KR100902634B1 - 재조합 ｈｍｇｂ1 펩티드를 포함하는 핵산 전달 복합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 HMGB-1(high mobility group box-1) 펩티드로 구성된 핵산 전달 펩티드, 이를 포함하는 펩티드-핵산 복합체 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 핵 단백질의 일종인 야생형의 HMGB-1 단백질보다 DNA 결합 능력이 개선된 재조합 핵산 전달 펩티드에 관한 것으로서, 본 발명에 따라 제조되는 재조합 핵산 전달 펩티드는 세포 표면의 리셉터와 결합하는 성질, 높은 효율로 DNA와 결합하는 성질 및 핵 단백질 특유의 핵으로의 이동성 (nuclear localization) 성질을 가지므로 핵산을 핵으로 원활하게 전달할 수 있다.

유전자 전달, HMGB-1

Description

재조합 ＨＭＧＢ1 펩티드를 포함하는 핵산 전달 복합체{NUCLEIC ACID DELIVERY COMPLEX COMPRISING RECOMBINANT HMGB-1 PEPTIDE}

도1은 야생형 HMGB-1 (high mobility group box-1) 단백질의 구조와 재조합 HMGB-1 펩티드의 구조를 비교하여 나타낸 모식도이다.

도 2는 재조합 HMGB-1 펩티드의 발현 벡터인 플라스미드의 구조를 나타내는 모식도이다.

도 3a는 재조합 HMGB-1 펩티드의 용출을 도시한 것이고, 3b는 동 펩티드를 SDS-PAGE 겔 상에서 전개한 사진이다. 사진에서 레인(lane) 1은 단백질 사이즈 마커, 레인 2는 단백질(HMGB-1) 발현 전, 레인 3은 단백질(HMGB-1) 발현 후, 레인 4는 순수 분리 정제된 단백질.

도 4는 겔 리타데이션 검정 (Gel retardation assay) 결과를 나타내는 사진이다. 위의 숫자는 DNA와 펩티드 사이의 중량비를 나타낸다.

도 5 및 6은 본 발명의 HMGB-1의 핵산 전달 효과를 확인하기 위하여 본 발명의 펩티드 또는 대조군 폴리펩티드를 전달체로 사용하여 루시퍼라제 DNA 트렌스펙션을 수행한 후 루시퍼라제 활성을 측정하여 표시한 그래프이다. 도 5는 DNA와 본 발명의 펩티드의 중량비의 변화에 따른 트렌스펙션 효율을 나타낸다. 도 6은 폴리-L-리신 (Poly-l-Lysin; PLL)과 본 발명의 폴리펩티드의 트렌스펙션 효율을 비교하 여 나타낸다.

도 7과 8은 본 발명의 폴리펩티드의 세포독성 유무를 실험한 MTT 검정 결과를 나타내는 그래프이다. 도 7은 본 발명의 펩티드의 세포 독성을 PLL의 독성과 비교하여 도식한 것이다. 도 8은 최적 핵산 전달 조건에서의 본원 펩티드/DNA 복합체의 독성을 대조군 및 PLL/DNA 복합체의 독성과 비교한 막대 그래프이다.

(기술분야)

본 발명은 재조합 HMGB-1(high mobility group box-1) 펩티드로 구성된 핵산 전달 펩티드, 이를 포함하는 펩티드-핵산 복합체 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 핵 단백질의 일종인 야생형의 HMGB-1 단백질의 핵산 전달 능력을 개선하기 위하여 그 유전자 수준에서 C-말단의 산성박스를 결실시켜 야생형보다 DNA 결합 능력이 개선된 재조합 핵산 전달 펩티드를 제조하는 방법 및 그 펩티드에 관한 것이다.

(종래기술)

DNA 재조합 기술의 발달로 외래의 핵산을 세포 내 또는 시험관 내에서 발현시키는 기술이 상용화되었으며, 이 같은 기술을 이용하여 세포 제어의 관찰, 재조합 단백질의 대량 생산, 유전자의 클로닝, 결실되거나 존재하지 않는 유전자의 교체 또는 세포 제어의 저해나 활성화 등 다양한 활용이 가능하게 되었다.

그 중에서도 환자가 가진 특정 유전자의 이상으로 인한 질병의 치료를 위하여 환자의 특정 세포 내에 있는 유전자를 조작하는 치료법인 유전자 치료는 질병의 새로운 치료 방법으로서 제시되어 지난 십 수년간 다양한 방법의 유전자 전달 수단의 연구가 이루어지고 있다. 유전자 치료를 위한 다양한 방법들이 저명한 저널에서 제시되어 있다. (예를 들어, Mountain, Trends in Biotech., 18:119-128, 2000; Romano et al. Stem Cells, 18:19-39, 2000 등 참조)

유전자 치료의 핵심적인 요소는 치료 효과를 나타내는 치료 유전자와 치료 유전자를 안전하고 효율적으로 인체에 전달해 줄 수 있는 유전자 전달체 (또는 전달 물질 또는 시스템)이다. 유전자 전달 시스템의 선택은 치료 유전자를 표적기관에 효과적으로 전달하는 문제와 그 유전자가 적당한 세포에 거부반응 없이 받아들여져 발현을 일으켜 목적하는 치료 효과를 거두는 문제에 관한 것이다. 실제로 유전자 치료의 성공을 위하여 새로운 전달 시스템을 개발하는 것이 유전자 치료 분야에서 주요 문제로 인식되어 있다. (예를 들어, Wilson et al. Nature, 365, 691, 1993; Rolland, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 15:143-198, 1998 등 참조) 이러한 유전자 전달체 또는 시스템은 경우에 따라 '벡터'라는 용어를 사용하여 지칭되기도 한다.

숙주에 대한 감염성이 그 속성인 바이러스를 변형하여 병원성을 제거하고 전달 유전자를 삽입하여 제조되는 바이러스성 벡터는 그 모체가 되는 바이러스의 종류에 따라, 아데노 바이러스, 레트로바이러스, AAV (adeno-associated virus) 벡터 등이 있다. 이들 바이러스성 벡터는 바이러스의 속성이 감염성이기 때문에 유전자 를 전달하는 효율은 우수하지만 숙주의 염색체 내에 삽입되었을 때 돌연변이 유발 가능성이 높고, 따라서 감염성 바이러스의 생성 가능성 및 숙주 내 염증 반응 유발 등의 위험요소가 많아 그 사용이 제한적이다. (예를 들어, Kremer et al., British Medical Bulletin 51:31-44, 1995; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807-838, 1995 참조)

이 같은 문제점을 피하기 위하여 바이러스성 벡터에 대한 대안으로 개발되어 온 비바이러스성 유전자 전달 시스템은 물리적 전달 방법에 의하며 리포좀 전달체 및 고분자 전달체로 대별된다. 이 같은 비바이러스성 벡터들은 안전성이 뛰어나고 전달 유전자의 크기에 따른 제한이 없다는 장점이 있다. 그러나, 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터와 비교하면 유전자 전달 효율이 낮다는 문제점이 있다.

한편, 고분자 전달체로 현재 많이 연구되고 있는 것은 Poly-L-lysine (PLL) 또는 Poly(ethylenimine) (PEI) 등이다. 그러나 PEI 등은 세포에서 독성이 높다는 이유 때문에 임상에서 사용에 어려움이 있기 때문에 보다 독성이 낮고 안전한 비바이러스성 전달체에 대한 요구는 여전히 높다.

비바이러스성 유전자 전달체가 성공적이기 위해서는 유전자-전달체 복합체를 주의 깊게 구성하는 것이 중요한데, 이는 바이러스 유전자 송달의 유리한 측면이 비바이러스성 전달체에서 나타날 수 있도록 벡터를 구성하는 것을 포함한다. 히스톤은 핵단백질로서 핵에서 DNA와 효과적으로 결합하며 DNA를 응축시키는 역할을 하기 때문에 유전자 전달체 물질로서 고려되어 왔다. DNA 트랜스펙션에서 히스톤의 효율에 관한 보고도 있다. (예를 들어, Balicki and Beutler, Mol. Med., 3:782- 787, 1997; Chen et al., Hum Gene Ther., 5:429-435, 1994; Fritz et al., Hum. Gene Ther., 7:1395-1404, 1996 등 참조)

한편, 본 발명자들은 핵 단백질인 히스톤과 유사하게 DNA와 효과적으로 결합하는 또 다른 핵 단백질인 HMGB-1(high mobility group box-1) 단백질이 놀랍게도 유전자 치료에 있어서 핵산 전달체로서 사용될 수 있는 가능성을 발견하였다.

아래 표는 히스톤과 HMGB-1 단백질을 핵산 전달체로서의 성질 관점에서 비교한 것이다.

	HMGB-1	히스톤	효과
비특이적 DNA 결합	○	○	DNA와 복합체 형성
핵으로의 이동성 (nuclear localization)	○	○	DNA를 세포핵 내로 전달
세포막 표면에 리셉터 존재 여부	○	×	레셉터 매개 endocytosis를 통한 원활한 유전자 전달

특히, HMGB-1은 핵산 전달체로서 히스톤이 가지고 있지 않은 장점을 더 갖는다. 즉, HMGB-1은 세포 밖에서 시토카인 (cytokine)으로 작용하며, 세포막 표면에 있는 HMGB-1 리셉터에 결합하는 성질이 있다. 이 성질 때문에 히스톤보다 높은 효율로 핵산을 세포 내로 전달할 수 있으며, 이와 같이 일단 세포 내로 전달된 핵산-전달체 복합체는 핵단백질 고유의 핵으로의 이동성 성질에 의하여 효율적인 핵산 전달이 가능하게 된다.

그러나, 야생형 HMGB-1은 C-말단 부분에 존재하는 음전하의 아미노산들이 풍부한 도메인 (C-말단의 산성박스)으로 인하여 핵산에 대한 전기적 결합력이 약한 문제점이 있다. 이에, 본 발명자들은 야생형 HMGB-1의 핵산에 대한 결합력을 증가시키기 위하여 재조합 기술을 통하여 유전자 수준에서 C-말단의 산성박스를 결실시 켜 재조합 HMGB-1 펩티드를 제조하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따르는 재조합 HMGB-1 펩티드는 야생형에 비하여 핵산 결합 능력은 월등하면서도 야생형이 갖는 핵산 전달 능력은 보유하는 우수한 핵산 전달체이다.

본 발명은 핵단백질인 HMGB-1의 C-말단 산성박스를 제거하여, 면역반응과 세포독성이 현저히 낮고, 강한 DNA 결합력을 갖는 핵산 전달체인 재조합 HMGB-1 펩티드, 이것과 전달 핵산의 결합체 및 그 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 야생형 HMGB-1(high mobility group box-1) 단백질의 C-말단 산성 박스가 제거된 재조합 HMGB-1 펩티드로 구성된 새로운 핵산 전달 펩티드, 이를 포함하는 펩티드-핵산 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 새로운 펩티드의 제조 방법을 제공한다.

이하에서는 본 발명을 더 구체적으로 설명한다.

본 발명은 핵 단백질의 일종인 야생형의 HMGB-1 단백질의 핵산 전달 능력을 개선하기 위하여 그 유전자 수준에서 C-말단의 산성박스를 결실시키는 새로운 방법을 사용하여 야생형보다 DNA 결합 능력이 개선된 재조합 핵산 전달 펩티드를 제조함으로써 기존의 고분자 핵산 전달체보다 독성이 낮아 안전한 비바이러스성 핵산 전달 펩티드를 제공한다.

상기에서 야생형 HMGB-1 단백질은 HMGB 박스 A, HMGB 박스 B, 및 산성 박스 의 세 부분으로 이루어진다. (도 1a 참조) 본 발명의 재조합 펩티드 제작의 재료가 되는 모 HMGB-1 단백질은 SEQ ID NO:3의 염기서열에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그 서열과 균등한, 개체별 다형성을 갖는 단백질일 수 있다. 상기 야생형 HMGB-1 단백질은 인간 기원의 HMGB-1이 바람직하다.

재조합 핵산 전달 펩티드는 상기 야생형 HMGB-1 단백질 중 상기 C-말단의 산성박스가 결여된 형태의 폴리펩티드이다.

본 발명의 한 양태는 핵 단백질인 HMGB-1(high mobility group box-1) 단백질 중 C-말단의 산성박스가 결실된 재조합 HMGB-1 펩티드로 구성된 핵산 전달 펩티드이다.

본 발명의 다른 양태에서는 상기 재조합 HMGB-1펩티드는 SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 핵산 전달 펩티드가 제공된다. 재조합 HMGB-1 펩티드는 야생형 HMGB-1과 비교하여 우수한 핵산 결합력을 지닌다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 상기 핵산 전달 펩티드와 전달하고자 하는 핵산이 결합하여 이루어진 핵산 전달 복합체가 제공된다. 재조합 HMGB-1 펩티드와 DNA 결합 실험을 통하여 결합을 확인하고 최적의 결합을 위한 비율을 산출한다. (도 4 참조)

본 발명의 다른 양태에서, 상기 핵산 전달 복합체는 핵산 전달 펩티드:핵산의 혼합 중량 비율이 5:1 내지 40:1이다. 특히 바람직하게는 핵산 전달 펩티드: 핵산 혼합 중량 비율은 30:1이다. (도 5 참조)

루시퍼라제 및 GFP 발현벡터를 리포터 유전자로 사용하여 본 발명의 핵산 전 달 펩티드의 최적 핵산 전달 조건을 결정하는 한편, 종래 상업적 비바이러스성 전달체와 그 전달 효율을 확인한다. 또한 MTT 검정을 통하여 농도 증가에 따른 세포 독성 및 종래 핵산 전달체와 비교한 독성 정도를 확인한 결과, 본 발명의 핵산 전달 펩티드는 사용 가능한 수준의 핵산 전달 효율을 보이면서도 세포 독성은 유의하게 낮은 것으로 나타났다.

본 발명의 다른 양태에서는 본 발명의 핵산 전달 펩티드에 표적지향성 펩티드 및 리간드가 결합된 선택적 핵산 전달체를 제공한다. 표적지향성 펩티드 및 리간드는 당업계에서 사용되는 어떤 종류의 것도 가능하다.

본 발명의 다른 양태에서는 본 발명의 핵산 전달 펩티드에 HIV 기원의 TAT 및 NLS가 접합된 형태의 핵산 전달체를 제공한다. TAT 및 NLS는 당 분야에서 단백질 도입부로 널리 사용되는 펩티드이다.

본 발명의 또 다른 양태에서는 HMGB-1(high mobility group box-1) 단백질을 코딩하는 유전자를 제공하는 단계, 상기 유전자의 C 말단에 존재하는 산성 박스 (Acid box)를 선별하여 결실시키는 단계, 얻어진 재조합 유전자를 발현 벡터 내에 발현 가능하도록 삽입하는 단계, 얻어진 벡터를 숙주 세포에 형질전환시켜 재조합 펩티드를 발현시키는 단계, 및 발현된 재조합 펩티드를 분리하여 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 HMGB-1 펩티드로 구성된 핵산 전달 펩티드의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명 의 범위가 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 핵산 재조합 HMGB -1의 최적 발현조건 확립

DNA 와 결합력을 높이기 위해 야생형의 HMGB-1의 C-말단 산성 박스를 제거하여 도1.과 같은 발현 플라스미드를 제작하였다. 그 후 단백질 발현 균주 (BL21)에 재조합 플라스미드를 형질전환시켰다. 형질전환된 균주는 T7 프로모터에 의해 조절되고 암피실린 내성을 지니게 된다. 형질전환을 확인하여 선택된 균주를 암피실린 (50 mg/㎖; Fluka Chemical 제조)이 포함된 10 ㎖ LB (10g/L 트립톤, 5g/L yeast extract, 및 10g/L NaCl) 배양액에서 단일 콜로니를 취하여 37℃에서 16 내지 18 시간동안 교반 (170 rpm)하며 배양하였다. 상기 배양액에서 2 ㎖를 취하여 50 mg/㎖ 암피실린이 포함된 2L LB에 접종하여 37℃에서 OD₆₀₀가 약 0.8에 이를 때까지 인큐베이션한 후, IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside; Sigma Chemical, St. Louis, MO)를 최종 농도가 500mM이 되도록 분주한 후, 6시간 동안 교반 배양하였다. 이를 원심분리기를 이용하여 5000rpm, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 50mM Na₂H₂PO₄/ 300mM NaCl / 10mM 이미다졸 완충용액 (pH 8.0), 100 ㎖에 현탁하고, 라이소자임 (Lysozyme; Sigma Chemical)을 0.1g 첨가한 후, 30분 동안 얼음 상에서 상기 혼합물을 가볍게 교반하였다. 라이소자임으로 처리한 혼합물을 Sonicator (Cell Disruptor 200, Branson Ultrasoniccs Corp.) 를 이용하여서 초음파를 이용하여 세포벽을 파괴한다. 그 후 10000g, 4℃에서 30분 동안 원심분리를 하여 상등액을 회수하였다.

< 실시예 2> 재조합 HMGB -1의 순수분리 및 정제

회수한 상등액을 니켈 레진(resin) (Probond, Invitrogen 사로부터 구매) 충진된 컬럼에 천천히 (0.5ml/min) 로딩하였다. 단백질이 로딩된 컬럼 (Glass Econo Column, 1.5 x 30 cm, Bio-Rad 사로부터 구매)에 50mM Na₂H₂PO₄/ 300mM NaCl / 20mM 이미다졸 완충용액 (pH 8.0) 100ml로 씻어서 비특이적으로 결합 되어있는 단백질을 제거하였다. 그 후 단계별로 이미다졸 농도를 증가시킴으로서 원하는 단백질을 분리·정제 하였다. 100mM ,150mM, 200mM ,250mM ,300mM까지 10ml 씩 총 50ml을 용출하며, 회수된 단백질은 1ml/1 분획 씩 총 50 분획이 회수되었다. 회수된 단백질은 BCA 검정 (Pierce 사로부터 구매)를 통하여 단백질의 양을 측정하였으며, 도 3(a) 와 같이 용출된 단백질을 양을 확인하였다. 또한, 용출된 단백질이 순수하게 분리 정제되었는지 확인하기 위하여 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 SDS-PAGE를 통하여 정성 분석하였다.

< 실시예3 > 재조합 HMGB -1의 DNA 의 복합체 형성 및 특성 확인

(1) 펩티드/ DNA 복합체 형성 조건 확립: 겔 리타데이션 검정 ( Gel retardation assay )

순수하게 분리 정제된 단백질 HMGB-1이 DNA와 복합체를 형성하는지를 확인하기 위하여 1% 아가로스 겔 전기영동을 실시하였다. 먼저 HMGB-1를 도 4와 같은 각각의 조건으로 비율을 증가시킴에 따라 DNA와 결합 정도를 확인하였다. DNA는 pCMV - Luc, 1㎍사용하였으며, 총 부피가 20㎕가 되도록 각각의 비율에 따라 혼합한 후, 30분 뒤에 100V 전압에서 전기영동을 수행하였다.

(2) 크기 측정

순수하게 정제된 단백질 HMGB-1와 DNA가 복합체가 형성되었을 때 크기를 확인하기 위하여 HMG:DNA 비율을 30:1로 정하여 입자 크기를 측정하였다. Zetasizer를 이용한 측정결과 200 nm 이하 크기의 펩티드/DNA 나노복합체를 형성함을 알 수 있다.

< 실시예4 > 293세포에서의 트랜스펙션 연구

제작된 펩티드의 핵산 전달 효과를 확인하기 위하여 293 세포로의 트랜스펙션을 실시하고, 최적의 트랜스펙션 효율을 나타내는 펩티드/ DNA 복합체 비율을 조사하였다. 뿐만 아니라, 흔히 사용되는 비바이러스성 고분자인 PLL과의 트랜스펙션 효율을 비교하였다.

(1) 최적의 트랜스펙션 복합체 성분비 결정

핵산 전달 효율은 리포터 유전자인 루시퍼라아제 DNA(pCMV-Luc)를 포함한 상기 복합체를 세포에 처리한 후, 발현된 루시퍼라아제의 양을 검출함으로써 측정하였다. 구체적으로, 복합체를 처리하기 약 24 시간 전에 페니실린, 스트렙토마이신 1%, 10% 혈청이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양한 293 세포 1x10⁵개를 6-웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 분주하고, 플레이트의 약 70% 정도로 세포가 자랄 때까지 37℃ 및 5% CO₂의 조건하에서 약 18 시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 웰로부터 배지를 제거하고 , 혈청이 첨가되지 않은 배지 1ml을 분주하여 세척한 다음, 같은 배지 2 ml을 각 웰에 분주하여, 상기 핵산 전달 복합체 인 HMGB-1과 DNA을 비율별로 (도 5) 첨가하여 4 시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 배양한 한다. 4시간 후에 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 10% 혈청 함유 배지 2㎖을 각 웰에 주입하여 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 배양하였다. 다음날 각 웰로부터 배지를 제거하고 세포를 인산 완충액 (PBS, pH 7.4) 1㎖로 세척한 다음, 200㎕의 1 X 용균 완충액(lysis buffer)로 세포를 용균(lysis) 시켰다. 각각의 샘플을 잘 혼합한 후에 원심분리를 (13000rpm로 3분) 행하여, 상층액만 수집하였다. 이어서, 상기 상층액 50 ㎕를 첨가하여 가볍게 혼합한 후, 루시퍼라아제 기질용액 (Promega, 미국) 50 ㎕를 가한 후, 형광 루미노미터 (luminometer, Detection System GmbH, Pforzheim, Germany)를 사용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 그 결과, 핵산 전달시 펩타이드:DNA의 최적 전달 효율를 알 수 있었다. HMGB-1가 DNA를 세포 내로 전달하는 효율은 30:1일 때 가장 높아 이때의 비율을 선정하여 후술하는 PLL 과 핵산 전달 효율비교 및 독성실험을 하였다.

그 결과 도 5와 같이 DNA:HMGB-1의 비율이 1:30인 지점에서 가장 트랜스펙션 효율이 높은 것을 확인할 수 있었다. 특히, 네이키드 DNA보다 월등히 높은 효율을 가진다.

(2) 다른 전달체와의 트랜스펙션 효율 비교

상기 (1) 절에서 제시한 실험방법과 동일한 조건에서 PLL과 핵산 전달 효율 을 비교하였다. HMGB-1은 위와 같은 조건으로 행하였으며 PLL은 N/P 비율이 1:2 지점일 때를 기준으로 하여 pCMV-Luc 와 PLL을 혼합하여 293 세포 내로 전달하였다.

도 6과 같이 PLL과 비교를 통해 HMGB-1의 트랜스펙션 효율은 독성이 강한 PLL보다는 10배 정도 낮게 나타났지만 상당한 양의 핵산을 전달하여 루시퍼라제를 발현시킴을 알 수 있다.

< 실시예 5> 독성조사

HMGB-1의 독성은 MTT 검정 (Tetrazolium-based colorimetirc Assay)으로 확인하였다. 재조합된 HMGB-1의 독성을 확인하기 위하여 HMGB-1의 농도를 증가시켜 분주한 뒤에 일정시간 배양 후 살아있는 세포의 양을 조사하였다.

구체적으로, 1% 페니실린, 스트렙토마이신, 10% 혈청이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양한 293 세포 1x104개를 12-웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 분주하고, 플레이트의 약 70% 정도로 세포가 자랄 때까지 37℃ 및 5% CO₂의 조건하에서 약 18 시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 웰로부터 배지를 제거하고, 혈청이 첨가되지 않은 배지 0.5ml을 분주하여 세척한 다음, 도 7에서는 같은 배지 1ml을 각 웰에 분주하여, 상기 핵산 전달 복합체인 HMGB-1을 농도를 각각 0-20 ㎍/웰로 증가시켰으며, 도 8에서는 같은 배지 1ml을 각 웰에 분주하여 HMGB-1과 DNA (30:1) 및 PLL 과 DNA (2:1) 첨가하여 4 시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 배양한 한다. 4 시간 후에 1% 페니실린 , 스트렙토마이신, 10% 혈청 함유 배지 2㎖을 각 웰에 주입하여 24시간 동안 37℃ 및 5% CO₂ 조건으로 배양한 한다. 이어서 24시간 후 2mg/ml의 MTT 용액을 주입한 후, 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 4 시간 후, MTT용액이 첨가된 배지를 제거하고, DMSO를 750㎕ 주입한 후 10분 정도 50℃에서 반응시켰다. 그 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 하기식에 따라 세포생존율을 구하였다.

세포생존율 (%) = OD₅₇₀(샘플)/ OD₅₇₀(대조구) x 100

도 7에서 확인되는 바와 같이 HMGB-1은 농도를 증가시켜도 전혀 세포독성에 영향을 미치지 않았으며, 도 8에서 확인되는 바와 같이 PLL은 낮은 농도에서도 세포 생존율을 현저히 떨어뜨리지만, HMGB-1은 세포 독성이 전혀 없는 것으로 평가되었다.

상기와 같은 구성을 갖는 본 발명은 세포독성이 없는 안전한 핵산 전달체를 제공하여, 기존 유전자치료 방법에 비하여 더 안전한 유전자치료의 수단을 제공한다. 재조합 HMGB-1 펩티드는 다음과 같은 응용범위를 갖는다.

세포 내 단백질을 기반으로 한 펩티드 핵산 전달체는 독성이나 면역반응으로부터 바이러스성 전달체나 기타 세포 외 물질을 기반으로 하는 전달체에 비하여 상대적으로 안전하다. 이 핵산 전달체는 TAT 펩티드와 핵 nuclear localization signal 펩티드와 연결하여 보다 효율을 개선할 수 있으므로, 보다 고효율을 확보할 수 있다. 따라서, 안전하고 고효율의 핵산 전달체로서 유전자 치료에 응용될 수 있다.

또한, 핵산 재조합 HMGB-1 펩티드 전달체를 기반으로 하여, 이미 알려진 표적지향성 펩티드 리간드를 접합함으로써, 특정 장기 또는 세포로 핵산 전달을 가능하게 하는 전달체를 제작할 수 있다.

<110> IUDF-HYU <120> RECOMBINANT HMGB-1 PEPTIDE FOR GENE DELIVERY <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 679 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(492) <400> 1 atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattc atg ggc aaa 9 Met Gly Lys 1 gga gat cct aag aag ccg aga ggc aaa atg tca tca tat gca ttt ttt 57 Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr Ala Phe Phe 5 10 15 gtg caa act tgt cgg gag gag cat aag aag aag cac cca gat gct tca 105 Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro Asp Ala Ser 20 25 30 35 gtc aac ttc tca gag ttt tct aag aag tgc tca gag agg tgg aag acc 153 Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg Trp Lys Thr 40 45 50 atg tct gct aaa gag aaa gga aaa ttt gaa gat atg gca aaa gcg gac 201 Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala Lys Ala Asp 55 60 65 aag gcc cgt tat gaa aga gaa atg aaa acc tat atc cct ccc aaa ggg 249 Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro Pro Lys Gly 70 75 80 gag aca aaa aag aag ttc aag gat ccc aat gca ccc aag agg cct cct 297 Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro 85 90 95 tcg gcc ttc ttc ctc ttc tgc tct gag tat cgc cca aaa atc aaa gga 345 Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly 100 105 110 115 gaa cat cct ggc ctg tcc att ggt gat gtt gcg aag aaa ctg gga gag 393 Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu 120 125 130 atg tgg aat aac act gct gca gat gac aag cag cct tat gaa aag aag 441 Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys 135 140 145 gct gcg aag ctg aag gaa aaa tac gaa aag gat att gct gcc tac aga 489 Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg 150 155 160 aag cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac caccactgag atccggctgc 542 Lys taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata 602 accccttggg gcctctaaac gggtcttga 631 <210> 2 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Lys <210> 3 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 4 <211> 5919 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant vector <400> 4 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540 tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600 gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660 ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720 agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780 agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840 tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900 tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960 cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020 aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080 tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140 tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200 ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260 ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320 cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380 gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440 actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500 aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560 caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620 aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680 accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740 aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800 ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860 agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920 accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980 gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040 tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100 cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160 cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220 cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280 ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340 taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400 gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460 tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520 cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580 gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640 gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700 catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760 tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820 ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880 tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940 ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000 aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060 gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120 tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180 acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240 cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300 cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 3360 gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 3420 cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 3480 gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540 tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600 atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660 tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720 gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780 tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840 cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900 tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960 atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020 atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080 tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140 cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200 aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 4260 ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320 tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380 tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440 gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500 gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 4560 gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 4620 ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 4680 taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 4740 ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 4800 atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860 tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc 4920 gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 4980 gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 5040 aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 5100 ctcgatcccg cgaaattaat acgactcact ataggggaat tgtgagcgga taacaattcc 5160 cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatggct agcatgactg 5220 gtggacagca aatgggtcgc ggatccgaat tcatgggcaa aggagatcct aagaagccga 5280 gaggcaaaat gtcatcatat gcattttttg tgcaaacttg tcgggaggag cataagaaga 5340 agcacccaga tgcttcagtc aacttctcag agttttctaa gaagtgctca gagaggtgga 5400 agaccatgtc tgctaaagag aaaggaaaat ttgaagatat ggcaaaagcg gacaaggccc 5460 gttatgaaag agaaatgaaa acctatatcc ctcccaaagg ggagacaaaa aagaagttca 5520 aggatcccaa tgcacccaag aggcctcctt cggccttctt cctcttctgc tctgagtatc 5580 gcccaaaaat caaaggagaa catcctggcc tgtccattgg tgatgttgcg aagaaactgg 5640 gagagatgtg gaataacact gctgcagatg acaagcagcc ttatgaaaag aaggctgcga 5700 agctgaagga aaaatacgaa aaggatattg ctgcctacag aaagcttgcg gccgcactcg 5760 agcaccacca ccaccaccac tgagatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt 5820 tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct 5880 tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggat 5919

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. SEQ ID NO:2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는, C-말단 산성박스가 결실된 재조합 핵단백질 HMGB-1(high mobility group box-1)로 구성된 핵산 전달 펩티드; 및 전달하고자 하는 핵산이 결합하여 이루어진 핵산 전달 복합체.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 핵산 전달 복합체는 핵산 전달 펩티드:핵산의 혼합 중량 비율이 5:1 내지 40:1인 것을 특징으로 하는 핵산 전달 복합체.
5. 제 3 항에 있어서, 핵산 전달 복합체는 표적지향성 펩티드 및 리간드를 추가적으로 포함하고, 상기 표적지향성 펩티드 및 리간드는 상기 핵산 전달 펩티드에 결합되어 선택성을 부여하는 것을 특징으로 하는 핵산 전달 복합체.
6. 제 3 항에 있어서, 핵산 전달 복합체는 TAT 및 NLS를 추가적으로 포함하고, 상기 TAT 및 NLS는 상기 핵산 전달 펩티드에 접합된 형태인 것을 특징으로 하는 핵산 전달 복합체.
7. 삭제

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