KR101307880B1 - 폴리진을 사용한 멀티단백질 복합체의 재조합 발현 - Google Patents

폴리진을 사용한 멀티단백질 복합체의 재조합 발현 Download PDF

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Abstract

본 발명은 각 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF) 내에 각각 3 이상의 생물학적 활성 폴리펩티드를 코딩하는 2 이상의 폴리진을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드로서 폴리진을 구성하는 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 2 이상은 비-바이러스 기원이며, 폴리진을 구성하는 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 2 이상은 상기 폴리진의 유전자에 의해 암호화된 1 이상의 다른 폴리펩티드와 적어도 일시적으로 상호작용할 수 있으며, 또 각 폴리진을 구성하는 유전자들은 1 이상의 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 서열 및/또는 1 이상의 자가 절단성 펩티드를 코딩하는 서열에 의해 서로 접속되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리진에 의해 암호화된 폴리단백질에도 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 함유하는 숙주 세포 및/또는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터에 의해 형질전환된 비-인간 트랜스제닉(transgenic) 동물이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드의 제조방법 및 멀티단백질 복합체의 제조방법에도 관한 것이다. 본 발명의 양태는 유전자 요법, 약물 후보 스크리닝(screening), 백신 생산 및 구조 연구를 위한 멀티단백질 복합체의 결정화에 특히 유용하다.
멀티단백질, 폴리진, 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터,

Description

폴리진을 사용한 멀티단백질 복합체의 재조합 발현{Recombinant expression of multiprotein complexes using polygenes}
본 발명은 각 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF) 내에 각각 3 이상의 생물학적 활성 폴리펩티드를 코딩하는 2 이상의 폴리진(polygene)을 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드로서, 폴리진을 구성하는 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 2 이상은 비-바이러스 기원이며, 폴리진을 구성하는 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 2 이상은 상기 폴리진의 유전자에 의해 코딩된 1 이상의 다른 폴리펩티드와 적어도 일시적으로 상호작용할 수 있으며, 또 각 폴리진을 구성하는 유전자들은 1 이상의 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 서열 및/또는 1 이상의 자가 절단성 펩티드를 코딩하는 서열에 의해 서로 접속되어 있는 재조합 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 함유하는 숙주 세포 및/또는 상기 재조합 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터에 의해 형질전환된 비-인간 트랜스제닉(transgenic) 동물이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드의 제조방법 및 멀티단백질(multiprotein) 복합체의 제조방법에도 관한 것이다. 본 발명의 양태는 유전자 요법, 약물 후보 스크리닝(screening), 백신 생산 및 구조 연구를 위한 멀티단백질 복합체의 결정화에 특히 유용하다.
포스트 게놈 시대(post-genomic era)에서 생물학적 연구 노력은 단백질 상호작용 네트워크(인터액톰: interactome)를 밝혀내는데 집중되고 있다. 동정(identified)된 멀티단백질 복합체의 다수는 자세한 분자 생물학적 분석을 할 만큼 충분한 양으로 천연 세포에 존재하지 않기 때문에, 이들의 연구는 대량의 이질성 단백질 생산을 위한 재조합 수법에 의존한다. 재조합 발현법은 멀티단백질 발현 이전에 노동력 및 재료 면에서 과도한 투자를 필요로 하고 또 발현 이후에 변형된 발현 연구를 위한 멀티단백질 성분의 신속한 변형을 위한 유연성을 제공하지 않는다.
멀티서브유닛(multisubunit) 복합체를 얻기 위해 현재 사용되는 몇 개의 재조합 수법이 있다. 단백질들은 예컨대 대장균에서 각자 용해성 형태 또는 봉입체로서 발현되고, 정제된 다음 시험관에서 유사하게 제조된 단백질과 재구성(reconstituted)되어 멀티단백질 복합체를 형성한다. 진핵생물 세포(예컨대 포유동물 또는 효모 세포)는 일시적 발현 실험에서 숙주로서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 시험관내에 효과적인 재구성 프로토콜(protocol)이 존재하는지 여부에 전적으로 의존한다. 이러한 전략은 소형 서브유닛 크기의 보다 간단한 시스템에서 허용가능한 결과를 얻을 수 있지만, 일반적으로 다수의 그리고 또한 대형인 서브유닛을 함유하는 보다 복잡한 멀티단백질 복합체(예컨대 모든 고등 진핵생물에 가까운 - 특히 인간의- 조절 복합체)에는 적용할 수 없다.
공발현(co-expression)은 상술한 바와 같은 시험관내 재구성 전략을 대체할 수 있는 것으로 인정되고 있다. 과거 원핵생물 및 진핵생물 발현 모두에서 몇 가지 공발현계가 개발되었다. 원핵생물 계에서, 공발현은 선택 유전자 모두를 함유하는 단일 플라스미드를 생성하거나 또는 1 또는 2개 유전자를 함유하는 플라스미드 몇 개와 상이한 내성 마커(resistance marker) 및 레플리콘(replicon)을 공형질전환(co-transforming)함으로써 달성할 수 있었다.
진핵생물 세포에서 공발현은 배큘로바이러스(baculovirus) 계를 사용하여 처음에는 몇 개 바이러스와 공감염(co-infection)에 의해 제한된 성공율로, 나중에는 단일 바이러스로부터 얻은 모든 단백질을 발현하는 것에 의해 더 성공적으로 실현되어, 많은 이점을 제공하고 원핵생물 계에 존재하는 몇 가지 제한(비교적 소형의 서브유닛 크기, 확실한(authentic) 가공의 결여, 진핵생물(특히 인간) 단백질의 발현 어려움 등)을 제거하였다. 배큘로바이러스 계의 경우, 단일 바이러스로부터 발현은 수율을 현저히 증가시키는 것으로 밝혀졌지만(Berger et al. (2004) Nature Biotech. 22, 1583-1587; Comment (2004), Nature Biotech. 22, vii, New & Views (2004), Nature Biotech. 22, 152, Research Highlights, Nature Methods 2, 7 (2005); Bertolotti-Ciarlet et al. (2003) Vaccine 21, 3885-3900 참조), 대량 생산을 위한 논리적 요건을 결정적으로 감소시킨다.
멀티단백질 발현의 주요 개선점은 WO 2005/085456 A1호 (PCT/EP2004/013381; Berger et al. (2004) 상기 참조)에 개시된 바와 같이 본 발명자에 의해 제공된 멀티진 발현 카세트를 생성하기 위한 모듈 계(modular system)을 제공하는 것이다. WO 2005/085456 A1호 (PCT/EP2004/013381호)에 개시된 MultiBac 수법은 멀티진 발 현 카세트의 간단한 생성뿐만 아니라 발현 실험의 변형 및 개정을 가능하게 하다(Berger et al. (2004) 상기 참조).
그러나, 특히 다수(6, 7, 8 또는 그 이상)의 서브유닛(진핵생물성, 예컨대 인간의 유전자 조절 복합체의 다수를 구성하는)을 갖는 멀티서브유닛 복합체의 성공적인 발현 및 생체 내 조립에 대한 장애는, 상기 서브유닛의 상대적 발현 수준이 전형적으로 많은 경우 충분히 이해되지 않은 메카니즘(예컨대 전사 및 번역 효율, 단백질 안정성, mRNA 안정성 및 2차 구조 등)을 기본으로 하여 현저히 달라진다는 사실에서 찾을 수 있다. 그 결과, 고유하게 균형이 이루어지지 않은 계에서 최소량으로 발현되는 서브유닛은 전체 복합체 수율을 제한함으로써 멀티서브유닛 복합체 생산 실험의 전체적 성공을 지시할 것이다. 따라서, 전사/번역 기구는 과정에 혼입되지 않는 과량의 다른 성분도 생산할 것이므로 세포성 전사/번역 물질을 소모하게된다. 개별적 발현 수준은 전형적으로 서로에 대해 수 배(예컨대 10배 이상까지) 정도로 다양할 수 있으므로, 특히 4 이상, 즉 5, 6, 8, 10 또는 그 이상의 서브유닛을 갖는 복합체의 경우(예컨대 다수의 진핵생물 유전자 조절 복합체의 경우) 소망하는 멀티서브유닛 복합체의 성공적인 생산이 어려운 손실을 수반한다.
피코르나바이러스 수퍼 그룹의 바이러스는 바이러스 프로테아제의 절단 부위에 의해 또는 자가 절단성 펩티드에 의해 서로 접속된 바이러스 단백질을 포함하는 폴리단백질을 암호화하는 단일 또는 2개의 ORF를 함유하는 센스 방향의 단일 스트랜드 RNA 분자로 구성된 게놈을 갖는다(Ryan et al. (1997) J. Gener. Virol. 78, 699-723에서 리뷰됨).
단백질 복합체를 생산하기 위해 재조합 바이러스를 통한 폴리펩티드를 발현하는 일반적 개념은 TCR(T 세포 수용체): CD3 복합체(Szymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594)의 재구성에 적용되어 왔다. 이들 저자는 2개의 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하였는데, 1개 벡터는 2개의 TCR 서브유닛을 코딩하는 서열을 함유한 반면에, 다른 1개 벡터는 4개의 CD3 서브유닛을 포함하는 폴리단백질을 암호화하였다. 상기 서브유닛들은 아프토바이러스(aphthovirus)로부터 유도된 자가절단성 2A 펩티드 서열에 의해 접속되었다. 이러한 접근법의 1개 단점은 완전한 복합체를 재구성하기 위하여, 2개의 별개의 벡터를 제조하고 또 2회의 형질감염이 필요한 점이다.
바이러스성 폴리단백질 접근법은 헤테로2량체 IL-2 (Kobuho et al. (1999) Vet. Immunol. Immunopathol. 72, 289-302)와 같은 소형 작제물(constructs) 및 배큘로바이러스성 폴리헤드린(polyhedrin) 및 관심을 둔 단백질로부터 유도된 핵 표적 시그널을 포함하는 융합 단백질(US 5,179,007호)에 대한 배큘로바이러스 발현 계에 적용되었다.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 복수의 단백질의 개선된 발현을 위한 신규 계를 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제의 해결은 특허청구범위에 정의된 양태에 의해 제공된다.
특히, 본 발명은 각 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF) 내에 각각 3 이상의 생물학적 활성 폴리펩티드를 코딩하는 2 이상의 폴리진을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리진을 구성하는 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 2 이상은 비-바이러스 기원이며, 폴리진을 구성하는 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 2 이상은 상기 폴리진의 유전자에 의해 암호화된 1 이상의 다른 폴리펩티드와 적어도 일시적으로 상호작용할 수 있으며, 또 각 폴리진을 구성하는 유전자들은 1 이상의 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 서열 및/또는 1 이상의 자가 절단성 펩티드를 코딩하는 서열에 의해 서로 접속되어 있는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 1 이상의 합성 뉴클레오티드 유사체(analogues)를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일쇄 형태 또는 이중쇄 형태로 존재할 수 있다. DNA, 특히 이중쇄 DNA 형태가 특히 바람직하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 폴리뉴클레오티드 작제물은 재조합 유전자 수법에 의해 제조될 수 있다(참고, 예컨대 Sambrook et al. "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).
본 명세서에 사용된 바와 같은 "폴리진"은 단일 ORF에서 3개 이상의 생물학적 활성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열이다. 따라서, 폴리진을 구성하는 각 "유전자"는 폴리펩티드, 특히 특수한, 특히 구조적, 조절적 또는 효소적 작용을 갖는 단백질 또는 그의 단편, 변이체, 돌연변이체 또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열이다. 바람직하게는 폴리펩티드를 암호화하는 "유전자"는 구조적, 조절 또는 효소적 단백질 또는 그의 단편, 변이체, 돌연변이체 또는 유사체를 암호화하는 cDNA의 코딩 영역을 포함하다.
폴리진에 함유된 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 "단편"은 원래 폴리펩티드의 일부 또는 영역, 바람직하게는 완전한 단백질의 작용 중의 적어도 하나를 보유하는 단편이다. 폴리진에 함유된 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 "변이체"는 다른 스플라이싱(접착) 또는 번역후 가공으로 생긴 원래 폴리펩티드의 기능적 또는 비-기능적 유도체 또는 다른 종으로부터 유도된 원래 폴리펩티드의 기능적 또는 비-기능적 등가물인 폴리펩티드를 의미한다. 폴리진에 함유된 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 "돌연변이체"는 1 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 천연적으로 생기는 단백질로부터 유도된 폴리펩티드를 의미한다. 폴리진에 함유된 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 "유사체"는 비-관련 아미노산 서열을 가질 수 있지만 상기 폴리펩티드와 동일한 작용을 하는 원래 폴리펩티드의 기능적 등가물을 의미한다.
따라서, 핵산 수준에서, 유전자 "단편"은 "단편"이 유도되는 원래 유전자의 일부 또는 영역이다. 유전자 "변이체"는 원래 유전자와 비교하여 상이한 종에서 발견되는 서열을 갖거나, 또는 관심을 두고 있는 폴리펩티드의 스플라이싱 변이체 또는 후-번역 가공된 것을 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. "돌연변이체"는 1 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 부가 및/또는 결실에 의해 모 유전자로부터 유도된다. 유전자의 "유사체"는 모 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 기능적 등가물을 아호화한다.
본 발명에 따른 폴리진에서 2 이상의 유전자는 비-바이러스성 기원이다. "비-바이러스성"은 폴리펩티드(기능적 단백질 또는 그의 단편, 변이체, 유사체 또는 돌연변이체를 나타냄)를 암호화하는 핵산 서열이 바이러스의 게놈에서 원래 발견되지 않거나 또는 바이러스 게놈으로부터 유도되지 않는 것을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 폴리진에 포함된 뉴클레오티드 서열은 진핵생물 및/또는 원핵생물로부터 유도된다.
따라서, 본 발명에 따르면, 멀티서브유닛 조립체의 서브유닛(멀티단백질 복합체 또는 대사경로의 구성원 또는 적어도 일시적으로 서로와 적어도 반응할 가능성이 있는 기타 단백질)을 암호화하는 유전자는 2 이상의 오픈 리딩 프레임(OFR)에 존재한다. 조립체의 서브유닛(폴리펩티드)를 암호화하는 서열은 2 이상의 폴리진에 존재하며, 각 폴리진을 구성하는 유전자는 프로테아제 절단 부위(즉, 프로테아제의 인식 부위를 포함하는 서열) 또는 1 이상의 자가 절단 펩티드를 코딩하는 서열(1 이상 있을 수 있음) 에 의해 서로 접속된다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 폴리진을 구성하는 유전자를 연결한 서열에 의해 암호화된 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 보다 바람직하게는, 프로테아제를 암호화하는 유전자는 폴리진의 1 이상의 부분이다.
적합한 프로테아제 절단 부위 및 자가 절단 펩티드는 당업자에게 공지되어 있다(참고: 예컨대 Ryan et al. (1997) J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). 프로테아제 절단 부위의 바람직한 예는 포티바이러스 NIa 프로테아제(예컨대 담배 식각 바이러스(etch virus) 프로테아제), 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1 (P35) 프로테아제, 비오바이러스 NIa 프로테아제, 비오바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 아프토바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 리코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV (벼 텅그로(tungro) 구형 바이러스) 3C상 프로테아제, PYVF (파스닙 황색 반점 바이러스(parsnip yellow fleck virus)) 3C상 프로테아제, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나아제의 절단 부위이다. 높은 절단 엄중성으로 인하여, TEV (담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단부위가 특히 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리진의 유전자는 일반형태 EXXYXQ(G/S)의 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 스트레치(streth)에 의해 연결되며, 상기에서 X는 아미노산(TEV에 의한 절단은 Q와 G 또는 Q와 S 사이에서 생김)을 나타낸다. 가장 바람직한 것은 ENLYFQG 및 ENLYFQS를 암호화하는 링커 뉴클레오티드 서열이다.
바람직한 자가 절단 펩티드(소위 "cis-작용 가수분해성 요소", CHYSEL이라 칭함; 참조: deFelipe (2002) Curr. Gene Ther. 2, 355-378)는 포티바이러스 및 카르디오바이러스 2A 펩티드로부터 유도된다. 특히 바람직한 자가 절단 펩티드는 FMDV (수족구병 바이러스), 말 비염 A 바이러스, 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 및 돼지 테초바이러스(teschovirus)로부터 유도된 2A 펩티드로부터 선택된다.
본 발명의 폴리진에 의해 암호화된 폴리펩티드의 적어도 2개는 폴리진에 의해 암호화된 다른 1개 폴리펩티드와 적어도 일시적으로 상호작용할 수 있거나, 또는 이들은 폴리진에 함유된 유전자에 의해 암호화된 다른 폴리펩티드와 적어도 일시적으로 상호작용할 수 있는 것으로 적어도 추정된다. 폴리펩티드 사이에 형성된 전형적인 "상호작용"은 공유결합, 수소결합, 정전 상호작용 및 반데어발스 상호작용을 포함한다. "일시적" 상호작용은 생분자, 특히 단백질에서는 흔한 것이며 또 전형적으로 효소와 이들의 기질 사이의 상호작용, 수용체와 이들의(작용성 또는 길항작용성) 리간드 사이의 상호작용, 대사경로의 구성원 사이의 상호작용 및 조절(예컨대 유전자 조절) 복합체의 단백질 사이의 상호작용으로 대표된다.
본 발명의 폴리진을 구성하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드는 동일하거나 상이할 수 있다. 따라서, 본 발명의 작제물에 존재하는 각 폴리진은 관심을 두고 있는 단백질을 암호화하는 각 뉴클레오티드 서열의 1 이상의 카피(copy)를 함유할 수 있다. 이렇게 하여, 특히 단백질이 보통 상이한 수준으로 발현되고 및/또는 상이한 화학양론적으로 고분자(macromolecular) 조립체에 존재할 경우, 소망하는 단백질의 최적 발현을 위해 적절한 작제물을 제공할 수 있다. 따라서, 폴리펩티드가 보통 사용되는 계에서 발현이 잘 되지 않는 경우, 2 카피 이상의 상응하는 코딩 서열을 본 발명의 작제물의 1 이상의 폴리진에 통합시킬 수 있다. 폴리펩티드가 이량체, 삼량체 또는 다량체로서 소망하는 복합체로서 존재할 경우 동일한 접근법을 이용할 수 있다. 이렇게 하여, 본 발명의 작제물은 당업자가 발현시키고 및/또는 정제하려고 하는 복합체 또는 다른 고분자 조립체의 요건(발현 수준, 화학양론 등)에 따라서 개별적으로 조립될 수 있다.
폴리진을 구성하는 유전자는 멀티단백질 복합체의 구성원을 암호화하는 유전자 및 대사 경로의 구성원을 암호화하는 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다. 바람직한 멀티단백질 복합체는 전사 인자 복합체; 핵 및/또는 세포 수송에 관여한 복합체와 같은 수송 복합체; 단백질 폴딩(folding) 복합체, 수용체/리간드 복합체, 세포-세포 인식 복합체, 세포자살에 관여한 복합체, 세포 주기 조절 등에 관여한 복합체와 같은 유전자 조절성 단백질 복합체이다. 대사 경로의 구성원은 예컨대 탄수화물 대사(당분해, 포도당신생, 시트르산 주기, 글리코겐 생합성, 갈락토오스 경로, 캘빈 주기 등), 지질 대사(트리아실글리세롤 대사, 지방산의 활성화, 지방산의 β-산화 (짝수 사슬/홀수 사슬), α-산화 경로, 지방산 생합성, 콜레스테롤 생합성 등), 아미노산 대사(글루타메이트 반응, 크렙스-한셀레이트 우레아 주기, 시키메이트 경로, Phe 및 Tyr 생합성, Trp 생합성 등), 에너지 대사 (산화성 인산화, ATP 합성, 광합성, 메탄 대사 등), 핵산 대사 (퓨린 및 피리미딘 생합성 및 분해, DNA 복제 등)의 구성원이다. 멀티단백질 복합체의 구성원 및 대사 경로의 구성원은 예컨대 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 http://biocarta.com/genes/index.asp 및 G.Michal (ed.) Biochemical Pathways, 1. edition, John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, USA, 1999로부터 입수할 수 있다.
본 발명에 따른 각 폴리진은 3 이상의 유전자, 즉 생물학적 활성 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 함유한다. 보다 바람직한 것은 4, 5, 6 또는 그 이상의 단백질을 암호화하는 폴리진이다. 상술한 바와 같이, 폴리펩티드를 연결하는 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제는 1 이상의 폴리진에 의해 암호화된다.
바람직한 양태에 따르면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 폴리진의 하나에 기능적으로 연결된 2 이상의 프로모터 서열을 함유하므로, 폴리진의 발현을 조절할 수 있다. 본 발명의 작제물에 적합한 프로모터는 polh, p10 및 pXIV 베리 레이트(very late) 배큘로바이러스 프로모터, vp39 배큘로바이러스 후기(late) 프로모터, vp39polh 배큘로바이러스 레이트/베리 레이트 프로모터, PCap / polh, pcna, etl, p35, da26 배큘로바이러스 어얼리 프로모터; CMV, SV40, UbC, EF-1α, RSVLTR, MT, PDS47, Ac5, PGAL 및 PADH 로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 프로모터 서열은 모든 폴리진에 대하여 동일하거나, 또는 상이한 프로모터가 상이한 폴리진에 대해 선택될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 폴리진을 함유하는 각 ORF은 SV40, HSVtk 또는 BGH (bovine growth hormone: 소의 생장 호르몬)과 같은 터미네이터(terminator) 서열과 접하고 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 인헨서(enhancer) 또는 서프레서(suppressor) 서열과 같은 다른 조절 서열을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 벡터 또는 숙주 세포에 통합하기 위한 1 이상의 부위를 함유하는 것이 또한 바람직하다. 이러한 통합 부위는 폴리뉴클레오티드를 벡터 (바이러스와 같은) 및 숙주 세포(예컨대 진핵생물 숙주 세포)에 유리하게 게놈 또는 일시적 통합하기 위한 것이다. 게놈 통합용 부위가 더 바람직하다.
특히 바람직한 통합 부위는 폴리뉴클레오티드의 바이러스로의 통합에 적합한 것이다. 보다 바람직하게는, 통합 부위는 아데노바이러스, 아데노 결합된 바이러스(AAV), 자동 파르보바이러스, 단순포진 바이러스(HSV), 레트로바이러스, 라디노바이러스, 엣스타인-바르 바이러스, 렌티바이러스, 셈리키 숲 바이러스 및 배큘로바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스에 폴리뉴클레오티드를 통합하기에 적합하다.
더욱 바람직하게는, 상기 통합 부위는 포유동물(인간 세포, 예컨대 HeLa, Huh7, HEK293, HepG2, KATO-III, IMR32, MT-2, 췌장 β 세포, 각질세포, 골수 섬유모세포, CHP212, 일차 신경 세포, W12, SK-N-MC, 사오스-2, WI38, 일차 간세포, FLC3, 13TK-, DLD-1, 제대혈 정맥 세포, 배아 폐 섬유모세포, 일차 이마 섬유모세포, 골육종암 세포, MRC5, MG63 세포 등), 돼지(CPL, FS-13, PK-15) 세포, 소 (MDB, BT) 세포, 양(FLL-YFT) 세포, 씨. 엘레간스(C. elegans) 세포, 효모 (에스. 세레비시아애(S. cerevisiae), 에스. 폼베(S. pombe), 씨, 알비칸스(C. albicans), 피. 파스토리스(P. pastoris)) 세포, 및 곤충 세포(에스. 프루기페르다(S. frugiperda), 예컨대 Sf9, Sf21, 익스프레스 Sf+, High Five H5 세포, 디. 멜라노가스터(D. melanogaster), 예컨대 S2 슈나이더 세포)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는 진핵생물 숙주 세포에 폴리뉴클레오티드를 통합하기에 적합하다.
특히 바람직한 통합 부위는 특히 바람직한 통합 부위는 Tn7의 트랜스포손(transposon) 요소, 인테그라제-특이적 부착 부위 및 SSR(site specific recombinases), 바람직하게는 cre-lox 특이적 (LoxP) 부위 또는 FLP 리콤비나아제 특이적 재조합(FRT) 부위로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 부가적으로 독성 물질에 대한 내성을 기본으로 하여 소망하는 특성을 갖는 숙주 세포를 선택하기 위한 1 이상의 내성 마커를 포함한다. 적합한 내성 마커의 예는 암피실린, 클로람페니콜, 겐타마이신, 스펙티노마이신 및/또는 카나마이신에 대한 내성을 제공하는 마커이다.
원핵생물 세포에 통합하기 위하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 증식을 원핵생물 숙주에서 pir 유전자 의존적으로 만들기 위하여 콘디쇼날 R6Kγ 복제기점을 포함한다.
발현 카세트로서 폴리진을 작제물에 삽입하는 것에 의한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 특히 바람직한 양태는 WO 2005/085456 A1호(PCT/EP2004/013381)에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는,
(a) MCS1의 경우 프로모터 P1 및 터미네이터 서열 T1이 측면에 위치하고 또 MCS2의 경우 프로모터 P2 및 터미네이터 서열 T2이 측면에 위치하는 다중 클로닝 부위 MCS1 또는 MCS2를 각각 포함하는, 헤드-투-헤드, 헤드-투-테일 또는 테일-투-테일 배열로 된 2 이상의 발현 벡터
Figure 112013050496170-pct00026
;
(b) 2 이상의 제한 부위 A 및 B를 포함하는 프로모터 P1 및 P2 사이에 1 이상의 증식 모듈 M;
(c) 발현 카세트의 하나와 측면을 접하는 2 이상의 제한부위 X 및 Y를 포함하며,
이때
(i) 제한부위 A 및 X 뿐만 아니라 B 및 Y는 상호친화성(compatible)이지만,
(ii) AY 및 BX의 결찰 생성물은 제한부위 A, B, X 및 Y에 대해 특이적인 제한효소 a, b, x 또는 y에 의해 효소적으로 절단되지 않으며, 또
(iii) 제한부위 A 및 B 뿐만 아니라 제한부위 X 및 Y는 상호친화성이 아니고(incompatible)이며, 각 폴리진은 발현 카세트의 하나에 삽입되는,
하기 구조식(I)에 따른 기능적 배치를 포함한다:
Figure 112008040441241-pct00002
구조식(I)의 배열을 갖는 작제물의 더욱 바람직한 양태에 관하여, WO 2005/085456 A1호(PCT/EP2004/013381)에 자세히 언급되어 있다. 특히, 증식 모듈 M 중의 제한 부위 A 및 B는 제한부위 BstZ171, SpeI, ClaI 및 NruI 및 이소시조머(isoschizomer)에 의해 절단된 제한 부위로 구성된 군으로부터 선택된다. 이소시조머는 동일한 절단 부위를 갖는 제한효소이다. 또한 제한부위 X 및 Y의 바람직한 예는 PmeI 및 AvrII 또는 그의 이소시조머에 의해 절단된 제한부위로 구성된 군으로부터 선택된 제한부위이다.
상기 구조식(I)에 함유된 발현 카세트의 하나에 삽입된 각각의 폴리진을 갖는 특히 바람직한 폴리뉴클레오티드는 다음 특징을 포함한다:
(a) 프로모터 P1 및 P2는 polh 및 p10으로 구성된 군으로부터 선택된다;
(b) 터미네이터 서열은 SV40 및 HSVtk로 구성된 군으로부터 선택된다;
(c) 증식 모듈 M 중의 제한 부위 A 및 B는 제한부위 BstZ171I, SpecI, ClaI 및 NruI으로 구성된 군으로부터 선택된다;
(d) 제한부위 X 및 X는 제한부위 PmeI 및 AvrII으로 구성된 군으로부터 선택된다; 및
(e) 바이러스 통합 부위는 cre-lox 및 Tn7로 구성된 군으로부터 선택된다.
구조식(I)에 따른 상기 배열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 제조에 관하여는 WO 2005/085456 A1호(PCT/EP2004/013381)에 자세히 기재되어 있다.
폴리진을 각기 함유하는 2 이상의 ORF 내에 몇 개의 생물학적 활성 폴리펩티드를 암호화하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 제공하면 멀티서브유닛 단백질 복합체의 구성을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 발현에 관한 주요 개선을 제공한다: 한편으로는 모든 서브유닛 유전자의 조립체가 단일 ORF에 들어가는 것은 결합될 코딩 서열의 거대한 크기 및 갯수로 인하여 거의 불가능하거나 아주 어렵다. 다른 한편으로는 별개의 발현 카세트에 각각 존재하는 멀티서브유닛 복합체의 모든 구성원 또는 몇 개 구성원의 효과적인 조립체는 효력이 없는 것으로 밝혀졌는데, 이는 전체 복합체 수율이 가장 적게 발현된 서브유닛에 의해 결정되기 때문이다. 본 발명에 따르면, 멀티단백질 조립체의 서브유닛은 작제물과 그의 성분 (특히 폴리진의 조립체)의 관리가능성과 발현 효율(특히 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 적합한 벡터에 존재하는 경우) 사이의 최적 타협을 초래하는 3 이상의 폴리펩티드(바람직하게는 비-바이러스성 기원)를 암호화하는 2 이상의 폴리진(각각 단일 ORF)에 의해 암호화된다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 상술한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터이다. 상기 벡터는 플라스미드, 발현 벡터 및 트랜스퍼 벡터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명으 벡터는 진핵생물 유전자 전달, 일시적 또는 바이러스성 벡터-매개된 유전자 전달에 유용하다.
특히 바람직한 벡터는 아데노바이러스, 아데노-결합된 바이러스(AAV), 자동 파르보바이러스, 단순포진 바이러스(HSV), 레트로바이러스, 라디노바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 렌티바이러스, 셈리키 숲 바이러스 및 배큘로바이러스로부터 선택된 바이러스와 같은 진핵생물 발현 벡터이다. 본 발명의 가장 바람직한 벡터는 배큘로바이러스 발현 벡터이다. 본 발명의 바람직한 배큘로바이러스는 유전자 v-cath 및 chiA가 기능적으로 파괴되어 감염 및 단백질 발현되는 동안 세포 구획의 향상된 유지를 초래한다. v- cath 유전자는 바이러스성 DNA 상에 병치된 유전자에 따른 방법에 의한 세포 치사에 의해 활성화되는 바이러스성 프로테아제 V-CATH를 암호화하고, chiA는 키티나아제를 암호화한다. 양쪽 유전자는 바람직하게는 파괴되어 V-CATH 활성을 제거하고 또 간섭 형태 chiA 유전자 생성물 없이 키틴 친화성 크로마토그래피를 이용하는 옵션을 얻는다. 기능적 활성 v- cath 및 chiA 유전자를 갖지 않는 배큘로바이러스 계에 의해 생성된 발현 생성물의 품질은 바이러스 의존적 단백질분해 활성 및 세포 분해의 감소로 인하여 현저히 향상된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 벡터는 SSRs에 대한 부위, 바람직하게는 cre-lox 부위 특이적 재조합을 위한 LoxP를 포함한다. 보다 바람직하게는, cre-lox 부위는 배큘로바이러스의 유전자 v- cath 및 chiA의 하나 또는 모두에 그 작용을 파괴하도록 위치한다.
본 발명의 벡터는 바람직하게는 정확하게 조립된 벡터에 의해 성공적으로 형질감염된 숙주를 선택하기 위한 1 이상의 마커 유전자를 함유한다. 적합한 마커 유전자의 예는 루시페라아제, β-Gal, CAT, GFP, BFP, YFP, CFP 및 그의 변이체와 같은 형광 단백질을 암호화하는 유전자, 및 lacZα 유전자이다. 마커 유전자는 상술한 예의 기능적으로 등가인 변이체, 돌연변이체, 단편 또는 유사체 또는 당업자에게 공지된 기타 적합한 마커일 수 있다. 변이체, 돌연변이체 또는 유사체는 바람직하게는 상기 마커 변이체, 돌연변이체 또는 유사체가 유도된 것에 비하여 아미노산 수준으로 75% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 특히 90%, 더욱 특히 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
다른 바람직한 양태로서, 본 발명의 벡터는 트랜스포손 요소, 바람직하게는 Tn7 부착 부위를 포함한다. 보다 바람직하게는, 이러한 트랜스포손 요소, 예컨대 Tn7 부착 부위는 마커 유전자 내에 위치하여서 전위(transposition)에 의한 성공적인 통합이 기능적 마커 유전자에 의해 제공되는 표현형을 시험하는 것에 의해 평가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 전달 벡터는 WO 2005/085456 A1호(PCT/EP2004/13381; 참조: 본 명세서에 기재된 서열번호 1 및 서열번호 2 뿐만 아니라 도 1 및 도 2)에 기재된 바와 같은 pFBDM 또는 pUCDM을 기본으로 한다. 본 발명의 더욱 바람직한 전달 벡터는 상기 pFBDM 및 pUCDM 벡터의 유도체를 기본으로 한다.
pFBDM 및 pUCDM의 특히 바람직한 유도체의 예는 전달 벡터 pSPL (도 3), pFL (도 4), pKL (도 5) 및 pKDM (도 6) 이다. pUCDM과 같이, pSPL은 콘디쇼날 복제 기점(R6Kγ)을 함유한다. pFL (pFBDM과 같이)은 고 카피수의 복제기점(ColE1)을 갖는다. pKDM 및 pKL은 pBR322로부터 유도된 저 카피의 복제 기점을 갖는다. pFBDM과 유사하게, pFL, pKL 및 pKDM은 트랜스포손 요소 (Tn7R, Tn7L)을 함유한다. 벡터 pSPL, pFL 및 pKL은 듀얼 발현 카세트(pUCDM과 마찬가지로)와 측면을 접하는 LoxP 불완전 역위 반복서열(inverted repeat)을 갖는다. 모든 벡터는 다유전자 카세트 1를 생성하기 위해 상술한 증식 모듈(M)을 함유한다. pFL 및 pKL (및 유도체)는 수용체 벡터이고, pUCDM 및 pSPL(및 유도체)는 Cre-매개된 플라스미드 융합물에서 공여 벡터이다.
본 발명의 작제물을 생성하기 위한 전달 벡터의 상기 바람직한 예의 중요한 특징을 하기 표 1에 요약한다.
Figure 112008040441241-pct00003
따라서, 본 발명의 폴리진은 다중 클로닝 부위 (MCS1 및 MCS2)에서 제한효소 절단 및 결찰(ligation)에 의해 또는 재조합(예컨대 BD In-Fusion 효소를 이용하여)을 통하여 pFBDM, pUCDM, pSPL, pFL, pKL 또는 pKDM과 같은 벡터에 삽입된다. 배큘로바이러스 전달 벡터 pFBDM, pUCDM, pSPL, pFL, pKL 및 pKDM은 단백질 생산 향상을 위하여 조작된(engineered) 변성 수용체 배큘로바이러스 DNA를 포함하며 또 2개의 액세스 부위(attTn7 및 LoxP)를 통하여 유전자를 이 목적에 맞춤처리된 대장균 세포 내의 배큘로바이러스 DNA에 통합시키기 위한 간단하고 신속한 방법을 허용한다.
다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
바람직한 숙주 세포의 예는 포유동물 세포, 예컨대 인간, 설치류, CPL, FS-13 및 PK-15와 같은 돼지 세포, MDB 및 BT와 같은 소 세포, FLL-YFT와 같은 양 세포, 씨. 엘레간스(C. elegans) 세포, 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae), 에스. 폼베(S. pombe), 피. 파스토리스(P. pastoris) 및 씨. 알비칸스(C. albicans)와 같은 효모 세포, 에스. 프루기페르다(S. frugiperda), 바람직하게는 Sf9, Sf21, Express Sf+ 또는 High Five h5 세포와 같은 곤충 세포, S2 슈나이더(Schneider) 세포와 같은 디. 멜라노가스터(D. melanogaster) 및 대장균(E. coli), 바람직하게는 Top10, Dh5α, DH10α, HB101, TG1, BW23473 및 BW23474 균주와 같은 세균이다.
바람직한 인간 세포는 HeLa, Huh7, HEK293, HepG2, KATO-III, IMR32, MT-2, 췌장 β 세포, 각질세포, 골수 섬유모세포, CHP212, 일차 신경 세포, W12, SK-N-MC, Saos-2, WI38, 일차 간세포, FLC3, 143TK-, DLD-1, 배꼽 정맥 세포, 배아 폐 섬유모세포, 일차 이마 섬유모세포, 골육종 세포, MRC5 및 MG63 세포로부터 선택된다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포는 단리된 세포이거나 또는 이들은 조직 또는 기관에 존재할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 1 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 벡터에 의해 형질전환된 비-인간 트랜스제닉(transgenic) 동물에 관한 것이다. 바람직한 트랜스제닉 동물은 설치류, 돼지, 소 및 씨. 엘레간스(C. elegans)(선충) 종이다.
본 발명의 트랜스제닉 동물은 생체 내에서 멀티단백질 복합체의 역할을 밝혀내거나 또는 이들의 생물학적 활성을 위한 화합물을 스크리닝하는데 특히 유용하다.
본 발명의 다른 양태는,
(a) 2 이상의 폴리진을 구성하는 유전자의 코딩 영역을 제공, 바람직하게는 증폭하는 단계;
(b) 상기 코딩 영역에 1 이상의 프로테아제 절단 부위 및/또는 1 이상의 자가 절단 펩티드를 코딩하는 서열을 제공하는 단계; 및
(c) 상기 단계(a) 및 (b)로부터 생긴 단편들을 조립하여 각 폴리진 내에 단일 ORF가 생기게 하는 단계; 및
(d) 2 이상의 폴리진을 단일 폴리뉴클레오티드에 조합하는 단계를 포함하는 상기 정의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는,
(a) 상기 정의한 바와 같은 단일 ORF 내에 3개 이상의 유전자를 각각 포함하는 2 이상의 폴리진을 생성하는 단계(바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위한 상기 방법에 의해); 및
(b) 상기 폴리진을 플라스미드 또는 바이러스성 벡터에 클로닝하는 단계를 포함하며, 각 폴리진의 유전자의 1 이상은 비-바이러스 기원이고 또 상기 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 2 이상은 상기 유전자에 의해 암호화된 다른 1개의 폴리펩티드와 적어도 일시적으로 상호작용할 수 있는 본 발명에 따른 벡터의 제조 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 폴리진에 조립된 유전자의 하나는 폴리진에 의해 암호화된 폴리펩티드를 연결하는 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제를 암호화하는 유전자이다. 바람직한 프로테아제는 상기 정의한 바와 같다.
본 발명의 폴리진 뿐만 아니라 벡터의 작성은 당업자에게 일반적으로 공지된 다양한 분자 생물학적 수법을 통하여 실시할 수 있다(참조, 예컨대 Ausubel et al. (eds) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Hoboken, NJ, USA, 2003). 폴리진의 제조는 예컨대 특정 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 PCR 증폭(예컨대 상응하는 cDNA 주형을 사용하여)에 의해, 바람직하게는 1 이상의 프로테아제 절단 부위 및/또는 1 이상의 자가 절단 펩티드를 코딩하는 서열을 제공하는 프라이머(5' 또는 3')를 사용하는 것에 의해 실시할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 적합한 제한 효소의 인식 서열을 더 함유한다. 바람직하게는, 각 프라이머는 생성한 증폭 생성물과 다른 증폭 생성물 및/또는 동일 제한 부위를 함유하는 선형화된 벡터의 방향성 결찰이 가능하도록 다른 프라이머의 제한 부위와는 상이한 제한 부위를 함유한다. 방향성 결찰에 의한 작제물(constructs)의 제조를 위한 다른 바람직한 양태에 따르면, 프라이머는 RsrII 또는 BstEII와 같이 자가 결찰되지 않는 오버행(overhang)을 생성하는 제한효소의 인식 서열을 함유할 수 있다. 프라이머 자체가 제한 부위를 함유하지 않을 경우, 소망하는 제한 부위를 포함하는 어댑터(adapter)를 갖는 증폭 생성물을 제공할 수 있다. 물론, 어떠한 공급원(증폭 이외에)을 이용하여 소망하는 폴리펩티드에 대한 코딩 영역을 제공할 수도 있다. 예컨대, 소망하는 서열은 서열이 적합한 제한 효소에 의해 절단될 수 있는 상응하는 벡터 내에 그 자체로 이미 존재할 수 있다. 적합한 제한 부위 등을 함유하지 않는 작제물에는 필요한 요소를 함유하는 적합한 어댑터의 결찰에 의해 적합한 서열(제한 부위, 프로테아제 절단 부위/자가 절단 펩티드, 링커 등)이 제공될 수 있다. 증폭 생성물 또는 다른 적합한 작제물(제한 부위를 함유하는)은 적합한 제한 효소에 의해 절단된다. 물론, 사용된 임의 프라이머의 서열은 바람직하게는 폴리진을 적합한 벡터에 최종 조립한 후, 각 폴리진에 대하여 단일 ORF가 생기도록 바람직하게 선택된다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 증폭 생성물 또는 다른 적합한 서열은 순차적으로 또는 동시에 적합한 벡터에, 예컨대 상기 언급한 MultiBac 벡터 계의 MCS1 또는 MCS2에 결찰된다. 예컨대, 1개 폴리진은 pFDBM에 도입될 수 있고 또 다른 폴리진은 pUCDM(WO 2005/085456 A1호(PCT/EP2004/013381)에 기재된 바와 같음)에 결찰될 수 있다. 생성한 작제물은 cre - lox 부위 특이적 재조합(pUCDM 유도체) 및 Tn7 특이적 전위(pFBDM 유도체)에 의해 상응하는 백미드(bacmid)를 제조하기 위해 사용되어 목적으로 하는 멀티단백질 복합체의 발현과 정제를 위한 상응하는 곤충 세포의 감염을 위한 배큘로바이러스 발현 벡터를 얻는다.
폴리진을 생성하여 이들을 제한/결찰에 의해 적합한 벡터에 도입하는 이외에, 적합한 리콤비나아제(recombinase)를 사용한 상동 재조합에 의해 그러한 작제물을 조립할 수도 있다. 리콤비나아제-기제 클로닝 수법의 적합한 예는 BD Biosciences Clontech (독일 하이델베르그 소재)(참조, Clontechniques, October 2002, p.10)로부터 입수가능한 In-Fusion® 계 및 Gene Bridge GmbH (독일 드레스덴 소재)로부터 입수가능한 Red®/ET® 재조합 계(참조 WO-A-99/29837; http://www.genebridgeds.com)이다.
In-Fusion® 계는 상응하는 상동 영역을 갖는 선형 작제물(적합한 벡터와 같은)에 융합되기 위한 DNA 분자 중에 15 bp 상동 영역을 필요로 한다. 따라서, 본 발명의 폴리진을 함유하는 벡터는 15 bp의 적합한 상동 서열을 갖는 구성적 코딩 영역(프로테아제 절단 부위 및/또는 자가 절단 펩티드를 코딩하는 링커 서열과 함께)을 제공함으로써 순차적으로 또는 동시에 조립될 수 있다. 필요한 경우, 15 bp 상동 서열은 구성적 코딩 서열이 소망하는 순서로 조립되도록 선택될 수 있다. 물론, 적합한 상동 영역은 소망하는 서열을 함유하는 프라이머를 사용하여 상응하는 단편의 PCR 증폭에 의해 도입될 수 있다.
Red?/ET? 재조합 계는 40 내지 60 염기쌍의 상동 서열을 필요로 하지만 단편이 삽입될 작제물이 선형일 필요가 없는 점에서 In-Fusion® 계와 구별된다. 상기 재조합은 이중 리콤비나아제 계 "ET" (RecE/RecT 또는 Redα/Redβ)를 발현하는 숙주의 생체 내에서, 바람직하게는 대장균 균주에서 실시한다. 따라서, 폴리진을 구성하는 단편은 적절한 벡터와 함께 적합한 숙주, 바람직하게는 대장균 세포에 직접적으로 형질전환될 수 있다. 이렇게 하여, 각 폴리진은 단편 대 단편으로 순차적으로 (바람직하게는 멀티단백질 복합체의 각 구성원 폴리펩티드 + 1 이상의 프로테아제 절단 부위 서열/자가 절단 펩티드 서열에 대한 코딩 영역을 포함하는) 또는 모든 단편의 동시 형질전환에 의해 적합한 벡터에서 조립될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 폴리뉴클레오티드 작제물은 적어도 유사한 길이의 폴리진을 함유하는데, 이는 본 발명자들이 각 작제물로부터 상응하는 폴리단백질의 발현이 견줄만한 발현 수준을 초래함을 발견하였기 때문이다. 본 발명에 따르면, "유사한 길이의 폴리진"은 폴리진의 뉴클레오티드 서열의 길이가 50% 이하, 더욱 바람직하게는 30% 이하, 특히 20% 이하 정도로 서로 상이함을 의미한다.
또한, 본 발명은
(a) 본 발명에 따른 숙주 세포를 폴리진의 발현을 허용하는 조건하의 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 폴리진에 의해 암호화된 발현 생성물을 배지 및/또는 숙주 세포로부터 수집하는 단계를 포하하는 시험관 내에서 멀티단백질 복합체를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은,
(a) 상기 정의된 바와 같은 단일 ORF 내에 3 이상의 유전자를 포함하는 2 이상의 폴리진을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 폴리진을 동물에 형질전환시켜 상술한 동물에서 폴리진이 발현되도록 하는 단계를 포함하는 생체 내에서 멀티단백질 복합체를 생산하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는 단계(b)에 따른 폴리진으로 상기 동물을 형질전환하는 것은 벡터, 특히 바이러스성 벡터, 더욱 바람직하게는 배큘로바이러스 벡터에 의해 실시한다. 배큘로바이러스는 특히 폴리진을 포유동물 종으로 전달하기 위한 유용한 비히클이다. 상기 생체 내 방법은 바람직하게는 포유동물, 씨. 엘레간스 또는 곤충에서 실시한다. 적합한 동물 종의 특히 바람직한 예는 상기 정의된 바와 같다.
본 발명의 양태는 또한 단백질이 멀티서브유닛 조립체 특이적인 백신의 제조에 유용하다. 복수의 서브유닛의 복합체는 복합체를 구성하는 개별 단백질과 대조하여 상이한 항원결정인자를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 멀티단백질 복합체는 더욱 적절한 방식으로 천연산출의 관련 항원결정인자를 나타내므로, 항체 생산을 위한 더욱 우수한 항원 표적을 제공한다.
최근 심각한 급성 호흡 증후군(SARS) 코로나바이러스로부터 얻은 4개 단백질을 구성하는 비리온-유사 입자(VLP)를 재조합 배큘로바이러스 발현 벡터를 이용하여 제조하였다(참조. Mortola et al. (2004), FEBS Lett. 576, 174-178). 백신을 제조하기 위한 이러한 감염성 입자의 효과적인 발현은 본 발명에 따른 폴리진 발현 계를 사용하여 용이하게 실시할 수 있다. 특히, SARS-VLP의 예에 비하여 실질적으로 더 많은 폴리펩티드를 함유하는 멀티서브유닛 조립체의 고수율 발현은 본 발명의 발현 도구에 의해 실시할 수 있다.
따라서, 본 발명은,
(a) 본 발명의 1 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 포유동물에 투여하여, 본 발명의 폴리진을 포유동물 내에서 발현시키는 단계;
(b) 경우에 따라, 보조제를 포유동물에 투여하는 단계; 및
(c) 경우에 따라, 폴리진에 의해 암호화된 1 이상의 폴리펩티드에 특이적인 항체 및/또는 항체 생산 비장 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 백신의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 멀티단백질 조립체의 재조합 제조를 위한 편리하고 간단한 접근법을 제공한다. 이들 멀티서브유닛 조립체는 멀티서브유닛 조립체를 구성하는 단백질의 단백질 복합체 상호작용 또는 변형에 대해 시험하였다. 본 발명에 따라 제조된 멀티서브유닛 조립체는 후보 화합물(소형 유기 분자, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 등)과 상호작용에 대해 분석되어 의료적 가치있는 생물학적으로 유의한 활성을 발휘할 수 있다.
따라서 본 발명은 단백질 복합체 상호작용 또는 단백질 변형을 분석하는 방법에도 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은
(a) 2 이상의 폴리진을 함유하는 본 발명에 따른 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 숙주 세포를 폴리진의 발현을 허용하는 조건하에서 유지시키는 단계; 및
(c) 상기 폴리진에 의해 암호화된 폴리펩티드의 상호작용 또는 변형을 검출하는 단계를 포함하는, 시험관 내의 멀티단백질 복합체의 단백질 복합체 상호작용 또는 변형을 스크리닝하기 위한 방법을 제공한다.
다른 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은
(a) 2 이상의 폴리진을 함유하는 본 발명에 따른 숙제 세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 숙주 세포를 폴리진의 발현을 허용하는 조건하에서 유지하는 단계;
(c) 후보 화합물을 상기 숙주 세포와 접촉시키는 단계; 및
(d) 후보 화합물과 발현 생성물의 상호작용 및/또는 발현 생성물 사이의 상호작용 및/또는 발현 생성물의 변형 및/또는 발현 생성물 사이의 상호작용의 억제를 검출하는 단계를 포함하는, (i) 멀티단백질 복합체와 상호작용 및/또는 (ii) 멀티단백질 복합체 내의 단백질의 변형 및/또는 (iii) 멀티단백질 복합체 내의 상호작용 또는 멀티단백질 복합체 간의 상호작용의 억제 및/또는 멀티단백질 복합체 내의 단백질변형을 억제할 수 있는 후보 화합물을 시험관 내에서 스크리닝하는 방법이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터는, 단백질 - 단백질, 단백질 - (멀티) 단백질 복합체 또는 멀티단백질 복합체 - 멀티단백질 복합체 상호작용 또는 멀티단백질 복합체의 생체 내에서 변형 (포스포릴화, 글리코실화 등)을 스크리닝하는데 적합하다.
따라서, 본 발명의 다른 바람직한 양태는
(a) 상기 정의한 바와 같은 2 이상의 폴리진을 함유하는 본 발명의 1 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 포함하는 동물을 제공하여 폴리진을 동물 내에서 발현시키는 단계;
(b) 후보 화합물을 동물에 투여하는 단계; 및
(c) 발현 생성물과 후보 화합물의 상호작용 및/또는 발현 생성물 간의 상호작용 및/또는 발현 생성물의 변형 및/또는 발현 생성물 간의 상호작용의 억제를 검출하는 단계를 포함하는 (i) 멀티단백질 복합체와 상호작용 및/또는 (ii) 멀티단백질 복합체 내의 단백질의 변형 및/또는 (iii) 멀티단백질 복합체 내의 상호작용 또는 멀티단백질 복합체 간의 상호작용의 억제 및/또는 멀티단백질 복합체 내의 단백질변형을 억제할 수 있는 후보 화합물을 생체 내에서 스크리닝하는 방법이다.
본 발명의 멀티단백질 발현 도구는 의과적 용도이다. 특히, 생체활성 멀티단백질 복합체 뿐만 아니라 의료적으로 유용한 단백질 조합물, 예컨대 경우에 따라 인터루킨 및/또는 보조제와 조합된 항체 혼합물을 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 유전자 전달 벡터에 의해 동물 또는 인간에게 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 유전자 요법용 폴리진 전달 비히클을 포함하는 의약을 제조하기 위한 상술한 바와 같은 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터 및/또는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
치료적 적용을 위한 유전자 전달 계를 개발하기 위하여 엄청난 노력을 기우려 왔다. 유전자 요법은 과거 강한 관심을 받아왔지만 비판도 받아왔다. 지금까지, 인간의 질병에 대한 생체 내 및 생체 밖 전략에서 안전하고 적용가능한 임상성을 달성하기 위해 임상 시험으로 유전자 요법을 평가하는데 주요한 진전이 있었다(참조 Worgall S. (2004) Peadiatr . Nephrol.). 전체적으로, 유전자 요법은 치료적 유전자 생성물의 영구적 또는 일시적 발현을 수반하는 유전자 질환 뿐만 아니라 후천적 질환의 치료를 위한 아주 유망한 수단으로 인식된다(Worgall S., 상기 참조). 바이러스, 특히 포유동물 숙주에서 복제 감수성이 아닌 바이러스를 기본으로 하는 재조합 벡터(예컨대 배큘로바이러스 벡터)가 최근 포유동물 세포 유전자 전달을 위한 강력한 도구로 떠올랐고 또 인간, 영장류, 설치류, 소, 돼지 및 양 세포를 비롯한 다양한 포유동물 세포주에 대해 성공적으로 적용되었다(Kost and Condreay (2002) Trends Biotech . 20, 173-180 참조). 생체 밖 및 생체 내에서 복합체 유전자 전달/요법 효과를 얻기 위하여, 단일 유전자 요법(de Felipe (2002), Curr . Gene Ther . 2, 355-378; Planelles (2003) Meth . Mol . Biol. 229, 273-284)에 의해서 보다 조합된 유전자 요법에 의해 더욱 강력한 결과를 달성하기 위하여 폴리시스트론성 바이러스 벡터에 대한 요구가 증가되고 있다. 액서사리 유전자를 생체내에 투여될 담체 바이러스에 혼입시키기 위한, 예컨대 보체 계에 의한 불활성화를 차단하기 위한 요건은 인간 분해-촉진 인자 단백질 도메인 융합(Hueser et al. (2001) Nat . Biotech. 19, 451-455)을 갖는 배큘로바이러스 gp64 엔빌로프 단백질을 갖는 슈도타입 배큘로바이러스를 사용함으로써 밝혀져서, 치료 목적을 위해 전달되는 복수의 유전자 이외에 바이러스 생산 수준에 대한 재조합 변형을 제공할 필요를 예시하였다.
따라서, 본 발명의 재조합 배큘로바이러스는 유전자 요법 의약 제조를 위해 바람직하다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 의약용을 위해 사용된 벡터는
(i) 1 이상의 치료적 폴리펩티드 및
(ii) 1 이상의 배큘로바이러스 단백질을 암호화하는 것으로 정의된 2 이상의 폴리진을 포함하는 배큘로바이러스이다.
바람직한 구체예로서, (ii)에 따른 단백질은 슈도타입 배큘로바이러스, 바람직하게는 인간화된 배큘로바이러스 엔빌로프 단백질 gp64, 예컨대 분해 촉진 인자와 같은 인간 단백질과 융합된 gp64로부터 발현된 인간화된 배큘로바이러스 단백질이다.
또한, 본 발명은
(a) 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리진 전달 비히클을 제공하는 단계; 및
(b) 상기 폴리진 전달 비히클을 유전 질병에 걸린 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 생체내 유전자 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은,
(a) 유전자 질병에 걸린 환자의 세포를 수집하는 단계;
(b) 상기 수집한 세포를 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리진 전달 비히클을 사용하여 형질전환시키는 단계; 및
(c) 형질전환된 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 생체 밖에서 유전자 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따라 제조된 멀티단백질 복합체는 생체물리적 연구, 특히 결정학상, 전자-현미경 및/또는 NMR 수법을 이용한 구조 연구, 단백질 화학 연구, 특히 단백질-단백질 상호작용과 같은 단백질 화학 연구 및 약물 개발을 위해 유리하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 멀티단백질 복합체를 결정화하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터 및/또는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는
(a) 폴리진을 구성하는 코딩 서열의 PCR 증폭을 위한 프라이머;
(b) 플라스미드 또는 바이러스 벡터; 및
(c) 플라스미드 또는 벡터의 제조에 적합한 숙주 세포를 포함하는 복수 단백질 복합체를 제조하기 위한 키트이다.
프라이머는 주로 각 폴리진에 대하여 단일 ORF를 생성하는데 필요한 사항을 만족시키기 위하여 사용되며 또 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 도입하기 위한 결찰(순차적으로 또는 동시에)용 제한 부위를 함유할 수 있거나 및/또는 프라이머는 상동 재조합에 의해 폴리진을 조립하기 위한 서열 및/또는 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 삽입하기 위한 서열을 함유할 수 있다(예컨대 상기 기재한 바와 같은 In-Fusion® 계 또는 Red®/ET® 계를 사용하여).
도 1은 인간 TATA-박스-결합 단백질 (hTPB) 코어 (hTBPc, 위치 159에서 절단된 전장(full-length) 단백질의 c-말단 단편)을 코딩하는 PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열(서열번호 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열번호 2)를 도시한다. RsrII 제한 부위(프라이머 서열에 존재)의 위치도 표시되어 있다.
도 2는 hTBPc 유전자 절편의 시험관 내 결찰 및 혼합물의 서브클로닝의 아가로오스 겔 전기영동 분석한 사진을 도시한다. PCR-증폭된 hTPBc 유전자는 RsrII로 분해하고 정제하였다(레인 1). 리가아제에 의한 배양은 1개 ORF 각각에서 연결된 1, 2, 3 및 그 이상의 유전자를 함유하는 콘카타머(concatamer)의 사다리를 얻는다(레인 2, 레인 3은 MBI DNA 마커 1 kb 사다리임). 1개 폴리진을 각각 함유하는 이렇게 하여 얻은 발현 작제물 혼합물을 RsrII을 사용한 제한 분해에 의해 분해될 수 있는 상이한 갯수의 연결된 hTBPc 유전자를 사용하여 서브클로닝한다(레인 4-7). 삽입된 폴리진의 분해 결과는 각 경우 단일 ORF를 얻는 1(레인 8), 2 (레인 9), 3(레인 10) 및 5 (레인 11) hTBPc 유전자를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 바람직한 전달 벡터 작제물의 기초를 이루는 기본적인 전달 벡터 pSPL의 개략도를 도시한다.
도 4는 본 발명의 바람직한 전달 벡터 작제물의 기초를 위루는 기본적인 전달 벡터 pFL의 개략도를 도시한다.
도 5는 본 발명의 바람직한 전달 벡터 작제물의 기초를 위루는 기본적인 전달 벡터 pKL의 개략도를 도시한다.
도 6은 본 발명의 바람직한 전달 벡터 작제물의 기초를 위루는 기본적인 전달 벡터 pKDM의 개략도를 도시한다.
도 7은 전달 벡터 작제물 pFBDO [hTBPc]3의 개략도를 도시한다.
도 8은 pFBDO [hTBPc]3의 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)을 도시한다.
도 9는 전달 벡터 작제물 pUCDMCSTAF1TBPcTAF2의 개략도를 도시한다.
도 10은 pUCDMCSTAF1TBPcTAF2의 뉴클레오티드 서열(서열번호 4)을 도시한다.
도 11은 전달 벡터 작제물 pFBDO [HisTEVTAF6TAF9]his의 개략도를 도시한다.
도 12는 pFBDO [HisTEVTAF6TAF9]his의 뉴클레오티드 서열(서열번호 5)을 도시한다.
본 발명을 하기 비제한적인 실시예에 의해 더욱 자세하게 설명한다.
실시예 1: 폴리진의 생성 및 발현 벡터로 결찰
폴리진을 생성하는 원리는 인간 TATA-Box-결합 단백질 (hTBP) 코어 (hTBPc, 위치 159에서 절단된 전장(full-length) 단백질의 c-말단 단편)을 사용하여 나타내었다. hTBPc를 암호화하는 유전자는 RsrII 제한 부위를 갖는 오버행을 함유하는 유전자의 5 말단에 어닐링하고 또 아미노산 스페이서를 암호화하는 센스 프라이머 및 담배-식각-바이러스 (TEV) 절단 부위를 사용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 증폭하였다. 안티센스 프라이머는 유전자의 3' 말단에 어닐링되며 또 RsrII 제한 부 위를 함유하였다. RsrII는 자가 결찰되지 않는 3개 뉴클레오티드의 비대칭 오버헹을 생성하는 제한 효소이므로, 제한 생성물은 비대칭이고 결찰은 방향적 생성물을 얻는다. PCR 생성물을 RsrII에 의해 분해하고 정제하였다. PCR 생성물의 DNA (서열번호 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열번호 2)을 도 1에 도시한다.
결찰은 도 2에 도시한 바와 같은 hTBPc의 콘카타머를 얻는다. 시험관내 결찰 반응 혼합물을 적합한 벡터에 서브클로닝하여 TEV 프로테아제 절단 부위에 의해 분리된 단일 폴리단백질에서 1, 2, 3 및 5개의 hTBP 단백질을 암호화하는 폴리진을 함유하는 발현 작제물을 얻었다. 생성한 발현 벡터 중의 하나의 개략도 및 뉴클레오티드 서열(서열번호 3)을 도 3 및 도 4에 각각 나타낸다.
실시예 2: 인간의 일반적 전사 인자의 서브유닛을 암호화하는 폴리진을 함유하는 배큘로바이러스 전달 벡터의 생성
배큘로바이러스 발현을 위한 전달 벡터 pUCDM (WO 2005/085456 A1호 (PCT/EP2004/013381) 참조)에 삽입된 hTBPc 이외에, 인간 TBP 결합 인자 hTAF1 및 hTAF2를 포함하는 폴리단백질을 암호화하는 폴리진과 함께 아미노산 스페이서 및 TEV 프로테아제 부위를 암호화하는 서열에 의해 분리된 유전자를 생성하였다. 생성한 작제물 pUCDMCSTAF1TBPcTAF2의 개략도를 도 9에 도시한다. 이 작제물의 뉴클레오티드 서열은 도 10에 도시한다(서열번호 4). 배큘로바이러스 발현을 위한 전달 벡터 pFBDM (참조: WO 2005/085456 A1호 (PCT/EP2004/013381))에 삽입된 TEV 프로테아제 및 인간 TBP 결합된 인자 hTAF6 및 hTAF9를 포함하는 폴리단백질을 암호화하는 폴리진과 함께 아미노산 스페이서 및 TEV 프로테아제 부위를 암호화하는 서열 에 의해 분리된 유전자를 함유하는 다른 작제물도 생성되었다. 생성한 작제물 pFDDO [HisTEVTAF6TAF9]his 의 개략도를 도 11에 도시한다. 이 작제물의 뉴클레오티드를 도 12에 도시한다(서열번호 5).
실시예 3: 박미드 ( Bacmid ) 작제물의 제조, 곤충 세포의 감염 및 단백질 발현
상기 2개의 폴리진을 포함하는 박미드 작제물을 작성하기 위하여, 작제물 pUCDMCSTAF1TBPcTAF2 (pUCDM 유도체) 및 pFDDO [HisTEVTAF6TAF9]his (pFBDM 유도체)를 각각 WO 2005/085456 A1호 (PCT/EP2004/01381)의 실시예 5 (pUCDMCSTAF1TBPcTAF2; Cre - lox 부위 특이적 재조합) 및 6 (pFDDO[HisTEVTAF6TAF9]his ; Tn7 전위)에 기재된 바와 같이 DH10MultiBacCre 세포에 도입하였다. 필요한 경우, 1 스텝 전위/ cre-lox 부위 특이적 재조합을 WO 2005/085456 A1호 (PCT/EP2004/013381)에 기재한 바와 같이 DH10MultiBacCre 세포에서 실시할 수 있다. Bacmid 제조, 곤충 세포의 감염 및 단백질 발현은 확립된 수순에 따라 실시하였다(참조, 예컨대 O'Reilly et al. (1994) "Baculovirus expression vectors. A laboratory manual" Oxford University Press, New York - Oxford; "Bac-to-BacTM Baculovirus Expression Systems Manual Invitrogen, Life Technologies, Inc., 2000).
이하에 기재한 서열 목록은 본 발명의 상세한 설명의 일부이다.
서열번호 1은 도 1에 도시된 인간 TATA-Box-결합 단백질 (hTPB) 코어 (hTBPc, 위치 159에서 절단된 전장(full-length) 단백질의 c-말단 단편)를 코딩하 는 PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 2는 도 1에 도시된 인간 TATA-Box-결합 단백질 (hTPB) 코어 (hTBPc)의 아미노산 서열이다.
서열번호 3은 도 8에 도시한 pFBDO[hTBPc]3의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 4는 도 10에 도시한 pUCDMCSTAF1TBPcTAF2의 뉴클레오티드 서열이다.
서열번호 5는 도 12에 도시한 pFBDO[HisTEVTAF6TAF9]his의 뉴클레오티드 서열이다.
SEQUENCE LISTING<110> Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Berger, Imre Fitzgerald, Daniel J. Richmond, Timothy J.<120> Recombinant expression of multiprotein complexes using polygenes<130> T-05-019<150> EP 05024271.8<151> 2005-11-08<160> 5 <170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 607<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> PCR product coding for hTBPc <400> 1 cgaattcctc gagcggtccg gaggtaacgg atccgaaaac ctgtattttc agggttctgg 60 gattgtaccg cagctgcaaa atattgtatc cacagtgaat cttggttgta aacttgacct 120 aaagaccatt gcacttcgtg cccgaaacgc cgaatataat cccaagcggt ttgctgcggt 180 aatcatgagg ataagagagc cacgaaccac ggcactgatt ttcagttctg ggaaaatggt 240 gtgcacagga gccaagagtg aagaacagtc cagactggca gcaagaaaat atgctagagt 300 tgtacagaag ttgggttttc cagctaagtt cttggacttc aagattcaga acatggtggg 360 gagctgtgat gtgaagtttc ctataaggtt agaaggcctt gtgctcaccc accaacaatt 420 tagtagttat gagccagagt tatttcctgg tttaatctac agaatgatca aacccagaat 480 tgttctcctt atttttgttt ctggaaaagt tgtattaaca ggtgctaaag tcagagcaga 540 aatttatgaa gcatttgaaa acatctaccc tattctaaag ggattcagga agacgacgcg 600 gtccggc 607 <210> 2<211> 196<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 2 Arg Ser Gly Gly Asn Gly Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Gly 1 5 10 15 Ile Val Pro Gln Leu Gln Asn Ile Val Ser Thr Val Asn Leu Gly Cys 20 25 30 Lys Leu Asp Leu Lys Thr Ile Ala Leu Arg Ala Arg Asn Ala Glu Tyr 35 40 45 Asn Pro Lys Arg Phe Ala Ala Val Ile Met Arg Ile Arg Glu Pro Arg 50 55 60 Thr Thr Ala Leu Ile Phe Ser Ser Gly Lys Met Val Cys Thr Gly Ala 65 70 75 80 Lys Ser Glu Glu Gln Ser Arg Leu Ala Ala Arg Lys Tyr Ala Arg Val 85 90 95 Val Gln Lys Leu Gly Phe Pro Ala Lys Phe Leu Asp Phe Lys Ile Gln 100 105 110 Asn Met Val Gly Ser Cys Asp Val Lys Phe Pro Ile Arg Leu Glu Gly 115 120 125 Leu Val Leu Thr His Gln Gln Phe Ser Ser Tyr Glu Pro Glu Leu Phe 130 135 140 Pro Gly Leu Ile Tyr Arg Met Ile Lys Pro Arg Ile Val Leu Leu Ile 145 150 155 160 Phe Val Ser Gly Lys Val Val Leu Thr Gly Ala Lys Val Arg Ala Glu 165 170 175 Ile Tyr Glu Ala Phe Glu Asn Ile Tyr Pro Ile Leu Lys Gly Phe Arg 180 185 190 Lys Thr Thr Arg 195 <210> 3<211> 6959<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Plasmid pFBDO[hTBPc]3 <400> 3 ttctctgtca cagaatgaaa atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga 60 ctgaatatca acgcttattt gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc 120 attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 180 agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 240 tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 300 ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 360 ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 420 aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 480 ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 540 attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 600 tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 660 gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 720 tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 780 aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 840 cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 900 agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 960 ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 1020 tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 1080 tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 1140 caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 1200 accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 1260 attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 1320 ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 1380 taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 1440 taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 1500 aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 1560 agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 1620 ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 1680 cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 1740 tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 1800 tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1860 tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1920 tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 1980 ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 2040 acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 2100 ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 2160 gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 2220 ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 2280 ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 2340 taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 2400 cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 2460 tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct ggcaaaatcg gttacggttg 2520 agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa 2580 caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag acagaatagt tgtaaactga 2640 aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt tgttatggct aaagcaaact 2700 cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga ggggcgtggc caagggcatg 2760 gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac aactccgcgg ccgggaagcc 2820 gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg tcgatatcaa agtgcatcac 2880 ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg ggatcgtcac cgtaatctgc 2940 ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca tgcttgagga gattgatgag 3000 cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact gcgagatcat agatatagat 3060 ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc gcgagagcgc caacaaccgc 3120 ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta cggagcaagt tcccgaggta 3180 atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct ccgaactcac gaccgaaaag 3240 atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg agcctacatg tgcgaatgat 3300 gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt 3360 cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa acagtcataa caagccatga 3420 aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg 3480 agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca ggcttatgtc aactgggttc 3540 gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg 3600 aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg 3660 cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg cacggatctg ccctggcttc 3720 aggagatcgg tagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag 3780 tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt gttcgcccag gactctagct 3840 atagttctag tggttggcct acagctttgt ttaaacaaag ctgtacccgt agtggctatg 3900 gcagggcttg ccgccccgac gttggctgcg agccctgggc cttcacccga acttgggggt 3960 tggggtgggg aaaaggaaga aacgcgggcg tattggtccc aatggggtct cggtggggta 4020 tcgacagagt gccagccctg ggaccgaacc ccgcgtttat gaacaaacga cccaacaccc 4080 gtgcgtttta ttctgtcttt ttattgccgt catagcgcgg gttccttccg gtattgtctc 4140 cttccgtgtt tcagttagcc tcccccatct cccggtaccg catgctatgc atcagctgct 4200 agcaccatgg ctcgagatcc cgggtgatca agtcttcgtc gagtgattgt aaataaaatg 4260 taatttacag tatagtattt taattaatat acaaatgatt tgataataat tcttatttaa 4320 ctataatata ttgtgttggg ttgaattaaa ggtccgtata ctagtatcga ttcgcgacct 4380 actccggaat attaatagat catggagata attaaaatga taaccatctc gcaaataaat 4440 aagtatttta ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat attccggatt 4500 attcataccg tcccaccatc gggcgcggat cctcgagatg ggtaaccatg acaagcgacg 4560 atggaaaaag aatttcatag ccgtctcagc agccaaccgc tttaagaaaa tctcatcctc 4620 cggggcagct agctggagcc acccgcagtt cgaaaaaggc gccgacgacg acgacgacaa 4680 gggctcccat atgtctggga ttgtaccgca gctgcaaaat attgtatcca cagtgaatct 4740 tggttgtaaa cttgacctaa agaccattgc acttcgtgcc cgaaacgccg aatataatcc 4800 caagcggttt gctgcggtaa tcatgaggat aagagagcca cgaaccacgg cactgatttt 4860 cagttctggg aaaatggtgt gcacaggagc caagagtgaa gaacagtcca gactggcagc 4920 aagaaaatat gctagagttg tacagaagtt gggttttcca gctaagttct tggacttcaa 4980 gattcagaac atggtgggga gctgtgatgt gaagtttcct ataaggttag aaggccttgt 5040 gctcacccac caacaattta gtagttatga gccagagtta tttcctggtt taatctacag 5100 aatgatcaaa cccagaattg ttctccttat ttttgtttct ggaaaagttg tattaacagg 5160 tgctaaagtc agagcagaaa tttatgaagc atttgaaaac atctacccta ttctaaaggg 5220 attcaggaag acgacgcggt ccggaggtaa cggatccgaa aacctgtatt ttcagggttc 5280 tgggattgta ccgcagctgc aaaatattgt atccacagtg aatcttggtt gtaaacttga 5340 cctaaagacc attgcacttc gtgcccgaaa cgccgaatat aatcccaagc ggtttgctgc 5400 ggtaatcatg aggataagag agccacgaac cacggcactg attttcagtt ctgggaaaat 5460 ggtgtgcaca ggagccaaga gtgaagaaca gtccagactg gcagcaagaa aatatgctag 5520 agttgtacag aagttgggtt ttccagctaa gttcttggac ttcaagattc agaacatggt 5580 ggggagctgt gatgtgaagt ttcctataag gttagaaggc cttgtgctca cccaccaaca 5640 atttagtagt tatgagccag agttatttcc tggtttaatc tacagaatga tcaaacccag 5700 aattgttctc cttatttttg tttctggaaa agttgtatta acaggtgcta aagtcagagc 5760 agaaatttat gaagcatttg aaaacatcta ccctattcta aagggattca ggaagacgac 5820 gcggtccgga ggtaacggat ccgaaaacct gtattttcag ggttctggga ttgtaccgca 5880 gctgcaaaat attgtatcca cagtgaatct tggttgtaaa cttgacctaa agaccattgc 5940 acttcgtgcc cgaaacgccg aatataatcc caagcggttt gctgcggtaa tcatgaggat 6000 aagagagcca cgaaccacgg cactgatttt cagttctggg aaaatggtgt gcacaggagc 6060 caagagtgaa gaacagtcca gactggcagc aagaaaatat gctagagttg tacagaagtt 6120 gggttttcca gctaagttct tggacttcaa gattcagaac atggtgggga gctgtgatgt 6180 gaagtttcct ataaggttag aaggccttgt gctcacccac caacaattta gtagttatga 6240 gccagagtta tttcctggtt taatctacag aatgatcaaa cccagaattg ttctccttat 6300 ttttgtttct ggaaaagttg tattaacagg tgctaaagtc agagcagaaa tttatgaagc 6360 atttgaaaac atctacccta ttctaaaggg attcaggaag acgacgcggt ccggccacca 6420 tcatcaccac cattgataag ctagcggccg ctttcgaatc tagagcctgc agtctcgaca 6480 agcttgtcga gaagtactag aggatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac 6540 ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 6600 ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 6660 atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 6720 atgtatctta tcatgtctgg atctgatcac tgcttgagcc taggagatcc gaaccagata 6780 agtgaaatct agttccaaac tattttgtca tttttaattt tcgtattagc ttacgacgct 6840 acacccagtt cccatctatt ttgtcactct tccctaaata atccttaaaa actccatttc 6900 cacccctccc agttcccaac gccaactcca tgtgacaaac cgtcatcttc ggctacttt 6959 <210> 4<211> 12950<212> DNA<213> Artificial Sequence<220><223> Plasmid pUCDMSTAF1TBPcTAF2 <400> 4 aattctgtca gccgttaagt gttcctgtgt cactgaaaat tgctttgaga ggctctaagg 60 gcttctcagt gcgttacatc cctggcttgt tgtccacaac cgttaaacct taaaagcttt 120 aaaagcctta tatattcttt tttttcttat aaaacttaaa accttagagg ctatttaagt 180 tgctgattta tattaatttt attgttcaaa catgagagct tagtacgtga aacatgagag 240 cttagtacgt tagccatgag agcttagtac gttagccatg agggtttagt tcgttaaaca 300 tgagagctta gtacgttaaa catgagagct tagtacgtga aacatgagag cttagtacgt 360 actatcaaca ggttgaactg ctgatcaaca gatcctctac gcggccgcgg taccataact 420 tcgtatagca tacattatac gaagttatct ggagtacccg tagtggctat ggcagggctt 480 gccgccccga cgttggctgc gagccctggg ccttcacccg aacttggggg ttggggtggg 540 gaaaaggaag aaacgcgggc gtattggtcc caatggggtc tcggtggggt atcgacagag 600 tgccagccct gggaccgaac cccgcgttta tgaacaaacg acccaacacc cgtgcgtttt 660 attctgtctt tttattgccg tcatagcgcg ggttccttcc ggtattgtct ccttccgtgt 720 ttcagttagc ctcccccatc tcccggtacc gcatgctatg catcagctgc tagcaccatg 780 gctcgagatc ccgggtgatc aagtcttcgt cgagtgattg taaataaaat gtaatttaca 840 gtatagtatt ttaattaata tacaaatgat ttgataataa ttcttattta actataatat 900 attgtgttgg gttgaattaa aggtccgtat actagtatcg attcgcgacc tactccggaa 960 tattaataga tcatggagat aattaaaatg ataaccatct cgcaaataaa taagtatttt 1020 actgttttcg taacagtttt gtaataaaaa aacctataaa tattccggat tattcatacc 1080 gtcccaccat cgggcgcgga tcctcgagat gggtaaccat gacaagcgac gatggaaaaa 1140 gaatttcata gccgtctcag cagccaaccg ctttaagaaa atctcatcct ccggggcagc 1200 tagctggagc cacccgcagt tcgaaaaagg cgccgacgac gacgacgaca agggctccca 1260 tatgggaccc ggctgcgatt tgctgctgcg gacagcagct accatcactg ctgccgccat 1320 catgtcagac acggacagcg acgaagattc cgctggaggc ggcccatttt ctttagcggg 1380 tttccttttc ggcaacatca atggagccgg gcagctggag ggggaaagcg tcttggatga 1440 tgaatgtaag aagcacttgg caggcttggg ggctttgggg ctgggcagcc tgatcactga 1500 actcacggca aatgaagaat tgaccgggac tgacggtgcc ttggtaaatg atgaagggtg 1560 ggttaggagt acagaagatg ctgtggacta ttcagacatc aatgaggtgg cagaagatga 1620 aagccgaaga taccagcaga cgatggggag cttgcagccc ctttgccact cagattatga 1680 tgaagatgac tatgatgctg attgtgaaga cattgattgc aagttgatgc ctcctccacc 1740 tccacccccg ggaccaatga agaaggataa ggaccaggat tctattactg gtgagaaagt 1800 ggacttcagt agttcctctg actcagaatc tgagatggga cctcaggaag caacacaggc 1860 agaatctgaa gatggaaagc tgacccttcc attggctggg attatgcagc atgatgccac 1920 caagctgttg ccaagtgtca cagaactttt tccagaattt cgacctggaa aggtgttacg 1980 ttttctacgt ctttttggac cagggaagaa tgtcccatct gtttggcgga gtgctcggag 2040 aaagaggaag aagaagcacc gtgagctgat acaggaagag cagatccagg aggtggagtg 2100 ctcagtagaa tcagaagtca gccagaagtc tttgtggaac tacgactacg ctccaccacc 2160 acctccagag cagtgtctct 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gagtgattgt aaataaaatg 4260 taatttacag tatagtattt taattaatat acaaatgatt tgataataat tcttatttaa 4320 ctataatata ttgtgttggg ttgaattaaa ggtccgtata ctagtatcga ttcgcgacct 4380 actccggaat attaatagat catggagata attaaaatga taaccatctc gcaaataaat 4440 aagtatttta ctgttttcgt aacagttttg taataaaaaa acctataaat attccggatt 4500 attcataccg tcccaccatc gggcgcggat cctcgagatg ggtaaccatc atcatcatca 4560 tcacggagaa agcttgttta agggaccacg tgattacaac ccgatatcga gcaccatttg 4620 tcatttgacg aatgaatctg atgggcacac aacatcgttg tatggtattg gatttggtcc 4680 cttcatcatt acaaacaagc acttgtttag aagaaataat ggaacactgt tggtccaatc 4740 actacatggt gtattcaagg tcaagaacac cacgactttg caacaacacc tcattgatgg 4800 gagggacatg ataattattc gcatgcctaa ggatttccca ccatttcctc aaaagctgaa 4860 atttagagag ccacaaaggg aagagcgcat atgtcttgtg acaaccaact tccaaactaa 4920 gagcatgtct agcatggtgt cagacactag ttgcacattc ccttcatctg atggcatatt 4980 ctggaagcat tggattcaaa ccaaggatgg gcagtgtggc agtccattag tatcaactag 5040 agatgggttc attgttggta tacactcagc atcgaatttc accaacacaa acaattattt 5100 cacaagcgtg ccgaaaaact tcatggaatt gttgacaaat caggaggcgc agcagtgggt 5160 tagtggttgg cgattaaatg ctgactcagt attgtggggg ggccataaag ttttcatgag 5220 caaacctgaa gagccttttc agccagttaa ggaagcgact caactcatga atgaattggt 5280 gtactcgcaa ggtggtggtg aaaacctgta cttccagggt aaccacgctg aggagaagaa 5340 gctgaagctt agcaacactg tgctgccctc ggagtccatg aaggtggtgg ctgaatccat 5400 gggcatcgcc cagattcagg aggagacctg ccagctgcta acggatgagg tcagctaccg 5460 catcaaagag atcgcacagg atgccttgaa gttcatgcac atggggaagc ggcagaagct 5520 caccaccagt gacattgact acgccttgaa gctaaagaat gtcgagccac tctatggctt 5580 ccacgcccag gagttcattc ctttccgctt cgcctctggt gggggccggg agctttactt 5640 ctatgaggag aaggaggttg atctgagcga catcatcaat acccctctgc cccgggtgcc 5700 cctggacgtc tgcctcaaag ctcattggct gagcatcgag ggctgccagc cagctatccc 5760 cgagaacccg cccccagctc ccaaagagca acagaaggct gaagccacag aacccctgaa 5820 gtcagccaag ccaggccagg aggaagacgg acccctgaag ggcaaaggtc aaggggccac 5880 cacagccgac ggcaaaggga aagagaagaa ggcgccgccc ttgctggagg gggccccctt 5940 gcgactgaag ccccggagca tccacgagtt gtctgtggag cagcagctct actacaagga 6000 gatcaccgag gcctgcgtgg gctcctgcga ggccaagagg gcggaagccc tgcaaagcat 6060 tgccacggac cctggactgt atcagatgct gccacggttc agtaccttta tctcggaggg 6120 ggtccgtgtg aacgtggttc agaacaacct ggccctactc atctacctga tgcgtatggt 6180 gaaagcgctg atggacaacc ccacgctcta tctagaaaaa tacgtccatg agctgattcc 6240 agctgtgatg acctgcatcg tgagcagaca gttgtgcctg cgaccagatg tggacaatca 6300 ctgggcactc cgagactttg ctgcccgcct ggtggcccag atctgcaagc attttagcac 6360 aaccactaac aacatccagt cccggatcac caagaccttc accaagagct gggtggacga 6420 gaagacgccc tggacgactc gttatggctc catcgcaggc ttggctgagc tgggacacga 6480 tgttatcaag actctgattc tgccccggct gcagcaggaa ggggagcgga tccgcagtgt 6540 gctggacggc cctgtgctga gcaacattga ccggattgga gcagaccatg tgcagagcct 6600 cctgctgaaa cactgtgctc ctgttctggc aaagctgcgc ccaccgcctg acaatcagga 6660 cgcctatcgg gcagaattcg ggtcccttgg gcccctcctc tgctcccagg tggtcaaggc 6720 tcgggcccag gctgctctgc aggctcagca ggtcaacagg accactctga ccatcacgca 6780 gccccggccc acgctgaccc tctcgcaggc cccacagcct ggccctcgca cccctggctt 6840 gctgaaggtt cctggctcca tcgcacttcc tgtccagaca ctggtgtctg cacgagcggc 6900 tgccccacca cagccttccc ctcctccaac caagtttatt gtaatgtcat cgtcctccag 6960 cgccccatcc acccagcagg tcctgtccct cagcacctcg gcccccggct caggttccac 7020 caccacttcg cccgtcacca ccaccgtccc cagcgtgcag cccatcgtca agttggtctc 7080 caccgccacc accgcacccc ccagcactgc tccctctggt cctgggagtg tccagaagta 7140 catcgtggtc tcacttcccc caacagggga gggcaaagga ggccccacct cccatccttc 7200 tccagttcct cccccggcat cgtccccgtc cccactcagc ggcagtgccc tttgtggggg 7260 gaagcaggag gctggggaca gtccccctcc agctccaggg actccaaaag ccaatggctc 7320 ccagcccaac tccggctccc ctcagcctgc tccgcggtcc ggtggtggtg gtgaaaacct 7380 gtattttcag ggcgagtctg gcaagacggc ttctcccaag agcatgccga aagatgcaca 7440 gatgatggca caaatcctga aggatatggg gattacagaa tatgagccaa gagttataaa 7500 tcagatgttg gagtttgcct tccgatatgt gaccacaatt ctagatgatg caaaaattta 7560 ttcaagccat gctaagaaag ctactgttga tgcagatgat gtgcgattgg caatccagtg 7620 ccgcgctgat cagtctttta cctctcctcc cccaagagat tttttattag atattgcaag 7680 gcaaagaaat caaacccctt tgccattgat caagccatat tcaggtccaa ggttgccacc 7740 tgatagatac tgcttaacag ctccaaacta taggctgaaa tctttacaga aaaaggcatc 7800 aacttctgcg ggaagaataa cagtcccgcg gttaagtgtt ggttcagtta ctagcagacc 7860 aagtactccc acactaggca caccaacccc acagaccatg tctgtttcaa ctaaagtagg 7920 gactcccatg tccctcacag gtcaaaggtt tacagtacag atgcctactt ctcagtctcc 7980 agctgtaaaa gcttcaattc ctgcaacctc agcagttcag aatgttctga ttaatccatc 8040 attaatcggg tccaaaaaca ttcttattac cactaatatg atgtcatcac aaaatactgc 8100 caatgaatca tcaaatgcat tgaaaagaaa acgtgaagat gatgatgatg acgatgatga 8160 tgatgatgac tatgataatc tgcggtccgg ccaccatcat caccaccatt gataagctag 8220 cggccgcttt cgaatctaga gcctgcagtc tcgacaagct tgtcgagaag tactagagga 8280 tcataatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc 8340 tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag 8400 cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 8460 cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggatct 8520 gatcactgct tgagcctagg agatccgaac cagataagtg aaatctagtt ccaaactatt 8580 ttgtcatttt taattttcgt attagcttac gacgctacac ccagttccca tctattttgt 8640 cactcttccc taaataatcc ttaaaaactc catttccacc cctcccagtt cccaacgcca 8700 actccatgtg acaaaccgtc atcttcggct acttt 8735

Claims (36)

  1. 각 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame: ORF) 내에 각각 3 이상의 생물학적 활성 폴리펩티드를 코딩하는 2 이상의 폴리진을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리진을 구성하는 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 2 이상은 비-바이러스 기원이며, 폴리진을 구성하는 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 2 이상은 상기 폴리진의 유전자에 의해 코딩된 1 이상의 다른 폴리펩티드와 적어도 일시적으로 상호작용할 수 있으며, 또 각 폴리진을 구성하는 유전자들은 1 이상의 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 서열, 또는 1 이상의 자가 절단성 펩티드를 코딩하는 서열, 또는 1 이상의 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 서열 및 1 이상의 자가 절단성 펩티드를 코딩하는 서열에 의해 서로 접속되어 있는 폴리뉴클레오티드.
  2. 제 1항에 있어서, 각 폴리진은 폴리진의 발현을 제어할 수 있는 프로모터 서열에 작용가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1항에 있어서, 각 ORF는 터미네이터 서열과 접하고 있는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 1항에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 포티바이러스 NIa 프로테아제, 포티바이러스 HC 프로테아제, 포티바이러스 P1 (P35) 프로테아제, 비오바이러스 NIa 프로테아제, 비오바이러스 RNA-2-암호화된 프로테아제, 아프토바이러스 L 프로테아제, 엔테로바이러스 2A 프로테아제, 리노바이러스 2A 프로테아제, 리코르나 3C 프로테아제, 코모바이러스 24K 프로테아제, 네포바이러스 24K 프로테아제, RTSV (벼 텅그로(tungro) 구형 바이러스) 3C상 프로테아제, PYVF (파스닙 황색 반점 바이러스(parsnip yellow fleck virus)) 3C상 프로테아제, 트롬빈, 인자 Xa 및 엔테로키나아제의 절단 부위로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제 4항에 있어서, 프로테아제 절단 부위는 TEV (담배 식각 바이러스) 프로테아제 절단부위인 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 1항에 있어서, 자가 절단 펩티드가 아프토바이러스(aphthovirus) 2A 펩티드 및 카르디오바이러스 2A 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제 6항에 있어서, 자가 절단 펩티드가 FMDV (수족구 질병 바이러스) 2A 펩티드인 폴리뉴클레오티드.
  8. 제 1항에 있어서, 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제에 대한 유전자를 더 함유하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제 8항에 있어서, 프로테아제 유전자가 폴리진의 1 이상의 일부인 폴리뉴클레오티드.
  10. 제 1항에 있어서, 1 이상의 폴리진이 4 이상의 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 10항에 있어서, 각 폴리진이 4 이상의 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 1항에 있어서, 폴리진의 뉴클레오티드 서열의 길이가 서로에 대해 20% 미만 정도로 상이한 폴리뉴클레오티드.
  13. 제 1항에 있어서, 벡터 또는 숙주 세포에 통합하기 위한 1 이상의 부위를 더 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 제 1항에 있어서, 폴리진을 구성하는 유전자는 멀티단백질 복합체의 구성원을 암호화하는 유전자 및 대사성 경로의 구성원을 암호화하는 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) MCS1의 경우 프로모터 P1 및 터미네이터 서열 T1이 측면에 위치하고 또 MCS2의 경우 프로모터 P2 및 터미네이터 서열 T2이 측면에 위치하는 다중 클로닝 부위 MCS1 또는 MCS2를 각각 포함하는, 헤드-투-헤드, 헤드-투-테일 또는 테일-투-테일 배열로 된 2 이상의 발현 벡터
    Figure 112013050496170-pct00027
    ;
    (b) 2 이상의 제한 부위 A 및 B를 포함하는 프로모터 P1 및 P2 사이에 1 이상의 증식 모듈 M;
    (c) 발현 카세트의 하나와 측면을 접하는 2 이상의 제한부위 X 및 Y를 포함하며,
    이때
    (d) 제한부위 A 및 X 뿐만 아니라 B 및 Y는 상호친화성(compatible)이지만,
    (e) AY 및 BX의 결찰 생성물은 제한부위 A, B, X 및 Y에 대해 특이적인 제한효소 a, b, x 또는 y에 의해 효소적으로 절단되지 않으며, 또
    (f) 제한부위 A 및 B 뿐만 아니라 제한부위 X 및 Y는 상호친화성이 아니고(incompatible)이며, 각 폴리진은 발현 카세트의 하나에 삽입되는,
    하기 구조식(I)에 따른 기능적 배열을 포함하는 폴리뉴클레오티드:
    Figure 112013050496170-pct00005
  16. 제 15항에 있어서, 증식 모듈 M 중의 제한 부위 A 및 B는 제한부위 BstZ171, SpeI, ClaI 및 NruI 및 이소시조머(isoschizomer)에 의해 절단된 제한 부위로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제 15항에 있어서, 제한부위 X 및 Y는 PmeI 및 AvrII 또는 그의 이소시조머에 의해 절단된 제한부위로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  18. 제 15항에 있어서,
    (a) 프로모터 P1 및 P2는 polh 및 p10으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    (b) 터미네이터 서열은 SV40 및 HSVtk로 구성된 군으로부터 선택되며;
    (c) 증식 모듈 M 중의 제한 부위 A 및 B는 제한부위 BstZ171I, SpecI, ClaI 및 NruI으로 구성된 군으로부터 선택되고;
    (d) 제한부위 X 및 Y는 제한부위 PmeI 및 AvrII으로 구성된 군으로부터 선택되며; 또
    (e) 바이러스 통합 부위는 cre-lox 및 Tn7로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제 1항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  20. 제 19항에 있어서, 진핵생물 발현 벡터 또는 전달 벡터인 벡터.
  21. 제 19항에 있어서, 바이러스인 벡터.
  22. 제 21항에 있어서, 배큘로바이러스 발현 벡터인 벡터.
  23. 제 22항에 있어서, 배큘로바이스 유전자 v-cath 및 chiA는 기능적으로 파쇄되는 벡터.
  24. 제 19항에 있어서, 부위 특이적 리콤비나아제(SSR)에 대한 부위를 포함하는 벡터.
  25. 제 24항에 있어서, cre-lox 특이적 재조합을 위한 LoxP 부위를 포함하는 벡터.
  26. 제 19항에 있어서, 트랜스포손 요소를 포함하는 벡터.
  27. 제 26항에 있어서, 트랜스포손 요소가 Tn7 부착 부위인 벡터.
  28. 제 1항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 제 19항에 따른 벡터, 또는 제 1항에 따른 폴리뉴클레오티드 및 제 19항에 따른 벡터를 함유하는 숙주 세포.
  29. 제 28항에 있어서, 세균, 효모 세포, 곤충 세포, 선충 세포 및 포유동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  30. 제 29항에 있어서, 대장균(E. coli), 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae), 피. 파스토리스(P. pastoris), 에스. 폼베(S. pombe), 씨, 알비칸스(C. albicans), Sf9 세포, 씨. 엘레간스(C. elegans) 세포, , 인간 세포, 설치류 세포, 돼지 세포, 소 세포 및 양 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  31. 제 1항에 따른 폴리뉴클레오티드, 또는 제 19항에 따른 벡터, 또는 제 1항에 따른 폴리뉴클레오티드 및 제 19항에 따른 벡터에 의해 형질전환된 트랜스제닉 비-인간 동물.
  32. 제 31항에 있어서, 설치류, 돼지, 소 및 씨. 엘레간스(C. elegans)로부터 선택되는 동물.
  33. (a) 폴리진을 구성하는 유전자의 코딩 영역을 증폭하는 단계;
    (b) 상기 코딩 영역에 1 이상의 프로테아제 절단 부위, 또는 1 이상의 자가 절단 펩티드, 또는 1 이상의 프로테아제 절단 부위 및 1 이상의 자가 절단 펩티드를 코딩하는 서열을 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 단계(a) 및 (b)로부터 생긴 단편들을 조립하여 각 폴리진 내에 단일 ORF가 생기게 하는 단계; 및
    (d) 2 이상의 폴리진을 단일 폴리뉴클레오티드에 조합하는 단계를 포함하는 제 1항에 따른 폴리뉴클레오티드의 제조 방법.
  34. (a) 제 28항에 따른 숙주 세포를 폴리진의 발현을 허용하는 조건하의 적합한 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배지, 또는 숙주 세포, 또는 배지 및 숙주 세포로부터 폴리진에 의해 암호화된 발현 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 멀티단백질 복합체를 제조하는 방법.
  35. 삭제
  36. 삭제
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