JPH0211524A - オーエスキー病ワクチンの製造方法及び該ワクチン接種豚と自然感染豚との識別方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明はオーエスキー病ワクチンのＭ３ｕ方法及び該ワ
クチン接種豚と自然感染豚との識別方法に関するもので
ある。

１従来の技１ｋ］ オーエスキー病は、仮性狂犬病とも称され、ブタヘルペ
スウィルス科のアルファヘルペス亜）４に属するブタヘ
ルペスｌウィルス（以下ＡＩ）Ｖと略称する。）によっ
て引き起こされる伝染病であり、主として豚が感染し、
その他、牛、羊、犬、及び猫が感染する場合がある。豚
以外の動物が重病に罹患した場合にはほとんど死に至る
。しかし、重病に罹患した豚の症状は日齢によりその様
相が異なり、仔豚では高い死亡率を示すが成豚では不顕
性感染を起こしやすく、ウィルスを長期間体内に保有す
る保毒豚となる。又、妊娠豚が該ウィルスに感染すると
高率で死流産を起す。そのためわ゛が国では、Ａ　Ｉ）
　Ｖに対する抗体を有する豚は層殺処分の対象となる。

従来、重病のワクチンとして不活化ワクチン及び弱毒化
ワクチンがある。これらはいずれも発病をある程度押え
ることができるが、感染は阻止し得ない（Ｔｈａｗｌｅ
ｖ、Ｄ、Ｇ、ｃｔ　ａｌ、１９８２　Ｊ、Ａｎ、Ｖｅｔ
、Ｈｅｄ。

＾５ｓｏｃ、　１８１．１５１３−１５１８）　、すな
わちワクチン接種豚にウィルスを感染させると１部気道
で増殖し、ウィルスを排泄したり、潜伏感染が成立する
などの欠点を有している。

最近、ＡＤＶ粒子の構成タンパクのうちエンベロープ（
ｅｎｖｅ　Ｉｏｐｅ　＞に存在する糖タンノくりのサブ
ユニットワクチンとしての有効性が指摘され（１４ａｅ
ｓ、Ｒ，に、ｅｔ　ａｌ、１９８３　Ａｎ、Ｊ、Ｖｅｔ
、Ｒａｓ、　４４，１２３−１２５Ｐｌａｉｔ、に、Ｂ
、１９８２　Ｖｅｔ、ＭｉｃｒｏｂｉｏＩＪ、５１５−
５３４）　−ａ数種存在する糖タンパクのうち、（ＩＶ
Ｉ　（（＋Ｉ）５０）は中和抗体を誘導する感染防御抗
原であり、サブユニットワクチンとして有効であること
が明かとなった（Ｃａｔｎ＋ｉｎｅ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、
１９８７．Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６１，３９７７−３
９８２　：　ｌ５ｈｉ　ｉ、ｔｌ、ｅｔ　ａｌ、　１９
８８．　Ｊ、　Ｇａｎ、　Ｖｉｒｏ　１．６９．１４１
１−Ｍ１／Ｉ）。

［発明が解決しようとする課題］ ところが、前記糖タンパクｇＶＩ　（ｏｐ５０）をオー
エスキー病のサブユニユツトワクチンとして実用化する
なめ、ＡＤＶ感染細胞から糖タンパクｇＶＩ（ｇｐ５０
　）を効率よくしかも簡単に得る方法については同等検
討が為されていなかった。

又、従来使用されているワクチンでは、それを使用した
場合、血清検査によりウィルス自然感染豚とワクチン接
種豚とを識別することができず、重病の撲滅が困難であ
った。そして、ワクチン接種豚と自然感染豚の識別が困
難なことから、この様なワクチンを使用した場合わが国
ではワクヅン接種によりＡＤＶに対する抗体を有するよ
うになった豚であっても層殺処分とせざるを得ないとい
う不都合があった。

本発明は前記従来の問題点に鑑みてなされたものであっ
て、その第一の目的はＡＤＶの糖タンパクｇＶＩ　（ｇ
ｐ５０）からなるサブユニットワクチンを効率よくしか
も簡単に得ることができるオーエスキー病ワクチンの製
造方法を提供することにある。

又、第二の目的はワクチン接種豚と自然感染豚とを簡単
に識別することができる方法を提供することにある。

［課題を解決するだめの手段及び作用］前記の目的を達
成するため第一請求項に記載の発明においては、ブタヘ
ルペス１ウィルス（オーエスキー病ウィルス）感染細胞
を界面活性剤で可溶化した溶液の上清を、貼イオン交換
体を充填したカラムにかけ、溶液が弱アルカリのとき陰
イオン交換体に吸着されない成分を含む分画を回収する
ようにした。

すなわち、本発明の方法では、ブタヘルペス１ウィルス
（オーエスキー病ウィルス）（δ染細胞を培養した後、
該感染細胞を界面活性剤で可溶化した溶液の上清を、陰
イオン交換体を充填したカラムに弱アルカリ状態におい
てかけることにより、オーエスキー病のサブユニットワ
クチンの有効成分であるブタヘルペス１ウィルスの糖タ
ンパクｕＶＩ　（（＋０５０＞が陰イオン交換体に吸着
されずに若干の細胞成分と共に流出液中に回収される。

感染細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＰＫ柑胞
、Ｐに一１５細胞、ＢＨＫ　Ａ［ｌ胞などＡＤＶに感受
性の高い細胞が好ましい。感染細胞の可溶化に使用する
界面活性剤としては、Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０、Ｔｒ
　ｉ　ｔｏｎＸｌｏｏ　、　Ｔｗｅｅｎ　８０　（いず
れら商品名）等の非イオン性界面活性剤が好ましいが、
陽イオン性界面活性剤あるいは陰イオン性界面活性刑を
使用してもよい、隘イオン交換体としては、ジエチルア
ミノエチル基を有するＤＥＡＥ−セルロースが好ましい
、ｆｒＩ記上清をカラムにかけて得られた溶液はそのま
まワクチンとして使用することもできるが、溶液中に混
在する細胞成分を、該細胞成分に対する抗体をリカンド
としたアフィニティークロマトグラフィーにより除去し
て精製した後、使用することが好ましい。

又、第一請求項に記載の発明では、ブタヘルペス１ウィ
ルスの抗体を有する豚から採取した血清中のブタヘルペ
スｌウィルスの糖タンパクｇＶＩ（ｇｐ５０　）以外の
糖タンパクに対する抗体の有無を、ブタヘルペス１ウィ
ルスの糖タンパクｕＶｌ（ａρ５０）以外の糖タンパク
を抗原とした酵素免疫測定法（Ｆｎｚｙｎ＋ｅ　Ｌｉｎ
ｋｅｄ　Ｉｉｎ＋ｕｎｏｓｏｒｖｅｎｔ　ａｓｓａｙ　
　：以十ト：ＬＩＳＡと略称する。）により測定し、該
血清中に前記糖タンパク（ＩＶＩ　（ｇｐ５０）以外の
糖タンパクに対する抗体が検出されなかった場合にはワ
クチン接種豚と判定し、前記糖タンパク（ＩＶＩ　（（
＋Ｅ］５０）以外の糖タンパクに対する抗体が検出され
た場合には自然感染豚と判定するという方法を採用して
いる。

［実施例１１ 以下、第一請求項に記載された本発明についてより具体
的に説明する。

（ウィルスの増殖及び可溶化） １０％牛血清を添加したイーグルＭＥＭ　（最小必須培
地）を使用してローラーボトルあるいはム°；養びんに
Ｖｅｒｏ細胞を単層培養し、これにＹＳ−８１株を接種
して３７°Ｃで２４時間培養した。ウィルス接種後の培
養液には血清を含まないイーグルＭＩＢＭ培地を使用し
た。

培ｉｆ＆、細胞を集め、０．５％Ｎｏｎ１ｄａｔ　Ｐ　
−４０を含む０．０１Ｍトリス塩酸ｆｆ衝滝ｐＨ７，８
中で１０分間撹拌して可溶化した。この溶液をｔ４００
０　ｒｐｔで３０分遠心した後、上清を得た。

（イオン交換クロマトグラフィーによる糖タンパクリＶ
ｌ　（ｇｐ５０）成分の分離回収）前記上清を陰イオン
交換体としてワラｉ・マン社製［）丁ら−５２＜ＤＥＡ
Ｅ−セルロースの商品名）を充填したカラムにかけ、カ
ラムに吸着されない成分を回収しな。次ぎにＮａＣ１の
濃度を０，０６．０、０８．０．１０．０，１４．０．
１８．１．０と段階的に高めなトリス塩酸ａｍ液＜０　
、　ＯＩ　Ｍ、　＋＋ｌ１７．８　）でカラムに吸着さ
れた成分を１１１次溶出させた。各分画の２８０　ｒｏ
ｌにおける吸光度を測定して得た溶出曲線を第１図に示
す。

前記のようにして得られたそれぞれの分画の成分を５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法及びウエスタン
ブロツテインクで解析したところ、カラｌ＼に吸着され
ない分画（第１図に１番目のピークとして現はれる分画
）にウィルス砧タンパクｇＶＩ　（ａｐ５０）が認めら
れ、しかもＩＩｊｉ記糖タンパク（ＩＶＩ　（（！ｐ５
０）以外のウィルス糖タンパクは含まれておらず、又、
細胞成分も比較的少なかった。

（細胞成分の除去） 前記カラムに吸着されない分画から細胞成分を取り除く
ため、細胞成分に対する抗体をリガンドとしたアフィニ
ティークロマトグラフィーを行った。

ＶａｒｏｌＳｌｌｌ胞を０．５％Ｎｏｎ＋ｄｅｔ　Ｐ−
４０を含むトリス塩酸Ｍ衝液（０，０１Ｍ、　１）１１
７．８　’）中で１０分間撹拌して可溶化した。この溶
液をヤギに免疫し、免疫されたヤギから採血した。この
血液に定法にしたがい硫酸アンモニウムを用いな塩析、
Ｐ　Ｅ（Ｓによる透析処理を行い、精製された抗Ｖｅ　
ｒｏ細胞抗体を得た。この抗Ｖｅ　ｒｏ細胞抗体をゲル
［チ・マン社製、ホルミルセルロファイン（商品名）］
にカップリングさせた。そして、このゲルを充填したカ
ラムを使用してアフィニティークロマトグラフィーを行
い、細胞成分が含まれないウィルス糖タンパクリｖ１（
卸５０）を得な。

（精製糖タンパク（ＩＶＩ　（ｇｌ１５０）の豚に川す
る免疫効果と感染防御試験） オーエスキー病ウィルスの自然感染の場合、上部気道が
初期の増殖部位であり、発症豚ではここからウィルスが
分離される。又、回復後も扁桃がらウィルスが高率に分
離され、扁桃が潜伏感染に重要な役割を果たしていると
考えられている。そこで精製糖タンパクｇＶＩ　（ｇｐ
５０）のワクチン効果について検討を行った。

（方法） １ヶ月齢の豚１２頭を２群に分け、１群には精製糖タン
パクｇＶＩ　（（ｌｐ５０）　　（２００μｇ／豚）　
ヲ７゜インドコンプリードアシュバンドとともに筋肉注
射した。その２週間後に採血し、２回目の免疫を１回［
１と同様に行った。２回免疫後２週間目に採血し、つづ
いて１０”ＰＦＶのＹＳ−８１株を経鼻攻撃した。他の
一群は無免疫対照として攻撃を同様に行った。

攻撃後毎日鼻粘膜スワブ（分泌物）を採取してウィルス
分離を行い、１４日目には生存した豚を屠殺処分して扁
桃からのウィルス分離に供試した。

結果を表に示す。

精製糖タンパク（ＩＶＩ　（（＋１１５０）免疫豚では
免疫後２週間で中和抗体の産生がみられ、２回の免疫で
さらに抗体価は上昇した。

攻撃後、対照群ではすべての豚が臨床症状を示し、また
スワブからウィルスが分離され、そのうち４頭は死亡し
た。しかし、免疫群では何等の臨床症状も示さずまたス
ワブからもウィルスは分離されず、全類生存した。

扁桃からのウィルスの分離試験では、無免疫対照群から
はすべての豚からウィルスが分離されたのに対し、免疫
群ではすべて陰性であった。

上記の結果から精製糖タンパク（ＩＶＩ　（ｑｐ５０）
をオーエスキー病のワクチンとして使用した場合には、
従来のワクチンと異なりワクチン接種豚はオーエスキー
病に感染することがなく、ウィルスが上部気道で増殖し
ないので、ワクチンとして非常に有効である。

（実施例２） 次に第２請求項に記載の発明についてより詳細に説明す
る。

２ヶ月齢の豚６頭に、オーエスキー病ウィルス（ＹＳ−
８１株）を経鼻接種し、その後１ケ月間に１１：って経
時的に採血した。又、１ヶ月齢の豚１２頭を２群に分け
、１群には前記実施例においてＤＥＡＥ−セルロースカ
ラムで分画した非吸着の分画（糖タンパクｑＶＩ　（ｇ
＋）５０）を含む）を、他の群はその分画から細胞成分
を除去したものをそれぞれサブユニットワクチンとして
、フロイントコンプリードアシュバンドを用い２週間隔
で２回免疫した。１回免疫後、経時的に採血した。

そして、採血した血液から定法に従って得た血清の中和
抗体価を測定するとともに、オーエスキー　Ｊ？ｊウィ
ルス抗原と、ウィルス感染細胞から得た糖タンパク抗原
に対する抗体の有無をＥｌ、ＩＳＡによりａｌｌｌ定し
た。

（抗原用オーエスキー病ウィルスの精製）ウィルスノ精
製は５ｐｅａｒ、Ｐ、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、の方法（Ｓｐｃ
ａｒ、Ｐ、Ｇ、＆Ｒｏｉｚｉａｎ、Ｂ、１９７２　Ｊ、
Ｖｉｒｏｌ、９，１４３−１５９）に従った。

（抗原粗糖タンパクの精製） Ｐに１５柑胞を１０％牛血清を添加したイーグルＭＥＭ
で単層培養し、これにウィルス（ＹＳ−８１株）を接種
して２４時間培養した。ウィルス接種後は血清を含まな
いイーグルＭＥＭで２４時間培養した。培ｉｆ＆、細胞
を集め、０．５％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０をふくむ０
．ＯＩＭトリス塩＃ｇ街液ｐｌ＋７．８中で１０分間撹
拌して可溶化した。この溶液を１４０００ｒｐ［１で３
０分遠心した後、上清を得た。

前記上清をＬｅｎｔｉｌ　Ｌｅｃｔｉｎ−３ｃｐｔ＋ａ
ｌｏｓｅ　４　Ｂカラム（ファルマシア社製）にかけ、
糖タンパクを吸着後、カラムをよく洗浄し未吸着の糖タ
ンパクを洗い流した後、３Ｍメチル−α−Ｄ−クルコシ
ドで溶出させた。この溶出糖タンパクを５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分析したところ、糖タ
ンパク（ＩＶＩ　（ｇｐ５０）は含まれていなかった。

（ＥＬＩＳＡによる血清中の抗体の測定）精製ウィルス
を抗原として使用する場合にはその濃度が０．５μｇ／
１００μＪ／ｗｅｌｌ、糖タンパクを抗原とした場合に
は１．０μ（１／１００μＪ／ｗａｌｌ　となるように
Ｏ，０５Ｍ炭酸榎ｔｆＪ雇（ｐＨ９，６）で調整し、Ｅ
Ｌ　Ｉ　５ＡＪｆＪ９６穴プレートに固相化した。４°
Ｃで一夜放置。

前記プレートを洗浄液（０，０２％Ｔ’ｗａｅｎ２０を
含む０．８５％ＮａＣｌ液）で３回洗浄後、３％牛血清
アルブミンを含むＰＢＳ１００μｍを加えて３７°Ｃで
１時間インキュベートした。

ブレートを洗浄液で洗浄後、ＰＢＳで１００倍に希釈し
た測定試料としての血清を１００μ」加えて２５°Ｃで
２５分反応させた。

反応後、洗浄液で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ブタ
ＩｇＧを１００μｍ加え、２５°Ｃで２０分反応さぜな
。

反応後、洗浄し、基質（０−フェニレンジアミン）液を
１００μｍ加えて２５°Ｃで１５分反応後、３Ｎ硫酸を
１００μオ加えて反応を停止させた。この試料について
分光光度計を使用して４９２ｎＩＩの吸光度（０，Ｄ、
（ｉｉ’ｉ）を測定した。

各試料について中和抗体価及び０．０．鎖のａ！１定結
果を、第２図（ａ）、（ｂ）に示す０図から明らかなよ
うに、ウィルス感染豚の血清では両抗原に対して反応し
、その反応性（０，Ｄ、（ａの大きさ）は中和抗体価と
比例していた。これに対し、ワクチン接種豚の血清では
精製ウィルス抗原とは反応するが、　Ｌｅｎｔｉｌ　Ｌ
ｅｃｔｉｎカラムで精製した糖タンパク＜　ｑＶｉ　（
ｇｐ５０）を含まない糖タンパク）抗原とは反応しなか
った。すなわち、オーエスキー病ウィルス（ＡＤＶ）に
対する抗体を有する豚から採血した血清を試料とし、（
ＩＶＩ　（ｇｐ５０）を含まない糖タンパクを抗原とし
たＥｌｊＳＡ−１１１定により、当該豚がワクチン接種
豚であるか自然感染豚であるかの判定が確実にできた。

なお、ワクチンとして細胞成分を除去しないものを使用
した場合でも、同様の結果かえられた。

［発明の効果］ 以上詳述したように第１請求項に記載の発明では、オー
エスキー病ウィルスの糖タンパク９■（ａｐ５０）から
なるサブユニットワクチンを効率よくしかも簡単に得る
ことができる。

又、第２請求項に記載の発明では、ワクチン接種豚と自
然感染豚とを簡単にしかも確実に識別することができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロースイオン交換体カラ
ムを使用してＮａＣＩｆｉ度を段階的に高めな場合の溶
出曲線を示す図、第２図（ａ）、（ｂ）はウィルス抗原
及び糖タンパク抗原に対するワクチン接秤豚及びオーエ
スキー病つィルス感染豚の血清のＥＬＩＳＡＯ，Ｄ、値
と中和抗体価の関係を示す図である。 特許出願人　株式会社ゲン・；１−ボレーション化　理
　人　弁理士　　恩口Ｊ　博宣

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ブタヘルペス１ウィルス感染細胞を界面活性剤で可
   溶化した溶液の上清を、陰イオン交換体を充填したカラ
   ムにかけ、溶液が弱アルカリのとき陰イオン交換体に吸
   着されない成分を含む分画を回収することを特長とする
   オーエスキー病ワクチンの製造方法。 ２、ブタヘルペス１ウィルスの抗体を有する豚から採取
   した血清中のブタヘルペス１ウィルスの糖タンパクｇV
   I（ｇｐ５０）以外の糖タンパクに対する抗体の有無を
   、ブタヘルペス１ウィルスの糖タンパクｇVI（ｇｐ５０
   ）以外の糖タンパクを抗原とした酵素免疫測定法により
   測定し、該血清中に前記糖タンパクｇVI（ｇｐ５０）以
   外の糖タンパクに対する抗体が検出されなかった場合に
   はワクチン接種豚と判定し、前記糖タンパクｇVI（ｇｐ
   ５０）以外の糖タンパクに対する抗体が検出された場合
   には自然感染豚と判定することを特徴とするワクチン接
   種豚と自然感染豚との識別方法。