CN112250738B

CN112250738B - 严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定方法

Info

Publication number: CN112250738B
Application number: CN202010912170.2A
Authority: CN
Inventors: 米友军; 谢涛; 祝秉东; 谭继英; 雒艳萍; 牛红霞; 李菲; 韩江媛; 吕薇; 王娟
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2040-09-02
Also published as: CN112250738A

Abstract

本发明提供严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：将pFastBacDual双表达载体改造为三表达载体，将SARS‑CoV‑2的M、S、E基因进行密码子优化，然后将密码子优化的M、S基因依次分别构建至多角体蛋白pPH启动子后，将E基因构建至pP10启动子后，获得表达EMS重组质粒；将EMS重组质粒转化至DH10 Bac^TM大肠杆菌中，经蓝白筛选挑取白色阳性克隆，提取杆粒转染ExpiSf9^TM细胞，胞内共表达E、M、S结构蛋白，自组装形成病毒样颗粒。本发明成功构建了EMS三表达载体，并利用杆状昆虫系统在ExpiSf9^TM细胞内成功表达了SARS‑CoV‑2VLPs。

Description

严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定方法

技术领域

本发明涉及严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)的制备、纯化和鉴定方法。

背景技术

自21世纪以来，全球已出现三次冠状病毒爆发流行。相比严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸道冠状病毒(MERS-CoV)，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)传播更快，传染指数2.6左右，目前对于SARS-CoV-2引起的冠状病毒病2019(COVID-19)没有特效药物，疫苗是预防和控制传染病的最有效和最经济的方法，急需开发针对SARS-CoV-2的疫苗，以预防和控制该病毒的传播。世界卫生组织估计，目前约有133种疫苗正在研制中。

目前冠状病毒疫苗形式多样，包括灭活病毒或减毒活病毒、基于蛋白质的疫苗、核酸疫苗等。灭活病毒或减毒活病毒需要在生物安全等级3(BSL3)条件下大量培养病毒，并需要进行广泛的安全测试，过程昂贵，费力且安全风险高。基于蛋白质的亚单位疫苗由于靶蛋白的不正确折叠或向免疫系统的展示不佳，使得一些亚单位疫苗的免疫原性很差。核酸疫苗无法有效地进入细胞，需要在注射后进行电穿孔，并且mRNA不是非常稳定，并需要多次接种。作为一类特定的亚单位疫苗，病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)能够模拟病毒天然形态结构，并具有不含病毒基因组核酸、无法复制、个体重复接种等特性。VLPs由于其强大的免疫原性，引发保护性中和抗体的能力以及可靠的安全性，因此可用于重组疫苗开发，有广阔的市场应用前景。目前已成功上市基于VLPs的有HPV疫苗和乙肝疫苗。

SARS-CoV-2基因组的3′端编码4种主要结构蛋白，包括刺突(S)蛋白，核衣壳(N)蛋白，膜(M)蛋白和包膜(E)蛋白，根据以往研究，SARS-CoVVLPs、MERS-CoVVLPs的构成同时需要E、M、S三种蛋白。在本发明中，构建了同时表达E、M、S三种蛋白的EMS载体，利用Bac toBac杆状病毒昆虫表达系统，在ExpiSf9^TM细胞内实现E、M、S三种蛋白的共表达，并在细胞内自组装形成VLPs。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)的制备、纯化和鉴定方法。

本发明提供严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)、将pFastBacDual双表达载体改造为三表达载体，将SARS-CoV-2的M、S、E基因进行密码子优化，然后将密码子优化的M、S基因依次分别构建至多角体蛋白启动子后，将E基因构建至pP10启动子后，获得表达EMS重组质粒；

(2)将EMS重组质粒转化至DH10 Bac^TM大肠杆菌中，经蓝白筛选挑取白色阳性克隆，提取杆粒转染ExpiSf9^TM细胞，胞内共表达E、M、S结构蛋白，自组装形成病毒样颗粒。

作为优选，所述将pFastBacDual双表达载体改造为三表达载体是依次在pFastBacDual载体多克隆位点MCS2后，插入pPH启动子、多克隆位点MCS3及SV40 polyA尾，改造成三表达载体。

作为进一步优选，所述多克隆位点MCS2包含BamHI、RsrII、BssHII、EcoRI酶切位点，多克隆位点MCS3包含酶切位点NdeI、HindIII酶切位点。

作为再进一步优选，所述多克隆位点MCS2的核苷酸序列为：GGATCCCGGTCCGAAGCGCGCGGAATTC；所述MCS3的核苷酸序列为：CATATGAAGCTT。

作为优选，所述密码子优化后的SARS-CoV-2E基因的核苷酸序列为序列表SEQ IDNO.4。

作为优选，所述密码子优化后的SARS-CoV-2M基因的核苷酸序列为序列表SEQ IDNO.5。

作为优选，所述密码子优化后的SARS-CoV-2S基因的核苷酸序列为序列表SEQ IDNO.6。

作为优选，将EMS重组质粒先转化入Top10感受态细胞，重新提取重组质粒后转化至DH10 Bac^TM大肠杆菌感受态细胞。

本发明提供上述的严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的纯化方法，将严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒用蔗糖密度梯度离心法进行纯化，收集30～40wt％之间的白色云雾状条带，用PBS稀释收集物，离心收集沉淀，PBS复溶，收集物为纯化的严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒。

本发明提供上述的严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的鉴定方法，Western Blot结果显示出现了大小为130kDa蛋白条带，则制备得到严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒；或，

透射电镜观察到直径80～120nm颗粒物，则制备得到严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒。

本发明将pFastBacDual双表达载体改造为三表达载体，并将严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的M、S基因分别构建至多角体蛋白启动子(polyhedrinpromotor，pPH)后，将E基因构建至pP10启动子后，获得表达EMS重组质粒；将重组质粒转化至DH10Bac^TM大肠杆菌中，转座后形成EMS重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid)，提取杆粒转染ExpiSf9^TM细胞，胞内共表达E、M、S结构蛋白，自组装形成病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)；再利用蔗糖密度梯度离心法纯化获得VLPs，并用Western Blot和透射电镜进行鉴定。结果显示：本发明成功构建三表达载体，并获得EMS重组质粒，测序一致。质粒转座后提取杆粒进行PCR鉴定，在预期目标处有清晰条带，测序鉴定一致。杆粒转染ExpiSf9^TM细胞后共表达E、M、S蛋白，自组装成VLPs。经蔗糖密度提取离心，在30wt％-40wt％处获得SARS-CoV-2VLPs，Western Blot检测可见特异性S条带，利用透射电镜可见直径为80～100nm的颗粒，形态和大小均与SARS-CoV-2一致。

本发明成功构建了EMS三表达载体，并利用杆状昆虫系统在ExpiSf9^TM细胞内成功表达了SARS-CoV-2VLPs，为今后疫苗的开发、发病机制的研究奠定了基础。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为EMS三表达载体构件图。

图2为EMS三表达质粒转座及二次筛选。

图3为重组杆粒PCR鉴定结果。

图4为ExpiSf9^TM细胞病变图。

图5为S蛋白WB鉴定结果。

图6为EMS VLPs透射电镜观察结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。“wt％”表示重量百分比。

实施例1

1材料与方法

1.1细胞ExpiSf9^TM细胞购自赛默飞世尔科技中国有限公司。

1.2载体双表达载体pFastBacDual购自赛默飞世尔科技中国有限公司；

1.3主要试剂及仪器

HiFi PCR SuperMix(全式金，中国)，S全长兔抗(sinobiological，中国)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(索莱宝，中国)，ECL化学发光显色液，0.4％台盼蓝染液；超净工作台、梯度PCR仪、伯乐公司凝胶成像仪、涡旋振荡器、PCR电泳凝胶成像系统、智诚公司水平轨道摇床、赛默飞培养箱、-80℃冰箱、高速冷冻离心机、小型离心机，超速离心机，FEITalos F200C电子显微镜。

1.4 EMS重组杆状病毒质粒的构建

1.4.1双表达载体改造为三表达载体pFastBacDual为双表达载体，依次在pFastBacDual载体多克隆位点MCS2 EcoRI酶切位点后，依次插入SV40 polyA尾、pPH启动子及多克隆位点MCS3，改造该载体为三表达载体。改造后MCS2多克隆位点包含BamHI、RsrII、BssHII、EcoRI酶切位点，MCS3包含酶切位点NdeI、HindIII酶切位点。

其中，改造后的MCS2的核苷酸序列为：

GGATCCCGGTCCGAAGCGCGCGGAATTC

BamHI GGATCC；RsrII CGGTCCG；BssHII GCGCGC；EcoRI GAATTC；

MCS3的核苷酸序列为：

CATATGAAGCTT

NdeI CATATG；HindIII AAGCTT；

改造后的三表达载体的核苷酸序列为：

TTCTCTGTCACAGAATGAAAATTTTTCTGTCATCTCTTCGTTATTAATGTTTGTAATTGACTGAATATCAACGCTTATTTGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAGACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAATAAATGGATGCCCTGCGTAAGCGGGTGTGGGCGGACAATAAAGTCTTAAACTGAACAAAATAGATCTAAACTATGACAATAAAGTCTTAAACTAGACAGAATAGTTGTAAACTGAAATCAGTCCAGTTATGCTGTGAAAAAGCATACTGGACTTTTGTTATGGCTAAAGCAAACTCTTCATTTTCTGAAGTGCAAATTGCCCGTCGTATTAAAGAGGGGCGTGGCCAAGGGCATGGTAAAGACTATATTCGCGGCGTTGTGACAATTTACCGAACAACTCCGCGGCCGGGAAGCCGATCTCGGCTTGAACGAATTGTTAGGTGGCGGTACTTGGGTCGATATCAAAGTGCATCACTTCTTCCCGTATGCCCAACTTTGTATAGAGAGCCACTGCGGGATCGTCACCGTAATCTGCTTGCACGTAGATCACATAAGCACCAAGCGCGTTGGCCTCATGCTTGAGGAGATTGATGAGCGCGGTGGCAATGCCCTGCCTCCGGTGCTCGCCGGAGACTGCGAGATCATAGATATAGATCTCACTACGCGGCTGCTCAAACCTGGGCAGAACGTAAGCCGCGAGAGCGCCAACAACCGCTTCTTGGTCGAAGGCAGCAAGCGCGATGAATGTCTTACTACGGAGCAAGTTCCCGAGGTAATCGGAGTCCGGCTGATGTTGGGAGTAGGTGGCTACGTCTCCGAACTCACGACCGAAAAGATCAAGAGCAGCCCGCATGGATTTGACTTGGTCAGGGCCGAGCCTACATGTGCGAATGATGCCCATACTTGAGCCACCTAACTTTGTTTTAGGGCGACTGCCCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTGCGTAACATCGTTGCTGCTCCATAACATCAAACATCGACCCACGGCGTAACGCGCTTGCTGCTTGGATGCCCGAGGCATAGACTGTACAAAAAAACAGTCATAACAAGCCATGAAAACCGCCACTGCGCCGTTACCACCGCTGCGTTCGGTCAAGGTTCTGGACCAGTTGCGTGAGCGCATACGCTACTTGCATTACAGTTTACGAACCGAACAGGCTTATGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCGTTTCCACGGTGTGCGTCACCCGGCAACCTTGGGCAGCAGCGAAGTCGAGGCATTTCTGTCCTGGCTGGCGAACGAGCGCAAGGTTTCGGTCTCCACGCATCGTCAGGCATTGGCGGCCTTGCTGTTCTTCTACGGCAAGGTGCTGTGCACGGATCTGCCCTGGCTTCAGGAGATCGGTAGACCTCGGCCGTCGCGGCGCTTGCCGGTGGTGCTGACCCCGGATGAAGTGGTTCGCATCCTCGGTTTTCTGGAAGGCGAGCATCGTTTGTTCGCCCAGGACTCTAGCTATAGTTCTAGTGGTTGGCCTACGTACCCGTAGTGGCTATGGCAGGGCTTGCCGCCCCGACGTTGGCTGCGAGCCCTGGGCCTTCACCCGAACTTGGGGGTTGGGGTGGGGAAAAGGAAGAAACGCGGGCGTATTGGTCCCAATGGGGTCTCGGTGGGGTATCGACAGAGTGCCAGCCCTGGGACCGAACCCCGCGTTTATGAACAAACGACCCAACACCCGTGCGTTTTATTCTGTCTTTTTATTGCCGTCATAGCGCGGGTTCCTTCCGGTATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTCCCCCATCTCCCGGTACCGCATGCTATGCATCAGCTGCTAGCACCATGGCTCGAGATCCCGGGTGATCAAGTCTTCGTCGAGTGATTGTAAATAAAATGTAATTTACAGTATAGTATTTTAATTAATATACAAATGATTTGATAATAATTCTTATTTAACTATAATATATTGTGTTGGGTTGAATTAAAGGTCCGTATACTCCGGAATATTAATAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCC GGTCCGAAGCGCGCGGAATTCAATTCGTCGAGAAGTACTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACACTCCGGAATATTAATAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTATTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGCATATGAAGC TTGTCGAGAAGTACTAGAGGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCTGATCACTGCTTGAGCCTAGGAGATCCGAACCAGATAAGTGAAATCTAGTTCCAAACTATTTTGTCATTTTTAATTTTCGTATTAGCTTACGACGCTACACCCAGTTCCCATCTATTTTGTCACTCTTCCCTAAATAATCCTTAAAAACTCCATTTCCACCCCTCCCAGTTCCCAACTATTTTGTCCGCCCACAGCGGGGCATTTTTCTTCCTGTTATGTTTTTAATCAAACATCCTGCCAACTCCATGTGACAAACCGTCATCTTCGGCTACTTT

1.4.2 E、M、S基因的确定根据肺炎病毒分离株第一株的完整基因组确定SARS-CoV-2E、M、S基因，根据基因序列对M、S基因进行密码子优化，以去除常用酶切位点。

SARS-CoV-2E基因的核苷酸序列为：

ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAACTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAA

密码子优化后的SARS-CoV-2M基因的核苷酸序列为：

ATGGCAGATTCCAACGGTACTATTACCGTTGAAGAGCTTAAAAAGCTCCTTGAACAATGGAACCTAGTAATAGGTTTCCTATTCCTTACATGGATTTGTCTTCTACAATTTGCCTATGCCAACAGGAATAGGTTTTTGTATATAATTAAGTTAATTTTCCTCTGGCTGTTATGGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTGTGCTTGCTGCTGTTTACAGAATAAATTGGATCACCGGTGGAATTGCTATCGCAATGGCTTGTCTTGTAGGCTTGATGTGGCTCAGCTACTTCATTGCTTCTTTCAGACTGTTTGCGCGTACGCGTTCCATGTGGTCATTCAATCCAGAAACTAACATTCTTCTCAACGTGCCACTCCATGGCACTATTCTGACCAGACCGCTTCTAGAAAGTGAACTCGTAATCGGAGCTGTGATCCTTCGTGGACATCTTCGTATTGCTGGACACCATCTAGGACGCTGTGACATCAAGGACCTGCCTAAAGAAATCACTGTTGCTACATCACGAACGCTTTCTTATTACAAATTGGGAGCTTCGCAGCGTGTAGCAGGTGACTCAGGTTTTGCTGCATACAGTCGCTACAGGATTGGCAACTATAAATTAAACACAGACCATTCCAGTAGCAGTGACAATATTGCTTTGCTTGTACAGTAA

密码子优化后的SARS-CoV-2S基因的核苷酸序列为：

ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTTGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAACTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATACGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATACGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCCTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATACGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCTTGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGTTCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACATAA

1.4.3重组质粒EMS质粒的构建将E基因插入pP10启动子后多克隆位点MCS1 KpnI、XhoI双酶切位点之间，M基因插入pPH启动子后多克隆位点MCS2 BamHI、EcoRI双酶切位点之间，S基因插入pPH启动子后多克隆位点MCS3 NdeI、HindIII双酶切位点之间，形成E-M-S结构，构建EMS三表达质粒。以上三表达载体改造、设计由本申请发明人完成，基因合成、插入载体由华大基因完成。

1.4.4杆粒获得及鉴定获得EMS质粒后，将其转化入Top10感受态细胞。重新提取重组质粒，42℃、60s进一步转化至DH10 Bac^TM大肠杆菌感受态细胞，37℃、250rpm培养3h后涂至含卡那霉素50ug/ml、庆大霉素7ug/ml、四环素10ug/ml、X-gal 200ug/ml、IPTG 40ug/ml的LB固体平板，48h后平板长出蓝白斑，挑选白色、大菌落重新在上述平板上进行第2次涂板筛选，挑选白色阳性克隆，过夜培养后1：100接种至新培养基继续培养12h，提取重组杆粒。EMS重组杆粒进行PCR鉴定及测序鉴定，所用引物见表1。

表1重组杆粒PCR鉴定引物

其中，S’是从S基因中选取的引物S′F至M13R间片段。

1.5重组杆状病毒EMS的构建及鉴定

将鉴定正确的步骤1.4.4中的EMS重组杆粒转染ExpiSf9^TM细胞，27℃、125rpm培养96h后，直至出现细胞病变效应达30％，3000rpm离心5min，收集细胞上清获得重组杆状病毒。

1.6 EMS VLPs的表达、纯化与鉴定

1.6.1表达E、M、S结构蛋白，自组装形成VLPs培养ExpiSf9^TM细胞，添加ExpiSf^TMEnhancer表达增强剂，18h后用步骤1.5获得的重组杆状病毒按照1：50体积感染ExpiSf9^TM细胞，细胞开始表达E、M、S结构蛋白，在27℃、125rpm，无二氧化碳，不需要加湿的环境中培养96h后观察病变效应，收集细胞。

其中，ExpiSf^TM Enhancer表达增强剂购买自赛默赛默飞世尔科技中国有限公司。

1.6.2 EMS VLPs的纯化3000g离心5min收集细胞，反复冻融3次，8000rpm离心后30min后，弃沉淀。上清100000g超速离心1h，收集沉淀，用PBS溶解。溶解后利用蔗糖密度梯度离心法纯化EMS VLPs，蔗糖密度梯度为30wt％、40wt％、50wt％，100000g超速离心2h，收集30～40wt％之间白色云雾状条带，用PBS稀释收集物，100000g超速离心1h，收集沉淀，PBS复溶，收集物为EMS VLPs。

1.6.3 EMS VLPs的鉴定收集后EMS VLPs进行Western Blot鉴定，样品用12％的SDS-PAGE进行分离，转移至PVDF膜，用含5％的脱脂奶粉封闭1.5个小时，用1:3000稀释的S全长兔抗过夜孵育，TBST洗涤3次，加入1:5000稀释的immunoway公司辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，TBST洗涤3次，索莱宝公司ECL化学发光显色液A液和B液体积1:1混合，滴加到PVDF膜上，放入化学发光成像仪中曝光并拍照。透射电镜观察EMS病毒样颗粒，铜网正面朝上滴加3-5ul EMS VLPs样品，吸附1-2min，用滤纸毛边吸走，去离子水洗三遍，滴1％磷钨酸染液8-10ul，染色30-60s，滤纸毛边吸走，干燥后电子显微镜观察。

2结果

2.1 SARS-CoV-2EMS三表达载体的构建

在pFastBacDual载体多克隆位点MCS2后，插入新pPH启动子、多克隆位点MCS3及SV40 polyA尾。将M、S基因分别插入三表达载体pPH启动子后，E基因插入pP10启动子后，获得EMS三表达载体，构建成功后经华大基因测序一致。

图1为EMS三表达载体构件图。

2.2 EMS三表达质粒转座及鉴定

EMS三表达质粒转化至DH10 BacTM大肠杆菌感受态，转座后可见蓝白菌落(图2a)挑选白色、大菌落经2次筛选，获得白色转座菌落(图2b)。挑选阳性菌落培养后提取杆粒，对E、M、S基因及插入片段进行PCR鉴定，可在相应位置获得目的条带(图3)，并送华大测序，序列一致。

图2为EMS三表达质粒转座及二次筛选。其中，a为EMS三表达质粒转座；b为转座后二次筛选。

图3为重组杆粒PCR鉴定结果。其中，a图1，2，3E基因PCR；4，5，6M基因PCR；b图1，2S基因PCR；c图1，2S’段PCR鉴定。

2.3 EMS转染，感染，表达过程中细胞变化

在病毒加入到细胞后，细胞会出现肿胀，细胞核变大(图4)，台盼蓝染色后观察细胞死亡率，与正常细胞相比可以看到细胞出现感染状态，荷包蛋样形态，表明重组杆状病毒包装成功。

图4为ExpiSf9^TM细胞病变图。其中，a：正常ExpiSf9^TM昆虫细胞(×10)；b：感染杆状病毒ExpiSf9^TM昆虫细胞(×10)；c：感染杆状病毒ExpiSf9^TM昆虫细胞(×40)。

2.4 Western Blot和透射电镜鉴定EMS表达结果

Western Blot结果显示，EMS VLP与S全长兔抗发生免疫反应，并且出现了大小为130kDa蛋白条带(图5)。为了鉴定EMS是否形成病毒样颗粒，通过透射电镜观察，结果观察到直径约80～120nm颗粒物(图6)，转染后的EMS成功装配成SARS-CoV-2病毒VLPs。

图5为S蛋白WB鉴定结果。其中，1为S蛋白WB鉴定；M蛋白Maker。

图6为EMS VLPs透射电镜观察结果图。

讨论

SARS-CoV-2病毒在肆虐全球，急需开发疫苗遏制病毒传播。目前，SARS-CoV-2相关传统疫苗及新一代疫苗均在研发中，但还未有一种有效的疫苗批准使用。

VLPs由于其独特的优势在疫苗开发中越来越受到重视。SARS-CoV-2、SARS-Cov、MERS-CoV均属于β冠状病毒，其基因组结构相似，并编码4种主要结构蛋白N、E、M、S，其中E、M、S蛋白可形成VLPs。Eduardo Mortola等通过杆状病毒-昆虫表达系统在Sf9细胞内共表达E、M、S蛋白后，自主装形成VLPs，在大小和颗粒形态上与SARS-CoV非常相似。Xinya Lu等证实SARS-Cov VLPs具有免疫原性，可以在小鼠中引起强烈的SARS-Cov VLPs特定的体液和细胞免疫反应。同样昆虫细胞中MERS CoV E、M和S重组杆状病毒的共感染产生与MERS-CoV病毒粒子相似的形态的VLPs。MERS-CoV VLP在恒河猴中具有出色的免疫原性，接种了MERS-CoVVLP和明矾佐剂的恒河猴诱导高效价的病毒中和抗体，MERS-CoVVLP还引发了T辅助1细胞(Th1)介导的免疫。

本发明将双表达载体pFastBacDual改造为三表达载体，并将E、M、S基因插入三表达载体，通过测序鉴定。将EMS载体转化入DH10 Bac^TM感受态细胞，转座后获得重组杆粒，提取杆粒后进行PCR鉴定，并测序成功。重组杆粒转染ExpiSf9^TM后获得重组杆状病毒，病毒感染ExpiSf9^TM后同时表达E、M、S蛋白，经胞内自组装形成VLPs，Western Blot证实VLPs正确表达，透射电镜证实其形态、大小，本发明获得VLPs大小、形态与SARS-CoV-2病毒相似。目前，国内外尚未见到SARS-CoV-2VLPs研究，通过本发明首次成功获得了SARS-CoV-2VLPs。建立了SARS-CoV-2VLPs制备和鉴定方法，为重组SARS-CoV-2VLPs疫苗的开发建立了技术平台。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 兰州大学

<120> 严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatcccggt ccgaagcgcg cggaattc 28

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catatgaagc tt 12

<210> 3

<211> 5533

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttctctgtca cagaatgaaa atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga 60

ctgaatatca acgcttattt gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc 120

attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 180

agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 240

tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 300

ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 360

ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 420

aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 480

ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 540

attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 600

tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 660

gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 720

tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 780

aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 840

cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 900

agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 960

ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 1020

tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 1080

tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 1140

caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 1200

accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 1260

attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 1320

ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 1380

taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 1440

taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 1500

aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 1560

agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 1620

ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 1680

ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 1740

cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 1800

tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 1860

tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1920

tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1980

tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 2040

ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 2100

acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 2160

ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 2220

gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 2280

ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 2340

ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 2400

taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 2460

cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 2520

tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct ggcaaaatcg gttacggttg 2580

agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa 2640

caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag acagaatagt tgtaaactga 2700

aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt tgttatggct aaagcaaact 2760

cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga ggggcgtggc caagggcatg 2820

gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac aactccgcgg ccgggaagcc 2880

gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg tcgatatcaa agtgcatcac 2940

ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg ggatcgtcac cgtaatctgc 3000

ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca tgcttgagga gattgatgag 3060

cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact gcgagatcat agatatagat 3120

ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc gcgagagcgc caacaaccgc 3180

ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta cggagcaagt tcccgaggta 3240

atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct ccgaactcac gaccgaaaag 3300

atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg agcctacatg tgcgaatgat 3360

gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt 3420

gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg 3480

cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa acagtcataa caagccatga 3540

aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg 3600

agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca ggcttatgtc aactgggttc 3660

gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg 3720

aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg 3780

cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg cacggatctg ccctggcttc 3840

aggagatcgg tagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag 3900

tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt gttcgcccag gactctagct 3960

atagttctag tggttggcct acgtacccgt agtggctatg gcagggcttg ccgccccgac 4020

gttggctgcg agccctgggc cttcacccga acttgggggt tggggtgggg aaaaggaaga 4080

aacgcgggcg tattggtccc aatggggtct cggtggggta tcgacagagt gccagccctg 4140

ggaccgaacc ccgcgtttat gaacaaacga cccaacaccc gtgcgtttta ttctgtcttt 4200

ttattgccgt catagcgcgg gttccttccg gtattgtctc cttccgtgtt tcagttagcc 4260

tcccccatct cccggtaccg catgctatgc atcagctgct agcaccatgg ctcgagatcc 4320

cgggtgatca agtcttcgtc gagtgattgt aaataaaatg taatttacag tatagtattt 4380

taattaatat acaaatgatt tgataataat tcttatttaa ctataatata ttgtgttggg 4440

ttgaattaaa ggtccgtata ctccggaata ttaatagatc atggagataa ttaaaatgat 4500

aaccatctcg caaataaata agtattttac tgttttcgta acagttttgt aataaaaaaa 4560

cctataaata ttccggatta ttcataccgt cccaccatcg ggcgcggatc ccggtccgaa 4620

gcgcgcggaa ttcaattcgt cgagaagtac tagaggatca taatcagcca taccacattt 4680

gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa 4740

atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 4800

aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac actccggaat attaatagat 4860

catggagata attaaaatga taaccatctc gcaaataaat aagtatttta ctgttttcgt 4920

aacagttttg taataaaaaa acctataaat attccggatt attcataccg tcccaccatc 4980

gggcgcgcat atgaagcttg tcgagaagta ctagaggatc ataatcagcc ataccacatt 5040

tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa 5100

aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 5160

caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt 5220

gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatctga tcactgcttg agcctaggag 5280

atccgaacca gataagtgaa atctagttcc aaactatttt gtcattttta attttcgtat 5340

tagcttacga cgctacaccc agttcccatc tattttgtca ctcttcccta aataatcctt 5400

aaaaactcca tttccacccc tcccagttcc caactatttt gtccgcccac agcggggcat 5460

ttttcttcct gttatgtttt taatcaaaca tcctgccaac tccatgtgac aaaccgtcat 5520

cttcggctac ttt 5533

<210> 4

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60

cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120

gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct 180

cgtgttaaaa atctgaactc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaa 228

<210> 5

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggcagatt ccaacggtac tattaccgtt gaagagctta aaaagctcct tgaacaatgg 60

aacctagtaa taggtttcct attccttaca tggatttgtc ttctacaatt tgcctatgcc 120

aacaggaata ggtttttgta tataattaag ttaattttcc tctggctgtt atggccagta 180

actttagctt gttttgtgct tgctgctgtt tacagaataa attggatcac cggtggaatt 240

gctatcgcaa tggcttgtct tgtaggcttg atgtggctca gctacttcat tgcttctttc 300

agactgtttg cgcgtacgcg ttccatgtgg tcattcaatc cagaaactaa cattcttctc 360

aacgtgccac tccatggcac tattctgacc agaccgcttc tagaaagtga actcgtaatc 420

ggagctgtga tccttcgtgg acatcttcgt attgctggac accatctagg acgctgtgac 480

atcaaggacc tgcctaaaga aatcactgtt gctacatcac gaacgctttc ttattacaaa 540

ttgggagctt cgcagcgtgt agcaggtgac tcaggttttg ctgcatacag tcgctacagg 600

attggcaact ataaattaaa cacagaccat tccagtagca gtgacaatat tgctttgctt 660

gtacagtaa 669

<210> 6

<211> 3822

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtttgttt ttcttgtttt attgccactt gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ctctaacaat 1320

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catacggttt ccaacccact 1500

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920

aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatac 1980

gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040

cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100

gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160

agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220

tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280

acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340

gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400

aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460

ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520

cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580

ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640

acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700

caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760

aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820

acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agccttaaac 2880

acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940

ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000

cttcaaagtt tgcagacata cgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060

tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120

gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180

gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240

atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300

cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360

tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420

ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480

tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600

caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggcctt ggtacatttg gctaggtttt 3660

atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720

tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggttcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780

tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822

Claims

1.严重急性呼吸综合征冠状病毒2病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

(1)、将pFastBacDual双表达载体改造为三表达载体，将SARS-CoV-2的M、S、E基因进行密码子优化，然后将密码子优化的M、S基因依次分别构建至多角体蛋白pPH启动子后，将E基因构建至pP10启动子后，获得表达EMS重组质粒；所述将pFastBacDual双表达载体改造为三表达载体是依次在pFastBacDual载体多克隆位点MCS2后，插入pPH启动子、多克隆位点MCS3及SV40 polyA尾，改造成三表达载体；

所述多克隆位点MCS2包含BamHI、RsrII、BssHII、EcoRI酶切位点，多克隆位点MCS3包含酶切位点NdeI、HindIII酶切位点；

所述多克隆位点MCS2的核苷酸序列为：GGATCCCGGTCCGAAGCGCGCGGAATTC；所述MCS3的核苷酸序列为：CATATGAAGCTT；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述密码子优化后的SARS-CoV-2E基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.4。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述密码子优化后的SARS-CoV-2M基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.5。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述密码子优化后的SARS-CoV-2S基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.6。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：将EMS重组质粒先转化入Top10感受态细胞，重新提取重组质粒后转化至DH10 Bac^TM大肠杆菌感受态细胞。