糞便或腸內容物基於D體及/或L體之胺基酸量而算出腎損傷之病態指標值。藉由將該病態指標值與由腎功能衰竭患者群及健康者群之病態指標值所確定之閾值進行比較，可實現輕度之腎損傷患者群之診斷。

Description

腎臟病之病態生物標記
本發明係關於一種包括自糞便或腸內容物基於D體及L體之胺基酸量而算出腎損傷之病態指標值之步驟的分析方法；腎損傷之檢查方法；以及輸出關於腎損傷之病態資訊之試樣分析系統。
腎臟係以過濾來自血液之代謝物或多餘之水分，以尿之形式排出，藉此維持體液之恆常性作為主要作用之器官。腎臟會因免疫系統之異常或對藥之過敏、高血壓、糖尿病、出血或急遽之血壓降低、傳染病、伴隨燙傷之脫水等要因而受到損傷，腎功能降低。於腎功能因腎損傷而降低至約60%以下之情形時，稱為腎功能衰竭，根據腎功能降低之發展速度之不同，大致分為急性腎功能衰竭(AKI)及慢性腎功能衰竭(CKD)。
急性腎功能衰竭(AKI)係指至發病為止之時間為數小時至數週之腎功能衰竭。急性腎功能衰竭係腎功能因缺血、藥劑、內毒素休克等原因而急遽降低之狀態，可見作為體內代謝產物之尿素氮或肌酸酐之血中濃度上升、電解質代謝之異常及酸中毒等症狀，一般藉由血清肌酸酐值之急遽上升而診斷為急性腎功能衰竭。急性腎功能衰竭由於藉由治療而期待恢復，故而期待開發一種可判別更早期之急性腎功能衰竭之診斷標記。然而，一般使用之血清中肌酸酐濃度會根據年齡、性別、肌肉量及服用之醫藥等條件而發生變動，故而可謂並非為特異性之診斷標記(非專利文獻1)，又，報告有嗜中性球明膠酶相關脂質運 載蛋白(NGAL)、介白素-18(IL-18)、腎損傷分子(KIM-1)、肝脂肪酸結合蛋白質(FABPs)、半胱胺酸蛋白酶抑制劑C等蛋白質；及高香草酸硫酸、三甲胺-N-氧化物等代謝低分子化合物等，但期待開發出一種可更早且更準確地檢測病態之診斷標記。
慢性腎功能衰竭(CKD)係指因各種腎損傷，而有絲球體過濾量所表示之腎功能之降低，或提示腎臟之損傷之觀察結果慢性(3個月以上)持續之腎功能衰竭。慢性腎功能衰竭係相當於日本之成年人口之約13%的1,330萬人罹患之疾病，發展至末期腎功能衰竭(ESKD)之風險較高，而威脅國民之健康。目前尚無對慢性腎功能衰竭有效之治療方法，若慢性腎功能衰竭發展而腎功能降低加重，則有尿毒癥之危險，需要人工透析或腎移植，醫療經濟上成為較大負擔(非專利文獻2)。慢性腎功能衰竭由於在無自覺症狀之狀態下症狀發展，故而為了早期發現慢性腎功能衰竭及抑制發展，需要利用腎功能衰竭之早期診斷標記的診斷。但是，目前尚無作為較發生絲球體過濾量所表示之腎功能變化更早之時期準確地反映腎損傷之發展的診斷標記而可令人滿意者。
不僅是急性腎功能衰竭，即便為慢性腎功能衰竭之情形時亦未獲得早期之診斷標記，認為其原因為：即便於腎臟受到損傷之情形時，於腎功能損傷至某程度、例如30%左右之前，未受到損傷之絲球體會以通常以上之水準發揮作用，藉此仍可發揮出充分之腎功能(即，過濾來自血液之代謝物或多餘之水分之功能)。例如，作為排出至尿中之代謝物之肌酸酐或尿素氮(BUN)係腎功能衰竭標記之一，但於腎功能喪失某程度之前，不會因正常排出至尿中，而使血中之肌酸酐值或BUN值增加。近年來開發出之NGAL或KIM-1等係藉由炎症細胞而表現之蛋白質，因此作為診斷標記而備受期待，但如上所述，尚無可令人滿意之標記。
先前認為不存在於哺乳類之活體中之D-胺基酸已明確存在於各種組織中，預測承擔某些生理功能。又，顯示血清中之D-胺基酸中D-絲胺酸、D-丙胺酸、D-脯胺酸、D-絲胺酸、D-麩胺酸、D-天冬胺酸之濃度可作為腎功能衰竭之診斷標記而發揮作用(非專利文獻3、非專利文獻4、非專利文獻5、非專利文獻6)。進而，揭示有選自由D-絲胺酸、D-蘇胺酸、D-丙胺酸、D-天冬醯胺、D-別蘇胺酸、D-麩醯胺、D-脯胺酸及D-苯丙胺酸所組成之群中之1種或2種以上之胺基酸可設為腎臟病之病態指標值(專利文獻1)，於該文獻中，作為試樣中所使用之生物學材料，可列舉血液、血漿、尿等體液；及糞便、汗、鼻涕等排泄物；體毛、指甲、皮膚組織、內臟組織等身體組織，但對於實際使用糞便中之D體之胺基酸作為診斷標記之情況並無任何提示。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2013/140785號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Slocum, J. L.等人，Transl Res. 159:277(2012)
[非專利文獻2]KDIGO 2012 Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney Disease, Kidney International Supplements 1(2013)
[非專利文獻3]Fukushima, T.等人，Biol. Pharm. Bull. 18:1130(1995)
[非專利文獻4]Nagata. Y Viva Origino Vol. 18(No.2)(1990)第15次學術講演會講演主旨集
[非專利文獻5]Ishida等人，北里醫學23:51~62(1993)
[非專利文獻6]Yong Huang等人，Biol. Pharm. Bull. 21:(2)156-162(1998)
業界期待開發出一種鑑定並分析較絲球體過濾量及血清中肌酸酐濃度等現有之腎功能衰竭之診斷標記自早期發生變動之腎功能衰竭之診斷標記的技術；以及藉由該技術而準確地判定、檢查或診斷初期之腎功能衰竭之技術。
本發明者等人使用可再現初期之腎功能衰竭之早期腎損傷之實驗動物模型，而探索了腎功能衰竭之早期診斷標記。具體而言，進行腎動脈、靜脈夾閉，對小鼠誘導缺血性腎損傷。可確認於該缺血性腎損傷誘導小鼠之腎臟組織中產生炎症(圖1及2)，另一方面，製作作為慣用之腎損傷之診斷標記之一的血清肌酸酐濃度、KIM-1或NGAL不變化之輕度腎損傷動物模型。於此種輕度之腎損傷動物模型中，發現糞便中之D-胺基酸之變化(圖3及4)。確認如此發現之糞便中之D-胺基酸之變化與腎損傷相關，從而完成本發明。
進而，本發明者等人係於慢性腎功能衰竭患者群及健康者群中，對糞便中之胺基酸分開計測D體及L體，結果發現與健康者群相比，於慢性腎功能衰竭患者群中若干手性胺基酸顯著發生變動，從而完成本發明。
因此，本發明係關於一種糞便或腸內容物之分析方法，其包括：測定至少1種胺基酸之D體及/或L體之量之步驟；及基於上述至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體及L體之量而算出腎損傷之病態指標值之步驟。
本發明之另一態樣係關於一種以糞便或腸內容物作為試樣之腎損傷之檢查方法，其進而包括： 測定至少1種胺基酸之D體及/或L體之量之步驟；基於上述至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體及L體之量而算出腎損傷之病態指標值之步驟；及將腎損傷之病態指標值與腎損傷之病態進行關聯之步驟。
此種檢查方法可基於預先確定之病態指標值之閾值而確定腎損傷之病態。
又一態樣係關於一種可實施本發明之分析方法之試樣分析系統。此種試樣分析系統包含記憶部、輸入部、分析測定部、資料處理部及病態資訊輸出部，可分析糞便或腸內容物之試樣，並輸出病態資訊。
又一態樣係關於一種可安裝於本發明之試樣分析系統之程式、及儲存該程式之記憶媒體。
以糞便或腸內容物作為試樣，基於試樣中之D-胺基酸量、L體之量、或D-胺基酸量及L-胺基酸量而算出之病態指標值可藉由與血中肌酸酐等已知之腎功能衰竭標記不同之作用機構而檢測腎功能衰竭。藉此，具有可用作較血中肌酸酐等已知標記可檢測早期之腎功能衰竭之診斷標記之可能性。又，用作試樣之糞便或腸內容物可非侵入性地容易地取得。由於為如此般可檢測早期之腎功能衰竭之診斷標記，且為可容易取得之試樣，故而藉由在診斷中採用本發明之分析方法，可實現腎功能衰竭及/或腎損傷之早期發現。
圖1A係藉由對腎損傷誘導群之小鼠之腎臟進行PAM染色，而將壞死細胞染色而表示之照片。圖1B係測定圖1A之圖中壞死細胞之比率，與對照群進行比較之圖表。
圖2A係藉由對腎損傷誘導群之小鼠之腎臟進行F4/80染色，而將 炎症細胞(巨噬細胞及單核球)染色而表示之照片。圖2B係測定圖2A之圖中炎症細胞之比率，與對照群進行比較之圖表。
圖3A係表示自對照群(Sham)之小鼠、及腎損傷誘導後第2天及第10天之小鼠採集之糞便中之D胺基酸+L胺基酸之變動的圖表。圖3B係表示自對照群之小鼠、及腎損傷誘導後第2天及第10天之小鼠採集之糞便中之D胺基酸之變動的圖表。
圖3C係表示自對照群(Sham)之小鼠、及腎損傷誘導後第2天及第10天之小鼠採集之糞便中之L胺基酸之變動的圖表。圖3D係表示自對照群之小鼠、及腎損傷誘導後第2天及第10天之小鼠採集之糞便中之D胺基酸/L胺基酸之比之變動的圖表。
圖3E係表示自對照群(Sham)之小鼠、及腎損傷誘導後第2天及第10天之小鼠採集之糞便中之D胺基酸/(D胺基酸+L胺基酸)之比之變動的圖表。
圖3F係圖3A~3E所示之資料間之統計有意義差之評價結果。表中「<LOQ」表示為定量極限以下。
圖4係表示自對照群(Sham)之小鼠、及腎損傷誘導後第2天及第10天之小鼠採集之糞便中之關於絲胺酸、精胺酸及丙胺酸之(A)D胺基酸、(B)D胺基酸/L胺基酸比、及(C)D胺基酸/(D胺基酸+L胺基酸)之比之變動的圖表。又，表示血清中之D絲胺酸、D精胺酸及D丙胺酸之變動(D)。
圖5A係於腎損傷誘導小鼠中，藉由對野生群、無菌群及植菌群之小鼠之腎臟進行PAM染色，對壞死細胞進行比較而表示之照片。圖5B係測定並比較圖5A之圖中壞死細胞之比率之圖表。
圖6A係於腎損傷誘導小鼠中，對野生群、無菌群及植菌群之小鼠之腎臟進行F4/80染色，藉此將炎症細胞(巨噬細胞及單核球)進行比較而表示之照片。圖6B係測定並比較圖6A之圖中炎症細胞之比率之 圖表。
圖7A係將腎損傷誘導群之小鼠之第2天及第10天之腸內細菌群落之DNA進行片段化後進行電泳的圖。圖7B係將腎損傷誘導群之小鼠之術後第2天及第10天之腸內細菌之種類及數量進行比較的圖。
圖8係本發明之試樣分析系統之構成圖。
圖9A-B係表示用以確定病態指標值之動作之例之流程圖。
圖9C-D係表示用以確定病態指標值及/或病態資訊之動作之例的流程圖。
圖10A係表示自健康者及慢性腎損傷患者採集之糞便中之D胺基酸+L胺基酸(總胺基酸)之量的圖表。圖10B係表示自健康者及慢性腎損傷患者採集之糞便中之L胺基酸之量的圖表。
圖10C係表示自健康者及慢性腎損傷患者採集之糞便中之D胺基酸之量的圖表。圖10D係表示自健康者及慢性腎損傷患者採集之糞便中之D胺基酸/L胺基酸之比的圖表。
圖11係調查慢性腎損傷患者之推定絲球體過濾量(eGFR)與糞便中之各胺基酸之量之相關關係的表。於相關係數超過0.7之情形時可稱為較高之相關，於為0.4~0.7之情形時可稱為存在相關，於為0.2~0.4之情形時可稱為存在較低之相關。
圖12表示：表示慢性腎損傷患者及健康者之L-Lys量的圖表(A)；表示慢性腎損傷患者及健康者之ROC曲線的圖表(B)；慢性腎損傷患者之推定絲球體過濾量(eGFR)與L-Lys量之散佈圖(C)；及慢性腎損傷患者之血清肌酸酐與L-Lys量之散佈圖(D)。
圖13表示：表示慢性腎損傷患者及健康者之D-Lys量的圖表(A)；表示慢性腎損傷患者及健康者之ROC曲線的圖表(B)；慢性腎損傷患者之推定絲球體過濾量(eGFR)與D-Lys量之散佈圖(C)；及慢性腎損傷患者之血清肌酸酐與D-Lys量之散佈圖(D)。
圖14表示：表示慢性腎損傷患者及健康者之D-Lys/L-Lys比的圖表(A)；表示慢性腎損傷患者及健康者中之ROC曲線的圖表(B)；慢性腎損傷患者之推定絲球體過濾量(eGFR)與D-Lys/L-Lys比之散佈圖(C)；及慢性腎損傷患者之血清肌酸酐與D-Lys/L-Lys比之散佈圖(D)。
本發明之糞便或腸內容物之分析方法包括以下之步驟：測定至少1種胺基酸之D體及/或L體之量之步驟；及基於上述至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體及L體之量而算出腎損傷之病態指標值之步驟。
該分析方法可提供醫生用以進行診斷之資料，亦可稱為診斷之預備方法。該分析方法可進而包括將腎損傷之病態指標值與腎損傷之病態進行關聯之步驟。此種分析方法可由分析公司或分析技術人員進行，提供與腎損傷之病態關聯之結果。
於本發明中，分析之試樣為糞便或腸內容物。因此，可為排出之糞便，亦可為滯留於腸內之宿便。腸內容物可藉由腸導管而採集，除糞便以外，亦可為直接採集腸內細菌群落者。就採集之簡便性或檢查之容易性之觀點而言，較佳為使用藉由驗便所採集之糞便作為試樣。所採集之試樣可於溶解或混合於水、甲醇、乙醇、乙腈、硼酸鈉水溶液、三氟乙酸等溶劑中之後，立即供於分析，亦可於常溫下或冷藏下儲藏後供於分析。試樣可於溶解於溶劑中之後，進行1次或複數次過濾及/或沈澱，藉此除去不溶物後，供於分析。藉由計測供於試樣之糞便或腸內容物之質量，可計測每單位試樣質量之胺基酸量。又，於無法計測供於試樣之糞便或腸內容物之質量之情形時，可於將試樣溶解於溶劑中之後，以吸光度等作為基準，以使試樣之量固定之方式進而加入溶劑進行稀釋。於使試樣之量固定而進行計測之情形時，本發明之胺基酸之量可以質量或莫耳表示，亦可以濃度表示。
於本發明中，用作腎功能衰竭標記之胺基酸係具有立體異構物之胺基酸。更佳為α-胺基酸，進而更佳為蛋白質構成胺基酸。作為此種胺基酸，可列舉：丙胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、組胺酸、異白胺酸、離胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、天冬醯胺、脯胺酸、麩醯胺、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、色胺酸、酪胺酸。此處，關於具有兩個不對稱碳之異白胺酸、蘇胺酸，由於存在別體，故作為L-異白胺酸之立體異構物，可列舉：D-異白胺酸、D-別異白胺酸及L-別異白胺酸，作為L-蘇胺酸之立體異構物，可列舉：D-蘇胺酸、D-別蘇胺酸及L-別蘇胺酸。於本說明書中，關於異白胺酸及蘇胺酸，「D體」除D體之胺基酸以外，亦使用選自D異體之胺基酸及L異體之胺基酸中之1種以上。可針對該等胺基酸中之至少1種胺基酸，測定D體胺基酸之量、L體胺基酸之量、或D體及L體胺基酸之量，基於測定值算出腎損傷之病態指標值。胺基酸可為1個，亦可為複數個、例如2~19個胺基酸之組合。就獲得感度較高之病態指標值之觀點而言，胺基酸較佳為使用選自由絲胺酸、精胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、丙胺酸及脯胺酸所組成之群中之至少1種胺基酸，較佳為使用選自由絲胺酸、精胺酸及丙胺酸所組成之群中之至少1種胺基酸。上述胺基酸係使用早期腎損傷之實驗動物模型所選擇之胺基酸，對於人類亦可成為早期之腎損傷之標記。於又一態樣中，就獲得人類之腎損傷、尤其是慢性腎損傷中感度較高之病態指標值之觀點而言，較佳為使用選自由組胺酸、天冬醯胺、精胺酸、天冬胺酸、別蘇胺酸、丙胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、別異白胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、離胺酸及酪胺酸所組成之群中之至少1種胺基酸。就獲得人類之腎損傷、尤其是慢性腎損傷中感度較高之病態指標值之觀點而言，更佳為組胺酸、天冬醯胺、精胺酸、天冬胺酸、別蘇胺酸、丙胺酸、脯胺酸、纈胺酸、別異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸及離胺酸，最 佳為使用組胺酸、別蘇胺酸及離胺酸。就獲得因急性腎損傷或缺血所致之腎損傷之病態指標值之觀點而言，使用絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、丙胺酸、精胺酸、離胺酸及脯胺酸。
於本發明之一態樣中，就與推定絲球體過濾量(eGFR)之相關性之觀點而言，可使用選自由D+L-組胺酸、D+L-別蘇胺酸、D+L-天冬醯胺、D+L-精胺酸、D+L-別異白胺酸、D+L-苯丙胺酸、D+L-天冬胺酸、D+L-甲硫胺酸、D+L-纈胺酸、D+L-異白胺酸、D+L-白胺酸、D+L-離胺酸、D+L-酪胺酸、L-組胺酸、L-天冬醯胺、L-精胺酸、L-苯丙胺酸、L-離胺酸、L-天冬胺酸、L-丙胺酸、L-甲硫胺酸、L-纈胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-酪胺酸、D-組胺酸、D-別蘇胺酸、D-離胺酸、D-別異白胺酸、D-白胺酸、D-苯丙胺酸、D/L-組胺酸、D/L-離胺酸、D/L-天冬胺酸、D/L-丙胺酸、D/L-脯胺酸、D/L-纈胺酸及D/L-苯丙胺酸所組成之群中之至少1種作為病態指標值(|r|>0.2)。就與eGFR之相關性更高(|r|>0.4)之觀點而言，更佳為使用選自由D+L-組胺酸、D+L-別蘇胺酸、L-組胺酸、D-組胺酸、D-別蘇胺酸、D-離胺酸、D/L-組胺酸及D/L-離胺酸、D+L-天冬醯胺、D+L-精胺酸、D+L-別異白胺酸及D+L-苯丙胺酸、L-天冬醯胺、L-精胺酸、L-苯丙胺酸、L-離胺酸、D-別異白胺酸、D-白胺酸、D-苯丙胺酸、D/L-天冬胺酸、D/L-丙胺酸、D/L-脯胺酸、D/L-纈胺酸及D/L-苯丙胺酸所組成之群中之至少1種作為病態指標值。就與eGFR之相關性更高(|r|>0.7)之觀點而言，進而更佳為使用選自由D+L-組胺酸、D+L-別蘇胺酸、L-組胺酸、D-組胺酸、D-別蘇胺酸、D-離胺酸、D/L-組胺酸及D/L-離胺酸所組成之群中之至少1種作為病態指標值。再者，於本發明中，D+L-胺基酸意指胺基酸之D體與L體之合計，D/L-胺基酸意指D體與L體之比。
本發明之試樣中之D-胺基酸量之測定可使用業者周知之任一方 法而實施。例如，可於胺基酸之D-體及L-體之同時測定中使用如下方法：預先利用鄰苯二甲醛(OPA)、N-第三丁氧基羰基-L-半胱胺酸(Boc-L-Cys)、及其他修飾試劑，立體異構特異性地將D-及L-胺基酸進行衍生物化，其後使用ODS-80TsQA之類的分析管柱將100mM之乙酸鹽緩衝液(pH值6.0)與乙腈之混合溶液進行梯度溶離而分離。又，可於構成蛋白質之胺基酸之微量測定中使用如下方法：預先利用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑(NBD-F)之類的螢光試劑將D-及L-胺基酸進行衍生物化，其後使用ODS-80TsQA、Mightysil RP-18GP等之類的分析管柱，立體異構非特異性地分離各胺基酸後，使用Pirkle型手性固定相管柱(例如Sumichiral OA-2500S或R)進行光學離析(浜瀨健司及財津潔，分析化學，53卷，677-690(2004))。本說明書中之光學離析管柱系統係指至少使用光學離析管柱之分離分析系統，有包含藉由光學離析管柱以外之分析管柱之分離分析之情形。更具體而言，藉由使用如下之光學異構物之分析方法，可測定試樣中之D-/L-胺基酸濃度，該光學異構物之分析方法之特徵在於包括：使包含具有光學異構物之成分之試樣與作為流動相之第一液體一併通過作為固定相之第一管柱填充劑，而分離上述試樣之上述成分之步驟；於多環單元中個別地保持上述試樣之上述成分之各者之步驟；通過流路將於上述多環單元中個別地保持之上述試樣之上述成分之各者與作為流動相之第二液體一併供給至作為固定相之具有光學活性中心的第二管柱填充劑，將上述試樣之成分之各者中所包含之上述光學異構物進行離析的步驟；及檢測上述試樣之成分之各者中所包含之上述光學異構物的步驟(日本專利第4291628號)。作為代替，可藉由免疫學方法而對D-胺基酸進行定量，該免疫學方法係使用與識別胺基酸之光學異構物之單株抗體、例如D-白胺酸、D-天冬胺酸等特異性地結合之單株抗體(日本專利特願2008-27650說明書)。
於本發明中，所謂腎損傷係指腎臟所發生之所有損傷，不僅包括腎功能衰竭，亦包括未達到腎功能衰竭之變化。腎功能衰竭係腎功能低於正常時之狀態，包括通常意義下使用之所有腎臟損傷。雖然並無限定，但一般而言，所謂腎功能衰竭係指腎功能低於正常時之30%之狀態，大致分為急性腎功能衰竭與慢性腎功能衰竭。作為腎功能降低之原因，可列舉：免疫系統之異常或對藥之過敏、高血壓、糖尿病、或者出血或急遽之血壓降低、傳染病、伴隨燙傷之脫水等複數個因素。急性腎功能衰竭(AKI)提倡RIFLE分類、AKIN分類、KDIGO分類之病期之分類，將急性腎功能衰竭分為風險(Risk)(階段1)、損傷(Injury)(階段2)、衰竭(Failure)(階段3)，進而根據持續時間分為喪失(Loss)及終末期腎病(End stage kidney disease)。該等分類均以血清肌酸酐之量及尿量作為指標，例如於風險(Risk)(階段1)中，以血清肌酸酐自基準線上升至1.5~2.0倍或未達0.5ml/kg/時之尿量為6小時以上作為判斷基準；於損傷(Injury)(階段2)中，以血清肌酸酐自基準線上升至2.0~3.0倍或未達0.5ml/kg/時之尿量為12小時以上作為判斷基準；於衰竭(Failure)(階段3)中，以血清肌酸酐自基準線上升至3.0倍以上或未達0.3ml/kg/時之尿量為24小時以上作為判斷基準。另一方面，該等分類藉由併用其他指標、例如GFR(glomerular filtration rate，絲球體過濾率)之變化量而可更準確地實現急性腎功能衰竭之分類。關於慢性腎功能衰竭(CKD)，於日本腎臟學會之準則(2009)中示出病期階段1(具有腎損傷但腎功能正常，eGFR≧90)~階段5(腎功能衰竭，eGFR<15)之診斷基準。此處，成為指標之推算絲球體過濾量(eGFR)係根據血清肌酸酐值及年齡、性別而算出者，表示腎臟將代謝物排出至尿中之能力。於本發明之分析、檢查方法中，可較迄今為止之腎功能標記以更高感度檢測腎功能之降低。因此，能夠分類出如利用從前之標記未分為腎功能衰竭般更早期之腎損傷之風險群，例如對 於具有如上述原因之AKI、CKD之危險因素，但於血清肌酸酐或GFR中未見明確之變動之風險群中，亦能夠檢測出腎功能之降低。尤其關於使用早期腎損傷之實驗動物模型所選擇之胺基酸，對於人類可成為更早期之腎損傷之標記。
於本發明中，腎損傷之病態指標值之算出係基於胺基酸之D體之量及/或L體之量而進行。於又一態樣中，可基於胺基酸之D體及L體之量而算出病態指標值。
於本說明書中，病態指標值可為各個生物標記分子之量，或指可基於複數個生物標記之量而計算之數值。本說明書中所使用之病態指標值可為某一胺基酸之D體之量，亦可為L體之量，亦可為某一胺基酸與其立體異構物之量之比、例如某一胺基酸之D體之量相對於L體之量的比、某一胺基酸之L體之量相對於D體之量的比、及D體之量相對於D體與L體之量之和的比。於使用某一胺基酸與立體異構物之量比作為病態指標值之情形時，有無需根據試樣之量或體積進行修正之優點。於病態指標值之算出中，可於用作腎損傷之診斷標記之範圍內，將任意之常數或年齡、體重、性別、BMI(Body Mass Index，身體質量指數)、eGFR等可能會影響手性胺基酸量之任意之變數進行加法運算、減法運算、乘法運算及/或除法運算。
於本發明之分析方法及檢查方法中，可基於預先基於對健康者群及腎損傷之患者群所測得之病態指標值確定之病態指標基準值，將被檢體之病態指標值與腎損傷之病態進行關聯。該病態指標基準值亦可為閾值。業者可根據健康者群或腎功能衰竭患者群之病態指標值而適當設定閾值。作為閾值，例如可使用健康者群或腎功能衰竭患者群之平均值、中間值、X百分比值，但並不限定於該等。此處，X可選擇任意之數值，可適當使用3、5、10、15、20、30、40、60、70、80、85、90、95、97。閾值可為1個，亦可根據腎功能衰竭之種類(急 性、慢性)或原因(例如藥劑性腎病、糖尿病性腎病、IgA(immunoglobulin A，免疫球蛋白A)腎病、膜性腎病、腎硬化症等)、狀態(早期、中期、後期)、以及所使用之胺基酸或其組合而設定複數個，亦可根據嚴重度將病態進行分類。藉由將預先設定之閾值與被試驗者之病態指標值進行比較，可判定、確定或診斷被試驗者之腎功能衰竭之病態。於又一態樣中，亦可於健康者群與各階段之腎損傷之患者群之間進行ROC(receiver operating characteristic，受試者工作特徵)分析，藉此確定閾值(臨界值)。
於本發明之另一態樣中，本發明係關於一種以糞便或腸內容物作為試樣之腎損傷之檢查方法。該檢查方法進而包括以下之步驟：測定蛋白質構成胺基酸中之至少1種胺基酸之D體及/或L體之量的步驟；基於上述至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體及L體之量而算出腎損傷之病態指標值之步驟；及將腎損傷之病態指標值與腎損傷之病態進行關聯之步驟。本發明之檢查方法可由分析公司或分析技術人員進行，而提供與腎損傷之病態關聯之結果。檢查方法中所使用之試樣、關聯之腎損傷之病態、所進行之各步驟可與分析方法中所定義者相同。
圖8係本發明之試樣分析系統之構成圖。圖8所示之本發明之試樣分析系統10係以可實施本發明之分析方法及檢查方法之方式構成。此種試樣分析系統10包含記憶部11、輸入部12、分析測定部13、資料處理部14及輸出部15，可分析糞便或腸內容物之試樣，輸出病態資訊。更具體而言，於本發明之試樣分析系統10中，記憶部11可記憶自輸入部12輸入之用以判別腎損傷之病態指標值之閾值，分析測定部13可將上述被檢體之糞便或腸內容物中之蛋白質構 成胺基酸中之至少1種胺基酸之胺基酸立體異構物進行分離並定量，資料處理部14可基於上述至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體及L體之量而算出腎損傷之病態指標值，資料處理部14可藉由與記憶於記憶部11中之閾值進行比較，而判別腎損傷之病態資訊，輸出部15可輸出關於被檢體之腎損傷之病態資訊。
記憶部11具有RAM(Random Access Memory，隨機存取記憶體)、ROM(Read Only Memory，唯讀記憶體)、快閃記憶體等記憶體裝置；硬碟驅動器等固定碟片裝置；或軟碟、光碟等可攜性之記憶裝置等。記憶部除記憶藉由分析測定部所測得之資料、自輸入部輸入之資料及指示、藉由資料處理部進行之運算處理結果等以外，亦記憶資訊處理裝置之各種處理中所使用之電腦程式、資料庫等。電腦程式例如可經由CD-ROM(Compact Disc-Read Only Memory，唯讀光碟)、DVD-ROM(Digital Versatile Disc-Read Only Memory，唯讀數位多功能光碟)等電腦可讀取之記錄媒體或網際網路而安裝。電腦程式係使用公知之設置程式等而安裝於記憶部。
輸入部12為介面等，亦包含鍵盤、滑鼠等操作部。藉此，輸入部可輸入藉由分析測定部13所測得之資料、藉由資料處理部14進行之運算處理之指示等。又，例如於分析測定部13處於外部之情形時，輸入部12可包含與操作部分開，可經由網路或記憶媒體而輸入所測得之資料等之介面部。
分析測定部13進行懸浮於溶劑中之糞便或腸內容物之試樣中之胺基酸之D體及L體之量的測定步驟。因此，分析測定部13具有可分離及測定胺基酸之D體及L體之構成。胺基酸可逐個分析，可對一部分或所有種類之胺基酸一併進行分析。分析測定部13並非意欲限定於以下者，例如可為具備試樣導入部、光學離析管柱、檢測部之高效液 相層析系統。分析測定部13可與試樣分析系統分開構成，亦可使用網路或記憶媒體經由輸入部12而輸入所測得之資料等。
資料處理部14係以如下方式構成：根據所測得之各胺基酸之D體、或D體及L體之量而算出腎損傷之病態指標值，然後，與記憶於記憶部11中之閾值進行比較，藉此判別腎損傷。資料處理部14按照記憶於記憶部中之程式，對藉由分析測定部13測得且記憶於記憶部11中之資料，執行各種運算處理。運算處理係藉由資料處理部中所包含之CPU(Central Processing Unit，中央處理單元)而進行。該CPU包含控制分析測定部13、輸入部12、記憶部11及輸出部15之功能模組，而可進行各種控制。該等各部可包含分別獨立之積體電路、微處理機、韌體等。
輸出部15係以輸出作為藉由資料處理部進行運算處理所獲得之結果的病態指標值及/或病態資訊之方式構成。輸出部15可為直接顯示運算處理之結果之液晶顯示器等顯示裝置、印表機等輸出構件，亦可為用以輸出至外部記憶裝置或經由網路進行輸出之介面部。
圖9A-B係表示用以確定藉由本發明之程式所獲得之病態指標值之動作之例的流程圖，圖9C-D係表示用以確定藉由本發明之程式所獲得之病態指標值及/或病態資訊之動作之例的流程圖。
具體而言，本發明之程式係使包含輸入部、輸出部、資料處理部、記憶部之資訊處理裝置確定病態指標值及/或病態資訊之程式。本發明之程式包含以下之用以使上述資訊處理裝置執行如下操作之指令：使記憶部記憶自輸入部輸入之至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體及L體之量之值，基於記憶於記憶部中之值使資料處理部算出病態指標值，使記憶部記憶算出之病態指標值，然後 使輸出部輸出所記憶之病態指標值。
本發明之程式可儲存於記憶媒體中，亦可經由網際網路或LAN(Local Area Network，區域網路)等電信線路而提供。
資訊處理裝置可包含用以使資訊處理裝置執行如下操作之指令：於具備分析測定部之情形時，分析測定部自糞便試樣測定該值並使記憶部進行記憶，以代替自輸入部輸入至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體及L體之量之值。
於確定病態資訊時，可進而包含用以使資訊處理裝置執行如下操作之指令：使資料處理部對所記憶之病態指標值與預先記憶於記憶部中之閾值進行比較，藉此判別腎損傷之病態，使記憶部記憶所判別之病態資訊，然後使輸出部輸出所記憶之病態資訊。
於本發明中，被試驗者並不限定於人類，亦可包括實驗動物、例如小鼠、大鼠、兔、狗、猴等。因此，被試驗者可表述為被檢體。
本發明之分析方法可用於收集用於慢性及/或急性腎功能衰竭之診斷方法之預備資料。醫生可使用此種預備資料進行慢性及/或急性腎功能衰竭診斷，此種分析方法可由並非為醫生之醫療輔助人員等進行，亦可由分析機關等進行。因此，本發明之分析方法亦可稱為診斷之預備方法。
可參照本發明之分析方法及檢查方法之結果，進而確定治療方針。並不限定於以下者，例如於判定為慢性腎功能衰竭之情形時，必須進一步進行生活習慣之改善、進餐指導、血壓管理、血糖值管理、脂質管理等治療。作為生活習慣之改善，例如推薦禁菸或用以降低BMI值之運動。作為進餐指導，推薦降低鹽分攝取以改善高血壓。作為血壓管理，推薦投予ACE(angiotensin converting enzyme，血管緊張 素轉化酶)抑制劑或ARB(angiotensin receptor blocker，血管緊張素受體阻斷劑)以改善高血壓。作為血糖值管理，推薦投予胰島素以降低HbA1c。作為脂質管理，推薦投予高脂血症藥以降低LDL(low density lipoprotein，低密度脂蛋白)膽固醇。該等治療方針係基於手性胺基酸量，接受醫生之問診後確定。因此，本發明之另一態樣係關於一種腎損傷之治療方法，其包括實施本發明之分析方法及檢查方法，進而進行腎損傷之治療。
關於本說明書中提及之所有文獻，其全部內容係藉由引用而併入至本說明書中。
以下說明之本發明之實施例僅為了例示，並非限定本發明之技術範圍。本發明之技術範圍僅受申請專利範圍之記載所限定。可以不脫離本發明之主旨為條件，進行本發明之變更、例如本發明之構成要件之追加、刪除及置換。
[實施例]
材料及方法
研究倫理
所有實驗均按照設施之準則而實施，獲得該設施之動物實驗委員會之批准後進行。
材料
胺基酸之對映異構物及HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析)級之乙腈係自Nacalai Tesque(京都)購買。HPLC級之甲醇、三氟乙酸、硼酸等係自和光純藥(大阪)購買。水係使用Mill-Q Gradient A10系統進行純化。
藉由腎動脈、靜脈夾閉之輕度急性腎損傷動物模型之製作
對6週齡之C57BL/6JJic雄小鼠(Clea Japan)，於麻醉下切開皮膚及腹膜。進行40分鐘腎動脈及靜脈夾閉，於此期間於37℃之熱板上進行 保溫。解除夾閉，縫合腹膜及皮膚。藉由腎動脈及靜脈夾閉，而誘導缺血性腎損傷。於實驗中使用供於誘導缺血性腎損傷之腎損傷誘導群、及僅進行假手術之對照群。
關於缺血性腎損傷之組織切片之評價
於缺血性腎損傷之誘導後第2天，處死小鼠，回收腎臟組織。對所回收之腎臟組織進行固定處理。自經固定之腎臟組織取得切片，進行PAS(periodic acid-Schiff，過碘酸-希夫氏)染色。進而，對另一切片進行F4/80染色。將PAS染色結果示於圖1(A)。基於圖1A之染色結果評價壞死細胞之比率。將其結果示於圖1(B)之圖表。將F4/80染色結果示於圖2(A)。基於圖2(A)之染色結果評價壞死細胞之比率。將其結果示於圖2(B)之圖表。
缺血性腎損傷之標記之評價
於缺血性腎損傷之誘導後第2天，自小鼠進行採血及採尿。針對所採集之血液試樣，於Becton Dickinson(BD)Microtainer中，藉由1500×g、10分鐘離心而分離血清。血清肌酸酐係使用FujiDRI-CHEM4000系統(Fujifilm，東京)進行測定。其次，使用R&D Systems公司製造之小鼠ELISA套組對尿中之KIM-1及NGAL進行定量。
根據該等結果顯示，本實施例中所進行之腎動脈、靜脈夾閉誘導出先前之腎功能衰竭標記無法感知之程度之腎損傷。
輕度急性腎損傷動物模型中之糞便試樣之胺基酸分析
將自缺血性腎損傷之誘導後第2天及第10天之對照群(Sham)及腎損傷誘導群之小鼠之大腸採集的糞便溶解於甲醇中，並供於利用財津等人所開發出之D、L-胺基酸同時高感度分析系統(日本專利第4291628號)之胺基酸立體異構物分析系統。各胺基酸之分析條件之詳細內容係於MiyoshiY.，等人，J.Chromatogr.B,879：3184(2011)及Sasabe,J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,109：627(2012)中有說 明。簡言之，糞便中之胺基酸係利用NBD-F(4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑，東京化成工業股份有限公司)進行衍生物化，並供於HPLC系統(參照NANOSPACE SI-2，資生堂股份有限公司之補充資訊)。簡言之，逆相分離用分析管柱係使用本公司製造之單一積體電路ODS(octadecylsilyl，十八烷基矽烷基)管柱(內徑0.53mm×500mm)。螢光檢測係於激發波長470nm、檢測波長530nm下執行。於逆相分離後，轉移至光學離析管柱。於對映異構物分離中，採用使用(S)-萘基甘胺酸作為手性選擇劑之Sumichiral OA-2500S管柱(1.5mm×250mm，自行填充，材料為住化分析中心股份有限公司製造)。將關於各胺基酸之總胺基酸量、D-胺基酸量、L-胺基酸量、D/L胺基酸比、D/(D+L)胺基酸比分別示於圖3A~E。
統計處理
本說明書及圖式所記載之所有數值係以平均±標本平均之標準誤差(SEM)表示。於實驗之統計學分析中，利用學生t兩側檢驗、單向配置分散分析(one way ANOVA)、Tukey之多重比較檢驗(Tukey's multiple comparison test)等統計學方法。又，於該等檢驗中之P值未達0.05時，評價為有顯著性。所有分析均使用Prism5(GraphPad Software，加利福尼亞州，拉荷雅)。
結果
D-胺基酸量之變化
將關於糞便中之D-胺基酸量之變化之分析結果示於圖3B。與對照群(Sham)相比，於腎損傷誘導群中可見D-胺基酸含量之顯著變化者為絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、丙胺酸及脯胺酸。其中，關於絲胺酸及脯胺酸，與對照群(Sham)相比，於術後第2天及第10天之兩者較高，第10天高於第2天。關於天冬胺酸及丙胺酸，與對照群(Sham)相比，雖然於術後第2天降低，但於第10天高於對照群。關於麩胺酸， 雖然於第2天未見變化，但於第10天有所增加。變化之模式雖然不固定，但絲胺酸、天冬胺酸、丙胺酸、脯胺酸於腎損傷極期之第2天出現差異，可作為輕度之腎損傷之檢測標記而發揮作用。若更詳細地進行分析，則關於絲胺酸及脯胺酸，於第2天D體增加，因此於糞便或腸內容物中該等D-胺基酸高於閾值之情形時，可判定為輕度之腎損傷。又，關於天冬胺酸及丙胺酸，於腎損傷極期之第2天減少，因此於糞便或腸內容物中該等D-胺基酸低於閾值之情形時，可判定為輕度之腎損傷。然而，有無有意義差可能會因增加參數而發生變化，於該情形時，於本發明中可用於輕度之腎損傷之檢測，故而並不一定意欲限定於以上所列舉之胺基酸。
D-胺基酸/L-胺基酸比之變化
將關於糞便中之D-胺基酸/L-胺基酸比之變化之分析結果示於圖3D。與對照群(Sham)相比，於腎損傷誘導群中可見D-胺基酸/L-胺基酸比之顯著變化者為絲胺酸、精胺酸及天冬胺酸。其中，關於絲胺酸及精胺酸，與對照群相比，於術後第2天及第10天之兩者較高，第10天高於第2天。另一方面，關於天冬胺酸，與對照群(Sham)相比，於術後第2天及第10天之兩者較低，第2天與第10天幾乎無差異。若更詳細地進行分析，則關於絲胺酸及精胺酸，於第2天D體/L體比增加，因此於糞便或腸內容物中該等胺基酸之D體/L體比高於閾值之情形時，可判定為輕度之腎損傷。又，關於天冬胺酸，於腎損傷極期之第2天減少，因此於糞便或腸內容物中該等D-胺基酸低於閾值之情形時，可判定為輕度之腎損傷。然而，有無有意義差可能會因增加參數而發生變化，於該情形時，於本發明中可用於輕度之腎損傷之檢測，故而並不一定意欲限定於以上所列舉之胺基酸。尤其對於D體/L體比，雖然未出現有意義差，但關於組胺酸、麩醯胺、麩胺酸、纈胺酸、白胺酸，於腎損傷極期之第2天發生與對照不同之舉動，因此可用於輕度 腎損傷之診斷。
D-胺基酸/(D-胺基酸+L-胺基酸)比之變化
將關於糞便中之D-胺基酸/(D-胺基酸+L-胺基酸)比之變化之分析結果示於圖3E。又，對圖3A~3E所示之資料間之統計有意義差進行評價。將其結果示於圖3F之表。
針對認為作為標記尤其有用之絲胺酸、精胺酸及丙胺酸，將關於糞便中之D-胺基酸量、D/L胺基酸比及D/(D+L)胺基酸比之變化之分析結果示於圖4(A)~(C)。於圖4(D)中，作為參考，針對該等胺基酸表示血中之D體之變動。
腸內細菌與炎症之關係
於上述輕度急性腎損傷動物模型中，將供於缺血再灌注之小鼠分為於通常之條件下飼養之野生群、於無菌下飼養之無菌群、及於無菌下飼養後進行植菌之植菌群。將於通常之條件下進行飼養，進行假手術之小鼠設為對照群。於缺血性腎損傷之誘導後第2天，處死小鼠，回收腎臟組織。對所回收之腎臟組織進行固定處理。自經固定之腎臟組織取得切片，進行PAS染色。進而，對另一切片進行F4/80染色。將PAS染色結果示於圖5(A)。基於圖5A之染色結果評價壞死細胞之比率。將其結果示於圖5(B)。將F4/80染色結果示於圖6(A)之圖表。基於圖6(A)之染色結果評價壞死細胞之比率。將其結果示於圖6(B)之圖表。
因輕度腎損傷所引起之腸內細菌之變化
對於對照群(Sham)及腎損傷誘導群，於術後第2天及第10天取得腸內細菌群落，進行RAPD-PCR(Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction，隨機擴增多態DNA-聚合酶鏈反應)。將對PCR後之帶進行電泳之結果示於圖7A。又，藉由對術後第2天及第10天取得之腸內細菌群落進行培養，確定所包含之細菌之種類及數量 (圖7B)。
結果
根據圖5及6之結果，關於無菌群，容易對輕度腎損傷誘導炎症，另一方面，藉由於腸內進行植菌，可降低炎症性。因此，顯示出腸內細菌與腎損傷中之炎症具有關係性。
圖7顯示，關於進行缺血再灌注之野生群、及進行假手術之對照群，RAPD-PCR之帶圖案發生變化(圖7A)，所包含之細菌數及/或種類產生變化。又，根據圖7B之結果顯示，於術後第2天，關於一部分之細菌，數量顯著發生變化，於第10天，雖然不存在有意義差，但可見該細菌之數量之不同。
顯示藉此即便為輕度之腎損傷，亦會使腸內細菌之種類或數量發生變化。並非意欲利用理論加以限制，但認為糞便中之D胺基酸係由腸內細菌所產生，因此認為腎損傷會使腸內細菌之數量或種類發生變化，其結果為D-胺基酸之量發生變化。認為藉此調查糞便中之D-胺基酸之變化，可敏銳地感知腎損傷。
實施例2
材料及方法
研究倫理
本發明者等人於金澤大學附屬醫院，取得8名慢性腎功能衰竭患者及3名健康者之糞便試樣及血液試樣。針對該等被試驗者，取得知情同意，按照由金澤大學醫學倫理審查委員會批准之試驗而進行實驗。
材料
胺基酸之對映異構物及HPLC級之乙腈係自Nacalai Tesque(京都)購買。HPLC級之甲醇、三氟乙酸、硼酸等係自和光純藥(大阪)購買。水係使用Mill-Q Gradient A10系統進行純化。
將自8名慢性腎功能衰竭患者及3名健康者採集之糞便溶解於甲醇中，供於利用財津等人所開發出之D、L-胺基酸同時高感度分析系統(日本專利第4291628號)之胺基酸立體異構物分析系統。各胺基酸之分析條件之詳細內容於MiyoshiY.，等人，J.Chromatogr.B,879：3184(2011)及Sasabe,J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,109：627(2012)中有說明。簡言之，糞便中之胺基酸係藉由NBD-F(4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并二唑，東京化成工業股份有限公司)進行衍生物化，並供於HPLC系統(參照NANOSPACE SI-2，資生堂股份有限公司之補充資訊)。簡言之，逆相分離用分析管柱係使用本公司製造之單一積體電路ODS管柱(內徑0.53mm×500mm)。螢光檢測係於激發波長470nm、檢測波長530nm下執行。於逆相分離後，轉移至光學離析管柱。對映異構物分離係採用使用(S)-萘基甘胺酸作為手性選擇劑之Sumichiral OA-2500S管柱(1.5mm×250mm，自行填充，材料為住化分析中心股份有限公司製造)。將關於各胺基酸之總胺基酸量、L-胺基酸量、D-胺基酸量及D/L胺基酸比分別示於圖10A~D。
藉由酵素方法計測自8名慢性腎功能衰竭患者及3名健康者採集之血液試樣中之血清肌酸酐。基於所測得之血清肌酸酐值及年齡確定推定絲球體過濾量(eGFR)。eGFR之確定式如下：[數1]eGFR=194×血清肌酸酐(SCr)-1.094×年齡-0.287
{式中，年齡之單位為年，SCr之單位為mg/dL，而且絲球體過濾量(GFR)之單位為mL/min/1.73m2體表面積}。
針對女性患者，數式之計算值乘以修正係數0.739。
測定被試驗者之eGFR值與20種各胺基酸之D-胺基酸與L-胺基酸之合計量、L-胺基酸量、D-胺基酸量及D胺基酸/L胺基酸比之間之相關係數。將其結果示於圖11。
關於D-胺基酸及L-胺基酸之合計量，對於組胺酸、別蘇胺酸可見較高之相關(|r|>0.7)，對於天冬醯胺、精胺酸、別異白胺酸及苯丙胺酸可見相關(|r|>0.4)，而且，對於天冬胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸及酪胺酸可見較低之相關(|r|>0.2)。
關於L-胺基酸之量，對於組胺酸可見較高之相關(|r|>0.7)，對於天冬醯胺、精胺酸、苯丙胺酸及離胺酸可見相關(|r|>0.4)，而且，對於天冬胺酸、丙胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸及酪胺酸可見較低之相關(|r|>0.2)。
關於D-胺基酸之量，對於組胺酸、別蘇胺酸及離胺酸可見較高之相關(|r|>0.7)，對於別異白胺酸、白胺酸及苯丙胺酸可見相關(|r|>0.4)。
關於D胺基酸/L胺基酸比，對於組胺酸及離胺酸可見較高之相關(|r|>0.7)，對於天冬胺酸、丙胺酸、脯胺酸、纈胺酸及苯丙胺酸可見相關(|r|>0.4)。
關於可見與eGFR正相關或負相關之胺基酸，可用作腎功能衰竭之診斷標記。認為相關越高，則越可用於腎功能衰竭之診斷。
關於L-離胺酸量(L-Lys)、D-離胺酸量(D-Lys)及D-離胺酸/L-離胺酸(D/L-Lys)比，分別將健康者及慢性腎功能衰竭患者分開進行繪圖(圖12A~圖14A)。又，基於健康者及慢性腎功能衰竭患者之L-離胺酸量、D-離胺酸量及D-離胺酸/L-離胺酸比，進行ROC分析，而獲得ROC曲線(圖12B~圖14B)。對慢性腎功能衰竭患者之合計量、L-離胺酸量、D-離胺酸量及D-離胺酸/L-離胺酸比以及推定絲球體過濾量(eGFR)進行繪圖，而製作散佈圖，調查相關係數(圖12C~圖14C)。對慢性腎功能衰竭患者之D-離胺酸與L-離胺酸之合計量、L-離胺酸量、D-離胺酸量及D-離胺酸/L-離胺酸比以及血清肌酸酐值進行繪圖，而製作散佈圖，調查相關係數(圖12D~圖14D)。
L-Lys與eGFR或血清肌酸酐之相關性較低(圖12C及D)。又，關於L-Lys之與慢性腎功能衰竭患者之診斷能力相關之ROC分析的結果為AUC=0.375，診斷能力亦較低。其臨界值為781.4nmol/g(圖12B)。
D-Lys與eGFR或血清肌酸酐之相關性較高(圖13C及D)。又，關於D-Lys之與慢性腎功能衰竭患者之診斷能力相關之ROC分析的結果為AUC=0.938，診斷能力極高，其臨界值為24.2nmol/g(圖13B)。
D/L-Lys與eGFR或血清肌酸酐之相關性較高(圖14C及D)。又，關於D/L-Lys之與慢性腎功能衰竭患者之診斷能力相關之ROC分析的結果為AUC=0.938，診斷能力極高，其臨界值為24.2(圖14B)。
可基於ROC曲線而算出臨界值，於為L-Lys之情形時將781.4nmol/g設為臨界值，於為D-Lys之情形時將24.2nmol/g設為臨界值，於為D/L-Lys之情形時將24.2設為臨界值，藉此可以較高之感度判別慢性腎功能衰竭患者(圖12B~圖14B)。

Claims (22)

  1. 一種糞便或腸內容物之分析方法，其包括：測定胺基酸中之至少1種胺基酸之D體及/或L體之量的步驟；及基於上述至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體及L體之量而算出腎損傷之病態指標值之步驟。
  2. 如請求項1之分析方法，其中上述腎損傷之病態指標值係上述至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體與L體之合計量。
  3. 如請求項1之分析方法，其中上述腎損傷之病態指標值係上述至少1種胺基酸之D體之量相對於D體與L體之量之和的比、L體之量相對於D體之量之比、或D體之量相對於L體之量之比。
  4. 如請求項1至3中任一項之分析方法，其中上述至少1種胺基酸係選自由絲胺酸、麩胺酸、組胺酸、天冬醯胺、精胺酸、天冬胺酸、別蘇胺酸、丙胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、別異白胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、離胺酸及酪胺酸所組成之群中。
  5. 如請求項4之分析方法，其中上述分析方法進而包括將腎損傷之病態指標值與腎損傷之病態進行關聯之步驟。
  6. 如請求項5之分析方法，其中於上述至少1種胺基酸為選自由組胺酸、天冬醯胺、精胺酸、天冬胺酸、別蘇胺酸、丙胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、別異白胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、離胺酸及酪胺酸所組成之群中之情形時，腎損傷為慢性腎損傷。
  7. 如請求項6之分析方法，其中上述至少1種胺基酸係選自由組胺酸、別蘇胺酸及離胺酸所組成之群中。
  8. 如請求項5之分析方法，其中於上述至少1種胺基酸為選自由絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、丙胺酸、離胺酸、精胺酸及脯胺酸所組成之群中之情形時，腎損傷係因急性腎損傷或缺血所致之腎損傷。
  9. 如請求項5之分析方法，其中將腎損傷之病態指標值與腎損傷之病態進行關聯之步驟係基於由健康者群之病態指標值及腎損傷之患者群之病態指標值所確定之病態指標基準值而確定。
  10. 如請求項5之分析方法，其中將腎損傷之病態指標值與腎損傷之病態進行關聯之步驟係藉由將對象之病態指標值與臨界值進行比較而確定。
  11. 如請求項10之分析方法，其中上述臨界值係藉由ROC曲線分析而預先確定。
  12. 一種以糞便或腸內容物作為試樣之腎損傷之檢查方法，其進而包括：測定胺基酸中之至少1種胺基酸之D體及/或L體之量的步驟；基於上述至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、D體及L體之量而算出腎損傷之病態指標值之步驟；及將腎損傷之病態指標值與腎損傷之病態進行關聯之步驟。
  13. 如請求項12之檢查方法，其中上述腎損傷之病態指標值係上述至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體與L體之合計量。
  14. 如請求項12之檢查方法，其中上述腎損傷之病態指標值係上述至少1種胺基酸之D體之量相對於D體與L體之量之和的比、L體之量相對於D體之量之比、或D體之量相對於L體之量之比。
  15. 一種被檢體之糞便或腸內容物之試樣分析系統，其包含記憶部、輸入部、分析測定部、資料處理部、及病態資訊輸出部，並且 上述記憶部記憶自輸入部輸入之判別為腎損傷之病態指標值之閾值，上述分析測定部係將上述被檢體之糞便或腸內容物中之胺基酸中之至少1種胺基酸之胺基酸立體異構物進行分離並定量，上述資料處理部係基於上述至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體及L體之量而算出腎損傷之病態指標值，上述資料處理部藉由與記憶於記憶部中之閾值進行比較，而判別腎損傷，上述病態資訊輸出部輸出關於被檢體之腎損傷之病態資訊。
  16. 如請求項15之試樣分析系統，其中上述腎損傷之病態指標值係上述至少1種胺基酸之D體之量、L體之量、或D體與L體之合計量。
  17. 如請求項15之試樣分析系統，其中上述腎損傷之病態指標值係上述至少1種胺基酸之D體之量相對於D體與L體之量之和的比、L體之量相對於D體之量之比、或D體之量相對於L體之量之比。
  18. 如請求項15至17中任一項之試樣分析系統，其中上述至少1種胺基酸係選自由絲胺酸、麩胺酸、組胺酸、天冬醯胺、精胺酸、天冬胺酸、別蘇胺酸、丙胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、別異白胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、離胺酸及酪胺酸所組成之群中。
  19. 如請求項18之試樣分析系統，其中於上述至少1種胺基酸為選自由組胺酸、天冬醯胺、精胺酸、天冬胺酸、別蘇胺酸、丙胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、別異白胺酸、異白胺酸、白胺酸、苯丙胺酸、離胺酸及酪胺酸所組成之群中之情形時，腎損傷為慢性腎損傷。
  20. 如請求項19之試樣分析系統，其中上述至少1種胺基酸係選自由 組胺酸、別蘇胺酸及離胺酸所組成之群中。
  21. 如請求項18之試樣分析系統，其中於上述至少1種胺基酸為選自由絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、丙胺酸、精胺酸、離胺酸及脯胺酸所組成之群中之情形時，腎損傷係因急性腎損傷或缺血所致之腎損傷。
  22. 如請求項15至17中任一項之試樣分析系統，其中病態指標值之閾值係藉由ROC曲線分析而預先確定。
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