JP5036741B2 - 翻訳段階で自己切断活性を有するポリヌクレオチド配列を同定するための方法およびシステム - Google Patents

Description

本発明は一般に、翻訳段階で自己切断活性を有する単離されたポリヌクレオチドを同定する方法および／またはシステムに関する。具体的には、本発明は、昆虫発現システムにおける蛍光分布パターンを用いることにより２Ａ様配列を同定する方法および／またはシステムに関する。

バイシストロン性または多シストロン性発現ベクターは、例えば、異種オリゴマータンパク質の産生、遺伝子治療、細胞組織工学などの様々な面で有用であり、標的タンパク質を等モル（ｅｑｕｉｍｏｌａｒ）発現させる。

多シストロン性発現ベクターを作成するための一般的な方法は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、多重プロモーター、及び細胞プロテアーゼ部位を介しまたは介さずに連接する融合タンパク質を用いることを含む。しかしながら、この三つの方法は、それらの実用化において各々の障害に遭う。

ＩＲＥＳエレメントが大きいので、その利用は、例えば、ウイルスおよびトランスポゾンベースのベクターなどの、サイズが制限されたベクターに限られるかもしれない。更に転写物における遺伝子の順序のために、下流の遺伝子発現が減弱される潜在的可能性がある（例えば、非特許文献１を参照）。

融合タンパク質の産生は、タンパク質の不適切なフォールディングまたは輸送により、その機能を弱める結果となる潜在的可能性がある。また、多重プロモーターの利用は、レポーター遺伝子の発現と標的遺伝子の発現との密接関連性を弱める結果となる（非特許文献２を参照）。

最近の方法は、同じ転写物から複数のタンパク質を発生し得る多シストロン性発現ベクターを産生するために、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）の２Ａまたは２Ａ様の加水分解酵素のシス作用性エレメント（ＣＨＹＳＥＬ）を利用することを含む（例えば、非特許文献３および非特許文献４を参照）。多くのウイルスは複数のタンパク質をコードし、それらのタンパク質が２Ａまたは２Ａ様配列において単一のタンパク質産物に切断される（非特許文献５、非特許文献６および非特許文献７を参照）。該２Ａ様配列は、標準的なＡｓｐ−Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏのモチーフを含み、そのモチーフがグリシン残基とプロリン残基との間のリンケージを自己切断できる（非特許文献８および非特許文献９を参照）。この切断機構は、グリシン残基とプロリン残基との間におけるペプチド結合の形成を防止するため、リボソームの活性が２Ａ様配列に変更されたリボソーム跳躍機構（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）に由来するものと考えられる。従って、２Ａ様配列の上流におけるタンパク質が放出されると共に、その下流における遺伝子の翻訳を続けることができる（非特許文献１０および非特許文献１１を参照）。

２Ａ様配列の多くは、哺乳類細胞に感染したウイルス中に発見される。一方、わずかの２Ａ様配列は昆虫ウイルスからクローニングされる。更に、既知のウイルス２Ａ様配列は、昆虫発現システムではやはりｍＲＮＡ翻訳中に完全に自己切断できないことを示し、その結果、上流および下流のそれぞれの標的ペプチドまたはタンパク質の量が不足する。

Ｈｅｎｎｅｃｋｅ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２９： ３３２７−３３３４； Ｆｕｘ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８６： １７４−８７ Ｇａｋｅｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７： １９７９−１９８５； ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ， Ｐ．， （２００４） Ｇｅｎｅｔ． Ｖａｃｃ． Ｔｈｅｒ． ２： １−１２ Ｓｚｙｍｃｚａｋ， Ａ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２２： ５８９−５９４； ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６： １９８−２０８ Ｅｌ Ａｍｒａｎｉ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， （２００４） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １３５： １６−２４ Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ， Ａ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０： ７５４−７６２ Ｄｏｎｎｅｌｌｙ， Ｍ． Ｌ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８２： １０２７−１０４１ Ｒｙａｎ， Ｍ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７２： ２７２７−２７３２ Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ， Ａ． Ｃ． （１９９０） Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４４： ６０３−６２３ Ｈａｈｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ， Ａ． Ｃ．， （１９９６） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７０： ６８７０−６８７５ ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， （２００３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７８： １１４４１−１１４４８； Ｄｏｎｎｅｌｌｙ， Ｍ． Ｌ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， （２００１） Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ８２： １０１３ − １０２５

従って、それぞれコードされている、機能的に連結された上流および下流のタンパク質の収率を高められるように、完全に自己切断できる改良された２Ａ様配列を求める要望が依然として存在する。本発明は、潜在的な配列が所望の２Ａ様配列であるか否かを決定するための指標として、昆虫発現システムに示された独特の蛍光分布パターンを利用することで潜在的な２Ａ様配列を同定するための、効率的且つ取扱い容易な方法および／またはシステムを提供することにより、前述の問題に取り組んでいる。

本明細書に具体的に広く記載されているとおり、本発明は、昆虫発現システムにおいて、ｍＲＮＡ翻訳中にリボソーム跳躍を誘導し得るポリヌクレオチド配列を同定するための方法および／またはシステムを特徴とする。

従って、本発明は、昆虫発現システムにおいて２Ａ様配列を同定する方法を提供することを目的とする。この方法は、
（ａ）プロモーターと、
前記プロモーターに機能的に連結され且つ分泌タンパク質をコードする第一ポリヌクレオチドと、
前記第一ポリヌクレオチドに機能的に連結された候補配列と、
前記候補配列に機能的に連結され且つ蛍光タンパク質をコードする第二ポリヌクレオチドと、を含む組換えベクターによって昆虫細胞に感染する工程、および
（ｂ）昆虫細胞における蛍光分布パターンに基づき、該蛍光が細胞核も含めて昆虫細胞内に均一に分布する場合、前記候補配列が２Ａ様配列である一方、該蛍光が細胞核外のスペースのみに限定される、または細胞外培地に分泌される場合、前記候補配列が２Ａ様配列ではないように、前記候補配列が翻訳段階で自己切断活性を有するか否かを決定する工程、を有する。

好適な一実施例において、前記候補配列は、Ｐｅｒｉｎａ ｎｕｄａ Ｐｉｃｏｒｎａ様ウイルス（Ｐｅｒｉｎａ ｎｕｄａ Ｐｉｃｏｒｎａ−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ、ＰｎＶ）から単離されるものであり、配列番号１のポリヌクレオチド配列を有する。本発明の方法により同定された配列は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、該ポリヌクレオチドは、グリシンとプロリンの間に位置する翻訳段階で自己切断部位を含み、また、分泌タンパク質及び蛍光タンパク質が生体内で約１：１の比率で産生されることを示し、翻訳段階で自己切断活性が１００％までに達する。別の好適な実施例において、前記候補配列は、ペリナ・ヌダ・ピコルナ様ウイルス（ＰｎＶ）から単離され、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列番号３のポリヌクレオチド配列を有する。一実施例において、前記分泌タンパク質は分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）であり、前記蛍光タンパク質は強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）である。

本発明は、翻訳段階で自己切断活性を有する２Ａ様配列を同定するための昆虫システムを提供することを別の目的とする。前記システムは、
プロモーターと、
前記プロモーターに機能的に連結され且つ分泌タンパク質をコードする第一ポリヌクレオチドと、
前記第一ポリヌクレオチドに機能的に連結された候補配列と、
前記候補配列に機能的に連結され且つ蛍光タンパク質をコードする第二ポリヌクレオチドと、を有する組換えベクターに感染した昆虫細胞を有し、
蛍光顕微鏡により観察する際の前記昆虫細胞における蛍光分布パターンを指標として利用して、該蛍光が細胞核も含めて前記昆虫細胞内に均一に分布する場合、前記候補配列が２Ａ様配列である一方、該蛍光分布パターンがドーナツ形をし、且つ細胞核外のスペースのみに限定される、または細胞外培地に分泌される場合、前記候補配列が２Ａ様配列ではないように、前記候補配列が２Ａ様配列であるか否かを決定する。

本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の説明に示される。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および図面、並びに特許請求の範囲から明らかになろう。

上記概略の説明および以下の詳細な説明は本発明の例であり、特許請求される発明の更なる説明を提供することを目的としていることが理解される。

本明細書は、少なくとも一つのカラー図を含む。カラー図を添付した本明細書の写しは、要望に応じて公定料金を支払うことで、特許商標庁から入手できる。本発明は図面および実施例で例証され、これらは例示にすぎず、本発明を限定するものではない。
（ａ）ｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅ、（ｂ）ｖＡｃ−ＳＥＦＰ、および（ｃ）ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅの組換えベクターを例証する模式図である。 図１の組換えベクターに感染した後４日目に撮ったＳｆ２１昆虫細胞の蛍光写真である。 図１の組換えベクターに感染したＳｆ２１細胞における、ＥＧＦＰ遺伝子のそれぞれの発現レベルを例証するウエスタンブロットの図である。 図１の組換えベクターに感染したＳｆ２１細胞における、それぞれのＳＥＡＰ活性を例証する棒グラフである。 図１の組換えベクターに感染したＳｆ２１細胞における、ＥＧＦＰ発現の定量結果を例証する棒グラフである。

別段に示されていない限り、本明細書で用いられている用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される用語と同じ意味を有し、本発明の実施には、本発明が属する分野の知識における微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技術を用いる。

本発明の実施は、翻訳段階で自己切断活性を有するポリヌクレオチドを同定するためのシステムおよび／または方法について、以下詳細に述べている。

本発明の一実施形態によれば、昆虫システムにおける２Ａ様配列を同定するための方法が提供されるが、本明細書に示される昆虫細胞システムだけに限定されない。前記方法は、（ａ）プロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結され且つ分泌タンパク質をコードする第一ポリヌクレオチドと、前記第一ポリヌクレオチドに機能的に連結された２Ａ様候補配列と、蛍光タンパク質をコードする前記候補配列に機能的に連結された第二ポリヌクレオチドとを含む組換えベクターによって昆虫細胞に感染する工程、および（ｂ）昆虫細胞における蛍光分布パターンに基づき、該蛍光が細胞核も含めて昆虫細胞内に均一に分布する場合に、前記候補配列が２Ａ様配列である一方、該蛍光分布パターンがドーナツ形をしていて、且つ細胞核外のスペースのみに限定される、または細胞外培地に分泌される場合に、前記候補配列が２Ａ様配列ではないとする、前記候補配列が翻訳段階で自己切断活性を有するか否かを決定する工程、を有する。

本発明において、翻訳段階で自己切断活性を有する２Ａ様配列は、ウイルスに由来するＤＮＡまたはｃＤＮＡであり、好ましくは、ピコルナウイルスファミリーに由来するものであり、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、カルジオウイルス、アフトウイルス、パレコウイルス、エルボウイルス、コブウイルス、パレコウイルス、テッショウウイルスまたは昆虫由来のピコルナ様ウイルスおよび蚕の伝染性軟化病様ウイルス（ｉｆｌａｖｉｒｕｓ）を含むが、それらだけには限定されない。本明細書における「翻訳段階で自己切断活性」とは、自らのＣ末端を切断することによって自己タンパク分解または自己切断でき、一次切断産物を産生できる配列の翻訳効果として定義される。潜在的な２Ａ様配列または候補配列は、カルジオウイルスおよびアフトウイルスのゲノムにおいて発見された２Ａ配列、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のような、任意の既知の２Ａ配列に対応する配列相同性、二次または三次構造類似性、あるいは保存領域の存在にあわせて選択することができる。好適な一実施形態において、前記候補配列は、配列相同性に基づいてペリナ・ヌダ・ピコルナ様ウイルス（ＰｎＶ）から単離され、任意の既知の２Ａ配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である、配列番号１または３のポリヌクレオチド配列を有する。

上で記述される方法に従って選択された候補配列は、次に二つのレポーター遺伝子と共に、組換えウイルスベクターにクローニングした。本明細書において、「レポーター遺伝子」とは、本発明に設定される条件（下記に更に説明する）に従って、宿主細胞（つまり発現すると）における蛍光または分泌能力のような独特な特性、選択された候補配列を同定する遺伝子を意味する。本発明において、宿主細胞における蛍光分布パターンのような、レポーター遺伝子の発現による効果は、候補配列が所望の２Ａ様配列であるかを蛍光顕微鏡下で容易に決定する指標として利用される。好適な一実施例において、組換えウイルスベクターは、プロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結され且つ分泌タンパク質をコードする第一レポーター遺伝子と、前記第一レポーター遺伝子に機能的に連結された候補配列と、前記候補配列に機能的に連結され且つ蛍光タンパク質をコードする第二レポーター遺伝子とを順次に含むように作製されている。本明細書において、「プロモーター」とは、該プロモーター遺伝子の下流におけるコード配列の転写を開始させることができる核酸配列を意味する。プロモーターは誘導性でも細胞特異的でもよい。昆虫細胞システムにおける発現に好ましいプロモーターとしては、ポリヘドリン、ｐ１０、ｖｐ３９、ｉｅ１およびｉｅ２プロモーターが挙げられ、更に好ましくは、ポリヘドリンプロモーターである。「機能的に連結される」とは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が制御配列に結合する際に、ポリペプチドコード配列と転写および翻訳調節配列とを、組換えベクターにおいて、ポリペプチドを発現できる方法で連結することを意味する。第一レポーター遺伝子は、分泌型ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のような分泌タンパク質をコードする。第二レポーター遺伝子は蛍光タンパク質をコードし、蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、アネモニア・マジャノ蛍光タンパク質（ａｍＦＰ）、Ｚｏａｎｔｈｕｓ ｓｐ．由来の蛍光タンパク質（ｚＦＰ）、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．由来の蛍光タンパク質（ｄｓＦＰ）、Ｃｌａｖｕｌａｒｉａ ｓｐ．由来の蛍光タンパク質（ｃＦＰ）、ホタルルシフェラーゼのようなルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、およびＲｅｎｉｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ由来のルシフェラーゼが挙げられるが、それだけには限らない。一実施例において、第一レポーター遺伝子はＳＥＡＰをコードし、第二レポーター遺伝子はＥＧＦＰをコードする。好適なウイルスベクターは、バキュロウイルスに由来するものであり、オートグラファーカリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）、ＰｎＭＮＰＶ（ペリナ・ヌダ核多角体病ウイルス）、ＢｍＮＰＶ（カイコ核多角体病ウイルス）、ＬｄＭＮＰＶ（マイマイガ核多角体病ウイルス）、およびＯｐＭＮＰＶ（オルギア・シュードツガタ核多角体病ウイルス）を含むが、それだけには限らない。

本発明の一つの好適な実施例に従って調製された組換えベクターは、その後に、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ＩＰＢＬ−Ｓｆ２１昆虫細胞系のような昆虫発現システムをトランスフェクトするのに用いられる。しかしながら、他の昆虫発現システムも用いられる。当業者に理解されるように、前述の融合核酸（即ち、順次に第一レポーター遺伝子、候補配列、および第二レポーター遺伝子を有する核酸）に組み入れられた候補配列が２Ａ様配列である場合、第一および第二レポーター遺伝子のそれぞれのタンパク質産物、即ち、分泌タンパク質および蛍光タンパク質を発現させ、また、前記分泌タンパク質が最終的に細胞外培地に輸送されるのに対して、前記蛍光タンパク質は依然として宿主細胞に留まる。それとは対照的に、融合核酸に組み入れられた候補配列が２Ａ様配列ではない場合、発現された候補配列は、第一及び第二タンパク質産物を結合させて融合タンパク質を形成するために、ペプチドリンカーとして作用する。融合したタンパク質、または融合した二つのレポータータンパク質は、その後、融合したタンパク質の分泌タンパク質のために、宿主細胞外に輸送される。従って、蛍光顕微鏡下で宿主細胞の蛍光分布パターンを容易に観察することにより、ウエスタンブロットアッセイまたはタンパク質の活性測定のような、より伝統的且つ時間がかかる決定方法に戻らずに、候補配列が２Ａ様配列であるか否かを決定する容易且つ有効な手段を提供する。好適な一実施例において、宿主細胞における均一な蛍光パターンは、候補配列が二つのタンパク質産物を産生するために自己切断でき、所望の２Ａ様配列であることを示す。別の実施例において、ドーナツ形の蛍光パターンが観察され、候補配列が所望の２Ａ様配列ではないことを示し、二つのそれぞれのタンパク質産物の代わりに、融合タンパク質が産生され且つ宿主細胞外に分泌される。そのため、蛍光がサイトゾルである細胞核外のスペースのみに限られ、または細胞外培地に分泌され、それによってドーナツ形の蛍光パターンを形成する。

好適な一実施例において、同定された２Ａ様配列または候補配列は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を有し、前記ポリヌクレオチド配列が、グリシン残基とプロリン残基の間に位置して保存されている自己切断部位を含む配列番号２の核酸配列を有するポリペプチドをコードする。別の好適な実施例において、同定された２Ａ様配列または候補配列は、配列番号３のポリヌクレオチド配列を有し、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号４の核酸配列を有するポリペプチドをコードする。

更に、本発明の方法および／またはシステムは、二つのレポータータンパク質の、平衡したまたは等分子の産生を提供する。つまり、二つのレポータータンパク質は、相対的に同じ割合で産生される。好適な一実施例において、第一レポーター遺伝子にコードされる分泌タンパク質と、第二レポーター遺伝子にコードされる蛍光タンパク質は、約１：１の比率で産生される。

本発明の別の実施形態によれば、翻訳段階で自己切断活性を有する２Ａ様配列を同定するためのシステムが提供されている。前記システムは、プロモーターと、前記プロモーターに機能的に連結され且つ分泌タンパク質をコードする第一ポリヌクレオチドと、前記第一ポリヌクレオチドに機能的に連結された候補配列と、前記候補配列に機能的に連結され且つ蛍光タンパク質をコードする第二ポリヌクレオチドとを含む組換えベクターに感染した昆虫細胞を有するものであり、前記昆虫細胞における蛍光分布パターンを指標として利用し、該蛍光が細胞核も含めて前記昆虫細胞内に均一に分布する場合、前記候補配列が２Ａ様配列である一方、該蛍光分布パターンがドーナツの形をする場合、前記候補配列が２Ａ様配列ではないように、前記候補配列が２Ａ様配列であるか否かを決定する。

当業者に本発明を利用する器具を提供するために、レポーター遺伝子の核酸及び本発明の昆虫細胞は、キットに組み入れられる。キットに含まれる構成成分は、ウイルスベクター、組換えウイルスコンストラクトを作るための酵素剤、ウイルスの増幅のための細胞、および標的細胞へのトランスフェクション及び形質導入のための試薬、ならびに本キットの使用方法を説明するパンフレット、テープ、ＣＤ、ＶＣＤまたはＤＶＤなどである。

以下の実施例は、本発明を例証するために提供されているが、本発明を限定するものではない。

［実施例１］プラスミドコンストラクトの作成
実施例１．１ ｐＢＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅ
ｐＢａｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅベクターは、ＤｓＲｅｄ遺伝子の代わりにＳＥＡＰレポーター遺伝子を用いたこと以外は、ｐＢａｃ−ＤＲｈｉｒ−Ｅベクターを作成するための陳らが記載した手順（Ｂｉｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕ． ２００５ ３３５； ６１６−６２３）と類似の手順に従って構築した。従って、ｐＢＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅは、ＳＥＡＰレポーター遺伝子、ムギクビレアブラムシ腸管ウイルスのＩＲＥＳ配列（ＲｈＰＶ）、およびＥＧＦＰレポーター遺伝子を順次に含む。

実施例１．２ ｐＢＡｃ−ＳＥＦＰ
ｐＢａｃ−ＤＲｈｉｒ−Ｅプラスミドにおいて、ＳＥＡＰ遺伝子は、ＥＧＦＰ遺伝子とインフレーム融合した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙ．ｌ Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕ． ２００５ ３３５； ６１６−６２３）。簡潔に述べると、ＳＥＡＰ断片は、まず５’−ＡＴＡＴＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧ−３’であるフォワードプライマー（配列番号５であり、下線で示すＢａｌＩＩ部位を有する）、および５’− ＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＧＧＣＣＧＧＣ−３’であるリバースプライマー（配列番号６であり、下線で示すＢｇｌＩＩ部位を有する）を用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ｐＧＳ−ＨＣＶプラスミドから増幅した。リバースプライマーにおける二つのＧＧヌクレオチド（ボールド体およびイタリック体で表示される）は、ＳＥＡＰ遺伝子の３’末端とＥＧＦＰ遺伝子の５’末端の間にインフレーム融合させるように添加した。ＰＣＲ後、ＢｇｌＩＩにより消化した１．６ｋｂのＳＥＡＰ遺伝子断片は、ＢａｍＨＩにより消化したｐＢａｃ−ＤＲｈｉｒ−Ｅプラスミドにサブクローニングし、得られたプラスミドはｐＢａｃ−ＤＲｈｉｒ−ＳＥＦＰと呼ばれ、順次にＤｓＲｅｄレポーター遺伝子、ＲｈＰＶ ＩＲＥＳ配列、およびＳＥＡＰとＥＧＦＰの融合遺伝子を含んでいた。

ｐＢａｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅプラスミドは、次にＳＥＡＰ−Ｒｈｉｒ−ＥＧＦＰ断片を除去するために、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素により消化した。ｐＢａｃ−ＤＲｈｉｒ−ＳＥＦＰプラスミドも同じように、ＳＥＡＰ−ＥＧＦＰの融合断片を除去するように、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ制限酵素により消化した。その次に、ＳＥＡＰ−ＥＧＦＰ断片を、ｐＢａｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−ＥプラスミドのＢａｍＨＩおよびＳａｌＩ部位にクローニングし、得られたプラスミドはｐＢａｃ−ＳＥＦＰと呼ばれる。

実施例１．３ ｐＢａｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅ
ＳＥＡＰ−ＰｎＶ２ＡＩ遺伝子断片は、まず５’−ＡＡＴＧＧＡＴＣＣＧＣＴＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧ−３’であるフォワードプライマー（配列番号７であり、下線で示すＢａｍＨＩ部位を有する）、および５’−ＡＡＴＡＧＡＴＣＴＡＡＧＧＧＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＧＡＣＴＣＡＡＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＣＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＣＧＡＡＧＣＧＧＣＣ−３’であるリバースプライマー（配列番号８であり、下線で示すＢｇｌＩＩ部位を有する）を用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、ｐＢａｃ−ＤｓＲｅｄ−ＰｎＶ−ＳＥＡＰ−ＲｈＰＶ−ＥＧＦＰプラスミドから増幅した。

増幅したＳＥＡＰ−ＰｎＶ２ＡＩ断片およびＰＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ）はＴＡクローニングのために用いられ、得られたプラスミドは以下でＰＣＲ２．１／ＳＥＡＰ−ＰｎＶ２ＡＩと称される。ＰＣＲ２．１／ＳＥＡＰ−ＰｎＶ２ＡＩプラスミドをＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩにより消化し、ＳＥＡＰ−ＰｎＶ２ＡＩ断片を除去した。除去されたＳＥＡＰ−ＰｎＶ２ＡＩ断片は、次にｐＢａｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−ＥプラスミドのＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩ部位にライゲートし、得られたプラスミドは以下でｐＢａｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅと称される。

実施例１．４ 組換えベクターの産生
Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ＩＰＢＬ−Ｓｆ２１昆虫細胞系（以下、Ｓｆ２１細胞と称する）を、コンフルエント細胞単層（約２×１０⁵細胞／ウェル）が得られるまで、８％熱失活ＦＢＳを含むＴＮＭ−ＦＨ培地で培養した。１μｌのＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いることにより、０．８μｇの実施例１．１（ｐＢａｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅ）、実施例１．２（ｐＢａｃ−ＳＥＦＰ）または実施例１．３（ｐＢａｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅ）のプラスミドは、０．２５μｇの直線化されたＢａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅバキュロウイルスＤＮＡと共に、コンフルエントＳｆ２１昆虫細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、無ＦＢＳのＴＮＭ−ＦＨ培地で１２時間培養し、その後、８％熱失活ＦＢＳを含むＴＮＭ−ＦＨ培地で培養した。

Ｂａｃ−Ｎ−ＢｌｕｅバキュロウイルスＤＮＡと三つのベクター、つまり、実施例１．１（即ち、ｐＢａｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅ）、実施例１．２（即ち、ｐＢａｃ−ＳＥＦＰ）または実施例１．３（即ち、ｐＢａｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅ）との間にＤＮＡ相同組換えが起これば、新たな組換えバキュロウイルス発現ベクターが形成され、それらの新たに形成された組換えベクターは、同時発現したＥＧＦＰから放射される緑色蛍光を用いて、従来の終点希釈法により選択することができる。選択された組換えバキュロウイルス発現ベクターは、それぞれｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅ、ｖＡｃ−ＳＥＦＰ、ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅと称される。

図１は、それぞれの組換えウイルス発現ベクター、（Ａ）ｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅ、（Ｂ）ｖＡｃ−ＳＥＦＰ、および（Ｃ）ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅを含む模式図である。本発明に用いられるプロモーターは、ポリヘドロンプロモーター（以下、Ｐ_PHと呼ばれる）である。組換えｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−ＥおよびｖＡｃ−ＳＥＦＰウイルス発現ベクターは、ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅベクターとの比較として用いた。

［実施例２］２Ａ様配列の同定
２．１ 蛍光パターンに基づく選択
実施例１．４の構築された組換えベクターにおける選択されたＰｎＶ２Ａ様配列が、リボソーム跳躍活性を有しない場合、ＳＥＡＰ遺伝子、ＰｎＶ２Ａ様配列、およびＥＧＦＰ遺伝子は、同じ転写物において発現した。従って、ＳＥＡＰ、ＰｎＶ２Ａ様ポリペプチドおよびＥＧＦＰを順次に含む融合タンパク質が発現され且つ細胞外に分泌され、ＥＧＦＰから放射した緑色蛍光は、細胞核外のスペースに限って緑色ドーナツのように見えた。それとは反対に、選択されたＰｎＶ２Ａ様配列がリボソーム跳躍活性を有する場合、ＰｎＶ２Ａ様配列は自己切断した。従って、ＳＥＦＰおよびＥＧＦＰは別個のポリペプチドとして発現され、ＥＧＦＰは細胞核も含めて細胞内に均一に分布したので、ＥＧＦＰから放射した緑色蛍光は、細胞内に均一に分布した。

組換えベクターであるｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅ、ｖＡｃ−ＳＥＦＰ、およびｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅにそれぞれ感染したＳｆ２１細胞（２４穴プレートにおいて、２×１０⁵細胞／ウェル）は、３００ｍｌの培養細胞溶解試薬（１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．８）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のトリトンＸ−１００、および７ｍＭのβ−メルカプトエタノール。）で１０分間溶解した。１２，８００ｒｐｍで３０分間遠心分離後、蛍光の測定のために、溶解した上清（１００μｌ）の小量を取り出した。ＥＧＦＰの蛍光スペクトルは、４８８ｎｍおよび５０７ｎｍにそれぞれ設定した励起および発光波長により、Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光分光光度計（Ｖａｒｉａｎ）を用いて測定した。

図２は、（Ａ）ｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅ、（Ｂ）ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅ、および（Ｃ）ｖＡｃ−ＳＥＦＰの組換えベクターにそれぞれ感染したＳｆ２１細胞における緑色蛍光パターンを例証する。図２Ａにおいて、ｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅに感染したＳｆ２１細胞におけるＳＥＡＰは、キャップ依存型翻訳により発現し、ＥＧＦＰはＲｈＰＶ ＩＲＥＳ配列により発現することから、ＥＧＦＰから放射した緑色蛍光は、細胞核を含めて細胞内に均一に分布したと推測された。図２Ｂにおいて、ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅに感染したＳｆ２１細胞に示された緑色蛍光パターンは、ｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅのそれと類似しており、ＰｎＶ２Ａ様配列は自己切断でき、よって、同時発現したＥＧＦＰは均一に細胞核内に分布することを示した。

それとは反対に、図２Ｃにおいて、ｖＡｃ−ＳＥＦＰに感染したＳｆ２１細胞の緑色蛍光は、ドーナツ形のパターンを示し、融合タンパク質（ＳＥＡＰとＥＧＦＰ）が合成され、且つ、培地に分泌されるため、蛍光が細胞核外のスペースのみに限られることを示した。言いかえれば、バキュロウイルス発現システムにおいて選択された２ａ様配列は、ｖＡｃ−ＳＥＦＰベクターのパターンと類似する緑色蛍光パターンを示す場合、選択された２Ａ様配列は、所望の２Ａ様配列ではなく、自己切断またはリボソーム跳躍を誘導することができない。

２．２ ウエスタンブロットの結果に基づく選択
選択されたＰｎＶ２Ａ様配列の翻訳段階での自己切断活性は、更にウエスタンブロット分析により確認した。簡潔に述べると、ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅ、ｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−ＥおよびｖＡｃ−ＳＥＦＰを含めて実施例１．４のベクターにそれぞれ感染したＳｆ２１細胞を収集して溶解した。細胞ライセートにおけるタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、続いて、ポリビニリデンジフルオリド膜（ＰＶＤＦ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写した。その膜は、次にトリス緩衝液（１００ｍＭのｐＨ７．４のトリス、１００ｍＭの塩化ナトリウム、および０．１％のトゥイーン２０）により、室温で１時間ブロックした。

ブロッキングの後、膜を抗ＥＧＦＰ抗体（１：２０００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣｌｏｎＴｅｃｈ社、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、非結合の抗ＥＧＦＰ抗体を除去するために、トリス緩衝液を用いて膜を室温で毎回５分間、３回洗浄した。ＰＶＤＦ膜は、その次に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役二次抗体と共に（１：２５００）、室温で１時間インキュベートした。ＰＶＤＦ膜は、非結合の二次抗体を除去するために、同じトリス緩衝液を用いて室温で毎回５分間、３回洗浄した。結果を図３に示す。

ＰｎＶ２Ａ様配列がリボソーム跳躍をうまく誘導した場合、ＥＧＦＰタンパク質およびＳＥＡＰタンパク質は別個に発現し、また、およそ２７ｋＤａのＥＧＦＰタンパク質が検出される。これに対して、ＰｎＶ２Ａ様配列の転写物が自己切断しない場合、およそ１００ｋＤａの分子量を有するＥＧＦＰおよびＳＥＡＰの融合タンパク質が産生される。

図３は、サイトゾル（細胞内）（それぞれレーン１、３および５）および培地（分泌したタンパク質）（それぞれレーン２、４および６）における、ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅ、ｖＡｃ−ＳＥＦＰ、およびｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅ組換えベクターに感染したＳｆ２１昆虫細胞のそれぞれのＥＧＦＰレベルを例証する。約２７ｋＤａのＥＧＦＰが産生され（レーン１対レーン２）、ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅにおける選択されたＰｎＶ２Ａ様配列は自己切断できることは明らかである。ｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅは、ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅに類似するパターンも示した（レーン５対レーン６）。レーン４において、約１００ｋＤａのＥＧＦＰタンパク質が検出され、ＥＧＦＰはＳＥＡＰと融合したことを示す。

さらに、図３のレーン１および２に例証された結果は、融合タンパク質の量（分子量約１００ｋＤａ）が無視できるものであることから、ＰｎＶ２Ａ様配列の切断効率が１００％まで達し得ることを示す。

２．３ 分泌型アルカリホスファターゼの活性に基づく選択
同定されたＰｎＶ２Ａ様配列の切断効率は、ＳＥＡＰ活性の測定により、更に明瞭となり得る。

ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅ、ｖＡｃ−ＳＥＦＰ、およびｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅに感染したＳｆ２１細胞（２４穴プレートにおいて、２×１０⁵細胞／ウェル）の培地を、それぞれ収集して１２，０００×ｇの速度で１０秒間遠心分離し、次にＳＥＡＰ活性の分析を行うまで、−２０℃に保持した。培地におけるＳＥＡＰ活性は、ＢＤ Ｇｒｅａｔ ＥｓｃＡｐｅ ＳＥＡＰ検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて測定した。対応するＳＥＡＰ活性を反映する化学発光強度は、化学発光カウンター（Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ ９４０）を用いて検出した。結果を図４に示す。

図４は、ｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅ、ｖＡｃ−ＳＥＦＰおよびｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅのウイルスベクターにそれぞれ感染したＳｆ２１昆虫細胞の、種々のＳＥＡＰ活性を例証する。ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅ（ＭＯＩ＝５、ｄｐｉ＝４）に感染したＳｆ２１昆虫細胞のＳＥＡＰ活性は、ｖＡｃ−ＳＥＦＰに感染したものより活性がかなり高く、およそ５００倍であることが明らかであった。従って、組換えｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅにおける選択されたＰｎＶ２Ａ様配列は、リボソーム跳躍をうまく誘導できるため、融合タンパク質におけるタンパク質フォールディングの干渉性欠損を避け、標的タンパク質の活性は影響されなかった。おもしろいことに、ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅに感染したＳｆ２１昆虫細胞のＳＥＡＰ活性も、同様に、ｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅに感染しＳＥＡＰ及びＥＧＦＰタンパク質を別々に発現する細胞のＳＥＡＰ活性よりも、かなり高かった。ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅに感染した細胞のＳＥＡＰ活性は、ｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅに感染した細胞のＳＥＡＰ活性よりおよそ１００倍高かった。発明者らは、ＰｎＶ２Ａ様配列のｍＲＮＡがＲｈＰＶ ＩＲＥＳ配列のｍＲＮＡより安定しているためであろうと考える。

２．４ 緑色蛍光の定量化
ＰＶＤＦ膜上のＥＧＦＰタンパク質を、ＥＧＦＰの発現した量を定量するために、強化化学発光キット（Ｐｉｅｃｅ）により検出した。結果は、それぞれｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅ、ｖＡｃ−ＳＥＦＰ、およびｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅに感染したＳｆ２１細胞の緑色蛍光強度を例証する図５に示した。ここでも再び、ｖＡｃ−Ｓ−ＰｎＶ２ＡＩ−Ｅに感染したＳｆ２１昆虫細胞におけるＥＧＦＰの蛍光強度は、ｖＡｃ−ＳＥＦＰとｖＡｃ−Ｓ−Ｒｈｉｒ−Ｅの各々に感染した細胞のＥＧＦＰの蛍光強度よりもかなり高かった。従って、ＥＧＦＰと融合したＰｎＶ２Ａ様配列の自己切断した部分が、ＥＧＦＰの蛍光強度に影響を与えないのは明らかである。

［実施例３］実施例２の方法により同定された２Ａ様配列の別の実施形態
別の２Ａ様配列は、実施例２に記載した手順に従ってクローニングし、同定した。トランスフェクトした昆虫宿主細胞がドーナツ様の蛍光パターン（データは示さず）を示すことから、候補配列が所望の２Ａ様配列であることを確認した。このように同定した該配列は、配列番号４の核酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号３のポリヌクレオチドを有する。

本発明は、潜在的な２Ａ様配列をスクリーニングするために、昆虫宿主細胞において同時発現した分泌タンパク質および蛍光タンパク質を利用する。昆虫宿主細胞は、まず、本発明の方法に従って作製し、候補配列と二つのレポーター遺伝子を含むベクターに感染し、候補配列が所望の２Ａ様配列であるか否かは、形質転換した宿主細胞を蛍光顕微鏡下で見ることにより容易に決定する。ドーナツ形の蛍光パターンは、選択した候補配列が２Ａ様配列ではないことを示し、一方、均一に分布した蛍光パターンは、選択した候補配列が所望の２Ａ様配列であることを示す。従って、本発明は、ウエスタンブロットのような、より労力と時間がかかり面倒なタンパク質測定を行うことなく、翻訳段階で自己切断活性を有するポリヌクレオチドを同定するための、迅速且つ容易にできるスクリーニング方法および／またはシステムを提供する。

上記は本発明の実施形態に関するが、本発明の他の多くの実施形態が本発明の基本範囲から逸脱せずに改変されてもよく、本発明の範囲は特許請求の範囲によって決定される。

Claims (2)

1. 翻訳段階で自己切断活性を有する２Ａ様配列を同定するための昆虫システムであって、
   プロモーターと、
   前記プロモーターに機能的に連結され且つ分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードする第一ポリヌクレオチドと、
   前記第一ポリヌクレオチドに機能的に連結された候補配列と、
   前記候補配列に機能的に連結され且つ強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする第二ポリヌクレオチドと、を有する組換えベクターに感染した昆虫細胞を備え、
   前記昆虫細胞における蛍光分布パターンが、前記候補配列が２Ａ様配列であるか否かを決定する指標として利用され、
   蛍光が細胞核を含めて前記昆虫細胞内に均一に分布する場合には、前記候補配列が２Ａ様配列である一方、蛍光分布パターンがドーナツ形を有し且つ細胞核外のスペースのみに限られる、または細胞外培地に分泌される場合には、前記候補配列が２Ａ様配列ではない昆虫システム。
2. 前記候補配列は、ペリナ・ヌダ・ピコルナ様ウイルス（Ｐｅｒｉｎａ ｎｕｄａ Ｐｉｃｏｒｎａ−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ、ＰｎＶ）から単離され、配列番号１または３のポリヌクレオチド配列を有する請求項１に記載の昆虫システム。