CN112481282A

CN112481282A - 一种特异性识别黄原胶侧链的碳水化合物结合模块cbm6b蛋白质及应用

Info

Publication number: CN112481282A
Application number: CN202011356407.XA
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 王雪妍; 李宪臻
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN112481282B

Abstract

本发明公开了一种特异性识别黄原胶侧链的碳水化合物结合模块CBM6B蛋白质及应用，属于生物技术领域。本发明应用现代分子生物学手段从微杆菌Microbacterium sp.XT11中克隆出CBM6B的基因，构建碳水化合物活性酶与的融合表达载体，转化至大肠杆菌中对融合酶进行高水平表达。CBM6B能够提高重组酶与底物黄原胶的亲和能力及催化能力，为高效、精准切割黄原胶，制备黄原胶寡糖打下基础。

Description

一种特异性识别黄原胶侧链的碳水化合物结合模块CBM6B蛋白质及应用

技术领域

本发明涉及一种特异性识别黄原胶侧链的碳水化合物结合模块CBM6B蛋白质及应用，属于生物技术领域。

背景技术

黄原胶作为自1969年以来第一种大规模生产的生物聚合物，具备诸多优良特性，应用十分广泛。其降解产物黄原胶寡糖已被证明是集抑菌、抗氧化、抗肿瘤等活性于一体的新型功能性寡糖，在食品、医药等领域有着广阔的应用前景。因此，寻找能够高效、精准降解黄原胶的方法迫在眉睫。目前，黄原胶降解主要是通过物理法、化学法和生物法来实现。于制备寡糖而言，物理法对仪器要求较高，且能耗大，难以实现大规模工业化生产。化学法制备黄原胶寡糖过程中会产生有毒化合物，对环境不友好。生物法主要利用酶作用黄原胶，使黄原胶的糖苷键发生断裂，产生侧链修饰或生成低分子量的寡糖。相对物理化学法，生物法的成本低廉，能够生成特异性更高的产物。

酶法生产黄原胶寡糖的主要瓶颈就是缺少能够高效、稳定发挥作用的黄原胶酶。黄原胶的主链为类纤维素结构，富含取代基的三糖侧链结构形成了酶攻击主链的屏障。黄原胶二级结构、三级结构较为复杂，限制了酶对底物的可及性，使一般的碳水化合物活性酶的难以降解黄原胶。

碳水化合物结合模块(CBM)是一类可以精准识别并结合各种形式的碳水化合物的蛋白质模块，该模块并无催化活性。CBM通常能够发挥邻近、靶向功能，从而增加底物表面的酶浓度，提高酶与底物的亲和能力，以此来影响酶的催化速率及稳定性。迄今为止，关于CBM与碳水化合物活性酶融合表达以高效水解黄原胶的研究尚未有人尝试。挖掘对黄原胶底物有特异性的碳水化合物结合模块和黄原胶降解酶是高效精准切割黄原胶，制备黄原胶寡糖的首要任务。

发明内容

本发明利用融合表达的手段，选取微杆菌XT11的黄原胶裂解酶的碳水化合物结合模块CBM6B作为底物结合域，对其进行理性改造，构建碳水化合物活性酶-CBM6B融合表达载体。将表达载体转化至遗传背景清晰的大肠杆菌中，高水平表达兼具高催化活性和稳定性的融合酶。旨在获得具备稳定、高效、定点切割能力的黄原胶酶，为快速、精准切割黄原胶，制备黄原胶寡糖打下基础。

本发明的目的在于提供一种含有能够特异性识别黄原胶侧链的碳水化合物结合模块CBM6B基因及其重组载体。此外，本发明提供了一种利用构建的大肠杆菌表达载体转化的大肠杆菌宿主。

本发明提供了一种基因，为1a)～2a)中的一种：

1a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2a)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列至少具有90％以上同源性编码所述蛋白质的DNA分子。

本发明还提供了所述基因编码的碳水化合物结合模块蛋白质，为1b)～3b)中的一种：

1b)具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质；

2b)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过1个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

3b)含有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的具有相同功能的蛋白质。

本发明还提供了所述碳水化合物结合模块蛋白质与碳水化合物活性酶构建的融合表达载体。

进一步地，上述技术方案中，所述碳水化合物活性酶包括糖苷水解酶类、糖基转移酶类、多糖裂解酶类或糖酯酶类。

进一步地，上述技术方案中，所述糖苷水解酶包括纤维素内切酶和黄原胶内切酶。

本发明还提供了一种含有所述融合表达载体的重组表达菌。

本发明还提供了所述碳水化合物结合模块在识别黄原胶侧链、降解黄原胶制备黄原胶寡糖中的应用。

本申请的有益效果包括：

本发明利用生物信息学及分子生物学手段，选取微杆菌XT11的黄原胶裂解酶碳水化合物结合模块CBM6B作为底物结合域，对其进行理性改造。甄选高活力的碳水化合物活性酶为催化结构域，构建碳水化合物活性酶-CBM6B融合表达载体。将其转化至大肠杆菌中，诱导表达融合酶。本发明发现CBM6B能够提高碳水化合物活性酶识别底物黄原胶的能力，使其可以高效、靶向作用底物，提高酶活力，从而获得聚合度集中的黄原胶寡糖。为黄原胶的酶法降解提供了新思路，为黄原胶寡糖的工业化生产和寡糖构效关系的研究打下基础。CBM6B能够提高重组酶与底物黄原胶的亲和能力及催化能力，为高效、精准切割黄原胶，制备黄原胶寡糖打下基础。

附图说明

图1是微杆菌Microbacterium sp.XT11全基因组DNA的电泳图，图中，泳道M为Marker蛋白，泳道1为微杆菌Microbacterium sp.XT11。

图2是cbm6b目的片段的琼脂糖凝胶电泳图，图中，泳道M为100bpDNA Marker，泳道1为cbm6b。

图3是重组质粒pET28a-CBM6B的构建流程图。

图4是重组质粒pET28a-CBM6B酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，图中，泳道M为100bpDNA Marker，泳道1-5为pET28a-CBM6B双酶切后DNA片段。

图5是Ctcel8a目的片段的琼脂糖凝胶电泳图，图中，泳道M为250bpDNA Marker，泳道1为Ctcel8a。

图6是表达载体pET28a-CtCel8A-CBM6B的构建流程图。

图7是表达载体pET28a-CtCel8A-CBM6B的酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，图中，泳道M为1kb DNA Marker，泳道1-2为pET28a-CtCel8A-CBM6B双酶切后的DNA片段。

图8是带MiXenCD同源臂的cbm6b目的片段的琼脂糖凝胶电泳图，图中，泳道M为100bpDNA Marker，泳道1为带MiXenCD同源臂的cbm6b。

图9是表达载体pET28a-MiXenCD-6B的构建流程图。

图10是表达载体pET28a-MiXenCD-6B的酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，图中，泳道M为1kb DNA Marker，泳道1-4为pET28a-MiXenCD-6B双酶切后的DNA片段。

图11是融合酶CtCel8A-CBM6B的SDS-PAGE分析，图中，泳道M为protein HighMarker，泳道1为融合酶CtCel8A-CBM6B。

图12是融合酶MiXenCD-6B的SDS-PAGE分析，图中，泳道M为protein High Marker，泳道1为融合酶MiXenCD-6B。

图13是纤维素内切酶CtCel8A和融合酶CtCel8A-CBM6B酶活力测定结果。

图14是纤维素内切酶CtCel8A和融合酶CtCel8A-CBM6B水解黄原胶的凝胶渗透色谱结果。

图15是纤维素内切酶CtCel8A和融合酶CtCel8A-CBM6B水解黄原胶的傅里叶红外光谱表征结果。

图16是重组黄原胶内切酶MiXen-CD及融合酶MiXenCD-6B的酶活力测定结果。

图17是重组黄原胶内切酶MiXen-CD及融合酶MiXenCD-6B降解产物的离子色谱表征结果。

具体实施方式

下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明构建所用的引物及Ni-NTA亲和填料均由上海生工公司合成；PCR反应所需的酶及各试剂均购自大连宝生物公司。

实施例1碳水化合物结合模块CBM6B表达载体的构建

A、微杆菌Microbacterium sp.XT11基因组DNA的提取(CTAB/NaCl法)

微杆菌Microbacterium sp.XT11(由本实验室从土壤中筛选的黄原胶降解菌XT11的中国典型培养物保藏中心编号为AB2016011，基因组序列在DDBJ/EMBL/GenBank数据库中的登录号为CP013859)。

4℃低温离心收集10mL新鲜的微杆菌XT11种子液，并用纯水重悬清洗菌体。用20μL浓度为10mg/mL的溶菌酶裂解菌体，加入1mL 1×TE后轻柔混匀，37℃反应1h。反应结束后，将菌体转移至新的2mL进口离心管中，依次加入10μL 10mg/mL蛋白酶K、60μL 10％SDS，混匀后，37℃反应1h。

加入100μL的5M NaCl、80μL CTAB/NaCl缓冲液(称取5g CTAB和2.045g NaCl，加纯水至50mL，过0.45μm滤膜)，混匀后，65℃反应30min。用等量的Tris-酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)抽提核酸后，用异丙醇沉淀核酸，并用75％乙醇清洗核酸沉淀。最后用终浓度为100μg/mL的RNaseA(核糖核酸酶A)处理核酸，溶解后电泳检验(见图1)并测定基因组DNA浓度为2253ng/μL。A260/A230为2.01，A260/A280为1.93，质量良好，冻存备用，命名为XT11-gDNA。

B、利用PCR技术扩增碳水化合物结合模块CBM6B的编码基因

PCR的具体反应体系及反应条件如下：150ng XT11-gDNA，30μL 5×PrimeSTARBuffer，15μL二甲基亚砜(DMSO)，上下游引物各30μM(上游引物序列如SEQ ID NO.3，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示)，12μl 2.5mM dNTPs，3.75U PrimeSTAR DNA聚合酶，纯水补齐150μL。反应参数为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min；16℃结束反应。PCR反应结束后，用DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段。琼脂糖凝胶电泳验证胶回收产物，结果如图2所示。目的基因cbm6b的回收产物的理论大小为464bp，序列如SEQ ID NO.1所示，图中条带与理论大小一致，成功获得含有pET28a质粒同源臂的DNA片段。由cbm6b基因编码的CBM6B蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示.

C、利用同源重组的方法将CBM6B构建至大肠杆菌的表达载体

以pET28a质粒为模板，完成对CBM6B表达载体的构建工作，构建流程图如图3。反应体系如下：100ng pET28a模板质粒，280ng目的基因片段(步骤B所得含有pET28a质粒同源臂的DNA片段)，5μL 5×PrimeSTAR Buffer，2.5mM dNTPs，0.625U PrimeSTAR DNA聚合酶，添加纯水至25μL。设置PCR反应参数为：95℃预变性5min；94℃变性1min、65℃退火1min(每循环一次降温1℃)、72℃延伸8min，15个循环；94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸8min，20个循环；68℃延伸20min；4℃终止反应。

吸取8.5μL反应产物，加入30U限制性核酸酶Dpn I，37℃反应9h，消化模板质粒。随后吸取2μL消化产物，电击转化至E.coli DH10B感受态细胞中。在含卡那霉素抗性的LB固体培养基上37℃培养12h。挑取阳性转化子，接种至含卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。提取质粒进行酶切鉴定，向PCR管中加入100ng待鉴定质粒，限制酶BglII和Xho I各0.3μL，1μL 10×Q.cut Buffer，加纯水至10μL，37℃酶切15min。经电泳分析检验样品的酶切产物，酶切后的正确大小为523bp和5142bp(见图4)。将酶切正确的质粒进行测序鉴定(由吉林库美生物进行)，测序结果显示序列正确，表达载体pET28a-CBM6B构建成功。

实施例2碳水化合物活性酶CtCel8A与CBM6B的融合表达载体的构建

甄选高活力的纤维素内切酶为改造对象，与底物结合域CBM6B融合表达，构建新型黄原胶内切酶。

A、利用PCR技术扩增纤维素内切酶CtCel8A的编码基因

全基因合成密码子优化后的来自热纤梭菌Clostridium thermocellum的高活力纤维素内切酶CtCel8A的序列(genebank:CP016502.1)，见SEQ ID NO.5。PCR的具体反应体系及反应条件如下：150ng pUC57-CtCel8，30μL 5×PrimeSTAR Buffer，15μL二甲基亚砜(DMSO)，上下游引物各30μM(上游引物序列如SEQ ID NO.6，下游引物序列如SEQ ID NO.7所示)，12μl 2.5mM dNTPs，3.75U PrimeSTAR DNA聚合酶，纯水补齐150μL。反应参数为：95℃预变性5min；95℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min；16℃结束反应。PCR反应结束后，用DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段。琼脂糖凝胶电泳验证胶回收产物，结果如图5所示。目的基因Ctcel8a的回收产物的理论大小为1399bp，图中条带与理论大小一致，成功扩增带pET28a-CBM6B同源臂的DNA片段。

B、利用同源重组的方法将CtCel8A构建至pET28a-CBM6B表达载体

以pET28a-CBM6B质粒为模板，完成对pET28a-CtCel8A-CBM6B表达载体的构建工作，构建流程见图6。反应体系如下：100ng pET28a-CBM6B模板质粒，280ng目的基因片段(步骤A所得含有pET28a-CBM6B质粒同源臂的DNA片段)，5μL5×PrimeSTAR Buffer，2.5mMdNTPs，0.625U PrimeSTAR DNA聚合酶，添加纯水至25μL。设置PCR反应参数为：95℃预变性5min；94℃变性1min、65℃退火1min(每循环一次降温1℃)、72℃延伸8min，15个循环；94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸8min，20个循环；68℃延伸20min；4℃终止反应。

吸取8.5μL反应产物，加入30U限制性核酸酶Dpn I，37℃反应9h，消化模板质粒。随后吸取2μL消化产物，电击转化至E.coli DH10B感受态细胞中。在含卡那霉素抗性的LB固体培养基上37℃培养12h。挑取阳性转化子，接种至含卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。提取质粒进行酶切鉴定，向PCR管中加入100ng待鉴定质粒，限制酶EcoRV和Hind III各0.3μL，1μL 10×Q.cut Buffer，加纯水至10μL，37℃酶切15min。经电泳分析检验样品的酶切产物，酶切后的理论大小为3051bp和3973bp(见图7)，电泳图中各条带的大小与实际大小一致。将酶切正确的质粒进行测序鉴定(由吉林库美生物进行)，测序结果显示序列正确，成功构建表达载体pET28a-CtCel8A-CBM6B。

实施例3碳水化合物活性酶MiXen与CBM6B的融合表达载体的构建

甄选来自黄原胶降解菌Microbacterium sp.XT11的黄原胶内切酶MiXen的催化结构域序列MiXen-CD，见SEQ ID NO.8(genebank:LX1-1GL001095)，与底物结合域CBM6B融合表达，构建新型黄原胶内切酶。

A、利用PCR技术扩增碳水化合物结合模块CBM6B的编码基因

PCR的具体反应体系及反应条件如下：150ng pET28a-CBM6B，30μL5×PrimeSTARBuffer，15μL二甲基亚砜(DMSO)，上下游引物各30μM(上游引物序列如SEQ ID NO.9，下游引物序列如SEQ ID NO.10所示)，12μl 2.5mM dNTPs，3.75U PrimeSTAR DNA聚合酶，纯水补齐150μL。反应参数为：95℃预变性5min；95℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min；16℃结束反应。PCR反应结束后，用DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段。琼脂糖凝胶电泳验证胶回收产物，结果如图8所示。目的基因cbm6b的回收产物的理论大小为463bp，图中条带与理论大小一致，成功获得含有pET28a-MiXenCD质粒同源臂的DNA片段。

B、利用同源重组的方法将MiXenCD构建至pET28a-CBM6B表达载体

以pET28a-MiXenCD质粒为模板，见序列SEQ ID NO.11，完成对pET28a-MiXenCD-6B表达载体的构建工作，构建流程见图9。反应体系如下：100ng pET28a-MiXen-CD模板质粒，280ng目的基因片段(步骤A所得含有pET28a-MiXen-CD质粒同源臂的DNA片段)，5μL 5×PrimeSTAR Buffer，2.5mM dNTPs，0.625U PrimeSTAR DNA聚合酶，添加纯水至25μL。设置PCR反应参数为：95℃预变性5min；94℃变性1min、65℃退火1min(每循环一次降温1℃)、72℃延伸8min，15个循环；94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸8min，20个循环；68℃延伸20min；4℃终止反应。

吸取8.5μL反应产物，加入30U限制性核酸酶Dpn I，37℃反应9h，消化模板质粒。随后吸取2μL消化产物，电击转化至E.coli DH10B感受态细胞中。在含卡那霉素抗性的LB固体培养基上37℃培养12h。挑取阳性转化子，接种至含卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养。提取质粒进行酶切鉴定，向PCR管中加入100ng待鉴定质粒，限制酶Sma I各0.3μL，1μL 10×Q.cut Buffer，加纯水至10μL，37℃酶切15min。经电泳分析检验样品的酶切产物，酶切后的理论大小为2443bp和5085bp(见图10)，电泳图中各条带的大小与实际大小一致。将酶切正确的质粒进行测序鉴定(由吉林库美生物进行)，测序结果显示序列正确，成功构建表达载体pET28a-MiXenCD-6B。

实施例4碳水化合物活性酶-CBM6B融合酶的表达及纯化

吸取100ng重组表达载体pET28a-CtCel8A-CBM6B，pET28a-MiXenCD-6B，分别电击转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中(至大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)、或Origami(DE3)也可以)。将转化液涂布在含卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养12h。挑取单菌落接种至LB液体培养基中，37℃过夜震荡培养。随后转接至LB低盐培养基中，于37℃摇床中培养，至OD₆₀₀约为0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃低温诱导表达16h。随后收集并超声破碎菌体，选用Ni-NTA填料柱进行亲和纯化。得到融合酶CtCel8A-CBM6B和融合酶MiXenCD-6B，纯化结果如图11和图12所示。

实施例5融合酶CtCel8A-CBM6B的酶活力测定及产物表征

A、测酶活方法：向CtCel8A-CBM6B酶液(提前与0.1倍体积的0.1mg/mL BSA混合)中加入等体积的2mg/mL黄原胶，在60℃反应20min。随后向反应体系中添加等体积的BCA溶液进行显色反应，在OD₅₆₂处测定还原糖的生成量。CtCel8A-CBM6B的酶活力定义为每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为1U。设置对照组为CtCel8A酶(来自热纤梭菌Clostridiumthermocellum的高活力纤维素内切酶)，测试方法同融合酶CtCel8A-CBM6B。

酶活力测定结果分析：如图13所示，融合酶CtCel8A-CBM6B的酶活为CtCel8A酶活的2.07倍，说明黄原胶侧链结合单元CBM6B能够有效提高CtCel8A对黄原胶底物的酶解活性。

B、产物表征：将3mg/mL融合酶CtCel8A-CBM6B与5g/L的黄原胶40℃孵育5天后得到黄原胶寡糖。将黄原胶寡糖经过凝胶渗透色谱(图14)、傅里叶红外光谱(图15)表征。

酶解产物表征结果分析：如图14和图15所示，融合酶CtCel8A-CBM6B将黄原胶水解成更多的中分子量低聚物，寡糖含量更高，说明CBM6B能够提高CtCel8A水解黄原胶的效率。

实施例6融合酶MiXenCD-6B的酶活力测定及产物表征

A、测酶活方法：向融合酶MiXenCD-6B酶液(提前与0.1倍体积的0.1mg/mL BSA混合)中加入等体积的2mg/mL黄原胶，在40℃反应20min。随后向反应体系中添加等体积的BCA溶液进行显色反应，在OD₅₆₂处测定还原糖的生成量。MiXenCD-6B的酶活力定义为每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量为1U。设置对照组为MiXen-CD酶(黄原胶降解菌Microbacteriumsp.XT11的黄原胶内切酶)，测试方法同融合酶MiXenCD-6B。

酶活力测定结果分析：如图16所示，融合酶MiXenCD-6B的酶活力是MiXen-CD的1.46倍，说明CBM6B能够提高黄原胶内切酶的水解能力。

B、产物表征：将1mg/mL融合酶MiXenCD-6B与5g/L的黄原胶孵育2天后得到黄原胶寡糖。将黄原胶寡糖经过离子色谱表征。对照组为MiXen-CD酶与黄原胶孵育，测试方法同融合酶MiXenCD-6B。

酶解产物表征结果分析：如图17所示，融合酶MiXenCD-6B作用黄原胶的中低分子量酶解产物明显多于对照组，说明CBM6B能够帮助黄原胶内切酶快速精准的定位在底物上，从而实现酶的精准切割，并使得降解产物的聚合度相对集中。

SEQUENCE LISTING

<110> 李宪臻

<120> 一种特异性识别黄原胶侧链的碳水化合物结合模块CBM6B蛋白质及应用

<130> 2020

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 414

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

acgaccgctg ctgtcagcac caggctggag gccgaggcgc tgaccgccag ttcgggagtg 60

atcaagagca atgccgacgc cagcggaggc cagtaccgga tcttcaacgc gtacggcgtc 120

gcggagcaga tcgactatgc ggttcctgta tcgcatgctg gggcatacga cctggtcctc 180

ggcaccatga gattcagcga caacggcacg tatcagctgc agatcgacgg gaacgacgtc 240

ggcgcccctg tggatctgtt tcgaccgtcg ggcaaagtgg tggttgtcga tctgggaagc 300

gtgacgctga gcgcgggcgt ccacgagttc acgttcacgg ctgtcggcaa gaacaccagc 360

tcgctgggct acaaacttcc tctcgactac attcagctgg tctccgccat cgag 414

<210> 2

<211> 138

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

Thr Thr Ala Ala Val Ser Thr Arg Leu Glu Ala Glu Ala Leu Thr Ala

1 5 10 15

Ser Ser Gly Val Ile Lys Ser Asn Ala Asp Ala Ser Gly Gly Gln Tyr

20 25 30

Arg Ile Phe Asn Ala Tyr Gly Val Ala Glu Gln Ile Asp Tyr Ala Val

35 40 45

Pro Val Ser His Ala Gly Ala Tyr Asp Leu Val Leu Gly Thr Met Arg

50 55 60

Phe Ser Asp Asn Gly Thr Tyr Gln Leu Gln Ile Asp Gly Asn Asp Val

65 70 75 80

Gly Ala Pro Val Asp Leu Phe Arg Pro Ser Gly Lys Val Val Val Val

85 90 95

Asp Leu Gly Ser Val Thr Leu Ser Ala Gly Val His Glu Phe Thr Phe

100 105 110

Thr Ala Val Gly Lys Asn Thr Ser Ser Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Leu

115 120 125

Asp Tyr Ile Gln Leu Val Ser Ala Ile Glu

130 135

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

gtttaacttt aagaaggaga tataccatga cgaccgctgc tgtcagcacc 50

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

ctcgagtgcg gccgcaagct tctcgatggc ggagaccagc 40

<210> 5

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

atggcaggtg tgccgtttaa caccaaatac ccgtatggtc cgacctctat tgccgataat 60

cagtctgaag tgaccgcgat gctgaaagcg gaatgggaag attggaaaag caaacgcatt 120

acctctaacg gtgcgggcgg ctacaagcgc gtgcagcgtg atgcgtccac caattatgat 180

acggtgtccg aaggtatggg ctatggcctg ctgctggcgg tttgctttaa cgaacaggcg 240

ctgtttgatg atctgtaccg ttatgtgaaa tctcatttta atggcaacgg cctgatgcat 300

tggcatattg atgccaataa taatgtgacc agtcatgatg gcggcgatgg tgcggcaacc 360

gatgcggatg aagatattgc actggcgctg atttttgcgg ataaactgtg gggttcttcc 420

ggtgcaatta attacggcca ggaagcacgc accctgatta ataatctgta caatcattgt 480

gtggaacatg gctcctatgt gctgaagccg ggtgaccgct ggggcggttc ttctgtgacc 540

aacccgtctt attttgcgcc ggcatggtac aaagtgtatg cgcagtatac cggcgatacc 600

cgctggaatc aggtggcgga taaatgttac cagattgttg aagaagttaa gaaatataac 660

aacggcaccg gcctggttcc ggattggtgt accgcaagcg gcaccccggc aagcggtcag 720

agttatgatt ataaatatga tgcgacccgt tatggctggc gcaccgcggt ggattattct 780

tggtttggtg accagcgcgc gaaggcgaac tgcgatatgc tgaccaaatt ttttgcgcgc 840

gatggcgcaa aaggcatcgt tgatggctac accattcagg gctctaaaat tagcaacaat 900

cataacgcat cttttattgg cccggttgcg gcagcaagta tgaccggtta tgatctgaac 960

tttgcaaagg aactgtatcg cgaaaccgtt gcggtgaagg atagtgaata ttatggctat 1020

tatggcaaca gcttgcgcct gctgaccctg ctgtatatta ccggcaactt tccgaatccg 1080

ctgagtgatc tgtccggcca gccgacccca ccgtctaatc cgaccccgtc tctgccgccg 1140

caggttgttt acggcgatgt gaatggcgat ggcaatgtta actccaccga tctgaccatg 1200

ctgaaacgct acctgctgaa gagcgttacc aatattaacc gcgaagcggc ggatgttaat 1260

cgtgatggtg cgattaactc ctctgatatg accattctga aacgctatct gattaaaagc 1320

attccgcacc tgccgtat 1338

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

aaggagatat accatgggca gcagcgcagg tgtgccgttt aacac 45

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

cctggtgctg acagcagcgg tcgtaccacc accaccacca tacggcaggt gcggaatgc 59

<210> 8

<211> 2157

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

atgtcccgac gacgagcgag ttcgatgtgg agaggtgcgg cagtcgtcac ggcggtcgtg 60

ctgggcgggg cggtgatcgc tgcgccgccc gccgcggccg ccaccatcga caaggtcacg 120

gtcagccagg cgggctacag cgccagcggt tacaaggtcg gcttcgccgt cgccgacagc 180

gcagttccgg gttcgaccag ctgtcgcctg ctccagggcg agacggtcgt gctgccgtcc 240

tgcactcttc tggatcgcgg cacgacctgg ggcgaccgcg tgtatcaggt cgacttcagc 300

gcgttcgacg acgtcggcac cgacttcgcc ctcgagatcg ggggtgtgcg ctccccgcgc 360

ttcgcgatcg aagacaacgt ctggtccggc tacctcgatg agatgatcgc gttctacagg 420

ttgcaacgct cgggaatgga caccgaggat gcataccccg cgggctacag cagcatcgcc 480

ccgtccgaca aggtcttcca cgccgccggt catctcgacg atgccgcgtc cgaggacggc 540

acgcagcact acgacctcac gggtggctgg tacgacgccg gcgactacgg catctacggt 600

gggaaccagt gggtcgcggg gaacatcgcc atctcgtatc tgcgatacgg cgacacaccc 660

gcggtcgggt tcgacggcga ctcgaacggc gtgcccgatc tcgtcgacga ggcctggttc 720

ggcagcgagt acctgctccg gatgctggac gctttcgggg gcccgttctg ggatgtcaag 780

ggcagcggcg gcttccggca tcccgagttc cacaccgacg gcgtgatcgg aacggctgac 840

gaccgacgtg tctccggcat gggtgtgggc ggctcggcca aggcgtcggg ttcgctcgcc 900

gccacagcga gagcgatccg cgccgccatc gacagcggag acatcgacgc cggagccgcc 960

gcgtcctggg agacccgggc cgccgaggcc gaggaagcag cggtcgcgtt ctacgagtac 1020

gccgacacgc accgcggaga tccgctcggc gggtactcga ccacgcgcgg cggcatcgcc 1080

aactccctgc tgttcgccga agtgcagctc taccttctgt cgggcgacgc ggcgtatcgc 1140

acgtcggccg aagcgacgat cgccgcgacc ccgttcacga tcctgtccag tacgaactac 1200

tgggacatgg cgccgctgtc gatggctgag ctgtatcccg ctgcgacggc gaccggaaag 1260

atcaacatcc agcgttacct caagaagcag ctcgactacg tcctctcctc gaccgacgac 1320

accccctacg gcgtgatcaa ccagttcaag aacttcggtg tcaacgagcc gcacgtctcc 1380

tacatggccg acgcgctgcg ctactgggag ctgttcggag accagcgtgc cctgcgagcg 1440

gtgcagaagg gcctgtactg ggtgttcggc aacaacccgt gggggacgag ctgggtctcc 1500

ggcgtgggtg agaagcacac gatgttcctg cacacgcggc tcgacgagca ggcgcagacc 1560

cagggcggca cggggatcat cctgccgggg gcgctcgtct cgggaccgaa tgcgaaggac 1620

ccgctcgacg cgaccagtgc gagcccctgg tacgaagatc gtccaggctc cgccgatgtc 1680

ggtcagcagt ggcgatacaa cgagtacagc gtgagcatcc aggctgggct gttctcgtcc 1740

gtgttcgggc tcgccgccgc cggcgacgcg ccgtggtcca ccgggacacc gccgacggcg 1800

ctgaccatcg gatccccgaa gatcggccag tacgtcaccg gcgaggtgac cgtgttcgcg 1860

cagagcggct cctcgctcac ggcgcacgcg ctcggtccgg attggacgcc gatgacctcg 1920

tcggccggag tctcgaccgg tgtggtcgat gtgagcggcc ttgcgccgta cacgaacgcc 1980

cgtatcgacg tgcgcggcac gcaggcgagc ggtgcccaca gctacagctc tacgcactac 2040

accgtcgcgc cacccctgcc ggctcccgac gcgccgctgc tgtacgacgg cttcggtcgc 2100

gacggcctgt tcggcgtgca ggggtacacc tgggcgaatt ggtacaacaa ccatgcc 2157

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

catgccggtg gtggtggtgg tggtacgacc gctgctgtca g 41

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 10

ctcgagtgcg gccgcaagct ttcactcgat ggcggagacc agc 43

<210> 11

<211> 7528

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 11

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcagca gccatcatca tcatcatcac 5100

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat atggctagca tgactggtgg acagcaaatg 5160

ggtcgcggat ccgaattcat gtcccgacga cgagcgagtt cgatgtggag aggtgcggca 5220

gtcgtcacgg cggtcgtgct gggcggggcg gtgatcgctg cgccgcccgc cgcggccgcc 5280

accatcgaca aggtcacggt cagccaggcg ggctacagcg ccagcggtta caaggtcggc 5340

ttcgccgtcg ccgacagcgc agttccgggt tcgaccagct gtcgcctgct ccagggcgag 5400

acggtcgtgc tgccgtcctg cactcttctg gatcgcggca cgacctgggg cgaccgcgtg 5460

tatcaggtcg acttcagcgc gttcgacgac gtcggcaccg acttcgccct cgagatcggg 5520

ggtgtgcgct ccccgcgctt cgcgatcgaa gacaacgtct ggtccggcta cctcgatgag 5580

atgatcgcgt tctacaggtt gcaacgctcg ggaatggaca ccgaggatgc ataccccgcg 5640

ggctacagca gcatcgcccc gtccgacaag gtcttccacg ccgccggtca tctcgacgat 5700

gccgcgtccg aggacggcac gcagcactac gacctcacgg gtggctggta cgacgccggc 5760

gactacggca tctacggtgg gaaccagtgg gtcgcgggga acatcgccat ctcgtatctg 5820

cgatacggcg acacacccgc ggtcgggttc gacggcgact cgaacggcgt gcccgatctc 5880

gtcgacgagg cctggttcgg cagcgagtac ctgctccgga tgctggacgc tttcgggggc 5940

ccgttctggg atgtcaaggg cagcggcggc ttccggcatc ccgagttcca caccgacggc 6000

gtgatcggaa cggctgacga ccgacgtgtc tccggcatgg gtgtgggcgg ctcggccaag 6060

gcgtcgggtt cgctcgccgc cacagcgaga gcgatccgcg ccgccatcga cagcggagac 6120

atcgacgccg gagccgccgc gtcctgggag acccgggccg ccgaggccga ggaagcagcg 6180

gtcgcgttct acgagtacgc cgacacgcac cgcggagatc cgctcggcgg gtactcgacc 6240

acgcgcggcg gcatcgccaa ctccctgctg ttcgccgaag tgcagctcta ccttctgtcg 6300

ggcgacgcgg cgtatcgcac gtcggccgaa gcgacgatcg ccgcgacccc gttcacgatc 6360

ctgtccagta cgaactactg ggacatggcg ccgctgtcga tggctgagct gtatcccgct 6420

gcgacggcga ccggaaagat caacatccag cgttacctca agaagcagct cgactacgtc 6480

ctctcctcga ccgacgacac cccctacggc gtgatcaacc agttcaagaa cttcggtgtc 6540

aacgagccgc acgtctccta catggccgac gcgctgcgct actgggagct gttcggagac 6600

cagcgtgccc tgcgagcggt gcagaagggc ctgtactggg tgttcggcaa caacccgtgg 6660

gggacgagct gggtctccgg cgtgggtgag aagcacacga tgttcctgca cacgcggctc 6720

gacgagcagg cgcagaccca gggcggcacg gggatcatcc tgccgggggc gctcgtctcg 6780

ggaccgaatg cgaaggaccc gctcgacgcg accagtgcga gcccctggta cgaagatcgt 6840

ccaggctccg ccgatgtcgg tcagcagtgg cgatacaacg agtacagcgt gagcatccag 6900

gctgggctgt tctcgtccgt gttcgggctc gccgccgccg gcgacgcgcc gtggtccacc 6960

gggacaccgc cgacggcgct gaccatcgga tccccgaaga tcggccagta cgtcaccggc 7020

gaggtgaccg tgttcgcgca gagcggctcc tcgctcacgg cgcacgcgct cggtccggat 7080

tggacgccga tgacctcgtc ggccggagtc tcgaccggtg tggtcgatgt gagcggcctt 7140

gcgccgtaca cgaacgcccg tatcgacgtg cgcggcacgc aggcgagcgg tgcccacagc 7200

tacagctcta cgcactacac cgtcgcgcca cccctgccgg ctcccgacgc gccgctgctg 7260

tacgacggct tcggtcgcga cggcctgttc ggcgtgcagg ggtacacctg ggcgaattgg 7320

tacaacaacc atgccggtgg tggtggtggt aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac 7380

caccaccact gagatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc 7440

accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt 7500

ttgctgaaag gaggaactat atccggat 7528

Claims

1.一种基因，其特征在于，为1a)～2a)中的一种：

1a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2.权利要求1所述基因编码的碳水化合物结合模块蛋白质，其特征在于：为1b)～3b)中的一种：

1b)具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质；

3.权利要求2所述的碳水化合物结合模块蛋白质与碳水化合物活性酶构建的融合表达载体。

4.根据权利要求3所述的融合表达载体，其特征在于，所述碳水化合物活性酶包括糖苷水解酶类、糖基转移酶类、多糖裂解酶类或糖酯酶类。

5.根据权利要求4所述的融合表达载体，其特征在于，所述糖苷水解酶包括纤维素内切酶和黄原胶内切酶。

6.一种含有权利要求3～5中任一项所述融合表达载体的重组表达菌。

7.权利要求2所述的碳水化合物结合模块在识别黄原胶侧链、降解黄原胶制备黄原胶寡糖中的应用。