CN110079491A - 富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法。包括选取携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β‑半乳糖苷酶的大肠杆菌宿主细胞，也包括制备由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的大肠杆菌宿主菌种子液，还包括接种所述的大肠杆菌宿主菌种子液至富含乳糖的生物质的培养基，以富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌宿主菌发酵制备。本发明公开的方法是一种富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂制备各类高附加值产品的普适方法，包括蛋白类高附加值产品和代谢类高附加值产品，应用广泛，可操作性强，而且节省了昂贵的诱导剂的添加，可大幅降低生物发酵制备高附加值产品的成本，适于推广应用。

Description

富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发 酵制备的方法
技术领域
本发明属于生物质资源转化利用技术领域，特别是涉及富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法。该方法包括选取携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌，也包括制备由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的大肠杆菌宿主菌种子液，还包括接种所述的大肠杆菌宿主菌种子液至富含乳糖的生物质的培养基，以富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌宿主菌发酵制备。
背景技术
乳清是牛奶经过凝乳沉淀酪蛋白后排出的上清液，是奶酪生产过程的副产物。它由2％～5％乳糖，0.6％～0.8％蛋白质，0.4％～0.5％脂肪、微量金属矿物质和水组成，是一种广义上的生物质资源。乳清通过干燥可获得乳清粉，通过除杂纯化可获取乳糖，因此乳糖，乳清和乳清粉统称为富含乳糖的生物质。目前，全球每年产生的乳清量多达1.8～1.9×108t，而且随着奶酪每年生产量的不断增多，乳清的产量也逐年增加。乳清富含乳糖、蛋白质和脂肪等高营养价值的物质，且BOD值和COD值高，因此将乳清直接排放至环境中会引起如富营养化、过量氧消耗等严重环境危害。由于乳清具有较高的生理功能和较好的理化特性，50％以上的乳清经处理可用作动物饲料和食物，但仍有40％～50％乳清随废水直接排放，这不仅浪费了生物质资源，还造成了严重的环境污染。所以，如何开发利用乳清生产高附加值产品，拓宽乳清的应用价值，降低甚至杜绝乳清对环境的污染是亟待解决的难题。
目前，异源表达生产高附加值产品最常用的原核系统是大肠杆菌，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)是大肠杆菌系统最常用的诱导剂，IPTG价格昂贵，从而导致一些高附加值产品因生产成本高而无法市场化应用；虽然，异乳糖可替代IPTG作为大肠杆菌诱导剂，但是异乳糖价格比IPTG更贵，更不适于直接用于做诱导剂来生产高附加值产品。有趣的是，β-半乳糖苷酶不仅具有水解活性，可将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，而且还具有转糖苷活性，可将乳糖转化为异乳糖。由此，葡萄糖和半乳糖作为碳源和能量来源可被大肠杆菌消耗利用，而异乳糖可作为大肠杆菌诱导剂。因此，当大肠杆菌系统可分泌表达β-半乳糖苷酶，如Escherichia coli(E.coli)BL21(DE3)，则富含乳糖的生物质既可作为底物，也可作为诱导剂，进行异源表达生产高附加值产品。综上，本发明开发了富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法，该发明不仅广泛拓宽乳清的应用，为解决乳清对环境污染的难题提供可靠有效的方法，而且还降低了在大肠杆菌系统中异源表达生产高附加值产品的成本，为各类稀有的高附加值产品(如萜类产品)工业化生产提供可行的技术支撑。
发明内容
本发明公开了富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法。该方法包括选取携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌，也包括制备由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的大肠杆菌宿主菌种子液，还包括接种所述的大肠杆菌宿主菌种子液至富含乳糖的生物质的培养基，以富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌宿主菌发酵制备。
富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法(图1)，包括下述步骤：
1)选取携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌；
2)制备由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的大肠杆菌宿主菌种子液；
3)接种步骤2)中所述的大肠杆菌宿主菌种子液至富含乳糖的生物质的培养基，以富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌宿主菌发酵制备。
所述的携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌选自E.coliBL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS、E.coli DH5α或者E.coli Transetta。
所述的异乳糖诱导型启动子选自lac启动子、tac启动子、trc启动子、T3启动子、T5启动子和T7启动子；所述的lac启动子序列如SEQ ID NO.1所示；所述的tac启动子序列如SEQ ID NO.2所示；所述的trc启动子如SEQ ID NO.3所示；所述的T3启动子序列如SEQ IDNO.4所示；所述的T5启动子序列如SEQ ID NO.5所示；所述的T7启动子如SEQ ID NO.6所示；所述的目的基因是一种或多种以表达蛋白为目的的基因；所述的目的基因是羧肽酶基因；所述的目的基因是漆酶基因；所述的目的基因簇是多种以表达代谢路径所需蛋白为目的的基因簇；所述的目的基因簇是合成法尼烯的MVA途径基因簇；所述的MVA途径基因簇包含乙酰乙酰基CoA硫解酶基因、HMG-CoA合酶基因、HMG-CoA还原酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、法尼烯焦磷酸合成酶基因和法尼烯合成酶基因。
所述的步骤2)大肠杆菌宿主菌种子液的制备方法是：将由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的大肠杆菌宿主菌接种至浓度为5g/L的酵母粉、浓度为10g/L的蛋白胨、浓度为10g/L的NaCl的种子培养液，在37℃和220rpm条件下发酵培养12h，获得大肠杆菌宿主菌种子液。
所述的大肠杆菌宿主菌的制备方法是构建由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的重组质粒，并转化导入所述的大肠杆菌，或通过染色体整合导入由异乳糖诱导型启动子转录的目的基因或目的基因簇，获得由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的大肠杆菌宿主菌。
所述的重组质粒可在大肠杆菌自主复制；所述的重组质粒携带异乳糖诱导型启动子、目的基因或目的基因簇，其中，异乳糖诱导型启动子用于转录目的基因或目的基因簇；所述的大肠杆菌宿主菌通过异乳糖诱导型启动子转录和大肠杆菌宿主菌翻译实现目的基因或者目的基因簇的异源表达。
所述的乳糖是可被大肠杆菌宿主菌分泌的β-半乳糖苷酶通过水解活性水解成葡萄糖和半乳糖，其作为底物用于大肠杆菌宿主菌繁殖生长和高附加值产品的分泌合成；所述的乳糖还被β-半乳糖苷酶通过转糖苷活性合成异乳糖，其作为诱导剂用于诱导异乳糖诱导型启动子转录目的基因或目的基因簇；所述的富含乳糖的生物质选自乳糖、乳清或乳清粉；所述的乳清是由2％～5％乳糖，0.6％～0.8％蛋白质，0.4％～0.5％脂肪、微量金属矿物质和水组成；所述的乳清粉是乳清经过干燥加工所获得的；所述的富含乳糖的生物质的培养基是每升培养基中含有1～100g富含乳糖的生物质、1～50g酵母粉、1～50g蛋白胨、1～30g无机盐、1～1000mg一种或者多种抗生素；所述的发酵制备，其过程是加入0.1％～10％大肠杆菌宿主菌种子液后，在30～45℃，50～350rpm条件下培养至OD600在0.4～5之间，调温度至16～35℃，通过富含乳糖的生物质诱导异源表达，时间为3～120h；所述的抗生素选自氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素或者阿奇霉素。
所述的高附加值产品包括蛋白类高附加值产品和代谢类高附加值产品；所述的蛋白类高附加值产品是大肠杆菌宿主菌由异乳糖诱导型启动子转录目的基因诱导表达获得的；所述的蛋白类高附加值产品是漆酶；所述的蛋白类高附加值产品是羧肽酶；所述的代谢类高附加值产品是大肠杆菌宿主菌由异乳糖诱导型启动子转录目的基因簇诱导表达获得的；所述的代谢类高附加值产品是法尼烯。
所述的大肠杆菌宿主菌含有重组质粒pCPY；所述的重组质粒pCPY以pET-22b为骨架载体、复制子为pBR322复制子、启动子为T5启动子、包含目的基因羧肽酶基因；所述的重组质粒pCPY序列如SEQ ID NO.7所示；所述的大肠杆菌宿主菌通过染色体整合导入ackA-pta-pT7-CotA-yfcC基因片段；所述的ackA-pta-pT7-CotA-yfcC基因片段包括ackA整合位点的前后臂、T7启动子和目的基因漆酶基因；所述的ackA-pta-pT7-CotA-yfcC基因片段序列如SEQ ID NO.8所示；所述的大肠杆菌宿主菌含有重组质粒pCotA；所述的重组质粒pCotA以pET-22b为骨架载体、复制子为pBR322复制子、启动子为lac启动子、包含目的基因漆酶基因；所述的重组质粒pCotA序列如SEQ ID NO.9。
所述的大肠杆菌宿主菌包含合成法尼烯的MVA途径基因簇，由重组质粒pAHR、pEEMII和p28a-FS协同表达；其特征在于所述的重组质粒pAHR以pACYCDuet-1为骨架载体、复制子为p15A复制子、启动子为Tac启动子、包含目的基因簇乙酰乙酰基CoA硫解酶基因、HMG-CoA合酶基因和HMG-CoA还原酶基因；所述的重组质粒pAHR序列如SEQ ID NO.10所示；所述的重组质粒pEEMII以pBBR1MCS-4为骨架载体、复制子为pBBR1复制子、启动子为T3启动子、包含目的基因簇甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和法尼烯焦磷酸合成酶基因；所述的重组质粒pEEMII序列如SEQ ID NO.11所示；所述的重组质粒p28a-FS以pET-28a为骨架载体、复制子为pBR322复制子、启动子为Trc启动子、包含目的基因簇法尼烯合成酶基因；所述的重组质粒p28a-FS序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明公开的富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法，与现有技术相比具有以下优点：
1)本发明公开的方法，是一种由异乳糖诱导型启动子异源诱导表达，制备各类高附加值产品的普适方法，应用广泛，可操作性强，适于推广应用。
2)本发明所利用的原料是富含乳糖的生物质，包括乳清和乳清粉，为解决乳清(乳清粉)对环境污染的难题提供可靠有效的方法，也可实现废弃物资源的回收利用。
3)本发明公开的富含乳糖的生物质不仅可以作为原料，同时可作为诱导剂诱导表达制备高附加值产品，从而节省了昂贵的诱导剂的添加，可大幅降低生物发酵制备高附加值产品的成本。
附图说明
图1在大肠杆菌系统中以富含乳糖的生物质同时作为底物和诱导剂发酵制备高附加值产品的流程图；
图2异源诱导表达漆酶的重组菌株F1的构建；
图3重组质粒pCPY示意图；
图4异源诱导表达羧肽酶的重组菌株F2的构建；
图5合成法尼烯的重组菌株F3的构建；
图6重组质粒pAHR示意图；
图7重组质粒pEEMII示意图；
图8重组质粒p28a-FS示意图；
图9以乳清粉为底物和诱导剂发酵制备法尼烯的细胞密度(■)和法尼烯(●)动力学曲线。
图10重组质粒pCotA示意图；
图11异源诱导表达漆酶的重组菌株F4的构建；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
在大肠杆菌系统中以乳糖作为底物和诱导剂发酵制备漆酶
1)选取携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌DH5
2)制备由异乳糖诱导型启动子转录漆酶基因的大肠杆菌宿主菌种子液
采用Qiagen公司的Blood and Cell Culture DNA Mini Kit试剂盒提取枯草芽孢杆菌TJ-101基因组，以此为模板，根据表1中cotA-f和cotA-r引物通过PCR扩增富集漆酶cotA基因序列(表2)，PCR扩增条件为：95℃，5min预变性，然后30个PCR循环95℃，30s；54℃，30s；72℃，1min，最后72℃充分延伸10min。选取T7启动子(SEQ ID NO.6)与cotA基因组合获得cotA基因表达盒ackA-pta-pT7-CotA-yfcC基因片段(SEQ ID NO.8，表2)，通过同源重组方式整合敲入大肠杆菌DH5α中(图2)获得大肠杆菌宿主菌F1。将大肠杆菌宿主菌F1接种至浓度为5g/L的酵母粉、浓度为10g/L的蛋白胨、浓度为10g/L的NaCl的种子培养液，在37℃和220rpm条件下发酵培养12h，获得大肠杆菌宿主菌种子液。
3)接种步骤2)中所述的大肠杆菌宿主菌种子液至富含乳糖的培养基，以乳糖即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌宿主菌发酵制备
按照每升发酵液含有1g乳糖，1g蛋白胨，1g酵母膏和1g NaCl的配方，配制300mL，平分于三个500mL锥形瓶中(三个平行样)，在121℃进行20min灭菌。在无菌条件下，向上述三个500mL锥形瓶中分别添加0.1mL大肠杆菌宿主菌种子液，发酵表达漆酶。在30℃，50rpm条件下，乳糖被大肠杆菌宿主菌F1分泌表达的β-半乳糖苷酶的水解活性水解为葡萄糖和半乳糖，同时被β-半乳糖苷酶转糖苷活性转化为异乳糖；其中，葡萄糖作为原料供大肠杆菌宿主菌F1生长繁殖，当OD600为0.4，在16℃，50rpm条件下通过异乳糖诱导异源表达，发酵培养4天，漆酶CotA表达量最高，酶活为65.36U/ml。
表1 本专利基因编辑所需引物
实施例2
在大肠杆菌系统中以乳清作为底物和诱导剂发酵制备羧肽酶
1)选取携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌BL21(DE3)
2)制备由异乳糖诱导型启动子转录羧肽酶基因的大肠杆菌宿主菌种子液
采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取米曲霉基因组DNA，以此为模板，根据表1中CPY-f和CPY-r引物通过PCR扩增富集羧肽酶基因CPY基因序列(表2)，PCR扩增条件为：95℃，5min预变性，然后30个PCR循环95℃，30s；56℃，30s；72℃，2min，最后72℃充分延伸10min。根据上述获得的DNA序列和质粒pet-22b，通过pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Ki技术手段构建如图3所示的重组质粒pCPY(SEQ ID NO.7)，启动子为T5启动子(SEQ ID NO.5)，根据图4所示，通过CaCl2转化法转入重组质粒pCPY获得大肠杆菌宿主菌F2。将大肠杆菌宿主菌F2接种至浓度为5g/L的酵母粉、浓度为10g/L的蛋白胨、浓度为10g/L的NaCl的种子培养液，在37℃和220rpm条件下发酵培养12h，获得大肠杆菌宿主菌种子液。
3)接种步骤2)中所述的大肠杆菌宿主菌种子液至富含乳清的培养基，以乳清即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌宿主菌发酵制备
按照每升发酵液含有100g乳清，50g蛋白胨，50g酵母膏和30g NaCl的配方，配制300mL，平分于三个500mL锥形瓶中(三个平行样)，在121℃进行20min灭菌。在无菌条件下，向上述三个500mL锥形瓶中分别添加10mL大肠杆菌宿主菌种子液和100ul浓度为100g/L的氨苄青霉素溶液。在45℃，350rpm条件下，乳清中的乳糖被大肠杆菌宿主菌F1分泌表达的β-半乳糖苷酶的水解活性水解为葡萄糖和半乳糖，同时被β-半乳糖苷酶转糖苷活性转化为异乳糖；其中，葡萄糖作为原料供大肠杆菌宿主菌F2生长繁殖，当OD600为5，在35℃，350rpm条件下通过异乳糖诱导诱导表达。发酵96h，羧肽酶表达量最高，酶活为53.04U/mL。
表2 本专利所需基因片段信息
实施例3
在大肠杆菌系统中以乳清粉作为底物和诱导剂发酵制备法尼烯
1)选取携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌BL21
2)制备由异乳糖诱导型启动子转录目的基因簇MVA途径的大肠杆菌宿主菌种子液
根据表1引物，以大肠杆菌单菌落和酿酒酵母组DNA为模板，通过PCR扩增获得MVA途径所有酶(除法尼烯合成酶外)的相应DNA序列，PCR扩增条件为：95℃，5min预变性，然后30个PCR循环95℃，30s；54℃，30s；72℃，1.5min，最后72℃充分延伸10min。法尼烯合成酶cDNA序列选自青蒿素该酶cDNA序列，通过基因合成方式获得该基因DNA序列。根据上述获得的DNA序列，质粒pBAD33、pBBR1MCS-4和pet-28a，通过pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Ki技术手段构建如图5所示的三种重组质粒pARH(图6)、pEEMII(图7)和p28a-FS(图8)，协同表达合成法尼烯的MVA途径基因簇(表2)。重组质粒pAHR以pACYCDuet-1为骨架载体、复制子为p15A复制子、启动子为Tac启动子(SEQ ID NO.2)、包含目的基因簇乙酰乙酰基CoA硫解酶基因、HMG-CoA合酶基因和HMG-CoA还原酶基因；重组质粒pEEMII以pBBR1MCS-4为骨架载体、复制子为pBBR1复制子、启动子为T3启动子(SEQ ID NO.4)、包含目的基因簇甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和法尼烯焦磷酸合成酶基因；重组质粒p28a-FS以pET-28a为骨架载体、复制子为pBR322复制子、启动子为Trc启动子(SEQ ID NO.3)、包含目的基因簇法尼烯合成酶基因。根据图5所示，通过CaCl2转化法转入重组质粒pARH(SEQ ID NO.10)、pEEMII(SEQ ID NO.11)和p28a-FS(SEQ ID NO.12)获得大肠杆菌宿主菌F3。将大肠杆菌宿主菌F3接种至浓度为5g/L的酵母粉、浓度为10g/L的蛋白胨、浓度为10g/L的NaCl的种子培养液，在37℃和220rpm条件下发酵培养12h，获得大肠杆菌宿主菌种子液。
3)接种步骤2)中所述的大肠杆菌宿主菌种子液至富含乳清粉的培养基，以乳清粉即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌宿主菌发酵制备
按照每升发酵液含有50g乳清粉，10g蛋白胨，50g酵母膏和5g NaCl的配方，配制300mL，平分于三个500mL锥形瓶中(三个平行样)，在121℃进行20min灭菌。在无菌条件下，向上述三个500mL锥形瓶中分别添加1mL大肠杆菌宿主菌种子液，100ul浓度为34g/L的氯霉素溶液，100ul浓度为50g/L的卡娜霉素溶液和100ul浓度为100g/L的氨苄青霉素溶液。在37℃，220rpm条件下，乳清粉中的乳糖被大肠杆菌宿主菌F3分泌表达的β-半乳糖苷酶的水解活性水解为葡萄糖和半乳糖，同时被β-半乳糖苷酶转糖苷活性转化为异乳糖；其中，葡萄糖作为原料供大肠杆菌宿主菌F3生长繁殖，当OD600为0.8，向发酵液中添加20mL正癸烷，在30℃，220rpm条件下通过异乳糖诱导表达。每24h取1mL发酵液和100ul十二烷分别进行细胞密度和法尼烯浓度的检测。实验结果如图9所示，发酵96h的实验结果如下：细胞密度OD600为15.52，法尼烯浓度为3.25g/L。
实施例4
在大肠杆菌系统中以乳清粉作为底物和诱导剂发酵制备漆酶
1)选取携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌Transetta
2)制备由异乳糖诱导型启动子转录羧肽酶基因的大肠杆菌宿主菌种子液
根据实施例1所得的漆酶基因的DNA序列和质粒pet-22b，通过pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Ki技术手段构建如图10所示的重组质粒pCotA(SEQ IDNO.9)，启动子为lac启动子(SEQ ID NO.1)，根据图11所示，通过CaCl2转化法转入重组质粒pCotA获得大肠杆菌宿主菌F4。将大肠杆菌宿主菌F4接种至浓度为5g/L的酵母粉、浓度为10g/L的蛋白胨、浓度为10g/L的NaCl的种子培养液，在37℃和220rpm条件下发酵培养12h，获得大肠杆菌宿主菌种子液。
3)接种步骤2)中所述的大肠杆菌宿主菌种子液至富含乳清粉的培养基，以乳清粉即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌宿主菌发酵制备
按照每升发酵液含有50g乳清粉，20g蛋白胨，20g酵母膏和5g NaCl的配方，配制300mL，平分于三个500mL锥形瓶中(三个平行样)，在121℃进行20min灭菌。在无菌条件下，向上述三个500mL锥形瓶中分别添加5mL大肠杆菌宿主菌种子液和100ul浓度为100g/L的氨苄青霉素溶液。在35℃，200rpm条件下，乳清粉中的乳糖被大肠杆菌宿主菌F4分泌表达的β-半乳糖苷酶的水解活性水解为葡萄糖和半乳糖，同时被β-半乳糖苷酶转糖苷活性转化为异乳糖；其中，葡萄糖作为原料供大肠杆菌宿主菌F4生长繁殖，当OD600为5，在20℃，200rpm条件下通过异乳糖诱导诱导表达。发酵10h，漆酶表达量最高，酶活为97.83U/mL。
序列表
<110> 天津大学
<120> 富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acatacgagc cggaagcata aagtgtaaa 29
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacaattaat catcggctcg tataatgt 28
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgacaattaa tcatccggct cgt 23
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctttagtga gggttaatt 19
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagaaatcat aaaaaattta tttgctttgt 30
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactata 17
<210> 7
<211> 7225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140
tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520
cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640
gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700
catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760
tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820
ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880
tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940
ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000
aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060
gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120
tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180
acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240
cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300
cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 3360
gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 3420
cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 3480
gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540
tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600
atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720
gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780
tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840
cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900
tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960
atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020
atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080
tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140
cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200
aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 4260
ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320
tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380
tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440
gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500
gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 4560
gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 4620
ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 4680
taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 4740
ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 4800
atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860
tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc 4920
gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 4980
gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 5040
aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 5100
ctcgatcccg cgaaagagaa atcataaaaa atttatttgc tttgttaggg gaattgtgag 5160
cggataacaa ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat 5220
gagagtattg ccggctactt tgctggttgg agctgcctct gcggccgttc cacctcttca 5280
gcaggtgctg ggtcgacctg aggagggcat gagcttctcc aagccactcc atgccttcca 5340
agagcagctc aagactcttt cagaggacgc tcgtaaactc tgggatgaag ttgccaacta 5400
cttcccggac agcatggacc acagccccat cttctctctt cccaagaagc acacccgtcg 5460
tccggattct cattgggacc acattgtccg tggttctgat gtccagaaga tctgggtgaa 5520
caatgccgac ggagagaagg agagagagat tgatggaaag cttgaggctt acgatctcag 5580
gatcaagaaa gctgacccga gcgctctcgg tatcgacccg aatgtgaagc aatacactgg 5640
ttatctcgac gataacggta atgacaagca tctgttctac tggttcttcg aatctcgcaa 5700
tgatcctaag aacgaccccg tcgtgctctg gctgaatggt ggccccggtt gctcttccct 5760
cactggtcta tttatggagc tgggacctag cagcatcgat gagaacatta agcccgtcta 5820
caatgacttc tcgtggaact ctaacgcctc cgtcattttc cttgatcagc ccgtgaacgt 5880
cggctattcc tacagtggct ccgctgttag cgacactgtt gctgctggca aggatgtcta 5940
cgctctgctc tctcttttct tcaaacaatt ccccgaatat gcggaacagg acttccatat 6000
tgccggcgag tcctacgccg ggcattacat tccagtcttt gcatccgaga tcttggctca 6060
caagaaccgc aacatcaacc tcaagtcagt cctgatcggc aacggtctca cggacggcct 6120
cactcagtac gggtactacc gccccatggg atgtggcgag ggtggctaca aggctgtcct 6180
cgatgaggct acctgcgaat ctatggacaa tgccctaccc cgctgtcggt ccatgatcga 6240
gtcttgctat aattctgaga gcgcctgggt ctgtgtccct gcctcgattt actgcaataa 6300
tgctcttatc ggaccttacc agcgcaccgg acagaacgtc tacgatgttc gtagcaagtg 6360
tgaggatgaa agcaacctgt gctacaaggg tatgggttac gtgagtgaat atctcaacaa 6420
ggctgaggtt cgcgaggccg tcggagccga agttggtggt tatgactcct gcaacttcga 6480
catcaaccgt aacttcctct tccacggtga ttggatgaag ccctaccacc gtcttgttcc 6540
cggccttctc gagcagatcc ctgtgctgat ctacgccggt gatgctgact acatctgcaa 6600
ctggctcggc aacaaggcct ggaccgaggc tcttgaatgg cctggccaga aggagtacgc 6660
ctcggccgaa ctggaggacc ttaagatcga gcagaacgaa cacaccggca agaagatcgg 6720
tcaggttaag tctcatggaa atttcacctt catgcgtctc tacggtggag gtcacatggt 6780
tcccatggac cagcccgagg ctagtctgga attcttcaac cgctggttgg gtggtgaatg 6840
gttctagtta atacgactca ctatagggga attgtgagcg gataacaatt cccctctaga 6900
aataattttg tttaacttta agaaggagat atacatatga aatacctgct gccgaccgct 6960
gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag ccggcgatgg ccatggatat cggaattaat 7020
tcggatccga attcgagctc cgtcgacaag cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac 7080
caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc 7140
gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg 7200
ctgaaaggag gaactatatc cggat 7225
<210> 8
<211> 2758
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatcggcggc ataaaacgga tcgcataacg cgtcatcttg ataacgcgat tttcgacaaa 60
gaccggggca aggcgttttt ccagcggcca cgtctttgag taatgctgtc cccggcgaaa 120
caagctaaaa aaattaacag aacgattatc cggcgttgac atgcttcacc tcaacttcac 180
atataaagat tcaaaaattt gtgcaaattc acaactcagc gggacaacgt tcaaaacatt 240
ttgtcttcca tacccactat caggtatcct ttagcagcct gaaggcctaa gtagtacata 300
ttcattgagt cgtcaaattc atatacatta tgccattggc tgaaaattac gcaaaatggc 360
atagactcaa gatatttctt ccatcatgca aaaaaaaatt tgcagtgcat gatgttaatc 420
ataaatgtcg gtgtcatcat gcgctacgct ctatggctcc ctgacgtttt tttagccacg 480
tatcaattat aggtacttcc ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca 540
attcccctct agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatatacata tgacacttga 600
aaaatttgtg gatgctctcc caatcccaga tacactaaag ccagtacagc aatcaaaaga 660
aaaaacatac tacgaagtca ccatggagga atgcacccat cagctccatc gcgatctccc 720
tccaacccgc ctgtggggct acaacggctt atttccgggg ccgaccattg aggttaaaag 780
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 9240
tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 9300
tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 9360
gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga 9420
acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat 9480
tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga 9540
gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag 9600
tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg 9660
accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg 9720
ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt 9780
agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg 9840
gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc 9900
ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg 9960
tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac 10020
ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact 10080
gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa 10140
acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 10200
aatccaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcgcccgcg ttcctgctgg cgctgggcct 10260
gtttctggcg ctggacttcc cgctgttccg tcagcagctt ttcgcccacg gccttgatga 10320
tcgcggcggc cttggcctgc atatcccgat tcaacggccc cagggcgtcc agaacgggct 10380
tcaggcgctc ccgaaggt 10398
<210> 12
<211> 6921
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattgacaat taatcatccg gctcgtgggg aattgtgagc ggataacaat tcccctctag 5040
aaataatttt gtttaacttt aggaggaatt aaccatgtcg actcttccta tttctagtgt 5100
ttcattctct tcatctacgt cacctttggt agttgatgat aaagttagca cgaaacaaga 5160
tgttatccgc cataccatga atttcaatgc tagcatatgg ggagatcaat ttcttacata 5220
tgatgagcca gaagatttgg ttatgaagaa acaacttgtt gaagagctca aagaggaagt 5280
caagaaagag ctaataacga tcaaaggttc taatgaaccg atgcagcatg tcaagttgtt 5340
agaacttatt gatgcagtcc aacggcttgg catagcctat cattttgaag aggagattga 5400
agaagccttg caacatatcc atgttacata tggcgagcag tgggtcgata aagaaaacct 5460
acaaagcatt tctctttggt tccgactcct acgacaacaa ggcttcaacg tctcatcagg 5520
agtattcaag gactttatgg acgagaaggg aaaatttaag gaatccttat gtaatgatgc 5580
tcagggaatt cttgctctgt atgaagcggc atttatgagg gtggaagatg aaacaatact 5640
agataatgcg ctcgagttca ctaaagttca ccttgacatc atagccaagg atccttcttg 5700
tgactcttcc ctaagaaccc aaatacacca agcgttaaag cagccactta ggagaaggct 5760
ggcaaggata gaggcgttgc attacatgcc tatctaccaa caagaaacat cccacaatga 5820
ggtcttactg aagcttgcaa aactagattt tagcgtgctt caatcaatgc acaaaaagga 5880
gcttagccac atttgcaaat ggtggaagga tttggacctt caaaataagc ttccttatgt 5940
tcgagacagg gtggtggaag gctatttttg gatactatcc atctattacg agcctcaaca 6000
tgctcgaaca agaatgttcc taatgaaaac atgcatgtgg ttagtcgttt tagatgatac 6060
atttgataat tatggtactt atgaagaact cgaaatcttt acacaagctg ttgaaagatg 6120
gtcaataagc tgcctggata tgcttccaga atacatgaaa ctaatatatc aagagcttgt 6180
gaatcttcac gtggaaatgg aggaatcact tgaaaaggag ggaaaaacat atcaaattca 6240
ctatgtcaag gagatggcaa aagagttggt tcgcaactac ttggtagaag cgagatggct 6300
aaaagagggg tacatgccaa ctcttgagga gtacatgtct gtgtcaatgg tgactggtac 6360
ctatggctta atgatagcga gatcttatgt cggtaggggt gatattgtca ccgaggatac 6420
ctttaaatgg gtgtcctcgt atcctcctat tataaaagct tcatgtgtga ttgtaagact 6480
tatggatgac attgtcagcc acaaggagga acaagagaga ggccatgttg cttcaagcat 6540
cgaatgctat tctaaggaaa gtggtgcatc agaggaggaa gcgtgtgaat atatctcagg 6600
aaaagttgaa gatgcatgga aagttataaa ccgagagtcg ctcaggccta cagcggtccc 6660
gtttcctcta cttatgcctg caatcaacct tgcacgtatg tgtgaagtcc tatatagcgt 6720
caacgatggc ttcactcatg ctgagggaga catgaaaagt tacatgaaat cgttcttcgt 6780
tcaccctatg gttgtctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct gccaccgctg 6840
agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga 6900
aaggaggaac tatatccgga t 6921

Claims (10)

1.富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌系统发酵制备的方法，包括下述步骤：
1)选取携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌；
2)制备由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的大肠杆菌宿主菌种子液；
3)接种步骤2)中所述的大肠杆菌宿主菌种子液至富含乳糖的生物质的培养基，以富含乳糖的生物质即作底物也作诱导剂用于大肠杆菌宿主菌发酵制备。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的携带乳糖操纵子系统且可分泌合成β-半乳糖苷酶的大肠杆菌选自E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS、E.coli DH5α或者E.coli Transetta。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的异乳糖诱导型启动子选自lac启动子、tac启动子、trc启动子、T3启动子、T5启动子和T7启动子；所述的lac启动子序列如SEQID NO.1所示；所述的tac启动子序列如SEQ ID NO.2所示；所述的trc启动子如SEQ ID NO.3所示；所述的T3启动子序列如SEQ ID NO.4所示；所述的T5启动子序列如SEQ ID NO.5所示；所述的T7启动子如SEQ ID NO.6所示；所述的目的基因是一种或多种以表达蛋白为目的的基因；所述的目的基因是羧肽酶基因；所述的目的基因是漆酶基因；所述的目的基因簇是多种以表达代谢路径所需蛋白为目的的基因簇；所述的目的基因簇是合成法尼烯的MVA途径基因簇；所述的MVA途径基因簇包含乙酰乙酰基CoA硫解酶基因、HMG-CoA合酶基因、HMG-CoA还原酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、法尼烯焦磷酸合成酶基因和法尼烯合成酶基因。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤2)大肠杆菌宿主菌种子液的制备方法是：将由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的大肠杆菌宿主菌接种至浓度为5g/L的酵母粉、浓度为10g/L的蛋白胨、浓度为10g/L的NaCl的种子培养液，在37℃和220rpm条件下发酵培养12h，获得大肠杆菌宿主菌种子液。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的大肠杆菌宿主菌是构建由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的重组质粒，并转化导入所述的大肠杆菌，或通过染色体整合导入由异乳糖诱导型启动子转录的目的基因或目的基因簇，获得由异乳糖诱导型启动子转录目的基因或者目的基因簇的大肠杆菌宿主菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的重组质粒可在大肠杆菌自主复制；所述的重组质粒携带异乳糖诱导型启动子、目的基因或目的基因簇，其中，异乳糖诱导型启动子用于转录目的基因或目的基因簇；所述的大肠杆菌宿主菌通过异乳糖诱导型启动子转录和大肠杆菌宿主菌翻译实现目的基因或者目的基因簇的异源表达。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的乳糖是可被大肠杆菌宿主菌分泌的β-半乳糖苷酶通过水解活性水解成葡萄糖和半乳糖，其作为底物用于大肠杆菌宿主菌繁殖生长和高附加值产品的分泌合成；所述的乳糖还被β-半乳糖苷酶通过转糖苷活性合成异乳糖，其作为诱导剂用于诱导异乳糖诱导型启动子转录目的基因或目的基因簇；所述的富含乳糖的生物质选自乳糖、乳清或乳清粉；所述的乳清是由2％～5％乳糖，0.6％～0.8％蛋白质，0.4％～0.5％脂肪、微量金属矿物质和水组成；所述的乳清粉是乳清经过干燥加工所获得的；所述的富含乳糖的生物质的培养基是每升培养基中含有1～100g富含乳糖的生物质、1～50g酵母粉、1～50g蛋白胨、1～30g无机盐、1～1000mg一种或者多种抗生素；所述的发酵制备，其过程是加入0.1％～10％大肠杆菌宿主菌种子液后，在30～45℃，50～350rpm条件下培养至OD600在0.4～5之间，调温度至16～35℃，通过富含乳糖的生物质诱导异源表达，时间为3～120h；所述的抗生素选自氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素或者阿奇霉素。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的高附加值产品包括蛋白类高附加值产品和代谢类高附加值产品；所述的蛋白类高附加值产品是大肠杆菌宿主菌由异乳糖诱导型启动子转录目的基因诱导表达获得的；所述的蛋白类高附加值产品是漆酶；所述的蛋白类高附加值产品是羧肽酶；所述的代谢类高附加值产品是大肠杆菌宿主菌由异乳糖诱导型启动子转录目的基因簇诱导表达获得的；所述的代谢类高附加值产品是法尼烯。
9.根据权利要求5、6、7或8所述的大肠杆菌宿主菌，其特征在于所述的大肠杆菌宿主菌含有重组质粒pCPY；所述的重组质粒pCPY以pET-22b为骨架载体、复制子为pBR322复制子、启动子为T5启动子、包含目的基因羧肽酶基因；所述的重组质粒pCPY序列如SEQ ID NO.7所示；所述的大肠杆菌宿主菌通过染色体整合导入ackA-pta-pT7-CotA-yfcC基因片段；所述的ackA-pta-pT7-CotA-yfcC基因片段包括ackA整合位点的前后臂、T7启动子和目的基因漆酶基因；所述的ackA-pta-pT7-CotA-yfcC基因片段序列如SEQ ID NO.8所示；所述的大肠杆菌宿主菌含有重组质粒pCotA；所述的重组质粒pCotA以pET-22b为骨架载体、复制子为pBR322复制子、启动子为lac启动子、包含目的基因漆酶基因；所述的重组质粒pCotA序列如SEQ ID NO.9。
10.根据权利要求5、6、7或8所述的大肠杆菌宿主菌，其特征在于所述的大肠杆菌宿主菌包含合成法尼烯的MVA途径基因簇，由重组质粒pAHR、pEEMII和p28a-FS协同表达；其特征在于所述的重组质粒pAHR以pACYCDuet-1为骨架载体、复制子为p15A复制子、启动子为Tac启动子、包含目的基因簇乙酰乙酰基CoA硫解酶基因、HMG-CoA合酶基因和HMG-CoA还原酶基因；所述的重组质粒pAHR序列如SEQ ID NO.10所示；所述的重组质粒pEEMII以pBBR1MCS-4为骨架载体、复制子为pBBR1复制子、启动子为T3启动子、包含目的基因簇甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和法尼烯焦磷酸合成酶基因；所述的重组质粒pEEMII序列如SEQ ID NO.11所示；所述的重组质粒p28a-FS以pET-28a为骨架载体、复制子为pBR322复制子、启动子为Trc启动子、包含目的基因簇法尼烯合成酶基因；所述的重组质粒p28a-FS序列如SEQ ID NO.12所示。
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