CN113109571B - 一种用于评估个体过敏程度的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于评估个体过敏程度的试剂盒，通过检测个体粪便中天冬氨酸含量来评估过敏程度，所述试剂盒包括用于检测粪便中天冬氨酸含量的试剂。本发明以天冬氨酸(ASP)作为一种评估过敏程度的生物标志物。该氨基酸生物标志物能够用于过敏个体的筛查，能够在制备过敏个体筛查产品等方面得到应用，为检测过敏的试剂及试剂盒的开发提供一种方向；该氨基酸生物标志物可作为靶点用于过敏反应发生风险的筛查和诊断，优化传统的检测、评估方法，提高过敏筛查和诊断效率与准确性，还可以作为靶点用于监控过敏患个体过敏发展进程；该氨基酸在过敏分体粪便中的异常变化，为以后研究过敏致病机制提供了新的方向，应用广泛。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于评估个体过敏程度的试剂盒。
背景技术
近年来，过敏己严重影响全球5％的成年人和8％的婴幼儿的正常生活，其患病率逐渐上升。花生、坚果、鱼、贝类、蛋、奶、小麦和豆子几类司空见惯的食物，产生了许多更严重的疾病负担。但是，目前还没有有效的防治过敏的方法。研究表明，存在多种会影响过敏发病率的因素，如致敏原、地域环境、膳食结构、种族差异，年龄性别等。因此，目前对于同一地区或不同地区、同一人群或不同人群存在多个不同的过敏的流行病数据，增加了过敏的研究和防治难度。
现临床上，过敏的诊断主要通过皮肤点刺试验、血清抗原特异性IgE(sIgE)检测和口服激发试验的方法评估过敏，通过病史和体检确认致敏原。因为对于过敏的诊断还未有高效统一的标准。近年来，新兴的组分解析诊断、生物信息学手段提高了诊断准确性。有学者对血清代谢物进行研究，以血清中的物质(类胰蛋白酶、溶血磷脂酰胆碱类物质等)作为评估过敏的生物标志物([1]UM Sahiner，et.al.，Serum basal tryptase may be a goodmarker for predicting the risk of anaphylaxis in children with food allergy，Allergy.2014Feb；69(2)：265-8.doi：10.1111/all.12317.Epub 2013Nov 20.；[2]公开号为CN107907610A的发明申请)。经大量研究发现，不同的氨基酸对T淋巴细胞存在着不同的调节作用，对提高人体免疫力，治疗过敏具有重要意义([1]Fu，L.，Fu，S.，Wang，C.，Xie，M.&Wang，Y.Yogurt-sourced probiotic bacteria alleviate shrimp tropomyosin-inducedallergic mucosal disorders，potentially through microbiota and metabolismmodifications.Allergology International 68，506-514(2019).[2]Gu，C.，Mao，X.，Chen，D.，Yu，B.&Yang，Q.Isoleucine Plays an Important Role for MaintainingImmune Function.Curr.Protein Pept.Sci.20，644-651(2019).[3]Aranda，C.S.etal.Isoleucine and atopic dermatitis.Pediatric Allergy and Immunology 28，495-497(2017).)。
发明内容
本发明目的在于公开一种评估过敏程度的生物标志物，同时公开提供一种评估过敏程度的生物标志物的应用，提供一种通过粪便评估过敏程度及其过敏种类的新方法，提高判断过敏程度准确性，丰富过敏检测方法，为过敏相关研究与应用提供新工具。
本发明首先提供了粪便中天冬氨酸含量作为生物标志物在制备用于评估个体过敏程度的试剂盒中的应用。
本发明又提供了一种用于评估个体过敏程度的试剂盒，通过检测个体粪便中天冬氨酸含量来评估过敏程度，所述试剂盒包括用于检测粪便中天冬氨酸含量的试剂。
所述的试剂盒，包括利用氨基酸自动分析仪检测样品中天冬氨酸含量的试剂。
所述的试剂盒，包括由已知浓度的天冬氨酸溶液组成的标准样。
检测时包括以下步骤：
(1)取个体粪便样品，烘干后粉碎；
(2)取一定量粉碎后的样品用盐酸水解；
(3)水解产物脱酸干燥；
(4)步骤(3)产物加入缓冲液混匀、过滤后上样到氨基酸自动分析仪进行分析；
(5)将步骤(4)分析所得色谱图与标准样色谱图比较，根据峰面积确定天冬氨酸的含量。
检测的对象可以是疑似过敏的个体，或者自认为健康的个体需要进行是否过敏的体检。
步骤(1)中，将样品放入60℃烘箱中烘干后粉碎。步骤(2)盐酸水解时，使用水解管，在样品中加入盐酸后用氮吹仪吹氮后封管进行水解。水解温度为110℃，时间为24h。准确称取干燥的固体样品50mg，放入水解管中，尽量避免样品粉末挂壁，缓慢加入4ml 6mol/L的盐酸，用氮吹仪水解管吹氮15min后立即封管；将封管后的样品置于110℃烘箱中水解22-24h后取出冷却；打开水解管，用纯水将样品定容至50ml；准确吸取定容后的溶液样品1ml，置氮吹仪上60℃脱酸，直至干燥；准确加入1ml浓度为0.02mol/L的HCl缓冲液，用旋涡器混匀。将混匀后的液体样品通过0.22μm的滤膜转移至仪器进样瓶中，按照规定步骤操作氨基酸自动分析仪进行测定。
将得到的健康和疑似过敏的待检个体粪便样本色谱图与混合氨基酸标准谱图进行对比以确定氨基酸种类，根据峰面积确定氨基酸的含量；将两类粪便样本中天门冬氨酸的含量进行比较，疑似过敏的待检个体粪便样本中天门冬氨酸含量低于健康水平，即可评估其为过敏。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以天冬氨酸(ASP)作为一种评估过敏程度的生物标志物。该氨基酸生物标志物能够用于过敏个体的筛查，能够在制备过敏个体筛查产品等方面得到应用，为检测过敏的试剂及试剂盒的开发提供一种方向；该氨基酸生物标志物可作为靶点用于过敏反应发生风险的筛查和诊断，优化传统的检测、评估方法，提高过敏筛查和诊断效率与准确性，还可以作为靶点用于监控过敏患个体过敏发展进程；该氨基酸在过敏分体粪便中的异常变化，为以后研究过敏致病机制提供了新的方向，应用广泛。
附图说明
图1是健康人群和海鲜过敏人群粪便中天门冬氨酸(ASP)含量图。
图2是健康小鼠和TM致敏小鼠粪便中天门冬氨酸(ASP)含量图。
具体实施方式
实施例1
天门冬氨酸(ASP)用于评估人体海鲜过敏情况的步骤如下：
(1)样本的获取：
招募具有软体类海鲜过敏史的志愿者3例，健康志愿者11例。健康组与过敏组在性别、年龄匹配，具有可比性(P＞0.05)。
(2)样本的前处理：
将粪便样品放入60℃烘箱中烘干后粉碎，准确称取干燥的固体样品50mg，放入水解管中，尽量避免样品粉末挂壁，缓慢加入4ml浓度6mol/L的盐酸，用氮吹仪水解管吹氮15min后立即封管；将封管后的样品置于110℃烘箱中水解22-24h后取出冷却；打开水解管，用纯水将样品定容至50ml；准确吸取定容后的溶液样品1ml，置氮吹仪上60℃脱酸，直至干燥；准确加入1ml浓度0.02mol/L的HCl，用旋涡器混匀。
(3)上机测定：
将混匀后的液体样品通过0.22μm的滤膜转移至仪器进样瓶中，按照规定步骤操作氨基酸自动分析仪进行测定。
(4)数据分析：
将得到的粪便样本色谱图与混合氨基酸标准谱图进行对比以确定氨基酸种类，根据峰面积确定氨基酸的含量。两类志愿者粪便样本中天门冬氨酸的含量，结果如下表1所示。
表1
| 组别 | 健康组 | 过敏组 |
| ASP含量(g/100g) | 1.2407±0.0838 | 1.0680±0.0286 |
经调查，3例未确诊的具有海鲜过敏史的志愿者中1例对鲍鱼、乌贼过敏，1例在免疫力低下时对海鲜过敏，还有1例为普通水平的海鲜过敏。3例海鲜过敏志愿者者粪便中天门冬氨酸含量低于健康水平，如图1所示，是健康和海鲜过敏志愿者粪便中天门冬氨酸(ASP)含量图，两者存在显著的统计学差异。经过血清指标显示3例志愿者确为海鲜过敏。因此，天门冬氨酸(ASP)可作为一种评估人体海鲜过敏情况的粪便代谢生物标志物，用于评估和检测人体的过敏程度，可用于过敏研究中志愿者资质的快速筛查等方面的应用。
实施例2
天门冬氨酸(ASP)用于评估小鼠TM(虾原肌球蛋白)致敏情况的检测步骤如下：
(1)样本的获取：
饲养9只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，其中3只进行TM致敏，对小鼠进行刺激，使其应激后排便，收集两组小鼠的粪便。
(2)样本的前处理：
将粪便样品放入60℃烘箱中烘干后粉碎，准确称取干燥的固体样品50mg，放入水解管中，尽量避免样品粉末挂壁，缓慢加入4ml 6mol/L的盐酸，用氮吹仪水解管吹氮15min后立即封管；将封管后的样品置于110℃烘箱中水解22-24h后取出冷却；打开水解管，用纯水将样品定容至50ml；准确吸取定容后的溶液样品1ml，置氮吹仪上60℃脱酸，直至干燥；准确加入1ml 0.02mol/L HCL缓冲液，用旋涡器混匀。
(3)上机测定：
将混匀后的液体样品通过0.22μm的滤膜转移至仪器进样瓶中，按照规定步骤操作氨基酸自动分析仪进行测定。
(4)数据分析：
将得到的粪便样本色谱图与混合氨基酸标准谱图进行对比以确定氨基酸种类，根据峰面积确定氨基酸的含量；两类小鼠粪便样本中天门冬氨酸的含量，结果如下表2所示。
表2
| 组别 | 健康组 | 过敏组 |
| ASP含量(g/100g) | 1.2373+0.1060 | 1.0180+0.0199 |
通过本发明，TM致敏小鼠粪便中天门冬氨酸含量低于健康水平，如图2所示，健康小鼠和TM致敏小鼠粪便中天门冬氨酸(ASP)含量图，两者存在显著的统计学差异。经血清指标验证小鼠已致敏。因此，天门冬氨酸(ASP)可作为一种评估小鼠模型致敏情况的粪便代谢生物标志物，用于评估和检测小鼠模型致敏程度，为基于动物实验的过敏研究提供新的实验方法。
Claims (1)
1.人体粪便中天冬氨酸含量作为生物标志物在制备用于评估个体过敏程度的试剂盒中的应用；
通过检测人体粪便中天冬氨酸含量来评估过敏程度，所述试剂盒包括用于检测粪便中天冬氨酸含量的试剂；
包括利用氨基酸自动分析仪检测样品中天冬氨酸含量的试剂；
包括由已知浓度的天冬氨酸溶液组成的标准样；
检测时包括以下步骤：
(1)取个体粪便样品，烘干后粉碎；
(2)取一定量粉碎后的样品用盐酸水解；
(3)水解产物脱酸干燥；
(4)步骤(3)产物加入缓冲液混匀、过滤后上样到氨基酸自动分析仪进行分析；
(5)将步骤(4)分析所得色谱图与标准样色谱图比较，根据峰面积确定天冬氨酸的含量；
步骤(2)盐酸水解时，使用水解管，在样品中加入盐酸后用氮吹仪吹氮后封管进行水解；
水解温度为110℃，时间为22～24h；
步骤(3)水解产物脱酸干燥时用氮吹仪脱酸，直至干燥。
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