CN103386129A - 作为鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株免疫佐剂的鞭毛蛋白及其应用 - Google Patents

作为鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株免疫佐剂的鞭毛蛋白及其应用 Download PDF

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王静
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张磊
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李求春
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耿士忠
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Abstract

本发明涉及一种具有佐剂效应的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白，该鞭毛蛋白在沙门菌ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)菌体表面表达而提取。该鞭毛蛋白作为鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株免疫佐剂，可有效增强疫苗的免疫应答。

Description

作为鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株免疫佐剂的鞭毛蛋白及其应用
技术领域
本发明涉及一种鞭毛蛋白作为鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株免疫佐剂，可有效增强疫苗的免疫应答。
背景技术
新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种禽类急性高度接触性传染病，严重威胁着养禽业。一般使用灭活苗和弱毒苗进行免疫预防，效果确实，在疾病的防控中发挥巨大的作用。
鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要结构蛋白，由4个球形结构域（D0，D1，D2和D3）构成，其中D0和D1结构域高度保守。胞外鞭毛蛋白被TLR5分子识别后，通过接头蛋白MyD88活化下游分子，最终激活NF-κB信号通路，在转录水平上调节多种前炎性因子基因的表达。研究表明，鞭毛蛋白作为固有免疫的诱导剂，诱导产生的固有免疫应答可启动针对外源抗原的获得性免疫应答，显示出鞭毛蛋白作为免疫佐剂的效应（Mizel SB,Bates JT.Flagellin as an adjuvant:cellular mechanisms and potential.The Journal of Immunology,2010,185(10):5677-5682）。最近研究显示，以沙门菌鞭毛蛋白作为佐剂，与禽流感病毒颗粒联合免疫后，可促进鸡产生更强的黏膜免疫应答（Chaung HC,Cheng LT,Hung LH,Tsai PC,Skountzou I,Wang B,Compans RW,Lien YY.Salmonella flagellin enhances mucosal immunity of avian influenza vaccine in chickens.Veterinary Microbiology,2012,157(1-2):69-77）。本实验室构建出沙门菌ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)，采用酸裂解提取该菌的鞭毛蛋白，与OVA混合免疫6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，可提高OVA特异性抗体的水平（《一种可用作免疫佐剂的改良型鞭毛蛋白及其制备与应用》，中国专利申请，公开号：CN103044530A）。
发明内容
本发明的目的是将鞭毛蛋白作为一种佐剂，添加到商品化的鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株中，增强机体的免疫应答。
本发明所述的鞭毛蛋白，是从沙门菌ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)中提取。宿主菌经IPTG诱导后，可在细菌表面长出重组鞭毛。经酸裂解法提取，可得到高纯度的野生型鞭毛蛋白（FliC），与商品化的鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株混合后，滴鼻免疫1周龄的SPF鸡，可提高新城疫抗体水平，具有良好的疫苗免疫佐剂应用前景。
附图说明
图1．SDS-PAGE分析重组鞭毛蛋白。M.蛋白Marker；1.FliC。
图2．3免14天后血清中IgG抗体水平。
图3．3免14天后血凝抑制抗体滴度。
具体实施方式
一、沙门菌鞭毛蛋白的制备
沙门菌ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)鞭毛蛋白的提取程序为：沙门菌ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)单菌落接种10mL M-broth，37℃静置培养16～18h后以1:100比例将培养液转接种于500mL M-肉汤中，37℃静置培养16～18h；3000rpm离心收集细菌，PBS洗1次，20mL PBS重悬；使用1N HCl调pH至2.0，室温150rpm振荡30min裂解细菌；10000rpm，离心20min去除细菌碎片；取上清18000rpm，离心l h，去除杂质；上清用1N NaOH溶液调pH至7.2；冰浴条件下，将上清置于磁力搅拌器上缓缓加入饱和硫酸铵，至饱和度达到67%。之后，4℃过夜，15000rpm离心30min；5mL PBS重悬沉淀，在PBS缓冲液中4℃透析48h，每隔12h换一次PBS缓冲液；蛋白经SDS-PAGE分析，大小约为50KD（图1）。应用ProteoSpinTMEndotoxin Removal Maxi试剂盒去除所提取鞭毛蛋白的内毒素。
二、疫苗
商品化的鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株（兽药生字（2011）170262007，批号20120102），由武汉中博生物股份有限公司生产。
三、动物免疫及抗体检测
1．动物免疫
将1周龄的SPF鸡分为3组，每组8只，滴鼻免疫，共免疫3次，每次免疫间隔时间为14d。免疫剂量分别为：LaSota疫苗免疫组（0.05mL/羽），LaSota+FliC免疫组（LaSota疫苗0.05mL+FliC50μg/羽），PBS空白对照组（0.05mL/羽）。于三免后4周进行翅静脉采血，制备血清样品，检测血清中NDV特异性IgG抗体水平和血凝抑制抗体滴度。
2．血清样品NDV特异性IgG抗体检测
用ELISA检测血清样品抗体：将LaSota病毒原液稀释28倍，100μL/孔，4℃包被过夜，用0.05%PBST洗板3次后，以每孔加入200μL含有1%BSA的PBS4℃封闭过夜；同上洗板4次后，每孔加入100μL血清样品，37℃作用2h，同上洗板5次后，每孔加入1:10000稀释的兔抗鸡HRP-IgG，37℃作用1h，同上洗板6次后，OPD显色，2M H2SO4终止液，酶标仪测定OD492nm值。结果显示，三免后14d，LaSota+FliC免疫组的NDV特异性IgG抗体水平显著高于LaSota疫苗免疫组（P<0.05）（图2）。
3.血凝抑制（HI）抗体检测
根据LaSota病毒血凝价制备4单位病毒，即将病毒原液稀释29倍；于96孔微量反应板上每孔加25μL PBS；第一孔加被检血清(LaSota疫苗组、LaSota+FliC组、PBS组)25μL，混合均匀，再吸取25μL液体小心地移至第2孔，如此连续稀释至第10孔，最后第10孔吸取25μL液体弃掉；被检血清稀释倍数依次为1:2～1:1024，第12孔为红细胞对照；每孔再加入含有4单位的病毒液25μL至第11孔，第12孔为红细胞对照孔，不加病毒液；置振荡器上振荡10s后，放4℃静置30min；每孔再加入1.0％红细胞悬浮液25μL，放振荡器上振荡10s混匀，置37℃，15min后判定结果。结果显示，三免后14d，LaSota+FliC免疫组的血凝抑制抗体滴度均显著高于LaSota疫苗免疫组（P<0.05）（图3）。

Claims (2)

1.一种具有佐剂效应的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白，该鞭毛蛋白在沙门菌ATCC14028s(pTrc99a-fliC-WT)菌体表面表达而提取。
2.一种鸡新城疫低毒力活疫苗免疫佐剂的应用，其特征在于，将权利1所述鞭毛蛋白以50μg的剂量与商品化的鸡新城疫低毒力活疫苗LaSota株混合后，通过滴鼻途径免疫。
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