CN101532016B - 一段dna分子、含有该dna分子的重组表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一段DNA分子。该DNA分子是如下1)-3)中任一所述的DNA分子：1)由序列表中序列1所示的脱氧核糖核苷酸序列组成的DNA分子；2)在严格条件下可与1)限定的DNA序列杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能促进目的基因转录和翻译的DNA分子。利用该DAN分子构建的重组表达载体不仅适用于低分子量谷蛋白亚基基因的表达，还适用于用常规载体不能表达的、具有与低分子量谷蛋白亚基类似结构的特殊基因的原核表达，同时也适用于其他普通基因的原核表达。这将为低分子量谷蛋白亚基的结构与功能鉴定提供支持，对小麦的品质改良具有重要的现实意义。

Description

一段DNA分子、含有该DNA分子的重组表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及一段DNA分子、含有该DNA分子的重组表达载体及其应用。

背景技术

小麦低分子量谷蛋白占胚乳贮藏蛋白含量的40％，占谷蛋白含量的60-70％，是胚乳中含量最丰富的蛋白质组成成分，在面团中起“骨架”的作用，并赋予面包、面条以及其他专用食品所需的粘弹性，对小麦品质有重要作用。由于小麦低分子量谷蛋白在组成上具有高度的异质性和复杂性，分离、分析比较困难，加上目前尚不成熟的生物学鉴定技术，严重制约了人们对低分子量谷蛋白的研究。

迄今为止，已经从小麦及其近缘种中克隆到至少80个具有完整编码框的低分子量谷蛋白基因，由于亚基鉴定及分离极其困难，甚至不可行，只能根据不完善的理论推测基因的功能。实验证明，这种方法是不可靠的，容易对生产实践造成误导。因此必须采用实验手段对低分子量谷蛋白亚基(LMW-GS)的结构与功能进行鉴定。

低分子量谷蛋白亚基结构与功能的鉴定是建立在分离到单个亚基的基础之上，目前有两种分离低分子量谷蛋白亚基的方法：第一种方法是利用SDS-PAGE、2-DE和MS技术，先将低分子量谷蛋白基因编码的亚基鉴定出来(Li et al.，Cloning andcharacterization of a novel at the Glu-A3 locus from wild emmer wheat(Triticumturgidum L.var.dicoccoides).Euphytica.2008.159：181-190.)，再通过SDS-PAGE多次回收，富集目的亚基。这种方法的工作量大、程序繁琐、耗费大，且分离到的亚基不纯(实验证明SDS-PAGE上的单一蛋白条带往往被2-DE分离出多个蛋白质组分)。第二种方法是利用体外表达体系，将克隆到的低分子量谷蛋白亚基基因表达出来，一方面利用诱导蛋白将胚乳中的内源蛋白亚基鉴定出来(Li et al.，Molecularcloning，heterologous expression，and phylogenetic analysis of a novel y-type HMWglutenin subunit gene from the G genome of Triticum timopheevi.Genome.2007.50：1130-1140.)；另一方面，直接富集诱导蛋白用于亚基功能鉴定(Xu et al.，Functional properties of a new low-molecular-weight glutenin subunit gene from a breadwheat cultivar.Theor.Appl.Genet.2006.113：1295-1303)。与前者相比，这种方法操作简便、成本低廉、易操作、结果可靠。然而，制约该方法广泛应用的瓶颈因素是：与一般真核基因相比，低分子量谷蛋白亚基基因由于其结构的复杂性，利用现有的体外表达载体很难获得稳定的、高表达量的蛋白，而低表达量的蛋白又不足以用配粉实验鉴定它的功能以及进一步研究其分子结构。

发明内容

本发明的目的是提供一段DNA分子、含有该DNA分子的重组表达载体以及该载体的应用。

本发明所提供的DNA分子，是如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)由序列表中序列1所示的脱氧核糖核苷酸序列组成的DNA分子；

2)在严格条件下可与1)限定的DNA序列杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能促进目的基因转录和翻译的DNA分子。

所述3)中的DNA分子，与1)的DNA分子最好有95％以上的同源性。

为了便于将所述DNA分子连入表达载体中，所述DNA分子的上游和下游还分别包括一个酶切位点，所述DNA分子上游的酶切位点为NdeI酶切位点，所述DNA分子下游的酶切位点为NcoI酶切位点。

为了使所述目的基因编码的蛋白更容易检测，所述DNA分子中还包括组氨酸编码序列，所述组氨酸编码序列位于所述DNA分子和其下游的酶切位点之间。

上述DNA分子中还包括凝血酶酶切位点，用于将所述组氨酸编码序列和所述DNA分子切除；所述凝血酶酶切位点位于所述组氨酸编码序列和其下游的酶切位点之间。

具体的，所述DNA分子是如下1)-3)中任一所述的DNA分子：

1)由序列表中序列2所示的脱氧核糖核苷酸序列组成的DNA分子；

2)在严格条件下可与1)限定的DNA序列杂交且能促进目的基因转录和翻译的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且能促进目的基因转录和翻译的DNA分子。

所述3)中的DNA分子，与1)的DNA分子最好有95％以上的同源性。

含有上述DNA分子的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体的出发载体为pET-30a，所述重组表达载体的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示。

含有上述重组表达载体的转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组菌是将所述重组表达载体导入大肠杆菌中得到的重组菌。

所述重组表达载体可用于促进目的基因的转录和翻译。

所述目的基因具体可为低分子量谷蛋白亚基的编码基因。

本发明的另一个目的是提供一种制备低分子量谷蛋白亚基的方法。

本发明所提供的制备低分子量谷蛋白亚基的方法，是发酵培养所述重组菌，得到低分子量谷蛋白亚基。

目前，低分子量谷蛋白亚基基因的原核表达极其困难，存在表达效率低、表达量低和不稳定表达等致命问题，限制了低分子量谷蛋白亚基的应用。本发明克服了低分子量谷蛋白亚基基因体外表达的难题，成功地在原核表达载体中表达了多个低分子量谷蛋白亚基基因，且表达量足以达到用配粉实验鉴定它的功能以及进一步研究其分子结构。本发明获得的重组表达载体不仅适用于低分子量谷蛋白亚基基因的表达，还适用于用常规载体不能表达的、具有与低分子量谷蛋白亚基类似结构的特殊基因的原核表达，同时也适用于其他普通基因的原核表达。这将为低分子量谷蛋白亚基的结构与功能鉴定提供支持，对小麦的品质改良具有重要的现实意义。

附图说明

图1为人工合成的促进目的基因转录和翻译的DNA分子的结构示意图。

图2为重组表达载体的结构示意图。

图3为SDS-PAGE鉴定AmLMW-m1的表达。

图4为SDS-PAGE和Western-blot验证ZyLMW-m1和ZyLMW-m2的表达。

图5为重组表达载体表达水平的鉴定。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、重组表达载体的构建

1、DNA分子的合成

人工合成一段DNA分子，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示(即序列表中序列3的自5′末端第5079-5184位)。序列表中序列2的自5′末端第1-6位为NdeI酶切位点，第7-63位为促进目的基因转录和翻译的DNA分子(其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示)，第64-81位为组氨酸编码序列，第82-99位为凝血酶酶切位点，第100位为消除移码突变而添加的一个碱基，第101-106位为NcoI酶切位点。所合成的DNA分子的结构示意图如图1所示。其中，1为NdeI酶切位点，2为促进目的基因转录和翻译的DNA分子，3为组氨酸编码序列，4为凝血酶酶切位点，5为为了消除移码突变而添加的一个碱基G，6为NcoI酶切位点。

NdeI和NcoI酶切位点可以确保将促进目的基因转录和翻译的DNA分子准确地插入到pET-30a载体中；组氨酸编码序列用于检测目的基因编码蛋白的可靠性；凝血酶酶切位点用于将组氨酸编码序列和目的基因切除，以获得完整插入序列的目的基因编码蛋白。

2、重组表达载体的构建

将上述步骤1合成的DNA分子与pMD19-T克隆载体相连接，16℃保温30分钟获得重组载体。将获得的重组载体转入大肠杆菌DH-5α的感受态细胞中，得到重组菌。将获得的重组菌用下列引物进行菌落PCR扩增：

F引物：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；

R引物：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’。

检测重组载体中插入片段的长度，筛选出含有目的基因(步骤1中合成的DNA分子)长度的插入片段的阳性克隆。

挑取含有目的基因的单菌落接种于含有80μl/ml Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。将菌液移至1.5ml的离心管中，12000rpm离心2分钟，弃上清，收集菌体。提取质粒进行测序，测序结果表明，该质粒的序列与设计的序列完全相符。

将测序结果正确的质粒用Nde I和Nco I进行双酶切，回收酶切产物与用相同酶切的质粒pET-30a相连接，获得重组表达载体EP-1，将该重组表达载体EP-1转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞。提取质粒进行测序，测序结果表明，所获得的重组表达载体EP-1的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示。该重组表达载体EP-1的结构示意图如图2所示。其中，1为T7启动子，2为Lac操纵子，3为Nde I酶切位点，4为促进目的基因转录和翻译的DNA分子，5为组氨酸编码序列，6为凝血酶酶切位点，7为为了消除移码突变而添加的一个碱基G，8为NcoI酶切位点，9为多克隆位点，10为终止密码子，11为T7终止子。

实施例2、LMW-GS基因AmLMW-m1的表达与鉴定

以克隆自尾状山羊草PI254863中的基因AmLMW-m1为材料，对上述实施例1获得的重组表达载体EP-1的有效性作初步验证，同时以不含有上述实施例1中步骤1合成的DNA分子的质粒pET-30a作为对照。

提取尾状山羊草PI254863的基因组DNA并以其为模板，对AmLMW-m1基因(AmLMW-m1基因在NCBI基因库的登录号为EU329425)进行PCR扩增。设计引物去掉信号肽，并在Forward和Reverse引物的5’端分别加上EcoR I和Xho I酶切位点，使扩增片段能插入正确的阅读框，引物序列如下：

Forward：5’-ACAGAATTCATGGAGACTAGCTGC-3’，

Reverse：5’-AAACTCGAGGTAGGCACCAACTC-3’。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA凝胶纯化回收试剂盒(购自Takara公司)将特异性条带纯化回收。将回收的PCR产物用EcoR I和Xho I进行双酶切，酶切产物分别与用相同酶切的上述实施例1获得的重组表达载体EP-1和用相同酶切的质粒pET-30a按照3∶1的质量比混合，加入T4DNA连接酶(购自Promega公司)，4℃连接过夜。

取上述连接产物，分别转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选和卡那霉素(Kana)抗性筛选。分别挑取白色单菌落接种于含又Kana(10ug/ml)的LB培养基中，37℃培养过夜，碱裂解法小量制备质粒，取质粒分别进行酶切鉴定(EcoR I和Xho I)，以确定AmLMW-m1基因已分别连接到表达载体EP-1和pET-30a上，将获得的重组表达载体分别命名为EP-1-AmLMW-m1和pET-30a-AmLMW-m1。

将上述重组表达载体EP-1-AmLMW-m1和pET-30a-AmLMW-m1分别转化大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞，挑取白色单菌落接种于含Kana(10μg/ml)的LB培养基中培养过夜，获得饱和培养物；取饱和培养物100μl加入到10ml含Kana(10ug/ml)的LB培养基中，37℃条件下150rpm摇培约4小时，直至OD₆₀₀＝0.6，向其中加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，使其在菌液中终浓度为0.5mmol/L，在相同条件下继续培养3小时。

上述诱导培养结束后，取1.8ml菌液于2.0ml eppendorf离心管中，10000rpm离心5min，去上清；加入120μl异丙醇，充分涡漩后，加入DTT，使其终浓度为1％；65℃水浴60min，然后12000rpm离心5min，取上清；再加入等体积的1×Loadingbuffer，65℃水浴30min，取10μl进行SDS-PAGE电泳。

结果如图3所示。其中，泳道1-3均为含有重组表达载体EP-1-AmLMW-m1的大肠杆菌中目的蛋白的检测结果，泳道4为含有重组表达载体pET-30a-AmLMW-m1的大肠杆菌中目的蛋白的检测结果。

实验设三次重复，结果表明，重组表达载体EP-1-AmLMW-m1中AmLMW-m1基因编码的蛋白已经表达；而重组表达载体pET-30a-AmLMW-m1中却没有AmLMW-m1基因编码蛋白的表达。

实施例3、LMW-GS基因ZyLMW-m1和ZyLMW-m2的表达与鉴定

以来自面包小麦中优9507中的基因ZyLMW-m1和ZyLMW-m2为材料，对上述实施例1获得的重组表达载体EP-1的有效性作进一步验证，同时以不含有上述实施例1中步骤1合成的DNA分子的质粒pET-30a作为对照。

提取面包小麦中优9507的基因组DNA并以其为模板，分别对ZyLMW-m1基因和ZyLMW-m2基因(ZyLMW-m1基因和ZyLMW-m2基因在NCBI基因库的登录号分别为EU329426和EU329427)进行PCR扩增。设计引物去掉信号肽，并在Forward和Reverse引物的5’端分别加上EcoR I和Xho I酶切位点，使扩增片段能插入正确的阅读框，引物序列如下：

Forward：5’-ACAGAATTCATGGAGACTAGATGC-3’，

Reverse：5’-AAACTCGAGGTAGGCACCAACTC-3’。

将PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA凝胶纯化回收试剂盒(购自Takara公司)将特异性条带纯化回收。将回收的PCR产物分别用EcoR I和Xho I进行双酶切，酶切产物分别与用相同酶切的上述实施例1获得的重组表达载体EP-1和用相同酶切的质粒pET-30a按照3∶1的质量比混合，加入T4DNA连接酶(购自Promega公司)，4℃连接过夜。

取上述连接产物，分别转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选和卡那霉素(Kana)抗性筛选。分别挑取白色单菌落接种于含又Kana(10ug/ml)的LB培养基中，37℃培养过夜，碱裂解法小量制备质粒，取质粒分别进行酶切鉴定(EcoR I和Xho I)，以确定ZyLMW-m1基因、ZyLMW-m2基因已分别连接到表达载体EP-1和pET-30a上，将获得的重组表达载体分别命名为EP-1-ZyLMW-m1、EP-1-ZyLMW-m2、pET-30a-ZyLMW-m1和pET-30a-ZyLMW-m2。

将上述重组表达载体EP-1-ZyLMW-m1、EP-1-ZyLMW-m2、pET-30a-ZyLMW-m1和pET-30a-ZyLMW-m2分别转化大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞，挑取白色单菌落接种于含Kana(10μg/ml)的LB培养基中培养过夜，获得饱和培养物；取饱和培养物100μl加入到10ml含Kana(10ug/ml)的LB培养基中，37℃条件下150rpm摇培约4小时，直至OD₆₀₀＝0.6，向其中加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，使其在菌液中终浓度为0.5mmol/L，在相同条件下继续培养3小时。

上述诱导培养结束后，取1.8ml菌液于2.0ml eppendorf离心管中，10000rpm离心5min，去上清；加入120μl异丙醇，充分涡漩后，加入DTT，使其终浓度为1％；65℃水浴60min，然后12000rpm离心5min，取上清；再加入等体积的1×Loadingbuffer，65℃水浴30min，取10μl进行SDS-PAGE电泳。

结果如图4a所示。其中，泳道1为含有重组表达载体pET-30a-ZyLMW-m1的大肠杆菌中目的蛋白的检测结果，泳道2为含有重组表达载体EP-1-ZyLMW-m1的大肠杆菌中目的蛋白的检测结果，泳道3为含有重组表达载体EP-1-ZyLMW-m2的大肠杆菌中目的蛋白的检测结果。

实验设三次重复，结果表明，重组表达载体EP-1-ZyLMW-m1或EP-1-ZyLMW-m2中ZyLMW-m1或ZyLMW-m2基因编码的蛋白均已经表达；而重组表达载体pET-30a-ZyLMW-m1或pET-30a-ZyLMW-m2中却没有ZyLMW-m1或ZyLMW-m2基因编码蛋白的表达。

由于重组表达载体EP-1-ZyLMW-m1或EP-1-ZyLMW-m2中含有组氨酸标签，故原核表达产物是含有六个组氨酸的融合蛋白，利用特异性高的抗His标签的单克隆鼠抗体(购自北京康为世纪生物科技有限公司)进行Western-blot杂交。

结果如图4b所示。其中，泳道1为含有重组表达载体pET-30a-ZyLMW-m1的大肠杆菌中目的蛋白的检测结果，泳道2为含有重组表达载体EP-1-ZyLMW-m1的大肠杆菌中目的蛋白的检测结果，泳道3为含有重组表达载体EP-1-ZyLMW-m2的大肠杆菌中目的蛋白的检测结果。

实验设三次重复，结果表明，重组表达载体EP-1-ZyLMW-m1或EP-1-ZyLMW-m2中ZyLMW-m1或ZyLMW-m2基因编码的蛋白均已经表达；而重组表达载体pET-30a-ZyLMW-m1或pET-30a-ZyLMW-m2中却没有ZyLMW-m1或ZyLMW-m2基因编码蛋白的表达。

SDS-PAGE和Western-blot实验均证明了ZyLMW-m1和ZyLMW-m2基因可以利用重组表达载体EP-1进行表达。

实施例4、重组表达载体表达水平的鉴定

以上述实施例3中含有ZyLMW-m1基因的重组表达载体EP-1-ZyLMW-m1为实验材料，鉴定ZyLMW-m1基因编码蛋白的表达情况。

按照上述实施例2中的方法诱导和提取目的蛋白，取10μl进行SDS-PAGE电泳，同时电泳5μl蛋白Marker(购自天根公司)，电泳的结果如图5所示。其中，泳道1为ZyLMW-m1基因编码蛋白的表达情况，泳道2为蛋白Marker。将电泳的图片扫描后用AlphaEaseFC软件进行分析。

实验设三次重复，结果表明，重组表达载体EP-1-ZyLMW-m1所表达的目的蛋白的浓度高达40-50mg/L。根据这一结果，一次诱导1.5L菌液，从中提取的LMW-GS就可以满足3次重复配粉功能鉴定实验的需求(10g标准粉添加25mg目的蛋白)。

序列表

<160>3

<210>1

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

aagaccttcc tcgtctttgc cctcctcgcc gttgtggcga caagtgccat tgcgcag        57

<210>2

<211>106

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

catatgaaga ccttcctcgt ctttgccctc ctcgccgttg tggcgacaag tgccattgcg     60

cagcaccatc atcatcatca tctggtgcca cgcggttctg ccatgg                   106

<210>3

<211>5395

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg     60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc    120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg    180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc    240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt    300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc    360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta    420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt    480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta    540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat    600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa    660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc    720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga    780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc     840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac     900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac     960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat    1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag    1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca    1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac    1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg    1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca    1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac    1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa    1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga    1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg    1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc    1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag    1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc    1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg    1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac    1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga    1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt    1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag    2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg    2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta    2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc    2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg    2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta    2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg    2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct    2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag    2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc    2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag    2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt    2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa    2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg    2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg    2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc    2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta    3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca    3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc    3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc    3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa    3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc    3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac    3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca    3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta    3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa    3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat    3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca    3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa    3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt    3780

atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg    3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca    3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta    3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg    4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat    4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct    4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg    4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat    4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc    4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca    4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg    4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt    4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg    4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct    4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga    4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg    4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc    4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg    4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg    4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga tctcgatccc    4980

gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa    5040

ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgca tatgaagacc ttcctcgtct    5100

ttgccctcct cgccgttgtg gcgacaagtg ccattgcgca gcaccatcat catcatcatc    5160

tggtgccacg cggttctgcc atggctgata tcggatccga attcgagctc cgtcgacaag    5220

cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac caccactgag atccggctgc taacaaagcc    5280

cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg    5340

gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggat         5395

Claims (7)

1.一段DNA分子，是由序列表中序列1所示的脱氧核糖核苷酸序列组成的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的上游和下游还分别包括一个酶切位点，所述DNA分子上游的酶切位点为NdeI酶切位点，所述DNA分子下游的酶切位点为NcoI酶切位点；

所述DNA分子中还包括组氨酸编码序列，所述组氨酸编码序列位于权利要求1所述DNA分子和其下游的酶切位点之间；

所述DNA分子中还包括凝血酶酶切位点，所述凝血酶酶切位点位于所述组氨酸编码序列和其下游的酶切位点之间；

所述DNA分子是由序列表中序列2所示的脱氧核糖核苷酸序列组成的DNA分子。

3.含有权利要求1或2所述DNA分子的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的出发载体为pET-30a，所述重组表达载体的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示。

4.含有权利要求3所述重组表达载体的转基因细胞系。

5.含有权利要求3所述重组表达载体的重组菌。

6.权利要求1或2所述的DNA分子或权利要求3所述的重组表达载体在促进目的基因转录和翻译中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述目的基因为低分子量谷蛋白亚基的编码基因。

Images