CN104328136A

CN104328136A - 鸡新城疫病毒毒株rClone30-fliC的制备及其在鸡新城疫病防治中的应用

Info

Publication number: CN104328136A
Application number: CN201410518366.8A
Authority: CN
Inventors: 李德山; 王卉; 张天援; 何金娇
Original assignee: HARBIN BOAO BIO-MEDICAL TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co
Current assignee: Jiangsu Kangyuan Ruiao Biomedical Technology Co., Ltd.
Priority date: 2014-10-03
Filing date: 2014-10-03
Publication date: 2015-02-04
Anticipated expiration: 2034-10-03
Also published as: CN104328136B

Abstract

本发明公开了一种鸡新城疫病毒毒株rClone30-fliC及其在鸡新城疫病防治中的应用。本发明提供的鸡新城疫病毒毒株及其制备方法，其制备方法包括如下步骤：将已构建的重组质粒pBrClone30-fliC以及相应的辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L共转染能稳定表达T7聚合酶的BHK-21细胞，并拯救培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株。本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入分子佐剂fliC，除了增强了接种鸡的免疫反应外，出乎意料的快速产生HI抗体，实现了早期免疫效果，缩短了免疫空白期，同时不受母源抗体的干扰，提高免疫保护效率。本发明对于新城疫病的防治具有重大价值。

Description

鸡新城疫病毒毒株rClone30-fliC的制备及其在鸡新城疫病防治中的应用

技术领域

本发明涉及鸡新城疫病毒毒株rClone30-fliC的制备及其在鸡新城疫病防治中的应用。

背景技术

新城疫（Newcastle Disease,ND），是由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）引起的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，该病具有很高的发病率和病死率，是严重危害世界养禽业的重大烈性传染病之一。OIE将其列为A类疫病，我国将其列为Ⅰ类动物疫病。NDV是一种不分节段单股负链RNA病毒，该病毒主要危害鸡和火鸡的呼吸系统、神经系统和消化系统，几乎可以感染所有禽类。该病一年四季均可发生，但以春秋季较多。鸡场内的鸡一旦发生本病，可于4～5d内波及全群。

目前，预防新城疫的主要方法是接种疫苗免疫。由于弱毒疫苗使用方便且能够诱导体液免疫和局部黏膜免疫，在国内外被普遍应用。但此类疫苗常常需要在首次接种后的15天左右才能产生相应保护抗体，即存在免疫空白期。如果新城疫一旦爆发在疫苗接种的免疫空白期，鸡群将无法得到有效的免疫保护。因此，在新城疫的预防工作中，迫切需要一种可以刺激机体快速产生抗体从而缩短免疫空白期的高效安全的新型弱毒疫苗。此外，由于母源抗体的干扰导致新城疫疫苗早期免疫失败这一问题是疫苗生产实践中亟待解决的技术难题，因此制备一种不受母源抗体干扰的新城疫疫苗具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种鸡新城疫病毒毒株rClone30-fliC的制备方法及其在鸡新城疫病预防中的应用。

本发明提供的鸡新城疫病毒毒株（命名为rClone30-fliC病毒），其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-fliC以及相应的辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞BHK-21并继续培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-fliC为具有序列表的序列3自5’末端第2703-19461位核苷酸所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3自5’末端第2703-19461位核苷酸所示的DNA分子即为rClone30-fliC病毒的基因组DNA。

所述重组质粒pBrClone30-fliC具体可为序列表的序列3所示的质粒。

所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。

rClone30-fliC病毒的制备方法具体如下：

（1）将所述重组质粒pBrClone30-fliC以及相应的辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞。每1×10⁶个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30-fliC、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒，置于5% CO₂、37℃条件下静置培养72h；

（2）取步骤（1）得到的转染细胞，于-80℃反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；

（3）取步骤（2）得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；

（4）取步骤（3）得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液；

（5）将步骤（2）和步骤（3）得到的鸡胚尿囊液进行混合，得到的混合液，即为rClone30-fliC病毒液。

本发明还保护一种鸡新城疫病毒毒株（命名为rClone30-fliC病毒），其基因组DNA如序列表的序列3自5ˊ末端第2703-19461位核苷酸所示。

本发明还保护以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。

本发明还保护一种鸡新城疫病疫苗，包括以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株。

本发明提供一种新的鸡新城疫病毒毒株，命名为rClone30-fliC，因此简称毒株rClone30-fliC。所述毒株rClone30-fliC是将fliC蛋白的编码基因插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30（简称毒株Clone30，弱毒株，为现有的新城疫病活疫苗）的基因组的F和HN基因之间得到的重组病毒株。毒株rClone30-fliC免疫鸡群后，可以使鸡快速产生抗体，使免疫空白期从15天缩短为7天，弥补了现有新城疫活疫苗产生抗体时间过长的缺点。在母源抗体存在的情况下仍可以激发鸡产生抗体,解决了现有疫苗不能抵抗母源抗体的缺点。

本发明构建的重组新城疫病毒可视为基因工程改造后的弱毒疫苗株，可制备为任何常规制剂，如冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等。

本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入分子佐剂fliC，可以有效提高免疫效果，极大缩短免疫空白期。同时可不受母源抗体的干扰，提高新城疫活疫苗的免疫保护率。本发明对于新城疫病的防治具有重大价值。

附图说明

图1为重组质粒pBrClone30-fliC的元件示意图。

图2为病毒混合液的HA效价和HI效价结果。

图3为PCR鉴定电泳图。

图4为实施例2的结果。

图5为实施例3的结果。

图6为实施例4的结果。

图7为实施例5的结果。

图8为实施例6的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

提及“pBrClone30质粒”的文献：“Enhancement of anti-tumor activity of Newcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase”,Zheng LV,Asian Pac J Cancer Ptev.。

提及“pBL-N质粒”、“pBL-P质粒”和“pBL-L质粒”的文献：Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin 2 is a potential drug candidate for cancer immunotherapy,Fuliang Bai,Immunology letters.。

pBrClone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，其中F基因和HN基因之间具有HpaI和MluI酶切识别位点。将pBrClone30质粒以及相应的辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞BHK-21并培养，得到毒株Clone30。

提及“NDV强毒BJ株”的文献：“鸡新城疫病毒强毒株的分离鉴定及其遗传变异分析”，校海霞，河北农业大学硕士学位论文。

BHK-21细胞：ATCC编号为CRL-13001。

DF-1细胞：ATCC编号为CRL-12203。

SPF级白色来航鸡：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

fliC蛋白的全称为鼠伤寒沙门氏菌I相鞭毛蛋白，如序列表的序列2所示，其编码基因的开放阅读框如序列表的序列1自5ˊ末端第16至1503位核苷酸所示。

完全培养基即为含有5%胎牛血清的DMEM培养基。

鸡血红细胞凝集（HA）试验的具体方法如下：(1)在血凝板第一排的1-12孔各加入25μL生理盐水；(2)在第1孔中加入25μL待测病毒液，混匀后吸25μL到第2孔，如此倍比稀释直到第10孔，第10孔混匀后弃除25μL；(3)在1-12孔中各加入25μL 1%鸡血红细胞；(4)震荡后室温静置20-30min，观察结果。

鸡血红细胞凝集抑制（HI）试验的具体方法如下：(1)在血凝板的1-12孔各加入25μL生理盐水；(2)第1孔加入待检血清25μL，混匀后吸25μL至第2孔，倍比稀释直至第10孔，第10孔混匀后弃除25μL；(3)在1-12孔中各加入25μL实施例1制备的rClone30病毒液（4个血凝单位），室温静置30min；(4)在1-12孔中各加入25μL 1%鸡血红细胞；(5)震荡后室温静置30-40min，观察结果。

实施例1、rClone30-fliC病毒液的制备

一、重组质粒的构建

1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。

序列表的序列1中，自5ˊ末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶HpaI的识别序列，第10-15位核苷酸为Kozac序列，第16至1503位核苷酸为fliC蛋白的编码基因，第1504至1509位核苷酸为限制性内切酶Mlu I的识别序列。

2、采用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切步骤1得到的双链DNA片段，回收酶切产物中的目的片段。

3、采用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切pBrClone30质粒，回收约16000bp的载体片段。

4、将步骤2的酶切产物片段和步骤3的载体片段进行连接，得到重组质粒pBrClone30-fliC。重组质粒pBrClone30-fliC的核苷酸序列如序列表的序列3所示（序列表的序列3中，自5ˊ末端第2703-19461位核苷酸为rClone30-fliC病毒的基因组）。重组质粒pBrClone30-fliC的元件示意图见图1。

二、重组病毒的制备

1、将重组质粒pBrClone30-fliC以及相应的辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞（每1×10⁶个细胞约转染1μg重组质粒pBrClone30-fliC、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒），置于5% CO₂、37℃条件中静置培养72h。

2、取步骤1得到的转染细胞，于-80℃反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液。

3、取步骤2得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液。

4、取步骤3得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚，37℃培养72h，收集鸡胚尿囊液。

5、将步骤2和步骤3得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液（该混合液的HA效价为2048，HI效价为512，见图2）。

6、取步骤5得到的混合液，提取总RNA并反转录为cDNA，采用F1和R1组成的引物对进行PCR鉴定(F1：5ˊ-GTTAACGCCACCatggcacaagtcattaatac-3ˊ；R1：5ˊ-ACGCGTTTAACGCAGTAAAGAGAGGA-3ˊ)，结果见图3。PCR扩增片段大小约为1488bp，与预期大小相符。

结果表明，成功制备了具备感染性的表达fliC蛋白的NDV病毒，将步骤5得到的混合液命名为rClone30-fliC病毒液。

三、对照病毒的制备

用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30-fliC进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30病毒液。

实施例2、检测病毒液中fliC的表达量

1、将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，以0.1MOI的实施例1制备的rClone30-fliC病毒液（rClone30-fliC病毒液用完全培养基稀释）感染细胞，37℃静置孵育1h，然后用完全培养基洗涤三遍，加入含1μg/mL胰蛋白酶的完全培养基并置于5% CO₂、37℃条件下静置培养48h，然后于-80℃反复冻融3次，取上清液。

2、使用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-fliC病毒液，其它同步骤1。

3、使用 fliC抗体（629702,BioLegend）进行ELISA检测，分别检测步骤1和步骤2得到的上清液中的fliC蛋白的浓度。

结果见图4。结果表明，rClone30-fliC病毒能够显著表达fliC蛋白,而rClone30病毒不表达fliC蛋白。

实施例3、rClone30-fliC病毒与rClone30病毒在宿主细胞中的动力生长曲线

1、将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，以0.1MOI的剂量将实施例1制备的rClone30-fliC病毒液（rClone30-fliC病毒液用完全培养基稀释）接种于单层细胞，采用含1μg/mL胰蛋白酶的完全培养基，置于5% CO₂、37℃条件下静置培养96h，每隔24h取上清液并测定TCID₅₀。

结果见图5。rClone30-fliC病毒与rClone30病毒保持着一致的繁殖滴度。结果表明，fliC蛋白的编码基因的插入并不影响rClone30病毒的增殖能力。

实施例4、rClone30-fliC病毒或rClone30病毒免疫SPF鸡后的HI抗体效价

根据农业部标准，青年鸡的抗体效价≥5log2时判为合格。特别是在30日龄前后抗体水平低于此标准，如果在此期间有强毒侵入，就有可能暴发新城疫。如果鸡群能在此期间达到此标准，将不受新城疫病毒的威胁。

取30日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组10只。分别处理如下（均为单次免疫）：

第一组：每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-fliC病毒液（rClone30-fliC病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第二组：每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液（rClone30病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第三组：每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL 0.9%生理盐水。

分别于免疫后7d、14 d、21d翅静脉采血分离血清，检测HI效价。

结果见图6。免疫后7d,第一组血清的HI效价高于5log2，第二组的效价低于3log2，即rClone30-fliC病毒液将可以实现早期保护效果，使鸡免受新城疫病毒的威胁，而rClone30病毒液将无法在免疫后7d实现有效保护鸡免受新城疫病毒的威胁。

实施例5 重组病毒rClone30-fliC或rClone30免疫含母源抗体的鸡后的HI抗体效价

取17日龄的含母源抗体的白色来航鸡，随机分为3组，每组12只。分别处理如下（均为单次免疫）：

第三组：每只采用滴鼻点眼方式免疫200μL生理盐水。

分别于免疫后0d、6d翅静脉采血分离血清，检测HI效价。

结果见图7。在母源抗体存在的情况下，免疫后7d,第一组血清的HI效价高于第二组的效价，即rClone30-fliC病毒在早期免疫中可以更有效的保护鸡免受新城疫病毒的威胁。

实施例6 重组病毒rClone30-fliC或rClone30免疫含母源抗体的鸡后的HI抗体效价

在养鸡生产中，一个鸡群的母源抗体水平往往参差不齐，其中一些母源抗体水平较低的雏鸡在其幼龄阶段易感染野毒和带毒，当其它雏鸡母源抗体水平下降时，它们亦依次受感染，使野毒在鸡群中的传播连绵不断，遗留很大的潜在威胁。据有关文献报道，蛋鸡出雏后在不同日龄测定其新城疫母源抗体水平，结果显示：1日龄母源抗体为6.6log2;7日龄时抗体水平下降为4.7log2；到10日龄时抗体水平降到4log2以下，如果以抗体效价4log2为临界保护值，1日龄雏鸡母源抗体保护率为95%，7日龄母源抗体保护率为80%，到10日龄时母源抗体保护率只有50%。

取1日龄的含母源抗体的白色来航鸡，随机分为3组，每组10只。分别处理如下（均为单次免疫）：

第一组：组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-fliC病毒液（rClone30-fliC病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第二组：组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液（rClone30病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第三组：组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL生理盐水。

分别于免疫后0d、6d翅静脉采血分离血清，检测HI效价。

结果见图8。

实施例7、攻毒试验

将30日龄SPF级白色来航鸡随机分为3组，每组30只。分别处理如下（均为单次免疫）：

第一组：实验第1天，每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-fliC病毒液（rClone30-fliC病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第二组：实验第1天，每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液（rClone30病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第三组：实验第1天，每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL 0.9%生理盐水。

实验第8天，采用NDV强毒BJ株进行攻毒（每只鸡采用10⁴ ELD₅₀的剂量经肌肉注射途径攻毒，攻毒体积为0.1ml），实验第18天，统计各组的发病与死亡情况。结果见表1。

表1 各组的发病与死亡情况统计（三次试验的平均值）

疫苗组	攻毒剂量	发病数量/死亡数量/总数量	保护率
				第一组	10⁴ELD₅₀	0/0/30	100%
第二组	10⁴ELD₅₀	14/8/30	53.3%
				第三组	10⁴ELD₅₀	30/30/30	0%

发病表征如下（满足①-④中的一项以上即判断为发病）：①上呼吸道分泌大量黏液，自口鼻流出，有时挂于嘴端，常摇头想甩掉；呼吸困难，呼吸时喉部发出“咯咯”的喘鸣声或尖叫声；②由于呼吸困难，血液中氧气不足，二氧化碳增多，使肉髯变为青紫色，临死前及死后尤为明显；③下痢，粪便呈绿色、黄白色，有时混有少量血液；④部分鸡嗉囊蓄积大量酸臭液体，倒提鸡时，液体急速自口中流出，提壶倒水一般。

结果表明：rClone30-fliC免疫可在早期先于rClone30疫苗株刺激鸡体内产生抗体并同时增强体液免疫水平，提高攻毒保护效率。

序列表

<110> 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司

<120> 鸡新城疫病毒毒株rClone30-fliC的制备及其在新城疫病防治中的应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1428

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1428)

<223>

<400> 1

atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa 50

cctgaacaaa tcccagtccg ctctgggcac cgctatcgag cgtctgtctt 100

ccggtctgcg tatcaacagc gcgaaagacg atgcggcagg tcaggcgatt 150

gctaaccgtt ttaccgcgaa catcaaaggt ctgactcagg cttcccgtaa 200

cgctaacgac ggtatctcca ttgcgcagac cactgaaggc gcgctgaacg 250

aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg aactggcggt tcagtctgct 300

aacagcacca actcccagtc tgacctcgac tccatccagg ctgaaatcac 350

ccagcgcctg aacgaaatcg accgtgtatc cggccagact cagttcaacg 400

gcgtgaaagt cctggcgcag gacaacaccc tgaccatcca ggttggtgcc 450

aacgacggtg aaactatcga tatcgatctg aagcagatca actctcagac 500

cctgggtctg gatacgctga atgtgcaaca aaaatataag gtcagcgata 550

cggctgcaac tgttacagga tatgccgata ctacgattgc tttagacaat 600

agtactttta aagcctcggc tactggtctt ggtggtactg accagaaaat 650

tgatggcgat ttaaaatttg atgatacgac tggaaaatat tacgccaaag 700

ttaccgttac ggggggaact ggtaaagatg gctattatga agtttccgtt 750

gataagacga acggtgagga ggatgtgaaa aatgtacaag ttgcaaatgc 800

tgatttgaca gaggctaaag ccgcattgac agcagcaggt gttaccggca 850

cagcatctgt tgttaagatg tcttatactg ataataacgg taaaactatt 900

gatggtggtt tagcagttaa ggtaggcgat gattactatt ctgcaactca 950

aaataaagat ggttccataa gtattaatac tacgaaatac actgcagatg 1000

acggtacatc caaaactgca ctaaacaaac tgggtggcgc agacggcaaa 1050

accgaagttg tttctattgg tggtaaaact tacgctgcaa gtaaagccga 1100

aggtcacaac tttaaagcac agcctgatct ggcggaagcg gctgctacaa 1150

ccaccgaaaa cccgctgcag aaaattgatg ctgctttggc acaggttgac 1200

acgttacgtt ctgacctggg tgcggtacag aaccgtttca actccgctat 1250

taccaacctg ggcaacaccg taaacaacct gacttctgcc cgtagccgta 1300

tcgaagattc cgactacgcg accgaagttt ccaacatgtc acgcgcgcag 1350

attctgcagc aggccggtac ctccgttctg gcgcaggcga accaggttcc 1400

gcaaaacgtc ctctctttac tgcgttaa 1428

<210> 2

<211> 476

<212> PRT

<213> Artifical sequence

<400> 2

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln

1 5 10 15

Asn Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu

16 20 25 30

Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala

31 35 40 45

Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly

46 50 55 60

Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala

61 65 70 75

Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln

76 80 85 90

Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser

91 95 100 105

Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu

106 110 115 120

Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val

121 125 130 135

Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr Ile Gln Val Gly Ala

136 140 145 150

Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys Gln Ile Asn Ser

151 155 160 165

Gln Thr Leu Gly Leu Asp Thr Leu Asn Val Gln Gln Lys Tyr Lys

166 170 175 180

Val Ser Asp Thr Ala Ala Thr Val Thr Gly Tyr Ala Asp Thr Thr

181 185 190 195

Ile Ala Leu Asp Asn Ser Thr Phe Lys Ala Ser Ala Thr Gly Leu

196 200 205 210

Gly Gly Thr Asp Gln Lys Ile Asp Gly Asp Leu Lys Phe Asp Asp

211 215 220 225

Thr Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Lys Val Thr Val Thr Gly Gly Thr

226 230 235 240

Gly Lys Asp Gly Tyr Tyr Glu Val Ser Val Asp Lys Thr Asn Gly

241 245 250 255

Glu Glu Asp Val Lys Asn Val Gln Val Ala Asn Ala Asp Leu Thr

256 260 265 270

Glu Ala Lys Ala Ala Leu Thr Ala Ala Gly Val Thr Gly Thr Ala

271 275 280 285

Ser Val Val Lys Met Ser Tyr Thr Asp Asn Asn Gly Lys Thr Ile

286 290 295 300

Asp Gly Gly Leu Ala Val Lys Val Gly Asp Asp Tyr Tyr Ser Ala

301 305 310 315

Thr Gln Asn Lys Asp Gly Ser Ile Ser Ile Asn Thr Thr Lys Tyr

316 320 325 330

Thr Ala Asp Asp Gly Thr Ser Lys Thr Ala Leu Asn Lys Leu Gly

331 335 340 345

Gly Ala Asp Gly Lys Thr Glu Val Val Ser Ile Gly Gly Lys Thr

346 350 355 360

Tyr Ala Ala Ser Lys Ala Glu Gly His Asn Phe Lys Ala Gln Pro

361 365 370 375

Asp Leu Ala Glu Ala Ala Ala Thr Thr Thr Glu Asn Pro Leu Gln

376 380 385 390

Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp

391 395 400 405

Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu

406 410 415 420

Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu

421 425 430 435

Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln

436 440 445 450

Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln

451 455 460 465

Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg ***

466 470 475

<210> 3

<211> 19873

<212> DNA

<213> Artifical sequence

<220>

<221> CDS

<222> (2703)..(19461)

<223>

<400> 1

ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 50

gtagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 100

gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 150

agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 200

gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 250

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 300

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 350

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 400

aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 450

ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 500

ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat 550

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 600

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 650

ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 700

gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 750

aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg 800

atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 850

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 900

tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 950

atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc 1000

atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataagcatga gtgataacac 1050

tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg 1100

ctttttttca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1150

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1200

tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 1250

ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt 1300

gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 1350

taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 1400

ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacgggcagt 1450

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1500

actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1550

agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 1600

ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 1650

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 1700

tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1750

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1800

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc 1850

cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc 1900

gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1950

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 2000

cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 2050

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct 2100

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa 2150

caggagagcg cacgagggag cttccagggg ggaacgcctg gtatctttat 2200

agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 2250

ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 2300

tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2350

ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2400

taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 2450

aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg 2500

attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 2550

tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg 2600

ctttacactt tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 2650

taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagctcgg 2700

aagcggccgc taatacgact cactataggg accaaacaga gaatccgtaa 2750

gttacgataa aaggcgaagg agcaattgaa gtcgcacggg tagaaggtgt 2800

gaatctcgag tgcgagcccg aagcacaaac tcgagaaagc cttctgccaa 2850

catgtcttcc gtatttgatg agtacgaaca gctcctcgcg gctcagactc 2900

gccccaatgg agctcatgga gggggagaaa aagggagtac cttaaaagta 2950

gacgtcccgg tattcactct taacagtgat gacccagaag atagatggag 3000

ctttgtggta ttctgcctcc ggattgctgt tagcgaagat gccaacaaac 3050

cactcaggca aggtgctctc atatctcttt tatgctccca ctcacaggta 3100

atgaggaacc atgttgccct tgcagggaaa cagaatgaag ccacattggc 3150

cgtgcttgag attgatggct ttgccaacgg cacgccccag ttcaacaata 3200

ggagtggagt gtctgaagag agagcacaga gatttgcgat gatagcagga 3250

tctctccctc gggcatgcag caacggaacc ccgttcgtca cagccggggc 3300

cgaagatgat gcaccagaag acatcaccga taccctggag aggatcctct 3350

ctatccaggc tcaagtatgg gtcacagtag caaaagccat gactgcgtat 3400

gagactgcag atgagtcgga aacaaggcga atcaataagt atatgcagca 3450

aggcagggtc caaaagaaat acatcctcta ccccgtatgc aggagcacaa 3500

tccaactcac gatcagacag tctcttgcag tccgcatctt tttggttagc 3550

gagctcaaga gaggccgcaa cacggcaggt ggtacctcta cttattataa 3600

cctggtaggg gacgtagact catacatcag gaataccggg cttactgcat 3650

tcttcttgac actcaagtac ggaatcaaca ccaagacatc agcccttgca 3700

cttagtagcc tctcaggcga catccagaag atgaagcagc tcatgcgttt 3750

gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacatta cttggtgata 3800

gtgaccagat gagctttgcg cctgccgagt atgcacaact ttactccttt 3850

gccatgggta tggcatcagt cctagataaa ggtactggga aataccaatt 3900

tgccagggac tttatgagca catcattctg gagacttgga gtagagtacg 3950

ctcaggctca gggaagtagc attaacgagg atatggctgc cgagctaaag 4000

ctaaccccag cagcaaggag gggcctggca gctgctgccc aacgggtctc 4050

cgaggagacc agcagcatag acatgcctac tcaacaagtc ggagtcctca 4100

ctgggcttag cgaggggggg tcccaagctc tacaaggcgg atcgaataga 4150

tcgcaagggc aaccagaagc cggggatggg gagacccaat tcctggatct 4200

gatgagagcg gtagcaaata gcatgaggga ggcgccaaac tctgcacagg 4250

gcactcccca atcggggcct cccccaactc ctgggccatc ccaagataac 4300

gacaccgact gggggtattg atggacaaaa cccagcctgc ttccacaaaa 4350

acatcccaat gccctcaccc gtagtcgacc cctcgatttg cggctctata 4400

tgaccacacc ctcaaacaaa catccccctc tttcctccct ccccctgctg 4450

tacaactccg cacgccctag ataccacagg cacaatgcgg ctcactaaca 4500

atcaaaacag agccgaggga attagaaaaa agtacgggta gaagagggat 4550

attcagagat cagggcaagt ctcccgagtc tctgctctct cctctacctg 4600

atagaccagg acaaacatgg ccacctttac agatgcagag atcgacgagc 4650

tatttgagac aagtggaact gtcattgaca acataattac agcccagggt 4700

aaaccagcag agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaagaccaa 4750

ggtgctgagc gcagcatggg agaagcatgg gagcatccag ccaccggcca 4800

gtcaagacaa ccccgatcga caggacagat ctgacaaaca accatccaca 4850

cccgagcaaa cgaccccgca tgacagcccg ccggccacat ccgccgacca 4900

gccccccacc caggccacag acgaagccgt cgacacacag ctcaggaccg 4950

gagcaagcaa ctctctgctg ttgatgcttg acaagctcag caataaatcg 5000

tccaatgcta aaaagggccc atggtcgagc ccccaagagg ggaatcacca 5050

acgtccgact caacagcagg ggagtcaacc cagtcgcgga aacagtcagg 5100

aaagaccgca gaaccaagtc aaggccgccc ctggaaacca gggcacagac 5150

gtgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac tatcagctgg 5200

tgcaacccct catgctctcc gatcaaggca gagccaagac aatacccttg 5250

tatctgcgga tcatgtccag ccacctgtag actttgtgca agcgatgatg 5300

tctatgatgg aggcgatatc acagagagta agtaaggttg actatcagct 5350

agatcttgtc ttgaaacaga catcctccat ccctatgatg cggtccgaaa 5400

tccaacagct gaaaacatct gttgcagtca tggaagccaa cttgggaatg 5450

atgaagattc tggatcccgg ttgtgccaac atttcatctc tgagtgatct 5500

acgggcagtt gcccgatctc acccggtttt agtttcaggc cctggagacc 5550

cctctcccta tgtgacacaa ggaggcgaaa tggcacttaa taaactttcg 5600

caaccagtgc cacatccatc tgaattgatt aaacccgcca ctgcatgcgg 5650

gcctgatata ggagtggaaa aggacactgt ccgtgcattg atcatgtcac 5700

gcccaatgca cccgagttct tcagccaagc tcctaagcaa gttagatgca 5750

gccgggtcga tcgaggaaat caggaaaatc aagcgccttg ctctaaatgg 5800

ctaattacta ctgccacacg tagcgggtcc ctgtccactc ggcatcacac 5850

ggaatctgca ccgagttccc ccccgcagac ccaaggtcca actctccaag 5900

cggcaatcct ctctcgcttc ctcagcccca ctgaatgatc gcgtaaccgt 5950

aattaatcta gctacattta agattaagaa aaaatacggg tagaattgga 6000

gtgccccaat tgtgccaaga tggactcatc taggacaatt gggctgtact 6050

ttgattctgc ccattcttct agcaacctgt tagcatttcc gatcgtccta 6100

caagacacag gagatgggaa gaagcaaatc gccccgcaat ataggatcca 6150

gcgccttgac ttgtggactg atagtaagga ggactcagta ttcatcacca 6200

cctatggatt catctttcaa gttgggaatg aagaagccac tgtcggcatg 6250

atcgatgata aacccaagcg cgagttactt tccgctgcga tgctctgcct 6300

aggaagcgtc ccaaataccg gagaccttat tgagctggca agggcctgtc 6350

tcactatgat agtcacatgc aagaagagtg caactaatac tgagagaatg 6400

gttttctcag tagtgcaggc accccaagtg ctgcaaagct gtagggttgt 6450

ggcaaacaaa tactcatcag tgaatgcagt caagcacgtg aaagcgccag 6500

agaagattcc cgggagtgga accctagaat acaaggtgaa ctttgtctcc 6550

ttgactgtgg taccgaagaa ggatgtctac aagatcccag ctgcagtatt 6600

gaaggtttct ggctcgagtc tgtacaatct tgcgctcaat gtcactatta 6650

atgtggaggt agacccgagg agtcctttgg ttaaatctct gtctaagtct 6700

gacagcggat actatgctaa cctcttcttg catattggac ttatgaccac 6750

cgtagatagg aaggggaaga aagtgacatt tgacaagctg gaaaagaaaa 6800

taaggagcct tgatctatct gtcgggctca gtgatgtgct cgggccttcc 6850

gtgttggtaa aagcaagagg tgcacggact aagcttttgg cacctttctt 6900

ctctagcagt gggacagcct gctatcccat agcaaatgct tctcctcagg 6950

tggccaagat actctggagt caaaccgcgt gcctgcggag cgttaaaatc 7000

attatccaag caggtaccca acgcgctgtc gcagtgaccg ccgaccacga 7050

ggttacctct actaagctgg agaaggggca cacccttgcc aaatacaatc 7100

cttttaagaa ataagctgcg tctctgagat tgcgctccgc ccactcaccc 7150

agatcatcat gacacaaaaa actaatctgt cttgattatt tacagttagt 7200

ttacctgtct atcaagttag aaaaaacacg ggtagaagat tctggatccc 7250

ggttggcgcc ctccaggtgc aagatgggct ccagaccttc taccaagaac 7300

ccagcaccta tgatgctgac tatccgggtt gcgctggtac tgagttgcat 7350

ctgtccggca aactccattg atggcaggcc tcttgcagct gcaggaattg 7400

tggttacagg agacaaagcc gtcaacatat acacctcatc ccagacagga 7450

tcaatcatag ttaagctcct cccgaatctg cccaaggata aggaggcatg 7500

tgcgaaagcc cccttggatg catacaacag gacattgacc actttgctca 7550

ccccccttgg tgactctatc cgtaggatac aagagtctgt gactacatct 7600

ggagggggga gacaggggcg ccttataggc gccattattg gcggtgtggc 7650

tcttggggtt gcaactgccg cacaaataac agcggccgca gctctgatac 7700

aagccaaaca aaatgctgcc aacatcctcc gacttaaaga gagcattgcc 7750

gcaaccaatg aggctgtgca tgaggtcact gacggattat cgcaactagc 7800

agtggcagtt gggaagatgc agcagtttgt taatgaccaa tttaataaaa 7850

cagctcagga attagactgc atcaaaattg cacagcaagt tggtgtagag 7900

ctcaacctgt acctaaccga attgactaca gtattcggac cacaaatcac 7950

ttcacctgct ttaaacaagc tgactattca ggcactttac aatctagctg 8000

gtggaaatat ggattactta ttgactaagt taggtgtagg gaacaatcaa 8050

ctcagctcat taatcggtag cggcttaatc accggtaacc ctattctata 8100

cgactcacag actcaactct tgggtataca ggtaactcta ccttcagtcg 8150

ggaacctaaa taatatgcgt gccacctact tggaaacctt atccgtaagc 8200

acaaccaggg gatttgcctc ggcacttgtc ccaaaagtgg tgacacaggt 8250

cggttctgtg atagaagaac ttgacacctc atactgtata gaaactgact 8300

tagatttata ttgtacaaga atagtaacgt tccctatgtc ccctggtatt 8350

tattcctgct tgagcggcaa tacgtcggcc tgtatgtact caaagaccga 8400

aggcgcactt actacaccat acatgactat caaaggttca gtcatcgcca 8450

actgcaagat gacaacatgt agatgtgtaa accccccggg tatcatatcg 8500

caaaactatg gagaagccgt gtctctaata gataaacaat catgcaatgt 8550

tttatcctta ggcgggataa ctttaaggct cagtggggaa ttcgatgtaa 8600

cttatcagaa gaatatctca atacaagatt ctcaagtaat aataacaggc 8650

aatcttgata tctcaactga gcttgggaat gtcaacaact cgatcagtaa 8700

tgctttgaat aagttagagg aaagcaacag aaaactagac aaagtcaatg 8750

tcaaactgac tagcacatct gctctcatta cctatatcgt tttgactatc 8800

atatctcttg tttttggtat acttagcctg attctagcat gctacctaat 8850

gtacaagcaa aaggcgcaac aaaagacctt attatggctt gggaataata 8900

ctctagatca gatgagagcc actacaaaaa tgtgaacaca gatgaggaac 8950

gaaggtttcc ctaatagtaa tttgtgtgaa agttctggta gtctgtcagt 9000

taagaaaaaa tacgggtaga aggttaacgc caccatggca caagtcatta 9050

atacaaacag cctgtcgctg ttgacccaga ataacctgaa caaatcccag 9100

tccgctctgg gcaccgctat cgagcgtctg tcttccggtc tgcgtatcaa 9150

cagcgcgaaa gacgatgcgg caggtcaggc gattgctaac cgttttaccg 9200

cgaacatcaa aggtctgact caggcttccc gtaacgctaa cgacggtatc 9250

tccattgcgc agaccactga aggcgcgctg aacgaaatca acaacaacct 9300

gcagcgtgtg cgtgaactgg cggttcagtc tgctaacagc accaactccc 9350

agtctgacct cgactccatc caggctgaaa tcacccagcg cctgaacgaa 9400

atcgaccgtg tatccggcca gactcagttc aacggcgtga aagtcctggc 9450

gcaggacaac accctgacca tccaggttgg tgccaacgac ggtgaaacta 9500

tcgatatcga tctgaagcag atcaactctc agaccctggg tctggatacg 9550

ctgaatgtgc aacaaaaata taaggtcagc gatacggctg caactgttac 9600

aggatatgcc gatactacga ttgctttaga caatagtact tttaaagcct 9650

cggctactgg tcttggtggt actgaccaga aaattgatgg cgatttaaaa 9700

tttgatgata cgactggaaa atattacgcc aaagttaccg ttacgggggg 9750

aactggtaaa gatggctatt atgaagtttc cgttgataag acgaacggtg 9800

aggtgactct tgctggcggt gcgacttccc cgcttacagg tggactacct 9850

gcgacagcaa ctgaggatgt gaaaaatgta caagttgcaa atgctgattt 9900

gacagaggct aaagccgcat tgacagcagc aggtgttacc ggcacagcat 9950

ctgttgttaa gatgtcttat actgataata acggtaaaac tattgatggt 10000

ggtttagcag ttaaggtagg cgatgattac tattctgcaa ctcaaaataa 10050

agatggttcc ataagtatta atactacgaa atacactgca gatgacggta 10100

catccaaaac tgcactaaac aaactgggtg gcgcagacgg caaaaccgaa 10150

gttgtttcta ttggtggtaa aacttacgct gcaagtaaag ccgaaggtca 10200

caactttaaa gcacagcctg atctggcgga agcggctgct acaaccaccg 10250

aaaacccgct gcagaaaatt gatgctgctt tggcacaggt tgacacgtta 10300

cgttctgacc tgggtgcggt acagaaccgt ttcaactccg ctattaccaa 10350

cctgggcaac accgtaaaca acctgacttc tgcccgtagc cgtatcgaag 10400

attccgacta cgcgaccgaa gtttccaaca tgtcacgcgc gcagattctg 10450

cagcaggccg gtacctccgt tctggcgcag gcgaaccagg ttccgcaaaa 10500

cgtcctctct ttactgcgtt aaacgcgtgg cctgagaggc cttcagagag 10550

ttaagaaaaa actaccggtt gtagatgacc aaaggacgat atacgggtag 10600

aacggtaaga gaggccgccc ctcaattgcg agccaggctt cacaacctcc 10650

gttctaccgc ttcaccgaca acagtcctca atcatggacc gcgccgttag 10700

ccaagttgcg ttagagaatg atgaaagaga ggcaaaaaat acatggcgct 10750

tgatattccg gattgcaatc ttattcttaa cagtagtgac cttggctata 10800

tctgtagcct cccttttata tagcatgggg gctagcacac ctagcgatct 10850

tgtaggcata ccgactagga tttccagggc agaagaaaag attacatcta 10900

cacttggttc caatcaagat gtagtagata ggatatataa gcaagtggcc 10950

cttgagtctc cgttggcatt gttaaatact gagaccacaa ttatgaacgc 11000

aataacatct ctctcttatc agattaatgg agctgcaaac aacagtgggt 11050

ggggggcacc tatccatgac ccagattata taggggggat aggcaaagaa 11100

ctcattgtag atgatgctag tgatgtcaca tcattctatc cctctgcatt 11150

tcaagaacat ctgaatttta tcccggcgcc tactacagga tcaggttgca 11200

ctcgaatacc ctcatttgac atgagtgcta cccattactg ctacacccat 11250

aatgtaatat tgtctggatg cagagatcac tcacattcat atcagtattt 11300

agcacttggt gtgctccgga catctgcaac agggagggta ttcttttcta 11350

ctctgcgttc catcaacctg gacgacaccc aaaatcggaa gtcttgcagt 11400

gtgagtgcaa ctcccctggg ttgtgatatg ctgtgctcga aagtcacgga 11450

gacagaggaa gaagattata actcagctgt ccctacgcgg atggtacatg 11500

ggaggttagg gttcgacggc cagtaccacg aaaaggacct agatgtcaca 11550

acattattcg gggactgggt ggccaactac ccaggagtag ggggtggatc 11600

ttttattgac agccgcgtat ggttctcagt ctacggaggg ttaaaaccca 11650

attcacccag tgacactgta caggaaggga aatatgtgat atacaagcga 11700

tacaatgaca catgcccaga tgagcaagac taccagattc gaatggccaa 11750

gtcttcgtat aagcctggac ggtttggtgg gaaacgcata cagcaggcta 11800

tcttatctat caaggtgtca acatccttag gcgaagaccc ggtactgact 11850

gtaccgccca acacagtcac actcatgggg gccgaaggca gaattctcac 11900

agtagggaca tctcatttct tgtatcaacg agggtcatca tacttctctc 11950

ccgcgttatt atatcctatg acagtcagca acaaaacagc cactcttcat 12000

agtccttata cattcaatgc cttcactcgg ccaggtagta tcccttgcca 12050

ggcttcagca agatgcccca actcgtgtgt tactggagtc tatacagatc 12100

catatcccct aatcttctat agaaaccaca ccttgcgagg ggtattcggg 12150

acaatgcttg atggtgtaca agcaagactt aaccctgcgt ctgcagtatt 12200

cgatagcaca tcccgcagtc gcattactcg agtgagttca agcagtacca 12250

aagcagcata cacaacatca acttgtttta aagtggtcaa gactaataag 12300

acctattgtc tcagcattgc tgaaatatct aatactctct tcggagaatt 12350

cagaatcgtc ccgttactag ttgagatcct caaagatgac ggggttagag 12400

aagccaggtc tggctagttg agtcaattat aaaggagttg gaaagatggc 12450

attgtatcac ctatcttctg cgacatcaag aatcaaaccg aatgccggcg 12500

cgtgctcgaa ttccatgttg ccagttgacc acaatcagcc agtgctcatg 12550

cgatcagatt aagccttgtc aatagtctct tgattaagaa aaaatgtaag 12600

tggcaatgag atacaaggca aaacagctca tggtaaataa tacgggtagg 12650

acatggcgag ctccggtcct gaaagggcag agcatcagat tatcctacca 12700

gagtcacacc tgtcttcacc attggtcaag cacaaactac tctattactg 12750

gaaattaact gggctaccgc ttcctgatga atgtgacttc gaccacctca 12800

ttctcagccg acaatggaaa aaaatacttg aatcggcctc tcctgatact 12850

gagagaatga taaaactcgg aagggcagta caccaaactc ttaaccacaa 12900

ttccagaata accggagtgc tccaccccag gtgtttagaa gaactggcta 12950

atattgaggt cccagattca accaacaaat ttcggaagat tgagaagaag 13000

atccaaattc acaacacgag atatggagaa ctgttcacaa ggctgtgtac 13050

gcatatagag aagaaactgc tggggtcatc ttggtctaac aatgtccccc 13100

ggtcagagga gttcagcagc attcgtacgg atccggcatt ctggtttcac 13150

tcaaaatggt ccacagccaa gtttgcatgg ctccatataa aacagatcca 13200

gaggcatctg atggtggcag ctaggacaag gtctgcggcc aacaaattgg 13250

tgatgctaac ccataaggta ggccaagtct ttgtcactcc tgaacttgtc 13300

gttgtgacgc atacgaatga gaacaagttc acatgtctac ccaggaactt 13350

gtattgatgt tatgcagata tgatggaggg cagagatatg gtcaacataa 13400

tatcaaccac ggcggtgcat ctcagaagct tatcagagaa aattgatgac 13450

attttgcggt taatagacgc tctggcaaaa gacttgggta atcaagtcta 13500

cgatgttgta tcactaatgg agggatttgc atacggagct gtccagctac 13550

tcgagccgtc aggtacattt gcaggagatt tcttcgcatt caacctgcag 13600

gagcttaaag acattctaat tggcctcctc cccaatgata tagcagaatc 13650

cgtgactcat gcaatcgcta ctgtattctc tggtttagaa cagaatcaag 13700

cagctgagat gttgtgtctg ttgcgtctgt ggggtcaccc actgcttgag 13750

tcccgtattg cagcaaaggc agtcaggagc caaatgtgcg caccgaaaat 13800

ggtagacttt gatatgatcc ttcaggtact gtctttcttc aagggaacaa 13850

tcatcaacgg gtacagaaag aagaatgcag gtgtgtggcc gcgagtcaaa 13900

gtggatacaa tatatgggaa ggtcattggg caactacatg cagattcagc 13950

agagatttca cacgatatca tgttgagaga gtataagagt ttatctgcac 14000

ttgaatttga gccatgtata gaatatgacc ctgtcaccaa cctgagcatg 14050

ttcctaaaag acaaggcaat cgcacacccc aacgataatt ggcttgcctc 14100

gtttaggcgg aaccttctct ccgaagacca gaagaaacat gtaaaagaag 14150

caacttcgac taatcgcctc ttgatagagt ttttagagtc aaatgatttt 14200

gatccatata aagagatgga atatctgacg acccttgagt accttagaga 14250

tgacaatgtg gcagtatcat actcgctcaa ggagaaggaa gtgaaagtta 14300

atggacggat cttcgctaag ctgacaaaga agttaaggaa ctgtcaggtg 14350

atggcggaag ggatcctagc cgatcagatt gcacctttct ttcagggaaa 14400

tggagtcatt caggatagca tatccttgac caagagtatg ctagcgatga 14450

gtcaactgtc ttttaacagc aataagaaac gtatcactga ctgtaaagaa 14500

agagtatctt caaaccgcaa tcatgatccg aaaagcaaga accgtcggag 14550

agttgcaacc ttcataacaa ctgacctgca aaagtactgt cttaattgga 14600

gatatcagac aatcaaattg ttcgctcatg ccatcaatca gttgatgggc 14650

ctacctcact tcttcgaatg gattcaccta agactgatgg acactacgat 14700

gttcgtagga gaccctttca atcctccaag tgaccctact gactgtgacc 14750

tctcaagagt ccctaatgat gacatatata ttgtcagtgc cagagggggt 14800

atcgaaggat tatgccagaa gctatggaca atgatctcaa ttgctgcaat 14850

ccaacttgct gcagctagat cgcattgtcg tgttgcctgt atggtacagg 14900

gtgataatca agtaatagca gtaacgagag aggtaagatc agacgactct 14950

ccggagatgg tgttgacaca gttgcatcaa gccagtgata atttcttcaa 15000

ggaattaatt catgtcaatc atttgattgg ccataatttg aaggatcgtg 15050

aaaccatcag gtcagacaca ttcttcatat acagcaaacg aatcttcaaa 15100

gatggagcaa tcctcagtca agtcctcaaa aattcatcta aattagtgct 15150

agtgtcaggt gatctcagtg aaaacaccgt aatgtcctgt gccaacattg 15200

cctctactgt agcacggcta tgcgagaacg ggcttcccaa agacttctgt 15250

tactatttaa actatataat gagttgtgtg cagacatact ttgactctga 15300

gttctccatc accaacaatt cgcaccccga tcttaatcag tcgtggattg 15350

aggacatctc ttttgtgcac tcatatgttc tgactcctgc ccaattaggg 15400

ggactgagta accttcaata ctcaaggctc tacactagaa atatcggtga 15450

cccggggact actgcttttg cagagatcaa gcgactagaa gcagtgggat 15500

tactgagtcc taacattatg actaatatct taactaggcc gcctgggaat 15550

ggagattggg ccagtctgtg caacgaccca tactctttca attttgagac 15600

tgttgcaagc ccaaatattg ttcttaagaa acatacgcaa agagtcctat 15650

ttgaaacttg ttcaaatccc ttattgtctg gagtgcacac agaggataat 15700

gaggcagaag agaaggcatt ggctgaattc ttgcttaatc aagaggtgat 15750

tcatccccgc gttgcgcatg ccatcatgga ggcaagctct gtaggtagga 15800

gaaagcaaat tcaagggctt gttgacacaa caaacaccgt aattaagatt 15850

gcgcttacta ggaggccatt aggcatcaag aggctgatgc ggatagtcaa 15900

ttattctagc atgcatgcaa tgctgtttag agacgatgtt ttttcctcca 15950

gtagatccaa ccacccctta gtctcttcta atatgtgttc tctgacactg 16000

gcagactatg cacggaatag aagctggtca cctttgacgg gaggcaggaa 16050

aatactgggt gtatctaatc ctgatacgat agaactcgta gagggtgaga 16100

ttcttagtgt aagcggaggg tgtacaagat gtgacagcgg agatgaacaa 16150

tttacttggt tccatcttcc aagcaatata gaattgaccg atgacaccag 16200

caagaatcct ccgatgaggg taccatatct cgggtcaaag acacaggaga 16250

ggagagctgc ctcacttgca aaaatagctc atatgtcgcc acatgtaaag 16300

gctgccctaa gggcatcatc cgtgttgatc tgggcttatg gggataatga 16350

agtaaattgg actgctgctc ttacgattgc aaaatctcgg tgtaatgtaa 16400

acttagagta tcttcggtta ctgtcccctt tacccacggc tgggaatctt 16450

caacatagac tagatgatgg tataactcag atgacattca cccctgcatc 16500

tctctacagg gtgtcacctt acattcacat atccaatgat tctcaaaggc 16550

tgttcactga agaaggagtc aaagagggga atgtggttta ccaacagatc 16600

atgctcttgg gtttatctct aatcgaatcg atctttccaa taacaacaac 16650

caggacatat gatgagatca cactgcacct acatagtaaa tttagttgct 16700

gtatcagaga agcacctgtt gcggttcctt tcgagctact tggggtggta 16750

ccggaactga ggacagtgac ctcaaataag tttatgtatg atcctagccc 16800

tgtatcggag ggagactttg cgagacttga cttagctact ttcaagagtt 16850

atgagcttaa tctggagtca tatcccacga tagagctaat gaacattctt 16900

tcaatatcca gcgggaagtt gattggccag tctgtggttt cttatgatga 16950

agatacctcc ataaagaatg acgccataat agtgtatgac aatacccgaa 17000

attggatcag tgaagctcag aattcagatg tggtccgcct atttgaatat 17050

gcagcacttg aagtgctcct cgactgttct taccaactct attacctgag 17100

agtaagaggc ctagacaata ttgtcttata tatgggtgat ttatacaaga 17150

atatgccagg aattctactt tccaacattg cagctacaat atctcatccc 17200

gtcattcatt caaggttaca tgcagtgggc ctggtcaacc atgacggatc 17250

acaccaactt gcagatacgg attttatcga aatgtctgca aaactattag 17300

tatcttgcac ccgacgtgtg atctccggct tatattcagg aaataagtat 17350

gatctgctgt tcccatctgt cttagatgat aacctgaatg agaagatgct 17400

tcagctgata tcccggttat gctgtctgta cacggtactc tttgctacaa 17450

caagagaaat cccgaaaata agaggcttaa ctgcagaaga gaaatgttca 17500

atactcactg agtatttact gtcggatgct gtgaaaccat tacttagtcc 17550

cgatcaagtg agctctatca tgtctcctaa cataattaca ttcccagcta 17600

atctgtacta catgtctcgg aagagcctca atttgatcag ggaaagggag 17650

gacagggata ctatcctggc gttgttgttc ccccaagagc cattattaga 17700

gttcccttct gtgcaagata ttggtgctcg agtgaaagat ccattcaccc 17750

gacaacctgc ggcatttttg caagagttag atttgagtgc tccagcaagg 17800

tatgacgcat tcacacttag tcagattcat cctgaactca catctccaaa 17850

tccggaggaa gactacttag tacgatactt gttcagaggg atagggactg 17900

catcttcctc ttggtataag gcatctcatc tcctttctgt acccgaggta 17950

agatgtgcaa gacacgggaa ctccttatac ttagctgaag ggagcggagc 18000

catcatgagt cttctcgaac tgcatgtacc acatgaaact atctattaca 18050

atacgctctt ttcaaatgag atgaaccccc cgcaacgaca tttcgggccg 18100

accccaactc agtttttgaa ttcggttgtt tataggaatc tacaggcgga 18150

ggtaacatgc aaagatggat ttgtccaaga gttccgtcca ttatggagag 18200

aaaatacaga ggaaagtgac ctgacctcag ataaagtagt ggggtatatt 18250

acatctgcag tgccctacag atctgtatca ttgctgcatt gtgacattga 18300

aattcctcca gggtccaatc aaagcttact agatcaacta gctatcaatt 18350

tatctctgat tgccatgcat tctgtaaggg agggcggggt agtaatcatc 18400

aaagtgttgt atgcaatggg atactacttt catctactca tgaacttgtt 18450

tgctccgtgt tccacaaaag gatatattct ctctaatggt tatgcatgtc 18500

gaggagatat ggagtgttac ctggtatttg tcatgggtta cctgggcggg 18550

cctacatttg tacatgaggt ggtgaggatg gcgaaaactc tggtgcagcg 18600

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agattaataa agtacttgag gaagaatatt gacactgcgc tgattgaagc 18750

cgggggacag cccgtccgtc cattctgtgc ggagagtctg gtgagcacgc 18800

tagcgaacat aactcagata acccagatca tcgctagtca cattgacaca 18850

gttatccggt ctgtgatata tatggaagct gagggtgatc tcgctgacac 18900

agtatttcta tttacccctt acaatctctc tactgacggg aaaaagagga 18950

catcacttaa acagtgcacg agacagatcc tagaggttac aatactaggt 19000

cttagagtcg aaaatctcaa taaaataggc gatataatca gcctagtgct 19050

taaaggcatg atctccatgg aggaccttat cccactaagg acatacttga 19100

agcatagtac ctgccctaaa tatttgaagg ctgtcctagg tattaccaaa 19150

ctcaaagaaa tgtttacaga cacttctgta ctgtacttga ctcgtgctca 19200

acaaaaattc tacatgaaaa ctataggcaa tgcagtcaaa ggatattaca 19250

gtaactgtga ctcttaacga aaatcacata ttaataggct ccttttttgg 19300

ccaattgtat tcttgttgat ttaatcatat tatgttagaa aaaagttgaa 19350

ccctgactcc ttaggactcg aattcgaact caaataaatg tcttaaaaaa 19400

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tgtttggttt ggtggccggc atggtcccag cctcctcgct ggcgccggct 19500

gggcaacatt ccgaggggac cgtcccctcg gtaatggcga atgggacgcg 19550

gccgatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc 19600

caccgctgag caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct 19650

tgaggggttt tttgctgaaa ggaggaacta tatccggatc ggccgatccg 19700

gctgctaaca aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga 19750

gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt 19800

ttttgctgaa aggaggaact atatccggat ggccgccacc ggtgggcctt 19850

gcagcacatc cccccttcgc cag 19873

Claims

1.重组质粒pBrClone30-fliC，所述重组质粒pBrClone30-fliC为具有序列表的序列3自5’末端第2703-19461位核苷酸所示的DNA分子的质粒。

2.一种鸡新城疫病毒毒株，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-fliC以及相应的辅助质粒pBL-N、pBL-P和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株。

3.一种鸡新城疫病毒毒株，其基因组DNA如序列表的序列3自5’末端第2703-19461位核苷酸所示。

4.权利要求1至3中任一所述的鸡新城疫病毒毒株在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。

5.一种鸡新城疫病疫苗，包括权利要求1至3中任一所述的鸡新城疫病毒毒株。