WO2023210683A1 - 腎機能低下リスクの評価方法 - Google Patents

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WO2023210683A1
WO2023210683A1 PCT/JP2023/016430 JP2023016430W WO2023210683A1 WO 2023210683 A1 WO2023210683 A1 WO 2023210683A1 JP 2023016430 W JP2023016430 W JP 2023016430W WO 2023210683 A1 WO2023210683 A1 WO 2023210683A1
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cystatin
renal function
concentration
subject
risk
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Inventor
浩之 久保田
康志 鏑木
俊之 今澤
Original Assignee
国立研究開発法人国立国際医療研究センター
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method, a biomarker, and a kit for evaluating the risk of decreased renal function in a diabetic subject.
  • GFR globular filtration rate
  • type 2 diabetes differs from type 1 diabetes in that the timing of diabetes onset is unknown and that hypertension is often present before the onset of DMN. It is thought to be similar to DMN caused by type 1 diabetes.
  • UACR urinary albumin-creatinine ratio
  • eGFR estimated glomerular filtration rate
  • DKD diabetic kidney disease
  • DMN atypical diabetes-related kidney disease in which GFR is decreased without overt albuminuria.
  • biomarker discovery research for DKD has been conducted, but in many cases, conventional studies have included cases of decreased GFR in the analysis, and it is unclear whether the reported biomarkers fluctuate prior to the decreased GFR. There was a problem in that it was difficult to accurately judge whether the fluctuation was accompanied by a decline.
  • renal function is normal or mildly decreased (i.e., renal function has not yet significantly decreased).
  • a certain type of urinary protein is a factor that fluctuates prior to the decline in eGFR in patients with diabetes (condition), and by measuring the concentration of this specific protein, we can assess the risk of kidney function decline.
  • the present invention has been completed by discovering new things that can be done.
  • the present invention relates to a method for measuring the concentration of a specific protein in urine in order to evaluate, determine, or predict the risk of decreased renal function in a subject with type 2 diabetes, and more specifically, ⁇ 1>
  • a method for evaluating the risk of renal function decline in a diabetic subject comprising: (A) obtaining a body fluid sample obtained from the subject; and (B) cystatin A present in the body fluid sample.
  • a method comprising: measuring the concentration of; ⁇ 2> The method according to ⁇ 1> above, wherein the subject has normal or mildly decreased renal function; ⁇ 3> The method according to ⁇ 1> above, wherein the eGFR of the subject is 60 (mL/min/1.73m 2 ) or more; ⁇ 4> The method according to ⁇ 1> above, further comprising the step of comparing the measured cystatin A concentration with a control value; ⁇ 5> The method according to ⁇ 1> above, which comprises repeating the steps (A) and (B) multiple times at regular intervals and monitoring the increase or decrease in the concentration of cystatin A; ⁇ 6> The method according to ⁇ 1> above, wherein the body fluid sample is urine; ⁇ 7> The method according to ⁇ 1> above, wherein the subject is a human; ⁇ 8> The measurement in step (B) is performed by at least one of mass spectrometry, gas chromatography, liquid chromatography, gas chromatography/mass spectrometry, liquid
  • the present invention provides the method described in ⁇ 1> above, which is used in combination with other testing methods that measure at least one of the following.
  • the present invention also relates to a biomarker or kit for evaluating the risk of renal function decline in diabetes, and more specifically, ⁇ 10> A biomarker for evaluating the risk of renal function decline in diabetes, including cystatin A; and ⁇ 11> A kit for evaluating the risk of renal function decline in diabetes, including a measurement reagent for cystatin A.
  • existing diagnostic methods such as eGFR detect protein markers in the urine of diabetic patients with normal or mildly decreased renal function (i.e., a state in which renal function has not significantly decreased). By measuring the concentration, the risk of future decline in renal function can be predicted easily and with high accuracy. Further, by using the information obtained by the method of the present invention together with general-purpose test information such as UACR, eGFR, and Hb, it is useful in that the risk of renal function decline can be predicted from an earlier stage.
  • general-purpose test information such as UACR, eGFR, and Hb
  • FIG. 1 shows an overview of protein quantitative analysis using multiple reaction monitoring method (MRM).
  • FIG. 2 is a table showing urinary proteins that can be a factor in decreased renal function (eGFR).
  • FIG. 3 is a table showing the ability to discriminate cases of decreased renal function using test information and urinary protein concentration information.
  • FIG. 4 is a diagram showing the correlation between cystatin A mRNA expression level in the kidneys of chronic kidney disease patients and (A) urinary cystatin A concentration, (B) eGFR, and (C) UACR.
  • FIG. 5 shows (A) the detection results of urinary cystatin A by Western blotting, and (B) the comparison results of the urinary cystatin A/creatinine ratio in the renal function decline group and the control group.
  • a first aspect of the present invention is a method for evaluating the risk of decreased renal function in a diabetic subject, and is characterized by comprising the following steps (A) and (B): (A) obtaining a body fluid sample obtained from the subject; and (B) measuring the concentration of cystatin A present in the body fluid sample.
  • kidney function includes filtering blood, secreting various toxins, metabolic waste products, and/or reabsorbing certain nutrients, amino acids, and water, and the like.
  • eGFR which is commonly used as an indicator of chronic kidney disease, is known to indicate the degree of renal function that excretes waste products from the kidneys into the urine.
  • Renishaw of decreased renal function refers to the risk that the above-mentioned renal function may decrease after a certain period of time.
  • diabetes includes both type 1 and type 2 diabetes, but type 2 diabetes is preferred.
  • the biological species to be tested is not particularly limited, but is typically a mammal, preferably a human.
  • the body fluid sample obtained from the subject can be blood, serum, plasma, or urine, but is typically urine.
  • the body fluid sample obtained from the subject can be used as it is, but depending on the case, it can be appropriately processed such as filtration with a filter or the like.
  • step (B) the concentration of protein, which is a biomarker for the risk of renal function decline, is measured in the body fluid sample obtained in step (A).
  • the biomarker is cystatin A.
  • “measuring the concentration” refers to detection to quantify the biomarkers contained in a sample. It may also include cases in which the derived substance is directly detected but the biomarker itself is not directly detected.
  • cystatin A a biomarker
  • cystatin A a biomarker
  • Cystatin A is a protein with a molecular weight of approximately 11 kDa, consisting of 98 amino acid residues, and belongs to the Cystatin superfamily. It functions as an inhibitor of cysteine proteases, represented by cathepsins, and prevents proteins from being broken down disorderly within cells. (For example, V. Turk et al., FEBS Letters, 285, 213-219, 1991). For the specific arrangement, reference can be made to, for example, Japanese Patent Laid-Open No. 2007-291089.
  • the method of the present invention is used in combination with other testing methods that measure at least one selected from the group consisting of sex, age, eGFR, UACR, HDL-C, TG, and Hb. I can do it.
  • control has the broadest meaning used in the technical field of the present invention.
  • control refers to a subject that is compared to a subject measured using the methods of the present invention, in which the protein concentration may also be determined according to the methods of the present invention.
  • a healthy subject a subject suffering from a disease other than diabetes, a subject previously diagnosed with diabetes but in remission, a subject before or after administration of a candidate drug to treat diabetes, or a former self. This may include yourself.
  • the control may be a sample from a population, and the "control value" may be the average value of those populations.
  • the method of the present invention includes repeating the steps (A) and (B) multiple times at regular intervals and monitoring the increase or decrease in the concentration of cystatin A. That is, by periodically measuring the protein concentration of the same subject using the method of the present invention, signs of decreased renal function can be confirmed from the tendency of the concentration change.
  • the "regular interval" can be, for example, an interval of 3 months, 6 months, or 1 year.
  • any measuring means used in the art for detecting the amount of protein can be used, such as mass spectrometry, gas chromatography, liquid chromatography, nuclear magnetic resonance spectroscopy. , or a combination thereof, or an immunological detection method typified by ELISA or flow cytometry test can be used.
  • a combination of these measurement techniques can also be used.
  • markers contained in samples can be detected using gas chromatography/mass spectrometry (hereinafter referred to as GC/MS) or liquid chromatography/mass spectrometry. More preferably, it is detected by analysis (referred to as LC/MS).
  • mass spectrometry it is preferable to use multiple reaction monitoring method (MRM) or selected reaction monitoring method (SRM).
  • MRM multiple reaction monitoring method
  • SRM selected reaction monitoring method
  • the type of mass spectrometer that performs these mass separations inside the mass spectrometer is not particularly limited, and may include a quadrupole mass filter, an ion trap, a time-of-flight mass spectrometer, and the like as appropriate.
  • the body fluid sample Before being subjected to measurement in step (B), the body fluid sample can undergo appropriate pretreatment. For example, when performing LC/MS, an internal standard can be added to the sample, and the internal standard can be selected as appropriate depending on the m/z of the marker to be detected, the type of sample (serum, plasma, etc.), etc. .
  • the body fluid sample is measured by mass spectrometry, data corresponding to a mass spectrum or mass chromatogram is created. Then, the detected amount of protein is calculated based on the intensity and area of these peaks, and the desired protein concentration is calculated by multiplying the detected amount by the detected amount of the internal standard and the known concentration of the internal standard. can be calculated.
  • cystatin A can also be used as a biomarker. Therefore, in another aspect, the present invention also relates to a biomarker for evaluating the risk of renal function decline in diabetes, including cystatin A.
  • the present invention also relates to a kit for evaluating the risk of renal function decline in diabetes, which includes a measuring reagent for the biomarker cystatin A.
  • a measurement reagent can be any compound or antibody that has affinity for cystatin A.
  • the organic compound can be a low-molecular or high-molecular compound, such as a dye, a fluorescent dye, a dye, a pigment, a coloring reagent, a coloring reagent, an immunostaining reagent, an enzyme, or a labeled compound.
  • examples include indicators and probe molecules that exhibit a change in absorbance or fluorescence response by specifically binding to these proteins or by chemical reaction. Compounds labeled with radioactive isotopes and the like can also be used.
  • the kit of the present invention can also be used in assays for measuring and comparing the concentrations of the aforementioned biomarkers.
  • assays include, for example, immunoassays (such as dot blot assays), Western blotting, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), sandwich ELISAs, immunoelectrophoresis, single radial immunodiffusion (SRID), radioimmunoassays, etc.
  • immunoassays such as dot blot assays
  • Western blotting enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), sandwich ELISAs, immunoelectrophoresis, single radial immunodiffusion (SRID), radioimmunoassays, etc.
  • ELISAs enzyme-linked immunosorbent assays
  • sandwich ELISAs sandwich ELISAs
  • immunoelectrophoresis single radial immunodiffusion
  • SRID single radial immunodiffusion
  • Clinical information and clinical specimens were collected once a year for 593 type 2 diabetic patients (T2D). Of these, 403 T2D patients with eGFR ⁇ 60 (mL/min/1.73 m 2 ) at enrollment were targeted for analysis.
  • the average annual eGFR decline rate ( ⁇ eGFR) for T2D was calculated by linear regression based on eGFR from the time of enrollment to the time of final clinical information collection, and ⁇ eGFR ⁇ 5% was defined as the renal function decline group, and ⁇ eGFR ⁇ 5% was defined as the control group. .
  • the urinary protein concentration in urine sampled at random during the first year of registration was measured using the MRM method. Selection of urinary proteins contributing to decreased renal function was performed by logistic regression analysis, and the ability to discriminate groups with decreased renal function based on urinary protein concentration was evaluated by area under the ROC curve (AUC).
  • proteins correlated with HDL-C proteins correlated with serum creatinine and eGFR; proteins correlated with UACR; and annual eGFR change rate. It was found that these proteins can be broadly classified into proteins that are correlated with each other.
  • cystatin A we investigated the correlation between the amount of cystatin A mRNA in the kidneys of 85 patients with chronic kidney disease and the urinary cystatin A concentration, eGFR, and UACR.
  • Cystatin A mRNA levels in the kidneys of chronic kidney disease patients were negatively correlated with urinary cystatin concentration (Figure 4A), negatively correlated with eGFR ( Figure 4B), and positively correlated with UACR ( Figure 4C). Indicated.
  • Figure 4A urinary cystatin concentration
  • Figure 4B negatively correlated with eGFR
  • Figure 4C positively correlated with UACR
  • urinary cystatin A protein was detected by Western blotting using occasional urine samples (4 samples each) collected at the time of enrollment for the renal function decline group and the control group. Cystatin A was detected as a band around 11 kDa (Fig. 5A).

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Abstract

【課題】　糖尿病、特に２型糖尿病における腎機能の低下リスクの指標となり得る新規かつ簡便な手法を開発することを課題とする。 【解決手段】　糖尿病の被検体における腎機能低下リスクを評価する方法であって、（Ａ）前記被検体から得られた体液サンプルを取得する工程、及び（Ｂ）前記体液サンプル中に存在するシスタチンＡの濃度を測定する工程を含む、方法。

Description

腎機能低下リスクの評価方法
　本発明は、糖尿病の被検体における腎機能低下リスクを評価するための方法、バイオマーカー、及びキットに関する。
　糖尿病性腎症（ＤＭＮ）の典型的な臨床経過では、１型糖尿病を起因とする場合、微量アルブミン尿の出現により発症し、顕性アルブミン尿あるいは持続的な蛋白尿への進展ののち、糸球体濾過量（ＧＦＲ）の低下から末期腎不全に至る経過を辿る(非特許文献１)。また、１型糖尿病では、発症早期に一過性にＧＦＲが上昇し，糸球体過剰濾過を呈する。
一方、２型糖尿病では、糖尿病発症時期が不明であることや、ＤＭＮ発症前より既に高血圧を合併していることが多い点が１型糖尿病と異なるものの、ＤＭＮを発症すれば、その臨床経過は１型糖尿病によるＤＭＮに類似するものと考えられている。
　ＤＭＮの診断では、一般に、尿中アルブミン・クレアチニン比(ＵＡＣＲ)や推算糸球体濾過量(ｅＧＦＲ)が用いられる。しかしながら、近年アルブミン尿の増加や蛋白尿を認めず進行性にＧＦＲが低下する症例が報告されるなど、ＵＡＣＲやｅＧＦＲで診断を行うには限界があることが指摘されている（非特許文献２）。
　このような背景から、典型的なＤＭＮに加え、顕性アルブミン尿を伴わずにＧＦＲが低下する非典型的な糖尿病関連腎疾患を含めた糖尿病性腎臓病(ＤＫＤ)という概念が提唱された。近年、ＤＫＤに関するバイオマーカー探索研究が行われているが、従来の研究ではＧＦＲ低下症例を解析対象に組み入れている場合が多く、報告されたバイオマーカーがＧＦＲ低下に先行して変動するのか、ＧＦＲ低下に伴って変動しているのかの正確な判断が難しいという課題があった。
Acta Diabetol, 51: 905-15, 2014 Diabetes Care 38: 954-962, 2015
　そこで、本発明は、糖尿病、特に２型糖尿病における腎機能の低下リスクの指標となり得る新規かつ簡便な手法を開発することを課題とするものである。特に、ｅＧＦＲの低下に先行して変動する因子を特定し、これをモニターすることで将来における腎機能低下リスクを予見するための方法を提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、尿プロテオーム解析を用いることにより、腎機能が正常又は軽度低下の状態（すなわち、未だ腎機能の低下が顕著に生じていない状態）の糖尿病患者において、ある種の尿中タンパク質がｅＧＦＲの低下に先行して変動する因子であることを初めて特定し、かかる特定のタンパク質の濃度を測定することで腎機能低下のリスクを評価できることを新規に見出し、本発明を完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は、一態様において、２型糖尿病の被検体における腎機能低下リスクを評価、判定或いは予測するために尿中における特定のタンパク質濃度を測定する方法に関し、より具体的には、
＜１＞糖尿病の被検体における腎機能低下リスクを評価する方法であって、（Ａ）前記被検体から得られた体液サンプルを取得する工程、及び（Ｂ）前記体液サンプル中に存在するシスタチンＡの濃度を測定する工程を含む、方法；
＜２＞前記被検体が、腎機能が正常又は軽度低下の状態である、上記＜１＞に記載の方法；
＜３＞前記被検体のｅＧＦＲが、６０（mL/min/1.73m2）以上である、上記＜１＞に記載の方法；
＜４＞測定された前記シスタチンＡの濃度を、対照の値と比較する工程をさらに含む、上記＜１＞に記載の方法；
＜５＞前記工程（Ａ）及び（Ｂ）を一定期間の間隔で複数回繰り返し行い、前記シスタチンＡの濃度の増減をモニタリングすることを含む、上記＜１＞に記載の方法；
＜６＞前記体液サンプルが、尿である、上記＜１＞に記載の方法；
＜７＞前記被検体が、ヒトである、上記＜１＞に記載の方法；
＜８＞前記工程（Ｂ）における測定が、質量分析、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ／質量分析、液体クロマトグラフィ／質量分析、核磁気共鳴分光法、および免疫学的検出法の少なくとも一つにより行われる、上記＜１＞に記載の方法；及び
＜９＞性別、年齢、ｅＧＦＲ、ＵＡＣＲ、ＨＤＬ-コレステロール （ＨＤＬ－Ｃ）、中性脂肪 （ＴＧ）、及びヘモグロビン（Ｈｂ）よりなる群から選択される少なくとも１つを測定する他の検査方法と併用して用いられる、上記＜１＞に記載の方法
を提供するものである。
　また、別の態様において、本発明は、糖尿病における腎機能低下リスクの評価用バイオマーカー又はキットにも関し、より具体的には、
＜１０＞シスタチンＡを含む、糖尿病における腎機能低下リスクの評価用バイオマーカー；及び
＜１１＞シスタチンＡに対する測定試薬を含む、糖尿病における腎機能低下リスクの評価用キット
を提供するものである。
　本発明によれば、ｅＧＦＲ等の既存の診断手法では腎機能が正常又は軽度低下の状態（すなわち、未だ腎機能の低下が顕著に生じていない状態）の糖尿病患者について、尿中におけるタンパク質マーカーの濃度を測定することで、将来における腎機能低下のリスクを簡便かつ高い精度で予見することができる。また、本発明の方法により得られる情報と、ＵＡＣＲやｅＧＦＲ、Ｈｂ等の汎用的な検査情報とを併用することで、より早い段階から腎機能低下リスクを予見できる点でも有用である。
図１は、多重反応モニタリング法（ＭＲＭ）によるタンパク質定量解析の概要を示すものである。 図２は、腎機能低下（ｅＧＦＲ）の要因となり得る尿中タンパク質を示す表である。 図３は、検査情報や尿中タンパク質濃度情報を用いた腎機能低下症例の判別能を示す表である。 図４は、慢性腎臓病患者の腎臓におけるシスタチンＡ ｍＲＮＡ発現量と、（Ａ）尿中シスタチンＡ濃度、（Ｂ）ｅＧＦＲ、（Ｃ）ＵＡＣＲとの相関を示す図である。 図５は、（Ａ）ウェスタンブロッティングによる尿中シスタチンＡの検出結果、（Ｂ）腎機能低下群、および対照群における尿中シスタチンＡ・クレアチニン比の比較結果を示すものである。
　以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
　本発明の第１の態様は、糖尿病の被検体における腎機能低下リスクを評価する方法であって、以下の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含むことを特徴とする：
（Ａ）前記被検体から得られた体液サンプルを取得する工程、及び
（Ｂ）前記体液サンプル中に存在するシスタチンＡの濃度を測定する工程。
　腎臓は、泌尿器系の必須の要素であり、また、恒常性機能、例えば電解質の制御、酸塩基バランスの維持、および血圧の制御などを提供するものでもある。本明細書における「腎機能」とは、血液を濾過すること、種々の毒素、代謝老廃物を分泌すること、ならびに／または特定の栄養素、アミノ酸、および水を再吸収すること等を含む。例えば、慢性腎臓病の指標として汎用されているｅＧＦＲは、腎臓における老廃物を尿へ排出する腎機能の程度を示すものとして知られている。「腎機能低下リスク」とは、一定期間経過の後に上記腎臓の機能の低下が生じ得るリスクを意味するが、より具体的には、糖尿病に該当すると診断されたものの、現状では腎機能が未だ正常又は軽度低下の状態に留まっている被検体において、将来的にｅＧＦＲ等で表される腎機能の低下が生じ得る可能性を意味している。本発明において、「糖尿病」とは、１型及び２型のいずれをも含むが、好ましくは２型糖尿病である。
　被験体となる生物種は特に限定されないが、典型的には哺乳動物であり、好ましくはヒト（人間）である。本発明の方法では、上述のように、糖尿病に該当すると診断されたものの、現状では腎機能が未だ正常又は軽度低下の状態に留まっている被検体を対象とすることが好適である。より具体的には、ｅＧＦＲが６０（mL/min/1.73m2）以上であるヒトが好ましい。
　工程（Ａ）において、被検体から取得する体液サンプルは、血液、血清、血漿、または尿であることができるが、典型的には尿である。当該体液サンプルは、被検体から取得したものをそのまま用いることができるが、場合により、フィルター等による濾過などの処理を適宜行うことができる。
　工程（Ｂ）では、工程（Ａ）で取得した体液サンプルについて腎機能低下リスクのバイオマーカーとなるタンパク質の濃度を測定する。当該バイオマーカーは、シスタチンＡである。これらバイオマーカーについて「濃度を測定する」とは、試料に含まれているバイオマーカーを定量するための検出を行うことを指し、それ以外にも、バイオマーカーの誘導体や修飾物等の、バイオマーカー由来の物質を直接検出するがバイオマーカー自体を直接検出しない場合も含み得る。
　バイオマーカーである当該シスタチンＡは、実施例で後述すように、腎機能が正常又は軽度低下の状態に留まっている糖尿病患者において、腎機能の低下に先立って尿中の濃度変動を示すことを本願発明者が初めて見出したものである。したがって、体液サンプル中におけるシスタチンＡの濃度を測定することで、将来における腎機能低下のリスクを評価、判定又は予測することができる。リスクを「評価、判定又は予測する」とは、例えば、現在または将来において腎機能が低下する可能性をいくつかのレベルに分けて出力することや、数値により出力することを含む。
　シスタチンＡは、９８アミノ酸残基からなる分子量約１１ｋＤａの蛋白質で、Ｃｙｓｔａｔｉｎスーパーファミリーに属し、カテプシンに代表されるシステインプロテアーゼのインヒビターとして機能し、細胞内で蛋白質が無秩序に分解されるのを防いでいることが知られている（例えば、V. Turk et al., FEBS Letters,285, 213-219, 1991）。その具体的な配列は、例えば、特開２００７－２９１０８９を参照することができる。
　実施例で後述するように、シスタチンＡと、糖尿病患者に対する一般的な診療の際に行われる検査情報（性別、年齢、ｅＧＦＲ、ＵＡＣＲ、ＨＤＬ－Ｃ、ＴＧ、Ｈｂ等）を併用することで、腎機能低下のリスクをより正確に早期から予見できる。
　したがって、好ましい態様において、本発明の方法は、性別、年齢、ｅＧＦＲ、ＵＡＣＲ、ＨＤＬ－Ｃ、ＴＧ及びＨｂよりなる群から選択される少なくとも１つを測定する他の検査方法と併用して用いることができる。
　また、本発明の方法では、工程（Ｂ）で測定されたシスタチンＡの濃度を、対照の値と比較する工程をさらに含むことができる。本明細書において「対照」とは、本発明の技術分野において用いられている最も広い意味を有する。例えば、用語「対照」は、本発明の方法を用いて測定される対象と比較される対象を意味し、当該対照も、本発明の方法に従ってタンパク質濃度が測定され得る。例えば、健常者、糖尿病以外の疾患に罹患している対象、以前に糖尿病と診断されたが寛解されている対象、糖尿病を治療するための候補薬剤の投与前若しくは後の対象、又は過去の自分自身などを含みうる。対照は、集団由来のサンプルであってもよく、「対照の値」はそれら集団の平均値であってもよい。
　好ましい態様において、本発明の方法は、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）を一定期間の間隔で複数回繰り返し行い、前記シスタチンＡの濃度の増減をモニタリングすることを含む。すなわち、同一の被検体に対して、本発明の方法を用いたタンパク質濃度の測定を定期的に行うことにより、その濃度変化の傾向から腎機能低下の予兆を確認することができる。「一定間隔」とは、例えば、３か月、６か月、１年などの間隔であることができる。
　工程（Ｂ）における測定は、当該技術分野においてタンパク質量を検出するために用いられている任意の測定手段を用いることができるが、例えば、質量分析、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、核磁気共鳴分光法、若しくは、これらの組合せ、またはＥＬＩＳＡやフローサイトメトリー検査に代表される免疫学的検出法を用いることができる。これらの測定手法を組み合わせて用いることもできる。様々な種類の物質を含む試料から、目的のマーカーを好適に分離して検出する観点から、試料に含まれるマーカーは、ガスクロマトグラフィ／質量分析（以下、ＧＣ／ＭＳと呼ぶ）または液体クロマトグラフィ／質量分析（ＬＣ／ＭＳと呼ぶ）により検出されることがより好ましい。ここで、質量分析は、多重反応モニタリング法（ＭＲＭ）や選択反応モニタリング法（ＳＲＭ）を用いることが好ましい。質量分析計の内部でこれらの質量分離を行う質量分析器についてもその種類は特に限定されず、四重極マスフィルタ、イオントラップおよび飛行時間型質量分析器等を適宜含むものとすることができる。
　工程（Ｂ）における測定に供する前に、体液サンプルは適切な前処理を受けることができる。例えば、ＬＣ／ＭＳを行う場合、試料に内部標準を加えることができ、内部標準は、検出するマーカーのｍ／ｚや試料の種類（血清、血漿等）等に合わせて適宜選択することができる。
　質量分析により上記体液サンプルの測定を行った場合には、マススペクトルやマスクロマトグラムに対応するデータが作成される。その後、これらにおけるピークの強度や面積に基づいてタンパク質の検出量が算出され、当該検出量を内部標準の検出量で割った値と、内部標準の既知の濃度との積等により所望のタンパク質濃度を算出することができる。
　上述のように、シスタチンＡの尿中濃度を測定することにより、糖尿病における腎機能低下リスクを評価、判定又は予測することができることから、当該シスタチンＡをバイオマーカーとして用いることもできる。したがって、本発明は、別の態様において、シスタチンＡを含む、糖尿病における腎機能低下リスクの評価用バイオマーカーにも関する。
　更なる態様において、本発明は、バイオマーカーであるシスタチンＡに対する測定試薬を含む、糖尿病における腎機能低下リスクの評価用キットにも関する。かかる測定試薬としては、シスタチンＡに対して親和性を有する任意の化合物又は抗体であることができる。有機化合物は、低分子又は高分子の化合物であることができ、例えば、色素、蛍光色素、染料、顔料、発色試薬、呈色試薬、免疫染色試薬、酵素、又は標識化された化合物などがある。特に、これらタンパク質と特異的に結合すること或いは化学反応により、吸光度変化や蛍光応答を示す指示薬やプローブ分子などを挙げることができる。放射性同位体などにより標識された化合物を用いることもできる。
　本発明のキットを用いて、上記バイオマーカー濃度の測定や比較を行うためのアッセイに用いることもできる。かかるアッセイは、例えば、免疫学的アッセイ（ドットブロットアッセイなど）、ウェスタンブロット法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチＥＬＩＳＡ、免疫電気泳動法、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ラテックス免疫測定法（ＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、呈色反応、及び比色法などがある。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
　２型糖尿病患者(Ｔ２Ｄ)　５９３名について臨床情報、および臨床検体を年１回の頻度で収集した。このうち、登録時ｅＧＦＲ≧６０（mL/min/1.73m2）のＴ２Ｄ　４０３名を解析対象とした。Ｔ２ＤのｅＧＦＲ年平均低下率(ΔｅＧＦＲ)は登録時から最終の臨床情報収集時までのｅＧＦＲに基づき線形回帰により算出し、ΔｅＧＦＲ≧５%を腎機能低下群、ΔｅＧＦＲ＜５%を対照群とした。登録初年度に採取した随時尿中の尿中タンパク質濃度の測定はＭＲＭ法にて行った。腎機能低下に寄与する尿中タンパク質の選抜はロジスティック回帰分析により行い、尿中タンパク質濃度による腎機能低下群の判別能は、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）によって評価した。
　追跡集団の観察期間中央値は５．５年（IQR, 3.9－7.3)であり、登録時ｅＧＦＲ≧６０（mL/min/1.73m2）のＴ２Ｄ　４０３名のうち４７名が腎機能低下群となった。ロジスティック回帰分析ではＨＤＬ－Ｃ（OR, 0.97; 95% CI, 0.948－0.996; P = 0.023）、ＴＧ（OR, 1.003; 95% CI, 1.00－1.01; P = 0.026)、 Ｈｂ（OR, 0.74; 95% CI, 0.55－0.98; P = 0.033)がｅＧＦＲ低下に寄与する有意な因子であることが分かった。
　次に、登録時ｅＧＦＲ≧６０（mL/min/1.73m2）のＴ２Ｄ　４０３名より腎機能低下群４４名、対照群１７４名を無作為に抽出し、被験者の随時尿サンプルを用いてプロテオーム解析を行った。具体的には、糖尿病性腎臓病関連尿タンパク質（Diabetes Res Clin Pract. 2019; 147: 37-46）のうち、定量解析系の構築が可能であった７５タンパク質についてｅＧＦＲ低下との関連を検討した。ＭＲＭ法による定量解析の概要を図１に示す。
　解析対象者より登録時に収集した尿検体を用い７５タンパク質の尿中濃度を測定した結果、以下に示す１１種のタンパク質が腎機能低下群と対照群との比較において有意差を示した。そのうち、７種は腎機能低下群で濃度上昇するタンパク質であり、４種は腎機能低下群で濃度低下するタンパク質であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これらの１１のタンパク質濃度と登録時患者臨床情報との相関解析を行った結果、これらはＨＤＬ－Ｃに相関するタンパク質；血清クレアチニンやｅＧＦＲに相関するタンパク質；ＵＡＣＲに相関するタンパク質；年間ｅＧＦＲ変化率に相関するタンパク質に大別されることが分かった。
　次に、上記１１種のタンパク質のうち、腎機能低下の要因となりうるタンパク質をロジスティック回帰分析にて評価した（図２）。その結果、シスタチンＡをはじめとする９種のタンパク質が、ｅＧＦＲ低下に寄与する有意な因子であることが分かった。
　また、シスタチンＡ、及びその他にＰＳＣＡ、ＴＢＧを含む３種のタンパク質の濃度について、ｅＧＦＲ≧６０（mL/min/1.73m2）の集団（２１８症例）における腎機能低下群の判別能をＲＯＣ曲線による解析で評価した（図３）。その結果、アウトカムをΔｅＧＦＲ≧５％とした場合、1種類の尿中タンパク質を用いた際のＡＵＣは、おおよそ０．６～０．７であり、ＨＤＬ－Ｃ, ＴＧ, ＨｂによるＡＵＣを上回った。
　さらに、上記シスタチンＡの尿中濃度と臨床情報とを併用し、ｅＧＦＲ低下症例の判別能を検討した（図３）。その結果、性別、年齢、ｅＧＦＲ, ＵＡＣＲ, ＨＤＬ－Ｃ, ＴＧ, Ｈｂの７臨床情報を統合した際の判別能(ＡＵＣ＝０．６８)に比べて、シスタチンＡを含む１種以上のタンパク質を臨床情報に付加した場合、ｅＧＦＲ低下症例の判別能がさらに上昇した。これらの結果から、シスタチンＡの尿中濃度を測定することで ２型糖尿病患者における腎機能低下を超早期から予見できることが実証された。　
　シスタチンＡについて、慢性腎臓病患者８５例の腎臓におけるシスタチンＡ ｍＲＮＡ量と、尿中シスタチンＡ濃度、ｅＧＦＲ、ＵＡＣＲとの相関について検討した。慢性腎臓病患者の腎臓におけるシスタチンＡ ｍＲＮＡ量は尿中シスタチン濃度と負の相関を（図４Ａ）、ｅＧＦＲとは負の相関を（図４Ｂ）、ＵＡＣＲとは正の相関を（図４Ｃ）それぞれ示した。これらの結果から、シスタチンＡの尿中濃度は腎臓におけるシスタチンＡ ｍＲＮＡ量を反映していること、さらに腎臓におけるシスタチンＡ ｍＲＮＡ量の変動は腎機能変化（ｅＧＦＲ、ＵＡＣＲ）と関連することが示された。
　これらの結果により、上記の尿中のシスタチンＡの濃度を指標に用いることで、ｅＧＦＲ≧６０（mL/min/1.73m2）集団において既存のマーカーとして知られるＵＡＣＲよりも高い判別能(ＡＵＣ) でｅＧＦＲ低下群を判別出来ることが分かった。
　また、腎機能低下群と対照群の登録時に収集した随時尿検体（各４検体）を用いてウェスタンブロッティングにより尿中シスタチンＡタンパク質を検出した。シスタチンＡは１１kDa付近のバンドとして検出された（図５Ａ）。
　さらに、腎機能低下群(９症例)と対照群(１８症例)の登録時に収集した随時尿検体を用いてシスタチンＡ濃度をＥＬＩＳＡにて測定した。腎機能低下群、対照群の２群間では登録時のｅＧＦＲは有意差を認めなかったものの（腎機能低下群，90±19［mL/min/1.73m2］；対照群，81±19［mL/min/1.73m2］；Ｐ＝０．２５）、尿中シスタチンＡ濃度を尿中クレアチニン濃度で除した尿中シスタチンＡ・クレアチニン比は対照群に比べ腎機能低下群で有意に低下した（Ｐ＝０．０２４，図５Ｂ）。これらの結果から、シスタチンＡの尿中濃度を測定することで ２型糖尿病患者における腎機能低下を超早期から予見できることが実証された。

Claims (11)

  1. 　糖尿病の被検体における腎機能低下リスクを評価する方法であって、
    （Ａ）前記被検体から得られた体液サンプルを取得する工程、及び
    （Ｂ）前記体液サンプル中に存在するシスタチンＡの濃度を測定する工程
    を含む、方法。
  2. 　前記被検体が、腎機能が正常又は軽度低下の状態である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記被検体のｅＧＦＲが、６０（mL/min/1.73m2）以上である、請求項１に記載の方法。
  4. 　測定された前記シスタチンＡの濃度を、対照の値と比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  5. 　前記工程（Ａ）及び（Ｂ）を一定期間の間隔で複数回繰り返し行い、前記シスタチンＡの濃度の増減をモニタリングすることを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 　前記体液サンプルが、尿である、請求項１に記載の方法。
  7. 　前記被検体が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
  8. 　前記工程（Ｂ）における測定が、質量分析、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ／質量分析、液体クロマトグラフィ／質量分析、核磁気共鳴分光法、および免疫学的検出法の少なくとも一つにより行われる、請求項１に記載の方法。
  9. 　性別、年齢、ｅＧＦＲ、尿中アルブミン／クレアチニン比（ＵＡＣＲ）、ＨＤＬ-コレステロール （ＨＤＬ－Ｃ）、中性脂肪 （ＴＧ）、及びヘモグロビン（Ｈｂ）よりなる群から選択される少なくとも１つを測定する他の検査方法と併用して用いられる、請求項１に記載の方法。
  10. 　シスタチンＡを含む、糖尿病における腎機能低下リスクの評価用バイオマーカー。
  11. 　シスタチンＡに対する測定試薬を含む、糖尿病における腎機能低下リスクの評価用キット。
    　
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