CN110964680B - 利用纤维素制备金合欢烯的工程菌株及方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种工程菌株，该工程菌株是保藏编号为CGMCC NO.14819的大肠杆菌。本公开还提供了一种制备工程菌的方法，该方法包括：在工程菌宿主菌的基因组中敲入乙酸激酶后进行重组质粒的转入，使得转入后的所述工程菌宿主菌能够过表达乙酸激酶并且能够表达所述重组质粒中所插入的基因；所述重组质粒包括如SEQ ID NO.1所示的质粒、如SEQ ID NO.2所示的质粒和如SEQ ID NO.3所示的质粒。本公开还提供了该方法制备得到的工程菌、上述工程菌株和工程菌的用途以及一种利用纤维素制备金合欢烯的方法。本公开通过上述技术方案，显著地提高了利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。

Description

利用纤维素制备金合欢烯的工程菌株及方法
技术领域
本公开涉及生物工程领域，具体地，涉及一种工程菌株、一种制备工程菌的方法、该方法制备得到的工程菌、上述工程菌株和工程菌的用途以及一种利用纤维素制备金合欢烯的方法。
背景技术
金合欢烯可加氢转化为金合欢烷，是一种可再生、可与石化柴油和航天燃料混合使用的燃料。金合欢烯具有不含硫、高十六烷值、低温性能和低GHG排放的优点，是一种应用广泛且效果理想的生物基化学品。例如，CN101553558A描述了在大肠杆菌中利用含有葡萄糖的培养基通过MEV途径生成金合欢烯。
通过微生物法生产金合欢烯需要解决的一个重要问题是葡萄糖的来源问题。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50％以上，是一种重要的葡萄糖来源。具体地，纤维素是由D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键联结而成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分。例如，棉花的纤维素含量接近100％。纤维素通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起。例如一般木材中，纤维素占40～50％，还有10～30％的半纤维素和20～30％的木质素。
纤维素只有在降解为葡萄糖以后，才能被微生物工程菌作为碳源利用。在实际生产中，作为纤维素的来源的原材料主要包括秸秆、树皮、木屑、玉米芯、米糠和麦麸等，这些原材料中纤维素往往形成一种具有高度结晶区的超分子稳定结构，同时其周围紧密镶嵌着半纤维素和木质素，从而形成复杂稳定的结构，其使得纤维素很难直接被微生物直接利用。目前，通常对作为纤维素的来源的原材料先进行预处理和酶解，在将得到的含有单糖的产物送入发酵过程。例如，已有的预处理方法主要有稀酸处理、热液处理、蒸汽爆破、有机溶剂处理、低温氨浸处理、碱液处理、碱性过氧化氢处理和生物法处理等。又例如，已有的酶解包括纤维素酶和/或β-葡萄糖苷酶的酶解。
然而，在研究过程中发现，纤维素水解产生含有单糖的产物如果用于金合欢烯的发酵生产，存在着产率低下的缺陷。
发明内容
本公开的目的之一是提高利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。
为了实现上述目的，一方面，本公开提供了一种工程菌株，该工程菌株是保藏编号为CGMCC NO.14819的大肠杆菌。
另一方面，本公开还提供了一种制备工程菌的方法，该方法包括：在工程菌宿主菌的基因组中敲入乙酸激酶后进行重组质粒的转入，使得转入后的所述工程菌宿主菌能够过表达乙酸激酶并且能够表达所述重组质粒中所插入的基因；所述重组质粒包括如SEQ IDNO.1所示的pMevT质粒、如SEQ ID NO.2所示的pMBIS质粒和如SEQ ID NO.3所示的pFII质粒。
另一方面，本公开还提供了上述方法制备得到的工程菌。
另一方面，本公开还提供了上述工程菌株或上述方法制备得到的工程菌在利用纤维素水解产物进行发酵产生金合欢烯中的用途。
再一方面，本公开还提供了一种利用纤维素制备金合欢烯的方法，其中，该方法包括如下步骤：(1)将含有纤维素的固态原料进行水解处理，得到含有单糖的水解产物；(2)在包括所述含有单糖的水解产物的液态发酵原料中接种如上所述的工程菌株或工程菌，并进行发酵培养，得到培养后的物料。
利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯存在着产率低下的原因可能在于菌株本身的抗逆性较差或合成能力较差，通过选取合适的载体、代谢通路、过表达关键代谢酶、基因排布顺序和启动子组合应用以平衡代谢通路，能显著地提高工程菌的抗逆性。因此，本公开通过上述技术方案，显著地提高了利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本公开涉及到的生物保藏信息包括：分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichiacoli；保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2017年10月16日；保藏编号为：CGMCC NO.14819。
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
一方面，本公开提供了一种工程菌株，其特征在于，该工程菌株是保藏编号为CGMCC NO.14819的大肠杆菌。
其中，保藏编号为CGMCC NO.14819的大肠杆菌是在根据制备工程菌的方法制备工程菌的过程中，出乎意料地得到的一个具有较高活性的克隆，由此得到了具有效果更好的工程菌株。
本公开还提供了一种制备工程菌的方法，该方法包括：在工程菌宿主菌的基因组中敲入乙酸激酶后进行重组质粒的转入，使得转入后的所述工程菌宿主菌能够过表达乙酸激酶并且能够表达所述重组质粒中所插入的基因；所述重组质粒包括如SEQ ID NO.1所示的pMevT质粒、如SEQ ID NO.2所示的pMBIS质粒和如SEQ ID NO.3所示的pFII质粒。
其中，乙酸激酶能够使得所述工程菌利用乙酸来发酵生产金合欢烯，从而进一步提高金合欢烯的产率。
可选地，其中，所述工程菌为大肠杆菌。
可选地，其中，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α和/或大肠杆菌BL21。
其中，由如SEQ ID NO.1所示的pMevT质粒、如SEQ ID NO.2所示的pMBIS质粒和如SEQ ID NO.3所示的pFII质粒三者组成的重组质粒使得所述工程菌中能够具有异戊烯焦磷酸异构酶(IDI)、金合欢烯焦磷酸合成酶(ispA)和金合欢烯合成酶(FG)的表达，并且能够具有组成甲羟戊酸(MVA)途径的多种酶的表达，还能具有柠檬酸裂解酶(ACL)的过表达；并且这种特定组合的重组质粒能够使得工程菌中各种代谢酶的表达量构成了高效的平衡代谢通路，由此提高了利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。
其中，所述组成甲羟戊酸(MVA)途径的多种酶包括乙酰乙酰基CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶(E12)、磷酸甲羟戊酸激酶(E8)和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD1)；所述乙酰乙酰基CoA硫解酶为atoB酶；所述HMG-CoA合酶为HMGS酶，所述HMG-CoA还原酶为HMGR酶。
其中，本公开中所涉及到的各种酶的物种来源、氨基酸序列和核苷酸编码序列可以为已知的选择。例如，异戊烯焦磷酸异构酶(IDI)是指编号为EC 5.3.3.2的酶，其来源及序列可以为已知的物种来源和序列(包括人工序列)。表1中给出了本公开中所涉及到的各种酶的参考信息，但本公开中所涉及到的各种酶的选取和使用并不局限于表1中的信息。
表1
Figure GDA0003310090250000041
Figure GDA0003310090250000051
另一方面，本公开还提供了如上所述的方法制备得到的工程菌。
另一方面，本公开还提供了如上所述的工程菌株或如上所述的工程菌在利用纤维素水解产物进行发酵产生金合欢烯中的用途。
另一方面，本公开还提供了一种利用纤维素制备金合欢烯的方法，其中，该方法包括如下步骤：(1)将含有纤维素的固态原料进行水解处理，得到含有单糖的水解产物；(2)在包括所述含有单糖的水解产物的液态发酵原料中接种如上所述的工程菌株或如上所述的工程菌，并进行发酵培养，得到培养后的物料。
可选地，其中，所述含有纤维素的原料包括秸秆、树皮、木屑、玉米芯、米糠和麦麸中的至少一种。
可选地，其中，将含有纤维素的原料进行水解处理的步骤包括：S1、将含有纤维素的固态原料先后进行酸预处理和碱预处理，或者先后进行碱预处理和酸预处理，得到预处理后的固态物料；S2、将所述预处理后的固态物料进行酶促水解。
可选地，其中，所述酸预处理为甲酸处理和/或稀硫酸处理；所述甲酸处理的条件包括：温度为40～100℃，时间为1～10小时，相对每千克预处理的固体物料，甲酸溶液的体积为5～50升，所述甲酸溶液含有70～95wt％的甲酸和0～2wt％的HCl；所述稀硫酸处理的条件包括：温度为80～150℃，时间为5分钟～2小时，相对每千克预处理的固体物料，稀硫酸溶液的体积为5～50升，所述稀硫酸溶液含有0.5～10wt％的稀硫酸。
可选地，其中，所述碱预处理为氨水处理和/或氢氧化钠处理；所述氨水处理的条件包括：温度为40～80℃，时间为2～24小时，相对每千克预处理的固体物料，氨水的体积为2～20升，所述氨水含有10-25wt％的NH3；所述氢氧化钠处理的条件包括：温度为60～120℃，时间为1～12小时，相对每千克预处理的固体物料，氢氧化钠水溶液的体积为5～50升，所述氢氧化钠水溶液含有0.5～10wt％的氢氧化钠。
可选地，其中，所述酶促水解的条件包括：温度30～70℃，时间3～72h，pH为4.0～6.0，每千克预处理后的固态物料，缓冲液的体积为5～100升，酶促水解所用的缓冲液含有0.01～1mol/L柠檬酸缓冲液和/或0.01～1mol/L的乙酸缓冲液，酶促水解所用的酶为纤维素酶和/或β-葡萄糖苷酶，所述纤维素酶加酶量为每克预处理后的固态物料10～500U，所述β-葡萄糖苷酶加酶量为每克预处理后的固态物料10～250U。
可选地，其中，发酵培养的条件包括：温度为16～35℃，时间为3～120h，相对每升所述液态发酵原料，萃取剂的用量为50～1000mL，所述工程菌或工程菌株的接种量为(10～300)×107个；所述的萃取剂选自正己烷、正癸烷、十二烷或煤油；每升所述液态发酵原料中，以单糖的量计算，所述含有单糖的水解产物的含量为0.01～0.9千克。
以下通过实施例进一步详细说明本发明：
实施例1
本实施例用于说明纤维素酶解液的制备。
称取粒径为20～80目的玉米秸秆100g，加入1.5L甲酸溶液(含有88wt％的甲酸和1wt％的HCl)置于处理罐中。在65℃恒温水浴中反应3h后将反应浆液固液分离。对固体组分再进行氨水处理，处理条件为：氨水浓度15wt％、每千克固体组分所用的氨水的体积为8升、处理温度60℃和反应时间16h。反应结束后将物料固液分离，固体组分用蒸馏水洗涤至pH 6～7，烘干，得到预处理后的固态物料。
将所述预处理后的固态物料进行酶促水解，酶解条件包括：温度为50℃、每千克预处理后的固态物料所用缓冲液的体积为20升、缓冲液为pH为4.8的柠檬酸缓冲液(0.15mol/L)、酶促水解所用的酶为纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，所述纤维素酶加酶量为每克预处理后的固态物料30U，所述β-葡萄糖苷酶加酶量为每克预处理后的固态物料60U。酶解24h后将反应浆液取出，在沸水浴中灭酶10min后进行抽滤。抽滤所得液体组分利用HPLC分析检测，所得纤维素酶解液葡萄糖浓度为38.2g/L。
实施例2
本实施例用于说明质粒的序列结构。本实施例中用到的可商购载体包括用于向大肠杆菌基因组中敲入乙酸激酶ack(基因)的pet-22b载体、pBAD33载体、pACYDCDuet-1载体、pBBR1MCS-4载体和pet-28a载体。
按照上述载体的使用说明书采用PCR克隆、全基因合成、限制性内切酶酶切和连接等分子生物学操作，构建1套MVA代谢路径的质粒，具体包括pMevT质粒、pMBIS质粒和pFII质粒，再构建1个用于替换pFII质粒的质粒，即pFG质粒，接着构建2个用于替换pMevT质粒的质粒，分别为pMevT-1和pMevT-2。上述质粒的序列信息具体如表2所示。
表2
Figure GDA0003310090250000071
Figure GDA0003310090250000081
实施例3
本实施例用于说明工程菌株的构建过程。
实验组工程菌株F1的构建：选用大肠杆菌BL21为宿主细胞，按照如下方法进行乙酸激酶(ack)的敲入，得到敲入后的过表达乙酸激酶(ack)的菌株。
第一步感受态细胞制备：将质粒pREDKI(SEQ ID NO.9所示)转入大肠杆菌BL21中以后，接种至LB液体培养基(kana抗性)中，置于30℃摇床培养过夜，次日以1：100的体积比转接于新鲜的LB液体培养基(kana抗性)中，30℃培养至OD600为0.2至0.3之间，加入终浓度10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导，诱导1～1.5h后，自30℃摇床中取出冰浴10min以上，3500rpm/min、4℃离心10min，弃培养基，用无菌去离子水洗涤3次后，以少量的灭菌去离子水重悬，得到第一步感受态细胞。
线性抗性基因打靶序列的转化：取约400ng同源臂引物扩增的外源抗性打靶片段(22b-Q-tetA-H，SEQ ID NO.7所示)与40微升第一步感受态细胞混匀；转入已经预冷了的0.1cm的Bio-Rad电击杯中，然后进行电击；电击完成后迅速加入1mL 30℃预热的加有L-阿拉伯糖的LB培养基，30℃复壮2h，涂布卡那霉素和四环素平板，30℃培养过夜，挑选转化子；上述得到的具有卡那霉素和四环素抗性的单菌落可能是携带有pREDKI的poxB基因被四环素取代的突变株，在同源臂上下游设计引物通过设计引物进行验证，得到携带有pREDKI的poxB基因被四环素取代的突变株。
第二步感受态细胞制备：将上述所得携带有pREDKI的poxB基因被四环素取代的突变株，接种至LB液体培养基(卡那霉素和四环素)中，置于30℃摇床培养过夜，次日以1:100的比例转接于新鲜的LB液体培养基(卡那霉素和四环素)中，30℃培养至OD600为0.2至0.3，加入终浓度10mmol/L的L-阿拉伯糖和鼠李糖诱导，诱导1～1.5h以后自30℃摇床中取出冰浴10min以上，3500r/min、4℃离心10min，弃培养基，用无菌去离子水洗涤3次后，以少量的灭菌去离子水重悬，得到第二步感受态细胞。
线性目的基因打靶序列的转化：取约400ng同源臂引物扩增的外源目的基因打靶片段(22b-Q-ack-H，SEQ ID NO.8所示)与40微升第二步感受态细胞混匀；转入已经预冷了的0.1cm的Bio-Rad电击杯中，然后进行电击；电击完成后迅速加入1mL 30℃预热的加有L-阿拉伯糖和鼠李糖的LB培养基，30℃复壮2h，涂布卡那霉素平板，30℃培养过夜，挑选转化子；上述得到的具有卡那霉素的单菌落可能是携带有pREDKI的poxB基因被ack基因取代的突变株，在同源臂上下游设计引物通过设计引物进行验证，验证得到携带有pREDKI的poxB基因被ack基因取代的突变株。
辅助质粒消除：携带有pREDKI的poxB基因被ack基因取代的突变株接种至LB液体培养基中，置于37℃摇床培养过夜，消除辅助质粒pREDKI，得到敲入后的过表达乙酸激酶(ack)的菌株。
然后通过CaCl2转化法在敲入后的过表达乙酸激酶(ack)的菌株中转入表2中所述pMevT质粒、pMBIS质粒和pFII质粒。该菌株可通过MVA代谢路径合成金合欢烯，具有优化后的高效的平衡代谢通路，并且具有柠檬酸裂解酶(ACL)的过表达。在抗生素抗性筛选平板上，选取该菌株的12个克隆，分别为F1-1至F1-12。
对照组工程菌株DF1的构建：选用大肠杆菌BL21为宿主细胞，通过CaCl2转化法转入表2中所述pMevT-1质粒、pMBIS质粒和pFG质粒。该菌株可通过MVA代谢路径合成金合欢烯，但没有进行平衡代谢通路的优化。在抗生素抗性筛选平板上，选取该菌株的3个克隆，分别为DF1-1、DF1-2和DF1-3。
对照组工程菌株DF2的构建：选用大肠杆菌BL21为宿主细胞，通过CaCl2转化法转入表2中所述pMevT-2质粒、pMBIS质粒和pFII质粒。该菌株可通过MVA代谢路径合成金合欢烯，具有优化后的高效的平衡代谢通路，但不具有柠檬酸裂解酶(ACL)的过表达。在抗生素抗性筛选平板上，选取该菌株的3个克隆，分别为DF2-1、DF2-2和DF2-3。
对照组工程菌株DF3的构建：选用大肠杆菌BL21为宿主细胞，通过CaCl2转化法转入表2中所述pMevT质粒、pMBIS质粒和pFII质粒。该菌株可通过MVA代谢路径合成金合欢烯，具有优化后的高效的平衡代谢通路，也具有柠檬酸裂解酶(ACL)的过表达，但不具有基因组中敲入的乙酸激酶(ack)。在抗生素抗性筛选平板上，选取该菌株的3个克隆，分别为DF3-1、DF3-2和DF3-3。
实施例4
本实施例用于说明利用纤维素制备金合欢烯的方法。
将实施例1得到的纤维素酶解液作为含有单糖的水解产物，用于制备液态发酵原料。每升所述液态发酵原料含有100mL实施例1得到的纤维素酶解液以及10g蛋白胨、5g酵母膏、10g NaCl和余量的水。液态发酵原料灭菌后待用。
在上述液态发酵原料中添加抗生素(氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素，终浓度为30mg/mL)，然后分别接种实施例3得到的15个克隆，接种密度为200×107个/L。在37℃下培养至OD600在0.6～08之间，向发酵液中添加终浓度为200mg/L的IPTG、终浓度为1g/L的L-阿拉伯糖和20mL正癸烷，在30℃下进行诱导表达以发酵合成金合欢烯。诱导24h后取1mL发酵液和100μl萃取层(正癸烷)分别进行细胞密度和金合欢烯浓度的检测。结果如表3所示。
表3
Figure GDA0003310090250000111
Figure GDA0003310090250000121
根据表3的数据可见，就发酵产物中的金合欢烯含量而言，实验组工程菌株F1的12个克隆均显著高于对照组工程菌株DF1的3个克隆DF1-1、DF1-2和DF1-3，也显著高于对照组工程菌株DF2的3个克隆DF2-1、DF2-2和DF2-3和DF3的3个克隆DF3-1、DF3-2和DF3-3，并且实验组工程菌株F1的12个克隆中，F1-6具有最高的发酵产物中的金合欢烯含量，将其选定为最优菌株进行保藏，保藏编号为：CGMCC NO.14819。由此可见，保藏编号为：CGMCC NO.14819具有更加突出的金合欢烯生产能力。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
序列表
<110> 中国石油化工股份有限公司
中国石油化工股份有限公司石油化工科学研究院
<120> 利用纤维素制备金合欢烯的工程菌株及方法
<130> 9513RIPP
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11077
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaatagg 60
aggaattaac catgaaaaat tgtgtcatcg tcagtgcggt acgtactgct atcggtagtt 120
ttaacggttc actcgcttcc accagcgcca tcgacctggg ggcgacagta attaaagccg 180
ccattgaacg tgcaaaaatc gattcacaac acgttgatga agtgattatg ggtaacgtgt 240
tacaagccgg gctggggcaa aatccggcgc gtcaggcact gttaaaaagc gggctggcag 300
aaacggtgtg cggattcacg gtcaataaag tatgtggttc gggtcttaaa agtgtggcgc 360
ttgccgccca ggccattcag gcaggtcagg cgcagagcat tgtggcgggg ggtatggaaa 420
atatgagttt agccccctac ttactcgatg caaaagcacg ctctggttat cgtcttggag 480
acggacaggt ttatgacgta atcctgcgcg atggcctgat gtgcgccacc catggttatc 540
atatggggat taccgccgaa aacgtggcta aagagtacgg aattacccgt gaaatgcagg 600
atgaactggc gctacattca cagcgtaaag cggcagccgc aattgagtcc ggtgctttta 660
cagccgaaat cgtcccggta aatgttgtca ctcgaaagaa aaccttcgtc ttcagtcaag 720
acgaattccc gaaagcgaat tcaacggctg aagcgttagg tgcattgcgc ccggccttcg 780
ataaagcagg aacagtcacc gctgggaacg cgtctggtat taacgacggt gctgccgctc 840
tggtgattat ggaagaatct gcggcgctgg cagcaggcct tacccccctg gctcgcatta 900
aaagttatgc cagcggtggc gtgccccccg cattgatggg tatggggcca gtacctgcca 960
cgcaaaaagc gttacaactg gcggggctgc aactggcgga tattgatctc attgaggcta 1020
atgaagcatt tgctgcacag ttccttgccg ttgggaaaaa cctgggcttt gattctgaga 1080
aagtgaatgt caacggcggg gccatcgcgc tcgggcatcc tatcggtgcc agtggtgctc 1140
gtattctggt cacactatta catgccatgc aggcacgcga taaaacgctg gggctggcaa 1200
cactgtgcat tggcggcggt cagggaattg cgatggtgat tgaacggttg aattaaagga 1260
ggaattaacc atgaaactct caactaaact ttgttggtgt ggtattaaag gaagacttag 1320
gccgcaaaag caacaacaat tacacaatac aaacttgcaa atgactgaac taaaaaaaca 1380
aaagaccgct gaacaaaaaa ccagacctca aaatgtcggt attaaaggta tccaaattta 1440
catcccaact caatgtgtca accaatctga gctagagaaa tttgatggcg tttctcaagg 1500
taaatacaca attggtctgg gccaaaccaa catgtctttt gtcaatgaca gagaagatat 1560
ctactcgatg tccctaactg ttttgtctaa gttgatcaag agttacaaca tcgacaccaa 1620
caaaattggt agattagaag tcggtactga aactctgatt gacaagtcca agtctgtcaa 1680
gtctgtcttg atgcaattgt ttggtgaaaa cactgacgtc gaaggtattg acacgcttaa 1740
tgcctgttac ggtggtacca acgcgttgtt caactctttg aactggattg aatctaacgc 1800
atgggatggt agagacgcca ttgtagtttg cggtgatatt gccatctacg ataagggtgc 1860
cgcaagacca accggtggtg ccggtactgt tgctatgtgg atcggtcctg atgctccaat 1920
tgtatttgac tctgtaagag cttcttacat ggaacacgcc tacgattttt acaagccaga 1980
tttcaccagc gaatatcctt acgtcgatgg tcatttttca ttaacttgtt acgtcaaggc 2040
tcttgatcaa gtttacaaga gttattccaa gaaggctatt tctaaagggt tggttagcga 2100
tcccgctggt tcggatgctt tgaacgtttt gaaatatttc gactacaacg ttttccatgt 2160
tccaacctgt aaattggtca caaaatcata cggtagatta ctatataacg atttcagagc 2220
caatcctcaa ttgttcccag aagttgacgc cgaattagct actcgcgatt atgacgaatc 2280
tttaaccgat aagaacattg aaaaaacttt tgttaatgtt gctaagccat tccacaaaga 2340
gagagttgcc caatctttga ttgttccaac aaacacaggt aacatgtaca ccgcatctgt 2400
ttatgccgcc tttgcatctc tattaaacta tgttggatct gacgacttac aaggcaagcg 2460
tgttggttta ttttcttacg gttccggttt agctgcatct ctatattctt gcaaaattgt 2520
tggtgacgtc caacatatta tcaaggaatt agatattact aacaaattag ccaagagaat 2580
caccgaaact ccaaaggatt acgaagctgc catcgaattg agagaaaatg cccatttgaa 2640
gaagaacttc aaacctcaag gttccattga gcatttgcaa agtggtgttt actacttgac 2700
caacatcgat gacaaattta gaagatctta cgatgttaaa aaataaagga ggaattaacc 2760
atgtcacttc ccttaaaaac gatagtacat ttggtaaagc cctttgcttg cactgctagg 2820
tttagtgcga gatacccaat ccacgtcatt gttgttgctg ttttattgag tgccgctgct 2880
tatctatccg tgacacaatc ttaccttaac gaatggaagc tggactctaa tcagtattct 2940
acatacttaa gcataaagcc ggatgagttg tttgaaaaat gcacacacta ctataggtct 3000
cctgtgtctg atacatggaa gttactcagc tctaaagaag ccgccgatat ttatacccct 3060
tttcattatt atttgtctac cataagtttt caaagtaagg acaattcaac gactttgcct 3120
tcccttgatg acgttattta cagtgttgac cataccaggt acttattaag tgaagagcca 3180
aagataccaa ctgaactagt gtctgaaaac ggaacgaaat ggagattgag aaacaacagc 3240
aattttattt tggacctgca taatatttac cgaaatatgg tgaagcaatt ttctaacaaa 3300
acgagcgaat ttgatcagtt cgatttgttt atcatcctag ctgcttacct tactcttttt 3360
tatactctct gttgcctgtt taatgacatg aggaaaatcg gatcaaagtt ttggttaagc 3420
ttttctgctc tttcaaactc tgcatgcgca ttatatttat cgctgtacac aactcacagt 3480
ttattgaaga aaccggcttc cttattaagt ttggtcattg gactaccatt tatcgtagta 3540
attattggct ttaagcataa agttcgactt gcggcattct cgctacaaaa attccacaga 3600
attagtattg acaagaaaat aacggtaagc aacattattt atgaggctat gtttcaagaa 3660
ggtgcctact taatccgcga ctacttattt tatattagct ccttcattgg atgtgctatt 3720
tatgctagac atcttcccgg attggtcaat ttctgtattt tgtctacatt tatgctagtt 3780
ttcgacttgc ttttgtctgc tactttttat tctgccattt tatcaatgaa gctggaaatt 3840
aacatcattc acagatcaac cgtcatcaga cagactttgg aagaggacgg agttgtccca 3900
actacagcag atattatata taaggatgaa actgcctcag aaccacattt tttgagatct 3960
aacgtggcta tcattctggg aaaagcatca gttattggtc ttttgcttct gatcaacctt 4020
tatgttttca cagataagtt aaatgctaca atactaaaca cggtatattt tgactctaca 4080
atttactcgt taccaaattt tatcaattat aaagatattg gcaatctcag caatcaagtg 4140
atcatttccg tgttgccaaa gcaatattat actccgctga aaaaatacca tcagatcgaa 4200
gattctgttc tacttatcat tgattccgtt agcaatgcta ttcgggacca atttatcagc 4260
aagttacttt tttttgcatt tgcagttagt atttccatca atgtctactt actgaatgct 4320
gcaaaaattc acacaggata catgaacttc caaccacaat caaataagat cgatgatctt 4380
gttgttcagc aaaaatcggc aacgattgag ttttcagaaa ctcgaagtat gcctgcttct 4440
tctggcctag aaactccagt gaccgcgaaa gatataatta tctctgaaga aatccagaat 4500
aacgaatgcg tctatgcttt gagttcccag gacgagccta tccgtccttt atcgaattta 4560
gtggaactta tggagaaaga acaattaaag aacatgaata atactgaggt ttcgaatctt 4620
gtcgtcaacg gtaaactgcc attatattcc ttagagaaaa aattagagga cacaactcgt 4680
gcggttttag ttaggagaaa ggcactttca actttggctg aatcgccaat tttagtttcc 4740
gaaaaattgc ccttcagaaa ttatgattat gatcgcgttt ttggagcttg ctgtgaaaat 4800
gtcatcggct atatgccaat accagttggt gtaattggtc cattaattat tgatggaaca 4860
tcttatcaca taccaatggc aaccacggaa ggttgtttag tggcttcagc tatgcgtggt 4920
tgcaaagcca tcaatgctgg tggtggtgca acaactgttt taaccaaaga tggtatgact 4980
agaggcccag tcgttcgttt ccctacttta ataagatctg gtgcctgcaa gatatggtta 5040
gactcggaag agggacaaaa ttcaattaaa aaagctttta attctacatc aaggtttgca 5100
cgtttgcaac atattcaaac ctgtctagca ggcgatttgc tttttatgag atttcggaca 5160
actaccggtg acgcaatggg tatgaacatg atatcgaaag gtgtcgaata ctctttgaaa 5220
caaatggtag aagaatatgg ttgggaagat atggaagttg tctccgtatc tggtaactat 5280
tgtactgata agaaacctgc cgcaatcaat tggattgaag gtcgtggtaa aagtgtcgta 5340
gctgaagcta ctattcctgg tgatgtcgta aaaagtgttt taaagagcga tgtttccgct 5400
ttagttgaat taaatatatc caagaacttg gttggatccg caatggctgg atctgttggt 5460
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cctgcgcaga acgtcgaaag ttccaactgt ataactttga tgaaggaagt tgatggtgat 5580
ttaaggatct ctgtttccat gccatctatt gaagttggta cgattggcgg gggtactgtt 5640
ctggagcctc agggcgccat gcttgatctt ctcggcgttc gtggtcctca ccccactgaa 5700
cctggagcaa atgctaggca attagctaga ataatcgcgt gtgctgtctt ggctggtgaa 5760
ctgtctctgt gctccgcact tgctgccggt cacctggtac aaagccatat gactcacaac 5820
cgtaaaacaa acaaagccaa tgaactgcca caaccaagta acaaagggcc cccctgtaaa 5880
acctcagcat tattataatg cttaagtcga acagaaagta atcgtattgt acacggccgc 5940
ataatcgaaa ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attccccatc 6000
ttagtatatt agttaagtat aaaggaggaa ttaaccatgt ctgccaagtc aatccttgaa 6060
gcggatggca aggccattct caactaccac ctcaccagaa gccccgtcat caaatcctcc 6120
cctctacccc ccccatccac ccacaatccc cccccaaagc tcgcctccct ctacttcccc 6180
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ggcctgcttg ctctggacag gacctggcct gaagcgagag catggattgc tgagcgcgca 6360
ggcaaggagc agaaggttga gactgttacg ggtgtcctga ggcagttcct cgttgaacca 6420
tttgtgcctc acccgcaaga aacggaatat tatatcaaca tcaactccgt acgagagggc 6480
gactggatcc tcttcaccca cgaaggcggc gtagatgtcg gcgacgtcga cgccaaggca 6540
gaaaagctct tgatcccagt caatctcgca aactacccct ccaacgacga aatcgcctct 6600
gccctcctca gcaaaatccc ctcgggcctc cacaacgtgc tcgtcgactt catcacccgc 6660
ctctacgccg tctacgtcga ctgccaattc acctatctcg aaatcaaccc cctcgttgtc 6720
attcccaatc cctccaaaac ctccgcagca gtgcacttcc ttgacctagc cgccaaacta 6780
gaccaaactg ccgaattcga atgcggtacc aaatgggcca ttgcccgcag ccccgccgct 6840
ctggggatcc gcaaggccac caatacggat ggcaaagtaa ccatcgacgc ggggccgccc 6900
atggaattcc ccgccccctt cggccgcgag cttagcaagg aagaaaaatt catcgcagac 6960
atggacgcca agacaggctc gtcgcttaaa ctcaccgtcc tcaacccgaa cggacgcatc 7020
tggaccctcg tcgccggcgg tggtgcatcc gtcgtctacg ccgacgccat cgcgtccgct 7080
ggcttcgtct ccgaactcgc aaactacgga gaatactccg gcgcacccac cgaaacgcag 7140
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gggaaggtcc tgttcattgg tggtgggatt gcgaatttca cgaacgtcgc atcgacgttc 7260
aagggggtta ttcgggcgct gagggaggtg gcgcctatct tgaatgagca taagacacag 7320
atctgggtta ggcgggctgg gcctaattac caggaaggcc tgaagaatat taaggctgtg 7380
ggcgaggagt tggggttgga tatgcatgtt tatgggccag agatgcatgt tagtgggatc 7440
gtgccgttgg cattgttggg gaagaagacc gatgttaagg aatttggagc ggcgtagtta 7500
acctaggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 7560
gtcttgaggg gttttttgct gaaacctcag gcatttgaga agcacacggt cacactgctt 7620
ccggtagtca ataaaccggt aaaccagcaa tagacataag cggctattta acgaccctgc 7680
cctgaaccga cgaccgggtc gaatttgctt tcgaatttct gccattcatc cgcttattat 7740
cacttattca ggcgtagcac caggcgttta agggcaccaa taactgcctt aaaaaaatta 7800
cgccccgccc tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg 7860
gaagccatca cagacggcat gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc 7920
ttgcgtataa tatttgccca tagtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac 7980
gtttaaatca aaactggtga aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc 8040
aataaaccct ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata 8100
tatgtgtaga aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc 8160
agtttgctca tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc 8220
gtctttcatt gccatacgga actccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat 8280
aaaggccgga taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc 8340
cagctgaacg gtctggttat aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc 8400
tttacgatgc cattgggata tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt 8460
agcttcctta gctcctgaaa atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat 8520
ttcattatgg tgaaagttgg aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt ttcgccaaaa 8580
gttggcccag ggcttcccgg tatcaacagg gacaccagga tttatttatt ctgcgaagtg 8640
atcttccgtc acaggtattt attcggcgca aagtgcgtcg ggtgatgctg ccaacttact 8700
gatttagtgt atgatggtgt ttttgaggtg ctccagtggc ttctgtttct atcagctgtc 8760
cctcctgttc agctactgac ggggtggtgc gtaacggcaa aagcaccgcc ggacatcagc 8820
gctagcggag tgtatactgg cttactatgt tggcactgat gagggtgtca gtgaagtgct 8880
tcatgtggca ggagaaaaaa ggctgcaccg gtgcgtcagc agaatatgtg atacaggata 8940
tattccgctt cctcgctcac tgactcgcta cgctcggtcg ttcgactgcg gcgagcggaa 9000
atggcttacg aacggggcgg agatttcctg gaagatgcca ggaagatact taacagggaa 9060
gtgagagggc cgcggcaaag ccgtttttcc ataggctccg cccccctgac aagcatcacg 9120
aaatctgacg ctcaaatcag tggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 9180
ttcccctggc ggctccctcg tgcgctctcc tgttcctgcc tttcggttta ccggtgtcat 9240
tccgctgtta tggccgcgtt tgtctcattc cacgcctgac actcagttcc gggtaggcag 9300
ttcgctccaa gctggactgt atgcacgaac cccccgttca gtccgaccgc tgcgccttat 9360
ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg aaagacatgc aaaagcacca ctggcagcag 9420
ccactggtaa ttgatttaga ggagttagtc ttgaagtcat gcgccggtta aggctaaact 9480
gaaaggacaa gttttggtga ctgcgctcct ccaagccagt tacctcggtt caaagagttg 9540
gtagctcaga gaaccttcga aaaaccgccc tgcaaggcgg ttttttcgtt ttcagagcaa 9600
gagattacgc gcagaccaaa acgatctcaa gaagatcatc ttattaatca gataaaatat 9660
ttctagattt cagtgcaatt tatctcttca aatgtagcac ctgaagtcag ccccatacga 9720
tataagttgt aattctcatg ttagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag ctgactgggt 9780
tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta atgagtgagc taacttacat 9840
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 9900
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgccag ggtggttttt 9960
cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca ccgcctggcc ctgagagagt 10020
tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa aatcctgttt gatggtggtt 10080
aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt atcccactac cgagatgtcc 10140
gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg cgcccagcgc catctgatcg 10200
ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca gcatttgcat ggtttgttga 10260
aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta tcggctgaat ttgattgcga 10320
gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg agacagaact taatgggccc 10380
gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat gctccacgcc cagtcgcgta 10440
ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct ggtcagagac atcaagaaat 10500
aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg catcctggtc atccagcgga 10560
tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat tgtgcaccgc cgctttacag 10620
gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc tggcacccag ttgatcggcg 10680
cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca gggccagact ggaggtggca 10740
acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg ccacgcggtt gggaatgtaa 10800
ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt tcgcagaaac gtggctggcc 10860
tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg catactctgc gacatcgtat 10920
aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct cttccgggcg ctatcatgcc 10980
ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga tctcgacgct ctcccttatg 11040
cgactcctgc attaggaaat taatacgact cactata 11077
<210> 2
<211> 10396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcgggccgt ctcttgggct tgatcggcct tcttgcgcat ctcacgcgct cctgcggcgg 60
cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt cagccggtcg gccacggctt 120
ccggcgtctc aacgcgcttt gagattccca gcttttcggc caatccctgc ggtgcatagg 180
cgcgtggctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctccaggg 240
cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct gccctcgatg ccccgttgca 300
gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctggtc gcgggtcatc tgcgctttgt 360
tgccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgtcctgcgt cagcggcacc acgaacgcgg 420
tcatgtgcgg gctggtttcg tcacggtgga tgctggccgt cacgatgcga tccgccccgt 480
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ccgacttcca ccattccggg ctggccgtca tgacgtactc gaccgccaac acagcgtcct 600
tgcgccgctt ctctggcagc aactcgcgca gtcggcccat cgcttcatcg gtgctgctgg 660
ccgcccagtg ctcgttctct ggcgtcctgc tggcgtcagc gttgggcgtc tcgcgctcgc 720
ggtaggcgtg cttgagactg gccgccacgt tgcccatttt cgccagcttc ttgcatcgca 780
tgatcgcgta tgccgccatg cctgcccctc ccttttggtg tccaaccggc tcgacggggg 840
cagcgcaagg cggtgcctcc ggcgggccac tcaatgcttg agtatactca ctagactttg 900
cttcgcaaag tcgtgaccgc ctacggcggc tgcggcgccc tacgggcttg ctctccgggc 960
ttcgccctgc gcggtcgctg cgctcccttg ccagcccgtg gatatgtgga cgatggccgc 1020
gagcggccac cggctggctc gcttcgctcg gcccgtggac aaccctgctg gacaagctga 1080
tggacaggct gcgcctgccc acgagcttga ccacagggat tgcccaccgg ctacccagcc 1140
ttcgaccaca tacccaccgg ctccaactgc gcggcctgcg gccttgcccc atcaattttt 1200
ttaattttct ctggggaaaa gcctccggcc tgcggcctgc gcgcttcgct tgccggttgg 1260
acaccaagtg gaaggcgggt caaggctcgc gcagcgaccg cgcagcggct tggccttgac 1320
gcgcctggaa cgacccaagc ctatgcgagt gggggcagtc gaaggcgaag cccgcccgcc 1380
tgccccccga gcctcacggc ggcgagtgcg ggggttccaa gggggcagcg ccaccttggg 1440
caaggccgaa ggccgcgcag tcgatcaaca agccccggag gggccacttt ttgccggagg 1500
gggagccgcg ccgaaggcgt gggggaaccc cgcaggggtg cccttctttg ggcaccaaag 1560
aactagatat agggcgaaat gcgaaagact taaaaatcaa caacttaaaa aaggggggta 1620
cgcaacagct cattgcggca ccccccgcaa tagctcattg cgtaggttaa agaaaatctg 1680
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gcagtccaga gaaatcggca ttcaagccaa gaacaagccc ggtcactggg tgcaaacgga 1860
acgcaaagcg catgaggcgt gggccgggct tattgcgagg aaacccacgg cggcaatgct 1920
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ggccgagcgc tggatctccg tcgtgaagct caacggcccc ggcaccgtgt cggcctacgt 2100
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gagtcatctg caccagatac tattgaattg gacttcccgg acattagctt taatcataag 3420
tggtccatca atgatttcaa tgccatcacc gaggatcaag taaactccca aaaattggcc 3480
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<210> 3
<211> 8392
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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cctaactgtt ttgtctaagt tgatcaagag ttacaacatc gacaccaaca aaattggtag 2880
attagaagtc ggtactgaaa ctctgattga caagtccaag tctgtcaagt ctgtcttgat 2940
gcaattgttt ggtgaaaaca ctgacgtcga aggtattgac acgcttaatg cctgttacgg 3000
tggtaccaac gcgttgttca actctttgaa ctggattgaa tctaacgcat gggatggtag 3060
agacgccatt gtagtttgcg gtgatattgc catctacgat aagggtgccg caagaccaac 3120
cggtggtgcc ggtactgttg ctatgtggat cggtcctgat gctccaattg tatttgactc 3180
tgtaagagct tcttacatgg aacacgccta cgatttttac aagccagatt tcaccagcga 3240
atatccttac gtcgatggtc atttttcatt aacttgttac gtcaaggctc ttgatcaagt 3300
ttacaagagt tattccaaga aggctatttc taaagggttg gttagcgatc ccgctggttc 3360
ggatgctttg aacgttttga aatatttcga ctacaacgtt ttccatgttc caacctgtaa 3420
attggtcaca aaatcatacg gtagattact atataacgat ttcagagcca atcctcaatt 3480
gttcccagaa gttgacgccg aattagctac tcgcgattat gacgaatctt taaccgataa 3540
gaacattgaa aaaacttttg ttaatgttgc taagccattc cacaaagaga gagttgccca 3600
atctttgatt gttccaacaa acacaggtaa catgtacacc gcatctgttt atgccgcctt 3660
tgcatctcta ttaaactatg ttggatctga cgacttacaa ggcaagcgtg ttggtttatt 3720
ttcttacggt tccggtttag ctgcatctct atattcttgc aaaattgttg gtgacgtcca 3780
acatattatc aaggaattag atattactaa caaattagcc aagagaatca ccgaaactcc 3840
aaaggattac gaagctgcca tcgaattgag agaaaatgcc catttgaaga agaacttcaa 3900
acctcaaggt tccattgagc atttgcaaag tggtgtttac tacttgacca acatcgatga 3960
caaatttaga agatcttacg atgttaaaaa ataaaggagg aattaaccat gtcacttccc 4020
ttaaaaacga tagtacattt ggtaaagccc tttgcttgca ctgctaggtt tagtgcgaga 4080
tacccaatcc acgtcattgt tgttgctgtt ttattgagtg ccgctgctta tctatccgtg 4140
acacaatctt accttaacga atggaagctg gactctaatc agtattctac atacttaagc 4200
ataaagccgg atgagttgtt tgaaaaatgc acacactact ataggtctcc tgtgtctgat 4260
acatggaagt tactcagctc taaagaagcc gccgatattt ataccccttt tcattattat 4320
ttgtctacca taagttttca aagtaaggac aattcaacga ctttgccttc ccttgatgac 4380
gttatttaca gtgttgacca taccaggtac ttattaagtg aagagccaaa gataccaact 4440
gaactagtgt ctgaaaacgg aacgaaatgg agattgagaa acaacagcaa ttttattttg 4500
gacctgcata atatttaccg aaatatggtg aagcaatttt ctaacaaaac gagcgaattt 4560
gatcagttcg atttgtttat catcctagct gcttacctta ctctttttta tactctctgt 4620
tgcctgttta atgacatgag gaaaatcgga tcaaagtttt ggttaagctt ttctgctctt 4680
tcaaactctg catgcgcatt atatttatcg ctgtacacaa ctcacagttt attgaagaaa 4740
ccggcttcct tattaagttt ggtcattgga ctaccattta tcgtagtaat tattggcttt 4800
aagcataaag ttcgacttgc ggcattctcg ctacaaaaat tccacagaat tagtattgac 4860
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atccgcgact acttatttta tattagctcc ttcattggat gtgctattta tgctagacat 4980
cttcccggat tggtcaattt ctgtattttg tctacattta tgctagtttt cgacttgctt 5040
ttgtctgcta ctttttattc tgccatttta tcaatgaagc tggaaattaa catcattcac 5100
agatcaaccg tcatcagaca gactttggaa gaggacggag ttgtcccaac tacagcagat 5160
attatatata aggatgaaac tgcctcagaa ccacattttt tgagatctaa cgtggctatc 5220
attctgggaa aagcatcagt tattggtctt ttgcttctga tcaaccttta tgttttcaca 5280
gataagttaa atgctacaat actaaacacg gtatattttg actctacaat ttactcgtta 5340
ccaaatttta tcaattataa agatattggc aatctcagca atcaagtgat catttccgtg 5400
ttgccaaagc aatattatac tccgctgaaa aaataccatc agatcgaaga ttctgttcta 5460
cttatcattg attccgttag caatgctatt cgggaccaat ttatcagcaa gttacttttt 5520
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tatgctttga gttcccagga cgagcctatc cgtcctttat cgaatttagt ggaacttatg 5820
gagaaagaac aattaaagaa catgaataat actgaggttt cgaatcttgt cgtcaacggt 5880
aaactgccat tatattcctt agagaaaaaa ttagaggaca caactcgtgc ggttttagtt 5940
aggagaaagg cactttcaac tttggctgaa tcgccaattt tagtttccga aaaattgccc 6000
ttcagaaatt atgattatga tcgcgttttt ggagcttgct gtgaaaatgt catcggctat 6060
atgccaatac cagttggtgt aattggtcca ttaattattg atggaacatc ttatcacata 6120
ccaatggcaa ccacggaagg ttgtttagtg gcttcagcta tgcgtggttg caaagccatc 6180
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ggacaaaatt caattaaaaa agcttttaat tctacatcaa ggtttgcacg tttgcaacat 6360
attcaaacct gtctagcagg cgatttgctt tttatgagat ttcggacaac taccggtgac 6420
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gaatatggtt gggaagatat ggaagttgtc tccgtatctg gtaactattg tactgataag 6540
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gctaggcaat tagctagaat aatcgcgtgt gctgtcttgg ctggtgaact gtctctgtgc 7020
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ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 7920
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gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 8040
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gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 8760
atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 8820
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ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtcaggca tttgagaagc acacggtcac 8940
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atcttatttc attatggtga aagttggaac ctcttacgtg ccgatcaacg tctcattttc 9900
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taaaatattt gctcatgagc ccgaagtggc gagcccgatc ttccccatcg gtgatgtcgg 11040
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cgtagaggat ctgctcatgt ttgacagctt atc 11133
<210> 6
<211> 6915
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
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ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
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agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
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ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
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ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
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gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
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ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
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ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
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accaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg aaaatgaaac aaacggttgc 5400
agcttatatc gccaaaacac tcgaatcggc aggggtgaaa cgcatctggg gagtcacagg 5460
cgactctctg aacggtctta gtgacagtct taatcgcatg ggcaccatcg agtggatgtc 5520
cacccgccac gaagaagtgg cggcctttgc cgctggcgct gaagcacaac ttagcggaga 5580
actggcggtc tgcgccggat cgtgcggccc cggcaacctg cacttaatca acgatgaatg 5640
aatttccggt tgttttggtt attaactgtg gttcgtcttc gattaagttt tccgtgctcg 5700
atgccagcga ctgtgaagta ttaatgtcag gtattgccga cggtattaac tcggaaaatg 5760
cattcttatc cgtaaatggg ggagagccag caccgctggc tcaccacagc tacgaaggtg 5820
cattgaaggc aattgcattt gaactggaaa aacggaattt aaatgacagt gtggccttaa 5880
ttggccaccg catcgctcac ggcggcagta tttttaccga gtccgccatt attaccgatg 5940
aagtcattga taatatccgt cgcgtttctc cactggcacc cctgcataat tacgccaatt 6000
taagtggtat tgaatcggcg cagcaattat ttccgggcgt aactcaggtg gcggtatttg 6060
ataccagttt ccaccagacg atggctccgg aagcttattt atacggcctg ccgtggaaat 6120
attatgaaga gttaggtgta cgccgttatg gtttccacgg cacgtcgcac cgctatgttt 6180
cccagcgcgc acattcgctg ctgaatctgg cggaagatga ctccggcctg gttgtggcgc 6240
atcttggcaa tggcgcgtca atctgcgcgg ttcgcaacgg tcagagtgtt gatacctcaa 6300
tgggaatgac gccgctggaa ggcttgatga tgggtacccg cagtggcgat gtcgactttg 6360
gtgcgatgtc ctgggtcgcc agccaaacca accagagcct gggtgacctg gaacgcgtag 6420
tgaataaaga gtcgggatta ttaggtattt ccggtctttc ttcggattta cgtgttctgg 6480
aaaaagcctg gcatgaaggt cacgaacgcg cgcaactggc aattaaaacc tttgttcacc 6540
gaattgcccg tcatattgcc ggacacgcag cttcattacg tcgcctggat ggaattatat 6600
tcaccggcgg aataggagag aattcaagct taattcgtcg tctggtcatg gaacatttgg 6660
ctgtattagg cttagagatt gatacagaaa tgaataatcg ctctaactcc tgtggtgagc 6720
gaattgtttc cagtgaaaat gcgcgtgtca tttgtgccgt tattccgact aacgaagaaa 6780
aaatgattgc tttggatgcc attcatttag gcaaagttaa cgcgcccgca gaatttgcat 6840
aatgccgaag cgtgcggcat tacgggtatc cgtgtagaaa aagcgtctga agttgatgaa 6900
gccctgcaac gcgccttctc catcgacggt ccggtgttgg tggatgtggt ggtcgccaaa 6960
gaagagttag ccattccacc gcagatcaaa ctcgaacagg ccaaaggttt cagcctgtat 7020
atgctgcgcg caatcatcag cggacgcggt gatgaagtga tcgaactggc gaaaacaaac 7080
tggctaaggt aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc 7140
ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg 7200
at 7202
<210> 9
<211> 9028
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaatggttta aacatttatt atgacaactt gacggctaca tcattcactt tttcttcaca 60
accggcacgg aactcgctcg ggctggcccc ggtgcatttt ttaaataccc gcgagaaata 120
gagttgatcg tcaaaaccaa cattgcgacc gacggtggcg ataggcatcc gggtggtgct 180
caaaagcagc ttcgcctggc tgatacgttg gtcctcgcgc cagcttaaga cgctaatccc 240
taactgctgg cggaaaagat gtgacagacg cgacggcgac aagcaaacat gctgtgcgac 300
gctggcgata tcaaaattgc tgtctgccag gtgatcgctg atgtactgac aagcctcgcg 360
tacccgatta tccatcggtg gatggagcga ctcgttaatc gcttccatgc gccgcagtaa 420
caattgctca agcagattta tcgccagcag ctccgaatag cgcccttccc cttgcccggc 480
gttaatgatt tgcccaaaca ggtcgctgaa atgcggctgg tgcgcttcat ccgggcgaaa 540
gaaccccgta ttggcaaata ttgacggcca gttaagccat tcatgccagt aggcgcgcgg 600
acgaaagtaa acccactggt gataccattc gcgagcctcc ggatgacgac cgtagtgatg 660
aatctctcct ggcgggaaca gcaaaatatc acccggtcgg caaacaaatt ctcgtccctg 720
atttttcacc accccctgac cgcgaatggt gagattgaga atataacctt tcattcccag 780
cggtcggtcg ataaaaaaat cgagataacc gttggcctca atcggcgtta aacccgccac 840
cagatgggca ttaaacgagt atcccggcag caggggatca ttttgcgctt cagccatact 900
tttcatactc ccgccattca gagaagaaac caattgtcca tattgcatca gacattgccg 960
tcactgcgtc ttttactggc tcttctcgct aaccaaaccg gtaaccccgc ttattaaaag 1020
cattctgtaa caaagcggga ccaaagccat gacaaaaacg cgtaacaaaa gtgtctataa 1080
tcacggcaga aaagtccaca ttgattattt gcacggcgtc acactttgct atgccatagc 1140
atttttatcc ataagattag cggatcctac ctgacgcttt ttatcgcaac tctctactgt 1200
ttctccatac ccgttttttt gggaattcga gctctaagga ggttataaaa aatggatatt 1260
aatactgaaa ctgagatcaa gcaaaagcat tcactaaccc cctttcctgt tttcctaatc 1320
agcccggcat ttcgcgggcg atattttcac agctatttca ggagttcagc catgaacgct 1380
tattacattc aggatcgtct tgaggctcag agctgggcgc gtcactacca gcagctcgcc 1440
cgtgaagaga aagaggcaga actggcagac gacatggaaa aaggcctgcc ccagcacctg 1500
tttgaatcgc tatgcatcga tcatttgcaa cgccacgggg ccagcaaaaa atccattacc 1560
cgtgcgtttg atgacgatgt tgagtttcag gagcgcatgg cagaacacat ccggtacatg 1620
gttgaaacca ttgctcacca ccaggttgat attgattcag aggtataaaa cgaatgagta 1680
ctgcactcgc aacgctggct gggaagctgg ctgaacgtgt cggcatggat tctgtcgacc 1740
cacaggaact gatcaccact cttcgccaga cggcatttaa aggtgatgcc agcgatgcgc 1800
agttcatcgc attactgatc gttgccaacc agtacggcct taatccgtgg acgaaagaaa 1860
tttacgcctt tcctgataag cagaatggca tcgttccggt ggtgggcgtt gatggctggt 1920
cccgcatcat caatgaaaac cagcagtttg atggcatgga ctttgagcag gacaatgaat 1980
cctgtacatg ccggatttac cgcaaggacc gtaatcatcc gatctgcgtt accgaatgga 2040
tggatgaatg ccgccgcgaa ccattcaaaa ctcgcgaagg cagagaaatc acggggccgt 2100
ggcagtcgca tcccaaacgg atgttacgtc ataaagccat gattcagtgt gcccgtctgg 2160
ccttcggatt tgctggtatc tatgacaagg atgaagccga gcgcattgtc gaaaatactg 2220
catacactgc agaacgtcag ccggaacgcg acatcactcc ggttaacgat gaaaccatgc 2280
aggagattaa cactctgctg atcgccctgg ataaaacatg ggatgacgac ttattgccgc 2340
tctgttccca gatatttcgc cgcgacattc gtgcatcgtc agaactgaca caggccgaag 2400
cagtaaaagc tcttggattc ctgaaacaga aagccgcaga gcagaaggtg gcagcatgac 2460
accggacatt atcctgcagc gtaccgggat cgatgtgaga gctgtcgaac agggggatga 2520
tgcgtggcac aaattacggc tcggcgtcat caccgcttca gaagttcaca acgtgatagc 2580
aaaaccccgc tccggaaaga agtggcctga catgaaaatg tcctacttcc acaccctgct 2640
tgctgaggtt tgcaccggtg tggctccgga agttaacgct aaagcactgg cctggggaaa 2700
acagtacgag aacgacgcca gaaccctgtt tgaattcact tccggcgtga atgttactga 2760
atccccgatc atctatcgcg acgaaagtat gcgtaccgcc tgctctcccg atggtttatg 2820
cagtgacggc aacggccttg aactgaaatg cccgtttacc tcccgggatt tcatgaagtt 2880
ccggctcggt ggtttcgagg ccataaagtc agcttacatg gcccaggtgc agtacagcat 2940
gtgggtgacg cgaaaaaatg cctggtactt tgccaactat gacccgcgta tgaagcgtga 3000
aggcctgcat tatgtcgtga ttgagcggga tgaaaagtac atggcgagtt ttgacgagat 3060
cgtgccggag ttcatcgaaa aaatggacga ggcactggct gaaattggtt ttgtatttgg 3120
ggagcaatgg cgatgacgca tcctcacgat aatatccggg taggcgcaat cactttcgtc 3180
tactccgtta caaagcgagg ctgggtattt cccggccttt ctgttatccg aaatccactg 3240
aaagcacagc ggctggctga ggagataaat aataaacgag gggctgtatg cacaaagcat 3300
cttctgttga gttaagaacg agtatcgaga tggcacatag ccttgctcaa attggaatca 3360
ggtttgtgcc aataccagta gaaacagacg aagaatccat ggggcatggc gaattaatct 3420
ttctgcgaat tgagatgacg ccactggctg ggcgtcatcc cggtttcccg ggtaaacacc 3480
accgaaaaat agttactatc ttcaaagcca cattcggtcg aaatatcact gattaacagg 3540
cggctatgct ggagaagata ttgcgcatga cacactctga cctgtcgcag atattgattg 3600
atggtcattc cagtctgctg gcgaaattgc tgacgcaaaa cgcgctcact gcacgatgcc 3660
tcatcacaaa atttatccag cgcaaaggga cttttcaggc tagccgccag ccgggtaatc 3720
agcttatcca gcaacgtttc gctggatgtt ggcggcaacg aatcactggt gtaacgatgg 3780
cgattcagca acatcaccaa ctgcccgaac agcaactcag ccatttcgtt agcaaacggc 3840
acatgctgac tactttcatg ctcaagctga ccgataacct gccgcgcctg cgccatcccc 3900
atgctaccta agcgccagtg tggttgccct gcgctggcgt taaatcccgg aatcgccccc 3960
tgccagtcaa gattcagctt cagacgctcc gggcaataaa taatattctg caaaaccaga 4020
tcgttaacgg aagcgtagga gtgtttatcg tcagcatgaa tgtaaaagag atcgccacgg 4080
gtaatgcgat aagggcgatc gttgagtaca tgcaggccat taccgcgcca gacaatcacc 4140
agctcacaaa aatcatgtgt atgttcagca aagacatctt gcggataacg gtcagccaca 4200
gcgactgcct gctggtcgct ggcaaaaaaa tcatctttga gaagttttaa ctgatgcgcc 4260
accgtggcta cctcggccag agaacgaagt tgattattcg caatatggcg tacaaatacg 4320
ttgagaagat tcgcgttatt gcagaaagcc atcccgtccc tggcgaatat cacgcggtga 4380
ccagttaaac tctcggcgaa aaagcgtcga aaagtggtta ctgtcgctga atccacagcg 4440
ataggcgatg tcagtaacgc tggcctcgct gtggcgtagc agatgtcggg ctttcatcag 4500
tcgcaggcgg ttcaggtatc gctgaggcgt cagtcccgtt tgctgcttaa gctgccgatg 4560
tagcgtacgc agtgaaagag aaaattgatc cgccacggca tcccaattca cctcatcggc 4620
aaaatggtcc tccagccagg ccagaagcaa gttgagacgt gatgcgctgt tttccaggtt 4680
ctcctgcaaa ctgcttttac gcagcaagag cagtaattgc ataaacaaga tctcgcgact 4740
ggcggtcgag ggtaaatcat tttccccttc ctgctgttcc atctgtgcaa ccagctgtcg 4800
cacctgctgc aatacgctgt ggttaacgcg ccagtgagac ggatactgcc catccagctc 4860
ttgtggcagc aactgattca gcccggcgag aaactgaaat cgatccggcg agcgatacag 4920
cacattggtc agacacagat tatcggtatg ttcatacaga tgccgatcat gatcgcgtac 4980
gaaacagacc gtgccaccgg tgatggtata gggctgccca ttaaacacat gaatacccgt 5040
gccatgttcg acaatcacaa tttcatgaaa atcatgatga tgttcaggaa aatccgcctg 5100
cgggagccgg ggttctatcg ccacggacgc gttaccagac ggaaaaaaat ccacactatg 5160
taatacggtc atactggcct cctgatgtcg tcaacacggc gaaatagtaa tcacgaggtc 5220
aggttcttac cttaaatttt cgacggaaaa ccacgtaaaa aacgtcgatt tttcaagata 5280
cagcgtgaat tttcaggaaa tgcggtgagc atcacatcac cacaattcag caaattgtga 5340
acatcatcac gttcatcttt ccctggttgc caatggccca ttttcctgtc agtaacgaga 5400
aggtcgcgaa ttcaggcgct ttttagactg gtcgtaatga aattcagcag gatcacatat 5460
gcatcaaaaa aaccaggtaa tgaacctggg tccgaactct aaactgctga aagaatacaa 5520
atcccagctg atcgaactga acatcgaaca gttcgaagca ggtatcggtc tgatcctggg 5580
tgatgcttac atccgttctc gtgatgaagg taaaacctac tgtatgcagt tcgagtggaa 5640
aaacaaagca tacatggacc acgtatgtct gctgtacgat cagtgggtac tgtctttcaa 5700
acaccaagct ttcaacaaac tggctaacct gttcatcgtt aacaacaaaa aaaccatccc 5760
gaacaacctg gttgaaaact acctgacccc gatgtctctg gcatactggt tcatggatga 5820
tggtggtaaa tgggattaca acaaaaactc taccaacaaa tcgatcgtac tgaacaccca 5880
gtctttcact ttcgaagaag tagaatacct ggttaagggt ctgcgtaaca aattccaact 5940
gaactgttac gtaaaaatca acaaaaacaa accgatcatc tacatcgatt ctatgtctta 6000
cctgatcttc tacaacctga tcaaaccgta cctgatcccg cagatgatgt acaaactgcc 6060
gaacactatc tcctccgaaa ctttcctgaa ataataacca tgggtatgga cagttttccc 6120
tttgatatgt aacggtgaac agttgttcta cttttgtttg ttagtcttga tgcttcactg 6180
atagatacaa gagccataag aacctcagat ccttccgtat ttagccagta tgttctctag 6240
tgtggttcgt tgtttttgcg tgagccatga gaacgaacca ttgagatcat acttactttg 6300
catgtcactc aaaaattttg cctcaaaact ggtgagctga atttttgcag ttaaagcatc 6360
gtgtagtgtt tttcttagtc cgttacgtag gtaggaatct gatgtaatgg ttgttggtat 6420
tttgtcacca ttcattttta tctggttgtt ctcaagttcg gttacgagat ccatttgtct 6480
atctagttca acttggaaaa tcaacgtatc agtcgggcgg cctcgcttat caaccaccaa 6540
tttcatattg ctgtaagtgt ttaaatcttt acttattggt ttcaaaaccc attggttaag 6600
ccttttaaac tcatggtagt tattttcaag cattaacatg aacttaaatt catcaaggct 6660
aatctctata tttgccttgt gagttttctt ttgtgttagt tcttttaata accactcata 6720
aatcctcata gagtatttgt tttcaaaaga cttaacatgt tccagattat attttatgaa 6780
tttttttaac tggaaaagat aaggcaatat ctcttcacta aaaactaatt ctaatttttc 6840
gcttgagaac ttggcatagt ttgtccactg gaaaatctca aagcctttaa ccaaaggatt 6900
cctgatttcc acagttctcg tcatcagctc tctggttgct ttagctaata caccataagc 6960
attttcccta ctgatgttca tcatctgagc gtattggtta taagtgaacg ataccgtccg 7020
ttctttcctt gtagggtttt caatcgtggg gttgagtagt gccacacagc ataaaattag 7080
cttggtttca tgctccgtta agtcatagcg actaatcgct agttcatttg ctttgaaaac 7140
aactaattca gacatacatc tcaattggtc taggtgattt taatcactat accaattgag 7200
atgggctagt caatgataat tactagtcct tttcctttga gttgtgggta tctgtaaatt 7260
ctgctagacc tttgctggaa aacttgtaaa ttctgctaga ccctctgtaa attccgctag 7320
acctttgtgt gttttttttg tttatattca agtggttata atttatagaa taaagaaaga 7380
ataaaaaaag ataaaaagaa tagatcccag ccctgtgtat aactcactac tttagtcagt 7440
tccgcagtat tacaaaagga tgtcgcaaac gctgtttgct cctctacaaa acagacctta 7500
aaaccctaaa ggcttaagta gcaccctcgc aagctcggtt gcggccgcaa tcgggcaaat 7560
cgctgaatat tccttttgtc tccgaccatc aggcacctga gtcgctgtct ttttcgtgac 7620
attcagttcg ctgcgctcac ggctctggca gtgaatgggg gtaaatggca ctacaggcgc 7680
cttttatgga ttcatgcaag gaaactaccc ataatacaag aaaagcccgt cacgggcttc 7740
tcagggcgtt ttatggcggg tctgctatgt ggtgctatct gactttttgc tgttcagcag 7800
ttcctgccct ctgattttcc agtctgacca cttcggatta tcccgtgaca ggtcattcag 7860
actggctaat gcacccagta aggcagcggt atcatcaacg gggtctgacg ctcagtggaa 7920
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 7980
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 8040
tgacagttac gtttaaacca tttcctgcag gggggggggg aaagccacgt tgtgtctcaa 8100
aatctctgat gttacattgc acaagataaa aatatatcat catgaacaat aaaactgtct 8160
gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc 8220
tcgaggccgc gattaaattc caacatggat gctgatttat atgggtataa atgggctcgc 8280
gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc tatcgattgt atgggaagcc cgatgcgcca 8340
gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc 8400
agactaaact ggctgacgga atttatgcct cttccgacca tcaagcattt tatccgtact 8460
cctgatgatg catggttact caccactgcg atccccggga aaacagcatt ccaggtatta 8520
gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg 8580
ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct 8640
caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt 8700
aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa gaaatgcata agcttttgcc attctcaccg 8760
gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa 8820
ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc 8880
atcctatgga actgcctcgg tgagttttct ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa 8940
tatggtattg ataatcctga tatgaataaa ttgcagtttc atttgatgct cgatgagttt 9000
ttctaatcag aattggttaa ttggttgg 9028

Claims (6)

1.一种工程菌株，其特征在于，该工程菌株是保藏编号为CGMCC NO.14819的大肠杆菌。
2.权利要求1所述的工程菌株在利用纤维素水解产物进行发酵产生金合欢烯中的用途。
3.一种利用纤维素制备金合欢烯的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将含有纤维素的固态原料进行水解处理，得到含有单糖的水解产物；
(2)在包括所述含有单糖的水解产物的液态发酵原料中接种权利要求1所述的工程菌株，并进行发酵培养，得到培养后的物料。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，
将含有纤维素的原料进行水解处理的步骤包括：
S1、将含有纤维素的固态原料先后进行酸预处理和碱预处理，或者先后进行碱预处理和酸预处理；
S2、将所述预处理后的固态物料进行酶促水解；
所述酸预处理为甲酸处理和/或稀硫酸处理；所述甲酸处理的条件包括：温度为40～100℃，时间为1～10小时，相对每千克预处理的固体物料，甲酸溶液的体积为5～50升，所述甲酸溶液含有70～95wt％的甲酸和0～2wt％的HCl；所述稀硫酸处理的条件包括：温度为80～150℃，时间为5分钟～2小时，相对每千克预处理的固体物料，稀硫酸溶液的体积为5～50升，所述稀硫酸溶液含有0.5～10wt％的稀硫酸；
所述碱预处理为氨水处理和/或氢氧化钠处理；所述氨水处理的条件包括：温度为40～80℃，时间为2～24小时，相对每千克预处理的固体物料，氨水的体积为2～20升，所述氨水含有10-25wt％的NH3；所述氢氧化钠处理的条件包括：温度为60～120℃，时间为1～12小时，相对每千克预处理的固体物料，氢氧化钠水溶液的体积为5～50升，所述氢氧化钠水溶液含有0.5～10wt％的氢氧化钠；
所述酶促水解的条件包括：温度30～70℃，时间3～72h，pH为4.0～6.0，每千克预处理后的固态物料，缓冲液的体积为5～100升，酶促水解所用的缓冲液含有0.01～1mol/L柠檬酸缓冲液和/或0.01～1mol/L的乙酸缓冲液，酶促水解所用的酶为纤维素酶和/或β-葡萄糖苷酶，所述纤维素酶加酶量为每克预处理后的固态物料10～500U，所述β-葡萄糖苷酶加酶量为每克预处理后的固态物料10～250U。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，发酵培养的条件包括：温度为16～35℃，时间为3～120h，相对每升所述液态发酵原料，萃取剂的用量为50～1000mL，所述工程菌或工程菌株的接种量为(10～300)×107个；所述的萃取剂选自正己烷、正癸烷、十二烷或煤油；每升所述液态发酵原料中，以单糖的量计算，所述含有单糖的水解产物的含量为0.01～0.9千克。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述含有纤维素的原料包括秸秆、树皮、木屑、玉米芯、米糠和麦麸中的至少一种。
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