JP2005336206A - 組換えアライグマポックスウイルスおよびネコ伝染性腹膜炎ウイルス疾患に対する効果的なワクチンとしてのそれらの使用 - Google Patents

Abstract

【課題】 ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）に対する効果的なワクチンおよび予防法を提供すること。
【解決手段】 ＦＩＰＶ ＮまたはＭ／Ｅ１タンパクに対する遺伝子を有するＲＲＰＶと、医薬上許容される担体およびアジュバントからなるワクチン、ならびにこのワクチンをネコに投与することからなるＦＩＰＶに起因する疾患の予防方法が提供される。
【選択図】 なし

Description

発明の詳細な説明

（産業上の利用分野）
本発明は、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）のヌクレオカプシド（Ｎ）およびトランスメンブレン（Ｍ／Ｅ１）タンパクを発現する組換えアライグマポックスウイルス（ＲＲＰＶ）をワクチンとして用いた、ＦＩＰＶに起因する疾患の予防に関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）
ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）は、ネコにおける全身性感染を誘発するが、この感染は致命的であることが多い。この疾患の滲出型は、線維素性の腹水の蓄積によって特徴付けられる。この疾患の非滲出型は、肝臓、脾臓、腎臓、肺および腸を含む（しかし、これらに限定されない）多数の臓器における肉芽腫性病変によって特徴付けられる。その総説としては、シー・イー・グリーン（C.E.Greene）編集のインフェクシャス・ディシージズ・オブ・ザ・ドッグ・アンド・キャッツ（Infectious Diseases of the Dog and Cats）（ダブリュー・ビー・ソーンダーズ・カンパニー（W.B.Saunders Co.）、フィラデルフィア、ＰＡ、1990年）におけるバーロウ，ジェイ・イー（Barlough，J.E.）およびシ−・エイ・ストッダルト（C.A.Stoddart）のフィーライン・コロナヴァイラル・インフェクションズ（Feline Coronaviral Infections），300-312頁を参照されたい。

ネコ伝染性腹膜炎ウイルスは、３つの主要な構造タンパク、すなわち、Ｓ（スパイク）タンパク、Ｅ１またはＭ（トランスメンブレン）タンパク、およびＮ（ヌクレオカプシド）タンパクから構成されるコロナウイルスである。ベネマ（Venema）ら、ヴァイロロジー（Virology）181巻：327-335頁，1991年およびデイル（Dale）ら、EPO第0,376,744号を参照。

ＦＩＰＶ感染を予防することを意図した従来のワクチンは、このウイルスに起因する疾患を悪化させることが実際に示されている。ペダーセン，エヌ・シー（Pedersen，N.C.）およびジェイ・ダブリュー・ブラック（J.W.Black）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヴェテリナリー・リサーチ（Am.J.Vet.Res.）44巻：229-234頁，1983年；ヴェネーマ・エイチ（Vennema H.）ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー（J.Virol.）64巻：1407-1409頁，1990年；バーロウ，ジェイ・イー（Barlough，J.E.）、カナディアン・ジャーナル・オブ・コンパラティブ・メディスン（Can.J.Comp.Med.）49巻：303-307頁，1985年；バーロウ，ジェイ・イー（Barlough，J.E.）ら、ラボラトリー・アニマル・サイエンス（Lab.Anim.Sci.）34巻：592-597頁，1984年；ストッダルト，シー・エイ（Stoddart，C.A.）ら、リサーチ・イン・ヴェテリナリー・サイエンス（Res.Vet.Sci.）45巻：383-388頁，1988年；およびペダーソン，エヌ・シー（Pedersen，N.C.）、アドヴ・ヴェット・サイ・コンプ・メッド（Adv.Vet.Sci.Comp.Med.）33巻：413-428頁，1989年を参照。この現象は、明らかに、上記ウイルスに応答して産生された免疫グロブリンによって、特にＳタンパクに対する抗体によって、媒介される感染の免疫増強を反映している。オルセン・シー・ダブリュー（Olsen C.W.）ら、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー（J.Virol.）4巻：175-189頁，1981年を参照。それゆえ、この疾患の予防用ワクチンとして最良の候補は、増強抗体の非存在下で強力な細胞媒介免疫を誘発する製剤であると考えられる。これは、外部エンベロープタンパクを欠損しているが、ＦＩＰＶの他の構造タンパク（ＮおよびＥ１）を含むワクチンによって達成されると考えられる。しかしながら、ＦＩＰＶのＮまたはＥ１タンパクを発現する組換えワクシニアウイルスを用いてネコにワクチン接種を行う従来の試みは、強力な防御免疫を誘発することに失敗した。ヴェネマ（Venema）ら、ヴァイロロジー（Virology）181巻：327-335頁，1991年およびデイル（Dale）ら、欧州特許出願第0,376,744号を参照。また、ヴェネマ（Venema）、欧州特許出願第0,411,684号を参照。

それゆえ、当該技術分野で必要とされているのは、ＮおよびＥ１タンパク、またはそれらのセグメントを免疫原として利用した、ＦＩＰＶに対する効果的なワクチンである。

（課題を解決するための手段）
本発明は、ＦＩＰＶに対するネコの防御免疫の誘発に関する。本発明のある目的は、ＦＩＰＶのＮまたはＭ／Ｅ１タンパクに対する遺伝子を含む組換えアライグマポックスウイルス（各々、ＲＲＰＶ-ＮおよびＲＲＰＶ-Ｅ１）を提供することである。すなわち、本発明のＲＲＰＶは、ＦＩＰＶのＮおよびＭ／Ｅ１タンパクからなる群から選択される要素をコードするＤＮＡ配列からなる少なくとも１つの内部遺伝子を有する。

本発明の別の目的は、ＲＲＰＶ-ＮまたはＲＲＰＶ-Ｅ１を、単独または組み合わせて、あるいは、不活性化または弱毒化された他のウイルス、細菌、または菌類と組み合わせて、含有するネコのワクチンを提供することである。すなわち、本発明のワクチンは、ＦＩＰＶのＮおよびＭ／Ｅ１タンパクからなる群から選択される要素をコードするＤＮＡ配列からなる少なくとも１つの内部遺伝子を有するＲＲＰＶと、医薬上許容される担体または希釈剤と、医薬上許容されるアジュバントとからなる。本発明の別のワクチンは、ＦＩＰＶのＮおよびＭ／Ｅ１タンパクからなる群から選択される要素をコードするＤＮＡ配列からなる少なくとも１つの内部遺伝子を有する第１のＲＲＰＶおよび第２のＲＲＰＶと、医薬上許容される担体または希釈剤と、医薬上許容されるアジュバントとからなる。

本発明のさらに別の目的は、ＦＩＰＶに起因する疾患を予防する方法を提供することであり、かかる方法は、このような処置を必要とするネコに、ＲＲＰＶ-Ｅ、ＲＲＰＶ-Ｅ１、またはこれらの組合せを含有するワクチンを投与することからなる。

これらおよび他の目的および利点は、本明細書から明らかであるが、以下に説明する本発明によって達成される。

本発明のワクチンは、ＦＩＰＶのＮまたはＥ１タンパクあるいはその免疫原性フラグメントをコードする遺伝子を含む組換えアライグマポックスウイルス（ＲＲＰＶ）を創製することによって調製すればよい。これらの遺伝子は、まずトランスファープラスミドに挿入し、次いで、これを予めアライグマポックスウイルスに感染させた適当な宿主細胞に導入する。その結果、トランスファープラスミド由来のＤＮＡが、同種組換えによって、ポックスウイルスＤＮＡ中に組み込まれ、ＲＲＰＶを産生する。ＲＲＰＶは細胞から放出される。

ＦＩＰＶのＮまたはＥ１タンパクをコードするＤＮＡは、トランスファープラスミド中のポックスウイルスプロモーターのすぐ下流に挿入する。好ましい具体例では、ワクシニアウイルスの初期／後期７.５Ｋｄタンパクプロモーターを用いる；しかしながら、ポックスウイルスにおいて機能的な別のプロモーター要素を用いることもできる。

好ましいトランスファープラスミドはまた、β-カラクトシダーゼ・マーカー遺伝子を含んでいるが、このマーカー遺伝子は組換えウイルスにおけるプラスミドＤＮＡ配列の選択および検出を可能にする。別の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子またはイー・コリ（E.coli）ｇｐｔ遺伝子などを用いて本発明を実施できることは、当業者に自明である。関心のある外来遺伝子および選択可能なマーカー遺伝子に隣接して、チミジンキナーゼＤＮＡ配列が存在するが、これら配列はプラスミドＤＮＡ配列の組み換えによるアライグマポックスウイルスＤＮＡ中への組み込みを容易にする。

ＦＩＰＶ ＮまたはＥ１遺伝子を発現する組換えウイルスは、まず、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）、ＢＳＣ-１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２６）、ＲＡＴ-２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７６４）、またはＣＲＦＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ９４１）などの感受性細胞系を野生型アライグマポックスウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ-８３８または類似の単離物、例えば、ＲＣＮＶ７１-Ｉ-８５Ａなど）に感染させることによって調製する。次いで、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、あるいは、エレクトロポレーションまたはリン酸カルシウム沈殿などの他の適当な手法を用いて、Ｅ１またはＮ遺伝子を含むトランスファープラスミドＤＮＡを感染細胞にトランスフェクトさせる。すべての細胞において細胞変性効果が見られるまで、ウイルス複製を進行させる。

ポックスウイルスＤＮＡへのＦＩＰＶ Ｅ１またはＮ遺伝子の組み込みは、ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の分断を伴う。それゆえ、この感染後に採取したウイルスを、チミジンキナーゼ遺伝子の不在について選択することによって単離すればよい；これは、５-ブロモデオキシウリジンの存在下、ｔｋ-ＲＡＴ-２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７６４）における増殖によって達成される。トランスファープラスミド由来の遺伝子挿入物を含有するウイルスは、さらに、Ｘ-ｇａｌなどのβ-ガラクトシダーゼに対する色素産性基質の存在下で増殖した場合の青いプラーク色の出現によって同定される。

これらの選択およびスクリーニングの手順を経て残存するウイルスプラークは、次いで、数サイクルのプラーク精製に供する。引き続いて、Ｅ１またはＮ遺伝子の存在は、ポリメラーゼ連鎖反応の手法によって確認し、Ｅ１またはＮタンパクの存在は、特異的抗体を用いたイムノブロット分析によって確認する。これらウイルスは、各々、ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｅ１およびＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｎと名づけられ、ブダペスト条約に基づき、１９９４年９月９日付で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたが、本願の出願時点で、受託番号は付与されていない。

本発明の別の具体例では、ＮおよびＥ１タンパクをコードする遺伝子は、単一のトランスファープラスミドに挿入された。このプラスミドを、予め野生型アライグマポックスウイルスに感染させた細胞に導入すると、両方のタンパクを同時に発現する組換えウイルス（ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｅ１／Ｎ）が産生される。

さらに別の具体例では、ＦＩＰＶ ＥおよびＮタンパクの全長未満のセグメントを発現するＲＲＰＶを製造することができる。Ｅ１およびＮタンパクの部分的な配列をコードするトランスファープラスミドを加工するのに用いられる手法は、本明細書中で詳述するＲＲＰＶの製造およびスクリーニング方法と同様に、当該技術分野で公知であり、広く用いられている。例えば、Ｅ１またはＮ ＤＮＡに沿って様々な位置に停止コドンを含有するオリゴヌクレオチドを導入すると、その遺伝子のカルボキシ末端で切断したもののが各種産生されるが、これらは、次いで、ＲＲＰＶに組み込むことができる。このような組換えＲＲＰＶの系統的なスクリーニングが、完全なタンパクまたはそのサブフラグメントが本発明を実施するのに最も好ましいかどうかを確立することができることは当業者に明らかである。さらに、上記のように、Ｅ１およびＮタンパクの様々なフラグメントをコードするＤＮＡは、同一または異なるＲＲＰＶに組み込んだ後、組合せワクチンに用いることができる。

ワクチンを調製する場合、０.１感染単位／細胞またはそれ以下の感染多重度（ＭＯＩ）で、上記のような感受性細胞をＲＲＰＶに感染させる。本明細書では、感染単位は、所定の条件下で５０％感染を与えるウイルス量、すなわち、組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）として定義される。ＴＣＩＤ_５０を測定する方法は、以下の実施例１で詳述する。細胞病理学が９０％を越える細胞に見られる場合、感染細胞および細胞外液（両方ともウイルスを含有する）を単一のウイルス-細胞溶解物として採集する。

ワクチンとして用いるべき高度に濃縮したウイルス株は、使用時まで、（−５０℃またはそれより低温で）凍結保存するか、あるいは凍結乾燥すればよい。凍結または凍結乾燥の間にウイルスを安定化するように設計されたＮＺ-アミン、デキストロース、ゼラチンなどの化合物を添加してもよい。ウイルス-細胞溶解物中に最初から存在するウイルスは、市販の装置を用いて、さらに濃縮してもよい。

典型的には、ワクチン製剤中におけるウイルスの濃度は、投与量あたり最低１０^６．５ＴＣＩＤ_５０であるが、典型的には、投与量あたり１０^７．０〜１０^９．０ＴＣＩＤ_５０の範囲内である。ワクチン接種の時点で、ウイルスは、（凍結されていれば）解凍するか、凍結乾燥されていれば、生理学的に許容される脱イオン水、食塩水、リン酸緩衝食塩水などの担体で復元する。

本発明は、天然（すなわち、複製-コンピテント）のＲＲＰＶに限定されない。ウイルス-細胞溶解物は、ウイスルを不活性化するのに当該技術分野で通常に用いられる処理に供することができる。不活性化ウイルスおよび発現されたタンパクを含有する組成物は、充分な量のＦＩＰＶタンパクを含有していれば、ＦＩＰＶに対する防御免疫を誘発するのに効果的である。この種のワクチンは、受容体であるネコが、ワクチン接種の結果、伝染性ＦＩＰＶに曝露されないという保証を与える。さらに、生理学的に許容されるＥＭＡ３１（モンサント・カンパニー（Monsanto Co.,）、セントルイス、ＭＯ）、ＮＥＯＣＲＹＬ（ポリビニル・ケミカル・インダストリーズ（Polyvinyl Chemical Industries）、ウィルミントン、ＭＡ）、ＭＶＰ（モダーン・ヴァテナリー・プロダクツ（Modern Veterinary Products）、オマハ、ＮＥ）、スクアレン（Squalene）、プルロニック（Pluronic）Ｌ１２１などのアジュバントをウイルスに添加してもよい。

ＮまたはＥ１遺伝子を発現する個々のアライグマポックスウイルスは、ワクチン接種用に互いに混合してもよい。さらに、このウイルスは、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコ腸内コロナウイルス、ネコオウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、イヌ小胞子菌（Microsporum canis）などの付加的な不活性化または弱毒化ウイルス、細菌、または菌類と混合してもよい。さらに、上記生物由来の抗原を組合せワクチンに組み込んでもよい。これら抗原は、天然源または組換え発現系から精製するか、あるいは、それら由来の抗原または合成ペプチドの個々のサブユニットを含有していてもよい。

本発明の別の具体例では、生きたまたは不活性化したＲＲＰＶウイルス-細胞溶解物を、リポソーム中に組み込んだり、投与の前に、当該技術分野で公知の手段を用いて、ペプチド-、タンパク-、または多糖類-ベースのマイクロカプセル中に被包することができる。

最終的なワクチンは、約０.５〜約５ｍｌの範囲内の容量でネコに投与される。このワクチンは、皮下、筋肉内、経口、皮内、または鼻腔内の経路で投与することができる。注射の回数およびそれらの時間間隔は、様々であり、適宜、変更すればよい。１〜３週間の間隔で投与する１〜３回のワクチン接種が、通常、効果的である。

（実施例）
以下の実施例によって、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。細胞を感染させ、かつ、トランスフェクトさせ、ウイルスをプラーク精製し、イムノブロット分析を行うのに用いた手法は、当該技術分野で広く実施されている。

実施例１：ＦＩＰＶ ＮおよびＥ１遺伝子を発現する組換えアライグマポックスウイルスの生成
１．ＦＩＰＶ ＮおよびＥ１遺伝子のクローニングならびにトランスファープラスミドの調製
本発明で用いたＥ１およびＮ遺伝子のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、各々、図１〜２と配列表の配列番号：１および図３〜５と配列表の配列番号：２に示す。ＦＩＰＶ ＮおよびＥ１遺伝子をクローニングし、それらをｐＳＣ１１トランスファーベクターに挿入する方法は、欧州特許出願第0,376,744号に詳述されている。Ｅ１およびＮ遺伝子に対するｃＤＮＡをクローン化するのに用いたプラスミドを図６に示す。ｐＵＣ１８：Ｅ１-Ｎは、共に連結したＦＩＰＶ Ｅ１およびＮ遺伝子を含有する１.９ｋｂｐＥｃｏＲ１-Ｓｐｈ１フラグメントを有する。Ｅ１およびＮ遺伝子を有するｐＳＣ１１プラスミドを、各々、図７および図８に示す。これらプラスミドのヌクレオチド配列を図９〜１１と配列表の配列番号３および図１２〜１４と配列表の配列番号：４に示す。

ＮおよびＥ１遺伝子を両方とも含有するｐＳＣ１１トランスファープラスミドを構築するために、ワクシニア７.５プロモーターおよびＥ１遺伝子を含有する１.０ｋｂ ＤＮＡフラグメントを、ｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ Ｎ中におけるＮ遺伝子の下流に挿入した。得られたプラスミドは、ｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ Ｎ／Ｅ１と名づけた。

２．組換えアライグマポックスウイルス（ＲＲＰＶ）の調製
８０％集密的（約５×１０^６個の細胞／１００ｍｍ組織培養皿）なＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８１）の単層を、３７℃で３０〜６０分間、野性型アライグマポックスウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ-８３８）に、０.１ＴＣＩＤ_５０／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。培地（２ｍｌ）は、０.０５％ラクトアルブミン加水分解産物および１５μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩を含有するイーグル最小必須培地（「ＭＥＭ」、ギブコ（Gibco）BRL＃410-1500）からなり、重炭酸ナトリウムでｐＨ７.２に調節した。感染後、培地を取り出し、製造業者の説明書に従って、各々、トランスフェクタム（Transfectam＠；プロメガ・コーポレーション（Promega Corporation）、マジソン、ＷＩ）およびＤＯＴＡＰ（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）、インディアナポリス、ＩＮ）を用いたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクションによって、細胞にｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ Ｎ、ｐＳＣ１１-ＦＰＩＶ Ｅ１、またはｐＳＣ１１ Ｎ／Ｅ１トランスファープラスミドをトランスフェクトさせた。これら細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する３ｍｌのＭＥＭ中で、ＤＮＡ-リポソーム混合物と共に、（５％ＣＯ_２下）３７℃で一晩インキュベートした後、培地を８ｍｌの新鮮なＭＥＭ-５％ＦＢＳと置換した。トランスフェクトした細胞を、細胞変性効果（ＣＰＥ）を示すものが８０％を越えるまで、（５％ＣＯ_２下）３７℃でインキュベートしたが、これには約３〜４日かかった。ウイルス-細胞溶解物を、次いで、プレートから取り出し、２サイクルの凍結-解凍に供してから、−７０℃で保存した。

３．ＦＩＰＶ Ｎ遺伝子を有する組換えアライグマポックスウイルスの単離
ＦＩＰＶ Ｎ遺伝子を有するＲＲＰＶ（ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｎ）を、標準的なウイルスプラーク精製方法によって、ｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ Ｎ-Ｖｅｒｏ細胞トランスフェクションから単離・精製した。Ｖｅｒｏ細胞の単層（５０〜８０％集密的）を、ウイルス-細胞溶解物の１０倍系列（１０^−１〜１０^−３）希釈液の２ｍｌによって、３７℃で１時間感染させた。インキュベートした後、培地を取り出し、感染した細胞に、ＭＥＭ／５％ＦＢＳを含有する１.２５％ノーブル（Noble）寒天培地８〜１０ｍｌを重ねた。感染した細胞を、次いで、（５％ＣＯ_２下）３７℃で３〜４日間インキュベートし、０.５×ＰＢＳおよび６００μｇ／ｍｌの５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド（Ｘ-gal；ステイツ・バイオケミカル（States Biochemical）、クリーブランド、オハイオ州）を含有する１.２５％ノーブル（Noble）寒天培地４ｍｌを再び重ねた。これらプレートを、青色（すなわち、β-ガラクトシダーゼ陽性）のウイルスプラークが観察されるまで、（５％ＣＯ_２下）３７℃で４〜１６時間インキュベートした。組換えウイルスプラークを、１ｃｃの注射器に取り付けた先端の平坦な滅菌針を用いて採集し、０.２５μｇ／ｍｌトリプシンの０.５ｍｌ中に懸濁し、ボルテックスミキサーで激しく撹拌し、３７℃で１５〜３０分間インキュベートした。次いで、破砕したウイルスプラークを２５ｃｍ^２のフラスコ中における５×１０^５個のＶｅｒｏ細胞上に接種し、８０％を越えるＣＰＥが観察されるまで、（５％ＣＯ_２下）３７℃でインキュベートした。ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｎを含有するウイルス-細胞溶解物は、２サイクルの凍結-解凍に供し、−７０℃で保存した。６つの個々のＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｎクローンを選択し、上記のようにプラーク精製を５回行った。

４．ＦＩＰＶ Ｅ１遺伝子を含有する組換えアライグマポックスウイルスの単離
ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｎについて説明した方法を多少変更して用いて、ＦＩＰＶ Ｅ１遺伝子を有するＲＲＰＶ（ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｅ１）を単離し、ｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ Ｅ１トランスフェクトＶｅｒｏ細胞から精製した。この場合、最初のウイルス-細胞溶解物由来のチミジンキナーゼ欠損（ｔｋ-）ＲＲＰＶを、ｔｋ-ＲＡＴ-２細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７６４）上で選択した。これは、最初のウイルス-細胞溶解物の１ｍlを、ＭＥＭ中に３０μｇ／ｍｌの５-ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の存在下、７５ｃｍ^２のフラスコ中におけるＲＡＴ-２細胞（約５×１０^６個の細胞）の単層上に接種することによって実施した。感染した単層を、７０％を越えるＣＰＥが観察されるまで、（５％ＣＯ_２下）３７℃で３〜４日間インキュベートした。ｔｋ-ウイルス細胞溶解物を、２サイクルの凍結-解凍に供し、−７０℃で保存した。２つの個々のＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｅ１クローンを選択し、ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｎについて上で説明したように、６サイクルのプラーク精製に供した。

５．ポリメラーゼ連鎖反応によるＲＲＰＶ中のＦＩＰＶ ＮおよびＥ１遺伝子の確認
ＲＲＰＶ中におけるＦＩＰＶ ＮおよびＥ１の存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて確認した。９０μｌのウイルス-細胞溶解物を１０μｌの１０倍濃縮ＰＣＲ溶解緩衝液（１００ｍＭトリス（Tris）-ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８.５；５００ｍＭ ＫＣｌ；２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２；５％ツウィーン（Tween）２０；３ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼ（Proteinase）Ｋ）と共に、５０℃で１６時間インキュベートし、次いで１０分間沸騰させた。この溶解物１０μｌをＰＣＲに用いた。ＰＣＲは、１０μｌの１０ｍＭトリス（Tris）-ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８.３；５０ｍＭ ＫＣｌ；２００μＭの各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、１.５ｍＭ ＭｇＣｌ_２；３０ピコモルの各オリゴヌクレオチドプライマー；および、２.５単位のアンプリターク（AmpliTaq＠）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン-エルマー・シータス（Perkin-Elmer Cetus）、ノルウォーク、ＣＴ）中で実施した。ＦＩＰＶ ＮのＰＣＲに用いたプライマーは、各々、ＦＩＰＶ Ｎオープンリーディングフレームのヌクレオチド６８〜９１および７２１〜７４４に対応する以下のプライマー１および２である。

（１）５'-ＣＴＣＧＴＧＧＴＣＧＧＡＡＧＡＡＴＡＡＴＧＡＴＡ-３'
（２）５'-ＡＧＣＡＣＣＡＴＡＧＡＡＡＧＴＴＧＴＣＡＣＡＴＣ-３'

ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン-エルマー・シータス（Perkin-Elmer Cetus））中で、まず反応混合物を９４℃に加熱して変性させ、次いで３５サイクルの増幅（各々は、９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間、および最後のサイクルでは、７２℃で８分間、最終的なインキュベーションを行うことからなる）を行うことによって実施した。１０μｌのＰＣＲ産物を、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス（Tris）塩基、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.２）中、ホリゾンタル-サブマリン４％ニューシーブ（NuSieve）アガロースゲル（エフ・エム・シー・バイオプロダクツ（FMC Bioproducts）、ロックランド、ＭＥ）により、５Ｖ／ｃｍを１〜２時間印加して電気泳動することによって解析した。ゲルをエチジウムブロマイドで染色することによって、ＤＮＡ産物を可視化した。

ＦＩＰＶ ＮおよびＥ１プライマーを用いたＰＣＲ増幅により、各々、６７６および４０８ヌクレオチドからなるＤＮＡフラグメント（図１５）を得た。図１５において、レーン１は、塩基対ＤＮＡマーカー；レーン２は、ｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ Ｎ（ＦＩＰＶ Ｎの正の対照）；レーン３は、ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｎ；レーン４は、ＦＩＰＶ Ｎプライマーを含む野生型アライグマポックスウイルス-細胞溶解物（負の対照）；レーン５は、ｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ Ｅ１（ＦＩＰＶ Ｅ１の正の対照）；レーン６は、ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｅ１；レーン７は、ＦＩＰＶ Ｅ１プライマーを含む野生型アライグマポックスウイルス-細胞溶解物（負の対照）を表す。ｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ ＮおよびＥ１トランスファープラスミドを用いたＰＣＲ増幅は、正の対照となり、予想されたサイズの産物を示した。野性型アライグマポックスウイルス-Ｖｅｒｏ細胞溶解物を用いたＰＣＲ増幅は、負の対照となり、それらの試料中にはＰＣＲ産物は観察されなかった。

６．イムノブロット分析によるＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ ＮおよびＥ１タンパク発現の確認
２５ｃｍ^２のフラスコ中におけるＶｅｒｏ細胞の集密的単層（１〜２×１０^６個の細胞）を、ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ ＮまたはＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｅ１のいずれかのクローンに、０.１のＭＯＩで感染させた。感染した細胞を、約８０％の細胞が細胞変性効果を示すまで、（５％ＣＯ_２下）３７℃で２〜３日間インキュベートした。ウイルス-細胞溶解物を調製し、２０μｌの試料を５μｌの５×ラエムリ（Laemmli）試料緩衝液（０.３Ｍトリス（Tris）-ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６.８、５％ＳＤＳ、５０％グリセロール、０.４％ブロモフェノールブルー、および３％２-β-メルカプトエタノールを含有）に添加し、９５℃で５分間加熱した。変性したタンパク試料を、前に説明したように、４〜１５％勾配ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ／ポリアクリルアミド電気泳動によって分離した。マニアチス（Maniatis）ら、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）：ア・ラボラトリー・マニュアル（A Laboratory Manual）、1982年、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Cold Spring Harbor Press）。電気泳動後、製造業者の説明書に従い、バイオ-ラッド（Bio-Rad）転写装置を用いた電気転写によって、タンパクをニトロセルロース（バイオ-ラッド・ラボラトリー（Bio-Rad Laboratories）、ハーキュリーズ、ＣＡ）に転写した。転写は、０.２Ｍグリシンおよび２０％メタノールを含有する２５ｍＭトリス（Tris）-ＨＣｌ緩衝液中、定電流電圧５０Ｖで、４５分間実施した。

特異的抗体を用いて、ニトロセルロースフィルター上にＦＩＰＶ ＮおよびＥ１タンパクを可視化した。デイビス（Davis）ら、ベーシック・メッソズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Basic Methods in Molecular Biology）、1986年、エルシビアー・サイエンス・パブリッシング・カンパニー（Elsevier Science Publishing Company）、ニューヨーク、ＮＹ。フィルターは、０.１％ツウィーン（Tween）-２０を含有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７.４）（「ＰＢＳ-ＴＷ」）ですすいだ後、１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ-ＢＳＡ）中、４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳ-ＴＷ中で１５分間洗浄することによって、非特異的部位をブロックした。次いで、このフィルターを、ＦＩＰＶ（７９-１１４６株）に感染したネコ由来の腹水からなり、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ-ＴＷ（「ＰＢＳ-ＴＷ-ＢＳＡ」）中に１：１００で希釈した抗-ＦＩＰＶ抗体と共に、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ-ＴＷ中で５分間の洗浄を４回行った後、フィルターを、ＰＢＳ-ＴＷ-ＢＳＡ中に１：２０００で希釈したビオチン標識マウス抗ネコＩｇＧ抗体（カークエガード・アンド・ペリー・ラボラトリー・インク（Kirkegaad ＆ Perry Laboratories Inc.）、ゲイザーズバーグ、ＭＤ）からなる２次抗体と共に、室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ-ＴＷ中で５分間の洗浄を４回行った。次いで、このフィルターを、ＰＢＳ-ＴＷ中に１：１０００で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ複合ストレプトアビジン（カークエガード・アンド・ペリー・ラボラトリー・インク（Kirkegaad ＆ Perry Laboratories Inc.））と共に、室温で３０分間インキュベートした。このフィルターをＰＢＳ-ＴＷ中で４回（各々５分間）洗浄した後、抗原-抗体複合体をペルオキシダーゼ色素産生基質（カークエガード・アンド・ペリー・ラボラトリー・インク（Kirkegaad ＆ Perry Laboratories Inc.））で可視化した。スクロース勾配精製ＦＩＰＶおよび野生型アライグマポックスウイルス-Ｖｅｒｏ細胞溶解物を、各々、正および負の対照として用いた。典型的なイムノブロットを図１６に示す。図１６において、レーン１は、分子量マーカー（ｋＤａ）；レーン２は、精製ＦＩＰＶ抗原（正の対照）；レーン３は、野生型アライグマポックスウイルス-細胞溶解物（負の対照）；レーン４は、ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｎ；レーン５は、ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｅ１を表す。

７．アライグマポックスウイルス力価測定
ウイルスの１０倍系列希釈物を、ＭＥＭ中に調製し、９６ウェルプレート中のＶｅｒｏ細胞（各ウェルあたり１×１０^４個の細胞）に、５通り接種した。ウイルス製剤は、等量の０.５％トリプシン中に希釈し、封入体からウイルスを放出させるために、３７℃で３０分間インキュベートすることによって調製すればよい。プレートを（５％ＣＯ_２下）３７℃で３〜５日間インキュベートし、アライグマポックスウイルスを象徴する細胞病理学について観察する。力価は、リード（Reed）およびミュンヒ（Muench）（ジ・アメリカン・ジャーナル・オブ・ハイジーン（The American Journal of Hygiene）27(3)巻：493-497頁、1938年）の方法を用いた細胞病理学に基づく５０％終点として計算する。

実施例２
ワクチンの調製およびネコにおける効力試験
１．ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ ＮおよびＥ１ウイルスのマスターシードの調製
各々の組換えウイルスの単一クローンを大規模な拡大（expansion）について選択し、マスターシードウイルスとした。選択の基準は、１）純度の検証：ポリメラーゼ連鎖反応を利用して、このクローンが野生型ウイルスで汚染されていないことを確かめた；および、２）ウェスタンブロットまたは他の抗原検出方法による適当な組換えタンパク発現の検証であった。

すべての組換えウイルスの拡大および力価測定は、２.５％ＦＢＳを含有するＭＥＭ中のＶｅｒｏ細胞について行った。プラーク精製した各々のウイルスクローンを、１５０ｃｍ^２のフラスコ中におけるＶｅｒｏ細胞の集密的単層（１×１０^７個の細胞）に１ｍｌのウイルス-細胞溶解物（約１０^７個の伝染性ウイルス粒子）を接種し、１００％の細胞変成効果が観察されるまで（２〜３日間）、（５％ＣＯ_２下）３７℃でインキュベートすることによって拡大させた。このウイルス-細胞溶解物を、実施例１に記載したように、Ｖｅｒｏ細胞について力価測定し、プレマスターシードウイルス株とし、マスターシードウイルスを得た。最も力価の高いマスターシードウイルスを生産するために用いるべきＭＯＩは、回転ビン中のＶｅｒｏ細胞の集密的単層（１×１０^８個の細胞）に様々なＭＯＩ（例えば、０.１、０.０５、０.０１、０.００５、および０.００１ ＴＣＩＤ_５０／細胞）の組換えウイルスを接種することによって測定した。感染した細胞を、８０％を越えるＣＰＥが観察されるまで（約３日間）、３７℃でインキュベートし、各々の感染回転ビンの力価を測定した。マスターシードウイルスの既知量を、１.５ｍｌのアンプルに取り、密封して、液体窒素冷凍庫中で保存した。

２．ワクチンの調製
３×１０^７個のＶｅｒｏ細胞を、２００ｍｌの増殖培地（０.５％ラクトアルブミン加水分解産物および５％ＦＢＳを含有するＭＥＭ）を入れた８５０ｃｍ^２回転ビン中に播種し、３７℃で１８時間インキュベートした。翌日、培地を細胞から除去し、感染培地（０.５％ラクトアルブミン加水分解産物および２.５％ＦＢＳを含有するＭＥＭ）中に０.０１のＭＯＩまで希釈した５０ｍｌのＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｎウイルスで置換した。用いたウイルスは、マスターシード調製物から第２継代のものであった。ウイルスを、細胞に３７℃で３０分間吸収させた後、培地の容量を１本の回転ビンあたり１５０ｍｌに調節した。これら回転ビンを、１００％の細胞病理学が明らかになるまで（３日間）、３７℃でインキュベートした。ウイルス-細胞溶解物を採集し、（−７０℃で）凍結保存した。ウイルス力価は、１０^６．９７ＴＣＩＤ_５０／ｍｌであると測定された。

０.１のＭＯＩを用いたこと以外は同様にして、ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｅ１株を調製した。採集的なウイルス製剤は、その力価を測定したところ、１０^６．５ＴＣＩＤ_５０／ｍｌを含むことがわかった。上記と同様の方法を用いて、野生型のアライグマポックスウイルスを増殖させたところ、１０^６．４４ＴＣＩＤ_５０／ｍｌを含んでいた。

３．ワクチン接種
２４匹（雄７匹および雌１７匹）の月齢９カ月のネコ（特定の病原体を有しない、ハーラン・スプラーグ・ドーリー（Harlan Sprague Dawley）、マディソン、ＷＩ）を用いて、ＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｎワクチンの効力を実証した。以下に示すように、ネコを５つのグループに分割し、２１日間隔でワクチン接種を２回行った。

４．抗原投与
第２のワクチン接種から２週間後、ネコに、１０^３．４ＴＣＩＤ_５０のネコ腸内コロナウイルス（７９-１６８３株、ＡＴＣＣ ＶＲ-９８９）を経口的に接種した。このウイルスは、次のＦＩＰＶ感染を増強することができる潜在的な感染を誘発する。３週間後、ネコに、１０^３．４ＴＣＩＤ_５０のＦＩＰＶ（７９-１１４６株、ＡＴＣＣ ＶＲ-９９０）を経口的に抗原投与（challenge）した。ネコを、発熱、黄疸、白血球減少、貧血、体重減少、食欲減退、抑うつ症、脱水症状、および腹腔膨化を含む臨床疾患の徴候について、抗原投与してから合計６４週間にわたって毎週モニターした。瀕死状態のネコは、参加している獣医が安楽死させ、死後の病理学的検査を実施した。臨床上の疾患の徴候は、以下に示すように評価された。

５．ＦＩＰＶに対して誘発された免疫の評価
毒性ＦＩＰＶの接種によって、野生型アライグマポックスウイルスをワクチン接種した対照のネコの４／５（８０％）において致死的な感染が誘発された（表１）。対照のネコにおいては、滲出型および非滲出型の両方の疾患が見られた。他方、皮下へのワクチン接種による抗原投与の後、臨床上の疾患は本質的に見られなかった。これらのネコにおける散発性の発熱は、興奮性に帰することができ、１２６４番のネコにおけるある日のわずかな貧血は有意な発見ではない。皮下へのワクチン接種は、対照のネコと比較した場合に、臨床上の徴候（ｐ＜０.０５、共変分析（ＡＮＯＶＡ）による）および死亡（ｐ＜０.０１、χ二乗分析による）における統計的に有意な減少を示した。

ワクチン接種の筋肉内経路は、ネコの２／５（４０％）がＦＩＰＶ誘発疾患に倒れた点で、それほど効果的ではなかった。しかしながら、これらのネコにおける疾患の発症は、対照と比較した場合、遅延された。減少した効力は、この経路によって投与できた投与量がわずか１ｍｌであったことから、より力価の低いウイルスがこれらのネコに接種されたことに関係していると考えられる。また、ネコを経口的経路によって接種した場合にも、効力が減少した（死亡率６０％）が、このことは、この経路によってワクチン接種を行う場合、より多くのウイルス量が必要であることを示していると考えられる。

皮下に投与されたワクチンによるＦＩＰＶ起因疾患に対する予防は、投与量依存性であることが示されたが、これにより、ＦＩＰＶウイルスによって誘発される臨床上の疾患に対する予防を誘発する際における高力価のＲＲＰＶ-ＦＩＰＶワクチンの利点が確証された。適当なワクチン量は、１０^４〜１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ、好ましくは１０^７〜１０^８ＴＣＩＤ_５０／ｍｌの範囲内のウイルス抗原を含有する。ネコへの投与に対する典型的な投与量は１〜３ｍｌであり、皮下経路による送達が好ましい。

（発明の効果）
本発明によれば、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）のヌクレオカプシド（Ｎ）およびトランスメンブレン（Ｍ／Ｅ１）タンパクを発現する組換えアライグマポックスウイルス（ＲＲＰＶ）が得られる。この組換えウイルスは、単独または担体やアジュバントと組み合わせて、ワクチンとして有用であり、ＦＩＰＶに起因する疾患を効果的に予防することができる。

（配列表）
配列番号：１
配列の長さ：789
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
起源
生物名：ネコ伝染性腹膜炎ウイルス
直接の起源
クローン名：FIPV E1
配列：
ATG AAG TAC ATT TTG CTA ATA CTC GCG TGC ATA ATT GCA TGC GTT TAT 48
Met Lys Tyr Ile Leu Leu Ile Leu Ala Cys Ile Ile Ala Cys Val Tyr
1 5 10 15
GGT GAA CGC TAC TGT GCC ATG CAA GAC AGT GGC TTG CAG TGT ATT AAT 96
Gly Glu Arg Tyr Cys Ala Met Gln Asp Ser Gly Leu Gln Cys Ile Asn
20 25 30
GGC ACA AAT TCA AGA TGT CAA ACC TGC TTT GAA CGT GGT GAT CTT ATT 144
Gly Thr Asn Ser Arg Cys Gln Thr Cys Phe Glu Arg Gly Asp Leu Ile
35 40 45
TGG CAT CTT GCT AAC TGG AAC TTC AGC TGG TCT GTA ATA TTG ATT GTT 192
Trp His Leu Ala Asn Trp Asn Phe Ser Trp Ser Val Ile Leu Ile Val
50 55 60
TTT ATA ACA GTG TTA CAA TAT GGC AGA CCA CAA TTT AGC TGG CTC GTT 240
Phe Ile Thr Val Leu Gln Tyr Gly Arg Pro Gln Phe Ser Trp Leu Val
65 70 75 80
TAT GGC ATT AAA ATG CTG ATC ATG TGG CTA TTA TGG CCT ATT GTT CTA 288
Tyr Gly Ile Lys Met Leu Ile Met Trp Leu Leu Trp Pro Ile Val Leu
85 90 95
GCG CTT ACG ATT TTT AAT GCA TAC TCT GAG TAC CAA GTT TCC AGA TAT 336
Ala Leu Thr Ile Phe Asn Ala Tyr Ser Glu Tyr Gln Val Ser Arg Tyr
100 105 110
GTA ATG TTC GGC TTT AGT GTT GCA GGT GCA GTT GTA ACG TTT GCA CTT 384
Val Met Phe Gly Phe Ser Val Ala Gly Ala Val Val Thr Phe Ala Leu
115 120 125
TGG ATG ATG TAT TTT GTG AGA TCT GTT CAG CTA TAT AGA AGA ACC AAA 432
Trp Met Met Tyr Phe Val Arg Ser Val Gln Leu Tyr Arg Arg Thr Lys
130 135 140
TCA TGG TGG TCT TTT AAT CCT GAG ACT AAT GCA ATT CTT TGT GTT AAT 480
Ser Trp Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ala Ile Leu Cys Val Asn
145 150 155 160
GCA TTG GGT AGA AGT TAT GTG CTT CCC TTA GAT GGT ACT CCT ACA GGT 528
Ala Leu Gly Arg Ser Tyr Val Leu Pro Leu Asp Gly Thr Pro Thr Gly
165 170 175
GTT ACC CTT ACT CTA CTT TCA GGA AAT CTA TAT GCT GAA GGT TTC AAA 576
Val Thr Leu Thr Leu Leu Ser Gly Asn Leu Tyr Ala Glu Gly Phe Lys
180 185 190
ATG GCT GGT GGT TTA ACC ATC GAG CAT TTG CCT AAA TAC GTC ATG ATT 624
Met Ala Gly Gly Leu Thr Ile Glu His Leu Pro Lys Tyr Val Met Ile
195 200 205
GCT ACA CCT AGT AGA ACC ATC GTT TAT ACA TTA GTT GGA AAA CAA TTA 672
Ala Thr Pro Ser Arg Thr Ile Val Tyr Thr Leu Val Gly Lys Gln Leu
210 215 220
AAA GCA ACT ACT GCC ACA GGA TGG GCT TAC TAC GTA AAA TCT AAA GCT 720
Lys Ala Thr Thr Ala Thr Gly Trp Ala Tyr Tyr Val Lys Ser Lys Ala
225 230 235 240
GGT GAT TAC TCA ACA GAA GCA CGT ACT GAC AAT TTG AGT GAA CAT GAA 768
Gly Asp Tyr Ser Thr Glu Ala Arg Thr Asp Asn Leu Ser Glu His Glu
245 250 255
AAA TTA TTA CAT ATG GTG TAA 789
Lys Leu Leu His Met Val
260

配列番号：２
配列の長さ：1134
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA
起源
生物名：ネコ伝染性腹膜炎ウイルス
直接の起源
クローン名：FIPV N
配列：
ATG GCC ACA CAG GGA CAA CGC GTC AAC TGG GGA GAT GAA CCT TCC AAA 48
Met Ala Thr Gln Gly Gln Arg Val Asn Trp Gly Asp Glu Pro Ser Lys
1 5 10 15
AGA CGT GGT CGT TCT AAC TCT CGT GGT CGG AAG AAT AAT GAT ATA CCT 96
Arg Arg Gly Arg Ser Asn Ser Arg Gly Arg Lys Asn Asn Asp Ile Pro
20 25 30
TTG TCA TTC TAC AAC CCC ATT ACC CTC GAA CAA GGA TCT AAA TTT TGG 144
Leu Ser Phe Tyr Asn Pro Ile Thr Leu Glu Gln Gly Ser Lys Phe Trp
35 40 45
AAT TTA TGT CCG AGA GAC CTT GTT CCC AAA GGA ATA GGT AAT AAG GAT 192
Asn Leu Cys Pro Arg Asp Leu Val Pro Lys Gly Ile Gly Asn Lys Asp
50 55 60
CAA CAA ATT GGT TAT TGG AAT AGA CAG ATT CGT TAT CGT ATT GTA AAA 240
Gln Gln Ile Gly Tyr Trp Asn Arg Gln Ile Arg Tyr Arg Ile Val Lys
65 70 75 80
GGC CAG CGT AAG GAA CTC GCT GAG AGG TGG TTC TTT TAC TTC TTA GGT 288
Gly Gln Arg Lys Glu Leu Ala Glu Arg Trp Phe Phe Tyr Phe Leu Gly
85 90 95
ACA GGA CCT CAT GCT GAT GCT AAA TTC AAA GAC AAG ATT GAT GGA GTC 336
Thr Gly Pro His Ala Asp Ala Lys Phe Lys Asp Lys Ile Asp Gly Val
100 105 110
TTC TGG GTT GCA AGG GAT GGT GCC ATG AAC AAG CCC ACA ACG CTT GGC 384
Phe Trp Val Ala Arg Asp Gly Ala Met Asn Lys Pro Thr Thr Leu Gly
115 120 125
ACT CGT GGA ACC AAT AAC GAA TCC AAA CCA CTG AGA TTT GAT GGT AAG 432
Thr Arg Gly Thr Asn Asn Glu Ser Lys Pro Leu Arg Phe Asp Gly Lys
130 135 140
ATA CCG CCA CAG TTT CAG CTT GAA GTG AAC CGT TCT AGG AAC AAT TCA 480
Ile Pro Pro Gln Phe Gln Leu Glu Val Asn Arg Ser Arg Asn Asn Ser
145 150 155 160
AGG TCT GGT TCT CAG TCT AGA TCT GTT TCA AGA AAC AGA TCT CAA TCT 528
Arg Ser Gly Ser Gln Ser Arg Ser Val Ser Arg Asn Arg Ser Gln Ser
165 170 175
AGA GGA AGA CAC CAT TCC AAT AAC CAG AAT AAT AAT GTT GAG GAT ACA 576
Arg Gly Arg His His Ser Asn Asn Gln Asn Asn Asn Val Glu Asp Thr
180 185 190
ATT GTA GCC GTG CTT GAA AAA TTA GGT GTT ACT GAC AAA CAA AGG TCA 624
Ile Val Ala Val Leu Glu Lys Leu Gly Val Thr Asp Lys Gln Arg Ser
195 200 205
CGT TCT AAA CCT AGA GAA CGT AGT GAT TCC AAA CCT AGG GAC ACA ACA 672
Arg Ser Lys Pro Arg Glu Arg Ser Asp Ser Lys Pro Arg Asp Thr Thr
210 215 220
CCT AAG AAT GCC AAC AAA CAC ACC TGG AAG AAA ACT GCA GGC AAG GGA 720
Pro Lys Asn Ala Asn Lys His Thr Trp Lys Lys Thr Ala Gly Lys Gly
225 230 235 240
GAT GTG ACA ACT TTC TAT GGT GCT AGA AGT AGT TCA GCT AAC TTT GGT 768
Asp Val Thr Thr Phe Tyr Gly Ala Arg Ser Ser Ser Ala Asn Phe Gly
245 250 255
GAT AGT GAT CTC GTT GCC AAT GGT AAC GCT GCC AAA TGC TAC CCT CAG 816
Asp Ser Asp Leu Val Ala Asn Gly Asn Ala Ala Lys Cys Tyr Pro Gln
260 265 270
ATA GCT GAA TGT GTT CCA TCA GTG TCT AGC ATA ATC TTT GGC AGT CAA 864
Ile Ala Glu Cys Val Pro Ser Val Ser Ser Ile Ile Phe Gly Ser Gln
275 280 285
TGG TCT GCT GAA GAA GCT GGT GAT CAA GTG AAA GTC ACG CTC ACT CAC 912
Trp Ser Ala Glu Glu Ala Gly Asp Gln Val Lys Val Thr Leu Thr His
290 295 300
ACC TAC TAC CTG CCA AAG GAT GAT GCC AAA ACT AGT CAA TTC CTA GAA 960
Thr Tyr Tyr Leu Pro Lys Asp Asp Ala Lys Thr Ser Gln Phe Leu Glu
305 310 315 320
CAG ATT GAC GCT TAC AAG CGA CCT TCT GAA GTG GCT AAG GAT CAG AGG 1008
Gln Ile Asp Ala Tyr Lys Arg Pro Ser Glu Val Ala Lys Asp Gln Arg
325 330 335
CAA AGA AGA TCC CGT TCT AAG TCT GCT GAT AAG AAG CCT GAG GAG TTG 1056
Gln Arg Arg Ser Arg Ser Lys Ser Ala Asp Lys Lys Pro Glu Glu Leu
340 345 350
TCT GTA ACT CTT GTG GAG GCA TAC ACA GAT GTG TTT GAT GAC ACA CAG 1104
Ser Val Thr Leu Val Glu Ala Tyr Thr Asp Val Phe Asp Asp Thr Gln
355 360 365
GTT GAG ATG ATT GAT GAG GTT ACG AAC TAA 1134
Val Glu Met Ile Asp Glu Val Thr Asn
370 375

配列番号：３
配列の長さ：8710
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：環状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：ネコ伝染性腹膜炎ウイルス
直接の起源
クローン名：pSC11-FIPV E1
配列：
CGAAAGGGCC TCGTGATACG CCTATTTTTA TAGGTTAATG TCATGATAAT AATGGTTTCT 60
TAGACGTCAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC 120
TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA 180
TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT 240
GCGGCATTTT GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT 300
GAAGATCAGT TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC 360
CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA 420
TGTGGCGCGG TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC 480
TATTCTCAGA ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC 540
ATGACAGTAA GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC 600
TTACTTCTGA CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG 660
GATCATGTAA CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC 720
GAGCGTGACA CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC 780
GAACTACTTA CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT 840
GCAGGACCAC TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA 900
GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC 960
CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG 1020
ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA 1080
TATATACTTT AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC 1140
CTTTTTGATA ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA 1200
GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC 1260
TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA 1320
CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT 1380
CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC 1440
GCTCTGCTAA TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG 1500
TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG 1560
TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG 1620
CATTGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC 1680
AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT 1740
AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG 1800
GGGCGGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC 1860
TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT 1920
ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA 1980
GTGAGCGAGG AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG 2040
ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC 2100
GCAATTAATG TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG 2160
GCTCGTATGT TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC 2220
CATGATTACG CCAAGCTTTT GCGATCAATA AATGGATCAC AACCAGTATC TCTTAACGAT 2280
GTTCTTCGCA GATGATGATT CATTTTTTAA GTATTTGGCT AGTCAAGATG ATGAAATCTT 2340
CATTATCTGA TATATTGCAA ATCACTCAAT ATCTAGACTT TCTGTTATTA TTATTGATCC 2400
AATCAAAAAA TAAATTAGAA GCCGTGGGTC ATTGTTATGA ATCTCTTTCA GAGGAATACA 2460
GACAATTGAC AAAATTCACA GACTTTCAAG ATTTTAAAAA ACTGTTTAAC AAGGTCCCTA 2520
TTGTTACAGA TGGAAGGGTC AAACTTAATA AAGGATATTT GTTCGACTTT GTGATTAGTT 2580
TGATGCGATT CAAAAAAGAA TCCTCTCTAG CTACCACCGC AATAGATCCT GTTAGATACA 2640
TAGATCCTCG TCGCAATATC GCATTTTCTA ACGTGATGGA TATATTAAAG TCGAATAAAG 2700
TGAACAATAA TTAATTCTTT ATTGTCATCA TGAACGGCGG ACATATTCAG TTGATAATCG 2760
GCCCCATGTT TTCAGGTAAA AGTACAGAAT TAATTAGACG AGTTAGACGT TATCAAATAG 2820
CTCAATATAA ATGCGTGACT ATAAAATATT CTAACGATAA TAGATACGGA ACGGGACTAT 2880
GGACGCATGA TAAGAATAAT TTTGAAGCAT TGGAAGCAAC TAAACTATGT GATCTCTTGG 2940
AATCAATTAC AGATTTCTCC GTGATAGGTA TCGATGAAGG ACAGTTCTTT CCAGACATTG 3000
TTGAATTCCG AGCTTGGCTG CAGGTCGGGG ATCCCCCCTG CCCGGTTATT ATTATTTTTG 3060
ACACCAGACC AACTGGTAAT GGTAGCGAAC GGCGCTCAGC TGAATTCCGC CGATACTGAC 3120
GGGCTCCAGG AGTCGTCGCC ACCAATCCCC ATATGGAAAC CGTCGATATT CAGCCATGTG 3180
CCTTCTTCCG CGTGCAGCAG ATGGCGATGG CTGGTTTCCA TCAGTTGCTG TTGACTGTAG 3240
CGGCTGATGT TGAACTGGAA GTCGCCGCGC CACTGGTGTG GGCCATAATT CAATTCGCGC 3300
GTCCCGCAGC GCAGACCGTT TTCGCTCGGG AAGACGTACG GGGTATACAT GTCTGACAAT 3360
GGCAGATCCC AGCGGTCAAA ACAGGCGGCA GTAAGGCGGT CGGGATAGTT TTCTTGCGGC 3420
CCTAATCCGA GCCAGTTTAC CCGCTCTGCT ACCTGCGCCA GCTGGCAGTT CAGGCCAATC 3480
CGCGCCGGAT GCGGTGTATC GCTCGCCACT TCAACATCAA CGGTAATCGC CATTTGACCA 3540
CTACCATCAA TCCGGTAGGT TTTCCGGCTG ATAAATAAGG TTTTCCCCTG ATGCTGCCAC 3600
GCGTGACCGG TCGTAATCAG CACCGCATCA GCAAGTGTAT CTGCCGTGCA CTGCAACAAC 3660
GCTGCTTCGG CCTGGTAATG GCCCGCCGCC TTCCAGCGTT CGACCCAGGC GTTAGGGTCA 3720
ATGCGGGTCG CTTCACTTAC GCCAATGTCG TTATCCAGCG GTGCACGGGT GAACTGATCG 3780
CGCAGCGGCG TCAGCAGTTG TTTTTTATCG CCAATCCACA TCTGTGAAAG AAAGCCTGAC 3840
TGGCGGTTAA ATTGCCAACG CTTATTACCC AGCTCGATGC AAAAATCCAT TTCGCTGGTG 3900
GTCAGATGCG GGATGGCGTG GGACGCGGCG GGGAGCGTCA CACTGAGGTT TTCCGCCAGA 3960
CGCCACTGCT GCCAGGCGCT GATGTGCCCG GCTTCTGACC ATGCGGTCGC GTTCGGTTGC 4020
ACTACGCGTA CTGTGAGCCA GAGTTGCCCG GCGCTCTCCG GCTGCGGTAG TTCAGGCAGT 4080
TCAATCAACT GTTTACCTTG TGGAGCGACA TCCAGAGGCA CTTCACCGCT TGCCAGCGGC 4140
TTACCATCCA GCGCCACCAT CCAGTGCAGG AGCTCGTTAT CGCTATGACG GAACAGGTAT 4200
TCGCTGGTCA CTTCGATGGT TTGCCCGGAT AAACGGAACT GGAAAAACTG CTGCTGGTGT 4260
TTTGCTTCCG TCAGCGCTGG ATGCGGCGTG CGGTCGGCAA AGACCAGACC GTTCATACAG 4320
AACTGGCGAT CGTTCGGCGT ATCGCCAAAA TCACCGCCGT AAGCCGACCA CGGGTTGCCG 4380
TTTTCATCAT ATTTAATCAG CGACTGATCC ACCCAGTCCC AGACGAAGCC GCCCTGTAAA 4440
CGGGGATACT GACGAAACGC CTGCCAGTAT TTAGCGAAAC CGCCAAGACT GTTACCCATC 4500
GCGTGGGCGT ATTCGCAAAG GATCAGCGGG CGCGTCTCTC CAGGTAGCGA AAGCCATTTT 4560
TTGATGGACC ATTTCGGCAC AGCCGGGAAG GGCTGGTCTT CATCCACGCG CGCGTACATC 4620
GGGCAAATAA TATCGGTGGC CGTGGTGTCG GCTCCGCCGC CTTCATACTG CACCGGGCGG 4680
GAAGGATCGA CAGATTTGAT CCAGCGATAC AGCGCGTCGT GATTAGCGCC GTGGCCTGAT 4740
TCATTCCCCA GCGACCAGAT GATCACACTC GGGTGATTAC GATCGCGCTG CACCATTCGC 4800
GTTACGCGTT CGCTCATCGC CGGTAGCCAG CGCGGATCAT CGGTCAGACG ATTGATTGGC 4860
ACCATGCCGT GGGTTTCAAT ATTGGCTTCA TCCACCACAT ACAGGCCGTA GCGGTCGCAC 4920
AGCGTGTACC ACAGCGGATG GTTCGGATAA TGCGAACAGC GCACGGCGTT AAAGTTGTTC 4980
TGCTTCATCA GCAGGATATC CTGCACCATC GTCTGCTCAT CCATGACCTG ACCATGCAGA 5040
GGATGATGCT CGTGACGGTT AACGCCTCGA ATCAGCAACG GCTTGCCGTT CAGCAGCAGC 5100
AGACCATTTT CAATCCGCAC CTCGCGGAAA CCGACATCGC AGGCTTCTGC TTCAATCAGC 5160
GTGCCGTCGG CGGTGTGCAG TTCAACCACC GCACGATAGA GATTCGGGAT TTCGGCGCTC 5220
CACAGTTTCG GGTTTTCGAC CTTGAGACGT AGTGTGACGC GATCGGCATA ACCACCACGC 5280
TCATCGATAA TTTCACCGCC GAAAGGCGCG GTGCCGCTGG CGACCTGCGT TTCACCCTGC 5340
CATAAAGAAA CTGTTACCCG TAGGTAGTCA CGCAACTCGC CGCACATCTG AACTTCAGCC 5400
TCCAGTACAG CGCGGCTGAA ATCATCATTA AAGCGAGTGG CAACATGGAA ATCGCTGATT 5460
TGTGTAGTCG GTTTATGCAG CAACGAGACG TCACGGAAAA TGCCGCTCAT CCGCCACATA 5520
TCCTGATCTT CCAGATAACT GCCGTCACTC CAACGCAGCA CCATCACCGC GAGGCGGTTT 5580
TCTCCGGCGC GTAAAAATGC GCTCAGGTCA AATTCAGACG GCAAACGACT GTCCTGGCCG 5640
TAACCGACCC AGCGCCCGTT GCACCACAGA TGAAACGCCG AGTTAACGCC ATCAAAAATA 5700
ATTCGCGTCT GGCCTTCCTG TAGCCAGCTT TCATCAACAT TAAATGTGAG CGAGTAACAA 5760
CCCGTCGGAT TCTCCGTGGG AACAAACGGC GGATTGACCG TAATGGGATA GGTTACGTTG 5820
GTGTAGATGG GCGCATCGTA ACCGTGCATC TGCCAGTTTG AGGGGACGAC GACAGTATCG 5880
GCCTCAGGAA GATCGCACTC CAGCCAGCTT TCCGGCACCG CTTCTGGTGC CGGAAACCAG 5940
GCAAAGCGCC ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC 6000
TCTTCGCTAT TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA 6060
ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG GATCCCTCGA GGAATTCATT 6120
TATAGCATAG AAAAAAACAA AATGAAATTC TACTATATTT TTACATACAT ATATTCTAAA 6180
TATGAAAGTG GTGATTGTGA CTAGCGTAGC ATCGCTTCTA GACATATACT ATATAGTAAT 6240
ACCAATACTC AAGACTACGA AACTGATACA ATCTCTTATC ATGTGGGTAA TGTTCTCGAT 6300
GTCGAATAGC CATATGCCGG TAGTTGCGAT ATACATAAAC TGATCACTAA TTCCAAACCC 6360
ACCCGCTTTT TATAGTAAGT TTTTCACCCA TAAATAATAA ATACAATAAT TAATTTCTCG 6420
TAAAAGTAGA AAATATATTC TAATTTATTG CACGGTAAGG AAGTAGAATC ATAAAGAACA 6480
GTGACGGATC CCAATTCGGG CATTTTTGGT TTGAACTAAA CAAAATGAAG TACATTTTGC 6540
TAATACTCGC GTGCATAATT GCATGCGTTT ATGGTGAACG CTACTGTGCC ATGCAAGACA 6600
GTGGCTTGCA GTGTATTAAT GGCACAAATT CAAGATGTCA AACCTGCTTT GAACGTGGTG 6660
ATCTTATTTG GCATCTTGCT AACTGGAACT TCAGCTGGTC TGTAATATTG ATTGTTTTTA 6720
TAACAGTGTT ACAATATGGC AGACCACAAT TTAGCTGGCT CGTTTATGGC ATTAAAATGC 6780
TGATCATGTG GCTATTATGG CCTATTGTTC TAGCGCTTAC GATTTTTAAT GCATACTCTG 6840
AGTACCAAGT TTCCAGATAT GTAATGTTCG GCTTTAGTGT TGCAGGTGCA GTTGTAACGT 6900
TTGCACTTTG GATGATGTAT TTTGTGAGAT CTGTTCAGCT ATATAGAAGA ACCAAATCAT 6960
GGTGGTCTTT TAATCCTGAG ACTAATGCAA TTCTTTGTGT TAATGCATTG GGTAGAAGTT 7020
ATGTGCTTCC CTTAGATGGT ACTCCTACAG GTGTTACCCT TACTCTACTT TCAGGAAATC 7080
TATATGCTGA AGGTTTCAAA ATGGCTGGTG GTTTAACCAT CGAGCATTTG CCTAAATACG 7140
TCATGATTGC TACACCTAGT AGAACCATCG TTTATACATT AGTTGGAAAA CAATTAAAAG 7200
CAACTACTGC CACAGGATGG GCTTACTACG TAAAATCTAA AGCTGGTGAT TACTCAACAG 7260
AAGCACGTAC TGACAATTTG AGTGAACATG AAAAATTATT ACATATGGTG TAACTAAACT 7320
TTCAAATGGG GGAATTCTGT GAGCGTATGG CAAACGAAGG AAAAATTAGT TATAGTAGCC 7380
GCACTCGATG GGACATTTCA ACGTAAACCG TTTAATAATA TTTTGAATCT TATTCCATTA 7440
TCTGAAATGG TGGTAAAACT AACTGCTGTG TGTATGAAAT GCTTTAAGGA GGCTTCCTTT 7500
TCTAAACGAT TGGGTGAGGA AACCGAGATA GAAATAATAG GAGGTAATGA TATGTATCAA 7560
TCGGTGTGTA GAAAGTGTTA CATCGACTCA TAATATTATA TTTTTTATCT AAAAAACTAA 7620
AAATAAACAT TGATTAAATT TTAATATAAT ACTTAAAAAT GGATGTTGTG TCGTTAGATA 7680
AACCGTTTAT GTATTTTGAG GAAATTGATA ATGAGTTAGA TTACGAACCA GAAAGTGCAA 7740
ATGAGGTCGC AAAAAAACTG CCGTATCAAG GACAGTTAAA ACTATTACTA GGAGAATTAT 7800
TTTTTCTTAG TAAGTTACAG CGACACGGTA TATTAGATGG TGCCACCGTA GTGTATATAG 7860
GATCTGCTCC CGGTACACAT ATACGTTATT TGAGAGATCA TTTCTATAAT TTAGGAGTGA 7920
TCATCAAATG GATGCTAATT GACGGCCGCC ATCATGATCC TATTTTAAAT GGATTGCGTG 7980
ATGTGACTCT AGTGACTCGG TTCGTTGATG AGGAATATCT ACGATCCATC AAAAAACAAC 8040
TGCATCCTTC TAAGATTATT TTAATTTCTG ATGTGAGATC CAAACGAGGA GGAAATGAAC 8100
CTAGTACGGC GGATTTACTA AGTAATTACG CTCTACAAAA TGTCATGATT AGTATTTTAA 8160
ACCCCGTGGC GTCTAGTCTT AAATGGAGAT GCCCGTTTCC AGATCAATGG ATCAAGGACT 8220
TTTATATCCC ACACGGTAAT AAAATGTTAC AACCTTTTGC TCCTTCATAT TCAGGGCCGT 8280
CGTTTTACAA CGTCGTGACT GGGAAAACCC TGGCGTTACC CAACTTAATC GCCTTGCAGC 8340
ACATCCCCCT TTCGCCAGCT GGCGTAATAG CGAAGAGGCC CGCACCGATC GCCCTTCCCA 8400
ACAGTTGCGC AGCCTGAATG GCGAATGGCG CCTGATGCGG TATTTTCTCT TTACGCATCT 8460
GTGCGGTATT TCACACCGCA TATGGTGCAC TCTCAGTACC ATCTGCTCTG ATGCCGCATA 8520
GTTAAGCCAG TACACTCCGC TATCGCTACG TGACTGGGTC ATGGCTGCGC CCCGACACCC 8580
GCCAACACCC GCTGACGCGC CCTGACGGGC TTGTCTGCTC CCGGCATCCG CTTACAGACA 8640
AGCTGTGACC GTCTCCGGGA GCTGCATGTG TCAGAGGTTT TCACCGTCAT CACCGAAACG 8700
CGCGAGGCAG 8710

配列番号：４
配列の長さ：9019
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：環状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：ネコ免疫不全ウイルス
直接の起源
クローン名：pSC11-FIPV N
配列：
CGAAAGGGCC TCGTGATACG CCTATTTTTA TAGGTTAATG TCATGATAAT AATGGTTTCT 60
TAGACGTCAG GTGGCACTTT TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC 120
TAAATACATT CAAATATGTA TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA 180
TATTGAAAAA GGAAGAGTAT GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT 240
GCGGCATTTT GCCTTCCTGT TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT 300
GAAGATCAGT TGGGTGCACG AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC 360
CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA 420
TGTGGCGCGG TATTATCCCG TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC 480
TATTCTCAGA ATGACTTGGT TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC 540
ATGACAGTAA GAGAATTATG CAGTGCTGCC ATAACCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC 600
TTACTTCTGA CAACGATCGG AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTGCA CAACATGGGG 660
GATCATGTAA CTCGCCTTGA TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC 720
GAGCGTGACA CCACGATGCC TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC 780
GAACTACTTA CTCTAGCTTC CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT 840
GCAGGACCAC TTCTGCGCTC GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA 900
GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC 960
CGTATCGTAG TTATCTACAC GACGGGGAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG 1020
ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA 1080
TATATACTTT AGATTGATTT AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC 1140
CTTTTTGATA ATCTCATGAC CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA 1200
GACCCCGTAG AAAAGATCAA AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC 1260
TGCTTGCAAA CAAAAAAACC ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA 1320
CCAACTCTTT TTCCGAAGGT AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT 1380
CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC 1440
GCTCTGCTAA TCCTGTTACC AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG 1500
TTGGACTCAA GACGATAGTT ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG 1560
TGCACACAGC CCAGCTTGGA GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG 1620
CATTGAGAAA GCGCCACGCT TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC 1680
AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GAAACGCCTG GTATCTTTAT 1740
AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG 1800
GGGCGGAGCC TATGGAAAAA CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC 1860
TGGCCTTTTG CTCACATGTT CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT 1920
ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA 1980
GTGAGCGAGG AAGCGGAAGA GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG 2040
ATTCATTAAT GCAGCTGGCA CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC 2100
GCAATTAATG TGAGTTAGCT CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG 2160
GCTCGTATGT TGTGTGGAAT TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC 2220
CATGATTACG CCAAGCTTTT GCGATCAATA AATGGATCAC AACCAGTATC TCTTAACGAT 2280
GTTCTTCGCA GATGATGATT CATTTTTTAA GTATTTGGCT AGTCAAGATG ATGAAATCTT 2340
CATTATCTGA TATATTGCAA ATCACTCAAT ATCTAGACTT TCTGTTATTA TTATTGATCC 2400
AATCAAAAAA TAAATTAGAA GCCGTGGGTC ATTGTTATGA ATCTCTTTCA GAGGAATACA 2460
GACAATTGAC AAAATTCACA GACTTTCAAG ATTTTAAAAA ACTGTTTAAC AAGGTCCCTA 2520
TTGTTACAGA TGGAAGGGTC AAACTTAATA AAGGATATTT GTTCGACTTT GTGATTAGTT 2580
TGATGCGATT CAAAAAAGAA TCCTCTCTAG CTACCACCGC AATAGATCCT GTTAGATACA 2640
TAGATCCTCG TCGCAATATC GCATTTTCTA ACGTGATGGA TATATTAAAG TCGAATAAAG 2700
TGAACAATAA TTAATTCTTT ATTGTCATCA TGAACGGCGG ACATATTCAG TTGATAATCG 2760
GCCCCATGTT TTCAGGTAAA AGTACAGAAT TAATTAGACG AGTTAGACGT TATCAAATAG 2820
CTCAATATAA ATGCGTGACT ATAAAATATT CTAACGATAA TAGATACGGA ACGGGACTAT 2880
GGACGCATGA TAAGAATAAT TTTGAAGCAT TGGAAGCAAC TAAACTATGT GATCTCTTGG 2940
AATCAATTAC AGATTTCTCC GTGATAGGTA TCGATGAAGG ACAGTTCTTT CCAGACATTG 3000
TTGAATTCCG AGCTTGGCTG CAGGTCGGGG ATCCCCCCTG CCCGGTTATT ATTATTTTTG 3060
ACACCAGACC AACTGGTAAT GGTAGCGAAC GGCGCTCAGC TGAATTCCGC CGATACTGAC 3120
GGGCTCCAGG AGTCGTCGCC ACCAATCCCC ATATGGAAAC CGTCGATATT CAGCCATGTG 3180
CCTTCTTCCG CGTGCAGCAG ATGGCGATGG CTGGTTTCCA TCAGTTGCTG TTGACTGTAG 3240
CGGCTGATGT TGAACTGGAA GTCGCCGCGC CACTGGTGTG GGCCATAATT CAATTCGCGC 3300
GTCCCGCAGC GCAGACCGTT TTCGCTCGGG AAGACGTACG GGGTATACAT GTCTGACAAT 3360
GGCAGATCCC AGCGGTCAAA ACAGGCGGCA GTAAGGCGGT CGGGATAGTT TTCTTGCGGC 3420
CCTAATCCGA GCCAGTTTAC CCGCTCTGCT ACCTGCGCCA GCTGGCAGTT CAGGCCAATC 3480
CGCGCCGGAT GCGGTGTATC GCTCGCCACT TCAACATCAA CGGTAATCGC CATTTGACCA 3540
CTACCATCAA TCCGGTAGGT TTTCCGGCTG ATAAATAAGG TTTTCCCCTG ATGCTGCCAC 3600
GCGTGACCGG TCGTAATCAG CACCGCATCA GCAAGTGTAT CTGCCGTGCA CTGCAACAAC 3660
GCTGCTTCGG CCTGGTAATG GCCCGCCGCC TTCCAGCGTT CGACCCAGGC GTTAGGGTCA 3720
ATGCGGGTCG CTTCACTTAC GCCAATGTCG TTATCCAGCG GTGCACGGGT GAACTGATCG 3780
CGCAGCGGCG TCAGCAGTTG TTTTTTATCG CCAATCCACA TCTGTGAAAG AAAGCCTGAC 3840
TGGCGGTTAA ATTGCCAACG CTTATTACCC AGCTCGATGC AAAAATCCAT TTCGCTGGTG 3900
GTCAGATGCG GGATGGCGTG GGACGCGGCG GGGAGCGTCA CACTGAGGTT TTCCGCCAGA 3960
CGCCACTGCT GCCAGGCGCT GATGTGCCCG GCTTCTGACC ATGCGGTCGC GTTCGGTTGC 4020
ACTACGCGTA CTGTGAGCCA GAGTTGCCCG GCGCTCTCCG GCTGCGGTAG TTCAGGCAGT 4080
TCAATCAACT GTTTACCTTG TGGAGCGACA TCCAGAGGCA CTTCACCGCT TGCCAGCGGC 4140
TTACCATCCA GCGCCACCAT CCAGTGCAGG AGCTCGTTAT CGCTATGACG GAACAGGTAT 4200
TCGCTGGTCA CTTCGATGGT TTGCCCGGAT AAACGGAACT GGAAAAACTG CTGCTGGTGT 4260
TTTGCTTCCG TCAGCGCTGG ATGCGGCGTG CGGTCGGCAA AGACCAGACC GTTCATACAG 4320
AACTGGCGAT CGTTCGGCGT ATCGCCAAAA TCACCGCCGT AAGCCGACCA CGGGTTGCCG 4380
TTTTCATCAT ATTTAATCAG CGACTGATCC ACCCAGTCCC AGACGAAGCC GCCCTGTAAA 4440
CGGGGATACT GACGAAACGC CTGCCAGTAT TTAGCGAAAC CGCCAAGACT GTTACCCATC 4500
GCGTGGGCGT ATTCGCAAAG GATCAGCGGG CGCGTCTCTC CAGGTAGCGA AAGCCATTTT 4560
TTGATGGACC ATTTCGGCAC AGCCGGGAAG GGCTGGTCTT CATCCACGCG CGCGTACATC 4620
GGGCAAATAA TATCGGTGGC CGTGGTGTCG GCTCCGCCGC CTTCATACTG CACCGGGCGG 4680
GAAGGATCGA CAGATTTGAT CCAGCGATAC AGCGCGTCGT GATTAGCGCC GTGGCCTGAT 4740
TCATTCCCCA GCGACCAGAT GATCACACTC GGGTGATTAC GATCGCGCTG CACCATTCGC 4800
GTTACGCGTT CGCTCATCGC CGGTAGCCAG CGCGGATCAT CGGTCAGACG ATTGATTGGC 4860
ACCATGCCGT GGGTTTCAAT ATTGGCTTCA TCCACCACAT ACAGGCCGTA GCGGTCGCAC 4920
AGCGTGTACC ACAGCGGATG GTTCGGATAA TGCGAACAGC GCACGGCGTT AAAGTTGTTC 4980
TGCTTCATCA GCAGGATATC CTGCACCATC GTCTGCTCAT CCATGACCTG ACCATGCAGA 5040
GGATGATGCT CGTGACGGTT AACGCCTCGA ATCAGCAACG GCTTGCCGTT CAGCAGCAGC 5100
AGACCATTTT CAATCCGCAC CTCGCGGAAA CCGACATCGC AGGCTTCTGC TTCAATCAGC 5160
GTGCCGTCGG CGGTGTGCAG TTCAACCACC GCACGATAGA GATTCGGGAT TTCGGCGCTC 5220
CACAGTTTCG GGTTTTCGAC CTTGAGACGT AGTGTGACGC GATCGGCATA ACCACCACGC 5280
TCATCGATAA TTTCACCGCC GAAAGGCGCG GTGCCGCTGG CGACCTGCGT TTCACCCTGC 5340
CATAAAGAAA CTGTTACCCG TAGGTAGTCA CGCAACTCGC CGCACATCTG AACTTCAGCC 5400
TCCAGTACAG CGCGGCTGAA ATCATCATTA AAGCGAGTGG CAACATGGAA ATCGCTGATT 5460
TGTGTAGTCG GTTTATGCAG CAACGAGACG TCACGGAAAA TGCCGCTCAT CCGCCACATA 5520
TCCTGATCTT CCAGATAACT GCCGTCACTC CAACGCAGCA CCATCACCGC GAGGCGGTTT 5580
TCTCCGGCGC GTAAAAATGC GCTCAGGTCA AATTCAGACG GCAAACGACT GTCCTGGCCG 5640
TAACCGACCC AGCGCCCGTT GCACCACAGA TGAAACGCCG AGTTAACGCC ATCAAAAATA 5700
ATTCGCGTCT GGCCTTCCTG TAGCCAGCTT TCATCAACAT TAAATGTGAG CGAGTAACAA 5760
CCCGTCGGAT TCTCCGTGGG AACAAACGGC GGATTGACCG TAATGGGATA GGTTACGTTG 5820
GTGTAGATGG GCGCATCGTA ACCGTGCATC TGCCAGTTTG AGGGGACGAC GACAGTATCG 5880
GCCTCAGGAA GATCGCACTC CAGCCAGCTT TCCGGCACCG CTTCTGGTGC CGGAAACCAG 5940
GCAAAGCGCC ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC 6000
TCTTCGCTAT TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA 6060
ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG GATCCCTCGA GGAATTCATT 6120
TATAGCATAG AAAAAAACAA AATGAAATTC TACTATATTT TTACATACAT ATATTCTAAA 6180
TATGAAAGTG GTGATTGTGA CTAGCGTAGC ATCGCTTCTA GACATATACT ATATAGTAAT 6240
ACCAATACTC AAGACTACGA AACTGATACA ATCTCTTATC ATGTGGGTAA TGTTCTCGAT 6300
GTCGAATAGC CATATGCCGG TAGTTGCGAT ATACATAAAC TGATCACTAA TTCCAAACCC 6360
ACCCGCTTTT TATAGTAAGT TTTTCACCCA TAAATAATAA ATACAATAAT TAATTTCTCG 6420
TAAAAGTAGA AAATATATTC TAATTTATTG CACGGTAAGG AAGTAGAATC ATAAAGAACA 6480
GTGACGGATC CCGGGATGGC CACACAGGGA CAACGCGTCA ACTGGGGAGA TGAACCTTCC 6540
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TACAACCCCA TTACCCTCGA ACAAGGATCT AAATTTTGGA ATTTATGTCC GAGAGACCTT 6660
GTTCCCAAAG GAATAGGTAA TAAGGATCAA CAAATTGGTT ATTGGAATAG ACAGATTCGT 6720
TATCGTATTG TAAAAGGCCA GCGTAAGGAA CTCGCTGAGA GGTGGTTCTT TTACTTCTTA 6780
GGTACAGGAC CTCATGCTGA TGCTAAATTC AAAGACAAGA TTGATGGAGT CTTCTGGGTT 6840
GCAAGGGATG GTGCCATGAA CAAGCCCACA ACGCTTGGCA CTCGTGGAAC CAATAACGAA 6900
TCCAAACCAC TGAGATTTGA TGGTAAGATA CCGCCACAGT TTCAGCTTGA AGTGAACCGT 6960
TCTAGGAACA ATTCAAGGTC TGGTTCTCAG TCTAGATCTG TTTCAAGAAA CAGATCTCAA 7020
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GTGCTTGAAA AATTAGGTGT TACTGACAAA CAAAGGTCAC GTTCTAAACC TAGAGAACGT 7140
AGTGATTCCA AACCTAGGGA CACAACACCT AAGAATGCCA ACAAACACAC CTGGAAGAAA 7200
ACTGCAGGCA AGGGAGATGT GACAACTTTC TATGGTGCTA GAAGTAGTTC AGCTAACTTT 7260
GGTGATAGTG ATCTCGTTGC CAATGGTAAC GCTGCCAAAT GCTACCCTCA GATAGCTGAA 7320
TGTGTTCCAT CAGTGTCTAG CATAATCTTT GGCAGTCAAT GGTCTGCTGA AGAAGCTGGT 7380
GATCAAGTGA AAGTCACGCT CACTCACACC TACTACCTGC CAAAGGATGA TGCCAAAACT 7440
AGTCAATTCC TAGAACAGAT TGACGCTTAC AAGCGACCTT CTGAAGTGGC TAAGGATCAG 7500
AGGCAAAGAA GATCCCGTTC TAAGTCTGCT GATAAGAAGC CTGAGGAGTT GTCTGTAACT 7560
CTTGTGGAGG CATACACAGA TGTGTTTGAT GACACACAGG TTGAGATGAT TGATGAGGTT 7620
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TATAGTAGCC GCACTCGATG GGACATTTCA ACGTAAACCG TTTAATAATA TTTTGAATCT 7740
TATTCCATTA TCTGAAATGG TGGTAAAACT AACTGCTGTG TGTATGAAAT GCTTTAAGGA 7800
GGCTTCCTTT TCTAAACGAT TGGGTGAGGA AACCGAGATA GAAATAATAG GAGGTAATGA 7860
TATGTATCAA TCGGTGTGTA GAAAGTGTTA CATCGACTCA TAATATTATA TTTTTTATCT 7920
AAAAAACTAA AAATAAACAT TGATTAAATT TTAATATAAT ACTTAAAAAT GGATGTTGTG 7980
TCGTTAGATA AACCGTTTAT GTATTTTGAG GAAATTGATA ATGAGTTAGA TTACGAACCA 8040
GAAAGTGCAA ATGAGGTCGC AAAAAAACTG CCGTATCAAG GACAGTTAAA ACTATTACTA 8100
GGAGAATTAT TTTTTCTTAG TAAGTTACAG CGACACGGTA TATTAGATGG TGCCACCGTA 8160
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GCCTTGCAGC ACATCCCCCT TTCGCCAGCT GGCGTAATAG CGAAGAGGCC CGCACCGATC 8700
GCCCTTCCCA ACAGTTGCGC AGCCTGAATG GCGAATGGCG CCTGATGCGG TATTTTCTCT 8760
TTACGCATCT GTGCGGTATT TCACACCGCA TATGGTGCAC TCTCAGTACC ATCTGCTCTG 8820
ATGCCGCATA GTTAAGCCAG TACACTCCGC TATCGCTACG TGACTGGGTC ATGGCTGCGC 8880
CCCGACACCC GCCAACACCC GCTGACGCGC CCTGACGGGC TTGTCTGCTC CCGGCATCCG 8940
CTTACAGACA AGCTGTGACC GTCTCCGGGA GCTGCATGTG TCAGAGGTTT TCACCGTCAT 9000
CACCGAAACG CGCGAGGCAG 9020

ＦＩＰＶ Ｅ１タンパク（オープンリーディングフレーム）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一部を示す図である。 図１のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のつづきを示す図である。 ＦＩＰＶ Ｎタンパク（オープンリーディングフレーム）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の一部を示す図である。 図３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のつづきを示す図である。 図４のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のつづきを示す図である。 ＦＩＰＶ Ｅ１およびＮタンパクをコードする遺伝子をクローン化するのに用いたプラスミドｐＵＣ１８ ＦＩＰＶ Ｅ１-ＮならびにＦＩＰＶ Ｅ１およびＮ ｃＤＮＡを示す図である。 ＦＩＰＶ Ｅ１タンパクをコードするＲＲＰＶを創製するのに用いたトランスファープラスミドｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ Ｅ１を示す図である。 ＦＩＰＶ ＮタンパクをコードするＲＲＰＶを創製するのに用いたトランスファープラスミドｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ Ｎを示す図である。 ｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ Ｅ１のヌクレオチド配列および様々な遺伝要素の位置を示す図である。 図９のヌクレオチド配列のつづきを示す図である。 図１０のヌクレオチド配列のつづきを示す図である。 ｐＳＣ１１-ＦＩＰＶ Ｎのヌクレオチド配列および様々な遺伝要素の位置を示す図である。 図１２のヌクレオチド配列のつづきを示す図である。 図１３のヌクレオチド配列のつづきを示す図である。 ポリメラーゼ連鎖反応によるＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ ＮおよびＲＲＰＶ-ＦＩＰＶ Ｅ１の分析を示すエチジウムブロマイド染色アガロースゲルの図である。 ウイルス感染細胞の溶解物中におけるＦＩＰＶ ＮおよびＥ１タンパクの検出を示すイムノブロットの図である。

Claims (9)

1. ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）のヌクレオカプシド（Ｎ）およびトランスメンブレン（Ｍ／Ｅ１）タンパクからなる群から選択される要素をコードするＤＮＡ配列からなる少なくとも１つの内部遺伝子を有する組換えアライグマポックスウイルスと、医薬上許容される担体または希釈剤と、医薬上許容されるアジュバントとからなることを特徴とするワクチン；ただし、当該内部遺伝子がＦＩＰＶのＮタンパクをコードするＤＮＡ配列だけを含むものを除く。
2. 前記内部遺伝子が配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＦＩＰＶのＭ／Ｅ１タンパクをコードする請求項１記載のワクチン。
3. 前記ウイルスがＦＩＰＶのＥ１およびＮタンパクをコードする遺伝子を有する請求項１記載のワクチン。
4. ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症、ネコ鼻気管炎ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ネコ腸内コロナウイルス、またはこれらの組合せからなる群から選択される不活性化または弱毒化されたウイルスをさらに含有する請求項１記載のワクチン。
5. 不活性化または弱毒化されたネコオオム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、イヌ小胞子菌（Microsporum canis）、またはこれらの組合せをさらに含有する請求項１記載のワクチン。
6. ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）のヌクレオカプシド（Ｎ）およびトランスメンブレン（Ｍ／Ｅ１）タンパクからなる群から選択される要素をコードするＤＮＡ配列からなる少なくとも１つの内部遺伝子を有する第１の組換えアライグマポックスウイルスと、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）のヌクレオカプシド（Ｎ）およびトランスメンブレン（Ｍ／Ｅ１）タンパクからなる群から選択される要素をコードするＤＮＡ配列からなる少なくとも１つの内部遺伝子を有する第２の組換えアライグマポックスウイルスと、医薬上許容される担体または希釈剤と、医薬上許容されるアジュバントとからなることを特徴とするワクチン；ただし、当該内部遺伝子がＦＩＰＶのＮタンパクをコードするＤＮＡ配列だけを含むものを除く。
7. ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）に起因する疾患を予防する方法であって、このような処置を必要とするネコに、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）のヌクレオカプシド（Ｎ）およびトランスメンブレン（Ｍ／Ｅ１）タンパクからなる群から選択される要素をコードするＤＮＡ配列からなる少なくとも１つの内部遺伝子を有する組換えアライグマポックスウイルスを含有するワクチンを投与することを特徴とする方法；ただし、当該内部遺伝子がＦＩＰＶのＮタンパクをコードするＤＮＡ配列だけを含むものを除く。
8. 前記内部遺伝子が配列表の配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＦＩＰＶのＭ／Ｅ１タンパクをコードする請求項７記載の方法。
9. 前記ウイルスがＦＩＰＶのＥ１およびＮタンパクをコードする遺伝子を有する請求項７記載の方法。
   
   

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