JPH08501452A

JPH08501452A - Ｆｅｌｖ及び／又はｆｉｖに対する組換レトロウィルスベクター

Info

Publication number: JPH08501452A
Application number: JP6508444A
Authority: JP
Inventors: ティー．エル．リー，ウィリアム; ジェイ．サービン，ジョン; ジェイ．ジョリー，ダグラス; アールバーバー，ジャック; チャダ，サニル; エム．ダブリュ．チャン，スティーブン
Original assignee: ビアジーン，インコーポレイティド
Priority date: 1992-09-21
Filing date: 1993-09-21
Publication date: 1996-02-20
Also published as: AU5138293A; CA2142325A1; EP0662139A1; WO1994006921A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ネコ白血病ウィルス感染症を処置又は予防するための方法であって、細胞性免疫応答が発生するようにネコ白血病ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導せしめるベクター構築体をネコに投与することを含んで成る方法を提供する。また、上記のネコ白血病ウィルス感染症を処置又は予防するための方法と独立した、又は組合さった、ネコ免疫不全ウィルス感染症を処置又は予防するための方法及びベクター構築体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 FELV及び／又はFIVに対する組換レトロウィルスベクター技術分野本発明は一般にネコの処置のための方法、そしてより詳しくは、ネコ白血病ウィルス及びネコ免疫不全ウィルス感染症を処置するための方法及び組成物、並びにこれらの感染症を予防するためのワクチンに関する。発明の背景ネコ白血病ウィルス（「FeLV」）及びネコ免疫不全ウィルス（「FIV」）はネコ科の個体群において報告されている最も一般的な２種類の病原性レトロウィルスである。症候学及び高リスク家畜ネコ有名な米国の研究において、13％がFeLV抗原に対して陽性であり、７％がFIV抗体に対して陽性であり、そして２％のみが両ウィルスに対して陽性であることが認められた（O'Connor ら、JAVMA199：1348-1359，1991を参照のこと）。ほとんどの研究が、FeLV及びF IVは互いと独立して獲得されることを示唆しているが、FeLV感染したネコは、Fe LVが陰性のネコよりも、FIV感染症に対して1.5〜４倍感受性であること（Cohen ら、JAVMA 197：220：225，1990；Moraillon，Vet Rec．126：68-69，1990を参照のこと）、及び二重感染したネコは、いづれかのウィルス単独で感染したネコよりも悪性の病気過程を経ることが報告されている（Hoiseら、Vet．Rec．125： 293-297，1989を参照のこと）。感染症に対する応答は一般に３つの群に分類できる：急性感染症、慢性ウィルス血症及び免疫。任意の特定の動物についての結果は様々なウィルス、宿主及び環境的要因に依存する。急性感染症においては、FeLVはまず扁桃のリンパ球及びマクロファージの中で複製し、そして２〜12日以内にネコ全身にわたって骨髄、胸腺、脾臓、腸及びリンパ節へと運ばれる。もしそのネコが適正な免疫応答を備えていないと、それは初期暴露から４〜６週間以内に慢性ウィルス血症を発症するであろう。慢性ウィルス血症は感染性FeLVが血液から、ウィルス感染（VI）アッセイの利用により、循環好中球及び血小板中のp27の免疫蛍光抗体（IFA）検査により、又は酵素結合免疫収着アッセイ（ELISA）を介しての可溶性p27抗原の検査により、回収できたときに確認される（Fischingerら、J．Virol．14：177-179，1974 ；Hardyら、「Detection of the Feline Leukemia Virus and Other MammalianOn cornaviruses by Immunofluorescence」 Unifying Concepts ofLeukemia，Dutche r，and Chieco-Bianchi（編）Karger（出版）．,Basal，Switzerland：778-799 ，1973を参照のこと）。この段階において、そのネコは伝染性が強く、そしてその唾液及び尿の中で大量のウィルスを排泄する。それはまた子ネコであるなら１ヶ月以内に、成ネコなら２〜３年以内にFeLV関連の病気を介して死に至ると予測される。FeLV関連の病気の例にはリンパ腫、非リンパ性白血病、骨髄増殖性障害、線維肉腫、細胞抑制病及び骨髄抑制病、貧血及び白血球減少症候群が含まれる（Hoover，JAVMA 199：1287-97，1991を参照のこと）。もしネコが有効な免疫応答を備えているなら、それはウィルス複製及び発現を初期暴露から４〜８週以内に削減するであろう。しかしながら、多くのネコはウィルスを完全に排除できず、そして骨髄及びリンパ節の軽度な潜伏性非発現型Fe LV感染症を数週間から数年にわたって保有することとなる。かかるネコがひどいストレスを受けたとき、その潜伏ウィルスは再活性化し、FeLV関連症を招き、ネコを死に至らしうる。 FeLV感染症と診断されたネコは一般に24〜36ヶ月以内に死ぬであろう。病気の伝染を防ぐため、FeLV感染したネコは他のネコから、この他のネコがFeLVについて種痘を受けているか否かに関係なく隔離すべきことが強く主張される。 FeLVを予防するため、数多くのワクチンが開発されている。より詳しくは、８種類のワクチンがUSDAより認可されており、その全てが不活性化ウィルス又は精製サブユニットを基礎とする。ほとんどの研究は、現状の商業的なFeLVワクチンは、ネコが存続中の感染症を発症してしまうのを防ぐのに60〜90％の薬効しか供さないことを提品している（Pollockら、JAVMA 199： 1406-1409，1991を参照のこと）。これらのワクチンは全て抗体の持続を維持するために２回目の投与及び１年がかりのブーストを必要とする。更に、現状ワクチンについての一つの間題は、従来の感染症についてチェックするために利用した診断検査が不正確、有効でない、又は利用するには高価すぎるとき、感染動物の種痘を行わねばならないことがあることにある。慣用のワクチンは治療剤としては期待されておらず、従って、後に種痘を受ける既に感染している動物はFeLVを発症してしまう。このことはネコの一部のオーナーにとってワクチンは有効でない、又は実際に感染症を招いてしまうことさえもあり、従って不要であると認めさせてしまいうる。ネコ白血病ウィルス感染症の臨床的な研究のFeLV関連症の処置に一般に制約されていた。詳しくは、数多くの研究者は、例えばBCG、レバミソル、混合細菌毒素（Cotter，Proceedings，7th Am．Coll．Vet．Int．Med．For.，909-912，198 9を参照のこと）、大用量のヒトアルファーインターフェロン及び３’−アシド −３’−デオキシチミジン（「AZT」）（Zeidnerら、Antimicrob．Agen．Chemo．34：1749-1756， 1990を参照のこと）の投与を含む治療法について実験してきた。しかしながら、これらの処置は限られた成功しか収めていない。更に、これらの治療剤の一部、例えばAZTは更に所望されない副作用、例えばAZT関連の肝臓毒素症及びウィルスを造血細胞の中に取り込んでしまった後のウィルス血症を排除する能力の無さが伴う。従って、所望されない副作用抜きでFeLV感染症を処置及び予防する有効な方法及び組成物についての要望が存在する。ネコ白血病ウィルスと同様に、ネコ免疫不全ウィルスはペット及びのらネコの両方において世界中で見い出されている（HoiseらVet．Rec．125：293-297，198 9；IshidaらJpn．J．Vet．Sci．50：39-44，1988：Pedersonら“Prevalence of infection withfeline immunodeficiency virus，feline leukemia virus andto xoplasma gondii in feral cat population（Abstract），FirstInternational Conference of Feline Immunodeficiency VirusResearchers，University of Ca lifornia，Davis，Calif.，Sep．4-7，1991を参照のこと）。このウィルスはけんかの際に感染唾液を介して主に伝染するものと信じられており（Wasmienら、「Transmission of feline immunodeficiency virus from infectedqueens to k ittens（Abstract），First International Conference、前掲を参照のこと）、従って、最も危険なネコは３才以上の雄ののらネコである（Yamamotoら、JAVMA 194：213-220，1989を参照のこと）。このような危険性の高い動物におけるネコ免疫不全の確率は米国において６〜14％（August，JAVMA 199：1472-1477，1991 ；Macyら「The clinical findings and prevalence of FIV and FeLVin Colorad o cats（Abstract）」First International Conference、前掲；O'ConnorらJAVM A 199：11348-1359，1991を参照のこと）、デンマークで18％（Petersonら前掲参照のこと）、そして日本で44％（Ishidaら Jpn．J．Vet．Sci．50：39-44，1988を参照のこと）である。更に、繁殖適齢期雌ネコの子ネコへの垂直伝播が観察されている（Callahanら、「Natural transm ission of FIV in kittens．（Abstract），First International Conference前掲；Wasmoenら、前掲を参照のこと）が、この感染経路の表皮学的意義はいまだ決定されていない。危険性の低い屋内のネコの一般集団においてはネコ免疫不全ウィルス感染症は１〜３％と推定される（Petersonら、前掲を参照のこと）。ヒト免疫不全ウィルス（「HIV」）とは異なり、ネコ免疫不全ウィルス感染症は性接触によって広がるものではないようである（Gardner and Luciw，FASEB J．3 ：2593-2606，1989を参照のこと）。ネコ免疫不全ウィルスはその宿主の中で、CD8⁺，CTL及びＴサップレッサー細胞のレベルを見かけ上の変化を伴わずに、CD4⁺リンパ球の徐々の、且つ持続的な消耗を介して免疫不全症を誘発する（Ackleyら、J．Virol．64：5652-5655，199 0を参照のこと）。このことはCD4⁺／CD8⁺細胞比の逆転を招き、これはネコの免疫状態を決定するために測定されうるものである。ネコ免疫不全ウィルスにより生ずる病気の過程はHIVにより生ずるものと非常に似ている。より詳しくは、感染の初期段階においては、全身リンパ節症、熱倦怠感及び汎白血球減少症が示されうる（Jarretら、AIDS 4：S163-S165，1990を参照のこと）。これに、臨床的徴候を示さない比較的無効症の潜伏期が続きうる。出現するのに数ヶ月から数年かかりうる末期は通常二次又は日和見的な種類のいくつかの慢性感染症を特徴とする。その他のウィルス又は寄生虫因子による同時感染はその第二潜伏期を極端に短くし、そして末期の進行を加速させる（Pede rsenら、Science 235：790-793，1987 を参照のこと）。この段階の臨床的発現には口腔感染症、慢性上部呼吸器感染症、慢性腸炎、慢性結膜炎及び神経異常が含まれる。ネコ免疫不全ウィルス陽性のネコは高い確率の腫瘍、例えばリンパ腫、鱗状細胞癌腫及び脊椎形状異状病も示しうる（Hutsonら、JAVMA199：1357-1362，1991を参照のこと）。ネコがネコ免疫不全ウィルスで感染されているかを決定するのに３タイプの試験が現状有用である。それらは、酵素結合免疫収着アッセイ（ELISA）、免疫蛍光抗体（IFA）試験及びイムノブロット試験であり、その後者は方法論的対比のための標準と考えられている。一般に、イムノブロット試験に比して、ELISA 又はIFAは93〜95％の感度及び98％の特異性を伴う結果をもたらす（Barrら、JAV MA199：1377-1381，1991を参照のこと）。ネコがネコ免疫不全ウィルスを有すると診断された後、その平均生存期間は約 24ヶ月である。これらの動物の臨床的処置は少ないが、しかしそれらを他のネコから隔離してその他の生命を脅かす日和見感染症の発症（Augustら、前掲を参照のこと）を防ぐのを助けること、及びネコ免疫不全ウィルスの非感染ネコへの伝染を防ぐことが含まれる。現在、研究の目的のために、抗レトロウィルスヒトAIDS薬剤AZT及び９−（２ −ホスホノメトキシエチル）−アデニン（PMEA）がネコ免疫不全ウィルスを有するネコに利用されている。これらの薬剤は感染ネコのCD4⁺／CD8⁺比を高めることによってその臨床状態を改善する。しかしながら、両方ともヘマトクリット及びヘモグロブリンレベルを低め、これはその長期治療剤としての有用性を損う（Ha rtmannら、「Use of two virustatica（AZT，PMEA）in thetreatment of FIV-an d FeLV-seropositive cats with clinicalsymptoms」（Abstract）。First Inte rnational Conference、前掲を参照のこと）。更に、ネコ免疫不全ウィルスのAZT耐性突然変異体の発見（Nor thら、「Drug resistant mutants of felineimmunodeficiency virus isolated in vitro （Abstract）」FirstInternational Conference、前掲を参照のこと）は、ネコ免疫不全ウィルス治療におけるAZTの有用性を更に制約しうる。本発明はFeLV及びFIVを処置するための組成物及び方法、FeLV及びFIVを予防するためのワクチンを提供し、そして更にその他の利点を提供する。発明の概要前述の如く、本発明のネコウィルス感染症を予防又は処置するための方法を提供する。簡単に述べると、本発明の範囲内で、ネコ白血病ウィルス感染症を処置又は予防する方法を提供し、この方法は、細胞性免疫応答が発生するようにネコ白血病ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導するベクタ構築体をネコに投与することを含んで成る。本発明の一態様の範囲内で、p15gag，p1 2gag，p27gag，p10gag，p14pol，p80pol，p46pol，gp70env及びp15envより成る群から選ばれる抗原の発現を誘導するベクター構築体を提供する。特に好適な態様の範囲内で、gp85envの発現を誘導するベクター構築体を提供する。本発明の別の観点において、ネコ免疫不全ウィルス感染症を処置又は予防する方法を提供し、この方法は、細胞性免疫応答が発生するようにネコ免疫不全ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導するベクター構築体をネコに投与することを含んで成る。一態様の範囲内で、p15gag，p24gag，p10gag，p1 3pol，p62pol，p15pol及びp36polより成る群から選ばれる抗原の発現を誘導するベクター構築体を提供する。特に好適な態様の範囲内で、gp68env， gp27env及びrevの発現を誘導するベクター構築体を提供する。本発明の別の観点において、ネコ白血病ウィルス及びネコ免疫不全ウィルス感染症を処置又は予防する方法を提供し、この方法は、ネコ白血病ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分とネコ免疫不全ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分との同時発現を誘導させ、これにより前記ウィルスに対する細胞性免疫応答を発生させるベクター構築体をネコに投与することを含んで成る。また、本発明の範囲において、ネコ白血病ウィルスの少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導するベクター構築体、ネコ免疫不全ウィルスの少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導するベクター構築体、及びネコ免疫原性ウィルスの少なくとも一の免疫原性部分とネコ白血病ウィルスの少なくとも一の免疫原性部分との同時発現を誘導するベクター構築体を提供する。様々な態様内で、上述のベクター構築体は、組換レトロウィルスにより、又はポリオウィルス、リノウィルス、ポックスウィルス（例えばカナリア痘ウィルスもしくはワクシニアウィルス）、インフレンザウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス（例えばアデノ関連ウィルスB19もしくはMVN）、ヘルペスウィルス、 SV40，HIV、麻疹及びアルファーウィルス、例えばシンドビスウィルスより成る群から選ばれる組換ウィルスにより担持される。また、上述のウィルスで感染された標的細胞を提供する。本発明の更なる別の態様内で、薬理組成物を提供し、これは上述の組換レトロウィルス又は組換ウィルス構築体を、薬理学的に許容される担体又は希釈剤との組立せで含んで成る。本発明のこれら及びその他の観点は下記の詳細な説明及び添付図面を参考により明らかにする。更に、下記の挙げている全ての文献は引用することでその内容全体を本明細書に組入れる。図面の簡単な説明図１は多価FIV-FeLVレトロウィルスベクターの構造の模式図である。発明の詳細な説明本発明を述べる前に、以降に用いている一定の用語の定義をまず記載することが本発明の理解に役立ちうる。本発明において利用している「免疫原性部分」とは、対応の抗原の一部であって、適切な条件下で、細胞性（即ち、細胞媒介型又は体液性）免疫応答を起こすことのできる部分を意味する。この「部分」は様々なサイズでよいが、しかし一般には９アミノ酸以上であるべきであり、そして全抗原を含みうる。免疫原性（例えば細胞媒介型免疫応答）を決定するのに利用されうる代表的なアッセイを以下及び実施例10Aの中でより詳しく説明する。細胞性免疫応答は主要組織適合性（「MHC」）クラスＩ表現もしくはMHCクラスII表現、又はその両者を介して媒介されうる。「ベクター構築体」とは、課題の１又は複数の配列もしくは遺伝子の発現を誘導することのできる集成体を意味する。ベクター構築体は１又は複数のプロモーター要素と、転写されたときに課題の１又は複数の配列もしくは遺伝子に作動連結しており、且つ翻訳開始配列として働く少なくとも一の配列を含んでいなくてはならない。任意的に、このベクター構築体は選択マーカー、例えばNeo，SV₂Ne o，TK、ヒグロマイシン、フレオマイシン、ヒスチジノールもしくはDHFR、ポリアデニル化を誘導するシグナル、翻訳終止配列、及び１又は複数の制限部位も含みうる。更に、もしこのベクター構築体をレトロウィルスの中に置くなら、このベクター構築体に、使用するレトロウィルスに適正なパッケージングシグナル及び長い終止リピート（LTR）（もしこれらが予め存在していないなら）を含ませなくてはならない。上述の如く、本発明は一般に例えばネコ白血病ウィルス及びネコ免疫不全ウィルス感染症を含む様々なネコの病気を処置するための組成物及び方法、並びに予防するためのワクチンに向けられる。簡単に述べると、外来病原体を認識する及びそれに対して防御する能力は免疫系の機能の中心である。この系は、免疫認識を通じて、「自己」を「非自己」（外来物）から区別する能力であり、そして防御機構が宿主の組織でなく侵入してくる物体に対して特異的であることを確証するのに必須である。免疫原のこの基本的な特徴は高度な多形性細胞表層認識構造（レセプター）及びエフェクター機構（抗体及び細胞溶解性細胞）であり、これは侵入してくる病原体を破壊するのに働く。免疫認識において特に重要な一の細胞タイプは細胞障害性Ｔリンパ球（「CTL 」）であり、これはMHCクラスＩ生成物と一緒にちってプロセスを受けた抗原を認識することにおいて主に制限されている。簡単に述べると、CTLは通常、CD3， ICAM-1，ICAM-2，LFA-1，LFA-3，β−ミクログロブリン、シャペロン及びその類似体の如きの分子と共にMHC分子と結合したプロセス剤病原体特異性ペプチドの表示により誘発される（例えばAltmannら、Nature 338：512，1989）。細胞媒介型応答の刺激又は認識を高めるタンパク質についてコードするその他の遺伝子も本発明において利用できる。MHCクラスＩ分子と一体となった抗原性ペプチドの表示はCD8⁺ CTL産生を招く。MHCクラスII分と一体となって表示されるペプチドは、抗体、ヘルパー細胞及びＢ細胞メモリーの産生を招き、そしてCD4⁺CTLを誘発しうる。以下により詳しく説明する方法は、有効なクラスＩ制限型防御及び治療的CTL応答並びに体液性応答を誘発する有効な手段を提供する。上述の如く、本発明の一観点内で、ネコ白血病ウィルス感染症を処置又は予防する方法を提供し、これは、細胞免疫応答が発生するようにネコ白血病ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導するベクター構築体をネコに投与することを含んで成る。簡単に述べると、ネコ白血病ウィルス（FeLV）はオンコウィルス亜科のレトロウィルスである。FeLVは３つのサブグループ（Ａ，Ｂ又はＣ）で存在しているものと現状信じられており、それらはそのエンベロープ抗原gp70並びにp15Eにより区別される。FeLVはp15，p12，p27及びp10を含むいくつかのコア抗原も含んで成り、これらはFeLVの全てのサブグループに関して高度に保存されている（Geerin gら、Vir．36：678-680，1968；Hardy ら、JAVMA 158：1060-1069，1971；Hard yら、Science 166：1019-1021，1969を参照のこと）。前述の如く、本発明の一態様内で、p15gag，p12gag，p27gag，p10gag，p14pol，p80pol，p46pol，gp70en v及びp15envより成る群から選ばれるネコ白血病ウィルス抗原の少なくとも一部の発現を誘発するベクター構築体を提供する。特に好適な態様内で、gp85envの発現を誘導するベクター構築体を提供する。これらの抗原をエンコードする配列は本明細書において供する開示内容に従って容易に獲得できうる（DonahueらJ． Vir．62（3）：722-731，1988；StewartらJ．Vir．58（3）：825-834，1986；Ku marらJ．Vir．63（5）：2379-2384，1989；ElderらJ．Vir．46（3）：871-880， 1983；BerryらJ．Vir．62（10）：3631-3641，1988；LaprevotteらJ．Vir．50（ 3）：884-894，1984を参照のこと）。本発明の別の観点において、ネコ免疫不全ウィルス感染症を処置又は予防するための方法を提供し、この方法は、細胞免疫応答を発生せしめるように、ネコ免疫不全ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導するベクター構築体をネコに投与することを含んで成る。簡単に述べると、ネコ免疫不全ウィルス（FIV）は、逆転写酵素（RT）のためのマグネシウム要件及びウィルス粒子の形態学を基礎として、レンチウィルス亜科のレトロウィルスに分類されている（Pederesenら、Science 235：790-793，1 987を参照のこと）。このネコ免疫不全ウィルスは形態学的及び抗原性的に、ネコ白血病ウィルス、Ｃ型オンコルナウィルス（RD-114）及びネコシンシチウム形成ウィルス（FeSFV）を含むその他のネコレトロウィルスと区別されている（Yam amotoら“Efficacy of experimental FIV vaccines，(Abstract)，First Intern ational Conference of FelineImmunodeficiency Virus Researchers，Universi ty of California，Davis，CA，Sep．4-7，1991を参照のこと）。前述の如く、本発明の一態様において、p15gag，p24gag，p10gag，p13pol，p62pol，p15pol及びp36polより成る群から選ばれるネコ免疫不全ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導するベクター構築体を提供する。特に好適な態様において、gp68env，gp27env及びrevの発現を誘導するベクター構築体を提供する。本発明の内容において、「rev」とはrevオープンリーディングフレームに対応する抗原を意味するものと理解される（Phillipsら、First InternationalConferenc e、前掲を参照のこと）。これらの抗原をエンコードする配列は本明細書において供する開示内容に従って当業者により容易に獲得できうる（PhillipsらJ．Vir ．64（10）：4605-4613，1990；OlmstedらPNAS 86：2448-2452，1989；Talbott らPNAS 86：5743-5747，1989を参照のこと）。上述のネコ白血病ウィルス及びネコ免疫不全ウィルス抗原をエンコードする配列は上述の文献に記載の通りに調製するか、又は様々な起源より得ることができうる。例えば、FeLVのエンベロープタンパク質をエンコードする配列はアメリカンタイプカルチャーコレクション（「ATCC」；Ro ckville，Maryland）より入手できる（例えば、ATCC No 39528，39529及び39530 を参照のこと）。同様に、AIDS Repository（ナショナルインスティテュートオブアレルギーアンドインフェクションスディシーズのAIDS部門、Be thesda，Maryland；NIH Dublication No．N2-1536を参照のこと）は全長複製コンピテントFeLVをエンコードする配列を含むプラスミドクローンの寄託物（例えば、クローンp61E-FeLV，Catalog No．109）及びネコ免疫不全ウィルスをエンコードする配列を含むプラスミドクローンの寄託物（例えば、クローンpFIV-14-Pe taluma，CatalogNo.851）を保持している。他方、上記のネコウィルス抗原をエンコードする配列は、これらのウィルスをエンコードする配列を発現又は含む細胞（例えば、FeLV又はFIVで感染したネコ由来）より容易に獲得できうる。簡単に述べると、一態様において、プライマーを、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）によってその後増幅する所望の配列のいづれかの側の上で調製する（米国特許第4,683,202,4,683,195及び4,800,159号を参照のこと）（更に、PCR Technology：Principles andApplications，for DNA Amplification，Erlich（編），StocktonPress，1989も参照のこと）。詳しくは、二本鎖DNAを、熱安定性Taqポリメラーゼ、配列特異的DNAプライマー、ATP，CT P，GTP及びTTPの存在下で加熱することにより変性させる。二本鎖DNAは合成が完了したときに作られる。このサイクルを数回繰り返してよく、所望のDNAの工場的増幅が得られる。上記のネコウィルス抗原をエンコードする配列は例えばAppliedBiosystems In c．DNA合成装置（例えばABI DNA 合成装置モデル392 （Foster City，California）で合成してもよい。かかる配列は、長い二本鎖DNA 分子を形成するために、相補性末端を介して互いに連結させ、続いてPCR増幅にかけてもよい。上述の如く、例えばネコ白血病ウィルス抗原、ネコ免疫不全ウィルス抗原、以下に詳しく説明する任意のネコウィルス抗原、又はこれらの抗原の任意の組合せを含むネコウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分をベクター構築体の中に入れる。このベクター構築体の中に組込む１又は複数の免疫原性部分は様々な長さであってよいが、しかしその部分は少なくとも９個のアミノ酸の長さであることが一般に好ましく、そして全抗原を含むことが好ましい。特定の配列の免疫原性は通常予測するのが困難であるが、しかし潜在的なＴ−ヘルパー部位及びCTL 部位にとってのFeLV gag，env，FIV gag，env及びrevのコード領域をスキャンするには、TSites（Medlmmune，Maryland）の如きのコンピューターアルゴリズムを利用することによってＴ細胞エピトープを予測することができうる。この分析は、１）タンパク質の構造的特徴（主に、アルファーヘリックス周期及び両親媒性）、並びに２）MHCクラスＩ及びクラスII分子により認識される配列において見い出せるモチーフを主に基礎とする。しかしながら、一般に、アッセイにおいて免疫原性を決定することが好ましい。代表的なアッセイには、新たに導入されたベクターに対する抗体の存在を検出するELISA、並びにＴヘルパー細胞について試験するアッセイ、例えばガンマー−インターフェロンアッセイ、IL-2産生アッセイ及び増殖アッセイが含まれる。特に好ましいアッセイは実施例10Aの中により詳しく記載されている。本発明の免疫原性タンパク質は、それらをより免疫原性なものにするために、当業界に公知の様々な方法によって操作されもする。かかる方法の代表例には：Ｔヘルパーエピトープに対応するアミノ酸配列の付加；疎水性残基を付加することによる細胞取込みの増進；特定構造の形成；又はこれらの任意の組合せが含まれる（一般には、Hart、前掲；Milichら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85：1610-1614，1988；Willis，Nature 340：32 3-324，1989；GriffithsらJ．Virol．65：450-456，1991を参照のこと）。ベクター構築体の中への一体化にとって特に好適な免疫原性部分には、ネコ白血病ウィルスにとってのgp85env抗原、並びにネコ免疫原性ウィルスにとってのg p68env，gp72env及びrev抗原が含まれる。本発明の特に好適な態様において、Fe LV及びFIVエンベロープ抗原（gp85env；並びにgp68env，gp27env及びrevのそれぞれ）の両者、又はFeLV及びFIV gag抗原（p15gag，p12gag，p27gag，p10gag及びp14pol；並びにp15gag，p24gag，p10gag及びrev、のそれぞれ）の両者を発現するベクター構築体を提供する。更に、上述の如く、複数の免疫原性部分をベクター構築体の中に組込んでよい。より詳しくは、本発明の一態様において、複数の病気のために利用できうる多価ベクター構築体を提供する。例えば、ベクター構築体は（別々に、又は一の構築体として）、全て又は一部のネコ白血病ウィルス抗原、ネコ免疫不全ウィルス抗原、及びその他のネコの病気に関係する抗原を発現しうる。かかる抗原の代表例には、ネコ汎白血球減少症ウィルスにとってのVP1及びVP2 （Martynら「Nucl eotide sequence of feline panleukopenia virus：comparison with canine pa rvovirus identifies host-specificdifferences」J．Gen．Vir．71：2747-2753 ，1990；Parrish．「Mapping Specific Functions in the Capsid Structure of CanineParvovirus and Feline Panleukopenia Virus Using InfectiousPlasmid Clones」 Vir．183-195-205，1991を参照のこと）；ネコカリチウイルスのカスピドタンパク質（Nellら「Nucleotide Sequence and Expression of the Capsid Protein Gene of Feline Calicivirus」J．Vir ．65（10）：5440-5447，1991；Tohyaら「Sequence Analysisof the 3’end of Feline Calicivirus Genome」Vir．183：810-814，1991；Carterら「Monoclonal antibodies to Feline Calicivirus」J．Gen．Vir．70：2197-2200，1989を参照のこと）；ラビエスウィルスの「Ｎ」又はヌクレオタンパク質（Ertlら「Indu ction ofRabies Virus-Specific T-Helper Cells by Synthetic Peptidesthat c arry dominant T-Helper Cell Epitopes of the ViralRibonucleoprotein」J．V ir．63（7）：2885-2892，1989を参照のこと）；及びネコヘルペルウィルスの糖タンパク質（Nunbergら「Identification of the Thymidine Kinase Gene of Fe lineHerpesvirus：Use of Degenerate Oligonucleotides in thePolymerase Ch ain Reaction to Isolate Herpesvirus Gene Homologs」J．Vir．63（8）：3240 -3249，1989を参照のこと）が含まれる。本発明の更なる態様において、１又は複数の上記の免疫原性部分は免疫調節補因子によって同時発現されうる。簡単に述べると、本発明の背景において使用している「免疫調節補因子」とは、免疫応答にかかわっている１又は複数の細胞により製造されたとき、又は細胞に外的に付加したとき、この補因子抜きで起こりうるであろうものとは質的又は能力的に異なる免疫応答を起こさせる因子を意味する。応答の質又は能力は当業者に公知の様々なアッセイ、例えば細胞増殖を測定するインビトロアッセイ（例えば³Ｈチミジン取込み）及びインビトロ細胞障害アッセイ（例えば⁵¹Cr放出を測定）により測定されうる（Warnerら、AIDS R es．and Human Retroviruses7：645-655，1991を参照のこと）。免疫調節補因子は生体内及び生体外の両方において活性である。かかる補因子の代表例には、アルファーインターフェロン（FinterらDrugs 42（5）：749-765， 1991；米国特許第4,892,743号；米国特許第4,966,843号；WO 85/02862；Nagata らNature 284：316-320，1980；FamillettiらMethods in Enz．78：387-394，19 81；TwuらProc．Natl．Acad．Sci．USA 86：2046-2050，1989；FaktorらOncogen e 5：867-872，1990）、ベーターインターフェロン（SeifらJ．Virology 65：66 4-671，1991）、ガンマーインターフェロン（RadfordらThe AmericanSociety of Hepatology 20082015，1991；WatanabeらPNAS 86：9456-9460，1989：Gansbach erらCancer Research 50：7820-7825，1990；MaioらCan．Immunol．Immunother ．30：34-42，1989；米国特許第4,762,791号；米国特許第4,727,138号）、GCSF （米国特許第4,999,291号及び第4,810,643号）、GMCSF(WO 85/04188)、TNFs(Jay aramanらJ.Immunology 144：942-951，1990)、インターロイキン２(“IL-2”)(K arupiahらJ．Immunology 144：290-298，1990：WeberらJ．Exp．Med．166：1716 -1733，1987；GansbacherらJ．Exp．Med．172：1217-1224，1990；米国特許第4, 738,927号）、インターロイキン４（“IL-4”）（TepperらCell 57：503-512，1 989；GolumbekらScience 254：713-716，1991；米国特許第5,017,691号）、インターロイキン６（“IL-6”）（Brakenhof らJ．Immunol．139：4116-4121，198 7；WO 90/06370），ICAM-1(AltmanらNature338：512-514，1989)，ICAM-2，IFA- 1，LFA-3，MHCクラスＩ分子、MHCクラスII分子、β−ミクログロブリン、シャペロン、CD3又はそれらの類似体が含まれる。上記の免疫調節補因子をエンコードする配列は様々な起源、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクチョン(ATCC Rockville，Maryland)又は商業的起源、例えばBritish Bio-technology Limited(Cowley，Oxford England)より容易に入手できうる。代表例にはBBG12(127のアミノ酸の成熟タンパク質についてコードするGM-CSF 遺伝子を含む）、BBG6（ガンマーインターフェロンをエンコードする配列を含む）、ATCC No.39656（TNFをエンコードする配列を含む）、ATCC No.20663（アルファーインターフェロンをエンコードする配列を含む）、ATCC No．31902，3190 2及び39517（ベクターインターフェロンをエンコードする配列を含む）、ATCC N o．39405，39452，39516，39626及び39673（インターロイキン−２をエンコードする配列を含む）、ATCC No．57592（インターロイキン−４をエンコードする配列を含む）、及びATCC 67153（インターロイキン−６をエンコードする配列を含む）が含まれる。どの免疫調節因子をベクター構築体の中に含ませるかの選択はその補因子の既知の治療的効果に基づくか、又は実験的に決定できうる。例えば、CTLアッセイに用いるために血液サンプルを特定の病気を有するネコから採取する。簡単に述べると、末梢血液リンパ球(PBL)を血液から分離し、そしてインビトロでコンカナバリンＡ、インターロイキン−２、牛Ｔ細胞成長因子及び自己の照射剤細胞で剌激し、次いで上記の病気に関係する抗原の免疫原性部分及び免疫調節補因子の発現を誘導する上記の組換レトロウィルスを形質導入する。CTLアッセイにおいては剌激したPBLをエフェクターとして、再剌激因子及び標的の両者としての自已形質導入剤細胞と共に利用する。自已剌激因子及び標的細胞であって抗原をエンコードするベクターのみで形質導入されたものを利用して行った同一のアッセイにおいて認められたものに勝るCTL応答の上昇は、有用な免疫調節補因子を示唆する。上記の１又は複数の免疫原性部分が選定されたら、これらのタンパク質をエンコードする遺伝子を、その発現を誘導するベクター構築体の中に置く。一般に、かかるレトロウィルスベクターはこれらの遺伝子しかエンコードせず、選択マーカーはエンコードしない。特異的な１又は複数の抗原をエンコードし、その発現をもたらしめるベクターは当業者によって容易に構築できうる。詳しくは、ベクター構築体の構築及び直接注入によるレトロウィルス構築体の投入は、全体を引用することで本明細書に組入れる表題「RecombinantRetroviruses」（U.S.S.N.07/586,603；1990年９月21 日提出）の出題に詳しく記載されている。これらのベクター構築体は、それらを適当なパッケージング細胞系の中に導入することによって形質導入コンピテントレトロウィルスベクター粒子を作製するのに利用できうる（U.S.S.N.07/800,921 号を参照のこと）。特に好適な態様において、ベクター構築体はプロモーター、例えばSV40（Krie glerら、Cell38：483，1984）、サイトメガロウィルス（「CMV」）（Boshartら、Cell41：521-530，1991を参照のこと）又は内部リボソーム結合性部位（「IRB S」）を含むように構築することができうる。簡単に述べると、IRBSに関しては、イムノグロブリン重鎖結合性タンパク質の５つのプライム未翻訳領域が複シストロンメッセージの内部結合を支持するということが示されている（Jacejak an d Sarnow，Nature 353：90-94，1991を参照のこと）。この配列は小さく（300 b p）、そしてシストロンがこの配列で始まる多重シストロンメッセージから複数の遺伝子を発現させるためにレトロウィルスベクターの中に容易に組込むことができうる。IRBSを利用する代表的なベクター構築体を下記の実施例４の中に詳しく説明する。更に、ベクター構築体はその他のウィルス担体、例えばポリオウィルス（Evan sらNature 339：385-388，1989、及びSabin，J．ofBiol．Standardization１：1 15-118，1973）；リノウィルス（Arnold，J．Cell．Biochem．L401-405，1990）；ポックスウィルス、例えばカナリア痘ウィルス又はワクシニアウィルス（Fish er-HochらPNAS 86：317-321，1989；FlexnerらAnn．N．Y．Acad．Sci．569：86-103，1989；Fle xnerらVaccine８：17-21，1990；米国特許第4,603,112及び4,769,330号；WO 89/ 01973）；SV40（MulliganらNature 277：108-114，1979）；インフレンザウィルス（LuytjesらCell 59：1107-1113，1989：McMichealらThe New EnglandJournal of Medicine309：13-17，1983；及びYapらNature 273：238-239，1978）；アデノウィルス（Berkner，Biotechniques 6：616-627，1988及びRosenfeldらScienc e 252：431-434，1991）；パルポウィルス、例えばアデノ関連ウィルス（Samuls kiらJournalof Virology 63：3822-3828，1989及びMendelsonらVirology 166：1 54-165，1988）；ヘルペス（Kit，Adv．Exp．Med．Biol．215：219-236，1989）；SV40；HIV；麻疹（EP 0 440,219）；及びシンドビスウィルス（XiongらScienc e 234：1188-1191，1989）により開発及び利用されうる。更に、ウィルス担体は同族で非病原性（欠陥）の複製コンピテントウィルス（例えばOverbaughらScien ce 239：906-910，1988）であってよく、そしてCTLを含む細胞免疫応答を誘発するものでありうる。上記のベクター構築体が構築できたら、ネコに投与する前に、例えばヌードマウスにおける腫瘍形成の程度を決定することにより、又はソフトアガーの中でのコロニー形成を評価することにより腫瘍形成力についてそれらを試験してよい。簡単に述べると、ヌードマウスにおける腫瘍形成は特に重要且つ高感度な腫瘍形成力決定方法である。ヌードマウスは機能的な細胞免疫系を欠き、成熟Ｔ細胞を保有せず、そしてそれ故細胞の腫瘍形成能力を試験する有用なインビボモデルを提供する。正常な非腫瘍形成性細胞はヌードマウスの中に注射したときに無秩序な増殖特性を示さない。しかしながら、形質転換細胞はヌードマウスの中で迅速に増殖し、そして腫瘍を発生する。一の態様において、このベクター構築体をヌードマウスの中に注射によって投与する。腫瘍増殖を決定するために注射して４〜１６週間の期間にわたってマウスを目視検査する。これらのマウスを、腫瘍が存在しているかを調べるために殺して解剖してもよい（Giovanellaら、J．Natl．Cancer Inst．48：1531-1 533，1972；Fureszら「Tumorigenicity testing of cell lines considered for production of biological drugs」Abnormal Cells，New Productsand Risk，Ho pps and Petricciani（編），Tissue Culture Association，1985；及びLevenbo okらJ．Biol．std．13：135-141，1985）。腫瘍形成能はソフトアガー中でのコロニー形成の識別によっても評価できる（ Mac Pherson and Montagnier，Vir．23：291-294，1964）。簡単に述べると、正常な非腫瘍形成性細胞の一の性質は定着依存性増殖である。より詳しくは、正常な非腫瘍形成性細胞は半固形アガー培地の中でプレート培養したときは増殖を停止し、一方、腫瘍形成性細胞はソフトアガーの中で増殖し続け、そしてコロニーを形成するであろう。ベクター構築体を調製したら、それは上記のネコの病気を処置するためにネコに投与してもよい。同様に、このベクター構築体は、上記のネコの病気を防ぐために予防的に投与してよい。レトロウィルスベクターを介してのベクター構築体の投与のための方法（例えばレトロウィルス構築体の直接注射による）は題名「 RecombinantRetroviruses」（U.S.S.N 07/586,603）に詳しく記載されている。本発明の別の観点において、ネコの病気を処置又は予防するため方法を提供し、この方法は、（ａ）ネコから細胞を取出す、（ｂ）取出した細胞に、ネコ白血病ウィルス抗原、ネコ免疫不全ウィルス抗原又はその両者の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導するベクター構築体を投与する、そして（ｃ）この細胞をネコに戻し、細胞性免疫応答を発生させる、段階を含んで成る。本発明の内容において、この取出した細胞は同一のネコに戻す必要はなく別のネコの中で利用できることを理解すべきである。かかるケースにおいては、組織適合性の合ったネコを得ることが一般に好適である（しかしそれが常であるわけではない。例えば、Yamamotoら、「Efficacyof Experimental FIV Vaccines」First International Conference of FIV Researches，University of California of Davis，1991年９月を参照のこと）。細胞は様々な箇所、例えば皮膚（皮膚繊維芽細胞）及び血液（末梢血液白血球）より取出すことができうる。所望するなら、Ｔ細胞サブセット又は幹細胞の如きの細胞の特定の画分も、ベクター構築体の投与のために血液から取出してよい（例えば、PCT WO 91/16116、題名「Immunoselection Device and Method」なる出願）。次いでベクター構築体は任意の上記の技術を利用してこの取出した細胞に投与してよく、続いてこの細胞をネコに戻す。本発明の別の観点において、上記の免疫原性部分の発現を誘導し、且つプロドラッグアクチベーターの発現を誘導するベクター構築体を提供する。例えば、一態様において、免疫原性部分及びプロドラッグアクチベーター、例えばヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ（HSVTK）にとっての遺伝子をベクター構築体の中に組入れる。次いでこのベクター構築体を、後に外生物質、例えばHSVTKを発現する細胞を殺傷するアクシロビルの投与によって排除することできる細胞に投与する。当業者は、このベクターを取込んだ細胞においてもその導入された遺伝子が腫瘍形成現象を担ってしまうことがあるにしても、これらの細胞が例えばアクシロビルの外生適用によって殺傷されうることを確証するためにこのベクター構築体を利用できることを容易に理解するであろう。上記の組換ウィルスベクターに加えて、その他の方法も、本発明のベクター構築体又は上記の１又は複数の免疫原性部分をエンコートする核酸をネコに、又は生体外でネコ細胞に投与するのに利用できうる。かかる方法には、例えば、様々な物理学的方法を利用する方法によるトランスフェクション、例えばリポフェクション（FelgnerらProc．Natl．Acad．Sci．USA 84：7413-7417，1989）、直接D NA注入（AcsadiらNature 352：815-818，1991）；マイクロプロジェクチルボンバートメント（WilliamsらPNAS 88：2726-2730，1991）；リポソーム（Wangら PNAS 84：7851-7855，1987）；CaPO₄（DubenskyらPNAS 81：7529-7533，1984）；又はDNAリガンド（WuらJ．of Biol．Chem．264：16985-16987，1989）が含まれる。更に、細胞性応答（CTLを含む）は上記の１又は複数の免疫原性部分を発現する細菌の投与によっても発生させることができる。代表例にはBCG（Stover，Nat ure 351：456-458，1991）、サルモネラ（NewtonらScience 244：70-72，1989）及びリステリア（SchaferらJ．Imm．149：53-59，1992）が含まれる。細胞媒介型及び体液性応答は、上記の１又は複数の免疫原性部分の投与によってもネコ白血病ウィルス又はネコ免疫不全ウィルスに対して誘発させることができうる。簡単に述べると、関連のエピトープを担持している免疫原性部分は数多くの公知の方法、（Ellisand Gerety，J．Med．Virol．31：54-58，1990）、例えば化学合成（BergotらApplied Biosystems Peptide Synthesizer User Bullet inNo．16，1986，Applied Biosystems，Foster City California）並びに組換系、例えば昆虫由来バキュロウィルス系（Doerfler，CurrentTopics in Immunolog y 131：51-68，1986）哺乳動物由来系（例えばCHO細胞）（BermanらJ．Virol．6 3：3489-3498，1989）、酵母由来系（McAleerらNature 307：178-180）及び原核細胞系（Burrel らNature 279：43-47，1979）におけるDNA発現によって製造できうる。本発明の免疫原性タンパク質又はペプチドはまた慣用の手段によって精製してよく、そしてクラスＩ及びクラスII応答を含む細胞媒介型応答を誘発するために数多くの方法によって導入してよい。これらの方法には、様々なタイプのアジュバント、例えばISCOMS（Morein，Immunology Letters 25：281-284，1990；Taka sashiらNature 344：873-875，1990）、スクアレン/Tween-80/プルロニックL121 （MorrowらPoster #32，「Advances in AIDS VaccineDevelopment，Proceedings of the Fifth Annual Meeting of theNational Cooperative Vaccine Dev．Gro up for AIDS」Aug，1992）、サポニン（Wu，Poster #16，Advances、前掲）、プロテオリポソーム（Letvin，「Vaccination of Rhesus monkeys with synthetic peptide in a fusogenic proteoliposome elicits FIV specificCD8⁺cytotoxic T-lymphocytes」Proceedings、前掲）、リポソーム（GergoriadisらVaccine 5： 145-151，1987）、脂質コンジュゲーション（DeresらNature 342：561-564，198 9）、自己細胞上のペプチドのコーティング（StaerzらNature 329：449-451，19 87）、ピノソーム（MooreらCell 54：777-785，1988）、みょうばん、完全又は不完全フロインドアジュバンド（HartらProc．Natl．Acad．Sci．USA 88：9448- 9452，1991）又は様々なその他の有用なアジュバント（例えばAllison and Byar s，Vaccines 87：56-59，ColdSpring Harbor Laboratory，1987）であって有効な非経口投与を可能にするものの利用が含まれる。他方、上記の１又は複数の免疫原性部分に相当するタンパク質又はペプチドは、免疫応答を誘引する経口、又は直腸投与のため、胃腸放出用の腸内カプセル（ ChannockらJ．Amer．Med．Assoc．195： 445-452，1966）又はその他の適当な担体、例えばポリ（DL−ラクチド−コ−グリコレート）球体（EldridgeらのProceedings of theInternational Conference on Advances in AIDS Vaccine Development，DAIDS，NLAID，U．S．Dept of He alth＆Human Services，1991）の中に封入してよい。本発明の更なる観点において、薬理組成物を提供し、これは一の上記の組換ウィルス、例えば組換レトロウィルス又は組換ウィルスであってポリオウィルス、リノウィルス、ポックスウィルス、カナリア痘、ワクシニアウィルス、インフレンザウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、SV40，HIV、麻疹及びシンドビスウィルスより選ばれるものを、薬理学的に許容されている担体又は希釈剤との組合せで含んで成る。この組成物は液状溶液として、又は投与前に溶液の中に懸濁する固形状態（例えば凍結乾燥して）のいづれかで調製されうる。更に、この組成物は注射、経口又は直腸投与のいづれかのために適切な担体又は希釈剤で調製できうる。一般に、組換ウィルスは製剤化前に0.25％〜25％、そして好ましくは約５％〜20％に範囲する濃度で利用する。次に、この組成物の調製後、この組換ウィルスは投与当たり約１μｇの材料を構成してよく、共精製夾雑物としてこの量は約10倍の材料（10μｇ）を伴う。好ましくは、この組成物は下記に記載の通りに処方した0.1〜1.0mlの水性溶液中で調製する。更に、この組成物はアジュバント、例えば水酸化アルミニウム、サポニン及びスクアレンを含みうる。薬理学的に許容される担体又は希釈剤は採用する投用量及び濃度では受容者にとって無毒である。注射用溶液にとっての担体又は希釈剤の代表例には、水、生理学的pHに緩衝されているのが好適な等張溶液（例えばリン酸緩衝食塩水又はトリス緩衝食塩水）、マンニトール、デキストロース、グリセロール及びエタノール、並びにポリペプチド及びタンパク質、例えばネコ血清アルブミンが含まれる。特に好適な組成物はベクター又は組換ウィルスを、10mg/mlのマンニトール、1mg/mlのネコ血清アルブミン、20mMのトリスpH＝7.2及び150mMのNaClの中に含んで成る。この場合、この組換ベクターは約１μｇの材料を占めているため、それは高分子材料の１％末梢、そして材料全体（水を含む）の1/100,000末梢であってよい。この組成物は−70 ℃で６ヶ月以上安定である。この組成物は静脈内的に（i.v.）又は皮下的に（s. c.）注射してよく、しかしながら筋肉内的に（i.m.）又は経鼻的にエアゾール投与することにより注入することが一般に好適である。これらは初め、１〜４週間間隔で、３又は４回の投与回数で投与する。その後のブースターショットを６〜 12ヶ月後に１又は２回の投与として与えてよく、そしてその後１年毎に投与してよい。経口製剤を、セルロース、ラクトース、マンニトール、ポリ（DL−ラクチド− コ−グリコレート）球体及び／又は炭水化物、例えばデンプンの如きの担体又は希釈剤を伴って採用してよい。この組成物は例えば錠剤、ジェルカプセル、ピル、溶液又は懸濁物の形態をとっていてよく、そして更には徐放のために処方されうる。直腸投与のためには、座薬の調製は伝統的な担体、例えばポリアルキレングルコール又はトリグリセリドで達し得る。以下の実施例は例示のために提供し、限定を意味するものではない。実施例実施例１Ａ．レトロウィルス骨格KT-3の調製 N2ベクター（Armentanoら、J．Vir．61：1647-1650，1987； Eglitasら、Science 230：1395-1398，1985）由来の、gag配列を含むモロニーネズミ白血病ウィルス（MoMLV）の５’の長い末端リピート（LTR）、EcoR Ｉ−Ec oR ＩフラグメントをプラスミドSK＋（Stratagene，Calif）の中にリゲートする。得られる構築体をN2R5と命名した。このN2R5構築体を部位特異的インビトロ突然変異誘発により突然変異させてATG開始コドンをgag発現を阻止するATTに改変する。この突然変異させたフラグメントは長さ200塩基対（bp）であり、そしてPst Ｉ制限部位が並んでいる。このpst Ｉ−Pst Ｉ突然変異化フラグメントを SK＋プラスミドより精製し、そしてプラスミドpUC31の中のN2 MoMLV５’LTRのPs t Ｉ部位の中に挿入して非突然変異200bpフラグメントと置換させる。このプラスミドpUC31は、追加の制限部位Xho Ｉ，Bgl II，BssH II及びNco ＩがポリリンカーのEcoR Ｉと，Sac Ｉ部位との間に挿入されているpUC19（Stratagene，Cali f）に由来する。この構築体をpUC31/N2R5gMと呼ぶ。 N2由来の1.0キロベース（Kb）のMoMLV３’LTR EcoR Ｉ−EcoRＩフラグメントをプラスミドSK＋の中にクローンし、N2R3−と命名する構築体を得る。1.0KbのC la Ｉ−Hind IIIフラグメントをこの構築体から精製する。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を作動させるSV40初期プロモーターを含んで成るpAFVXMレトロウィルスベクター由来のCla Ｉ−Cla Ｉ優性選択マーカー遺伝子フラグメント（KrieglerのCell 38：483，1984；St．Loui sらPNAS 85：3150-3154，1988）をSK＋プラスミドの中にクローンする。1.3 Kb のClaＩ−BstB Ｉ遺伝子フラグメントをSK＋プラスミドより精製する。この発現ベクターは３部リゲーションにより構築し、それにおいては課題の遺伝子を含むXho Ｉ−Cla Ｉフラグメント及び1.0 Kbの MoMLV ３’LTR Cla Ｉ−Hind IIIフラグメントpUC31/N2R5gMプラスミドのXho Ｉ −Hind III部位の中に挿入する。次に、pAFVXMレトロウィルスベクター由来の1. 3 KbのCla Ｉ−BstB Ｉ neo遺伝子をこのプラスミドのCla Ｉ部位の中にセンス配向で挿入する。Ｂ．レトロウィルス骨格KT-1の調製 KT-1レトロウィルス骨格ベクターは実施例1AにおけるKT-3について本質的に説明した通りに構築したが、ただし優性選択マーカー遺伝子neoは発現ベクターの中に挿入しない。実施例２ PCRを利用する配列の調製Ａ．FeLV gag/prot遺伝子のPCR FeLV gag/prot遺伝子を得るため、FeLV配列（p61E-FeLV）を含むプラスミドを NIH Research and Reference Reagent Program，Marylandより入手する。次に反応混合物をPerkin Elmer Cetus（Emeryville，Calif）により指示された手順に従って調製する。より詳しくは、１μｇの精製プラスミド、10μＬの10XのPCR反応バッファー、２μｌの2.5mMづつの各dATP，dCTP，dGTP及びdTTP，0.5μｌの2. 5単位／100μｌのTaqポリメラーゼ、10μｌの10mMのMgCl₂並びに0.5〜1.0μｇの以下に特定するプライマー（配列IDNo.1及び配列ID No.2）を含む反応混合物を調製する。センスプライマー配列は、FGAプロウィルスの位置609にあるATG開始コドンの上流のFeLV gag/prot遺伝子の５’領域に由来する。プライマーの５’末端は２本の連続Xho Ｉ制限部位を含む：（配列ID No.1）アンチセンスプライマー配列はFGAプロウィルスの位置2800にある配列に相補性であり、そしてFeLV gag/prot遺伝子とインフレームで２つの連続停止コドンを含む。このプライマーの５’末端は２つの連続したCla Ｉ制限部位を含む：（配列ID No.2）この反応混合物をDI H₂Oで100μｌにし、そして各チューブをPCR装置（Gene A mp PCR System 9600，Perkin-Elmer，Cetus，Calif.）の中に入れる。PCRプログラムは反応槽の温度を最初は94℃で２分、次に56℃で30秒、72℃で30秒、して最後に94℃で30秒調節する。このサイクルを35回繰り返した。35回のサイクル後、反応を４℃に保つＢ．PCR DNAの単離 PCR反応物を1.5mlのマイクロ遠沈管に移し、そして50μｌの３Ｍの酢酸ナトリウムを加える。次に、500μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）をこの溶液に加え、これをボルテックスに付し、次いで５分間遠心する。上部の水性相を新鮮なマイクロ遠沈管に移し、そして１mlの100％のEtOHを加える。この溶液を−20℃で４時間インキュベートし、次いで20分間遠心する。その上清液を捨て、そしてそのペレットを500μｌの70％EtOHですすぐ。このペレットを真空下で遠心することにより乾かし、そして10μｌのH₂Oの中に再懸濁する。実施例３レトロウィルスベクターの構築Ａ．FeLV envレトロウィルスベクターの構築 FeLV-A-Gardner-Arnstein [FGA]プロウィルス（Donahueら、J．Vir．62：722- 731，1988）由来の2.0KbのPSt Ｉフラグメントを psp 72ベクター（Promega Biotech，Wisc.）のpst部位にサブクローンする。５ ’Xho Ｉ及び３’Cla Ｉ部位に対してセンス配向においてFeLV envを含むサブクローンを制限酵素分析により選別する。次にこのXho Ｉ−Cla Ｉフラグメントを切り出し、そしてKT-3骨格の中に挿入する。Ｂ．FeLV gag/protレトロウィルスベクターの構築 FeLV gag/prot遺伝子をエンコードするDNAを実施例２に記載の通りに調製し、そしてpBluescript KSII＋プラスミド（Stratgene，Calif.）のXho Ｉ及びCla Ｉ部位の中に入れ、そしてDNA配列決定により確認した。この構築体をpBluescri pt KSII＋FeLV gag/protと命名した。このXho Ｉ−Cla Ｉフラグメントを切り出し、そしてKT-3骨格に挿入する。Ｃ．FIV env/rev/RREレトロウィルスベクターの構築 FIV env/rev/RRE遺伝子をエンコードする配列を増幅させ、そして以下のプライマーを用いて、上記の実施例２に本質的に記載の通りにして、プラスミドpFIV -14-Petaluma （NIH Research and ReferenceReagent Program，Maryland）から単離する：センスプライマーはクローン34F10の位置6020にある５’末端に置かれている２つの連続するXho Ｉ制限部位を有する（Talbottら、PNAS 86：5743-5747，198 9）：（配列ID No.3）アンチセンスプライマー配列はクローン34F10の位置9387にある配列に相補性である。このプライマーの５’末端は２つの連続するCla Ｉ部位を含む：（配列ID No.4）このPCR生成物をpBluescript KSII＋プライマー（Stratagene，Calif）の中に入れ、そしてDNA配列決定により確認する。この構築体をpBluescript KSII＋FIV env/rev/RREと命名した。次にこのXho Ｉ−Cla Ｉフラグメントを切り出し、そしてKT-3骨格に挿入する。Ｄ．FIV gag/rev/RREレトロウィルスベクターの構築 sp 72（Promega，Wisc.）プラスミドの中のCla Ｉ部位をまず１）Cla Ｉ消化により殺し；２）クレノウフラグメントによりブラント化し；そして３）再リゲートする。ｉ）psp 72 BIB-FIV gagの構築 Sph Ｉ及びBgl II制限部位がオープンリーディングフレームと並んでいるFIV gagオープンリーディングフレームを構築するため、下記のプライマーを用いてP CR反応を行う：センスプライマー配列はクローン34F10の位置612からである。２つの連続する Sph Ｉ制限部位がこのプライマーの５’末端にある：（配列ID No.5）アンチセンスプライマー配列は34F10クローンの位置1959にある配列に対して相補性である。このオリゴヌクレオチドは２つの連続するインフレーム停止コドンをFIV gagオープンリーディングフレームと共に含む：（配列ID No.6）得られるPCR生成物はSph Ｉ−Bgl II/FIV gagと命名する。３部リゲーションにおいて、Bgl II−Sph Ｉ BIPフラグメント（Peter Sarnow ．Univ．of Colo．Health Sciences Center，Denver，ヒトイムノグロブリン重鎖結合性タンパク質）、Sph Ｉ−Bgl II／FIV gag PCR生成物を、Cla Ｉ部位を有さない再操作psp 72ベクターのCIP（牛小腸ホスファターゼ、New England Bio labs，Mass）処理Bgl II部位の中にリゲートする。このインサートをDNA配列決定により確認する。この構築体をpsp 72 BIP-FIV gagと命名する。BIP-FIV gag を含むこのBgl IIフラグメントを切り出し、そして下記のリゲーションに用いる。 ii）pBluescript KSII＋/FIV rev/RREの構築 FIV rev/RREを、以下の２つの追加のオリゴヌクレオチドを伴って、FIV env/r ev/RREを作るのに用いてセンスプライマー配列IDNo.3及びアンチセンス配列ID N o.4によるPCR部位特異的突然変異誘発（Hoら、Gene 77：51-59，1989）により構築する：センスプライマー配列（配列ID No.7）及びアンチセンスプライマー配列（配列ID No.8）プライマー配列ID No.7及び８の中にかくれているのは34F10クローンの位置67 98にあるFIV env遺伝子とインフレートとなっている２つの連続した停止コドンである。プライマー配列No.3と８を最初のPCR反応に用いて、２つのインフレーム停止コドンを有するFIV envのアミノ末端領域を作り上げる。この二本鎖DNAをFIV env/amino/stopと命名する。プライマー配列No.7と４を第二PCR反応に用いて、FIV env/amino/stopの両停止コドンを包括する相補性領域を有するFIV envのカルボキシル末端領域を作り上げる。この二本鎖DNAをFIV env/carboxyl/stopと命名する。PCR生成物、FIV env/ami no/stop及びFIV env/carboxyl/stopを変性させ、再アニールさせ、そしてプライマー配列No.3と４による第三のPCR反応にかける。この二本鎖DNAをFIV env/RRE と命名する。このFIV env/RRE DNAをXho Ｉ及びCla Ｉで消化し、次いでpBluesc ript KSII＋プラスミドのXho Ｉ及びCla Ｉ部位の中にサブクローンし、そしてD NA配列決定により確認する。この中間構築体をpBluescript KSII＋/FIVrev/RRE と命名する。 iii．KT-3 FIV gag/rev/RREの構築 pBluescript KSII＋/FIV rev/RREをBcl Ｉにより位置7249で消化し（Talbott ら、PNAS 86：5743-5747，1989）、次いでCIP処理する。Bgl II BIP-FIV gagフラグメントをpsp 72 BIP-FIV gagより切り出し、そしてBcl Ｉ部位の中にセンス配向で挿入する。この構築体をpBluescript KSII＋/BIP-FIV gag/rev/RREと命名する。この構築体をApa Ｉ部位で切断し、クレノウフラグメントでブラント化し、次いでCla Ｉで切断する。KT-3骨格のXho Ｉ部位をXho Ｉで切り、そしてクレノウフラグメントでブラント化し、次いでCla Ｉで切断する。ブラント化したAp a ＩからCla Ｉ部位に至るBIP-FIV gag/rev/RREフラグメントをKT-3骨格のブラント化したXho Ｉ部位及びClaＩ部位の中に挿入する。実施例４多価レトロウィルスベクターの構築Ａ．FIV env/rev/RRE, FeLV envレトロウィルスベクターの構築 i．IRBSを有する多価envレトロウィルスベクター psp 72由来のIRBS（BIP）を含むCla Ｉ−Hind IIIフラグメントをまずpBluesc ript KSII＋プラスミド内の対応の部位の中に挿入した。2.0 KbのFeLV env Pst ＩフラグメントをPst Ｉ部位にBIPに対してセンスな配向で挿入する。この構築体をpB1uescript KSII＋/BIP-FeLV envと命名する。 FIV env/rev/RREをまずpBluescript KSII＋/FIV env/rev/RREプラスミドから、Xho Ｉ及びCla Ｉ消化によって切り出し、そしてKT-1骨格のXho Ｉ−Cla Ｉ部位の中に挿入する。この構築体をCla Ｉ部位で切り、そしてクレノウフラグメントによりブラント化する。pBluescript KSII＋/BIP-FeLV env由来のCla Ｉ−Bam H Ｉフラグメントを単離し、クレノウフラグメントによりブラント化し、そして KT-1レトロウィルス骨格のブラント化Cla Ｉ部位にセンス配向で挿入する。 ii）CMVプロモーターを有する多価envレトロウィルスベクター FIV env/rev/RREをまずpBluescript KSII＋/FIV/env/rev/RREプラスミドから、Xho Ｉ及びCla Ｉ消化によって切り出し、そしてKT-1骨格のXho Ｉ−Cla Ｉ部位の中に挿入する。この構築体をCla Ｉ部位で切り、そしてクレノウフラグメントによりブラント化する。Xho Ｉ−Cla Ｉ FeLV envフラグメントをクローニング中間体psp72-FeLV envベクターより単離し、そしてpUC 18 CMV gag/pol/CARの中にXho Ｉ−Cla Ｉインサートの代わりに入れる。次にこのCMVFIV envをPst Ｉフラグメントとして切り出し、T4 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs，Mas s.）によりブラント化し、そしてKT -1レトロウィルス骨格のブラント化Cla Ｉ部位にセンス配向で挿入する。 pUC 18 CMV gag/pol/CARは本質的に下記の通りに構築する。簡単には、pAF/CM V/ Env^R（米国特許第07/395,932号）から、4.7KbのCMV Env^R Pst−ＲＩフラグメントを単離し、そしてpUC 18（NewEngland Biolabs，Mass.）の中にPst Ｉ及びＲＩ部位で挿入する。この構築体をpUC 18 CMV Env^Rと命名する。CMV gag/pol/C ARを作るため、HIV-1 III_B CARをSau 3AフラグメントとしてpBluescriptIIKS⁺/C ARのBam ＨＩ部位の中にサブクローンする。このCARフラグメントをpBluescript IISK⁺/CARよりXho Ｉ-Cla Ｉフラグメントとして切り出す。このXho Ｉ−Xho Ｉ HIV-1 III_B gag/polフラグメントをKS⁺/gag/pol SDデルターから切り出す（米国特許出願第07/395,932号）。CMVプロモーターを含むプラスミド骨格をXhoＩ及びCla ＩによりpUC 18 CMV/Env^Rより切り出す。３部リゲーションにおいて、X ho Ｉ−Xha Ｉ HIV III_B gag-polフラグメント、Xha Ｉ−Cla Ｉ CARフラグメントをpUC 18 CMV/Env^R骨格のXho Ｉ−Cla Ｉ部位の中に挿入して、pUC 18 CMV ga g/pol/CARを作る。Ｂ．FIV gag/rev/RRE,FeLV gagレトロウィルスベクターの構築ｉ．IRBSを有する多価gagレトロウィルスベクター Xho Ｉ制限部位の並んでいるFeLV gag/protを構築するため、下記のプライマーでPCR反応を行う。センスプライマー配列は、FGAプロウィルスの位置609にあるATG開始コドンの上流のFeLV gag/prot遺伝子の５’領域に由来する。このプライマーの５’末端は２つの連続するXho Ｉ制限部位を含む：（配列ID No.1）アンチセンスプライマー配列はFGAプロウィルスの位置2800にある配列に対して相補性であり、そしてFeLV gag/prot遺伝子とインフレームで２つの連続する停止コドンを含む。このプライマーの５’末端は２つの連続するXho Ｉ制限部位を含む：（配列ID No.9）得られるPCR生成物をXho Ｉ部位に、sp 72 BIPプラスミドのBIPに対してセンス配向において挿入し、そしてpsp 72 BIP-FeLV gag/protと命名する。 BIP-FIV gag/rev/RREフラグメントをpBluescript KSII＋/BIP-FIV gag/rev/RR Eより単離し、Apa Ｉ部位で切断し、クレノウフラグメントによりブラント化し、次いでCla Ｉにより切断した。このフラグメントをKT-1骨格のXho Ｉブラント化−Cla Ｉ部位に挿入し、そしてこれをKT-1/BIP-FIV gag/rev/RREと命名する。次いでKT-1/BIP-FIV gag/rev/RREをCla Ｉ部位において切断し、そしてクレノウフラグメントによりブラント化する。psp 72 BIP-FeLV gag/prot由来のCla Ｉ− Nde Ｉ BIP-FeLV gag/protフラグメントをクレノウフラグメントによりブラント化し、そしてKT-1レトロウィルス骨格のブラント化Cla Ｉ部位にセンス配向で挿入する。 ii．CMVプロモーターを有する多価gagレトロウィルスベクター pBluescript KSII＋/BIP-FIV gag/rev/RREをApa Ｉ部位で切断し、クレノウフラグメントによりブラント化し、そしてCla Ｉで切断する。このブラント化Apa ＩからCla Ｉ部位に至るこのBIP-FIV gag/rev/RREフラグメントをKT-1骨格のXho Ｉブラント化及びCla Ｉ部位の中に挿入する。この構築体を次にCla Ｉ部位で切り、そしてクレノウフラグメントによりブラント化する。FeLV gag/protのXho Ｉ−Cla ＩフラグメントをpBluescript KSII＋/FeLV gag/protから単離し、そしてpUC 18 CMV gag/pol/CAR中のXho Ｉ Cla Ｉインサートを置き換える。CMV-FeL V gag/protフラグメントをpst Ｉフラグメントとして切り出し、T4 DNAポリメラーゼによりブラント化し、そしてKT-1レトロウィルス骨格のブラント化Cla Ｉ部位にセンス配向で挿入する。実施例５パッケージング細胞系DXびDAの一過性トランスフェクション及び形質導入Ａ．プラスミドDNAのトランスフェクション DX細胞（WO 92/05266）を１日目に、６cmの組織培養皿上に５×10⁵の集密で植え付ける。２日目に、トランスフェクションの４時間前にその培地を４mlの新鮮な培地と変換する。標準のリン酸カルシウム−DNA共沈殿を、25μｌの2.0ＭのCa Cl₂，10μｇのプラスミドDNA（10mMのトリス−Cl，pH7.5中）及び全体を200μｌにする水を混合することによって行う。沈殿バッファーを、100μｌの500mMのHE PES-NaOH（pH7.1），125μｌの2.0ＭのNaCl，10μｌの150mMのNa₂HPO₄−NaH₂PO₄ （pH7.0）及び全体を１mlにする水を混合することにより新たに調製する。DNA-C aCl₂溶液（200μｌ）を定常撹拌を伴って200μｌの沈殿バッファーに滴下する。室温で30分後、得られる微細な沈殿物を細胞の皿に加える。細胞を、３日目に培地をアスピレートし、そして新鮮な培地を加えるまで、DNA沈殿にさらす。４日目に、ウィルス含有培地を取出し、そして0.45μｍのフィルターに通す。Ｂ．パッケージング細胞系形質導入 DA（WO 92/05266）を１×10⁵細胞／６cm皿でまく。0.5mlの新たに集めたウィルス含有DX培地を、４μｇ／mlのポリブレン（Sigma， Missouri）を含む新鮮培地を有するDA細胞に加える。翌日、G418（800μｇ／ml ）をこれらの細胞に加え、そして翌週にかけて薬剤耐性プールが出来上る。この細胞のプールを、96穴プレートの各ウェルに0.8〜1.0の細胞を加えることにより希釈クローンする。48のクローンを24穴プレートに、次いで６穴プレートに拡張し、その時点で細胞上清液を力価検定のために集める。選択マーカーneoを含むベクターを発現する産生細胞から、1.0mlの産生細胞系上清液を10^-9の希釈率に至るまで５倍希釈し、そして各希釈液を５×10⁵のクランデル（Crandell）ネコ腎臓（CRFK，ATCC CCL 94）細胞を形質導入するために用いる。翌日、この細胞にG418を加え、そして14日後、G418耐性コロニーを各希釈率において評点する。 neo-多価ベクターを発現するDNA産生細胞を、４μｇ／mlのポリブレンを含む新鮮な培地を有する新たに集めた0.5mlのウィルス含有DX培地の形質導入の３日後に希釈クローンする。48のクローンを24穴プレートに拡張し、そして細胞上清液を実施例６において力価検定する。実施例６多価ベクターについての力価検定多価ベクターについての力価検定この多価ベクターは選択マーカー、例えばネオマイシン遺伝子を含まないため、ベクターの力価検定のための別の方法を述べる。より詳しくは、1.0mlのベクター上清液を10^-9の希釈率まで５倍希釈し、そして各希釈液を５×10⁵のCRFK細胞を形質導入するために使用する。１週間後、DNAを各皿から抽出した（Willis ら、J．Biol．Chem．259：7842-7849，1984）。FIV gag又はFIV envを下記のPCR プライマーを利用するPCRにより増幅させる： FIV gagのためのセンスプライマー配列：（配列ID No.10）はクローン34F10の位置612に由来する。アンチセンスプライマー配列：（配列ID No.11）は34F10クローンの位置1959に対して相補性である。 FIV envのためのセンスプライマー配列：（配列ID No.12）はクローン34F10の位置6020に由来する。アンチセンスプライマー配列：（配列ID No.13）はクローン34F10の位置9387に由来する。 PCR生成物を適当なプローブでサザンブロット分析により分析する（Sambrook ら、Molecular Cloning，a Laboratory Manual第２版Cold Spring Harbor Labor atory，Cold Spring Harbor，NY，1989）。シグナルは全ての低めの希釈率において予測され、そして一定の希釈率で衰え、高めの希釈率は全てシグナルを有さないものである。シグナルが識別できる最後の希釈率がベクターの感染力Ｕ／ml をもたらす。実施例７Ａ．ベクター構築体によるネズミ細胞の形質導入ネズミ繊維芽細胞系BC 10 ME（Patekら、Cell Imm．72：113-121，1992）（BC ，H-2d）を、10％の胎児牛血清（FBS）（Gemini， Calabasas，California）を含むダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）、4,500mg ／ｌのグルコースとＬ−グルタミン（Irvine Scientific，Santa Ana，Californ ia）の中で増殖させる。 BC 10 ME細胞系をレトロウィルスベクターで形質導入し、そしてクローンを実施例5Bに記載の通りに、800μgm／mlのG418を使用して14日間かけて選別する。ウェスタンブロットを利用してタンパク質発現についてアッセイするために細胞を溶解した。BC 10 ME細胞系をこの多価ベクターで形質導入すると、これらの細胞は２０Ｕ／細胞の感染重度で形質導入されたこととなる。形質導入の１週間後、細胞を溶解させ、そしてウェスタンブロット分析を利用してタンパク質発現についてアッセイする。Ｂ．ベクター構築体によるネコ細胞の形質導入ネコの腎臓の細胞系（CRFK）を、10％のFBSを含むDMEMの中で増殖させる。CRF K細胞を実施例5Bに記載の通りにベクター構築体で形質導入し、そしてウェスタンブロット分析を利用してネコ細胞におけるベクター発現を示すのに用いる。樹立された自己ネコＴ−細胞（下記の実施例10Bに記載）系をベクター産生細胞系との共培養により形質導入せしめる。１×10⁶のDA（ベクタ産生細胞系）を照射に付し（10,000rad、室温）、そしてこの樹立自己Ｔ−細胞系由来の１×10⁶ のＴ−細胞と共に３日間プレート培養する。これらの細胞を上記と同一の方法でこのベクター産生系と更に２回共培養する。３回目の共培養後、これらの細胞を G418選別にかける。これらの細胞をウェスタンブロット分析により所望のタンパク質の発現についてアッセイする。実施例８ウェスタンブロット分析による形質導入遺伝子の発現タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によってその分子量（MW）に従って分別する。タンパク質を次にこのゲルからIPVH Immobilon -P膜（Millipore Corp.，Bedford，Mass.）に移す。Hoefer HSI TTE転写装置（H oefer Scientific Instruments，Calif.）をゲルから膜にタンパク質を転写するために用いる。次にこの膜を発現タンパク質に特異的に反応するポリクローナル抗体でプローブする。結合抗体を、オートラジオグラフィーによる形質導入タンパク質の識別を可能にする¹²⁵Ｉ−ラベルプロテインＡを用いて検出する。実施例９腫瘍形成能及び形質転換Ａ．腫瘍形成能アッセイヌードマウスにおける腫瘍形成は腫瘍形成能を決定するための特に重要、且つ高感度方法である。ヌードマウスは成熟Ｔ−細胞を保有せず、それ故機能的な細胞性免疫系を欠き、細胞の腫瘍形成能力を試験する有用なインビボモデルを担う。正常な非腫瘍形成性細胞はヌードマウスの中に注入されたときに無秩序な増殖特性を示さない。しかしながら、形質転換細胞は迅速に増殖し、そしてヌードマウスにおいて腫瘍を発生させるであろう。簡単に述べると、このベクター構築体をヌードマウスに注射によって投与する。腫瘍増殖を調べるために注射して４〜 16週間かけてこのマウスを目視検査する。腫瘍が存在しているかどうかを決定するためにマウスを殺して解剖してもよい（GiovanellaらJ．Natl．Cancer Inst． 48：1531-1533，1972；Fureszら「Tumorigenicity testing of cell linesconsi dered for production of biological drugs」AbnormalCells，New Products an d Risk，Hopps and Petricciani（編），Tissue Culture Association，1985；及びLevenbookらJ．Biol．Std．13：135-141，1985）。この試験はQuality Biot ech Inc.，NJ により行われる。Ｂ．形質転換アッセイ腫瘍形成能はソフトアガー中のコロニー形成を識別することによっても評価できる（Mac Phersonら、Vir．23：291-294，1964）。簡単に述べると、正常な非腫瘍形成性細胞の一の性質は定着依存性増殖にある。正常な非腫瘍形成性細胞は半固形状アガー支持培地の中では増殖を停止し、一方、腫瘍形成性細胞はソフトアガーの中で増殖し続けてコロニーを形成するであろう。ヒト線維肉腫に由来し、且つ１００％のヌードマウスにおいて腫瘍を生じせしめることで知られる腫瘍性細胞系HT 1080（ATCC CCL 121）をアッセイのポジティブコントロールとして用いる。ヌードマウスにおいて腫瘍形成性であり二倍体胎芽ヒト肺細胞系WI-38（ATCC CCL75）をアッセイのネガティブコントロールとして用いる。まず、ネコ繊維芽細胞又はWI-38細胞系を実施例6Bに記載の通りにしてベクター構築体で形質導入する。各形質導入細胞系、HT1080及びWI-38それぞれの二重サンプルをアガーの中で培養する。簡単に述べると、DMEM 17％FBS中の5.0mlの0 .8％のBactoagar（Difco，Michigan）の下層を60mmの組織培養プレートの上で硬化させる。これに、細胞が５×10⁵細胞／mlの濃度で懸濁されている同一の培地中の2.0mlの0.3％のBactoagarをかぶせる。バックグランドの塊を少なくするため、各細胞系をアガー溶液の中に懸濁する前に70μｍのナイロンメッシュでこす。これらのプレートを５％のCO₂の多湿雰囲気の中で37℃で14日間インキュベートする。24時間のプレート培養内で、各細胞系の代表的なプレートをプレートに存在している細胞塊について調べる。13日目に、このプレートを1.0mlのINTウィルス染料（Sigma，Missouri）で染め、そして14日目に、それらを１mmの接眼レチクルを利用して直径において≧150μｍのコロニーについてスキャンする。任意の方向において150μｍに広がるコロニーのみを採点し、なぜならこのサイズのコロニーは顕微鏡のもとで全面において容易に観察することができ、そして非形質転換細胞のめったにこのサイズのコロニーを形成しないからである。このアッセイの終了時において、各細胞系についてのプレート培養効率をｂ／ａ× 100として計算する。ここでｂ＝全プレート上のコロニーの合計であり、そしてａ＝細胞プレートの総枚数である。非形質転換細胞系は0.001％以下のプレート培養効率を有するものである。従って、形質転換細胞系は0.001％より大のプレート培養効率を有するであろう（Risserら、Vir．59：477-489，1974を参照のこと）。実施例１０細胞障害アッセイＡ．マウス生後６〜８週目の雌のBALB／ｃマウス（Harlan Sprague-Dawley，Indianapoli s，Indiana）に、１×10⁷の照射剤（10,000rads、室温）ベクター形質導入細胞を２回腹腔膜内的（i.p.）に注射する。動物を７日後に殺し、そして牌臓細胞（３×10⁶／ml）をインビトロで、フラスコ（Ｔ−25，Corning，Corning，New Yor k）の中で照射剤同系形質導入細胞（６×10⁴／ml）と培養する。培養培地はRPMI 1640（Irvine Scientific，Santa Ana，Calif.）、熱不活性化胎児牛血清（５％，Hyclone，Logan，Utah）、ピルビン酸ナトリウム（１mM）、ゲンタマイシン（50μｇ／ml）及び２−メルカプトエタノール（10^-5Ｍ，Sigma Chemical，St． Louis，Missouri）より成る。エフェクター細胞を４〜７日後に回収し、そして様々なエフェクター：標的細胞の比を利用して96穴マイクロタイタープレート（ Corning，Corning，New York）の中で標準の４〜６時間アッセイにおいて試験する。このアッセイはNa₂ ⁵¹CrO₄−ラベル化（Amersham，ArlingtonHeights，Ill inois）（100μCi，１hr，37℃）標的細胞（１×10⁴細胞／ウェル）を200μｌの最後容量で採用する。インキュベーション後、100μｌの培養培地を取出し、そしてBeckmanガンマー光度計で分析する。自発放出（SR）は標的と培地とに由来するCPMとして決定し、そして最大放出（HR）は標的と１ＭのHCIとに由来するCP Mとして決定する。％標的細胞溶解は：〔（エフェクター細胞＋標的CPM）−（SR）／（MR）−（SR）］×100として計算する。標的の自発放出の値はMRの一般に10％〜20％である。Ｂ．ネコ上述のベクターはネコを処置するために利用されるものであるため、ネコにおける免疫学的効果を実証するアッセイが必要とされる。以下は標準の⁵¹Cr放出アッセイ（Brownら、J．Vir．65：3359-3364，1991）にとっての再剌激因子及び標的細胞のために必要とされる自己Ｔ−細胞系の作製の詳細である。末梢血液単核細胞（PBMC）を静脈穿剌及びフィコール−ジトリゾン酸ナトリウム（sodiumdiat rizoate）（Histopaque-1077；Sigma，St．louis，Mo.）密度勾配遠心を経て得る。これらのPBMCを５μｇ／mlのコンカナバリンＡ（Con A，Sigma）により３日間剌激し、そして25Ｕ／mlのヒト組換インターロイキン−２（IL-2）（Boehring er Mannheim Biochemicals，Indianapolis，Ind）及び10％の牛Ｔ−細胞成長因子（TCGF）を含む培地の中で維持する。細胞を丸底96穴マイクロタイタープレートの中で、ウェル当り平均して１又は0.3の細胞で、５×10⁴の照射剤（3,000rad ）自己PBMC，10％の牛TCGF及び25Ｕ／mlのIL-2を伴って、最終容量200μｌの完全RPMIの中で稙え付ける。完全RPMIは10％のFBB，2mMのＬ−グルタミン、５×10^-5 Ｍの２−メルカプトエタノール及び５０μｇのゲンタマイシンをml当り含むRPMI 1640培地より成る。クローンを次に48穴、次いで24穴プレートに拡張する。数週間後、細胞を実施例7Bに記載の通りに、FeLV又はFIV gagもしくはenv遺伝子のどれかを発現するレトロウィルスベクターで形質導入する。これらの細胞系の発現を実施例８に記載の通りにしてウェスタンブロット分析によりモニターする。高レベルの所望のタンパク質を発現する細胞系は、実施例10Aに記載の標準の⁵¹Cr放出アッセイにおいて再刺激因子及び標的として機能する。以上より、明らかであることは、本発明の態様を例示の目的でここで述べてきたが、様々な改変が本発明の範囲を逸脱することなく行うことができる。従って、本発明は添付の請求の範囲以外に限定されることはない。配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：名称：Viagene，Inc．通り：11075 Roselle Street 町：San Diego，California 国：USA 郵便番号：92121 電話番号：（619）452-1288 ファックス番号：（619）453-0095 発明者：Lee，William T.L. Serbin，John J． Jolly，Douglas J． Barber，Jack R． Chada，Sunil Chang，Stephen M.W．（ii）発明の名称：ネコ白血病ウィルス及びネコ免疫不全ウィルスを処置するための組成物及び方法（iii）配列の数：13 （iv）連絡先：（Ａ）あて先：Seed and Berry （Ｂ）通り：6300 Columbia Center，701 Fifth Avenue （Ｃ）町：Seattle （Ｄ）州：Washington （Ｅ）国：U.S.A. （Ｆ）郵便番号：98104 （ｖ）コンピューター読取形式：（Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：IBM PC コンバチブル（Ｃ）作動システム：PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウェア：Patentln Release#1.0,バージョン#1.25 （vi）現出願のデーター：（Ａ）出願番号：N/A （Ｂ）出願日：N/A （Ｃ）分類：N/A （viii）代理人／代理店情報：（Ａ）名称：McMasters，David D．（Ｂ）登録番号：33,963 （Ｃ）参照／事件番号：930049.415PC （ix）通信情報：（Ａ）電話：206-622-4900 （Ｂ）ファックス：206-682-6031 （Ｃ）テレックス：3723836 （２）SEQ ID NO：１についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：39塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：１：（２）SEQ ID NO：２についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：47塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：２：（２）SEQ ID NO：３についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：44塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：３：（２）SEQ ID NO：４についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：41塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：４：（２）SEQ ID NO：５についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：45塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：５：（２）SEQ ID NO：６についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：50塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：６：（２）SEQ ID NO：７についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：31塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：７：（２）SEQ ID NO：８についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：35塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：８：（２）SEQ ID NO：９についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：47塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：９：（２）SEQ ID NO：10についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：31塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：10：（２）SEQ ID NO：11についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：29塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎮の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：11：（２）SEQ ID NO：12についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：30塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：12：（２）SEQ ID NO：13についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：27塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：cDNA （iii）ヒポセティカル：NO （xi）配列の詳細：SEQ ID NO：13：

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９４年４月１４日【補正内容】請求の範囲〔1994年４月14日（94.04.14）に国際事務局により受理；当初の請求項１−19を補正請求項１−19に置き換える（３頁）〕１．ネコ白血病ウィルス感染症を処置又は予防するための医薬品の製造において使用するための、ネコ白血病ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導せしめるベクター構築体。２．前記ベクター構築体がp15gag，p12gag，p27gag，p10gag，p14pol，p80pol ，p46pol，gp70env及びp15envより成る群から選ばれる抗原の発現を誘導せしめる、請求項１記載のベクター構築体。３．前記ベクター構築体がgp85envの発現誘導せしめる、請求項１記載のベクター構築体。４．ネコ免疫不全ウィルス感染症を処置又は予防するための医薬品の製造において使用するための、ネコ免疫不全ウィルスの少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導せしめるベクター構築体。５．前記ベクター構築体がp15gag，p24gag，p10gag，p13pol，p62pol，p15pol 及びp36polより成る群から選ばれる抗原の発現を誘導せしめる、請求項４記載のベクター構築体。６．前記ベクター構築体がgp68env，gp27env及びrevの発現を誘導せしめる、請求項４記載のベクター構築体。７．ネコ白血病ウィルス及びネコ免疫不全ウィルスの感染症を処置又は予防するための医薬品の製造において使用するための、ネコ白血病ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分とネコ免疫不全ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分との同時発現を誘導せしめるベクター構築体。８．前記ベクター構築体がネコ汎白血球減少症ウィルス、ネコカリチウィルス、ラビエスウィルス及びネコヘルペスウィルスより成る群から選ばれるネコウィルスの免疫原性部分の発現をも誘導せしめる、請求項７記載のベクター構築体。９．前記ベクター構築体が組換レトロウィルスにより担持されている、請求項１，４又は７記載のべクター構築体。 10．前記ベクター構築体が、ポリオウィルス、リノウィルス、ポックスウィルス、インフレンザウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス、ヘルペスウィルス、SV40，HIV、麻疹及びシンドビスウィルスより成る群から選ばれる組換ウィルスにより担持されている、請求項１，４又は７記載のベクター構築体。 11．ネコ免疫不全ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分とネコ白血球ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分との同時発現を誘導せしめる、ベクター構築体。 12．前記ネコ白血病ウィルス抗原が、gp85envであり、そして前記ネコ免疫不全ウィルス抗原がgp68env，gp27env及びrevである、請求項１１記載のベクター構築体。 13．請求項11又は12記載のベクター構築体を担持している組換レトロウィルス。 14．ネコ白血病ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導せしめるベクター構築体を担持している組換レトロウィルス。 15．ネコ免疫不全ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導せしめるベクター構築体を担持している組換レトロウィルス。 16．前記ウィルスがポリオウィルス、リノウィルス、ポックスウィルス、インフレンザウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス、ヘルベスウィルス、SV40 ，HIV、麻疹及びシンドビスウィルスより成る群から選ばれるものである請求項11又は12記載のベクター構築体、を担持している組換ウィルス。 17．請求項13，14又は15記載の組換レトロウィルスにより感染された標的細胞。 18．請求項13，14又は15記載の組換レトロウィルスを、薬理学的に許容されている担体又は希釈剤との組合せで含んで成る薬理組成物。 19．請求項16記載の組換ウィルスを、薬理学的に許容されている担体又は希釈剤との組合せで含んで成る薬理組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 7/00 8931−4Ｂ (72)発明者ジョリー，ダグラスジェイ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92037, サンディエゴ，ビアアリカントドライブ 30508 (72)発明者バーバー，ジャックアールアメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サンディエゴ，カーロッタストリート 11168 (72)発明者チャダ，サニルアメリカ合衆国，カリフォルニア 92083, ビスタ，エンチャントメントアベニュ 1542 (72)発明者チャン，スティーブンエム．ダブリュ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サンディエゴ，ビアカセラス 9838

Claims

【特許請求の範囲】１．ネコ白血病ウィルス感染症を処置又は予防するための方法であって、細胞系免疫応答が発生するように、ネコ白血病ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導せしめるベクター構築体をネコに投与することを含んで成る方法。２．前記ベクター構築体がp15gag，p12gag，p27gag，p10gag，p14pol，p80pol ，p46pol，gp70env及びp15envより成る群から選ばれる抗原の発現を誘導せしめる、請求項１記載の方法。３．前記ベクター構築体がgp85envの発現誘導せしめる、請求項１記載の方法。４．ネコ免疫不全ウィルス感染症を処置又は予防するための方法であって、細胞系免疫応答が発現するように、ネコ免疫不全ウィルスの少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導せしめるベクター構築体をネコに投与することを含んで成る方法。５．前記ベクター構築体がp15gag，p24gag，p10gag，p13pol，p62pol，p15pol 及びp36polより成る群から選ばれる抗原の発現を誘導せしめる、請求項４記載の方法。６．前記ベクター構築体がgp68env，gp27env及びrevの発現を誘導せしめる、請求項４記載の方法。７．ネコ白血病ウィルス及びネコ免疫不全ウィルスの感染症を処置又は予防する方法であって、ネコ白血病ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分とネコ免疫不全ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分との同時発現を誘導せしめるベクター構築体を、前記ウィルスに対する細胞性免疫応答が発生するように、ネコに投与することを含んで成る方法。８．前記ベクター構築体がネコ汎白血球減少症ウィルス、ネコカリチウィルス、ラビエスウィルス及びネコヘルペスウィルスより成る群から選ばれるネコウィルスの免疫原性部分の発現をも誘導せしめる、請求項７記載の方法。９．前記ベクター構築体が組換レトロウィルスにより担持されている、請求項１，４又は７記載の方法。 10．前記ベクター構築体が、ポリオウィルス、リノウィルス、ポックスウィルス、インフレンザウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス、ヘルペスウィルス、SV40，HIV、麻疹及びシンドビスウィルスより成る群から選ばれる組換ウィルスにより担持されている、請求項１，４又は７記載の方法。 11．ネコ免疫不全ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分とネコ白血球ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分との同時発現を誘導せしめる、ベクター構築体。 12．前記ネコ白血病ウィルス抗原が、gp85envであり、そして前記ネコ免疫不全ウィルス抗原がgp68env，gp27env及びrevである、請求項11記載のベクター構築体。 13．請求項11又は12記載のベクター構築体を担持している組換レトロウィルス。 14．ネコ白血病ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導せしめるベクター構築体を担持している組換レトロウィルス。 15．ネコ免疫不全ウィルス抗原の少なくとも一の免疫原性部分の発現を誘導せしめるベクター構築体を担持している組換レトロウィルス。 16．前記ウィルスがポリオウィルス、リノウィルス、ポックスウィルス、インフレンザウィルス、アデノウィルス、パルボウィルス、ヘルペスウィルス、SV40 ，HIV、麻疹及びシンドビスウィルスより成る群から選ばれるものである請求項11又は12記載のベクター構築体、を担持している組換ウィルス。 17．請求項13，14又は15記載の組換レトロウィルスにより感染された標的細胞。 18．請求項13，14又は15記載の組換レトロウィルスを、薬理学的に許容されている担体又は希釈剤との組合せで含んで成る薬理組成物。 19．請求項16記載の組換ウィルスを、薬理学的に許容されている担体又は希釈剤との組合せで含んで成る薬理組成物。