CN114410564B - 一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株及生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于5‑氨基乙酰丙酸生产的菌株，所述菌株进行基因表达抑制；所述抑制的基因为hemF、ybdK、gadB、gadA、mppA或dppA的任一种或几种组合。本发明获得菌株可高量生产5‑氨基乙酰丙酸，最高能使5‑氨基乙酰丙酸产量较原菌株提高2.42倍。

Description

一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株及生产方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株及生产方法。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，简称5-ALA)，分子式C₅H₉NO₃，分子量131.13，是一种两边分别有氨基和羧基的δ型－氨基酸。5-ALA 是四氢吡咯 (四氢吡咯是构成血红素、细胞色素、维生素B12的物质) 的前缀化合物，也是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B12等必不可少的物质，通常以盐酸盐的形式保存并被广泛应用到各个领域。

5-ALA存在于动物、植物以及微生物细胞中，广泛应用于医药、化妆品、农药、肥料、动物饲料以及微生物培养等领域，在生命过程中发挥着重要的作用，因此具有广阔的应用前景和市场开发前景，已经引起国内外学者及业界的广泛关注。

作为一种具有极大潜能的化学物质，其合成同样备受关注。目前主要有化学合成与生物合成两个途径来进行5-ALA的生产。化学合成反应步骤多、副产物多、分离提纯难、ALA的得率低以及环境污染严重等问题，生物法合成ALA已成为未来研究发展的趋势，随着生物技术的进步，应用微生物生产ALA 逐渐为人们所关注。自然界中许多生物可以合成ALA，但这些天然宿主的生产效率并不能让人们满意。

因此本发明尝试将外源基因导入工程菌，并不断对微生物合成5-ALA产量进行着优化，本发明通过应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对菌株BW25113菌株进行基因编辑，插入T7 RNA聚合酶（T7 RNA Polymerase，缩写为T7 RNAP）基因，使得该菌株可以应用T7表达系统；再对BW25113-T7菌株进行代谢通路改造，使其更适合用于5-ALA生产。

发明内容

本发明公开一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株，所述菌株进行基因表达抑制；所述抑制的基因为hemF、ybdK、gadB、gadA、mppA或dppA的任一种或几种组合。

在一些实施方式中，在大肠杆菌基因组中插入T7 RNAP基因，获得含T7表达系统的菌株；优选地，所述大肠杆菌为BW25113或MG1655。

在一些实施方式中，所述T7 RNAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明选择以大肠杆菌作为底盘菌，其具有生长速度快、遗传信息明确等优势，较适合用于代谢工程。但大部分野生型大肠杆菌无法应用T7表达系统，因为其基因组上缺少T7 RNAP。而诱导T7表达系统的T7 RNAP具有超强的启动其他基因转录的功能，并具有如下优点：T7 RNAP能特异性地识别T7启动子，开启下游基因的转录；T7 mRNA比较稳定；T7 mRNA具有较强的翻译信号。T7表达系统能够转录大肠杆菌中的几乎任何基因或其互补序列，但要求大肠杆菌中存在T7 RNAP基因。而部分代谢工程菌株（如MG1655、BW25113等）的基因组中缺少该基因，无法应用T7表达系统进行异源蛋白表达。本发明通过将T7 RNAP基因插入该菌株的基因组中，使得T7表达系统能够在该菌株中得以应用。

为了提高5-ALA的产量，使获得的含T7表达系统的大肠菌株更加特化、适合于ALA生产，本发明对BW25113-T7菌株进行代谢通路改造，在BW25113-T7上抑制1-6个基因的表达，所述基因分别是hemF、ybdk、gadB、gadA、mppA或dppA。

在一些实施方式中，所述基因hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述ybdK的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述gadB的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述gadA的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述mppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述dppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

在一些实施方式中，所述菌株基因表达抑制和在大肠杆菌基因组中插入T7 RNAP基因采用规律成簇的间隔短回文重复与Cas9核酸内切酶组合（CRISPR/Cas9，ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技术或基因重组技术。

在一些实施方式中，所述菌株基因表达抑制和在大肠杆菌基因组中插入T7 RNAP基因也可以利用CRISPR/Cas9技术对目的基因的活性进行编辑，在将所需编辑的基因启动子进行替换或删除，从而使该基因的表达发生正向（强化表达）或逆向（抑制表达）的效果。

在一些实施方式中，所述菌株基因表达抑制和在大肠杆菌基因组中插入T7 RNAP基因也可以利用CRISPR技术编辑启动子来弱化基因表达，对基因进行抑制。

在一些实施方式中，所述大肠杆菌基因组中插入T7 RNAP基因的具体步骤如下：

（1）将大肠杆菌BW25113基因组上的ybhC片段扩增，并将其连接于pACYCD骨架上，得到pACYCD-ybhC质粒；所述ybhC片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述ybhC的连接位点为pACYCD骨架上的p15a ori与CmR；

（2）扩增 T7 RNAP基因，同时利用反向PCR将pACYCD-ybhC质粒线性化，留下HRL+ori+Cmr+HRR部分，将二者进行连接，得到pACYCD-Donor-T7质粒；

（3）将pACYCD-Donor-T7上的HRL+T7 RNAP+HRR部分扩增，得到Donor DNA-ybhC；所述Donor DNA-ybhC的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

（4）将pTarget-N20载体上的N20片段替换为ybhC的N20片段，获得pTarget-N20-ybhC载体；N20-ybhC核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

（5）将pTarget-N20-ybhC载体与Donor DNA-ybhC一同进行基因打靶，获得BW25113-T7。

在一些实施方式中，所述基因表达抑制的方法如下：

（1）将大肠杆菌BW25113基因组上的目标基因Gene片段扩增，并将其连接于pACYCD骨架上，得到pACYCD-Gene质粒；所述Gene的连接位点为pACYCD骨架上的p15a ori与CmR；

（2）利用反向PCR将pACYCD-Gene质粒线性化，留下HRL+ori+Cmr+HRR部分，将其与Gene进行连接，得到pACYCD-Donor-Gene质粒；

（3）将pACYCD-Donor-Gene上的HRL+Gene +HRR部分扩增，得到Donor DNA-Gene；

（4）将pTarget-N20载体上的N20片段替换为Gene的N20片段，获得pTarget-N20-Gene载体；

（5）将pTarget-N20-Gene载体与Donor DNA-Gene一同进行基因打靶，获得BW25113-T7-Gene；

所述抑制基因表达为抑制hemF、ybdK 、gadB、gadA、mppA或dppA的任一种或几种基因表达的组合。

在一些实施方式中，当抑制基因表达为抑制两种或两种以上基因组合表达时，所述步骤如下：（1）上述步骤抑制第一个目的基因的表达，获得菌株BW25113-T7-Gene1；（2）以pACYCD-Gene1质粒为骨架，上述步骤（2）抑制第二个目的基因的表达，获得菌株BW25113-T7-Gene1-Gene2；（3）以pACYCD- Gene1-Gene2质粒为骨架，重复上述步骤（2）抑制多个目的基因的表达，获得菌株BW25113-T7-Gene1-Gene2-GeneN；所述Gene1、Gene2、GeneN为抑制的目的基因。

在一些实施方式中，所述抑制目标基因为hemF与ybdK基因组合抑制，或hemF与gadB基因组合抑制，或hemF与gadA基因组合抑制。

在一些实施方式中，所述抑制目标基因为hemF、ybdK与gadA基因组合抑制，或hemF、ybdK与gadB基因组合抑制，或hemF、gadA与gadB基因组合抑制。

在一些实施方式中，所述抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA与gadB基因组合抑制。

在一些实施方式中，所述抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA、gadB与mppA基因连接，或hemF、ybdK、gadA、gadB与dppA基因组合抑制。

在一些实施方式中，所述抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA、gadB、mppA与dppA基因组合抑制。

本发明还提供一种生产5-氨基乙酰丙酸的方法，将过表达hemA、hemL、eamA的质粒pET28b-ALA-LAA分别转入上述改造菌株中，培养所述菌株，从该发酵培养体系中收获5-氨基乙酰丙酸，得到5-氨基乙酰丙酸。

所述培养选用的培养基碳源为葡萄糖。

本发明选择过表达hemA、hemL、eamA的质粒pET28b-ALA-LAA转入改造菌株中，将葡萄糖作为基础培养基的碳源，在大肠杆菌体内通过三羧酸循环转化为谷氨酸，以谷氨酸为底物，通过hemA和hemL分别表达谷氨酸-tRNA还原酶和GSA转氨酶两个合成酶，将谷氨酸进一步转化为5-ALA；利用eamA基因表达出转运蛋白，将ALA从大肠杆菌体内转移至胞外，从而获得5-ALA。

本发明获得菌株可高量生产5-氨基乙酰丙酸，最高能使5-ALA产量较原BW25113-T7菌株提高2.42倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1. ybhC基因插入BW25113菌株的位置。

图2. T7 RNAP基因敲入BW25113菌株的示意图。

图3. BW25113插入T7 RNAP基因后的基因组。

图4. 三种菌株的生长曲线。

图5. 5-ALA生产路线示意图。

图6. 5-ALA产量结果。

图7. 不同基因抑制的改造菌株的5-ALA产量变化(以原始菌株作为对照)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

主要实验材料和试剂配制

BW25113菌株购自：北京启航立业科技有限公司

BL21(DE3)菌株购自：北京全式金生物技术 (TransGen Biotech) 股份有限公司

质粒pACYCD-Blank购自：北京启航立业科技有限公司

实施例1、BW25113-T7的构建

1、实验设计

通过NCBI以及BioCyc确认序列后，将BW25113菌株的ybhC基因中插入T7 RNAP基因（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示），插入位点见图1，N20:gctgacgattcgtttccaga。BW25113-T7构建示意图见图2，预计插入后基因组变为图3所示。

引物列表见表1。

表1. 引物列表

2、BW25113-T7的构建过程

BW25113-T7的具体构建过程如下：

（1）获取重组质粒pACYCD-ybhC

以大肠杆菌BW25113为模板，以引物Primer ybhC-F和Primer ybhC-R，进行PCR扩增，获得一条带有目的基因sgRNA识别位点的937 bp的ybhC基因编码区的DNA片段(ybhC，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示）)；以质粒pACYCD-Blank为模板，以引物Primer F1和PrimerR1，进行PCR扩增，获得一条带有CmR氯霉素抗性基因与p15a转录起始位点的2065bp的DNA片段（L-ACYCD，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示）。

PCR扩增体系为：99 uL ddH₂O，30 uL Q5 Reaction Buffer，引物各7.5 uL，1.25uL 25mM dNTP，1.5 uL Q5 DNA Polymerase， 30~100 ng 模板。

PCR扩增反应程序为：98 ℃预变性1 min，（98 ℃变性15 s；68 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s/kb；30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

将上述两条DNA片段（ybhC和L-ACYCD）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，对目的条带进行回收，之后进行In-Fusion连接。In-Fusion连接体系为：200 ng 片段ybhC，200 ng片段L-ACYCD，1 uL 5× In-Fusion HD Enzyme Premix，用ddH₂O补齐至5 uL。连接反应程序为：50℃ 15 min。反应结束后，将连接产物转化DH5α，长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pACYCD-ybhC，该重组载体上含有氯霉素抗性标记。

所述重组载体pACYCD-ybhC是将pACYCD-Blank载体上的p15a ori与CmR之间插入了ybhC片段后，载体的其他序列不变，得到的重组载体。

所述重组载体pACYCD-ybhC含有BW25113的ybhC基因的第318-1255位共计937 bp的DNA分子。

（2）获取重组质粒pACYCD-Donor

以大肠杆菌BL21为模板，以引物Primer RNAP-F和Primer RNAP-R，进行PCR扩增，获得一条带有所需插入基因T7 RNA聚合酶的4488 bp的DNA片段(T7RNAP，核苷酸序列如SEQID NO.1所示）；以质粒pACYCD-ybhC为模板，以引物Primer F2和Primer R2，进行PCR扩增，获得一条带有氯霉素抗性基因、p15a转录起始位点、ybhC的左半部分（HRL）和ybhC的右半部分（HRR）的2866 bp的HRL+ori+Cmr+HRR的DNA片段（L-ybhC，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示）。

PCR扩增体系为：99 uL ddH₂O，30 uL Q5 Reaction Buffer，引物各7.5 uL，1.25uL 25mM dNTP，1.5 uL Q5 DNA Polymerase，30-100 ng 模板。

PCR扩增反应程序为：98 ℃预变性1 min，（98 ℃变性15 s；68 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s/kb；30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

将上述两条DNA片段（T7RNAP和L-yhbC）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，对目的条带进行回收，之后进行In-Fusion连接。In-Fusion连接体系为：200 ng 片段ybhC，200 ng片段L-ACYCD，1 uL 5× In-Fusion HD Enzyme Premix，用ddH₂O补齐至5 uL。连接反应程序为：50℃ 15 min。反应结束后，将连接产物转化DH5α，长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pACYCD-Donor-T7，该重组载体上含有氯霉素抗性标记。

所述重组载体pACYCD-Donor-T7是将pACYCD-ybhC载体上的HRL与HRR之间插入了T7RNAP片段后并缺失了基因sgRNA识别位点N20附近100bp，载体的其他序列不变，得到的重组载体。

所述重组载体pACYCD-Donor-T7含有的BW25113的ybhC基因的HRL（417 bp）、BL21的T7RNAP基因（4488 bp）和BW25113的ybhC基因的HRR（401 bp）。

（3）获取Donor DNA-ybhC

以质粒pACYCD-Donor-T7为模板，以引物Primer Donor-F和Primer Donor-R，进行PCR扩增，获得一条含有BW25113的ybhC基因的HRL（417 bp）、BL21的T7RNAP基因（4488 bp）和BW25113的ybhC基因的HRR（401 bp）的5306 bp的DNA片段（Donor DNA-ybhC，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示）。

PCR扩增体系为：99 uL ddH₂O，30 uL Q5 Reaction Buffer，引物各7.5 uL，1.25uL 25mM dNTP，1.5 uL Q5 DNA Polymerase， 30~100 ng 模板。

PCR扩增反应程序为：98 ℃预变性1 min，（98 ℃变性15 s；68 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s/kb；30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

将该DNA片段（Donor DNA-ybhC）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，对目的条带进行回收。

（4）获取重组质粒pTarget-N20-ybhC

以质粒pTarget-N20为模板，以引物Primer N20-F、Primer N20-R，进行PCR扩增，获得一条含有p15a ori、氯霉素抗性基因CmR、Cas9-sgRNA-N20-ybhC的2554 bp的DNA片段（N20-ybhC，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示），其中引物Primer N20-F进行了5‘端磷酸化修饰。

PCR扩增体系为：99 uL ddH₂O，30 uL Q5 Reaction Buffer，引物各7.5 uL，1.25uL 25mM dNTP，1.5 uL Q5 DNA Polymerase，30~100 ng 模板。

PCR扩增反应程序为：98 ℃预变性1 min，（98 ℃变性15 s；68 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s/kb；30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

将该DNA片段（N20-ybhC）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，对目的条带进行回收，之后进行T4 Ligase连接。连接体系为：200 ng 片段N20-ybhC，1 uL T4 Ligase, 1 ul 10×T4 Reaction Buffer，用ddH₂O补齐至10 uL。连接反应程序为：16 ℃ 12h。反应结束后，将连接产物转化DH5α，长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pTarget-N20-ybhC，该重组载体上含有氯霉素抗性标记。

所述重组载体pTarget-N20-ybhC是将pTarget-N20载体上的N20片段替换为了目的基因sgRNA识别位点的片段（ybhC的N20片段：gctgacgattcgtttccaga）载体的其他序列不变，得到的重组载体。

所述重组载体pTarget-N20-ybhC含有的p15a ori、氯霉素抗性基因CmR、sgRNA，其中sgRNA包括PAM（NGG）+crRNA（含ybhC序列N20）+tracrRNA（与cas9蛋白结合）。

（5）基因打靶

制备含pCAS菌株的电转感受态细胞。将含有pCas的目标菌株30 ℃过夜活化（LB+Kan 25 ug/ml），次日取0.2 ml转接到100 ml LB（+kan 25 ug/ml，+10 mM Arabinose）中，30 ℃培养至OD600≈0.5左右离心收集菌体，制备电转感受态细胞。

转化pTarget-N20-ybhC质粒和Donor DNA-ybhC至含有pCas9的目标菌株中，每50ul感受态细胞中，加入N20-Target质粒约100 ng，同时加donor DNA 约400 ng（二者总体积不要超过15ul为宜），电转条件：2.5k v，5ms；向电转后的细胞中加入900 ul SOC或LB，30℃220rpm复苏培养1 h，然后涂布在加了两种抗性（kan 25 ug/ml， Chl 50 ug/ml）的LB平板上, 30℃过夜培养。

电转次日，挑取单克隆，以引物Primer Seq-F (gctcttacttcttcgcctctgc)和Primer Seq-R (tacccacgccgcggttattg)，以挑取的单克隆作为模板，进行PCR扩增验证。Primer Seq-F 位于BW25113的ybhC基因的下游(1267–1288 bp)，Primer Seq-R位于BW25113的ybhC基因的上游(261-282 bp)。若基因成功插入，则扩增的片段为5kb左右。经过菌落PCR确定挑出阳性单克隆，将该菌作为后续代谢改造的底盘菌，并命名为BW25113-T7(D0)。

实施例2、BW25113-T7的性状以及利用该菌株进行5-ALA的生产

1、BW25113-T7菌株的生长性状测试

测定菌株BW25113-T7的生长性状，BW25113和BL21(DE3)菌株作为对照，结果见图4，其中，M9和LB为标准培养基，M9YE为在M9的基础上额外添加至10 g/L的葡萄糖和4 g/L的酵母提取物，结果显示BW25113-T7菌株与原始菌株相比几乎没有生长性状上的差异，较BL21(DE3)菌株相比，在丰富培养基中具有更大的生长速度优势。

2、利用BW25113-T7进行5-ALA生物合成

利用BW25113-T7进行5-ALA生物合成，生产路线示意图见图5，5-ALA产量结果见图6。图6结果显示，在将T7聚合酶导入BW25113后，其用T7表达系统进行5-ALA代谢合成的效率与BL21(DE3)接近。并且，在额外过表达外排蛋白eamA后，其产量提升的幅度较BL21(DE3)更大。

实施例3、BW25113-T7菌株的代谢通路改造

为了提高5-ALA的产量，使BW25113-T7菌株更加特化、适合于5-ALA生产，对BW25113-T7菌株进行代谢通路改造。

1、实验设计

计划在BW25113-T7上抑制6个基因的表达，分别是hemF（核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示）、ybdk（核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示）、gadB（核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示）、gadA（核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示）、mppA（核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示）、dppA（核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示）。其中，对上述基因进行一定的排列组合，确定不同基因抑制效果的叠加带来的5-ALA产量提升效果。

根据该方案，进行了以上基因改造，获得的改造菌株见表2。

表2 改造菌株列表

菌株	基因型	来源
			<i>D0</i>	<i>BW25113-T7</i>	BW25113基因编辑获得
<i>D1:F</i>	<i>BW25113-T7 ΔhemF</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
			<i>D1:M</i>	<i>BW25113-T7 ΔmppA</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
D1:D	<i>BW25113-T7 ΔdppA</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
			D2:FY	<i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
D2:FA	<i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔgdhA</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
			D2:FB	<i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔgadB</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
D3:FYA	<i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgdhA</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
			D3:FYB	<i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgadB</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
D3:FAB	<i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔgdhA, ΔgadB</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
			D4:FYAB	<i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgdhA, ΔgadB</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
D5:FYABM	<i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgdhA, ΔgadB, ΔmppA</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
			D5:FYABD	<i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgdhA, ΔgadB, ΔdppA</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得
D6:FYABMD	<i>BW25113-T7 ΔhemF, ΔybdK, ΔgdhA, ΔgadB, ΔmppA, ΔdppA</i>	BW25113-T7(D0)基因编辑获得

具体实验步骤见下（以hemF基因抑制为例），引物列表见表3，加粗部分代表为In-Fusion连接设计的同源片段，灰色阴影部分表示sgRNA识别位点的N20。

表3.引物列表

Primer名称	序列(5'to3')	碱基数
			ACYCD-hemF-F	gcgagcgcaatttccctgccattcatccgcttattatc	38
ACYCD-hemF-R	tgcggctgtgcagttcctggcgttacccaacttaa	35
			HRL-hemF-F	aactgcacagccgcaacac	19
HRR-hemF-R	ggaaattgcgctcgcgct	18
			HRL-hemF-R	cccgtatgttcccaccagc	19
HRR-hemF-F	gcctgcctgttcgaaaacac	20
			N20argI-s	gttttagagctagaaatagcaagttaaaat	30
N20-hemF	ctcatcgcccggaacttgccactagtattatacctaggactga	43
			Test-hemF-F	tgacgctcggctcgcatatt	20
Test-hemF-R	ccgcgatcccagaccagatt	20

2、BW25113-T7菌株的代谢通路改造（以hemF基因抑制为例）

（1）获取重组质粒pACYCD-hemF

以大肠杆菌BW25113为模板，以引物HRL-hemF-F和HRR-hemF-R，进行PCR扩增，获得一条带有目的基因sgRNA识别位点的921 bp的hemF基因编码区的DNA片段(hemF，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)；以质粒pACYCD-Blank为模板，以引物ACYCD-hemF-F和ACYCD-hemF-R，进行PCR扩增，获得一条带有CmR氯霉素抗性基因与p15a转录起始位点的2173 bp的DNA片段（ACYCD，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示）。

PCR扩增体系为：99 uL ddH₂O，30 uL Q5 Reaction Buffer，引物各7.5 uL，1.25uL 25mM dNTP，1.5 uL Q5 DNA Polymerase， 30-100 ng 模板。

PCR扩增反应程序为：98 ℃预变性1 min，（98 ℃变性15 s；68 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s/kb；30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

将上述两条DNA片段（hemF和ACYCD）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，对目的条带进行回收，之后进行In-Fusion连接。In-Fusion连接体系为：200 ng 片段hemF，200 ng片段L-ACYCD，1 uL 5× In-Fusion HD Enzyme Premix，用ddH₂O补齐至5 uL。连接反应程序为：50℃ 15 min。反应结束后，将连接产物转化DH5α，长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pACYCD-hemF，该重组载体上含有氯霉素抗性标记。

所述重组载体pACYCD-hemF是将pACYCD-Blank载体上的p15a ori与CmR之间插入了hemF片段后，载体的其他序列不变，得到的重组载体。

所述重组载体pACYCD-hemF含有的BW25113的hemF基因的第-244至697位共计921bp的DNA分子。

（2）获取重组质粒pACYCD-Donor

以质粒pACYCD-hemF为模板，以引物HRL-hemF-R和HRR-hemF-F，进行PCR扩增，获得一条带有氯霉素抗性基因、p15a转录起始位点、hemF的左半部分（HRL）和hemF的右半部分（HRR）的3042bp的DNA片段（L-hemF，核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示），其中HRL-hemF-R引物进行5‘端磷酸化修饰。

PCR扩增体系为：99 uL ddH₂O，30 uL Q5 Reaction Buffer，引物各7.5 uL，1.25uL 25mM dNTP，1.5 uL Q5 DNA Polymerase， 30~100 ng 模板。

PCR扩增反应程序为：98 ℃预变性1 min，（98 ℃变性15 s；68 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s/kb；30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

将该DNA片段（L-hemF）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，对目的条带进行回收，之后进行T4 Ligase连接。连接体系为：200 ng 片段L-hemF，1 uL T4 Ligase, 1 ul 10× T4Reaction Buffer，用ddH₂O补齐至10 uL。连接反应程序为：16℃ 12h。反应结束后，将连接产物转化DH5α，长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pACYCD-Donor-hemF，该重组载体上含有氯霉素抗性标记。所述重组载体pACYCD-Donor-hemF是将pACYCD-hemF载体上的HRL与HRR之间缺失了基因sgRNA识别位点N20附近100bp，载体的其他序列不变，得到的重组载体。

所述重组载体pACYCD-Donor-hemF含有的BW25113的hemF基因的HRL（401 bp）、HRR（401 bp）。

（3）获取Donor DNA-hemF

以质粒pACYCD-Donor-hemF为模板，以引物HRL-hem-F和HRR-hemF-R，进行PCR扩增，获得一条含有BW25113的hemF基因的HRL（401 bp）和HRR（401 bp）的802bp的DNA片段（Donor DNA-hemF，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示）。

PCR扩增体系为：99 uL ddH₂O，30 uL Q5 Reaction Buffer，引物各7.5 uL，1.25uL 25mM dNTP，1.5 uL Q5 DNA Polymerase， 30-100 ng 模板。

PCR扩增反应程序为：98 ℃预变性1 min，（98 ℃变性15 s；68 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s/kb；30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

将该DNA片段（Donor DNA-hemF）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，对目的条带进行回收。

（4）获取重组质粒pTarget-N20-hemF

以质粒pTarget-N20为模板，以引物N20-argI-s、N20-hemF，进行PCR扩增，获得一条含有p15a ori、氯霉素抗性基因CmR、Cas9-sgRNA-N20-hemF的2554 bp的DNA片段（N20-hemF，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示），其中N20-argI-s引物进行了5‘端磷酸化修饰。

PCR扩增体系为：99 uL ddH₂O，30 uL Q5 Reaction Buffer，引物各7.5 uL，1.25uL 25mM dNTP，1.5 uL Q5 DNA Polymerase， 30~100 ng 模板。

PCR扩增反应程序为：98 ℃预变性1 min，（98 ℃变性15 s；68 ℃退火30 s；72 ℃延伸15 s/kb；30个循环），72 ℃过度延伸10 min。

将该DNA片段（N20-hemF）经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，对目的条带进行回收，之后进行T4 Ligase连接。连接体系为：200 ng 片段N20-hemF，1 uL T4 Ligase, 1 ul 10×T4 Reaction Buffer，用ddH₂O补齐至10 uL。连接反应程序为：16℃ 12h。反应结束后，将连接产物转化DH5α，长出的单克隆经PCR鉴定获得阳性重组载体pTarget-N20-hemF，该重组载体上含有氯霉素抗性标记。

所述重组载体pTarget-N20-hemF是将pTarget-N20载体上的N20片段替换为了目的基因sgRNA识别位点的片段（hemF的N20片段：GGCAAGTTCCGGGCGATGAG）载体的其他序列不变，得到的重组载体。

所述重组载体pTarget-N20-hemF含有的p15a ori、氯霉素抗性基因CmR、sgRNA，其中sgRNA包括PAM（NGG）+crRNA（含hemF序列N20）+tracrRNA（与cas9蛋白结合）。

（5）基因打靶

制备含pCAS菌株的电转感受态细胞。将含有pCas的目标菌株30℃过夜活化（LB+Kan 25 ug/ml），次日取0.2 ml转接到100 ml LB（+kan 25 ug/ml，+10 mM Arabinose）中，30℃培养至OD600≈0.5左右离心收集菌体，制备电转感受态细胞。

转化pTarget-N20-hemF质粒和Donor DNA-hemF至含有pCas9的目标菌株中，每50ul感受态细胞中，加入N20-Target质粒约100 ng，同时加donor DNA 约400 ng（二者总体积不要超过15 ul为宜），电转条件：2.5 kv，5 ms；向电转后的细胞中加入900 ul SOC或LB，30℃ 220 rpm复苏培养1 h，然后涂布在加了两种抗性（kan 25 ug/ml， Chl 50 ug/ml）的LB平板上, 30℃过夜培养。

电转次日，挑取单克隆，以引物Test-hemF-F和Test-hemF-R，以挑取的单克隆作为模板，进行PCR扩增验证。若基因成功被抑制，则扩增的片段为900 bp左右；而原始菌株的扩增片段为1 kb左右。经过菌落PCR确定挑出阳性单克隆，并命名为D1:F。

D2:FY的构建则是在D1:F的基础上进一步抑制基因ybdK；其余构建菌株同理，D6:FYABMD则是将hemF、ybdK、gdhA、gadB、mppA和dppA这六个基因叠加抑制获得。

将过表达hemA、hemL、eamA的质粒pET28b-ALA-LAA（核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示）分别转入这些改造菌株中，培养所述菌株，从该发酵培养体系中收获5-氨基乙酰丙酸，从而得到5-氨基乙酰丙酸并分别检测每个改造菌株的5-ALA产量。

改造菌株的5-ALA产量相对变化见图7与表4。

表4.不同基因抑制的改造菌株的ALA产量变化(以原始菌株作为对照)

菌株	ALA产量相对变化
		D0	1.00
D1:F	2.06
		D1:D	1.28
D1:M	0.91
		D2:FY	1.93
D2:FA	1.68
		D2:FB	1.65
D3:FYA	2.23
		D3:FYB	2.30
D3:FAB	2.03
		D4:FYAB	2.17
D5:FYABD	2.42
		D5:FYABM	1.93
D6:FYABMD	1.53

由表4可以看到，基因hemF、ybdK 、gadB、gadA、mppA、dppA的抑制可以均能给5-ALA的产量带来较为明显的提升；dppA的单基因抑制可以提高5-ALA产量约1.28倍，hemF的单基因抑制可以提高5-ALA产量约2.06倍；在多个基因抑制中，多基因抑制株D5:FYABD有着更高的5-ALA产量，可以提高5-ALA产量约2.42倍。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一种用于5-氨基乙酰丙酸生产的菌株及生产方法

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4479

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacaccatcg aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc ggaagagagt 60

caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga gtatgccggt 120

gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc tgcgaaaacg 180

cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg cgtggcacaa 240

caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct ggccctgcac 300

gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg 360

gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt 420

ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca ggatgccatt 480

gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca 540

cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg 600

gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg 660

cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg 720

gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat 780

gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg 840

cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata tctcggtagt gggatacgac 900

gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca ggattttcgc 960

ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag 1020

ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg 1080

caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 1140

cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta agttagctca ctcattaggc 1200

accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata 1260

acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgga ttcactggcc gtcgttttac 1320

aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 1380

ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 1440

gcagcctgaa tggcgaatgg cgctttgcct ggtttccggc accagaagcg gtgccggaaa 1500

gctggctgga gtgcgatctt cctgaggccg atactgtcgt cgtcccctca aactggcaga 1560

tgcacggtta cgatgcgccc atctacacca acgtgaccta tcccattacg gtcaatccgc 1620

cgtttgttcc cacggagaat ccgacgggtt gttactcgct cacatttaat gttgatgaaa 1680

gctggctaca ggaaggccag acgcgaatta tttttgatgg cgtcgggatc tgatccggat 1740

ttactaactg gaagaggcac taaatgaaca cgattaacat cgctaagaac gacttctctg 1800

acatcgaact ggctgctatc ccgttcaaca ctctggctga ccattacggt gagcgtttag 1860

ctcgcgaaca gttggccctt gagcatgagt cttacgagat gggtgaagca cgcttccgca 1920

agatgtttga gcgtcaactt aaagctggtg aggttgcgga taacgctgcc gccaagcctc 1980

tcatcactac cctactccct aagatgattg cacgcatcaa cgactggttt gaggaagtga 2040

aagctaagcg cggcaagcgc ccgacagcct tccagttcct gcaagaaatc aagccggaag 2100

ccgtagcgta catcaccatt aagaccactc tggcttgcct aaccagtgct gacaatacaa 2160

ccgttcaggc tgtagcaagc gcaatcggtc gggccattga ggacgaggct cgcttcggtc 2220

gtatccgtga ccttgaagct aagcacttca agaaaaacgt tgaggaacaa ctcaacaagc 2280

gcgtagggca cgtctacaag aaagcattta tgcaagttgt cgaggctgac atgctctcta 2340

agggtctact cggtggcgag gcgtggtctt cgtggcataa ggaagactct attcatgtag 2400

gagtacgctg catcgagatg ctcattgagt caaccggaat ggttagctta caccgccaaa 2460

atgctggcgt agtaggtcaa gactctgaga ctatcgaact cgcacctgaa tacgctgagg 2520

ctatcgcaac ccgtgcaggt gcgctggctg gcatctctcc gatgttccaa ccttgcgtag 2580

ttcctcctaa gccgtggact ggcattactg gtggtggcta ttgggctaac ggtcgtcgtc 2640

ctctggcgct ggtgcgtact cacagtaaga aagcactgat gcgctacgaa gacgtttaca 2700

tgcctgaggt gtacaaagcg attaacattg cgcaaaacac cgcatggaaa atcaacaaga 2760

aagtcctagc ggtcgccaac gtaatcacca agtggaagca ttgtccggtc gaggacatcc 2820

ctgcgattga gcgtgaagaa ctcccgatga aaccggaaga catcgacatg aatcctgagg 2880

ctctcaccgc gtggaaacgt gctgccgctg ctgtgtaccg caaggacaag gctcgcaagt 2940

ctcgccgtat cagccttgag ttcatgcttg agcaagccaa taagtttgct aaccataagg 3000

ccatctggtt cccttacaac atggactggc gcggtcgtgt ttacgctgtg tcaatgttca 3060

acccgcaagg taacgatatg accaaaggac tgcttacgct ggcgaaaggt aaaccaatcg 3120

gtaaggaagg ttactactgg ctgaaaatcc acggtgcaaa ctgtgcgggt gtcgataagg 3180

ttccgttccc tgagcgcatc aagttcattg aggaaaacca cgagaacatc atggcttgcg 3240

ctaagtctcc actggagaac acttggtggg ctgagcaaga ttctccgttc tgcttccttg 3300

cgttctgctt tgagtacgct ggggtacagc accacggcct gagctataac tgctcccttc 3360

cgctggcgtt tgacgggtct tgctctggca tccagcactt ctccgcgatg ctccgagatg 3420

aggtaggtgg tcgcgcggtt aacttgcttc ctagtgaaac cgttcaggac atctacggga 3480

ttgttgctaa gaaagtcaac gagattctac aagcagacgc aatcaatggg accgataacg 3540

aagtagttac cgtgaccgat gagaacactg gtgaaatctc tgagaaagtc aagctgggca 3600

ctaaggcact ggctggtcaa tggctggctt acggtgttac tcgcagtgtg actaagcgtt 3660

cagtcatgac gctggcttac gggtccaaag agttcggctt ccgtcaacaa gtgctggaag 3720

ataccattca gccagctatt gattccggca agggtctgat gttcactcag ccgaatcagg 3780

ctgctggata catggctaag ctgatttggg aatctgtgag cgtgacggtg gtagctgcgg 3840

ttgaagcaat gaactggctt aagtctgctg ctaagctgct ggctgctgag gtcaaagata 3900

agaagactgg agagattctt cgcaagcgtt gcgctgtgca ttgggtaact cctgatggtt 3960

tccctgtgtg gcaggaatac aagaagccta ttcagacgcg cttgaacctg atgttcctcg 4020

gtcagttccg cttacagcct accattaaca ccaacaaaga tagcgagatt gatgcacaca 4080

aacaggagtc tggtatcgct cctaactttg tacacagcca agacggtagc caccttcgta 4140

agactgtagt gtgggcacac gagaagtacg gaatcgaatc ttttgcactg attcacgact 4200

ccttcggtac cattccggct gacgctgcga acctgttcaa agcagtgcgc gaaactatgg 4260

ttgacacata tgagtcttgt gatgtactgg ctgatttcta cgaccagttc gctgaccagt 4320

tgcacgagtc tcaattggac aaaatgccag cacttccggc taaaggtaac ttgaacctcc 4380

gtgacatctt agagtcggac ttcgcgttcg cgtaacgcca aatcaatacg actccggatc 4440

cccttcgaag gaaagacctg atgcttttcg tgcgcgcat 4479

<210> 2

<211> 937

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tacccacgcc gcggttattg tattcccaca tgcggttgta gttagtgtca ttcagattgc 60

gctgtatttc gtcgttatca tctacgctgc cggtattacc cgcaaacgga cgattagaga 120

tcaccgcatc ggcccacggt ttagccgtgt taaaaccttc gttgatggcg ctatcacgga 180

tcaccacctg accgttggta ttggcatcaa catccagcga gcggcccagt tgcgccacac 240

catcaccgaa agcattgaaa cggctgttta cggcgaggaa accgtagtaa atgttggaca 300

gcgtagccgg tgcaaacaca tacgcttctt gctgagtacg tgagttcacc acgcggaatt 360

cggtgttatc gaacaccact gcgccgcgac cagaaacgat atccacatcc ccttcaatgt 420

agctgttggt caccagcgta cgcggctgac gattcgtttc cagacggttc tgcacaccgc 480

tgttggtgac aaagaaggtg ttctgacgac cgagaatgtt aacgttgtta atctgtacct 540

ggtcaccatc agtacgcagt gccaccgccg gatggttacc tgcatctacg ctatcgccca 600

gcgtgttttc gatggtcaga ttttgcagtt gcaggccatt gttttgtgac cagaagaccg 660

cagagcagag aacaccgata ctgtcgctgc gtttgctctg gcagctatcg tacatatacc 720

acgctggttt acctggcata tatttgccgc gcgggttgac gtcgtgacgc cagtcggcag 780

ggctcatgcc accatcaagg gaaagcccaa tcttcacatc aatcggtttt tcacctgtac 840

cgtacagagt aattccaccc ggagcggcag ggacatatac cgttccctga tactcaccag 900

gcatcacggc aatatactgg cgcttgttgg tacgctt 937

<210> 3

<211> 2064

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttgttggta cgcttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag 60

gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc 120

agtactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacag acggcatgat 180

gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatag 240

tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac 300

tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg 360

ccaggttttc accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat 420

cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt 480

aacaagggtg aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaact 540

ccggatgagc attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct 600

tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg 660

tacattgagc aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat 720

caacggtggt atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc 780

tcgataactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc attatggtga aagttggaac 840

ctcttacgtg ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt ggcccagggc ttcccggtat 900

caacagggac accaggattt atttattctg cgaagtgatc ttccgtcaca ggtatttatt 960

cggcgcaaag tgcgtcgggt gatgctgcca acttactgat ttagtgtatg atggtgtttt 1020

tgaggtgctc cagtggcttc tgtttctatc agctgtccct cctgttcagc tactgacggg 1080

gtggtgcgta acggcaaaag caccgccgga catcagcgct agcggagtgt atactggctt 1140

actatgttgg cactgatgag ggtgtcagtg aagtgcttca tgtggcagga gaaaaaaggc 1200

tgcaccggtg cgtcagcaga atatgtgata caggatatat tccgcttcct cgctcactga 1260

ctcgctacgc tcggtcgttc gactgcggcg agcggaaatg gcttacgaac ggggcggaga 1320

tttcctggaa gatgccagga agatacttaa cagggaagtg agagggccgc ggcaaagccg 1380

tttttccata ggctccgccc ccctgacaag catcacgaaa tctgacgctc aaatcagtgg 1440

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc ccctggcggc tccctcgtgc 1500

gctctcctgt tcctgccttt cggtttaccg gtgtcattcc gctgttatgg ccgcgtttgt 1560

ctcattccac gcctgacact cagttccggg taggcagttc gctccaagct ggactgtatg 1620

cacgaacccc ccgttcagtc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 1680

aacccggaaa gacatgcaaa agcaccactg gcagcagcca ctggtaattg atttagagga 1740

gttagtcttg aagtcatgcg ccggttaagg ctaaactgaa aggacaagtt ttggtgactg 1800

cgctcctcca agccagttac ctcggttcaa agagttggta gctcagagaa ccttcgaaaa 1860

accgccctgc aaggcggttt tttcgttttc agagcaagag attacgcgca gaccaaaacg 1920

atctcaagaa gatcatctta ttaatcagat aaaatatttc tagatttcag tgcaatttat 1980

ctcttcaaat gtagcacctg aagtcaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt 2040

aacgccaggt acccacgccg cggt 2064

<210> 4

<211> 2836

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccgtatgtt cccaccagcc acgcgaatgt gcggtttttt attgccgaaa aaccgggtgc 60

cgatcccgtc tggtggtttg gcggtggctt cgacttaacc ccattctatg gttttgaaga 120

agatgctatt cactggcatc gcaccgcccg tgacctgtgc ctgccatttg gcgaagacgt 180

ttatccccgt tacaaaaagt ggtgcgacga atacttctac ctcaaacatc gcaacgaaca 240

gcgcggtatt ggcgggctgt tctttgatga cctgaacacg ccagatttcg accgctgttt 300

tgcctttatg caggcggtag gcaaaggcta caccgacgct tatttaccaa ttgtcgagcg 360

acggaaagcg atggcctacg gcgagcgcga gcgcaatttc cctgccattc atccgcttat 420

tatcacttat tcaggcgtag caccaggcgt ttaagggcac caataactgc cttaaaaaaa 480

ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac 540

atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 600

gccttgcgta taatatttgc ccatagtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc 660

cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt 720

ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga 780

atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt 840

ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc 900

accgtctttc attgccatac ggaactccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg 960

aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat 1020

atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg 1080

ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat 1140

tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct 1200

tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca 1260

aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa 1320

gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt 1380

actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct 1440

gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc 1500

agcgctagcg gagtgtatac tggcttacta tgttggcact gatgagggtg tcagtgaagt 1560

gcttcatgtg gcaggagaaa aaaggctgca ccggtgcgtc agcagaatat gtgatacagg 1620

atatattccg cttcctcgct cactgactcg ctacgctcgg tcgttcgact gcggcgagcg 1680

gaaatggctt acgaacgggg cggagatttc ctggaagatg ccaggaagat acttaacagg 1740

gaagtgagag ggccgcggca aagccgtttt tccataggct ccgcccccct gacaagcatc 1800

acgaaatctg acgctcaaat cagtggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1860

cgtttcccct ggcggctccc tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt 1920

cattccgctg ttatggccgc gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg 1980

cagttcgctc caagctggac tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct 2040

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag 2100

cagccactgg taattgattt agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa 2160

actgaaagga caagttttgg tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag 2220

ttggtagctc agagaacctt cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag 2280

caagagatta cgcgcagacc aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa 2340

tatttctaga tttcagtgca atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt caaaggggga 2400

tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccaggaactg cacagccgca acaccgaaca 2460

agcggcattt gtggtgttga aatcaccgtc ggttccttcg gtgctggtgg aaacctcgtt 2520

tatcaccaac ccggaagaag aacggctgtt aggcacggcg gcgtttcgtc agaaaatcgc 2580

cacagcgatt gctgaaggcg tgatcagtta tttccactgg ttcgacaacc agaaagcaca 2640

ttcgaaaaag cgataagtta tgaaacccga cgcacaccag gttaaacagt ttctgctcaa 2700

ccttcaggat acgatttgtc agcagctgac cgccgtcgat ggcgcagaat ttgtcgaaga 2760

tagttggcag cgcgaagctg gcggcggcgg gcgtagtcgg gtgttgcgta atggtggtgt 2820

tttcgaacag gcaggc 2836

<210> 5

<211> 5306

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tacccacgcc gcggttattg tattcccaca tgcggttgta gttagtgtca ttcagattgc 60

gctgtatttc gtcgttatca tctacgctgc cggtattacc cgcaaacgga cgattagaga 120

tcaccgcatc ggcccacggt ttagccgtgt taaaaccttc gttgatggcg ctatcacgga 180

tcaccacctg accgttggta ttggcatcaa catccagcga gcggcccagt tgcgccacac 240

catcaccgaa agcattgaaa cggctgttta cggcgaggaa accgtagtaa atgttggaca 300

gcgtagccgg tgcaaacaca tacgcttctt gctgagtacg tgagttcacc acgcggaatt 360

cggtgttatc gaacaccact gcgccgcgac cagaaacgat acagatcccg gacaccatcg 420

aatggcgcaa aacctttcgc ggtatggcat gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg 480

tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc 540

agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag 600

tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg 660

gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc 720

aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga 780

tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac 840

gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag 900

ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca 960

gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg 1020

gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc 1080

tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag 1140

gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg 1200

ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta 1260

ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata tctcggtagt gggatacgac gataccgaag 1320

acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc 1380

aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc 1440

tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct 1500

ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa 1560

gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta agttagctca ctcattaggc accccaggct 1620

ttacacttta tgcttccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 1680

acaggaaaca gctatgacca tgattacgga ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 1740

ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 1800

ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 1860

tggcgaatgg cgctttgcct ggtttccggc accagaagcg gtgccggaaa gctggctgga 1920

gtgcgatctt cctgaggccg atactgtcgt cgtcccctca aactggcaga tgcacggtta 1980

cgatgcgccc atctacacca acgtgaccta tcccattacg gtcaatccgc cgtttgttcc 2040

cacggagaat ccgacgggtt gttactcgct cacatttaat gttgatgaaa gctggctaca 2100

ggaaggccag acgcgaatta tttttgatgg cgtcgggatc tgatccggat ttactaactg 2160

gaagaggcac taaatgaaca cgattaacat cgctaagaac gacttctctg acatcgaact 2220

ggctgctatc ccgttcaaca ctctggctga ccattacggt gagcgtttag ctcgcgaaca 2280

gttggccctt gagcatgagt cttacgagat gggtgaagca cgcttccgca agatgtttga 2340

gcgtcaactt aaagctggtg aggttgcgga taacgctgcc gccaagcctc tcatcactac 2400

cctactccct aagatgattg cacgcatcaa cgactggttt gaggaagtga aagctaagcg 2460

cggcaagcgc ccgacagcct tccagttcct gcaagaaatc aagccggaag ccgtagcgta 2520

catcaccatt aagaccactc tggcttgcct aaccagtgct gacaatacaa ccgttcaggc 2580

tgtagcaagc gcaatcggtc gggccattga ggacgaggct cgcttcggtc gtatccgtga 2640

ccttgaagct aagcacttca agaaaaacgt tgaggaacaa ctcaacaagc gcgtagggca 2700

cgtctacaag aaagcattta tgcaagttgt cgaggctgac atgctctcta agggtctact 2760

cggtggcgag gcgtggtctt cgtggcataa ggaagactct attcatgtag gagtacgctg 2820

catcgagatg ctcattgagt caaccggaat ggttagctta caccgccaaa atgctggcgt 2880

agtaggtcaa gactctgaga ctatcgaact cgcacctgaa tacgctgagg ctatcgcaac 2940

ccgtgcaggt gcgctggctg gcatctctcc gatgttccaa ccttgcgtag ttcctcctaa 3000

gccgtggact ggcattactg gtggtggcta ttgggctaac ggtcgtcgtc ctctggcgct 3060

ggtgcgtact cacagtaaga aagcactgat gcgctacgaa gacgtttaca tgcctgaggt 3120

gtacaaagcg attaacattg cgcaaaacac cgcatggaaa atcaacaaga aagtcctagc 3180

ggtcgccaac gtaatcacca agtggaagca ttgtccggtc gaggacatcc ctgcgattga 3240

gcgtgaagaa ctcccgatga aaccggaaga catcgacatg aatcctgagg ctctcaccgc 3300

gtggaaacgt gctgccgctg ctgtgtaccg caaggacaag gctcgcaagt ctcgccgtat 3360

cagccttgag ttcatgcttg agcaagccaa taagtttgct aaccataagg ccatctggtt 3420

cccttacaac atggactggc gcggtcgtgt ttacgctgtg tcaatgttca acccgcaagg 3480

taacgatatg accaaaggac tgcttacgct ggcgaaaggt aaaccaatcg gtaaggaagg 3540

ttactactgg ctgaaaatcc acggtgcaaa ctgtgcgggt gtcgataagg ttccgttccc 3600

tgagcgcatc aagttcattg aggaaaacca cgagaacatc atggcttgcg ctaagtctcc 3660

actggagaac acttggtggg ctgagcaaga ttctccgttc tgcttccttg cgttctgctt 3720

tgagtacgct ggggtacagc accacggcct gagctataac tgctcccttc cgctggcgtt 3780

tgacgggtct tgctctggca tccagcactt ctccgcgatg ctccgagatg aggtaggtgg 3840

tcgcgcggtt aacttgcttc ctagtgaaac cgttcaggac atctacggga ttgttgctaa 3900

gaaagtcaac gagattctac aagcagacgc aatcaatggg accgataacg aagtagttac 3960

cgtgaccgat gagaacactg gtgaaatctc tgagaaagtc aagctgggca ctaaggcact 4020

ggctggtcaa tggctggctt acggtgttac tcgcagtgtg actaagcgtt cagtcatgac 4080

gctggcttac gggtccaaag agttcggctt ccgtcaacaa gtgctggaag ataccattca 4140

gccagctatt gattccggca agggtctgat gttcactcag ccgaatcagg ctgctggata 4200

catggctaag ctgatttggg aatctgtgag cgtgacggtg gtagctgcgg ttgaagcaat 4260

gaactggctt aagtctgctg ctaagctgct ggctgctgag gtcaaagata agaagactgg 4320

agagattctt cgcaagcgtt gcgctgtgca ttgggtaact cctgatggtt tccctgtgtg 4380

gcaggaatac aagaagccta ttcagacgcg cttgaacctg atgttcctcg gtcagttccg 4440

cttacagcct accattaaca ccaacaaaga tagcgagatt gatgcacaca aacaggagtc 4500

tggtatcgct cctaactttg tacacagcca agacggtagc caccttcgta agactgtagt 4560

gtgggcacac gagaagtacg gaatcgaatc ttttgcactg attcacgact ccttcggtac 4620

cattccggct gacgctgcga acctgttcaa agcagtgcgc gaaactatgg ttgacacata 4680

tgagtcttgt gatgtactgg ctgatttcta cgaccagttc gctgaccagt tgcacgagtc 4740

tcaattggac aaaatgccag cacttccggc taaaggtaac ttgaacctcc gtgacatctt 4800

agagtcggac ttcgcgttcg cgtaacgcca aatcaatacg actccggatc cccttcgaag 4860

gaaagacctg atgcttttcg tgcgcgcata acgttgttaa tctgtacctg gtcaccatca 4920

gtacgcagtg ccaccgccgg atggttacct gcatctacgc tatcgcccag cgtgttttcg 4980

atggtcagat tttgcagttg caggccattg ttttgtgacc agaagaccgc agagcagaga 5040

acaccgatac tgtcgctgcg tttgctctgg cagctatcgt acatatacca cgctggttta 5100

cctggcatat atttgccgcg cgggttgacg tcgtgacgcc agtcggcagg gctcatgcca 5160

ccatcaaggg aaagcccaat cttcacatca atcggttttt cacctgtacc gtacagagta 5220

attccacccg gagcggcagg gacatatacc gttccctgat actcaccagg catcacggca 5280

atatactggc gcttgttggt acgctt 5306

<210> 6

<211> 137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagtgctga cgattcgttt ccagagtttt 60

agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac 120

cgagtcggtg ctttttt 137

<210> 7

<211> 921

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aactgcacag ccgcaacacc gaacaagcgg catttgtggt gttgaaatca ccgtcggttc 60

cttcggtgct ggtggaaacc tcgtttatca ccaacccgga agaagaacgg ctgttaggca 120

cggcggcgtt tcgtcagaaa atcgccacag cgattgctga aggcgtgatc agttatttcc 180

actggttcga caaccagaaa gcacattcga aaaagcgata agttatgaaa cccgacgcac 240

accaggttaa acagtttctg ctcaaccttc aggatacgat ttgtcagcag ctgaccgccg 300

tcgatggcgc agaatttgtc gaagatagtt ggcagcgcga agctggcggc ggcgggcgta 360

gtcgggtgtt gcgtaatggt ggtgttttcg aacaggcagg cgtcaacttt tcgcatgtcc 420

acggtgaggc gatgcctgct tccgccaccg ctcatcgccc ggaacttgcc gggcgcagtt 480

tcgaggcgat gggcgtttca ctggtagtgc atccgcataa cccgtatgtt cccaccagcc 540

acgcgaatgt gcggtttttt attgccgaaa aaccgggtgc cgatcccgtc tggtggtttg 600

gcggtggctt cgacttaacc ccattctatg gttttgaaga agatgctatt cactggcatc 660

gcaccgcccg tgacctgtgc ctgccatttg gcgaagacgt ttatccccgt tacaaaaagt 720

ggtgcgacga atacttctac ctcaaacatc gcaacgaaca gcgcggtatt ggcgggctgt 780

tctttgatga cctgaacacg ccagatttcg accgctgttt tgcctttatg caggcggtag 840

gcaaaggcta caccgacgct tatttaccaa ttgtcgagcg acggaaagcg atggcctacg 900

gcgagcgcga gcgcaatttc c 921

<210> 8

<211> 929

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcggaagggg cgattttttc cagcaatcgc aaggtatctt ccgttagcgg tcgacgatct 60

ccagtgtgcg gatcggtgat gacgccttca agcccatagc gacaggcctg gaaacggttg 120

aatttataca gcaggtaatc tttttcctga tgtttaaacg ggcgttccgt cagtaaccag 180

tgggcggtag cctgaattaa tcccgccata tttactgcgt ggctaagggt taacggggta 240

tccatcaccc gaacctccac cgtgccaaaa tgaggactgg ggcgaatatc ccagtgcaga 300

tctttaatgc tgtcgatcat cgtggtgtaa ctcagacagc gaaacagggc ttcaaattgt 360

tgccagttac tgacccacgg catcgggcca ttatcaggaa aggcggaaaa aatattcggt 420

cgtgaggagg caaaacgcgt atccgttccc tgcatatatg gcgacgcggc ggaaagggcg 480

ataaagtgcg gcacaaatcg tgacaagccg tgcagcaaat aaatggcgtc atcgccactg 540

gcgcagccaa catggacatg ctgaccaaaa acggtcgcct gctgaatgag ataaccaaag 600

ttttccagcg tgcgttgata gcgttcgtta tcgcatacct cctgacgctg ccatttctga 660

aacgggtgcg tgccaccgcc gcaaatttcc agatgatggt ctgtggctgc ctgcaatacg 720

actttctgca tcgctgaaaa ctgcccggca gcctggttga tatcacggca aacatccgtc 780

gccagctcca gcatactttc ggtgatatcg tgctttacct ctccggccgt gatcttattt 840

ttaaccgcgt caatcagcat tgaagagtcc tggcttaagt catagcccgg cggattaacc 900

acctgcattt ccagttcaat accgagggt 929

<210> 9

<211> 918

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acacataatg cgcatcacca cgatgtcggt ggcttcaccg ccgagagtga aggccggaac 60

ctgccagccg cgcagacgca gacgttcaga gaggtcatac agggtgtatc ccggatcttc 120

accatctttc agtttgaagc aaaccgccgg gatgccttcg tccgggcgac ccgtacagat 180

gaactcatac ggccccagtt tggcgatttc atccgccaga taagcggcaa cctggtaaga 240

ggcgttctgt actttggtat agccttcacg accgaggcgc aggaattcat agtactgtgc 300

aattacctga cccgccgggc gggagaagtt gatggcaaaa gtaccaattt gaccacccag 360

gtagtcaacg ttgaacacca gttcctgcgg cagcgcttct tcgtcacgcc agataaccca 420

gccgcagccc agcggagcca gaccgaattt atggcctgaa gcactgatcg atttcacacg 480

cggcaggcgg aagtcccaga cgatatccgg ggcgacgaac ggtgccagga agccaccgct 540

ggcagcgtcg atgtgcatgt cgatgtcgat accggtatcg gcctggaatt tatccagcgc 600

atcgtgcagc ggttgtggga actcatagtt accagtgtag gtcacgccga aagtcggcac 660

cacgccgatg gtgttttcgt cacaggcttc aatcatgcgt ttcgggtcca taaacaactg 720

accggggcgc atagggatct cacgcagctc cacatcccag tagcgggcga atttatgcca 780

gcagatttgt accggaccgc acaccaggtt tggtttatcc gttggtttgc ctgcagcttc 840

catacgcttg cgccaacgcc atttcatcgc catcccgccg agcatacagg cctcggaaga 900

accaatggtg ttggtgcc 918

<210> 10

<211> 890

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgacccgaa tcaaaccgag ttcgcgcaag ccgttcgtga agtaatgacc acactctggc 60

cttttcttga acaaaatcca aaatatcgcc agatgtcatt actggagcgt ctggttgaac 120

cggagcgcgt gatccagttt cgcgtggtat gggttgatga tcgcaaccag atacaggtca 180

accgtgcatg gcgtgtgcag ttcagctctg ccatcggccc gtacaaaggc ggtatgcgct 240

tccatccgtc agttaacctt tccattctca aattcctcgg ctttgaacaa accttcaaaa 300

atgccctgac tactctgccg atgggcggtg gtaaaggcgg cagcgatttc gatccgaaag 360

gaaaaagcga aggtgaagtg atgcgttttt gccaggcgct gatgactgaa ctgtatcgcc 420

acctgggcgc ggataccgac gttccggcag gtgatatcgg ggttggtggt cgtgaagtcg 480

gctttatggc ggggatgatg aaaaagctct ccaacaatac cgcctgcgtc ttcaccggta 540

agggcctttc atttggcggc agtcttattc gcccggaagc taccggctac ggtctggttt 600

atttcacaga agcaatgcta aaacgccacg gtatgggttt tgaagggatg cgcgtttccg 660

tttctggctc cggcaacgtc gcccagtacg ctatcgaaaa agcgatggaa tttggtgctc 720

gtgtgatcac tgcgtcagac tccagcggca ctgtagttga tgaaagcgga ttcacgaaag 780

agaaactggc acgtcttatc gaaatcaaag ccagccgcga tggtcgagtg gcagattacg 840

ccaaagaatt tggtctggtc tatctcgaag gccaacagcc gtggtctcta 890

<210> 11

<211> 935

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgtgcttta ccgcattttg gagactatta tttacactaa atctgatttg atatattgat 60

acttaaaaca tttgatgctt cctttgtcac ttttttgatg gaagttgttt gcatttcttt 120

aaggcgaaac aaataattac gcatcaattt taatgtcggt tagagggaaa cttatgaagc 180

actctgtttc agtcacgtgt tgtgcgctgt tggtcagcag catttctctt tcgtatgctg 240

cagaagttcc gagcggcaca gtactggcag agaagcagga gctggtgcgc cacattaaag 300

atgagcctgc gtcgctggat cccgctaaag ccgtgggcct gccagagatt caggtcattc 360

gcgatctgtt tgaaggtctg gtgaatcaga acgaaaaagg ggagattgtc cccggcgttg 420

cgactcagtg gaaaagtaat gacaaccgta tctggacttt taccctgcgc gataacgcaa 480

aatgggcgga tggcacaccg gtaacggcgc aagattttgt ctacagctgg caacgtctgg 540

tggacccaaa aacattgtcg ccatttgcat ggtttgccgc gctggcggga atcaacaacg 600

cacaggcgat tattgatggt aaagctacgc ctgaccagct tggcgtcacc gcagttgatg 660

cccatacttt gaaaattcag cttgataaac cgttgccgtg gtttgtgaat ttaaccgcta 720

actttgcctt cttcccggtg caaaaagcca acgtagaaag cggtaaagag tggacgaaac 780

ccggaaatct gatcggcaat ggcgcttatg ttcttaaaga gcgcgtagtc aatgaaaaac 840

tggtcgtggt accgaatacc cattattggg ataacgccaa aacggtactg caaaaagtga 900

ccttcctgcc aattaatcag gaatccgcag ccact 935

<210> 12

<211> 934

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttttggcctg cacgccgact ttcgcccagt ctgcctgaat catctccgcc atgcggcgag 60

cgttcgggtt atacggacgt tgtaccggca tcgcccacag gtcgatggag aaaccttttt 120

ccagacccgc ttctttcagc aaggctttcg ctttttcagg atcgtaggtg tagtcctgaa 180

cgtcgtcgtt atagccccac atggttggcg ggatcaggtt tttcgctgat acgcccgcgc 240

cctgataaac cgctttgatg atcgcgtctt tgttcaccgc gtaggtcaga gcctggcgaa 300

ctttcacgtc atcgagtggt tttttctgca cgttatacga gagataaccg acgttcagcc 360

ccggcatttc catcagattg atggatttat cctgcttcat gcgagcgata tctgccgggt 420

tcgggtacgg catcacctgg cattcattct tctgcaattt cgcgtaacgc acggaagcgt 480

caggggtaat agagaaaacc agcgtatcga tctgcggttt ggtgccccag tagccatcaa 540

acgctttgta gcggatacgg gaatcttttt gatactgctg taactggaac ggaccggttc 600

cgattgggtt gaggtccagt ttttccggtg taccggcttt catcatcgca tcagcatatt 660

cttttgacag aatagaggcg aagtccattg ccaggtcagc gaggaacggc gcttccgggc 720

gagtcagcac aaactgaacg gtgttgtcgt ccaccttttt cacttcactg atcagctctg 780

gcaagcccat gccttcgaag tattcgtagc tgccgccaga aactttatgg tacgggtttt 840

gcgcgttttt ctgacgatcg aacgagaaca ccacatcatc ggcgttcagt tcacgcgtcg 900

gtttgaattc tttattgtcg tgccacttca cacc 934

<210> 13

<211> 2064

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cttgttggta cgcttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag 60

gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc 120

agtactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacag acggcatgat 180

gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatag 240

tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac 300

tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg 360

ccaggttttc accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat 420

cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt 480

aacaagggtg aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaact 540

ccggatgagc attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct 600

tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg 660

tacattgagc aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat 720

caacggtggt atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc 780

tcgataactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc attatggtga aagttggaac 840

ctcttacgtg ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt ggcccagggc ttcccggtat 900

caacagggac accaggattt atttattctg cgaagtgatc ttccgtcaca ggtatttatt 960

cggcgcaaag tgcgtcgggt gatgctgcca acttactgat ttagtgtatg atggtgtttt 1020

tgaggtgctc cagtggcttc tgtttctatc agctgtccct cctgttcagc tactgacggg 1080

gtggtgcgta acggcaaaag caccgccgga catcagcgct agcggagtgt atactggctt 1140

actatgttgg cactgatgag ggtgtcagtg aagtgcttca tgtggcagga gaaaaaaggc 1200

tgcaccggtg cgtcagcaga atatgtgata caggatatat tccgcttcct cgctcactga 1260

ctcgctacgc tcggtcgttc gactgcggcg agcggaaatg gcttacgaac ggggcggaga 1320

tttcctggaa gatgccagga agatacttaa cagggaagtg agagggccgc ggcaaagccg 1380

tttttccata ggctccgccc ccctgacaag catcacgaaa tctgacgctc aaatcagtgg 1440

tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc ccctggcggc tccctcgtgc 1500

gctctcctgt tcctgccttt cggtttaccg gtgtcattcc gctgttatgg ccgcgtttgt 1560

ctcattccac gcctgacact cagttccggg taggcagttc gctccaagct ggactgtatg 1620

cacgaacccc ccgttcagtc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc 1680

aacccggaaa gacatgcaaa agcaccactg gcagcagcca ctggtaattg atttagagga 1740

gttagtcttg aagtcatgcg ccggttaagg ctaaactgaa aggacaagtt ttggtgactg 1800

cgctcctcca agccagttac ctcggttcaa agagttggta gctcagagaa ccttcgaaaa 1860

accgccctgc aaggcggttt tttcgttttc agagcaagag attacgcgca gaccaaaacg 1920

atctcaagaa gatcatctta ttaatcagat aaaatatttc tagatttcag tgcaatttat 1980

ctcttcaaat gtagcacctg aagtcaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt 2040

aacgccaggt acccacgccg cggt 2064

<210> 14

<211> 2836

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cccgtatgtt cccaccagcc acgcgaatgt gcggtttttt attgccgaaa aaccgggtgc 60

cgatcccgtc tggtggtttg gcggtggctt cgacttaacc ccattctatg gttttgaaga 120

agatgctatt cactggcatc gcaccgcccg tgacctgtgc ctgccatttg gcgaagacgt 180

ttatccccgt tacaaaaagt ggtgcgacga atacttctac ctcaaacatc gcaacgaaca 240

gcgcggtatt ggcgggctgt tctttgatga cctgaacacg ccagatttcg accgctgttt 300

tgcctttatg caggcggtag gcaaaggcta caccgacgct tatttaccaa ttgtcgagcg 360

acggaaagcg atggcctacg gcgagcgcga gcgcaatttc cctgccattc atccgcttat 420

tatcacttat tcaggcgtag caccaggcgt ttaagggcac caataactgc cttaaaaaaa 480

ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac 540

atggaagcca tcacagacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc 600

gccttgcgta taatatttgc ccatagtgaa aacgggggcg aagaagttgt ccatattggc 660

cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga aaaacatatt 720

ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca catcttgcga 780

atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg atgaaaacgt 840

ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata tcaccagctc 900

accgtctttc attgccatac ggaactccgg atgagcattc atcaggcggg caagaatgtg 960

aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa aggccgtaat 1020

atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg cctcaaaatg 1080

ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt ttttctccat 1140

tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg gtagtgatct 1200

tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc attttcgcca 1260

aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac agggacacca ggatttattt attctgcgaa 1320

gtgatcttcc gtcacaggta tttattcggc gcaaagtgcg tcgggtgatg ctgccaactt 1380

actgatttag tgtatgatgg tgtttttgag gtgctccagt ggcttctgtt tctatcagct 1440

gtccctcctg ttcagctact gacggggtgg tgcgtaacgg caaaagcacc gccggacatc 1500

agcgctagcg gagtgtatac tggcttacta tgttggcact gatgagggtg tcagtgaagt 1560

gcttcatgtg gcaggagaaa aaaggctgca ccggtgcgtc agcagaatat gtgatacagg 1620

atatattccg cttcctcgct cactgactcg ctacgctcgg tcgttcgact gcggcgagcg 1680

gaaatggctt acgaacgggg cggagatttc ctggaagatg ccaggaagat acttaacagg 1740

gaagtgagag ggccgcggca aagccgtttt tccataggct ccgcccccct gacaagcatc 1800

acgaaatctg acgctcaaat cagtggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1860

cgtttcccct ggcggctccc tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt 1920

cattccgctg ttatggccgc gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg 1980

cagttcgctc caagctggac tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct 2040

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag 2100

cagccactgg taattgattt agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa 2160

actgaaagga caagttttgg tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag 2220

ttggtagctc agagaacctt cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag 2280

caagagatta cgcgcagacc aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa 2340

tatttctaga tttcagtgca atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt caaaggggga 2400

tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccaggaactg cacagccgca acaccgaaca 2460

agcggcattt gtggtgttga aatcaccgtc ggttccttcg gtgctggtgg aaacctcgtt 2520

tatcaccaac ccggaagaag aacggctgtt aggcacggcg gcgtttcgtc agaaaatcgc 2580

cacagcgatt gctgaaggcg tgatcagtta tttccactgg ttcgacaacc agaaagcaca 2640

ttcgaaaaag cgataagtta tgaaacccga cgcacaccag gttaaacagt ttctgctcaa 2700

ccttcaggat acgatttgtc agcagctgac cgccgtcgat ggcgcagaat ttgtcgaaga 2760

tagttggcag cgcgaagctg gcggcggcgg gcgtagtcgg gtgttgcgta atggtggtgt 2820

tttcgaacag gcaggc 2836

<210> 15

<211> 802

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aactgcacag ccgcaacacc gaacaagcgg catttgtggt gttgaaatca ccgtcggttc 60

cttcggtgct ggtggaaacc tcgtttatca ccaacccgga agaagaacgg ctgttaggca 120

cggcggcgtt tcgtcagaaa atcgccacag cgattgctga aggcgtgatc agttatttcc 180

actggttcga caaccagaaa gcacattcga aaaagcgata agttatgaaa cccgacgcac 240

accaggttaa acagtttctg ctcaaccttc aggatacgat ttgtcagcag ctgaccgccg 300

tcgatggcgc agaatttgtc gaagatagtt ggcagcgcga agctggcggc ggcgggcgta 360

gtcgggtgtt gcgtaatggt ggtgttttcg aacaggcagg ccccgtatgt tcccaccagc 420

cacgcgaatg tgcggttttt tattgccgaa aaaccgggtg ccgatcccgt ctggtggttt 480

ggcggtggct tcgacttaac cccattctat ggttttgaag aagatgctat tcactggcat 540

cgcaccgccc gtgacctgtg cctgccattt ggcgaagacg tttatccccg ttacaaaaag 600

tggtgcgacg aatacttcta cctcaaacat cgcaacgaac agcgcggtat tggcgggctg 660

ttctttgatg acctgaacac gccagatttc gaccgctgtt ttgcctttat gcaggcggta 720

ggcaaaggct acaccgacgc ttatttacca attgtcgagc gacggaaagc gatggcctac 780

ggcgagcgcg agcgcaattt cc 802

<210> 16

<211> 137

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagtggcaa gttccgggcg atgaggtttt 60

agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac 120

cgagtcggtg ctttttt 137

<210> 17

<211> 8629

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atatgagtaa gtctgaaaat ctttacagcg 5100

cagcgcgcga gctgatccct ggcggtgtga actcccctgt tcgcgccttt actggcgtgg 5160

gcggcactcc actgtttatc gaaaaagcgg acggcgctta tctgtacgat gttgatggca 5220

aagcctatat cgattatgtc ggttcctggg ggccgatggt gctgggccat aaccatccgg 5280

caatccgcaa tgccgtgatt gaagccgccg agcgtggttt aagctttggt gcaccaaccg 5340

aaatggaagt gaaaatggcg caactggtga ctgaactggt cccgaccatg gatatggtgc 5400

gcatggtgaa ctccggcacc gaggcgacga tgagcgccat ccgcctggcc cgtggtttta 5460

ccggtcgcga caaaattatt aaatttgaag gttgttacca cggtcacgct gactgcctgc 5520

tggtgaaagc cggttctggc gcactcacgt taggccagcc aaactcgccg ggcgttccgg 5580

cagatttcgc caaacatacc ttaacctgta cttataacga tctggcttct gtacgcgccg 5640

cgtttgagca atacccgcaa gagattgcct gtattatcgt cgagccggtg gcaggcaata 5700

tgaactgcgt tccaccgctg ccagagttcc tgccaggtct gcgtgcgctg tgcgacgaat 5760

ttggcgcatt gctgatcatc gatgaagtaa tgaccggctt ccgcgtggca ctggctggcg 5820

cacaggatta ttacggtgtg gaaccggatc tcacctgcct gggcaaaatc atcggcggtg 5880

gaatgccggt aggcgcattc ggtggtcgtc gtgatgtaat ggatgcgctg gccccgacgg 5940

gtccggtcta tcaggcgggt acgctttccg gtaacccaat tgcgatggca gcgggtttcg 6000

cctgtctgaa tgaagtcgcg cagccgggcg ttcacgaaac gttggatgag ctgacatcac 6060

gtctggcaga aggtctgctg gaagcggcag aagaagccgg aattccgctg gtcgttaacc 6120

acgttggcgg catgttcggt attttcttta ccgacgccga gtccgtgacg tgctatcagg 6180

atgtgatggc ctgtgacgtg gaacgcttta agcgtttctt ccatatgatg ctggacgaag 6240

gtgtttacct ggcaccgtca gcgtttgaag cgggctttat gtccgtggcg cacagcatgg 6300

aagatatcaa taacaccatc gatgctgcac gtcgggtgtt tgcgaagttg tgacaggagg 6360

aattaacatg acccttttag cactcggtat caaccataaa acggcacctg tatcgctgcg 6420

agaacgtgta tcgttttcgc cggataagct cgatcaggcg cttgacagcc tgcttgcgca 6480

gccgatggtg cagggcggcg tggtgctgtc gacgtgcaac cgcacggaac tttatcttag 6540

cgttgaagag caggataacc tgcaagaggc gttaatccgc tggctttgcg attatcacaa 6600

tcttaatgaa gaagatctgc gtaaaagcct ctactggcat caggataacg acgcggttag 6660

ccatttaatg cgtgttgcca gcggcctgga ttcattggtt cttggggagc cgcagatcct 6720

cggtcaggtt aaaaaagcgt ttgccgattc gcaaaaaggc catatgaagg ccagcgaact 6780

ggaacgcatg ttccagaaat ctttctctgt agcgaaacgc gttcgcactg aaacagatat 6840

cggtgccagc gctgtgtctg tcgcttttgc ggcttgtacg ctggcgcggc agatctttga 6900

atcgctctct acggtcacag tgttgctggt aggcgcgggc gaaaccatcg agctggtagc 6960

gcgtcatctg cgcgaacata aagtacagaa gatgattatc gccaaccgca ctcgcgaacg 7020

tgcccaaata ctggcagatg aagttggcgc ggaagtgatt gccctgagtg agatcgacga 7080

acgtctgcgc gaagccgata tcatcatcag ttccaccgcc agcccgttac cgattatcgg 7140

gaaaggcatg gtggagcgcg cattaaaaag ccgtcgcaac caaccaatgc tgttggtgga 7200

tattgccgtt ccgcgcgatg ttgagccgga agttggcaaa ctggcgaatg cttatcttta 7260

tagcgtggac gatctgcaaa gcatcatttc gcacaacctg gcgcagcgta aagccgcagc 7320

ggttgaggcg gaaactattg tcgctcagga aaccagcgaa tttatggcgt ggctgcgagc 7380

acaaagcgcc agcgaaacca ttcgcgagta tcgcagccag gcagagcaag ttcgcgatga 7440

gttaaccgcc aaagcgttag cggcccttga gcagggcggc gacgcgcaag ccattatgca 7500

ggatctggca tggaaactga ctaaccgctt gatccatgcg ccaacgaaat cacttcaaca 7560

ggccgcccgt gacggggata acgaacgcct gaatattctg cgcgacagcc tcgggctgga 7620

gtaggtcgac tgcagaggcc tgcatgcatg tcgcgaaaag atggggtgtt ggcgctactg 7680

gtagtggtcg tatgggggct aaattttgtg gtcatcaaag tggggcttca taacatgcca 7740

ccgctaatgc tggccggttt gcgctttatg ttggtcgctt ttccggctat cttttttgtc 7800

gcacgaccga aagtaccact gaatttgctg ctggggtatg gattaaccat cagttttgcg 7860

cagtttgctt ttcttttttg tgccattaac ttcggtatgc ctgctggact ggcttcgctg 7920

gtgttacagg cacaggcgtt ttttactatc gtgcttggcg cgtttacttt cggtgagcga 7980

ctgcatggca aacaattggc ggggatcgcc ttagcgattt ttggcgtact ggtgttaatc 8040

gaagatagtc tgaacggtca gcatgtggcg atgctcggct ttatgttgac cctggcggca 8100

gcatttagtt gggcgtgtgg caacatcttc aataaaaaga tcatgtcgca ctcaacgcgt 8160

ccggcggtga tatcgctggt aatctggagc gctttaatcc caatcattcc cttctttgtt 8220

gcctcgctga ttctcgatgg ttccgcatcc atgattcaca gtctggttac tattgatatg 8280

accaccatct tgtcgctgat gtatctggcg tttgtggcga caattgttgg ttatgggatc 8340

tgggggacgt tactgggacg ctatgaaacc tggcgggttg caccgttatc gttactggtg 8400

cccgtagtcg gactggcaag tgcggcacta ttgttggatg aacgcttaac gggtctgcaa 8460

tttttaggtg cggtgctcat tatgaccggg ctgtatatca atgtatttgg cttgcggtgg 8520

cgtaaagcgg taaaggtggg aagttaagag caataactag cataacccct tggggcctct 8580

aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 8629

Claims (9)

1.一种菌株用于生产5-氨基乙酰丙酸的用途，其特征在于，所述菌株进行基因表达抑制；所述菌株为大肠杆菌；所述抑制的基因包括hemF；

所述菌株进行基因表达抑制前，在大肠杆菌基因组中插入T7 RNAP基因，获得含T7表达系统的菌株；所述T7 RNAP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述大肠杆菌为BW25113菌株或MG1655菌株。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述菌株抑制目标基因为hemF与ybdK基因组合抑制，或hemF与gadB基因组合抑制，或hemF与gadA基因组合抑制。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述菌株抑制目标基因为hemF、ybdK与gadA基因组合抑制，或hemF、ybdK与gadB基因组合抑制，或hemF、gadA与gadB基因组合抑制。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述菌株抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA与gadB基因组合抑制。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述菌株抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA、gadB与mppA基因组合抑制，或hemF、ybdK、gadA、gadB与dppA基因组合抑制。

7.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述菌株抑制目标基因为hemF、ybdK、gadA、gadB、mppA与dppA基因组合抑制。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述基因hemF的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；所述ybdK的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述gadB的核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；所述gadA的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述mppA的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；所述dppA的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

9.一种生产5-氨基乙酰丙酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

将过表达hemA、hemL、eamA的质粒pET28b-ALA-LAA分别转入权利要求1-8任一项所述用途的菌株，培养所述菌株，从该发酵培养体系中收获5-氨基乙酰丙酸，得到5-氨基乙酰丙酸；所述质粒pET28b-ALA-LAA的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。

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