DE69631246T2 - Rekombinante pockenviren des waschbaers sowie ihre verwendung als ein effektiver impfstoff gegen eine infektion mit immunschwaecheviren der katze - Google Patents

Rekombinante pockenviren des waschbaers sowie ihre verwendung als ein effektiver impfstoff gegen eine infektion mit immunschwaecheviren der katze Download PDF

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Description

  • Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Vorbeugung vor Krankheit, welche durch felines Immunschwächevirus (FIV) verursacht wird, unter Verwendung von rekombinanten Waschbär-Pockenviren (RRPVs), welche das Hüllenprotein von FIV exprimieren, als Vakzine.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Feline Immunschwächevirus (FIV)-Infektion ist ein signifikantes Gesundheitsproblem für Hauskatzen überall auf der Welt. Wie beim humanen Gegenstück verursacht Infektion mit FIV eine fortschreitende Zerschlagung von Immunfunktion. In der akuten Infektionsphase verursacht das Virus vorübergehende Krankheit in Verbindung mit Symptomen wie Lymphadenopathie, Pyrexie und Neutropenie. Nachfolgend tritt ein infiziertes Tier in eine asymptomatische Phase von 1–2 Jahren ein, bevor klinische Anzeichen von Immunschwäche ersichtlich werden, wonach die mittlere Überlebenszeit üblicherweise weniger als ein Jahr beträgt.
  • FIV ist ein typisches Retrovirus, das ein einzelsträngiges polyadenyliertes RNA-Genom, interne Strukturproteine, abgeleitet vom gag-Genprodukt und eine Lipidhülle enthält, welche vom env-Genprodukt abgeleitete Membranproteine enthält (Bendinelli et al., Clin. Microbiol. Rev. 8: 87, 1995). Das gag-Gen wird in ein primäres Produkt von etwa 50 kDa translatiert, das nachfolgend durch eine virale Protease in die Matrix-, Capsid- und Nucleocapsid-Proteine gespalten wird. Das env-Gen erzeugt ein primäres Translationsprodukt von 75–80 kDa (unglycosyliertes Molekulargewicht); in infizierten Zellen hat der Vorläufer ein offensichtliches Molekulargewicht von 145–150 kDa aufgrund N-gebundener Glycosylierung. Der env-Vorläufer wird im Golgi-Apparat in die SU- und TM-Proteine (auch als gp95, bzw. gp40 bezeichnet) gespalten.
  • Die meisten Impfstoffe gegen FIV haben dabei versagt, schützende Immunität herbeizuführen. Unwirksame Impfstoffe haben inaktivierten ganzen Virus, fixierte infizierte Zellen, rekombinante CA- und SU-Proteine und ein synthetisches Peptid einbezogen, welches der V3-Region von SU entspricht. In einigen Fällen verstärkte der Impfstoff tatsächlich die Infektion nach dem Challenge. In einem System ergab Impfung mit Paraformaldehyd-fixiertem Virus oder infizierten Zellen schützende Immunität (Yamamoto et al., J. Virol. 67: 601, 1993), aber die Anwendung dieser Herangehensweise durch andere war nicht erfolgreich (Hosie et al., in Abstracts of the International Symposium on Feline Retrovirus Research, 1993, Seite 50).
  • WO-94/06471 und WO-94/02613 offenbaren Anti-feline Immunschwächevirus (FIV)-Vakzine. WO-92/15684 offenbart rekombinantes FIV-Glycoprotein 160 und p24 GAG Protein. EP-0652287 offenbart Pockenvirus-Vektoren und ihre Verwendung als Vakzin gegen feline infektiöse Peritonitis-Virus-Erkrankung. US-5266313 offenbart Wachbär-Pockenvirus als Genexpression und Impfstoffvektor für Gene von Tollwutvirus und andere Organismen.
  • Somit gibt es einen Bedarf nach Stand der Technik für einen wirksamen Impfstoff gegen FIV, der env-Proteine oder Fragmente davon als Immunogene nutzt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verhinderung oder Abschwächung von Krankheit in Katzen, welche durch felines Immunschwächevirus (FIV) verursacht wird. Verhinderung oder Abschwächung von Krankheit versteht sich so, dass es die Milderung von Symptomen, einschließlich Immunsystem-Zerschlagung meint, die sich aus FIV-Infektion ergeben.
  • Die Erfindung sieht rekombinante Waschbär-Pockenviren mit mindestens einem internen Gen vor, umfassend eine DNA-Sequenz, welche für FIV-Hüllenprotein (env), ein Polypeptid, bestehend aus Aminosäuren 1–735 von FIV-env oder Immunogene Fragmente von einem der Vorhergehenden codiert. Mit immunogenem Fragment ist jeder Teil der Codierungssequenz von FIV-gag oder env Polypeptiden gemeint, der eine zuträgliche Immunresponse in Katzen herbeiführt.
  • Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft daher ein rekombinantes Waschbär-Pockenvirus mit mindestens einem internen Gen, das eine DNA-Sequenz aufweist, die für ein Polypeptid bestehend aus den Aminosäuren 1–735 des Hüllenproteins eines felinen Immunschwächevirus (FIV) codiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform codiert das interne Gen des rekombinanten Waschbär-Pockenvirus für das FIV-Hüllenprotein mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 12 dargestellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform codiert das interne Gen für die Aminosäuren 1–735 des FIV-Hüllenproteins mit der Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr. 12 dargestellt.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung Vakzine, die ein oder mehr der oben beschriebenen FIV-exprimierenden rekombinanten Waschbär-Pockenviren mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel und einem pharmazeutisch akzeptablen Adjuvans umfassen.
  • Weitere Aspekte der Erfindung betreffen eine DNA-Sequenz, welche für Aminosäuren 1–735 eines FIV-Hüllenproteins gemäß SEQ ID Nr. 12 codiert, und ihre Verwendung in der Medizin.
  • In noch einem weiteren Aspekt werden Verfahren zum Verhindern oder Abschwächen von Krankheit, verursacht durch FIV offenbart, welche durch Verabreichen des oben beschriebenen Vakzins an eine Katze durchgeführt werden, welche solch einer Behandlung bedarf. Somit sieht die Erfindung die Verwendung des oben beschriebenen rekombinanten Waschbär-Pockenvirus bei der Herstellung eines Vakzins zur Verhinderung oder Abschwächung von Krankheit vor, die durch FIV verursacht wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine graphische Illustration der Klonierungsstrategie für das Hüllen-Gen von FIV.
  • 2 ist eine Diagrammdarstellung der Struktur des rekombinanten FIV-env-Gens in pSL-EnvABC.
  • 3 zeigt die DNA [SEQ ID Nr. 14] und Proteinsequenz [SEQ ID Nr. 12] des env-Gens von FIV.
  • 4 ist eine graphische Illustration des pSL-WGag-Plasmids.
  • 5 zeigt die DNA [SEQ ID Nr. 13] und Proteinsequenz [SEQ ID Nr. 11] des gag-Gens von FIV.
  • 6 ist eine graphische Illustration der Klonierungsstrategie zur Konstruktion des Waschbär-Pockenvirus Transferplasmids pSC11-FIV gag.
  • 7 ist eine graphische Illustration der Klonierungsstrategie zur Konstruktion des Waschbär-Pockenvirus Transferplasmids pSC11-FIV Env.
  • 8 ist eine graphische Illustration der Klonierungsstrategie zur Konstruktion des Waschbär-Pockenvirus Transferplasmids pSC11-FIV EnvAB.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Das Vakzin der vorliegenden Erfindung kann durch Erzeugen von rekombinanten Waschbär-Pockenviren (RRPVs) hergestellt werden, welche ein Gen enthalten, welches für die gag oder env Proteine von felinem Immunschwächevirus (FIV) oder immunogenen Fragmenten davon codieren. Gag und env Gene, welche beim Praktizieren der vorliegenden Erfindung brauchbar sind, können durch nach Stand der Technik gut bekannte Verfahren erhalten werden. In einer Ausführungsform wird Virus-RNA unter Verwendung von endogener oder exogener Umkehr-Transkriptase umgekehrt transkribiert und die DNA wird unter Verwendung von DNA-Polymerase doppelsträngig gemacht. Die für gag und env codierenden DNA-Segmente werden dann durch Restriktionsenzymverdau gewonnen und durch Klonieren in E. coli amplifiziert. In einer weiteren Ausführungsform dienen FIV-infizierte Katzenzellen als Quelle für FIV provirale DNA. In dieser Ausführungsform wird chromosomale DNA aus den Zellen isoliert und Oligonucleotid-Primer werden verwendet, um die gag und env Gene oder Fragmente davon unter Verwendung von Polymerase-Kettenreaktionstechniken spezifisch zu amplifizieren. Diese Herangehensweise ist auf Reinigen von gag und env Genen von unterschiedlichen FIV-Stämmen oder Isolaten breit anwendbar, da Primer aus nicht-polymorphen Bereichen des FIV-Genoms entworfen werden können.
  • FIV gag und env Gene, isoliert durch die obigen Verfahren, werden zuerst in ein Transferplasmid insertiert und das rekombinante Plasmid wird in passende Wirtszellen eingeführt, die vorher mit einem Waschbär-Pockenvirus infiziert worden sind. Als Ergebnis wird die DNA aus dem Transferplasmid durch homologe Rekombination in die Pockenvirus-DNA eingeschlossen, was die RRPVs erzeugt, die von den Zellen freigesetzt werden.
  • DNA, welche für die FIV gag oder env Proteine oder Fragmente davon codiert, wird in ein Transferplasmid gleich unterhalb eines Pockenvirus-Promotors insertiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der early/late 7,5 kD Proteinpromotor von Kuhpockenvirus verwendet. Jedoch können alternierende Promotorelemente verwendet werden.
  • Das bevorzugte Transferplasmid enthält ebenfalls ein Beta-Galactosidase-Markergen, welches Selektion und Nachweis der Plasmid DNA-Sequenzen in rekombinanten Viren erlaubt. Es wird von den gewöhnlichen Fachleuten verstanden werden, dass alternierende selektierfähige Markergene, wie das Neomycin-Resistenzgen oder das E. coli gpt Gen oder Andere verwendet werden können, um die Erfindung zu praktizieren. Das insertierte FIV-Gen und das selektierfähige Markergen flankierend sind Thymidinkinase DNA-Sequenzen, welche Integration der Plasmid DNA-Sequenzen in die Waschbär-Pockenvirus DNA durch homologe Rekombination erleichtern.
  • Rekombinante Viren, welche die FIV gag oder env Gene exprimieren, werden durch zuerst Infizieren einer anfälligen Zelllinie (wie Vero [ATCC CCL 81], BSC-1 [ATCC CCL 26], RAT-2 [ATCC CRL 1764] oder CRFK [ATCC CCL 94]) mit Wildtyp Waschbär-Pockenvirus (ATCC VR-838 oder ähnlichen Isolaten) hergestellt. Transferplasmid DNA, welches das FIV gag oder env Gen enthält, wird dann unter Verwendung einer kationischen Liposom-vermittelten Transfektion oder anderen geeigneten Techniken, wie Elektroporation oder Calciumphosphat-Ausfällung in die infizierten Zellen transfiziert. Waschbär-Pockenviren schließen DNA aus dem Transferplasmid durch homologe Rekombination mit den Thymidinkinase-Gensequenzen ein, welche an dem Plasmid vorhanden sind. Virusinfektion darf sich fortsetzen, bis cytopathische Wirkungen in allen Zellen bemerkt werden.
  • Einschluss des FIV gag oder env Gens in Pockenvirus-DNA wird durch Zerreißen des viralen Thymidinkinasegens begleitet. Daher kann rekombinantes Virus hinsichtlich der Abwesenheit eines Thymidinkinasegens selektiert werden; dies wird durch selektive Expansion auf RAT-2 Zellen (tk-, ATCC CRL 1764) in Gegenwart von 5-Bromdeoxyuridin erreicht. Viren, welche ein Gen-Insert aus dem Transferplasmid enthalten, werden durch blaue Plaque-Farbe identifiziert, wenn sie in Gegenwart eines chromogenen Substrats für Beta-Galactosidase wie X-gal wachsen gelassen werden.
  • Virale Plaques, welche diese Selektions- und Screening-Verfahren überleben, werden dann mehreren Zyklen der Plaque-Reinigung unterworfen. Nachfolgend wird die Gegenwart der gag oder env Gene durch Polymerasekettenreaktionstechnologie bestätigt und die Gegenwart von gag oder env antigenen Determinanten wird durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung spezifischer Antikörper bestätigt. Diese Viren werden als RRPV-FIV gag, bzw. RRPV-FIV env bezeichnet.
  • Es können RRPVs hergestellt werden, welche Segmente der FIV gag und env Proteine mit weniger als der vollen Länge exprimieren. Die Techniken, welche verwendet werden, um Transferplasmide zu konstruieren, welche für Teilsequenzen von env und gag codieren, sind gut bekannt und werden in der Technik weit verbreitet verwendet, wie die verfahren zur Herstellung und zum Screening von RRPVs, wie in dieser Beschreibung detailliert beschrieben. Zum Beispiel können geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen verwendet werden, um Fragmente von jedem Gen zu erhalten, wie z. B. in Beispiel 1 unten beschrieben. Alternativ wird Einführung von Oligonucleotiden, welche ein Stop-Codon enthalten, an verschiedenen Punkten entlang der gag oder env DNA einen gebündelten Satz an Carboxy-endständig abgebrochenen Versionen dieses Gens erzeugen, welche dann in RRPVs eingeschlossen werden können. Ferner können Sequenzen, welche für unterschiedliche Domänen an jedem Protein codieren, unter Verwendung von Domänen rekombiniert werden, welche von unterschiedlichen FIV-Stämmen oder Isolaten abgeleitet werden. Es wird den gewöhnlichen Fachleuten offensichtlich sein, dass systematisches Screening solcher rekombinanten RRPVs begründen kann, ob das intakte Protein, Unterfragmente davon oder Multistamm-Rekombinanten davon beim Praktizieren der vorliegenden Erfindung am meisten bevorzugt werden. Ferner kann, wie oben angeführt, für unterschiedliche Fragmente von gag und env codierende DNA in einem Kombinations-Vakzin nach Einschluss in die gleichen oder unterschiedliche RRPVs verwendet werden.
  • Zur Vakzinherstellung werden anfällige Zellen in minimalen essentiellen Medien wachsen gelassen, welche fötales Rinderserum oder einen geeigneten Medienersatz enthalten. Die Zellen werden mit rekombinantem Waschbär-Pockenvirus bei einer Multiplizität der Infektion von 0,1 Infektionseinheiten/-Zelle oder weniger infiziert. In dieser Beschreibung ist eine Infektionseinheit definiert als eine Gewebekultur-Infektionsdosis (Tissue Culture Infectious Dose) (TCID50), eine Menge an Virus, welche 50% Infektion unter definierten Bedingungen ergibt. Wenn in >90% der Zellen Cytopathologie bemerkt wird, werden die infizierten Zellen und extrazellulären Flüssigkeiten geerntet. Das Virus kann gefroren (–50°C oder kälter) oder gefriergetrocknet bis zur Verwendungszeit gelagert werden. Verbindungen wie NZ-Amin, Dextrose, Gelatine oder Andere, welche so gestaltet sind, dass sie das Virus während des Gefrierens und Gefriertrocknens stabilisieren, können zugegeben werden. Das Virus kann unter Verwendung von im Handel erhältlicher Ausrüstung weiter konzentriert werden.
  • Typischerweise wird die Viruskonzentration in der Vakzin-Formulierung ein Minimum von 106,5 TCID50 pro Dosis betragen, aber wird sich typischerweise im Bereich von 107,0 bis 109,0 TCID50 pro Dosis befinden. Zur Zeit der Impfung wird das Virus aufgetaut (falls gefroren) oder (falls gefriergetrocknet) mit einem physiologisch annehmbaren Träger wie entionisiertem Wasser, Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder Ähnlichem rekonstituiert.
  • In einer Ausführungsform wird ein physiologisch annehmbares Adjuvans wie zum Beispiel EMA31, Adjuvant A oder Kombinationen daraus zur Vakzin-Formulierung zugegeben. Nicht einschränkende Beispiele für geeignete Adjuvantien schließen Squalan und Squalen (oder andere Öle tierischen Ursprungs); Block-Copolymere wie Pluronic® (L121) Saponin; Detergentien wie Tween®-80; Quil® A, Mineralöle wie Drakeol® oder Marcol®, Pflanzenöle wie Erdnussöl; Corynebacterium-abgeleitete Hilfsstoffe wie Corynebacterium parvum; Propionibacterium-abgeleitete Hilfsstoffe wie Propionibacterium acne; Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette und Guerinn oder BCG); Interleukine wie Interleukin 2 und Interleukin-12; Monokine wie Interleukin 1; Tumornekrosefaktor; Interferone wie gamma-Interferon; Kombinationen wie Saponin-Aluminiumhydroxid oder Quil®-A Aluminiumhydroxid; Liposome; Iscom-Adjuvans; mycobakterielles Zellwandextrakt; synthetische Glycopeptide wie Muramyl-Dipeptide oder andere Derivate; Avridin; Lipid A; Dextransulfat; DEAE-Dextran oder DEAE-Dextran mit Aluminiumphosphat; Carboxypolymethylen wie Carbopol®; EMA; Acryl-Copolymeremulsion wie Neocryl® A640 (z. B. US-Patent 5047238); Kuhpocken oder Tierpockenvirusproteine; subvirale Partikel-Adjuvantien wie Orbivirus; Choleratoxin; Dimethyldiocledecylammoniumbromid oder Gemische daraus ein.
  • EMA 31 (Monsanto, St. Louis, MO) ist ein lineares Ethylen/Maleinsäure-Copolymer mit etwa gleichen Mengen an Ethylen und Maleinsäureanhydrid mit einem geschätzten durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 75000 bis 100000. Adjuvans A ist ein Adjuvans, welches ein Block-Copolymer wie Polyoxypropylen-Polyoxyethylen (POP-POE) Block-Copolymer, vorzugsweise Pluronic® L121 (z. B. US-Patent 4772466) und einen organischen Bestandteil wie metabolisierbares Öl, z. B. einen ungesättigten Turpin-Kohlenwas serstoff, vorzugsweise Squalan (2,6,10,15,19,23-Hexamethyltetracosan) oder Squalen umfasst. Das Vakzin kann auch ein nichtionisches Detergens oder Surfactanten einschließen, vorzugsweise ein Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat wie ein Tween® Detergens, am meisten bevorzugt Tween®-80, also Polyoxyethylen(20)-sorbitan-monooleat.
  • In diesem Adjuvansgemisch können das Block-Copolymer, organisches Öl und Surfactant in Mengen im Bereich von etwa 10 bis etwa 40 ml/l, etwa 20 bis etwa 80 ml/l bzw. etwa 1,5 bis etwa 6,5 ml/l vorhanden sein. In einer bevorzugten Ausführungsform des Adjuvansvorrats ist der organische Bestandteil Squalan, welches in einer Menge von etwa 40 ml/l vorhanden ist, der Surfactant ist Polyoxyethylensorbitan-monooleat (Tween®-80), welches in einer Menge von etwa 3,2 ml/l vorhanden ist, und das POP-POE Block-Copolymer ist Pluronic® L121, welches in einer Menge von etwa 20 ml/l vorhanden ist. Pluronic® L121 ist ein flüssiges Copolymer bei 15–40°C, wo der Polyoxypropylen (POP)-Bestandteil ein Molekulargewicht von 3250 bis 4000 hat und der Polyoxyethylen (POE) Bestandteil etwa 10–20%, vorzugsweise 10% des gesamten Moleküls umfasst.
  • Einzelne Waschbär-Pockenviren, welche die gag oder env Gene exprimieren, können zur Impfung zusammengemischt werden. Ferner kann das Virus mit zusätzlichen inaktivierten oder abgeschwächten Viren, Bakterien oder Pilzen oder mit Immunogenen, abgeleitet von Viren, Bakterien oder Pilzen wie felinem Leukämie-Virus, felinem Panleukopänie-Virus, felinem Rhinotrachitis-Virus, felinem Calici-Virus, felinem infektiösem Peritonitis-Virus, felinem Chlamydia psittaci, Microsporum canis oder anderen gemischt werden. Zusätzlich können Antigene aus den oben angeführten Organismen in Kombinations-Vakzine eingeschlossen werden. Diese Antigene können aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanten Expressionssystemen gereinigt werden, oder können individuelle Untereinheiten des daraus abgeleiteten Antigens oder synthetischer Peptide umfassen.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können lebende oder inaktivierte RRPV-Virus-Zelllysate in Liposome eingeschlossen, oder in Peptid-, Protein- oder Polysaccharid-basierte Mikrokapseln vor der Verabreichung unter Verwendung von nach Stand der Technik bekannten Mitteln eingekapselt werden. Das Vakzin der vorliegenden Erfindung wird Katzen in Volu mina im Bereich von 0,5 bis 5 Millilitern verabreicht. Das Vakzin kann auf subkutanen, intramuskulären, oralen, intradermalen oder intranasalen Wegen an Katzen verabreicht werden. Die Anzahl an Injektionen und ihr zeitlicher Abstand können variiert werden. Ein bis drei Impfungen, verabreicht in Intervallen von ein bis drei Wochen, sind üblicherweise wirksam.
  • Die Wirksamkeit der Vakzine der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Verfahren bewertet. Bei etwa einem Monat nach der letzten Impfung werden die Geimpften und Kontrollen jeweils 3–20 Katzen ID50-Einheiten, vorzugsweise 5 Katzen ID50-Einheiten von FIV, vorzugsweise dem NCSU1 Isolat (ATCC VR-2333), ausgesetzt. Ganzes Blut wird direkt vor dem Challenge und in Intervallen nach dem Challenge zur Messung von a) Virämie und b) relativen Mengen von CD4 und CD8 Lymphozyten von den Tieren erhalten.
  • Virämie wird durch Isolieren mononukleärer Zellen aus dem Blut und Kultivieren der Zellen mit mononukleären Zellen von nicht infizierten Tieren gemessen. Nach 7 Tagen Kultur werden die Kultursupernatanten durch Enzym-gebundenen Immuntest auf FIV getestet (siehe Beispiel 5 unten).
  • Das Verhältnis von CD4 zu CD8 Lymphozyten in der Zirkulation von Geimpften und Kontrollen wird als Maß für Immunfunktion genommen. Typischerweise verursacht FIV-Infektion eine Umkehrung des normalen CD4 : CD8 Verhältnisses von etwa 1,5–4,0 zu einem pathologischen Verhältnis von etwa 0,5–1,0. Die Zahlen von CD4 und CD8 Lymphozyten werden durch Flusszytometrie unter Verwendung spezifischer Antikörper gemessen (siehe Beispiel 5 unten).
  • Ein weiteres Maß zur Immunfunktion ist es, Geimpfte und Kontrollen mit Toxoplasma gondii bei 6–12 Monaten nach der letzten RRPV-FIV Impfung herauszufordern. Normalerweise ist die Schwere von durch T. gondii verursachten Krankheitssymptomen in FIV-infizierten Katzen bezogen auf nicht infizierte Katzen beträchtlich verschlimmert. Die Schwere der T. gondii Wirkung wird durch Bewerten von Augenausfluss, Nasenausfluss, Dyspnoe und Fieber bestimmt.
  • Es versteht sich, dass Verbesserung von jedem der Symptome von FIV-Infektion ein wünschenswertes klinisches Ziel ist. Dies schließt Verringerung der Dosierung von Medikation ein, welche verwendet wird, um durch FIV herbeigeführte Symptome zu behandeln.
  • Von den folgenden Beispielen ist beabsichtigt, dass sie die vorliegende Erfindung veranschaulichen, ohne sie einzuschränken.
  • Beispiel 1: Klonieren von FIV gag und env Genen
  • A. Isolierung von viraler DNA
  • FIV-Stamm NCSU-1 (mit der Bezeichnung „FIV-NCSU-1") wurde aus einer natürlich infizierten, feliner Leukämie-Virus negativen Katze isoliert und ist vorhergehend beschrieben worden (Tompkins et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 199: 1311, 1991.) Das Virus wurde in eine normale, spezifisch Pathogen-freie (SPF) Katze (erhalten von Liberty Laboratories, Waverly, NY) passiert. FIV-infizierte mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC) wurden aus dem ganzen Blut durch Abtrennung an diskontinuierlichen Percoll-Gradienten erhalten. Kurz: anti-koaguliertes ganzes Blut wurde über einen zweistufigen Gradienten geschichtet, welcher 43% PercollTM (Pharmacia, Piscataway, NJ) über 62,5% PercollTM in 0,15 M NaCl enthielt. Die Gradienten wurden bei 400 × g für 5 Minuten zentrifugiert, gefolgt von 800 × g für 20 Minuten bei 22°C. PBMC wurde aus der Gradient-Grenzfläche geerntet und in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, welche 5% fötales Rinderserum enthielt. Parallel wurden PBMCs aus normalen Katzen isoliert.
  • FIV wurde durch Co-Kultur von PBMCs aus der FIV-infizierten Katze mit PBMCs aus normalen Katzen propagiert. Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medien gehalten, welche 10% fötales Rinderserum, 2,5 × 10–5 Beta-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 5 μg/ml Concanavalin A und 20% konditionierte Medien von MLA-Zellen (ATCC TIB 201) als Quelle für Interleukin-2 (IL-2) enthielten.
  • Genomische DNA von der Katze, welche FIV-NCSU-1 provirale Sequenzen enthielt, wurde aus den kultivierten PBMCs isoliert durch Lysis der Zellen mit 0,6% Natriumdodecylsulfat (SDS) in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, gefolgt von Ausfällung von chromosomaler DNA durch Inkubation über Nacht mit 1 mM NaCl. Die DNA wurde durch Zentrifugation bei 10000 U/Min. (Beckman J2, JA-20 Rotor) für 40 Minuten gewonnen. Das DNA-Pellet wurde in einer Lösung resuspendiert, welche 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,1% SDS Puffer enthielt und mit Ribonuclease A (20 μg/ml) und Proteinase K (0,2 mg/ml) bei 50°C für 4 Stunden verdaut. Die DNA wurde dann durch aufeinander folgende Extraktion mit Phenol, Phenol : Chloroform (1 : 1) und Chloroform gereinigt und wurde in reiner Form gewonnen, gefolgt von Ethanol-Ausfällung.
  • B. Klonieren von FIV Hüllen-Gen
  • FIV-NCSU-1 Hüllen-DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung von Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Verfahren wie folgt kloniert:
  • Hüllenfragment A
  • Die folgenden Oligonucleotide wurden verwendet, um das 5' proximale Segment des env Gens zu amplifizieren.
  • 5'-TCGGATCCAACAATAATTATGGCAGAAGG-3' [SEQ ID. Nr. 1] (Codierungsstrang, 6252-V)
  • 5'-AATCAGGTACAAAGTCACCGTTC-3' [SEQ ID. Nr. 2] (komplementärer Strang, 6745-C)
  • Primer 6252-V entspricht Nucleotiden 6252–6273 von FIV-Stamm PPR (GenBank Nr. M36968) und Primer 6745-C (unterstrichener Bereich) entspricht Nucleotiden 6723–6745 von FIV-Stamm 14 (Gen-Bank Nr. 25381). Das Start-Codon zur Hüllenproteintranslation ist in Primer 6252-V eingeschlossen. Primer 6252-V hat auch eine synthetische BamHI Restriktionsenzymstelle nahe dem 5'-Ende, um Klonieren zu erleichtern. Eine AvrII-Stelle, welche sich an Position 6719 befindet, erleichtert ebenfalls das Klonieren. Hüllenfragment A hat eine Länge von 494 bp.
  • Hüllenfragment B
  • Die folgenden Oligonucleotide wurden verwendet, um das mittlere Segment des env Gens zu amplifizieren.
  • 5'-TATAGAAGCACCCCAAGAAGAG-3' [SEQ ID. Nr. 3] (Codierungsstrang, 6637-V)
  • 5'-CATTCCCCCAAAGTTATATTTC-3' [SEQ ID Nr. 4] (komplementärer Strang, 8469-C)
  • Primer 6637-V und 8469-C entsprechen Nucleotiden 6637–6659, bzw. 8448–8469 von FIV 14 Stamm. Eine AvrII-Stelle an Position 6719 und eine SpeI-Stelle an Position 8288 erleichterten das Klonieren. Hüllenfragment B hat eine Länge von 1833 bp.
  • Hüllenfragment C
  • Die folgenden Oligonucleotide wurden verwendet, um das 3' distale Fragment des env Gens zu amplifizieren.
  • 5'-TTAGTTACATTAGAGCATCAAG-3' [SEQ ID Nr. 5] (Codierungsstrang, 8264-V)
  • 5'-TTCTAGATCTTCAGGGTCCCAATACTC-3' [SEQ ID Nr. 6] (komplementärer Strang, 9145-C).
  • Primer 8264-v entspricht Nucleotiden 8264–8285 von FIV Stamm 14 und Primer 9145-C (unterstrichener Bereich) entspricht Nucleotiden 9126–9145 von FIV-Stamm PPR. Primer 9145-C hat eine synthetische BgIII-Stelle nahe dem 5'-Ende, um Klonieren zu erleichtern. Eine SpeI-Stelle, welche sich an Position 8288 befindet, erleichtert ebenfalls das Klonieren. Hüllenfragment C hat eine Länge von 880 bp.
  • In jedem Fall wurde PCR für 35 Zyklen von 1 Min. 30 Sek. bei 94°C, 2 Min. bei 56°C und 2 Min. bei 72°C durchgeführt, gefolgt von einem Zyklus von 8 Min. bei 72°C. Jedes Hüllenfragment wurde durch Gel-Elektrophorese isoliert und unter Verwendung von Standardverfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Press) in Plasmid pSL1190 kloniert.
  • Anfänglich wurde jedes Fragment in pSL1190 kloniert, wonach die drei Fragmente zusammen gespleißt wurden, um wieder ein Hüllen-Gen in voller Länge zu erzeugen. Zu diesem Zweck wurde das Hüllen-A Plasmid mit BamHI und AvrII verdaut, das Hüllen-B Plasmid wurde mit AvrII und SpeI verdaut und das Hüllen-C Plasmid wurde mit SpeI und BgIII verdaut. Nachfolgend wurde das 1,5 kbp AvrII/SpeI Hüllen-B Fragment in pSL-EnvA ligatiert, das mit AvrII und SpeI verdaut worden war, um pSL-EnvAB zu erzeugen (1). Das envAB Fragment codiert für das gesamte Oberflächenmembranprotein (SU) und die ersten 63 Aminosäuren des Amino-Terminus des Transmembranproteins (TM) von FIV-NCSU-1, also Aminosäuren 1–735 von env. Jedoch enthält envAB nicht die Transmembran-Domäne (TM).
  • Als nächstes wurde 0,9 kbp SpeI/SmaI Hüllen-C Fragment von pSL-EnvC in pSL-EnvAB ligatiert, das mit SpeI und BbrPI verdaut worden war, um pSL-EnvABC oder pSL-WEnv zu erzeugen (1). Das WEnv-Fragment codiert für den gesamten env offenen Leserahmen (SU und TM Proteine) von FIV NCSU-1 (2).
  • Die subklonierten genetischen Elemente von FIV-NCSU-1 wurden unter Verwendung von Sequenase Version 2.0 (United States Biochemical, Cleveland, OH) wie für doppelsträngige DNA beschrieben sequenziert und die Reaktionen wurden unter Verwendung des ABI automatisierten Sequenzierers (Applied Biosystems, Foster City, CA) analysiert. Beide DNA-Stränge wurden sequenziert, um die Ergebnisse zu bestätigen. Die DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung der MacVector DNA Analysis Software (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT) analysiert. Die env DNA-Sequenzen wurden bezüglich offenen Leserahmen analysiert und mit den vorher veröffentlichten DNA-Sequenzen von anderen FIV-Isolaten verglichen. Die DNA und vorhergesehenen Aminosäure-Sequenzen von env und envAB offenen Leserahmen von FIV-NCSU-1 werden in 3 gezeigt.
  • C. Klonieren des FIV GAG-Gens
  • Das gag Gen von FIV-NCSU1 wurde unter Verwendung von PCR und den folgenden Oligonucleotid-Primer amplifiziert:
    5'-CAATTCTAGAGAGACTCTACAGCAACATG-3' [SEQ ID Nr. 7] (Codierungsstrang, 610-V)
    5'-TAATAGATCTGGCCTCTTTTCTAATGATG-3' [SEQ ID Nr. 8] (komplementärer Strang, 2026-C).
  • Primer 610-V und 2026-C entsprechen Nucleotiden 610–630 bzw. 2005–2026 vom FIV 14 Stamm. Primer 610-V und 2026-C haben XbaI bzw. BgIII Restriktionsenzymstellen nahe den 5'-Enden, um Klonierung zu erleichtern. Die letzten drei Nucleotide von Primer 610-V entsprechen dem Start-Codon für gag Proteintranslation.
  • PCR wurde für 35 Zyklen von 1 Min. 30 Sek. bei 94°C, 2 Min. bei 56°C und 2 Min. bei 72°C durchgeführt, gefolgt von einem Zyklus von 4 Min. bei 72°C. Das 1,4 kbp DNA-Fragment, welches das gag Gen enthält, wurde durch Gel-Elektrophorese gereinigt und in die XbaI/BgIII-Stelle von pSL1190 kloniert, um pSL-WGag zu bilden (4). Die DNA-Sequenz von FIV-NCSU-1 gag wird in 5 gezeigt.
  • Beispiel 2: Herstellung von rekombinanten Waschbär-Pockenviren
  • A. Konstruktion von Waschbär-Pockenvirus Transferplasmiden
  • Die DNA-Sequenzen, welche für das gag, env und envAB codieren, isoliert wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden einzeln in den Pockenvirus Transfervektor pSC11 subkloniert. Die Sequenz von pSC11 wird im kanadischen Patent Nr. 2132374 offenbart, welches durch Verweis eingeschlossen wird. Zu diesem Zweck wurden das 1,4 kb XbaI/BgIII-Fragment von pSL-WGag (6), das 2,9 kb BamHI/SpiI-Fragment von pSL-WEnv (7) und das 2,1 kb BamHI/SpeI-Fragment von pSL-EnvAB (8) einzeln isoliert und mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase stumpf-endig gemacht, wonach jedes einzeln in die SmaI-Stelle von pSC11 kloniert wurde.
  • B. Herstellung von rekombinanten Waschbär-Pockenviren
  • Rekombinante Waschbär-Pockenviren (RRPV), welche die FIV gag und env Gene tragen, wurden wie für rekombinante Kuhpockenviren allgemein beschrieben (Mackett und Smith, J. Gen. Virol. 67: 2067–2082, 1986) mit einigen Modifikationen hergestellt. Monoschichten von Vero-Zellen (ATCC CCL 81), die 80% konfluent waren (etwa 5 × 106 Zellen in 100 mm Gewebekultur-Schalen), wurden mit Wildtyp Waschbär-Pockenvirus (ATCC VR-838) bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 0,1 TCID50/Zelle in 2 ml MEM (Eagle's Minimum Essential Medium, (Gibco BRL # 410–1500), welches 0,05 Lactalbuminhydrolysat und 15 mg/ml Gentamicinsulfat enthielt und mit Natriumbicarbonat an pH 7,2 angepasst war) für 30–60 Minuten bei 37°C infiziert. Die Zellen wurden dann mit entweder pSC11-FIV gag, pSC11-FIV env oder pSC11-FIV env AB Transferplasmiden durch kationische Liposomen-vermittelte Transfektion unter Verwendung von Transfectam® (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) nach den Anleitungen des Herstellers transfiziert. Das Zellen/DNA-Liposomengemisch wurde in 3 ml MEM, welches 5% fötales Rinderserum (FBS) enthielt, über Nacht bei 37°C (5% CO2) inkubiert, wonach das Medium durch 8 ml frisches MEM-5% FBS ersetzt wurde. Die transfizierten Zellen wurden bei 37°C (5% CO2) inkubiert, bis mehr als 80% der Zellen cytopathische Wirkungen zeigten (etwa 3–4 Tage). Die Zellen und Kulturmedien (Virus-Zelllysate) wurden dann aus den Schalen entfernt und vor Lagerung bei –70°C zwei Frost/Tau-Wechseln unterworfen.
  • C. Isolierung von rekombinantem Waschbär-Pockenvirus, welcher das FIV gag-Gen trägt
  • RRPVs, welche das FIV-NCSU1 gag Gen tragen (RRPV-FIV gag) wurden isoliert und von der pSC11-FIV gag/Vero-Zellen Transfektion durch Virusplaque-Testverfahren gereinigt. Monoschichten von Vero-Zellen (50–80% konfluent) in 100 mm Gewebekulturschalen wurden mit 2 ml von 10-fachen seriellen Verdünnungen (10–1 bis 10–3 in MEM) der Virus-Zelllysate infiziert. Nach Inkubation für 1 Stunde bei 37°C wurde das Medium entfernt und die infizierten Zellen wurden mit 8–10 ml von 1,25 Nobel-Agar überschichtet, welches MEM/5% FBS enthielt. Die infizierten Zellen wurden dann für 3–4 Tage bei 37°C (5% CO2) inkubiert und wiederum mit 4 ml von 1,25 Nobel-Agar überschichtet, welches 0,5X PBS und 600 μg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-gal, United States Biochemical, Cleveland, Ohio) enthielt. Die Schalen wurden bei 37°C (5% CO2) für 4–16 Stunden inkubiert, bis blaue Virusplaques (β-Galactosidase positiv) beobachtet wurden. Die rekombinanten Virusplaques wurden mit sterilen, stumpfen Nadeln aufgenommen, welche an einer 1 ml (cc) Spritze befestigt waren, in 0,5 ml von 0,25 mg/ml Trypsin suspendiert, kräftig gewirbelt und bei 37°C für 15–30 Min. inkubiert. Die zerrissenen Virusplaques wurden dann auf 5 × 105 Vero-Zellen in T-25 cm2 Kolben inokuliert und bei 37°C (5% CO2) inkubiert, bis mehr als 80% CPE beobachtet wurde. Die Virus-Zelllysate, welche RRPV-FIV gag enthielten, wurden zwei Frost/Tau-Wechseln unterworfen und bei –70°C gelagert. Fünf einzelne RRPV-FIV gag-Klone wurden ausgewählt und viermal wie oben beschrieben Plaque-gereinigt.
  • D. Isolation von rekombinantem Waschbär-Pockenvirus, welcher FIV envAB-Gen trägt
  • RRPVs, welche das FIV-NCSU1 envAB-Gen tragen (RRPV-FIV envAB) wurden isoliert und von pSC11-FIV envAB/Vero-Zellen Transfektion unter Verwendung der für RRPV-FIV gag beschriebenen Verfahren mit einigen Modifikationen gereinigt. (tk-) Waschbär-Pockenviren aus den anfänglichen Virus-Zelllysaten, welchen es an Thymidinkinase mangelte, wurden an tk-Rat-2 Zellen (ATCC CRL 1764) selektiert. Dieses wurde durch Inokulieren von 1 ml des anfänglichen Virus-Zelllysats auf eine Monoschicht von Rat-2-Zellen in einem T-75 cm2 Kolben (etwa 5 × 106 Zellen) durchgeführt, welcher 5-Bromdeoxyuridin (BrdU) bei 30 μg/ml in MEM enthielt. Die infizierte Monoschicht wurde bei 37°C (5% CO2) für 3–4 Tage inkubiert, bis mehr als 70% CPE beobachtet wurde. Die tk-Virus-Zelllysate wurden zwei Frost/Tau-Wechseln unterworfen und bei –70°C gelagert. RRPV-FIV envAB wurden isoliert und durch den Virusplaque-Standardtest wie oben für RRPV-FIV gag an Vero-Zellen beschrieben von den tk-Virus-Zelllysaten gereinigt. Fünf einzelne RRPV-FIV envAB-Klone wurden selektiert und fünf Mal Plaque-gereinigt.
  • Beispiel 3: Merkmale von rekombinanten FIV-exprimierenden Waschbär-Pockenviren
  • A. Bestätigung von FIV gag und envAB Genen in RRPV durch Polymerasekettenreaktion
  • Die Gegenwart der FIV gag und envAB Gene in den RRPVs wurde unter Verwendung von PCR bestätigt. 90 μl eines Virus-Zelllysats wurden mit 10 μl 10X PCR-Lysepuffer (1X; 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,5, welches 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,5% Tween 20, 0,3 mg/ml Proteinase K enthielt) für 16 Stunden bei 50°C inkubiert, dann für 10 Min. gesiedet. 10 μl dieses Lysats wurden in der PCR-Reaktion als Matrize verwendet. Die PCR wurde in 100 μl von 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,3, welches 50 mM KCl, 200 μM jedes dNTP, 1,5 mM MgCl2, 30 p-Mol jedes Primers, und 2,5 Einheiten Ampli-Tag® DNA Polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) enthielt, durchgeführt. Die in der PCR für FIV gag verwendeten Primer waren:
    5'-TATGGAAAAGGCAAGAGAAGGAC-3' [SEQ ID Nr. 9]
    5'-TCGAGATACCATGCTCTACACTG-3' [SEQ ID Nr. 10],
    welche den Nucleotiden 471–493, bzw. 763–785 des FIV gag offenen Leserahmens entsprechen. Die in der PCR für FIV envAB verwendeten Primer waren:
    5'-TATGGAAAAGATGGGATGAGACTA-3' [SEQ ID Nr. 15]
    5'-GTCACTTACCTTCATAGTAAACC-3' [SEQ ID Nr. 16],
    welche den Nucleotiden 857–880, bzw. 1513–1535 des FIV env offenen Leserahmens entsprechen. Die PCR-Amplifikationen wurden in einem DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus) durch zuerst Erhitzen des Umsetzungsgemisches auf 94°C zur Denaturierung und dann 35 Zyklen von 1 Min. bei 95°C, 1 Min. bei 55°C, 2 Min. bei 72°C und einer Endinkubation von 8 Min. bei 72°C durchgeführt. 10 μl der PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in einem horizontal-submarinen 4% NuSieve® Agarosegel (FMC BioProducts, Rockland, ME) in TAE Puffer (40 mM Tris-Base, 20 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, pH 7,2) durch Anwenden von 5 V/cm für 1–2 Stunden und Färben mit Ethidiumbromid analysiert.
  • PCR-Amplifikationen mit den FIV gag und env Primern ergab erwartete DNA-Fragmente aus 314 bzw. 678 Nucleotiden. PCR-Amplifikationen unter Verwendung der pSC11 FIV gag und envAB Transferplasmide dienten als positive Kontrollen. PCR-Amplifikationen unter Verwendung von Wildtyp Waschbär-Pockenvirus Vero-Zelllysaten dienten als negative Kontrolle.
  • B. Bestätigung von RRPV FIV gag und envAB Proteinexpression durch Western-Blot-Analyse
  • Konfluente Monoschichten von Vero-Zellen in einem T-25 cm2 Kolben (1–2 × 106 Zellen) wurden mit Klonen von entweder RRPV-FIV gag oder RRPV-FIV envAB bei einer M. O. I. von 1 bis 10 TCID50 pro Zelle infiziert. Die infizierten Zellen wurden bei 37°C (5% CO2) für 2–3 Tage inkubiert, bis etwa 80% CPE beobachtet wurde. 20 μl des Virus-Zelllysats wurden zu 5 μl von 5X Laemmli Probenpuffer (0,3 M Tris-HCl Puffer, pH 6,8, welcher 5% SDS, 50% Glycerol, 0,4% Bromphenol blau und 3% 2-Mercaptoethanol enthielt) zugegeben und bei 95°C für 5 Min. erhitzt. Die denaturierten Proteinproben wurden durch SDS/Polyacrylamid-Elektrophorese unter Verwendung eines 4–15% Gradient-Polyacrylamidgels getrennt (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Press). Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf Nitrocellulosefilter (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) durch Elektrotransfer unter Verwendung eines Bio-Rad-Transferapparats nach Anweisung des Herstellers transferiert. Der Transfer wurde in 25 mM Tris-HCl Puffer, welcher 0,2 M Glycin und 20% Methanol enthielt, für 45 Minuten bei 50V mit konstantem Strom durchgeführt.
  • Der Blot wurde dann durch Immunoblot-Analyse wie vorher beschrieben (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986, Elsevier Science Publishing Company, New York, NY) mit einigen geringen Modifikationen bezüglich FIV gag und envAB Proteinen gescreent. Nach dem Transfer wurde der Nitrocellulose-Blot in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 gespült, welche 0,1% Tween-20 enthielt (PBS-TW), und nicht-spezifische Stellen wurden durch Inkubation des Blots in PBS, welches 1% Rinderserum Albumin enthielt (PBS-BSA) bei 4°C über Nacht blockiert, gefolgt von einer 15 Min. Wäsche in PBS-TW. Der Blot wurde dann für 30 Min bei Raumtemperatur mit Anti-FIV IgG von der Ziege, verdünnt 1 : 100 in PBS-TW, enthaltend 1% BSA (PBS-TW-BSA) inkubiert, gefolgt von vier 5-minütigen Wäschen in PBS-TW. Als nächstes wurde der Blot für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Biotin-markierten Maus-anti-Ziege IgG Antikörper (sekundärer Antikörper) (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) inkubiert, der 1 : 2000 in PBS-TW-BSA verdünnt worden war, gefolgt von vier 5-minütigen Wäschen in PBS-TW. Antigen-Antikörper-Komplexe wurden durch Inkubieren des Blots für 30 Minuten bei Raumtempe ratur mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertem Streptavidin inkubiert (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.), das 1 : 1000 in PBS-TW verdünnt worden war, vier Mal jeweils 5 Min. Waschen in PBS-TW und sichtbar Machen mit Peroxidase-chromogenem Substrat (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) nachgewiesen. Sucrose-Gradient gereinigtes FIV und Wildtyp Waschbär-Pockenvirus Vero-Zelllysate wurden als positive, bzw. negative Kontrollen für die Immunoblot-Analyse verwendet.
  • Ziegen Anti-FIV-Antikörper wurden wir folgt hergestellt. FIV NCSU1 wurde in Lymphozyten aus peripherem Blut wachsen gelassen und unter Verwendung eines Hohlfaser-Apparats zu einer Konzentration von etwa 106 TCID50/ml konzentriert. Der konzentrierte Virusvorrat wurde mit einem Ölhilfsstoff wie OW3 in einem Verhältnis von 1 : 1 (v : v) gemischt und die Emulsion wurde verwendet, um Ziegen sechsmal in Intervallen von 3–4 Wochen zu inokulieren. In monatlichen Intervallen wurden die Ziegen bluten gelassen und das Serum wurde hinsichtlich Gegenwart von Anti-FIV Antikörpern getestet.
  • C. Bestätigung von RRPV FIV gag und envAB Proteinexpression durch Immunfluoreszenztest
  • Konfluente Monoschichten von Vero-Zellen in 96-Mulden Schalen (1–2 × 104 Zellen/Mulde) werden mit Klonen von entweder RRPV-FIV gag oder RRPV-FIV envAB bei einer Multiplizität der Infektion von 0,1 bis 1,0 Plaque-bildenden Einheiten pro Zelle infiziert. Mit Wildtyp RCNV infizierte Zellen dienen als negative Kontrolle. Die infizierten Zellen werden bei 37°C (5% CO2) für 1 Tag inkubiert, bis etwa 20% CPE beobachtet werden. Die Zellen werden dann dreimal mit PBS gewaschen und mit 80% Aceton bei 4°C für zehn Minuten fixiert. Als nächstes werden die Zellen mit PBS rehydriert und mit einem monoklonalen Antikörper (IgG) gegen entweder FIV gag oder env Oberflächenmembranproteinen für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. FIV-Antigen/FIV-Antikörper-Komplexe werden unter Verwendung eines FITC-konjugierten Ziegen-Anti-Maus IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) und Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen.
  • D. Waschbär-Pockenvirus-Titration
  • Viruspräparate wurden durch Verdünnung in einem gleichen Volumen von 0,5% Trypsin und Inkubation bei 37°C für 30 Minuten vorbehandelt, um Virus aus Inklusionen freizusetzen. Es wurden dann serielle Verdünnungen (10-fach) von Virus in MEM hergestellt und in Replikaten von fünf auf Vero-Zellen (1 × 104 Zellen in 100 μl pro Mulde) in einer 96-Mulden-Schale inokuliert (100 μl/Mulde). Die Schalen wurden für 3–5 Tage bei 37°C (5% CO2) inkubiert und bezüglich Cytopathologie beobachtet, welche für Waschbär-Pockenvirus typisch ist. Virale Infektivitätstiter wurden als 50% Endpunkte, basierend auf der Cytopathologie unter Verwendung der Verfahren von Reed und Muench, The American Journal of Hygiene 27: 493, 1938) berechnet.
  • Beispiel 4: Herstellung von Impfstoffen basierend auf rekombinanten Pockenviren
  • A. Herstellung von Masterseeds von RRPV-FIV gag und envAB Viren
  • Ein einzelner Klon von jedem rekombinanten Virus, das signifikante Rekombinant-Proteinexpression (durch das oben in Beispiel 3 beschriebene Verfahren) zeigte, wurde für Expansion im großen Maßstab ausgewählt, um als Masterseed-Virus zu dienen. Alle Rekombinant-Virusexpansionen und Titrationen wurden auf Vero-Zellen in MEM durchgeführt, welches 2,5% FBS enthielt. Jeder Plaque-gereinigte Virusklon wurde durch Inokulieren einer konfluenten Monoschicht von Vero-Zellen in einem T-150 cm2 Kolben (1 × 107 Zellen) mit 1 ml Virus-Zelllysat (etwa 107 infektiöse Viruspartikel) und Inkubieren bei 37°C (5% CO2), bis 100 CPE beobachtet wurde (2–3 Tage) expandiert. Dieses Virus-Zelllysat diente als Premasterseed-Virusvorrat und wurde verwendet, um den Masterseed-Virus zu erhalten. Der Premasterseed von jedem rekombinanten Virus wurde auf Vero-Zellen titriert und ein TCID50 wurde bestimmt. Die Masterseed-Viren für RRPV-FIV gag und RRPV-FIV envAB wurden auf Vero-Zellen unter Verwendung eines MOI von 0,01 bzw. 0,1 wachsen gelassen. Drei Rollflaschen von konfluenten Vero-Zellen wurden für jeden der Masterseed-Viren unter Verwendung von MEM-Medien, ergänzt durch 2,5% fötales Rinderserum infiziert und für etwa 3 Tage bei 37°C inkubiert. Infizierte Kultur-Supernatantflüssigkeiten wurden geerntet und die Seed-Viren wurden in 1,5 ml Ampullen aliquotiert, welche versiegelt und in einem Flüssigstickstoff-Gefrierer gelagert wurden.
  • B. Herstellung von Impfstoffen
  • Vero-Zellen (3 × 107) wurden in 850 cm2 Rollflaschen in 200 ml Wachstumsmedium (MEM, welches 0,5% Lactalbumin-hydrolysat und 5% Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum enthält) gesät und für 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium von den Zellen entfernt und mit 50 ml RRPV-FIV gag bei einer Multiplizität der Infektion von 0,01 in Infektionsmedium (MEM, welches 0,5% LAH und 2,5% Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum enthält) ersetzt. Das verwendete Virus war bei der vierten Passage nach dem Masterseed-Präparat. Das Virus durfte sich für 30 Min. bei 37°C an die Zellen ansaugen, wonach das Volumen an Medium auf 150 ml pro Rollflasche angepasst wurde. Die Rollflaschen wurden bei 37°C inkubiert, bis 100% Cytopathologie offensichtlich war (3 Tage). Ein Virus/Zelllysat wurde dann hergestellt und gefroren (–70°C) gelagert. Der Virustiter von RRPV-FIV gag wurde als 1074 TCID50/ml bestimmt.
  • Rekombinante Waschbär-Pockenviren, welche das FIV envAB-Fragment exprimieren, wurde auf gleiche Weise hergestellt, außer, dass eine Multiplizität der Infektion von 0,1 verwendet wurde. Das Virus war die vierte Passage nach dem Masterseed-Präparat. Das RRPV-FIV envAB Präparat wurde titriert und es wurde befunden, das es 106,4 TCID50/ml enthält.
  • Wildtyp Waschbär-Pockenvirus wurde unter Verwendung der gleichen Verfahren wie oben beschrieben wachsen gelassen. Von diesem Viruspräparat wurde befunden, dass es 107,7 TCID50/ml enthielt.
  • Beispiel 5: Wirksamkeitstest von FIV-Vakzinen, basierend auf rekombinanten Pockenviren
  • A. Impfung
  • Dreißig 6–7 Monate alte Katzen (spezifisch Pathogen-frei, Harlan Sprague Dawley, Madison, WI), fünfzehn männliche und fünfzehn weibliche, wurden verwendet. Die Katzen wurden in sechs Gruppen eingeteilt und zweimal in einem Abstand von 21 Tagen geimpft, wie unten angezeigt:
  • Tabelle 1: Gruppenzuteilung zur Impfung
    Figure 00210001
  • B. Versuchsentwurf
  • Fünfundzwanzig Katzen wurden mit den rekombinanten Waschbär-Pockenvirus-Vakzinen wie in Tabelle 1 gezeigt geimpft. Fünf Katzen wurde ein ähnlicher Titer aus Wildtyp Waschbär-Pockenviren verabreicht, um als negative Kontrollen zu dienen. Zwei Impfungen wurden im Abstand von 21 Tagen verabreicht. Subkutane Impfungen wurden im Genick verabreicht und intramuskuläre Impfungen wurden in einem hinteren Oberschenkel verabreicht. Vier Wochen nach der zweiten Impfung wurden alle Katzen dem NCSU-1 Stamm von FIV ausgesetzt und bezüglich Virämie und Nachweis von Veränderungen der Lymphozytenpopulation wie unten beschrieben überwacht. Elf Monate nach dem FIV-Challenge wurden Katzen in Gruppen 1, 2, 3, 4 und 6 Toxoplasma gondii ausgesetzt und für 48 Tage bezüglich klinischer Krankheitszeichen überwacht.
  • C. FIV-Challenge
  • Vier Wochen nach der zweiten Impfung wurden alle Katzen subkutan 10 Katzen ID50 Einheiten des NCSU1 Isolats von FIV (1 : 1000 Verdünnung von Partie # 021891) ausgesetzt. Ganzes Blut wurde vor dem Challenge und periodisch nach dem Challenge von den Katzen erhalten, um Virusinfektionsparameter wie folgt zu bewerten:
  • 1. Nachweis von Virämie
  • Kulturisolation von FIV wurde wie vorher beschrieben (Wasmoen et al., Vet. Immuno. Immunopath. 35: 83 1992) durchgeführt.
  • Mononukleäre Zellen wurden unter Verwendung von PercollTM (Pharmacia Biotech, Piscataway NJ) Gradienten aus ganzem Blut isoliert. 5 × 105 Zellen von FIV ausgesetzten Katzen wurden mit 1 × 106 mononukleären Zellen kultiviert, welche aus nicht infizierten Katzen isoliert wurden. Die Kulturen wurden mit RPMI-Medium alle 7 Tage gespeist und die Flüssigkeitsüberstände wurden bezüglich der Gegenwart von FIV durch einen Enzym-gebundenen Immunsorbenstest (ELISA) getestet, welcher FIV p25 Antigen nachweist (Petcheck ELISA, IDEXX, Portland ME).
  • 2. Lymphozyten-Teilmengen
  • Leukozyten wurden aus ganzem Blut unter Verwendung von HistopaqueTM (Sigma Chemical Company, St. Louis MO) isoliert und Lymphozyten-Teilmengen quantifiziert durch Färben der Zellen mit Antikörpern, welche für CD4 (monoklonaler Antikörper CAT30A), CD8 (monoklonaler Antikörper FLSM 3.357), Pan T-Lymphozyten (monoklonaler Antikörper FLSM 1.572) oder B-Lymphozyten (Anti-Katze IgG) spezifisch sind, gefolgt von FACS-Analyse. Diese monoklonalen Antikörper werden woanders beschrieben (Tompkins et al., Vet. Immunol. Immunopathol. 26: 305, 1990) und das Flusszytometrieverfahren ist das gleiche, wie vorher beschrieben (R. V. English et al., J. Infect. Dis. 170: 543, 1994). CD4 : CD8-Verhältnisse wurden berechnet.
  • D. Toxoplasma gondii Challenge
  • Tacheozoiten des ME49 Stamms von T. gondii, die in 10% Glycerol eingefroren waren, wurden intraperitoneal in Swiss-Mäuse (Charles Rivers Laboratories) inokuliert und seriell in Mäuse gemäß veröffentlichten Verfahren passiert (Davidson et al., Am. J. Pathol. 143: 1486, 1993). Tacheozoiten, welche aus peritonealen Flüssigkeiten von Mäusen geerntet wurden, wurden unter Verwendung eines Hämazytometers aufgezeichnet. Die Katzen wurden unter Verwendung von Ketaminhydrochlorid beruhigt und mit 50000 frischen Tachyzoiten in die rechte Arteria carotis communis inokuliert, die chirurgisch isoliert worden war. Die Katzen wurden bezüglich klinischer Zeichen der Erkrankung einschließlich Augenausfluss, Nasenausfluss, Dyspnoe, Fieber, Depression und Gewichtsverlust für 3 Tage vor und 48 Tage nach T. gondii Inokulierung überwacht.
  • Klinische Zeichen nach T. gondii Challenge wurden wie folgt bewertet:
    Klinisches Zeichen Bewertung
    Fieber 103,0 bis 103,9°F 104,0 bis 104,9°F ≥105,0°F 1 Punkt pro Tag 2 Punkte pro Tag 3 Punkte pro Tag
    (Temperaturen wurden bis ≥1°F über der Grundlinie nicht bewertet)
    Depression/Lethargie 1 Punkt pro Tag
    Dehydratation 2 Punkte pro Tag
    Nasenausfluss 1 Punkt pro Tag
    Augenausfluss 1 Punkt pro Tag
    Atemnot:
    Tachypnoe 2 Punkte pro Tag
    Dyspnoe 4 Punkte pro Tag
  • E. Ergebnisse
  • Bei einem Monat nach Inokulation mit dem NCSU-1 Stamm von FIV wurde von 60% der Kontrollkatzen befunden, dass die virämisch waren (Tabelle 2). Mit RRPV-FIV gag geimpfte Katzen waren alle bezüglich FIV negativ, 40% der mit RRPV-FIV envAB geimpften Katzen waren Virus-positiv und 20% der mit einer Kombination aus diesen zwei Viren geimpften Katzen waren virämisch (Tabelle 2). Daher variierte die Fähigkeit der Test-Vakzine, Virämie zu verhindern, an diesem Punkt von 33% bis 100% (Tabelle 3).
  • Bei drei Monaten nach FIV-Challenge wurde befunden, dass 80% der Kontrollkatzen Virus-positiv waren (Tabelle 2). Ähnlich konnte FIV aus mononukleären Zellen von peripherem Blut von fast allen geimpften Katzen unter Verwendung dieses sehr empfindlichen Verfahrens isoliert werden (Tabelle 2).
  • Bezüglich des Immunstatus zeigten 80% der Kontrollkatzen Anzeichen von CD4 : CD8 Lymphozytenverhältnisumkehrungen (also Quotienten von kleiner als 1,0) bei drei Monaten (Tabelle 2). Im Gegensatz dazu hatten nur 30% der RRPV-gag geimpften Katzen Anzeichen von signifikanten CD4 : CD8 Umkehrungen und die mit RRPV-FIV envAB Geimpften waren auf ähnliche Weise vor dieser Lymphozyten-Teilmengenveränderung geschützt (Tabelle 2). Mit einer Kombination aus den zwei rekombinanten Viren geimpfte Katzen waren nicht signifikant unterschiedlich von den Kontrollen (also 80% zeigten CD4 : CD8 Umkehrungen) bei 3 Monaten nach Challenge (Tabelle 2).
  • Bei 9 Monaten nach FIV-Challenge waren 100 der Kontrollkatzen FIV-infiziert und alle zeigten CD4 : CD8 Umkehrungen (Tabelle 2). Von einem großen Prozentsatz der geimpften Katzen wurde auch gezeigt, dass sie an diesem Punkt virämisch waren. Jedoch zeigten nur 50% der mit RRPV-FIV gag Geimpften und 20% der mit RRPV-FIV envAB Geimpften Anzeichen von CD4 : CD8 Umkehrungen an diesem Punkt. Daher zeigten diese zwei Vakzine eine signifikante Fähigkeit, die CD4 : CD8 Lymphozytenverhältnisveränderungen in Verbindung mit FIV-Infektion zu verhindern, obwohl die Katzen virämisch schienen (Tabelle 3).
  • Um zu bestimmen, ob CD4 : CD8 Lymphozyten-Teilmengen-Umkehrungen eine Verschlechterung im Immunsystem von Katzen nach FIV-Infektion bedeuteten (und umgekehrt, der Mangel an Umkehrung in Geimpften Aufrechterhaltung von Immunfunktion bedeutete) wurden Geimpfte und Kontrollkatzen (von Gruppen 1, 2, 3, 4 und 6) Toxoplasma gondii ausgesetzt. Dieser Parasit verursacht subklinische Infektionen in normalen Katzen, aber davon wurde berichtet, dass er schwere Erkrankung in Katzen verursacht, die aufgrund von FIV-Infektion immunbeeinträchtigt sind (Davidson et al., Am. J. Pathol. 143: 1486, 1993). Nach T. gondii Challenge zeigten Kontrollkatzen Augenausfluss, Nasenausfluss, Dyspnoe und Fieber. Der durchschnittliche klinische Gesamtwert für Kontrollkatzen betrug 15,6 (Tabelle 4). Im Vergleich gab es eine 41% Reduktion bei klinischen Erkrankungswerten bei mit RRPV-FIV gag geimpften Katzen, bezogen auf Reduktionen der klinischen Anzeichen von Augenausfluss und Dyspnoe (Tabelle 4). Das klinische Bild nach T. gondii Challenge war sogar noch weniger schwerwiegend in mit RRPV-FIV envAB geimpften Katzen. Diese Gruppe zeigte eine 92% Verringerung bei Augenanzeichen, 75% Verringerung bei Nasenausfluss, 73% Verringerung bei Dyspnoe und 58% Verringerung bei klinischen Gesamtwerten (Tabelle 4). Ferner zeigten 80% der Kontrollkatzen Gewichtsverlust in den ersten 14 Tagen nach Challenge im Vergleich zu Gewichtsverlust in nur 44% der mit RRPV-FIV gag Geimpften und 50% der mit V-FIV envAB Geimpften. Daher waren Kontrollkatzen anfälliger gegenüber Herbeiführung von Krankheit durch dieses opportunistische Pathogen als geimpfte Katzen.
  • Diese Daten legen nahe, dass Impfung das Fortschreiten von klinischer Erkrankung, verursacht durch dieses Virus verändert (also Herbeiführung von Immunsuppression). Dies wird durch eine niedrigere Rate von CD4 : CD6 Umkehrungen in geimpften Katzen angezeigt und durch eine verringerte Anfälligkeit gegenüber Infektion mit dem opportunistischen Pathogen T. gondii.
  • Figure 00260001
  • Figure 00270001
  • Figure 00280001

Claims (16)

  1. Rekombinantes Waschbär-Pockenvirus (raccoon poxvirus) mit mindestens einem internen Gen, das eine DNA-Sequenz aufweist, die für ein Polypeptid bestehend aus den Aminosäuren 1–735 des Hüllenproteins eines felinen Immunschwäche-Virus (Feline immunodeficiency Virus, FIV) codiert.
  2. Rekombinantes Waschbär-Pockenvirus nach Anspruch 1, wobei das interne Gen für das FIV-Hüllenprotein mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID Nr. 12 codiert.
  3. Rekombinantes Waschbär-Pockenvirus nach Anspruch 1, wobei das interne Gen für die Aminosäuren 1–735 des FIV-Hüllenproteins mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID Nr. 12 codiert.
  4. Vakzin, umfassend das rekombinante Waschbär-Pockenvirus gemäß Anspruch 1 und ein pharmazeutisch akzeptables Träger- oder Verdünnungsmittel.
  5. Vakzin nach Anspruch 4, welches weiters ein pharmazeutisch akzeptables Adjuvans aufweist.
  6. Vakzin nach Anspruch 4, wobei das interne Gen für das FIV-Hüllenprotein mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID Nr. 12 codiert.
  7. Vakzin nach Anspruch 4, wobei das interne Gen für die Aminosäuren 1–735 des FIV-Hüllenproteins mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID Nr. 12 codiert.
  8. Vakzin nach Anspruch 4, welches weiters Immunogene aufweist, die von Viren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus felinem Leukämie-Virus, felinem Panleukopänie-Virus, felinem Rhinotracheitis-Virus, felinem Calicivirus, infektiösem felinem Peritonitis-Virus, felinem Herpesvirus, felinem enteralem Coronavirus oder Mischungen davon, stammen.
  9. Vakzin nach Anspruch 4, welches weiters inaktivierte oder attenuierte feline Chlamydia psittaci, Microsporum canis oder Mischungen davon aufweist.
  10. Vakzin, welches umfasst: das rekombinante Waschbär-Pockenvirus nach Anspruch 1; ein zweites rekombinantes Waschbär-Pockenvirus mit mindestens einem internen Gen, das eine DNA-Sequenz aufweist, die für ein gag-Protein des felinen Immunschwäche-Virus (FIV) codiert; und ein pharmazeutisch akzeptables Träger- oder Verdünnungsmittel.
  11. Vakzin nach Anspruch 10, welches weiters ein pharmazeutisch akzeptables Adjuvans aufweist.
  12. Isoliertes DNA-Molekül, das für die Aminosäuren 1–735 des felinen Immunschwäche-Virus(FIV)-Hüllenproteins gemäß SEQ. ID Nr. 12 codiert.
  13. Isoliertes DNA-Molekül, das für die Aminosäuren 1–735 des felinen Immunschwäche-Virus(FIV)-Hüllenproteins gemäß SEQ. ID Nr. 12 codiert, zur Verwendung in der Medizin.
  14. Verwendung des rekombinanten Waschbär-Pockenvirus nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Vakzins zur Verhinderung oder Abschwächung einer durch das feline Immunschwäche-Virus (FIV) verursachten Erkrankung.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das interne Gen für das FIV-Hüllenprotein mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID Nr. 12 codiert.
  16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das interne Gen für die Aminosäuren 1–735 des FIV-Hüllenproteins gemäß SEQ. ID Nr. 12 codiert.
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