CN113583928A - 一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株及构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种稳定表达增强型绿色荧光蛋白的鼠伤寒沙门氏菌菌株及其构建方法，属于基因工程技术领域。该鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株分类命名为Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏号为CGMCC No.22723；保藏时间为2021年6月16日。该菌株以ATCC 14028沙门氏菌菌株为基础，通过导入PagC‑EGFP质粒以实现胞内沙门氏菌的荧光观察，解决了现有荧光沙门氏菌菌株难获得、荧光信号不强、感染能力弱、适应性不广的缺点，是研究沙门氏菌与细胞的互作机理研究的理想的生物材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种稳定表达增强型绿色荧光蛋白的鼠伤寒沙门氏菌菌株及其构建方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhinuurim）是导致肠道感染的重要人畜共患病原菌，是一种革兰氏阴性杆菌。鼠伤寒沙门氏菌主要通过污染的食物或水经粪口传播，经胃入肠后，在肠道内增殖，粘附于肠黏膜上皮细胞，侵入固有层，引起的症状轻至肠炎重至败血症。鼠伤寒沙门氏菌在宿主体内散播的分子机制尚待进一步确定。目前对鼠伤寒沙门氏菌的研究主要集中在对其致病因子表达调控网络，毒力因子特异抗体的制备，新型药物靶点的寻找等。这些研究需明确鼠伤寒沙门氏菌的生理、病理特点，以及其与宿主之间的互作。因此需要有效的途径实时观测细菌在宿主细胞内的行为状态。荧光蛋白标记系统作为一种分子标记技术可直观地观测到病原菌与宿主相互作用的过程，因而被广泛应用于细胞生物学。
目前荧光沙门氏菌菌株多基于pUCP18、pKK223系列质粒构建，如ATCC公司的Salmonella 14028 GFP菌株采用的是pUCP18MCSgfpmut3质粒转化沙门氏菌所得，优点是荧光信号较强，缺点是该菌株所含荧光质粒的结构尚未见报道，且国内难以获得。pPpagCGFP_OVA和pPtacCGFP_OVA 质粒是疫苗研发应用较为成功的沙门氏菌荧光质粒，主要针对SL3261减毒型沙门氏菌菌株设计(Dirk Bumann 2001; Meike Wendland, Dirk Bumann2002)，含上述两种质粒的SL3261等减毒型沙门氏菌菌株缺乏aroA、pAB、DHB等关键致病基因，感染细胞的能力比14028标准沙门氏菌菌株略弱，在沙门氏菌与细胞的互作机理研究方面没有明显优势。此外，用pPpagCGFP_OVA、pACYC和pSIF等质粒构建的荧光沙门氏菌因载体中的四环素抗性基因可影响吞噬胞内的沙门氏菌的存活和生长，也不能作为沙门氏菌与细胞的互作机理研究的理想的生物材料(Stephanie Abromaitis, et al. 2005)。针对以上各种质粒的结构和优缺点，有必要研发一种1）具有自主知识产权；2）荧光信号较强，适合胞内细胞生物学实验观察；3）感染细胞能力较强的荧光质粒，以满足人们研究使用的需要。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，以解决现有荧光沙门氏菌菌株难获得、感染能力弱、荧光信号不强、适应性不广的缺点。
本发明的技术方案是：
一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，其特征在于：所述的该鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株分类命名为Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏号为CGMCC No. 22723；保藏时间为2021年6月16日。
所述的鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，采用基因工程法构建其具体构建步骤如下：
1、目的基因PagC启动子的扩增和纯化
以长江大学动物科学实验室保存的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028为模板，用上海生物工程有限公司合成的引物PagC-F1、PagC-R2扩增PagC基因启动子，引物序列分别为：CGTGCG CAG TTA ACC ACT CTT AAT AAT AAT G，GCT CTA GAT ACT ACT TAT TAT TTA CGGTGT，该引物由长江大学动物科学实验室提供；PCR扩增反应体系50μL，反应组分为10×buffer 5μL，dNTP 5μL， PagC-F1 1.25μL， PagC-R2 1.25μL，鼠伤寒沙门氏菌菌液0.25μL，rTaq酶0.5μL，ddH2O 35.75μL，其中Taq酶和dNTP购自上海宝生物有限公司；扩增程序为95℃ 4min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃30s，39循环；72℃ 4min；
PCR结束后取50μL PCR产物，配置1.5％琼脂糖凝胶，6×Loading Buffer与PCR反应液充分混匀上样，凝胶成像仪确认条带位置，紫外仪上切取716bp的目的基因片段；凝胶回收试剂盒回收PagC启动子目的片段；最终得到纯化后的PagC基因启动子片段。
2、 pMD18T-PagC质粒的构建
（1）将纯化后的PagC基因启动子片段连接到pMD18-T载体上，连接体系为pMD18-T1μL，PagCDNA 1μL，ddH2O 2μL，SolutionⅠ5μL，其中pMD18-T载体和SolutionⅠ购自上海宝生物有限公司；连接体系置恒温金属浴上16℃反应30min，得到pMD18T-PagC连接产物；
（2）制备E. coliDH5α大肠杆菌感受态；
无菌接种环取长江大学动物科学实验室冻存的E. coliDH5α大肠杆菌于LB琼脂平板划线，37℃培养箱培养，第二天挑取单菌落于3mL LB液体培养基37℃，200 r/min摇床过夜培养；将过夜培养液按1:100接种50 mL LB液体培养基，37℃ 200 r/min培养使细菌分光光度值OD600达0.6，培养3h得到菌液；菌液冰上预冷30min，分装到预冷的1.5mL离心管中，使培养物冷却至0℃；4℃ 3500r/min离心10min，弃上清；用预冷的0.1mol/LCaCl2重悬菌体，冰上放置30min，4℃ 3500r/min离心10min，弃上清；加入50μL预冷含15％甘油的0.1mol/LCaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，即成感受态细胞悬液；
（3）将pMD18T-PagC连接产物用CaCl2转化法转入E. coliDH5α感受态细胞中，构建pMD18T-PagC大肠杆菌菌株，提取阳性克隆子质粒，具体步骤如下：
pMD18T-PagC连接产物10μL加入50μLE. coliDH5α大肠杆菌感受态感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置2～3min；加入100μL LB液体培养基，37℃，180rpm/min复苏1h；将160μL转化菌液涂至含50µg/mL氨苄的LB平板，37℃过夜培养；挑取单菌落进行PCR鉴定；PCR反应体系为10×buffer 2μL，dNTP 2μL，PagC-F1 0.5μL，PagC-R2 0.5μL，疑似含pMD18T-PagC的E. coli DH5α菌液0.1μL，rTaq酶0.2μL，ddH2O 14.7μL；PCR程序为95℃4min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃30s，39循环；72℃ 4min；最终鉴定出4个阳性克隆菌株；阳性菌落扩大培养后使用小量提取试剂盒提取质粒，命名为pMD8T-PagC重组质粒；
3、PagC-EGFP质粒的构建
（1）接种环取购自丰晖生物有限公司的pET28a-EGFP菌株接种于含30µg/mL卡那霉素的平板，37℃恒温培养箱过夜培养。第二天挑取单菌落于3mL含30µg/mL卡那霉素的LB培养液37℃、200 r/min摇床过夜培养；将过夜培养液按1:100接种50 mL含30µg/mL卡那霉素的LB培养液，37℃ 200 r/min过夜培养，使用小量质粒提取试剂盒提取pET28a-EGFP质粒；
（2）分别用XbaⅠ、FspⅠ限制性内切酶对pET28a-EGFP质粒和pMD18T-PagC重组质粒进行酶切；酶切体系为质粒DNA 2μg，FspⅠ0.4μL，XbaⅠ0.2μL，10× Buffer 0.6μL，ddH2O0.8μL，37℃孵育2h；将pET28a-EGFP质粒和pMD18T-PagC重组质粒经XbaⅠ、FspⅠ酶切的产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离；凝胶回收试剂盒分别回收约716bp的PagC片段和4184bp的pET28a-EGFP片段；最终得到了纯化的PagC片段和pET28a-EGFP片段；
（3）将PagC片段与pET28a-EGFP片段以3:1摩尔比混合，加入T4DNA连接酶，16℃连接12h；连接体系为pET28a-EGFP片段0.5μg，PagC片段0.5μg，10×Buffer 1μL，T4连接酶1μL，ddH2O 2μL，其中T4连接酶购自NEB公司；连接产物用CaCl2转化法转化大肠杆菌，冰浴30min，42℃热激90s，冰上急冷2～3min；加入100μL LB液体培养基中，37℃，180rpm/min 培养2h。将160μL转化菌液涂至含30µg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养16小时；
（4）挑取卡那霉素平板上的单菌落进行菌液PCR鉴定；
将疑似阳性的单菌落进一步扩大培养提取质粒进行质粒PCR鉴定，PCR体系为10×buffer 2μL，DNTP 2μL， PagC-F1 0.5μL， PagC-R2 0.5μL，疑似含PagC-EGFP的阳性克隆菌液0.1μL，rTaq酶0.2μL，ddH2O 14.7μL。PCR程序为95℃ 4min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃30s，39循环；72℃ 4min；PCR反应阳性菌液抽提质粒后，采用FspⅠ和XbaⅠ酶切再次鉴定，酶切体系为质粒DNA 1μg，FspⅠ0.4μL，XbaⅠ0.2μL，10× Buffer 0.6μL，ddH2O 0.1μL，37℃孵育3h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。将阳性菌株进行测序，测序引物为5'-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3'，序列见序列表；将鉴定的重组质粒命名为PagC-EGFP。
4、Sal14028-EGFP菌株的构建
（1）鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028感受态细胞的制备；
以无菌接种环取长江大学动物科学实验室冻存的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028于LB琼脂平板划线，37℃培养箱培养，第2天挑取单菌落于3mL LB液体培养基；37℃，200 r/min摇床过夜培养；将过夜培养液按1:100接种50 mL LB液体培养基，37℃ 200 r/min培养使细菌分光光度值OD600达0.3～0.4，一般需2.5-3h；4℃条件下4000 r/min离心15 min，弃上清，用预冷的50mL去离子水重悬菌体；去离子水重悬并离心2次，去离子水体积分别为25、12.5mL；用预冷的50mL 10%甘油重悬菌体后4000 r/min离心15 min。10%甘油重悬并离心4次，10%甘油体积分别为50、25、12.5、0.25mL；悬浮的感受态细胞按40 µL/管分装，制得鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028感受态细胞；
（2）鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028感受态细胞的转化与鉴定；
加0.5μg PagC-EGFP质粒于40μL鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028感受态细胞中，混合后放冰上预冷30min；设置一个不含DNA样品的阴性对照；设置电转仪参数：电压2.0KV，时间4ms，电容25μF和脉冲电阻200Ω；将冷却的混合物加入预冷的电转杯中，擦净杯外的水份并进行电转；取出电转产物到1.5mL EP管，立刻加入200μL LB液体培养基于37℃摇床复苏1h；复苏产物全部涂布于含30μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃培养16h；挑取单个菌落于30μg/mL卡那霉素抗性LB液体培养基扩增培养，荧光显微镜观察；荧光阳性菌株标记为Sal14028-EGFP。
本发明的优点在于：
该菌株以ATCC 14028沙门氏菌菌株为基础，通过导入PagC-EGFP质粒以实现胞内沙门氏菌的荧光观察，解决了现有荧光沙门氏菌菌株难获得、荧光信号不强、感染能力弱、适应性不广的缺点，是研究沙门氏菌与细胞的互作机理研究的理想的生物材料。
附图说明
图1为PCR扩增PagC启动子片段1.5%琼脂糖凝胶电泳图；
图2为pMD18T-PagC质粒阳性的DH5α转化子PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳图；
图3为pMD18T-PagC、pET28a-EGFP经XbaⅠ、FspⅠ双酶切产物1.5%琼脂糖凝胶电泳图；
图4为重组质粒PagC-EGFP经Fsp I和Xba I双酶切产物1.5%琼脂糖凝胶电泳图；
图5为Sal14028-EGFP鼠伤寒沙门氏菌在荧光显微镜下的图片；
图6为PagC-EGFP重组质粒结构图谱。
本发明的具体实施例：
实施例Sal14028-EGFP菌株构建
1. 实验材料
本发明所述的菌株、质粒及引物见表1。
表1. 菌株、质粒及引物
2. 实验方法
2.1目的基因PagC启动子扩增和纯化
以鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028为模板，用引物PagC-F1、PagC-R2扩增PagC基因启动子；PCR扩增反应体系50μL，反应体系见表2，扩增程序见表3。
表2. 目的基因PagC启动子PCR扩增体系（50μL）
表3. 目的基因PagC启动子PCR扩增程序
按表2所列各种成分加样，置PCR仪上，按表3所示程序运行，程序运行结束后取50μL PCR产物，配置1.5％琼脂糖凝胶，6×Loading Buffer与PCR反应液充分混匀上样，凝胶成像仪确认条带位置，紫外仪上切取716bp的目的基因片段；电泳结果参见说明书附图1；电泳结果中泳道M为DNA分子Marker DL2000，泳道PagC为以鼠伤寒沙门氏菌14028为模板扩增得到的PagC基因启动子片段；凝胶回收试剂盒回收PagC启动子目的片段。
2.2、pMD18T-PagC质粒的构建
（1）将纯化后的PagC基因启动子片段连接到pMD18-T载体上，连接体系如表4；按表4各种成分加样，置恒温金属浴上16℃反应30min，连接产物备用。
表4. pMD18T-PagC连接体系
（2）制备E. coliDH5α大肠杆菌感受态。
无菌接种环取冻存E. coliDH5α大肠杆菌于LB琼脂平板划线，37℃培养箱培养，第二天挑取单菌落于3mL LB液体培养基37℃，200 r/min摇床过夜培养。将过夜培养液按1:100接种50 mL LB液体培养基，37℃ 200 r/min培养使细菌分光光度值OD600达0.6，一般需3h。菌液冰上预冷30min，分装到预冷的1.5mL离心管中，使培养物冷却至0℃。4℃ 3500r/min离心10min，弃上清。用预冷的0.1mol/LCaCl2重悬菌体，冰上放置30min，4℃ 3500r/min离心10min，弃上清。加入50μL预冷含15％甘油的0.1mol/LCaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，即成感受态细胞悬液。
（3）将pMD18T-PagC用CaCl2转化法转入E. coliDH5α感受态细胞中，构建pMD18T-PagC大肠杆菌菌株，提取阳性克隆子质粒，具体步骤如下：
将pMD18T-PagC连接产物10μL加入50μLE. coliDH5α大肠杆菌感受态感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置2～3min；加入100μL LB液体培养基，37℃，180rpm/min 1h。将160μL转化菌液涂至含50µg/mL氨苄的LB平板，37℃过夜培养。挑取单菌落进行PCR鉴定。PCR反应体系见表5，PCR程序见表3，PCR产物电泳结果参见说明书附图2。PCR产物电泳结果中泳道M为DNA分子Marker DL2000，泳道1、2、3、4分别为4个DH5α转化子为模板扩增得到的PagC基因启动子片段。
表5. 含pMD18T-PagC的E. coliDH5α阳性克隆PCR筛选体系（20μL）
阳性菌落扩大培养后使用小量提取试剂盒提取质粒，命名为pMD18T-PagC。
2.3PagC-EGFP质粒的构建
（1）接种环取pET28a-EGFP菌株接种于含30µg/mL卡那霉素抗性平板，37℃恒温培养箱过夜培养。第2天挑取单菌落于3mL含30µg/mL卡那霉素的LB培养液37℃、200 r/min摇床过夜培养。将过夜培养液按1:100接种50 mL含30µg/mL卡那霉素的 LB培养液，37℃ 200r/min，过夜培养，使用小量质粒提取试剂盒提取pET28a-EGFP质粒。
（2）分别用XbaⅠ、FspⅠ限制性内切酶对pET28a-EGFP质粒和pMD18T-PagC重组质粒进行酶切，酶切反应温度为37℃、时间为2h。酶切体系如表6。将pET28a-EGFP质粒和pMD18T-PagC重组质粒经XbaⅠ、FspⅠ酶切的产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，琼脂糖凝胶电泳结果参见说明书附图3。电泳图泳道M为DNA分子Marker DL2000，泳道1为pET28a-EGFP双酶切产物，泳道2为pMD18T-PagC双酶切产物。凝胶回收试剂盒分别回收约716bp的PagC片段和4184bp的pET28a-EGFP片段。
利用pET28a-EGFP的XbaⅠ、FspⅠ酶切位点构建荧光质粒属首例。
表6. pET28a-EGFP和重组质粒pMD18T-PagC双酶切体系（6μL）
（3）将PagC片段与pET28a-EGFP片段以3:1摩尔比混合，加入T4DNA连接酶，16℃连接12h。连接体系如表7所示。连接产物用CaCl2转化法按以下步骤转化大肠杆菌，冰浴30min，42℃热激90s，冰上急冷2～3min；加入100μL LB液体培养基中，37℃，180rpm/min 培养2h。将160μL转化菌液涂至含30µg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养16小时。
表7. PagC-EGFP连接体系（10μL）
（4）挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，PCR体系如表8、程序同表3。含PagC目的片段的单菌落进一步扩大培养提取质粒进行质粒PCR鉴定。阳性质粒采用FspⅠ和XbaⅠ酶切再次鉴定，酶切体系如表9。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果参见说明书附图4。电泳泳道M为DNA分子Marker DL2000，泳道1为未经Fsp I和Xba I双酶切重组质粒PagC-EGFP，泳道2-3为重组质粒PagC-EGFP经Fsp I和Xba I双酶切产物。将阳性菌株进行测序，测序引物为5'-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3'，序列见序列表。将其重组质粒命名为PagC-EGFP。
表8. 含PagC-EGFP质粒的E. coliDH5α阳性克隆的PCR筛选体系（20μL）
表9.重组质粒PagC-EGFP双酶切体系（6μL）
2.4 Sal14028-EGFP菌株的构建
（1）鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028感受态细胞的制备。以无菌接种环取冻存的鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028于LB琼脂平板划线，37℃培养箱培养，第二天挑取单菌落于3mL LB液体培养基。37℃，200 r/min摇床过夜培养。将过夜培养液按1:100接种50 mL LB液体培养基，37℃ 200 r/min培养使细菌分光光度值OD600达0.3～0.4，一般需2.5-3h。4℃条件下4000r/min离心15 min，弃上清，用预冷的50mL去离子水重悬菌体。去离子水重悬并离心2次，去离子水体积分别为25、12.5mL。用预冷的50mL 10%甘油重悬菌体后4000 r/min离心15 min。10%甘油重悬并离心4次，10%甘油体积分别为50、25、12.5、0.25mL。悬浮的感受态细胞40 µL/管分装。
（2）鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028感受态细胞的转化与鉴定。加入0.5μg PagC-EGFP质粒于40μL鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028感受态细胞中，混合后放冰上预冷30min。设置一个不含DNA样品的阴性对照。设置电转仪参数：电压2.0KV，时间4ms，电容25μF和脉冲电阻200Ω。将冷却的混合物加入预冷的电转杯中，擦净杯外的水并进行电转。取出电转产物到1.5mL EP管，立刻加入200μL LB液体培养基于37℃摇床复苏1h。复苏产物全部涂布于含30μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃培养16h。挑取单个菌落于30μg/mL卡那霉素抗性LB液体培养基扩增培养，荧光显微镜观察，观察结果参见说明书附图5，显微镜激发波长：488nm；发射波长：507nm。荧光阳性菌株标记为Sal14028-EGFP。
2.5 本例构建的PagC-EGFP质粒的结构
本例构建的PagC-EGFP质粒的结构参见说明书附图6。其中启动子序列、EGFP序列、卡那霉素抗性编码基因序列、鼠伤寒沙门氏菌基因复制起始点序列位置见表10。
表10. PagC-EGFP质粒序列特征
为了验证本申请的先进性，本申请对PagC-EGFP的整体骨架、Origin位点、抗性筛选标记、荧光基因及启动子和现有质粒进行了对比，对比结果见表11。
表11.不同荧光沙门氏菌菌株构建方案所用质粒的比较
上述PagC-EGFP质粒和现有质粒的整体骨架、Origin位点、抗性筛选标记、荧光基因及启动子的组合的比较可以明确得出，PagC-EGFP质粒不同于现有质粒，且综合了现有质粒的优点。PagC-EGFP质粒的Origin位点整合了现有沙门氏菌荧光质粒的结构，基于PET28a-eGFP构建的PagC-EGFP质粒能在沙门氏菌中稳定传代。PagC-EGFP质粒相比于ATCC公司的pUCP18MCSgfpmut3质粒结构清楚透明，基于PagC-EGFP质粒构建的Sal4028-EGFP荧光菌株能达到ATCC 14028 GFP荧光效果。PagC-EGFP质粒和pPpagCGFP_OVA质粒使用了相同的启动子序列，但质粒的骨架、原点、抗性筛选标记均不相同，pPpagCGFP_OVA含OVA序列用于SL3261减毒型菌株的疫苗研发，而PagC-EGFP用于沙门氏菌14028标准菌株的致病机理研究。PagC-EGFP因采用了卡那抗性筛选标记，避免了pPpagCGFP_OVA、pACYC和pSIF等含四环素抗性筛选标记的菌株感染细胞能力弱的缺点。
序列表
<110> 长江大学
<120> 一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株及构建方法
<141> 2021-07-09
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 4184
<212> DNA
<213> 一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株(Salmonella enterica)
<400> 2
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcctagaa ataattttgt 3180
ttaactttaa gaaggagata taccatgggc agcagccatc atcatcatca tcacagcagc 3240
ggcctggtgc cgcgcggcag ccatatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 3300
gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 3360
gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 3420
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 3480
agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 3540
tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 3600
gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 3660
gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 3720
atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 3780
gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 3840
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 3900
aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 3960
ggcatggacg agctgtacaa gggatccgaa ttcgagctcc gtcgacaagc ttgcggccgc 4020
actcgagcac caccaccacc accactgaga tccggctgct aacaaagccc gaaaggaagc 4080
tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg 4140
ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggat 4184
Claims (2)
1.一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，其特征在于：所述的该鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株分类命名为Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏号为CGMCC No. 22723；保藏时间为2021年6月16日。
2.根据权利要求1所述的一种鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，其特征在于：所述的鼠伤寒沙门氏菌绿色荧光菌株，采用基因工程法构建，其具体构建步骤如下：
1、目的基因PagC启动子的扩增和纯化；
以长江大学动物科学实验室保存的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028为模板，用上海生物工程有限公司合成的引物PagC-F1、PagC-R2扩增PagC基因启动子，引物序列分别为：CGT GCGCAG TTA ACC ACT CTT AAT AAT AAT G，GCT CTA GAT ACT ACT TAT TAT TTA CGG TGT，该引物由长江大学动物科学实验室提供；PCR扩增反应体系50μL，反应组分为10×buffer 5μL，dNTP 5μL， PagC-F1 1.25μL， PagC-R2 1.25μL，鼠伤寒沙门氏菌菌液0.25μL，rTaq酶0.5μL，ddH2O 35.75μL，其中Taq酶和dNTP购自上海宝生物有限公司；扩增程序为95℃ 4min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃30s，39循环；72℃ 4min；
PCR结束后取50μL PCR产物，配置1.5％琼脂糖凝胶，6×Loading Buffer与PCR反应液充分混匀上样，凝胶成像仪确认条带位置，紫外仪上切取716bp的目的基因片段；凝胶回收试剂盒回收PagC启动子目的片段；最终得到纯化后的PagC基因启动子片段；
2、 pMD18T-PagC质粒的构建
（1）将纯化后的PagC基因启动子片段连接到pMD18-T载体上，连接体系为pMD18-T 1μL，PagCDNA 1μL，ddH2O 2μL，SolutionⅠ5μL，其中pMD18-T载体和SolutionⅠ购自上海宝生物有限公司；连接体系置恒温金属浴上16℃反应30min，得到pMD18T-PagC连接产物；
（2）制备E. coliDH5α大肠杆菌感受态；
无菌接种环取长江大学动物科学实验室冻存的E. coliDH5α大肠杆菌于LB琼脂平板划线，37℃培养箱培养，第二天挑取单菌落于3mL LB液体培养基37℃，200 r/min摇床过夜培养；将过夜培养液按1:100接种50 mL LB液体培养基，37℃ 200 r/min培养使细菌分光光度值OD600达0.6，培养3h得到菌液；菌液冰上预冷30min，分装到预冷的1.5mL离心管中，使培养物冷却至0℃；4℃ 3500r/min离心10min，弃上清；用预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，冰上放置30min，4℃ 3500r/min离心10min，弃上清；加入50μL预冷含15％甘油的0.1mol/LCaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，即成感受态细胞悬液；
（3）将pMD18T-PagC连接产物用CaCl2转化法转入E. coliDH5α感受态细胞中，构建pMD18T-PagC大肠杆菌菌株，提取阳性克隆子质粒，具体步骤如下：
pMD18T-PagC连接产物10μL加入50μLE. coliDH5α大肠杆菌感受态感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置2～3min；加入100μL LB液体培养基，37℃，180rpm/min 复苏1h；将160μL转化菌液涂至含50µg/mL氨苄的LB平板，37℃过夜培养；挑取单菌落进行PCR鉴定；PCR反应体系为10×buffer 2μL，dNTP 2μL，PagC-F1 0.5μL，PagC-R2 0.5μL，疑似含pMD18T-PagC的E. coli DH5α菌液0.1μL，rTaq酶0.2μL，ddH2O 14.7μL；PCR程序为95℃4min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃30s，39循环；72℃ 4min；最终鉴定出4个阳性克隆菌株；阳性菌落扩大培养后使用小量提取试剂盒提取质粒，命名为pMD8T-PagC重组质粒；
3、PagC-EGFP质粒的构建
（1）接种环取购自丰晖生物有限公司的pET28a-EGFP菌株接种于含30µg/mL卡那霉素的平板，37℃恒温培养箱过夜培养；
第二天挑取单菌落于3mL含30µg/mL卡那霉素的LB培养液37℃、200 r/min摇床过夜培养；将过夜培养液按1:100接种50 mL含30µg/mL卡那霉素的LB培养液，37℃ 200 r/min过夜培养，使用小量质粒提取试剂盒提取pET28a-EGFP质粒；
（2）分别用XbaⅠ、FspⅠ限制性内切酶对pET28a-EGFP质粒和pMD18T-PagC重组质粒进行酶切；酶切体系为质粒DNA 2μg，FspⅠ 0.4μL，XbaⅠ 0.2μL，10× Buffer 0.6μL，ddH2O 0.8μL，37℃孵育2h；将pET28a-EGFP质粒和pMD18T-PagC重组质粒经XbaⅠ、FspⅠ酶切的产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离；凝胶回收试剂盒分别回收约716bp的PagC片段和4184bp的pET28a-EGFP片段；最终得到了纯化的PagC片段和pET28a-EGFP片段；
（3）将PagC片段与pET28a-EGFP片段以3:1摩尔比混合，加入T4DNA连接酶，16℃连接12h；连接体系为pET28a-EGFP片段0.5μg，PagC片段0.5μg，10×Buffer 1μL，T4连接酶1μL，ddH2O 2μL，其中T4连接酶购自NEB公司；连接产物用CaCl2转化法转化大肠杆菌，冰浴30min，42℃热激90s，冰上急冷2～3min；加入100μL LB液体培养基中，37℃，180rpm/min 培养2h；
将160μL转化菌液涂至含30µg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养16小时；
（4）挑取卡那霉素平板上的单菌落进行菌液PCR鉴定；
将疑似阳性的单菌落进一步扩大培养提取质粒进行质粒PCR鉴定，PCR体系为10×buffer 2μL，DNTP 2μL， PagC-F1 0.5μL， PagC-R2 0.5μL，疑似含PagC-EGFP的阳性克隆菌液0.1μL，rTaq酶0.2μL，ddH2O 14.7μL；PCR程序为95℃ 4min；95℃ 30s，57℃ 30s，72℃30s，39循环；72℃ 4min；PCR反应阳性菌液抽提质粒后，采用FspⅠ和XbaⅠ酶切再次鉴定，酶切体系为质粒DNA 1μg，FspⅠ 0.4μL，XbaⅠ 0.2μL，10×Buffer 0.6μL，ddH2O 0.1μL，37℃孵育3h，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳；将阳性菌株进行测序，测序引物为5'-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3'；将鉴定的重组质粒命名为PagC-EGFP；
4、Sal14028-EGFP菌株的构建
（1）鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028感受态细胞的制备；
以无菌接种环取长江大学动物科学实验室冻存的鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028于LB琼脂平板划线，37℃培养箱培养，第2天挑取单菌落于3mL LB液体培养基；37℃，200 r/min摇床过夜培养；将过夜培养液按1:100接种50 mL LB液体培养基，37℃ 200 r/min培养使细菌分光光度值OD600达0.3～0.4，一般需2.5-3h；4℃条件下4000 r/min离心15 min，弃上清，用预冷的50mL去离子水重悬菌体；去离子水重悬并离心2次，去离子水体积分别为25、12.5mL；用预冷的50mL 10%甘油重悬菌体后4000 r/min离心15 min；10%甘油重悬并离心4次，10%甘油体积分别为50、25、12.5、0.25mL；悬浮的感受态细胞按40 µL/管分装，制得鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028感受态细胞；
（2）鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028感受态细胞的转化与鉴定；
加0.5μg PagC-EGFP质粒于40μL鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028感受态细胞中，混合后放冰上预冷30min；设置一个不含DNA样品的阴性对照；设置电转仪参数：电压2.0KV，时间4ms，电容25μF和脉冲电阻200Ω；将冷却的混合物加入预冷的电转杯中，擦净杯外的水份并进行电转；取出电转产物到1.5mL EP管，立刻加入200μL LB液体培养基于37℃摇床复苏1h；复苏产物全部涂布于含30μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃培养16h；挑取单个菌落于30μg/mL卡那霉素抗性LB液体培养基扩增培养，荧光显微镜观察；荧光阳性菌株标记为Sal14028-EGFP。
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