KR101974044B1 - 주어진 표적에 대한 친화성을 갖는 인간의 리포칼린 2의 뮤테인 - Google Patents

주어진 표적에 대한 친화성을 갖는 인간의 리포칼린 2의 뮤테인 Download PDF

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Abstract

본 발명은 뮤테인의 생성을 위한 신규한 라이브러리 및 인간의 리포칼린 2(Lcn2, hNGAL)로부터 유래한 신규한 뮤테인에 관한 것이며 탐지할 수 있는 친화성을 갖는 주어진 표적을 바인드하는 관련된 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 뮤테인과 같은 대응 핵산 분자를 암호화하고 그것의 생산을 위한 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 뮤테인 같이 알츠하이머 병 내의 아밀로이드 베타 펩타이드와 같은 천연의 생체분자의 종류를 고갈시키거나 바인드 하는 역할을 하거나 종양 신생혈관과 관련된 피브로넥틴 엑스트라 도메인-B(extra-domainB)을 표적으로 하는 역할을 한다.

Description

주어진 표적에 대한 친화성을 갖는 인간의 리포칼린 2의 뮤테인{Muteins of human lipocalin 2(Lcn2, hNGAL) with affinity for a given target}
본 발명은 뮤테인의 생성을 위한 신규한 라이브러리 및 인간의 리포칼린 2(Lcn2, hNGAL) 및 탐지할 수 있는 친화성을 갖는 주어진 표적을 바인딩한 연관된 단백질로부터 유래한 신규한 뮤테인에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 뮤테인을 암호화하는 대응하는 핵산 분자 및 이들을 생산하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 뮤테인을 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 리포칼린 뮤테인을 포함하는 약학 조성물뿐만 아니라 뮤테인의 다양한 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 Lcn2의 뮤테인은 여러 질병 분야에 있어서 치료 및/또는 치료 시약으로서 가능성을 보인다. 예를 들면, Lcn2의 뮤테인은 자연적 생체 분자의 병적인 형태를 결속시키고 감소시키기 위해 사용될 수 있고, 다른 실시예에서는 종양 신생 혈관과 연관된 피브로넥틴 엑스트라-도메인 B와 같은 질병 관련 세포 표면 마커에 다양한 레이블(label) 또는 독소의 특이적 표적을 위해 적용될 수 있다.
알츠하이머병(AD)은 노인 인구에 있어서 치매의 가장 흔한 병이다. 알츠하이머와 연관된 것은 아밀로이드 베타 펩타이드(Aβ)를 포함한 잠재적인 신경독성의, 40-42 잔기를 초래하는 아밀로이드 전구체 단백질의 결함적인 과정이다. 올리고머 및 긴 원섬유에 대한 Aβ의 후속 집합은 질병의 과정에 있어서 중추적인 역할을 하고 노인기의 반점을 형성한다(Haass and Selkoe (2007) Nat. Rev. Mol . Cell. Biol. 8, 101-112). 알츠하이머병의 중요성이 증대되고 있음에도 불구하고 이런 치매를 예방하거나 치료 또는 속도를 줄이기 위한 효과적인 치료법은 여전히 충분치 않다.
현재 항-아밀로이드는 (i) Aβ형성의 방지, (ii) 이의 집합의 차단, (iii) 뇌에서 수용성 Aβ 레벨의 감소, 및 (iv) 존재하는 아밀로이드 반점의 분해를 목표로 접근하고 있다. 지금까지, 면역요법은, AD 환자의 능동 및 수동의 모든 면역법을 포함하고 있는, 이 분야에서 가장 전망이 있다(Dodel et al. (2003) Lancet Neurology 2, 215-220; Lichtlen and Mohajeri (2007) J. Neurochem . 104, 859-874; Brody and Holtzmann (2008) Annu . Rev. Neurosci . 31, 175-193). 그러나, AD 환자의 능동 면역법을 갖는 최근 임상 시험은 환자의 6%가 수막뇌염을 일으켜 중단되었다. 이런 Fc-매개한 면역학의 기능의 잠재성 있는 부작용 때문에 앤티칼린(anticalins)과 같은 비-Ig 결합제를 대안으로 제공한다. 아밀로이드 베타에 대한 특이성을 갖는 애피바디(affibody) 입자의 인식은 설계된 비-Ig 결합 단백질의 가능성을 입증하기 위한 하나의 예이다(Grwall et al (2007) J. Biotechnol. 128, 162-183; Hoyer et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 5099-5104).
그러나, 애피바디(affibodies)의 박테리아의 기원은 인간 환자에게 면역형성을 갖는 문제점을 초래할 수 있다.
피브로넥틴(FN)은 세포의 부착, 이동, 증식 및 분화에 있어서 필수적인 역할을 한다. 피브로넥틴은 크고, 모듈의, 타입 I, II, 및 III의 다중의 도메인을 포함하는 이합체의 글리코단백질이다. FNIII7 및 FNIII8 도메인 사이에 통합된 엑스트라-도메인 B(ED-B)와 같은 FN의 대안의 스플라이스(splice) 변종은 특정-조직 및 발전기-종속적인 방식으로 발현된다(Zardi et al. (1987) EMBO J 6, 2337-2342).
ED-B는 상처 치유 및 종양의 혈관 신생 시기를 제외하고 정상적인 성인 조직에서는 존재하지 않는다. 결과적으로, 피브로넥틴을 함유한 ED-B는 신혈관 형성을 불러일으키거나 비정상적인 혈관형성을 겪는 다양한 종양 타입에서 풍부하게 발현된다. 혈관형성에서 ED-B의 실질적 생물학적 기능은 파악하기 힘들더라도 ED-B의 FN으로의 결합은 세포의 암화(tumorgenesis)를 위한 우수한 마커 역할을 한다. 일반적으로, 악성 조직과 건강한 장기 사이의 구별은 증가된 국소적 약물 농도를 야기한 종양 조직에 직접적으로 선택적 약물의 표적화와 같은 유리한 치료전략이다.
ED-B를 특별하게 감지하고 표적하기 위해서, 재조합 항체 단편을 파지 디스플레이 항체 기술을 사용하여 생산하였다. 분리된 항체 조각 중에 하나는 L19 단일 체인(single chain) Fv 이었다(Carnemolla et al. (1996) Int . J. Cancer 68, 397-405; Ebbinghaus et al. (2004) Curr . Pharm . Des. 10, 1537-1549). 효과적인 세포독성 물질과 함께 L19에 의한 ED-B는 근래에 암 치료 및 진단을 위한 전망을 보여준다(Schliemann and Neri (2007) Biochim . Biophys . Acta 1776 , 175-192; Kaspar et al. (2006) Int. J. Cancer 118, 1331-1339).
그러나, L19 scFv 단편은 올리고머화되는 경향이 있다.
알츠하이머 병의 치료 및 종양의 진단 또는 치료에 있어 언급된 존재하는 문제점 때문에, 본 발명의 목적은 대안적인 방법 및 알츠하이머 병의 치료 및 종양의 진단 또는 치료에 사용될 수 있는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 리포칼린 2로부터 유래한 높은 안정성과 보다 작은 크기로 인한 매력적인 화합물인 단백질의 특이 뮤테인을 발견하였다. 본 발명자들은 ED-B에 있어서 실시예에서 높은 친화성 및 특이성을 보이고 있는 특이 위치에서 돌연변이를 갖는 리포칼린 2 뮤테인의 특이 그룹을 확인했다. 그런 Lcn2 뮤테인은 높은 민감성을 갖는 인간 세포의 피브로넥틴을 함유한 특이적으로 ED-B를 인식하고 따라서 종양 질환의 치료 및 치료에 있어서 치료 시약으로서 전망을 보인다.
또한, 본 발명자들은 Aβ 펩타이드를 위해서 높은 친화성 및 특이성을 갖는 특이 Lcn2 뮤테인을 확인할 수 있다. 그런 Lcn2 뮤테인은 추가 개선 및 수정 후에 알츠하이머병을 치료하기 위해서 치료제로서 Aβ집합을 억제할 수도 있고 따라서 전망을 보인다.
본 발명은 뮤테인의 생성을 위한 신규한 라이브러리 및 인간의 리포칼린 2(Lcn2, hNGAL)로부터 유래한 신규한 뮤테인에 관한 것이며 탐지할 수 있는 친화성을 갖는 주어진 표적을 바인드하는 관련된 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 뮤테인과 같은 대응 핵산 분자를 암호화하고 그것의 생산을 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 생성될 수 있는 Lcn2 뮤테인의 특별한 실익 때문에 다양한 응용 또는 실험이 가능하다.
도 1은 성숙한 Lcn2의 아미노산 서열 내 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, 및 134(underlined and numbered)의 20 아미노산 위치의 동시의 무작위 돌연변이유발을 위한 PCR assembly 전략을 나타낸다.
도 2는 합성 Lcn2 유전자(도 1에서 개시된 것처럼 두 BstXI 제한 부위 측면에 단지 중앙의 카세트가 배치되어 있다)의 뉴클레오타이드 서열를 나타낸다.
도 3은 E. coli 발현 이후의 재조합 Aβ융합 단백질 Trx- Aβ28(A) 및 MBP- Aβ40(B)의 SEC 용출 프로파일을 보여준다.
도 4는 Lcn2 뮤테인 H1-G1, S1-A4, 및 US7(A)의 SEC 용출 프로파일의 오버레이 및 15% SDS-PAGE(B)를 통한 정제된 단백질의 분석을 나타낸다.
도 5는 다른 비오틴과 결합한 Aβ표적을 갖는 캡처 ELISAs 내 Lcn2 뮤테인 H1-G1, S1-A4, 및 US7의 바인드 활성을 나타낸다.
도 6은 direct ELISA 내에서 Lcn2 뮤테인 S1-A4 및 US7의 바인딩 활성을 나타낸다.
도 7은 competitive ELISA내 Lcn2 뮤테인 S1-A4(A) 및 US7 (B)의 바인딩 활성을 나타낸다.
도 8은 10 ml/min의 유속에서 Biacore 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 S1-A4(A) 및 US7(B)의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다.
도 9는 티오플라빈 T 집계 분석으로 측정된 Lcn2 뮤테인 S1-A4 및 US7의 기능적 활성을 나타낸다.
도 10은 Coomassie 밝은 파랑으로 염색 후, 이온 교환 크로마토그래피 후, 재조합 ED-B(lane 1), FN7B8(lane 2), 및 FN789(lane 3)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 11은 Coomassie 밝은 파랑으로 염색 후, Strep-tag II 친화성 정화 후, Lcn2 뮤테인 N7A(lane 1), N7E(lane 2), N9B(lane 3), 및 N10D(lane 4)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다.
도 12는 ELISA의 바인딩 활성을 묘사한 것이다.
도 13은 Biacore 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 N9B의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다.
도 14는 Biacore 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 N7E의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다.
도 15는 Biacore 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 N7A의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다.
도 16은 Biacore 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 N10D의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다.
도 17은 Lcn2를 갖는 S1-A4 (서열번호 39), US-7 (서열번호 41), H1-G1 (서열번호 43), N7A (서열번호 20), N7E (서열번호 22), N9B (서열번호 24) 및 N10D (서열번호 26)로 지정된 인간 Lcn2 뮤테인의 서열 정열을 나타낸다.
도 18은 Lcn2 뮤테인 H1GA 및 H1GV(A)의 SEC 용출 프로파일의 오버레이 및 15% SDS-PAGE(B)를 통한 정제된 단백질의 분석을 나타낸다.
도 19는 비오틴과 결합한 Aβ 표적 Aβ40(A) 및 Trx-Aβ28(B)를 갖는 capture ELISAs 내의 Lcn2 뮤테인 H1GA, H1GV, 및 H1-G1의 바인딩 활성을 나타낸다.
도 20은 20㎕/min의 유속에서 Biacore X 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 H1GA(A) 및 H1GV(B)의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다.
도 21은 높은 농도에서 측정된 기록에 있어서 확장된 분해 시간을 사용하여 고정된 Aβ40은 Biacore T100 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 H1GA의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다.
도 22 (A)는 티오플라빈 T 집계 분석에서 테스트한 Lcn2 뮤테인 H1GA의 기능적 활성을 보여준다. 도 22(B)는 반대로, 음성 대조군으로서 BSA 또는 Lcn2도 아닌 몰 양은 Aβ40 집합에 억제 효과에 관한 것이다.
도 23은 Lcn2 뮤테인 H1GA 및 H1GV을 위한 표면 플라스몬 공명뿐만 아니라 다른 ELISA setups 내 결정된 KD 값의 요약에 관한 것이다.
도 24는 Lcn2(서열번호 44)를 갖는 Lcn2 뮤테인 S1-A4(서열번호 39), US7(서열번호 41), H1-G1(서열번호 43), H1GA(서열번호 50), H1GV(서열번호 52), N7A(서열번호 20), N7E(서열번호 22), N9B(서열번호 24), 및 N10D (서열번호 26)의 서열 정렬에 관한 것이다.
도 25는 전구체 H1-G1 (서열번호 43) 및 wt Lcn2(서열번호 44)를 갖는 뮤테인 H1GA(서열번호 50) 및 H1GV(서열번호 52)의 상호 서열 정렬에 관한 것이다.
도 26은 ELISA 내에서 FN7B8을 위한 Lcn2 변종 N7E의 특이 바인딩 활성을 나타낸다.
도 27은 Biacore X로 측정한 Lcn2 변종 N7A (A), N7E (B), N9B (C) 및 N10D (D)의 운동 실시간 분석을 나타낸 것이다.
도 28는 Lcn2 변종 N7A (A), N10D (B), N9B (C) 및 N7E (D)의 사이즈 배제 크로마토그래피의 분석을 나타낸 것이다.
본 발명은 일반적으로 주어진 표적을 위한 높은 친화성 및 특이성을 갖는 본 발명의 뮤테인과 같은 뮤테인의 효율적인 생성을 허락하는 인간 Lcn2 scaffold에 기초한 새로운 무작위 라이브러리를 개시한다. 예를 들면 이런 라이브러리는 또는 이의 단면은 도 1 및 2에 나타냈다.
hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, 및 134번의 서열 위치 중 어느 것을 위해 암호화하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 뉴클레오타이드 삼중자의 한 측면에서 무작위 돌연변이유발은 뉴클레오타이드 삼중자의 부분 집합에 의해서 이런 위치에서 치환을 가능하게 함으로써 실행되었다. 뉴클레오타이드 삼중자의 부분 집합은 이에 제한되는 것은 아니나, (a) 뉴클레오타이드 NNN(만약 N = A, T, G, C 이면, 이는 4x4x4=64 가능한 삼중자를 의미함)에 의해 암호화되는 64의 가능한 삼중자 미만, (b) 뉴클레오타이드 NNK 또는 NNS에 의해 암호화되는 32의 가능한 삼중자 미만, (c) 모든 20의 자연적 단백질을 만드는 아미노산(proteinogenic amino acids)을 암호화하는 필요한 삼중자 미만을 언급할 수 있다. 다른 실시예에서는, 시스테인을 위한 뉴클레오타이드 삼중자 코딩은 돌연변이유발 동안에 치환을 위해서 사용되지 않는다. 이는 돌연변이유발은 뮤테인이 돌연변이 유발된 서열이 아닌 오리지널에 이미 포함되지 않은 새로운 시스테인을 운반하도록 이끌지 않음을 의미한다. 따라서, 이런 측면에서 어떻게 뉴클레오타이드 삼중자가 이 문단(또한 실시예 1 및 도 2를 참조)에서 지정된 돌연변이가 유발되는 위치 내로 도입되는 것과 같이 보이는 것처럼 지정되는 것이다.
따라서, 본 발명에 있어서, 첫 번째 측면은 인간 리포칼린 2(Lcn2; 인간 호중구젤라티나아제-연관된 리포칼린, hNGAL, 또는 siderocalin로 또한 알려진)로부터 유래한 뮤테인을 생성하는 방법에 관한 것이다. 이런 방법으로 얻은 뮤테인은 측정할 수 있는 친화성를 갖는 비-천연 표적에 결합할 수 있다. 상기 방법은 하나 이상의 뮤테인 핵산 분자를 결과로 하는 인간 리포칼린 2의 선형 폴리펩타이드 서열의 96, 100, 및 106번의 서열 위치에 대응하는 서열 위치 중 적어도 어느 하나를 위해 뉴클레오타이드 삼중자를 코딩하는 돌연변이유발에 인간 리포칼린 2(Lcn2, hNGAL)를 암호화하는 종속하는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명에 있어서, “인간 리포칼린 2” 또는 "인간 호중구젤라티나아제-연관된 리포칼린(hNGAL)"는 약 60% 이상의 아미노산 서열 상동성 또는 서열 유사성(identity)을 갖는 다른 종으로부터 이미 확인되었거나 아직 분리되지 않은 구조적 동족성을 포함한다. hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열의 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 및 138의 서열 위치에 대응하는 어느 서열 위치에서도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17 변이된 아미노산 잔기를 포함하는 상기에서 개시된 이런 인간 리포칼린이 바람직하다.
본 발명에 있어서, “상동성”은 일반적인 의미를 갖고 서로 비교되는 두 개의 단백질의 선형 아미노산 서열 내 동등한 위치에서 보존성의 대체물로 간주되는 아미노산(실시예에 있어서, 아스파르트산염 잔기에 의해서 글루타민산염 잔기의 교환)뿐만 아니라, 동등한 아미노산을 포함한다. 본 발명에 있어서, “서열 동일성” 또는 “동일성”은 이런 두 서열에서 더 긴 잔기의 수에 관하여 한 쌍의 방식으로(pair-wise) 동일한 잔기-문제의 서열를 갖는 본 발명의 폴리펩타이드의 서열의 상동성 조정에 따라-의 백분율을 의미한다.
서열 상동성 또는 서열 동일성의 백분율을 프로그램 BLASTP, version blastp 2.2.5 (November 16, 2002; cf. Altschul, S. F. et al. (1997) Nucl . Acids Res. 25, 3389-3402)을 사용하여 결정하였다. 상동성의 백분율은 쌍별 비교에서 참조로서 인간 리포칼린 2를 사용하여 프로펩타이드 서열를 포함하는 전체의 폴리펩타이드 서열(매트릭스: BLOSUM 62; 갭 코스트: 11.1; 10- 3로 cutoff 값의 설정)의 조정에 기초한다. 조정을 위한 프로그램에 의해서 선택된 총 아미노산의 수로 나누어진 BLASTP 프로그램의 산출물 내 결과로서 "양성"(상응하는 아미노산)의 수의 백분율로서 계산된다. 선택된 아미노산의 총 수는 인간 리포칼린 2의 길이에 따라 다를 수 있는 연관성이 알려졌다.
본 발명에서 사용된 인간 리포칼린 2가 아닌 단백질인 경우, 인간 리포칼린 2를 위하여 주어진 변이된 서열의 위치의 정의는 공지된 서열 조정의 도움을 갖는 다른 리포칼린 또는 당업자에 의해 가능한 조정 방법에 할당될 수 있다. 실시예에 있어서, 서열의 조정은 Redl, B. (2000) Biochim . Biophys . Acta 1482, 241-248의 도 1 내의 하나와 같이 개시된 조정을 사용하여 WO 99/16873 (도 3 참조)내에 설명된 것과 같이 실행되었다. 만약 리포칼린의 삼차원 구조가 가능하다면 또한 구조적 중합은 본 발명에 있어서 돌연변이유발에 종속되는 서열 위치의 결정을 위해서 사용될 수 있다. 또한, 다차원 핵 자성 공명법과 같은 다른 구조적 분석의 방법은 본 목적에 적용될 수 있다.
또한, 인간 리포칼린 2의 동족체는 인간 리포칼린 2 자체의 뮤테인 단백질일 수 있고, 아미노산 치환체는 본 발명에서 선택된 부위가 아닌 다른 부위에 도입된다. 예를 들면, 이런 뮤테인은 단백질의 용해도 또는 안정성을 증가시키기 위해서 인간 리포칼린 2의 야생형의 서열과 비교하여 β-배럴(β-barrel)의 용매 노출된 표면의 위치에서 변이된 단백질일 수 있다.
일반적으로 "인간 리포칼린 2"는 인간 리포칼린 2에 연관된 서열 상동성 또는 60%, 70% 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상의 유사성을 갖는 서열를 갖는 모든 단백질을 포함한다. 상기에서 개시된 이런 인간 리포칼린은 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열의 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 및 138의 서열 위치에 대응하는 어느 서열 위치에서든 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17 변이된 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 인간 리포칼린 2(즉, 인간 리포칼린 뮤테인 또는 변이된 인간 리포칼린, 바람직하게는 변이된 성숙한 hNGAL, 여기서 상기 성숙한 hNGAL는 SWISS-PROT Data Bank Accession Number P80188을 가지고 있고, 더욱 바람직하게는 상기 성숙한 hNGAL는 서열번호 44에서 보여진 아미노산 서열를 가지고 있다.)로부터 유래된 뮤테인을 제공한다. 이 뮤테인은 인간 Lcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 96, 100 및 106의 서열 위치에 대응하는 어느 서열 위치에서든 적어도 하나 또는 두 개의 변이된 아미노산 잔기를 포함한다. 그리고 여기서 뮤테인은 탐지할 수 있는 친화성를 갖는 주어진 비-천연 표적을 바인드한다.
본 발명의 명세서에서 "뮤테인", "변이된" 본체 (단백질 또는 핵산이던 간에) 또는 "돌연변이"는 자연적으로 발생하는 (야생형) 핵산 또는 단백질 "참조" 비계(scaffold)와 비교하여 각각 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 변화, 제거 또는 삽입을 의미한다. 바람직하게는, 변하고, 제거되고 또는 삽입된 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 25, 30, 35, 40, 45 또는 50과 같이 그 이상이다.
본 발명의 명세서에서 "인간 호중구 젤라티나아제-연관된 리포칼린" 또는 "hNGAL" 또는 "리포칼린 2" 또는 "Lcn2"는 SWISS-PROT Data Bank Accession Number P80188 (여기서 예는 서열번호44)를 갖는 성숙한 hNGAL를 의미한다.
본 발명의 명세서에서, 본 발명은 이에 제한되지 않으나, 펩타이드, 단백질, 단편 또는 단백질의 도메인 또는 작은 유기 분자를 포함할 수 있는 미리-정의된 표적에 충분하게 아핀(affine) 결합하는 것을 갖는 뮤테인을 제공하는 상기에서 개시된 하나 이상의 3 서열 위치에서 돌연변이유발에 종속하는 인간 리포칼린 2, 쥐 α2-마이크로글로불린-관련된 단백질(A2m) 및 마우스24p3/우테로칼린(uterocalin) (24p3)의 놀라운 결과물에 기초한다.
주어진 표적은 어떤 원하는 비-천연 표적/리간드일 수 있다. 일례로, "비-천연 리간드"는 생리적 조건 하에 천연 그대로의 성숙한 hNGAL에 결합되지 않은 화합물을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 비-천연 표적을 위해 사용된 "유기 분자" 또는 "작은 유기 분자"는 바람직하게 7개 또는 12개 이상의 회전가능한 탄소 결합이 아닌 적어도 두 개의 탄소 원자, 100 내지 2000 Dalton 사이의 분자량, 바람직하게는 100 내지 1000 Dalton 사이의 분자량을 갖고 선택적으로 1개 또는 2개의 금속 원자를 포함하는 유기 분자를 의미한다.
본 발명의 명세서에서 비-천연 표적을 위해 사용된 "펩타이드"는 디펩타이드 또는 2 내지 45개의 아미노산을 갖는 올리고 펩타이드를 의미한다. 일례로, 펩타이드는 2-40, 2-35, 2-30, 2-25, 2-20, 2-15 또는 2-10의 아미노산 잔기를 갖는다. 펩타이드는 자연적으로 발생하거나 합성의 펩타이드일 수 있고 D-아미노산 -20개의 자연적으로 발생하는 L-아미노산 이외에-, 비자연적으로 발생하는 아미노산 및 아미노산 유사형을 포함할 수 있다. 일례로, 펩타이드는 아밀로이드 베타 펩타이드(Abeta 또는 Aβ)이다. 다른 예로, 아밀로이드 베타 펩타이드는 Aβ40 펩타이드 또는 Aβ42 펩타이드이다.
일례로, 작은 유기 분자는 면역학적 합텐의 특징을 보이는 화합물이다.
일례로, 단백질이 피브로넥틴 또는 EB-도메인 또는 EB-도메인의 단편과 같은 이의 도메인인 비-천연 표적이다.
본 발명의 인간 리포칼린 2 뮤테인은 변이된 아미노산 서열 위치 바깥쪽 야생형(자연적) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한편, 본 발명에서 개시한 리포칼린 뮤테인은 돌연변이가 뮤테인의 바인딩 활성 및 폴딩을 방해하지 않는 한 돌연변이유발이 쉬운 서열 위치의 외부의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 이런 돌연변이는 확립된 기준 방법을 사용하여 DNA level에 의해 매우 쉽게 달성될 수 있다(Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2ndEd.,Cold Spring Harbor aboratory Press,ColdSpringHarbor,NY). 아미노산 서열의 가능한 변화는 아미노산 대체물뿐만 아니라 삽입 또는 삭제이다. 이런 대체는 보존성일 수 있고, 예를 들면, 아미노산 잔기가 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 바뀐다. 보존성의 대체물의 예로는 다음의 그룹으로부터 중의 대체물이다: 1) 알라닌, 세린, 트레오닌; 2) 아스파르트산 및 글루탐산; 3) 아스파라긴 및 글루타민; 4) 아르기린 및 라이신; 5) 메티오닌 이소 류신, 류신, 및 발린, 및 6) 티로신 페닐알라닌, 및 트립토판. 한편, 아미노산 서열 내 비-보존성의 변화를 도입하는 것은 또한 가능하다. 게다가, 단일 아미노산 자기의 교체 대신에, 이런 제거 또는 삽입이 안정하게 접힌/기능적 뮤테인의 결과를 가져오는 한 인간 리포칼린 2의 일차 구조에 하나 이상의 지속적인 아미노산을 삽입하거나 제거하기 위하는 것은 가능하다.
이런 아미노산 서열의 변형은 특정 제한 효소를 위한 절단부위를 통합함으로써 변이된 리포칼린 유전자 또는 이의 부분의 서브-클로닝의 단순화룰 위해서 단일 아미노산 부위의 직접적인 돌연변이유발을 포함한다. 게다가, 이런 돌연변이의 주어진 표적을 위해서 리포칼린 뮤테인의 친화성을 추가적으로 개선시키기 위해서 통합될 수 있다. 더욱이, 돌연변이는 필요하다면, 집합 경향을 줄이기 위해서 또는 폴딩 안정성, 혈청 안정성, 단백질 저항 또는 물의 용해도를 개선시키기 위한 것과 같이 뮤테인의 특정 특성을 조정하기 위새서 도입될 수 있다. 예를 들어, 자연적으로 발생하는 시스테인 잔기는 다른 아미노산에 대해 이황화 결합의 형성을 막기 위해서 변이될 수 있다. 그러나, 새로운 활성 그룹을 도입하기 위해서 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG), 히드록시에틸 전분(HES), 비오틴, 펩타이드 또는 단백질, 또는 비자연적으로 발생하는 이황화 결합의 형성을 위한 것과 같은 다른 화합물의 접합을 위해서 의도적으로 다른 아미노산 서열 위치를 시스테인으로 변형하는 것도 가능하다. 시스테인 잔기를 인간 리포칼린 2 뮤테인의 아미노산으로 도입을 위해서 이런 뮤테인의 전형적인 가능성은 hNGAL의 야생형의 서열의 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 또는 158번의 서열 위치에 대응하는 서열의 적어도 하나의 시스테인 잔기의 도입을 포함한다. 4, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 및/또는 158의 아미노산 위치의 어떤 측면에서의 생성된 티올 부분은 예를 들면, 각각의 인간 리포칼린 2 뮤테인의 혈청 반감기를 증가시키기 위해서 PEGylate 또는 HESylate 뮤테인으로 사용될 수 있다.
일례로, 본 발명의 뮤테인은 인간 리포칼린 2의 선형 폴리펩타이드 서열의 96, 100 및 106의 서열 위치에 대응하는 적어도 서열 위치의 2 또는 모든 3의 어느 부위에서 변이된 아미노산 잔기를 포함한다.
다른 실시예에서, 뮤테인은 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열의 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 및 138의 서열 위치에 대응하는 서열 위치 중 하나에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17의 변이된 아미노산 잔기를 포함한다. 다른 실시예에서, 뮤테인은 적어도 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열의 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 및 138의 서열 위치 중 하나에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 변이된 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 뮤테인은 인간 리포칼린 2의 선형 폴리펩타이드 서열의 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 및 138의 서열 위치 중 하나에서 18, 19 또는 20 변이된 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 일례로 뮤테인은 상기 나열된 서열 위치의 10, 14, 15, 20, 22, 24, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35 또는 모든 45의 적어도 어디에서 변이된 아미노산 잔기를 포함한다.
Aβ40 펩타이드 또는 Aβ42 펩타이드와 같은 아밀로이드 베타 펩타이드에 결합한 본 발명의 뮤테인은 도 17(Lcn2)의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 아미노산 대체물에서 증명된 성숙한 인간 리포칼린 2 야생형의 아미노산 서열에 관해서 포함할 수 있고, 아미노산 대체물은 이에 제한되는 것은 아니나, Leu36 → Val 또는 Cys; Ala40 → Tyr 또는 Lys 또는 Val; Ile41 → Thr 또는 Ser 또는 Leu; Gln49 → Leu 또는 Trp; Leu70 → Gly; Arg72 → Gly 또는 Asp; Lys73 → Leu 또는 Thr 또는 Asp ; Asp77 → Asn 또는 His 또는 Leu; Trp79 → Lys; Asn96 → Ile 또는 Arg; Tyr100 → Gln 또는 Arg 또는 Glu; Leu103 → Met 또는 Arg 또는 Gly; Tyr106 → Tyr 또는 Ala 또는 Trp; Lys125 → Thr 또는 Val 또는 Glu; Ser127 → Gly 또는 Gln 또는 Ala; Tyr132 → Met 또는 Ser 또는 Thr; 및 Lys134 → Asn을 포함한다. 이런 뮤테인은 생체 내 또는 시험관 내에서 Aβ 집합을 줄일 수 있다. 본 발명에서 개시된 뮤테인은 결합되고, Aβ의, 바람직하게는 Aβ40, 더욱 바람직하게는 실시예 11(바람직하게는 뮤테인: Aβ40의 비율은 1:10)에서 지정된 분석 조건 하에서의 집합을 억제하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명은 뮤테인 US7과 비교해 볼 때 비슷한 생물학적 기능을 갖는 상기에서 개시한 뮤테인과 관련된다. “비슷한 생물학적 기능”은 이런 뮤테인이 결합할 수 있고 Aβ를, 예를 들어 실시예 11(바람직하게는 뮤테인: Aβ40의 비율은 1:10)에서 규정된 것과 동일하거나 동일시 되는 조건 하에서 약 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 2% 또는 1% 이상이 아닌 US7에 관해서 집합 억제 활성의 편차를 갖는 바람직하게는 Aβ40를 저해한다. 또한, 본 발명은 알츠하이머 병과 같은 퇴행성 신경 질환의 치료 또는 예방의 용도를 위한 뮤테인에 관한 것이다.
일례로, Aβ40 펩타이드 또는 Aβ42 펩타이드와 같은 아밀로이드 베타 펩타이드에 결합한 본 발명의 뮤테인은 다음의 아미노산 대체물을 포함한다. Leu36 → Val; Ala40 → Tyr; Ile41 → Thr; Gln49 → Leu; Leu70 → Gly; Lys73 → Leu; Asp77 → Asn; Trp79 → Lys; Asn96 → Ile; Tyr100 → Gln; Leu103 → Met; Lys125 → Thr; Ser127 → Gly; Tyr132 → Met; 및 Lys134 → Asn. 아미노산 대체물과 같은 것을 포함하는 뮤테인의 예는 도 17(서열번호 39)에서 증명된 S1-A4이다.
또 다른 실시예에서, Aβ40 펩타이드 또는 Aβ42 펩타이드와 같은 아밀로이드 베타 펩타이드에 결합한 본 발명의 뮤테인은 다음의 아미노산 대체물을 포함한다. Leu36 → Val; Ala40 → Lys; Ile41 → Ser; Gln49 → Trp; Leu70 → Gly; Arg72 → Gly; Lys73 → Thr; Asp77 → His; Trp79 → Lys; Asn96 → Arg; Tyr100 → Arg; Leu103 → Arg; Tyr106 → Ala; Lys125 → Val; Ser127 → Gln; Tyr132 → Ser; 및 Lys134 → Asn. 아미노산 대체물과 같은 것을 포함하는 뮤테인의 예는 도 17(서열번호 41)에서 증명된 US-7이다.
본 발명은 변이된 성숙한 hNGAL 리포칼린이 야생형 hNGAL 하나 이상의 변이된 아미노산의 선형 폴리펩타이드 서열의 36, 40, 41, 49, 70, 72, 73, 77, 79, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, 134번의 서열 위치에 대응하는 위치를 포함하는 것을 예상한다(as deposited in SWISS-PROT Data Bank under Accession Number P80188, 바람직하게는 서열번호 40을 갖는 아미노산 서열을 갖음).
다른 실시예에서, Aβ40 펩타이드 또는 Aβ42 펩타이드와 같은 아밀로이드 베타 펩타이드에 결합한 본 발명의 뮤테인은 다음의 아미노산 대체물을 포함한다. Leu36 → Cys; Ala40 → Val; Ile41 → Leu; Gln49 → Leu; Leu70 → Gly; Arg72 → Asp; Lys73 → Asp; Asp77 → Leu; Trp79 → Lys; Asn96 → Arg; Tyr100 → Glu; Leu103 → Gly; Tyr106 → Trp; Lys125 → Glu; Ser127 → Ala; Tyr132 → Thr; 및 Lys134 → Asn. 아미노산 대체물과 같은 것을 포함하는 뮤테인의 예는 도 17(서열번호 43)에서 증명된 H1-G1이다.
다른 실시예에서, Aβ40 펩타이드 또는 Aβ42 펩타이드와 같은 아밀로이드 베타 펩타이드에 결합한 본 발명의 뮤테인은 다음의 아미노산 대체물을 포함한다. Leu36 → Ala; Ala40 → Val; Ile41 → Leu; Gln49 → Leu; Leu70 → Gly; Arg72 → Asp; Lys73 → Asp; Asp77 → Leu; Trp79 → Lys; Asn96 → Arg; Tyr100 → Glu; Leu103 → Gly; Tyr106 → Trp; Lys125 → Glu; Ser127 → Ala; Tyr132 → Thr; 및 Lys134 → Asn. 아미노산 대체물과 같은 것을 포함하는 뮤테인의 예는 서열번호 50에서 증명된 H1GA 이다.
상기에서 개시된 뮤테인은 결합되고, Aβ의, 바람직하게는 Aβ40, 더욱 바람직하게는 실시예 23(바람직하게는 Aβ40: H1GA의 비율은 10:2)에서 지정된 분석 조건 하에서 집합을 억제하는 것이 바람직하다. 또한 뮤테인 H1GA과 비교해 볼 때 비슷한 생물학적 기능을 갖는 상기에서 개시한 뮤테인과 관련된다. “비슷한 생물학적 기능”은 이런 뮤테인이 결합할 수 있고 Aβ를, 예를 들어 실시예 23(바람직하게는 Aβ40: H1GA의 비율은 10:2)에서 규정된 것과 동일하거나 동일시되는 조건 하에서 약 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 2% 또는 1% 이상이 아닌 H1GA에 관해서 집합 억제 활성의 편차를 갖는 바람직하게는 Aβ40을 저해한다. 또한, 본 발명은 알츠하이머 병과 같은 퇴행성 신경 질환의 치료 또는 예방의 용도를 위한 뮤테인에 관한 것이다.
다른 실시예에서는, Aβ40 펩타이드 또는 Aβ42 펩타이드와 같은 아밀로이드 베타 펩타이드에 결합된 본 발명의 뮤테인은 다음의 아미노산 대체물을 포함한다. Leu36 → Val; Ala40 → Val; Ile41 → Leu; Gln49 → Leu; Leu70 → Gly; Arg72 → Asp; Lys73 → Asp; Asp77 → Leu; Trp79 → Lys; Asn96 → Arg; Tyr100 → Glu; Leu103 → Gly; Tyr106 → Trp; Lys125 → Glu; Ser127 → Ala; Tyr132 → Thr; 및 Lys134 → Asn. 아미노산 대체물과 같은 것을 포함하는 뮤테인의 예는 서열번호 52에서 증명된 H1GV이다.
상기에서 개시된 뮤테인은 분석 조건 하에서 실시예 21시에서 지정된 것처럼 Aβ40에 결합되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 상기에서 개시된 뮤테인 H1GV과 비교했을 때 비슷한 생물학적 기능을 갖는 뮤테인과 관련된 것이다. “비슷한 생물학적 기능”은 이런 뮤테인이 Aβ에, 예를 들어 실시예 21에서 규정된 것과 동일하거나 동일시되는 조건 하에서 약 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2,5%, 2% 또는 1% 이상이 아닌 H1GV에 관해서 집합 억제 활성의 편차를 갖는 바람직하게는 Aβ40에 결합 될 수 있다. 또한, 본 발명은 알츠하이머 병과 같은 퇴행성 신경 질환의 치료 또는 예방의 용도를 위한 뮤테인에 관한 것이다.
다른 실시예에서는, 엑스트라- 도메인 B 또는 이의 단편에 결합된 본 발명의 뮤테인은 다음의 아미노산 대체물을 포함한다. Leu36 → Lys; Ala40 → His; Ile41 → Asp; Gln49 → Arg; Tyr52 → Gln; Ser68 → Asn; Leu70 → Arg; Arg72 → Val; Lys73 → His; Asp77 → Asn; Trp79 → Arg; Arg81 → Trp; Tyr100 → Trp; Tyr106 → Trp; Lys125 → Arg; Ser127 → Tyr; Tyr132 → Leu; Lys134 → Glu 및 Ser146 → Asn. 아미노산 대체물과 같은 것을 포함하는 뮤테인의 예는 도 17에서 증명된 N7A이다(서열번호 20).
다른 실시예에서는, 엑스트라- 도메인 B 또는 이의 단편에 결합된 본 발명의 뮤테인은 다음의 아미노산 대체물을 포함한다. Leu36 → Arg; Ala40 → Met; Ile41 → Arg; Gln49 → Ala; Tyr52 → Val; Ser68 → Lys; Leu70 → Met; Arg72 → Gln; Lys73 → Arg; Asp77 → Lys; Trp79 → Met; Arg81 → Asn; Asn96 → Ala; Tyr100 → Pro; Leu103 → Pro; Tyr106 → Thr; Lys125 → His; Ser127 → Phe; 및 Lys134 → His. 아미노산 대체물과 같은 것을 포함하는 뮤테인의 예는 도 17에서 증명된 N9B이다(서열번호 24).
다른 실시예에서는, 엑스트라- 도메인 B 또는 이의 단편에 결합된 본 발명의 뮤테인은 다음의 아미노산 대체물을 포함한다. Leu36→ Ala; Ala40 → Thr; Ile41→ Trp; Gln49 → Tyr; Tyr52 → Gln; Ser68 → Asn; Arg72 → Met; Lys73 → Ser; Asp77 → Arg; Trp79 → Met; Arg81 → His; Asn96 → Ser; Tyr100 → Trp; Tyr106 → Trp; Lys125 → Arg; Ser127 → Tyr; Tyr132 → Phe; 및 Lys134→ Gly. 아미노산 대체물과 같은 것을 포함하는 뮤테인의 예는 도 17에서 증명된 N10D이다(서열번호 22).
다른 실시예에서는, 엑스트라- 도메인 B 또는 이의 단편에 결합된 본 발명의 뮤테인은 다음의 아미노산 대체물을 포함한다. Leu36→ Glu; Ala40→ Ser; Ile41 → Leu; Gln49→ Arg; Leu70 → Arg; Lys73 → Ser; Asp77→ His; Trp79 → Leu; Asn96 → Leu; Tyr100 → Lys; Leu103 → His; Tyr106 → Phe; Lys125 → Thr; Ser127 → Ala; 및 Lys134 →Phe. 아미노산 대체물과 같은 것을 포함하는 뮤테인의 예는 도 16에서 증명된 N7E이다(서열번호 22).
도 17에 참고하여 개시된 상기 뮤테인은 추가적으로 아미노산 대체물을 포함할 수 있다. 뮤테인은 추가적으로 아미노산 대체물을 포함할 수 있고, 이는 이에 제한되는 것은 아니나, Gln28→ His 또는 Cys87→ Ser을 포함할 수 있다. 다른 가능한 아미노산 대체물은 이에 제한되는 것은 아니나, Tyr52→ Gln 또는 Val; Ser68→ Lys 또는Asn; 또는 Arg81→ Trp 또는 Asn 또는 His을 포함할 수 있다.
본 발명의 리포칼린 뮤테인은 탐지할 수 있는 친화성, 예를 들면, 적어도 200 nM의 분해 상수(KD)를 갖는 바람직한 비-천연 표적에 결합할 수 있다. 다른 실시예에서, 뮤테인은 1μM 이하, 또는 100μM 이하, 또는 1μM 이하, 또는 500 nM, 또는 200 nM 이하, 또는 100 nM 이하, 또는 50 nM 이하, 또는 10 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 K D를 갖는 주어진 비-천연 표적에 결합한다. 다른 실시예에서, 리포칼린 뮤테인은 적어도 100, 20, 1 nM 또는 그 이하의 주어진 표적을 위한 분해 상수를 갖는 바람직한 표적에 결합한다. 바람직한 표적의 뮤테인의 바인딩 친화성는 형광 적정, competition ELISA 또는 표면 플라스몬 공명과 같은 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다.
표적을 갖는 복합체 형성이 바인딩 파트너의 농도, 경쟁자의 존재, 버퍼 시스템의 이온 강도 등과 같은 많은 요인에 의존하는 것은 당업자에게 이미 명백하다. 선택 및 농축은 일반적으로 바람직한 표적을 갖는 집합체 내의 리포칼린 뮤테인 가능하게 하는 분리, 상기에서 개시된 분해 상수의 조건 하에서 실행되었다. 그러나, 세척 및 용리 과정은 엄중한 상황을 변화시켜가면서 실행될 수 있다. 운동 특색에 관한 선택은 또한 가능하다. 실시예에 있어서, 선택은 뮤테인을 갖는 표적의 우세 복합체의 형성은 표적으로부터 낮은 분해, 즉 낮은 koff비율을 나타내는 조건하에서 실행될 수 있다. 대안적으로 선택은 뮤테인 및 표적 사이의 복합체의 빠른 즉, 높은 kon비율로 우세 형성의 조건 하에서 실행될 수 있다.
본 발명의 뮤테인은 모노머의 단백질로서 전형적으로 존재한다. 그러나, 또한 창의적인 리포칼린 뮤테인은 자발적인 다이머 또는 올리고머일 수 있다. 안정한 모노머를 형성하는 리포칼린 뮤테인의 용도는 몇몇 응용에 있어서 바람직하게는 예를 들면, 더 빠른 확산 및 더 좋은 조직 침투때문에, 안정한 호모다이머 또는 멀티머로부터 형성된 리포칼린 뮤테인의 용도는 이런 멀티머는 주어진 표적에 증가된 친화성 및/또는 결합 활성을 위해서 제공될 수 있기 때문에 다른 예에서 유리할 수 있다. 또한, 리포칼린 뮤테인의 올리고머의 형성은 더 낮은 분해 속도 또는 연장된 혈청 반감기를 가질 수 있다.
또한, 각각의 뮤테인 및 이의 리간드 사이에서 복합체 형성은 각각의 바인딩 파트너, 경쟁자의 존재, pH 및 사용된 버퍼 시스템의 이온 강도 및 분해 상수 KD(실시예에 있어서, 형광 적정, competition ELISA 또는 표면 플라즈마 공명, 단지 몇 개만 지정)의 결정을 위해서 사용된 실험적 방법 또는 실험적 데이터의 평가를 위해서 사용되는 수학적 알고리즘과 같은 많은 다양한 요인에 의해서 영향을 받고 있다.
따라서, 당업자에게 명백한 KDvalue(각각의 뮤테인 및 이의 표적/리간드 사이에서 복합체 형성의 분해 상수)는 주어진 리간드를 위한 리포칼린 뮤테인의 친화성을 결정하는데 사용되는 특정한 방법 및 실험적 준비에 의존하여 특정 실험의 범위 내에서 변할 수 있다. 이는, 실시예에서, 표면 플라스몬 공명 또는 competition ELISA에 의해서 결정되는 KD값인지 여부에 의존하여 측정된 KD값 또는 허용 오차 범위 내에서 약간의 편차가 있을 수 있음을 의미한다.
일례로, 본 발명에서 개시된 뮤테인은 펜타히스티딘 태그(pentahistidine tag), 헥사히스티딘 태그(hexahistidine tag) 또는 Strep-tag와 같은 N- 또는 C-터미널에 친화성이 있는 태그에 연결될 수 있다. 따라서, 또한, 본 발명의 응용은 이런 태그를 갖춘 모든 명확하고 제네릭한 개시된 뮤테인을 포함한다.
본 발명에서 사용된 리포칼린 뮤테인 단편의 특성과 관련된 “단편”은 예를 들면, N-터미널 및/또는 C-터미널의 적어도 한 개가 부족한, N-터미널 및/또는 C-터미널이 단축된 전체-길이의 성숙한 Lcn2로부터 유래한 단백질 또는 펩타이드에 관련된다. 그런 단편은 성숙한 Lcn2의 일차 서열의 바람직하게 적어도 10, 더욱 바람직하게는 20, 가장 바람직하게는 30 이상의 연속적인 아미노산을 구성하고 성숙한 Lcn2의 면역정량법 내에서 보통 탐지할 수 있다.
또한, 상기 뮤테인은 본 발명의 범위에서 포함되고, 뮤테인의 면역원성과 관련하여 변경되었다.
세포독성 T-세포는 class I의 MHC(major histocompatibility complex) 분자와 연관된 항원제시세포의 세포 표면 위의 펩타이드 항원을 인식한다. MHC 분자에 결합할 수 있는 펩타이드의 능력은 대립형질에 특이적이고 그들의 면역원성에 연관성이 있다. 주어진 단백질의 면역원성을 감소시키기 위해서, 단백질 내의 펩타이드가 주어진 MHC 분자에 결합할 수 있는 가능성을 가지는 것을 예견하는 능력은 매우 가치가 있다. 잠재적인 T-세포 에피토프를 식별하기 위해서 전산의 스레딩 접근(threading approach)을 적용하는 접근들은 MHC class I 분자에 주어진 펩타이드 서열의 바인딩을 예견하기 위해서 이미 개시하고 있다(Altuvia et al. (1995) J.Mol.Biol. 249:244-250).
또한, 그런 접근은 본 발명의 뮤테인 발명에 잠재적인 T-세포 에피토프를 식별하고 뮤테인의 예측된 면역원성에 근거하여 특이 뮤테인의 그 용도 선택에 의존하는데 이용될 수 있다. 이런 T-세포 에피토프를 감소 또는 제거하거나 따라서 면역원성을 최소화하기 위해서, 추가적인 돌연변이유발을 위해서 T-세포 에피토프를 포함하는 것이 예측되어 있는 종속된 펩타이드 영역을 추가적으로 가능하게 할 수 있다. 유전적으로 조작된 항체로부터 양친매성 에피토프의 제거는 개시(Mateo et al. (2000) Hybridoma19(6):463-471)되었고, 본 발명의 뮤테인에 적용될 수 있다.
따라서, 얻은 뮤테인은 최소한의 면역원성을 가질 수 있고, 이는 하기에서 개시하는 치료 및 진단의 응용에 바람직하게 사용될 수 있다.
몇몇의 응용에 있어서, 본 발명의 뮤테인은 접합된 형태로 유용하게 이용할 수 있다. 따라서, 또한 본 발명은 이에 제한되는 것은 아니나, 유기 분자, 레이블 효소, 착색한 레이블, 세포성장억제제, 독소, 빛에 의해 활성을 갖을 수 있으며 광역학 치료 적합한 레이블, 형광 레이블, 방사성의 레이블, 색소생산성 레이블, 발광성의 레이블, 금속 복합체, 콜로이드 골드, 합텐, 디곡시제닌, 비오틴, 화학요법의 금속(chemotherapeutic metal), 또는 단지 몇몇의 연상시키는 실시예에 명명된 화학요법의 금속과 같은 금속을 포함할 수 있는 화합물과 접합되는 리포칼린 뮤테인에 유도된다. 뮤테인은 또한 유기 약물 분자에 접합될 수 있다. 접합은 당 업계에 알려진 기존의 결합 방법을 사용하여 실행될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에서 개시하고 있는 Lcn2 뮤테인을 화학, 물리, 광학, 또는 효소 반응에서 직접적으로 또는 간접적으로 탐지할 수 있는 화합물 또는 신호를 생성시키는 어느 적절한 화학 물질 또는 효소로 레이블하는 것은 가능하다. 물리적 반응을 위한 실시예 및 동시에 광학적 반응/마커는 발광 시 형광을 방출한다. 알칼리 포스타아제, 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase) 또는 β-갈라토시다아제는 색소생산성 반응 제품의 형성을 촉진하는 효소 레이블(동시에 광학 레이블)의 실시예이다. 또한, 일반적으로 항체(독점적으로 면역 글로불린의 Fc 부분 내에서 당 잔기와 함께 사용되는 것을 제외)로서 주로 사용되는 모든 레이블은 본 발명에 있어서의 뮤테인에 접합(conjugation)하기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명의 뮤테인은 또한 어느 적합한 치료상의 활성제 예를 들면 주어진 세포, 조직 또는 장기에서 표적된 전달체를 위한 또는 예를 들면, 주변의 정상 세포에 영향을 주지 않는 종양 세포의 선택적 표적을 위한 물질과 접합할 수 있다. 실시예의 치료상의 활성제는 방사성 핵종, 독소, 작은 유기 분자 및 치료상의 펩타이드(주어진 세포의 표적에서 단백질 바인딩 부위와 경쟁하는 세포 표면 리셉터 또는 펩타이드의 작용제/대항제로서 활성을 갖는 펩타이드 같은)를 포함한다. 실시예의 적합한 독소는 이에 제한되는 것은 아니나, 백일해-독소, 디프테리아 독소, 리신, 사포린, 슈도모나스 외독소, 칼리키아마이신 또는 이의 유도체, taxoid, 메이탄시노이드, 툴부리신 또는 돌라스태틴 유사체를 포함한다. 돌라스태틴 유사체는 아우리스타틴 E, 모노메틸 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 PYE 및 아우리스타틴 PHE이다. 실시예의 세포성장억제제는 이에 제한되는 것은 아니나, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 5-플루오로시토신, 탁소텔(Docetaxel), 파클리탁셀, 안트라사이클린(Doxorubicin), 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 다카바진, 시클로포스파미드, 에토포시드, 아드리아마이신(Adriamycine), 캄토테신(Camptotecine), 콤브레타타스틴(Combretatastin) 관련된 화합물, 술폰아미드, 옥사디아졸린(oxadiazolines), 벤조[b]티오펜합성의 스피로케탈 피란(benzo[b]thiophenes synthetic spiroketal pyrans), 모노테트라하이드로퓨란 화합물, 큐라신(curacin) 및 이의 유도체, 메톡시에스트라디올 유도체 및 루코보린을 포함한다. 또한, 본 발명의 리포칼린 뮤테인은 역배열의 핵산 분자, siRNAs(small interfering RNAs), 마이크로 RNAs 또는 라이보자임과 같은 치료상 활성 핵산과 접합할 수 있다. 그런 접합은 당 업계에서 공지된 방법으로 생성될 수 있다.
일례로, 본 발명의 뮤테인은 원하는 영역 또는 바디 내의 지역으로 운반하기 위해서 표적 특이 바디(body) 영역의 표적 부분으로 결합될 수 있다. 여기서 이런 변형의 바람직한 하나의 예는 혈액 뇌관문(blood-brain-barrier)의 교차이다. 혈액 뇌관문을 교차하기 위해서, 본 발명의 뮤테인은 이런 장벽을 교차하는 활성적 이동을 촉진하는 부분으로 결합할 수 있다(Gaillard PJ, et al. (2005) International Congress Series . 1277,185-198 또는 Gaillard PJ, et al. (2005) Expert Opin Drug Deliv . 2(2), 299-309 참조). 예를 들면, 이런 화합물은 트레이드 네임 2B-Trans(to-BBB technologies BV, Leiden, NL)가 가능하다. 본 발명의 뮤테인에 표적하는 분자의 다른 모범은 항체, 항체 단편 또는 원하는 표적 분자에 친화성을 갖는 리포칼린 뮤테인을 포함하여 결합 될 수 있다. 예를 들어, 표적하는 부분의 표적 분자는 세포-표면 항원일 수 있다. 세포-표면 항원은 세포 또는 조직 타입, 예를 들어 암 세포를 위해서 특이적일 수 있다. 이런 세포 표면 단백질을 입증하는 예는 HER-2 또는 NEU-2와 같은 프로테오글리칸(proteoglycans)이다.
상기에서 개시되었듯이 본 발명의 뮤테인은 몇몇의 실시예에서 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 화합물과 접합할 수 있다(이런 점에서 PCT 공개 문서 WO 2006/56464에서의 접합 전략은 CTLA-4를 위한 바인딩 친화성을 갖는 인간 호중구젤라티나아제-연관된 리포칼린의 뮤테인에 참조하여 개시되어 있다). 혈청 반감기를 연장시키는 화합물은 폴리에틸렌(PEG) 또는 이의 활성 유도체와 같은 폴리알킬렌 글리콜 분자, 히드록시에틸 전분, 팔미트산(Vajo & Duckworth (2000) Pharmacol . Rev. 52, 1-9), 면역 글로불린의 Fc 부분, 면역 글로불린의 CH3 도메인, 면역 글로불린의 CH4 도메인, 알부민 또는 이의 단편과 같은 지방산 분자, 알부민 바인딩 펩타이드, 또는 알부민 바인딩 단백질, 단지 몇 개의 이름이 명명된 트린스페린일 수 있다. 알부민 바인딩 단백질은 박테리아의 알부민 바인딩 단백질, 항체, 도메인 항체(US patent 6,696,245의 실시예 참조), 알부민을 위한 바인딩 활성을 갖는 리포칼린 뮤테인을 포함하는 항체 단편일 수 있다. 따라서, 본 발명의 리포칼린 뮤테인의 반감기를 연장할 수 있는 적합한 접합 화합물은 알부민(Osborn et al. (2002) J. Pharmacol . Exp . Ther . 303, 540-548), 또는 알부민 바인딩 단백질, 실시예에 있어서, 연쇄상 구균 단백질 G
Figure 112018027260785-pat00001
의 하나와 같은 박테리아의 알부민 바인딩 도메인을 포함한다. 접합 파트너로 사용될 수 있는 다른 알부민 바인딩 펩타이드의 실시예는 미국특허출원 US2003/0069395 또는 Dennis et al. (Dennis et al. (2002) J. Biol . Chem . 277, 35035-35043)에 개시된, 예를 들면, Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys 일치 서열, 여기서 Xaa1는 Asp, Asn, Ser, Thr, 또는 Trp; Xaa2는 Asn, Gln, His, Ile, Leu, 또는 Lys; Xaa3는 Ala, Asp, Phe, Trp, 또는 Tyr; 및 Xaa4는 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, 또는 Thr를 갖는다.
다른 실시예에서, 알부민 자체 또는 알부민의 생물학적 활성 단편은 본 발명의 리포칼린 뮤테인의 화합물로서 사용될 수 있고, 이는 뮤테인의 혈청 반감기를 연장한다. 용어 "알부민"은 인간의 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민 또는 쥐 알부민과 같은 모든 포유류의 알부민을 포함한다. 알부민 또는 이의 단편은 미국특허출원 US5,728,553 또는 유럽특허출원 EP 0 330 451 및 EP 0 361 991에 개시된 대로 재조합형으로 생산될 수 있다. 단백질 안정제로서 사용을 위한 재조합 인간 알부민(Recombumin ®)은 예를 들면 Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK)로부터 가능하다.
알부민-바인딩 단백질이 항체 단편이라면 이는 도메인 항체일 수 있다. 도메인 항체(dAbs)는 생물물리학의 속성을 통해 정확하게 제어 및 생체 내 반감기가 최적의 안정성과 효능 제품의 프로파일을 만들 수 있도록 설계된다. 실시예에 있어서, 도메인 항체는 Domantis Ltd.(Cambridge, UK and MA, USA)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
본 발명에서 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키기 위한 부분으로서 트랜스페린의 사용으로, 뮤테인은 유전적으로 N 또는 C 터미널, 또는 비-글리코실레이트 트랜스페린 모두에 융합할 수 있다. 비-글리코실레이트 트랜스페린은 14-17일의 반감기를 가지고, 트랜스페린 융합 단백질은 유사하게 연장된 반감기를 가질 수 있다. 또한, 트랜스페린 운반체는 높은 생체 이용율, 비오디스트리뷰션(biodistribution) 및 회전 안정성을 제공한다. 이런 기술은 BioRexis(BioRexis Pharmaceutical Corporation, PA, USA)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 트랜스페린 운반체는 또한, 높은 생체 이용율, 생체 내 분포 및 순환 안정성을 제공한다. 이런 기술은 BioRexis (BioRexis Pharmaceutical Corporation, PA, USA)로부터 상업적으로 이용가능하다. 또한, 단백질 안정제로서 사용된 재조합 인간 트랜스페린(DeltaFerrin™)은 Novozymes Delta Ltd. (Nottingham, UK)로부터 상업적으로 입수 가능하다. 면역 글로불린의 Fc 부분이 본 발명의 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키기 위한 목적을 위해서 사용된다면, Syntonix Pharmaceuticals, Inc(MA, USA)로부터 상업적으로 가능한 SynFusion™ 기술은 사용될 수 있다. 이런 Fc-융합 기술의 용도는 오랜-활성의 생물약제학의 창출을 가능하게 하고 실시예에 있어서 약물동력학, 용해도, 및 생산 효율을 증진시키기 위한 항체의 Fc 영역과 연결된 뮤테인의 두 복제를 구성할 수 있다.
그러나, 본 발명의 뮤테인의 반감기를 연장시키기 위한 다른 대안점은 긴, 구조화되지 않은 유연한 글리신-풍부한 서열에 대한 본 발명의 뮤테인의 N- 또는 C-터미널를 융합하는 것이다(실시예에 있어서, 약 20-80의 연속 글리신 잔기를 갖는 폴리-글리신). WO2007/038619의 실시예에 개시된 이런 접근은 또한 "rPEG"(재조합 PEG)란 용어로 사용되었다.
만약 폴리알킬렌 글리콜이 뮤테인의 반감기를 연장시키는 화합물로 사용된다면, 폴리알킬렌 글리콜은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 이는 또한 활성의 폴리알킬렌 유도체일 수 있다. 실시예의 적합한 화합물은 WO 99/64016, 미국특허출원 US 6,177,074 또는 인터페론과 관련하여 미국특허출원 US 6,403,564, 또는 PEG-조작된 아스파라기나제 또는 PEG-과산화물제거효소(실시예에 있어서, Fuertges et al. (1990) The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J. Control. Release 11, 139-148)와 같은 다른 단백질로서 개시되어 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자이다. 이런 폴리머 바람직하게 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 약300 에서 약70.000 Dalton의 범위일 수 있으며 실시예에 있어서, 약10.000, 약2.000, 약30.000 또는 약40.000 Dalton의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 더욱이 예를 들면 미국특허출원 US 6,500,930 또는 6,620,413에 개시된 전분 또는 히드로에틸 전분(HES)과 같은 탄수화물 올리고- 및 폴리머는 혈청 반감기의 연장의 목적을 위한 본 발명의 뮤테인과 접합할 수 있다.
다른 실시예에서는 본 발명의 뮤테인에 상기 화합물 중 하나의 결합을 위한 적합한 아미노산 사이드 체인을 제공하기 위해서 인공 아미노산은 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 일반적으로, 이런 인공 아미노산은 원하는 잔기로의 결합을 촉진시키기 위해서 더 활성적으로 설계되었다. 이런 인공 아미노산이 인공의 tRNA를 통해서 도입될 수 있는 하나의 실시예는 파라-아세틸-페닐알라닌이다.
본 발명에서 개시된 뮤테인의 여러 응용에 있어서, 이는 융합 단백질의 형태로 뮤테인을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 몇몇의 실시예에서, 본 발명의 뮤테인은 이의 단백질의 N-터미널 및/또는 이의 C-터미널에 단백질, 단백질 도메인 또는 단일 서열 및/또는 친화성 태그와 같은 펩타이드가 융합된다.
약학적 응용에 있어서, 본 발명의 뮤테인은 뮤테인의 생체 내에서 혈청 반감기를 연장하는 융합 파트너에 융합될 수 있다(CTLA-4에 있어서 바인딩 친화성을 갖는 인간 호중구 젤라티나아제-관련된 리포칼린의 뮤테인에 대한 참고를 하는 WO 2006/56464). 상기에서 개시하고 있는 결합된 화합물과 유사하게, 융합 파트너는 면역 글로불린의 Fc 부분, 면역 글로불린의 CH3 도메인, 면역 글로불린의 CH4 도메인, 알부민, 알부민 바인딩 펩타이드 또는 알부민 바인딩 단백질, 단지 몇 개의 이름이 명명된 것일 수 있다. 알부민 바인딩 단백질은 박테리아의 알부민 바인딩 단백질 또는 알부민을 위한 바인딩 활성을 갖는 리포칼린 뮤테인일 수 있다. 따라서, 본 발명의 리포칼린 뮤테인의 반감기를 연장하기 위한 적합한 융합 파트너는 알부민(Osborn, B.L. et al. (2002) supra J. Pharmacol . Exp . Ther . 303, 540-548), 또는 알부민 바인딩 단백질, 실시예에 있어서, 연쇄상 구균 단백질 G 중의 하나와 같은 박테리아의 알부민 바인딩 도메인을 포함한다
Figure 112018027260785-pat00002
.
Dennis et al, supra (2002) 또는 US patent application 2003/0069395에 개시된 Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys 일치 서열, 여기서, Xaa1는 Asp, Asn, Ser, Thr, 또는 Trp; Xaa2는 Asn, Gln, His, Ile, Leu, 또는 Lys; Xaa3는 Ala, Asp, Phe, Trp, 또는 Tyr; 및 Xaa4는 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, 또는 Thr를 갖는 알부민 바인딩 펩타이드는 융합 파트너로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서 리포칼린 뮤테인의 융합 파트너로서 알부민의 생물학의 활성 단편 또는 알부민 자체를 사용하는 것도 가능하다. 용어 "알부민"은 인간의 혈청 알부민 또는 소 혈청 알부민 또는 쥐의 혈청 알부민과 같은 모든 포유류의 알부민을 포함한다. 알부민의 재조합 생성 또는 단편 자체는 당 업계에 잘 알려졌고 미국특허출원 US 5,728,553, 유럽특허출원 EP 0 330 451 또는 EP 0 361 99의 실시예에 개시되어 있다.
융합 파트너는 효소적 활성 또는 다른 분자에 대한 바인딩 친화성과 같은 본 발명의 리포칼린 뮤테인에 새로운 특성을 부여할 수 있다. 적합한 융합 단백질의 예는 알칼리 포스타아제, 겨자무과산화효소, 글루타치온-S-전이효소, 단백질 G의 알부민-바인딩 도메인, 단백질 A, 항체 단편, 올리고머 도메인, 동일한 또는 다른 바인딩 특이성("duocalins"의 형성의 결과를 나타낸다, cf. Schlehuber, S., and Skerra, A. (2001), Duocalins, 리포칼린 폴딩으로부터 유래한 이중의 특이성을 갖는 리간드-바인딩 단백질로서 설계되었다(Biol . Chem . 382, 1335-1342))의 리포칼린 뮤테인 또는 독소이다.
특히, 주어진 치료상의 표적에 작용하는 융합 단백질의 "구성 요소(component)" 모두와 같은 분리된 효소 활성 부위를 갖는 본 발명의 리포칼린 뮤테인을 융합할 수 있다. 리포칼린 뮤테인의 바인딩 도메인은 표적의 생물학적 기능을 없애기 위해서 효소 도메인을 가능하게 하는 질병-원인 표적에 부착한다.
또한, Strep-tag® 또는 Strep-tag®II(Schmidt, T.G.M. et al. (1996) J. Mol. Biol . 255, 753-766)와 같은 친화적 태그, myc-태그, FLAG-태그, His6-태그 또는 HA-태그 또는 글루타치온-S-전이효소와 같은 단백질은 쉬운 탐지를 가능하게 하고/하거나 재조합 단백질의 정화는 바람직한 융합파트너의 추가적인 예이다. 최종적으로 색소생산성 또는 녹색 형광 단백질(GFP), 노란 형광 단백질(YFP)과 같은 형광 특성을 갖는 단백질은 또한 본 발명의 리포칼린 뮤테인을 위한 적합한 융합 파트너이다.
본 발명에서 사용된 "융합 단백질"은 신호 서열를 포함하는 본 발명에 따른 리포칼린 뮤테인을 포함한다. 폴리펩타이드의 N-터미널에서 신호 서열는 이런 폴리 펩타이드를 특정 세포구획으로 이동하고 예를 들면, E. coli 또는 진핵 세포의 소포체의 주변 세포질로 이동한다. 많은 수의 신호 서열는 당업계에 알려져 있다. E. coli의 세포질로의 폴리펩타이드의 분리를 위한 바람직한 신호 서열는 OmpA-신호 서열이다.
또한, 본 발명은 여기서 개시한 뮤테인을 위해 코팅하는 뉴클레오타이드 서열를 포함하는 핵산 분자(DNA 및 RNA)에 관련이 있다. 유전 정보의 퇴화는 동일한 아미노산을 지정하는 다른 코돈에 의해서 특정 코돈의 치환을 허락하고, 본 발명은 본 발명의 뮤테인을 암호화하는 특정 핵산 분자를 제한하는 것이 아니라 기능적 뮤테인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열를 포함하는 모든 핵산 분자를 포함한다.
따라서, 또한 본 발명은 Lcn2의 선형 폴리펩타이드의 96, 100 및 106의 아미노산 서열 위치 중 적어도 어느 하나의 코돈에서 뮤테인을 포함하는 본 발명에 따른 뮤테인을 암호화하는 핵산 서열를 포함한다.
또한, 본 발명은 Lcn2 뮤테인를 암호화하는 핵산 분자를 포함하고, 이는 실험적인 돌연변이유발의 개시된 서열 위치의 밖으로 추가적인 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 폴딩 효율성, 혈청 안정성, 열안정성 또는 뮤테인의 리간드 바인딩 친화성을 개선시키는데 기여하는 경우 이런 돌연변이는 종종 내성이 있거나, 유리한 것으로 입증될 수 있다.
본 발명에서 개시된 핵산 분자는 이 핵산 분자의 발현이 가능하게 하는 규제 서열에 "작동할 수 있도록 연결된" 것일 수 있다.
DNA와 같은 핵산 분자는 "핵산 분자를 발현할 수 있는" 또는 "뉴클레오타이드 서열의 발현을 가능하게" 할 수 있는 것을 의미하고, 만약 전사 및/또는 전사의 조절에 관한 정보를 포함하는 서열의 구성 요소를 포함한다면 이런 서열은 폴리펩타이드를 암호화 하는 뉴클레오타이드 서열에 “작동할 수 있도록 연결"된다. 작동할 수 있도록 연결은 규제 서열의 구성 요소 및 발현된 서열로의 결합이 가능한 유전자 발현의 방식으로 연결된다. 유전자 발현에 필요한 규제 영역의 정밀한 본질은 종마다 다를 수 있으나, 일반적으로 이런 영역은 프로모터를 포함하고 원핵세포 내 프로모터 그 자체를 포함한다. DNA 구성 요소, 이는 RNA로 해석될 때뿐만 아니라 전사의 개시를 유도하는 DNA 구성 요소는 전사의 개시의 신호일 것이다. 이런 프로모터 영역은 보통 원핵생물 내 -35/-10 boxes 및 Shine-Dalgarno 요소 또는 진핵생물 내 TATA box, CAAT 서열, 및 5'-캡핑 요소(capping elements)와 같은 전사와 번역의 개시에 관여하는 5‘비-코딩 서열을 포함한다. 이런 영역은 숙주세포의 특이적 구획에 본래의 폴리펩타이드를 표적하기 위해서 번역 신호 및 리더 서열뿐만 아니라 인핸서 또는 리프레서를 또한 포함할 수 있다.
게다가, 3' 코딩되지 않은 서열는 전사 터미널에 포함되는 규제 구성 요소, 폴리아데닐레이션(polyadenylation) 또는 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 그러나, 만약 이런 터미널 서열는 특정 숙주 세포 내에서 만족할 만한 기능은 없고, 따라서 세포 내에서 신호 기능으로 대체될 수 있다.
따라서, 본 발명의 핵산 분자는 규제 서열, 바람직하게는 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서는, 본 발명에 따른 핵산 분자는 프로모터 서열 및 전사 터미널 서열를 포함한다. 적합한 원핵 프로모터는 실시예에서 tet 프로모터, lacUV5 프로모터 또는 T7 프로모터이다. 진핵 세포에서 발현을 위한 유용한 프로모터의 실시예는 SV40 프로모터 또는 CMV 프로모터이다.
또한, 본 발명의 핵산 분자는 벡터 또는 플라스미드, 파지플라스미드복합체, 파지, 바큐로바이러스, 코스미드, 또는 인공 염색체와 같은 클로닝 운반체의 다른 종류의 일부일 수 있다.
일례로, 핵산 분자는 플라스미드로 구성되어 있다. 플라스미드 벡터는 M13 또는 f1와 같은 절제된(temperent) 파지의 유전자간 영역을 암호화하는 벡터 또는 이의 기능적 부분은 interest의 cDNA에 융합되었다. 파지플라스미드복합체 벡터 및 적합한 헬퍼 파지(예를 들면, M13K07, VCS-M13 또는 R408)와 같은 것을 갖는 박테이라 숙주 세포의 중복 감염 이후, 온전한 파지 입자는 생성되었고, 따라서 파지 표면 위에 디스플레이된 폴리펩타이드에 대응하는 이의 암호화된 이중기원의 cDNA에 물리적 결합을 가능하게 한다(reviewed, e.g., in Kay, B.K. et al. (1996) 펩타이드 및 단백질의 파지디스플레이 o- A LAβoratory Manual, 1st Ed., Academic Press, New York NY; Lowman, H.B. (1997) Annu . Rev. Biophys . Biomol . Struct . 26, 401-424, or Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr . Opin . Biotechnol . 10, 87-93).
이런 클로닝 운반체는 본 발명의 리포칼린 뮤테인을 암호화하는 핵산 서열 및 상기에서 개시된 규제 서열과는 별도로, 변형되거나 감염된 세포의 선택할 수 있는 표현형을 부여하는 선택 마커뿐만 아니라 발현을 위해서 사용되는 숙주 세포와 양립할 수 있는 종으로부터 유래된 복제 및 제어 서열을 포함할 수 있다. 많은 수의 적합한 클로닝 벡터는 당 업계에서 알려졌고 상업적으로 이용이 가능하다.
본 발명의 리포칼린 뮤테인을 암호화하는 DNA분자는 특히, 이런 리포칼린 뮤테인의 코딩 서열을 포함하는 클로닝 벡터는 유전자를 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 변형될 수 있다. 변형은 표준 기술(Sambrook, J. et al. (1989), supra)을 사용하여 실행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 개시한 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 유도된다.
변형된 숙주 세포는 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현에 적합한 조건 하에서 배양되었다. 적합한 숙주 세포는 Escherichia coli(E. coli) 또는 Bacillus subtilis와 같은 원핵세포 또는 Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, SF9 또는 High5 곤충 세포와 같은 진핵세포 또는 불멸화된 포유동물 세포 라인(예를 들면 HeLa 세포 또는 CHO 세포) 또는 기본 포유동물 세포일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 뮤테인의 생산을 위한 방법에 관련된다. 여기서 뮤테인, 뮤테인의 단편 또는 뮤테인의 융합 단백질 및 다른 폴리펩타이드는 유전 공학 기법에 의해 뮤테인을 위해서 코딩하는 핵산으로부터 시작되는 것을 생산된다. 상기 방법은 생체 내에서 실행될 수 있고, 예를 들면 뮤테인은 박테리아 또는 진핵세포 숙주 유기체 내에서 생산되며 이 숙주 유기체 또는 이의 배양액에서 분리된다. 체외에서 예를 들면, 체외의 전사 시스템의 사용에 의해 단백질의 생산은 가능하다.
생체 내에서 뮤테인을 생성할 때 본 발명의 뮤테인을 암호화하는 핵산은 재조합 DNA기술(이미 상기에서 서술된)로 적합한 박테리아 또는 진핵 숙주 유기체 내로 도입된다. 이런 목적으로 처음에 숙주 세포는 확립된 표준 방법(Sambrook, J. et al. (1989), supra)을 사용하여 본 발명의 뮤테인을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 클로닝 벡터로 변형된다. 그리고 숙주 세포는 대응하는 폴리펩타이드의 합성 및 이종의 DNA발현을 가능하게 하는 조건에서 배양된다. 그 뒤에, 폴리펩타이드는 숙주세포 또는 배양 매개체로부터 회복된다.
한 측면에서 본 발명은 본 발명의 뮤테인의 생성을 위한 방법에 관한 것이다. (a) 하나 이상의 뮤테인 핵산 분자를 결과로 하는 Lcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 96, 100, 및 106번의 서열 위치에 대응하는 적어도 어느 하나의 서열 위치를 위해 코딩하는 뉴클레오타이드 삼중자에서 돌연변이유발에 인간 리포칼린 2를 암호화하는 종속하는 핵산 분자를 포함한다.
상기 방법은 추가적으로 (b) 적합한 발현 시스템에서 수득되는 하나 더의 뮤테인 핵산 분자를 발현하고, 및 (c) 선택 및/또는 분리의 수단에 의해 주어진 표적을 위한 탐지할 수 있는 바인딩 친화성을 갖는 하나 이상의 뮤테인을 농축시키는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 "돌연변이유발"은 Lcn2의 주어진 서열 위치(hNGAL; Swiss-Prot data bank entry P80188)에서 자연적으로 발생하는 아미노산이 각각의 자연적 폴리펩타이드 서열 내의 이런 특이적 위치에 존재하지 않는 적어도 하나의 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산에서 선택되는 실험적 조건을 의미한다. 용어 "돌연변이유발"은 하나 이상의 아미노산의 제거 또는 도입에 의한 서열 분절의 길이의 변형을 (부가적으로) 또한 포함한다. 그러므로 본 발명의 범위 내에서 예를 들면, 야생형의 단백질의 각각의 분절의 길이에 비해 두 개의 아미노산 잔기의 도입으로 유도하는 선택된 서열 위치에서 하나의 아미노산은 세 개의 무작위 돌연변이의 스트레치(stretch)에 의해서 대체된다. 이런 제거의 도입은 본 발명의 돌연변이유발에 적용될 수 있는 펩타이드 분절 중의 어느 각각으로 부터 독립적으로 유도될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 여러 돌연변이의 유입은 선택된 리포칼린 scaffold의 루프 Aβ내로 유도될 수 있다(참고적으로 WO 2005/019256은 전체에 언급된 참조에 의해 통합된다). 용어 "무작위 돌연변이유발"은 미리 예정되지 않은 단일 아미노산(돌연변이)의 특정 서열 위치에서 존재하는 것을 의미하나, 적어도 두 개의 아미노산은 돌연변이유발 동안 미리 정의된 서열 위치에서 특정 확률을 갖는 것으로 통합될 수 있다.
인간 리포칼린 2의 코딩 서열은 본 발명에서 선택된 펩타이드 분절의 돌연변이유발을 위한 시작점으로써 사용된다. 나열된 아미노산 부위의 돌연변이유발을 위해서 당업자는 돌연변이유발(Sambrook, J. et al. (1989), supra)을 유도하는 부위를 위해서 처분의 다양한 확립된 기준을 갖는다. 통상적으로 사용된 기술은 합성의 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 사용하여 PCR의 수단에 의한 변이의 도입이고, 원하는 서열 위치에서 염기의 구성을 저조시키는 것을 가진다. 예를 들면, 코돈 NNK 또는 NNS(여기서 N = 아데닌, 구아닌 또는 사이토신 또는 티민; K = 구아닌 또는 티민; S = 아데닌 또는 사이토신)의 사용은 돌연변이유발 동안에 앰버 정지 코돈에 더하여 모든 20개의 아미노산의 통합을 가능하게 한다.
폴리펩타이드 서열의 선택된 부위로의 통합으로부터의 아미노산 Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val을 제외하기 때문에 반면에 코돈 VVS는 12까지의 가능하게 통합된 아미노산의 수를 제한한다; 코돈 NMS(여기서 M = 아데닌 또는 사이토신)의 사용, 선택된 서열 영역에서 통합되는 것으로부터의 아미노산 Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val을 제외하기 때문에 예를 들면, 선택된 서열에서 11까지의 가능한 아미노산의 수는 제한된다. 이런 측면에서 셀레노시스테인 또는 피롤리신과 같은 다른 아미노산(정규의 20 자연적으로 발생하는 아미노산보다)을 위한 코돈은 뮤테인의 핵산으로 통합될 수 있다. Wang, L., et al. (2001) Science 292,498-500,또는 Wang, L., 및 Schultz, P.G. (2002) Chem . Comm.1,1-11에 개시된, UAG와 같은 “인공의” 코돈 사용, 이는 예를 들면, o-메틸-L-티로신 또는 p-아미노페닐알라닌 같은 다른 특이한 아미노산에 주입하기 위해서 정지 코돈으로서 대개 인식된다.
뉴클레오타이드 빌딩의 사용은 예를 들면, 이노신, 8-oxo-2'데옥시구아노신 또는 6(2-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-디하이드로-8H-pyrimindo-1,2-옥사진-7-one(Zaccolo et al. (1996) J. Mol . Biol.255,589-603), 감소된 염기 쌍 특이성을 막고, 선택된 서열 분절로 변이의 도입을 위한 다른 선택이다.
추가적 가능성은 소위 삼중자 돌연변이유발이다. 이런 방법은 각각은 하나의 아미노산을 코드하는, 코딩 서열로 통합을 위한 다른 뉴클레오타이드 삼중자의 혼합물을 사용한다
Figure 112018027260785-pat00003
Schneider KC, Wellnhofer G, Moroney SE. 1994 Trinucleotide phosphoramidites: 무작위 돌연변이유발을 위한 혼합된 올리고뉴클레오타이드의 합성을 위한 이상적인 시약. Nucleic acids Res 22,5600-5607).
각각의 폴리펩타이드의 선택된 영역에서 변이를 초래하기 위한 하나의 가능한 전략은 변이된 서열 분절에 대응하는 하나로부터 부분적으로 유래된 각각의 네 개의 올리고뉴클레오타이드의 사용에 기초한다. 이런 올리고뉴클레오타이드가 합성될 때, 당업자는 변이된 아미노산 위치에 대응하는 이런 뉴클레오타이드 삼중자의 합성을 위해서 핵산 빌딩 블락의 혼합물을 사용할 수 있고, 모든 자연적 아미노산을 무작위적으로 암호화하는 코돈이 발생하며, 마지막에 리포칼린 펩타이드 라이브러리의 생성의 결과를 낸다. 예를 들면, 리포칼린 폴리펩타이드의 가장 N-터미널 부위에서 변이된 펩타이드 분절을 위한 코딩 가닥으로 첫 번째 올리고뉴클레오타이드는 이의 서열에 대응한다(변이된 부위와는 별개). 따라서 두 번째 올리고뉴클레오타이드는 다음의 폴리펩타이드 서열을 따르는 두 번 째 서열 분절을 위한 코딩하지 않은 가닥에 대응한다. 세 번째 올리고뉴클레오타이드는 세 번째 서열 분절에 대응을 위해서 차례로 코딩 가닥에 대응한다. 마지막으로, 네 번째 올리고뉴클레오타이드는 네 번째 서열 분절을 위해서 코딩되지 않은 가닥에 대응한다. 폴리머라제 연쇄 반응은 첫 번째 및 두 번째 올리고뉴클레오타이드 및 각각이 필요하다면 세 번째 및 네 번째 올리고뉴클레오타이드 각각으로 수행될 수 있다.
이런 반응의 모든 증폭 생산물은 다양하게 알려진 방법에 의해서 첫 번째에서 4 번째 서열 분절로부터 서열을 포함하는 단일 핵산으로 결합되고, 변이는 선택된 위치에서 초래된다. 이를 위하여 생산품 모두는 예를 들면 하나 이상의 두 번째 및 세 번째 서열 분절에 사이에 기여하는 서열인 매개체 핵산 분자뿐만 아니라 측면에 위치한(flanking) 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 새로운 폴리머라제 연쇄 반응에 적용시킬 수 있다. 돌연변이유발을 위해 사용된 올리고뉴클레오타이드의 서열 내에서 많은 수의 선택 및 배열은, 당업계에서 처리에 많은 대안점을 가지고 있다.
상기 정의한 핵산은 리포칼린 폴리펩타이드 및/또는 벡터를 암호화하는 핵산의 빠진 5'- 및 3'-서열과의 연결(ligation)에 의해 연결될 수 있으며, 공지된 숙주 유기체 내에서 클로닝될 수 있다. 다수의 확립된 과정은 연결 및 클로닝을 위해 이용가능하다(참조: Sambrook, J. et al. (1989), 상기 참조). 예를 들면, 클로닝 벡터의 서열 내에 또한 존재하는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열은 합성 올리고뉴클레오타이드의 서열 내로 가공할 수 있다. 따라서, 각각의 PCR 생성물을 증폭시키고 효소 절단 후에, 수득되는 단편은 상응하는 인식 서열을 사용하여 용이하게 클로닝시킬 수 있다.
돌연변이유발을 위해 선택된 단백질을 암호화하는 유전자 내의 보다 긴 서열 분절을 또한 공지된 방법, 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 증가된 오차율의 조건하에서, 화학적 돌연변이유발에 의해 또는 세균 돌연변이인자 균주를 사용하여 무작위적 돌연변이유발에 적용시킬 수 있다. 이러한 방법은 또한 리포칼린 뮤테인의 표적 친화성 또는 특이성의 추가의 최적화를 위해 사용될 수 있다. 실험적 돌연변이유발의 분절 외부에 가능하게 존재하는 돌연변이는 흔히 내성이거나, 예를 들면, 이들이 리포칼린 뮤테인의 개선된 폴딩 효능 또는 폴딩 안정성에 기여하는 경우 심지어 유리한 것으로 입증될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 방법은 인간 리포칼린 2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 인간 리포칼린 2의 상기 나타낸 서열 위치 중 어느 것에 대해 암호화하는 적어도 2 또는 3개의 뉴클레오타이드 삼중자(triplet)에서 돌연변이유발에 적용시킴을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 당해 방법은 핵산 분자를 hNGAL의 선형 폴리펩타이드 서열의 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 및 138번 서열 위치에 대응하는 서열 위치들 중의 어느 것에 대해 암호화하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 삼중자에서 돌연변이유발에 적용시킴을 추가로 포함한다.
여전히 본 발명의 또 다른 실시예에서, 당해 방법은 핵산 분자를 인간 리포칼린 2의 선형 폴리펩타이드 서열의 33, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54, 55, 59, 65, 68, 70, 72, 73, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 86, 87, 98, 96, 99, 100, 103, 106, 107, 110, 111, 125, 127, 132, 134, 136 및 138번 서열 위치에 대응하는 서열 위치의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20번 중 어느 것에 대해 암호화하는 뉴클레오타이드 삼중자에서 돌연변이유발에 적용시킴을 포함한다.
본 발명의 방법에 따라서, 뮤테인은 hNGAL을 암호화하는 핵산으로부터 출발하여 수득된다. 이러한 핵산은 돌연변이유발에 적용시키고 적합한 세균 또는 진균 숙주 유기체 내로 재조합 DNA 기술을 사용하여 도입시킨다. 인간 리포칼린 2의 핵산 라이브러리(library)의 수득은 항체-유사 특성을 갖는 리포칼린 뮤테인, 즉, 제공된 표적에 대해 친화성을 갖는 뮤테인을 생성하기 위한 당해 분야에 공지된 어떠한 적합한 기술을 사용하여서도 수행할 수 있다. 이러한 조합 방법의 예는 예를 들면, 국제 특허원 WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, 또는 WO 2006/56464에 상세히 기술되어 있다. 이들 각각의 내용은 본 발명에서 이의 전문이 참조로 혼입된다. 적절한 숙주 내에서 돌연변이유발에 적용시킨 핵산 서열의 발현 후, 제공된 표적에 결합하는, 각각의 리포칼린 뮤테인 다수에 대한 유전 정보를 지닌 클론을 수득된 라이브러리로부터 선택할 수 있다. 익히 공지된 기술, 예를 들면, 파지 디스플레이[참조: Kay, B.K. et al. (1996) 상기 참조; Lowman, H.B. (1997) 상기 참조 또는 Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) 상기 참조], 콜로니 스크리닝[참조: Pini, A. et al. (2002) Comb. Chem . High Throughput Screen. 5, 503-510], 리보소옴 디스플레이[참조: Amstutz, P. et al. (2001) Curr . Opin . Biotechnol . 12, 400-405] 또는 mRNA 디스플레이[참조: Wilson, D.S. et al. (2001) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 98, 3750-3755] 또는 WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, 또는 WO 2006/56464에 구체적으로 기술된 방법들을 이들 클론의 선택을 위해 사용할 수 있다.
당해 기재내용에 따라서, 단계 (c)는 또한 상기 방법의 다른 실시예에서:
(i) 면역학적 합텐(immunological hapten), 펩타이드, 단백질 또는 다른 거대분자, 예를 들면, 다당류, 핵산 분자(예를 들면, DNA 또는 RNA) 또는 전체 바이러스 입자 또는 비로이드(viroid)의 특징을 나타내는 유리되거나 접합된 형태의 화학적 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물을 제공된 표적/리간드로서 제공하는 단계,
(ii) 다수의 뮤테인을 상기 표적/리간드와 접촉시켜 상기 리간드와 상기 표적/리간드에 대한 결합 친화성을 갖는 뮤테인 사이에 복합체를 형성시키는 단계, 및
(iii) 결합 친화성이 없거나 결합 친화성이 거의 없는 뮤테인을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 특수 양태에서, 표적/리간드는 펩타이드, 단백질, 단백질의 단편 또는 도메인, 또는 작은 유기 분자(small organic molecule)를 포함하나, 이에 제한되지 않는 비-천연 표적이다. 하나의 양태에서, 작은 유기 분자는 면역학적 합텐의 특징을 나타내는 화합물이다. 추가의 양태에서, 펩타이드는 아밀로이드 베타 펩타이드, 예를 들면, Aβ40 펩타이드 또는 Aβ42 펩타이드이다. 여전히 다른 양태에서, 비-천연 표적은 피브로넥틴 또는 이의 도메인, 예를 들면, EB-도메인 또는 EB-도메인의 단편이다.
본 발명의 방법의 하나의 양태에서, 단계 (c)에서의 선택된 경쟁적 조건하에 수행한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 경쟁적 조건은, 뮤테인의 선택이 적어도 하나의 단계를 포함함을 의미하며, 여기서 뮤테인 및 인간 리포칼린 2(표적)의 제공된 비-천연 리간드는 표적에 대한 뮤테인의 결합과 경쟁하는 추가의 리간드의 존재시 접촉된다. 당해 추가의 리간드는 표적의 생리학적 리간드, 과량의 표적 자체 또는 본 발명의 뮤테인에 의해 인식된 에피토프에 적어도 하나의 오우버랩핑 에피토프를 결합시킴으로써 뮤테인의 표적 결합을 방해하는 표적의 다른 어떠한 비-생리학적 리간드일 수 있다. 대안적으로, 추가의 리간드는 알로스테릭 효과(allosteric effect)에 의해 뮤테인의 결합 부위로부터 떨어진 에피토프를 표적에 복합체화시킴으로써 뮤테인의 결합과 경쟁한다.
절제된(temperent) M13 파지를 사용한 파지 디스플레이 기술[참조: Kay, B.K. et al. (1996), 상기 참조; Lowman, H. B. (1997) 상기 참조 또는 Rodi, D. J., and Makowski, L. (1999), 상기 참조]의 양태는 본 발명에서 사용될 수 있는 선택 방법의 예로 제공된다. 본 발명의 뮤테인의 선택을 위해 사용될 수 있는 파지 디스플레이 기술의 다른 양태는 문헌[참조: Broders et al. (Broders et al. (2003) 및 "Hyperphage. Improving antibody presentation in phase display." Methods Mol . Biol . 205:295-302]에 기술된 바와 같은 하이퍼파지 파지 기술(hyperphase phage techology)이다. f1과 같은 다른 절제된 파지 또는 T7과 같은 분해 파지를 또한 사용할 수 있다. 예시적인 선택 방법에 있어서, N-터미널에서 신호 서열, 바람직하게는 OpmA-신호 서열, 및 C-터미널에서 파지 캡시드 내로 혼입될 수 있는 파지 M13의 캡시드 단백질 pIII 또는 이의 단편과의 융합 단백질로서 돌연변이된 리포칼린 핵산 서열의 발현을 허용하는 M13 파지플라스미드복합체가 생산된다. 야생형 서열의 217 내지 416번 아미노산을 포함하는 파지 캡시드 단백질의 C-터미널 단편 △pIII가 융합 단백질을 생산하기 위해 바람직하게 사용된다. 하나의 양태에서, 201번 위치에서 시스테인 잔기가 없거나 다른 아미노산으로 치환된 pIII의 C-터미널 단편이 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명의 방법의 추가의 양태는 인간 리포칼린 2의 다수의 뮤테인에 대해 암호화하고 M13-계열의 필라멘트형(filamentous) 박테리오파지의 외피 단백질(coat protein) pIII 또는 당해 외피 단백질의 단편에 대해 암호화하는 유전자를 사용한 3' 터미널에서의 돌연변이 유발로부터 생성된 핵산을 작동적으로 융합시켜, 제공된 리간드의 결합에 대해 적어도 하나의 뮤테인을 선택함을 포함한다.
융합 단백질은 융합 단백질 또는 이의 부분의 면역화, 검출 및/또는 정제를 허용하는 친화성 태그와 같은 추가의 성분들을 포함할 수 있다. 또한, 정지 코돈이 리포칼린 또는 이의 뮤테인을 암호화하는 서열 영역과 파지 캡시드 유전자 또는 이의 단편 사이에 위치할 수 있으며, 여기서 정지 코돈, 바람직하게는 앰버(amber) 정지 코돈은 적합한 억제 균주(suppressor strain)에서 해독 동안 아미노산 내로 적어도 부분적으로 해독된다.
예를 들어, 본 발명에 이르러 또한 본 발명에 기술된 pTlc27로 일컫는 플라스미드 벡터 pTLPC27을 인간 리포칼린 2 뮤테인에 대해 암호화하는 파지플라스미드복합체 라이브러리의 제조에 사용할 수 있다. hNGAL 뮤테인을 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 2개의 BstXI 제한 부위를 사용하여 벡터 내로 삽입시킨다. 연결 후에, 적합한 숙주 균주, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) XL1-Blue를 수득되는 핵산 혼합물로 형질전환시켜 다수의 독립된 클론을 수득한다. 각각의 벡터는 경우에 따라, 하이퍼파지플라스미드복합체 라이브러리의 제조를 위해 생성시킬 수 있다.
수득되는 라이브러리는 적절한 M13-헬퍼 파지 또는 하이퍼파지를 사용하여 액체 배양물 속에서 후속적으로 중감염(superinfection)시켜 기능적 파지플라스미드복합체(phagemid)를 생산한다. 재조합 파지플라스미드복합체는 외피 단백질 pIII 또는 이의 단편과의 융합체로서 이의 표면에 리포칼린 뮤테인을 나타내지만, 융합 단백질의 N-터미널 신호 서열은 정상적으로 절단 제거된다. 다른 한편, 이는 또한 헬퍼 파지에 의해 공급된 자연의 캡시드 단백질 pIII의 하나 이상의 카피를 지님으로써 수용체, 일반적으로 F- 또는 F'-플라스미드를 수반하는 세균 균주를 감염시킬 수 있다. 하이퍼파지 디스플레이의 경우에, 하이퍼파지플라스미드복합체는 천연 캡시드 단백질이 아닌 감염성 외피 단백질 pIII와의 융합체로서 이들의 표면에 리포칼린 뮤테인을 나타낸다. 헬퍼 파지 또는 하이퍼파지를 사용한 감염 동안 또는 감염 후에, 리포칼린 뮤테인과 캡시드 단백질 pIII 사이의 융합 단백질의 유전자 발현은 예를 들면, 안하이드로테트라사이클린의 첨가에 의해 유도될 수 있다. 유도 조건은, 수득된 파지플라스미드복합체의 실질적인 분획이 이의 표면에 적어도 하나의 리포칼린 뮤테인을 나타내도록 선택된다. 하이퍼파지 디스플레이의 경우, 유도 조건은 리포칼린 뮤테인 및 캡시드 단백질 pIII로 이루어진 3개 내지 5개의 융합 단백질을 수반하는 하이퍼파지플라스미드복합체의 집단을 생성한다. 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 침전과 같은, 파지플라스미드복합체를 분리하기 위한 각종 방법이 공지되어 있다. 분리는 통상적으로 6 내지 8시간의 항온처리 기간 후에 일어난다.
이후에, 분리된 플라스미드는 바람직한 표적과의 항온처리에 의해 선택에 적용시킬 수 있으며, 여기서 표적은 이들의 외피에 융합 단백질로서 바람직한 결합 활성을 지닌 뮤테인을 수반하는 파지플라스미드복합체의 적어도 일시적인 고정화를 허용하는 형태로 존재한다. 당업자에게 공지된 각종 양태들 중에서, 표적은 예를 들면, 혈청 알부민과 같은 담체 단백질과 접합시키고 당해 담체 단백질을 통해 단백질 결합 표면, 예를 들면, 폴리스티렌에 결합시킬 수 있다. ELISA 기술 또는 소위 "면역-스틱스(immuno-sticks)"에 적합한 미세역가 플레이트(microtiter plate)가 표적의 이러한 고정화에 바람직하게 사용될 수 있다. 대안적으로, 표적과 다른 결합 그룹, 예를 들면, 바이오틴의 접합체가 사용될 수 있다. 이후에, 표적은 당해 그룹, 예를 들면, 미세역가 플레이트 또는 스트렙타비딘, 뉴트라비딘 또는 아비딘으로 피복된 상자성 입자(paramagnetic particle)를 선택적으로 결합시키는 표면에 고정시킬 수 있다. 표적이 면역글로불린의 Fc 부위에 융합되는 경우, 고정화는 또한 표면, 예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 G로 피복된 미세역가 플레이트 또는 상자성 입자를 사용하여 달성할 수 있다.
표면에 존재하는 비-특이적인 파지플라스미드복합체-결합 부위는, 이들이 ELISA 방법을 위해 공지된 바와 같이 차단 용액으로 포화시킬 수 있다. 이후에, 파지플라스미드복합체는 통상적으로 생리학적 완충액의 존재하에서 표면에 고정된 표적과 접촉된다. 결합되지 않는 파지플라스미드복합체는 다수 세척에 의해 제거한다. 표면에 남은 파지플라스미드복합체 입자는 이후에 용출시킨다. 용출을 위해, 몇 가지 방법이 가능하다. 예를 들면, 파지플라스미드복합체는 프로테아제의 첨가 또는 산, 염기, 세제 또는 카오트로픽 염(chaotropic salt)의 존재하에서 또는 온화한 변성 조건하에서 용출시킬 수 있다. 바람직한 방법은 pH 2.2의 완충액을 사용한 용출이며, 여기서 용출물은 후속적으로 중화된다. 대안적으로, 유리 표적의 용액을 가하여 파지플라스미드복합체에 대한 결합에 대해 고정된 표적과 경쟁하도록 할 수 있거나 표적-특이적인 파지플라스미드복합체를 목적한 표적에 특이적으로 결합하는 천연 리간드화 단백질 또는 면역글로불린과의 경쟁에 의해 용출시킬 수 있다.
이후에, 이. 콜라이 세포를 용출된 파지플라스미드복합체로 감염시킨다. 대안적으로, 핵산을 용출된 파지플라스미드복합체로부터 추출하여 서열 분석, 증폭 또는 세포의 형질전환에 다른 방식으로 사용할 수 있다. 당해 방식으로 수득된 이. 콜라이 클론으로부터 출발하여, 신선한 파지플라스미드복합체 또는 하이퍼플라스미드를 M13 헬퍼 파지 또는 하이퍼파지를 사용한 중감염에 의해 상기 기술된 방법에 따라 다시 생산하고, 이러한 방식으로 증폭시킨 파지플라스미드복합체를 고정된 표적 위에서의 선택에 한번에 다시 적용시킨다. 본 발명의 뮤테인을 충분히 농축된 형태로 지닌 파지플라스미드복합체를 수득하기 위해 다중 선택 주기가 흔히 필요하다. 선택 주기의 수는 바람직하게는, 후속적인 기능적 분석에서 연구된 클론의 적어도 0.1%가 제공된 표적에 대해 탐지할 수 있는 친화성을 갖는 뮤테인을 생산하도록 선택된다. 크기, 즉 사용된 라이브러리의 복잡성에 따라서, 2 내지 8회 주기가 전형적으로 당해 목적을 위해 요구된다.
선택된 뮤테인의 기능적 분석을 위해, 이. 콜라이 균주를 선택 주기로부터 수득된 파지플라스미드복합체로 감염시키고 상응하는 이본쇄 플라스미드 DNA를 분리한다. 이러한 플라스미드 DNA로부터, 또는 또한 파지플라스미드복합체로부터 추출된 일본쇄 DNA로부터 출발하여, 본 발명의 선택된 뮤테인의 핵산 서열을 당해 분야에 공지된 방법으로 측정하고 아미노산 서열을 이로부터 유추할 수 있다. 전체 hNGAL 뮤테인의 서열 또는 돌연변이된 영역은 다른 발현 벡터에서 서브클로닝(subcloning)되고 적합한 숙주 유기체 내에서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 이르러 또한 pTlc26으로 일컫는 벡터 pTLPC26은 이. 콜라이 TG1과 같은 이. 콜라이 균주내 발현을 위해 사용될 수 있다. 이렇게 생산된 인간 리포칼린 2의 뮤테인은 각종 생화학적 방법으로 정제할 수 있다. 예를 들면, pTlc26으로 생산된 hNGAL 뮤테인은 이들의 C 터미널에서 친화성 펩타이드 Strep-태그 II(참조: Schmidt et al., 상기 참조)를 수반하므로 스트렙타비딘 친화성 크로마토그래피에 의해 바람직하게 정제할 수 있다.
선택은 또한 다른 방법들을 사용하여 수행할 수 있다. 많은 상응하는 양태들이 당업자에게 공지되어 있거나 문헌에 기술되어 있다. 또한, 방법들의 조합을 적용할 수 있다. 예를 들면, 선택되거나 적어도 "파지 디스플레이"에 의해 농축된 클론을 "콜로니 스크리닝"에 추가로 적용시킬 수 있다. 당해 과정은, 개개 클론이 표적에 대해 탐지할 수 있는 결합 친화성을 갖는 인간 리포칼린 2 뮤테인의 생산과 관련하여 직접 분리될 수 있는 장점을 갖는다.
"파지 디스플레이" 기술 또는 "콜로니 스크리닝" 방법에서 숙주 유기체로서 이. 콜라이의 사용 외에, 다른 세균 균주, 효모 또는 또한 곤충 세포 또는 포유동물 세포를 당해 목적을 위해 사용할 수 있다. 위에서 기술한 바와 같은 무작위 라이브러리로부터 인간 리포칼린 2 뮤테인을 선택하는 것에 추가하여, 제한된 돌연변이유발을 포함하는 진화 방법을 또한 적용하여 표적에 대한 친화성 또는 특이성과 관련하여 표적에 대한 일부 결합 활성을 이미 지닌 뮤테인을 최적화시킬 수 있다.
제공된 표적에 대한 친화성을 갖는 뮤테인이 선택되면, 이러한 뮤테인을 다른 돌연변이유발에 적용시켜 훨씬 더 높은 친화성을 지닌 변이체 또는 개선된 특성, 예를 들면, 보다 높은 열안전성, 개선된 혈청 안정성, 열역학적 안정성, 개선된 가용성, 개선된 단량체성 거동, 열 변성, 화학적 변성, 단백질분해 또는 세제 등에 대한 개선된 내성을 지닌 변이체를 후속적으로 선택하는 것이 또한 가능하다. 높은 친화성을 목표로 하는 경우에, 시험관 내 "친화성 성숙"에서와 같이 고려될 수 있는 이러한 추가의 돌연변이유발은 합리적 설계 또는 무작위 돌연변이를 기초로 하는 부위 특이적인 돌연변이에 의해 달성할 수 있다. 높은 친화성 또는 개선된 특성을 수득하기 위한 다른 가능한 시도는 오류-발생이 쉬운 PCR(error-prone PCR)의 사용이며, 이는 리포칼린 뮤테인의 서열 위치의 선택된 범위에 걸쳐 점 돌연변이(point mutation)를 생성한다. 오류-발생이 쉬운 PCR은 문헌[참조: Zaccolo et al. (1996) J. Mol . Biol . 255, 589-603]에 기술된 바와 같은 어떠한 공지된 프로토콜에 따라 수행할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 무작위 돌연변이유발의 다른 방법은 문헌[참조: Murakami et al. (2002) Nat. Biotechnol . 20, 76-81]에 기술된 바와 같은 무작위 삽입/결실(RID) 돌연변이유발 또는 문헌[참조: Bittker et al. (2002) Nat. Biotechnol . 20,1024-1029]에 기술된 바와 같은 비동종의 무작위적 재조합(NRR)을 포함한다. 경우에 따라서, 친화성 성숙을 또한 문헌[참조: WO 00/75308 또는 Schlehuber et al. (2000) J. Mol . Biol . 297, 1105-1120]에 기술된 과정에 따라 수행할 수 있으며, 여기서 디옥시게닌에 대해 높은 친화성을 갖는 빌린(bilin)-결합 단백질의 뮤테인이 수득되었다. 친화성을 개선시키기 위한 추가의 시도는 위치 포화 돌연변이유발을 수행하기 위한 것이다. 당해 시도에서 "작은(small)" 핵산 라이브러리를 생성시킬 수 있으며, 여기서 아미노산 교환/돌연변이는 어떠한 4개의 루프 분절(loop segment)내 단일 위치에서만 도입된다. 이후에, 이들 라이브러리는 추가 라운드의 패닝(panning) 없이 선택 단계(친화성 스크리닝)에 직접 적용된다. 당해 시도는 목적한 표적의 개선된 결합에 기여하는 잔기의 확인을 허용하고 결합에 중요한 "핫 스팟(hot spot)"을 확인하도록 하는데 기여하는 잔기의 확인을 허용한다.
하나의 양태에서, 뮤테인을 변형시키기 위한 상기 방법은 인간 리포칼린 2의 야생형 서열의 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 또는 158번 서열 위치에 대응하는 어떠한 서열 위치 중 적어도 하나에서 Cys 잔기를 도입하고 상기 뮤테인을 혈청 반감기를 hNGAL의 야생형 서열의 14, 21, 60, 84, 88, 116, 141, 145, 143, 146 또는 158번 서열 위치에 대응하는 어떠한 서열 위치 중 하나 이상에 도입된 Cys 잔기의 티올 그룹을 통해 변형시킬 수 있는 잔기를 커플링시킴을 추가로 포함한다. 상기 뮤테인의 혈청 반감기를 변형시킬 수 있는 잔기는 폴리알킬렌 글리콜 분자 및 하이드록시에틸 전분으로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
추가의 국면에서, 본 발명은 본 발명의 위에서 기술한 방법들에 의해 수득되거나, 수득될 수 있는 인간 리포칼린 2의 제공된 비-천연 리간드에 대한 탐지할 수 있는 결합 친화성을 갖는 인간 리포칼린 2의 뮤테인에 관한 것이다.
본 발명의 일부 인간 리포칼린 2 뮤테인에서, Cys 76과 Cys 175 사이의 천연적으로 존재하는 이황화물 결합이 제거된다. 따라서, 이러한 뮤테인(또는 분자간 이황화물 결합을 포함하지 않는 어떠한 다른 인간 리포칼린 2 뮤테인)은 환원하는 산화환원 환경(redox milieu)을 갖는 세포 구획, 예를 들면, 그람-음성 세균의 세포질에서 생산될 수 있다.
본 발명의 리포칼린 뮤테인이 분자간 이황화물 결합을 포함하는 경우에, 인접한 폴리펩타이드를 적절한 신호 서열(signal sequence)을 사용하여 산화하는 산화환원 환경을 갖는 세포 구획으로 이동하도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 산화 환경은 그람-양성 세균의 세포외 환경 또는 진핵 세포의 세망 세포질의 내강(lumen)내에서, 이. 콜라이와 같은 그람-음성 세균의 세포질에 의해 제공될 수 있으며 일반적으로 구조적 이황화물 결합의 형성을 선호한다.
그러나, 숙주 세포, 바람직하게는 이. 콜라이의 세포질 내에서 본 발명의 뮤테인을 생산하는 것도 또한 가능하다. 이 경우에, 폴리펩타이드는 봉입체의 형태로 회수되거나 가용성 및 폴딩된 상태로 직접 수득된 뒤 시험관 내에서 복원된다. 추가의 선택사항은 산화하는 세포 내 환경을 갖는 특수 숙주 균주의 사용이며, 따라서, 이는 세포질 속에서 이황화물 결합의 형성을 허용할 수 있다[참조: Venturi et al. (2002) J. Mol . Biol . 315, 1-8].
그러나, 본 발명의 뮤테인은 필수적으로 유전 공학의 사용에 의해서만 필수적으로 생성되거나 생산되지 않을 수 있다. 오히려, 리포칼린 뮤테인은 또한 메리필드 고체 상 폴리펩타이드 합성(Merrifield solid phase polypeptide synthesis) 또는 시험관내 전사 및 해독과 같은 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 촉망되는 돌연변이가 분자 모델링을 사용하여 확인한 후 시험관 내에서 원하는(설계된) 폴리펩타이드를 합성하고 제공된 표적에 대한 결합 활성을 조사하는 것이 가능하다. 단백질의 고체 상 및/또는 액체 상 합성 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Lloyd-Williams et al. (1997) Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins. CRC Press, Boca Raton, Fields, GB, and Colowick (1997) Solid-Phase Peptide Synthesis. Academic Press, San Diego, or Bruckdorfer et al. (2004) Curr . Pharm . Biotechnol . 5, 29-43].
다른 양태에서, 본 발명의 뮤테인은 당업자에게 공지된 잘-확립된 방법들을 사용하는 시험관 내 전사/해독에 의해 생산될 수 있다.
본 발명은 또한 특허청구범위에서 언급된 적어도 하나의 본 발명의 뮤테인 또는, 융합 단백질 또는 이의 접합체 및, 임의로, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 리포칼린 뮤테인은 단백질성 약물에 대해 치료학적으로 효과적인 어떠한 비경구 또는 비-비경구(장내) 경로를 통해 투여될 수 있다. 비경구 적용 방법은, 예를 들면, 주사 용액, 주입 용액 또는 팅크제(tincture)의 형태의, 예를 들면, 피하 내, 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사 및 주입 기술 및, 예를 들면, 에어로졸 혼합물, 스프레이 또는 분말의 형태의 에어로졸 장치 및 흡입을 포함한다. 비-비경구 전달 방식은, 예를 들면, 환제, 정제, 캅셀제, 액제 또는 현탁제의 형태의 경구적 방식이거나 또는, 예를 들면, 좌제 형태의 직장내 방식이다. 본 발명의 뮤테인은 목적하는 경우 통상의 무-독성의 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 첨가제 및 운반체를 함유하는 제형 속에 전신계적으로 또는 국소적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, 약제는 포유동물 및 특히 인간에게 비경구적으로 투여된다. 상응하는 투여 방법은, 예를 들면 주사 용액, 주입 용액 또는 팅크제 형태의, 예를 들면, 피하 내, 피하, 근육 내 또는 정맥 내 주사 및 주입 기술 및, 예를 들면, 에어로졸 혼합물, 스프레이 또는 분말의 형태의 에어로졸 장치 및 흡입을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 정맥 내 및 피하 주입 및/또는 주사의 조합은 상대적으로 짧은 혈청 반감기를 지닌 화합물의 경우에 가장 편리할 수 있다. 약학 조성물은 수용액, 수중유 유액(oil-in-water emulsion) 또는 유중수 유액일 수 있다.
이와 관련하여, 문헌[참조: Meidan and Michniak (2004) Am. J. Ther . 11(4), 312-316]에 기술된 바와 같은, 경피 전달 기술, 예를 들면, 이온이동법, 소노포레시스(sonophoresis) 또는 미세침-향상된 전달을 또한 본 발명에 기술된 뮤테인의 경피 전달에 사용할 수 있다. 비-비경구 전달 방식은 예를 들면, 환제, 정제, 캅셀제, 액제 또는 현탁제의 형태의, 예를 들면, 경구 방식이거나, 또는 예를 들면, 좌제 형태의, 예를 들면, 직장 투여 방식이다. 본 발명의 뮤테인은 각종의 통상적인 무-독성의 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 첨가제 및 비히클을 함유하는 제형 속에서 전신계적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
적용된 뮤테인의 용량은 광범위한 한계 내에서 변하여 바람직한 예방적 효과 또는 치료적 반응을 달성할 수 있다. 예를 들면, 이는 선택된 리간드에 대한 화합물의 친화성 및, 생체 내에서 뮤테인과 리간드 사이의 복합체의 반감기에 의존할 것이다. 또한, 최적 용량은 뮤테인 또는 이의 융합 단백질 또는 이의 접합체의 생분배(biodistribution), 투여 방식, 치료하는 질병/질환의 중증도 및 환자의 의학 상태에 의존할 것이다. 예를 들면, 국소 적용을 위한 연고제에 사용되는 경우, 고 농도의 인간 리포칼린 2 뮤테인을 사용할 수 있다. 그러나, 원하는 경우, 뮤테인은 또한 서방출 제형(sustained release formulation), 예를 들면, 리포소옴 분산제 또는 하이드로겔-계 중합체 미소구체, 예를 들면, PolyActiveTM 또는 OctoDEXTM(참조: Bos et al., Business Briefing: Pharmatech 2003: 1-6)로 제공될 수 있다.
따라서, 본 발명의 뮤테인은 약학적으로 허용되는 성분 및 확립된 제조 방법으로 제형화할 수 있다[참조: Gennaro and Gennaro (2000) Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]. 약학 조성물을 제조하기 위하여, 약학적으로 불활성인 무기 또는 유기 부형제를 사용할 수 있다. 예를 들면, 환제, 산제, 젤라틴 캅셀제 또는 좌제를 제조하기 위하여, 예를 들면, 락토즈, 활석, 스테아르산 및 이의 염, 지방, 왁스, 고체 또는 액체 폴리올, 천연 및 경화 오일을 사용할 수 있다. 액제, 현탁제, 유제, 에어로졸 혼합물 또는 사용 전에 액제 또는 에어로졸 혼합물로 재구성하기 위한 산제의 생산을 위한 적합한 부형제는 물, 알코올, 글리세롤, 폴리올, 및 이의 혼합물, 및 식물성 오일을 포함한다.
약학 조성물은 또한 첨가제, 예를 들면, 충전제, 결합제, 습윤제, 활주제, 안정화제, 방부제, 유화제 및 또한 용매 또는 가용화제 또는 데포트(depot) 효과를 달성하기 위한 제제를 함유할 수 있다. 후자는, 융합 단백질이 리포좀 및 미세캅셀제와 같이 느린 또는 서방출 또는 표적화된 전달 시스템 내로 혼입될 수 있는 것이다.
제형은, 예를 들면, 세균-보유 여과기를 통한 여과를 포함하는 다수의 수단에 의해, 또는 안정화제를 사용 직전에 멸균수 또는 다른 멸균 매질 속에 용해시키거나 분산시킬 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 뮤테인 또는 융합 단백질 또는 이의 접합체는 다수의 적용에 사용할 수 있다. 일반적으로, 모든 적용에 사용될 수 있는 이러한 뮤테인은, Fc 부위의 글리코실화에 특이적으로 의존하는 것들을 제외하고, 사용된다.
따라서, 본 발명의 다른 국면에서, 인간 리포칼린 2의 본 발명의 뮤테인은 인간 리포칼린 2의 제공된 비-천연 리간드의 결합 및/또는 검출에 사용된다. 이러한 용도는 뮤테인을 제공된 리간드를 함유하는 것으로 의심되는 시료와 적합한 조건하에서 접촉시켜 뮤테인과 제공된 리간드 사이에 복합체를 형성하도록 하는 단계, 및 적합한 신호에 의해 복합체화된 뮤테인을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
탐지할 수 있는 신호는 위에서 설명된 바와 같이, 레이블(label)에 의해, 또는 결합으로 인한 물리학적 특성, 즉 복합체 형성 자체의 변화에 의해 유발될 수 있다. 하나의 예는 플라스몬 표면 공명이며, 이의 값은 이로부터 하나가 금박(gold foil)과 같은 표면에 고정되는 결합 파트너(binding partner)의 결합 동안 변화된다.
본 발명에 기재된 인간 리포칼린 2의 뮤테인은 또한 인간 리포칼린 2의 제공된 비-천연 리간드의 분리를 위해 사용될 수 있다. 이러한 용도는 뮤테인을 상기 리간드를 함유하는 것으로 추측되는 시료와 적합한 조건하에서 접촉시킴으로써 뮤테인과 제공된 리간드 사이에 복합체를 형성하도록 하는 단계, 및 시료로부터 뮤테인/리간드 복합체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
제공된 비-천연 리간드의 검출 및 제공된 리간드의 분리를 위한 뮤테인의 사용 모두에 있어서, 뮤테인 및/또는 표적은 적합한 고체 상에 고정될 수 있다.
본 발명의 인간 리포칼린 2 뮤테인은 또한 예비-선택된 부위에 대해 화합물을 표적화시키는데 사용할 수 있다. 하나의 이러한 양태에서, 인간 리포칼린 2의 뮤테인은
*a) 뮤테인을 상기 화합물과 접합시키는 단계, 및
b) 뮤테인/화합물 복합체를 예비-선택된 부위에 전달하는 단계를 포함하여, 기관 또는 조직 내 예비-선택된 부위에 약학적으로 활성인 화합물을 표적화하는데 사용된다.
이러한 목적을 위해, 뮤테인은 목적한 화합물과 접촉시켜 복합체가 형성되도록 한다. 이후에, 뮤테인과 목적한 화합물을 포함하는 복합체는 예비-선택된 부위로 전달된다. 이는 예를 들면, 뮤테인을 표적화 잔기, 예를 들면, 선택된 표적에 대해 결합 친화성을 갖는 항체, 항체 단편 또는 리포칼린 뮤테인 또는 리포칼린 뮤테인 단편에 커플링시킴으로써 달성할 수 있다.
제한되지 않은 이 용도는 약물로 처리되어야 하는 감염된 몸의 일부, 조직 또는 장기와 같은 유기체 내의 미리 선택된 부위에 (선택적으로) 약물을 전달하기 위해서 특히 적합하다. 뮤테인 및 관심의 화합물 사이의 복합체의 형성 외에 뮤테인은 뮤테인 및 화합물의 접합을 생성하기 위해 주어진 화합물과 또한 재반응을 할 수 있다. 상기 복합체와 유사하게 이런 접합은 미리 선택된 표적 부위의 화합물을 전달하는데 적합할 수 있다. 이런 뮤테인 및 화합물의 접합은 뮤테인 및 화합물 각각을 공유적으로 결합하는 링커를 또한 포함할 수 있다. 선택적으로, 이런 링커는 혈류 내에서는 적합하나 세포의 환경 내에서는 결합이 깨질 수 있다.
여기서 개시된 뮤테인 및 이의 유도체는 항체 또는 이들의 단편과 유사한 많은 분야에서 사용될 수 있다. 게다가 지지하기 위한 바인딩의 용도는 이 표적의 주어진 뮤테인 또는 접합 또는 융합 단백질이 고정화되거나 분리되는 것이 가능하게 하고, 뮤테인은 효소, 항체, 방사성 물질 또는 생화학적 활성 또는 정의된 바인딩 특성을 갖는 다른 그룹을 갖는 레이블링을 위해 사용될 수 있다. 이렇게 함으로써, 이들의 표적 또는 접합 또는 융합 단백질 각각은 측정되거나 접촉될 수 있다. 실시예에 있어서, 본 발명의 뮤테인은 확립된 분석 방법(예: ELISA 또는 웨스턴 블럿)의 수단 또는 현미경 또는 immunosensorics에 의해서 화학적 구조를 측정하기 위해서 사용될 수 있다. 여기서, 검출 신호는 항체를 통한 결합된 뮤테인의 면역화학적 검출에 의해 간접적으로 또는 적합한 뮤테인 접합 또는 융합 단백질의 용도에 의해 직접적으로 생성될 수 있다.
본 발명의 뮤테인을 위한 수많은 가능한 응용성은 약물에 존재한다. 게다가 진단 및 약물 전달에 있어 뮤테인의 용도, 본 발명의 돌연변이 폴리펩타이드, 실시예에 있어서, 조직- 또는 종양-특이적 세포 표면 분자를 생성할 수 있는 것을 바인드 한다. 실시예에 있어서, 그런 뮤테인은 복합 형태 또는 "종양 이미징"을 위한 융합 단백질 또는 직접적으로 암치료을 위해서 적용된다.
따라서, 본 발명은 또한 주어진 비-천연 리간드 또는 표적을 갖는 착체 형성을 위한 본 발명의 뮤테인 인간 리포칼린 2의 용도와 관련된다.
또한, 다른 측면에서 본 발명은 약학 조성물의 생성을 위한 본 발명에 따른 뮤테인의 용도를 포함한다. 따라서, 얻어진 약학 조성물은 알츠하이머병과 같은 퇴행성 신경 장애에 적합할 수 있다. 또한, 약학 조성물은 암의 치료, 섬유증 치료 또는 염증의 치료에 사용될 수 있다. 약학 조성물은 단일요법 또는 병용요법으로서 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 뮤테인을 포함하는 진단 또는 분석 키트를 특징으로 한다.
본 발명의 다른 측면은 이를 필요로 하는 대상에 본 발명에 따른 뮤테인을 포함하는 약학 조성물 또는 본 발명의 뮤테인을 각각 투여하는 것을 포함하는, 퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease), 또는 암, 또는 섬유증, 또는 염증으로부터 고통받는 대상을 치료하는 방법과 관련된다.
그런 치료를 필요로 사는 대상은 인간, 개, 마우스, 쥐(rat), 돼지, cymologous 원숭이와 같은 단지 실시예에서 실례가 되는 이름이 지정된 원숭이와 같은 포유류일 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 뮤테인을 포함하는 약학 조성물 또는 본 발명의 뮤테인을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 대상 내 생체 내 이미징하는 방법을 특색으로 한다. 대상은 상기에서 정의된 바와 같을 수 있다.
본 발명은 다음의 비제한적 실시예 및 첨부된 도면에 의해서 자세히 증명된다.
도 1은 성숙한 Lcn2의 아미노산 서열 내 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, 및 134(underlined and numbered)의 20 아미노산 부위의 동시의 무작위 돌연변이유발을 위한 PCR assembly 전략을 나타낸다. 이런 20 부위는 4개의 서열 부분집합으로 나뉘었다. 각각의 부분 집합에서 아미노산의 무작위를 위해서 올리고데옥시뉴클레오타이드는 합성(서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4)되었고, 여기서 뉴클레오타이드의 NNK 혼합물은 변이된 코돈에서 적용되었다. N은 4개의 염기 A,C,G 및 T의 혼합물을 의미하고, K는 단지 2개의 염기 G 및 T의 혼합물을 의미한다; 따라서 이런 삼중자는 앰버 정지 코돈 TAG뿐만 아니라 모든 20개의 자연적 아미노산을 암호화한다. 이는 파지플라스미드복합체의 생성 및 유전자의 발현을 위해 사용된 E. coli supE-strains XL1-blue(Bullock et al., BioTechniques5(1987),376-378) 또는 TG1(Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press) 내의 글루타민으로 바뀌었다. 비-코딩된 가닥(하기에서 기재한 DNA 이중 가닥 서열 3'-5' 방향)과 대응하고 상기 올리고데옥시뉴클레오타이드 사이의 갭을 채우는 뉴클레오타이드 서열로 고정된 4개의 부가적인 올리고데옥시뉴클레오타이드(서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8)는 조립 반응에 또한 사용된다. 과량으로 첨가되고 비오틴 그룹을 운반하는 두 깨의 짧은 인접해 있는(flanking) 올리고데옥시뉴클레오타이드(서열번호 9 및 서열번호 10)는 전체적인 합성의 유전자 단편, 조립된 증폭 PCR을 위한 프라이머로 제공한다. 두 개의 인접해 있는 프라이머 각각은 상호 비-호환적인 효소 소화시의 돌출부를 초래하면서, BstXI 제한 부위(CCANNNNNNTGG)를 포함한다. 제한 부위의 이런 특이 배열은 특히 효율적인 결합과 합성 유전자의 클로닝을 가능하게 하였다. 오리지날 Lcn2 서열에 관하여 아미노산 Gln28에서 His로의 치환은 첫 번째 BstXI 부위를 도입하기 위해서 필요하며, 반면 두 번째 BstXI 부위는 Lcn2의 cDNA 내에서 자연적으로 발생한다. 더욱이, 짝을 이루지 않은 Cys87 잔기는 유전자 조립 동안에 Ser로 대체되었다. one pot PCR 이후에 유전자 단편은 Lcn2 구조 유전자의 누락된 부분을 제공하는 벡터에 삽입되었다. 또한, 이런 예는 두 개의 BstXI 제한 부위의 카세트(cassette) 측면에 배치되고, 이는 이중 가닥 DNA 시퀀싱을 제공하는 각각 두 개의 짧은 프라이머(서열번호 45 및 서열번호 46) 업스트림(upstream) 및 다운스트림(downstream)을 묘사한다.
도 2는 합성 Lcn2 유전자(도 1에서 개시된 것처럼 두 BstXI 제한 부위 측면에 단지 중앙의 카세트가 배치되어 있다)의 뉴클레오타이드 서열를 나타낸다. 이 유전자 단편은 Sloning BioTechnology GmbH에 의해 제조되었고, 이는 도 1에 개시된 DNA 라이브러리와 비교하여 두 가지의 차이점이 있다. 첫째, E. coli 의 발현을 위해 가능한 코돈이 최적화될 때마다 코돈은 변이되지 않은 아미노산 위치를 위해서 사용되었다. 둘째, 19개의 다른 삼중자(GAC, TTC, CTG, CAC, AAT, AGC, ACC, GCA, ATG, CCT, GTT, TGG, GAG, CAA, ATC, GGA, CGT, GCA, TAC)의 혼합물은, 각각 Cys를 제외하고 다른 아미노산을 코딩하는, 도 1에 묘사된 것과 동일한 20의 무작위 위치에서 적용되었다. 아미노산의 번호는 여기서 Sloning BioTechnology GmbH에 의해 적용된 내부 구조와 일치하고, 그것에 의해 Gly no. 1은 상류 BstX1 제한 부위에 따라 직접적으로 첫 번째 아미노산 코돈이다.
도 3은 E. coli 발현 이후의 재조합 Aβ융합 단백질 Trx- Aβ28(A) 및 MBP- Aβ40(B)의 SEC 용출 프로파일을 보여준다. 합성 Aβ40 및 재조합 Aβ융합 단백질 모두의 순도는 SDS-PAGE 분석(C)에 의해 평가되었다. 융합 단백질 모두는 E. coli JM83의 세포질에서 발현되었다. French Pressure Cell을 갖는 세포의 파열 이후에 단백질은 파열 친화성 크로마토그래피를 통해 정제되었고, 다음으로 Trx- Aβ28의 경우 Superdex 75 HR 10/30 컬럼 또는 MBP- Aβ40 경우 Superdex 200 HR 10/30 컬럼에 적용되었다. 모든 단백질은 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 모노머로서 주로 녹여서 분리되었고, 정화 후 필수적으로 균질화 되었다. Keck Foundation로부터 수득된 Ab40는, HFIP로 처리되었고, SpeedVac로 증발되었으며, 최종적으로 증류된 H2O에 용해되었다. 15% 겔은 HFIP로 처리 및 Trx-Ab28후의 Ab40 및 IMAC 정화 및 SEC 후의 MBP-Ab40의 샘플을 보여준다. M은 젤의 왼쪽에 표시된 kDa의 밴드 사이즈와 대응하는 것을 갖는 분자량 마커를 의미한다.
도 4는 Lcn2 뮤테인 H1-G1, S1-A4, 및 US7(A)의 SEC 용출 프로파일의 오버레이 및 15% SDS-PAGE(B)를 통한 정제된 단백질의 분석을 나타낸다. 세 Lcn2 뮤테인 H1-G1, S1-A4, 및 US7는 E. coli JM83 또는 TG1-F-(여기에서 개시된)의 세포질 내에서 발현되고 Strep-tag II 친화성 크로마토그래피를 통해 정제되었다. 10-11ml의 보존 체적을 갖는 Superdex 75 HR 10/30 컬럼으로부터 대부분 모노머의 단백질로서 모든 세 개의 뮤테인은 녹여서 분리되었다. 피크의 강도는 특정 뮤테인의 발현 양에 따라 달랐다. (B)는 Strep-tag II 친화성 정화 및 SEC 이후에 재조합 야생형 Lcn2(lanes 1, 5) 및 뮤테인 US7(lanes 2, 6), H1-G1(lanes 3, 7), 및 S1-A4 (lanes 4, 8)의 15% SDS-PAGE 분석을 나타낸다. Lanes 1-4는 2-메르캅토에탄올에 의해 감소된 Lcn2 뮤테인을 나타내고, lanes 5-8은 감소되지 않은 상태 하의 단백질을 나타낸다. M은 겔의 왼쪽 위에 진열된 kDa 내의 밴드 사이즈에 대응하는 분자량 마커를 나타낸다.
도 5는 다른 비오틴과 결합한 Aβ표적을 갖는 캡처 ELISAs 내 Lcn2 뮤테인 H1-G1, S1-A4, 및 US7의 바인드 활성을 나타낸다. 10 mg/ml에서 StrepMAβ-Immo는 미세역가 플레이트에 고정되고, Strep-tag II를 통한 1 mM Lcn2 뮤테인의 캡처를 위해서 적용되었다. 도 5A에서 C는 비오틴과 결합한 Aβ40(A), 비오틴과 결합한 Trx-Aβ28(B) 및 비오틴과 결합한 MBP-Aβ40(C)에 대한 Lcn2 뮤테인 S1-A4 및 US7의 바인딩을 나타낸다. 바인딩은 ExtrAvidin/AP로 배양 및 pNPP와 반응하는 다음의 색소생산성에 의해 탐지되었다. ovalbumin(Ova), 티오레독신(Trx), 및 말토오스 결합 단백질(MBP)은 음성 대조군으로 사용되었다. 또한, 야생형(wt) 리포칼린의 바인딩을 측정하였다. 데이터는 1가의 바인딩 모델로 적합하였다. 도 5D는 표적으로서 Lcn2 H1-G1 및 비오틴과 결합한 Aβ40 및 Trx-Aβ28으로 실행된 동일한 ELISA setup을 나타낸다. Aβ40을 위해서 결정된 KD 값은 S1-A4에서 2.7 nM, US7에서 6.8 nM, 및 H1-G1에서 16.2 nM, Trx-Aβ28을 위해 대응하는 값은 1.9 nM, 2.4 nM, 및 24.3 nM 였다. MBP-Aβ40에 대한 바인딩은 S1-A4에서 4.7 nM 및 US7에서 11.4 nM의 KD 값을 나타내었다. 따라서, Aβ16-27을 위한 KD 값은 2.6 nM 및 2.1 nM 였다.
도 6은 direct ELISA 내에서 Lcn2 뮤테인 S1-A4 및 US7의 바인딩 활성을 나타낸다. 제어 단백질 말토오스 결합 단백질(MBP) 뿐만 아니라 Aβ표적 Trx-Aβ28 및 MBP-Aβ40는 하룻밤 동안 PBS내 2 mM에서 고정화되었다. 바운드(bound) Lcn2 뮤테인은 스트랩타아비딘/AP을 사용하여 그들의 Strep-tag II을 통해 감지되었고 pNPP와 색소색산성 반응이 뒤따랐다. 대조군으로서, 야생형(wt) 리포칼린의 바인딩을 측정하였다. 데이터는 1가의 바인딩 모델로 적합하였다. Trx-Aβ28을 위한 결정된 KD 값은 S1-A4에서 16.2 nM 및 US7에서 9.6 nM였고, MBP-Aβ40을 위해 대응하는 값은 149 nM 및 49.7 nM였다.
도 7은 competitive ELISA내 Lcn2 뮤테인 S1-A4(A) 및 US7(B)의 바인딩 활성을 나타낸다. StrepMAβ-Immo는 미세역가 플레이트 위에서 10 mg/ml로 고정되었고 Strep-tag II 통해 1 mM Lcn2 뮤테인의 캡처를 위해 적용되었다. 경쟁을 위해서 추적자로서 비오틴과 결합한 Trx-Aβ28의 일정한 농도는 레이블 되지 않은 Trx-Aβ28의 다양한 농도와 혼합되었다. 바운드 비오틴과 결합한 Trx-Aβ28는 ExtrAvidin/AP로 배양을 통해 이후에 감지되었고 pNPP과 색소생산성 반응이 뒤따랐다. 데이터는 sigmoidal 방정식을 사용하여 알맞게 되었다. KD 값은 S1-A4에서 21.7 nM 및 US7에서 6.9 nM 였다.
도 8은 10 ml/min의 유속에서 Biacore 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 S1-A4(A) 및 US7(B)의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다. MBP-Aβ40 융합 단백질은 CMD 200I 칩(DRU = 1455)에 amine chemistry를 통해 결합되었고, 정제된 Lcn2 뮤테인은 다양한 농도로 적용되었다. 측정된 신호는 회색 선으로 표시된 반면에 보정 곡선은 각 경우에 검정 선으로 묘사되었다. 모든 뮤테인의 kon 및 koff의 비율은 상당히 다르다(kon(S1-A4) = 0.4805 M-1s-1, kon(US7) = 2.0205 M-1s- 1, koff(S1-A4) = 8.360-5 s-1, koff(US7) = 25.20-5 s-1). 그러나, 총 KD 값은 S1-A4에 대해서 1.74 nM, US7에 대해서 1.25 nM로 매우 유사하였다.
도 9는 티오플라빈 T 집계 분석으로 측정된 Lcn2 뮤테인 S1-A4 및 US7의 기능적 활성을 나타낸다. 100 mM의 Aβ40은 교반 없이 37℃에서 10 mM의 US7, S1-A4, 야생형(wt) 리포칼린 또는 PBS로 배양되었다. 20 ml의 각 샘플의 지정된 시간 위치에서 5 mM의 티오플라빈 T 180 ml으로 혼합되었고 형광은 450 nm의 여기 파장 및 482 nm의 방출 파장에서 측정되었다. Lcn2 뮤테인 US7은 1:10의 비율(US7:Aβ40)에서 집합을 가능한 억제하는 것으로 나타났다. S1-A4는 상기 비율로 집합을 상당히 억제할 수는 없었지만 1:2의 비율(S1-A4:Aβ40)에서 분명하게 억제를 하였다. 야생형 Lcn2는 Aβ 집합에 대해 억제효과를 나타내지 않았다.
도 10은 Coomassie 밝은 파랑으로 염색 후, 이온 교환 크로마토그래피 후, 재조합 ED-B(lane 1), FN7B8(lane 2), 및 FN789(lane 3)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 모든 샘플은 2-메르캅토에탄올로 감소되었다. M:분자량 마커(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)
도 11은 Coomassie 밝은 파랑으로 염색 후, Strep-tag II 친화성 정화 후, Lcn2 뮤테인 N7A(lane 1), N7E(lane 2), N9B(lane 3), 및 N10D(lane 4)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 모든 샘플은 2-메르캅토에탄올로 감소되었다. M:분자량 마커(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)
도 12는 ELISA의 바인딩 활성을 묘사한 것이다. 미세역가 플레이트는 정제된 단백질 FN7B8 및 FN789로 코팅되었고, 선택된 Lcn2 뮤테인의 희석 시리즈로 배양되었고, 스트렙타아비딘-알칼리-포스파타아제 접합 및 pNPP 기질로 측정이 뒤따랐다. 재조합 Lcn2 뮤테인 N7A, N9B, 및 N10D는 FN789를 위한 분석에서 무시할만한 신호가 나타났고, 이는 ED-B가 부족했고 음성 대조군으로서 제공했다.
도 13은 Biacore 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 N9B의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다. FN7B8는 CMD 200 센서칩(△RU = 500)에 amine chemistry를 통해 결합되었고 정제된 Lcn2 뮤테인은 다양한 농도로 적용되었다. 측정된 신호는 회색 선으로 표시된 반면에 보정 곡선은 각 경우에 검정 선으로 묘사되었다. 이 곡선 세트로부터 결정된 운동 상수(kinetic constant)는 표 2(실시예 17)에 개시된다.
도 14는 Biacore 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 N7E의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다. FN7B8는 CMD 200 센서칩(△RU = 500)에 amine chemistry를 통해 결합되었고, 정제된 Lcn2 뮤테인은 다양한 농도로 적용되었다. 측정된 신호는 회색 선으로 표시된 반면에 보정 곡선은 각 경우에 검정 선으로 묘사되었다. 이 곡선 세트로부터 결정된 운동 상수는 표 2(실시예 17)에 개시된다.
도 15는 Biacore 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 N7A의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다. FN7B8는 CMD 200 센서칩(△RU = 500)에 amine chemistry를 통해 결합되었고 정제된 Lcn2 뮤테인은 다양한 농도로 적용되었다. 측정된 신호는 회색 선으로 표시된 반면에 보정 곡선은 각 경우에 검정 선으로 묘사되었다. 이 곡선 세트로부터 결정된 운동 상수는 표 2(실시예 17)에 개시된다.
도 16은 Biacore 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 N10D의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다. FN7B8는 CMD 200 센서칩(△RU = 500)에 amine chemistry를 통해 결합되었고 정제된 Lcn2 뮤테인은 다양한 농도로 적용되었다. 측정된 신호는 회색 선으로 표시된 반면에 보정 곡선은 각 경우에 검정 선으로 묘사되었다. 이 곡선 세트로부터 결정된 운동 상수는 표 2(실시예 17)에 개시된다.
도 17은 Lcn2를 갖는 S1-A4(서열번호 39), US-7(서열번호 41), H1-G1(서열번호 43), N7A(서열번호 20), N7E(서열번호 22), N9B(서열번호 24) 및 N10D(서열번호 26)로 지정된 인간 Lcn2 뮤테인의 서열 정열을 나타낸다. 서열 아래의 마지막 선은 리포칼린의 두 번째 구조적 특징을 나타낸다(Schfeld et al. (2009) PUSc . N Nl . Acad. Sci . USA 106, 8198-8203).
도 18은 Lcn2 뮤테인 H1GA 및 H1GV(A)의 SEC 용출 프로파일의 오버레이 및 15% SDS-PAGE(B)를 통한 정제된 단백질의 분석을 나타낸다. 두 Lcn2 뮤테인 H1GA 및 H1GV는 E. coli JM83의 주변세포질 내에서 발현되고 Strep-tag II 친화성 크로마토그래피를 통해 정제된다. 10~11ml의 보존량을 갖는 Superdex 75 HR 10/30 컬럼으로부터 모노머의 단백질로서 대부분의 뮤테인 모두는 녹여서 분리되었다. 피크의 강도는 뮤테인의 발현양에 의존하여 변한다. 도 18(B)는 Strep-tag II 친화성 크로마토그래피 및 SEC 후에 재조합 Lcn2 뮤테인 H1-G1, H1GA, 및 H1GV의 15% SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 모든 세 Lcn2 뮤테인은 2-메르캅토에탄올을 사용하여 감소된 조건 하에 표시되었다. M은 분자량 마커를 나타낸다.
도 19는 비오틴과 결합한 Aβ 표적 Aβ40(A) 및 Trx-Aβ28(B)를 갖는 capture ELISAs 내의 Lcn2 뮤테인 H1GA, H1GV, 및 H1-G1의 바인딩 활성을 나타낸다. StrepMAB-Immo는 미세역가 플레이트 위에 10 mg/ml 고정화되었고 Strep-tag II를 통해 1 mM의 Lcn2 뮤테인을 포획하기 위해서 적용되었다. 비오틴과 결합한 표적의 바인딩, 희석 시리즈에서 적용된, ExtrAvidin/AP로 배양 및 다음으로 pNPP로 색소생산성의 반응으로 측정되었다. 비오틴과 결합한 ovaalbumin(Ova) 및 티오레독신(Trx)은 음성 대조군으로서 사용되고 Lcn2 뮤테인에 대해 바인딩을 나타내지 않았다. 데이터는 1가의 바인딩 모델에 보정되었다. Aβ40을 위해서 결정된 KD 값은 H1GA에서 4.2 nM, H1GV에서 4.9 nM, 및 H1-G1에서 21.5 nM 였다; Trx-Aβ28을 위한 대응하는 값은 각각 3.8 nM, 4.2 nM, 및 24.4 nM.
도 20은 20㎕/min의 유속에서 Biacore X 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 H1GA(A) 및 H1GV(B)의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다. MBP-Aβ40 융합 단백질은 CMD 200I 센서칩(△RU = 1316)에 amine chemistry를 통해 결합되었고 정제된 Lcn2 뮤테인은 다양한 농도로 적용되었다. 측정된 신호는 회색 선으로 표시된 반면에 보정 곡선은 각 경우에 검정 선으로 묘사되었다. 모든 뮤테인의 kon 및 koff의 비율은 다음과 같이 계산되었다: kon(H1GA) = 5.77·104 M-1s-1, kon(H1GV) = 6.84·104 M-1s-1, koff(H1GA) = 2.75·10-5 s-1, koff(H1GV) = 7.26·10-5 s-1. 전체 KD 값은 H1GA에서 0.476 nM, H1GV에서 1.06 nM 였다.
도 21은 높은 농도에서 측정된 기록에 있어서 확장된 분해 시간을 사용하여 고정된 Aβ40은 Biacore T100 기구로 측정된 Lcn2 뮤테인 H1GA의 운동의 실시간 분석에 관한 것이다. 표적 펩타이드 Aβ40은 Biacore CM5 칩(△RU =325)에 amine chemistry를 통해 결합되었고, 정제된 Lcn2 뮤테인은 30㎕/min의 유속으로 적용되었다. 낮은 koff 비율의 정확한 측정을 위해서, 분리는 7200 s로 가장 높은 농도에서 실행되었다. kon 비율은 300 s의 시간으로 결합 및 분해를 갖는 Lcn2 뮤테인 H1GA의 희석 시리즈를 사용하여 결정되었다. H1GA를 위한 운동의 값은 다음과 같다: kon = 1.25·105 M-1s-1, koff = 1.18·10-5 s-1, 및 KD = 0.095 nM.
도 22 (A)는 티오플라빈 T 집계 분석에서 테스트한 Lcn2 뮤테인 H1GA의 기능적 활성을 보여준다. 1 mg/ml 모노머 Aβ의 500μℓ는 37℃, 0.5×PBS에서 교반하면서 Lcn2 뮤테인 H1GA의 다른 몰 비율의 부재 또는 존재에서 배양되었다. 집계 반응은 3번 실행되었다. 형광 측정은 정기적인 간격으로 촬영된 샘플의 20μℓ는 0.5×PBS 내의 50μM의 최종 농도에서 180μℓ로 각각 혼합되었고, 450nm의 여기 파장 및 482nm의 방출 파장에서 분석되었다. Lcn2 뮤테인 H1GA은 몰 비율에서 집합의 강한 억제를 나타내었다. 10:2(Aβ40:H1GA) 집합의 subequimolar 비율에서 여전히 상당하게 감소되었다. 도 22(B)는 반대로, 음성 대조군으로서 BSA 또는 Lcn2도 아닌 몰 양은 Aβ40 집합에 억제 효과를 가졌다.
도 23은 Lcn2 뮤테인 H1GA 및 H1GV을 위한 표면 플라스몬 공명뿐만 아니라 다른 ELISA setups 내 결정된 KD 값의 요약에 관한 것이다.
도 24는 Lcn2(서열번호 44)를 갖는 Lcn2 뮤테인 S1-A4(서열번호 39), US7(서열번호 41), H1-G1(서열번호 43), H1GA(서열번호 50), H1GV(서열번호 52), N7A(서열번호 20), N7E(서열번호 22), N9B(서열번호 24), 및 N10D(서열번호 26)의 서열 정렬에 관한 것이다.
도 25는 전구체 H1-G1(서열번호 43) 및 wt Lcn2(서열번호 44)를 갖는 뮤테인 H1GA(서열번호 50) 및 H1GV(서열번호 52)의 상호 서열 정렬에 관한 것이다.
도 26은 ELISA 내에서 FN7B8을 위한 Lcn2 변종 N7E의 특이 바인딩 활성을 나타낸다. 미세역가 플레이트는 FN7B8, FN789, BSA 또는 ovalbumin으로 코팅되었고 N7E의 희석 시리즈로 배양되었으며, 스트렙타아비딘-알칼리-포스파타아제 접합 및 pNPP 기질로 측정되는 것이 뒤따랐다. Lcn2 변종 N7E는 FN789, BSA 및 ovalbumin을 위한 측정에서 무시할 만한 신호를 나타냈다.
도 27은 Biacore X로 측정한 Lcn2 변종 N7A (A), N7E (B), N9B (C) 및 N10D (D)의 운동 실시간 분석을 나타낸 것이다. 단일 피브로넥틴 도메인 ED-B는 CMD 200 m 센서 칩(△RU =180)에 대한 amine chemistry를 통해 결합되었고 정제된 Lcn2 변종은 다양한 농도에서 적용되었다. 측정된 신호는 곡선에 함께 일치하여 기록으로서 보여진다. 이런 sensorgrams로부터 측정된 운동 상수는 표 3개 개시되어 있다(실시예 24).
도 28는 Lcn2 변종 N7A (A), N10D (B), N9B (C) 및 N7E (D)의 사이즈 배제 크로마토그래피의 분석을 나타낸 것이다. 친화성- 정제 단백질은 TBS로 평형을 유지하고 Superdex S75 10/30 컬럼으로 적용시켰다. 화살표는 컬럼(6.7 ml)의 배제 부피를 나타낸다. 분석의 겔 여과는 4개의 Lcn2 변종 각각의 현저한 피크로 나타났다. 단백질의 명백한 분자량은 단지 모노머의 종(species)의 존재를 나타내면서, N7A은 21.0 kDa, N10D는 21.3 kDa, N9B는 21.7 kDa 및 N7E는 21.7 kDa였다.
< 실시예 1: 변이 Lcn2 파지 디스플레이 라이브러리의 구축>
Lcn2 변종의 조합 라이브러리는 두 번째 BstXI 제한 부위에 도입하기 위한 Gln28His뿐만 아니라 단일 짝 안지(unpair)은 티올 사이드 체인(Goetz et al. (2000) Biochemistry 39, 1935-1941)을 제거하기 위해서, 아미노산 대체물의 Cys87Ser을 운반하는 복제된 cDNA에 근거하여 생성(Breustedt et al. (2006) Biochim. Biophys . Acta 1764, 161-173)되었다. 이 반응의 돌연변이유발 및 PCR(polymerase chain reaction) 어셈블리(assembly)는 도 1에 개시된 올리고데옥시뉴클레오타이드(서열번호 1-10)를 갖는 원 팟(one pot) 증폭반응을 사용하여 공지된 기술(Beste et al. (1999) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 96, 1898-1903; Skerra (2001) J. Biotechnol. 74, 257-275)에 따라서 본질적으로 실행되었다. 올리고데옥시뉴클레오타이드는 코딩 가닥(coding strand)에 대응하는 서열번호 1-4를 갖는 프라이머를 갖도록 설계되었고, 각각 36, 40, 41, 49, 52, 또는 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 또는 96, 100, 103, 106, 또는 125, 127, 132, 134의 아미노산 위치에서 퇴보한 코돈을 운반하였다. 반면에, 코팅되지 않은 가닥에 대응하는 서열번호 9 및 서열번호 5-8을 갖는 두 개의 인접한 프라이머(flanking primers)를 초과사용하였고 집합된 랜덤 유전자 단편을 증폭시키기 위해 제공되었다. 모든 PCR 과정은 기술(Schlehuber et al. (2000) J. Mol . Biol . 297, 1105-1120)된 대로 Go-Taq Hot Start DNA polymerase(Promega, Mannheim, Germany)을 사용하여 실행되었다.
퇴보한 코돈을 운반하지 않는 올리고데옥시뉴클레오타이드를 Metabion (Munich, Germany)에서 HPLC 등급으로 구매하였다. NNK-함유하는 올리고데옥시뉴클레오타이드를 같은 공급업체로부터 탈염된 것을 구매했고, urea PAGE을 사용하여 추가적으로 정제하였다. 결과 DNA 라이브러리는 BstXI(Promega, Mannheim, Germany)로 절단하였고, 일반 발현 벡터 pASK111(Vogt and Skerra (2001) J. Mol . Recognit. 14 (1), 79-86)에 기초한 파지플라스미드 벡터 pASK111(Vogt and Skerra (2001) J. Mol . Recognit . 14 (1), 79-86)로 복제되었고, OmpA 신호 펩타이드로 구성된 융합 단백질, 변형된 성숙한 Lcn2를 위해 코드하며, 앰버 코든 및 실모양의 박테리오 파지 M13의 C-터미널 단편의 유전자 III 을 덮는 단백질 예를 들면, 앞에서 개시된 bilin-바인딩 단백질(Beste et al., supra; Skerra, supra)과 유사한 단백질이 뒤따랐다. 8,4 ㎍ digested PCR 생산물 및 94 ㎍ digested 플라스미드 DNA의 리게이션(ligation) 혼합물을 갖는 E. coli XL1-Blue(Bullock et al. (1987) Biotechniques 5, 376-378)의 전기 천공법 이후에 1 x 1010 개의 변형체를 얻었다.
대신에, 도 2에서 묘사된 복제된 합성 Lcn2 랜덤 라이브러리는 Sloning BioTechnology GmbH(Puchheim, Germany)로부터 획득하였다. 두 BstXI 제한 부위에 의해 측면의 중앙 유전자 카세트(cassette)는 적합한 프라이머(서열번호 9 및 서열번호 10)를 사용하여 증폭되었고, 1,7 x 1010 독립 형질전환체에 대응하는 복잡한 특징을 갖는 라이브러리를 생산하는 phNGAL108(서열번호 12)에 서브클로닝되었다. 일반 발현 벡터 pASK75(Skerra (1994) Gene 151, 131-135)에 기초한 phNGAL108는 OmpA 신호 펩타이드로 구성된 융합 단백질, 변형된 성숙한 Lcn2, 앰버 코든에 뒤따르는 Strep-tag, 및 실모양의 박테리오 파지 M13의 전체 길이의 유전자 III을 덮는 단백질을 위해 코드한다.
라이브러리 생성에 있어서 다음의 과정은 Lcn2 라이브러리 모두를 위해 동일하게 수행되었다. 각각 phNGAL102 또는 phNGAL108에 근거한 플라스미드 벡터로 변형된 세포를 포함하는, 파지 pIII 융합 단백질로서 리포칼린 뮤테인의 라이브러리를 위한 코딩된, 100 ml의 배양액은 멸균 Erlenmeyer 플라스크로 이동되었고, 항생제 선택 없이 2YT 배지에서 37℃, 160rpm으로 한 시간 동안 배양되었다. VCS-M13 헬퍼 파지로 감염 전에 배양액은 2YT 배지 내에서 추가된 대응 항생제를 갖는 0,1의 OD550로 희석되었고, 0,6의 OD550가 도달될 때까지 동일한 조건 하에서 성장하였다. 약 10회의 다수의 감염에서 VCS-M13 헬퍼 파지(Agilent Technologies, La Jolla, USA)로 감염 후에 배양액을 37℃, 100 rpm에서 추가적으로 30분 동안 흔들었다. 그 다음에 인큐베이터 온도를 26℃로 낮추었고 흔드는 속도는 다시 160 rpm로 증가되었고 10분 후에 카나마이신(70㎍ /ml)이 첨가되었고 25㎍ /l (125μℓ of a 200㎍ /ml stock solution in 디메틸포름아미드, DMF per liter of culture)에서 언하이드로테트라사이클론(ACROS Organics, Geel, Belgium)을 통해 유전자 발현의 유도가 뒤따랐다. 배양은 26℃, 160 rpm에서 다른 12-15 시간 동안 계속되었다. 완전한 배양액으로부터의 세포는 원심분리(30분, 18000 g, 4℃)에 의해 침전되었다. 파지플라스미드복합체 입자를 포함하는 상등액은 멸균-여과(0.45㎛)되었고, 1/4 volume 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl로 혼합되었고, 적어도 2 시간 동안 얼음에서 배양되었다. 원심분리(30분, 18000 g, 4℃) 후에 1 리터의 배양액으로부터 침전된 파지플라스미드복합체 입자는 50 mM의 벤즈아미딘(benzamidine)(Sigma) 및 Pefabloc 1㎍ /ml(Roth, Karlsruhe, Germany)을 포함하는 30 ml의 시원한 BBS/E (200 mM Na-borate, 160 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0)내에서 용해되었다. 용액은 1 시간 동안 얼음 위에서 배양되었다. 용해되지 않은 성분의 원심분리(10분, 43000 g, 4℃) 이후에 각 상등액을 새로운 반응조로 이동하였다. 20 % w/v PEG 8000, 15 % w/v NaCl 1/4 부피의 추가 및 아이스에서 60분 동안 배양은 파지플라스미드복합체 입자를 파지플라스미드복합체가 정제되고 저장을 위해서 -80°C에서 얼 때까지 다시 응결시키기 위해서 제공하였다. 첫 번째 선택 사이클 파지플라스미드복합체는 해동되고 원심분리(30분, 34000 g, 4°C) 되었고, 상등액은 제거되었으며, 침전된 파지플라스미드복합체 입자는 용해되었고 50 mM의 벤즈아미딘을 포함하고 있는 총 400㎕의 PBS로 결합되었다. 아이스에서 30분 동안의 배양 후에 용액은 잔류 집합체를 제거하기 위해서 원심분리(5분, 18500 g, 4°C)되었고 상등액은 파지디스플레이 선택을 위해서 직접적으로 사용하였다.
< 실시예 2: 다른 포맷에서의 Aβ 표적의 제조>
성숙한 베타-아밀로이드 서열(Dodel et al. (2003) Lancet Neurology 2, 215-220)의 1 내지 40의 아미노산에 대응하는 Aβ40 펩타이드(서열번호 29)를 합성, 라이신 스페이서(Peptide Speciality Laboratory, Heidelberg, Germany)를 통해서 C-터미널 비오틴 그룹에 부착되거나 비-레이블된 형태(W. M. Keck LAβoratory, New Haven, USA)를 갖는 동결건조된 펩타이드를 구입하였다. 동종의 모노머의 Aβ40은 상온에서 적어도 0.5 시간 동안 0.5 mL의 1,1,1,3,3,3-헥사풀루오로-2-프로판올(HFIP; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)내 5 mg의 펩타이드를 용해함으로써 얻었다. 그 뒤에, HFIP는 SpeedVac concentrator에서 증발되었고, Aβ40은 증류한 물의 적합한 부피에서 용해되었고, 15분 동안 차가운 물에서 초음파 분해(Bandelin, Sonorex, RK100, Germany)가 뒤따랐다. 0.22㎛ 필터(Spin-X Centrifuge Tube Filter; Corning, USA)로 여과 후에, 단백질 농축은 1490 M-1cm-1의 계산된 소거 계수를 사용하여(Gasteiger et al. (2003) ExPASy: 심층 단백질의 프로테오믹스는 심층 단백질 인식 및 분석을 위한 서버. nucleic acids Res. 31, 3784-3788, http://www.expasy.ch/tools/protparam.html) 280 nm에서 흡수 측정에 의해 결정되었다.
N-터미널 펩타이드 Aβ1-11(서열번호 30) 및 중심의 펩타이드 Aβ16-27(서열번호 31)과 같은 베타-아밀로이드의 더 짧은 버전은 펩타이드 전문 연구실에서 구매하였다. 이런 더 짧은 버전은 사전의 HFIP 처리 없이 선택된 버퍼에서 곧바로 용해되었다.
합성 펩타이드 이외에, 다른 재조합 Aβ 융합 단백질을 암호화하는 두 개의 벡터는 박테리아 발현의 목적을 위해서 구축하였다: 첫째, 말토오스 결합 단백질(MBP, pMBP-His, 서열번호 32)을 갖는 융합 단백질은 pASK75-MBP-Abeta40(서열번호 33)을 발생한 Hortschansky et al.((2005) Protein Sci . 14, 1753-1759)에 따라 구축되었다. 둘째, 성숙한 아밀로이드 펩타이드의 1 내지 28의 아미노산이 티오레독신(Trx, pASK75-TrxH6, 서열번호 35)의 활성 부위 루프에 주입되어 있는 SK75-Trx Abeta28H6(서열번호 34)는 Moretto et al.((2007) J. Biol . Chem . 282, 11436-11445)에 따라 구축되었다.
말토오스 결합 단백질의 유전자를 갖는 프레임 내의 확장된 N-터미널을 운반하는 인간 Aβ40의 연속 클로닝은 벡터 pASK75(Skerra (1994) Gene 151, 131-135)의 새로운 플라스미드 pASK75-MBP-Aβ40의 유도체를 산출하였다. 이 벡터는 말토오스 결합 단백질의 융합 단백질을 인코드하고, 인간 Aβ40의 서열 뿐만 아니라 융합 단백질의 쪼개김을 위한 TEV(tobacco etch virus) 인식 부위, 손쉬운 단백질 정화를 위한 His6-tag가 뒤따랐다. 벡터는 테트라사이클린 프로모터/오퍼레이터 시스템의 엄격한 제어하에서, E. coli.의 세포질 내의 높은 산출의 융합 단백질의 발현을 가능하게 한다.
성숙한 아밀로이드 펩타이드(Aβ28)의 아미노산의 1 에서 28까지를 코딩하는 서열는 벡터 pASK75-Trx-Abeta28H6를 산출하는 티오레독신의 활성 부위 루프(아미노산 잔기 34 및 35에 대응하는 뉴클레오타이드 위치 99-105)내 특이 CpoI 부위를 통해 티오레독신 루프로 주입되었다.
융합되지 않은 제어 단백질 Trx 및 MBP뿐만 아니라 Aβ 융합 단백질, Trx-Aβ28 및 MBP-Aβ40 모두 37 ℃에서 대장균 JM83(Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33, 103-119) 내에서 발현되었다. 단백질의 발현은 물이 없는 디메틸포름아미드(DMF; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)에 용해된 200 mg/l의 언하이드로테트라사이클론(aTc; Acros, Geel, Belgium)을 첨가하고 3시간 동안 교반하면서 계속적인 배양을 함으로써, 0.5 OD550의 최적의 농도에서 유도되었다. 세포는 20분 동안 4 ℃에서 4200 g의 원심분리에 의해 수확되었다. 2 L의 배양액으로부터의 세포 펠렛은 용해 버퍼(100 mM Tris/HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA)내에서 재차 현탁되었고 결과 현탁액은 French Pressure Cell을 통해 세 번의 흐름에 의해서 균질화 되었다. 불용성 물질은 원심분리(34500 g, 4℃, 20 분)에 의해서 제거되었고, 상등액은 0.45 mm 필터(Filtropur S 0.45; Sarstedt, Nuembrecht, Germany)로 여과되었으며, 각 단백질의 His6-tag를 통해서 친화성 정화를 위해서 사용되었다. 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)이후에, 융합 단백질은 추가적으로 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)를 통해서 정제되었다.
단백질 농축은 MBP(서열번호 32)에 대해서 66350 M-1cm-1, MBP-Aβ40(서열번호 33)에서 69330 M-1cm-1, Trx-Aβ28(서열번호 34)에서 15470 M-1cm-1, 및 Trx(서열번호 35)에서 13980 M-1cm-1의 계산된 소거 계수를 사용하여 280 nm에서 흡수를 측정함으로써 결정되었다(Gasteiger et al., supra).
대조 단백질로서 사용되는 ovalbumin(Ova; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany), Trx, 및 MBP뿐만 아니라 모든 Aβ 융합 단백질s, Trx-Aβ28 및 MBP-Aβ40의 다음의 실험은 2:1의 몰 비율에서 비오틴 또는 디곡시제닌(DIG)로 레이블되었다(레이블된 시약: 표적 단백질).
이를 위하여, 물이 없는 디메틸포름아미드(DMF; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) 또는 디메틸설폭시화물(DMSO; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)에 용해된 D-바이오티노일-e-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드 에스테르(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 또는 디곡시제닌-3-O-메틸카르보닐-e-아미노카프로산-N-하이드록시석신이미드 에스테르(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)는 PBS(4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7.4)내의 단백질에 2-fold 몰 비율로 첨가되었다. 혼합물을 상온에서 1시간 동안 회전하였다. 그리고, 잔여하고 있는 활성 NHS 에스테르 그룹을 포화시키기 위해서 10분 동안, 1 M Tris/HCl pH 8.0은 10 mM의 최종 농도로 첨가하였고 레이블된 단백질은 Superdex 75 HR 10/30 컬럼(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)의 SEC를 통해서 정제되었다. 파지디스플레이 선택에 표적으로서 사용하기 위해서 Trx-Aβ28는 1시간 동안 디곡시제닌으로 먼저 레이블되었고, 그리고-짝 짓지 않은 Cys 잔기를 차단하기 위해서- 50-fold 초과된 몰의 요오드아세트아미드(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)가 첨가되었고, 1시간 동안 배양이 뒤따랐다. 그 후, 수정된 단백질은 1 M Tris/HCl pH 8.0로 처리되었고 위에서와 같이 정제되었다.
< 실시예 3: 파지디스플레이에 의해 Aβ40 펩타이드에 대해 친화성을 갖는 Lcn2 뮤테인의 선택>
약 1012의 각각의 패닝 사이클을 위해서 PBS(4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7.4)내의 재조합 파지플라스미드복합체는 1시간 동안 PBS/T(0.1 % (v/v) Tween 20을 함유한 PBS [polyoxyethylene sorbitan monolaurate; AppliChem, Darmstadt, Germany])내의 2 % (w/v) BSA로 차단되었다. 스트랩타아비딘-코팅된 자성 비드 현탁액(Dynabeads M-280 스트랩타아비딘; Dynal Biotech, Invitrogen, Karlsruhe, Germany and 스트랩타아비딘 자성 입자; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)의 50 및 25 μL의 부분은 PBS/T로 개별적으로 세척되었고 1시간 동안 PBS/T 내의 2 % (w/v) BSA로 차단되었다. 비드에 특이적인 파지플라스미드복합체를 제거하기 위해서 25 μL의 차단된 비드는 차단된 파지플라스미드복합체의 사전 흡수를 위해서 사용되었고, 50 μL는 사이클 선택을 위해서 사용되었다.
차단된 파지플라스미드복합체는 25 μL의 세척되고 차단된 스트랩타아비딘-코팅된 자성비드로 30분 동안 배양되었다. 비드를 단일 튜브 자성 스탠드(Promega, Mannheim, Germany)로 2분 동안 헐었고, 비드에 결합되지 않은 파지플라스미드복합체를 함유한 상등액은 1~2 시간 동안 실시예 2로부터의 400μL의 총 부피 내의 100nM의 비오틴결합된 Aβ40로 배양되었다. 파지플라스미드복합체 및 펩타이드 표적 혼합물은 50μL 차단된 비드(beads)로 0.5시간 배양되었고, 그 뒤에 2분 동안 단일 튜브 자성 가닥으로 헐었다. 결합되지 않은 파지플라스미드복합체를 함유한 상등액은 폐기 처분되었다. 자성비드에 결합된 표적/파지플라스미드복합체는 400 μL의 PBS/T로 10회 세척되었고, 그리고 결합된 파지플라스미드복합체는 350μL 0.1 M 글리신/HCl, pH 2.2로 10분 동안 회전하에 녹여서 분리되었고, 55 μL 0.5 M Tris base로 즉시 중화되었다. 대신에 용리는 30분 동안 PBS 내 400 μL 4 M 우레아로 변성 조건하에 실행되었고, 1 mL의 PBS로 희석되었다. 산 또는 우레아로 변성 조건 하의 용리는 사이클 1 및 2를 선택하여 적용되었고, 반면에 사이클 3 및 4를 위한 용리는 400 μL 100μM의 비오틴과 결합되지 않은 Aβ40이 결합된 파지플라스미드복합체를 갖는 비드에 첨가하고 1시간 동안의 회전에 의한 경쟁의 조건하에서 실행되었다. 총 4 선택된 사이클이 실행되었다.
녹여서 분리된 파지플라스미드복합체를 위해서 E. coli XL-1 Blue의 기하 급수적으로 성장하는 배양액은 30분 동안 37℃에서 감염되었다. 잔여하고 있는 비드-결합된 파지플라스미드복합체는 비드에 기하 급수적인 성장 단계에서 E.　 coli XL-1 Blue의 첨가에 의해 녹여서 분리되었다. 4℃에서 원심분리 후에 박테리아 펠렛은 2x YT 배지(16 g/L Bacto Tryptone, 10 g/L Bacto Yeast Extract, 5 g/L NaCl, pH 7.5)의 적합한 부피에서 재현탁되었고, LB-Cam 플레이트(10 g/L Bacto Tryptone, 5 g/L Bacto Yeast Extract, 5 g/L NaCl, 15 g/L Bacto Agar, 35 mg/L chloramphenicol, pH 7.5) 위에 도금되었으며, 32℃에서 14-16시간 동안 배양되었다. 그리고 세포는 플레이트 위에서 벗겨졌으며, 재조합 파지플라스미드복합체의 재증폭 및 구조를 위해서 사용되었다.
농축된 파지플라스미드복합체 풀의 스크리닝은 4번째 패닝 단계(pannig step) 이후에 스크리닝 ELISA (실시예 5)로 실행되었다.
< 실시예 4: 파지 디스플레이에 의해 Trx - Aβ28 융합 단백질에 친화성를 갖는 Lcn2 뮤테인의 선택>
PBS(4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7.4)내 각각의 약 1012 재조합 파지플라스미드복합체 패닝 사이클(panning cycle)은 1 시간 동안 PBS/T (PBS 함유 0.1 % (v/v) Tween 20)내 2 % (w/v) BSA로 사이클 1 및 2 동안 첫 번째로 저지되었다. 선택된 사이클 3으로부터, PBS/T내 2 % (w/v) 탈지유(Sucofin, TSI, Zeven, Germany)는 차단제로서 사용되었다. 자성 비드 서스펜션(Europa Bioproducts Ltd, Cambridge, UK)으로 코딩된 50 및 25μL의 항-DIG-IgG는 PBS/T로 세척되었고, PBS/T 또는 탈지유 내의 2 % (w/v) BSA로 1시간 동안 각각 저지되었다.
차단된 파지플라스미드복합체는 세척되고 자성비드로 코팅된 차단된 25 μL 항-DIG-IgG로 30분 동안 배양되었다. 다음으로 비드는 2분 동안 단일 튜브 자성 스탠드(Promega, Mannheim, Germany)로 둔화되었고, Trx에 특이성이 있는 파지플라스미드복합체를 제거하기 위해서 비드에 바운드 되지 않은 파지플라스미드복합체를 함유한 상등액을 실시예 2로부터의 15 μM의 비-레이블된 Trx로 30분 동안 배양하였다. 실시예 2로부터의 디고옥시제네이트(digoxigenated) 되고 카르보메틸화(carboxymethylated)된 Trx-Aβ28는 100 nM의 최종 농도로 첨가되었고, 혼합물은 400 μL의 총 부피로 1-2시간 동안 배양되었다. 파지플라스미드복합체, Trx 및 Trx-Aβ28의 복합체는 30분 동안 50일부터 drained 차단된 비드로 배양되었다. 다음으로 비드는 단일 튜브 자성 스탠드로 2 분 동안 허물었다. 결합되지 않은 파지플라스미드복합체를 포함하는 상등액은 폐기 처분하였다. 결합되지 않은 파지플라스미드복합체를 포함하는 상등액은 폐기 처분하였다. 파지플라스미드복합체로 묶인 자성비드는 500μL PBS/T로 10회 세척되었다. 그 후, 묶인 파지플라스미드복합체는 PBS 내의 400μL 4 M 요소로 30분 동안 회전하에 녹여서 분리되었고, 1 mL PBS로 희석이 뒤따랐다. 총 6 선택된 사이클이 실행되었다.
녹여서 분리된 파지플라스미드복합체의 증폭을 위해서 E. coli XL-1 Blue의 기하급수적으로 성장하는 배지는 37℃에서 30분 동안 감염되었다. 잔여하고 있는 비드-바운드된 파지플라스미드복합체는 직접적으로 비드로 기하급수적인 성장기 내의 E.　 coli XL-1 Blue의 첨가에 의해 녹여서 분리되었다. 4°C에서 원심분리 이후에 박테리아의 펠렛은 2x YT 배지(16 g/L Bacto Tryptone, 10 g/L Bacto Yeast Extract, 5 g/L NaCl, pH 7.5)의 적합한 부피에서 재현탁 되었고 LB-Cam 플레이트(10 g/L Bacto Tryptone, 5 g/L Bacto Yeast Extract, 5 g/L NaCl, 15 g/L Bacto Agar, 35 mg/L chloramphenicol, pH 7.5)위에 놓였고 32°C에서 14-16시간 동안 배양되었다. 다음에 세포는 플레이트에서 벗겨졌으며 구조 및 재조합 파지플라스미드복합체의 재증폭을 위해 적용되었다. 농축된 파지플라스미드복합체 풀의 스크리닝은 6번의 패닝 단계 후에 필터-샌드위치 콜로니 스크리닝 분석(실시예 6)으로 실행되었다.
< 실시예 5: 스크링 ELISA을 통한 Aβ에 특이적 Lcn2 뮤테인의 인식>
실시예 3에서 개시된 Aβ40을 갖는 선택된 파지플라스미드복합체의 4 번의 사이클 이후에 Lcn2 뮤테인의 농축된 풀(pool)은 phNGAL98(서열번호 27)에 서브클론되었고 E. coli supE strain TG1-F-(E. coli K12TG1의 유도체(Kim et al. (2009) J.Am.Chem.Soc.131,3565-3576)의 변형을 위해 사용되었으며 스크리닝 ELISA에 적용되었다.
본 실험의 목적은, 농축된 풀(pool)로부터의 단일 콜로니(single colonies)는 37℃에서 밤새 100μL의 TB-Amp 배지(12 g/L Bacto Tryptone, 24 g/L Bacto 효모 추출물, 55 mM 글리세린, 17 mM KH2PO4, 72 mM K2HPO4, 100 mg/L 암피실린)의 96-웰 플레이트(덮개가 있는 둥근 바닥의 다중 웰 플레이트 96; Sarstedt, Nuembrecht, Germany)내에서 성장했다. 100μL의 TB-Amp 배지를 함유한 새로운 플레이트는 22℃ 또는 37℃에서 하룻밤 동안의 배양액으로 접종되었고 지수기(exponential phase)로 성장하였다. Lcn2 뮤테인의 주변 세포질 발현은 20℃에서 13-17 시간 동안 물이 없는 디메틸포름아미드(DMF; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)에 용해된 20μL 0.2㎍/mL 언하이드로테트라사이클론(aTc; Acros, Geel, Belgium)으로 유도되었다. 주변 세포질 단백질은 4℃에서 1시간 동안 배양 및 750 rpm에서 교반(Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg, Germany)으로 1 mg/mL 라이소자임을 함유한 40μL의 BBS(800 mM Na-borate, 640 mM NaCl, 8 mM EDTA, pH 8.0)로 방출되었다. 4℃에서 1시간 동안 배양 및 750 rpm에서 교반으로 PBS/T (0.05 % (v/v) Tween 20와 함께 4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7.4 )내 40μL 10 % (w/v) BSA로 차단한 후에 플레이트는 4℃ 및 3000 g에서 10분 동안 원심분리되었다. 상등액은 ELISA를 위해 사용되었다.
C-터미널 Strep-tag II(Schmidt and Skerra (2007) Nat. Protoc . 2, 1528-1535)을 운반하는 Lcn2 뮤테인의 선택적 포획을 위해서, 96-웰 MaxiSorp 폴리스티렌 미세역가 플레이트(Nunc, Langenselbold, Germany)는 4℃에서 하룻밤 동안 PBS 내에서 10㎍/mL trepMAβ-Immo
Figure 112018027260785-pat00004
로 코팅되었고 상온에서 1시간 동안 PBS/T(0.1 % (v/v) Tween 20를 갖는 PBS )내 3 % (w/v) BSA로 차단되었다. PBS/T로 3 세척 단계 이후, 상기로부터 120μL의 세포 추출물은 웰당 적용되었고 300 rpm에서 1.5시간 동안 배양되었다. 세척 후에, 실시예 2로부터 비오틴과 결합된 Aβ40는 0.5μM의 농도로 첨가되었고 1시간 동안 배양되었다. 대조군으로서 Aβ40 대신에 비오틴과 결합된 Ova가 사용되었다. 웰은 다시 세척되었고 구속 비오틴과 결합된 펩타이드 또는 단백질은 1시간 동안 PBS/T내에서 1:5000로 희석된 50μL의 ExtrAvidin/AP 접합(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)으로 감지되었고, 최대 1 시간 동안 100 mM Tris/HCl, pH 8.8, 100 mM NaCl, 5　mM MgCl2 내에서 100μL 0.5 mg/mL의 p-니트로페닐 포스페이트(AppliChem, Darmstadt, Germany) 존재 하에 신호 개발이 뒤따랐다. 405 nm에서 흡수는 SpectraMax 250 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)로 측정되었다.
대안적으로, 실시예 2로부터 0.5μM 비오틴과 결합되지 않은 Aβ40는 직접적으로 96-well MaxiSorp polystyrene 미세역가 플레이트(Nunc, Langenselbold, Germany) 위에 고정되었고, 차단되었다. 상기로부터 추출되고 세척된 세포 추출물로 배양된 후, 묶인 Lcn2 뮤테인은 Streptactin/AP 접합
Figure 112018027260785-pat00005
의 1:1500 희석액을 사용하여 Strep-tag II로 감지되었다. 대조군으로서, 0.5 μM Ova는 ELISA 플레이트 위에 고정화되었다.
< 실시예 6: 필터-샌드위치 콜로니 스크리닝 분석에 의해 Trx - Aβ28에 특이성이 있는 Lcn2 뮤테인의 인식>
실시예 4에서 개시된 Aβ40을 갖는 선택된 파지플라스미드복합체의 6 번의 사이클 이후에 돌연변이를 일으킨 Lcn2 유전자 카세트(cassette)는 플라스미드 phNGAL124(서열번호 42)위에서 BstXI(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)를 통해 서브클론되었고, 이는 OmpA 신호 펩타이드, C-터미널 Strep-tag II(Schmidt and Skerra (2007) Nat. Protoc . 2,1528-1535)을 갖는 Lcn2-코딩 영역을 암호화하고, 연쇄상 구균 단백질 G(Schlehuber et al. (2000) J. Mol . Biol .297,1105-1120)로부터 알부민 -바인딩 도메인(ABD)을 위한 유전자뿐만 아니라 앰버 정지 코돈이 뒤따랐다.
그 다음으로, 필터-샌드위치 콜로니 스크리닝 분석은 실행되었고, 이에 의해 Lcn2-AβD 융합 단백질은 친수성의 필터 막(PVDF type GVWP, 0.22 mm; Millipore, Schwalbach, Germany) 위에 플레이트된 콜로니로부터 방출되었고, Schlehuber et al.((2000) J. Mol . Biol .297,1105-1120)에 상세하게 개시된 다음의 과정으로 인간의 혈청 알부민(HSA, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)으로 코팅된 근본적인 두 번째 막(Immobilon-P membrane, 0.45 mm; Millipore, Schwalbach, Germany) 위에 기능적으로 포획되었다. 이 막은 1시간 동안 PBS/T내에서 실시예 2로부터 DIG-레이블된 Trx-Aβ28의 100 nM로 탐지되었다. 바운드 표적 접합은 항- DIG Fab/포스타아제(AP) 접합(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)으로 탐지되었고, 5 - 브로모 -4 - 클로로 -3 - 인돌릴 인산염, 톨루이딘 염(NBT; AppliChem, Darmstadt, Germany) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT; AppliChem, Darmstadt, Germany)로 색소생산성 반응이 뒤따랐다. 이 막의 강렬한 컬러 신호로 스팟(spots)을 확인하기 위해서, 대응하는 콜로니는 첫 번째 필터로부터 선택되었고 두 번째 콜로니 스크린과 비교해 나란히 번식하였다.
본 실험에서의 목적은 야생형 리포칼린과 같은 박테리아 발현 제어 Lcn2 뮤테인 뿐만아니라 분리된 박테리아는 작은 콜로니가 보일 때까지 신선한 친수성 막 위에 점묘법으로 그렸고 성장하였다. 바인딩은 DIG-레이블된 대조 단백질 Trx 및 Ova뿐만 아니라 DIG-레이블된 Trx-Aβ28 모두를 위해서 측정되었다. 이 두 번째 스크린 내의 Trx-Aβ28 표적을 위한 특이 신호를 초래하기 위한 Lcn2 뮤테인은 추가적으로 플라스미드 분리 및 그 다음의 서열 분석을 위해서 번식되었다.
< 실시예 7: Aβ 및 ED-B를 위한 특정의 Lcn2 뮤테인의 수용성 생산 및 정제>
재조합 Lcn2 및 이의 뮤테인은 E. coli BL21(Studier and Moffat (1986) J.Mol.Biol.189,113-130),E.coli W3110(Bachmann(1990) Microbiol . Rev. 54,130-197), E. coli JM83(Yanisch-Perronetal.(1985) Gene 33, 103-119) 또는 E. coli supE strain TG1-F-(아크리디늄 오렌지를 사용하여 이의 에피솜으로부터 치유된 E. coli K12 TG1 [Kim et al. (2009) J.Am. Chem . Soc . 131,3565-3576]의 파생물)내의 주변 세포질 분비에 의해 생성되었다. 가용성 단백질 발현을 위해서, 플라스미드 phNGAL98(서열번호 27)가 사용되었고, 성숙한 Lcn2 단백질(서열번호 28) 및 C-터미널 Strep-tag II를 갖는 OmpA 신호 펩타이드의 융합을 암호화하면서, 플라스미드는 변이된 유전자 카세트(cassette)의 단방향 서브클로닝을 위한 두 개의 비-양립할 수 있는 BstXI 제한 부위를 운반한다.
가용성 단백질은 Strep-tag II(Schmidt and Skerra (2007) Nat. Protoc . 2,1528-1535)에 의해 친화성-정제되었고, PBS 버퍼를 사용하여 Superdex 75 HR 10/30 컬럼(Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany) 위의 사이즈 배제 크로마토그래피(SEC)가 뒤따랐다. 단백질 순도는 SDS-PAGE(Fling and Gregerson (1986) Anal. iochem. 155,83-88)에 의해 확인되었다. 단백질의 농도는 wt Lcn2(서열번호 44)에 있어서 31400 M-1cm-1, 특이적 뮤테인 H1-G1(서열번호 43)에 있어서 26930 M-1cm-1, S1-A4(SEQIDNO:38)에 있어서 24410 M-1cm-1, 및 US7(서열번호 41)에 있어서, 26930 M-1cm-1의 계산된 흡수계수(extinction coefficients)를 사용하여 280 nm에서 흡수 측정에 의해서 측정되었다. ED-B 특이 Lcn2 뮤테인의 계산된 흡수 계수는 뮤테인 N7A(서열번호 20)에서 37930 M-1cm- 1,N7E(서열번호 22)에서 22920 M-1cm-1, N9B(서열번호 24)에서 21430 M-1cm-1, 및 N10D(서열번호 26)에서 39420 M-1cm-1였다(Gasteiger et al. , supra).
< 실시예 8: ELISA 실험에서 다른 Aβ 표적을 위한 바인딩 활성의 측정>
C-터미널 Strep-tag II(Schmidt and Skerra (2007) Nat. Protoc . 2,1528-1535)를 운반하는 Lcn2 뮤테인의 선택적 포획을 위해서, 96-웰 MaxiSorp 폴리스티렌 미세역가 플레이트(Nunc, Langenselbold, Germany)은 밤새 동안 4°C에서 PBS내 10 /mL의 StrepMAB-Immo(IBA, G, Germany)로 코팅하였고, 상온에서 1시간 동안 3 % (w/v) BSA로 차단되었다. PBS/T로 3 번의 세척 단계 후에, 실시예 7로부터 정제된 Lcn2 뮤테인의 1μM 용액의 50μL 는 1시간 동안 모든 웰에 적용되었다. 세척 후에, 실시예 2로부터 비오틴과 결합한 표적 Aβ40, MBP-Aβ40 또는 Trx-Aβ28의 희석 시리즈의 50μL은 첨가되었고, 1시간 동안 배양되었다. 여기서 실시예 2로부터의 Ova, MBP 및 Trx의 비오틴과 결합한 형태는 음성 대조군 단백질로 제공되었다. 웰은 다시 세척되었고 바운드 접합은 1시간 동안 PBS/T 내의 1:1500로 희석된 50μL의 스트랩타아비딘/AP 접합(Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)으로 탐지되었고, 100 mM Tris/HCl, pH 8.8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2내의 100μL 0.5 mg/mL p-니트로페닐 인산(AppliChem, Darmstadt, Germany)의 존재 하에서 신호 개발이 뒤따랐다. 405nm에서 흡수의 시간 코스 △A/△t는 SpectraMax 250 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)로 측정되었고, 데이터는 방정식
△A = △Amaxx [L]tot/(KD+[L]tot)로 KaleidaGraph software(Synergy software, Reading, PA)을 사용하여 보정되었다.
여기서 [L]tot는 적용된 리간드 접합의 농도를 나타내고 KD는 분해 상수(dissociation constant)이다(Voss and Skerra (1997) ProteinEng . 10,975-982). 대안적으로, 실시예 2로부터 “직접” ELISA을 위한, 2 레이블 되지 않은 Aβ40 표적은 96-웰 MaxiSorp 폴리스티렌 미세역가 플레이트 위에서 흡수되었고 정제된 Lcn2 뮤테인으로 배양되었고, 이는 스트랩타아비딘/AP 접합(GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK)의 1:1500 희석을 사용하여 Strep-tag II을 통해 측정되었다. 대조군으로서, 실시예 2로부터 2 MBP는 ELISA 플레이트 위에 흡수되었다. 흡수는 SpectraMax 250 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, USA)로 405 nm에서 측정되었다. 대안적으로, “경쟁적” ELISA는 상기에서 개시된 “포획” ELISA와 유사한 방법으로 실행되었다. 다시, StrepMAβ-Immo고정화 및 세척 이후에 실시예 7로부터 정제된 Lcn2 뮤테인의 1μM 용액의 50μL 은 1 시간 동안 모든 웰에 적용되었다. 세척 후에, 실시예 2로부터 비오틴화된 표적 Trx-Aβ28는 경쟁자로서 자유 비-레이블된 Trx-Aβ28 표적의 다양한 농도의 존재 하에 5 nM(S1-A4를 위해) 또는 40 nM (US7을 위해)의 고정된 농도에서 적용되었다. 100-fold 초과로 시작에서, 경쟁자 농도는 각 단계에서 요인 3에 의해 감소되었다. 이 경우, 데이터는 S자 모양의 방정식으로 보정되었다.
△A = (△Amax-△Amin)/(1+([L]tot free/KD)p)+△Amin
추가적 파라미터로서 곡선 경사 p(힐 계수)를 갖음.
다음의 표 1은 표면 플라스몬 공명뿐만 아니라 다른 ELISA 설정에 의해 결정된 KD값의 요약이다(실시예 9 참조).
　 K D [nM]
　 S1-A4 US7 H1-G1
Aβ40 (Capture ELISA, 도 5) 2.7 ±0.1 6.8 ±0.4 16.2 ±1.9
Trx - Aβ28 (Capture ELISA, 도 5) 1.9± 0.1 2.4 ±0.2 24.3 ±3.8
MBP - Aβ40 (Capture ELISA, 도 5) 4.7 ±0.1 11.4 ±0.6 n.d.
Aβ16 -27 (Capture ELISA, 도 5) 2.6 ±0.3 2.1± 0.1 n.d.
Trx - Aβ28 (Direct ELISA, 도 6) 16.2 ±4.4 9.6 ±1.7 290± 62
MBP - Aβ40 (Direct ELISA, 도 6) 149 ±31 49.7 ±8.1 n.d.
Trx - Aβ28 (Comp. ELISA, 도 7) 21.7 ±1.5 76.9 ±4.5 n.d.
MBP - Aβ40 (SPR, 도 8, 실시예 9) 1.7 1.3 n.d.
< 실시예 9: 표면 플라스몬 공명을 통해 Aβ를 위한 바인딩 활성의 측정> Lcn2 뮤테인의 실시간 분석은 전기영동영 완충용액으로서 PBS/T(0.005 % (v/v) Tween 20 함유하는 PBS)를 사용하여 Biacore X system(Biacore, Uppsala, Sweden)에 의해 실행되었다. 10 mM Na-아세테이트, pH 4.5 내의 실시예 2로부터 MBP-Aβ40의 50㎍/mL 용액은 기준 아민 커플링 케미스트리(standard amine coupling chemistry)를 사용하여, 1455 공명 장치(RU)의 리간드 밀도의 결과를 내는 CMD 200I 칩
Figure 112018027260785-pat00006
위에서 고정되었다. 실시예 7로부터의 정제된 Lcn2 뮤테인 S1-A4 및 US7은 10μL /min 유랑에서 2 nM 내지 125 nM의 농도 범위에서 적용되었다. 센서그람(sensorgrams)은 제어 채널을 위해서 측정된 대응되는 신호의 공제에 의해서 보정되었고, 이는 에탄올아민으로 차단되었고 활성화되었다. 운동데이터 평가는 BIAevaluation software V 3.0 (Karlsson et al. (1991) J.Immunol.Methods145,229-240)로 보정됨으로써 실행되었다. 이런 과정 동안 kon및 koff는 전체적으로 조정되었고, 최대 반응 차이 Rmax는 각 곡선에 부분적으로 조정되었다.
< 실시예 10: SPOT 막(membrane)에서 에피토프 매핑(mapping)을 통한 Aβ 에피토프의 결정>
Lcn2 뮤테인 S1-A4 및 US7의 Aβ 에피토프를 매핑하기 위한 SPOT 막[Amino-PEG500-UC540 sheet, 100 x 150 mm, Intavis, 쾰른(K), 독일]은 MultiPep RS 장비(Intavis, 쾰른, 독일) 및 동일 벤더(vendor)로부터의 활성 아미노산을 이용한 프랭크([2002] J. Immunol. Methods 262, 13-26)에 기술된 자동화된 절차에 의해 준비되었다. Aβ40 아미노산 서열(서열번호 29)이 각각 하나의 아미노산이 전위(dislocation)되어서 전체 서열을 커버링(covering)하여 연이어 hexamers, decamers 및 pentadecamers로 막에 합성된다. 이러한 펩타이드의 C-termini는 공유결합으로 막에 부착되나, N-termini는 아세틸화된다. 고정화된 Strep-tag II는 검출 방법을 위해 양성 대조군(positive control)으로 기능한다.
곁사슬 디프로텍션(Side chain deprotection)이 95% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)(시그마-알드리치[Sigma-Aldrich], 슈타인하임[Steinheim], 독일), 3% 트리이소프로필실란(triisopropylsilane)(시그마-알드리치[Sigma-Aldrich], 슈타인하임[Steinheim], 독일) 및 2%의 2시간 동안 증류된 H2O와 함께 수행된다. 디클로로메탄(dichloromethane)(시그마-알드리치[Sigma-Aldrich], 슈타인하임[Steinheim], 독일)로 4번, 디메틸포름아미드(시그마-알드리치[Sigma-Aldrich], 슈타인하임[Steinheim], 독일)로 두 번 그리고 에탄올로 두 번 막을 세척한 후에, 막은 기건(air-dried)된다.
사용에 앞서, 막은 에탄올로 한 번, PBS(4mM KH2PO4, 16mM Na2HPO4, 115mM NaCl, pH7.4)로 세 번 세척되며, PBS/T내 3%(w/v) BSA(0.1% (v/v) Tween 20를 함유한 PBS)로 한 시간 동안 블록(block)된다. PBS/T로 세 번 세척한 후, 막은 Lcn2 뮤테인S1-A4(50nM), US7(100nM) 또는 야생형 Lcn2(100nM)와 함께 PBS/T 내에서 한 시간 동안 배양되고 PBS/T로 세 번 세척된다. 그리고 나서, 막은 단백질 검출을 위해 Strep-tag II를 통해 1:1500로 희석된 스트랩타아비딘/AP 접합(conjugate)(GE Healthcare, 버킹엄셔[Buckinghamshire],영국[UK])과 함께 PBS/T 내에서 한 시간 동안 배양된다. 이어서, 막은 PBS/T로 세 번, AP 버퍼(buffer)(100mM Tris/HCl, pH8.8, 100mM NaCl, 5mM MgCl2) 내에서 한 번 세척된 다음에, Schlehuber et al. ((2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120)에 기술되어 있는 바와 같이, AP 버퍼 내에서 5-브로모-4-클로로-3-인도릴 인산염, 4-toluidine salt(BCIP; AppliChem, Darmstadt, Germany) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT; AppliChem, Darmstadt, Germany)과 색소생산성 반응을 한다.
S1-A4과 배양된 막과 야생형 Lcn2와 배양된 막을 각각 비교해보면, 야생형 Lcn2과 배양된 막이 아니라 S1-A4과 배양된 막에서만 현저한 스팟(spots)이 생긴다. pentadecameric Aβ40 단편과 함께, motif LVFFAED는 S1-A4의 바인딩에 필수적인 것으로 보여진다. shorter hexameric 및 decameric 펩타이드 서열과 함께, S1-A4의 바인딩 내지 minimal motives VFFAED 및 FFAEDV가 검출되었다. Lcn2 뮤테인 US7은 이번 분석에 매우 유사한 에피토프 프로파일을 보여주었다.
< 실시예 11: ThT 집계 분석 내 Aβ에 친화성이 있는 Lcn2 뮤테인의 기능적 분석>
실시예 2로부터, 용해되고 균질화된 모노머의 비오티과 결합되지 않은 Aβ40가 다양한 Lcn2 뮤테인의 존재 또는 부존재에서 티오플라빈 T 집계 분석된다. 티오플라빈 T(ThT; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)는 특히 b-시트(sheet)-풍부한 아밀로이드 원섬유(amyloid fibrils) 및 올리고머성 전구체(oligomeric precursors)에 연결되지만, 모노머의 Aβ 펩타이드에는 연결되지 않는데, 이는 ThT 형광에서의 증가에 의해 동반된다(Khurana et al. (2005) J. Struct. Biol. 151, 229-238).
이를 위해서, ThT는 1 mM의 농도로 증류된 H2O 에 용해되었다. Working solution은 증류된 H2O(실시예 2에 따라 용해된)내 200 μM Aβ40의 1:1 혼합물의 5mM 글리신/NaOH, pH 8.5. 500μL와 함께 5μM의 최종농도로 1mM stock solution의 희석에 의해서 제조되었고, PBS 내의 실시예 7로부터 Lcn2 뮤테인 20μM은 교반 없이 37℃에서 배양되었다. 다른 시간 포인트에서 각 형광 측정 전에, 샘플을 곧 10회 소용돌이쳤고 각 샘플의 20μL은 ThT working solution의 180μL으로 혼합하였다. 형광 강도는 발광 분광계(LS 50 B, Perkin Elmer, Waltham, USA)로 450 nm의 여기 파장 및 482 nm의 방출 파장으로 측정되었다.
도 9에서 개시되었듯이, Lcn2 뮤테인 US7은 1:10의 비율에서 Aβ40 집합의 강한 억제를 나타내었다.
< 실시예 12: 엑스트라 도메인 B(ED-B)를 함유하고 있는 재조합 피브로넥틴 단편의 제조>
인간 피브로넥틴의 세 개의 다른 재조합 단편은 선택을 위한 표적으로서 사용되었다: 엑스트라 도메인-B 단독(termed ED-B; Zardi et al. (1987) EMBO Journal, 6, 2337-2342), 이의 근접한 도메인 7 및 8(FN7B8로 언급되는)의 본 명세서 내의 동일한 도메인, 및 기존의 도메인 7, 8 및 9를 포함하는 FN789, 그러므로 부족한(lacking) ED-B(Carnemolla et al. (1996), Int . J. Cancer, 68, 397-405; Leahy et al. (1994) proteins 19, 48-54).
FN7B8, FN789, 및 ED-B의 코딩 서열은 벡터 pASK75(Skerra (1994) Gene 151, 131-135) 또는 이의 유도체 pASG-IBA-33
Figure 112018027260785-pat00007
위에서 클론되었고, 각각 pASK75-FN7B8(서열번호 13), pASK75-FN789(서열번호 17), 및 pASG-IBA-33-EDB(서열번호 15)의 산출량을 낸다. 모든 구성체는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 통해서 정화를 위해 카르복시 터미널에서 His6-tag 를 제공하였고 E. coli TG1/F- [E. coli K12 TG1의 유도체(Gibson (1984) Studies on the Epstein-Barr virus genome, Cambridge University, England)] 또는 BL21(Studier and Moffatt (1986), 189, 113-130)의 세포질 내에서 가용성 단백질로서 생산되었다. 따라서, 발현 플라스미드를 품은 E. coli의 2-L 배양액은 100 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB-배지 내의 37℃에서 중간 로그상에서 성장하였다. 200 ㎍/L 언하이드로테트라사이클론(Acros, Geel, Belgium)의 첨가 후에, 성장은 37℃에서 5 내지 7 시간 동안 계속되었다. 세포는 원심분리에 의해서 농축되었고, 35 ml의 아이스-차가운 크로마토그래피 버퍼(40 mM Hepes/NaOH, 1 M NaCl, pH 7.5) 내에서 재현탁되었고 초음파 분해(S250D, Branson, Danbury CT, USA)에 의해 용해되었다.
하기에서 주어진 순수 프로토콜은 모든 세 개의 재조합 피브로넥틴 단편을 위해서 동일했다. 깨끗한 용해물은 10 mM ZnSO4 로 차지를 띈 Zn2 +/IDA-Sepharose 컬럼(GE Healthcare, Munich, Germany)으로 적용되었고, 40 mM Hepes/NaOH, 1 M NaCl, pH 7.5로 평형을 이루었다. 바운드된 단백질은 크로마토그래피 버퍼 내에서 0 내지 300 mM의 이미다졸(HCl로 pH를 조정)의 얇은 구배로 녹여서 분리되었다. 재조합 단백질을 포함하고 있는 분획은 SDS-PAGE로 확인되었으며, 1 mM의 최종 농도로 EDTA와 혼합되었으며, 밤새 20 mM Hepes/NaOH, pH 7.4로 투석되었다. 이어서, 단백질은 이온-교환 크로마토그래피 컬럼(Resource Q, GE Healthcare, Munich, Germany) 위에 로드되었다. 묶인 피브로넥틴 단편을 용리하기 위해서 0 내지 300 mM NaCl 구배는 사용되었다.
최종적으로 단백질의 순도는 SDS-PAGE 분석 및 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해서 확인되었다. 280 nm에서 흡수 측정에 의해서 단백질의 농도를 결정하기 위해서, 다음의 계산된 흡수 계수(Gasteiger et al. (2003) nucleic acids Res. 31, 3784-3788)는 사용되었다: FN7B8에 있어서 31,400 M-1cm-1, FN789에 있어서 28420 M-1cm-1, 및 ED-B에 있어서 11460 M-1cm-1. 전형적으로 약 10 내지 20 mg의 정제된 단백질은 2-L 쉐이크 플라스크 배양 당 수득되었다.
정제된 피브로넥틴 단편은 공급자의 매뉴얼에 따라서 상온에서 1시간 동안 디곡시제닌-3-O-메틸카르보닐-e-아미노카프로익 산-N-히드로숙신이미드 에스터(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)의 과량(4:1 몰 비율)으로 디곡시제닌-레이블되었다. 유리 디곡시제닌을 제거하기 위해서 단백질 용액은 40 mM Tris/HCl, 115 mM NaCl 및 1 mM EDTA, pH 7.5와 평형을 유지하였고 PD-10 탈염 컬럼(GE Healthcare, Munich, Germany)에 적용되었다. 성공적인 디옥시제네이션(digoxigenation) 및 단백질의 무결성은 안티-디곡시제닌-AP, Fab 단편(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)으로 염색에 의해 SDS-PAGE, ESI 질량 분석법 또는 점블럿(dot blot)으로 확인하였다.
< 실시예 13: 파지 디스플레이로 ED-B에 대한 친화성를 갖는 Lcn2 변종의 선택>
4개의 파지플라스미드복합체 디스플레이 선택 사이클 전부는 실시예 1에서 개시된 Sloning BioTechnology GmbH에 의해서 본래 합성된 합성의 유전자 집합에 기초한 Lcn2 무작위 파지플라스미드복합체 라이브러리를 사용하여 실행하였다. 첫 번째 선택 사이클에 있어서, 50 mM의 벤즈아미딘으로 보충된 300 mL의 TBS/E 40 mM Tris/HCl, 115 mM NaCl 및 1 mM EDTA, pH 7.4)내로 용해된 약5x1012 재조합 파지플라스미드복합체는 0.4% (v/v) Tween 20[폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우닌; AppliChem, Darmstadt, Germany]을 함유한 TBS 내로 100μL 8 % (w/v) BSA (Sigma-Aldrich, Munich, Germany)을 첨가함으로써 30분 동안 차단되었다. 그 다음에, 이 용액은 TBS/T (0.1 % (v/v) Tween 20을 함유하고 있는 TBS)내 2 % (w/v) BSA로 1시간 동안 차단된 항-디곡시제닌 IgG 마그네틱 비드(Europa Bioproducts, Cambridge, UK)로 1시간 동안 배양되었고, 0,1μM의 디곡시제닌-레이블된 재조합 FN7B8 400㎕ 로 가득찼다(실시예 12 참조).
자석을 통한 비드의 집합 및 상등액의 폐기 후에, TBS/T로 10번의 세척 단계는 실행되었고 잔여하고 있는 결합된 파지플라스미드복합체는 6분 동안 0.1 M 트리에틸아민(pH가 조정되지 않음)의 400㎕로 처음에는 녹여서 분리되었고, 8분 동안 0.1 M 글리신/HCl, pH 2.2의 350㎕로 두 번째 용리가 뒤따랐다. 용리액을 모았고 기하급수적으로 성장하는 E. coli XL1-Blue를 감염시키기 위해서 각각 2 M의 아세트산 또는 50μℓ 0.5 M Tris base의 즉시 적합한 양으로 중화시키고, 결합시키고 사용하였다. 파지플라스미드복합체는 다음의 패닝 단계 이전에 타이터(titer)되었고 재증폭 되었으며, 공지된 프로토콜이 뒤따랐다(Beste et al. (1999) PNAS 96, 1898-903; Schlehuber et al. (2000) J Mol Biol 297 1109-20).
선택의 두 번째 라운드를 위해서 증폭된 파지플라스미드복합체의 약 2x1012는 사용되었고 묶인 파지플라스미드복합체의 용리는 75분 동안 유리 재조합 ED-B의 231 nmol/ml의 400μℓ로 경쟁에 의해 실행되었다.
세 번 및 네 번째 선택 사이클에서 처음에 증폭된 파지플라스미드복합체의 약 2x1012 는 100 nM의 디곡시제닌-레이블된 FN7B8로 1시간 동안 배양되었다. 그리고, 파지플라스미드복합체-항원 복합체는 20분 동안 안티-디곡시제닌 IgG 자성비드로 포획되었다. TBS/T로 10회 비드를 세척한 후에, 바운드된 파지플라스미드복합체는 상온에서 75분 동안 유리 재조합 ED-B의 140 내지 231nmol/ml의 400μℓ로 경쟁에 의해 녹여서 분리되었다.
< 실시예 14: 스크리닝 ELISA로 ED- B 에 대한 친화성를 갖는 Lcn2 변종의 선택>
실시예 13에 개시된 표적 단백질 ED-B에 특이적으로 결합한 파지 디스프레이 선택으로부터 얻은 Lcn2 뮤테인 농축은 스크리닝 ELISA에 의해 측정되었다. 마지막 패닝 단계로부터의 pooled 플라스미드 준비를 사용하여, 돌연변이를 일으킨 유전자 카세트(cassette)는 플라스미드 phNGAL98의 발현에 있어서 BstXI을 통해서 서브클론되고, 이는 E. coli 내 periplasmatic 생산을 위한 OmpA 신호 펩타이드의 융합 및 C-터미널 Strep-tag II(Schmidt and Skerra (2007) Nat. Protoc . 2, 1528-1535)을 갖는 Lcn2 코딩 영역을 암호화한다. 96-웰 플레이트 내의 각각의 Lcn2 뮤테인의 용해 가능한 발현은 다음과 같이 실행되었다: 100㎍/ml의 암피실린을 함유하는 100 μℓ TB 배지(Tartof and Hobbs (1987) Bethesda Research LAβoratory Focus 9, 12)는 단일, 무작위로 선택한 콜로니로 주입되었고, 교반(500에서 800rpm; Thermomixer comfort; Eppendorf, Hamburg, Germany)하면서 37℃에서 5시간 동안 배양되었다. 100μℓ의 신선한 배지의 각각의 클론은 10μℓ의 이 배양액으로 주입되었고 교반에 의해서 37℃에서 1 내지 2시간 동안 배양되었고 온도를 22℃로 낮추는 것이 뒤따랐다. 추가적인 2~4시간 동안의 Lcn2 뮤테인의 발현을 위한 배양은 0.2 ㎍/ml의 언하이드로테트라사이클론(Acros, Geel, Belgium)으로 12-14 시간 동안 기하급수적으로 성장하는 세포로 유도되었다. 단백질의 주변 세포질 방출은 상온에서 1시간 동안 교반에 의해서 1mg/ml의 라이소자임(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)을 포함하고 있는 40μℓ2xBBS (0.2 M borate/NaOH, 160 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)의 첨가로 영향을 받았다. 1시간 동안 TBS 및 0,5 % Tween-20 내의 40μℓ10 % w/v BSA (Applichem, Darmstadt, Germany)로 용해물은 차단되었고 세포 잔해는 10 분 동안 원심분리에 의해 조 추출물로부터 제거되었다.
96-웰 Nunc Maxisorp 플레이트(Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Germany)의 표면 위에 FN7B8 또는 FN789를 흡수하기 위해서 TBS 내 100㎍/ml 단백질 용액 50μℓ을 웰(well)당 첨가하였고 4℃에서 하룻밤 동안 배양했다. TBS/T로 세 번 세척하는 단계 이후에, 웰은 상온에서 3시간 동안 TBS/T 내에서 2 % (w/v) BSA로 차단되었고 E. coli로부터 추출된 조 추출물에 도입되기 전에 반복적으로 세척되었다. ELISA에 있어서, 50μℓ의 깨끗한 용해물을 웰당 적용했고 1시간 동안 배양했으며, TBS/T로 세 차례 용해했다. 바운드된 Lcn2 뮤테인을 0.1 M Tris/HCl, 0.1 M NaCl, 5 mM MgCl2, pH 8.8(실시예 16 참조)내의 4-니트로페닐 인산염(pNpp, 0.5 mg/ml; AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany) 기질을 사용하여 스트랩타아비딘-알칼리 포스타아제 접합(TBS/T 내 1:1500; GE Healthcare, Munich, Germany)로 측정하였다.
스크리닝 ELISA로 4개의 클론을 동정했다. 후속 실험(실시예 16-18 참조)으로 이런 4개 Lcn2 뮤테인은 ELISA, SPR-분석, 및 ED-B 양성의 인간 콜론 암 세포의 면역형광 현미경에서 FN7B8를 위한 특이 바인딩 활성을 보여주었다. 이런 Lcn2 뮤테인은 N7A(서열번호 20), N7E(서열번호 22), N9B(서열번호 24), 및 N10D (서열번호 26)로 지정되었다.
< 실시예 15: 수용성 단백질 생산 및 Lcn2 및 이의 변종의 정화>
실시예 7과 동일하게 하였다.
< 실시예 16: ELISA 내에 ED-B을 위한 바인딩 활성의 측정>
96-웰 Nunc Maxisorp 플레이트(Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Germany)의 표면 위에 FN7B8 또는 FN789를 흡수하기 위해서 TBS/E 내 100㎍/ml 단백질 용액 50μℓ을 웰(well)당 첨가하였고 상온에서 2 시간 동안 배양했다. 또한, 제어 단백질을 포함하기 위해서, 빈 웰은 TBS/ET 내의 120μℓ2 % (w/v) BSA (AppliChem, Darmstadt, Germany)에 노출되었다. 세 번의 세척 후에, 웰을 상온에서 2시간 동안 TBS/ET 내의 120μℓ2 % (w/v) BSA(AppliChem, Darmstadt, Germany)로 차단하였고 정화된 Lcn2 뮤테인의 희석용액 시리즈의 50μL가 첨가되고 1 시간 동안 배양되기 전에 반복적으로 세척되었다. 웰은 다시 세척되었고 바운드된 Lcn2 뮤테인은 1시간 동안 TBS/T 내 1:1500으로 희석된 50μL의 스트랩타아비딘-알칼리 포스타아제 접합(GE Healthcare, Munich, Germany)으로 측정하였고, 100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, pH 8.8내의 0.5 mg/ml p -니트로페닐 인산염 50μℓ의 존재하에서 신호 개발이 뒤따랐다. 405 nm에서 △A/△t의 흡수의 시간 코스는 SpectraMax 250 reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 측정되었고, 데이터는 하기 식에 KaleidaGraph software(Synergy software, Reading, PA)로 적용하였다.
△A = △Amax x [L]tot/(KD + [L]tot)
여기서 [L]tot은 적용된 리간드 접합의 농도를 나타내고, KD 는 분해 상수(Voss and Skerra (1997) Protein Eng . 10, 975-982)를 나타낸다.
Lcn2 변종 N7A, N9B, 및 N10D은, 각각 FN789 또는 BSA이 아닌 14.8 nM (N7A), 40.1 nM(N9B), 30.0 nM(N7E), 및 51.2(N10D)의 KD 값을 갖는 FN7B8에 특이적으로 결합하였다.
< 실시예 17: 표면 플라스몬 공명( SPR )을 통한 재조합 피브로넥틴 FN7B8을 위한 바인딩 활성의 측정>
Lcn2 뮤테인의 실시간 분석은 전기영동영 완충용액으로서 HBS/ET(0.005 % (v/v) Tween 20를 함유한 20 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)을 사용하여 BIAcore X system(BIAcore, Uppsala, Sweden)에 의해 실행되었다. pH 4.0, 10 mM Na-acetate내 재조합 FN7B8의 200㎍/mL 용액은 표준 amine coupling chemistry(Biacore, Uppsala, Sweden)를 사용하여 CMD 200 m 센서칩(XanTec bioanalytics, Duesseldorf, Germany) 위에 고정화되었고, 결과물은 약 500 공명 단위(RU)의 리간드 밀도였다. 정제된 Lcn2 뮤테인은 2.5 에서 160nM의 농도에서 25μℓ/min 유속에서 적용되었다. 에탄올아민에 의해 활성화되었고 저해되는 Sensorgrams을 제어 채널에 대한 측정된 대응 신호를 공제함으로써 수정하였다. 이는 에탄올아민에 의해 활성화되었고 저해되었다. 운동 데이터 평가는 BIAevaluation software V 4.1 (Karlsson et al. (1991) J. Immunol . Methods 145, 229-240)을 사용하여 전세계 기준에 맞게 하였다. 하기 표 2는 표면 플라스몬 공명으로 FN7B8 측정을 위한 선택된 Lcn2 뮤테인의 운동 바인딩 데이터이다.
Lcn2 변종 k on [M -1 s -1 ] k off [s -1 ] K D [M]
N7A 4.6x106 2.6x10-2 5.8x10-9
N7E 4.1x106 3.0x10-2 7.2x10-9
N9B 2.1x106 7.5x10-2 3.6x10-8
N10D 1.5x106 5.8x10-2 3.8x10-8
< 실시예 18: ED-B 양성의 CaCo2 세포의 면역염색법> 37℃에서 세포의 융합이 약 50 내지 70%가 될 때까지, 습기 찬 대기에서 인간 암 콜론 세포
Figure 112018027260785-pat00008
에 의해 제공받았다; Pujuguet et al., Am. J. Pathol . 148, 579-592)는 Earle's Salts 및 L-글루타민을 갖는 MEM 내 Nunc LAβ-Tek™ II 챔버 슬라이드™ 시스템(슬라이드당 4 챔버; Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Germany)에서 배양되었고, 10 % 소태아혈청, 1x MEM 비-필수 아미노산, 및 50 ㎍/ml의 젠타마이신(PAA Laboratories, Pasching, Austria)으로 보충되었다. 커버슬라이드에 부착된 세포 단분자막은 PBS(Ca2+ 및 Mg2 +이 없는 Dulbecco's; PAA Laboratories, Pasching, Austria)로 세척되었고, 증류수에 의해서 뒤따랐으며, 그리고 5분 동안 5㎍/ml의 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindol; Sigma-Aldrich, Munich, Germany)를 함유하고 있는 아이스-시원한 메탄올로 고정 및 대비 염색체로 착색되었다.
모든 후속 배양은 암지에서 실행되었다. 고정된 세포는 세척되었고 1시간 동안 500μℓ1μM 야생형 Lcn2, Lcn2 뮤테인, PBS 또는 ED-B 특이 항체 scFv-L19 (Pini et al. (1998) J. Biol . Chem . 273, 21769-21776)로 배양되었다. 모든 이런 시약들은 Strep-tag II 융합 단백질(Schmidt and Skerra, supra)로 정제되었다. 세포는 PBS로 세척되었고 1시간 동안 레이블 되지 않은 항체 StrepMABimmo
Figure 112018027260785-pat00009
로 배양되었으며, 2 번의 세척 과정이 뒤따랐다. 최종적으로, CaCo2 세포에 특이한 바인딩은 2차 항체로서 PBS 내에서 1:200로 희석된 형광 레이블된 항-마우스 IgG (H+L) F(ab')2 단편 Dylight-488 접합(Cell Signaling Technology, Danvers, USA)을 사용하여 측정하였다.
이 분석에서 재조합 야생형 Lcn2 및 PBS는 미미한 신호를 나타낸 반면, Axiovert 40 CFL microscope
Figure 112018027260785-pat00010
로 관찰되었을 때 모든 Lcn2 변종 및 또한 항체 scFv-L19는 특정 세포 염색을 나타내었다.
< 실시예 19: 36 위치에서 H1-G1 내 자유 시스테인 잔기의 교환을 통한 Aβ -특이 Lcn2 뮤테인 H1GA 및 H1GV의 생성>
Cys36는 부위-특이적 돌연변이에 의해 Ala 또는 Val로 교체되었다. 이를 위해, PCR은 템플레이트(서열번호 37)로서 Lcn2 뮤테인 H1-G1을 암호화하는 플라스미드 DNA뿐만 아니라 퇴보한 올리고데옥시뉴클레오타이드 DH-4(서열번호 45) 및 두 번째 올리고데옥시뉴클레오타이드 J08rev(서열번호 48)로 처리되었다. 증폭된 단편은 각각의 치환 변종을 확인하기 위해서 플라스미드 phNGAL98의 발현에 BstXI를 통해 서브클론되었고 서열되었다. 도입된 아미노산의 교환물 Lcn2 변종에 의존하여 H1GA(서열번호 49, 50) 및 H1GV(서열번호 51, 52)로 명명되었다.
< 실시예 20: 높은 광학 밀도를 갖는 E. coli 배양을 사용하여 새로운 Aβ -특 이 Lcn2 뮤테인 H1GA 및의 H1GV의 가용성 있는 생산 및 정화>
재조합 Lcn2 및 이의 뮤테인은 E. coli JM83 내에서 주변 세포질 분비에 의해 생산되었다. BstXI 삽입 암호화 H1GA(서열번호 49) 또는 H1GV(서열번호 51)에 대응하는 수용성 단백질 발현 플라스미드 phNGAL98는 사용되었다.
100 mg/L의 암피실린(Amp)을 포함하고 있는 22℃의 2 L LB 배지 내 교반 하에서 배양액을 성장시켰다. 유전자 발현은 0.2 mg/L의 최종 농도로서 언하이드로테트라싸이클린(aTc)을 첨가함으로써 OD550 = 2.5의 세포 밀도에서 유도되었다. 5시간 동안의 배양 후에 세포는 원심 분리에 의해 수확되었고, 0.1 mg/mL의 라이소자임을 함유하고 있는 40mL의 차가운 주변 세포질 분별 버퍼(fractionation buffer)(0.5 M 수크로오스, 1 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0)에 떠있었고 30분 동안 얼음에서 배양되었다. 스페로플라스트(spheroplasts)는 반복된 원심분리에 의해서 침전되었고 수용성 재조합 단백질을 포함하고 있는 상청액은 회수되었다.
수용성 단백질은 Strep-tag II에 의해 친화성 있게 정제되었고, PBS buffer(4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7.4)을 사용하여 Superdex 75 HR 10/30 컬럼에 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, (SEC))가 뒤따랐다. 단백질의 순도는 SDS-PAGE에 의해 체크되었다. 단백질의 농도는 Aβ 특이적 뮤테인 H1GA(서열번호 50) 및 H1GV(서열번호 52)을 위해서 계산된 흡광 계수를 사용하여 280nm에서 흡수를 측정함으로써 결정되었다.
< 실시예 21: BiacoreX 기기로 표면 플라스몬 공명을 통한 MBP - Aβ40을 위한 바인딩 활성의 측정>
Lcn2 뮤테인 H1GA 또는 H1GV 및 MBP-Aβ40(서열번호 33) 사이의 실시간 상호 작용의 분석은 전기영동영 완충용액으로서 PBS/T (0.005 % (v/v) Tween 20를 함유하고 있는 4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7.4 )를 사용하여 Biacore X system에 의해 실행되었다.
pH 4.5 , 10 mM Na-acetate 내 실시예 2로부터 MBP-Aβ40의 15㎍/mL 용액은 표준 amine coupling chemistry를 사용하여 CMD 200I 칩(Xantec, Duseldorf, Germany) 위에 고정화되었고, 결과물은 약 1316 공명 단위(RU)의 리간드 밀도였다. 실시예 20으로부터 정제된 Lcn2 뮤테인 H1GA 및 H1GV은 4 nM 에서 128 nM 사이의 농도 범위 20 μℓ/min 유속에서 적용되었다. 완충용액 주입의 평균을 위해서 측정된 신호의 공제뿐만 아니라 제어 채널에 대한 측정된 대응 신호를 공제함으로써 데이터는 두 번 참고되었다. 운동 데이터는 BIAevaluation software V 3.0 (Karlsson et al. (1991) J. Immunol . Methods 145, 229-240)를 사용하여 전세계 기준에 맞게 하였다.
< 실시예 22: Biacore T100 기기로 표면 플라스몬 공명을 통한 Aβ40을 위한 바인딩활성 측정>
Lcn2 뮤테인 H1GA 및 Aβ40 (서열번호 29) 사이의 실시간 상호 작용의 분석은 전기영동영 완충용액으로서 PBS/P (0.005 % (v/v) Surfactant P20을 포함하는 4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4, 115 mM NaCl, pH 7.4)를 사용하여 Biacore T100 system (Biacore, Uppsala, Sweden)에 의해 실행되었다. pH 4.5 의 10 mM 아세트산 나트륨 내에 실시예 2로부터의 Aβ40의 10㎍/mL 용액은 표준 amine coupling chemistry를 사용하여 CM5 칩(Biacore, Uppsala, Sweden) 위에 고정화되었고, 결과물은 325 공명 단위(RU)의 리간드 밀도였다. 실시예 20으로부터 정제된 Lcn2 뮤테인 H1GA은 1에서 32 nM의 농도로 30μℓ/min 유속에서 적용되었다. H1GA의 희석용액 시리즈는 kon 정보를 얻기 위해서 300s로 결합 및 분리 시간에 주입되었다. 7200s의 분리 시간을 이용하여 낮은 koff 비율의 가장 높은 농도의 정확한 측정을 위해서 분석하였다. 데이터는 실시예 21처럼 두 번 참고하였다. 바인딩 반응을 위한 kon 및 koff는 데이터 프로세싱을 위하여 Biacore T100 Evaluation Software V2.0.3을 사용하여 전체적 데이터 세트로부터 측정하였다. 데이터는 1:1 바인딩 모델을 사용하여 전세계 기준에 맞게 하였다.
* < 실시예 23: ThT 집계 분석 내의 Lcn2 뮤테인 H1GA의 기능적 분석>
Thioflavin T (ThT) 집계 분석 합성의 Aβ펩타이드(서열번호 29)는 12 시간 동안 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol(HFIP; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)에 용해되었다. HFIP를 진공하에 증발시켰고, Aβ는 H2O dd의 적합한 부피에 용해되었고, 4℃에서 15분 동안 초음파 분해되었으며, 여과되었다(Costar Spin-X centrifuge tube filter cellulose acetate membrane, 0.45㎛; Corning Inc., Corning, NY). 다음으로 가용화 모노머의 Aβ는 집계분석을 위해 즉시 사용되었다.
1 mg/ml Aβ의 500μℓ는 교반하면서 37 ℃, 0.5 x PBS 내의 BSA 또는 다른 몰 비율의 다양한 Lcn2 뮤테인의 존재 또는 부존재 상에서 배양되었다. 집계 반응은 3회 실시되었다. 형광 측정을 위해서 주기적으로 제거된 샘플의 20μℓ은 0.5 x PBS내 50μM의 최종 농도에서 180μℓ의 ThT와 혼합되었고, FluoroMax-3 분광형광계(HORIBA Jobin Yvon, Grasbrunn, Germany)를 사용하여 450nm의 여기 파장과 480nm의 방출 파장에서 분석되었다.
< 실시예 24: 표면 플라스몬 공명 ( SPR )을 통해 재조합 피브로넥틴 단일 도메인 ED- B에 대한 바인딩 활성 측정>
Lcn2 뮤테인의 실시간 상호 작용의 분석은 전기영동영 완충용액으로서 HBS/ET( 0.005 % (v/v) Tween 20를 함유하고 있는 20 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)을 사용하여 BIAcore X 기기에 의해 실행되었다. pH 4.0, 10 mM Na-acetate 내의 재조합 ED-B의 100 μℓ/ml 용액은 표준 amine coupling chemistry를 사용하여 CMD 200 m 센서칩으로 고정화되었고, 결과물은 약 180 공명 단위(RU)의 리간드 밀도였다. 정제된 Lcn2 뮤테인은 2.5에서 최대 160nM의 농도로 25 μℓ/min 유속에서 적용되었다. 에탄올아민에 의해 활성화되었고 저해되는 Sensorgrams을 제어 채널에 대한 측정된 대응 신호를 공제함으로써 수정하였다. 이는 에탄올아민에 의해 활성화되었고 저해되었다.
운동 데이터에 대한 평가는 BIAevaluation software V 4.1 (Karlsson et al. (1991) J. Immunol. Methods 145, 229-240)과 함께 글로벌 피팅에 의해 수행되었다. N10D의 경우 이질성 분석 경쟁 반응 모델은 데이터를 맞추고, 운동 상수의 두 세트의 결과를 얻는데 사용되었다.
표 3은 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 ED-B을 위한 Lcn2 뮤테인의 운동의 바인딩 데이터이다.
Lcn2 변종 k on [M -1 s -1 ] k off [s -1 ] K D [M]
N7A 1,8x106 0,138 1, 27 x 10 -7
N7E 3,1x106 0,054 1, 73 x 10 -8
N9B 1,45x106 7,62x10-3 5, 26 x 10 -9
N10D k1 = 6,21x105
k2 = 2,94x104 		k-1= 0,064
k-2 =3,35x10-3
<110> Pieris AG <120> Muteins of human lipocalin 2(Lcn2, hNGAL) with affinity for a given target <130> I18O10C0029P/DE <150> US61/267,098 <151> 2009-12-07 <160> 52 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NNK oligomer for positions 36, 40, 41, 49, 52 <400> 1 gaagtggtat gtggtaggtn nkgcagggaa tnnknnkctc agagaagaca aagacccgnn 60 kaagatgnnk gccaccatct atgagctg 88 <210> 2 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NNK oligomer for positions 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81 <400> 2 caagagctac aatgtcaccn nkgtcnnktt tnnknnkaag aagtgtnnkt acnnkatcnn 60 kacttttgtt ccaggttcc 79 <210> 3 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NNK oligomer for positions 96, 100, 103, 106 <400> 3 ggcgagttca cgctgggcnn kattaagagt nnkcctggan nkacgagtnn kctcgtccga 60 gtggtgag 68 <210> 4 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NNK oligomer for positions 125, 127, 132, 134 <400> 4 gctatggtgt tcttcaagnn kgttnnkcaa aacagggagn nkttcnnkat caccctctac 60 gggagaac 68 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr primer with fixed nucleotide sequence corresponding to the noncoding strand <400> 5 ggtgacattg tagctcttgt cttctttcag ctcatagatg gtggc 45 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr primer with fixed nucleotide sequence correspondig to the noncoding strand <400> 6 gcccagcgtg aactcgcctg gctgggaacc tggaacaaaa gt 42 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr primer with fixed nucleotide sequence corresponding to the noncoding strand <400> 7 cttgaagaac accatagcat gctggttgta gttggtgctc accactcgga cgag 54 <210> 8 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pcr primer with fixed nucleotide sequence correspondig to the noncoding strand <400> 8 ggagaagcgg atgaagttct cctttagttc cgaagtcagc tccttggttc tcccgtagag 60 ggtg 64 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' flanking PCR-Oligo biotinylated <400> 9 ccaggacaac caattccatg ggaagtggta tgtggtaggt 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' flanking PCR-Oligo biotinylated <400> 10 ttcagggagg cccagagatt tggagaagcg gatgaagttc 40 <210> 11 <211> 4746 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phage display vector phNGAL102 with CamR used as backbone for NNK Library <400> 11 ccataacgct cggttgccgc cgggcgtttt ttattggcca gatgattaat tcctaatttt 60 tgttgacact ctatcattgg tagagttatt ttaccactcc ctatcagtga tagagaaaag 120 tgaaatgaat agttcgacaa aaatctagat aacgagggca aaaaatgaaa aagacagcta 180 tcgcgattgc agtggctctg gctggcttcg ctaccgtagc gcaggcccag gactccacct 240 cagacctgat cccagcccca cctctgagca aggtccctct gcagcagaac ttccaggaca 300 accaattcca tgggaagtgg tatgtggtag gtctcgcagg gaatgcaatt ctcagagaag 360 acaaagaccc gcaaaagatg tatgccacca tctatgagct gaaagaagac aagagctaca 420 atgtcacctc cgtcctgttt aggaaaaaga agtgtgacta ctggatcagg acttttgttc 480 caggttccca gccaggcgag ttcacgctgg gcaacattaa gagttaccct ggattaacga 540 gttacctcgt ccgagtggtg agcaccaact acaaccagca tgctatggtg ttcttcaaga 600 aagtttctca aaacagggag tacttcaaga tcaccctcta cgggagaacc aaggagctga 660 cttcggaact aaaggagaac ttcatccgct tctccaaatc tctgggcctc cctgaaaacc 720 acatcgtctt ccctgtccca atcgaccagt gtatcgacgg cagcgctggt ggggcctaga 780 ctgttgaaag ttgtttagca aaaccccata cagaaaattc atttactaac gtctggaaag 840 acgacaaaac tttagatcgt tacgctaact atgagggctg tctgtggaat gctacaggcg 900 ttgtagtttg tactggtgac gaaactcagt gttacggtac atgggttcct attgggcttg 960 ctatccctga aaatgagggt ggtggctctg agggtggcgg ttctgagggt ggcggttctg 1020 agggtggcgg tactaaacct cctgagtacg gtgatacacc tattccgggc tatacttata 1080 tcaaccctct cgacggcact tatccgcctg gtactgagca aaaccccgct aatcctaatc 1140 cttctcttga ggagtctcag cctcttaata ctttcatgtt tcagaataat aggttccgaa 1200 ataggcaggg ggcattaact gtttatacgg gcactgttac tcaaggcact gaccccgtta 1260 aaacttatta ccagtacact cctgtatcat caaaagccat gtatgacgct tactggaacg 1320 gtaaattcag agactgcgct ttccattctg gctttaatga ggatccattc gtttgtgaat 1380 atcaaggcca atcgtctgac ctgcctcaac ctcctgtcaa tgctggcggc ggctctggtg 1440 gtggttctgg tggcggctct gagggtggtg gctctgtggg tggcggttct gagggtggcg 1500 gctctgaggg aggcggttcc ggtggtggct ctggttccgg tgattttgat tatgaaaaga 1560 tggcaaacgc taataagggg gctatgaccg aaaatgccga tgaaaacgcg ctacagtctg 1620 acgctaaagg caaacttgat tctgtcgcta ctgattacgg tgctgctatc gatggtttca 1680 ttggtgacgt ttccggcctt gctaatggta atggtgctac tggtgatttt gctggctcta 1740 attcccaaat ggctcaagtc ggtgacggtg ataattcacc tttaatgaat aatttccgtc 1800 aatatttacc ttccctccct caatcggttg aatgtcgccc ttttgtcttt ggcgctggta 1860 aaccatatga attttctatt gattgtgaca aaataaactt attccgtggt gtctttgcgt 1920 ttcttttata tgttgccacc tttatgtatg tattttctac gtttgctaac atactgcgta 1980 ataaggagtc ttaataagct tgacctgtga agtgaaaaat ggcgcacatt gtgcgacatt 2040 ttttttgtct gccgtttacc gctactgcgt cacggatctc cacgcgccct gtagcggcgc 2100 attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 2160 agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 2220 tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 2280 ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 2340 ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 2400 aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 2460 ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 2520 ttggcgaaaa tgagacgttg atcggcacgt aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat 2580 aagatcacta ccgggcgtat tttttgagtt atcgagattt tcaggagcta aggaagctaa 2640 aatggagaaa aaaatcactg gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga 2700 acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga 2760 tattacggcc tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat 2820 tcacattctt gcccgcctga tgaatgctca tccggaattc cgtatggcaa tgaaagacgg 2880 tgagctggtg atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga 2940 aacgttttca tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata 3000 ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga 3060 gaatatgttt ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt 3120 ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcactatg ggcaaatatt atacgcaagg 3180 cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtttgtg atggcttcca 3240 tgtcggcaga atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta 3300 ataggaatta atgatgtctc gtttagataa aagtaaagtg attaacagcg cattagagct 3360 gcttaatgag gtcggaatcg aaggtttaac aacccgtaaa ctcgcccaga agctaggtgt 3420 agagcagcct acattgtatt ggcatgtaaa aaataagcgg gctttgctcg acgccttagc 3480 cattgagatg ttagataggc accatactca cttttgccct ttagaagggg aaagctggca 3540 agatttttta cgtaataacg ctaaaagttt tagatgtgct ttactaagtc atcgcgatgg 3600 agcaaaagta catttaggta cacggcctac agaaaaacag tatgaaactc tcgaaaatca 3660 attagccttt ttatgccaac aaggtttttc actagagaat gcattatatg cactcagcgc 3720 agtggggcat tttactttag gttgcgtatt ggaagatcaa gagcatcaag tcgctaaaga 3780 agaaagggaa acacctacta ctgatagtat gccgccatta ttacgacaag ctatcgaatt 3840 atttgatcac caaggtgcag agccagcctt cttattcggc cttgaattga tcatatgcgg 3900 attagaaaaa caacttaaat gtgaaagtgg gtcttaaaag cagcataacc tttttccgtg 3960 atggtaactt cactagttta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 4020 caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 4080 aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 4140 accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 4200 aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg 4260 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 4320 agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 4380 accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 4440 gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 4500 tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 4560 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 4620 cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 4680 cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgac 4740 ccgaca 4746 <210> 12 <211> 4963 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phage display vector phNGAL108 with AmpR used for Sloning Library <400> 12 ccatcgaatg gccagatgat taattcctaa tttttgttga cactctatca ttgatagagt 60 tattttacca ctccctatca gtgatagaga aaagtgaaat gaatagttcg acaaaaatct 120 agataacgag ggcaaaaaat gaaaaagaca gctatcgcga ttgcagtggc tctggctggc 180 ttcgctaccg tagcgcaggc ccaggactcc acctcagacc tgatcccagc cccacctctg 240 agcaaggtcc ctctgcagca gaacttccag gacaaccaat tccatgggaa gtggtatgtg 300 gtaggtctcg cagggaatgc aattctcaga gaagacaaag acccgcaaaa gatgtatgcc 360 accatctatg agctgaaaga agacaagagc tacaatgtca cctccgtcct gtttaggaaa 420 aagaagtgtg actactggat caggactttt gttccaggtt cccagccagg cgagttcacg 480 ctgggcaaca ttaagagtta ccctggatta acgagttacc tcgtccgagt ggtgagcacc 540 aactacaacc agcatgctat ggtgttcttc aagaaagttt ctcaaaacag ggagtacttc 600 aagatcaccc tctacgggag aaccaaggag ctgacttcgg aactaaagga gaacttcatc 660 cgcttctcca aatctctggg cctccctgaa aaccacatcg tcttccctgt cccaatcgac 720 cagtgtatcg acggcagcgc ttggcgtcac ccgcagttcg 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cacacctttg tgccggggag ccagccgggc gagtttactt taggcagcat taaaagttgg 300 ccgggcctga catcatggtt ggtccgcgtc gtgagcacca actacaacca gcatgccatg 360 gtgttcttca agcgtgtgta ccagaaccgc gagttctttg gaatcacact gtacgggcgc 420 acgaaagaac tgacaagcga gctgaaggaa aattttatcc gcttttccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 26 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N10D: Mutein of hNGAL specific for ED-B of fibronectin cloned on phNGAL98 <400> 26 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Ala Ala Gly Asn Thr Trp Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Tyr Lys Met Gln Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Asn Val Leu Phe Met Ser Lys Lys Cys Arg Tyr Met Ile 65 70 75 80 His Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Ser 85 90 95 Ile Lys Ser Trp Pro Gly Leu Thr Ser Trp Leu Val Arg Val Val Ser 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actactggat caggactttt gttccaggtt cccagccagg cgagttcacg 480 ctgggcaaca ttaagagtta ccctggatta acgagttacc tcgtccgagt ggtgagcacc 540 aactacaacc agcatgctat ggtgttcttc aagaaagttt ctcaaaacag ggagtacttc 600 aagatcaccc tctacgggag aaccaaggag ctgacttcgg aactaaagga gaacttcatc 660 cgcttctcca aatctctggg cctccctgaa aaccacatcg tcttccctgt cccaatcgac 720 cagtgtatcg acggcagcgc ttggtctcac ccgcagttcg aaaaataata agcttgacct 780 gtgaagtgaa aaatggcgca cattgtgcga catttttttt gtctgccgtt taccgctact 840 gcgtcacgga tctccacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta 900 cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc 960 cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt 1020 tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg 1080 gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca 1140 cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct 1200 attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga 1260 tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gtttacaatt tcaggtggca 1320 cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 1380 tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 1440 gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc 1500 ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg 1560 cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc 1620 ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat 1680 cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact 1740 tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat 1800 tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga 1860 tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc 1920 ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga 1980 tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag 2040 cttcccggca acaattgata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc 2100 gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtggct 2160 ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct 2220 acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg 2280 cctcactgat taagcattgg taggaattaa tgatgtctcg tttagataaa agtaaagtga 2340 ttaacagcgc attagagctg cttaatgagg tcggaatcga aggtttaaca acccgtaaac 2400 tcgcccagaa gctaggtgta gagcagccta cattgtattg gcatgtaaaa aataagcggg 2460 ctttgctcga cgccttagcc attgagatgt tagataggca ccatactcac ttttgccctt 2520 tagaagggga aagctggcaa gattttttac gtaataacgc taaaagtttt agatgtgctt 2580 tactaagtca tcgcgatgga gcaaaagtac atttaggtac acggcctaca gaaaaacagt 2640 atgaaactct cgaaaatcaa ttagcctttt tatgccaaca aggtttttca ctagagaatg 2700 cattatatgc actcagcgca gtggggcatt ttactttagg ttgcgtattg gaagatcaag 2760 agcatcaagt cgctaaagaa gaaagggaaa cacctactac tgatagtatg ccgccattat 2820 tacgacaagc tatcgaatta tttgatcacc aaggtgcaga gccagccttc ttattcggcc 2880 ttgaattgat catatgcgga ttagaaaaac aacttaaatg tgaaagtggg tcttaaaagc 2940 agcataacct ttttccgtga tggtaacttc actagtttaa aaggatctag gtgaagatcc 3000 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 3060 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 3120 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 3180 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 3240 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 3300 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 3360 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 3420 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 3480 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 3540 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 3600 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 3660 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 3720 ggccttttgc tcacatgacc cgaca 3745 <210> 28 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Wild type Lcn2 cloned on phNGAL98 without OmpA signal peptide and Strep-tagII <400> 28 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 29 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn 1 5 10 <210> 32 <211> 1182 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI HindIII DNA restriction fragment of pMBP-His. Reading frame starts at position 27 with atg <400> 32 tctagaacca acaaggacca tagcatatga aaactgaaga aggtaaactg gtaatctgga 60 ttaacggcga taaaggctat aacggtctcg ctgaagtcgg taagaaattc gagaaagata 120 ccggaattaa agtcaccgtt gagcatccgg ataaactgga agagaaattc ccacaggttg 180 cggcaactgg cgatggccct gacattatct tctgggcaca cgaccgcttt ggtggctacg 240 ctcaatctgg cctgttggct gaaatcaccc cggacaaagc gttccaggac aagctgtatc 300 cgtttacctg ggatgccgta cgttacaacg gcaagctgat tgcttacccg atcgctgttg 360 aagcgttatc gctgatttat aacaaagatc tgctgccgaa cccgccaaaa acctgggaag 420 agatcccggc gctggataaa gaactgaaag cgaaaggtaa gagcgcgctg atgttcaacc 480 tgcaagaacc gtacttcacc tggccgctga ttgctgctga cgggggttat gcgttcaagt 540 atgaaaacgg caagtacgac attaaagacg tgggcgtgga taacgctggc gcgaaagcgg 600 gtctgacctt cctggttgac ctgattaaaa acaaacacat gaatgcagac accgattact 660 ccatcgcaga agctgccttt aataaaggcg aaacagcgat gaccatcaac ggcccgtggg 720 catggtccaa catcgacacc agcaaagtga attatggtgt aacggtactg ccgaccttca 780 agggtcaacc atccaaaccg ttcgttggcg tgctgagcgc aggtattaac gccgccagtc 840 cgaacaaaga gctggcgaaa gagttcctcg aaaactatct gctgactgat gaaggtctgg 900 aagcggttaa taaagacaaa ccgctgggtg ccgtagcgct gaagtcttac gaggaagagt 960 tggcgaaaga tccacgtatt gccgccacca tggaaaacgc ccagaaaggt gaaatcatgc 1020 cgaacatccc gcagatgtcc gctttctggt atgccgtgcg tactgcggtg atcaacgccg 1080 ccagcggtcg tcagactgtc gatgaagccc tgaaagacgc gcagactcgt atcacccagg 1140 gatccctcga gatcaaacat caccaccatc accattaagc tt 1182 <210> 33 <211> 1308 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI HindIII DNA restriction fragment pASK75-MBP-Abeta40. Reading frame starts at position 27 with atg <400> 33 tctagaacca acaaggacca tagcatatga aaactgaaga aggtaaactg gtaatctgga 60 ttaacggcga taaaggctat aacggtctcg ctgaagtcgg taagaaattc gagaaagata 120 ccggaattaa agtcaccgtt gagcatccgg ataaactgga agagaaattc ccacaggttg 180 cggcaactgg cgatggccct gacattatct tctgggcaca cgaccgcttt ggtggctacg 240 ctcaatctgg cctgttggct gaaatcaccc cggacaaagc gttccaggac aagctgtatc 300 cgtttacctg ggatgccgta cgttacaacg gcaagctgat tgcttacccg atcgctgttg 360 aagcgttatc gctgatttat aacaaagatc tgctgccgaa cccgccaaaa acctgggaag 420 agatcccggc gctggataaa gaactgaaag cgaaaggtaa gagcgcgctg atgttcaacc 480 tgcaagaacc gtacttcacc tggccgctga ttgctgctga cgggggttat gcgttcaagt 540 atgaaaacgg caagtacgac attaaagacg tgggcgtgga taacgctggc gcgaaagcgg 600 gtctgacctt cctggttgac ctgattaaaa acaaacacat gaatgcagac accgattact 660 ccatcgcaga agctgccttt aataaaggcg aaacagcgat gaccatcaac ggcccgtggg 720 catggtccaa catcgacacc agcaaagtga attatggtgt aacggtactg ccgaccttca 780 agggtcaacc atccaaaccg ttcgttggcg tgctgagcgc aggtattaac gccgccagtc 840 cgaacaaaga gctggcgaaa gagttcctcg aaaactatct gctgactgat gaaggtctgg 900 aagcggttaa taaagacaaa ccgctgggtg ccgtagcgct gaagtcttac gaggaagagt 960 tggcgaaaga tccacgtatt gccgccacca tggaaaacgc ccagaaaggt gaaatcatgc 1020 cgaacatccc gcagatgtcc gctttctggt atgccgtgcg tactgcggtg atcaacgccg 1080 ccagcggtcg tcagactgtc gatgaagccc tgaaagacgc gcagactcgt atcacccagg 1140 gatcccatca ccaccatcat cacgagaact tgtacttcca ggacgctgaa ttccgtcacg 1200 actccggtta cgaagttcac caccagaagc tggttttctt cgctgaagac gttggttcca 1260 acaaaggtgc tatcatcggt ctgatggttg gtggtgttgt ttaagctt 1308 <210> 34 <211> 488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI HindIII DNA restriction fragment of pASK75-TrxAbeta28H6.Reading frame starts at position 23 with atg <400> 34 tctagatact gtggagttat atatgagcga taaaattatt cacctgactg acgacagttt 60 tgacacggat gtactcaaag cggacggggc gatcctcgtc gatttctggg cagagtggtg 120 cggtccgggt ggtggtgacg ctgaattccg tcacgactcc ggttacgaag ttcaccacca 180 gaaactggtg ttcttcgctg aagacgttgg ttccaacaaa ggtggcggtc cgtgcaaaat 240 gatcgccccg attctggatg aaatcgctga cgaatatcag ggcaaactga ccgttgcaaa 300 actgaacatc gatcaaaacc ctggcactgc gccgaaatat ggcatccgtg gtatcccgac 360 tctgctgctg ttcaaaaacg gtgaagtggc ggcaaccaaa gtgggtgcac tgtctaaagg 420 tcagttgaaa gagttcctcg acgctaacct ggccagcgct caccatcacc atcaccatta 480 ataagctt 488 <210> 35 <211> 383 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI HindIII DNA restriction fragment of pASK75-TrxH6. Reading frame starts at position 23 with atg <400> 35 tctagatact gtggagttat atatgagcga taaaattatt cacctgactg acgacagttt 60 tgacacggat gtactcaaag cggacggggc gatcctcgtc gatttctggg cagagtggtg 120 cggtccgtgc aaaatgatcg ccccgattct ggatgaaatc gctgacgaat atcagggcaa 180 actgaccgtt gcaaaactga acatcgatca aaaccctggc actgcgccga aatatggcat 240 ccgtggtatc ccgactctgc tgctgttcaa aaacggtgaa gtggcggcaa ccaaagtggg 300 tgcactgtct aaaggtcagt tgaaagagtt cctcgacgct aacctggcca gcgctcacca 360 tcaccatcac cattaataag ctt 383 <210> 36 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for the mature protein wt Lcn2 without Strep-tag II.Reading frame starts with the first nucleotide of the following sequence <400> 36 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaag tggtatgtgg taggtctcgc agggaatgca 120 attctcagag aagacaaaga cccgcaaaag atgtatgcca ccatctatga gctgaaagaa 180 gacaagagct acaatgtcac ctccgtcctg tttaggaaaa agaagtgtga ctactggatc 240 aggacttttg ttccaggttc ccagccaggc gagttcacgc tgggcaacat taagagttac 300 cctggattaa cgagttacct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 360 gtgttcttca agaaagtttc tcaaaacagg gagtacttca agatcaccct ctacgggaga 420 accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 37 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for the mature protein H1-G1 without Strep-tag II.Reading frame starts with the first nucleotide of the following sequence <400> 37 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaag tggtatgtgg taggttgtgc agggaatgtg 120 ttgctcagag aagacaaaga cccgcttaag atgtatgcca ccatctatga gctgaaagaa 180 gacaagagct acaatgtcac cagtgtcggg tttgatgata agaagtgttt gtacaagatc 240 cggacttttg ttccaggttc ccagccaggc gagttcacgc tgggcaggat taagagtgag 300 cctggaggta cgagttggct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 360 gtgttcttca aggaggttgc gcaaaacagg gagacgttca atatcaccct ctacgggaga 420 accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 38 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for the mature protein S1-A4 without Strep-tag II. Reading frame starts with the first nucleotide of the following sequence <400> 38 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaag tggtatgtgg taggtgttgc agggaattat 120 acgctcagag aagacaaaga cccgctgaag atgtatgcca ccatctatga gctgaaagaa 180 gacaagagct acaatgtcac cagtgtcggg tttaggttga agaagtgtaa ttacaagatc 240 cggacttttg ttccaggttc ccagccaggc gagttcacgc tgggcattat taagagtcag 300 cctggaatga cgagttatct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 360 gtgttcttca agacggttgg gcaaaacagg gagatgttca atatcaccct ctacgggaga 420 accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 39 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S1-A4 (Abeta) <400> 39 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Val Ala Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Leu Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Gly Phe Arg Leu Lys Lys Cys Asn Tyr Lys Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Ile 85 90 95 Ile Lys Ser Gln Pro Gly Met Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Thr Val Gly Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Met Phe Asn Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 40 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for the mature protein US7 without Strep-tag II. Reading frame starts with the first nucleotide of the following sequence <400> 40 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaag tggtatgtgg taggtgttgc agggaataag 120 tctctcagag aagacaaaga cccgtggaag atgtatgcca ccatctatga gctgaaagaa 180 gacaagagct acaatgtcac ctcggtcggg tttgggacta agaagtgtca ttacaagatc 240 aggacttttg ttccaggttc ccagccaggc gagttcacgc tgggcaggat taagagtcgg 300 cctggaagga cgagtgctct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 360 gtgttcttca aggtggttca gcaaaacagg gagtcgttca atatcaccct ctacgggaga 420 accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 41 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> US7 (Abeta) <400> 41 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Val Ala Gly Asn Lys Ser Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Trp Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Gly Phe Gly Thr Lys Lys Cys His Tyr Lys Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Arg 85 90 95 Ile Lys Ser Arg Pro Gly Arg Thr Ser Ala Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Val Val Gln Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Ser Phe Asn Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 42 <211> 805 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XbaI/HindIII restriction fragment of phNGAL124, which encodes wild type Lcn2 as fusion with the albumin-binding domain cloned on pASK75. Reading frame starts at position 22 with atg <400> 42 tctagataac gagggcaaaa aatgaaaaag acagctatcg cgattgcagt ggctctggct 60 ggcttcgcta ccgtagcgca ggcccaggac tccacctcag acctgatccc agccccacct 120 ctgagcaagg tccctctgca gcagaacttc caggacaacc aattccatgg gaagtggtat 180 gtggtaggtc tcgcagggaa tgcaattctc agagaagaca aagacccgca aaagatgtat 240 gccaccatct atgagctgaa agaagacaag agctacaatg tcacctccgt cctgtttagg 300 aaaaagaagt gtgactactg gatcaggact tttgttccag gttcccagcc aggcgagttc 360 acgctgggca acattaagag ttaccctgga ttaacgagtt acctcgtccg agtggtgagc 420 accaactaca accagcatgc tatggtgttc ttcaagaaag tttctcaaaa cagggagtac 480 ttcaagatca ccctctacgg gagaaccaag gagctgactt cggaactaaa ggagaacttc 540 atccgcttct ccaaatctct gggcctccct gaaaaccaca tcgtcttccc tgtcccaatc 600 gaccagtgta tcgacggcag cgcttggtcc cacccgcagt tcgaaaaata ggcccacctg 660 gctgaagcta aagttctggc taaccgtgaa ctggacaaat acggtgtttc cgactactac 720 aaaaacctca tcaacaacgc taaaaccgtt gaaggtgtta aagctctgat cgacgaaatt 780 ctcgcagcac tgccgtaata agctt 805 <210> 43 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1-G1 (Abeta) <400> 43 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Cys Ala Gly Asn Val Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Leu Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Gly Phe Asp Asp Lys Lys Cys Leu Tyr Lys Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Arg 85 90 95 Ile Lys Ser Glu Pro Gly Gly Thr Ser Trp Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Ala Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Thr Phe Asn Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 44 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp Tyr Trp Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Asn 85 90 95 Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Lys Val Ser Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 cccaggactc cacctcagac c 21 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 actgcgggtg ggaccaagcg ctgccgt 27 <210> 47 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> degenerate oligonucleotide DH-4 <400> 47 ggacaaccaa ttccatggga agtggtatgt ggtaggtgyt gcagggaatg tgttgctc 58 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer J08rev <400> 48 gctgccgtcg atacactg 18 <210> 49 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for the mature protein H1GA without Strep-tag II.Reading frame starts with the first nucleotide of the following sequence <400> 49 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaag tggtatgtgg taggtgctgc agggaatgtg 120 ttgctcagag aagacaaaga cccgcttaag atgtatgcca ccatctatga gctgaaagaa 180 gacaagagct acaatgtcac cagtgtcggg tttgatgata agaagtgttt gtacaagatc 240 cggacttttg ttccaggttc ccagccaggc gagttcacgc tgggcaggat taagagtgag 300 cctggaggta cgagttggct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 360 gtgttcttca aggaggttgc gcaaaacagg gagacgttca atatcaccct ctacgggaga 420 accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 50 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1GA (Abeta) <400> 50 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Ala Ala Gly Asn Val Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Leu Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Gly Phe Asp Asp Lys Lys Cys Leu Tyr Lys Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Arg 85 90 95 Ile Lys Ser Glu Pro Gly Gly Thr Ser Trp Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Ala Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Thr Phe Asn Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly <210> 51 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence for the mature protein H1GV without Strep-tag II. Reading frame starts with the first nucleotide of the following sequence <400> 51 caggactcca cctcagacct gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag 60 aacttccagg acaaccaatt ccatgggaag tggtatgtgg taggtgttgc agggaatgtg 120 ttgctcagag aagacaaaga cccgcttaag atgtatgcca ccatctatga gctgaaagaa 180 gacaagagct acaatgtcac cagtgtcggg tttgatgata agaagtgttt gtacaagatc 240 cggacttttg ttccaggttc ccagccaggc gagttcacgc tgggcaggat taagagtgag 300 cctggaggta cgagttggct cgtccgagtg gtgagcacca actacaacca gcatgctatg 360 gtgttcttca aggaggttgc gcaaaacagg gagacgttca atatcaccct ctacgggaga 420 accaaggagc tgacttcgga actaaaggag aacttcatcc gcttctccaa atctctgggc 480 ctccctgaaa accacatcgt cttccctgtc ccaatcgacc agtgtatcga cggc 534 <210> 52 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1GV (A beta) <400> 52 Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val 1 5 10 15 Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr 20 25 30 Val Val Gly Val Ala Gly Asn Val Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro 35 40 45 Leu Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr 50 55 60 Asn Val Thr Ser Val Gly Phe Asp Asp Lys Lys Cys Leu Tyr Lys Ile 65 70 75 80 Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Arg 85 90 95 Ile Lys Ser Glu Pro Gly Gly Thr Ser Trp Leu Val Arg Val Val Ser 100 105 110 Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Ala Gln 115 120 125 Asn Arg Glu Thr Phe Asn Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile 165 170 175 Asp Gly

Claims (21)

  1. (a) 인간 Lcn2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를, 서열번호 44로 표시되는 인간 Lcn2(hLcn2)의 선형 폴리펩타이드 서열의 96, 100 및 106번의 서열 위치에 대응하는 적어도 하나의 서열 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 삼중자(triplet coding)에서 돌연변이를 유발시키고, 그리고 서열번호 44로 표시되는 hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 103, 125, 127, 132, 및 134번의 서열 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 삼중자 중 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 또는 17개 모두에서 돌연변이를 유발시키는 단계를 포함하는, 인간 리포칼린 2 (hLcn2, hNGAL) 유래 복수의 상이한 뮤테인들을 암호화하는 복수의 상이한 핵산들을 포함하는 핵산 라이브러리(nucleic acid library)의 제조 방법으로,
    상기 복수의 뮤테인들은 200 nM 이하의 해리 상수(KD) 갖는 주어진 비-천연 표적과 결합하는 하나 이상의 뮤테인을 포함하고, 상기 비-천연 표적은 생리학적 조건에서 천연 그대로의 성숙한 hLcn2과 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. (a) 인간 Lcn2 단백질을 암호화하는 핵산 분자를, 서열번호 44로 표시되는 인간 Lcn2(hLcn2)의 선형 폴리펩타이드 서열의 96, 100 및 106번의 서열 위치에 대응하는 적어도 하나의 서열 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 삼중자(triplet coding)에서 돌연변이를 유발시키고, 그리고 서열번호 44로 표시되는 hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 103, 125, 127, 132, 및 134번의 서열 위치를 코딩하는 뉴클레오타이드 삼중자 중 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 또는 17개 모두에서 돌연변이를 유발시키는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 복수의 상이한 핵산 분자들을 적합한 발현 시스템에서 발현시키는 단계;
    를 포함하는, 인간 리포칼린 2 (hLcn2, hNGAL) 유래 복수의 상이한 뮤테인들을 포함하는 리포칼린 뮤테인 라이브러리(library)의 제조 방법으로,
    상기 복수의 뮤테인들은 200 nM 이하의 해리 상수(KD) 갖는 주어진 비-천연 표적과 결합하는 하나 이상의 뮤테인을 포함하고, 상기 비-천연 표적은 생리학적 조건에서 천연 그대로의 성숙한 hLcn2과 결합하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 시스테인을 코딩하는 뉴클레오타이드 삼중자는 돌연변이 되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 인간 리포칼린 2(hLcn2, hNGAL) 유래의 복수의 상이한 뮤테인들을 포함하는 리포칼린 뮤테인 라이브러리로,
    상기 복수의 뮤테인들은 서열번호 44로 표시되는 hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 96, 100 및 106번의 서열 위치에 대응하는 어느 하나의 서열 위치에서 적어도 하나의 변이된 아미노산 잔기를 포함하고, 그리고 서열번호 44로 표시되는 hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 103, 125, 127, 132, 및 134번의 서열 위치에 대응하는 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 또는 17개의 서열 위치에서 변이된 아미노산 잔기를 포함하며,
    상기 복수의 뮤테인들은 200 nM 이하의 해리 상수(KD) 갖는 주어진 비-천연 표적에 결합하는 하나 이상의 뮤테인들을 포함하고, 및
    상기 비-천연 표적은 생리학적 조건에서 천연 그대로의 성숙한 hLcn2과 결합하지 않는 것인, 리포칼린 뮤테인 라이브러리.
  5. 제4항에 있어서, 상기 라이브러리는 서열번호 44로 표시되는 hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 96, 100 및 106번의 서열 위치에 대응하는 서열 위치에서 변이된 아미노산 잔기를 포함하는 복수의 상이한 뮤테인들을 포함하는, 뮤테인 라이브러리.
  6. 제4항에 있어서, 상기 라이브러리는 서열번호 44로 표시되는 hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 103, 125, 127, 132, 및 134번의 서열 위치에 대응하는 15개, 16개, 또는 17개의 서열 위치에서 변이된 아미노산 잔기를 포함하는 복수의 상이한 뮤테인들을 포함하는, 뮤테인 라이브러리.
  7. 제4항에 있어서, 상기 라이브러리는 서열번호 44로 표시되는 hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 96, 100, 103, 106, 125, 127, 132, 및 134번의 서열 위치에 대응하는 18개, 19개, 또는 20개의 서열 위치에서 변이된 아미노산 잔기를 포함하는 복수의 상이한 뮤테인들을 포함하는, 뮤테인 라이브러리.
  8. 제4항에 있어서, 상기 비-천연 표적은 펩타이드, 단백질, 단백질의 단편 또는 도메인, 및 작은 유기 분자 중에서 선택되는 뮤테인 라이브러리.
  9. 제4항에 있어서, 상기 라이브러리는 서열번호 44로 표시되는 hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열에 관하여 Gln28→His 및 Cys87→Ser으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 추가로 포함하는 복수의 상이한 뮤테인들을 포함하는, 뮤테인 라이브러리.
  10. 제4항에 있어서, 상기 라이브러리는 서열번호 44로 표시되는 hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 137 및 145 서열 위치에 대응하는 서열 위치 중 어느 하나의 변이된 아미노산 잔기를 포함하지 않는 복수의 상이한 뮤테인들을 포함하는, 뮤테인 라이브러리.
  11. 제4항에 있어서, 상기 라이브러리는 유기 분자, 효소 레이블, 방사성 레이블, 컬러 레이블, 형광 레이블, 색소생산성 레이블, 발광 레이블, 합텐, 디곡시제닌, 비오틴, 세포증식 억제제, 독소, 금속 복합체, 금속, 콜로이드 골드 및 뮤테인의 혈청 반감기를 확장하는 화합물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 화합물에 결합할 수 있는 복수의 상이한 뮤테인들을 포함하는, 뮤테인 라이브러리.
  12. 제4항에 있어서, 상기 라이브러리는 단백질 또는 단백질 도메인 또는 펩타이드인 융합 파트너에 N-터미널 또는 C-터미널 또는 N- 및 C-터미널에서 융합되는 것을 특징으로 하는 복수의 상이한 뮤테인들을 포함하는, 뮤테인 라이브러리.
  13. 제11항에 있어서, 상기 혈청 반감기를 확장하는 화합물은 폴리알킬렌 글리콜 분자, 하이드로에틸녹말, 면역 글로불린의 Fc 일부, 면역 글로불린의 CH3 도메인, 면역 글로불린의 CH4 도메인, 알부민 결합 펩타이드, 및 알부민 결합 단백질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뮤테인 라이브러리.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 이의 활성 유도체인 것을 특징으로 하는 뮤테인 라이브러리.
  15. 제12항에 있어서, 상기 뮤테인의 융합 파트너는 뮤테인의 혈청 반감기를 확장하는 단백질 도메인인 것을 특징으로 하는 뮤테인 라이브러리.
  16. 인간 리포칼린 2(hLcn2, hNGAL) 유래의 복수의 상이한 뮤테인들을 암호화하는 복수의 상이한 핵산 분자들을 포함하는 핵산 라이브러리로,
    상기 복수의 뮤테인들은 서열번호 44로 표시되는 hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 96, 100 및 106번의 서열 위치에 대응하는 어느 하나의 서열 위치에서 적어도 하나의 변이된 아미노산 잔기를 포함하고, 그리고 서열번호 44로 표시되는 hLcn2의 선형 폴리펩타이드 서열의 36, 40, 41, 49, 52, 68, 70, 72, 73, 77, 79, 81, 103, 125, 127, 132, 및 134번의 서열 위치에 대응하는 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 또는 17개의 서열 위치에서 변이된 아미노산 잔기를 포함하며,
    상기 복수의 뮤테인들은 200 nM 이하의 해리 상수(KD) 갖는 주어진 비-천연 표적에 결합하는 하나 이상의 뮤테인들을 포함하고, 및
    상기 비-천연 표적은 생리학적 조건에서 천연 그대로의 성숙한 hLcn2과 결합하지 않는 것인, 핵산 라이브러리.
  17. 제16항에 있어서, 상기 복수의 상이한 핵산들은 상기 복수의 상이한 핵산들의 발현이 가능하도록 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 것임을 특징으로 하는 핵산 라이브러리.
  18. 제17항에 따른 핵산 라이브러리의 상이한 핵산 분자들을 포함하는 복수의 상이한 숙주세포들을 포함하는 숙주 세포 라이브러리.
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