ES2327340T3 - Procedimiento y dispositivo para detectar el virus de la inmunodeficiencia felina. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento in vitro para distinguir entre (a) los félidos que han sido infectados de manera natural con el VIF o félidos vacunados con la vacuna entera del VIF muerto producida a partir de múltiples cepas que tienen diferentes subtipos, y en una fase de inicial transitoria de producción de anticuerpos y (b) los félidos vacunados con dicha vacuna entera del VIF muerto y después de una fase inicial transitoria de producción de anticuerpos o los félidos que no han sido infectados, procedimiento que comprende las etapas de: poner en contacto una primera muestra biológica que ha sido tomada de un félido con un polipéptido env del VIF para formar un primer complejo de anticuerpo-polipéptido env en presencia de anticuerpos frente a env del VIF, si los hay, en la primera muestra biológica; detectar la presencia o la ausencia del primer complejo; determinar que el félido: (i) está infectado de manera natural con el VIF o vacunado y en la fase inicial transitoria de producción de anticuerpos, si el primer complejo está presente; o (ii) no está infectado con el VIF ni vacunado y después de la fase inicial transitoria de producción de anticuerpos, si el primer complejo está ausente.
Description
Procedimiento y dispositivo para detectar el
virus de la inmunodeficiencia felina.
La invención se refiere a la detección de
anticuerpos dirigidos frente al virus de la inmunodeficiencia
felina.
El virus de la inmunodeficiencia felina (VIF),
anteriormente denominado lentivirus linfotrófico T felino, fue
aislado por primera vez en 1986 de un gran hogar con múltiples gatos
situado en Petaluma, Calif. (Pederson et al., Science (1987)
235:790). El VIF infecta a los gatos para producir un síndrome como
el SIDA. Aunque el VIF es morfológica y patológicamente similar al
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), se ha demostrado que es
distinto antigénicamente del VIH. Como el VIH, una vez que un gato
es infectado por el VIF, la enfermedad progresa desde una infección
primaria (viremia, fiebre, linfadenitis general) hasta una larga y
pesada fase asintomática, seguida por una deficiencia grave de la
función inmune provocada por una reducción de los linfocitos CD4 y
que da como resultado una mayor susceptibilidad a infecciones
secundarias y, en última instancia, la muerte.
El VIF ha sido clasificado como un miembro de la
subfamilia Lentiviridae de la familia Retroviridae,
la familia que incluye los virus de la inmunodeficiencia humana y de
simio, la anemia infecciosa equina, y el virus
Maedi-Visna de oveja y el de la artritis encefálica
caprina (VAEC). El genoma del VIF se organiza como otros lentivirus
con tres largos marcos de lectura abiertos correspondientes a
gag, pol y env (Talbott et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (1989) 86:5743; Olmsted et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. (1989) 86:2448). El gen gag codifica los
principales componentes estructurales del virus, el gen env
codifica la glicoproteína de la envoltura y el gen pol
codifica la proteína
polimerasa.
polimerasa.
El gen gag se expresa como una
poliproteína de 55 kD que está procesada en tres subunidades: una
proteína de la matriz p15, una proteína de la cápside p24 y una
proteína de la nucleocápside p10. El gen pol codifica tres
proteínas: la proteasa, la transcriptasa inversa y una proteína
p14.6 de función desconocida. El autoprocesamiento realizado por la
parte de proteasa del gen da lugar a las tres proteínas de la región
pol. Además, la proteasa es responsable del procesamiento
del precursor gag. El gen pol se expresa como una
proteína de fusión gag-pol. El gen de la
envoltura se expresa como una glicoproteína de 160 kD, la gp160. La
antigenicidad de las proteínas del núcleo del VIF es similar a la
de otros lentivirus.
Se han preparado varios aislados víricos
independientes en todo el mundo, y se ha llevado a cabo un cierto
número de estudios para demostrar la estructura de las cepas
aisladas: la cepa estadounidense Petaluma, Talbott et al. Natl.
Acad. Sci. EE.UU., 1989, 86, 5743-5747;
Philipps et al., J. Virol., 1990, 64, 10,
4605-4613), las cepas japonesas (las cepas TM1 y
TM2), Miyazawa et al., Arch. Virol., 1989, 108,
59-68, y los aislados suizos (FIVZ1 y FIVZ2),
Morikawa et al., Virus Research, 1991, 21,
53-63.
Se han descrito las secuencias de nucleótidos de
tres clones províricos derivados de los aislados de VIF
estadounidenses (cepa Petaluma) (clones FIV34TF10, FIV14 y el
asilado PPR) (Olmsted, et al. 1989; Philipps et al.,
1990; Talbott et al., 1989) y se han comparado con dos
aislados suizos (Morikawa et al. 1991). Esta comparación
condujo a Morikawa et al. a especificar la presencia de
ciertas regiones conservadas y ciertas regiones variables dentro
del gen env del VIF. También se han aislado cepas francesas
(cepas Wo y Me) (Moraillon et al., 1992, Vet. Mic.,
31, 41-45).
El virus se replica óptimamente en células
mononucleares sanguíneas y tiene un tropismo para los linfocitos T,
el macrófago peritoneal, el macrófago cerebral y los astrocitos. En
común con otros retrovirus, el material genético del VIF está
compuesto por ARN, siendo la producción de una copia de ADN del ARN
vírico una etapa esencial en la replicación del VIF del huésped.
Esta etapa requiere la enzima transcriptasa inversa que es portada
en el huésped por el virus invasor. La versión de ADN del genoma
vírico es insertada en el material genético de las células huésped
infectadas en las que continúa para residir como un provirus. Este
provirus se replica cada vez que la célula se divide y puede
codificar la producción de nuevas partículas de virus. Las células
infectadas con el VIF permanecen infectadas durante toda su
vida.
El virus parece ser propagado de manera natural
por transmisión horizontal, predominantemente, por heridas causadas
por mordeduras de un gato infectado, pues estos animales liberan
cantidades apreciables de virus en la saliva (Yamamoto et al.,
Am. J. Vet. Res. 1988, 8:1246). Se ha publicado información
sobre la transmisión vertical, pero ésta es escasa.
Los actuales análisis de diagnóstico para la
infección por VIF detectan anticuerpo (Ac) en suero frente al VIF.
También hay disponibles equipos de detección del virus, pero no son
corrientes. Hay un número de análisis de diagnóstico disponibles
para determinar la presencia del anticuerpo frente a VIF en animales
infectados. Por ejemplo, el equipo de análisis del Ac frente al VIF
PetChek® y el equipo de análisis del Ag del VLFE/Ac frente al VIF
SNAP® Combo (Laboratorios IDEXX, Westbrook, Me.) son análisis de
diagnóstico basados en el inmunoanálisis para la infección por
VIF.
La detección de la infección por VIF se está
volviendo cada vez más importante, pues los estudios revelan que la
infección por VIF está extendida por todo el mundo Como se han
desarrollado vacunas en un intento por combatir la enfermedad, es
incluso más importante ser capaz de detectar la eficacia de una
vacuna y poder distinguir entre los gatos vacunados y los gatos
infectados de manera natural. Murray, 2003, J. Am. Vet. Med.
Assoc., 222(6), 710 sugieren tatuar
los gatos tras la vacunación para poder diferenciar entre los gatos vacunados y los gatos infectados de manera natural.
los gatos tras la vacunación para poder diferenciar entre los gatos vacunados y los gatos infectados de manera natural.
La invención se dirige a un procedimiento in
vitro para distinguir entre (a) los félidos que han sido
infectados de manera natural con el VIF o los félidos vacunados con
una vacuna entera del VIF muerto, producida a partir de múltiples
cepas que tienen diferentes subtipos, y en una fase de producción
inicial transitoria de anticuerpos, y (b) los félidos vacunados con
dicha vacuna entera del virus muerto y transcurrida la fase inicial
transitoria de producción de anticuerpos o los félidos que no han
sido infectados.
En un aspecto, la presente memoria proporciona
un procedimiento para determinar si un félido ha sido vacunado
frente al VIF o está infectado de manera natural por el VIF mediante
la determinación de la respuesta inmune del félido a un polipéptido
del VIF, tal como un polipéptido env del VIF.
En otro aspecto, la memoria se dirige a un
procedimiento para distinguir entre animales que han sido infectados
de manera natural por el VIF frente a animales que no han sido
infectados o han sido vacunados frente a una infección por el VIF.
El procedimiento incluye poner en contacto una muestra biológica de
un animal con un polipéptido que no se una sustancialmente con un
anticuerpo frente al VIF que sea un componente significativo de la
respuesta inmune del animal frente a una vacuna contra el VIF. Se
detectan los anticuerpos frente al VIF de la muestra que se unen
sustancialmente con el polipéptido. Se determina que el animal está
infectado de manera natural mediante la correlación de un resultado
positivo obtenido en la etapa de detección con una infección
natural, y se determina que el animal ha sido vacunado o no está
infectado mediante la correlación de un resultado negativo con una
vacunación o una no infección. El polipéptido puede ser derivado del
env del VIF.
En otro aspecto más, la memoria se dirige a un
procedimiento para determinar si un gato ha sido vacunado frente al
VIF o está infectado de manera natural por el VIF. El procedimiento
incluye (a) detectar, antes de un período de tiempo posterior a la
vacunación suficiente para no detectar ciertos anticuerpos
específicos de antígenos del VIF surgidos como respuesta a la
vacuna, si el gato tiene anticuerpos frente a un péptido del VIF;
(b) detectar, tras un período de tiempo posterior a la vacunación
suficiente como para que no se detecten ciertos anticuerpos
específicos de antígenos del VIF surgidos como respuesta a la
vacuna, si el gato tiene anticuerpos frente a un polipéptido del
VIF; (c) determinar que el animal ha sido vacunado mediante la
detección de anticuerpos en la etapa (a), pero no en la etapa (b),
y (d)
determinar que el animal está infectado de manera natural mediante la detección de anticuerpos en las etapas (a) y (b).
determinar que el animal está infectado de manera natural mediante la detección de anticuerpos en las etapas (a) y (b).
La memoria también proporciona un procedimiento
para determinar si un gato no ha sido infectado por el VIF o ha
sido vacunado frente al VIF. El procedimiento incluye analizar una
muestra biológica del gato para detectar los anticuerpos frente a
un polipéptido derivado del VIF y determinar que el animal no ha
sido infectado o ha sido vacunado mediante la no detección de tales
anticuerpos.
En otro aspecto más, la memoria proporciona un
procedimiento para determinar si un gato ha sido o no ha sido
vacunado frente al VIF o ha sido infectado de manera natural con el
VIF. El procedimiento incluye proporcionar un dispositivo analítico
que comprende un polipéptido, obtener una muestra de sangre de un
gato, procesar la muestra de sangre en el dispositivo analítico y
leer el dispositivo analítico. Un resultado positivo indica que el
gato ha sido infectado de manera natural con el VIF o vacunado
frente al VIF, y un resultado negativo indica que el gato no ha
sido infectado de manera natural con el VIF o no ha sido vacunado
frente al VIF.
Además, la memoria se dirige a un dispositivo de
diagnóstico que tiene un vehículo poroso seco, un primer reactivo
de detección inmovilizado sobre el vehículo poroso, primer reactivo
de detección que incluye una proteína que captura anticuerpos
frente al VIF generados por un huésped como respuesta a bien una
infección por el VIF natural o una vacunación frente al VIF, y un
segundo reactivo de detección inmovilizado sobre el vehículo
poroso, segundo reactivo de detección que incluye una proteína que
captura los anticuerpos frente al VIF generados por un huésped como
respuesta a una infección por el VIF natural, pero que no captura
sustancialmente los anticuerpos generados por el huésped como
respuesta a una vacunación frente al VIF. El primer reactivo de
detección puede ser el antígeno p15 o p24 del VIF, y el segundo
reactivo de detección puede ser una proteína env del
VIF.
En otro aspecto, la memoria se dirige a
polipéptidos novedosos del VIF.
Antes de describir la presente invención
detalladamente, se definirá un número de términos. Como se usan en
la presente memoria, las formas singulares "un", "uno",
"una", "el" y "la" incluyen los referentes en plural,
a no ser que el contexto indique claramente lo contrario.
Como se usa en la presente memoria, el término
"polipéptido" se refiere a un compuesto de una sola cadena o
un complejo de dos o más cadenas de residuos de aminoácido unidos
mediante enlaces peptídicos. La o las cadenas pueden ser de
cualquier longitud. Una proteína es un polipéptido, empleándose los
términos como sinónimos. También se incluyen en el ámbito de la
invención las variantes funcionalmente equivalentes y los fragmentos
de los polipéptidos del VIF. El polipéptido es capaz de unirse a
uno o más anticuerpos específicos del polipéptido.
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Los polipéptidos derivados del VIF incluyen
cualquier región del proteoma del VIF, incluyendo, por ejemplo, las
partes de las regiones gag y env, y los mimítopos de
las mismas. Las patentes estadounidenses n.º 5.648.209, 5.591.572 y
6.458.528 describen polipéptidos del VIF derivados de las proteínas
env y gag del VIF. Estos péptidos y otros similares
procedentes de las proteínas env y gag son adecuados
para su uso en los procedimientos de la presente invención. Los
ejemplos de polipéptidos env adecuados incluyen los
siguientes:
La SEC ID N.º 1 es una secuencia trimérica; el
primer monómero es la secuencia nativa de env del VIF, los
aminoácidos 696-717 con las sustituciones de C a S,
I a V, L a P y T a K; el segundo monómero (subrayado) es un ligador
de KS; el tercer monómero es la proteína env nativa de la
superficie del VIF, los aminoácidos 396-408 con una
adición de C C-terminal. En un aspecto de la
invención, la longitud del ligador de KS es modificada de
2-20 aminoácidos.
La SEC ID N.º 2 es una secuencia trimérica; el
primer monómero es la proteína env nativa del VIF, los
aminoácidos 396-408 con la adición de C
N-terminal; el segundo monómero (subrayado) es un
ligador de KS; el tercer monómero es la proteína env nativa
del VIF, los aminoácidos 694-717 con las
sustituciones de C a S, de I a V, de L a P y de T a K. En un
aspecto de la invención, la longitud del ligador de KS es modificada
de 2-20 aminoácidos.
"Especificidad de unión" o "unión
específica" se refiere al reconocimiento sustancial de una
primera molécula hacia una segunda molécula, por ejemplo, un
polipéptido y un anticuerpo policlonal o monoclonal, o un fragmento
del anticuerpo (p. ej., un fragmento Fv, Fv monocatenario, Fab' o
F(ab')_{2}) específico del polipéptido.
"Unión sustancial" o "unirse
sustancialmente" se refiere a una cantidad de unión específica o
reconocimiento entre las moléculas de una mezcla analítica en
determinadas condiciones analíticas. En su aspecto más amplio, la
unión sustancial se refiere a la diferencia entre la incapacidad de
una primera molécula para unirse o reconocer a una segunda
molécula, y la capacidad de las primeras moléculas para unirse o
reconocer a una tercera molécula, tal que la diferencia sea
suficiente para permitir la realización de un análisis significativo
distinguiendo la unión específica en un determinado conjunto de
condiciones analíticas, que incluye las concentraciones relativas
de las moléculas, y el tiempo y la temperatura de una incubación. En
otro aspecto, una molécula es sustancialmente incapaz de unirse o
reconocer a otra molécula en términos de reactividad cruzada,
presentando la primera molécula una reactividad por una segunda
molécula que es menor del 25%, preferiblemente, menor del 10%, más
preferiblemente, menor del 5% de la reactividad mostrada hacia una
tercera molécula en un determinado conjunto de condiciones
analíticas que incluye la concentración relativa y la incubación de
las moléculas. Se puede analizar la unión específica usando un
número de procedimientos ampliamente conocidos, p. ej., un análisis
inmunohistoquímico, un análisis de inmunoabsorción ligado a una
enzima (ELISA), un radioinmunoanálisis (RIA) o un análisis de
transferencia western.
Los animales infectados con el VIF son félidos,
entendiéndose que incluyen a todos los miembros del orden
Felidae, incluyendo gatos domésticos, leones, tigres,
jaguares, leopardos, pumas, ocelotes, etc. Como se usan en la
presente memoria, los términos "félido", "gato" o
"animal" hacen referencia a todos los félidos.
Una "muestra biológica" se refiere a una
muestra de un sujeto animal que incluye saliva, sangre entera,
suero, plasma u otra muestra conocida por contener anticuerpos
frente al VIF.
Un "anticuerpo que es un componente
significativo de una respuesta inmune de un animal frente a la
vacuna del VIF" se refiere a un anticuerpo que surge como
resultado de una vacunación con una vacuna frente al VIF. Estos
anticuerpos pueden ser idénticos o similares a anticuerpos que
surgen como resultado de una infección natural por el VIF. Una
vacunación satisfactoria produce un nivel medible del anticuerpo que
es un componente significativo de la vacuna frente al VIF.
Las vacunas frente al VIF se describen, por
ejemplo, en las patentes estadounidenses n.º 6.667.295, 5.833.993,
6.447.993, 6.254.872 y 6.544.528, y la solicitud de patente
estadounidense publicada 20040096460. Las patentes estadounidenses
n.º 6.447.993 y 6.254.872 describen vacunas que se preparan a partir
de aislados víricos libres de células de diferente subtipos del VIF
o una combinación de líneas celulares cada una de las cuales está
infectada con diferentes prototipos del virus VIF de un subtipo
diferente. La patente estadounidense n.º 5.833.933 describe vacunas
que contienen secuencias de ADN codificantes de la proteína
gag del VIF y de la proteína env del VIF. Estas
vacunas incluyen un sistema de expresión para expresar las
secuencias. Una vacuna disponible es el VIF
FEL-O-VAX® (Fort Dodge Animal
Health, Overland Park, Kansas).
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Las muestras biológicas de animales que han sido
vacunados frente a una infección por VIF tienen el potencial de
producir un resultado positivo en un análisis para detectar la
infección por VIF debido a la presencia de anticuerpos producidos
por el animal como respuesta a la vacuna. En un aspecto, la memoria
proporciona un procedimiento para distinguir entre animales que han
sido infectados de manera natural con el VIF y animales que no han
sido infectados o han sido vacunados frente a una infección por el
VIF. El procedimiento incluye poner en contacto una muestra
biológica del animal con un polipéptido derivado de un VIF que no se
una sustancialmente con un anticuerpo que sea un componente
significativo de la respuesta de los anticuerpos del animal frente a
la vacuna del VIF.
En otro aspecto, la memoria incluye un
procedimiento para determinar si un gato no ha sido infectado por el
VIF y no ha sido vacunado frente al VIF. Se analiza una muestra
biológica de un gato para detectar los anticuerpos frente a un
polipéptido derivados de env y/o gag del VIF. Entonces
se determina que el animal no ha sido infectado y no ha sido
vacunado mediante la determinación de la ausencia de tales
anticuerpos.
En algunos casos, durante una fase inicial
posterior a una vacunación, los animales pueden producir
temporalmente (transitoriamente) niveles inferiores de ciertos
anticuerpos frente a polipéptidos del VIF específicos que son
elementos de una vacuna, en comparación con los producidos como
respuesta a una infección natural. Estos niveles de los anticuerpos
disminuyen tras un período de tiempo hasta el momento en que el
anticuerpo frente a estos polipéptidos no es detectado tras la fase
inicial. Generalmente, esta cantidad de tiempo es de aproximadamente
diez a doce semanas, pero variará entre las especies y los sujetos
animales individuales. Los anticuerpos transitorios no son un
componente significativo de la respuesta inmune del animal a la
vacuna.
Por ejemplo, el desarrollo de los anticuerpos
frente al VIF en un animal frente a una vacuna depende de la
vacuna. Por ejemplo, se ha descubierto que los animales dan
resultados seropositivos para los anticuerpos frente al VIF frente
a p24 (gag) aproximadamente dos a cuatro semanas después de
la vacunación con la vacuna
FEL-O-VAXO®. Sin embargo, los
animales vacunados de este modo no generan niveles persistentes de
anticuerpos frente a una o más regiones de la proteína env,
incluso aunque esta proteína esté incluida como un elemento de la
vacuna. Por el contrario, los animales infectados de manera natural
generan comúnmente niveles persistentes de anticuerpos frente tanto
a proteínas gag como env del VIF.
Las diferencias en la respuesta inmune entre los
animales que son vacunados y los animales que son infectados de
manera natural proporcionan un medio para detectar si un animal ha
sido vacunado o está infectado de manera natural. Mediante el uso
del procedimiento de la invención, es posible distinguir entre
animales que han sido infectados de manera natural con el VIF y los
animales que no han sido infectados o han sido vacunados frente a
una infección por el VIF. Por consiguiente, la detección de la unión
sustancial entre un polipéptido derivado del VIF y un anticuerpo
que no es un componente significativo de la respuesta inmune de un
animal frente a la vacuna puede indicar una infección natural. La
ausencia relativa de tal unión puede indicar vacunación o no
infección. Además, se puede incluir un segundo reactivo de captura
de anticuerpos separado en el análisis que se una sustancialmente a
los anticuerpos producidos como respuesta a la vacunación y/o la
infección natural, tal como las proteínas p15 o p24. Como tales,
las diversas combinaciones de reactivos de captura separados pueden
conducir a una determinación de la vacunación y/o del estado
infeccioso del sujeto del análisis.
Por ejemplo, las proteínas gag del VIF
p15 y p24 pueden ser componentes inmunogénicos de la vacuna entera
del virus VIF muerto. Se espera que estos componentes provoquen una
respuesta de los anticuerpos persistente cuando se administran a un
animal. Por otro lado, algunas vacunas pueden no incluir cantidades
inmunológicamente significativas de la proteína env de VIF
o, esta proteína ha sido modificada en el procedimiento de
desactivación del virus, o la presentación de esta proteína
mediante la vacunación difiere de la de la infección natural hasta
un punto en el que los anticuerpos producidos frente a la misma, si
los hay, son detectados durante un período de tiempo menor que los
anticuerpo p15 y p24. De este modo, mientras que durante la fase
inicial posterior a la vacunación, los animales pueden producir
transitoriamente niveles bajos de tales anticuerpos que se unen con
las proteínas env, cualquier producción de tales anticuerpos
desciende durante un período de tiempo y no es detectada tras
aproximadamente 12 semanas. En este ejemplo, los anticuerpos
producidos transitoriamente no son un componente significativo de
la respuesta inmune del animal frente a la vacuna tras un período de
tiempo.
Dado que la producción de los anticuerpos
detectables que son dirigidos hacia polipéptidos env
específicos de VIF habitualmente disminuye tras aproximadamente 12
semanas de haberse completado la vacunación, en un aspecto de la
invención, la muestra biológica se obtiene del animal que no ha
recibido una vacuna frente al VIF en aproximadamente las 12 semanas
anteriores. Si el estado de vacunación es desconocido y el análisis
indica infección (en base a una reacción con la proteína de captura
de anticuerpos), puede ser recomendable realizar un nuevo análisis
tras otras 12 semanas.
Se deberían tener en cuenta diferencias en la
respuesta inmune entre los animales vacunados y los animales
infectados de manera natural, tales como los niveles de anticuerpos
específicos y/o parámetros cinéticos para las reacciones de unión
de anticuerpo-antígeno (p. ej., afinidades,
avideces) en el diseño de un análisis para distinguir entre los
animales vacunados y los animales infectados. Las diferencias en la
respuesta inmune pueden ser significativas tal que incluso tras la
fase inicial posterior a una vacunación, un animal puede producir
persistentemente niveles inferiores de anticuerpos frente a
polipéptidos del VIF específicos y/o anticuerpos con diferentes
propiedades de unión en comparación con aquellos anticuerpos
producidos como respuesta a una infección natural.
Es posible optimizar el procedimiento de la
invención de muchos modos y cualquier experto en la técnica podría
ajustar simultáneamente las diluciones de las muestras, las
concentraciones de los reactivos, las temperaturas de incubación y
los tiempos usados en el procedimiento para conseguir una detección
diferencial del suero que tenga anticuerpos frente a una infección
por o vacunación frente al VIF. Por ejemplo, a una dilución de las
muestras y otras condiciones optimizadas para un inmunoanálisis para
anticuerpos frente a polipéptidos específicos, las muestras de los
animales vacunados pueden, para un polipéptido del VIF específico,
proporcionar un resultado analítico negativo, dando las muestras de
los animales infectados un resultado analítico positivo. Para un
segundo polipéptido del VIF, ambas muestras pueden dar un resultado
positivo.
En un aspecto de la invención, las proteínas son
inmovilizadas sobre un soporte sólido adecuado. La muestra
biológica es puesta en contacto con la proteína, a la que se unen
los anticuerpos anti-VIF, si tales anticuerpos
están presentes en la muestra. Se puede detectar la unión mediante
cualquier procedimiento adecuado, p. ej., enzimas, radionúclidos,
materia particulada o marcadores fluorescentes. En una realización
adecuada, es posible asociar el reactivo de detección con una
proteína que sea la misma o similar a la que se usa para capturar
los anticuerpos anti-VIF (si están presentes).
En otro aspecto, la memoria se dirige a un
dispositivo analítico para determinar si un gato ha sido vacunado
frente al VIF o ha sido infectado de manera natural con el VIF. Un
procedimiento para usar el dispositivo analítico incluye
proporcionar un dispositivo analítico que tenga una proteína
env de VIF y una proteína gag de VIF separada. Se
puede usar el dispositivo para analizar una muestra biológica de un
gato poniendo en contacto el dispositivo con la muestra biológica.
Tras leer el dispositivo, la detección de la unión de un anticuerpo
con la proteína gag (un resultado positivo sobre la proteína
gag) indica que el gato ha sido infectado de manera natural
con el VIF o ha sido vacunado frente al VIF. Un resultado positivo
simultáneo sobre la proteína env indica la infección natural
(o, quizás, una respuesta posterior a la vacunación transitoria),
mientras que el resultado negativo simultáneo sobre la proteína
env indica la vacunación. La siguiente tabla resume lo
anterior:
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos usados en la invención
contienen al menos seis aminoácidos, habitualmente, al menos nueve
aminoácidos, y más habitualmente, doce o más aminoácidos encontrados
en una de las proteínas y mimítopos del VIF naturales, y variantes
funcionalmente equivalentes de los mismos.
"Equivalente funcional" o "funcionalmente
equivalente" se refiere a polipéptidos relacionados con o
derivados de secuencias nativas de polipéptidos de la envoltura
(env) o del núcleo vírico (gag) de VIF, en las que la
secuencia de aminoácidos ha sido modificada mediante sustituciones,
inserciones, eliminaciones de un solo o múltiples aminoácidos, y
también secuencias en las que los aminoácidos han sido modificados
químicamente, tales como análogos de aminoácidos, pero que no
obstante conservan la función sustancialmente equivalente. Se
pueden dar variantes funcionalmente equivalentes como variaciones
biológicas naturales o se pueden preparar usando técnicas conocidas
tales como síntesis química, mutagénesis de sitio dirigida,
mutagénesis aleatoria o escisión enzimática y/o unión de
aminoácidos. De este modo, la modificación de la secuencia de
aminoácidos para obtener secuencias de variantes se puede producir
siempre y cuando la función del polipéptido no sea afectada.
Las variantes funcionalmente equivalentes del
VIF que pertenecen al ámbito de la invención pueden comprender
secuencias sustituidas conservadoramente, lo que significa que uno o
más residuos de aminoácido del polipéptido del VIF están
reemplazados por diferentes residuos que no modifican la estructura
secundaria y/o terciaria del polipéptido del VIF. Tales
sustituciones pueden incluir la sustitución de un aminoácido por un
residuo que tenga propiedades fisicoquímicas similares, tales como
la densidad de carga, el tamaño, la configuración o la
hidrofilidad/hidrofobicidad. Únicamente a efectos ilustrativos,
tales sustituciones podrían incluir sustituir un residuo alifático
(Ile, Val, Leu o Ala) por otro, o una sustitución de los residuos
básicos Lys y Arg, los residuos ácidos Glu y Asp, los residuos de
amida Gln y Asn, los residuos de hidroxilo Ser y Tyr, o los
residuos aromáticos Phe y Tyr. Generalmente, es posible identificar
las variantes conservadoras mediante la modificación de una
secuencia polipeptídica de la invención y evaluar la actividad
antigénica del polipéptido modificado usando, por ejemplo, un
análisis inmunohistoquímico, un análisis de inmunoabsorción ligado a
una enzima (ELISA), un radioinmunoanálisis (RIA) o un análisis de
transferencia western. Es posible encontrar más información
relativa a la realización de cambios en aminoácidos fenotípicamente
silenciosos en Bowie et al., Science 247:
1306-1310 (1990).
A continuación, se muestran los ejemplos de los
equivalentes funcionales de las SEC ID N.º 1 y 2 con una descripción
de las diversas modificaciones realizadas en los péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
También se contemplan otras variantes en el
ámbito de la invención, y tales variantes incluyen fusiones de los
terminales amino y/o carboxilo, por ejemplo, las realizadas mediante
la adición de secuencias de aminoácidos de cualquier número de
residuos, así como la inserción intrasecuencial de uno o más
aminoácidos. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos añadidas
pueden ser aquéllas derivadas de la totalidad o partes de otros
polipéptidos o proteínas, o pueden ser aquéllas proporcionadas en
las correspondientes posiciones de la proteína de la envoltura o
vírica del VIF. Los péptidos más largos pueden comprender múltiples
copias de una o más de las secuencias de polipéptidos. Además, se
pueden aparear múltiples copias de los polipéptidos con una
estructura de poliaminoácidos, tal como una estructura de
polilisina para formar péptidos de múltiples antígenos (MAP).
Las variantes de secuencias de aminoácidos
delecionales son aquéllas en las que se han eliminado uno o más
residuos de aminoácido de la secuencia. Las variantes insercionales
se producen cuando se integran uno o más aminoácidos en un sitio
predeterminado de la proteína, aunque la inserción aleatoria es una
opción con un rastreo adecuado del producto resultante. En todos
los casos, éstas y otras variantes del VIF usadas conservan
sustancialmente la misma antigenicidad de los polipéptidos del VIF.
También se contemplan otras variantes, incluyendo aquéllas en las
que las sustituciones de los aminoácidos se realizan en la zona
exterior a las regiones de reconocimiento de anticuerpos de la
proteína. También pertenecen al ámbito de la invención las
proteínas de fusión que comprenden dos o más secuencias de
polipéptidos del VIF siempre y cuando las secuencias proporcionen
la antigenicidad apropiada. Tales polipéptidos se corresponderán en
general con al menos un epítopo o mimítopo que sea característico
del VIF. Característico pretende significar que el epítopo o el
mimítopo permitirán la detección inmunológica del anticuerpo
dirigido frente al VIF en una muestra fisiológica con una garantía
razonable. Habitualmente, será deseable que el epítopo o el
mimítopo, la variante o la proteína de fusión sea distinta
inmunológicamente de (i.e., no sea reactiva de forma cruzada con los
anticuerpos que reconocen) los virus distintos del VIF.
Una variante antigénicamente activa difiere en
aproximadamente, por ejemplo, 1, 2, 3, 5, 6, 10, 15 ó 20 residuos
de aminoácido de las SEC ID N.º 1 y 2, tales como aquéllas mostradas
en las SEC ID N.º 3-10 o un fragmento de las
mismas. Cuando esta comparación requiere un alineamiento, las
secuencias son alineadas para obtener la máxima homología. Las
eliminaciones, las inserciones, las sustituciones, las repeticiones,
las inversiones o los apareamientos erróneos se consideran
diferencias. Las diferencias son, preferiblemente, diferencias o
cambios en un residuo no esencial o una sustitución conservadora. El
sitio de la variación puede darse en cualquier lugar del
polipéptido, siempre y cuando el polipéptido variante resultante sea
sustancialmente antigénicamente similar a las SEC ID N.º 1 y 2,
tales como, por ejemplo, las variaciones mostradas en las SEC ID N.º
3-10. Las variantes funcionalmente equivalentes
ejemplares incluyen aquéllas que muestran el 50% o más de homología
de los aminoácidos. Preferiblemente, tal homología es del 60%, 70% o
mayor del 80%. Sin embargo, tales variantes pueden mostrar un
porcentaje menor de homología global y seguir perteneciendo al
ámbito de la invención si tienen regiones conservadas de
homología.
En algunos casos, se pueden añadir uno o más
residuos de cisteína al terminal de los polipéptidos para facilitar
la unión con el vehículo específico o para permitir que el enlace de
tipo disulfuro imite a los bucles antigénicos, aumentando así la
antigenicidad. Además, se puede añadir un ácido graso o una cola
hidrófoba a los péptidos para facilitar la incorporación a los
vehículos de administración y aumentar la antigenicidad.
Algunos ejemplos de los monómeros que se pueden
usar para producir variantes de los polipéptidos de las SEC ID N.º
1-5 son los siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En otro aspecto más, la invención usa
polipéptidos novedosos. Estos polipéptidos también se pueden usar,
por ejemplo, como reactivos de detección en equipos o en vacunas.
Uno de tales polipéptidos tiene la siguiente fórmula
[(P^{1})_{a}-(L^{1})_{b}-(P^{2})_{c}]_{n},
en la que P^{1} es un polipéptido que es el nativo, o un
fragmento antigénico y una variante funcionalmente equivalente de
los péptidos env nativos del VIF 696-717, y
P^{2} es un polipéptido que es el nativo, o un fragmento
antigénico y una variante funcionalmente equivalente de la proteína
env nativa del VIF, aminoácidos 396-408. Se
pueden invertir bien P^{1} o P^{2}. Por ejemplo, P^{1} puede
ser, por ejemplo, cualquiera de las SEC ID N.º 6-10
o una entre:
| ELGSNQNQFFSKVPPELWKRYN | [SEC ID N.º 11], | |
| MQELGSNQNQFFSPPELWKRYN | [SEC ID N.º 12], | |
| ELGSNQNQFFSK | [SEC ID N.º 13], | |
| LGSNQNQFFS | [SEC ID N.º 14] y | |
| TAFAMQELGSNQNQFFSKIPLELWTR | [SEC ID N.º 15], | |
y P^{2} puede ser, por ejemplo, uno entre:
| NRWEWRPDFESEKC | [SEC ID N.º 16], | |
| CNRWEWRPDFESEK | [SEC ID N.º 17], | |
| CWEWRPDFESER | [SEC ID N.º 18] y | |
| CNRWDWRPDFESKK | [SEC ID N.º 19], |
en las que se invierte bien P^{1}
y/o P^{2}. L^{1} es un polipéptido ligador constituido por
2-20 péptidos S y K alternativamente repetidos,
empezando y acabando bien con S o con K, y en los que a, c y n
pueden ser independientemente un número entero de 1 a 3, y be puede
ser un número entero de 0 a
1.
Los polipéptidos de VIF usados como reactivos de
detección pueden ser naturales, i.e., que incluyen la proteína del
VIF entera o fragmentos de la misma de origen natural, o pueden se
sintéticos. Las proteínas naturales se pueden aislar del virus VIF
entero mediante técnicas convencionales, tales como la cromatografía
de afinidad. Se pueden usar anticuerpos policlonales y monoclonales
para preparar una columna de afinidad adecuada mediante técnicas
conocidas.
Es posible sintetizar químicamente proteínas que
sean inmunológicamente reactivas de forma cruzada con una proteína
del VIF natural. Por ejemplo, es posible sintetizar polipéptidos que
tienen menos de aproximadamente 100 aminoácidos, más habitualmente,
menos de aproximadamente 80 aminoácidos, y comúnmente, menos de
aproximadamente 50 aminoácidos mediante el conocido procedimiento
de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que los aminoácidos
son añadidos consecutivamente a una cadena creciente. Merrifield,
1963, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156).
También se pueden usar proteínas recombinantes. Estas proteínas se
pueden producir mediante la expresión en células cultivadas de
moléculas de ADN recombinante codificantes de una parte deseada del
genoma del VIF. La parte del genoma del VIF puede ser natural o
sintética, pudiéndose obtener genes naturales del virus aislado
mediante técnicas convencionales. Es obvio que el genoma del VIF es
ARN, y será necesario transcribir el ARN natural en ADN mediante
técnicas convencionales empleando transcriptasa inversa. También se
pueden sintetizar polinucleótidos mediante técnicas conocidas. Por
ejemplo, se pueden preparar fragmentos de ADN monocatenarios cortos
mediante el procedimiento de la fosforamidita descrito por Beaucage
y Carruthers, 1981, Tett. Letters 22:
1859-1862. Luego se pueden obtener fragmentos
bicatenarios bien sintetizando la cadena complementaria y luego
apareando las cadenas entre sí en condiciones apropiadas, o
añadiendo la cadena complementaria mediante el uso de ADN
polimerasa con una secuencia cebadora apropiada.
Los fragmentos de ADN naturales o sintéticos
codificantes de la proteína del VIF deseada o del fragmento se
pueden incorporar en un constructo de ADN capaz de introducirse en y
expresarse en un cultivo celular in vitro. Habitualmente,
los constructos de ADN serán adecuados para la replicación en un
huésped unicelular tal como levadura o bacterias. También pueden
ser destinados a la introducción y la integración en el genoma de
células de mamífero cultivadas u otras células eucariotas. Los
constructos de ADN preparados para la introducción en bacterias o
en levadura incluirán un sistema de replicación reconocido por el
huésped, el fragmento de ADN del VIF codificante del producto
polipeptídico deseado, las secuencias reguladoras del inicio de la
transcripción y la traducción unidas al extremo 5' de las
secuencias reguladoras de la terminación del ADN del VIF unidas en
el extremo 3' del fragmento. Las secuencias reguladoras de la
transcripción incluirán un promotor heterólogo que será reconocido
por el huésped. Afortunadamente, hay una variedad de vectores de
expresión adecuados que se encuentran comercialmente disponibles
para un número de huéspedes.
Para que sean útiles en los procedimientos de
detección de la presente invención, los polipéptidos se obtienen en
una forma sustancialmente pura, es decir, comúnmente, del
aproximadamente 50% p/p o una pureza mayor, sustancialmente libres
de proteínas y contaminantes interferentes. Preferiblemente, los
polipéptidos del VIF se aíslan o se sintetizan en una pureza del al
menos 80% p/p, y más preferiblemente, en al menos aproximadamente el
95% p/p de pureza. Usando técnicas de purificación de proteínas
convencionales, se pueden obtener composiciones de polipéptidos
homogéneas del al menos aproximadamente 99% p/p de pureza. Por
ejemplo, es posible purificar las proteínas mediante el uso de los
anticuerpos descritos de aquí en adelante usando las columnas de
afinidad inmunoabsorbentes descritas anteriormente en la presente
memoria.
El procedimiento de la invención se puede
realizar usando técnicas de inmunoanálisis conocidas por aquéllos
expertos en la técnica, incluyendo, pero no limitándose al uso de
microplacas y dispositivos de flujo lateral. En una realización, se
inmoviliza una proteína del VIF sobre un soporte sólido en una
ubicación distinta. La detección de los complejos de
proteína-anticuerpo sobre el soporte sólido se puede
hacer mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Por
ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.726.010 describe un ejemplo
de un dispositivo de flujo lateral, el dispositivo de
inmunoanálisis SNAP® (Laboratorios IDEXX), útil en la presente
invención. También se pueden usar análisis basados en partículas
coloidales, tales como el análisis de diagnóstico del VIF WITNESS®
comercialmente disponible (Synbiotics Corporation, Lyon,
Francia).
La inmovilización de uno o más reactivos de
captura de analitos, p. ej., proteínas del VIF, sobre un dispositivo
o un soporte sólido se realiza tal que el reactivo de captura de
analitos no sea lavado por la muestra, el diluyente y/o los
procedimientos de lavado. Se pueden unir uno o más reactivos de
captura de analitos a la superficie mediante la adsorción física
(i.e., sin el uso de ligadores químicos) o mediante la unión química
(i.e., con el uso de ligadores químicos). La unión química puede
generar una unión más firme de las sustancias de unión específica
sobre una superficie, y proporcionar la orientación y la
configuración definidas de las moléculas unidas a la
superficie.
La memoria también proporciona un dispositivo
que es adecuado para un análisis de flujo lateral. Por ejemplo, se
añade una muestra analítica a una matriz de flujo en una primera
región (una zona de aplicación de muestras). Se lleva la muestra
analítica por una trayectoria de fluidos por acción capilar a una
segunda región de la matriz de flujo en la que hay un marcador
capaz de unirse y formar un primer complejo con un analito en la
muestra analítica. Se lleva el primer complejo a una tercera región
de la matriz de flujo en la que se inmoviliza una proteína del VIF
en una ubicación distinta. Se forma un segundo complejo entre una
proteína inmovilizada y el primer complejo incluyendo el anticuerpo
de la muestra. Por ejemplo, un primer complejo que comprende una
partícula de sol de oro y una proteína del VIF unidas a un
anticuerpo frente al VIF se unirá específicamente y formará un
segundo complejo con una segunda proteína del VIF inmovilizada o con
un segundo anticuerpo dirigido contra los anticuerpos felinos. El
marcador que forma parte del segundo complejo se puede visualizar
directamente.
En otro aspecto, la memoria incluye uno o más
reactivos de unión específica marcados que se pueden mezclar con
una muestra analítica antes de la aplicación a un dispositivo de la
invención. En este caso, no es necesario tener reactivos de unión
específica marcados depositados y secados sobre un lecho corto de
reactivos de unión específica en el dispositivo. Un reactivo de
unión específica marcado, bien añadido a una muestra analítica o
depositado previamente sobre el dispositivo, puede ser, por ejemplo,
una proteína del VIF marcada que se una específicamente con un
anticuerpo frente al VIF.
Cualquiera o todas las realizaciones anteriores
se pueden proporcionar como un equipo. En un ejemplo concreto, tal
equipo incluiría un dispositivo completo con los reactivos de unión
específica (p. ej., un reactivo de unión específica marcado no
inmovilizado y un reactivo de captura de analitos inmovilizado) y un
reactivo de lavado, así como un reactivo detector y reactivos de
control positivo y negativo, si así se desea o es apropiado.
Además, se pueden incluir otros aditivos, tales como
estabilizadores, tampones y similares. Las cantidades relativas de
los diversos reactivos se pueden variar para proporcionar
concentraciones en disolución de los reactivos que optimicen
sustancialmente la sensibilidad del análisis. Particularmente, se
pueden proporcionar los reactivos como polvos secos, habitualmente,
liofilizados que en disolución proporcionarán una solución de
reactivos que tendrá las concentraciones apropiadas para combinarse
con una muestra.
Una proteína del VIF puede ser un reactivo de
captura de analitos inmovilizado en una zona de reacción (fase
sólida). Se puede añadir un segundo reactivo de captura de analitos,
i.e., una segunda proteína del VIF, que haya sido conjugada con un
marcador, bien a la muestra antes de que la muestra sea añadida al
dispositivo, o se puede incorporar el segundo reactivo de captura
de analitos en el dispositivo. Por ejemplo, se puede depositar el
reactivo de unión específica marcado y secarlo sobre una trayectoria
de fluidos que proporcione la comunicación de los fluidos entre la
zona de aplicación de la muestra y la fase sólida. El contacto del
reactivo de unión específica marcado con la muestra de fluido da
como resultado la disolución del reactivo de unión específica
marcado.
El dispositivo también puede incluir un reactivo
líquido que transporte el material no unido (p. ej., muestra de
fluido sin reaccionar y reactivos de unión específica sin unir)
fuera de la zona de reacción (fase sólida). Un reactivo líquido
puede ser un reactivo de lavado y servir sólo para eliminar el
material no unido de la zona de reacción, o puede incluir un
reactivo detector y servir tanto para separar el material no unido
como para facilitar la detección de analitos. Por ejemplo, en el
caso de un reactivo de unión específica conjugado con un enzima, el
reactivo detector incluye un sustrato que produce una señal
detectable tras la reacción con el conjugado de
enzima-anticuerpo en la zona reactiva. En el caso de
un reactivo de unión específica marcado conjugado con una molécula
radiactiva, fluorescente o absorbente de la luz, el reactivo
detector actúa simplemente como una solución de lavado facilitando
la detección de la formación del complejo en la zona reactiva
lavando el reactivo marcado sin unir.
Pueden estar presentes dos o más reactivos
líquidos en un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo puede
comprender un reactivo líquido que actúe como un reactivo de lavado
y un reactivo líquido que actúe como un reactivo detector y que
facilite la detección de analitos.
Un reactivo líquido puede incluir además una
cantidad limitada de un "inhibidor", i.e., una sustancia que
bloquee el desarrollo del producto final detectable. Una cantidad
limitada es una cantidad de inhibidor suficiente para bloquear el
desarrollo del producto final hasta que la mayor parte o todo el
material sin unir en exceso sean transportado fuera de la segunda
región, en cuyo momento se produce el producto final detectable.
La siguiente información se proporciona
únicamente a efectos ilustrativos y no pretende limitar el ámbito
de la invención descrita anteriormente en términos generales.
\vskip1.000000\baselineskip
Se vacunaron ocho gatos que dieron negativo en
el VIF con los equipos de análisis del Ag del VLFE/Ac frente al VIF
SNAP® con la vacuna contra el VIF
Fel-O-Vax®, Fort Dodge Animal
Health, Fort Dodge Iowa. Esta vacuna se produce a partir de
múltiples cepas del virus VIF muerto entero. Los gatos fueron
vacunados siguiendo las instrucciones del fabricante el día 0, 14 y
28. Se dejaron sin vacunar dos gatos que habían dado negativo en el
VIF y se incluyeron como controles para este estudio.
Se obtuvieron muestras de sangre de cada uno de
los diez gatos del estudio de vacunación el día cero y cada siete
días durante 12 semanas, y se almacenaron congeladas hasta su
análisis. Además, también se analizaron muestras sanguíneas de
gatos negativos en el VIF y gatos infectados de manera natural con
el VIF, negativos o positivos en Ac del VIF confirmados mediante un
análisis de confirmación de inmunotransferencia western.
El análisis de las muestras se realizó usando un
formato de ELISA SNAP®. Se usó la tecnología del dispositivo SNAP®
para proporcionar una fase sólida con flujo cromatográfico
reversible de la muestra, y flujo automático secuencial de lavado y
soluciones de sustrato enzimático según lo descrito en la patente
estadounidense n.º 5.726.010.
\newpage
Para el dispositivo SNAP®, se depositaron la
proteína gag del VIF p24 (recombinante) y una proteína
env del VIF 696-707 con una cisteína
N-terminal más - CELGCNQNQFFCK [SEC ID N.º 20] -
para formar un solo punto de captura de anticuerpos sobre la fase
sólida. Se depositó un reactivo de control negativo para formar un
punto de control negativo y un reactivo de control positivo para
formar un punto de control positivo sobre la fase sólida del
dispositivo SNAP®. Las proteínas gag o env fueron
conjugadas químicamente con la enzima peroxidasa de rábano picante
y proporcionadas en una solución que estaba constituida por un
tampón, detergente, y componentes de suero animal.
Se combinaron las muestras de suero con solución
de conjugado de enzima y proteína bien gag o env, y
se aplicaron sobre el dispositivo SNAP®. Tras un breve período de
incubación, se activó el dispositivo. El desarrollo de color sobre
el punto de control positivo indicó que el análisis era válido. El
desarrollo de color sobre el punto de la muestra mayor que el
desarrollo de color del punto de control negativo indicó la
presencia de antígeno en la muestra y fue calificado como un
resultado analítico positivo. Los resultados analíticos fueron
determinados visualmente y se muestran en la tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Se realizó un análisis ELISA en microplacas
sobre muestras de suero recogidas de gatos con confirmación de
negativo en VIF y gatos infectados, y con gatos vacunados con la
vacuna frente al VIF FEL-O-VAX® en
un formato de análisis indirecto con polipéptidos del VIF
individuales sobre la fase sólida y el conjugado de peroxidasa anti
IgG felina. Los anticuerpos frente a env del VIF fueron
detectados usando estos péptidos como reactivos
antigénicos:
antigénicos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los polipéptidos se sintetizaron usando un
instrumento comercial y siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se prepararon soluciones madre de polipéptido a 5 mg/ml en DMSO.
Entonces se revistieron los polipéptidos sobre pocillos de
microplacas (péptido a 10 ug/ml en Tris-HCl 50 mM,
pH 7,4, 100 ul/pocillo). Luego se bloquearon/se volvieron a
revestir las placas con Tween-20 al 2%/ sacarosa al
2,5%, dejando que se secaran en bolsas de mylar con desecante.
Para los análisis, se añadieron muestras de
suero felino (100 ul/pocillo, diluidas 1/1000 en suero bovino fetal
al 50%) a los pocillos y se incubaron las placas durante diez
minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, se lavaron las
microplacas con PBS/Tween. Se añadió conjugado de peroxidasa de
cabra anti IgG de gato a los pocillos (100 ul/pocillo de peroxidasa
anti IgG de gato diluidos en suero bovino fetal al 50%). Se
incubaron las placas durante otros quince minutos a temperatura
ambiente y se lavaron una segunda vez en PBS/Tween. Se añadió
sustrato de peroxidasa (100 ul/pocillo, sustrato de peroxidasa y
tetrametil-bencidina) y se incubaron las placas una
tercera vez durante diez minutos a temperatura ambiente. Se añadió
una solución de detención de ácido fluorhídrico (50 ul/pocillo) a
las placas. Se midió la unión a los anticuerpos de las muestras
determinando la actividad de la peroxidasa (producto coloreado) con
un espectrofotómetro (A650 nm). Se considera como unión a los
anticuerpos sustancial significativa para una muestra la de A650 nm
mayor de 0,200. También se utilizó en equipo de análisis de
anticuerpos anti-VIF PetChek® de IDEXX en estas
muestras como análisis de referencia. Los resultados se muestran en
la
tabla 2.
tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un análisis ELISA en microplacas como
el del ejemplo 2 sobre muestras de suero recogidas de gatos con
confirmación de negativo en el VIF y gatos infectados, y con gatos
vacunados con la vacuna contra el VIF
FEL-O-VAX®. Los anticuerpos frente
a env del VIF se detectaron usando estos péptidos como
reactivos antigénicos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se considera como unión a los anticuerpos
sustancial significativa para una muestra la de A650 nm mayor de
0,200. También se utilizó en equipo de análisis de anticuerpos
anti-VIF PetChek® de IDEXX en estas muestras como
análisis de referencia. Los resultados se muestran en la tabla
3.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(Continuación)
\newpage
(Continuación)
\newpage
(Continuación)
Aunque en la presente memoria se han descrito
diversas realizaciones específicas de la presente invención, se
entenderá que la invención no está limitada a aquellas realizaciones
exactas y que cualquier experto en la técnica puede hacer diversos
cambios o modificaciones en las mismas, siempre y cuando no se
alejen del alcance de la invención según lo definido por las
reivindicaciones.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Groat, Randall G
\hskip1cm Tonelli, Quentin J.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento y dispositivo para
detectar el virus de la inmunodeficiencia felina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
1224-E1-US/03-327-N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/584.106
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
30-06-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/501.982
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
11-09-2003
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm25
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm31
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm32
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm34
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm40
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm41
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm42
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm43
Claims (10)
1. Un procedimiento in vitro para
distinguir entre (a) los félidos que han sido infectados de manera
natural con el VIF o félidos vacunados con la vacuna entera del VIF
muerto producida a partir de múltiples cepas que tienen diferentes
subtipos, y en una fase de inicial transitoria de producción de
anticuerpos y (b) los félidos vacunados con dicha vacuna entera del
VIF muerto y después de una fase inicial transitoria de producción
de anticuerpos o los félidos que no han sido infectados,
procedimiento que comprende las etapas de:
poner en contacto una primera muestra biológica
que ha sido tomada de un félido con un polipéptido env del
VIF para formar un primer complejo de
anticuerpo-polipéptido env en presencia de
anticuerpos frente a env del VIF, si los hay, en la primera
muestra biológica;
detectar la presencia o la ausencia del primer
complejo;
determinar que el félido:
- (i)
- está infectado de manera natural con el VIF o vacunado y en la fase inicial transitoria de producción de anticuerpos, si el primer complejo está presente; o
- (ii)
- no está infectado con el VIF ni vacunado y después de la fase inicial transitoria de producción de anticuerpos, si el primer complejo está ausente.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que si se detecta el primer complejo y el estado de vacunación
del félido es desconocido, comprende además las etapas de:
poner en contacto una segunda muestra biológica
que ha sido tomada del félido, segunda muestra biológica que ha
sido tomada a un intervalo temporal pre-determinado
tras haberse tomado la primera muestra biológica, siendo dicho
intervalo de tiempo predeterminado de 12 semanas, con el polipéptido
env del VIF para formar un segundo complejo de
anticuerpo-polipéptido env en presencia de
anticuerpos frente a env del VIF, si los hay, en la segunda
muestra biológica;
detectar la presencia o la ausencia del segundo
complejo; y
determinar que el félido:
- (iii)
- está infectado de manera natural con el VIF, si el segundo complejo está presente; o
- (iv)
- está vacunado y en la fase inicial transitoria de producción de anticuerpos, si el segundo complejo está ausente.
3. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2 que comprende además las etapas de:
poner en contacto la primera muestra biológica
del félido con un polipéptido gag del VIF para formar un
complejo de anticuerpo-polipéptido gag en
presencia de anticuerpos frente a gag del VIF, si los hay,
en la primera muestra biológica;
detectar la presencia o la ausencia del complejo
de anticuerpo-polipéptido gag;
determinar que el félido:
- (i)
- está infectado de manera natural con el VIF o vacunado, si el complejo de anticuerpo -polipéptido gag está presente; o
- (ii)
- no está infectado con el VIF ni vacunado, si el complejo de anticuerpo -polipéptido gag está ausente.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que el polipéptido env del VIF y el polipéptido gag
del VIF están inmovilizados sobre un vehículo sólido.
5. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que el polipéptido gag del VIF se selecciona del grupo
constituido por p15 y p24 del VIF.
6. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que los polipéptidos env del
VIF tienen una homología del al menos 80% con las SEC ID N.º 1, SEC
ID N.º 2, SEC ID N.º 3, SEC ID N.º 4 o SEC ID N.º 5.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el polipéptido env del VIF
se selecciona del grupo constituido por SEC ID N.º 1, SEC ID N.º 2,
SEC ID N.º 3, SEC ID N.º 4 y SEC ID N.º 5.
8. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido env del VIF
tiene la fórmula:
[(P^{1})_{a}-(L^{1})_{b}-(P^{2})_{c}]_{n},
en la
que
P^{1} es:
P^{2} es
y L^{1} es un polipéptido
constituido por 2-20 residuos S y K alternativamente
repetidos, empezando y acabando bien con S o con K, y a, c y n son
independientemente un número entero de 1 a 3, y b es un número
entero de 0 a
1.
9. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido del VIF tiene la
fórmula:
[(P^{1})_{a}-(L^{1})_{b}-(P^{2})_{c}]_{n},
en la
que
P^{1} es un polipéptido que tiene una
homología del al menos 80% con una secuencia de env del VIF,
aminoácidos 696-717, en la que P^{1} puede estar
invertido;
L^{1} es un polipéptido constituido por
2-20 residuos S y K alternativamente repetidos,
empezando y acabando bien con S o con K;
P^{2} es un polipéptido que tiene una
homología del al menos 80% con una proteína env de la
superficie del VIF, aminoácidos 396-408, en la que
P^{2} puede estar invertido;
a, c y n pueden ser independientemente un número
entero de 1 a 3, y
b es un número entero de 0 a 1.
10. El procedimiento según la reivindicación 9,
en el que P^{2} es MQELGSNQNQFFSKVPPELWKRYN, P^{1} es
CNRWEWRPDFESEK [SEC ID N.º 17] y a, b, c, n son 1.
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