CN112501103B - 一株过表达lsrB基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株过表达lsrB基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用；所述的重组大肠杆菌过表达lsrB基因。本发明构建了一株过表达lsrB基因的重组大肠杆菌，对重组菌生物膜的形成有促进作用，对大肠杆菌发酵产L‑苏氨酸有促进作用，同时缩短了发酵周期、实现了细胞的可循环使用，节约了成本。

Description

一株过表达lsrB基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一株过表达lsrB基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

苏氨酸(L-threonine)是人体所必需的八种氨基酸中的之一。苏氨酸在人体内和动物体内不能合成，但是在生命过程中发挥重要的作用。现如今，L-苏氨酸已经成为了继甲硫氨酸、赖氨酸和色氨酸以外第四种重要的氨基酸。在食品产业、医疗制药行业和化妆品行业中L-苏氨酸已被广泛应用，需求量逐年增加。在食品行业中，L-苏氨酸作为一种食品添加剂，主要用作食品强化剂，提高食品中的营养成分，补充被破坏的营养元素，同时，L-苏氨酸用于人们常食用的糕点、乳化食品和牛奶之中，发挥抗氧化作用，并且 L-苏氨酸与葡萄糖可以发生反应产生巧克力香味和焦香味道，可以用作食品的增香剂。 L-苏氨酸在医疗行业领域中可以存进T淋巴细胞成熟发育，也可以提高人体免疫功能。 L-苏氨酸除了是重要的食品强化剂外，也是一种重要的饲料添加剂，主要添加到家禽和猪饲料之中。

在大肠杆菌，鼠伤寒沙门氏菌和哈维氏弧菌中发现了一种种间QS系统，这个系统中的信号分子是自诱导物2即AI-2。这一类分子可以作为媒介来传导不同种属的细菌之间的交流。细菌可以感知自身与环境中其他类型细菌的群落密度变化，为了保证自身功能不受影响，会自主的控制细菌在环境中的浓度。鉴于无论是内源产生的AI-2还是相邻环境中其他细菌产生的AI-2都能通过Ⅱ型群体感应系统来应答细菌，AI-2被视为一种细菌种间的通用语言。AI-2的受体lsrB，是一个可以与ABC转运系统的膜元件互相作用的具有高亲和力的底物结合膜间蛋白。lsrB可以通过和L-丝氨酸受体(Tsr)相互作用引起下游的趋化反应。AI-2作为K12株的趋化诱导物，必须依靠Tsr和lsrB才能发挥其应有的作用。

目前，微生物发酵已广泛用于工业以大肠杆菌为最佳候选菌株生产L-苏氨酸。然而， L-苏氨酸发酵已在单批次游离发酵中进行，发酵后不能重复使用的模式。批量发酵和一次性使用细胞会增加操作成本并降低生产率。同时，分散在发酵培养基中的游离细胞在有氧发酵过程中受到应力条件(例如剪切力)的挑战，导致在发酵过程中细胞活力降低。基于生物膜的固定发酵具有更高的代谢活性以及细胞重复利用以达到节约成本。本发明通过构建一株过表达lsrB基因的重组大肠杆菌，经过连续化发酵，具有发酵产量高，周期短的特点，在生产中有较好的应用价值。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株重组大肠杆菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的其构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株过表达lsrB基因的重组大肠杆菌。

其中，所述lsrB基因的基因序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，所述的大肠杆菌为E.coli CIBTS1688，赠自中国科学院上海生命科学研究院，所述大肠杆菌CIBTS1688已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2015233，菌株号为CIBTS1688，其具体信息已在申请号为2015101990361的发明专利中公开。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述重组大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以大肠杆菌为模板，PCR扩增lsrB片段，扩增后，其核苷酸序列如SEQ ID NO： 4所示；

(2)将步骤(1)得到的基因片段克隆到线性化质粒pET28a上，得到重组质粒pET28a-lsrB，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

(3)将步骤(2)所得质粒转入大大肠杆菌，即得。

步骤(1)中，所述的模板为E.coli CIBTS1688基因组，扩增引物lsrB-F和lsrB-R的基因序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

步骤(2)中，所述的线性化质粒pET28a为经NcoI酶与Xhol酶对质粒pET28a进行双酶切后的载体。

为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述重组大肠杆菌在发酵产L-苏氨酸中的应用。

其中，所述的发酵为将重组大肠杆菌的菌液接种于发酵培养基中进行发酵。

其中，将所述的菌液按照4％～8％的体积比接种于发酵培养基中进行发酵，优选为按照5％的体积比。

其中，发酵培养基中含有葡萄糖、酵母粉、KH₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄·7H₂0、 FeSO₄·7H₂O、MnSO₄·5H₂O和CaCO₃。

优选地，所述的发酵培养基中各组分的浓度为30g/L葡萄糖，2g/L酵母粉，1g/LKH₂PO₄，20g/L(NH₄)₂SO₄，0.8g/L MgSO₄·7H₂0，0.2g/L FeSO₄·7H₂O，0.2g/L MnSO₄·5H₂O，15g/L CaCO₃。

其中，所述发酵的温度为28～37℃。

其中，所述的发酵为游离发酵。

其中，所述的游离发酵包括如下步骤：

(i)将菌液接种于不含有固定化载体的发酵培养基中进行第一批发酵，待发酵液中葡萄糖含量为低于0.1g/L时，第一批发酵结束；

(ii)第一批发酵结束后，移出部分发酵液，并添加新的发酵培养基进行第二批发酵，待发酵液中葡萄糖含量为低于0.1g/L时，第二批发酵结束；

(iii)重复步骤(ii)直至L-苏氨酸产量稳定时停止。

步骤(ii)中，所述的部分发酵液为总发酵液体积的60％～90％，优选为80％。

其中，所述的发酵也可以是固定化连续发酵。

其中，所述固定化连续发酵中固定载体为聚合物多孔泡沫；优选地，所述的固定化载体为聚氨酯多孔泡沫；更进一步优选地，所述的固定化载体的密度为1.5g/cm³，孔径0.2-0.6mm。

其中，所述固定化连续发酵中固定化载体在发酵培养基中的用量为20～50g/L，优选为30g/L。

其中，所述固定化连续发酵包括如下步骤：

(1)将菌液接种于含有固定化载体的发酵培养基中进行第一批发酵，待发酵液中葡萄糖含量为低于0.1g/L时，第一批发酵结束；

(2)第一批发酵结束后，移出部分发酵液，并添加新的发酵培养基进行第二批发酵，待发酵液中葡萄糖含量为低于0.1g/L时，第二批发酵结束；

(3)重复步骤(2)直至L-苏氨酸产量稳定时停止。

步骤(2)中，所述的部分发酵液为总发酵液体积的60％～90％，优选为80％。

优选地，所述的发酵为固定化连续发酵。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

1、本发明构建了一株过表达lsrB基因的重组大肠杆菌，对重组菌生物膜的形成有促进作用，对大肠杆菌发酵产L-苏氨酸有促进作用，同时缩短了发酵周期、实现了细胞的可循环使用，节约了成本。

2、本发明是第一次将细菌群体感应基因利用到基于生物膜固定化发酵产氨基酸当中。

3、本发明所构建的重组大肠杆菌经过连续化发酵，具有发酵产量高，周期短的特点，在生产中有较好的应用价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/ 或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为构建重组的表达质粒示意图。

图2为lsrB扩增的电泳结果。

图3为载体线性化电泳结果。

图4为重组质粒构建的电泳结果。

图5为重组菌菌落PCR的验证。

图6为结晶紫染色图。

图7为结晶紫染色分析图。

图8为DAPI染色结果。

图9 SEM电镜观察结构。

图10 swarming平板泳动结果图。

图11为L-苏氨酸产量图。

图12为发酵周期图。

图13为固定化载体图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：目的菌株分子改造

1.扩增目的基因

以E.coli CIBTS1688基因组作为模板，对目的基因lsrB进行扩增。以NCBI基因序列为根据，设计扩增的引物如表1所示。其中，引物包含XhoI和NcoI限制性酶切位点，用于后续与质粒pET28a相连。

表1用于扩增的实验引物序列

PCR采用25μL反应体系，引物lsrB-F、lsrB-R各1.5μL；1.0μL的模板(基因组)； 1.0μL的KOD酶(DNA Polymerase 1.0unit/μL)；10μL的dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)(150mM)；10μL的无菌水，分别装成一管25μL，PCR后经胶回收纯化

2.重组质粒的构建

2.1提质粒

(1)将E.coli DH5α甘油菌(含质粒pET28a)接于液体LB(卡那抗性浓度：50 μg/mL)，37℃培养12小时。

(2)用1.5mL的离心管收集上一步骤所培养的细胞，以10000rpm，离心2min，去上清。

(3)依照Corning生命科学有限公司的AxyPrep质粒提取试剂盒，提取出质粒pET28a。

2.2载体的线性化

为了将目的基因lsrB连接到质粒pET28a上，需要将载体进行酶切，利用双酶切的反应体系为(20μL)0.1％BSA 2μL，1× M buffer 2μL，NcoI酶与Xhol酶各取0.5μL，质粒pET28a10μL，无菌水5μL。酶切反应与37℃条件下反应2h。酶切后进行胶回收，用于后续的实验。

其中，所述的buffer：10×Loading buffer：0.9％SDS，50％Glycerol，0.05％Bromophenol Blue；

所述的NcoI酶：限制性内切酶

所述的Xhol酶：限制性内切酶

酶活的定义：在50μL反应液中，37℃温度下反应1小时，将1μg的λDNA 完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

2.3构建质粒pET28a-lsrB

将上述lsrB片段与纯化后线性载体按照Vazyme公司

II一步克隆试剂盒的说明书的步骤相连接，得到重组质粒pET28a-lsrB。一步克隆反应体系如表2所示，37℃水浴30分钟后，立即冰浴5分钟，-20℃保存。构建重组的表达质粒示意图如图1所示。

表2一步克隆反应体系

3.重组质粒的转化与筛选

取出感受态细胞冰上解冻至液态，预冷离心管中加入比例为10:1v/v的感受态细胞和质粒。冰上放置30min，于42℃水浴锅进行热激，热激90秒。冰盒中冷却3分钟，加入1mLLB后于摇床37℃、200rpm培养1小时，离心去除大部分上清后重悬菌液并涂布于卡那霉素抗性平板。

挑取平板上的单点，接入摇管中(50μg/mL卡那霉素)，37℃培养箱过夜培养，然后提质粒pET28a-lsrB。设计测序引物如表3。

表3用于测序的实验引物序列

测序验证成功后，构建过表达菌株E.coli CIBTS1688-lsrB*。将构建的质粒以相同的转化方法转入到大肠杆菌CIBTS1688感受态中。挑取单菌落进行菌落PCR并提质粒测序验证，引物同上表。

结果：

(1)图2为lsrB扩增的电泳结果，第一泳道为2000bp DNA marker，基因lsrB长度为1023bp，对应marker的第二根1000bp的亮带，由此可见基因lsrB扩增成功，可以进行下一步实验。

(2)图3为载体线性化电泳结果，泳道一为5000bp marker，pET28a质粒5369bp，经NcoI酶与Xhol酶双酶切后为5231bp，由电泳结果为一条带且大于5000bp可知，经双酶切后pET28a质粒线性化成功。

(3)图4为重组质粒构建的电泳结果，第一泳道为5000bp DNAmarker，二、三、四为重组质粒电泳图，重组质粒大小6253bp，由图可知电泳结果为多条带且大于5000 bp，由此可知重组质粒构建成功。

(4)图5为重组菌菌落PCR的验证，泳道一为2000bp DNAmarker，二三四五为改造菌经lsrB-check引物菌落PCR电泳结果，若改造成功check引物PCR条带大小为 1163bp，由图可见改造菌菌落PCR条带大小正确，E.coli CIBTS1688-lsrB*菌株改造成功。

实施例2：生物膜的表征实验

1.结晶紫染色

本实施例采用结晶紫染色法对比2株目的菌(原始菌WT：E.coli CIBTS1688，和实施例1制备的重组大肠杆菌)的生物膜相对表达。因此，在96孔板中，对这2株菌株进行成膜验证。

(1)把2菌株在37℃、200rpm培养至对数期(OD600约为0.6)。

(2)将菌液稀释至OD600为0.1，96孔板中加入180μL的LB液体培养基，然后将20μL稀释后菌液接入到培养基中，37℃下分别静置培养6h、12h、18h、24h、30 h、36h、42h，使大肠杆菌在96孔板底部成膜。

(3)倒掉LB液体培养基，用PBS冲洗2-3遍后，用甲醇固定生物膜15分钟后，倒掉甲醇并用烘箱烘干，最后加入0.1％的结晶紫染色20分钟。

(4)倒掉结晶紫，用PBS冲洗，加入33％的冰醋酸并于振荡器轻微震荡30分钟，使结晶紫脱色溶解。

(5)利用酶标仪在OD570下进行读数。

(6)重复上述的实验过程，观察2种菌株在发酵培养基中的成膜差异。

2.DAPI染色

DAPI染料是一种能与细胞的DNA结合的蓝色荧光染料，它可以透过完整细胞膜，因此一般可以用于固定细胞和活细胞的染色。将2株菌株(原始菌WT：E.coli CIBTS1688，和实施例1制备的重组大肠杆菌)过夜生长后稀释到OD600约为0.5，在 12孔板中加入细胞爬片后加入1mL发酵液，然后加入200μL稀释好的菌液，37℃静止培养24h后取出，倒掉培养基，加入PBS洗去游离菌液，加入400μL多聚甲醛固定液4℃固定12h。固定后洗去固定液，加入400μL DAPI室温放置3-5分钟。吸除DAPI 染色液，用PBS洗涤2-3次，每次3-5分钟，取出细胞爬片直接在荧光显微镜下观察。

3.SEM电镜观察

将菌株培养12h后，将其OD600稀释到约为0.5，在12孔板中加入1mL发酵液，然后加入200μL稀释好的菌液，37℃静止培养24h后取出，倒去培养基，留下生物膜进行乙醇梯度脱水后-80℃冷冻过夜进行真空干燥，干燥好的样品直接用SEM电镜观察。

4.swarming平板泳动

将取2.5μL的菌株接种至含有5mL LB液体培养基的50mL离心管中，于200rmp， 37℃培养12h后，将菌液稀释到同一OD。取5μL菌液点swarming泳动平板，此平板包含20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、20g/L氯化钠，0.3％的琼脂粉，点好后的平板于37℃静置培养12h后取出观察。

本实施例利用原始菌和重组菌通过一系列表征实验，如图6和图7结晶紫染色结果表明重组菌生物膜量增加了80％，同时图8DAPI染色结果和图9SEM电镜观察也能明显的观察的重组菌生物膜量明显增多。图10可观察到重组菌浮游能力增加即运动能力增加，这都是重组菌较原始菌生物膜量增加的表现。

实施例3：目的菌株发酵产L-苏氨酸性能研究

1、游离发酵

(1)恢复菌株活力

分别取原始菌及重组菌的保菌管，置于冰盒中等待解冻，解冻后，取适量菌液接入LB摇管，37℃恒温培养。

(2)接发酵液

(i)在100mL摇瓶中加入已经恢复活力的菌液1mL，放入37℃培养箱恒温培养12h。

(ii)将100mL发酵培养基倒入500mL三角烧瓶中，取10mL步骤(1)中培养完成的菌液接入三角烧瓶中，于37℃的摇床中进行恒温发酵，每6小时检测发酵液中的残余葡萄糖量和L-苏氨酸产量，待葡萄糖含量为零，结束第一批发酵；

其中，发酵培养基中各组分的含量为：30g/L葡萄糖，2g/L酵母粉，1g/L KH₂PO₄，20g/L(NH₄)₂SO₄，0.8g/L MgSO₄·7H₂0，0.2g/L FeSO₄·7H₂O，0.2g/L MnSO₄·5H₂O，15 g/LCaCO₃。

(iii)将第一批发酵液中的80vt％的发酵液移出，剩余20vt％的发酵液留给第二批次，同时补增新鲜发酵培养基(最初发酵液的体积的80％)，以相同的条件进行第二批发酵，待葡萄糖含量为零，结束第二批发酵；

(iv)同步骤(iii)，以相同的方式，进行多批次发酵，直至苏氨酸产量达到稳定状态时停止。

2、固定化连续发酵

同游离发酵，仅在步骤(ii)更改为：将100mL发酵培养基倒入500mL三角烧瓶中，并将载体按照30g/L的用量加入发酵培养基中，再取10mL步骤(1)中培养完成的菌液接入三角烧瓶中，于37℃的摇床中进行恒温发酵，每6小时检测发酵液中的残余葡萄糖量和L-苏氨酸产量，待葡萄糖含量为零，结束第一批发酵；

步骤(iii)更改为：将第一批发酵液中的80vt％的发酵液移出，剩余20vt％的发酵液和固定化载体留给第二批次，同时补增新鲜发酵培养基(第一批最初发酵液的体积的80％)，以相同的条件进行第二批发酵，待葡萄糖含量为零，结束第二批发酵；

其中，所述的载体为聚氨酯多孔泡沫，密度为1.5g/cm³，孔径0.2-0.6mm，载体大小为10mm×10mm×10mm，详见图13。

3.测定葡萄糖含量

取不同时间段的发酵液各2mL，离心，取上清液，稀释相应倍数后用测糖仪进行葡萄糖含量测定

4.L-苏氨酸产量测定

HPLC法测L-苏氨酸产量，参数如下：

使用Agilent 1260仪器，色谱柱使用Sepax AAA(4.6× 250mm)；

液相色谱参数

表4固定化连续发酵数据

批数	一	二	三	四	五	六	七	八	九
										原始菌/g/L	10.51	10.78	10.97	11.32	11.42	11.63	11.72	11.87	12.1
重组菌/g/L	10.37	11.89	13.67	14.54	14.72	14.92	15.11	15.42	15.71

本实施例进行连续发酵实验，通过9批次发酵实验，发酵结果见表4。由表4中数据可以看出，在原始菌连续化发酵到第6批的时候发酵产量趋于稳定，改造菌连续化发酵到第9批时产量达到最高，出发菌和重组菌第9批次产量分别为12.1g/L和15.71g/L，均比出发菌的初始产量高。从图11可以看出，改造后的菌株固定化产量比原始菌高出49.5％。从图12可以看出，改造后的菌株固定化发酵周期比原始菌缩短22％。

本发明提供了一株过表达lsrB基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株过表达lsrB基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1023

<212> DNA

<213> lsrB

<400> 1

atgacacttc atcgctttaa gaaaatcgcc ttacttagcg ctcttggcat tgccgcaatc 60

tctatgaatg tgcaggccgc agagcgtatt gcatttattc ccaaactggt tggcgtggga 120

ttttttacca gcggtggcaa cggcgcacaa caagcgggta aagagctggg cgttgatgtg 180

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gatgccaacg ccctgcccgc tgccgcacaa gccgcagaaa acttgaaaaa tgacaaagta 720

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tga 1023

<210> 2

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<212> DNA

<213> lsrB-F

<400> 2

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<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> lsrB-R

<400> 3

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<210> 4

<211> 1020

<212> DNA

<213> IsrB

<400> 4

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tctatgaatg tgcaggccgc agagcgtatt gcatttattc ccaaactggt tggcgtggga 120

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 重组质粒(pET28a-lsrB)

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tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

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actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgacacttc atcgctttaa gaaaatcgcc 5100

ttacttagcg ctcttggcat tgccgcaatc tctatgaatg tgcaggccgc agagcgtatt 5160

gcatttattc ccaaactggt tggcgtggga ttttttacca gcggtggcaa cggcgcacaa 5220

caagcgggta aagagctggg cgttgatgtg acctacgacg ggccgacaga acccagtgtt 5280

tctggtcagg tacagttgat taataacttc gtcaatcaag gttataacgc cattatcgtt 5340

tctgcggttt cgcctgatgg cttgtgtccg gcactgaaac gcgccatgca acgtggtgtg 5400

agagtgctga cctgggactc tgatactaaa ccggagtgcc gctcttacta cattaatcag 5460

ggaacgcccg cccagttagg aggtatgttg gtggatatgg cggcgcgtca ggtgaataaa 5520

gacaaagcca aagtcgcgtt tttctactca agccccaccg ttacggacca aaaccagtgg 5580

gtgaaagaag cgaaagcgaa aatcgccaaa gagcatccag gctgggaaat tgtcactacg 5640

cagtttggct ataacgatgc cactaaatcg ttacaaaccg cagaaggaat attaaaagcg 5700

tatagcgatc tcgacgccat tatcgccccc gatgccaacg ccctgcccgc tgccgcacaa 5760

gccgcagaaa acttgaaaaa tgacaaagta gcgattgtcg gattcagtac gccaaatgtg 5820

atgcgcccgt atgtagagcg cggcacggtg aaagaatttg gcctgtggga tgtggttcag 5880

caaggcaaaa tttcagtgta tgtcgcggat gcattattga aaaaaggatc aatgaaaacg 5940

ggcgacaagc tggatatcaa gggcgtaggt caggttgaag tctcgccaaa cagcgttcag 6000

ggctatgact acgaagcgga tggtaatggc atcgtactgt taccggagcg cgtgatattc 6060

aacaaagaga atatcggcaa atacgatttc ctcgagcacc accaccacca ccactgagat 6120

ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa 6180

ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga 6240

actatatccg gat 6253

Claims (8)

1.一株重组大肠杆菌，其特征在于，所述的重组大肠杆菌过表达lsrB基因；

其中，所述lsrB基因的基因序列如SEQ ID NO：1所示；

其中，所述的大肠杆菌为E.coli CIBTS1688。

2.权利要求1所述重组大肠杆菌在发酵产L-苏氨酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵培养基中含有葡萄糖、酵母粉、KH₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄·7H₂0、FeSO₄·7H₂O、MnSO₄·5H₂O和CaCO₃。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述发酵的温度为28~37℃。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵为游离发酵。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的发酵为固定化连续发酵。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述固定化连续发酵的固定载体为聚合物多孔泡沫。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的固体载体在发酵培养基中的用量为20~50 g/L。

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