DE69627109T2 - REKOMBINANTES HERPESVIRUS UNTER DER VERWENDUNG DES gB GENPROMOTERS - Google Patents
REKOMBINANTES HERPESVIRUS UNTER DER VERWENDUNG DES gB GENPROMOTERSInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues rekombinantes Virus, das ein exogenes Gen in einer tierischen Zelle oder in einem tierischen Körper auch in Gegenwart eines maternalen Antikörpers exprimieren und persistierend infizieren kann, um eine Antigenstimulierung über einen langen Zeitraum aufrechtzuerhalten, während es der Exposition des Immunsystems des Wirtes entkommt, wodurch ein Impfstoff bereitgestellt wird, der auch bei herkömmlichen Tieren wirksam ist, die einen maternalen Antikörper aufweisen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen polyvalenten Lebendimpfstoff für Tiere unter Verwendung des rekombinanten Virus. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen rekombinanten Virusvektor, der als ein Arzneistofffreisetzungssystem (DDS) zur Herstellung von physiologisch aktiven Stoffen, wie Hormone oder Cytokine, innerhalb des lebenden Körpers verwendet werden kann.
- Virusvektoren sind umfassend auf ihre Wirksamkeit für eine Impfung und auf die Verwendung als Einschleusungssystem für Gene in den lebenden Körper untersucht worden. Besonders in der Geflügelindustrie hat eine Studie zur Verwendung von Pockenviren, insbesondere dem Gefügelpockenvirus, schnelle Fortschritte gemacht. Um einen wirksameren Vektor zu entwickeln, haben die hierin genannten Erfinder unter diesen Umständen Untersuchungen durchgeführt, um einen Vektor aus dem Marek-Disease-Virus-Typ 1 (nachstehend auch bezeichnet als "MDVI), eine Art der Vögel-Herpesviren, herzustellen, und haben über viele Ergebnisse davon berichtet. Zum Beispiel haben die Erfinder mehr als 20 Stellen auf dem MDV 1-Genom untersucht und als Ergebnis das US10-Gen als eine Insertionsstelle für ein exogenes Gen identifiziert, welche ein exogenes Gen stabil beibehalten kann, aber die Impfstoffwirkung gegen die Marek-Krankheit nicht beeinträchtigt [Japanische Patentanmeldung Nr. 4-205933 (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-22757); 4. International Symposium on Marek's Disease (1992), Amsterdam; Vaccine, Bd. 12 (1994), 953-957]. Ein rekombinantes Virus, das das F-Protein-Gen des Newcastle-Virus in das US10-Gen einbaut, zeigte eine ausreichende Wirkung als Impfstoff bei SPF-Hühnern, wobei die Wirkung über mindestens 24 Wochen nach der Impfung anhielt (4. International Symposium on Marek's Disease (1992), Amsterdam). Es ist nachgewiesen worden, daß dieses rekombinante Virus eine Schutzwirkung gegen sowohl die Marek-Krankheit als auch die Newcastle-Krankheit zeigt, auch bei Hühnern, die maternale Antikörper aufweisen, aber die Schutzwirkung war etwas geringer als bei SPF-Hühnern. Das heißt, dieses rekombinante Virus zeigte eine 100%ige Schutzwirkung gegen die Newcastle-Krankheit bei SPF-Hühnern, während es eine etwas geringere Wirkung, d. h. einen Grad von 70 bis 90%, bei Feldhühnern zeigte, die maternale Antikörper aufweisen (Current Developments in the Molecular Biology of Marek's Disease Virus Workshop, 1995, Florida). Eine derartige Verringerung der Wirkung war vermutlich auf die Suppression der in vivo-Vermehrung des rekombinanten Virus durch die maternalen Antikörper gegen die Newcastle-Krankheit und die Marek-Krankheit zurückzuführen, wenn Feldhühner mit dem rekombinanten Virus immunisiert werden.
- Wenn ein Lebendimpfstoff, der ein rekombinantes Virus umfaßt, an ein Tier überimpft wird, das maternale Antikörper aufweist, ergibt sich insofern ein Problem, wie vorstehend erwähnt, als das Virus eliminiert oder die Virusvermehrung durch das Immunsystem des Wirtes, wie maternale Antikörper, gehemmt wird. Folglich ist ein verbessertes rekombinantes Virus wünschenswert, das die Eigenschaften eines Lebendimpfstoffes beibehält und anhaltend eine Antigenstimulierung für einen langen Zeitraum vorsehen kann, während es der Exposition des Immunsystems entkommt.
- Um das vorstehend erwähnte Problem zu lösen, haben die Erfinder aus MDV1 abgeleitete Promotoren zusammengestellt und mehrere mutmaßliche Promotorgene aus dem Genom des Marek-Disease-Virus (nachstehend auch bezeichnet als "MDV") cloniert. Unter Verwendung dieser Promotorgene haben die Erfinder ein Experiment zur Expression eines exogenen Gens in einem rekombinanten Virus, das die Gene umfaßt, durchgeführt. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß unter den mehreren Promotorgenen, welche die Erfinder cloniert haben, ein Promotor aus dem Glycoprotein B (nachstehend bezeichnet als "gB")-Gen, ein Gen, das zu dem Herpes simplex-Virus-gB-Gen homolog ist, eine besonders ausgezeichnete Wirkung bei der Expression eines exogenen Gens (z. B. des Newcastle-Disease-Virus-F- Proteins (nachstehend auch bezeichnet als "NDV-F")) zeigte und außerdem eine viel bessere Immunisierungswirkung bei Tieren als erwartet ausübt. Das heißt, die Menge an F-Protein, die mit diesem Promotor in Kulturzellen exprimiert wurde, war deutlich geringer als diejenige eines rekombinanten Virus mit herkömmlichen Promotoren (z. B. dem SV40-Promotor), aber trotzdem wurde eine sehr hohe Immunogenität bei Tieren (Hühnern) entgegengesetzt der Erwartungen beobachtet, d. h. ein rekombinantes Virus mit diesem Promotor zeigte eine größere Schutzwirkung gegen die Newcastle-Krankheit als diejenige der herkömmlichen rekombinanten Viren und zeigte beständig eine Schutzwirkung von mehr als 95%, auch bei der Verwendung zur Immunisierung von Feldhühnern, die einen maternalen Antikörper aufweisen, wobei die wirksame Immunisierung von Tieren mit einem maternalen Antikörper ein unerledigtes Problem darstellte.
- Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der clonierten mutmaßlichen gB- Promotorfragmente.
- Fig. 2 zeigt die Nucleotidsequenz stromaufwärts des gB-Gens sowie jeweils die Position der Primer, die zur Nucleotidsequenzbestimmung verwendet wurden, und der PCR- Primer.
- Fig. 3 zeigt die Konstruktion von Insertionsvektorplasmiden (pKA4BPF und pKA4BNF) zur Expression des NDV-F-Proteins mit dem gB-Promotor.
- Fig. 4 zeigt ein theoretisches Schema der Insertion von gB-Promotoren und des NDV-F-Gens für US10BPF und US10BNF sowie die Position von Fragment A4, das zur Konstruktion des Insertionsvektorplasmids verwendet wurde.
- Fig. 5 zeigt die Ergebnisse einer Southern-Hybridisierung von Spaltprodukten mit dem Restriktionsenzym PstI von DNA, extrahiert aus CEFs, die mit dem rekombinanten Virus US10BPF oder US10BNF infiziert wurden, unter Verwendung von Fragment P aus dem gB-Promotor oder von Fragment A4 als Sonde.
- Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Veränderung des anti-F-Antikörpertiters in einem ELISA für Hühner, die mit dem rekombinanten Virus US10BPF, US10OBNF oder US10BLF geimpft wurden, und für Hühner ohne eine Impfung zeigt.
- Fig. 7 ist ein Diagramm, das die Veränderung des anti-F-Antikörpertiters in einem ELISA für Hühner zeigt, die mit dem rekombinanten Virus US10BPF geimpft wurden.
- Im Hinblick auf die ausgezeichnete Schutzwirkung, die in dem vorstehend erwähnten Immunisierungsexperiment erhalten wurde, weist der erfindungsgemäß verwendete gB- Promotor, der aus einem Herpesvirus abgeleitet ist, vermutlich die im folgenden erwähnten Eigenschaften auf.
- Das heißt, Lebendimpfstoffviren gegen die Marek-Krankheit infizieren persistierend innerhalb des Körpers von Hühnern trotz der Anwesenheit neutralisierender Antikörper im Blut, wodurch ein hoher Antikörpertiter gegen MDVs hervorgerufen wird. Obwohl der Mechanismus unbekannt ist, durch den das Virus das Immunsystem des Wirtes umgeht, um anhaltend eine Antigenstimulierung zu induzieren, könnte eine Möglichkeit sein, daß ein Gewebe, das mit dem Virus latent infiziert ist, verschieden ist von dem Gewebe, in dem ein Antigen (z. B. gB) exprimiert wird. Das heißt, man nimmt an, daß in einem Gewebe, in dem eine latente Infektion mit dem Marek-Virus vorliegt, kein Zielantigen für das Immunsystem exprimiert wird, und als Ergebnis kann das Virus der Überwachung durch das Immunsystem des Wirtes entkommen. Ein solches latentes Virus wird vermutlich oft aktiviert und stimuliert das Immunsystem möglicherweise durch die Infektion eines anderen Gewebes, wo es ein virales Antigen exprimiert, wodurch eine hohe Antikörperproduktion induziert wird.
- gB, dessen Expression durch den gB-Genpromotor intrinsisch kontrolliert wird, wobei der Promotor erfindungsgemäß erfolgreich cloniert wurde, ist ein Glycoprotein, das die Produktion neutralisierender Antikörper gegen das Virus induziert. Man nimmt an, daß, obwohl die Produktion eines Antikörpers gegen gB (d. h. eines neutralisierenden Antikörpers) in mit MDV infizierten Hühnern induziert wird, die MDVs dem neutralisierenden Antikörper entkommen und persistierend infizieren, um eine Antigenstimulierung hervorzurufen, wodurch ein hoher Antikörpertiter induziert wird. Das heißt, man nahm an, daß der gB-Promotor gB in spezifischen Zellen exprimiert, aber nicht in solchen Zellen, wo MDVs latent sind. Als Ergebnis können MDVs persistierend infizieren, während sie dem Immunsystem des Wirtes entkommen. Demgemäß wird unter Verwendung des gB-Promotors zur Expression des Newcastle-Virus-F-Proteins die Expression des F-Proteins in ähnlicher Weise durch den gB- Promotor kontrolliert, und als Ergebnis erhält ein rekombinantes Virus die Eigenschaften einer persistierenden Infektion, während es der Exposition des Immunsystems des Wirtes entkommt.
- Im Gegensatz zu einem aus SV40 abgeleiteten Promotor, der in verschiedene rekombinante Viren eingebaut wurde, welche die Erfinder bisher konstruiert haben, exprimieren die rekombinante Viren, obwohl die Promotoraktivität selbst hinreichend wirksam ist, das F-Protein sogar auf der Oberfläche von solchen Zellen, bei denen eine latente Infektion möglich sein könnte. Als Ergebnis werden die Viren durch das Immunsystem des Wirtes zielgerecht angegangen und daher aus dem lebenden Körper infolge des Fehlens des Kontrollmechanismus entfernt, wie vorstehend erwähnt. Unter diesen Umständen, besonders in Gegenwart von maternalen Antikörpern, nahm man an, daß sich die rekombinanten Viren infolge der schnelleren Eliminierung durch das Immunsystem nicht ausreichend vermehren könnten.
- Andere zu MDV-gB homologe Glycoproteine sind in einer Reihe von Herpesviren stark konserviert und werden als ein Antigen angesehen, das für den Schutz vor einer Infektion verantwortlich ist (Eberl R. et al., J. Med. Virol. 27 (1989), 309-316). Im Hinblick darauf wurde nicht nur für das Marek-Virus, sondern auch für andere als Vektoren verwendete Herpesviren, die Verwendung des gB-Genpromotors zur effizienten Expression eines exogenen Gens von Interesse und zur Aufrechterhaltung der Impfstoffwirkung für einen langen Zeitraum als sehr wirksam angesehen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein wirksames rekombinantes Herpesvirus unter Verwendung eines gB-Promotor-Gens aus einem Herpesvirus hergestellt (d. h. einem gB-Promotor-Gen, das intrinsisch in dem Herpesvirus enthalten ist). Solche Herpesviren schließen zusätzlich zu MDV das Herpesvirus saimiri [Desrosiers R. C. et al., Molecular and Cellular Biology 5 (1994), 2796-2803]; das Aujeszky- Virus [Glazenburg K. L. et al., J. Virology 69 (1995), 189-197]; das Herpes simplex-Virus- Typ 1 (nachstehend bezeichnet als "HSV1") [Federoff H. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59 (1992), 1636-1640]; das Herpes simplex-Virus-Typ 2 (nachstehend bezeichnet als "HSV2") [David J. B. et al., Virology 155 (1986), 322-333]; das Herpes zoster-Virus [Lowa R. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 3896-3900]; das Pferde-Herpesvirus-Typ 1 [Elizabeth A. R. et al., Virology 189 (1992), 304-316]; das Rinder-Herpesvirus-Typ 1 (nachstehend bezeichnet als "BHV1") [Whitbeck J. C. et al., 3. Virology 62 (1988), 3319- 3327]; das Rinder-Herpesvirus-Typ 2 (nachstehend bezeichnet als "BHV2") [Hammerschmidt et al., Virology 165 (1988), 388-405]; das Katzen-Herpesvirus-Typ 1 [Spaete R. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7213-7217; Naoaki Yokoyama et al., 119. Japan Veterinary Society, Kurzmitteilung, S. 116 (1995)]; das Truthahn-Herpesvirus (nachstehend bezeichnet als "HVT") [Sondermeijer P. J. et al., Vaccine 11 (1993), 349-358]; das menschliche Cytomegalievirus (nachstehend bezeichnet als "HCMV") [McDougall J. K., Cytomegaloviruses, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg]; das menschliche Herpesvirus-Typ 6 (nachstehend bezeichnet als "HHV6") [Ellinger K. et al., J. Gen. Virol. 74 (1993), 495-500]; das menschliche Herpesvirus-Typ 7 (nachstehend bezeichnet als "HHV7") [Atsuko Haneda et al., 42. Japan Virology Society, Kurzmitteilung, S. 166 (1994)]; das Epstein-Barr-Virus (nachstehend bezeichnet als "EBV") [Davison A. J. et al., J. Gen. Virol. 68 (1987), 1067-1079] und ähnliche ein.
- Zusätzlich zu der vorstehend erwähnten Wirkung, daß die Expression eines exogenen Gens in Wirtszellen, die mit dem Virus geimpft sind, kontrolliert wird, kann erfindungsgemäß auch die Wirkung erzielt werden, daß die Promotorgenfragmente zur Expression eines exogenen Gens kürzer sind als die herkömmliche Promotoren, wie der SV40-Promotor. Auf diese Weise kann durch den verkürzten Teil geeigneterweise ein längeres Strukturgen (exogenes Gen) zur Expression in ein Plasmid eingebaut werden, so daß die Konstruktion eines Plasmids und eines rekombinanten Virus erleichtert wird.
- Die Erfinder haben die 5'-Stelle der gB, US10, US537 und US420 codierenden Gene [Sakaguchi et al., Virus Gene 6 (1992), S. 365-378] als einen aus MDV abgeleiteten Promotor cloniert und unter Verwendung dieser Genfragmente ein Experiment zur Expression eines exogenen Gens durchgeführt. Als Ergebnis konnte das 5'-Fragment eines gB-Gens unter diesen Promotoren das exogene Gen in Kulturzellen erfolgreich exprimieren und folglich wurde der gB-Promotor für weitere Untersuchungen, wie nachstehend beschrieben, ausgewählt.
- Die Position des gB-Gens auf dem MDV1-Genom ist durch Anne E. Buckmaster et al. [J. Gen. Virol. 69 (1988), S. 2033-2042] beschrieben worden. Danach sind auch die Nucleotidsequenzen des gB-Gens und stromaufwärts davon bis zur Base -360 beschrieben worden [Ross L. J. N. et al., J. Gen. Virol. 70 (1989), S. 1789-1804].
- Die Sequenzen wurden anschließend zur Konstruktion von Rekombinanten des Truthahn-Herpesvirus (HVT) verwendet, worin ein 3,9 kbp-Fragment, umfassend das gB-Gen und bis zu 360 bp stromaufwärts der Translationsinitiationsstelle, in das HVT-Thymidinkinase-Gen integriert wurde [Ross L. J. N. et al., J. Gen. Virol. 74 (1993), S. 371-377].
- Jedoch ist bis jetzt noch nicht über die Identifizierung einer Promotorregion, die an der Expression des gB-Gens beteiligt ist, sowie die Aktivitäten davon berichtet worden. Folglich haben die hierin genannten Erfinder die Promotorregion zur Verwendung in einem rekombinanten Virus zuerst identifiziert.
- Zuerst wurden unter Bezugnahme auf die durch Ross et al. [J. Gen. Virol. 70 (1989), S. 1789-1804] beschriebene Nucleotidsequenz Primer konstruiert, und eine weitere stromaufwärts vorhandene Nucleotidsequenz wurde durch das Primerverlängerungsverfahren bestimmt.
- Anschließend wurden ein 5'-Primer innerhalb der bestimmten Region und ein 3'-Primer unmittelbar vor dem offenen Leseraster (ORF) von gB konstruiert, und etwa 500 Nucleotide wurden mittels PCR amplifiziert und cloniert. Dann wurde stromabwärts der Nucleotide ein F-Protein-Gen von NDV ligiert, um ein Expressionsplasmid zu konstruieren. In ähnlicher Weise wurde unter Verwendung von nur der 3'-Hälfte der mittels PCR amplifizierten Nucleotide ein Plasmid zur Expression des F-Protein-Gens konstruiert und einem Experiment unterzogen.
- Zur Messung der Promotoraktivitäten wurde zuerst die Expression in Kulturzellen bestätigt. Das heißt, die Plasmide wurden in Hühnerembryofibroblasten (CEFs) eingeschleust, und die Expression des F-Proteins wurde durch das Fluoreszenz-Antikörper-Verfahren unter Verwendung eines monoclonalen Antikörpers nachgewiesen, der das F-Protein erkennt. Im Anschluß daran wurden rekombinante Viren unter Verwendung jedes Plasmids konstruiert und die F-Protein-Expression wurde in jedem rekombinanten Virus bestätigt. Als letztes Experiment wurde jedes der rekombinanten Viren an Hühner überimpft, die maternale Antikörper aufweisen, und die Immunogenität davon wurde verglichen. Als Ergebnis wurde kein Unterschied zwischen den rekombinanten Viren bezüglich der exprimierten Menge des F-Proteins in Kulturzellen beobachtet, während die Immunogenität nach dem Überimpfen an Hühner unerwarteterweise sehr unterschieden war. Das heißt, es wurde festgestellt, daß das rekombinante Virus mit der gesamten mittels PCR amplifizierten Nucleotidsequenz eine äußerst hohe Immunogenität zeigte, während das rekombinante Virus, das nur die 3'-Hälfte der amplifizierten Sequenz als Promotor umfaßt, eine äußerst geringe Immunogenität zeigte.
- Folglich sind als gB-Promotorregion zur Expression eines exogenen Gens in einem rekombinanten Virus nicht nur bis zu etwa 200 bis 300 Nucleotide stromaufwärts der Translationsinitiationsstelle, gewöhnlich eine minimale Region für einen Promotor entscheidend, sondern auch eine, weiter stromaufwärts vorkommende Region von Nucleotid -262 bis zum Nucleotid -561 (vgl. Fig. 2), die einen Transkriptionskontrollfaktor enthält. Das heißt, es wurde gezeigt, daß die erforderliche minimale Sequenz für einen Promotor innerhalb ungefähr der 3'-Hälfte der clonierten Sequenz von etwa 500 Nucleotiden im Hinblick auf die F-Protein-Expression in Kulturzellen enthalten ist, aber die in der 5'-Hälfte der clonierten Sequenz enthaltene Transkriptionskontrollregion eine wichtige Rolle bei der wirksamen Expression innerhalb des lebenden Körpers von Hühnern spielt.
- Das Promotorgenfragment zur erfindungsgemäßen Verwendung bei der Expression eines exogenen Gens ist ein Genfragment, das die Sequenz von Nucleotid 61 bis zu dem Nucleotid 557 in SEQ ID Nr. 1 des Sequenzprotokolls umfaßt.
- Ein exogenes Gen, das durch solche gB-Promotoren kontrolliert wird, zum Einbau in das Genom des Marek-Virus schließt verschiedene Gene ein, die Proteine eines möglichen Impfstoffantigens für verschiedene Erkrankungen bei Hühnern codieren, einschließlich virale Erkrankungen, bakterielle Erkrankungen, parasitische Erkrankungen und ähnliche. Zum Beispiel schließt ein exogenes Gen, das zur Herstellung eines polyvalenten Impfstoffes zur Verwendung bei Hühnern eingebaut werden kann, ein Gen ein, das ein Newcastle-Disease- Virus (NDV)-Antigen codiert (z. B. Gene, die das NDV-F-Protein oder das HN-Protein codieren), das ein Glycoprotein der infektiösen Laryngitis bei Vögeln (ILTV) codiert, das ein virales Strukturprotein des infektiösen Bursa-Disease-Virus (IBDV) codiert, z. B. Gene, die VP2 oder das ganze VP243 codieren, ein Gen, das ein Oberflächenprotein des infektiösen Bronchitisvirus (IBV) codiert, ein Gen, das das HA-Protein von Heamophilus paragallinarum codiert, dem Erreger eines infektiösen Virusschnupfens, und ähnliche. Da im Falle des Influenzavirus gezeigt worden ist, daß ein Kernprotein (NP) ein Schlüsselantigen ist, das zur Vorbeugung wirksam ist, unabhängig vom Serotyp, ist bei anderen Viren ein Kernproteingen als ein Antigen zur Verwendung bei der Vorbeugung vor viralen Erkrankungen möglicherweise ein entscheidendes Antigengen für einen Schutz.
- Zur Expression von exogenen Genen, wie vorstehend erwähnt, wird eine Expressionskassette unter Verwendung des erfindungsgemäßen gB-Promotor-Gens konstruiert, und die Kassette wird in MDV eingeschleust, um einen polyvalenten Impfstoff mit einem einzigen Virus (einem rekombinanten MDV) herzustellen, da MDV selbst als Impfstoff gegen das Marek-Virus wirksam ist. Gegebenenfalls kann auch ein Impfstoff mit mehr als zwei Valenzen hergestellt werden, und ein polyvalenter Impfstoff mit mehr als drei Valenzen, der nur eine Art eines rekombinanten Virus umfaßt, kann auch durch das Einschleusen einer Vielzahl von verschiedenen fremden Genexpressionskassetten in einen einzigen Virus hergestellt werden. Ein solcher Impfstoff kann ohne weiteres unter Anwendung der bekannten Verfahren gemäß dem Stand der Technik hergestellt werden.
- Das erfindungsgemäße rekombinante Virus kann an Hühner überimpft werden, die ein Alter von beliebigen Wochen aufweisen. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß das charakteristischste Merkmal des erfindungsgemäßen rekombinanten Virus die Fähigkeit ist, daß es wirksam an Hühner überimpft werden kann, die maternale Antikörper aufweisen, z. B. direkt nach dem Ausbrüten. Außerdem ist es auch möglich, im Stadium der sich entwickelnden Eier zu impfen, am geeignetsten bei 17 bis 18 Tage alten Embryos.
- Zusätzlich zur Expression der vorstehend erwähnten Impfstoffantigene ist das erfindungsgemäße rekombinante Virus auch als Virusvektor zur Expression von physiologisch aktiven Proteinen, die von den Impfstoffantigenen in geimpften Tieren verschieden sind, nützlich. Das heißt, da das erfindungsgemäße rekombinante Herpesvirus kein transientes Expressionssystem ist, sondern, wenn an Tiere verabreicht, persistierend infizieren kann, während es dem Immunsystem innerhalb des tierischen Körpers entkommt, wird erwartet, daß es als Arzneistoffübertragungssystem (DDS) zur wirksamen Herstellung eines exogenen Genprodukts innerhalb des lebenden Körpers sehr wirksam ist.
- Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe des folgenden Abschnitts "Herstellung" und von Beispielen ausführlicher veranschaulicht.
- Der Marek-Virus-Typ 1-CVI988-Stamm wurde zur Clonierung der gB-Promotorgenregion und zur Konstruktion eines rekombinanten Virus verwendet.
- Nach dem Überimpfen des Virus an Hühnerembryofibroblasten (CEFs) wurden die infizierten Zellen geerntet, wenn ein starker cytophatischer Effekt (CPE) beobachtet wurde. Die infizierten Zellen wurden in einer 1%igen SDS-Lösung (0,1% Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1% Sarcocinat; hergestellt durch Wako Junyaku Kogyo K. K.), enthaltend 0,1% Proteinase K (Boehringer Mannheim), suspendiert. Die Suspension ließ man bei 37ºC über Nacht stehen. Anschließend wurde eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung durchgeführt, um die DNAs zu gewinnen, die in einer geeigneten Menge an TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) gelöst wurden, um eine Lösung der viralen DNAs zu erhalten.
- Die auf diese Weise präparierten viralen DNAs (5 ug) wurden mit einem Restriktionsenzym gespalten, und die Fragmente wurden mittels Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel aufgetrennt. Die DNA-Fragmente wurden durch das Elektroelutionsverfahren aus dem Gel eluiert und durch eine Phenolbehandlung und eine Ethanolfällung gewonnen. Die erhaltenen Fragmente wurden in einen geeigneten Plasmidvektor (z. B. pUC119; Takarashuzo) mit einem Ligierungskit (Takarashuzo) inseriert, und kompetente Zellen (z. B. JM109) wurden mit dem Vektor transformiert, um transformierte E. coli-Zellen zu erhalten. Anschließend wurden die Transformantenzellen auf einem kreisförmigen Wachstumsmedium (BIO101, Inc.), enthaltend 100 ug/ml Ampicillin, gezüchtet, und im Anschluß daran wurden die Plasmide durch das Alkaliverfahren aus den Zellen gewonnen.
- Nach Clonierung der Genfragmente in die Multiclonierungsstelle von pUC119 wurden die Plasmide in kompetente Zellen, wie JM109, eingeschleust. Nach Vermehren der erhaltenen Transformanten auf LB-Medium über Nacht wurden 30 ul der Transformanten mit 60 ul des M13-Phagen (10&sup9; PFU/ml oder mehr) infiziert und durch eine Schüttelkultur über Nacht weiter gezüchtet. Nach Entfernen der Zellen durch Zentrifugation wurden die Phagen aus dem Überstand gewonnen, und eine einzelsträngige DNA (ssDNA), welche die Nucleotidsequenz eines gewünschten Genfragments enthält, wurde durch das herkömmliche Verfahren hergestellt. Die Nucleotidsequenz der erhaltenen ssDNA wurde mit SEQUENASE Ver. 2.0 (Toyobo) gemäß dem beiliegenden Protokoll bestimmt.
- Die virale DNA (0,1 ug) wurde in 1 · Vent-Puffen (10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 mM MgSO&sub4;), enthaltend 100 ug/ml BSA, gelöst und dazu wurden 0,5 mM dNTP, jeweils 100 pmmol der Stromaufwärts- und Stromabwärts-Primer und 1 ul Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) zugegeben. Die Reaktion wurde für 35 Zylden durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 95ºC für 1 Minute, 55ºC für 1 Minute und 72ºC für 1 Minute bestand.
- 10&sup6; CEF-Zellen/Vertiefung wurden auf eine Platte mit 6 Vertiefungen überimpft, die ein Deckglas enthielt (MATSUNAMI Nr. 1, 18 · 18), und auf Eagle-Medium mit 5% FBS bei 37ºC für 5 Stunden gezüchtet. Nach zweimaligem Waschen mit serumfreiem Eagle- Medium, wurden 1 ml serumfreies Eagle-Medium, enthaltend 10 ug Lipofectin, und 30 ug des Insertionsplasmids zugegeben, und die Zellen wurden bei 37ºC für 16 Stunden herangezüchtet. Nach Zugabe von 1 ml Eagle-Medium mit 10% FBS und Heranzüchten für 2 Tage wurde das Deckglas entfernt, und die Zellen wurden mit Aceton bei Raumtemperatur für 20 Minuten fixiert und dann bei -80ºC gelagert. Die F-Protein-Expression in den rekombinanten Viren wurde durch die Umsetzung mit dem monoclonalen anti-NDV-F-Antikörper #313 [Umino Y. et al., J. Gen. Virol. 71 (1990), S. 1199], 20fach verdünnt mit PBS(-), bei 4ºC über Nacht und dann durch die Umsetzung mit FITC-markiertem anti-Maus-IgG, 20fach verdünnt mit PBS(-), bei 37ºC für 2 Stunden, gefolgt vom Waschen und Beobachten mit einem Fluoreszenzmikroskop, bestätigt.
- Nach dem Ernten einer Primärkultur von CEFs, die bei 37ºC über Nacht herangezüchtet worden waren, und dem Waschen mit einer EDTA-Trypsin-Lösung wurden die Zellen in Eagle-MEM (E-MEM; Nissui), supplementiert mit 5% Rinderserum (BS), in einer Zellkonzentration von 2 · 10&sup5; Zellen/ml suspendiert. Eine Gewebekulturflasche, hergestellt durch Falcon (Nr. 3028), wurde mit 40 ml der Suspension gefüllt, und darauf wurden etwa 8 · 10&sup5; CEF-Zellen, infiziert mit Marek-Viren, überimpft, gefolgt vom Heranzüchten bei 37ºC für 4 Stunden. Anschließend wurden die Zellen wieder mit einer EDTA-Trypsin-Lösung geerntet und zweimal mit PBS(-) gewaschen, 5 · 10&sup6; Zellen davon wurden in die Küvette einer Gene Pulser-Vorrichtung, hergestellt durch Bio-Rad (Katalog Nr. 165-2075), überführt, und dazu wurden die Insertionsplasmide zugegeben. Dann wurde gemäß dem beigefügten Protokoll ein Impuls appliziert, um die Insertionsplasmide in die mit dem Virus infizierten Zellen einzuschleusen. Dann wurden die Zellen in 15 ml E-MEM (Nissui), supplementiert mit 5% BS, suspendiert, in eine Laborschale mit einem Durchmesser von 10 cm (hergestellt durch Falcon; Nr. 3003) überführt und bei 37ºC herangezüchtet. Am nächsten Tag wurde das Kulturmedium zusammen mit solchen Zellen entfernt, welche die Plasmide nicht aufgenommen haben, und eine Primärkultur von CEFs (zweite CEFs), die am Tag vorher separat herangezüchtet und in 15 ml E-MEM (Nissui), supplementiert mit 5% BS, bei 5 · 10&sup5; Zellen/ml suspendiert worden waren, wurde zugegeben. Die Heranzüchtung wurde bei 37ºC für 4 bis 7 Tage fortgesetzt.
- Nach Waschen der Laborschale, auf der Plaques mit E-MEM-Medium erschienen waren, wurde eine isotonische Lösung, enthaltend den monoclonalen Antikörper #313, dazugegeben, und die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde durchgeführt. Nach dem Waschen wurde ein Peroxidase-markierter Maus-Antikörper (Bio-Rad, Code-Nr. 172- 1011), 200fach verdünnt mit einer isotonische Lösung, dazugegeben und die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde fortgeführt. Nach dem Waschen wurde 0,1 M Tris- Puffer, enthaltend 5 mg 3,3-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB; Wako Junyaku Kogyo K. K., Code-Nr. 343-00901) und 1,6 mg Wasserstoffperoxid (Mitsubishi Gasu Kagaku K. K., enthaltend 31% H&sub2;O&sub2;), pro 10 ml dazugegeben. Die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 10 bis 60 Minuten ausgeführt, um die Plaques des rekombinanten Virus zu färben. Die braun gefärbten Plaques wurden mit einem Penicillinbecher eingeschlossen und nur der Bereich innerhalb des Bechers wurde mit einer Trypsinlösung, enthaltend 0,1% EDTA, verdaut, um die mit dem rekombinanten Virus infizierten Zellen zu ernten, die mit frischen CEFs zur Reinigung des rekombinanten Virus gezüchtet wurden. Nach der Bestätigung, daß 100% der Virusplaques das F-Protein exprimierten, wurde zweimal eine Ultraschallbehandlung durchgeführt, um das Virus gemäß den in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 4- 205933 (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-22757) beschriebenen Verfahren zellfrei zu machen, um die Reinigung des rekombinanten Virus abzuschließen.
- Unter Verwendung des DIG-DNA-Markierungskits (Katalog Nr. 150350), hergestellt durch Boehringer Mannheim, wurden Sonden hergestellt, und die Hybridisierung wurde gemäß dem beiliegenden Protokoll durchgeführt.
- Eine geeignete Menge der vorstehend erhaltenen DNA des rekombinanten Virus wurde auf einem Agargel einer Elektrophorese unterzogen, und nach der Elektrophorese wurde sie auf Hybond N+ (Amersham Japan, Katalog Nr. RPN.303B) übertragen. Die Hybridisierung wurde gemäß dem Protokoll ausgeführt. Anschließend wurde unter Verwendung des DIG-DNA-Nachweiskits (Katalog Nr. 150350), hergestellt durch Boehringer Mannheim, die DNA von Interesse gemäß dem beiliegenden Protokoll nachgewiesen.
- Einen Tag alte Babcock-Hühner wurden subkutan mit 10&sup4; PFU/Huhn des rekombinanten Virus geimpft. Jeder Gruppe von Hühnern wurde bis 4 Wochen nach der Impfung wiederholt Blut abgenommen, und die Veränderung des Titers eines ani-F-Protein-Antikörpers, induziert durch das rekombinante Virus, wurde durch einen ELISA gemessen. Zur Messung der Antikörper wurde ein ELISA verwendet, bei dem Zellen, die persistierend das F-Protein herstellen (Maus-Myelomzellen P3-X63-AG8.653, transformiert mit dem NDV- F-Gen unter Kontrolle des β-Actin-Genpromotors), immobilisiert auf einer Platte mit 96 Vertiefungen zur Gewebekultur, als Antigen verwendet wurden, wie in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 5-96727 (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-289028) ausführlich offenbart ist.
- Andererseits wurde zur Beurteilung der Schutzwirkung gegen eine Infektion mit dem Newcastle-Virus die Hälfte der Anzahl jeder Gruppe intramuskulär einer Letaldosis von 10&sup4; Zellen des virulenten NDV-Sato-Stamms in einem Alter von 6 Wochen ausgesetzt und für 2 Wochen beobachtet. Als eine Schutzwirkung gegen eine Infektion mit dem Marek-Virus- Typ 1 wurde eine intraperitoneale Exposition mit 500 PFU/Huhn der sehr virulenten MDV (vvMDV)-RB1B-Zellen (infizierte Milzzellen) im Alter von 1 Woche durchgeführt und die Hühner wurden bis zu einem Alter von 10 Wochen beobachtet. Alle überlebenden Hühner wurden einer Autopsie unterzogen, um das Vorhandensein tumorartiger Läsionen zu untersuchen.
- Nach der Blutentnahme mit einer mit Heparin gefüllten 1 ml-Spritze wurde PBS(-) auf 4 ml zugegeben, und das Gemisch wurde vorsichtig auf Ficoll-Paque (Pharmacia), 3 ml in einem konischen Röhrchen (Falcon, Katalog Nr. 2099), überschichtet und bei 1500 UpM für 5 Minuten zentrifugiert (KUBOTA KN-30F). Die mittlere Schicht, enthaltend Lymphocyten und Monocyten (Leukozytenmanschette), wurde entfernt und nach dem Suspendieren in PBS(-), enthaltend 0,1% EDTA, bei 1000 UpM für 5 Minuten wiederum zentrifugiert, um die Lymphocyten und Monocyten zu gewinnen, die auf CEFs überimpft wurden, die für 4 Stunden gezüchtet worden waren (zweite CEFs), und die CEFs wurden für 10 Tage gezüchtet und beobachtet. Diejenigen CEFs, die keine CPE von MDV zeigten, wurden bis zur 3. Generation subkultiviert und dann untersucht.
- Unter der beispielhaften Verwendung eines Vektors, worin das Marek-Virus als ein Herpesvirus verwendet wird, werden nachstehend die Clonierung der gB-Promotorregion und die Konstruktion eines rekombinanten Virus zur Konstruktion eines rekombinanten Lebendimpfstoffes für Hühner veranschaulicht.
- Das BamHI-I3-Fragment, das die Nucleotidsequenz des gB-Gens umfaßt, wie beschrieben durch Ross et al. [J. Gen. Virol. 70 (1989), S. 1789-1804], wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRV und SspI gespalten, und das erhaltene Fragment von etwa 1, 2 kbp wurde in pUC119 subcloniert. Wie in "Herstellung" beschrieben, wurde die Nucleotidsequenz für eine Region weiter stromaufwärts des gB-Gens unter Verwendung des Plasmids bestimmt. Eine Nucleotidsequenz von etwa 300 bp in Stromaufwärtsrichtung wurde zuerst bestimmt, und im Anschluß daran wurde die Bestimmung einer Nucleotidsequenz in Stromabwärtsrichtung bis zur SspI-Stelle durchgeführt, so daß eine Nucleotidsequenz von insgesamt 557 bp bestimmt wurde. Das Ergebnis ist als SEQ ID Nr. 1 gezeigt. Die Sequenz von Nucleotid 558 bis zu dem Translationsinitiationscodon ATG (Nucleotid 624) in SEQ ID Nr. 2 befindet sich an der 3'-Stelle der vorstehenden 557 bp-Sequenz und ist durch Ross et al. (ibid) beschrieben worden. Der Primer, den die hierin genannten Erfinder zur Bestimmung der Nucleotidsequenz verwendeten, entspricht den Nucleotiden 275 bis 291 in SEQ ID Nr. 1.
- Primer wurden basierend auf der in Beispiel 1 erhaltenen Nucleotidsequenz (vgl. SEQ ID Nr. 1) für einen Stromaufwärts-Primer oder unter Zugrundelegung der durch Ross et al. [J. Gen. Virol. 70 (1989), S. 1789-1804] beschriebenen Sequenz für einen Stromabwärts- Primer konstruiert. Das heißt, ein Stromaufwärts-Primer wurde zwischen den Nucleotiden 61 und 82 in SEQ ID Nr. 1 konstruiert und ein Stromabwärts-Primer wurde zwischen den Nucleotiden 566 und 586 konstruiert. Die jeweilige Sequenz der Primer ist nachstehend gezeigt. Stromaufwärts Stromabwärts
- Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: d. h. 0,1 ug der viralen DNA wurden in 1 · Vent-Puffer (10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 2 mM MgSO&sub4;), enthaltend 100 ug/ml BSA, gelöst, und zu der Lösung wurden dann 0,5 mM dNTP, jeweils 100 pmmol des Stromaufwärts- und Stromabwärts-Primers und 1 ul Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs) zugegeben. Die Reaktion wurde für 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus 95ºC für 1 Minute, 55ºC für 1 Minute und 72ºC für 1 Minute bestand. Als Ergebnis wurde ein DNA-Fragment von etwa 0,5 kbp erfolgreich amplifiziert. Dieses DNA- Fragment wurde gespalten mit EcoRI und SspI, um ein DNA-Fragment von etwa 0,5 kbp (nachstehend bezeichnet als "Fragment P", eine Nucleotidsequenz, die den Nucleotiden 61 bis 557 in SEQ ID Nr. 1 entspricht) zu erhalten, und mit EcoRI und NdeI, um ein DNA-Fragment von 230 bp (nachstehend bezeichnet als "Fragment N", eine Nucleotidsequenz, die den Nucleotiden 359 bis 586 in SEQ ID Nr. 2 entspricht) zu erhalten, die als gB-Genpromotorregion verwendet wurden (vgl. Fig. 1 und 2).
- Nach Spalten des Insertionsvektorplasmids pKA4BLF [beschrieben in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 4-205933 (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-22757)], das das NDV-F-Protein mit Hilfe des späten SV40-Promotors exprimiert, mit den Restriktionsenzymen HindIII und XbaI wurde ein DNA-Fragment von etwa 7,9 kbp ohne die Sequenz des späten SV40-Promotors durch eine 0,8%ige Agargelelektrophorese gewonnen. Nach Überführen der Enden dieses Fragments in glatte Enden mit dem Blunt End Ligation-Kit (TaKaRa), wurde das gB-Genpromotor-Fragment P oder N cloniert. Unter den erhaltenen Plasmiden wurde ein Plasmid, welches das gB-Promotor-Fragment P in der richtigen Orientierung umfaßte (d. h. in einer Orientierung, die die Expression des NDV-F-Proteins ermöglicht), als "pKA4BPF" bezeichnet, und ein Plasmid, welches das Fragment N in der richtigen Richtung umfaßte, wurde als "pKA4BNF" bezeichnet (Fig. 3).
- Das FA wurde durchgeführt, wie in "Herstellung" beschrieben, und als Ergebnis wurde pKA4BPF und pKA4BNF gezeigt, daß beide das NDV-F-Protein in CEFs exprimieren. Es wurde kein Unterschied bezüglich der Fluoreszenzintensität zwischen den Zellen beobachtet, in die jedes Plasmid eingeschleust wurde, und auf diese Weise wurde abgeschätzt, daß die Promotoraktivität der beiden Fragmente P und N in CEFs im wesentlichen gleich war.
- Nach Spalten jedes der in Beispiel 3 konstruierten Insertionsvektorplasmide pKA4BPF und pKA4BNF mit den Restriktionsenzym ScaI, um diese zu linearisieren, wurden diese Plasmide in mit dem CV1988-Stamm infizierte Zellen eingeschleust, wie in "Herstellung eines rekombinanten Virus" beschrieben ist. Die auf diese Weise erhaltenen rekombinanten Viren wurden als "US10BPF" bzw. "US10BNF" bezeichnet. Plaques der rekombinanten Viren wurden mit dem monoclonalen anti-F-Protein-Antikörper-DAB [Japanische Patentanmeldung Nr. 4-205933 (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-22757)] gefärbt. Als Ergebnis wurde kein signifikanter Unterschied bezüglich der exprimierten Menge an F-Protein durch beide rekombinante Viren beobachtet, und auf diese Weise wurde abgeschätzt, daß die Promotoraktivität der Fragmente P und N in Kulturzellen gleich war.
- Um die Insertionsposition der Expressionskassette in beiden rekombinanten Viren US10BPF und US10BNF zu bestätigen, wurden aus infizierten CEFs extrahierte DNAs mit Restriktionsenzymen gespalten, und anschließend wurde eine Southern-Hybridisierung durchgeführt. Unter Verwendung irgendeines der gB-Promotorfragmente P oder A4 als Sonde wurden nur die erwarteten Banden nachgewiesen, wobei bestätigt wurde, daß die Insertion der Expressionskassette durch homologe Rekombination ausgeführt wurde und daß die Reinigung der rekombinanten Viren tatsächlich erfolgt ist (Fig. 4 und 5).
- Um die Wirksamkeit als Impfstoff des hergestellten US10BPF und US10BNF gegen die Newcastle-Krankheit (ND) zu zeigen, wurde 1 Tag alte Hühner mit diesen rekombinanten Viren geimpft, und ein Expositionstest wurde 6 Wochen später durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Das hierin als Kontrolle verwendete US10BLF ist ein rekombinantes Virus, worin die Expression des F-Proteins unter der Kontrolle des späten SV40-Promotors erfolgt, das mit dem Insertionsplasmid pKA4BF hergestellt wurde, die Konstruktion davon ist in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 4-205933 (Japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-22757) offenbart. Dieses rekombinante Virus zeigt eine starke Impfstoffwirkung gegen eine NDV-Exposition bei SPF-Hühnern, aber die ND-Schutzwirkung ist, wie in Tabelle 1 gezeigt, bei Hühnern verringert, die einen maternalen Antikörper aufweisen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigten Kontroll-Hühner und SPF-Hühner ohne eine Impfung eine Schutzrate von 0%, während die Impfung mit US10BPF alle Individuen schützte, selbst Hühner, die einen maternalen Antikörper aufweisen. Folglich zeigten diejenigen rekombinanten Viren, worin das F-Protein unter Kontrolle des gB-Genpromotors exprimiert wird, eine ausgezeichnete Impfstoffwirkung. Jedoch zeigte das rekombinante Virus US10BNF, das den gB-N-Promotor umfaßt, einer der gB-Promotoren, der halb so lang ist wie der gB-P-Promotor, keine Schutzwirkung. Obwohl US10BNF eine F-Protein-Expression in Kulturzellen in der gleichen Rate wie US10BPF zeigte, war die Schutzwirkung in vivo zwischen US10BPF und US10BNF sehr verschieden, was nahelegt, daß die Verwendung der gB-P-Region als Promotor für die Expression eines exogenen Gens in rekombinanten Viren zur Verabreichung an den lebenden Körper entscheidend ist.
- Als Impfstoffwirkung gegen die Marek-Krankheit (MD), wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, wurde für das erfindungsgemäße rekombinante Virus US10BPF nachgewiesen, daß es eine Schutzrate von 90% gegen das sehr virulente Marek-Virus-Typ 1 zeigt, wobei die Schutzrate äquivalent zu oder höher als diejenige des Elternstamms (nicht-rekombinant), 89%, oder des im Handel erhältlichen MDV1-Impfstoffes, 84%, ist.
- Wie vorstehend erwähnt, wurde für das erfindungsgemäße rekombinante Virus US10BPF nachgewiesen, daß es eine starke Schutzwirkung gegen sowohl das Newcastle- Disease (ND)- als auch das Marek-Disease (MD)-Virus zeigt und folglich als ein polyvalenter Impfstoff nützlich ist. Tabelle 1 Tabelle 2
- * 1: Nicht-rekombinantes Virus (Elternstamm).
- *2: Im Handel erhältlicher MDV1-Impfstoff.
- *3: Keine Immunisierung.
- Die Veränderung des anti-F-Antikörpertiters in Hühnerserum, gemessen durch einen ELISA, ist in Fig. 6 gezeigt. Der Antikörpertiter in der Gruppe ohne Impfung ist auf maternale Antikörper zurückzuführen, wobei beobachtet wurde, daß er mit der Zeit abfällt. Im Falle von US10BLF begann sich der anti-F-Antikörpertiter erst zu erhöhen, nachdem die maternalen Antikörper in einem gewissen Ausmaß abnahmen, d. h. in der 5. bis 6. Woche. Andererseits erhöhte sich im Falle von Hühnern, die mit US10BPF geimpft wurden, der Antikörpertiter schon in der 4. Woche, und in der 6. Woche, wenn eine Exposition durchgeführt wurde, war er viel höher als der von US10BLF. In diesem Zusammenhang zeigte US10BNF eine ziemliche Erhöhung des Antikörpertiters in der 5. bis 6. Woche, aber nicht in einem solchen Ausmaß, daß er vor einer Exposition mit dem Newcastle-Virus schützen konnte, was die Ergebnisse des Expositionstests bestätigt.
- Die Veränderung des anti-F-Antikörpertiters wurde über ein Jahr für Hühner beobachtet, die mit US10BPF geimpft wurden, und die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt. Der anti-F-Antikörpertiter während des ganzen Jahres überstieg den anti-F-Antikörpertiter für die Gruppe, die mit US10BLF, d. h. 0,65 (Fig. 6), geimpft wurde, der bei einem Schutzverhältnis von 70% (Tabelle 1) in dem Expositionstest mit dem Newcastle-Virus erhalten wurde, was zeigt, daß in den meisten der Individuen die Impfstoffwirkung des rekombinanten Virus für mindestens ein Jahr weiterhin wirksam war.
- Das Virus wurde in der 7 Woche nach der Impfung gewonnen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. US10BLF zeigte einen Wert von 0/5 (+), d. h. keine Virusgewinnung, während US10BPF einen Wert von 5/5 (+), d. h. eine hohe Virämie, zeigte, was nahelegt, daß US10BPF eine ausgezeichnete Vermehrung in vivo zeigt. Außerdem wurde für alle Plaques des gewonnenen rekombinanten Virus gezeigt, daß sie das F-Protein exprimieren, was bestätigt, daß das erfindungsgemäße rekombinante Virus auch in vivo genetisch stabil ist und persistierend infiziert. Dies zeigt, daß das erfindungsgemäße Virusvektorsystem nicht nur ein transientes Expressionssystem ist, sondern persistierend infiziert, auch in Gegenwart eines maternalen Antikörpers, und folglich als ein Arzneistoffübertragungssystem (DDS) zur wirksamen Herstellung eines exogenen Genprodukts innerhalb des lebenden Körpers sehr nützlich sein kann. Demgemäß ist das erfindungsgemäße System nicht nur ein Vektor zur Verabreichung eines Impfstoffes, sondern auch ein DDS, das zur Abgabe solcher Stoffe, wie Hormone und Cytokine, falls erforderlich, für einen langen Zeitraum innerhalb des lebenden Körpers sehr nützlich ist. Tabelle 3
- SEQ ID Nr. 1
- SEQUENZLÄNGE: 557
- SEQUENZTYP: Nucleinsäure
- STRANGFORM: Doppelstrang
- TOPOLOGE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Genomische DNA
- URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- ORGANISMUS: Marek-Virus-Typ 1 SEQUENZBESCHREIBUNG:
- SEQ ID Nr. 2
- SEQUENZLÄNGE: 624
- SEQUENZTYP: Nucleinsäure
- STRANGFORM: Doppelstrang
- TOPOLOGE: Linear
- MOLEKÜLTYP: Genomische DNA
- URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
- ORGANISMUS: Marek-Virus-Typ 1 SEQUENZBESCHREIBUNG:
Claims (10)
1. Rekombinantes Herpesvirus, das eine exogene Genexpressionskassette
einschließt, in der ein Glycoprotein B (gB)-Genpromotor des Marek-Virus-Typ
1 als Promotor für die Expression eines exogenen Gens verwendet wird,
wobei der gB-Genpromotor die Sequenz vom Nucleotid -262 bis zum
Nucleotid -561, wie in Fig. 2 dargestellt, zusätzlich zu einer Sequenz von
200 bis 300 Nucleotiden stromaufwärts der Translationsinitiationsstelle (+1)
von gB umfasst, und wobei das rekombinante Herpesvirus einen Wirt
persistierend infizieren kann.
2. Rekombinantes Herpesvirus nach Anspruch 1, wobei das exogene Gen ein
Antigen zur Immunisierung codiert.
3. Rekombinantes Herpesvirus nach Anspruch 2, wobei das Antigen zur
Immunisierung ein Impfstoff ist, das wirksam zur Prävention einer viralen
Infektionskrankheit bei Hühnern ist.
4. Rekombinantes Herpesvirus nach Anspruch 1, wobei das exogene Gen ein
physiologisch aktives Protein codiert.
5. Rekombinantes Herpesvirus nach einen der Ansprüche 1 bis 4, wobei der gB-
Genpromotor die Sequenz von Nucleotid 61 bis Nucleotid 557, wie in SEQ ID
NO: 1 dargestellt, umfasst.
6. Rekombinantes Herpesvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das vom
Marek-Virus ableitbar ist.
7. Rekombinantes Herpesvirus nach Anspruch 6, das vom Marek-Virus-Typ 1
ableitbar ist.
8. Lebendimpfstoff für Tiere, welcher das rekombinante Herpesvirus nach einem
der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.
9. Lebendimpfstoff nach Anspruch 8, der ein polyvalenter Lebendimpfstoff ist.
10. Impfstoff nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Tier ein Huhn ist.
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