CN114292800A - 用于igf-1基因重组表达的重组细胞和重组表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于IGF‑1基因重组表达的重组细胞和重组表达方法，属于基因工程技术领域。所述重组细胞包含SP‑IGF1‑pET‑28b载体和质粒pATX‑4E，所述SP‑IGF1‑pET‑28b载体上包含有一种信号肽的基因，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；所述质粒pATX‑4E上包含有SurA、Trx、DsbA和DsbC的基因。将所述重组细胞进行培养，使用IPTG进行诱导表达，最后收集得到有活性的IGF‑1。通过本发明提供的重组表达IGF‑1基因的方法得到的IGF‑1产量能达到10.56mg/L，与其受体IGF1R的结合效果很好。

Description

用于IGF-1基因重组表达的重组细胞和重组表达方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用于IGF-1基因重组表达的重组细胞和重组表达方法。

背景技术

胰岛素样生长因子(IGF)是一类广谱性促生长因子，其化学结构与胰岛素原类似，为同源的单链多肽，他们分子组成的氨基酸有70％是相同的。IGF在组织或血液中均与胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)相结合，以复合物的形式存在。血清中含有多种IGF，但到目前为止，已提纯的还只有两种，分别命名为IGF-I和IGF-II。这两者占血清中可提取的胰岛素样生长因子总量的90％以上，并且他们在促组织细胞生长发育中起主要作用。机体多种组织器官可以合成分泌IGF-1，但最主要的器官是肝脏，约合成血液中80％的IGF-1。另外，骨组织、其他组织和细胞也能合成少量IGF-1。血液循环中的IGF-1主要由肝脏分泌，但是它的表达却分布在所有组织中，暗示局部IGF-1的自分泌和旁分泌可能是控制组织生长的主要机制。IGF-1与生长发育、心脏生理和病理、糖尿病和骨质疏松密切相关，IGF-1也成了身材矮小的儿童体检时必查的指标。

人的IGF-1是由70个氨基酸组成的多肽链，有6个半胱氨酸(Cys)，形成三对链内二硫键，由于大肠杆菌细胞质是弱还原性，所以很难正确形成二硫键，因些通常采用信号肽将重组蛋白引导到大肠杆菌周质空间表达，然而信号肽引导重组蛋白进入周质空间的能力各有不同，且蛋白进入周质空间后，各种用于二硫键形成的酶含量很有限，所以重组蛋白进入周质空间后仍然难以大量积累，因此同时重组表达氧化还原酶和二硫键异构酶也非常重要。

发明内容

本发明中采用合适的信号肽，帮助四个酶SurA、Trx、DsbA和DsbC共同转化，使得SurA酶能够帮助脯氨酸形成正确构象，Trx、DsbA和DsbC酶能够正确形成二硫键，从而使IGF-1在大肠杆菌细胞周质空间中能大量积累。因此，本发明第一个目的是提供一种用于IGF-1基因重组表达的重组细胞，第二个目的是提供一种利用重组细胞诱导表达IGF-1基因的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于IGF-1基因重组表达的重组细胞，所述重组细胞包含SP-IGF1-pET-28b载体和质粒pATX-4E，所述SP-IGF1-pET-28b载体上包含有一种信号肽的基因，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述质粒pATX-4E上包含有SurA、Trx、DsbA和DsbC的基因。

优选的，所述SP-IGF1-pET-28b载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步优选的，所述SP-IGF1-pET-28b载体的构建方法包括以下步骤：

A1、合成PCR扩增模板

将无信号肽基因的IGF-1基因插入到pET-21a载体的NdeI/XhoI酶切位点之间，得到序列号如SEQ ID No.3所示的质粒IGF1-pET-21a作为PCR扩增模板；

A2、构建载体

用第一对引物扩增步骤A1中所述PCR扩增模板得到扩增产物P1；以P1为模板，用第二对引物对P1进行扩增得到扩增产物P2；以P2为模板，用第三对引物对P2进行扩增得到扩增产物P3；对P3进行无缝克隆，再插入到pET-28b载体的NcoI/XhoI酶切位点之间，得到所述SP-IGF1-pET-28b载体。

优选的，所述质粒pATX-4E的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步优选的，所述质粒pATX-4E的构建方法包括如下步骤：

B1、构建过渡质粒骨架pACYC

用第四对引物扩增pACYCDuet-1质粒得到扩增产物Q1，对Q1进行无缝克隆得到核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的过渡质粒骨架pACYC；

B2、构建质粒pATX-1E

用第五对引物扩增DsbA的基因及启动子，对得到的扩增产物Q2进行无缝克隆，再插入到所述过渡质粒骨架pACYC的XhoI/HindIII酶切位点之间，得到核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示的质粒pATX-1E；

B3、构建质粒pATX-2E

用第六对引物扩增包含有AmpR-pelB-Trx-Myc基因的第一pUC57质粒，对得到的产物Q3进行无缝克隆，插入到所述质粒pATX-1E的KpnI/EcoRI酶切位点之间，得到核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的质粒pATX-2E；

B4、构建质粒pATX-3E

用第七对引物扩增带Myc标签的SurA基因，得到扩增产物Q4；用第八对引物扩增Q4，得到扩增产物Q5；对Q5进行无缝克隆，插入到所述质粒pATX-2E的EcoRI酶切位点处，得到核苷酸序列号如SEQ ID No.8所示的质粒pATX-3E；

B5、构建质粒pATX-4E

用第九对引物扩增包含有Myc-DsbC-Myc-terminator基因的第二pUC57质粒，得到扩增产物Q6，对Q6进行无缝克隆，插入到所述质粒pATX-3E的HindIII酶切位点处，得到所述质粒pATX-4E。

本发明提供的重组表达IGF-1基因的方法包括以下步骤：

C1、培养上述任一项所述的重组细胞；

C2、用IPTG作为诱导剂进行诱导表达；

C3、收集目标蛋白IGF-1。

优选的，步骤C1包括以下步骤：

C1-1、对超净工作台灭菌；

C1-2、将大肠杆菌感受态细胞BL21在冰上解冻；

C1-3、在超净工作台中，向大肠杆菌感受态细胞BL21中加入质粒pATX-4E和SP-IGF1-pET-28b载体各1μL，轻轻混匀，置于冰上静置30min；在42℃水浴热激90s，再置于冰上静置3min，得到重组细胞；

C1-4、在超净工作台中，将步骤C1-3中的重组细胞接种至400μL LB培养基中，于37℃下孵育45min；

C1-5、将复苏后的菌液均匀涂布在含有37μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基的培养皿上，37℃培养过夜。

优选的，步骤C2包括以下步骤：

C2-1、从步骤C1中培养好的重组细胞中挑选单菌落置于10mL含有37μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养；

C2-2、将步骤C2-1中的培养基转接到1L含有37μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中放大培养3小时，待培养基OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG，在16℃下过夜诱导表达；所述IPTG添加的量使IPTG在所述LB液体培养基中的终浓度为1.0×10^-4mol/L。

优选的，步骤C3包括以下步骤：

C3-1、将步骤C2中诱导表达后的包含重组细胞的培养基在9000g离心力下离心10min，收集表达菌体，用pH＝7.4的PBS缓冲液重悬菌体，采用超声波细胞裂解，在4℃、17000g离心力下离心1h，收集离心后的上清液；

C3-2、向步骤C3-1中的上清液中加入1mL预先用pH＝7.4的PBS缓冲液平衡好的Ni-NTA填料，孵育1小时；

C3-3、将步骤C3-2中孵育后的悬浮液加入重力柱中，纯化，待液体滴完后，用50mLpH＝7.4的PBS缓冲液淋洗Ni-NTA填料，再用50mL pH＝7.4的含20mmol/L咪唑的PBS缓冲液淋洗Ni-NTA填料，最后用pH＝7.4的含250mmol/L咪唑的PBS缓冲液洗脱得到15mL目标蛋白粗品；

C3-4、将步骤C3-3中的目标蛋白粗品置于pH＝7.4的PBS缓冲液中透析过夜，第二天再换新鲜的pH＝7.4的PBS缓冲液透析6h，即得到有活性的IGF-1。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

(1)本发明中采用合适的信号肽，帮助四个酶SurA、Trx、DsbA和DsbC共同转化，使得SurA酶能够帮助脯氨酸形成正确构象，Trx、DsbA和DsbC酶能够正确形成二硫键，从而使IGF-1在大肠杆菌细胞周质空间中能大量积累，产量能达到10.56mg/L；

(2)通过本发明的方法重组表达得到的IGF-1的活性很好，与其受体IGF1R的结合效果很好。

附图说明

图1为IGF-1基因既不带信号肽也不与质粒pATX-4E共表达的SDS-PAGE电泳图；

图2为IGF-1基因带信号肽但是不与质粒pATX-4E共表达的SDS-PAGE电泳图；

图3为IGF-1基因不带信号肽但是与质粒pATX-4E共表达的SDS-PAGE电泳图；

图4为本发明实施例中重组表达得到的IGF-1的SDS-PAGE电泳图；

图5为按照本发明中提供的重组表达方法得到的IGF-1的活性测定结果图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。本领域技术人员依据以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。

以下实施例中所使用的试剂盒和主要试剂来源如下：

pACYCDuet-1质粒：采购自EMD Biosciences(Novagen)；

无缝克隆试剂盒：普健生物(武汉)科技有限公司，货号为ATO00037；

PrimeSTAR MAX Premix(2×)：购买自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为R045；

2x Master Mix：普健生物(武汉)科技有限公司；

包含有AmpR-pelB-Trx-Myc基因的第一pUC57质粒：由通用生物(安徽)股份有限公司合成；

包含有Myc-DsbC-Myc-terminator基因的第二pUC57质粒：由通用生物(安徽)股份有限公司合成；

pET-21a载体：由通用生物(安徽)股份有限公司提供；

无信号肽基因的IGF1基因：由通用生物(安徽)股份有限公司合成；

大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)：购买自武汉淼灵生物科技有限公司，货号为T0041；

IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)：购买自阿拉丁，货号为I104812-100g；

Ni-NTA填料：购买自嘉兴千纯生物科技有限公司，货号为A41002-07；

实施例中所有PCR反应体系均如下：

10μmol/L正向引物：1μL；

10μmol/L反向引物：1μL；

模板：1μL；

PrimeSTAR MAX Premix(2×)：25μL；

ddH₂O：补至总体积为50μL。

PCR扩增的条件均按如下程序进行：

实施例

1、构建SP-IGF1-pET-28b载体

A1、合成PCR扩增模板

将无信号肽基因的IGF1基因插入到pET-21a载体的NdeI/XhoI酶切位点之间，得到序列号如SEQ ID No.3所示的质粒IGF1-pET-21a作为PCR扩增模板；

A2、通过PCR扩增程序合成包含信号肽和IGF1基因的载体

设计四条引物分别为IGF1-F1、IGF1-F2、IGF1-F3和pET28b-R，以质粒IGF1-pET-21a为模板，以IGF1-F1为正向引物，pET28b-R为反向引物，进行第一次PCR扩增，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离第一次扩增产物，再用DNA试剂回收盒回收纯化得297bp的第一次PCR扩增产物P1；以P1为模板，以IGF1-F2为正向引物，pET28b-R为反向引物，进行第二次PCR扩增，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离第二次扩增产物，再用DNA试剂回收盒回收纯化得到321bp的第二次PCR扩增产物P2；以P2为模板，以IGF1-F3为正向引物，pET28b-R为反向引物，进行第三次PCR扩增，用1.2％琼脂糖凝胶电泳分离第三次扩增产物，再用DNA试剂回收盒回收纯化得到346bp的第三次PCR扩增产物P3；P3用无缝克隆试剂盒(货号：ATO00037)进行无缝克隆，插入到pET-28b载体的NcoI/XhoI酶切位点之间，得到序列号如SEQ ID No.2所示的SP-IGF1-pET-28b载体，该载体上包含有信号肽基因和IGF1基因；

其中，正向引物IGF1-F1的核苷酸序列(SEQ ID No.9)如下：

IGF1-F1：gctctggctgctctgctgttcgctgctcaggcttctgctggtcctgaaaccctgtgtgg；

正向引物IGF1-F2的核苷酸序列(SEQ ID No.10)如下：

IGF1-F2：atgcgtttcaacaacaaaatgctggctctggctgctctgctgttcgct；

正向引物IGF1-F3的核苷酸序列(SEQ ID No.11)如下：

IGF1-F3：tttaactttaagaaggagatataccatgcgtttcaacaacaaaatgctgg；

反向引物pET28b-R的核苷酸序列(SEQ ID No.12)如下：

pET28b-R：ggctttgttagcagccggatc；

信号肽从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)核酸酶信号肽中筛选得到，其基酸序列如SEQ ID No.1所示；

无缝克隆体系如下：

第三次PCR扩增产物P3：3μL；

pET-28b载体：1μL；

2x Master Mix：4μL。

2、构建质粒pATX-4E

B1、构建过渡质粒骨架pACYC

以pACYC-F为正向引物，以pACYC-R为反向引物，以pACYCDuet-1质粒为模板进行PCR扩增；用1.0％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离，用DNA试剂回收盒回收纯化得2138bp的PCR扩增的产物Q1，然后用无缝克隆试剂盒(货号：ATO00037)做无缝克隆，使质粒环化，得到一个序列号如SEQ ID No.5所示的过渡质粒骨架pACYC；

其中，正向引物pACYC-F的核苷酸序列(SEQ ID No.13)如下：

pACYC-F：ggtaccgacgactcgactcgagaagcttaataactgccttaaaaaaattacgccccg；

反向引物pACYC-R的核苷酸序列(SEQ ID No.14)如下：

pACYC-R：aagcttctcgagtcgagtcgtcggtaccgaattcgcgcaacgcaattaatgtaagttag；

无缝克隆体系如下：

PCR扩增产物Q1：4μL；

2x Master Mix：4μL。

B2、构建质粒pATX-1E

以二硫键异构酶DsbA的基因及启动子为模板，以DsbA-F为正向引物，以DsbA-R为反向引物，进行PCR扩增；用1.2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离，用DNA试剂回收盒回收纯化得910bp的PCR扩增的产物Q2，然后用无缝克隆试剂盒(货号：ATO00037)做无缝克隆，插入到过渡质粒骨架pACYC的XhoI/HindIII酶切位点之间，得到序列号如SEQ ID No.6所示的质粒pATX-1E；

其中，正向引物DsbA-F的核苷酸序列(SEQ ID No.15)如下：

DsbA-F：gaattcggtaccgacgactcgactcgagttcgacaccgctgaaatcggac；

反向引物DsbA-R的核苷酸序列(SEQ ID No.16)如下：

DsbA-R：atttttttaaggcagttattaagcttttttttctcgcttaagtatttcactgtatcagc；

无缝克隆体系如下：

PCR扩增产物Q2：3μL；

过渡质粒骨架pACYC：1μL；

2x Master Mix：4μL；

DsbA的基因及启动子的序列如SEQ ID No.17所示。

B3、构建质粒pATX-2E

以包含有AmpR-pelB-Trx-Myc基因的第一pUC57质粒为扩增模板，以Trx-F为正向引物，以Trx-R为反向引物，进行PCR扩增；用1.2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离，用DNA试剂回收盒回收纯化得613bp的PCR扩增的产物Q3，然后用无缝克隆试剂盒(货号：ATO00037)做无缝克隆，插入到质粒pATX-1E的KpnI/EcoRI酶切位点之间，得到序列号如SEQID No.7所示的质粒pATX-2E；

其中，正向引物Trx-F的核苷酸序列(SEQ ID No.18)如下：

Trx-F：cttacattaattgcgttgcgcgaattcttacagatcctcttcagagatga；

反向引物Trx-R的核苷酸序列(SEQ ID No.19)如下：

Trx-R：tgtcgaactcgagtcgagtcgtcggtacctatagtgagtcgtattaatttc；

无缝克隆体系如下：

PCR扩增产物Q3：3μL；

质粒pATX-1E：1μL；

2x Master Mix：4μL；

AmpR-pelB-Trx-Myc基因的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示。

B4、构建质粒pATX-3E

设计三条引物分别为SurA-F、SurA-F1、SurA-R，以大肠杆菌基因组为模板，以SurA-F1为正向引物，SurA-R为反向引物，进行第一次PCR扩增，用1.2％琼脂糖凝胶电泳对第一次扩增产物进行分离，用DNA试剂回收盒回收纯化得1339bp的第一次PCR扩增产物Q4；以Q4为模板，以SurA-F为正向引物，以SurA-R为反向引物，进行第二次PCR扩增，用1.2％琼脂糖凝胶电泳对第二次扩增产物进行分离，用DNA试剂回收盒回收纯化得1367bp的第二次PCR扩增产物Q5；用无缝克隆试剂盒(货号：ATO00037)对回收纯化的第二次PCR扩增产物Q5进行无缝克隆，插入到质粒pATX-2E的EcoRI酶切位点处，得到序列号如SEQ ID No.8所示的质粒pATX-3E；

其中，正向引物SurA-F1的核苷酸序列(SEQ ID No.21)如下：

SurA-F1：ttacaggtcttcttcagagatcagtttctgttcgttgctcaggattttaacgtaggcgc；

正向引物SurA-F的核苷酸序列(SEQ ID No.22)如下：

SurA-F：acttacattaattgcgttgcgcgaattcttacaggtcttcttcagagatcagtttctgt；

反向引物SurA-R的核苷酸序列(SEQ ID No.23)如下：

SurA-R：catctctgaagaggatctgtaaatgaagaactggaaaacgctgcttct；

无缝克隆体系如下：

第二次PCR扩增产物Q5：3μL；

质粒pATX-2E：1μL；

2x Master Mix：4μL。

B5、构建质粒pATX-4E

以包含有Myc-DsbC-Myc-terminator基因的第二pUC57质粒为扩增模板，以DsbC-F为正向引物，以DsbC-R为反向引物进行PCR扩增，用1.2％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离，用DNA试剂回收盒回收纯化得到928bp的PCR扩增产物Q6；Q6用无缝克隆试剂盒(货号：ATO00037)进行无缝克隆，再插入到质粒pATX-3E的HindIII酶切位点处，得到序列号如SEQID No.4所示的质粒pATX-4E；

其中，正向引物DsbC-F的核苷酸序列(SEQ ID No.24)如下：

DsbC-F：acagtgaaatacttaagcgagaaaaaagagcagaaactcatctctgaagaggatc；

反向引物DsbC-R的核苷酸序列(SEQ ID No.25)如下：

DsbC-R：cgtaatttttttaaggcagttattaagcttcaaaaaacccctcaagacccgtttag；

包含有Myc-DsbC-Myc-terminator基因的第二pUC57质粒的核苷酸序列如SEQ IDNo.26所示；

无缝克隆体系如下：

PCR扩增产物Q6：3μL；

质粒pATX-3E：1μL；

2x Master Mix：4μL。

3、IGF-1基因重组表达

C1、将构建好的质粒pATX-4E和SP-IGF1-pET-28b载体共转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，转化方法如下：

C1-1、超净工作台用75％消毒酒精擦拭，打开紫外灯灭菌30min；

C1-2、从超低温冰箱中取出一支大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)(50μL/支)，在冰上解冻；

C1-3、在超净工作台中，向大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中加入质粒pATX-4E和SP-IGF1-pET-28b载体各1μL，轻轻混匀，置于冰上静置30min；在42℃水浴热激90s，再置于冰上静置3min，得到重组细胞；

C1-4、在超净工作台中，将步骤C1-3中的重组细胞接种至400μL LB培养基中，于37℃下孵育45min；

C1-5、将复苏后的菌液均匀涂布在含有37μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基的培养皿上，37℃培养过夜；

C2、诱导表达

C2-1、从步骤C1-5中的培养皿上挑选单菌落置于10mL含有37μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养；

C2-2、将步骤C2-1中的培养基转接到1L含有37μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中放大培养3小时，待培养基OD₆₀₀＝0.6时，加入100μL浓度为1mol/L的IPTG，16℃下过夜诱导表达；

C3、收集目标蛋白IGF-1

C3-1、将步骤C2-2中诱导表达后的培养基在9000g离心力下离心10min，收集表达菌体，用pH＝7.4的PBS缓冲液重悬菌体，采用超声波细胞裂解，在4℃、17000g离心力下离心1h，收集离心后的上清液；

C3-2、向步骤C3-1中的上清液中加入1mL预先用pH＝7.4的PBS缓冲液平衡好的Ni-NTA填料，孵育1小时；

C3-3、将步骤C3-2中孵育后的悬浮液加入重力柱中，纯化，待液体滴完后，用50mLpH＝7.4的PBS缓冲液淋洗Ni-NTA填料，再用50mL含20mmol/L咪唑的PBS缓冲液(pH＝7.4)淋洗Ni-NTA填料，最后用含250mmol/L咪唑的PBS缓冲液(pH＝7.4)洗脱得到15mL目标蛋白粗品；

C3-4、将步骤C3-3中的目标蛋白粗品置于pH＝7.4的PBS缓冲液中透析过夜，第二天再换新鲜的pH＝7.4的PBS缓冲液透析6小时，即得到10.56mg有活性的IGF-1。

4、IGF-1重组表达效果验证

(1)将既不含信号肽基因也不含质粒pATX-4E基因的IGF-1基因按照常规方法进行诱导表达，用含5wt％浓缩胶和16.5wt％的分离胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目标蛋白表达情况，得到的结果如图1所示，从图1中可以看出，在IGF-1基因不含有信号肽基因和pATX-4E基因的情况下，IGF-1全部表达在包含体中，上清中没有目标蛋白。

(2)将信号肽基因重组到IGF-1基因中，按照常规方法进行诱导表达，用含5wt％浓缩胶和16.5wt％的分离胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目标蛋白表达情况，得到的结构如图2所示，从图2中可以看出，在IGF-1基因中含有信号肽基因但是不含pATX-4E基因的情况下，上清和包含体中都检测不到目标蛋白。

(3)将质粒pATX-4E基因重组到IGF-1基因中，按照常规方法进行诱导表达，用含5wt％浓缩胶和16.5wt％的分离胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目标蛋白表达情况，得到的结构如图3所示，从图3中可以看出，在IGF-1基因中不含信号肽基因但是含有pATX-4E基因的情况下，IGF-1全部表达在包含体中，上清中没有目标蛋白。

(4)将按照实施例中的重组表达方法得到的IGF-1用含5wt％浓缩胶和16.5wt％的分离胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目标蛋白表达情况，得到的结果如图4所示，从图4中可以看出，上清和包含体中都有目标蛋白。

图1～图4中的Native为IGF-1诱导表达后细胞裂解液离心后的上清，Denatured为离心后的沉淀部分，待测样品用8mmo/L尿素溶解；图1～图4中16、30和37分别表示加入IPTG后在温度为16℃、30℃和37℃下进行诱导的平行实验；从图1～图4还可以看出，温度对上述四种表达情况中的任何一种都没有明显影响。

5、IGF-1活性测定

将本发明中进行重组表达得到的IGF-1和对照组的既不带信号肽基因也不带质粒pATX-4E基因表达得到的IGF-1分别以5μg/mL的浓度包被在酶标板上，用标记有生物素的IFG1R(由普健生物(武汉)科技有限公司生产)按10000ng/mL，2000ng/mL，400ng/mL，80ng/mL，16ng/mL，3.2ng/mL，0.64ng/mL，0ng/mL的浓度梯度稀释做ELISA，用标记有辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素检测，得到IGF1R与不同表达方法得到的IGF-1的结合活性，检测结果如图5所示。从图5中可以看出，使用本发明中进行重组表达得到的IGF-1与IGF1R结合的EC50＝74.84ng/mL，远低于对照组，这说明本发明中对IGF-1基因进行重组表达得到的IGF-1与IGF1R的结合效果很好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 普健生物（武汉）科技有限公司

<120> 用于IGF-1基因重组表达的重组细胞和重组表达方法

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Phe Asn Asn Lys Met Leu Ala Leu Ala Ala Leu Leu Phe Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ala Ser Ala

20

<210> 2

<211> 5506

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

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tgcaccggtg cgtcagcaga atatgtgata caggatatat tccgcttcct cgctcactga 2940

ctcgctacgc tcggtcgttc gactgcggcg agcggaaatg gcttacgaac ggggcggaga 3000

tttcctggaa gatgccagga agatacttaa cagggaagtg agagggccgc ggcaaagccg 3060

tttttccata ggctccgccc ccctgacaag catcacgaaa tctgacgctc aaatcagtgg 3120

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc ccctggcggc tccctcgtgc 3180

gctctcctgt tcctgccttt cggtttaccg gtgtcattcc gctgttatgg ccgcgtttgt 3240

ctcattccac gcctgacact cagttccggg taggcagttc gctccaagct ggactgtatg 3300

cacgaacccc ccgttcagtc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 3360

aacccggaaa gacatgcaaa agcaccactg gcagcagcca ctggtaattg atttagagga 3420

gttagtcttg aagtcatgcg ccggttaagg ctaaactgaa aggacaagtt ttggtgactg 3480

cgctcctcca agccagttac ctcggttcaa agagttggta gctcagagaa ccttcgaaaa 3540

accgccctgc aaggcggttt tttcgttttc agagcaagag attacgcgca gaccaaaacg 3600

atctcaagaa gatcatctta ttaatcagat aaaatatttc tagatttcag tgcaatttat 3660

ctcttcaaat gtagcacctg aagtcagccc catacgatat aagttgtaat tctcatgtta 3720

gtcatgcccc gcgcccaccg gaaggagctg actgggttga aggctctcaa gggcatcggt 3780

cgagatcccg gtgcctaatg agtgagctaa cttacattaa ttgcgttgcg cgaattctta 3840

caggtcttct tcagagatca gtttctgttc gttgctcagg attttaacgt aggcgctggc 3900

acgttgttcc tgcatccagc ttgctgcttc ttccgagaac ttacggttca tcagcatgcg 3960

gtatgcacga tctttctgcg cagcgtcggt tttatcgaca tttcgggtat ccagcagttc 4020

gattaaatgc cagccgaatg aagagtgaac cggtgcactc atttgacctt tgttcaggcg 4080

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gccctggtta gcagagcctg gatcctgaga gaactctttc gctgcggcag caaaagtcgt 4200

tttaccactc ttgatatcag cagcaatctg ttccagtttc acacgggcct gttcgtcagt 4260

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tttgctttcg ccgcgcaggt cgttaacttt cagaatatgg aagccaacgc cggaacgaat 4380

cgggccaaca atgtcgcctt tcttcgcggt gcttaatgcc tgggcgaaga tcccgggcaa 4440

ctcctgaata cggccccagc ccatctggcc gccgttcagc gcctgctggt cggcagaatg 4500

agcaatcgcc agcttaccga aatcagcgcc gttacgcgcc tgatcgacaa tggcgcgcgc 4560

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gtggctcagg ttcagctcag tgctggcgtc gttttggtta cccacctgct gcgccaggga 4680

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gataatcatc tctttgcgga tctggttacg ataggtgttg tagttcagtc catcgtaagc 4800

cagacggctg cgcatctgat ccagcgtcat gttgttctgt ttcgcgatgt tagcaatcgc 4860

ctgatccagc tgctcatcgg agattttcac tcccattttc tgccccatct gcaggatgat 4920

ttgatccatg atcaaacgtt ccatgatttg gtggcgcagc gtcgcgtcat caggaagttg 4980

ctgccttgcc tgagcagcgt tcagttttac cgactgcatt aatccatcaa cgtcgctttc 5040

cagcacgacg ccgttattga cgacggctgc gactttatcg actacctggg gggcagcgaa 5100

actggtattc gcgatcatgg cgataccgag aagcagcgtt ttccagttct tcatttacag 5160

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acctttagac agtgcaccca ctttggttgc cgccacttca ccgtttttga acagcagcag 5280

agtcgggata ccacggatgc catatttcgg cgcagtgcca gggttttgat cgatgttcag 5340

ttttgcaacg gtcagtttgc cctgatattc gtcagcgatt tcatccagaa tcggggcgat 5400

cattttgcac ggaccgcacc actctgccca gaaatcgacg aggatcgccc cgtccgcttt 5460

gagtacatcc gtgtcaaaac tgtcgtcagt caggtgaata attttatcgc tggccatcgc 5520

cggctgggca gcgaggagca gcagaccagc agcagcggtc ggcagcaggt atttcatact 5580

cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 5640

atttgaatgc gggatctcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aaattaatac 5700

gactcactat a 5711

<210> 5

<211> 2110

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtaccgacg actcgactcg agaagcttaa taactgcctt aaaaaaatta cgccccgccc 60

tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca 120

cagacggcat gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa 180

tatttgccca tagtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca 240

aaactggtga aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct 300

ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga 360

aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca 420

tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt 480

gccatacgga actccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga 540

taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg 600

gtctggttat aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc 660

cattgggata tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta 720

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tgtatactgg cttactatgt tggcactgat gagggtgtca gtgaagtgct tcatgtggca 1140

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ctcaaatcag tggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttcccctggc 1440

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<210> 6

<211> 2966

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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cgtataatat ttgcccatag tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt 1140

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ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg aacactatcc catatcacca gctcaccgtc 1380

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ggccggataa aacttgtgct tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag 1500

ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt 1560

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<210> 7

<211> 3523

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccggtgcct aatgagtgag ctaacttaca ttaattgcgt tgcgcgaatt cttacagatc 60

ctcttcagag atgagtttct gctcggccag gttagcgtcg aggaactctt tcaactgacc 120

tttagacagt gcacccactt tggttgccgc cacttcaccg tttttgaaca gcagcagagt 180

cgggatacca cggatgccat atttcggcgc agtgccaggg ttttgatcga tgttcagttt 240

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tacatccgtg tcaaaactgt cgtcagtcag gtgaataatt ttatcgctgg ccatcgccgg 420

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tgaatgcggg atctcgacgc tctcccttat gcgactcctg cattaggaaa ttaatacgac 600

tcactatagg taccgacgac tcgactcgag ttcgacaccg ctgaaatcgg actgattgaa 660

cctttacgcg ccatgcgttt ggtttattat cttgcctggc taatgcggcg ttgggctgat 720

cccgcgttcc cgaaaaattt cccgtggtta accggggaag attactggct acgacagacg 780

gcgactttta tagaacaggc aaaagttcta caagaacccc ctttgcaatt aacacctatg 840

tattaatcgg agagagtaga tcatgaaaaa gatttggctg gcgctggctg gtttagtttt 900

agcgtttagc gcatcggcgg cgcagtatga agatggtaaa cagtacacta ccctggaaaa 960

accggtagct ggcgcgccgc aagtgctgga gtttttctct ttcttctgcc cgcactgcta 1020

tcagtttgaa gaagttctgc atatttctga taatgtgaag aaaaaactgc cggaaggcgt 1080

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aggcgtacag aaaacccaga ccattcgttc tgcttctgat atccgcgatg tatttatcaa 1260

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ggtcgctcag caggaaaaag ctgcagctga cgtgcaattg cgtggcgttc cggcgatgtt 1380

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gcctcaaaat gttctttacg atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt 2160

tttttctcca ttttagcttc cttagctcct gaaaatctcg ataactcaaa aaatacgccc 2220

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cattttcgcc aaaagttggc ccagggcttc ccggtatcaa cagggacacc aggatttatt 2340

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gctgccaact tactgattta gtgtatgatg gtgtttttga ggtgctccag tggcttctgt 2460

ttctatcagc tgtccctcct gttcagctac tgacggggtg gtgcgtaacg gcaaaagcac 2520

cgccggacat cagcgctagc ggagtgtata ctggcttact atgttggcac tgatgagggt 2580

gtcagtgaag tgcttcatgt ggcaggagaa aaaaggctgc accggtgcgt cagcagaata 2640

tgtgatacag gatatattcc gcttcctcgc tcactgactc gctacgctcg gtcgttcgac 2700

tgcggcgagc ggaaatggct tacgaacggg gcggagattt cctggaagat gccaggaaga 2760

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tttaccggtg tcattccgct gttatggccg cgtttgtctc attccacgcc tgacactcag 3000

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<210> 8

<211> 4840

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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attctcaata aaccctttag ggaaataggc caggttttca ccgtaacacg ccacatcttg 1200

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gtgaataaag gccggataaa acttgtgctt atttttcttt acggtcttta aaaaggccgt 1440

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aggcgtttcc cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc ggtttaccgg 2340

tgtcattccg ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc agttccgggt 2400

aggcagttcg ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc gaccgctgcg 2460

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa gcaccactgg 2520

cagcagccac tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc cggttaaggc 2580

taaactgaaa ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc tcggttcaaa 2640

gagttggtag ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt ttcgttttca 2700

gagcaagaga ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat taatcagata 2760

aaatatttct agatttcagt gcaatttatc tcttcaaatg tagcacctga agtcagcccc 2820

atacgatata agttgtaatt ctcatgttag tcatgccccg cgcccaccgg aaggagctga 2880

ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg tgcctaatga gtgagctaac 2940

ttacattaat tgcgttgcgc gaattcttac aggtcttctt cagagatcag tttctgttcg 3000

ttgctcagga ttttaacgta ggcgctggca cgttgttcct gcatccagct tgctgcttct 3060

tccgagaact tacggttcat cagcatgcgg tatgcacgat ctttctgcgc agcgtcggtt 3120

ttatcgacat ttcgggtatc cagcagttcg attaaatgcc agccgaatga agagtgaacc 3180

ggtgcactca tttgaccttt gttcaggcgg gtcagggcgt cacggaaagc cggatcgaaa 3240

atatctggtg tagcccagcc gagatcgccg ccctggttag cagagcctgg atcctgagag 3300

aactctttcg ctgcggcagc aaaagtcgtt ttaccactct tgatatcagc agcaatctgt 3360

tccagtttca cacgggcctg ttcgtcagtc atgatcggcg acggtttcag cagaatatgg 3420

cgagcatgaa cttcggtcac cgagatattt ttgctttcgc cgcgcaggtc gttaactttc 3480

agaatatgga agccaacgcc ggaacgaatc gggccaacaa tgtcgccttt cttcgcggtg 3540

cttaatgcct gggcgaagat cccgggcaac tcctgaatac ggccccagcc catctggccg 3600

ccgttcagcg cctgctggtc ggcagaatga gcaatcgcca gcttaccgaa atcagcgccg 3660

ttacgcgcct gatcgacaat ggcgcgcgcc tggctttccg cttcgttcac ctgatcagag 3720

gtcgggtttt ccggcagcgg gatcaggatg tggctcaggt tcagctcagt gctggcgtcg 3780

ttttggttac ccacctgctg cgccagggat tcgacttcct gcggcaggat ggtgatgcga 3840

cgacgcacct cgttgttacg cacttcagag ataatcatct ctttgcggat ctggttacga 3900

taggtgttgt agttcagtcc atcgtaagcc agacggctgc gcatctgatc cagcgtcatg 3960

ttgttctgtt tcgcgatgtt agcaatcgcc tgatccagct gctcatcgga gattttcact 4020

cccattttct gccccatctg caggatgatt tgatccatga tcaaacgttc catgatttgg 4080

tggcgcagcg tcgcgtcatc aggaagttgc tgccttgcct gagcagcgtt cagttttacc 4140

gactgcatta atccatcaac gtcgctttcc agcacgacgc cgttattgac gacggctgcg 4200

actttatcga ctacctgggg ggcagcgaaa ctggtattcg cgatcatggc gataccgaga 4260

agcagcgttt tccagttctt catttacaga tcctcttcag agatgagttt ctgctcggcc 4320

aggttagcgt cgaggaactc tttcaactga cctttagaca gtgcacccac tttggttgcc 4380

gccacttcac cgtttttgaa cagcagcaga gtcgggatac cacggatgcc atatttcggc 4440

gcagtgccag ggttttgatc gatgttcagt tttgcaacgg tcagtttgcc ctgatattcg 4500

tcagcgattt catccagaat cggggcgatc attttgcacg gaccgcacca ctctgcccag 4560

aaatcgacga ggatcgcccc gtccgctttg agtacatccg tgtcaaaact gtcgtcagtc 4620

aggtgaataa ttttatcgct ggccatcgcc ggctgggcag cgaggagcag cagaccagca 4680

gcagcggtcg gcagcaggta tttcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 4740

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgcg ggatctcgac gctctccctt 4800

atgcgactcc tgcattagga aattaatacg actcactata 4840

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctctggctg ctctgctgtt cgctgctcag gcttctgctg gtcctgaaac cctgtgtgg 59

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgcgtttca acaacaaaat gctggctctg gctgctctgc tgttcgct 48

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttaacttta agaaggagat ataccatgcg tttcaacaac aaaatgctgg 50

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggctttgtta gcagccggat c 21

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtaccgacg actcgactcg agaagcttaa taactgcctt aaaaaaatta cgccccg 57

<210> 14

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aagcttctcg agtcgagtcg tcggtaccga attcgcgcaa cgcaattaat gtaagttag 59

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaattcggta ccgacgactc gactcgagtt cgacaccgct gaaatcggac 50

<210> 16

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atttttttaa ggcagttatt aagctttttt ttctcgctta agtatttcac tgtatcagc 59

<210> 17

<211> 856

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttcgacaccg ctgaaatcgg actgattgaa cctttacgcg ccatgcgttt ggtttattat 60

cttgcctggc taatgcggcg ttgggctgat cccgcgttcc cgaaaaattt cccgtggtta 120

accggggaag attactggct acgacagacg gcgactttta tagaacaggc aaaagttcta 180

caagaacccc ctttgcaatt aacacctatg tattaatcgg agagagtaga tcatgaaaaa 240

gatttggctg gcgctggctg gtttagtttt agcgtttagc gcatcggcgg cgcagtatga 300

agatggtaaa cagtacacta ccctggaaaa accggtagct ggcgcgccgc aagtgctgga 360

gtttttctct ttcttctgcc cgcactgcta tcagtttgaa gaagttctgc atatttctga 420

taatgtgaag aaaaaactgc cggaaggcgt gaagatgact aaataccacg tcaacttcat 480

gggtggtgac ctgggcaaag atctgactca ggcatgggct gtggcgatgg cgctgggcgt 540

ggaagacaaa gtcactgttc cgctgtttga aggcgtacag aaaacccaga ccattcgttc 600

agcatctgat atccgcgatg tatttatcaa cgcaggtatt aaaggtgaag agtacgacgc 660

ggcgtggaac agcttcgtgg tcaaatctct ggtcgctcag caggaaaaag ctgcagctga 720

cgtgcaattg cgtggcgttc cggcgatgtt tgttaacggt aaatatcagc tgaatccgca 780

gggtatggat accagcaata tggatgtttt tgttcagcag tatgctgata cagtgaaata 840

cttaagcgag aaaaaa 856

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cttacattaa ttgcgttgcg cgaattctta cagatcctct tcagagatga 50

<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgtcgaactc gagtcgagtc gtcggtacct atagtgagtc gtattaattt c 51

<210> 20

<211> 557

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttacagatcc tcttcagaga tgagtttctg ctcggccagg ttagcgtcga ggaactcttt 60

caactgacct ttagacagtg cacccacttt ggttgccgcc acttcaccgt ttttgaacag 120

cagcagagtc gggataccac ggatgccata tttcggcgca gtgccagggt tttgatcgat 180

gttcagtttt gcaacggtca gtttgccctg atattcgtca gcgatttcat ccagaatcgg 240

ggcgatcatt ttgcacggac cgcaccactc tgcccagaaa tcgacgagga tcgccccgtc 300

cgctttgagt acatccgtgt caaaactgtc gtcagtcagg tgaataattt tatcgctggc 360

catcgccggc tgggcagcga ggagcagcag accagcagca gcggtcggca gcaggtattt 420

catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 480

atacatattt gaatgcggga tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaaat 540

taatacgact cactata 557

<210> 21

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttacaggtct tcttcagaga tcagtttctg ttcgttgctc aggattttaa cgtaggcgc 59

<210> 22

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acttacatta attgcgttgc gcgaattctt acaggtcttc ttcagagatc agtttctgt 59

<210> 23

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

catctctgaa gaggatctgt aaatgaagaa ctggaaaacg ctgcttct 48

<210> 24

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

acagtgaaat acttaagcga gaaaaaagag cagaaactca tctctgaaga ggatc 55

<210> 25

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgtaattttt ttaaggcagt tattaagctt caaaaaaccc ctcaagaccc gtttag 56

<210> 26

<211> 871

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gagcagaaac tcatctctga agaggatctg taaatgaaga aaggttttat gttgtttact 60

ttgttagcgg cgttttcagg ctttgctcag gctgatgacg cggcaattca acaaacgtta 120

gccaaaatgg gcatcaaaag cagcgatatt cagcccgcgc ctgtagctgg catgaagaca 180

gttctgacta acagcggcgt gttgtacatc accgatgatg gtaaacatat cattcagggg 240

ccaatgtatg acgttagtgg cacggctccg gtcaatgtca ccaataagat gctgttaaag 300

cagttgaatg cgcttgaaaa agagatgatc gtttataaag cgccgcagga aaaacacgtc 360

atcaccgtgt ttactgatat tacctgtggt tactgccaca aactgcatga gcaaatggca 420

gactacaacg cgctggggat caccgtgcgt tatcttgctt tcccgcgcca ggggctggac 480

agcgatgcag agaaagaaat gaaagctatc tggtgtgcga aagataaaaa caaagcgttt 540

gatgatgtga tggcaggtaa aagcgtcgca ccagccagtt gcgacgtgga tattgccgac 600

cattacgcac ttggcgtcca gcttggcgtt agcggtactc cggcagttgt gctgagcaat 660

ggcacacttg ttccgggtta ccagccgccg aaagagatga aagaatttct cgacgaacac 720

caaaaaatga ccagcggtaa agagcagaaa ctcatctctg aagaggatct gtaacaaagc 780

ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg 840

ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt g 871

Claims (9)

1.一种用于IGF-1基因重组表达的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含SP-IGF1-pET-28b载体和质粒pATX-4E，所述SP-IGF1-pET-28b载体上包含有一种信号肽的基因，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述质粒pATX-4E上包含有SurA、Trx、DsbA和DsbC的基因。

2.根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述SP-IGF1-pET-28b载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根据权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述SP-IGF1-pET-28b载体的构建方法包括以下步骤：

A1、合成PCR扩增模板

将无信号肽基因的IGF-1基因插入到pET-21a载体的NdeI/XhoI酶切位点之间，得到序列号如SEQ ID No.3所示的质粒IGF1-pET-21a作为PCR扩增模板；

A2、构建载体

用第一对引物扩增步骤A1中所述PCR扩增模板得到扩增产物P1；以P1为模板，用第二对引物对P1进行扩增得到扩增产物P2；以P2为模板，用第三对引物对P2进行扩增得到扩增产物P3；对P3进行无缝克隆，再插入到pET-28b载体的NcoI/XhoI酶切位点之间，得到所述SP-IGF1-pET-28b载体。

4.根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述质粒pATX-4E的核苷酸序列如SEQID No.4所示。

5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述质粒pATX-4E的构建方法包括如下步骤：

B1、构建过渡质粒骨架pACYC

用第四对引物扩增pACYCDuet-1质粒得到扩增产物Q1，对Q1进行无缝克隆得到核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的过渡质粒骨架pACYC；

B2、构建质粒pATX-1E

用第五对引物扩增DsbA的基因及启动子，对得到的扩增产物Q2进行无缝克隆，再插入到所述过渡质粒骨架pACYC的XhoI/HindIII酶切位点之间，得到核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的质粒pATX-1E；

B3、构建质粒pATX-2E

用第六对引物扩增包含有AmpR-pelB-Trx-Myc基因的第一pUC57质粒，对得到的产物Q3进行无缝克隆，插入到所述质粒pATX-1E的KpnI/EcoRI酶切位点之间，得到核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的质粒pATX-2E；

B4、构建质粒pATX-3E

用第七对引物扩增带Myc标签的SurA基因，得到扩增产物Q4；用第八对引物扩增Q4，得到扩增产物Q5；对Q5进行无缝克隆，插入到所述质粒pATX-2E的EcoRI酶切位点处，得到核苷酸序列号如SEQ ID No.8所示的质粒pATX-3E；

B5、构建质粒pATX-4E

用第九对引物扩增包含有Myc-DsbC-Myc-terminator基因的第二pUC57质粒，得到扩增产物Q6，对Q6进行无缝克隆，插入到所述质粒pATX-3E的HindIII酶切位点处，得到所述质粒pATX-4E。

6.一种重组表达IGF-1基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

C1、培养如权利要求1～5任一项所述的重组细胞；

C2、用IPTG作为诱导剂进行诱导表达；

C3、收集目标蛋白IGF-1。

7.根据权利要求6所述的重组表达IGF-1基因的方法，其特征在于，将步骤C1包括以下步骤：

C1-1、对超净工作台灭菌；

C1-2、将大肠杆菌感受态细胞BL21在冰上解冻；

C1-3、在超净工作台中，向大肠杆菌感受态细胞BL21中加入质粒pATX-4E和SP-IGF1-pET-28b载体各1μL，轻轻混匀，置于冰上静置30min；在42℃水浴热激90s，再置于冰上静置3min，得到重组细胞；

C1-4、在超净工作台中，将步骤C1-3中的重组细胞接种至400μL LB培养基中，于37℃下孵育45min；

C1-5、将复苏后的菌液均匀涂布在含有37μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基的培养皿上，37℃培养过夜。

8.根据权利要求6所述的重组表达IGF-1基因的方法，其特征在于，步骤C2包括以下步骤：

C2-1、从步骤C1中培养好的重组细胞中挑选单菌落置于10mL含有37μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养；

C2-2、将步骤C2-1中的培养基转接到1L含有37μg/mL氯霉素和50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中放大培养3小时，待培养基OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG，在16℃下过夜诱导表达；所述IPTG添加的量使IPTG在所述LB液体培养基中的终浓度为1.0×10^-4mol/L。

9.根据权利要求7所述的重组表达IGF-1基因的方法，其特征在于，步骤C3包括以下步骤：

C3-1、将步骤C2中诱导表达后的包含重组细胞的培养基在9000g离心力下离心10min，收集表达菌体，用pH＝7.4的PBS缓冲液重悬菌体，超声，在4℃、17000g离心力下离心1h，收集离心后的上清液；

C3-2、向步骤C3-1中的上清液中加入1mL预先用pH＝7.4的PBS缓冲液平衡好的Ni-NTA填料，孵育1小时；

C3-3、将步骤C3-2中孵育后的悬浮液加入重力柱中，纯化，待液体滴完后，用50mL pH＝7.4的PBS缓冲液淋洗Ni-NTA填料，再用50mL pH＝7.4的含20mmol/L咪唑的PBS缓冲液淋洗Ni-NTA填料，最后用pH＝7.4的含250mmol/L咪唑的PBS缓冲液洗脱得到15mL目标蛋白粗品；

C3-4、将步骤C3-3中的目标蛋白粗品置于pH＝7.4的PBS缓冲液中透析过夜，第二天再换新鲜的pH＝7.4的PBS缓冲液透析6h，即得到有活性的IGF-1。

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