CN115247173A - 构建tmprss6基因突变的缺铁性贫血猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了构建TMPRSS6基因突变的缺铁性贫血猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。本发明提供了SEQ ID NO：16所示TMPRSS6‑gRNA2、SEQ ID NO：17所示TMPRSS6‑gRNA4和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。本发明还提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将TMPRSS6‑gRNA2、TMPRSS6‑gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。所述重组细胞为TMPRSS6基因发生突变的重组细胞。以上任一所述试剂盒的用途为：制备重组细胞；制备缺铁性贫血模型猪；制备缺铁性贫血细胞模型或缺铁性贫血组织模型或缺铁性贫血器官模型。本发明对于缺铁性贫血疾病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。

Description

构建TMPRSS6基因突变的缺铁性贫血猪核移植供体细胞的基 因编辑系统及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体属于基因编辑技术领域，更具体涉及构建TMPRSS6基因突变的缺铁性贫血猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用，具体的所述缺铁性贫血为铁剂难治性缺铁性贫血。
背景技术
缺铁性贫血通常是获得性的，然而，铁剂难治性缺铁性贫血(IRIDA)却是一种罕见的常染色体隐性遗传病。通常，若用口服铁剂治疗4～6周后缺乏血液学应答(血红蛋白增加不足1g)，则将缺铁性贫血定义为“难治”。在实际临床中，虽然缺铁性贫血病例中IRIDA只占有不到1％，但由于IRIDA患者对口服铁剂治疗无应答，治疗起来较为困难。目前，IRIDA的主要治疗方法为静脉补铁，但由于患者血清中存在大量的铁调素，其治疗反应迟缓且贫血改善不完全，患者需长期进行静脉补铁治疗。
TMPRSS6基因已被确定为IRIDA的致病基因，该基因编码跨膜丝氨酸蛋白酶6。正常的TMPRSS6会负反馈调节铁调素的信号通路BMPR-SMAD，通过调节铁调素基因的表达，从而维持体内的铁调素含量的稳定；但突变后的TMPRSS6会丧失对BMPR-SMAD通路的负反馈调节作用，从而造成铁调素组成性的大量生成，阻碍肠道对铁的吸收，即造成了IRIDA的病理状态。
研究IRIDA的发生发展机制及研发相应的药物均需要在动物模型的基础上进行，目前常用的动物模型为小鼠模型，然而小鼠不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，不能真实地模拟人类正常的生理、病理状态。猪作为大动物，其体型大小和生理功能与人类近似，易于大规模繁殖饲养，而且在伦理道德及动物保护等方面要求较低，是理想的人类疾病模型动物。
基因编辑是近年来不断取得重大发展的一种生物技术，其包括从基于同源重组的基因编辑到基于核酸酶的ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等编辑技术，其中CRISPR/Cas9技术是当前最先进的基因编辑技术。目前，基因编辑技术被越来越多地应用到动物模型的制作上。
发明内容
本发明的目的是提供构建TMPRSS6基因突变的缺铁性贫血猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用。
本发明提供了TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
本发明还提供了TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用。
本发明还提供了TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和特异质粒在制备试剂盒中的应用。
本发明提供了一种试剂盒，包括TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和NCN蛋白。
本发明提供了一种试剂盒，包括TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和PRONCN蛋白。
本发明提供了一种试剂盒，包括TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和特异质粒。
以上任一所述试剂盒还包括猪细胞。
以上任一所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备缺铁性贫血模型猪；(c)制备缺铁性贫血细胞模型或缺铁性贫血组织模型或缺铁性贫血器官模型。
本发明还提供了一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞。
所述共转染具体采用电击转染的方式。
电击转染的参数设置具体可为：1450V、10ms、3pulse。
所述共转染具体可采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与NeonTM transfection system电转仪。
TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和NCN蛋白的配比依次为：0.8-1.2μg TMPRSS6-gRNA2：0.8-1.2μg TMPRSS6-gRNA4：3-5μg NCN蛋白。
TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和NCN蛋白的配比依次为：1μg TMPRSS6-gRNA2：1μgTMPRSS6-gRNA4：4μg NCN蛋白。
猪细胞、TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：0.8-1.2μg TMPRSS6-gRNA2：0.8-1.2μg TMPRSS6-gRNA4：3-5μg NCN蛋白。
猪细胞、TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和NCN蛋白的配比依次为：10万个猪细胞：1μg TMPRSS6-gRNA2：1μg TMPRSS6-gRNA4：4μg NCN蛋白。
以上任一所述TMPRSS6-gRNA2为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3-22位核苷酸所示。
具体的，所述TMPRSS6-gRNA2如SEQ ID NO：16所示。
具体的，所述TMPRSS6-gRNA2如SEQ ID NO：11所示。
以上任一所述TMPRSS6-gRNA4为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3-22位核苷酸所示。
具体的，所述TMPRSS6-gRNA4如SEQ ID NO：17所示。
具体的，所述TMPRSS6-gRNA4如SEQ ID NO：13所示。
以上任一所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白。
具体的，所述NCN蛋白如SEQ ID NO：3所示。
以上任一所述猪细胞为猪成纤维细胞。
以上任一所述猪细胞为猪原代成纤维细胞。
所述NCN蛋白的制备方法包括如下步骤：
(1)将质粒pKG-GE4导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；
(2)采用液体培养基30℃培养所述重组菌，然后加入IPTG并进行25℃诱导培养，然后收集菌体；
(3)将收集的菌体进行菌体破碎，收集粗蛋白溶液；
(4)采用亲和层析从所述粗蛋白溶液中纯化具有His6标签的融合蛋白；
(5)采用具有His6标签的肠激酶酶切具有His6标签的融合蛋白，然后采用Ni-NTA树脂去除具有His6标签的蛋白，得到纯化的NCN蛋白；
质粒pKG-GE4中具有SEQ ID NO：1中第5209-9852位核苷酸所示的融合基因。
所述NCN蛋白的制备方法具体包括如下步骤：
(1)将质粒pKG-GE4导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
(2)将步骤(1)得到的重组菌接种至含氨苄青霉素的液体LB培养基，振荡培养；
(3)将步骤(2)得到的菌液接种至液体LB培养基，30℃、230rpm振荡培养至OD600nm值＝1.0，然后加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.5mM，然后25℃、230rpm振荡培养12小时，然后离心收集菌体；
(4)取步骤(3)得到的菌体，用PBS缓冲液洗涤；
(5)取步骤(4)得到的菌体，加入粗提缓冲液并悬浮菌体，然后进行菌体破碎，然后离心收集上清液，采用0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液；
(6)采用亲和层析从步骤(5)得到的滤液中纯化具有His6标签的融合蛋白(SEQ IDNO：2所示的融合蛋白)；
(7)取步骤(6)收集的过柱后溶液，使用超滤管浓缩，然后用25mM Tris-HCl(pH8.0)稀释；
(8)将具有His6标签的重组牛肠激酶加入到步骤(7)得到的溶液中，酶切；
(9)将完成步骤(8)的溶液与Ni-NTA树脂混匀，孵育，然后离心收集上清液；
(10)取步骤(9)得到的上清液，使用超滤管浓缩，然后加入酶贮存液中，即为NCN蛋白溶液。
采用亲和层析从步骤(5)得到的滤液中纯化具有His6标签的融合蛋白的具体方法如下：
首先采用5个柱体积的平衡液平衡Ni-NTA琼脂糖柱(流速为1ml/min)；然后上样50ml步骤(5)得到的滤液(流速为0.5-1ml/min)；然后用5个柱体积的平衡液洗涤柱子(流速为1ml/min)；然后用5个柱体积的缓冲液洗涤柱子(流速为1ml/min)，以去除杂蛋白；然后用10个柱体积的洗脱液以0.5-1ml/min的流速洗脱，收集过柱后溶液(90-100ml)。
以上任一所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号。
所述信号肽的功能为促进蛋白分泌表达。所述信号肽可选自大肠杆菌碱性磷酸酶(phoA)信号肽、金黄色葡萄球菌蛋白A信号肽、大肠杆菌外膜蛋白(ompa)信号肽或任何其他原核基因的信号肽，优选为碱性磷酸酶信号肽(phoA signal peptide)。碱性磷酸酶信号肽用来引导目的蛋白分泌表达至细菌周质腔中，从而与细菌胞内蛋白分离，且分泌到细菌周质腔中的目的蛋白为可溶性表达，可被细菌周质腔中的信号肽酶裂解。
所述分子伴侣蛋白的功能为增加蛋白的可溶性。所述分子伴侣可为任何帮助形成二硫键的蛋白，优选为硫氧还原蛋白(TrxA蛋白)。硫氧还原蛋白，其能作为分子伴侣帮助所共表达的目的蛋白(例如Cas9蛋白)形成二硫键，提高蛋白的稳定性、折叠的正确性，增加目的蛋白的溶解性及活性。
所述蛋白标签的功能为用于蛋白纯化。所述标签可为His标签(His-Tag，His6蛋白标签)、GST标签、Flag标签、HA标签、c-Myc标签或其他任何蛋白标签，进一步优选为His标签。His标签能与Ni柱结合，可以通过一步法Ni柱亲和层析纯化目的蛋白，可极大地简化目的蛋白的纯化流程。
所述蛋白酶酶切位点的功能为纯化后用于切除非功能区段，以释放天然形式Cas9蛋白。所述蛋白酶可选自肠激酶(Enterokinase)、因子Xa(Factor Xa)、凝血酶(Thrombin)、TEV蛋白酶(TEV protease)、HRV 3C蛋白酶(HRV 3C protease)、WELQut蛋白酶或任何其他内切蛋白酶，进一步优选为肠激酶。EK为肠激酶酶切位点，便于使用肠激酶切除所融合的TrxA-His区段，得到天然形式的Cas9蛋白。本申请使用带His标签的商品肠激酶酶切融合蛋白后，可通过一次亲和层析除去TrxA-His区段及带His标签的肠激酶，得到天然形式的Cas9蛋白，避免了多次纯化透析对目的蛋白的伤害和损耗。
所述核定位信号可为任何核定位信号，优选为SV40核定位信号和/或nucleoplasmin核定位信号。NLS为核定位信号，在Cas9的N端及C端分别设计了一个NLS位点，使Cas9能更有效地进入细胞核进行基因编辑。
所述Cas9蛋白可为saCas9或spCas9,优选为spCas9蛋白。
PRONCN蛋白具体如SEQ ID NO：2所示。
以上任一所述特异质粒自上游至下游依次包括如下元件：启动子、操纵子、核糖体结合位点、PRONCN蛋白的编码基因、终止子。
所述启动子具体可为T7启动子。T7启动子为原核表达强启动子，能高效驱动外源基因的表达。
所述操纵子具体可为Lac操纵子。Lac操纵子为乳糖诱导表达的调控元件，可在细菌生长至一定数量后，再用IPTG在低温下诱导目的蛋白的表达，可避免目的蛋白过早表达对宿主菌生长的影响，低温下诱导表达也显著提高所表达的目的蛋白的可溶性。
所述核糖体结合位点是蛋白翻译时的核糖体结合位点，对蛋白质的翻译是必要的。
所述终止子具体可为T7终止子。T7终止子可在目的基因的末端有效终止基因转录，避免目的基因之外的其他下游序列得到转录和翻译。
对于spCas9蛋白的密码子，本申请对其密码子进行了优化，使之完全适应本申请所选用的大肠杆菌高效表达菌株E.coli BL21(DE3)的密码子偏好，从而提高Cas9蛋白的表达水平。
T7启动子如SEQ ID NO：1中第5121-5139位核苷酸所示。
Lac操纵子如SEQ ID NO：1中第5140-5164位核苷酸所示。
核糖体结合位点如SEQ ID NO：1中第5178-5201位核苷酸所示。
碱性磷酸酶信号肽的编码序列如SEQ ID NO：1中第5209-5271位核苷酸所示。
TrxA蛋白的编码序列如SEQ ID NO：1中第5272-5598位核苷酸所示。
His-Tag的编码序列如SEQ ID NO：1中第5620-5637位核苷酸所示。
肠激酶酶切位点的编码序列如SEQ ID NO：1中第5638-5652位核苷酸所示。
核定位信号的编码序列如SEQ ID NO：1中第5656-5670位核苷酸所示。
spCas9蛋白的编码序列如SEQ ID NO：1中第5701-9801位核苷酸所示。
核定位信号的编码序列如SEQ ID NO：1中第9802-9849位核苷酸所示。
T7终止子如SEQ ID NO：1中第9902-9949位核苷酸。
具体的，所述特异质粒为质粒pKG-GE4。
质粒pKG-GE4中具有SEQ ID NO：1中第5121-9949位核苷酸所示的DNA分子。
具体的，以上任一所述质粒pKG-GE4如SEQ ID NO：1所示。
本发明还保护以上任一所述方法制备得到的重组细胞。
所述重组细胞为TMPRSS6基因发生突变的重组细胞。
所述重组细胞具体可为表1中杂合型、双等位基因相同突变型或双等位基因不同突变型的单细胞克隆。
本发明还保护所述重组细胞在制备缺铁性贫血模型猪中的应用。
将所述重组细胞作为核移植供体细胞进行体细胞克隆，可以得到克隆猪，即为缺铁性贫血模型猪。
本发明还保护利用所述重组细胞制备的模型猪的猪组织，即缺铁性贫血组织模型。
本发明还保护利用所述重组细胞制备的模型猪的猪器官，即缺铁性贫血器官模型。
本发明还保护利用所述重组细胞制备的模型猪的猪细胞，即缺铁性贫血细胞模型。
本发明还保护所述重组细胞、所述缺铁性贫血组织模型、所述缺铁性贫血器官模型、所述缺铁性贫血细胞模型或者所述缺铁性贫血模型猪的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：
(d1)筛选治疗缺铁性贫血的药物；
(d2)进行缺铁性贫血药物的药效评价；
(d3)进行缺铁性贫血的基因治疗和/或细胞治疗的疗效评价；
(d4)研究缺铁性贫血的发病机制。
以上任一所述猪具体可为从江香猪。
以上任一所述缺铁性贫血是由TMPRSS6基因突变引起的。
猪TMPRSS6基因信息：编码跨膜丝氨酸蛋白酶6；位于5号染色体；Gene ID为100516673，Sus scrofa。
猪TMPRSS6基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
猪TMPRSS6基因具有SEQ ID NO：9所示的DNA区段。
以上任一所述突变为一个或多个核苷酸的缺失和/或插入和/或替换。
以上任一所述突变为一个或多个核苷酸的缺失。
以上任一所述突变为一个或多个核苷酸的插入。
以上任一所述突变为一个或多个核苷酸的缺失和插入。
以上任一所述缺铁性贫血为铁剂难治性缺铁性贫血。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
(1)本发明研究对象(猪)比其他动物(大小鼠、灵长类)具有更好的应用性。
大小鼠等啮齿类动物不论从体型、器官大小、生理、病理等方面都与人相差巨大，无法真实地模拟人类正常的生理、病理状态。研究表明，95％以上在大小鼠中验证有效的药物在人类临床试验中是无效的。就大动物而言，灵长类是与人亲缘关系最近的动物，但其体型小、性成熟晚(6-7岁开始交配)，且为单胎动物，群体扩繁速度极慢，饲养成本很高。另外，灵长类动物克隆效率低、难度大、成本高。
而猪作为模型动物就没有上述缺点，猪是除灵长类外与人亲缘关系最近的动物，其体型、体重、器官大小等与人相近，在解剖学、生理学、免疫学、营养代谢、疾病发病机制等方面与人类极为相似。同时，猪的性成熟早(4-6个月)，繁殖力高，一胎多仔，在2-3年内即可形成一个较大群体。另外，猪的克隆技术非常成熟，克隆及饲养成本也较灵长类低得多。因此猪是非常适合作为人类疾病模型的动物。
(2)本发明所构建的载体，使用了能够高效表达目的蛋白的强启动子T7-lac来进行目的蛋白的表达，用细菌周质蛋白碱性磷酸酶(phoA)的信号肽来引导目的蛋白分泌表达至细菌周质腔中，从而与细菌胞内蛋白分离，且分泌到细菌周质腔中的目的蛋白为可溶性表达。同时还采用硫氧还原蛋白TrxA与Cas9蛋白融合表达，TrxA能帮助所共表达的目的蛋白形成二硫键，提高蛋白的稳定性、折叠的正确性，增加目的蛋白的溶解性及活性。为了方便目的蛋白的纯化，设计了His标签，可以通过一步法Ni柱亲和层析纯化目的蛋白，极大地简化了目的蛋白的纯化流程。同时在His标签后设计了一个肠激酶酶切位点，便于切除所融合的TrxA-His多肽片段，得到天然形式的Cas9蛋白。利用带His标签的肠激酶酶切融合蛋白后，可通过一次亲和层析除去TrxA-His多肽片段及带His标签的肠激酶，得到天然形式的Cas9蛋白，避免了多次纯化透析对目的蛋白的伤害和损耗。同时，本发明也在Cas9的N端及C端分别设计了一个NLS位点，使Cas9能更有效地进入细胞核进行基因编辑。另外，本发明选择了E.coli BL21(DE3)菌株为目的蛋白表达菌株，该菌株可高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET-32a)的外源基因。同时，对于Cas9蛋白的密码子，本发明进行了密码子优化，使之完全适应表达菌株的密码子偏好，从而提高目的蛋白的表达水平。另外，本发明在细菌生长至一定数量后，再用IPTG在低温下诱导目的蛋白的表达，可避免目的蛋白过早表达对宿主菌生长的影响，低温下诱导表达也显著提高所表达的目的蛋白的可溶性。经过上述各项优化设计及实验实施，所得到的Cas9蛋白活性比商品Cas9蛋白有了极显著的提高。
(3)采用本发明构建并表达的Cas9高效蛋白联合体外转录的gRNA进行基因编辑，并对Cas9和gRNA的最佳用量配比进行了优化，最终获得基因编辑单细胞克隆的比率高达86.3％，远高于常规的基因编辑效率(10-30％)。
(4)利用本发明所得到的靶基因敲除单细胞克隆株进行体细胞核移植动物克隆可直接得到靶基因敲除的克隆猪，并且该基因变异可稳定遗传。
在小鼠模型制作中采用的受精卵显微注射基因编辑材料后再进行胚胎移植的方法，因其直接获得基因突变后代的概率比较低，需要进行后代的杂交选育，不太适用于妊娠期较长的大动物(如猪)模型制作。因此，本发明采用技术难度大、挑战性高的原代细胞体外编辑以及Cas9蛋白和双gRNA切割并筛选阳性编辑单细胞克隆的方法，后期再通过体细胞核移植动物克隆技术直接获得相应疾病模型猪，可大大缩短模型猪制作周期并节省人力、物力、财力。
本发明采用CRISPR/Cas9技术联合双gRNA编辑进行了TMPRSS6基因的敲除，模拟缺铁性贫血的自然发病遗传特征，并获得了TMPRSS6基因敲除的单细胞克隆，为后期通过体细胞核移植动物克隆技术培育缺铁性贫血模型猪奠定了基础。本发明将有助于研究并揭示由TMPRSS6基因功能异常所导致的缺铁性贫血的发病机制，也可用于进行药物筛选、药效评价、基因治疗及细胞治疗等研究，能够为进一步的临床应用提供有效的实验数据，进而为成功治疗人类缺铁性贫血提供有力的实验手段。本发明对于缺铁性贫血疾病药物的研发及揭示该病的发病机制具有重大应用价值。
附图说明
图1为质粒pET-32a的结构示意图。
图2为质粒pKG-GE4的结构示意图。
图3为实施例3中gRNA与NCN蛋白用量配比优化的电泳图。
图4为实施例3中NCN蛋白与商品Cas9蛋白的基因编辑效率比较的电泳图。
图5为实施例4中用命名为1的猪的耳组织提取基因组作为模板采用不同引物对进行PCR扩增的电泳图。
图6为实施例4中分别以18只猪的基因组DNA为模板采用TMPRSS6-E1-JDF280和TMPRSS6-E1-JDR673组成的引物对进行PCR扩增的电泳图。
图7是编号为1的单细胞克隆的反向测序与野生型序列的比对结果。
图8是编号为12的单细胞克隆的反向测序与野生型序列的比对结果。
图9是编号为36的单细胞克隆的正向和反向测序同时与野生型序列的比对结果。
图10是编号为17的单细胞克隆的反向测序与野生型序列的比对结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中构建的重组质粒，均已进行测序验证。商品Cas9-A蛋白为市售的效果好的Cas9蛋白。商品Cas9-B蛋白为市售的效果好的Cas9蛋白。完全培养液(％为体积比)：15％胎牛血清(Gibco)+83％DMEM培养基(Gibco)+1％Penicillin-Streptomycin(Gibco)+1％HEPES(Solarbio)。细胞培养条件：37℃，5％CO2、5％O2的恒温培养箱。
实施例中采用的猪原代成纤维细胞均是用初生从江香猪耳组织制备得到的。制备猪原代成纤维细胞的方法：①取猪耳组织0.5g，去除毛发及骨组织，然后用75％酒精浸泡30-40s，然后用含5％(体积比)Penicillin-Streptomycin(Gibco)的PBS缓冲液洗涤5次，然后用PBS缓冲液洗涤一次；②用剪刀将组织剪碎，采用5mL 0.1％胶原酶溶液(Sigma)，37℃消化1h，然后500g离心5min，弃上清；③将沉淀用1mL完全培养液重悬，然后铺入含10mL完全培养液并已用0.2％明胶(VWR)封盘的直径为10cm的细胞培养皿中，培养至细胞长满皿底60％左右；④完成步骤③后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后重悬于完全培养液。用于进行后续电转实验。
实施例1、原核Cas9高效表达载体的构建
质粒pET-32a的结构示意图见图1。
质粒pKG-GE4是以质粒pET-32a为出发质粒进行改造得到的。质粒pET32a-T7lac-phoA:SP-TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS-T7ter(简称质粒pKG-GE4)，如SEQ ID NO：1所示，为环形质粒，结构示意图见图2。
SEQ ID NO：1中，第5121-5139位核苷酸组成T7启动子，第5140-5164位核苷酸编码Lac操纵子(lac operator)，第5178-5201位核苷酸组成核糖体结合位点(RBS),第5209-5271位核苷酸编码碱性磷酸酶信号肽(phoA signal peptide)，第5272-5598位核苷酸编码TrxA蛋白，第5620-5637位核苷酸编码His-Tag(又称为His6标签)，第5638-5652位核苷酸编码肠激酶酶切位点(EK酶切位点)，第5656-5670位核苷酸编码核定位信号，第5701-9801位核苷酸编码spCas9蛋白，第9802-9849位核苷酸编码核定位信号，第9902-9949位核苷酸组成T7终止子。编码spCas9蛋白的核苷酸已进行针对大肠杆菌BL21(DE3)菌株的密码子优化。
质粒pKG-GE4的主要改造如下：①保留了TrxA蛋白的编码区域，TrxA蛋白可以帮助所表达的目的蛋白形成二硫键、增加目的蛋白的溶解性及活性；在TrxA蛋白的编码区域之前加入碱性磷酸酶信号肽的编码序列，碱性磷酸酶信号肽可以引导所表达的目的蛋白分泌至细菌的膜周质腔中并可被原核周质信号肽酶酶切；②在TrxA蛋白的编码序列之后增加His-Tag的编码序列，His-Tag可用于所表达的目的蛋白的富集；③在His-Tag的编码序列下游增加肠激酶酶切位点DDDDK(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)的编码序列，纯化出的蛋白将在肠激酶作用下去除His-Tag和上游所融合的TrxA蛋白；④插入密码子优化后的适宜大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达的Cas9基因，同时在该基因的上游和下游均增加核定位信号编码序列，增加后期纯化出的Cas9蛋白的核定位能力。
质粒pKG-GE4中的融合基因如SEQ ID NO：1中第5209-9852位核苷酸所示，编码SEQID NO：2所示的融合蛋白(融合蛋白TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS，简称为PRONCN蛋白)。由于碱性磷酸酶信号肽以及肠激酶酶切位点的存在，融合蛋白被肠激酶酶切后形成SEQ IDNO：3所示的蛋白质，将SEQ ID NO：3所示的蛋白质命名为NCN蛋白。
实施例2、NCN蛋白的制备和纯化
一、诱导表达
1、将质粒pKG-GE4导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌接种至含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜。
3、将步骤2得到的菌液接种至液体LB培养基，30℃、230rpm振荡培养至OD600nm值＝1.0，然后加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)并使其在体系中的浓度为0.5mM，然后25℃、230rpm振荡培养12小时，然后4℃、10000g离心15分钟，收集菌体。
4、取步骤3得到的菌体，用PBS缓冲液洗涤。
二、融合蛋白TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS的纯化
1、取步骤一得到的菌体，加入粗提缓冲液并悬浮菌体，然后采用均质机进行菌体破碎(1000par循环三次)，然后4℃、15000g离心30min，收集上清液，上清液采用0.22μm孔径滤膜过滤，收集滤液。本步骤中，每g湿重的菌体配比10ml粗提缓冲液。
粗提缓冲液：含20mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5M NaCl、5mM Imidazole、1mM PMSF，余量为ddH2O。
2、采用亲和层析纯化融合蛋白。
首先采用5个柱体积的平衡液平衡Ni-NTA琼脂糖柱(流速为1ml/min)；然后上样50ml步骤1得到的滤液(流速为0.5-1ml/min)；然后用5个柱体积的平衡液洗涤柱子(流速为1ml/min)；然后用5个柱体积的缓冲液洗涤柱子(流速为1ml/min)，以去除杂蛋白；然后用10个柱体积的洗脱液以0.5-1ml/min的流速洗脱，收集过柱后溶液(90-100ml)。
Ni-NTA琼脂糖柱：金斯瑞，L00250/L00250-C，填料为10ml。
平衡液：含20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.5M NaCl、5mM Imidazole，余量为ddH2O。
缓冲液：含20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.5M NaCl、50mM Imidazole，余量为ddH2O。
洗脱液：含20mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.5M NaCl、500mM Imidazole，余量为ddH2O。
三、融合蛋白TrxA-His-EK-NLS-spCas9-NLS的酶切与NCN蛋白的纯化
1、取15ml步骤二收集的过柱后溶液，使用Amicon超滤管(Sigma,UFC9100，容量为15ml)将其浓缩至200μl，然后用25mM Tris-HCl(pH8.0)稀释至1ml。采用6个超滤管，共得到6ml。
2、将商品来源的具有His6标签的重组牛肠激酶(生工生物，C620031，重组牛肠激酶轻链，带His6标签，Recombinant Bovine Enterokinase Light Chain,His)加入到步骤1得到的溶液(约6ml)中，25℃酶切16小时。每50μg蛋白量配比加入2个单位的肠激酶。
3、取完成步骤2的溶液(约6ml)，与480μl Ni-NTA树脂(金斯瑞，L00250/L00250-C)混匀，在室温下旋转混匀15min，然后7000g离心3min，收集上清液(4-5.5ml)。
4、取步骤3得到的上清液，使用Amicon超滤管(Sigma,UFC9100，容量为15ml)将其浓缩至200μl，然后加入酶贮存液中，调整蛋白浓度为5mg/ml，即为NCN蛋白溶液。
经测序，NCN蛋白溶液中的蛋白质，N端15个氨基酸残基如SEQ ID NO：3第1至15位所示，即NCN蛋白。
用于后续实施例的NCN蛋白均由NCN蛋白溶液提供。
酶贮存液(pH7.4)：含10mM Tris,300mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,50％(体积比)甘油，余量为ddH2O。
实施例3、NCN蛋白的性能
选择靶向TTN基因的2个gRNA靶点如下：
TTN-gRNA1：AGAGCACAGTCAGCCTGGCG；
TTN-gRNA2：CTTCCAGAATTGGATCTCCG。
用于鉴定包含TTN基因中gRNA的靶点片段的引物如下：
TTN-F55：TACGGAATTGGGGAGCCAGCGGA；
TTN-R560：CAAAGTTAACTCTCTGTGTCT。
一、制备gRNA
1、制备TTN-T7-gRNA1转录模板和TTN-T7-gRNA2转录模板
TTN-T7-gRNA1转录模板为双链DNA分子，如SEQ ID NO：4所示。
TTN-T7-gRNA2转录模板为双链DNA分子，如SEQ ID NO：5所示。
2、体外转录得到gRNA
取TTN-T7-gRNA1转录模板，采用Transcript Aid T7 High Yield TranscriptionKit(Fermentas，K0441)进行体外转录，然后用MEGA clearTMTranscription Clean-Up Kit(Thermo，AM1908)进行回收纯化，得到TTN-gRNA1。TTN-gRNA1为单链RNA，如SEQ ID NO：6所示。
取TTN-T7-gRNA2转录模板，采用Transcript Aid T7 High Yield TranscriptionKit(Fermentas，K0441)进行体外转录，然后用MEGA clearTMTranscription Clean-Up Kit(Thermo，AM1908)进行回收纯化，得到TTN-gRNA2。TTN-gRNA2为单链RNA，如SEQ ID NO：7所示。
二、gRNA与NCN蛋白用量配比优化
1、共转染猪原代成纤维细胞
第一组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：0.5μg TTN-gRNA1：0.5μg TTN-gRNA2：4μg NCN蛋白。
第二组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：0.75μg TTN-gRNA1：0.75μg TTN-gRNA2：4μg NCN蛋白。
第三组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2：4μg NCN蛋白。
第四组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1.25μg TTN-gRNA1：1.25μg TTN-gRNA2：4μg NCN蛋白。
第五组：将TTN-gRNA1和TTN-gRNA2共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养12-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。电转后培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用TTN-F55和TTN-R560组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。
电泳图见图3。505bp条带为野生型条带(WT)，254bp左右(野生型条带505bp理论缺失251bp)为缺失突变条带(MT)。
基因缺失突变效率＝(MT灰度/MT条带bp数)/(WT灰度/WT条带bp数+MT灰度/MT条带bp数)×100％。第一组基因缺失突变效率为19.9％，第二组基因缺失突变效率为39.9％，第三组基因缺失突变效率为79.9％，第四组基因缺失突变效率为44.3％。第五组未发生突变。
结果表明，当两个gRNA与NCN蛋白的质量配比为1：1：4，实际用量为1μg：1μg：4μg时基因编辑效率最高。因此，确定两个gRNA与NCN蛋白的最适用量为1μg：1μg：4μg。
三、NCN蛋白与商品Cas9蛋白的基因编辑效率比较
1、共转染猪原代成纤维细胞
Cas9-A组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和商品Cas9-A蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2：4μg Cas9-A蛋白。
pKG-GE4组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2：4μg NCN蛋白。
Cas9-B组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2和商品Cas9-B蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2：4μg Cas9-B蛋白。
Control组：将TTN-gRNA1、TTN-gRNA2共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TTN-gRNA1：1μg TTN-gRNA2。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养12-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。电转后培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，提取基因组DNA，采用TTN-F55和TTN-R560组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。
电泳图见图4。采用商品Cas9-A蛋白的基因缺失突变效率为28.5％，采用NCN蛋白的基因缺失突变效率为85.6％，采用商品Cas9-B蛋白的基因缺失突变效率为16.6％。
结果表明，与采用商品的Cas9蛋白相比，采用本发明制备的NCN蛋白使得基因编辑效率显著提高。
实施例4、TMPRSS6基因高效gRNA靶点的筛选
猪TMPRSS6基因信息：编码跨膜丝氨酸蛋白酶6；位于5号染色体；Gene ID为100516673，Sus scrofa。猪TMPRSS6基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。猪基因组DNA中，TMPRSS6基因具有18个外显子，其中编码外显子为17个，TMPRSS6基因第1编码外显子及其上下游各300bp如SEQ ID NO：9所示。
质粒pKG-GE3，为环形质粒，如专利申请202010084343.6中的SEQ ID NO：2所示。专利申请202010084343.6中的SEQ ID NO：2中，第395-680位核苷酸组成CMV增强子，第682-890位核苷酸组成EF1a启动子，第986-1006位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1016-1036位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第1037-5161位核苷酸编码Cas9蛋白，第5162-5209位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5219-5266位核苷酸编码核定位信号(NLS)，第5276-5332位核苷酸编码自剪切多肽P2A(自剪切多肽P2A的氨基酸序列为“ATNFSLLKQAGDVEENPGP”，发生自剪切的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第5333-6046位核苷酸编码EGFP蛋白，第6056-6109位核苷酸编码自裂解多肽T2A(自裂解多肽T2A的氨基酸序列为“EGRGSLLTCGDVEENPGP”，发生自裂解的断裂位置为C端开始第一个氨基酸残基和第二个氨基酸残基之间)，第6110-6703位核苷酸编码Puromycin蛋白(简称Puro蛋白)，第6722-7310位核苷酸组成WPRE序列元件，第7382-7615位核苷酸组成3’LTR序列元件，第7647-7871位核苷酸组成bGH poly(A)signal序列元件。专利申请202010084343.6中的SEQ ID NO：2中，第911-6706位核苷酸形成融合基因，表达融合蛋白。由于自剪切多肽P2A和自裂解多肽T2A的存在，融合蛋白自发形成如下三个蛋白：具有Cas9蛋白的蛋白、具有EGFP蛋白的蛋白和具有Puro蛋白的蛋白。
pKG-U6gRNA载体即质粒pKG-U6gRNA，为环形质粒，如专利申请202010084343.6中的SEQ ID NO：3所示。专利申请202010084343.6中的SEQ ID NO：3中，第2280-2539位核苷酸组成hU6启动子，第2558-2637位核苷酸用于转录形成gRNA骨架。使用时，将20bp左右的DNA分子(用于转录形成gRNA的靶序列结合区)插入质粒pKG-U6gRNA，形成重组质粒，在细胞中重组质粒转录得到gRNA。
一、TMPRSS6基因预设缺失区域及邻近基因组序列保守性分析
18只初生从江香猪，其中雌性10只(分别命名为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)、雄性8只(分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H)。
TMPRSS6-E1-JDF280：CTGGTCTGTTTCTTTGCCAGG；
TMPRSS6-E1-JDR626：GAAGTGCTCGTCCAAGGTCA；
TMPRSS6-E1-JDF281：TGGTCTGTTTCTTTGCCAGG；
TMPRSS6-E1-JDR673：AGGAACTTGCACTCCCATCG。
用命名为1的猪的耳组织提取基因组作为模板，采用不同引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。电泳图见图5。图5中：组1：采用TMPRSS6-E1-JDF280和TMPRSS6-E1-JDR626组成的引物对；组2：采用TMPRSS6-E1-JDF280和TMPRSS6-E1-JDR673组成的引物对；组3：采用TMPRSS6-E1-JDR281和TMPRSS6-E1-JDR626组成的引物对；组4：采用TMPRSS6-E1-JDR281和TMPRSS6-E1-JDR673组成的引物对。结果表明，优选采用TMPRSS6-E1-JDF280和TMPRSS6-E1-JDR673组成的引物对进行目的片段扩增。
分别以18只猪的基因组DNA为模板，采用TMPRSS6-E1-JDF280和TMPRSS6-E1-JDR673组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。电泳图见图6。回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与公共数据库中的TMPRSS6基因序列进行比对分析。选择18只猪中共有的保守区进行gRNA靶点的设计。
二、筛选靶点
通过筛选NGG(避开可能的突变位点)初步筛选到若干靶点，经过预实验进一步从中筛选到4个靶点。
4个靶点分别如下：
TMPRSS6-E1-gRNA1：GAGCCAGACGGAGGTAGTCG；
TMPRSS6-E1-gRNA2：GGGAATGTTCAGGCCCCCCA；
TMPRSS6-E1-gRNA3：TGACGGAGGTGATGGCGAGG；
TMPRSS6-E1-gRNA4：CACTGAAGCCAGCACGACCA。
三、制备gRNA
取质粒pKG-U6gRNA，用限制性内切酶BbsI进行酶切，回收载体骨架(约3kb的线性大片段)。
分别合成TMPRSS6-E1-gRNA1-S和TMPRSS6-E1-gRNA1-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA1)。质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA1)表达SEQ ID NO：10所示的sgRNATMPRSS6-E1-gRNA1。
sgRNATMPRSS6-E1-gRNA1(SEQ ID NO：10)：
GAGCCAGACGGAGGUAGUCGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成TMPRSS6-E1-gRNA2-S和TMPRSS6-E1-gRNA2-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA2)。质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA2)表达SEQ ID NO：11所示的sgRNATMPRSS6-E1-gRNA2。
sgRNATMPRSS6-E1-gRNA2(SEQ ID NO：11)：
GGGAAUGUUCAGGCCCCCCAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成TMPRSS6-E1-gRNA3-S和TMPRSS6-E1-gRNA3-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA3)。质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA3)表达SEQ ID NO：12所示的sgRNATMPRSS6-E1-gRNA3。
sgRNATMPRSS6-E1-gRNA3(SEQ ID NO：12)：
UGACGGAGGUGAUGGCGAGGguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
分别合成TMPRSS6-E1-gRNA4-S和TMPRSS6-E1-gRNA4-A，然后混合并进行退火，得到具有粘性末端的双链DNA分子。将具有粘性末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA4)。质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA4)表达SEQ ID NO：13所示的sgRNATMPRSS6-E1-gRNA4。
sgRNATMPRSS6-E1-gRNA4(SEQ ID NO：13)：
CACUGAAGCCAGCACGACCAguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu
TMPRSS6-E1-gRNA1-S：caccGAGCCAGACGGAGGTAGTCG；
TMPRSS6-E1-gRNA1-A：aaacCGACTACCTCCGTCTGGCTC；
TMPRSS6-E1-gRNA2-S：caccGGGAATGTTCAGGCCCCCCA；
TMPRSS6-E1-gRNA2-A：aaacTGGGGGGCCTGAACATTCCC；
TMPRSS6-E1-gRNA3-S：caccgTGACGGAGGTGATGGCGAGG；
TMPRSS6-E1-gRNA3-A：aaacCCTCGCCATCACCTCCGTCAc；
TMPRSS6-E1-gRNA4-S：caccgCACTGAAGCCAGCACGACCA；
TMPRSS6-E1-gRNA4-A：aaacTGGTCGTGCTGGCTTCAGTGc。
TMPRSS6-E1-gRNA1-S、TMPRSS6-E1-gRNA1-A、TMPRSS6-E1-gRNA2-S、TMPRSS6-E1-gRNA2-A、TMPRSS6-E1-gRNA3-S、TMPRSS6-E1-gRNA3-A、TMPRSS6-E1-gRNA4-S、TMPRSS6-E1-gRNA4-A均为单链DNA分子。
四、不同靶点组合的编辑效率比较
1、共转染
第一组：将质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA1)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA1)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第二组：将质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA2)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA2)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第三组：将质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA3)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA3)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第四组：将质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA4)、质粒pKG-GE3共转染猪原代成纤维细胞。配比：约20万个猪原代成纤维细胞：0.92μg质粒pKG-U6gRNA(TMPRSS6-E1-gRNA4)：1.08μg质粒pKG-GE3。
第五组：猪原代成纤维细胞，同等电转参数不加质粒进行电转操作。
共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TM transfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养12-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。电转后培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，裂解细胞，提取基因组DNA，采用TMPRSS6-E1-JDF280和TMPRSS6-E1-JDR673组成的引物对进行PCR扩增，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳。检测细胞靶基因突变情况。
将目的产物切胶回收后送测序公司进行测序，然后将测序结果利用网页版Synthego ICE工具分析测序峰图得出不同靶点的基因编辑效率。第一组至第四组的基因编辑效率依次为28％、56％、33％、35％，第五组未发生基因编辑。结果表明，TMPRSS6-E1-gRNA2和TMPRSS6-E1-gRNA4编辑效率较高。
实施例5、制备TMPRSS6基因敲除的从江香猪单细胞克隆
选用实施例4中筛到的两个高效gRNA靶点(TMPRSS6-E1-gRNA2和TMPRSS6-E1-gRNA4)。
一、制备gRNA
1、制备TMPRSS6-T7-gRNA2转录模板和TMPRSS6-T7-gRNA4转录模板
TMPRSS6-T7-gRNA2转录模板为双链DNA分子，如SEQ ID NO：14所示。
TMPRSS6-T7-gRNA4转录模板为双链DNA分子，如SEQ ID NO：15所示。
2、体外转录得到gRNA
取TMPRSS6-T7-gRNA2转录模板，采用Transcript Aid T7 High YieldTranscription Kit(Fermentas，K0441)进行体外转录，然后用MEGA clearTMTranscriptionClean-Up Kit(Thermo，AM1908)进行回收纯化，得到TMPRSS6-gRNA2。TMPRSS6-gRNA2为单链RNA，如SEQ ID NO：16所示。
TMPRSS6-gRNA2(SEQ ID NO：16)：
GGGGGAAUGUUCAGGCCCCCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
取TMPRSS6-T7-gRNA4转录模板，采用Transcript Aid T7 High YieldTranscription Kit(Fermentas，K0441)进行体外转录，然后用MEGA clearTMTranscriptionClean-Up Kit(Thermo，AM1908)进行回收纯化，得到TMPRSS6-gRNA4。TMPRSS6-gRNA4为单链RNA，如SEQ ID NO：17所示。
TMPRSS6-gRNA4(SEQ ID NO：17)：
GGCACUGAAGCCAGCACGACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
二、转染猪原代成纤维细胞
1、将TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和NCN蛋白共转染猪原代成纤维细胞。配比：约10万个猪原代成纤维细胞：1μg TMPRSS6-gRNA2：1μg TMPRSS6-gRNA4：4μg NCN蛋白。共转染采用电击转染的方式，采用哺乳动物核转染试剂盒(Neon kit,Thermofisher)与Neon TMtransfection system电转仪(参数设置为：1450V、10ms、3pulse)。
2、完成步骤1后，采用完全培养液培养16-18小时，然后更换新的完全培养液进行培养。电转后培养总时间为48小时。
3、完成步骤2后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，然后用完全培养液洗涤，然后用完全培养液重悬，然后分别挑取各个单克隆转移到96孔板中(每个孔1个细胞，每个孔中装有100μl完全培养液)，培养2周(每2-3天更换新的完全培养液)。
4、完成步骤3后，采用胰蛋白酶消化并收集细胞(每孔得到的细胞，约2/3接种到装有完全培养液的6孔板中，剩余的1/3收集在1.5mL离心管中)。
5、取步骤4的6孔板，培养直至细胞长至80％汇合度，采用胰蛋白酶消化并收集细胞，使用细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO，体积比)将细胞冻存。
6、取步骤4的离心管，取细胞，进行细胞裂解并提取基因组DNA，采用TMPRSS6-E1-JDF280和TMPRSS6-E1-JDR673组成的引物对进行PCR扩增，然后进行电泳。将猪原代成纤维细胞作为野生型对照(WT)。
7、完成步骤6后，回收PCR扩增产物并测序。
猪原代成纤维细胞的测序结果只有一种，其基因型为野生型(也可称为纯合野生型)。如果某一单细胞克隆的测序结果有两种，一种与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，另一种与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为杂合型；如果某一单细胞克隆的测序结果为两种，均与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为双等位基因不同突变型；如果某一单细胞克隆的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该单细胞克隆的基因型为双等位基因相同突变型；如果某一单细胞克隆的测序结果为一种，且与猪原代成纤维细胞的测序结果一致，该单细胞克隆的基因型为野生型(也可称为纯合野生型)。
结果见表1。编号为1、6、14、32、35、38、47的单细胞克隆的基因型为野生型。编号为2、3、4、5、8、9、10、11、12、13、15、18、20、22、23、24、26、27、29、33、34、40、41、43、44、46、50、51的单细胞克隆的基因型为杂合型。编号为16、36、37、42、45的单细胞克隆的基因型为双等位基因不同突变型。编号为7、17、19、21、25、28、30、31、39、48、49的单细胞克隆的基因型为双等位基因相同突变型。得到TMPRSS6基因编辑单细胞克隆的比率为86.3％。
示例性的测序比对结果如图7至图10。图7是克隆号为1的正向测序与野生型序列的比对结果，判定为野生型。图8是克隆号为12的正向测序与野生型序列的比对结果，判定为杂合型。图9是克隆号为36的正向测序和反向测序同时与野生型序列的比对结果，为双等位基因不同突变型。图10是克隆号为17的正向测序和反向测序同时与野生型序列的比对结果，为双等位基因相同突变型。
表1 TMPRSS6基因编辑单细胞克隆的基因型测定结果
Figure BDA0003348927880000151
Figure BDA0003348927880000161
表1中杂合型、双等位基因相同突变型及双等位基因不同突变型的单细胞克隆均为目标单细胞克隆。将细胞作为核移植供体细胞进行体细胞克隆，可以得到克隆猪，即为IRIDA模型猪。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 南京启真基因工程有限公司
<120> 构建TMPRSS6基因突变的缺铁性贫血猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用
<130> GNCYX213046
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9974
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140
tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520
cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640
gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700
catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760
tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820
ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880
tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940
ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000
aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060
gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120
tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180
acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240
cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300
cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 3360
gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 3420
cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 3480
gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540
tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600
atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720
gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780
tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840
cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900
tcggtatcgt cgtatcccac taccgagatg tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960
atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020
atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080
tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140
cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200
aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 4260
ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320
tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380
tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440
gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500
gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 4560
gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 4620
ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 4680
taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 4740
ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 4800
atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860
tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc 4920
gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 4980
gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 5040
aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 5100
cgatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 5160
ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gaaacaaagc 5220
actattgcac tggcactctt accgttactg tttacccctg tgacaaaagc catgagcgat 5280
aaaattattc acctgactga cgacagtttt gacacggatg tactcaaagc ggacggggcg 5340
atcctcgtcg atttctgggc agagtggtgc ggtccgtgca aaatgatcgc cccgattctg 5400
gatgaaatcg ctgacgaata tcagggcaaa ctgaccgttg caaaactgaa catcgatcaa 5460
aaccctggca ctgcgccgaa atatggcatc cgtggtatcc cgactctgct gctgttcaaa 5520
aacggtgaag tggcggcaac caaagtgggt gcactgtcta aaggtcagtt gaaagagttc 5580
ctcgacgcta acctggccgg ttctggttct ggccatatgc accatcatca tcatcatgac 5640
gatgacgata agatgcccaa aaagaaacga aaggtgggta tccacggagt cccagcagcc 5700
gacaaaaaat atagcatcgg cctggacatc ggtaccaaca gcgttggctg ggcagtgatc 5760
actgatgaat acaaagttcc atccaaaaaa tttaaagtac tgggcaacac cgaccgtcac 5820
tctatcaaaa aaaacctgat tggtgctctg ctgtttgaca gcggcgaaac tgctgaggct 5880
acccgtctga aacgtacggc tcgccgtcgc tacactcgtc gtaaaaaccg catctgttat 5940
ctgcaggaaa ttttctctaa cgaaatggca aaagttgatg atagcttctt tcatcgtctg 6000
gaagagagct tcctggtgga agaagataaa aaacacgaac gtcacccgat tttcggtaac 6060
attgtggatg aggttgccta ccacgagaaa tatccgacca tctaccatct gcgtaaaaaa 6120
ctggttgata gcactgacaa agcggatctg cgtctgatct acctggctct ggcacacatg 6180
atcaaattcc gtggtcactt cctgatcgaa ggtgatctga accctgataa ctccgacgtg 6240
gacaaactgt tcattcagct ggttcagacc tataaccagc tgttcgaaga aaacccgatc 6300
aacgcgtccg gtgtagacgc taaggcaatt ctgtctgcgc gtctgtctaa gtctcgtcgt 6360
ctggaaaacc tgattgcgca actgccaggt gaaaagaaaa acggcctgtt cggcaatctg 6420
atcgccctgt ccctgggtct gactccgaac tttaaatcca actttgacct ggcggaagat 6480
gccaagctgc agctgagcaa agatacctat gacgatgacc tggataacct gctggcacag 6540
atcggtgatc agtatgccga tctgttcctg gccgcgaaaa acctgtctga tgcgattctg 6600
ctgtctgata tcctgcgcgt taacactgaa attactaaag cgccgctgag cgcatccatg 6660
attaaacgtt acgatgaaca ccaccaggat ctgaccctgc tgaaagcgct ggtgcgtcag 6720
cagctgccgg aaaaatacaa ggagatcttc ttcgaccaga gcaaaaacgg ttacgcgggc 6780
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cagcgtacct tcgataacgg ttccatcccg catcagattc atctgggcga actgcacgct 6960
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ctgccgaacg agaaagtgct gccgaaacac tctctgctgt acgagtactt cactgtgtac 7260
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ggtgagcaaa aaaaagcaat cgtggatctg ctgttcaaaa ccaaccgtaa agtaaccgtg 7380
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ctgactttca aagaagacat ccagaaagca caggtttccg gccagggtga ctctctgcac 7860
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gaaatggcac gtgaaaacca gacgacccag aaaggtcaga aaaactctcg tgaacgcatg 8040
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attatgaact ttttcaaaac cgaaatcacc ctggcgaatg gtgaaattcg taaacgcccg 8880
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tccgttctgg tggtagccaa agttgagaaa ggtaaaagca aaaaactgaa atccgtaaag 9180
gaactgctgg gtattactat catggagcgt agctccttcg aaaaaaaccc gatcgatttt 9240
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actagcataa ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg 9960
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<211> 1547
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Pro Val Thr Lys Ala Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp
20 25 30
Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp
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Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu
50 55 60
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Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly
85 90 95
Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys
100 105 110
Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn
115 120 125
Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His His Asp
130 135 140
Asp Asp Asp Lys Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Ile His Gly
145 150 155 160
Val Pro Ala Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr
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Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser
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Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys
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210 215 220
Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn
225 230 235 240
Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val
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Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu
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Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu
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305 310 315 320
Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp
325 330 335
Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val
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355 360 365
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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565 570 575
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595 600 605
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met
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Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp
180 185 190
Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn
195 200 205
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Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu
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Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp
275 280 285
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545 550 555 560
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580 585 590
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595 600 605
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Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr
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675 680 685
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900 905 910
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930 935 940
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Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr
1205 1210 1215
Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala
1220 1225 1230
Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val
1235 1240 1245
Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro
1250 1255 1260
Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr
1265 1270 1275 1280
Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile
1285 1290 1295
Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His
1300 1305 1310
Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe
1315 1320 1325
Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr
1330 1335 1340
Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala
1345 1350 1355 1360
Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp
1365 1370 1375
Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala
1380 1385 1390
Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1395
<210> 4
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcttgtcgg actcttcgct attacgccag ctggcgaagg gggatgtgct gcaaggcgat 60
taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgtta ggaaattaat acgactcact 120
ataggagagc acagtcagcc tggcggtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 180
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttt 225
<210> 5
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggcttgtcgg actcttcgct attacgccag ctggcgaagg gggatgtgct gcaaggcgat 60
taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgtta ggaaattaat acgactcact 120
ataggcttcc agaattggat ctccggtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 180
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttt 225
<210> 6
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggagagcaca gucagccugg cgguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcuu uu 102
<210> 7
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcuuccaga auuggaucuc cgguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcuu uu 102
<210> 8
<211> 803
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 8
Met Pro Met Ala Glu Ala Pro Gln Ala Ala Ala Gly Gln Gly Asp Gly
1 5 10 15
Gly Asp Gly Glu Glu Ala Glu Pro Glu Gly Met Phe Arg Pro Pro Lys
20 25 30
Asp Ser Lys Arg Lys Val Arg Asp Tyr Leu Arg Leu Ala Pro Leu Trp
35 40 45
Leu Ala Leu Val Val Leu Ala Ser Val Gly Val Leu Leu Trp Tyr Phe
50 55 60
Leu Gly Tyr Lys Ala Glu Val Thr Val Ser Gln Val Tyr Ser Gly Ser
65 70 75 80
Leu Arg Val Leu Asn Arg His Phe Ser Gln Asp Leu Ala Arg Arg Glu
85 90 95
Ser Ser Ala Phe Arg Ser Glu Thr Ala Lys Ala Gln Lys Met Leu Lys
100 105 110
Glu Leu Ile Ala Ser Thr Arg Leu Gly Thr Tyr Tyr Asn Ser Ser Ser
115 120 125
Val Tyr Ser Phe Gly Glu Gly Pro Leu Thr Cys Phe Phe Trp Phe Ile
130 135 140
Leu Gln Ile Pro Glu His Arg Arg Pro Met Leu Ser Pro Asp Val Val
145 150 155 160
Arg Ala Leu Leu Val Glu Ala Leu Leu Ser Thr Ala Asn Ser Ser Val
165 170 175
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Arg Ala Glu Tyr Glu Val Asp Pro Glu
180 185 190
Gly Leu Val Ile Leu Glu Ala Ser Val Lys Asp Ile Val Ala Leu Asn
195 200 205
Ser Thr Leu Gly Cys Tyr Arg Tyr Ser Tyr Val Gly Arg Gly Gln Val
210 215 220
Leu Arg Leu Lys Gly Pro Asp His Leu Ala Ser Ser Cys Leu Trp His
225 230 235 240
Leu Gln Gly Pro Glu Asp Leu Met Leu Lys Leu Arg Leu Glu Trp Thr
245 250 255
Leu Ala Asp Cys Arg Asp Arg Leu Ala Met Tyr Asp Val Ala Gly Pro
260 265 270
Leu Glu Gly Arg Leu Ile Thr Ser Val Tyr Gly Cys Ser Arg Gln Glu
275 280 285
Pro Val Leu Glu Val Leu Ala Ser Gly Ala Val Met Ala Val Val Trp
290 295 300
Lys Lys Gly Leu Tyr Ser Tyr Cys Asp Pro Phe Val Leu Ser Val Gln
305 310 315 320
Pro Val Asp Phe Gln Ala Cys Glu Val Asn Leu Thr Leu Glu Asp Arg
325 330 335
Leu Glu Pro Gln Gly Ile Leu Ser Thr Pro Tyr Phe Pro Ser Tyr Tyr
340 345 350
Ser Pro Ser Thr His Cys Ser Trp His Phe Thr Val Pro Ser Leu Asp
355 360 365
Tyr Gly Leu Ala Leu Trp Phe Asp Ala Tyr Ala Leu Arg Arg Gln Lys
370 375 380
Tyr Asp Met Pro Cys Thr Gln Gly Gln Trp Thr Ile Gln Asn Arg Arg
385 390 395 400
Leu Cys Gly Leu Arg Thr Leu Gln Pro Tyr Ala Glu Arg Ile Pro Val
405 410 415
Val Ala Thr Ala Gly Ile Thr Ile Asn Phe Thr Ser Gln Ile Ser Leu
420 425 430
Thr Gly Pro Gly Val Gln Val His Tyr Ser Leu Tyr Asn Gln Ser Asp
435 440 445
Pro Cys Pro Gly Glu Phe Leu Cys Ser Val Asn Gly Leu Cys Val Pro
450 455 460
Ala Cys Asp Gly Val Lys Asp Cys Pro Asn Gly Leu Asp Glu Arg Asn
465 470 475 480
Cys Val Cys Arg Ala Thr Phe Gln Cys Gln Glu Asp Ser Thr Cys Ile
485 490 495
Ser Leu Ser Arg Val Cys Asp Arg Gln Pro Asp Cys Leu Asn Gly Ser
500 505 510
Asp Glu Glu Gln Cys Gln Glu Gly Val Pro Cys Gly Thr Phe Thr Phe
515 520 525
Gln Cys Glu Asp Arg Ser Cys Val Lys Lys Pro Asn Pro Gln Cys Asp
530 535 540
Gly His Pro Asp Cys Arg Asp Gly Ser Asp Glu Gln His Cys Asp Cys
545 550 555 560
Gly Leu Gln Gly Pro Ser Gly Arg Ile Val Gly Gly Ala Val Ser Ser
565 570 575
Glu Gly Glu Trp Pro Trp Gln Ala Ser Leu Gln Val Arg Gly Arg His
580 585 590
Ile Cys Gly Gly Ala Leu Ile Ala Asp Arg Trp Val Ile Thr Ala Ala
595 600 605
His Cys Phe Gln Glu Asp Ser Met Ala Ser Pro Ala Leu Trp Thr Val
610 615 620
Tyr Leu Gly Lys Val Trp Gln Ser Ser Arg Trp Pro Gly Glu Val Ser
625 630 635 640
Phe Lys Val Ser Arg Leu Leu Leu His Pro Tyr His Glu Glu Asp Ser
645 650 655
His Asp Tyr Asp Val Ala Leu Leu Gln Leu Asp His Pro Val Val Arg
660 665 670
Ser Ala Ala Val His Pro Val Cys Leu Pro Ala Arg Ser His Phe Phe
675 680 685
Glu Pro Gly Leu His Cys Trp Ile Thr Gly Trp Gly Ala Leu Arg Glu
690 695 700
Gly Gly Pro Thr Ser Asn Gly Leu Gln Lys Val Asp Val Gln Leu Ile
705 710 715 720
Pro Gln Asp Leu Cys Ser Glu Ala Tyr Arg Tyr Gln Val Thr Pro Arg
725 730 735
Met Leu Cys Ala Gly Tyr Arg Arg Gly Lys Lys Asp Ala Cys Gln Gly
740 745 750
Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys Glu Pro Ser Gly Arg Trp Phe
755 760 765
Leu Ala Gly Leu Val Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Arg Pro Asn Tyr
770 775 780
Phe Gly Val Tyr Thr Arg Ile Thr Gly Val Ile Gly Trp Ile Gln Gln
785 790 795 800
Val Leu Thr
<210> 9
<211> 796
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 9
caggctggga gttcccgttg tggctcagcg ggttaagaac acgactagta tccatgagga 60
tgcaggtttg atccctggcc ttgctcagcg gattgggtgt tgcccccagc tatgtgtagg 120
ttgcaaattc agctcagatc tggcattgct gtggctgtgg tgtaggctgg cagctgtagc 180
tctgatttga cccctagcct gggaacttcc atatgcagca ggtgtggccc taaaaaaaaa 240
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tggcaggctg tttccagccc tggtctgttt ctttgccagg 300
atgcccatgg ccgaggcccc ccaagcggct gctgggcagg gtgacggagg tgatggcgag 360
gaggccgagc cggagggaat gttcaggccc cccaaggatt ccaagagaaa agtccgcgac 420
tacctccgtc tggctccgct gtggctggcc ctggtcgtgc tggcttcagt gggggttctg 480
ctctggtatt tcctaggtaa ctgtgtgggc ccctgggagg ggcagccggg gaggacttgg 540
ggtgactgag ggggcgcagc aggacagacc cgattccagg ctcagcaaca cctagacacc 600
cctgggtgac cttggacgag cacttctccc tgagtctccc ttcctgtcct gggcgatggg 660
agtgcaagtt ccttgctggg gccaagtgtc ccctgctccc agcagctggg gaagaagtgc 720
tctcccagca cccagtcctt ctgaactaac aagtcaaagg agagtaatca ttgcttcccc 780
ttcccacagc cctcct 796
<210> 10
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagccagacg gagguagucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 11
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggaauguuc aggcccccca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 12
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ugacggaggu gauggcgagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 13
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cacugaagcc agcacgacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 14
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcttgtcgg actcttcgct attacgccag ctggcgaagg gggatgtgct gcaaggcgat 60
taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgtta ggaaattaat acgactcact 120
atagggggaa tgttcaggcc ccccagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 180
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttt 225
<210> 15
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggcttgtcgg actcttcgct attacgccag ctggcgaagg gggatgtgct gcaaggcgat 60
taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgtta ggaaattaat acgactcact 120
ataggcactg aagccagcac gaccagtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc 180
tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg ctttt 225
<210> 16
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggggaaugu ucaggccccc caguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcuu uu 102
<210> 17
<211> 102
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggcacugaag ccagcacgac caguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcuu uu 102

Claims (13)

1.TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和NCN蛋白在制备试剂盒中的应用；
所述TMPRSS6-gRNA2为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：16中第3-22位核苷酸所示；所述TMPRSS6-gRNA4为sgRNA，其靶序列结合区如SEQ ID NO：17中第3-22位核苷酸所示；所述NCN蛋白为Cas9蛋白或具有Cas9蛋白的融合蛋白；
所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备缺铁性贫血模型猪；(c)制备缺铁性贫血细胞模型或缺铁性贫血组织模型或缺铁性贫血器官模型。
2.TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和PRONCN蛋白在制备试剂盒中的应用；
TMPRSS6-gRNA2为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA2；TMPRSS6-gRNA4为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA4；
所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；
所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备缺铁性贫血模型猪；(c)制备缺铁性贫血细胞模型或缺铁性贫血组织模型或缺铁性贫血器官模型。
3.TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和特异质粒在制备试剂盒中的应用；
TMPRSS6-gRNA2为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA2；TMPRSS6-gRNA4为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA4；
所述特异质粒自上游至下游依次包括如下元件：启动子、操纵子、核糖体结合位点、PRONCN蛋白的编码基因、终止子；所述PRONCN蛋白自上游至下游依次包括如下元件：信号肽、分子伴侣蛋白、蛋白标签、蛋白酶酶切位点、核定位信号、Cas9蛋白、核定位信号；
所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备缺铁性贫血模型猪；(c)制备缺铁性贫血细胞模型或缺铁性贫血组织模型或缺铁性贫血器官模型。
4.一种试剂盒，包括TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和NCN蛋白；
TMPRSS6-gRNA2为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA2；TMPRSS6-gRNA4为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA4；NCN蛋白为权利要求1中所述的NCN蛋白；
所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备缺铁性贫血模型猪；(c)制备缺铁性贫血细胞模型或缺铁性贫血组织模型或缺铁性贫血器官模型。
5.一种试剂盒，包括TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和PRONCN蛋白；
TMPRSS6-gRNA2为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA2；TMPRSS6-gRNA4为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA4；PRONCN蛋白为权利要求2中所述的PRONCN蛋白；
所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备缺铁性贫血模型猪；(c)制备缺铁性贫血细胞模型或缺铁性贫血组织模型或缺铁性贫血器官模型。
6.一种试剂盒，包括TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和特异质粒；
TMPRSS6-gRNA2为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA2；TMPRSS6-gRNA4为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA4；特异质粒为权利要求3中所述的特异质粒；
所述试剂盒的用途为如下(a)或(b)或(c)：(a)制备重组细胞；(b)制备缺铁性贫血模型猪；(c)制备缺铁性贫血细胞模型或缺铁性贫血组织模型或缺铁性贫血器官模型。
7.一种制备重组细胞的方法，包括如下步骤：将TMPRSS6-gRNA2、TMPRSS6-gRNA4和NCN蛋白共转染猪细胞，得到重组细胞；TMPRSS6-gRNA2为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA2；TMPRSS6-gRNA4为权利要求1中所述的TMPRSS6-gRNA4；NCN蛋白为权利要求1中所述的NCN蛋白。
8.如权利要求1所述的应用或如权利要求4所述的试剂盒或如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述NCN蛋白如SEQ ID NO：3所示。
9.如权利要求8所述的应用或试剂盒或方法，其特征在于：
所述NCN蛋白的制备方法包括如下步骤：
(1)将质粒pKG-GE4导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌；
(2)采用液体培养基30℃培养所述重组菌，然后加入IPTG并25℃诱导培养，然后收集菌体；
(3)将收集的菌体进行菌体破碎，收集粗蛋白溶液；
(4)采用亲和层析从所述粗蛋白溶液中纯化具有His6标签的融合蛋白；
(5)采用具有His6标签的肠激酶酶切具有His6标签的融合蛋白，然后采用Ni-NTA树脂去除具有His6标签的蛋白，得到纯化的NCN蛋白；
质粒pKG-GE4中具有SEQ ID NO：1中第5209-9852位核苷酸所示的融合基因。
10.权利要求7或8或9所述方法制备得到的重组细胞。
11.权利要求10所述重组细胞在制备缺铁性贫血模型猪中的应用。
12.利用权利要求10所述重组细胞所制备的缺铁性贫血模型猪的猪组织、猪器官或猪细胞。
13.权利要求10所述重组细胞、权利要求12所述猪组织、权利要求12所述猪器官、权利要求12所述猪细胞或者利用权利要求10所述重组细胞所制备的缺铁性贫血模型猪的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：
(d1)筛选治疗缺铁性贫血的药物；
(d2)进行缺铁性贫血药物的药效评价；
(d3)进行缺铁性贫血的基因治疗和/或细胞治疗的疗效评价；
(d4)研究缺铁性贫血的发病机制。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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