CN110117624A - 利用地沟油生物法制备法尼烯的方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明公开了利用地沟油生物法制备法尼烯的方法，该方法过程包括：(1)地沟油与烷基醇在脂肪酶催化作用下发生酶法酯交换反应生成粗甘油和脂肪酸烷基酯，粗甘油浓度95％(w/w)左右，脂肪酸烷基酯的产率达到96％；(2)制备以粗甘油为底物发酵制备法尼烯的大肠杆菌宿主菌种子液；(3)在含有上述所述粗甘油的液态发酵液中，接种大肠杆菌宿主菌种子液，发酵培养获得法尼烯，浓度达到5.2g/L。本发明所述的方法绿色环保、反应条件温和、产率高、选择性好、能耗低，实现了地沟油资源的高效利用。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体地，涉及一种利用地沟油生物法制备法尼烯的方法。
背景技术
我国地沟油(各类劣质油的通称)资源丰富，据估算，地沟油的量约占食用油总消费量的20％～30％，以我国年均消费食用油2100万吨计，则每年产生地沟油400～800万吨，易于收集作为资源利用的地沟油有400万吨左右。因含有毒素，若食用会破坏白血球和消化道黏膜，容易引起食物中毒，甚至致癌；因富含营养物质，若流向江河会造成水体营养化。地沟油若能被有效分离和收集，通过地沟油的资源化利用，不仅可以生产出可生物降解、环境友好、成本低廉的化工产品，同时也可解决对环境的危害问题。目前地沟油已在破乳剂、乳化剂、日用洗涤用品、有机肥料、涂料及润滑脂等多个领域实现资源化利用，但地沟油有效利用率仅为30％。因此，合理利用地沟油转化具有高附加值的多样化产品是提高其有效利用率和解决环境危害问题的重要途径。
地沟油主要成分为甘油三酯，故利用地沟油与烷基醇进行酯交换反应来制备粗甘油和副产物脂肪酸烷基酯的方法是实现地沟油高效利用的有效途径之一。酯交换反应主要为化学法和生物酶法。化学法有能耗大、要求设备耐腐蚀、对原料油质量要求高、烷基醇用量大、产品提纯困难和产生污染物等诸多弊端，与使用酸性、碱性催化剂的化学法相比，利用脂肪酶催化酯交换反应的生物法有很多优势和很大的应用潜力，具体优势为反应条件温和、效率高、选择性好、能耗低、烷基醇消耗量低、产品易分离、对环境无污染等好处。
副产物脂肪酸烷基酯是生产可生物降解且具有高附加值精细化工产品的重要原料，在能源、化工中间体、表面活性剂等方面都有广泛的用途。其中，脂肪酸烷基酯可作为无毒无污染的化工中间体被广泛使用，经过一些简单的化学反应，如皂化、磺化、环氧化、加氢还原等方式得到各类高附加值的化工产品，主要应用在表面活性剂和塑料制品行业，具有无毒、可再生、成本低、可降解等明显优势，具有可观的社会经济效益和可持续发展的战略意义。
然而，粗甘油的大规模化生产，导致了供大于求，远大于市场需求，从而引起了粗甘油的市场价格不断下降，进而造成了大量的粗甘油无法被有效利用，甚至被当做废弃物排放，易于引起环境污染。针对于此，本发明提供了一种利用地沟油生物法制备法尼烯的方法，包括利用脂肪酶催化地沟油与烷基醇发生酶法酯交换反应生成粗甘油和副产物脂肪酸烷基酯，也包括微生物发酵利用粗甘油生产高附加值产品法尼烯。其中，法尼烯是一种天然的倍半萜化合物，可应用于食品、化妆品和医药等领域。比如，法尼烯可用于制备茄呢醇、辅酶Q10和维生素K2等高附加值产品，也可用于表面活性剂、乳化剂、稳定剂等食品添加剂。另外，法尼烯还可以通过聚合生成高分子聚合物，可用于橡胶和轮胎的制备，性能优势明显。因此，本发明可高效利用地沟油，减少环境污染，提高经济效益，是一种变废为宝、潜在应用价值巨大的甘油增值途径。
发明内容
本发明的目的在于开发一种利用地沟油生物法制备法尼烯的方法(图1)。
一种利用地沟油生物法制备法尼烯的方法；包括如下步骤：
1)利用地沟油酶法制备粗甘油和副产物脂肪酸烷基酯；
2)制备大肠杆菌宿主菌种子液；
3)以粗甘油为底物接种大肠杆菌宿主菌种子液发酵制备法尼烯。
所述步骤1)利用地沟油酶法制备粗甘油和副产物脂肪酸烷基酯方法是：在无溶剂体系或有机溶剂体系中，加入醇油摩尔比为1:1～10:1的烷基醇和地沟油，并在反应体系中加入酶含量为1％～30％wt的脂肪酶，在20～45℃、50～260rpm/min条件下，酶法酯交换反应12～48h后，静置分离获得浓度为20％～99％(w/w)的粗甘油和产率为20％～98％的副产物脂肪酸烷基酯。
所述的地沟油是废弃动物油脂、泔水油、多次反复加热使用及从餐饮单位或者食品加工厂产生的废油脚或煎炸油的各种垃圾油的总称；所述脂肪酶包括游离脂肪酶、全细胞脂肪酶和固定化脂肪酶等多种形式。
所述步骤2)制备大肠杆菌宿主菌种子液的方法是：将大肠杆菌宿主菌接种至液态种子培养液，在37℃和220rpm条件下发酵培养12h，获得大肠杆菌宿主菌种子液。
所述液态种子培养液是浓度为5g/L的酵母粉、浓度为10g/L的蛋白胨、浓度为10g/L的NaCl、浓度为50mg/L的氯霉素、浓度为50mg/L的氨苄霉素和浓度为50mg/L的卡那霉素。
所述大肠杆菌宿主菌的制备方法是往大肠杆菌通过CaCl2转化法转入质粒pTJU-1、pTJU-2和pTJU-3，并通过染色体整合敲入ackA-paraC-FG-yfcC基因片段；质粒pTJU-1以pACYCDuet-1为骨架载体、复制子为p15A复制子、启动子为T5启动子、包含乙酰乙酰基CoA硫解酶基因、HMG-CoA合酶基因和HMG-CoA还原酶基因；质粒pTJU-2以pBBR1MCS-4为骨架载体、复制子为pBBR1复制子、启动子为T7启动子、包含甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和金合欢烯焦磷酸合成酶基因；质粒pTJU-3以pET-28a为骨架载体、复制子为pBR322复制子、启动子为T3启动子、包含金合欢烯合成酶基因；所述的ackA-paraC-FG-yfcC基因片段包括ackA整合位点的前后臂、araC启动子和法尼烯合成酶基因。
所述的质粒pTJU-1序列为seq.1；所述的质粒pTJU-2序列为seq.2；所述的质粒pTJU-3序列为seq.3；所述的ackA-paraC-FG-yfcC基因片段序列为seq.4。
所述的大肠杆菌是E.coli BL21(DE3)。
所述步骤3)以粗甘油为底物接种大肠杆菌宿主菌种子液发酵制备法尼烯方法是：在含有浓度为1～100g/L的粗甘油、浓度为1～50g/L的酵母粉、浓度为1～50g/L的蛋白胨、浓度为1～30g/L的无机盐、浓度为1～1000mg/L的氯霉素、浓度为1～1000mg/L的氨苄霉素、浓度为1～1000mg/L的卡那霉素的的液态发酵液中，加入0.1～10％大肠杆菌宿主菌种子液后，在30～45℃，50～350rpm条件下培养至OD600在0.6～0.8之间，向每升液态发酵液中添加1～100mg异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和50～1000mL萃取剂，在16～35℃，50～350rpm条件下进行异源诱导表达，发酵制备法尼烯。
所述的萃取剂选自正己烷、正癸烷、十二烷、聚烯烃或煤油。
本发明提供一种利用地沟油生物法制备法尼烯的方法，与现有地沟油应用的技术相比具有以下优点：
(1)本发明所述的利用地沟油生物法制备法尼烯的方法中，整个制备过程实现了地沟油资源的全面高效利用，制得的法尼烯可用于制备高附加值产品，应用于食品、化妆品和医药等领域，制得的副产物脂肪酸烷基酯是生产精细化工产品的重要原料，具有无毒、可再生、成本低、可降解等可观的社会经济效益，故该方法具有广阔的市场前景。
(2)本发明所述的利用脂肪酶催化地沟油制备粗甘油和副产物脂肪酸烷基酯的方法，绿色环保、反应条件温和、产率高、选择性好、能耗低、烷基醇消耗量低、产品易分离。
(3)本发明所述的酶法酯交换反应所得的粗甘油杂质少，纯度高，无污染物，相比化学法所得的粗甘油，不需预处理可直接作为发酵制备法尼烯的碳源，简化生产工艺、降低发酵成本、提高产量。
(4)本发明所述的以粗甘油为底物利用大肠杆菌宿主菌发酵培养制备法尼烯，可解决以葡萄糖或纯甘油作为碳源制备法尼烯成本高的问题，也可提高市场竞争力，减少环境污染，提高经济效益，是一种变废为宝、潜在应用价值巨大的甘油增值途径。
附图说明
图1为本发明的利用地沟油生物法制备法尼烯的流程图；
图2为本发明的例5发酵过程中细胞密度OD600和法尼烯浓度图；
图3为本发明的例6发酵过程中细胞密度OD600和法尼烯浓度图；
图4为本发明的例7发酵过程中细胞密度OD600和法尼烯浓度图；
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
利用地沟油酶法制备粗甘油和和副产物脂肪酸烷基酯：
将10.0g地沟油和醇油摩尔比为4:1(等分三次添加)的甲醇，10％wt的正己烷，4％wt的固定化脂肪酶(购自诺维信)，装入100ml具塞圆底烧瓶中混合均匀，40℃密闭260rpm/min磁力搅拌一定时间，当反应12h时，取样并离心获得10μL上层油相，添加990μL正己烷混合均匀，用于气相检测，同时离心收集下层的副产物粗甘油，并向反应体系中再次添加等量的甲醇，反应24h、36h后均重复上述操作，结束后通过分离可得上层油相脂肪酸甲酯和下层粗甘油。所得的粗甘油的浓度为95％(w/w)，脂肪酸甲脂产率最终达到96％。
实施例2
利用地沟油酶法制备粗甘油和和副产物脂肪酸烷基酯：
将10.0g地沟油和醇油摩尔比为10:1(流加方式添加)的叔丁醇，30％wt的正己烷，30％wt的游离脂肪酶(购自诺维信)，装入100ml具塞圆底烧瓶中混合均匀，30℃密闭150rpm/min磁力搅拌一定时间，当反应8h时，取样并离心获得10μL上层油相，添加990μL正己烷混合均匀，用于气相检测，同时离心收集下层的副产物粗甘油，并向反应体系中再次添加等量的叔丁醇，反应16h、24h后均重复上述操作，结束后通过分离可得上层油相脂肪酸叔丁酯和下层粗甘油。所得的粗甘油的浓度为62％(w/w)，脂肪酸叔丁酯产率最终达到76％。
实施例3
利用地沟油酶法制备粗甘油和和副产物脂肪酸烷基酯：
将10.0g地沟油和醇油摩尔比为1:1(一次添加)的正丁醇，10％wt的石油醚，15％wt的全细胞脂肪酶(购自诺维信)，装入100ml具塞圆底烧瓶中混合均匀，20℃密闭50rpm/min磁力搅拌一定时间，当反应4h时，取样并离心获得10μL上层油相，添加990μL正己烷混合均匀，用于气相检测，同时离心收集下层的副产物粗甘油，并向反应体系中再次添加等量的正丁醇，反应8h、12h后均重复上述操作，结束后通过分离可得上层油相脂肪酸正丁酯和下层粗甘油。所得的粗甘油的浓度为38％(w/w)，脂肪酸正丁酯产率最终达到46％。
实施例4
大肠杆菌宿主菌种子液发酵制备:
根据表1引物，以大肠杆菌和酿酒酵母组DNA为模板，通过PCR扩增获得MVA途径所有酶(除法尼烯合成酶外)的相应DNA序列。法尼烯合成酶cDNA序列选自青蒿素该酶cDNA序列，通过基因合成方式获得该基因DNA序列。根据上述获得的DNA序列通过pEASY-UniSeamless Cloning and Assembly Ki技术手段构建三种重组质粒和ackA-paraC-FG-yfcC基因片段，包括质粒pTJU-1、pTJU-2和pTJU-3。其中，质粒pTJU-1是以pACYCDuet-1为骨架载体、复制子为p15A复制子、启动子为T5启动子、包含乙酰乙酰基CoA硫解酶基因、HMG-CoA合酶基因和HMG-CoA还原酶基因；质粒pTJU-2是以pBBR1MCS-4为骨架载体、复制子为pBBR1复制子、启动子为T7启动子、包含甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和金合欢烯焦磷酸合成酶基因；质粒pTJU-3是以pET-28a为骨架载体、复制子为pBR322复制子、启动子为T3启动子、包含金合欢烯合成酶基因；ackA-paraC-FG-yfcC基因片段包括ackA整合位点的前后臂、araC启动子和法尼烯合成酶基因；另外，质粒pTJU-1序列为seq.1；所述的质粒pTJU-2序列为seq.2；所述的质粒pTJU-3序列为seq.3；所述的ackA-paraC-FG-yfcC基因片段序列为seq.4；选用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主细胞，通过CaCl2转化法转入这三种重组质粒，再通过染色整合导入ackA-paraC-FG-yfcC基因片段，获得大肠杆菌宿主菌。将大肠杆菌宿主菌接种至浓度为5g/L的酵母粉、浓度为10g/L的蛋白胨、浓度为10g/L的NaCl、浓度为50mg/L的氯霉素、浓度为50mg/L的氨苄霉素、浓度为50mg/L的卡那霉素的液态种子培养液，在37℃和220rpm条件下发酵培养12h，获得大肠杆菌宿主菌种子液。
表1通过PCR获得MVA代谢途径中的基因所需引物
实施例5
以粗甘油为底物接种大肠杆菌宿主菌种子液发酵制备法尼烯
以上述实施例1所得的95％(w/w)的粗甘油为碳源，接种实施例4所得的大肠杆菌宿主菌种子液发酵制备法尼烯：按照每升发酵液含有16g蛋白胨，10g酵母膏和5g NaCl的配方，配制300mL，平分于三个500mL锥形瓶中(三个平行样)。粗甘油在121℃进行20min灭菌。在无菌条件下，向上述三个500mL锥形瓶中分别添加1.57ml已灭菌后粗甘油，接种量为100×107个活菌的大肠杆菌宿主菌种子液，100ul浓度为34g/L的氯霉素溶液，100ul浓度为50g/L的卡娜霉素溶液和100ul浓度为100g/L的氨苄青霉素溶液。在37℃，220rpm条件下培养至OD600在0.6～08之间，向发酵液中添加100ul浓度为24g/L的IPTG溶液和20mL正癸烷，在30℃，220rpm条件下进行诱导表达。每24h取1mL发酵液和100ul正癸烷分别进行细胞密度和法尼烯浓度的检测。发酵96h的实验结果如下：细胞密度OD600为16.27，法尼烯浓度为5.2g/L(如图2所示)。
实施例6
以粗甘油为底物接种大肠杆菌宿主菌种子液发酵制备法尼烯
以上述实施例2所得的62％(w/w)的粗甘油为碳源，接种实施例4所得的大肠杆菌宿主菌种子液发酵制备法尼烯：按照每升发酵液含有16g蛋白胨，10g酵母膏和5g NFG的配方，配制300mL，平分于三个500mL锥形瓶中(三个平行样)。粗甘油在121℃进行20min灭菌。在无菌条件下，向上述三个500mL锥形瓶中分别添加2.57ml已灭菌后粗甘油，接种量为300×107个活菌的种子液，100ul浓度为34g/L的氯霉素溶液，100ul浓度为50g/L的卡娜霉素溶液和100ul浓度为100g/L的氨苄青霉素溶液。在35℃，220rpm条件下培养至OD600在0.6～08之间，向发酵液中添加100ul浓度为24g/L的IPTG溶液和5mL十二烷，在35℃，220rpm条件下进行诱导表达。每24h取1mL发酵液和100ul正癸烷分别进行细胞密度和法尼烯浓度的检测。发酵96h的实验结果如下：细胞密度OD600为13.12，法尼烯浓度为3.5g/L(如图3所示)。
实施例7
以粗甘油为底物接种大肠杆菌宿主菌种子液发酵制备法尼烯
以上述实施例3所得的38％(w/w)的粗甘油为碳源，接种实施例4所得的大肠杆菌宿主菌种子液发酵制备法尼烯：按照每升发酵液含有16g蛋白胨，10g酵母膏和5g NFG的配方，配制300mL，平分于三个500mL锥形瓶中(三个平行样)。粗甘油在121℃进行20min灭菌。在无菌条件下，向上述三个500mL锥形瓶中分别添加2.36ml已灭菌后粗甘油，接种量为10×107个活菌的种子液，100ul浓度为34g/L的氯霉素溶液，100ul浓度为50g/L的卡娜霉素溶液和100ul浓度为100g/L的氨苄青霉素溶液。在30℃，220rpm条件下培养至OD600在0.6～08之间，向发酵液中添加100ul浓度为24g/L的IPTG溶液和100mL煤油，在16℃，220rpm条件下进行诱导表达。每24h取1mL发酵液和100ul正癸烷分别进行细胞密度和法尼烯浓度的检测。发酵96h的实验结果如下：细胞密度OD600为10.36，法尼烯浓度为1.8g/L(如图4所示)。
序列表
<110> 天津大学
<120> 利用地沟油生物法制备法尼烯的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9701
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 10398
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ccgccgttgc cgttatgagc ttggcgtgga aattacgcct cctgaatcta tctatcctga 7500
ctttcgctac cgcgccaccg atccgagtgg cattgtggaa aatgaagtgt gtccggtatt 7560
tgccgcacgc accactagtg cgttacagat caatgatgat gaagtgatgg attatcaatg 7620
gtgtgattta gcagatgtat tacacggtat tgatgccacg ccgtgggcgt tcagtccgtg 7680
gatggtgatg caggcgacaa atcgcgaagc cagaaaacga ttatctgcat ttacccagct 7740
taaataactg cagtaaggag gataccctat ggactttccg cagcaactcg aagcctgcgt 7800
taagcaggcc aaccaggcgc tgagccgttt tatcgcccca ctgccctttc agaacactcc 7860
cgtggtcgaa accatgcagt atggcgcatt attaggtggt aagcgcctgc gacctttcct 7920
ggtttatgcc accggtcata tgttcggcgt tagcacaaac acgctggacg cacccgctgc 7980
cgccgttgag tgtatccacg cttactcatt aattcatgat gatttaccgg caatggatga 8040
tgacgatctg cgtcgcggtt tgccaacctg ccatgtgaag tttggcgaag caaacgcgat 8100
tctcgctggc gacgctttac aaacgctggc gttctcgatt ttaagcgatg ccgatatgcc 8160
ggaagtgtcg gaccgcgaca gaatttcgat gatttctgaa ctggcgagcg ccagtggtat 8220
tgccggaatg tgcggtggtc aggcattaga tttagacgcg gaaggcaaac acgtacctct 8280
ggacgcgctt gagcgtattc atcgtcataa aaccggcgca ttgattcgcg ccgccgttcg 8340
ccttggtgca ttaagcgccg gagataaagg acgccgtgct ctgccggtac tcgacaagta 8400
tgcagagagc atcggccttg ccttccaggt tcaggacgac atcctggatg tggtgggaga 8460
tactgcaacg ttgggaaaac gccagggtgc cgaccagcaa cttggtaaaa gtacctaccc 8520
tgcacttctg ggtcttgagc aagcccggaa gaaagcccgg gatctgatcg acgatgcccg 8580
tcagtcgctg aaacaactgg ctgaacagtc actcgatacc tcggcactgg aagcgctagc 8640
ggactacatc atccagcgta ataaataaca ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg 8700
atcccccggg ctgcaggaat tcgatatcaa gcttatcgat accgtcgacc tcgagggggg 8760
gcccggtacc cagcttttgt tccctttagt gagggttaat tgcgcgcttg gcgtaatcat 8820
ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag 8880
ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg 8940
cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 9000
tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg catgcataaa aactgttgta 9060
attcattaag cattctgccg acatggaagc catcacaaac ggcatgatga acctgaatcg 9120
ccagcggcat cagcaccttg tcgccttgcg tataatattt gcccattcaa atatgtatcc 9180
gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 9240
tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 9300
tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 9360
gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga 9420
acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat 9480
tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga 9540
gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag 9600
tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg 9660
accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg 9720
ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt 9780
agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg 9840
gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc 9900
ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg 9960
tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac 10020
ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact 10080
gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa 10140
acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 10200
aatccaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcgcccgcg ttcctgctgg cgctgggcct 10260
gtttctggcg ctggacttcc cgctgttccg tcagcagctt ttcgcccacg gccttgatga 10320
tcgcggcggc cttggcctgc atatcccgat tcaacggccc cagggcgtcc agaacgggct 10380
tcaggcgctc ccgaaggt 10398
<210> 3
<211> 6921
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattgacaat taatcatccg gctcgtgggg aattgtgagc ggataacaat tcccctctag 5040
aaataatttt gtttaacttt aggaggaatt aaccatgtcg actcttccta tttctagtgt 5100
ttcattctct tcatctacgt cacctttggt agttgatgat aaagttagca cgaaacaaga 5160
tgttatccgc cataccatga atttcaatgc tagcatatgg ggagatcaat ttcttacata 5220
tgatgagcca gaagatttgg ttatgaagaa acaacttgtt gaagagctca aagaggaagt 5280
caagaaagag ctaataacga tcaaaggttc taatgaaccg atgcagcatg tcaagttgtt 5340
agaacttatt gatgcagtcc aacggcttgg catagcctat cattttgaag aggagattga 5400
agaagccttg caacatatcc atgttacata tggcgagcag tgggtcgata aagaaaacct 5460
acaaagcatt tctctttggt tccgactcct acgacaacaa ggcttcaacg tctcatcagg 5520
agtattcaag gactttatgg acgagaaggg aaaatttaag gaatccttat gtaatgatgc 5580
tcagggaatt cttgctctgt atgaagcggc atttatgagg gtggaagatg aaacaatact 5640
agataatgcg ctcgagttca ctaaagttca ccttgacatc atagccaagg atccttcttg 5700
tgactcttcc ctaagaaccc aaatacacca agcgttaaag cagccactta ggagaaggct 5760
ggcaaggata gaggcgttgc attacatgcc tatctaccaa caagaaacat cccacaatga 5820
ggtcttactg aagcttgcaa aactagattt tagcgtgctt caatcaatgc acaaaaagga 5880
gcttagccac atttgcaaat ggtggaagga tttggacctt caaaataagc ttccttatgt 5940
tcgagacagg gtggtggaag gctatttttg gatactatcc atctattacg agcctcaaca 6000
tgctcgaaca agaatgttcc taatgaaaac atgcatgtgg ttagtcgttt tagatgatac 6060
atttgataat tatggtactt atgaagaact cgaaatcttt acacaagctg ttgaaagatg 6120
gtcaataagc tgcctggata tgcttccaga atacatgaaa ctaatatatc aagagcttgt 6180
gaatcttcac gtggaaatgg aggaatcact tgaaaaggag ggaaaaacat atcaaattca 6240
ctatgtcaag gagatggcaa aagagttggt tcgcaactac ttggtagaag cgagatggct 6300
aaaagagggg tacatgccaa ctcttgagga gtacatgtct gtgtcaatgg tgactggtac 6360
ctatggctta atgatagcga gatcttatgt cggtaggggt gatattgtca ccgaggatac 6420
ctttaaatgg gtgtcctcgt atcctcctat tataaaagct tcatgtgtga ttgtaagact 6480
tatggatgac attgtcagcc acaaggagga acaagagaga ggccatgttg cttcaagcat 6540
cgaatgctat tctaaggaaa gtggtgcatc agaggaggaa gcgtgtgaat atatctcagg 6600
aaaagttgaa gatgcatgga aagttataaa ccgagagtcg ctcaggccta cagcggtccc 6660
gtttcctcta cttatgcctg caatcaacct tgcacgtatg tgtgaagtcc tatatagcgt 6720
caacgatggc ttcactcatg ctgagggaga catgaaaagt tacatgaaat cgttcttcgt 6780
tcaccctatg gttgtctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct gccaccgctg 6840
agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga 6900
aaggaggaac tatatccgga t 6921
<210> 4
<211> 2780
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatcggcggc ataaaacgga tcgcataacg cgtcatcttg ataacgcgat tttcgacaaa 60
gaccggggca aggcgttttt ccagcggcca cgtctttgag taatgctgtc cccggcgaaa 120
caagctaaaa aaattaacag aacgattatc cggcgttgac atgcttcacc tcaacttcac 180
atataaagat tcaaaaattt gtgcaaattc acaactcagc gggacaacgt tcaaaacatt 240
ttgtcttcca tacccactat caggtatcct ttagcagcct gaaggcctaa gtagtacata 300
ttcattgagt cgtcaaattc atatacatta tgccattggc tgaaaattac gcaaaatggc 360
atagactcaa gatatttctt ccatcatgca aaaaaaaatt tgcagtgcat gatgttaatc 420
ataaatgtcg gtgtcatcat gcgctacgct ctatggctcc ctgacgtttt tttagccacg 480
tatcaattat aggtacttcc tgacgctttt tatcgcaact ctctactgtt tctccataaa 540
gaaggagata tacatatgga cactctgccg atctcttccg taagcttttc ttcctctact 600
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aacttcaacg catctatctg gggcgatcag ttcctgactt atgatgaacc ggaagatctg 720
gtaatgaaaa agcaactggt agaagaactg aaagaagaag ttaaaaagga actgatcacc 780
attaagggta gcaacgaacc gatgcagcac gtgaaactga ttgaactgat cgatgcggtt 840
cagcgtctgg gtattgctta tcattttgaa gaggaaatcg aggaagctct gcaacacatc 900
cacgtaacct acggcgaaca atgggtggat aaagagaatc tgcagtctat cagcctgtgg 960
ttccgcctgc tgcgtcagca aggtttcaat gtctcttctg gcgttttcaa agacttcatg 1020
gatgaaaagg gcaaattcaa ggaatccctg tgtaacgatg cgcaaggtat cctggcactg 1080
tacgaagcgg ccttcatgcg tgtggaagac gaaaccattc tggacaacgc gctggaattc 1140
actaaagtgc atctggacat catcgcgaaa gatccgtcct gcgactcctc tctgcgtact 1200
cagatccatc aagcgctgaa acagccgctg cgtcgtcgcc tggcacgtat tgaggctctg 1260
cactatatgc cgatttacca gcaggaaacc tctcacgacg aagtcctgct gaaactggct 1320
aaactggact tcagcgttct gcaatctatg cacaagaaag aactgtccca catctgcaaa 1380
tggtggaaag atctggatct gcaaaacaaa ctgccgtacg ttcgtgaccg tgttgttgag 1440
ggctattttt ggattctgtc catctactat gaaccacagc acgcgcgtac tcgcatgttt 1500
ctgatgaaaa cctgcatgtg gctggttgtc ctggacgaca cctttgacaa ctatggtacg 1560
tacgaagaac tggaaatctt cacccaggcc gtggaacgtt ggtctatttc ctgcctggat 1620
atgctgccgg aatacatgaa actgatctat caagaactgg ttaacctgca cgtggaaatg 1680
gaagagtctc tggagaaaga aggtaaaact taccagatcc actacgtcaa ggagatggcg 1740
aaagaactgg tccgtaacta tctggtcgag gcgcgttggc tgaaagaggg ctatatgccg 1800
actctggaag aatacatgag cgtatccatg gttaccggca cctacggcct gatgattgcg 1860
cgttcctacg tcggccgtgg tgatattgtt accgaagata cctttaagtg ggtttcttcc 1920
tacccgccga tcatcaaagc gtcttgtgtc atcgttcgcc tgatggacga catcgtttct 1980
cacaaagagg agcaagaacg tggtcacgta gcatctagca tcgaatgcta ctccaaagaa 2040
tccggcgcgt ccgaagaaga agcttgcgaa tacatcagcc gtaaagttga agatgcctgg 2100
aaagttatca accgcgaaag cctgcgtccg acggcggtcc cgtttccgct gctgatgccg 2160
gcaatcaacc tggcacgcat gtgtgaggtt ctgtacagcg tgaacgatgg ttttactcac 2220
gcggaaggtg acatgaagag ctatatgaag agcttcttcg tacaccctat ggtcgtatga 2280
tttcacaccg ccagctcagc tggcggtgct gttttgtaac ccgccaaatc ggcggtaacg 2340
aaagaggata aaccgtgtcc cgtattatta tgctgatccc taccggaacc agcgtcggtc 2400
tgaccagcgt cagccttggc gtgatccgtg caatggaacg caaaggcgtt cgtctgagcg 2460
ttttcaaacc tatcgctcag ccgcgtaccg gtggcgatgc gcccgatcag actacgacta 2520
tcgtgcgtgc gaactcttcc accacgacgg ccgctgaacc gctgaaaatg agctacgttg 2580
aaggtctgct ttccagcaat cagaaagatg tgctgatgga agagatcgtc gcaaactacc 2640
acgctaacac caaagacgct gaagtcgttc tggttgaagg tctggtcccg acacgtaagc 2700
accagtttgc ccagtctctg aactacgaaa tcgctaaaac gctgaatgcg gaaatcgtct 2760
tcgttatgtc tcagggcact 2780
Claims (10)
1.利用地沟油生物法制备法尼烯的方法；其特征是包括如下步骤：
1)利用地沟油酶法制备粗甘油和副产物脂肪酸烷基酯；
2)制备大肠杆菌宿主菌种子液；
3)以粗甘油为底物接种大肠杆菌宿主菌种子液发酵制备法尼烯。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤1)利用地沟油酶法制备粗甘油和副产物脂肪酸烷基酯方法是：在无溶剂体系或有机溶剂体系中，加入醇油摩尔比为1:1～10:1的烷基醇和地沟油，并在反应体系中加入酶含量为1％～30％wt的脂肪酶，在20～45℃、50～260rpm/min条件下，酶法酯交换反应12～48h后，静置分离获得浓度为20％～99％(w/w)的粗甘油和产率为20％～98％的副产物脂肪酸烷基酯。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的地沟油是废弃动物油脂、泔水油、多次反复加热使用及从餐饮单位或者食品加工厂产生的废油脚或煎炸油的各种垃圾油的总称；所述脂肪酶包括游离脂肪酶、全细胞脂肪酶和固定化脂肪酶的多种形式。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤2)制备大肠杆菌宿主菌种子液的方法是：将大肠杆菌宿主菌接种至液态种子培养液，在37℃和220rpm条件下发酵培养12h，获得大肠杆菌宿主菌种子液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是液态种子培养液是浓度为5g/L的酵母粉、浓度为10g/L的蛋白胨、浓度为10g/L的NaCl、浓度为50mg/L的氯霉素、浓度为50mg/L的氨苄霉素和浓度为50mg/L的卡那霉素。
6.如权利要求4所述的方法，其特征是所述大肠杆菌宿主菌的制备方法是往大肠杆菌通过CaCl2转化法转入质粒pTJU-1、pTJU-2和pTJU-3，并通过染色体整合敲入ackA-paraC-FG-yfcC基因片段；质粒pTJU-1以pACYCDuet-1为骨架载体、复制子为p15A复制子、启动子为T5启动子、包含乙酰乙酰基CoA硫解酶基因、HMG-CoA合酶基因和HMG-CoA还原酶基因；质粒pTJU-2以pBBR1MCS-4为骨架载体、复制子为pBBR1复制子、启动子为T7启动子、包含甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和金合欢烯焦磷酸合成酶基因；质粒pTJU-3以pET-28a为骨架载体、复制子为pBR322复制子、启动子为T3启动子、包含金合欢烯合成酶基因；所述的ackA-paraC-FG-yfcC基因片段包括ackA整合位点的前后臂、araC启动子和法尼烯合成酶基因。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是所述的质粒pTJU-1序列为seq.1；所述的质粒pTJU-2序列为seq.2；所述的质粒pTJU-3序列为seq.3；所述的ackA-paraC-FG-yfcC基因片段序列为seq.4。
8.如权利要求6所述的方法，其特征是所述的大肠杆菌是E.coli BL21(DE3)。
9.如权利要求1所述的方法，其特征是所述步骤3)以粗甘油为底物接种大肠杆菌宿主菌种子液发酵制备法尼烯方法是：在含有浓度为1～100g/L的粗甘油、浓度为1～50g/L的酵母粉、浓度为1～50g/L的蛋白胨、浓度为1～30g/L的无机盐、浓度为1～1000mg/L的氯霉素、浓度为1～1000mg/L的氨苄霉素、浓度为1～1000mg/L的卡那霉素的的液态发酵液中，加入0.1～10％大肠杆菌宿主菌种子液后，在30～45℃，50～350rpm条件下培养至OD600在0.6～0.8之间，向每升液态发酵液中添加1～100mg异丙基-β-D-硫代半乳糖苷和50～1000mL萃取剂，在16～35℃，50～350rpm条件下进行异源诱导表达，发酵制备法尼烯。
10.如权利要求9所述的方法，其特征是所述的萃取剂选自正己烷、正癸烷、十二烷、聚烯烃或煤油。
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