DE69432207T2

DE69432207T2 - Poxvirusvektoren und deren Anwendung als Impstoff gegen Katzenansteckende Peritonitis-Viruskrankheit

Info

Publication number: DE69432207T2
Application number: DE69432207T
Authority: DE
Inventors: Lloyd Chavez; Hsien-Jue Chu; Terri Wasmoen
Original assignee: Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1993-09-22
Filing date: 1994-09-21
Publication date: 2003-11-13
Anticipated expiration: 2014-09-22
Also published as: AU7411694A; US5770211A; EP0652287A2; JPH07184662A; TW377373B; JP2005336206A; DE69432207D1; EP0652287B1; NZ264518A; SG55095A1; PT652287E; CA2132374A1; EP0652287A3; CA2132374C; DK0652287T3; US5656275A; ES2188605T3; ATE233821T1; AU680531B2

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Vorbeugung vor Krankheit, welche durch felinen infektiösen Peritonitis (Feline Infectious Peritonitis) Virus (FIPV) verursacht wird, unter Verwendung von rekombinierten Waschbären-Pockenviren (RRPVs), welche die Nucleocapsid- und Transmembran-Proteine von FIPV exprimieren, als Impfstoffe.

Hintergrund der Erfindung

Feliner infektiöser Peritonitis-Virus (FIPV) verursacht eine systemische Infektion in Katzen, welche häufig tödlich ist. Die effusive Form dieser Krankheit wird durch Ansammlung von fibrinöser Aszites-Flüssigkeit gekennzeichnet. Die nicht-effusive Form der Krankheit wird durch granulomatöse Läsionen in multiplen Organen gekennzeichnet, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Leber, Milz, Nieren, Lunge und Eingeweide. Besprochen in Barlough, J. E. und C. A. Stoddart. Feline Coronaviral Infections in C. E. Greene (Hrsg.). Infectious Diseases of the Dog an Cats. W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA, 1990, pp. 300-312.
Feliner infektiöser Peritonitis-Virus ist ein aus drei Hauptstrukturproteinen zusammengesetzter Coronavirus: Dem S(Spike)-Protein, dem E1 oder M(Transmembran)-Protein und dem N(Nucleocapsid)-Protein. Venema et al., Virology 181 : 327-335, 1991 und Dale et al., EPO-0376744.
Von vorherigen Impfstoffen mit der Absicht, FIPV-Infektion zu verhindern, ist tatsächlich gezeigt worden, dass sie die durch diesen Virus verursachte Krankheit verschlimmern. Pedersen, N. C. und J. W. Black, Am. J. Vet. Res. 44 : 229-234, 1983; Vennema H. et al. J. Virol. 64 : 1407-1409, 1990; Barlough, J. E., Can. J. Comp. Med. 49 : 303-307, 1985; Barlough J. E. et al., Lab. Anim. Sci. 34: 592-597, 1984; Stoddart, C. A. et al., Res. Vet. Sci. 45 : 383-388, 1988; und Pedersen, N. C., Adv. Vet. Sci. Comp. Med. 33 : 413-428, 1989. Dieses Phänomen spiegelt offenbar eine Steigerung der Infektion durch das Immunsystem wider, vermittelt durch in Response auf den Virus produzierte Immunglobuline, insbesondere durch jene Antikörper, welche gegen das S-Protein gerichtet sind. Olsen C. W. et al.., J. Virol. 4: 175-189, 1981. Daher wäre der beste Kandidat-Impfstoff zur Prophylaxe dieser Krankheit ein Präparat, welches starke Zellenvermittelte Immunität in Abwesenheit von verstärkenden Antikörpern herbeiführt. Dies könnte mit einem Impfstoff erreicht werden, dem das äußere Envelope-Protein fehlt, aber welcher die anderen Strukturproteine von FIPV (N und E1) enthält. Vorherige Versuche, Katzen mit einem rekombinierten Kuhpockenvirus zu impfen, welcher die N- oder E1-Proteine von FIPV exprimiert, haben jedoch dabei versagt, starke schützende Immunität herbeizuführen. Venema et al., Virology 181: 327-335, 1991 und Dale et al., Europäische Patentanmeldung 0376744. Siehe ebenfalls Venema, Europäische Patentanmeldung 0411684.
Was in der Technik gebraucht wird, ist daher ein wirksamer Impfstoff gegen FIPV, welcher die N- und E1-Proteine oder Segmente davon als Immunogene nutzt.
WO-93/012894A beschreibt einen Impfstoff, welcher auf einem infektiösen Rekombinant von Waschbären-Pockenvirus basiert, welcher ein exogenes Virusgen trägt, insbesondere ein Gen vom felinen Parovirus. D. L. Lodmell et al., Journal of Virology, 65, 3400-3405, 1991, beschreiben Waschbären-Pockenviren-Rekombinante, welche Virus-Nucleoprotein exprimieren. Sie schützen Mäuse vor Tollwut-Virusinfektion.
EP-0386946A offenbart Impfstoffe, welche wesentliche Zellenvermittelte Immunität gegen einen Virus vorsehen, ohne wesentliche humorale Immunität gegen den Virus vorzusehen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herbeiführung von schützender Immunität gegenüber FIPV in Katzen. Ein Ziel der Erfindung ist es, rekombinierte Wäschbären-Pockenviren vorzusehen, welche die Gene für die FIPV N-oder M/E1-Proteine (RRPV-N bzw. RRPV-E1) enthalten.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, einen felinen Impfstoff vorzusehen, welcher RRPV-N oder RRPV-E1, entweder einzeln oder in Kombination umfasst, oder in Kombination mit anderen Viren, Bakterien oder Pilzen, welche inaktiviert oder abgeschwächt worden sind. Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Verhindern von durch FIPV verursachte Krankheit vorzusehen, und zwar durch Verabreichen eines Impfstoffs, welcher RRPV-N, RRPV-E1 oder Kombinationen davon umfasst, an eine Katze, welche solch eine Behandlung benötigt.
Diese und weitere Ziele und Vorteile, welche aus dieser Beschreibung offensichtlich sein werden, werden durch die unten beschriebene Erfindung erreicht.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht die Nucleotid- und Aminosäureseguenz des FIPV-E1-Proteins und des FIPV N-Proteins (Fig. 1A bzw. 1B).
Fig. 2 veranschaulicht das Plasmid, welches verwendet wurde, um die Gene zu klonen, welche für die FIPV E1- und N-Proteine kodieren.
Fig. 3 zeigt schematisch die pSC11-Transferplasmide, welche verwendet wurden, um RRPVs zu erzeugen, welche für die FIPV-E1- und N-Proteine kodieren (Fig. 3B bzw. 3C).
Fig. 4 veranschaulicht die Nucleotidsequenz von pSC11 FIPV E1 und pSC11 FIPV N (Fig. 4A bzw. 4B).
Fig. 5 ist ein Photogramm eines Ethidium-Bromid-befleckten Agarose-Gels, welches die Analyse von RRPV-FIPV N und RRPV-FIPV E2 durch Polymerasekettenreaktion zeigt.
Fig. 6 ist ein Immunoblot, welches den Nachweis von FIPV N- und E1-Proteinen in virusinfizierten Zelllysaten veranschaulicht.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann durch Erzeugen von rekombinierten Waschbären-Pockenviren (RRPVs) hergestellt- werden, welche die Gene enthalten, die für die N- oder E1-Proteine von FIPV kodieren oder immungenetische Fragmente davon. Diese Gene werden zuerst in ein Transferplasmid insertiert, welches dann in passende Wirtszellen eingeführt wird, welche vorher mit einem Waschbären-Pockenvirus infiziert worden sind. Als Ergebnis wird die DNA von dem Transferplasmid in die Pockenvirus-DNA durch homologe Rekombination eingeschlossen, was RRPVs erzeugt, die von den Zellen freigegeben werden.
DNA, welche für die FIPV N- oder E1-Proteine kodiert, wird in das Transferplasmid gleich unterhalb eines Pockenvirus-Promotors insertiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der frühe/späte 7,5 Kd Proteinpromotor von Kuhpockenvirus verwendet; jedoch können alternierende Promotorelemente, die in Pockenviren funktionell sind, ebenfalls verwendet werden.
Das bevorzugte Transferplasmid enthält ebenfalls ein beta- Galactosidase-Markierungsgen, welches Selektion und Nachweis der Plasmid DNA-Sequenzen in rekombinierten Viren erlaubt. Es wird einem Fachmann offensichtlich sein, dass alternative selektierfähige Markierungsgene, wie das Neomycin-Resistenzgen oder das E. coli gpt Gen oder andere verwendet werden können, um die Erfindung zu praktizieren. Das fremde Gen, welches von Interesse ist, und das selektierfähige Markierungsgen flankierend, sind Thymidinkinase DNA-Sequenzen, welche rekombinatorische Integration der Plasmid DNA-Sequenzen in die Waschbären-Pockenvirus DNA erleichtern.
Rekombinierte Viren, welche die FIPV N- oder E1-Gene exprimieren, werden durch zuerst Infizieren einer anfälligen Zelllinie wie Vero (ATCC CCL 81), BSC-1 (ATCC CCL 26), RAT-2 (ATCC CRL 1764) oder CRFK (ATCC CCL 941) mit wildartigem Waschbären-Pockenvirus (ATCC VR-838 oder ähnliche Isolate, wie zum Beispiel RCNV71-I-85A) hergestellt. Transferplasmid DNA, welches das E1- oder N-Gen enthält, wird dann unter Verwendung einer kationischen Liposom-vermittelten Transfektion oder anderen geeigneten Techniken, wie Elektroporation oder Calciumphosphat-Ausfällung in die infizierten Zellen transfektiert. Virusreplikation darf sich fortsetzen, bis cytopathische Wirkungen in allen Zellen bemerkt werden.
Einschluss der FIPV E1- oder N-Gene in Pockenvirus-DNA wird durch Zerreißung des viralen Thymidinkinasegens begleitet. Daher können Viren, welche von dieser Infektion geerntet werden, durch Selektieren hinsichtlich der Abwesenheit eines Thymidinkinasegens isoliert werden; dies wird durch Wachstum auf tk-RAT-2 Zellen (ATCC CRL 1764) in Gegenwart von 5-Bromdeoxyuridin erreicht. Viren, welche ein Gen-Insert aus dem Transferplasmid enthalten, werden durch das Erscheinen einer blauen Plaque-Farbe weiter identifiziert, wenn sie in Gegenwart eines chromogenen Substrats für beta-Galactosidase wie X-Gal wachsen gelassen werden.
Virale Plaques, welche diese Selektions- und Screening-Verfahren überleben, werden mehreren Zyklen der Plaque-Reinigung unterworfen. Nachfolgend wird die Gegenwart der E1- oder N-Gene durch Polymerasekettenreaktionstechnologie bestätigt und die Gegenwart von E1- oder N-Protein wird durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung spezifischer Antikörper bestätigt. Diese Viren werden als RRPV-FIPV E1, bzw. RRPV-FIPV N bezeichnet.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden die für N- und E1 kodierenden Gene in ein einzelnes Transferplasmid insertiert. Einführung dieses Plastaids in vorher mit wildartigen Waschbären-Pockenviren infizierte Zellen ergibt die Herstellung von rekombinierten Viren, welche beide Proteine gleichzeitig exprimieren (RRPV-FIPV E1/N).
In noch einer weiteren Ausführungsform können RRPVs hergestellt werden, welche Segmente der FIPV E- und N-Proteine mit weniger als der vollen Länge exprimieren. Diese Techniken, welche verwendet werden, um Transferplasmide zu konstruieren, welche für Teilsequenzen von E1 und N kodieren, sind gut bekannt und werden in der Technik weitverbreitet verwendet, wie die Verfahren zur Herstellung und zum Screening von RRPVs, wie in dieser Beschreibung detailliert beschrieben. Zum Beispiel wird Einführung von Oligonucleotiden, welche ein Stop-Codon enthalten, an verschiedenen Punkten entlang der E1- oder N-DNA einen gebündelten Satz an Carboxy-endständig abgebrochenen Versionen dieses Gens erzeugen, welche dann in RRPVs eingeschlossen werden können. Es wird den gewöhnlichen Fachleuten offensichtlich sein, dass systematisches Screening solcher rekombinierten RRPVs begründen kann, ob das intakte Protein oder Unterfragmente davon beim Praktizieren der vorliegenden Erfindung am meisten bevorzugt werden. Ferner kann, wie oben angeführt, für unterschiedliche Fragmente von E1 und N kodierende DNA in einem Kombinationsimpfstoff nach Einschluss in die gleichen oder unterschiedliche RRPVs verwendet werden.
Zur Impfstoffherstellung werden anfällige Zellen, wie jene, welche oben aufgelistet werden, mit RRPVs bei einer Infektionsmultiplizität (MOl) von 0,1 Infektionseinheiten / Zelle oder weniger infiziert. In dieser Beschreibung ist eine Infektionseinheit definiert als eine Gewebekultur-Infektionsdosis (Tissue Culture Infectious Dose) (TCID&sub5;&sub0;), eine Menge an Virus, welche 50% Infektion unter definierten Bedingungen ergibt. Ein Verfahren zur TCID&sub5;&sub0;-Bestimmung wird in Beispiel 1 unten detailliert beschrieben. Wenn in > 90% der Zellen Cytopathologie bemerkt wird, werden die infizierten Zellen und extrazellulären Flüssigkeiten (welche beide Viren enthalten) als einzelnes Viruszellenlysat geerntet.
Das als Impfstoff zu verwendende, hochkonzentrierte Virus- Ausgangsmaterial kann gefroren (-50ºC oder kälter) oder gefriergetrocknet bis zur Verwendungszeit gelagert werden. Verbindungen wie NZ-Amin, Dextrose, Gelatine oder andere, welche so gestaltet sind, dass sie den Virus während des Gefrierens und Gefriertrocknens stabilisieren, können zugegeben werden. Der anfänglich in dem Viruszellenlysat vorhandene Virus kann unter Verwendung von im Handel erhältlicher Ausrüstung weiter konzentriert werden.
Typischerweise wird die Viruskonzentration in der Impfstoffformulierung ein Minimum von 106,5 TCID&sub5;&sub0; pro Dosis betragen, aber wird sich typischerweise im Bereich von 107,0 bis 109,0. TCID&sub5;&sub0; Pro Dosis befinden. Zur Zeit der Impfung wird der Virus aufgetaut (falls gefroren) oder, falls gefriergetrocknet, mit einem physiologisch annehmbaren Träger wie entionisiertem Wasser, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder Ähnlichem wiederhergestellt.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf native (also replikationsfähige) RRPVs begrenzt. Das Viruszellenlysat kann Behandlungen unterworfen werden, welche üblicherweise in der Technik verwendet werden, um Viren zu inaktivieren. Eine Zusammensetzung, welche inaktivierten Virus und exprimiertes Protein umfasst, wird beim Auslösen schützender Immunität gegenüber FIPV wirksam sein, falls sie eine ausreichende Menge an FIPV-Protein enthält. Diese Impfstoffart würde zusätzliche Sicherstellung vorsehen, dass Empfängerkatzen nicht infektiöser FIPV als Folge von Impfung ausgesetzt werden. Zusätzlich kann ein physiologisch annehmbarer Hilfsstoff dem Virus zugegeben werden, wie EMA 31 (Monsanto Co., St. Louis, MO), NEOCRYL (Polyvinyl Chemical Industries, Wilmington, MA), MVP (Modern Veterinary Products, Omaha, NE), Scjualene, Pluronic L121 oder Ähnliches.
Einzelne Waschbären-Pockenviren, welche die N- oder E1-Gene exprimieren, können zur Impfung zusammengemischt werden. Ferner kann der Virus mit zusätzlichen inaktivierten oder abgeschwächten Viren, Bakterien oder Pilzen wie felinem Leukämie-Virus, felinem Panleukopenie-Virus, felinem Rhinotrachitis-Virus, felinem Calici-Virus, felinem Immunschwäche-Virus, felinem Herpes-Virus, felinem enterischem Coronavirus, felinem Chlamydia psittaci, Microsporum canis oder anderen gemischt werden. Zusätzlich können Antigene aus den oben angeführten Organismen in Kombinationsimpfstoffe eingeschlossen werden, Diese Antigene können aus natürlichen Quellen oder aus Rekombinant-Expressionssystemen gereinigt werden, oder können individuelle Untereinheiten des daraus abgeleiteten Antigens oder synthetischen Peptids umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können lebende oder inaktivierte RRPV-Viruszellenlysate in Liposome eingeschlossen, oder in Peptid-, Protein- oder Polysaccharid-basierte Mikrokapseln vor der Verabreichung unter Verwendung von nach Stand der Technik bekannten Mitteln eingekapselt werden.
Der endgültige Impfstoff wird Katzen in einem Volumen verabreicht, welches von etwa 0,5 bis etwa 5 ml reichen kann. Der Impfstoff kann auf subkutanen, intramuskulären, oralen, intradermalen oder intranasalen Wegen verabreicht werden. Die Anzahl an Injektionen und ihr zeitlicher Abstand kann variiert werden. Ein bis drei Impfungen, verabreicht in Intervallen von ein bis drei Wochen, sind üblicherweise wirksam.
Von den folgenden Beispielen ist beabsichtigt, dass sie die Erfindung weiter veranschaulichen, ohne ihren Umfang zu begrenzen. Die verwendeten Techniken zum Infizieren und Transfektieren von Zellen, Plaque-Reinigen von Virus, Durchführen von Immunoblot-Analyse werden nach Stand der Technik weitverbreitet praktiziert.

Beispiel 1

Erzeugung von rekombinierten Waschbären-Pockenviren, welche FIPV N- und E1-Gene exprimieren

1. Klonen von FIPV N und E1-Genen und Herstellung von Transferplasmiden

Die Sequenzen der E1- und N-Gene, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden in Fig. 1A bzw. 1B der Beschreibung gezeigt. Die Verfahren zum Klonen der N- und E1-Gene von FIPV und ihre Insertion in einen pSC11 Transtervektor werden detailliert in der Europäischen Patentanmeldung 0376744 beschrieben, welche durch Verweis eingeschlossen wird. Das Plasmid, welches verwendet wird, um die cDNA für die E1- und N-Gene zu klonen, wird in Fig. 2 gezeigt. Die pSC11-Plasmide, welche die E1- und N-Gene tragen, werden in Fig. 3B bzw. 3C gezeigt. Die Sequenzen dieser Plasmide werden in Fig. 4A bzw. 4B gezeigt.
Um ein pSC11-Transferplasmid zu konstruieren, welches beide N- und E1-Gene enthält, wurde ein 1,0 kb DNA-Fragment, welches den Kuhpocken 7,5-Promotor und das E1-Gen enthält, unterhalb dem N-Gen in pSC11-FLPV N insertiert. Das sich ergebende Plasmid wurde als pSC11-FIPV N/E1 bezeichnet.

2 Herstellung von rekombinierten Waschbären-Pockenviren (RRPVs)

Monoschichten von Vero-Zellen (ATCC CCL 81), die 80% konfluent waren (etwa 5 · 10&sup6; Zellen/100 mm Gewebekultur-Schale), wurden für 30-60 Minuten bei 37ºC mit wildartigen Waschbären-Pockenviren (ATCC VR-838) bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,1 TCID5o/Zelle infiziert. Das Medium (2ml) bestand aus Eagle's Minimum Essential Medium ("MEM", Gibco BRL # 410-1500), welches 0,05% Lactalbuminhydrolysat und 15 ug/ml Gentamicinsulfat enthielt und mit Natriumbicarbonat an pH 7,2 angepasst war. Nach der Infektion wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden mit dem pSC11-FIPV N, pSC11-FIPV E1 oder pSC11 N/E1 Transferplasmid durch kationische Liposomen-vermittelte Transfektion unter Verwendung von Transfectam@ (Promega Corparation, Madison, WI) bzw. DOTAP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) nach den Anleitungen des Herstellers transfektiert. Die Zellen wurden mit dem DNA- Liposomengemisch in 3 ml MEM, welches 5% fötales Rinderserum (FBS) enthielt, über Nacht bei 37ºC (5% CO&sub2;) inkubiert, wonach das Medium durch 8 ml frisches MEM-5% FBS ersetzt wurde. Die transfektierten Zellen wurden bei 37ºC (5% CO&sub2;) inkubiert, bis mehr als 80% cytopathische Wirkungen (CPE) zeigten, was etwa 3-4 Tage dauerte. Die Viruszellenlysate wurden dann aus den Schalen entfernt und vor Lagerung bei -70ºC zwei Frost/Tau-Wechseln unterworfen.

3. Isolierung von rekombiniertem Waschbären-Pockenvirus, welcher das FIPV N-Gen trägt

RRPVs, welche das FIPV N-Gen tragen (RRPV-FIPV N) wurden isoliert und von der pSC&sub1;&sub1;-FIPV N-Vero-ZeTIen-Transfektion durch Virusplaque-Standardreinigungsverfahren gereinigt. Monoschichten von Vero-Zellen (50-80% konfluent) wurden mit 2 ml von zehnfachen seriellen Verdünnungen (10&supmin;¹ bis 10&supmin;³) der Viruszellenlysate für 1 Stunde bei 37ºC infiziert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die infizierten Zellen wurden mit 8-10 ml von 1,25% Edel-Agar überschichtet, welches MEMIS% FBS enthielt. Die infizierten Zellen wurden dann für 3-4 Tage bei 37ºC (5% CO&sub2;) inkubiert und wiederum mit 4 ml von 1,25% Edel-Agar überschichtet, welches 0,5X PBS und 600 ug/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal, States Biochemical Cleveland, Ohio) enthielt. Die Schälen wurden bei 37ºC (5% CO&sub2;) für 4-16 Stunden inkubiert, bis blaue (also β-Galactosidase positive) Virusplaques beobachtet wurden. Die rekombinierten Virusplaques wurden mit sterilen, stumpfen Nadeln aufgenommen, welche an einer 1 cc Spritze befestigt waren, in 0,5 ml von 0,25 ug/ml Trypsin suspendiert, kräftig gewirbelt und bei 37ºC für 15-30 Min. inkubiert. Die zerrissenen Virusplaques wurden dann auf 5 · 10&sup5; Vero-Zellen in 25 cm² Kolben inokuliert und bei 37ºC (5% CO&sub2;) inkubiert, bis mehr als 80% CPE beobachtet wurde. Die Viruszellenlysate, welche RRPV-FIPV N enthielten, wurden zwei Frost/Tau-Wechseln unterworfen und bei -70ºC gelagert. Sechs einzelne RRPV-FIPV N Klone wurden ausgewählt und fünf mal wie oben beschrieben Plaque-gereinigt.

4. Isolierung von rekombiniertem Waschbären-Pockenvirus, welches das FIPV E1-Gen enthält

RRPVs, welche das FIPV E1-Gen tragen ((RRPV-FIPV E1) wurden isoliert und von pSC11-FIPV E1-transfektierten Vero-Zellen unter Verwendung der für RRPV-FIPV N beschriebenen Verfahren mit einigen Modifikationen gereinigt. In diesem Fall wurden (tk-)RRPVs aus den anfänglichen Viruszellenlysaten, welchen es an Thymidinkinase mangelte, an tk-RAT-2 Zellen (ATCC CRL 1764) selektiert. Dieses wurde durch Inokulieren von 1 ml des anfänglichen Viruszellenlysats auf eine Monoschicht von RAT-2 Zellen in einem 75 cm² Kolben (etwa 5 · 10&sup6; Zellen) in Gegenwart von 5-Bromdeoxyuridin (BrdU) bei 30 ug/ml in MEM durchgeführt. Die infizierte Monoschicht wurde bei 37ºC (5% CO&sub2;) für 3-4 Tage inkubiert, bis mehr als 70% CPE beobachtet wurde. Die tk-Viruszellenlysate wurden vor Lagerung bei -70ºC zwei Frost/Tau-Wechseln unterworfen. Die einzelnen RRPV-FIPV E1 Klone wurden selektiert und sechs Zyklen der Plaquereinigung unterworfen, wie oben für RRPV-FIPV N beschrieben.

5. Betätigung von FIPV N- und E1-G nen in RRPV durch Polymerasekettenreaktion

Die Gegenwart der FIPV N- und E2-Genen in den RRPVs wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) bestätigt. 90 ul eines Viruszellenlysats wurden mit 10 gl zehnfach konzentriertem PCR-Lysepuffer (100 mM Tris-HCL Puffer, pH 8,5; 500 mM KCl; 25 m14 MgCl&sub2;; 5% Tween 20; 3 mg/ml Proteinase K) für 16 Stunden bei 50ºC inkubiert, dann für 10 Min. gesiedet. 10 ul dieses Lysats wurden in der PCR verwendet. Die PCR wurde in 100 ul von 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3; 50 mM KCl; 200 uM jedes Deoxyribonucleotid-triphosphats, 1,5 mM MgCl&sub2;; 30 p-Mol jedes Oligonucleotid-Primers; und 2,5 Einheiten AmpliTaq@ DNA Polymerase (Perkin- Elmer Cetus, Norwalk, CT) durchgeführt. Die in der PCR für FIPV N verwendeten Primer waren:
(1) 5'-CTCGTGGTCGGAAGAATAATGATA-3'
(2) 5'-AGCACCATAGAAAGTTGTCACATC-3',
welche den Nucleotiden 68-91 und 721-744 des FIPV N offenen Leserahmens entsprechen (Primer 1 bzw. 2). Die in der PCR für FIPV E1 verwendeten Primer waren:
(3) 5'-TATGTAATGTTCGGCTTTAGTG-3'
(4) 5'-GTGCTTCTGTTGAGTAATCACC-3',
welche den Nucleotiden 334-335 und 721-742 des FIPV E1 offenen Leserahmens entsprechen (Primer 3 bzw. 4). Die PCR-Amplifikationen wurden in einem DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus) durch zuerst Erhitzen des Umsetzungsgemisches auf 94ºC für Denaturierung und dann Durchführen von 35 Amplifikationszyklen durchgeführt, von welchen jeder aus 1 Min. bei 95ºC, 1 Min. bei 55ºC, 2 Min. bei 72ºC und am letzten Zyklus, einer Endinkubation von 8 Min. bei 72ºC bestand. 10 gl des PCR-Produkts wurden durch Elektrophorese in einem horizontal-submarinen 4% NuSieve Agarosegel (FMC BioProducts, Rockland, ME) in TAE Puffer (40 mM Tris-Base, 20 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, pH 7,2) durch Anwenden von 5 V/cm für 1-2 Stunden gelöst. Die DNA-Produkte wurden durch Beflecken des Gels mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
PCR-Amplifikationen mit den FIPV N und E1-Primern ergab DNA- Fragmente aus 676 bzw. 408 Nucleotiden (Fig. 5). PCR-Amplifikationen unter Verwendung der pSC11 FIPV N- und E1 -Transferplasmide dienten als positive Kontrolle und zeigten Produkte der vorhergesagten Größe. PCR-Amplifikationen unter Verwendung von wildartigen Waschbären-Pockenvirus-Vero-Zellenlysaten dienten als negative Kontrolle und in jenen Proben wurden keine PCR-Produkte beobachtet.

6. Bestätigung von RRPV FIPV N- und E1-Protein Expression durch Immunoblot-Analyse

Konfluente Monoschichten von Vero-Zellen in einem 25 cm² Kolben (1-2 · 10&sup6; Zellen) wurden mit Klonen von entweder RRPV- FIPV N oder RRPV-FIPV E1 bei einer MOl von 0,1 infiziert. Die infizierten Zellen wurden bei 37ºC (5% 002) für 2-3 Tage inkubiert, bis etwa 80% der Zellen cytopathische Wirkungen zeigten. Ein Viruszellenlysat wurde hergestellt und 20 ul der Probe wurden zu 5 ul von 5X Laemmli-Probenpuffer (0,3 M Tris-HCl-Puffer, pH 6,8,- welcher 5% SDS, 50% Glycerol, 0,4% Bromphenol blau und 3% 2-β- Mercaptoethanol enthielt) zugegeben und bei 95ºC für 5 Min. erhitzt. Die denaturierten Proteinproben wurden durch SDS/Polyacrylamid-Elektrophorese unter Verwendung eines 4-15% Gradient- Polyacrylamidgels getrennt, wie vorhergehend beschrieben. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Press. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrocellulose (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) durch Elektrotransfer unter Verwendung eines Bio-Rad-Transferapparats nach Anweisung des Herstellers transferiert. Der Transfer wurde in 25 mM Tris-HCl-Puffer, welcher 0,2 M Glycin und 20% Methanol enthielt, für 45 Minuten bei 50 V mit konstantem Strom durchgeführt.
FIPV N- und E1-Proteine wurden an dem Nitrocellulosefilter unter Verwendung spezifischer Antikörper sichtbar gemacht. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986, Elsevier Science Publishing Company, New York, NY. Der Filter wurde in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 gespült, welche 0,1% Tween-20 enthielt("PBS-TW"), wonach nicht-spezifische Stellen durch Inkubation über Nacht bei 4ºC in PBS blockiert wurden, welches 1% Rinderserum Albumin enthielt (PBS-BSA), gefolgt von einer 15 Min. Wäsche in PBS-TW. Der Filter wurde dann für 30 Min. bei Raumtemperatur mit Anti-FIPV-Antikörpern inkubiert, welche aus Aszites-Flüssigkeit von einer FIPV (Stamm 79-1146)-infizierten Katze, verdünnt 1 : 100 in PBS-TW, enthaltend 1% BSA ("PBS-TW-BSA") bestanden. Nach vier 5-minütigen Wäschen in PBS-TW wurde der Filter für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, mit einem sekundären Antikörper, bestehend aus Biotin-markiertem Maus-anti-Katze IgG Antikörper (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD), der 1 : 2000 in PBS-TW-BSA verdünnt worden war, gefolgt von vier 5-minütigen Wäschen in PBS-TW. Der Filter wurde dann für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertem Streptavidin inkubiert (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.), der 1 : 1000 in PBS-TW verdünnt worden war. Nachdem der Filter vier Mal (jeweils 5 Min.) in PBS-TW gewaschen worden war, wurden die Antigen-Antikörper-Komplexe mit Peroxidase-chromogenem Substrat sichtbar gemacht (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.). Sucrose-Gradient gereinigtes FIPV und wildartige Waschbären-Pockenvirus-Vero-Zellenlysate wurden als positive, bzw. negative Kontrollen verwendet. Ein typisches Immunoblot wird in Fig. 6 gezeigt.

7. Waschbären-Pockenvirus-Titration

Es werden serielle, zehnfache Verdünnungen an Virus in MEM hergestellt und in Replikaten von fünf auf Vero-Zellen (1 · 10&sup4; Zellen pro Mulde) in einer 96-Mulden-Schale inokuliert. Viruspräparate können durch Verdünnung in ein gleiches Volumen von 0,5% Trypsin und Inkubation bei 37ºC für 30 Min. vorbehandelt werden, um Virus aus Inklusionen freizusetzen. Die Schalen werden für 3-5 Tage bei 37ºC (5% CO&sub2;) inkubiert und bezüglich Cytopathologie beobachtet, welche für Waschbären-Pockenvirus typisch ist. Titer werden als 50% Endpunkte, basierend auf der Cytopathologie unter Verwendung der Verfahren von Reed und Muench, The American Journal of Hygiene 27(3): 493-497) (1938) berechnet.

Beispiel 2

Herstellung von Impfstoff und Wirksamkeitstests in Katzen

1. Herstellung von Masterseeds von RRPV-FIPV N- und E1-Viren

Ein einzelner Klon von jedem rekombinierten Virus wurde für Expansion im großen Maßstab ausgewählt, um als Masterseed-Virus zu dienen. Die Selektionskriterien waren: 1) Demonstration von Reinheit. Polymerasekettenreaktion wurde genutzt, um szcherzustellen, dass der Klon nicht mit wildartigem Virus verunreinigt war. 2) Demonstration von angemessener rekombinierter Proteinexpression durch Western-Blot oder andere Antigen-Nachweisverfahren.
Alle Rekombinant-Virusexpansionen und Titrationen wurden auf Vero-Zellen in MEM durchgeführt, welches 2,5% FBS enthielt. Jeder Plaque-gereinigte Virusklon wurde durch Inokulieren einer konfluenten Monoschicht von Vero-Zellen in einem 150 cm² Kolben (1 · 10&sup7; Zellen) mit 1 ml Viruszellenlysat (etwa 10&sup7; infektiöse Viruspartikel) und Inkubieren bei 37ºC (5% CO&sub2;), bis 100% cytopathische Wirkung beobachtet wurde (2-3 Tage) expandiert. Dieses Viruszellenlysat wurde auf Vero-Zellen titriert, wie in Beispiel 1 beschrieben, und diente als Premasterseed-Virus-Ausgangsmaterial, um den Masterseed-Virus zu erhalten. Die zu verwendende MOI, um den höchsten Titer-Masterseed-Virus herzustellen, wurde durch Inokulieren einer konfluenten Monoschicht aus Vero-Zellen in einer Rollflasche (1 · 10&sup8; Zellen) mit verschiedenen MOIs von rekombiniertem Virus bestimmt (z. B. 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 und 0,001 TCID&sub5;&sub0;/Zelle). Die infizierten Zellen wurden bei 37ºC inkubiert, bis mehr als 80% CPE beobachtet wurden (etwa 3 Tage), und die Titer jeder infizierten Rollflasche wurden bestimmt. Die Masterseed-Viren wurden in 1,5 ml Ampullen aliquotiert, welche versiegelt und in einem Flüssigstickstoffgefrierer gelagert wurden.

2. Herstellung von Impfstoffen

3 · 17&sup7; Vero-Zellen wurden in 850 cm² Rollflaschen in 200 ml Wachstumsmedium (MEM, welches 0,5% Lactalbumin-hydrolysat und 5% FBS enthält) gesät und für 18 Stunden bei 37ºC inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium von den Zellen entfernt und mit 50 ml RRPV-FIPV N-Virus, verdünnt zu einer MOI von 0,01 in infektiösem Medium (MEM, welches 0,5% Lactalbumin-hydrolysat und 2,5% FBS enthält) ersetzt. Der verwendete Virus war die zweite Passage nach dem Masterseed-Präparat. Der Virus durfte sich für 30 Min. bei 37ºC an die Zellen ansaugen, wonach das Volumen an Medium auf 150 ml pro Rollflasche angepasst wurde. Die Rollflaschen wurden bei 37ºC inkubiert, bis 100% Cytopathologie offensichtlich war (3 Tage). Das Viruszellenlysat wurde geerntet und gefroren (-70ºC) gelagert. Der Virustiter wurde mit 106,97 TCID&sub5;&sub0;/ml bestimmt.
RRPV-FIPV E1-Ausgangsmaterial wurde auf gleiche Weise hergestellt, außer dass eine MOI von 0,1 verwendet wurde. Das endgültige Viruspräparat wurde titriert und es wurde befunden, das es 106,5 TCID&sub5;&sub0;/ml enthält. Wildartiger Waschbären-Pockenvirus wurde unter Verwendung der gleichen Verfahren wie oben beschrieben wachsen gelassen und enthielt 10644 TCID&sub5;&sub0;/ml.

3. Impfung

Eine Gruppe von vierundzwanzig 9 Monate alten Katzen (spezifisch Pathogen-frei, Harlan Sprague Dawley, Madison, WI), welche sieben männliche und siebzehn weibliche Tiere umfasste, wurde verwendet, um die Wirksamkeit des RRPV-FIPV N-Impfstoffs zu demonstrieren. Die Katzen wurden in fünf Gruppen eingeteilt und zweimal in einem Abstand von 21 Tagen geimpft, wie unten angezeigt:
*SC = Subkutan
IM = Intramuskulär
Oral = Oral

4. Challenge

Zwei Wochen nach der zweiten Impfung wurden die Katzen oral mit 103,4 TCIDso von felinem enterischen Coronavirus (Stamm 79- 1683, ATCC VR-989) inokuliert. Dieser Virus erzeugte eine subklinische Infektion, welche nachfolgende FIPV-Infektion verstärken kann. Drei Wochen später wurden die Katzen oral mit 103,4 TCIDso von FIPV (Stamm 79-1146, ATCC VR-990) ge-challenged. Die Katzen wurden wöchentlich für insgesamt 64 Tage nach dem Challenge bezüglich Zeichen von klinischer Krankheit überwacht, einschließlich: Fieber, Ikterus, Leukopenie, Anämie, Gewichtsverlust, Anorexie, Depression, Dehydrierung und peritonealer Schwellung. Katzen, welche als sterbend erachtet wurden, wurden durch den behandelnden Veterinär euthanasiert und pathologische Untersuchung post mortem wurde durchgeführt. Klinische Krankheitszeichen wurden wie folgt bewertet:
* Für Katzen mit Bezugslinientemperaturen von durchschnittlich 39,4ºC (103ºF) werden keine Punkte vergeben, bis die Temperaturen 0,55ºC (1ºF) über der Bezugslinie sind.

5. Bewertung von herbeigeführter Immunität gegenüber FIPV

Inokulierung mit virulenten FIPV führte eine tödliche Infektion in 4/5 (80%) der Kontrollkatzen herbei, welche mit wildartigem Waschbären-Pockenvirus geimpft wurden (Tabelle 1). Sowohl die effusiven, als auch die nicht effusiven Formen dieser Krankheit wurden in den Kontrollkatzen bemerkt. Andererseits war klinische Krankheit nach Challenge der subkutanen Impfstoffe im Wesentlichen abwesend. Das sporadische Fieber in diesen Katzen konnte der Aufgeregtheit zugeschrieben werden und die leichte Anämie an einem Tag in Katze 1264 ist kein signifikanter Befund. Die subkutanen Impfstoffe zeigten eine statistisch signifikante Verringerung der klinischen Anzeichen (p< 0,05 durch ANOVA) und Tod (p> 0,01 durch Chi Square Analysis) im Vergleich mit den Kontrollkatzen.
Der intramuskuläre Impfungsweg war weniger wirksam, da 2/5 (40%) der Katzen durch FIPV herbeigeführter Krankheit unterlagen. Jedoch wurde der Beginn der Krankheit in diesen Katzen im Vergleich mit den Kontrollen verzögert. Die verringerte Wirksamkeit kann auf den niedrigeren Virustiter, welcher in diese Katzen inokuliert wurde, bezogen werden, weil nur eine 1 ml Dosis durch diesen Weg verabreicht werden konnte. Es gab ebenfalls verringerte Wirksamkeit wenn die Katzen durch den oralen Weg inokuliert wurden (60% Sterblichkeit), was einen Bedarf an höheren Virusdosen anzeigen kann, wenn durch diesen Weg geimpft wird.
Der gegen FIPV verursachte Krankheit verliehene Schutz durch den subkutan verabreichten Impfstoff zeigte sich Dosis-abhängig und bestätigte den Nutzen eines Hochtiter RRPV-FIPV-Impfstoffs beim Herbeiführen von Schutz gegen durch FIPV-Virus herbeigeführte klinische Krankheit. Eine geeignete Impfstoffdosis enthält virales Antigen im Bereich von 10&sup4;-10&sup8; TCID&sub5;&sub0;/ml, vorzugsweise 10&sup7;- .10&sup8; TCID&sub5;&sub0;/ml. Eine typische Dosis zur Verabreichung an Katzen ist 1-3 ml und die Überbringung durch den subkutanen Weg wird bevorzugt. Tabelle 1: Gesamt-klinische Beurteilung nach Challenge mit FIPV

SEQUENZPROTOKOLL

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder: Wasmoen, Terri Chavez, Lloyd Chu, Hsien-Jue
(ii) Titel der Erfindung: Rekombinierte Waschbären- Pockenviren und ihre Verwendung als wirksamer Impfstoff gegen infektiöse Peritonitis Viruskrankheit
(iii) Anzahl an Sequenzen: 4
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adresse: Darby & Darby PC
(B) Straße: 805 Third Avenue
(C) Stadt: New York
(E) Land: US
(F) ZIP: 10022
(v) Computerlesbar von:
(A) Medium Art: Floppy Disk
(B) Computer: IBM PC compatible
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS r
(D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) Laufende Anmeldedaten:
(A) Anmeldenummer: US 08/125516
(B) Einreichungsdatum: 22. Sept. 1993
(C) Klassifizierung:
(viii) Information über Anwalt/Agent:
(A) Name: Schaffer, Robert
(B) Registrierungsnummer: 31194
(C) Referenz/Beglaubigungsnummer: 9632/08669
(ix) Telekommunikationsinformationen:
(A) Telefon: 212-527-7700
(B) Telefax: 212-753-6237
(C) Telex: 236687
2) Informationen für SEQ ID Nr. 1:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 789 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: doppelt
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: cDNA
(vi) Originalquelle:
(A) Organismus: Feliner infektiöser Peritonitis Virus
(vii) Unmittelbare Quelle:
(B) Klon: FIPV E1 (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 1:
2) Informationen für SEQ ID Nr. 2:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 1134 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: doppelt
(D) Topologie: linear
(ii) Art des Moleküls: cDNA
(vi) Originalquelle:
(A) Organismus: Feliner infektiöser Peritonitis Virus
(vii) Unmittelbare Quelle:
(B) Klon: FIPV N (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 2:
2) Informationen für SEQ ID Nr. 3:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 8710 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: doppelt
(D) Topologie: zirkulär
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(vi) Originalquelle:
(A) Organismus: Feliner infektiöser Peritonitis Virus (vii) Unmittelbare Quelle:
(B) Klon: psc11f1 (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 3:
(2) Informationen für SEQ ID Nr. 4:
(i) Sequenzkennzeichen:
(A) Länge: 9019 Basenpaare
(B) Art: Nucleinsäure
(C) Strängigkeit: doppelt
(D) Topologie: zirkulär
(ii) Art des Moleküls: DNA (genomisch)
(vi) Originalquelle:
(A) Organismus: Feliner Immunschwächevirus
(vii) Unmittelbare Quelle:
(B) Klon: psc11e1 (xi) Sequenzbeschreibung SEQ ID Nr. 4:

Claims

Rekombiniertes Waschbären-Pockenvirus mit mindestens einem inneren Gen, welches eine DNA-Sequenz umfasst, welche für ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nucleocapsid- (N) und Transmembran- (M/E1) Proteinen von felinem infektiösem Peritonitis (Feline Infectious Peritonitis) Virus (FIPV) kodiert.
2. Rekombiniertes Waschbären-Pockenvirus nach Anspruch 1, worin besagtes inneres Gen für das N-Protein von FIPV mit der Aminosäurensequenz gemäss SEQ ID-Nr.: 2 kodiert.
3. Rekombiniertes Waschbären-Pockenvirus nach Anspruch 1, worin besagtes inneres Gen für das M/E1-Protein von FTPV mit der Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID-Nr.: 1 kodiert.
4. Rekombiniertes Waschbären-Pockenvirus nach Anspruch 1, worin besagtes Virus Gene hat, welche für die E1- und N-Proteine von FIPV kodieren.
5. Impfstoff, umfassend:

eine rekombiniertes Waschbären-Pockenvirus mit mindestens einem inneren Gen, welches eine DNA-Sequenz umfasst, welche für ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nucleocapsid- (N) und Transmembran- (M/E2) Proteinen von felinem infektiösem Peritonitis Virus (FIPV) kodiert,

einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel und

einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff.
6. Impfstoff nach Anspruch 5, worin besagtes inneres Gen für das N-Protein von FIPV mit der Aminosäurensequenz gemäss SEQ ID- Nr.: 2 kodiert.
7. Impfstoff nach Anspruch 5, worin besagtes inneres Gen für das M/E1-Protein von FIPV mit der Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID-Nr.: 1 kodiert.
8. Impfstoff nach Anspruch 5, worin besagtes Virus Gene hat, welche für die E1- und N-Proteine von FIPV kodieren.
9. Impfstoff nach Anspruch 5, welcher ferner inaktivierte oder abgeschwächte Viren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus felinem Leukämie-Virus, felinem Panleukopenie-Virus, felinem Rhinotrachitis-Virus, felinem Calici-Virus, felinem Immunschwäche-Virus, felinem Herpes-Virus, felinem enterischem Coronavirus oder Gemische daraus umfasst.
10. Impfstoff nach Anspruch 5, welcher ferner inaktiviertes oder abgeschwächtes felines Chlamydia psittaci, Microsporum canis oder Gemische daraus umfasst.
11. Impfstoff, umfassend:

ein erstes rekombiniertes Waschbären-Pockenvirus mit mindestens einem inneren Gen, welches eine DNA-Sequenz umfasst, welche für ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nucleocapsid- (N) und Transmembran- (M/E1) Proteinen von felinem infektiösem Peritonitis Virus (FIPV) kodiert,

ein zweites rekombiniertes Waschbären-Pockenvirus mit mindestens einem inneren Gen, welches eine DNA-Sequenz umfasst, welche für ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nucleocapsid- (N) und Transmembran- (M/E1) Proteinen von felinem infektiösem Peritonitis Virus (FIPV) kodiert,

einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel und

einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff.
12. Verwendung eines rekombinierten Waschbären-Pockenvirus mit mindestens einem inneren Gen, welches eine DNA-Sequenz umfasst, welche für ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Nucleocapsid- (N) und Transmembran- (M/E1) Proteinen von felinem infektiösem Peritonitis Virus (FIPV) kodiert, um einen Impfstoff zur Verabreichung an eine Katze herzustellen, um Krankheit zu verhindern, welche durch FIPV verursacht wird.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei besagtes inneres Gen für das N-Protein von FIPV mit der Aminosäurensequenz gemäss SEQ ID- Nr.: 2 kodiert.
14. Verwendung nach Anspruch 12, wobei besagtes inneres Gen für das M/E1-Protein von FIPV mit der Aminosäuresequenz gemäss SEQ ID-Nr.: 1 kodiert.
15. Verwendung nach Anspruch 12, wobei besagter Virus Gene hat, welche für die E1- und N-Proteine von FIPV kodieren.