CN112410361B

CN112410361B - 一种生产南极假丝酵母脂肪酶b的方法及其使用的特异dna分子

Info

Publication number: CN112410361B
Application number: CN202011350709.6A
Authority: CN
Inventors: 江红; 邹振
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN112410361A

Abstract

本发明公开了一种生产南极假丝酵母脂肪酶B的方法及其使用的特异DNA分子，特异DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。实验证明，采用重组质粒pET30a‑CALB原核表达CALB包涵体，再经过复性，得到高纯度(95％以上)、高活性的CALB蛋白；1L培养液约获得CALB蛋白的酶活力为21252U，比活力约253U/mg；远远高于现有文献制备的CALB蛋白的比活力。由此可见，本发明显著提高了CALB的产量，且生产工艺简单、完成可以应用于实际生产。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种生产南极假丝酵母脂肪酶B的方法及其使用的特异DNA 分子

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产南极假丝酵母脂肪酶B的方法及其使用的特异DNA分子。

背景技术

南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica Lipase B，CALB)是从南极洲样品中提取的假丝酵母的一个脂肪酶，能催化生物有机酯类化合物(如表面活性剂、医药中间体等)的合成、酯类的水解、转酯以及其他类型反应，对水溶性和非水溶性物质都有很强的催化活性、高度立体选择性和高度稳定性，成为世界上应用最广泛的脂肪酶之一，低成本的量产将使其在绿色生物化工医药领域具有更广阔的应用前景。

1994年，Uppenberg J.等测定出CALB的氨基酸序列及其三维立体结构(UppenbergJ.，Patkar S.，Bergfors T.and Jones T.A.Crystallization and preliminary X-raystudies of lipase B from Candida antarctica，Journal of Molecular Biology(1994)235(2):790-792；Uppenberg J.，Hansen M.T.，Patkar S.and Jones T.A.，1994b，The sequence，crystal structure determination and refinement of two crystalforms of lipase B from Candida antarctica，Structure(1994)2(4):293-308)。1995年，丹麦诺和诺德公司克隆了CALB基因，在米曲霉(Aspergillns oryzae)中表达，并获得专利。之后，诺维信公司通过真核表达将CALB产业化生产。真核表达成本高，产业化应用难以推广，因此低成本的原核表达成为研究趋势。然而来源于酵母菌的CALB很难在原核细胞中表达，人们采用各种突变(So Yeon Hong&Young Je Yoo，Activity enhancement ofCandida antarctica Lipase B by flexibility modulation in helix regionsurrounding the Active Site.Appl Biochem Biotechnol(2013)170:925–933.SuhyunJung,Seongsoon Park.Improving the expression yield of Candida antarcticalipase B in Escherichia coli by mutagenesis.Biotechnol Lett(2008)30:717–722)、添加氨基酸标签(Hyun-Jung Jung,Sun-Ki Kim,Won-Ki Min,Sung-Suk Lee,KyungmoonPark,Yong-Cheol Park,Jin-Ho Seo.Polycationic amino acid tags enhance solubleexpression of Candida antarctica lipase B in recombinant Escherichiacoli.Bioprocess Biosyst Eng(2011)34:833–839.Xiaoxue Zhou,Yu Han,Zheng Lv,Xuemei Tian,Han Li,PanpanXie,Liangyu Zheng.Simultaneously achieve solubleexpression and biomimetic immobilization of Candida antarctica lipase B byintroducing polyamine tags.Journal of Biotechnology 249(2017)1–9)、利用分子伴侣(D.Liu,R.D.Schmid,M.Rusnak.Functional expression of Candidaantarcticalipase B in the Escherichia coli cytoplasm—a screening system for afrequently used biocatalyst.ApplMicrobiolBiotechnol(2006)72:1024–1032.)等方法改善CALB在原核细胞中的表达，但CALB的表达量都没有很好地改善，而且有些还会影响CALB活性。

发明内容

本发明的目的为生产南极假丝酵母脂肪酶B。

本发明首先保护特异DNA分子，可为s1)或s2)：

s1)核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

s2)与s1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性的DNA分子。

优选地，s2)包括与SEQ ID NO:3所示的DNA分子具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高，同一性的核苷酸序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

本发明还保护含有所述特异DNA分子的重组质粒。

优选地，组成重组质粒的原始质粒可为原核表达质粒。

所述原核表达质粒具体可为质粒pET30a。

所述重组质粒具体可为重组质粒pET30a-CALB。所述重组质粒pET30a-CALB可为将质粒pET30a的限制性内切酶NdeI和HindIII之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO:3自5’末端起第4至978位所示的DNA分子，其它序列均不变，得到的重组质粒。

所述重组质粒pET30a-CALB的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。重组质粒pET30a-CALB表达SEQ ID No:4所示CALB融合蛋白。

本发明还保护含有所述重组质粒的重组菌。

优选地，组成所述重组菌的原始菌可为原核表达菌。

优选的，所述原核表达菌可为大肠杆菌。

优选的，所述大肠杆菌可为大肠杆菌BL21(DE3)。

上述含有所述重组质粒的重组菌具体可为将重组质粒pET30a-CALB转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到的重组大肠杆菌。

本发明还保护上述任一所述特异DNA分子在生产南极假丝酵母脂肪酶B中的应用。

本发明还保护上述任一所述重组质粒在生产南极假丝酵母脂肪酶B中的应用。

本发明还保护上述任一所述重组菌在生产南极假丝酵母脂肪酶B中的应用。

本发明还保护一种生产南极假丝酵母脂肪酶B的方法，可包括如下步骤(a1)：发酵培养上述任一所述重组菌。

所述方法还可包括步骤(a2)、步骤(a3)和步骤(a4)中的至少一个；

步骤(a2)：获得包涵体；

步骤(a3)：复性包涵体；

步骤(a4)：透析获得南极假丝酵母脂肪酶B。

所述步骤(a2)可包括使用裂解液和/或高压破碎仪和/或超声破碎仪破碎细胞的步骤。

优选地，所述裂解液至少包括NaCl、Triton X-100和/或PB缓冲液。

优选地，所述裂解液的溶质及其浓度可为50-500mM NaCl和0.1-10％(v/v)TritonX-100；溶剂可为pH6.5-8.5、5-500mM PB缓冲液。

所述步骤(a3)中，复性包涵体的方法可为实施例提及的稀释法和/或透析法。

所述稀释法中使用了变性液、复性液和/或透析液。

优选地，所述变性液至少包含NaCl、Urea、DTT和/或PB缓冲液。

优选地，所述变性液的溶质及其浓度可为50-500mM NaCl、2-10M Urea和0.1-10mMDTT；溶剂可为6.5-8.5、5-500mM PB缓冲液。

优选地，所述复性液至少包含NaCl、GSH、GSSG、L-Arginine、甘油和/或PB缓冲液。

优选地，所述复性液的溶质及其浓度可为50-500mM NaCl、0.4-40mM GSH、0.04-4mM GSSG、0.04-4M L-Arginine和5-25％(v/v)甘油；溶剂可为pH6.5-8.5、5-500mM PB缓冲液。

优选地，所述透析液至少包含NaCl和/或PB缓冲液。

优选地，所述透析液的溶质及其浓度可为50-500mM NaCl；溶剂可为pH6.5-8.5、5-500mM PB缓冲液。

所述透析法中使用了复性透析液1和复性透析液2。

优选地，所述复性透析液1和/或2至少包含NaCl、Urea、GSH、GSSG、L-Arginine、甘油和/或PB缓冲液。

优选地，所述复性透析液1和/或2的溶质及其浓度可为50-500mM NaCl、0-8MUrea、0.4-40mM GSH、0.04-4mM GSSG、0.04-4M L-Arginine和5-25％(v/v)甘油；溶剂可为pH6.5-8.5、5-500mM PB缓冲液。

上述任一所述方法还可包括将南极假丝酵母脂肪酶B纯化的步骤。

本发明还保护一种生产南极假丝酵母脂肪酶B的方法，其不包括纯化步骤，所获得的蛋白酶活力至少高于100U/L、1000U/L、10000U/L。

本发明还保护一种生产南极假丝酵母脂肪酶B的方法，其不包括纯化步骤，所获得的蛋白酶比活力至少高于5U/mg、10U/mg、100U/mg。

本发明还保护一种生产南极假丝酵母脂肪酶B的方法，其不包括纯化步骤，所获得的蛋白酶纯度至少高于10％、20％、40％、60％、80％、90％、95％和/或以上。

本发明还保护一种南极假丝酵母脂肪酶B，其由上述任一所述的方法制备得到。

本发明还保护南极假丝酵母脂肪酶B，其氨基酸序列可如SEQ ID NO:4所示。

本发明还保护一种融合南极假丝酵母脂肪酶B，其在南极假丝酵母脂肪酶B的N端加入了组氨酸标签。

上述任一所述南极假丝酵母脂肪酶B或上述任一所述融合南极假丝酵母脂肪酶B在催化生物有机酯类化合物合成、水解、转酯以及其他类型反应中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种融合南极假丝酵母脂肪酶B包涵体的复性方法，其特征在于，所述复性方法为稀释法，复性后所获得的蛋白酶活力至少高于100U/L、1000U/L、10000U/L，和/或所获得的蛋白酶比活力至少高于5U/mg、10U/mg、100U/mg和/或纯度至少高于10％、20％、40％，、60％、80％、90％、95％和/或以上。

优选地，所述稀释法中使用了上述任一所述变性液、上述任一所述复性液和/或上述任一所述透析液。

上述任一所述南极假丝酵母脂肪酶B的氨基酸序列可如SEQ ID NO:4所示。

实验证明，采用重组质粒pET30a-CALB原核表达CALB包涵体，再经过复性，得到高纯度(95％以上)、高活性的CALB蛋白；1L培养液约获得CALB蛋白的酶活力为21252U，比活力约253U/mg；远远高于现有文献制备的CALB蛋白的比活力。由此可见，本发明显著提高了CALB的产量，且生产工艺简单、完成可以应用于实际生产。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中步骤二菌体上清液和菌体沉淀的SDS-PAGE结果。

图2为实施例1中步骤三包涵体的SDS-PAGE结果。

图3为实施例1中步骤三复性后的CALB的SDS-PAGE结果。

图4为对比例1中菌体上清液和菌体沉淀的SDS-PAGE结果。

图5为对比例2中菌体上清液和菌体沉淀的SDS-PAGE结果。

图6为对比例3中菌体上清液和菌体沉淀的SDS-PAGE结果。

图7为对比例6中洗脱样品的SDS-PAGE结果。

图8为对比例7中洗脱样品的SDS-PAGE结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

质粒pET30a和pETDuet-1均为Novagen公司的产品，产品目录号分别为69909-3和71146-3。质粒pCold III为Novagen公司的产品，产品目录号为3363。Bradford蛋白浓度检测试剂盒为康为公司的产品，产品目录号为CW0013。

编码CALB蛋白的基因(简称CALB基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

CALB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例1、采用CALB融合基因生产南极假丝酵母脂肪酶B

一、重组质粒的构建

1、根据CALB蛋白的氨基酸序列优化密码子，人工合成N端带有6个His标签的CALB融合基因。

CALB融合基因的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。

CALB融合基因编码SEQ ID No:4所示CALB融合蛋白。

2、重组质粒pET30a-CALB的构建

将质粒pET30a的限制性内切酶NdeI和HindIII之间的DNA小片段替换为SEQ IDNO:3自5’末端起第4至978位所示的DNA分子，其它序列均不变，得到重组质粒pET30a-CALB。

重组质粒pET30a-CALB的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

重组质粒pET30a-CALB表达SEQ ID No:4所示CALB融合蛋白。

二、蛋白的表达

1、将重组质粒pET30a-CALB转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组大肠杆菌。

2、将步骤1得到的重组大肠杆菌单克隆接种至5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm培养4-5h，得到培养菌液1。之后，将培养菌液1接种至1L含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm培养，得到OD_600nm为0.6-0.8的培养菌液2。之后，向培养菌液2中加入IPTG，得到诱导体系；诱导体系中，IPTG的浓度为0.6-1mM。最后将诱导体系37℃、200rpm诱导表达培养6-8h，得到培养液。

3、取步骤2得到的培养液，5500rpm离心10min，收集沉淀(即菌体)并称重。

1L培养液的菌体的湿重为2.355g。

4、取少量沉淀，加入少量300mM NaCl的pH7.5、50mM PB缓冲液，超声破碎，然后8000rpm离心10min，得到菌体上清液和菌体沉淀。

5、取菌体上清液或菌体沉淀，加入40uL 6×Loading Buffer，100℃处理5min，得到上样样品；上样，进行SDS-PAGE。

SDS-PAGE结果见图1(1为菌体沉淀，2为蛋白Marker，3为菌体上清液)。结果表明，CALB融合蛋白主要在菌体沉淀中以包涵体形式表达。

三、CALB包涵体的获得

裂解液：含300mM NaCl、1％(v/v)Triton X-100的pH7.5、50mM PB缓冲液。

1、取步骤二中3收集的沉淀，加入裂解液，混匀；之后用高压破碎仪或者超声破碎仪破碎细胞，5500rpm离心10min，收集沉淀甲并称重。

沉淀甲即为CALB包涵体和细胞碎片。

包涵体和细胞碎片的湿重为0.848g。

2、取少量沉淀甲，加入40uL 6×Loading Buffer，100℃处理5min，得到上样样品；上样，进行SDS-PAGE。

SDS-PAGE结果见图2(1为包涵体，2为蛋白Marker)。

四、稀释法复性CALB包涵体

变性液：含300mM NaCl、8M Urea、1mM DTT的pH7.5、50mM PB缓冲液。

复性液：含300mM NaCl、4mM GSH、0.4mM GSSG、0.4M L-Arginine和10％(v/v)甘油的pH7.5、50mM PB缓冲液。

透析液：含300mM NaCl的pH7.5、50mM PB缓冲液。

1、取步骤三中1收集的沉淀甲，加入变性液溶解，然后加入复性液，4℃静置过夜，得到复性蛋白液。

2、将步骤2得到的复性蛋白液装入透析袋，在透析液中透析过夜，透析后袋中的液体即为复性后的CALB。

取一定量透析后的透析液，加入终浓度为10％(v/v)的甘油，作为检测CALB活性的缓冲液。

向复性后的CALB中加入终浓度为10％(v/v)的甘油，得到CALB蛋白溶液；分装，-80℃保存。

3、取复性后的CALB，加入40uL 6×Loading Buffer，100℃处理5min，得到上样样品；上样，进行SDS-PAGE。

SDS-PAGE结果见图3(1为蛋白Marker，2为复性后的CALB)。结果表明，CALB蛋白溶液中CALB蛋白纯度为95％以上。

4、取-80℃保存的CALB蛋白溶液，置于冰水浴中5-10min(目的为使其缓慢融化)，然后4℃放置0.5h，观察。结果无异常现象，说明CALB蛋白溶液在-80℃下安全稳定。

五、透析法复性CALB包涵体

复性透析液1：含300mM NaCl、3M Urea、4mM GSH、0.4mM GSSG、0.4M L-Arginine和10％(v/v)甘油的pH7.5、50mM PB缓冲液。

复性透析液2：含300mM NaCl、4mM GSH、0.4mM GSSG、0.4M L-Arginine和10％(v/v)甘油的pH7.5、50mM PB缓冲液。

1、取步骤三中1收集的沉淀甲，加入变性液溶解，装入透析袋，在复性透析液1中透析过夜。

2、在复性透析液2中透析过夜。

3、按照步骤四2中操作，在透析液中透析、加入甘油。

六、酶活性检测

1、CALB浓度及总蛋白的测定

采用Bradford蛋白浓度检测试剂盒检测CALB蛋白溶液中CALB的浓度，并计算获得的总蛋白。

结果表明，步骤二中2获得的1L培养液中约含有84mg总蛋白。稀释法和透析法复性的CALB可以获得相当量的总蛋白。

2、CALB酶活性测定

CALB分解对硝基丁酸酯(p-NPB)产生对硝基苯酚，因此可通过测定对硝基苯酚来测定CALB酶活性，具体方法记载于如下文献中：Kerstin Blank,Julia Morfill,HermannGumpp,Hermann E.Gaub.Functional expression of Candida antarctica lipase B inEschericha coli.Journal of Biotechnology 125(2006)474–483.步骤简述如下：

(1)取酶标板，每孔加入10ul浓度为2mM的p-NPB溶液(溶剂为无水乙醇；p-NPB溶液作为底物)和190ul CALB稀释液(用步骤四中2检测CALB活性的缓冲液稀释CALB蛋白溶液)，混匀。

按照上述步骤，将CALB稀释液替换为步骤四中2检测CALB活性的缓冲液，其它步骤均不变，作为对照。

(2)完成步骤(1)后，立即在酶标仪上通过读取410nm处时间动态吸光值来测定CALB的活力。CALB活力单位(U)的定义为在上述条件下，每分钟生成每微摩尔对硝基苯酚所需要的酶量。

结果表明，每mg CALB蛋白的酶活力为253U。

经计算，步骤二中2获得的1L培养液中CALB蛋白的酶活力为21252U。

稀释法和透析法复性的CALB可以获得相当纯度和量的CALB蛋白。

对比例1、采用CALB基因生产南极假丝酵母脂肪酶B

一、重组质粒的构建

1、人工合成SEQ ID NO:1所示CALB基因。

CALB基因编码SEQ ID NO:2所示的CALB蛋白。

2、将质粒pETDuet-1的限制性内切酶BamHI和HindIII之间的DNA小片段替换为SEQID NO:1所示的DNA分子，其它序列均不变，得到重组质粒pETDuet-CALB。

重组质粒pETDuet-CALB表达SEQ ID No:2所示的CALB蛋白。

二、蛋白的表达

按照实施例1中步骤二的方法，将重组质粒pET30a-CALB替换为重组质粒pETDuet-CALB，其它步骤均不变。

SDS-PAGE结果见图4(1为菌体上清液，2为菌体沉淀，3为蛋白Marker)。结果表明，CALB蛋白在菌体上清液和菌体沉淀中均未有明显表达。

对比例2、采用CALB基因1生产南极假丝酵母脂肪酶B

一、重组质粒的构建

1、本发明的发明人根据密码子偏好性优化并合成CALB基因1。CALB基因1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

CALB基因1编码SEQ ID NO:2所示的CALB蛋白。

2、将质粒pCold III的限制性内切酶EcoRI和SalI之间的DNA小片段替换为SEQ IDNO:5所示的DNA分子，其它序列均不变，得到重组质粒pCold III-CALB1。

重组质粒pCold III-CALB1表达SEQ ID NO:2所示的CALB蛋白。

二、蛋白的表达

按照实施例1中步骤二的方法，将重组质粒pET30a-CALB替换为重组质粒pColdIII-CALB1，大肠杆菌BL21(DE3)替换为Origami B，其它步骤均不变。

SDS-PAGE结果见图5(1为蛋白Marker，3为菌体上清液，5为菌体沉淀)。结果表明，CALB蛋白在菌体上清液和菌体沉淀中均未有明显表达。

对比例3、采用CALB基因2生产南极假丝酵母脂肪酶B

一、重组质粒的构建

1、人工合成SEQ ID NO:6所示CALB基因2。

CALB基因2编码SEQ ID NO:7所示的CALB蛋白2。

SEQ ID NO:7所示的CALB蛋白2与CALB蛋白的唯一不同在于第59位氨基酸不同：前者第59位为Q，后者第59位为T。

2、将质粒pCold III的限制性内切酶EcoRI和SalI之间的DNA小片段替换为SEQ IDNO:6所示的DNA分子，其它序列均不变，得到重组质粒pCold III-CALB2。

重组质粒pCold III-CALB2表达SEQ ID NO:7所示的CALB蛋白2。

二、蛋白的表达

按照实施例1中步骤二的方法，将重组质粒pET30a-CALB替换为重组质粒pColdIII-CALB2，其它步骤均不变。

SDS-PAGE结果见图6(1为蛋白Marker，2为菌体上清液，3为菌体沉淀)。结果表明，CALB蛋白2在菌体上清液和菌体沉淀中均未有明显表达。

对比例4、常规透析法复性CALB包涵体

取实施例1步骤三中1收集的沉淀甲，加入变性液溶解，然后将其加入到透析袋中，4℃环境下，透析到缓冲液[50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M L-Arginine，1M Urea，10％Glycerol]中复性，复性后CALB蛋白最终透析于储存液[50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，10％Glycerol溶液]约6-8h，CALB得率为40mg,约为实施例1的50％。

对比例5、常规稀释法复性CALB包涵体

Buffer A：50mM Tris(pH8.0)，300mM NaCl，8M Urea，2mM DTT。

Buffer B：50mM Tris(pH8.0)，50mM NaCl，4mM GSH，0.4mM GSSG，0.4M L-Arginine，10％Glycerol。

取实施例1步骤三中1收集的沉淀甲，用Buffer A溶解，在4℃下将Buffer B以约1ml/min的流速滴加入其中，复性后CALB蛋白最终透析于储存液[50mM Tris(pH8.0)，300mMNaCl，10％Glycerol溶液]约6-8h，大量CALB蛋白沉淀析出，CALB得率为几乎为0。

对比例6、通过弱阴离子柱复性CALB包涵体

1、取实施例1步骤三中1收集的沉淀甲，加入变性液溶解，以1ml/min的流速上样(上样至DMEM SepharoseTM FF离子柱)。

2、采用复性Buffer(50mM Tris，20mM NaCl，4mM GSH，0.4mM GSSG，10％Glycerol，pH8.0)以0.5ml/min流速复性蛋白，整个复性时间14h。

3、采用洗脱Buffer(50mM Tris，0.5-1M NaCl，2mM DTT，10％Glycerol，pH8.0)以0.3ml/min流速洗脱。

4、将洗脱样品进行SDS-PAGE。

SDS-PAGE结果见图7。结果表明，采用弱阴离子柱复性回收的样品基本检测不到蛋白浓度。

对比例7、通过离子柱复性CALB包涵体

将步骤6中的DMEM SepharoseTM FF离子柱替换为Q SepharoseTM FF离子柱，其它步骤均不变。

SDS-PAGE结果见图8。结果表明，采用离子柱复性回收的样品Lane 3-Lane 4得率远低于1‰。

上述结果表明，采用重组质粒pET30a-CALB(即包含核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CALB融合基因的质粒)原核表达CALB包涵体，再经过复性(本发明提供的稀释法或透析法)，得到高纯度(95％以上)、高活性的CALB蛋白；1L培养液约获得CALB蛋白的酶活力为21252U，比活力约253U/mg。而现有文献(D.Liu.R.D.Schmid.M.Rusnak.Functionalexpression of Candida antarctica lipase B in the Escherichia coli cytoplasm-ascreening system for a frequently used biocatalyst.Appl Microbiol Biotechnol(2006)72:1024–1032.)中以磷酸对硝基酯为底物，最高获得CALB蛋白的比活力为71U/mg。由此可见，本发明显著提高了CALB的产量，且生产工艺简单、完全可以应用于实际生产。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110>中国科学院动物研究所

<120>一种生产南极假丝酵母脂肪酶B的方法及其使用的特异DNA分子

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 960

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atggccctgc cgagcggtag cgatccggcg tttagccagc cgaaaagcgt tctggatgca 60

ggcctcacgt gtcagggtgc gagcccgagc agcgttagca aaccgattct gctggttccg 120

ggtacgggta cgaccggtcc gcagagcttt gatagcaatt ggattccgct gagcacgcaa 180

ctcggctata ccccgtgttg gattagcccg ccgccgttta tgctgaatga tacccaggtg 240

aataccgaat atatggtgaa tgcgattacc gcgctgtatg cgggtagcgg taataataaa 300

ctgccggtgc tgacctggag ccagggtggt ctggtggcgc agtggggcct gacctttttt 360

ccgagcattc gtagcaaagt ggatcgtctg atggcgtttg cgccggatta taaaggcacc 420

gtgctggcgg gtccgctgga tgcgctggcg gtgagcgcgc cgagcgtgtg gcagcagacc 480

accggtagcg cgctgaccac cgcgctgcgt aatgcgggtg gtctgaccca gattgtgccg 540

accaccaatc tgtatagcgc gaccgatgaa attgtgcagc cgcaggtgag caatagcccg 600

ctggattcga gctatctgtt taatggtaaa aacgttcaag cacaggcggt gtgtggtccg 660

ctgtttgtga ttgatcatgc gggtagcctg accagccagt ttagctatgt ggtgggtcgt 720

tcggcactgc gtagcaccac cggccaggcg cgtagcgcgg attatggcat taccgattgt 780

aatccgctgc cggcgaatga tctgaccccg gaacagaaag ttgccgctgc tgccctgctg 840

gctccagcgg cggcagccat tgtggcgggt ccgaaacaga attgtgaacc ggatctgatg 900

ccgtatgcgc gtccgtttgc ggtgggtaaa cgtacctgta gcggtattgt gaccccgtaa 960

<210> 2

<211> 319

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Ala Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser

1 5 10 15

Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val

20 25 30

Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln

35 40 45

Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr

50 55 60

Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val

65 70 75 80

Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser

85 90 95

Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val

100 105 110

Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp

115 120 125

Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly

130 135 140

Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr

145 150 155 160

Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr

165 170 175

Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val

180 185 190

Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn

195 200 205

Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile

210 215 220

Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg

225 230 235 240

Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly

245 250 255

Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln

260 265 270

Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val

275 280 285

Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg

290 295 300

Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro

305 310 315

<210> 3

<211> 978

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgcatcatc accatcatca tctgccgtct ggttctgatc cggcatttag tcagccgaaa 60

agcgttctgg acgcaggtct gacctgtcaa ggtgcaagtc caagcagcgt tagcaaaccg 120

attctgctgg ttccaggtac gggtaccacc ggtccacaga gctttgatag caactggatt 180

ccgctgagta cccaactggg ttataccccg tgttggatta gtccaccgcc gtttatgctg 240

aacgataccc aggtcaacac cgaatacatg gtcaatgcga ttaccgcact gtacgcaggt 300

tctggcaata acaaactgcc ggttctgacc tggagtcaag gcggtctggt tgcacagtgg 360

ggtctgacct ttttcccgag catccgcagc aaagttgatc gtctgatggc gtttgcaccg 420

gattataaag gcaccgttct ggctggtcca ctggatgcac tggcagttag cgcaccaagc 480

gtttggcaac aaaccaccgg ttctgcactg accaccgcac tgcgtaacgc aggcggtctg 540

acccaaattg tcccgaccac caacctgtat agcgcaaccg acgaaattgt tcagccgcaa 600

gttagcaata gcccactgga tagcagctac ctgtttaacg gcaaaaacgt tcaggcgcag 660

gctgtttgcg gcccgctgtt tgttattgat cacgcaggta gcctgacctc tcagtttagc 720

tatgttgttg gtcgttctgc actgcgtagt accaccggtc aagcacgttc tgcggattac 780

ggtattaccg attgcaatcc gctgccagca aacgatctga ccccagaaca gaaagttgca 840

gcagcagcac tgctggcacc agcagcagca gcaattgtag cgggtccgaa acagaactgc 900

gaaccagatc tgatgccgta cgcacgtcca tttgcagttg gtaaacgcac ctgtagcggt 960

attgttaccc cataatga 978

<210> 4

<211> 324

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met His His His His His His Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe

1 5 10 15

Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala

20 25 30

Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly

35 40 45

Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr

50 55 60

Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu

65 70 75 80

Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala

85 90 95

Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser

100 105 110

Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile

115 120 125

Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly

130 135 140

Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser

145 150 155 160

Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn

165 170 175

Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala

180 185 190

Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser

195 200 205

Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly

210 215 220

Pro Leu Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser

225 230 235 240

Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg

245 250 255

Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp

260 265 270

Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala

275 280 285

Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu

290 295 300

Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly

305 310 315 320

Ile Val Thr Pro

<210> 5

<211> 960

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atggccctgc ctagcggtag cgatccggcc tttagccagc cgaaaagtgt tctggatgcc 60

ggtctgacct gccagggcgc tagtcctagt agcgttagta aaccgattct gctggtgccg 120

ggcaccggta caaccggtcc tcagagcttt gatagtaatt ggattccgct gagtacccag 180

ctgggctata ccccgtgctg gattagtccg ccgccgttta tgctgaatga tacccaggtg 240

aataccgaat atatggttaa tgccattacc gccctgtatg ccggcagcgg caataataag 300

ctgccggtgc tgacctggag tcagggcggt ctggttgcac agtggggcct gacctttttc 360

ccgagcattc gtagtaaagt tgatcgtctg atggcctttg caccggatta taaaggtaca 420

gtgctggcag gtccgctgga tgcactggca gttagtgccc cgagcgtgtg gcagcagacc 480

accggtagcg ccctgaccac cgcactgcgt aatgcaggtg gcctgaccca gattgtgccg 540

accaccaatc tgtatagtgc caccgatgaa attgttcagc cgcaggttag taatagtccg 600

ctggatagta gttatctgtt taatggcaaa aacgttcagg cacaggcagt ttgcggtccg 660

ctgtttgtta ttgatcatgc aggtagtctg accagtcagt ttagctatgt ggttggtcgt 720

agtgcactgc gcagtaccac cggccaggcc agaagtgcag attatggcat taccgattgc 780

aatccgctgc cggccaatga tctgaccccg gaacagaaag ttgccgcagc cgcactgctg 840

gcaccggcag cagcagcaat tgtggcaggt ccgaaacaga attgtgaacc ggatctgatg 900

ccgtatgccc gtccgtttgc agttggtaaa cgtacctgca gcggtattgt taccccgtaa 960

<210> 6

<211> 960

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atggccctac cttccggttc ggaccctgcc ttttcgcagc ccaagtcggt gctcgatgcg 60

ggtctgacct gccagggtgc ttcgccatcc tcggtctcca aacccatcct tctcgtcccc 120

ggaaccggca ccacaggtcc acagtcgttc gactcgaact ggatccccct ctctgcgcag 180

ctgggttaca caccctgctg gatctcaccc ccgccgttca tgctcaacga cacccaggtc 240

aacacggagt acatggtcaa cgccatcacc gcgctctacg ctggttcggg caacaacaag 300

cttcccgtgc ttacctggtc ccagggtggt ctggttgcac agtggggtct gaccttcttc 360

cccagtatca ggtccaaggt cgatcgactt atggcctttg cgcccgacta caagggcacc 420

gtcctcgccg gccctctcga tgcactcgcg gttagtgcac cctccgtatg gcagcaaacc 480

accggttcgg cactcaccac cgcactccga aacgcaggtg gtctgaccca gatcgtgccc 540

accaccaacc tctactcggc gaccgacgag atcgttcagc ctcaggtgtc caactcgcca 600

ctcgactcat cctacctctt caacggaaag aacgtccagg cacaggccgt gtgtgggccg 660

ctgttcgtca tcgaccatgc aggctcgctc acctcgcagt tctcctacgt cgtcggtcga 720

tccgccctgc gctccaccac gggccaggct cgtagtgcag actatggcat tacggactgc 780

aaccctcttc ccgccaatga tctgactccc gagcaaaagg tcgccgcggc tgcgctcctg 840

gcgccggcag ctgcagccat cgtggcgggt ccaaagcaga actgcgagcc cgacctcatg 900

ccctacgccc gcccctttgc agtaggcaaa aggacctgct ccggcatcgt caccccctga 960

<210> 7

<211> 319

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Met Ala Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser

1 5 10 15

Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val

20 25 30

Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln

35 40 45

Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Ala Gln Leu Gly Tyr Thr

50 55 60

Pro Cys Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val

65 70 75 80

Asn Thr Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser

85 90 95

Gly Asn Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val

100 105 110

Ala Gln Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp

115 120 125

Arg Leu Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly

130 135 140

Pro Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr

145 150 155 160

Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr

165 170 175

Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val

180 185 190

Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn

195 200 205

Gly Lys Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile

210 215 220

Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg

225 230 235 240

Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly

245 250 255

Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln

260 265 270

Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val

275 280 285

Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg

290 295 300

Pro Phe Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro

305 310 315

<210> 8

<211> 6231

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga tctcgatccc 4980

gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 5040

ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgca tcatcaccat catcatctgc 5100

cgtctggttc tgatccggca tttagtcagc cgaaaagcgt tctggacgca ggtctgacct 5160

gtcaaggtgc aagtccaagc agcgttagca aaccgattct gctggttcca ggtacgggta 5220

ccaccggtcc acagagcttt gatagcaact ggattccgct gagtacccaa ctgggttata 5280

ccccgtgttg gattagtcca ccgccgttta tgctgaacga tacccaggtc aacaccgaat 5340

acatggtcaa tgcgattacc gcactgtacg caggttctgg caataacaaa ctgccggttc 5400

tgacctggag tcaaggcggt ctggttgcac agtggggtct gacctttttc ccgagcatcc 5460

gcagcaaagt tgatcgtctg atggcgtttg caccggatta taaaggcacc gttctggctg 5520

gtccactgga tgcactggca gttagcgcac caagcgtttg gcaacaaacc accggttctg 5580

cactgaccac cgcactgcgt aacgcaggcg gtctgaccca aattgtcccg accaccaacc 5640

tgtatagcgc aaccgacgaa attgttcagc cgcaagttag caatagccca ctggatagca 5700

gctacctgtt taacggcaaa aacgttcagg cgcaggctgt ttgcggcccg ctgtttgtta 5760

ttgatcacgc aggtagcctg acctctcagt ttagctatgt tgttggtcgt tctgcactgc 5820

gtagtaccac cggtcaagca cgttctgcgg attacggtat taccgattgc aatccgctgc 5880

cagcaaacga tctgacccca gaacagaaag ttgcagcagc agcactgctg gcaccagcag 5940

cagcagcaat tgtagcgggt ccgaaacaga actgcgaacc agatctgatg ccgtacgcac 6000

gtccatttgc agttggtaaa cgcacctgta gcggtattgt taccccataa tgaaagcttg 6060

cggccgcact cgagcaccac caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa 6120

aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct 6180

ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga t 6231

Claims

1.特异DNA分子，为核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的DNA分子。

2.含有权利要求1所述特异DNA分子的重组质粒。

3.含有权利要求2所述重组质粒的重组菌。

4.一种生产南极假丝酵母脂肪酶B的方法，包括如下步骤：

（a1）发酵培养权利要求3所述重组菌，收集菌体沉淀；

（a2）向步骤（a1）收集的菌体沉淀中加入裂解液，破碎，收集的沉淀即为包涵体；

所述裂解液的溶质及其浓度为50-500mM NaCl和0.1-10%Triton X-100；溶剂为pH6.5-8.5、5-500mM PB缓冲液；

（a3）将步骤（a2）获得的包涵体进行复性，获得复性后的CALB；复性后的CALB即为南极假丝酵母脂肪酶B；

所述复性的方法采用稀释法或透析法；

所述稀释法的步骤如下：

（b1）取步骤（a2）获得的包涵体，加入变性液溶解，之后加入复性液，静置，得到复性蛋白液；

所述变性液的溶质及其浓度为300mM NaCl、8M Urea、1mM DTT；溶剂为pH7.5、50mM PB缓冲液；

所述复性液的溶质及其浓度为300mM NaCl、4mM GSH、0.4mM GSSG、0.4M L-Arginine和10%甘油；溶剂为pH7.5、50mM PB缓冲液；

（b2）采用透析液对步骤（b1）得到的复性蛋白液进行透析，得到复性后的CALB；

所述透析液的溶质及其浓度为300mM NaCl；溶剂为pH7.5、50mM PB缓冲液；

所述透析法的步骤如下：

（c1）取步骤（a2）获得的包涵体，加入所述变性液溶解，之后在复性透析液1中透析；

所述复性透析液1的溶质及其浓度为300mM NaCl、3M Urea、4mM GSH、0.4mM GSSG、0.4ML-Arginine和10%甘油；溶剂为pH7.5、50mM PB缓冲液；

（c2）完成步骤（c1）后，在复性透析液2中透析，得到复性后的CALB；

所述复性透析液2的溶质及其浓度为300mM NaCl、4mM GSH、0.4mM GSSG、0.4M L-Arginine和10%甘油；溶剂为pH7.5、50mM PB缓冲液。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将南极假丝酵母脂肪酶B纯化的步骤。