ES2213178T3 - Poxvirus recombinantes del mapache y su utilizacion como vacuna eficaz contra la infeccion por el virus de la inmunodeficiencia felina. - Google Patents

Poxvirus recombinantes del mapache y su utilizacion como vacuna eficaz contra la infeccion por el virus de la inmunodeficiencia felina.

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA VIRUS DE MAPACHE RECOMBINANTES (RRPVS) UTILES EN VACUNAS PARA LA PROFILAXIS DE ENFERMEDADES CAUSADAS POR EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA FELINA (FIV). LOS RRPVS DE CONFORMIDAD CON LA INVENCION POSEEN AL MENOS UN GEN INTERNO QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA LA PROTEINA GAG DE FIV (GAG), LA PROTEINA DE ENVUELTA (ENV) DE FIV, UN POLIPEPTIDO QUE CONSISTE EN LOS AMINOACIDOS 1-735 DE FIV ENV, O FRAGMENTOS INMUNOGENICOS DE CUALQUIERA DE LOS ANTERIORES. LAS VACUNAS QUE COMPRENDEN UNO O MAS DE LOS POXVIRUS DE MAPACHE RECOMBINANTES QUE EXPRESAN FIV DESCRITOS ANTERIORMENTE PUEDEN COMPRENDER ADICIONALMENTE UN VEHICULO O DILUYENTE FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLE Y UN ADYUVANTE FARMACEUTICAMENTE ACEPTABLE. LA INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA METODOS PARA PREVENIR O DISMINUIR LA ENFERMEDAD CAUSADA POR FIV, QUE SE REALIZAN ADMINISTRANDO A UN FELINO QUE NECESITE DICHO TRATAMIENTO LAS VACUNAS DESCRITAS ANTERIORMENTE.

Description

Proxvirus recombinantes del mapache y su utilización como vacuna eficaz contra la infección por el virus de la inmunodeficiencia felina.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la profilaxis de la enfermedad causada por el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), utilizando como vacunas virus recombinantes de la viruela del mapache (RRPVs) que expresan la proteína de la cubierta del FIV.
Antecedentes de la invención
La infección por el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) es un problema sanitario importante en los gatos domésticos de todo el mundo. Como en el caso de su homóloga humana, la infección por FIV provoca un deterioro progresivo de la función inmunitaria. En la fase aguda de la infección, el virus provoca una enfermedad transitoria asociada a síntomas tales como linfoadenopatía, pirexia y neutropenia. Después, el animal infectado entra en una fase asintomática de 1-2 años antes de que se hagan patentes los síntomas clínicos de la inmunodeficiencia, tras cuya aparición el tiempo medio de supervivencia es generalmente inferior a un año.
El FIV es un retrovirus típico que contienen un genoma de ARN poliadenilado, monocatenario, proteínas estructurales internas derivadas del producto del gen gag, y una cubierta lipídica que contiene proteínas de membrana derivadas del producto del gen env (Bendinelli et al., Clin.Microbiol.Rev. 8:87, 1995). El gen gag se traduce en un producto primario de aproximadamente 50 kDa, que es posteriormente escindido por una proteasa vírica para dar formar las proteínas de la matriz, la cápside y la nucleocápside. El gen env da lugar a un producto primario de traducción de 75-80 kDa (peso molecular de la forma no glucosilado); en células infectadas el precursor tienen un peso molecular aparente de 145-150 kDa debido a glucosilación en N. El precursor de env se escinde en el aparato de Golgi para formar las proteínas SU y TM (también denominadas gp95 y gp40, respectivamente).
La mayoría de las vacunas contra el FIV no han sido capaces de inducir inmunidad protectora. Las vacunas ineficaces han hecho uso de virus enteros inactivados, células infectadas fijadas, proteínas CA y SU recombinantes, y un péptido sintético correspondiente a la región V3 de SU. En algunos casos la vacuna llegó a aumentar la infección tras la prueba de provocación. En un sistema, la vacunación con virus o células infectadas, fijados con paraformaldehído, dio lugar a inmunidad protectora (Yamamoto et al., J. Virol. 67:601, 1993), pero no ha tenido éxito la aplicación de esta estrategia por otros (Hosie et al., en Abstracts of the International Symposium on Feline Retrovirus Research, 1993, página 50).
Los documentos WO94/06471 y WO94/02613 describen vacunas contra el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV). El documento WO92/15684 describe la glucoproteína recombinante 160 y la proteína p24 GAG, del FIV. El documento EP 0652287 describe vectores del virus de la viruela y su utilización como vacunas contra el virus de la peritonitis infecciosa felina. El documento US 5266313 describe virus de la viruela del mapache como vector de expresión génica y de vacuna para los genes del virus de la rabia y de otros organismos.
Así pues, existe la necesidad en la materia de una vacuna eficaz contra el FIV que utilice las proteínas gag o env, o fragmentos de las mismas, como inmunógenos.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a la prevención o la paliación de la enfermedad provocada en gatos por el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV). Se entiende que la prevención o la paliación de la enfermedad significa el mejoramiento de cualesquiera síntomas, incluido el deterioro del sistema inmunitario, originados por la infección por FIV.
La invención proporciona virus recombinantes de la viruela del mapache que tienen por lo menos un gen interno que comprende una secuencia de ADN que codifica la proteína de la cubierta del FIV (env), un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-735 de la env del FIV, o fragmentos inmunógenos de cualquiera de los anteriores. Por fragmento inmunógeno se entiende cualquier porción de la secuencia codificante de los polipéptidos gag o env del FIV que induce una respuesta inmunitaria beneficiosa en gatos.
Un primer aspecto de la infección se refiere, por consiguiente, a un virus recombinante de la viruela del mapache que tiene por lo menos un gen interno que comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido que comprende los aminoácidos 1-735 de la proteína de la cubierta de un virus de la viruela del mapache (FIV).
En una realización preferida, el gen interno del virus de la viruela del mapache codifica la proteína de la cubierta del FIV que tiene la secuencia aminoácida presentada en la SEC. ID. nº 12. En otra realización preferida, el gen interno codifica los aminoácidos 1-735 de la proteína de la cubierta del FIV que tiene la secuencia aminoácida presentada en la SEC. ID. nº 12.
En otro aspecto, la invención abarca vacunas que comprenden uno o más de los virus recombinantes de la viruela del mapache que expresan FIV descritos anteriormente, con un excipiente o diluyente aceptable desde el punto de vista farmacéutico y un adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
Aspectos adicionales de la invención se refieren a una secuencia de ADN que codifica los aminoácidos 1-735 de una proteína de la cubierta del FIV según la SEC. ID. nº 12, y a la utilización de la misma en medicina.
En otro aspecto adicional, se describen métodos para prevenir o paliar la enfermedad causada por el FIV, que se llevan a cabo administrando a un felino que necesite dicho tratamiento las vacunas descritas anteriormente. Por tanto, la invención proporciona la utilización de los virus recombinantes de la viruela del mapache descritos anteriormente en la preparación de una vacuna para prevenir o paliar la enfermedad causada por el FIV.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una ilustración gráfica de la estrategia de clonación del gen de la cubierta del FIV.
La figura 2 es un diagrama que representa la estructura del gen env recombinante del FIV en pSL-EnvABC.
La figura 3 muestra la secuencia de ADN [SEC. ID. nº 14] y de proteína [SEC. ID. nº 12] del gen env del FIV.
La figura 4 es una ilustración gráfica del plásmido pSL-WGag.
La figura 5 muestra la secuencia de ADN [SEC. ID. nº 13] y de proteína [SEC. ID. nº 11] del gen gag del FIV.
La figura 6 es una ilustración gráfica de la estrategia de clonación para la construcción del plásmido de transferencia del virus de la viruela del mapache pSC11-FIV gag.
La figura 7 es una ilustración gráfica de la estrategia de clonación para la construcción del plásmido de transferencia del virus de la viruela del mapache pSC11-FIV Env.
La figura 8 es una ilustración gráfica de la estrategia de clonación para la construcción del plásmido de transferencia del virus de la viruela del mapache pSC11-FIV EnvAB.
Descripción detallada de la invención
La vacuna de la presente invención puede prepararse creando virus recombinantes de la viruela del mapache (RRPVs) que contienen un gen que codifica las proteínas gag o env del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) o fragmentos inmunógenos de los mismos. Los genes gag y env útiles en la práctica de la presente invención pueden obtenerse por métodos bien conocidos en la materia. En una realización, se transcribe de forma inversa el ARN vírico utilizando transcriptasa inversa endógena o exógena y el ADN se hace bicatenario utilizando ADN-polimerasa. Los segmentos de ADN que codifican gag y env se recuperan a continuación por digestión con enzimas de restricción y se amplifican para su clonación en E. coli. En otra realización, células de gato infectadas con FIV sirven como fuente de ADN provírico del FIV. En esta realización, se aísla ADN cromosómico de las células, y se utilizan oligonucleótidos cebadores para amplificar específicamente los genes gag y env o fragmentos de los mismos utilizando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa. Esta estrategia es generalmente aplicable a la purificación de los genes gag y env de diferentes cepas y aislados del FIV, ya que pueden diseñarse cebadores a partir de regiones no polimórficas del genoma del FIV.
Los genes gag y env del FIV aislados con los métodos anteriores se insertan primero en un plásmido de transferencia y el plásmido recombinante se introduce en las células hospedadoras apropiadas que han sido previamente infectadas con un virus de la viruela del mapache. Como resultado, el ADN del plásmido de transferencia se incorpora en el ADN del virus de la viruela por recombinación homóloga, produciéndose los RRPVs que se liberan de las células.
El ADN que codifica las proteínas gag o env del FIV o fragmentos de las mismas se inserta en un plásmido de transferencia corriente abajo de un promotor del virus de la viruela. En una realización preferida, se utiliza el promotor temprano/tardío de la proteína de 7,5 kD del virus de la vacuna. Sin embargo, podrían utilizarse elementos promotores alternativos.
El plásmido de transferencia preferido también contiene un gen marcador de beta-galactosidasa, que permite la selección y detección de las secuencias de ADN del plásmido en los virus recombinantes. Los expertos en la materia apreciarán la posibilidad de utilizar otros genes marcadores adicionales, tales como el gen de la resistencia a la neomicina, el gen gpt de E. coli, u otros, en la práctica de la invención. Flanqueando el gen del FIV insertado y el gen del marcador seleccionable, se encuentran secuencias de ADN de la timidina-quinasa, que facilitan la integración de las secuencias de ADN del plásmido en el ADN del virus de la viruela del mapache por recombinación homóloga.
Los virus recombinantes que expresan los genes gag o env del FIV se preparan infectando primero una línea celular susceptible (tal como Vero [ATCC CCL 81], BSC-1 [ATCC CCL 26], RAT-2 [ATCC CRL 1764] o CRFK [ATCC CCL 94]) con virus de la viruela del mapache de tipo salvaje (ATCC VR-838 o cepas aisladas similares). El ADN del plásmido de transferencia que contiene el gen gag o env del FIV se utiliza después para transfectar las células infectadas utilizando transfección mediada por liposomas catiónicos, u otras técnicas adecuadas tales como electroporación o precipitación con fosfato de calcio. Los virus de la viruela del mapache incorporan el ADN del plásmido de transferencia por recombinación homóloga con las secuencias del gen de la timidina-quinasa presentes en el plásmido. Se deja transcurrir la infección vírica hasta que se observan efectos citopáticos en todas las células.
La incorporación del gen gag o env del FIV en el ADN del virus de la viruela se acompaña de la desactivación del gen vírico de la timidina-quinasa. De este modo, puede seleccionarse el virus recombinante atendiendo a la ausencia del gen de la timidina-quinasa; que se consigue por expansión selectiva en células RAT-2 (tk-, ATCC CRL 1764) en presencia de 5-bromodeoxiuridina. Los virus que contienen un gen inserto del plásmido de transferencia se identifican por el color azul de las placas cuando se cultivan en presencia de un sustrato cromogénico para la beta-galactosidasa, tal como X-gal.
Las placas víricas que sobreviven a los procedimientos de selección y cribado se someten a continuación a varios ciclos de purificación en placas. Después, la presencia de los genes gag o env se confirma por tecnología de reacción en cadena de la polimerasa, y la presencia del determinante antigénico gag o env se confirma por análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos. Los virus se denominan RRPV-FIV gag y RRPV-FIV env, respectivamente.
Pueden producirse RRPVs que expresan segmentos truncados de las proteínas gag y env del FIV. Las técnicas utilizadas para modificar los plásmidos de transferencia de modo que codifiquen secuencias parciales de env y gag son bien conocidas y de amplia difusión en la materia, como lo son los métodos para la producción y el cribado de RRPVs, como se detalla en la presente descripción. Por ejemplo, pueden utilizarse sitios adecuados de reconocimiento de enzimas de restricción para obtener fragmentos de cualquiera de ambos genes, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 1 más adelante. Alternativamente, la introducción de oligonucleótidos que contienen un codón de terminación en varios lugares del ADN de gag o env producirá un conjunto anidado de versiones del gen truncadas en el extremo carboxiterminal, que pueden incorporarse después en los RRPVs. Es más, las secuencias que codifican diferentes dominios de cada proteína pueden recombinarse, utilizando dominios procedentes de distintas cepas o aislados del FIV. El experto en la materia apreciará que el cribado sistemático de dichos RRPVs recombinantes puede determinar si es más preferible, en la práctica de la presente invención, la proteína intacta, subfragmentos de la misma o formas recombinantes de la misma procedentes de varias cepas. Es más, como se ha mencionado anteriormente, el ADN que codifica diferentes fragmentos de gag y env puede utilizarse en una vacuna combinada tras su incorporación en los mismos, o diferentes, RRPVs.
Para preparar la vacuna, se cultivan células susceptibles en medio mínimo esencial que contiene suero de ternero fetal o un sucedáneo adecuado de medio de cultivo. Las células se infectan con virus recombinante de la viruela del mapache a una multiplicidad de infección de 0,1 unidades infecciosas/célula, o menos. En la presente descripción una unidad infecciosa se define como una dosis infecciosa en cultivo de tejidos (TCID_{50}), una cantidad de virus que origina un 50% de infección en las condiciones definidas. Cuando se observan efectos citopatológicos en >90% de las células, se recogen las células infectadas y los líquidos extracelulares. El virus puede almacenarse congelado (a -50ºC o menos) o liofilizado hasta el momento de su utilización. Pueden añadirse compuestos tales como NZ-amina, dextrosa, gelatina u otros, adecuados para estabilizar el virus durante la congelación y liofilización. El virus puede concentrarse utilizando equipo comercial.
Típicamente, la concentración del virus en la formulación de vacuna será de un mínimo de 10^{6,5} TCID_{50} por dosis, pero se situará típicamente en el intervalo de 10^{7,0} a 10^{9,0} TCID_{50} por dosis. En el momento de la vacunación, el virus se descongela (si estaba congelado) o se reconstituye (si estaba liofilizado) con un excipiente aceptable desde el punto de vista fisiológico, tal como agua desionizada, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, o similares.
En una realización, un adyuvante aceptable desde el punto de vista fisiológico tal como, por ejemplo, EMA31, Adyuvante A, o combinaciones de los mismos, se añade a la formulación de vacuna. Ejemplos no limitantes de adyuvantes adecuados incluyen escualano y escualeno (u otros aceites de origen animal); copolímeros en bloque tales como Pluronic^{®} (L121) Saponin; detergentes tales como Tween^{®}-80; Quil^{®} A, aceites minerales tales como Drakeol^{®} o Marcol^{®}, aceites vegetales tales como aceite de cacahuete; adyuvantes derivados de Corynebacterium tales como Corynebacterium parvum; adyuvantes derivados de Propionibacterium tales como Propionibacterium acne; Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette y Guerinn, o BCG); interleucinas tales como interleucina 2 e interleucina-12; monocinas tales como interleucina 1; factor de necrosis tumoral; interferones tales como interferón gamma; combinaciones tales como saponina-hidróxido de aluminio o Quil^{®}-A hidróxido de aluminio; liposomas; adyuvante ISCOM; extracto de pared celular de micobacterias; glucopéptidos sintéticos tales como muramil-dipéptidos u otros derivados; Avridina; Lipid A; sulfato de dextrano; DEAE-Dextrano o DEAE-Dextrano con fosfato de aluminio; carboxipolimetileno, tales como Carbopol^{®}; EMA; emulsiones de copolímeros acrílicos tales como Neocryl^{®} A640 (por ejemplo, la patente U.S. nº 5.047.238); proteínas del virus de la vacuna o del virus de la viruela de animales; adyuvantes con partículas subvíricas tales como orbivirus; toxina del cólera; bromuro de dimetildiocledecilamonio; o mezclas de los mismos.
El EMA 31 (Monsanto, St. Louis, MO) es un copolímero lineal de etileno/maleico con cantidades aproximadamente iguales de etileno y anhídrido maleico, que tiene un peso molecular promedio estimado de aproximadamente 75.000 a 100.000. El Adyuvante A es un adyuvante que comprende un copolímero en bloque, tal como un copolímero en bloque de polioxipropileno-polioxietileno (POP-POE), preferiblemente Pluronic^{®} L121 (por ejemplo, la patente U.S. nº 4.772.466), y un componente orgánico, tal como un aceite metabolizable, por ejemplo, un hidrocarburo de trementina no saturado, preferiblemente escualano (2,6,10,15,19,23-hexametiltetracosano) o escualeno. La vacuna puede incluir también un detergente o tensioactivo no iónicos, preferiblemente un monooleato de polioxietileno sorbitano tal como un detergente Tween^{®}, lo más preferiblemente Tween^{®}-80, es decir, monooleato de polioxietileno (20) sorbitano.
En esta mezcla de adyuvantes, el copolímero en bloque, aceite orgánico y tensioactivo pueden estar presentes en cantidades desde aproximadamente 10 a aproximadamente 40 ml/l, de aproximadamente 20 a aproximadamente 80 ml/l, y de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 6,5 ml/l, respectivamente. En una realización preferida del adyuvante de reserva, el componente orgánico es escualano presente en una cantidad de aproximadamente 40 ml/l, el tensioactivo es monooleato de polioxietilenosorbitano (Tween^{®}-80) presente en una cantidad de aproximadamente 3,2 ml/l, y el copolímero en bloque POP-POE es Pluronic^{®} L121 presente en una cantidad de aproximadamente 20 ml/l. El Pluronic^{®} L121 es un copolímero líquido a 15-40ºC, en el que el componente de polioxipropileno (POP) tiene un peso molecular de 3250 a 4000 y el componente de polioxietileno (POE) comprende aproximadamente 10-20%, preferiblemente 10%, de la molécula total.
Los virus individuales de la viruela del mapache que expresan los genes gag o env pueden mezclarse juntos para la vacunación. Es más, el virus puede mezclarse con otros virus, bacterias u hongos, inactivados o atenuados, o con inmunógenos derivados de virus, bacterias u hongos, tales como el virus de la leucemia felina, virus de la panleucopenia felina, virus de la rinotraqueitis felina, calcivirus felino, virus de la peritonitis infecciosa felina, Chlamydia psittaci felina, Microsporum canis, u otros. Además, los antígenos de los organismos citados anteriormente pueden incorporarse en vacunas combinadas. Estos antígenos pueden purificarse a partir de fuentes naturales o de sistemas de expresión recombinantes, o pueden comprender subunidades individuales del antígeno o péptidos sintéticos derivados de los mismos.
En una realización adicional de la presente invención, pueden incorporarse lisados de células infectadas con el virus RRPV, vivo o inactivado, en liposomas o pueden encapsularse en microcápsulas de péptidos, proteínas o polisacáridos antes de su administración, utilizando medios conocidos en la materia. La vacuna de la presente invención se administra a gatos en volúmenes de 0,5 a 5 mililitros. La vacuna puede administrarse a gatos por vía subcutánea, intramuscular, oral, intradérmica o intranasal. Pueden variarse el número de inyecciones y su distribución temporal. Una a tres vacunaciones administradas a intervalos de una a tres semanas son normalmente eficaces.
La eficacia de las vacunas de la presente invención se valora por medio de los siguientes métodos. Aproximadamente un mes tras la vacunación final se administra a los animales vacunados y a los testigos una prueba de provocación con 3-20 unidades ID_{50} para gatos, preferiblemente 5 unidades ID_{50} para gatos, del FIV, preferiblemente la cepa aislada NCSU1 (ATCC VR-2333). Se extrae sangre completa de los animales inmediatamente antes de la prueba de provocación y a intervalos después de la prueba de provocación, para la medición de a) viremia y b) cantidades relativas de linfocitos CD4 y CD8.
La viremia se mide aislando células mononucleares de la sangre, y cultivando conjuntamente las células con células mononucleares de animales no infectados. Tras 7 días en cultivo, se analizan los sobrenadantes del cultivo para verificar la presencia del FIV mediante inmunoensayo ligado a enzimas (Véase el Ejemplo 5 más adelante).
La relación de linfocitos CD4 a CD8 en la sangre circulante de los animales vacunados y de los testigos se considera una medida de la función inmunitaria. Típicamente, la infección por FIV provoca una inversión de la relación normal de CD4:CD8, de aproximadamente 1,5-4,0, a una relación patológica de aproximadamente 0,5-1,0. Los números de linfocitos CD4 y CD8 se miden por citometría de flujo, utilizando anticuerpos específicos (Véase el Ejemplo 5 más adelante).
Otra medida de la función inmunitaria consiste en administrar una prueba de provocación, a animales vacunados y testigos, con Toxoplasma gondii a los 6-12 meses tras la vacunación final con RRPV-FIV. Normalmente, la intensidad de los síntomas de la enfermedad provocada por T. gondii aparece considerablemente exacerbada en los gatos infectados con FIV, en comparación con los gatos no infectados. La intensidad del efecto de T. gondii se determina mediante la puntuación de la secreción ocular, rinorrea, disnea y fiebre.
Se entiende que la mejora de cualquiera de los síntomas de la infección por FIV es un objetivo clínico deseable, e incluye la disminución de la dosis de medicación utilizada para tratar los síntomas provocados por el FIV.
Los siguientes ejemplos tienen por objeto ilustrar la presente invención sin limitación de la misma.
Ejemplo 1 Clonación de los genes gag y env del FIV A. Aislamiento del ADN vírico
La cepa NCSU-1 del FIV (denominada "FIV-NCSU-1") se aisló a partir de un gato infectado de forma natural que era negativo al virus de la leucemia felina, y ha sido descrita previamente (Tompkins et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 199: 1311, 1991). El virus se propagó en un gato normal exento de patógenos específicos (SPF) (obtenido de Liberty Laboratories, Waverly, N.Y.). Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) infectadas con FIV a partir de la sangre completa por separación en gradientes discontinuos de Percoll. Brevemente, se depositó una capa de sangre completa con anticoagulante sobre un gradiente de dos etapas que contenía Percoll™ al 43% (Pharmacia, Piscataway, N.J.) sobre Percoll™ al 62,5% en NaCl 0,15 M. Los gradientes se centrifugaron a 400 x g durante 5 minutos, seguido por 800 x g durante 20 minutos a 22ºC. Las PBMC se recogieron de la interfase entre gradientes y se lavaron en solución salina tamponada con fosfato que contenía suero de ternero fetal al 5%. De forma paralela, se aislaron las PBMCs de gatos normales.
El FIV se propagó mediante co-cultivo de las PBMCs procedentes de un gato infectado con FIV con PBMCs de gatos normales. Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contenía suero de ternero fetal al 10%,
2,5 x 10^{-5} de beta-mercaptoetanol, L-glutamina 2 mM, 5 \mug/ml de concanavalina A, y 20% de medio condicionado de células MLA (ATCC TIB 201) como fuente de interleucina-2 (IL-2).
Se aisló el ADN genómico de gato que contenía las secuencias províricas del FIV-NCSU-1 a partir de PBMCs cultivadas por lisis de las células con dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,6% en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 10 mM, seguido por precipitación del ADN cromosómico por incubación durante toda la noche con NaCl 1 mM. El ADN se recuperó por centrifugación a 10.000 r.p.m. (Beckman J2, rotor JA-20) durante 40 minutos. El sedimento de ADN se resuspendió en una solución que contenía tampón Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 10 mM, SDS al 0,1% y se digirió con ribonucleasa A (20 \mug/ml) y proteinasa K (0,2 mg/ml) a 50ºC durante 4 horas. Después se purificó el ADN por extracción sucesiva con fenol, fenol:cloroformo (1:1) y cloroformo, y se recuperó en forma pura tras precipitación con etanol.
B. Clonación del gen de la cubierta del FIV
Las secuencias de ADN de la cubierta del FIV-NCSU-1 se clonaron utilizando métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la siguiente manera:
Fragmento de la cubierta A
Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para amplificar el segmento proximal 5' del gen env.
5'-TCGGATCCAACAATAATTATGGCAGAAGG-3' [SEC. ID. nº 1] (Cadena codificante, 6252-V)
5'-AATCAGGTACAAAGTCACCGTTC-3' [SEC. ID. nº 2] (Cadena complementaria, 6745-C)
El cebador 6252-V corresponde a los nucleótidos 6252-6273 de la cepa PPR del FIV (GenBank nº M36968) y el cebador 6745-C (región subrayada) corresponde a los nucleótidos 6723-6745 de la cepa 14 del FIV (GenBank
nº 25381). El codón de iniciación para la traducción de la proteína de la cubierta está incluido en el cebador 6252-V. El cebador 6252-V tiene también un sitio sintético para la enzima de restricción BamHl cerca del extremo 5', para facilitar la clonación. Asimismo, un sitio Avrll situado en la posición 6719 facilita la clonación. El fragmento de la cubierta A tienen una longitud de 494 pb.
Fragmento de la cubierta B
Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para amplificar el segmento medio del gen env.
5'-TATAGAAGCACCCCAAGAAGAG-3' [SEC. ID. nº 3] (Cadena codificante, 6637-V)
5'-CATTCCCCCAAAGTTATATTTC-3' [SEC. ID. nº 4] (Cadena complementaria, 8469-C)
Los cebadores 6637-V y 8469-C corresponden a los nucleótidos 6637-6659 y 8448-8469 de la cepa 14 del FIV, respectivamente. Un sitio Avrll en la posición 6719 y un sitio Spel en la posición 8288 facilitaron la clonación. El fragmento de la cubierta B tiene una longitud de 1833 pb.
Fragmento de la cubierta C
Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos para amplificar el segmento 3' distal fragmento del gen env.
5'-TTAGTTACATTAGAGCATCAAG-3' [SEC. ID. nº 5] (Cadena codificante, 8264-V)
5'-TTCTAGATCTTCAGGGTCCCAATACTC-3' [SEC. ID. nº 6] (Cadena complementaria, 9145-C)
El cebador 8264-V corresponde a los nucleótidos 8264-8285 del FIV cepa 14, y el cebador 9145-C (región subrayada) corresponde a los nucleótidos 9126-9145 de la cepa PPR del FIV. El cebador 9145-C tiene un sitio Bglll sintético cerca del extremo 5', para facilitar la clonación. Un sitio Spel situado en la posición 8288 también facilitó la clonación. El fragmento de la cubierta C tiene una longitud de 880 pb.
En cada caso, se realizó la PCR durante 35 ciclos de 1 min 30 s a 94ºC, 2 min a 56ºC, y 2 min a 72ºC, seguido por un ciclo de 8 min a 72ºC. Cada fragmento de la cubierta se aisló por electroforesis en gel y se clonó en el plásmido pSL1190 utilizando métodos estándar (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Press).
Inicialmente, cada fragmento se clonó en pSL1190 y después se empalmaron juntos los tres fragmentos para formar un gen de la cubierta de longitud completa. Para ello, el plásmido de la cubierta A se digirió con BamHl y Avrlll, el plásmido de la cubierta B se digirió con Avrll y Spel, y el plásmido de la cubierta C se digirió con Spel y Bglll. Después, el fragmento de la cubierta B, cortado con Avrll/Spel, de 1,5 kpb, se ligó en pSL-EnvA que se había digerido con Avrll y Spel para crear el pSL-EnvAB (Figura 1). El fragmento envAB codifica toda la proteína de membrana superficial (SU) y los primeros 63 aminoácidos del extremo aminoterminal de la proteína transmembranal (TM) del FIV-NCSU-1, es decir, los aminoácidos 1-735 de env. Sin embargo, el envAB no contiene el dominio transmembranal (TM).
A continuación, el fragmento de la cubierta C, cortado con Spel/Smal, de 0,9 kpb, del pSL-EnvC se ligó en pSL-EnvAB que se había digerido con Spel y BbrPl, para crear pSL-EnvABC o pSL-WEnv (Figura 1). El fragmento WEnv codifica todo el marco de lectura abierto de env (proteínas SU y TM) del FIV-NCSU-1 (Figura 2).
Los elementos genéticos subclonados del FIV-NCSU-1 se secuenciaron utilizando Sequenase Versión 2.0 (United States Biochemical, Cleveland, OH) como se describe para el caso de ADN bicatenario, y las reacciones se analizaron utilizando el secuenciador automático ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se secuenciaron ambas cadenas de ADN para confirmar los resultados. Las secuencias de ADN se analizaron utilizando el software de análisis de ADN MacVector (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT). Las secuencias de ADN de env se analizaron en lo relativo a marcos de lectura abiertos y se compararon con las secuencias de ADN, previamente publicadas, de otros aislados del FIV. La secuencia de ADN y la secuencia prevista de aminoácidos de los marcos de lectura abiertos de env y envAB del FIV-NCSU-1 se muestran en la Figura 3.
C. Clonación del gen GAG del FIV
El gen gag del FIV-NCSU_{1}, se amplificó utilizando PCR y los siguientes oligonucleótido cebadores:
5'-CAATTCTAGAGAGACTCTACAGCAACATG-3' [SEC. ID. nº 7] (Cadena codificante, 610-V)
5'-TAATAGATCTGGCCTCTTTTCTAATGATG-3' [SEC. ID. nº 8] (Cadena complementaria, 2026-C)
Los cebadores 610-V y 2026-C corresponden a los nucleótidos 610-630 y 2005-2026 de la cepa 14 del FIV, respectivamente. Los cebadores 610-V y 2026-C tienen sitios para las enzimas de restricción Xbal y Bglll, respectivamente, cerca de los extremos 5', para facilitar la clonación. Los últimos tres nucleótidos del cebador 610-V corresponden al codón de iniciación de la traducción de la proteína gag. Se llevó a cabo la PCR durante 35 ciclos de 1 min 30 s a 94ºC, 2 min a 56ºC, y 2 min a 72ºC, seguido por un ciclo de 4 min a 72ºC. El fragmento de ADN de 1,4 kpb que contenía el gen gag se purificó por electroforesis en gel y se clonó en el sitio Xbal/Bglll del pSL1190, para formar pSL-WGag (Figura 4). La secuencia de ADN del gag del FIV-NCSU-1 se muestra en la Figura 5.
Ejemplo 2 Preparación de virus recombinantes de la viruela del mapache A. Construcción de plásmidos de transferencia del virus de la viruela del mapache
Las secuencias de ADN que codifican gag, env y envAB, aisladas como se ha descrito en el Ejemplo 1, se subclonaron por separado en el vector de transferencia del virus de la viruela pSC11. La secuencia del pSC11 se describe en la patente canadiense nº 2132374, que se incorpora en la presente memoria a título de referencia. Para ello, el fragmento Xbal/Bglll, de 1,4 kb, del pSL-WGag (Figura 6), el fragmento BamHl/Spil, de 2,9 kb, del pSL-WEnv (Figura 7) y el fragmento BamHl/Spel, de 2,1 kb, del pSL-EnvAB (Figura 8) se aislaron por separado y se hicieron romos con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa, y después se clonaron por separado en el sitio Smal del pSC11.
B. Preparación de virus recombinantes de la viruela del mapache
Se prepararon virus recombinantes de la viruela del mapache (RRPV) que portaban los genes gag y env del FIV como se ha descrito de modo general para los virus de la vacuna recombinantes (Mackett y Smith, J Gen Virol 67: 2067-2082, 1986) con algunas modificaciones. Se infectaron monocapas de células Vero (ATCC CCL 81) con un 80% de confluencia (aproximadamente 5 x 10^{6} células en placas de cultivo de tejidos de 100 mm) con virus de la viruela del mapache de tipo salvaje (ATCC VR-838) a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 TCID_{50}/célula en 2 ml de MEM (Medio mínimo esencial de Eagle (Gibco BRL #410-1500) que contenía 0,05% de hidrolizado de lactoalbúmina y 15 mg/ml de sulfato de gentamicina, con el pH ajustado a 7,2 con bicarbonato de sodio) durante 30-60 minutos a 37ºC. Las células se transfectaron después con plásmidos de transferencia pSC11-FIV gag, pSC11-FIV env, o pSC11-FIV env AB por transfección mediada por liposomas catiónicos, utilizando Transfectam^{®} (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) siguiendo las instrucciones del fabricante. La mezcla de células/liposomas-ADN se incubó en 3 ml de MEM que contenía suero de ternero fetal (FBS) al 5% durante toda la noche a 37ºC (CO_{2} al 5%), y después se sustituyó el medio por 8 ml de MEM/FBS al 5%, recién preparado. Las células transfectadas se incubaron a 37ºC (CO_{2} al 5%) hasta que más del 80% de las células mostraron efectos citopáticos (aproximadamente 3-4 días). Después se extrajeron las células y el medios de cultivo (lisados de células infectadas con virus) de la placas y se sometieron a dos ciclos de congelación-descongelación antes de su almacenamiento a -70ºC.
C. Aislamiento de virus recombinante de la viruela del mapache que porta el gen gag del FIV
Se aíslan y purifican RRPV que portan el gen gag del FIV-NCSU1 (RRPV-FIV gag) a partir de células Vero transfectadas con pSC11-FIV gag mediante métodos estándar de ensayo de placas víricas. Se infectaron monocapas de células Vero (50-80% de confluencia) en placas de cultivo de tejidos de 100 mm con 2 ml de diluciones sucesivas de 10 veces (10^{-1} a 10^{-3} en MEM) de los lisados de células infectadas con virus. Tras incubar durante 1 hora a 37ºC, se extrajeron los medios y se aplicó sobre las células infectadas una capa de 8-10 ml de agar de Noble al 1,25% que contenía MEM/FBS al 5%. Las células infectadas se incubaron después durante 3-4 días a 37ºC (CO_{2} al 5%), se aplicó una vez más otra capa de 4 ml de agar de Noble al 1,25% que contenía 0,5X PBS y 600 \mug/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido (X-gal, United States Biochemical, Cleveland, Ohio). Las placas se incubaron a 37ºC (CO_{2} al 5%) durante 4-16 horas, hasta que se observaron placas víricas azules (positivas a la \beta-galactosidasa). Se tomaron placas víricas recombinantes con ayuda de agujas romas estériles acopladas a una jeringa de 1 ml (cc), se resuspendieron en 0,5 ml de tripsina 0,25 mg/ml, se agitaron vigorosamente en un vórtex y se incubaron a 37ºC durante 15-30 minutos. Las placas víricas extraídas se inocularon a continuación en 5 x 10^{5} células Vero en matraces T de 25 cm^{2} y se incubaron a 37ºC (CO_{2} al 5%) hasta que se observó más del 80% de CPE. Los lisados de células infectadas con virus que contenían el RRPV-FIV gag se sometieron a dos ciclos de congelación-descongelación y se almacenaron a -70ºC. Se seleccionaron cinco clones individuales del RRPV-FIV gag y se purificaron por placas cuatro veces, como se ha descrito anteriormente.
D. Aislamiento del virus recombinante de la viruela del mapache que porta el gen envAB del FIV
Se aislaron y purificaron RRPV que portaban el gen envAB del FIV-NCSU_{1} (RRPV-FIV envAB) a partir de células Vero transfectadas con pSC11-FIV envAB utilizando los métodos descritos para el caso del RRPV-FIV gag con algunas pequeñas modificaciones. Se seleccionaron virus de la viruela del mapache carentes de timidina-quinasa (tk-) a partir de lisados iniciales de células infectadas con virus, en células Rat-2 tk- (ATCC CRL 1764). Esto se llevó a cabo inoculando 1 ml del lisado inicial de células infectadas con virus en una monocapa de células Rat-2 en un matraz T de 75 cm^{2} (aproximadamente 5 x 10^{6} células) que contenía 5-bromodeoxiuridina (BrdU) a 30 \mug/ml en MEM. La monocapa infectada se incubó a 37ºC (CO_{2} al 5%) durante 3-4 días hasta que se observó más del 70% de CPE. Los lisados de células infectadas con virus tk- se sometieron a dos ciclos de congelación-descongelación dos veces y se almacenaron a -70ºC. Se aislaron y purificaron RRPV-FIV envAB a partir de los lisados de células infectadas con virus tk-, mediante el ensayo estándar de placas víricas, como se ha descrito anteriormente para el caso del RRPV-FIV gag en células Vero. Se seleccionaron cinco clones individuales del RRPV-FIV env AB y se purificaron por placas cinco veces
Ejemplo 3 Características de los virus recombinantes de la viruela del mapache que expresan el FIV A. Confirmación de la presencia de los genes gag y envAB del FIV en los RRPV por reacción en cadena de la polimerasa
La presencia de los genes gag y envAB del FIV en los RRPVs se confirmó utilizando PCR. Se incubaron 90 \mul de un lisado de células infectadas con virus con 10 \mul de tampón de lisis para PCR 10X (1X; tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, con KCI 50 mM, MgCl_{2} 2,5 mM, Tween 20 al 0,5%, 0,3 mg/ml de proteinasa K) durante 16 horas a 50ºC, después se hirvió durante 10 minutos. Se utilizaron 10 \mul de este lisado como molde en la reacción de PCR. La PCR se llevó a cabo en 100 \mul de tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, que contenía KCl 50 mM, 200 uM de cada dNTP, MgCl_{2} 1,5 mM, 30 pmol de cada cebador, y 2,5 unidades de ADN-polimerasa AmpliTaq^{®} (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT). Los cebadores utilizados en la PCR para el gag del FIV fueron:
5'-TATGGAAAAGGCAAGAGAAGGAC-3' [SEC. ID. nº 9]
5'-TCGAGATACCATGCTCTACACTG-3' [SEC. ID. nº 10]
\newpage
que corresponden a los nucleótidos 471-493 y 763-785 del marco de lectura abierto del gag del FIV, respectivamente. Los cebadores utilizados en la PCR para el envAB del FIV fueron:
5'-TATGGAAAAGATGGGATGAGACTA-3' [SEC. ID. nº 15]
5'-GTCACTTACCTTCATAGTAAACC-3' [SEC. ID. nº 16]
que corresponden a los nucleótidos 857-880 y 1513-1535 del marco de lectura abierto del env del FIV, respectivamente. Las amplificaciones de la PCR se realizaron en un termociclador de ADN (Perkin-Elmer Cetus) calentando primero las mezclas de reacción a 94ºC para la desnaturalización, y aplicando después 35 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 55ºC, y 2 minutos a 72ºC, y una incubación final de 8 minutos a 72ºC. Se analizaron 10 \mul de los productos de la PCR por electroforesis en un gel horizontal-sumergido de agarosa NuSieve^{®} al 4% (FMC BioProducts, Rockland, ME) en tampón TAE (base Tris 40 mM, acetato de sodio al 20 mM, EDTA 1 mM, pH 7,2) aplicando 5 V/cm durante 1-2 horas, y tiñendo con bromuro de etidio. Las amplificaciones de la PCR con los cebadores gag y env del FIV dieron como resultado los fragmentos de ADN esperados de 314 y 678 nucleótidos, respectivamente. Las amplificaciones de la PCR utilizando los plásmidos de trasferencia pSC11 FIV gag y envAB sirvieron de testigos positivos. Las amplificaciones de la PCR utilizando lisados de células Vero infectadas con el virus de la viruela del mapache de tipo salvaje sirvieron de testigo negativo.
B. Confirmación de la expresión de las proteínas gag y envAB del RRPV FIV por análisis de inmunoelectrotransferencia
Se infectaron monocapas confluentes de células Vero en un matraz T de 25 cm^{2} (1-2 x 10^{6} células) con clones de RRPV-FIV gag o de RRPV-FIV envAB a una M.O.I. de 1 a 10 TCID_{50} por célula. Las células infectadas se incubaron a 37ºC (CO_{2} al 5%) durante 2-3 días hasta que se observó aproximadamente 80% de CPE. Se añadieron 20 \mul del lisado de células infectadas con virus a 5 \mul de tampón de muestra de Laemmli 5X (tampón Tris-HCl 0,3 M, pH 6,8, con SDS al 5%, glicerol al 50%, azul de bromofenol al 0,4% y 2-mercaptoetanol al 3%) y se calentó a 95ºC durante 5 minutos. Las muestras de proteína desnaturalizadas se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, utilizando un gel con gradiente de poliacrilamida al 4-15% (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Press). Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) mediante electrotransferencia, utilizando un aparato de transferencia Bio-Rad siguiendo las instrucciones del fabricante. La transferencia se realizó en tampón Tris-HCl 25 mM, con glicina 0,2 M y metanol al 20%, durante 45 minutos a 50 V con corriente continua.
Después se analizó la transferencia en busca de las proteínas gag y envAB del FIV por análisis de inmunotransferencia, como se ha descrito anteriormente (Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986, Elsevier Science Publishing Company, Nueva York, N.Y.) con algunas pequeñas modificaciones. Después de la transferencia, el filtro de nitrocelulosa se lavó con solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, que contenía Tween-20 al 0,1% (PBS-TW), y los sitios no específicos se bloquearon incubando la transferencia en PBS que contenía seroalbúmina bovina al 1% (PBS-BSA) a 4ºC durante toda la noche, seguido por un lavado de 15 minutos PBS-TW. La transferencia se incubó después durante 30 minutos a temperatura ambiente con IgG caprina anti-FIV diluida 1:100 en PBS-TW que contenía BSA 1% (PBS-TW-BSA), seguido por cuatro lavados de 5 minutos en PBS-TW. A continuación, la transferencia se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente con un anticuerpo murino contra la IgG caprina, marcado con biotina (anticuerpo secundario) (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) diluido 1:2000 en PBS-TW-BSA, seguido por cuatro lavados de 5 minutos en PBS-TW. Los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron incubando la transferencia durante 30 minutos a temperatura ambiente con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.) diluida 1:1000 en PBS-TW, seguido por cuatro lavados de 5 minutos en PBS-TW, y visualizando con sustrato cromógeno de peroxidasa (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.). Se utilizaron lisados de células Vero infectadas con el FIV y con el virus de la viruela del mapache de tipo salvaje, purificados en gradiente de sacarosa, como testigos positivo y negativo del análisis de inmunotransferencia, respectivamente.
Los anticuerpos caprinos anti-FIV se prepararon como sigue. El FIV NCSU_{1} se cultivó en linfocitos de sangre periférica y se concentró utilizando un aparato de fibra hueca hasta una concentración de aproximadamente 10^{6} TCID_{50}/ml. La reserva de virus concentrada se mezcló con un adyuvante oleaginoso tal como OW3 en una relación de 1:1 (v:v), y la emulsión se utilizó para inocular cabras seis veces, a intervalos de 3-4 semanas. A intervalos mensuales, se extrajo la sangre de las cabras y se analizó el suero para verificar la presencia de anticuerpos anti-FIV.
C. Confirmación de la expresión de las proteínas gag y envAB del RRPV FIV por ensayo de inmunofluorescencia
Se infectan monocapas confluentes de células Vero en placas de 96 pocillos (1-2 x 10^{4} células/pocillo) con clones de RRPV-FIV gag o de RRPV-FIV envAB a una multiplicidad de infección de 0,1 a 1,0 unidades formadoras de placas por célula. Las células infectadas con el RCNV de tipo salvaje sirven como testigo negativo. Las células infectadas se incuban a 37ºC (CO_{2} al 5%) durante 1 día hasta que se observa aproximadamente 20% de CPE. Las células se lavan después tres veces con PBS y se fijan con acetona al 80% a 4ºC durante diez minutos. A continuación, las células se rehidratan con PBS y se incuban con un anticuerpo monoclonal (IgG) contra las proteínas de membrana superficiales gag o env del FIV durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los complejos de antígeno FIV/anticuerpo FIV se detectan utilizando un anticuerpo caprino contra la IgG murina, conjugado con FITC (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD) y microscopía de fluorescencia.
D. Titulación del virus de la viruela del mapache
Las preparaciones de virus se sometieron a un tratmiento previo por dilución en el mismo volumen con tripsina al 0,5% e incubación a 37ºC durante 30 minutos, con el objeto de liberar los virus de las inclusiones. Después se prepararon diluciones sucesivas (de 10 veces) de virus en MEM y se inocularon (100 \mul/pocillo) por quintuplicado en células Vero (1 x 10^{4} células en 100 \mul por pocillo) en una placa de 96 pocillos. Las placas se incubaron durante 3-5 días a 37ºC (CO_{2} al 5%) y se observaron en busca de signos citopatológicos típicos del virus de la viruela del mapache. Se calcularon los títulos de infectividad vírica como 50% de los puntos finales, sobre la base de los efectos citopatológicos, utilizando los métodos de Reed y Muench (Reed y Muench, The American Journal of Hygiene 27: 493, 1938).
Ejemplo 4 Preparación de vacunas basadas en virus de la viruela recombinantes A. Preparación de reservas maestras de virus RRPV-FIV gag y envAB
Se seleccionó un único clon de cada virus recombinante que mostraba una expresión significativa de proteína recombinante (según el método descrito en el Ejemplo 3 anterior) para su expansión a gran escala y para servir de reserva maestra del virus. Todas las expansiones y titulaciones de virus recombinantes se realizaron en células Vero en MEM que contenía FBS al 2,5%. Cada clon de virus purificado en placas se expandió inoculando una monocapa de células Vero confluentes en un matraz T de 150 cm^{2} (1 x 10^{7} células) con 1 ml de lisado de células infectadas con virus (aproximadamente 10^{7} partículas de virus infeccioso), e incubando a 37ºC (CO_{2} al 5%) hasta que se observó 100% de CPE (2-3 días). Este lisado de células infectadas con virus sirvió de reserva pre-maestra de virus y se utilizó para obtener la reserva maestra de virus. La reserva premaestra de cada virus recombinante se tituló en células Vero y se determinó la TCID_{50}. Las reservas maestras de los virus RRPV-FIV gag y RRPV-FIV envAB se cultivaron en células Vero utilizando una MOI de 0,01 y 0,1, respectivamente. Se infectaron tres botellas rodantes de células Vero confluentes para cada una de las reservas maestras de los virus, utilizando medio MEM enriquecido con suero de ternero fetal al 2,5% y se incubaron durante aproximadamente 3 días a 37ºC. Se recogieron los líquidos sobrenadantes de cultivos infectados, y las reservas de virus se dividieron en partes alícuotas en ampollas de 1,5 ml, que se sellaron y almacenaron en un congelador de nitrógeno líquido.
B. Preparación de vacunas
Se sembraron células Vero (3 x 10^{7}) en botellas rodantes de 850 cm^{2} en 200 ml de medio de cultivo (MEM con hidrolizado de lactoalbúmina al 0,5% y suero de ternero fetal al 5%, termoinactivado) y se incubaron durante 18 horas a 37ºC. Al día siguiente, se eliminó el medio de las células y se sustituyó con 50 ml de RRPV-FIV gag a una multiplicidad de infección de 0,01 en medio de infección (MEM con LAH al 0,5% y suero de ternero fetal al 2,5%, termoinactivado). Se utilizó el virus del cuarto pase tras la preparación de la reserva maestra. Se dejó absorber el virus a las células durante 30 minutos a 37ºC, y después se ajustó el volumen del medio hasta 150 ml por botella rodante. Las botellas rodantes se incubaron a 37ºC hasta que se puso de manifiesto el 100% de la citopatología (3 días). A continuación se preparó un lisado de células infectadas con virus y se almacenó congelado (-70ºC.). Se comprobó que el título del virus RRPV-FIV gag era 10^{7,4} TCID_{50}/ml.
Los virus recombinantes de la viruela del mapache que expresan el fragmento del gen envAB del FIV se prepararon del mismo modo, con la excepción de que se utilizó una multiplicidad de infección de 0,1. El virus estaba en el cuarto pase tras la preparación de la reserva maestra. La preparación de RRPV-FIV envAB se tituló y se comprobó que contenía 10^{6,4} TCID_{50}/ml.
El virus de la viruela del mapache de tipo salvaje se cultivó utilizando los mismos métodos, como se ha descrito anteriormente. Se comprobó que esta preparación de virus contenía 10^{7,7} TCID_{50}/ml.
Ejemplo 5 Prueba de la eficacia de las vacunas contra el FIV basadas en los virus de la viruela recombinantes A. Vacunación
Se utilizaron treinta gatos de 6-7 meses de edad (exentos de patógenos específicos, Harlan Sprague Dawley, Madison, WI), quince machos y quince hembras. Los gatos se dividieron en seis grupos y se vacunaron dos veces, con un intervalo de 21 días, como se indica a continuación:
TABLA 1 Asignación de grupos para la Vacunación
1
B. Diseño experimental
Se vacunaron veinticinco gatos con vacunas del virus recombinante de la viruela del mapache como se indica en la Tabla 1. A cinco gatos se les administró un título similar de virus de la viruela del mapache de tipo salvaje, como testigos negativos. Se administraron dos vacunaciones separadas por un intervalo de 21 días. Las vacunaciones subcutáneas se administraron en la nuca, y las vacunaciones intramusculares se administraron en la parte trasera del muslo. Cuatro semanas después de la segunda vacunación se administró a todos los gatos una prueba de provocación con la cepa NCSU-1 del FIV y se controlaron la viremia y los indicios de cambios en la población de linfocitos, como se describe más adelante. Once meses después de la prueba de provocación con FIV, se administró una prueba de provocación con Toxoplasma gondii a los gatos de los Grupos 1, 2, 3, 4 y 6, y se controlaron durante 48 días los signos clínicos de la enfermedad.
C. Prueba de provocación con FIV
Cuatro semanas después de la segunda vacunación, se administró a todos los gatos una prueba de provocación por vía subcutánea con 10 unidades ID_{50} para gatos de la cepa aislada NCSU_{1} del FIV (dilución 1:1000 del lote #021891). Se extrajo sangre completa de los gatos antes de la prueba de provocación, y periódicamente tras la prueba de provocación, para evaluar los parámetros de la infección vírica de la siguiente forma:
1. Detección de la viremia
El aislamiento del FIV del cultivo se realizó como se ha descrito previamente (Wasmoen et al., Vet. Immuno. Immunopath. 35:83 1992). Las células mononucleares se aislaron a partir de sangre completa utilizando gradientes de Percoll™ (Pharmacia Biotech, Piscataway N.J.). Se cultivaron 5 x 10^{5} células, procedentes de los gatos a los que se había administrado una prueba de provocación con FIV, con 1 x 10^{6} células mononucleares aisladas a partir de gatos no infectados. Los cultivos recibieron medio RPMI cada 7 días y los sobrenadantes se analizaron en busca de la presencia del FIV mediante un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) que detecta el antígeno p25 del FIV (Petcheck ELISA, IDEXX, Portland ME).
2. Subconjuntos de linfocitos
Los linfocitos se aislaron a partir de sangre completa utilizando Histopaque™ (Sigma Chemical Company, St. Louis MO) y se cuantificaron los subconjuntos de linfocitos tiñendo las células con anticuerpos específicos para CD4 (anticuerpo monoclonal CAT30A), CD8 (anticuerpo monoclonal FLSM 3.357), linfocitos pan-T (anticuerpo monoclonal FLSM 1.572) o linfocitos B (contra la IgG de gato) seguido por análisis por FACS. Estos anticuerpos monoclonales se describen en otro lugar (Tompkins et al. Vet. Immunol. Immunopathol. 26:305, 1990) y el procedimiento de citometría de flujo es el mismo que se ha descrito anteriormente (R. V. English et al. J. Infect. Dis. 170:543, 1994). Se calcularon las relaciones CD4:CD8.
D. Prueba de provocación con Toxoplasma gondii
Se inocularon taquizoítos de la cepa ME49 de T. gondii, que habían permanecido congelados en glicerol al 10%, por vía intraperitoneal en ratones Swiss (Charles Rivers Laboratories) y se hicieron pases sucesivos en ratones según procedimientos publicados (Davidson et al., Am. J. Pathol. 143:1486, 1993). Los taquizoítos recogidos del líquido peritoneal de los ratones se contaron utilizando un hemocitómetro. Los gatos fueron tranquilizados utilizando clorhidrato de ketamina y se inocularon con 50.000 taquizoítos, recientemente recogidos, en la arteria carótida común derecha que había sido aislada quirúrgicamente. Se controlaron los signos clínicos de la enfermedad en los gatos, incluidas la secreción ocular, rinorrea, disnea, fiebre, depresión y pérdida de peso, durante 3 días antes de la inoculación con T. gondii y 48 días después de la misma.
Los signos clínicos tras la prueba de provocación con T. gondii se puntuaron de la siguiente manera:
2
E. Resultados
Un mes después de la inoculación con la cepa NCSU-1 del FIV, se comprobó que el 60% de los gatos testigo eran virémicos (Tabla 2). Los gatos vacunados con RRPV-FIV gag resultaron todos negativos para el FIV, el 40% de los gatos vacunados con RRPV-FIV envAB resultaron positivos al virus, y el 20% de los gatos vacunados con una combinación de estos dos virus fueron virémicos (Tabla 2). Por consiguiente, la capacidad de las vacunas de prueba de prevenir la viremia en este punto temporal variaba de 33% a 100% (Tabla 3).
Tres meses después de la prueba de provocación con FIV, se comprobó que el 80% de los gatos testigo resultaron positivos al virus (Tabla 2). De modo similar, el FIV pudo aislarse a partir de las células mononucleares de sangre periférica de casi todos los gatos vacunados, utilizando este método muy sensible (Tabla 2).
En lo que se refiere al estado inmunitario, el 80% de los gatos testigo presentó indicios de inversiones en la relación de linfocitos CD4:CD8 (es decir, relaciones menores de 1,0) a los tres meses (Tabla 2). En contraposición, sólo el 30% de los gatos vacunados con RRPV-gag presentaron indicios de inversiones CD4:CD8 significativas, y los animales vacunados con RRPV-FIV envAB estuvieron protegidos de modo similar de este cambio en el subconjunto de linfocitos (Tabla 2). Los gatos vacunados con una combinación de ambos virus recombinantes no presentaron diferencias significativas con los testigos (es decir, el 80% presentó inversiones CD4:CD8) a los 3 meses después de la prueba de provocación (Tabla 2).
A los 9 meses después de la prueba de provocación con FIV, el 100% de los gatos testigo resultaron infectados con FIV, y todos mostraron inversiones CD4:CD8 (Tabla 2). Un elevado porcentaje de los gatos vacunados resultaron también virémicos en este punto temporal. Sin embargo, sólo el 50% de los animales vacunados con RRPV-FIV gag y el 20% de los animales vacunados con RRPV-FIV envAB presentaron indicios de inversiones CD4:CD8 en este punto temporal. Por consiguiente, estas dos vacunas demostraron una capacidad significativa de prevenir cambios en la relación de linfocitos CD4:CD8 asociados a la infección por FIV, aunque los gatos parecían ser virémicos (Tabla 3).
Con el objeto de determinar si las inversiones en el subconjunto de linfocitos CD4:CD8 significaban un deterioro del sistema inmunitario de los gatos tras la infección por FIV (y viceversa, que la falta de inversión en los animales vacunados significaba el mantenimiento de la función inmunitaria), se administró a los gatos vacunados y a los gatos testigo (de los grupos 1, 2, 3, 4 y 6) una prueba de provocación con Toxoplasma gondii. Este parásito provoca infecciones subclínicas en gatos normales, pero se ha descrito que provoca una enfermedad grave en gatos que son inmunodeficientes debido a infección por FIV (Davidson et al., Am. J. Pathol. 143:1486, 1993). Tras la prueba de provocación con T. gondii, los gatos testigo presentaron secreción ocular, rinorrea, disnea y fiebre. La puntuación clínica total promedio de los gatos testigo fue 15,6 (Tabla 4). En comparación, hubo una reducción del 41% en las puntuaciones de la enfermedad clínica en los gatos vacunados con RRPV-FIV gag, relacionada con las reducciones en los signos clínicos de secreción ocular y disnea (Tabla 4). El estado clínico tras la prueba de provocación con T. gondii fue aún menos grave en los gatos vacunados con RRPV-FIV envAB. Este grupo presentó una disminución del 92% en los signos oculares, una disminución del 75% en la rinorrea, una reducción del 73% en la disnea, y una disminución del 58% en las puntuaciones clínicas globales (Tabla 4). Es más, el 80% de los gatos testigo mostró pérdida de peso en los primeros 14 días tras la prueba de provocación, en comparación con una pérdida de peso de sólo 44% en los animales vacunados con RRPV-FIV gag y de 50% en los animales vacunados con V-FIV envAB. Por tanto, los gatos testigo eran más susceptibles a la inducción de la enfermedad por este patógeno oportunista que los gatos vacunados.
Estos datos sugieren que la vacunación alteró la progresión de la enfermedad causada por este virus (es decir, la inducción de la supresión inmunitaria). Así lo indican una menor tasa de inversiones CD4:CD8 en los gatos vacunados y una menor susceptibilidad a la infección por el patógeno oportunista T. gondii.
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3
4
5

Claims (16)

1. Virus recombinante de la viruela del mapache que tiene por lo menos un gen interno que comprende una secuencia de ADN que codifica un péptido que consta de los aminoácidos 1-735 de la proteína de la cubierta de un virus de la inmunodeficiencia felina (FIV).
2. Virus recombinante de la viruela del mapache según la reivindicación 1, en el que dicho gen interno codifica la proteína de la cubierta del FIV que tiene la secuencia aminoácida presentada en la SEC. ID. nº 12.
3. Virus recombinante de la viruela del mapache según la reivindicación 1, en el que dicho gen interno codifica los aminoácidos 1-735 de la proteína de la cubierta del FIV que tiene la secuencia aminoácida presentada en la SEC. ID. nº 12.
4. Vacuna que comprende el virus recombinante de la viruela del mapache según la reivindicación 1 y un excipiente o diluyente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
5. Vacuna según la reivindicación 4, que comprende además un adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
6. Vacuna según la reivindicación 4, en el que dicho gen interno codifica la proteína de la cubierta del FIV que tiene la secuencia aminoácida presentada en la SEC. ID. nº 12.
7. Vacuna según la reivindicación 4, en el que dicho gen interno codifica los aminoácidos 1-735 de la proteína de la cubierta del FIV que tiene la secuencia aminoácida presentada en la SEC. ID. nº 12.
8. Vacuna según la reivindicación 4, que comprende además immunógenos procedentes de virus seleccionados a partir del grupo formado por virus de la leucemia felina, virus de la panleucopenia felina, virus de la rinotraqueitis felina, calcivirus felino, virus de la peritonitis infecciosa felina, herpesvirus felino, coronavirus entérico felino, o mezclas de los mismos.
9. Vacuna según la reivindicación 4, que comprende además Chlamydia psittaci felina, Microsporum canis, inactivados o atenuados, o mezclas de los mismos.
10. Vacuna que comprende:
el virus recombinante de la viruela del mapache según la reivindicación 1;
un segundo virus recombinante de la viruela del mapache que tiene por lo menos un gen interno que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína gag del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), y
un excipiente o diluyente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
11. Vacuna según la reivindicación 10, que comprende además un adyuvante aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
12. Molécula de ADN aislada, que codifica los aminoácidos 1-735 de la proteína de la cubierta del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) según la SEC. ID. nº 12.
13. Molécula de ADN aislada, que codifica los aminoácidos 1-735 de la proteína de la cubierta del virus de la inmunodeficiencia felina (FIV) según la SEC. ID. nº 12, para su utilización en medicina.
14. Utilización del virus recombinante de la viruela del mapache según la reivindicación 1, en la preparación de una vacuna para la prevención o la paliación de la enfermedad causada por el virus de la inmunodeficiencia felina (FIV).
15. Utilización según la reivindicación 14, en la que dicho gen interno codifica la proteína de la cubierta del FIV que tiene la secuencia aminoácida presentada en la SEC. ID. nº 12.
\newpage
16. Utilización según la reivindicación 14, en la que dicho gen interno codifica los aminoácidos 1-735 de la proteína de la cubierta del FIV según la SEC ID nº 12.
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