DE3888290T2

DE3888290T2 - Mutanten des infektiösen bovinen Rhinotracheitisvirus, Vakzine die sie enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihrer Verwendung.

Info

Publication number: DE3888290T2
Application number: DE3888290T
Authority: DE
Inventors: Malon Kit; Saul Kit; Haruki Otsuka
Original assignee: NOVAGENE Inc; Baylor College of Medicine
Current assignee: NOVAGENE Inc; Baylor College of Medicine
Priority date: 1987-11-03
Filing date: 1988-11-02
Publication date: 1994-08-11
Anticipated expiration: 2008-11-03
Also published as: ES2061603T3; JPH02431A; CA1299121C; ATE102650T1; US4992051A; EP0316658A1; AU2403188A; DE3888290D1; EP0316658B1

Description

Die hier beschriebene Erfindung wurde entwickelt, während Dr. Saul Kit einen Research Career Award vom United States Public Health Service des Department of Health and Human Services innehatte.

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Mutanten des Virus für infektiöse Rinderrhinotracheitis (Rinderherpesvirus Typ 1), die Deletions- und/oder Insertionsmutationen in einem hauptsächlichen viralen Glycoproteingen enthalten, so daß keine antigenen Polypeptide, die durch das virale Gen codiert werden, gebildet werden. Als Folge davon entwickeln Tiere, die damit geimpft wurden, keine Antikörper gegen das virale Glycoprotein, und sie können serologisch von Tieren unterschieden werden, die mit Feldstämmen des infektiösen Rinderrhinotracheitisvirus infiziert wurden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vakzine für infektiöse Rinderrhinotracheitis, die diese enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zu ihrer Anwendung.

Hintergrund der Erfindung

I. Infektiöse Rinderrhinotracheitis

Rinderherpesvirus Typ 1 (nachstehend "BHV-1"), das besser als infektiöses Rinderrhinotracheitisvirus (nachstehend "IBRV") bekannt ist, wird mit Infektionen der Atemwege, Infektionen der Fortpflanzungsorgane, Infektionen des Darms, Infektionen der Augen, Infektionen des zentralen Nervensystems, Infektionen von Neugeborenen, Infektionen der Brust und Infektionen der Haut bei Vieh in Verbindung gebracht (E.P.J. Gibbs et al., Vet. Bull. (London), Bd. 47 (1977), S. 317- 313). Belege für den Zusammenhang von IBRV mit Erkrankungen der Atemwege wurden erstmals in den frühen 1950er Jahren erhalten. Es ist seitdem deutlich geworden, daß infektiöse Rinderrhinotracheitis (nachstehend "IBR") weltweit verbreitet ist. Mitte der 1960er Jahre führten durch IBRV verursachte Atemwegerkrankungen in den Vereinigten Staaten zu geschätzten Verlusten von etwa 25 Millionen Dollar. Weitere Verluste in Verbindung mit IBRV-Infektionen hatten ihre Ursache in Aborten, dramatischen Rückgängen des Milchertrags, Metritis, Enteritis und Meningitis. Seit 1972 haben ernstere Formen von IBRV-Atemweginfektionen in Kanada und Westeuropa weite Verbreitung gefunden. Neue IBR-Ausbrüche erfolgen wahrscheinlich, indem Tiere importierten, asymptomatischen IBRV-Trägern oder infizierten Tieren vor dem Auftreten der klinischen Erkrankung ausgesetzt werden. Daher wird der Import von IBRV-infiziertem Vieh möglicherweise durch einige Länder beschränkt oder verboten.
Die Verbreitung von IBR bei natürlich oder künstlich gezeugtem Vieh führt auch zu einem ernsthaften Problem, insbesondere bei der fortgesetzten, weit verbreiteten Verwendung von gefrorenem Samen. Außerdem führt die wiederholte Abgabe von IBRV von infizierten Bullen zu einer wesentlichen Gefahr für die künstliche Besamungsindustrie in den Vereinigten Staaten und für die weltweite Verbreitung von Rinderkeimplasma. Der Verdacht, daß es sich bei IBRV um das ätiologische Agens von Oophoritis und Salphingitis mit daraus folgender Infertilität und Sterilität handelt, trägt weiter zur Ernsthaftigkeit von IBRV-Infektionen bei.
Natürliche IBRV-Infektionen bei von Vieh verschiedenen Spezies treten bei Schweinen, Ziegen, Wasserbüffeln, Weißschwanzgnus, Frettchen und Nerzen auf. Experimentelle Infektionen sind bei Schweinen, Ziegen, Maultieren, Frettchen und Kaninchen nachgewiesen worden (H.S. Joo et al., Am. J. Vet. Med. Assoc., Bd. 45 (1984), S. 1924-1927).
Die Schwere der Erkrankung als Folge von IBRV-Infektionen hängt vom Virusstamm und vom Alter des betroffenen Tiers ab. Nach der Genesung von der Infektion können Tiere klinische Zeichen einer wiederkehrenden Erkrankung zeigen, ohne daß sie erneut dem Virus ausgesetzt werden. Die wiederkehrende Erkrankung, ohne daß die Tiere erneut dem Virus ausgesetzt werden, tritt auf, da der Virus schlummernd, d.h. latent, in den Neuronen der sonsorischen Ganglien seines Wirts verbleibt und selbst nach einer langen Zeitspanne reaktiviert werden kann (D. L. Rock et al., J. Gen. Virol., Bd. 67 (1986), S. 2515-2520). Eine Dexamethason-Behandlung kann ebenfalls eine nasale Abgabe des Virus mit oder ohne klinische Symptome einer aktiven IBR hervorrufen. Dies deutet darauf hin, daß eine Reaktivierung und eine Freisetzung aus den neuronalen Stellen und möglicherweise eine persistente Infektion anderer Gewebe auftreten können (C.R. Rossi et al., Am. J. Vet. Res., Bd. 43 (1982), S. 1440-1442). Die Reaktivierung von IBRV aus seiner Latenz und die symptomatische Abgabe können auch spontan auftreten, so daß latent mit Feldstämmen von IBRV infiziertes Vieh eine sporadische Quelle für Virusübertragung und Herdeninfektion darstellt.

II. Bekannte IBR-Vakzine

Die Bekämpfung von IBR basiert zum großen Teil auf Impfung. Gegenwärtig werden drei Typen von IBR-Vakzinen eingesetzt: (1) abgetötete Virusvakzine; (2) Untereinheitvakzine; und (3) Vakzine mit modifizierten lebenden Viren (nachstehend "MLV") (US-Patente 3 634 587; 3 925 544 und 4 291 019). Abgetötete IBR-Vakzine werden durch Behandlung des Virus mit Chemikalien, wie Formalin oder Ethanol, und/oder mit physikalischen Mitteln, wie Wärme oder ultraviolette Strahlung, hergestellt. Untereinheit-IBR-Vakzine werden durch Solubilisierung von IBRV-infizierten Zellkulturen mit nichtionischen Detergentien und Reinigung einiger der solubilisierten Virusproteine hergestellt (L.A. Babiuk et al., Virol., Bd. 159 (1987), S. 57-66). Frühe MLV-Vakzine wurden für die parenterale Verabreichung entwickelt und bestanden aus durch rasche Passage in Rinderzellkulturen abgeschwächtem IBRV. In neuerer Zeit werden parenteral verabreichte MLV-Vakzine durch Anpassung von IBRV an Schweine- oder Hundezellkulturen, durch Anpassung des Wachstums in Zellkulturen bei einer niedrigen Temperatur (30ºC) oder durch Auswahl wärmestabiler Virusteilchen (56ºC für 40 Minuten) abgeschwächt. Besondere Arten vom MLV- Vakzinen sind diejenigen, die intranasal verabreicht werden. Diese MLV-Vakzine werden durch serielle Passage in Kaninchenzellkulturen oder durch Behandlung von IBRV mit salpetriger Säure und anschließende Selektion temperaturempfindlicher Mutanten abgeschwächt. Ein temperaturempfindlicher Virus ist ein Virus, der wirksam bei 32 bis 38ºC, nicht jedoch bei etwa 39 bis 41ºC repliziert wird (J.D. Todd et al., J. Am. Vet. Med. Assoc., Bd. 159 (1971), S. 1370-1374; R.F. Kahrs et al., J. Am. Vet. Med. Assoc., Bd. 163 (1973), S. 437-441; M.W. Smith et al., Can. Vet. J., Bd. 19 (1978), S. 63-71; N. Zygraich et al., Res. Vet. Sci., Bd. 16 (1974), S. 328-335; und US-Patente 3 907 986 und 4 132 775).
WO 87/04463 beschreibt einen IBRV (S-IBR-002) mit einer Deletion, die die beiden EcoRV-Restriktionsstellen des IBRV- Genoms und eine benachbarte BglII-Restriktionsstelle entfernt, einen IBRV(S-IBR-004), der eine Insertion eines fremden Gens trägt, und einen IBRV (S-IBR-008) mit einer Deletion in der einzigen kurzen Region und einer Insertion in den XbaI-Stellen und der einzigen langen Region.
Die derzeit verfügbaren, vorstehend erörterten IBR-Vakzine weisen ernsthafte Nachteile auf, und sie haben sich daher bei der großtechnischen Anwendung als unbefriedigend erwiesen. Genauer gesagt, obwohl abgetötete IBR-Vakzine von einigen als sicherer als MLV-Vakzine angesehen werden, d.h., sie können nicht zu einer Latenz führen und sie beseitigen das Problem der Abgabe nach der Impfung, sind sie teuer herzustellen, müssen mehrfach verabreicht werden und erfordern in nachteiliger Weise Adjuvanzien. Außerdem besteht bei ihrer Verwendung die Möglichkeit tödlicher Hypersensibilisierungsreaktionen und nicht-tödlicher Urticaria. Darüber hinaus können einige infektiöse Virusteilchen möglicherweise das Verfahren zur Abtötung überleben und so eine Erkrankung verursachen. Ferner kann mit abgetöteten IBR-Vakzinen geimpftes Vieh zu einem späteren Zeitpunkt mit virulenten Viren infiziert werden und virulente Viren abgeben, wodurch eine Ausbreitung der Infektion in der Herde erfolgt (G.N. Frerichs et al., Vet. Rec., Bd. 111 (1982), S. 116-122; und A. Wiseman et al., Vet. Rec., Bd. 104 (1979), S. 535-536). Obwohl also abgetötete IBR-Vakzine einen gewissen Schutz gegenüber IBR verleihen können, sind sie im allgemeinen gegenüber MLV-Vakzinen hinsichtlich der Verleihung eines Langzeitschutzes unterlegen.
Untereinheit-Vakzine sind oftmals weniger toxisch als abgetötete Virusvakzine, und sie können neuartige immunologische Wirkungen hervorrufen, die von beträchtlichem Wert sein können. Die Technik zur Herstellung von Untereinheitvakzinen umfaßt die Entfernung von Kapsidproteinen, während die antigenen Proteine, die eine schützende Immunität hervorrufen, intakt belassen werden. Dies eröffnet eine Möglichkeit zur Entwicklung serologischer Verfahren zur Unterscheidung geimpfter Tiere von natürlich infizierten Tieren. Ferner enthalten Untereinheitvakzine, obwohl sie antigen sind, keine lebenden Viren und können daher nicht auf andere Tiere übertragen werden, einen Abort verursachen oder eine Latenz hervorrufen (H.W. Lupton et al., Am. J. Vet. Res., Bd. 41 (1980), S. 383-390; und C. le Q. Darcel et al., Can. J. Comp. Med., Bd. 45 (1981), S. 87-91). Untereinheitvakzine verhindern jedoch, wie abgetötete Virusvakzine, nicht allgemein Infektion und Latenz, wenn Vieh anschließend virulenten IBRV-Feldstämmen ausgesetzt wird. Weitere Nachteile von Untereinheitvakzinen bestehen in den hohen Kosten der Reinigung und der Notwendigkeit mehrerer Injektionen mit einem Adjuvans.
MLV-IBR-Vakzine weisen den wesentlichen Vorteil auf, daß sie einen raschen Schutz verleihen und zellvermittelte und humorale Bestandteile des Immunsystems aktivieren. Im Fall einer intranasalen Impfung trägt die lokale Immunantwort, die eine spätere Replikation eines virulenten IBRV in den Atemwegen unterdrückt, wesentlich zum Schutz bei. Die lokale Immunantwort umfaßt die Bildung von Interferon und Antikörpern in nasalen Sekreten (C.J. Kucera et al., Am. J. Vet. Res., Bd. 39 (1978), S. 607-610). Die umfangreiche Verwendung von MLV-IBR-Vakzinen hat die Häufigkeit des Auftretens von IBR verringert. Die meisten verfügbaren MLV- IBR-Vakzine sind jedoch nicht völlig zufriedenstellend. Genauer gesagt, bestehen Bedenken hinsichtlich ihrer Sicherheit, insbesondere wenn das Vakzinvirus selbst Latenz hervorruft sowie abgegeben und auf anfälliges Vieh übertragen werden kann.
Die maximale Anwendung von intramuskulär (nachstehend "i.m.") verabreichten MLV-IBR-Vakzinen wird insbesondere durch das Risiko von Vakzin-induzierten Aborten eingeschränkt. Das heißt, es ist über Abortraten von bis zu 60 % nach der i.m. Injektion einiger MLV-IBR-Vakzine berichtet worden (R.F. Kahrs, J. Am. Vet. Med. Assoc., Bd. 171 (1977), S. 1055-1064; und J. W. Kendrick et al., Am. J. Vet. Res., Bd. 28 (1967), S. 1269-1282). Außerdem besteht bei den gegenwärtig verwendeten MLV-IBR-Vakzinen die Gefahr einer Rückkehr zur Virulenz.
Bei der Suche nach sicheren MLV-IBR-Vakzinen sind besondere Vakzine entwickelt worden (J.D. Todd. et al., J. Am. Vet. Med. Assoc., Bd. 159 (1971), S. 1370-1374; R.F. Kahrs et al., J. Am. Vet. Med. Assoc., Bd. 163 (1973), S. 427-441; M.W. Smith et al., Can. Vet. J., Bd. 19 (1979) S. 63-71; N. Zygraich et al., Res. Vet. Sci., Bd. 16 (1974), S. 328-325; und C.J. Kucera et al., Am. J. Vet. Res., Bd. 39 (1978), S. 607-610). Es ist festgestellt worden, daß diese Vakzine immunogen und bei der intranasalen (nachstehend "i.n.") Impfung trächtiger Kühe sicher sind und Aborte bei trächtigen Kühen, die virulenten IBRV ausgesetzt wurden, verhindern können. Sie weisen jedoch den Nachteil auf, daß sie nur auf dem i.n. Weg verabreicht werden können. Dies hat seinen Grund darin, daß ein derartiges IBR-Vakzin, wenn es i.n. verabreicht wird, in einem begrenzten Ausmaß bei niedriger Temperatur in den oberen Atemwegen repliziert wird. Wenn es i.m. verabreicht wird, dann wird das Vakzin jedoch schlecht oder gar nicht bei normaler Körpertemperatur repliziert (N. Zygraich et al., Res. Vet. Sci., Bd. 16 (1974), S. 328-335). Andererseits wird ein weiteres IBR-Vakzin unzureichend für die i.m. Verabreichung an trächtige Tiere abgeschwächt, obwohl es sicher ist, wenn es i.n. gegeben wird (J.D. Todd, J. Am. Vet. Med. Assoc., Bd. 163 (1973), S. 427-441). Ferner führen einige der Vakzinstämme zu milden oder mäßigen Atemwegerkrankungen selbst nach i.n. Verabreichung, und sie verhindern nicht die Anzeichen einer IBR, wenn die Tiere Feldstämmen ausgesetzt werden (R.F. Kahrs et al., J. Am. Vet. Med. Assoc., Bd. 163 (1973), S. 437-441).
Dementsprechend passen weder die i.m. verabreichten MLV-IBR- Vakzine, die für trächtige Kühe unsicher sind, noch die MLV- IBR-Vakzine, die i.n. verabreicht werden müssen, gut in die gegenwärtige Bewirtschaftungspraxis. Das heißt, die Impfung einer großen Anzahl von Rindern auf dem i.n. Weg ist unbequem und möglicherweise gefährlich für diejenigen, die mit den Tieren umgehen. Außerdem ist eine Untersuchung, um trächtige Tiere vor der Immunisierung festzustellen, oftmals nicht wünschenswert oder wirtschaftlich.

III. Abgeschwächte Eigenschaften von Thymidinkinase negativen Herpesvirusmutanten

Kürzlich sind temperaturresistente, Thymidinkinase-negative (nachstehend "tk&supmin;") IBR-Vakzine, die vom Thymidinkinase- positiven (nachstehend "tk&spplus;"), d.h. Wildtyp-Los Angeles-Stamm von IBRV (ATCC Nr. VR-188) abgeleitet sind, entwickelt worden, die viele der Probleme überwinden, die die Verwendung gegenwärtig verfügbarer Vakzine begrenzt haben (S. Kit et al., Virol., Bd. 130 (1983), S. 381-389; S. Kit et al., Arch. Virol., Bd. 86 (1985), S. 63-83; S. Kit et al., Vaccine, Bd. 4 (1986), S. 55-51; und US-Patente 4 569 840 und 4 703 011, wobei diese Artikel und Patente durch Zitat als Ganzes zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht werden). Diese IBR-Vakzine bestehen aus Plaque-gereinigtem, isoliertem IBRV- Material, das sowohl bei 39,1ºC als auch bei 34,5ºC in Kaninchenhautzellen und in Rinderluftröhrenzellen gleich gut repliziert wird. Es wird daher als temperaturresistent bezeichnet. Dies steht im Gegensatz zu denjenigen IBRV- Stämmen, die als "temperaturempfindlich" bezeichnet werden, d.h. diejenigen, die für i.n. verabreichte Vakzine verwendet werden, die nur etwa 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup7; mal so gut bei 39,1ºC wie bei 34,5ºC repliziert werden. Außer daß sie die Fähigkeit zur gleich guten Replikation bei 39,1ºC oder 34,5ºC besitzen, fehlt den tk&supmin;-IBR-Vakzinen die Fähigkeit, ein funktionelles Thymidinkinase-Enzym (nachstehend "TK-Enzym") in infizierten Zellen zu bilden. Bei einem Vakzin, das als IBRV (B8-D53) (ATCC Nr. VR-2066) (US-Patent 4 569 840) bezeichnet wird, ist das Fehlen der Fähigkeit zur Bildung einer funktionellen TK die Folge einer Mutagen-induzierten Mutation. Bei einem zweiten Vakzin, das als IBRV(NG)dltk (ATCC Nr. VR-2112) (US- Patent Nr. 4 703 011) bezeichnet wird, ist das Fehlen der Fähigkeit zur Bildung einer funktionellen TK die Folge einer Deletion von etwa 400 Basenpaaren (nachstehend "bp") aus den codierenden Sequenzen des IBRV-tk-Gens sowie einer Insertion in das IBRV-tk-Gen eines 40 bp umfassenden Oligonucleotids mit Stopcodons in allen drei Leserahmen. Die beiden Merkmale, d.h. Temperaturresistenz und tk&supmin;, tragen direkt zur Überlegenheit dieser mutierten IBRVs als Vakzine bei.
Während die Merkmale Temperaturresistenz und tk&supmin; der vorstehend erläuterten IBRV-Mutanten ihre Sicherheit und Brauchbarkeit als Vakzine stark erhöhen, macht die Latenzeigenschaft von IBRV die Ausrottung von IBR durch Anwendung von Quarantänemaßnahmen, die die Ausbreitung von IBR durch Isolierung von IBRV-infizierten Herden und Schlachtung von IBRV-infizierten Tieren verhindern sollen, schwierig. Das heißt, mit den bestehenden MLV-IBR-Vakzinen ist es schwierig zu bestimmen, ob ein spezielles Tier, das keine Symptome der Erkrankung zeigt, Träger eines schlummernden IBRV ist, da die Verwendung der meisten gegenwärtigen Vakzine Infektionen maskiert. Da also Tiere, die gesund erscheinen, tatsächlich Träger und auf diese Weise Verbreiter von IBRV sein können, ist es wichtig, selbst nach einer Impfung fähig zu sein, infizierte Tiere und Herden zu identifizieren, so daß Quarantänemaßnahmen angewandt werden können. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurden entwickelt, um diese Anforderung zu erfüllen.
Außerdem verlangen einige Länder, das importiertes Vieh, und zwar für Züchtung, Ausstattung von Farmen oder für den Markt, untersucht wird und daß gezeigt wird, daß es sich nicht um Träger von IBRV handelt, d.h. die Tiere können nicht importiert werden, wenn sie nicht seronegativ im Hinblick auf IBRV sind. Mit den gegenwärtigen abgetöteten und MLV-IBR- Vakzinen besteht für einen Hersteller, der sich dafür entscheidet, seine Tiere gegenüber Erkrankungen, die die Belastungen des Transports mit sich bringen, zu schützen, oder der durch die Umstände einer IBRV-Infektion in einer endemischen Region gezwungen ist, anfällige Tiere zu impfen, ein schwerer wirtschaftlicher Nachteil, da die Impfung des Viehbestands zu einem positiven serologischen Test auf IBRV führt. Eine erneute Impfung zur Verstärkung des Schutzes erhöht weiter die IBRV-Antikörpertiter. Als Folge davon ist die Möglichkeit des Bauern, wertvolles Vieh zu exportieren und seinen Viehbestand im Heimatland zu verkaufen, beschränkt, und er ist im Nachteil, ob er nun impft oder nicht. Ein IBR-Vakzin, das sicher verabreicht werden kann, Vieh vor Erkrankung und schlummernden Infektionen, die durch Feldstämme von IBRV verursacht werden, schützt, eine geringe oder nicht vorhandene Wahrscheinlichkeit der Rückumwandlung zur Virulenz aufweist und dennoch keine positiven serologischen Testergebnisse auf IBRV hervorruft, würde den Export von Vieh und die Durchführung von Impfprogrammen, die nicht durch die Furcht vor Quarantäne beeinträchtigt werden, erlauben. Ein derartiger Hersteller könnte die Verluste innerhalb seiner eigenen Herde minimieren, während für die Tiergesundheit verantwortliche Behörden ihre entsprechenden Kontrollmaßnahmen fortsetzen könnten. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wurden auch entwickelt, um diese Anforderungen zu erfüllen.

IV. Die Genome von IBRV

Die Genome von IBRV-Stämmen bestehen aus linearen, doppelsträngigen, nicht-kreisförmig permutierten DNA- Molekülen mit einer Größe von ungefähr 135 bis 140 Kilobasen (nachstehend "kb"). Analysen der Genome von IBRV durch Elektronenmikroskopie und mit Restriktionsnuclease-Enzymen haben gezeigt, daß sie aus einer DNA-Sequenz bestehen, die als kurze einzigartige Sequenz (nachstehend "US-Sequenz") mit einer Größe von etwa 13 kb bestehen. Die US-Sequenz wird von umgekehrten Wiederholungssequenzen und endständigen Wiederholungssequenzen (nachstehend "IRS" bzw. "TRS") mit einer Größe von jeweils etwa 11,5 kb eingeklammert. Eine weitere einzigartige Sequenz, d.h. die lange einzigartige Sequenz (nachstehend "UL-Sequenz"), die eine Größe von etwa 100 kb aufweist, umfaßt den Rest des DNA-Moleküls (W. Hammerschmidt et al., J. Virol., Bd. 58 (1986), S. 43-49; M. Engels et al., Virus Res., Bd. 6 (1986/87), S. 57-73; und J.E. Mayfield et al., J. Virol., Bd. 47 (1983), S. 259-264). Diese Genomstruktur ist ein Beispiel für einen Herpesvirus Klasse D, und sie wird auch beim Pseudorabies-Virus (nachstehend "PRV"), beim Pferdeherpesvirus Typ 1 und 3 und beim Varicella-Zoster-Virus gefunden. Eine Folge einer derartigen Genomstruktur ist die Fähigkeit, US bezogen auf UL umzukehren, was zu zwei isomeren Strukturen des DNA-Moleküls führt. Physikalische Karten der Genome mehrerer IBRV-Stämme sind für die Restriktionsendonucleasen HindIII, BamHI, HpaI, EcoRI und BstEII aufgestellt worden. Es ist über spezielle Unterschiede bei den Restriktionsendonucleasemustern von IBRV-Stämmen berichtet worden. Analysen der Restriktionsendonucleasemuster der DNAs von mehr als 100 IBRV-Stämmen erlauben die Unterscheidung von drei verschiedenen Gruppen, aber diese korrelieren nicht mit epidemiologischen Merkmalen (M. Engels et al., Virus Res., Bd. 6 (1986/87), S. 57-73).
Obwohl IBRV 50 bis 100 Gene codiert, sind wenige der viralen Gene auf der physikalischen Karte des IBRV-Genoms lokalisiert worden. Das IBRV-tk-Gen befindet sich innerhalb des HindIII- A-Restriktionsfragments bei etwa 0,47 Karteneinheiten, wie in Fig. 1 gezeigt (vgl. auch Fig. 1 von US-Patent 4 703 011). Das IBRV-Gen, das für Glycoprotein gI codiert, liegt ebenfalls im HindIII-A-Fragment, und zwar links vom IBRV-tk- Gen bei ungefähr 0,405 bis 0,432 Karteneinheiten (W.C. Lawrence et al., J. Virol., Bd. 60 (1986), S. 405-414).
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung hat die Identifizierung der Lage eines weiteren IBRV-Glycoproteingens, d.h. das IBRV- gIII-Gens, auf der Karte zur Folge. Die hier vorgelegten Daten zeigen, daß das IBRV-gIII-Gen bei etwa 0,11 bis 0,12 Karteneinheiten in den HindIII-I- und BamHI-E-Fragmenten von IBRV liegt (vgl. Fig. 1).

V. IBRV-Glycoproteine

Wie die meisten bis heute untersuchten Herpesviren spezifiziert IBRV mehr als 25 strukturelle Polypeptide (V. Misra et al., J. Virol., Bd. 40 (1981), S. 367-378; und S. Van Drunen-en Littel-van den Hurk et al., J. Virol., Bd. 59 (1986), S. 401-410). Unter diesen Polypeptiden sind bis heute 10 oder mehr glycosylierte Spezies identifiziert worden. Die virusspezifischen Glycoproteine spielen eine zentrale Rolle bei den Wirt-Virus-Beziehungen, da sie der Plasmamembran der Wirtszelle einverleibt werden und schließlich Bestandteile der Virushülle werden. Durch letztere Fähigkeit spielen sie eine wichtige Rolle bei Erkennung, Anheftung und Eindringen des Virus in anfällige Zellen, bei der Syncytiabildung und bei verschiedenen Antworten des Rinderimmunsystems auf eine IBRV-Infektion, wie eine Virusneutralisierung und die Immunzerstörung infizierter Zellen.
Kürzlich durchgeführte Immunpräzipitationsversuche mit nichtspezifischen Antiseren und monoclonalen Antikörpern haben gezeigt, daß die folgenden drei Sätze von gemeinsam präzipitierenden Glycoproteinen: (1) Glycoproteine mit Molekulargewichten von 180 und 97 Kilodalton (nachstehend "kD"); (2) Glycoproteine mit Molekulargewichten von 150 kD und 77 kD; und (3) Glycoproteine mit Molekulargewichten von 130 kD, 74 kD und 55 kD; die Hauptbestandteile der IBRV-Hülle sind (R.L. Marshall et al., J. Virol., Bd. 57 (1986), S. 745- 753). Diese Glycoproteine werden auch an der Oberfläche IBRV- infizierter Zellen festgestellt, und sie reagieren mit neutralisierenden nicht-spezifischen Antiseren und monoclonalen Antikörpern. Analysen unter nicht-reduzierenden Bedingungen haben gezeigt, daß die Glycoproteine mit Molekulargewichten von 74 kD und 55 kD durch Disulfidbrücken unter Bildung des Glycoproteins mit einem Molekulargewicht von 130 kD, das als IBRV-gI bezeichnet wird, in Wechselwirkung treten (S. Van Drunen Littel-van den Hurk et al., J. Virol., Bd. 59 (1986), S.401-410). Untersuchungen durch teilweise Proteolyse haben auch gezeigt, daß das Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 180 kD eine dimere Form des Glycoproteins mit einem Molekulargewicht von 97 kD ist, das als IBRV-gIII bezeichnet wird, und daß das Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 150 kD ein Dimer des Glycoproteins mit einem Molekulargewicht von 77 kD ist, das als IBRV-gIV bezeichnet wird, daß diese Dimere jedoch nicht durch Disulfidbrücken miteinander verbunden sind.
Außerdem werden untergeordnete Glycoproteine mit Molekulargewichten von etwa 115 kD, 64 kD und 45 kD und ein nicht-glycosyliertes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 107 kD aus gereinigten IBRV-Teilchen durch Detergensbehandlung entfernt. Das Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 115 kD, das als IBRV-gII bezeichnet wird, scheint virusspezifisch zu sein, da es durch monoclonale Antikörper gegen IBRV ausgefällt wird. die Glycoproteine mit Molekulargewichten von 64 kD und 45 kD werden jedoch nicht durch anti-IBRV-Rekonvaleszenten- Antiseren gefällt. Ein Antiserum gegen das Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 64 kD fällt mehrere Polypeptide aus Lysaten nicht-infizierter Zellen, was darauf hindeutet, daß es sich bei dem Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 64 kD und möglicherweise bei dem Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 45 kD um Proteine zellulären Ursprungs handelt, die mit der IBRV-Virushülle verbunden sind.
Hinsichtlich ihrer antigenen Eigenschaften verschiedene Vorstufen für jedes der IBRV-Glycoproteine oder jeden der Glycoproteinkomplexe sind durch monoclonale Antikörper identifiziert worden. Die Vorstufen für IBRV-gI weisen Molekulargewichte von etwas 117 kD und 62 kD auf. Die Vorstufen für IBRV-gII, IBRV-gIII und IBRV-gIV weisen Molekulargewichte von etwa 100 kD, 69 kD bzw. 63 kD auf. Diese Vorstufen sind empfindlich gegenüber einer Endo-β-N- acetylglucosaminidase H-Behandlung, was andeutet, daß sie teilweise glycosylierte, Hochmannose-Typ-Zwischenstufen darstellen, die durch cotranslationale Glycosylierung der primären, nicht-glycosylierten Vorstufen von IBRV-gI, IBRV- gII, IBRV-gIII und IBRV-gIV, die scheinbare Molekulargewichte von etwa 105 kD, 90 kD, 61 kD bzw. 58 kD aufweisen, gebildet werden (S. Van Drunen Littel-van den Hurk et al., J. Virol., Bd. 59 (1986), S. 401-410).
Es ist nun bekannt, daß bei Herpesviren mehr als ein Glycoprotein virusneutralisierende Antikörper und cytotoxische Lymphocyten hervorruft, die zur Verhinderung einer Infektion und zur Erholung von einer Infektion beitragen. Zum Beispiel sind monospezifische Antiseren gegen jedes der Glycoproteine gB, gC, gD und gE des Herpes simplex- Virus Typ 1 (nachstehend "HSV-1") fähig, den Virus zu neutralisieren und eine Komplement-abhängige Cytolyse von Virus-infizierten Zellen zu vermitteln (B. Norrild et al., J. Virol., Bd. 32 (1979), S. 741-748). In ähnlicher Weise vermitteln monoclonale Antikörper gegen die Glycoproteine gB, gC, gD und gF des Herpes simplex-Virus Typ 2 (nachstehend "HSV-2") eine Immunlyse (N. Balachandran et al., Infect. Immun., Bd. 37 (1982), S. 1132-1137). Außerdem werden neutralisierende Antikörper gegen jedes der PRV-Glycoproteine gII, g92 und gp50 gebildet. Ferner schützt eine passive Immunisierung von Tieren mit monoclonalen Antikörpern, die entweder gegen PRV-gp50 oder PRV-g92 gerichtet sind, die Tiere vor Wildtyp-Infektionen (H. Hampl et al., J. Virol., Bd. 52 (1984), S. 583-590; T. Ben Porat et al., Virol., Bd. 154 (1986), S. 325-334; und L.M.K. Wathen et al., Virus Res., Bd. 4 (1985), S. 19-29). Im Hinblick auf IBRV induzieren die hauptsächlichen Glycoproteine gI, gIII und gIV hohe Konzentrationen an neutralisierenden Antikörpern in Vieh und sind an der antikörperabhängigen Zellcytotoxizität beteiligt (L.A. Babiuk et al., Virol., Bd. 159 (1987), S. 57-66).
Um ein Vakzin mit einem serologischen Marker zu entwickeln, das geimpfte Tiere von mit Feldstämmen infizierten Tieren unterscheidet, war es bei der vorliegenden Erfindung erforderlich, ein IBRV-Glycoproteingen zu identifizieren, das für die Virusreplikation nicht essentiell ist.
Das IBRV-gI-Glycoprotein scheint dem HSV-1-gB-Glycoprotein (W.C. Lawrence et al., J. Virol., Bd. 60 (1986), S. 405-414) und dem PRV-gII-Glycoprotein (T.C. Mettenleiter et al., Virol., Bd. 152 (1986), S. 66-75) zu entsprechen. Ferner besteht das PRV-gII-Glycoprotein wie das IBRV-gI-Glycoprotein aus über Disulfidbindungen kovalent verknüpften Polypeptiden mit Molekulargewichten von etwa 70 kD und 58 kD. Außerdem weist das PRV-gII-Glycoprotein 50 % Aminosäurehomologie mit dem ausgerichteten HSV-1-gB-Glycoprotein auf, und gegen das PRV-gII-Glycoprotein hergestellte monospezifische Antiseren immunpräzipitieren das HSV-1-gB-Glycoprotein aus infizierten Zellen (A.K. Robbins et al., J. Virol., Bd. 61 (1987), S. 2691-2701). Es gibt jedoch eine große Menge an Daten, die anzeigen, daß das HSV-1-gB-Gen und das PRV-gII-Gen für die Virusreplikation essentiell sind (P.G. Spear, The Herpesviruses, Bd. 3 (1985), S. 315-356; S.D. Marlin et al., J. Virol., Bd. 53 (1985), S. 128-136; W.C. Lawrence et al., J. Virol., Bd. 60 (1986), S. 405-414; und D.J. Bzik et al., Virol., Bd. 137 (1984), S. 185-190). Das IBRV-Gen, das für das entsprechende IBRV-Glycoprotein codiert, d.h. IBRV-gI, scheint also kein erfolgversprechender Kandidat als serologischer IBRV-Marker zu sein.
Es sind lebensfähige HSV-1- und HSV-2-Mutanten, die das gC- Glycoprotein nicht exprimieren können, isoliert worden (T.C. Holland et al., J. Virol., Bd. 52 (1984), S. 566-574; K.G. Draper et al., J. Virol., Bd. 51 (1984), S. 578-585; F.L. Homa et al., J. Virol., Bd. 58 (1986), S. 281-289; und D.C. Johnson et al., J. Virol., Bd. 58 (1986), S. 36-42). In ähnlicher Weise ist eine PRV-Mutante, PRV(dlg92/dltk), mit einer Deletion im PRV-g92-Gen isoliert worden (S. Kit et al., Am. J. Vet. Res., Bd. 48 (1987) S. 780-793; und US- Patentanmeldung Serien-Nr. 823 439, eingereicht am 28. Januar 1986). PRV (dlg92/dltk) exprimiert kein funktionelles TK- Polypeptid und keine antigenen PRV-g92-Polypeptide, aber es wird bis zu Titern von über 10&sup8; p.f.u./ml in Kaninchenhautzellen und Schweinehodenzellen repliziert.
Ferner enthalten Extrakte aus mit PRV(dlg92/dltk) infizierten Zellen kein Protein, das durch monoclonale anti-g92- Antikörper gefällt wird, und mit PRV(dlg92/dltk) geimpfte Schweine bilden keine Antikörper gegen PRV-g92-Polypeptide, sie bilden jedoch Antikörper gegen andere PRV-Polypeptide. Außerdem haben Untersuchungen zur Sicherheit und Wirksamkeit gezeigt, daß PRV(dlg92/dltk) eine Immunantwort in Schweinen und Mäusen hervorruft und sie schützt, wenn sie letalen Dosen virulenter Stämme von PRV ausgesetzt werden (S. Kit et al., "Genetically Engineered Pseudorabies Virus Vaccine With Deletions in Thymidine Kinase and Glycoprotein Genes", Vaccines, Bd. 87, S. 345-349, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York (1987)). Die Deletion des PRV-g92- Gens verringert nicht die Fähigkeit von PRV(dlg92/dltk), eine schützende Immunantwort oder virusneutralisierende Antikörper in Schweinen und Mäusen zu erzeugen. Aufgrund der PRV-g92- Deletion können jedoch mit PRV(dlg92/dltk) immunisierte Tiere serologisch von Tieren unterschieden werden, die mit Feldstämmen von PRV infiziert wurden. PRV(dlg92/dltk) ist also ein Beispiel für ein sicheres und wirksames Vakzin (US- Patentanmeldung, Serien-Nr. 823 439, eingereicht am 28. Januar 1986). Entsprechend wurde also in der vorliegenden Erfindung postuliert, daß ein besserer Kandidat für ein entbehrliches IBRV-Glycoproteinmarkergen möglicherweise das IBRV-Gen ist, das dem HSV-gC-Gen und dem PRV-g92-Gen entspricht.
Andere Glycoproteingene, die nicht essentiell für die IBRV- Replikation in kultivierten Zellen sind, sind möglicherweise ebenfalls geeignet als serologische IBRV-Marker. Nicht- essentielle IBRV-Glycoproteingene befinden sich wahrscheinlich im US-Segment des IBRV-Genoms, da die HSV-1- Glycoproteingene gE (US8), gG (US4) und gI (US7) im US- Abschnitt des HSV-1-Genoms liegen und mindestens in einigen Zellinien in Gewebekulturen entbehrlich für die Virusreplikation sind (R. Longnecker et al., Science, Bd. 236 (1987), S. 573-576); und die PRV-Glycoproteingene gI, gp63 und gX sich im US-Segment des PRV-Genoms befinden und ebenfalls entbehrlich für die Virusreplikation in kultivierten Zellen sind (E.A. Petrovskis et al, J. Virol., Bd. 60 (1986), S. 1166-1169; E.A. Petrovskis et al., Virol., Bd. 159 (1987), S. 193-195; T.C. Mettenleiter et al., J. Virol., Bd. 61 (1987), S.2764-2769; und D.R. Thomsen et al., J. Virol., Bd. 61 (1987), S. 229-232).
In der vorliegenden Erfindung ist es zum ersten Mal möglich, das IBRV-gIII-Gen zu identifizieren, seine Anordnung zu bestimmen, es zu clonieren und es zu sequenzieren. Ferner ist in der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal festgestellt worden, daß das IBRV-gIII-Gen entbehrlich für die Virusreplikation in kultivierten Zellen ist. Als Folge ist es mit der vorliegenden Erfindung zum ersten Mal möglich, gentechnisch erzeugte Mutationen des IBRV-gIII-Gens zu erhalten, so daß IBRVs bereitgestellt werden, wobei Tiere, die damit geimpft werden, aufgrund von Deletions- und/oder Insertionsmutationen im IBRV-gIII-Gen keine antigenen Polypeptide bilden, die durch das IBRV-gIII-Gen codiert werden, und nicht zur Bildung von IBRV-gIII-Antigenen zurückkehren können. Als Folge davon können Tiere, die damit geimpft wurden, von Tieren, die mit Feldstämmen von IBRV infiziert wurden, unterschieden werden, so daß es möglich, die IBR-Erkrankung durch Anwendung von Quarantänemaßnahmen auszurotten. Außerdem ist es erfindungsgemäß zum ersten Mal möglich, ein IBR-Vakzin bereitzustellen, das gleichzeitig, wie vorstehend erläutert wurde, von Feldstämmen unterscheidbar ist, und nicht nur wirksam bei der Bekämpfung der Ausbreitung der IBR-Erkrankung ist, sondern bei dem die Tiere, die damit geimpft wurden, aufgrund von Mutationen auch des IBRV-tk-Gens mit geringerer Wahrscheinlichkeit Träger des Vakzinvirus werden und es unwahrscheinlich ist, daß sie eine schlummernde Infektion mit pathogenen Feldstämmen erwerben.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein IBR-Vakzin bereitzustellen, das wirksam bei der Bekämpfung der Ausbreitung von IBR ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein IBR-Vakzin bereitzustellen, bei dem Tiere, die damit geimpft sind, mit geringerer Wahrscheinlichkeit Träger entweder des IBRV-Vakzinvirus oder eines IBRV-Feldstamms werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein IBR-Vakzin bereitzustellen, wobei das IBRV- Vakzinvirus von beliebigen IBRV-Feldstämmen und von anderen IBR-Vakzinviren unterscheidbar ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein IBR-Vakzin bereitzustellen, wobei Tiere, die damit geimpft sind, von Tieren unterscheidbar sind, die mit einem beliebigen IBRV-Feldstamm infiziert oder mit einem anderen IBR-Vakzinvirus geimpft sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen IBRV bereitzustellen, der als Folge einer Deletion und/oder Insertionsmutation im IBRV-gIII-Gen keine antigenen gIII-Polypeptide bildet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen IBR-Virus bereitzustellen, der sowohl keine funktionelle TK als Folge einer Mutation in der codierenden Sequenz des IBRV-tk-Gens bildet als auch keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide als Folge einer Deletions- und/oder Insertionsmutation im IBRV-gIII-Gen bildet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein IBR-Vakzin bereitzustellen, wobei Tiere, die damit geimpft sind, keine Antikörper gegen das IBRV-gIII- Glycoprotein bilden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen IBR-Virus bereitzustellen, der nicht zu tk&spplus; zurückkehren kann, leicht von tk&spplus;-Viren unterscheidbar ist und nicht zu gIII&spplus; zurückkehren kann.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen IBRV bereitzustellen, der wirksam bei Temperaturen im Bereich von 34,5ºC bis 40ºC repliziert werden kann, d.h. temperaturresistente Viren umfaßt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verfahren zur Herstellung eines IBRV bereitzustellen, der Deletions- und/oder Insertionsmutationen im IBRV-gIII-Gen aufweist.
Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung deutlich.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die vorstehend genannten Aufgaben durch einen IBRV gelöst, der keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide als Folge einer Deletions- und/oder Insertionsmutation im IBRV-gIII-Gen bildet, und durch ein Vakzin für die IBR-Erkrankung, das (1) eine pharmazeutisch wirksame Menge des Virus und (2) einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel umfaßt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bildet IBRV auch keine funktionelle TK als Folge einer Mutation im IBRV-TK-Gen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der IBRV-Mutante um einen temperaturresistenten Virus.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die vorstehend beschriebenen Aufgaben durch ein Verfahren zur Herstellung eines IBRV, der keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide als Folge einer Deletion im IBRV-gIII- Gen bildet, gelöst, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
(1) Konstruktion eines Hybridplasmids, das einen Clonierungsvektor und ein DNA-Fragment von IBRV, das im wesentlichen das gesamte IBRV-gIII-Gen und flankierende Sequenzen davon enthält, umfaßt;
(2) Deletion von DNA-Sequenzen aus dem Hybridplasmid von Stufe (1), so daß weniger als im wesentlichen das gesamte IBRV-gIII-Gen vorhanden ist, während IBRV-DNA-Sequenzen, die benachbart zu jeder Seite der Deletion sind, beibehalten werden;
(3) Cotransfektion des resultierenden Hybridplasmids von Stufe (2) in IBRV-Wirtszellen mit infektiöser gIII&spplus;-IBRV-DNA; und
(4) Absuchen der in Stufe (3) erhaltenen Virusnachkommen, um einen IBRV zu identifizieren und herzustellen, der keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide als Folge einer Deletion im IBRV-gIII-Gen bildet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine fremde DNA- Sequenz an der Stelle der deletierten IBRV-gIII-Gensequenzen in Stufe (2) inseriert, so daß keine antigenen IBRV-gIII- Polypeptide gebildet werden und so daß IBRV-DNA-Sequenzen, die zu jeder Seite der deletierten IBRV-gIII-Gensequenzen benachbart sind, beibehalten werden. Als Folge können die IBRV-Mutanten von Stufe (4) keine antigenen IBRV-gIII- Polypeptide aufgrund der kombinierten Deletions- und Insertionsmutationen im IBRV-gIII-Gen bilden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird Stufe (2) durch Stufe (2') ersetzt: Insertion einer fremden DNA-Sequenz in das Plasmid von Stufe (1), so daß keine antigenen IBRV-gIII- Polypeptide gebildet werden und so daß IBRV-DNA-Sequenzen, die zu jeder Seite der Insertion benachbart sind, beibehalten werden. Als Folge können die IBRV-Mutanten von Stufe (4) keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide aufgrund einer Insertionsmutation im IBRV-gIII-Gen bilden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt die infektiöse gIII&spplus;-IBRV-DNA von Stufe (3) aus einer IBRV-Mutante, die keine funktionelle Thymidinkinase bilden kann, so daß die resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) sowohl tk&supmin; als auch gIII&supmin; sind.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt die infektiöse gIII&spplus;-IBRV-DNA von Stufe (3) aus einem temperaturresistenten IBRV, so daß die resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) sowohl temperaturresistent als auch gIII&supmin; sind.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 erläutert schematisch durch ein Beispiel die Ableitung des IBRV der vorliegenden Erfindung. Genauer gesagt zeigt Fig. 1 die Konstruktion von IBRV(NG)dltkdlgIII, der durch Cotransfektion von infektiöser gIII&spplus;-DNA aus IBRV(NG)dltk mit dem 6,3 kb umfassenden HindIII-KpnI-Fragment des Plasmids pLAHKdlApaI erhalten wird. Die HindIII-Restriktionskarte von IBRV(NG)dltk-Virus-DNA ist ebenfalls in Fig. 1 gezeigt. Wie in Fig. 1 gezeigt ist, befinden sich die IBRV-tk- Gendeletionsmutation und die (NG)-Sequenzinsertionsmutation in IBRV(NG)dltk im HindIII-A-Fragment. Andererseits befindet sich das IBRV-gIII-Gen im HindIII-I-Fragment. Die Restriktionskarte eines Abschnitts des HindIII-I-Fragments (HindIII bis BgIII) ist oben in Fig. 1 vergrößert dargestellt und zeigt die Anordnung des translationalen Startsignals (ATG) und des translationalen Polyadenylierungssignals (AATAAA) des IBRV-gIII-Gens. Die HindIII-Restriktionskarte des rekombinanten IBRV(NG)dltkdlgIII der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls gezeigt. Die HindIII-BglII-Sequenz, die nach der 1,53 kb umfassenden ApaI-Deletion für das Plasmid pLAHKdlApaI verbleibt, ist unten in Fig. 1 gezeigt, um die vorhergesagte Restriktionskarte im Bereich des deletierten IBRV-gIII-Gens für IBRV(NG)dltkdlgIII zu zeigen.
Fig. 2 zeigt schematisch durch ein Beispiel die Ableitung der in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Plasmide. Genauer gesagt zeigt Fig. 2 die Konstruktion von pLAHKdlApaI, das für die in Fig. 1 gezeigte Cotransfektion verwendet wurde, um den rekombinanten Virus IBRV(NG)dltkdlgIII zu erhalten. In Fig. 2 wurde das IBRV-HindIII-I-Fragment (11,7 kb) von IBRV(Los Angeles) (ATCC Nr. VR-188) (vgl. Fig. 1 von US-Patent 4 703 011) zuerst in pBR322 cloniert, wobei man das Plasmid pLAH-I erhielt. Anschließend wurde das 7,6 kb umfassende HindIII-KpnI-Fragment von pLAH-I an den HindIII-KpnI-Stellen des Plasmids pUC18dlEcoRI subcloniert, wobei man das Plasmid pLAHK erhielt. Das Plasmid pUC18dlEcoRI wurde aus dem Plasmid pUC18 durch Restriktionsendonucleasebehandlung mit EcoRI, Mungobohnennuclease-Behandlung und erneute Ligation abgeleitet. Dieses Verfahren entfernte die vier Basen der Überlappungssequenz
der EcoRI-Restriktionsendonucleasestelle, veränderte aber sonst das Plasmid pUC18 nicht. Das Plasmid pLAHK weist nur eine EooRI-Restriktionsstelle auf, die in der IBRV-Sequenz in 3'-Richtung vom IBRV-gIII-Gen angeordnet ist. Das 2,5 kb umfassende EcoRI-BamHI-Fragment vom pLAH-I wurde ebenfalls an den EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonucleasestellen von pBR322 subcloniert, wobei man das Plasmid pLAEB erhielt. Die Apal-Spaltung von pLAEB und die Erneute Ligation führten zur Deletion der drei ApaI-Fragmente von 731, 590 bzw. 212 bp, wobei man das Plasmid pLAEBdlApaI mit insgesamt 1533 deletierten Basenpaaren erhielt. Die ApaI-Deletion entfernt den größten Teil der codierenden Sequenz des IBRV-gIII-Gens (vgl. Fig. 3). Schließlich wurde das EcoRI-BamHI-Fragment von pLAEBdlApaI gegen das EcoRI-BamHI-Fragment von pLAHK ausgetauscht, um ein Deletionsplasmid herzustellen, dem die IBRV-gIII-Gensequenzen fehlen, das jedoch die 5'- und 3'- flankierenden IBRV-Sequenzen beibehält, um die Rekombination mit infektiösen gIII&spplus;-IBRV-DNAs zu erleichtern.
Fig. 3 erläutert die Nucleotidsequenz (1975 Basen) von IBRV(Los Angeles) DNA, die die codierende Region für das IBRV-gIII-Gen und flankierende Sequenzen davon enthält. Diese Sequenz ist das Komplement des DNA-Strangs, der transkribiert wird, um IBRV-gIII-mRNA zu bilden. Die ApaI- Restriktionsendonucleasefragmente, die aus dem IBRV-gIII-Gen deletiert wurden, um IBRV(NG)dltkdlgIII zu erhalten, sind in Fig. 3 gezeigt. Ebenfalls in Fig. 3 wird die vorhergesagte Aminosäuresequenz des IBRV-gIII-Polypeptids mit der Dreibuchstabenbezeichnung für die Aminosäuren vorgelegt.
Fig. 4A zeigt mit Ethidiumbromid angefärbte Agarosegelfragmente von mit HindIII verdauter und von mit BamHI plus EcoRI verdauter DNA des IBRV(NG)dltk-Elternvirus und des isolierten rekombinanten IBRV-Materials E12A, C6G und C3F. Diese rekombinanten Viren weisen Deletionen in den IBRV- tk- und gIII-Genen auf. Spur M zeigt DNA-Markerfragmente von mit HindIII gespaltenem lambda-Phagen und mit HaeII gespaltenem X174-Phagen.
Fig. 4B zeigt Autoradiogramme, die die molekulare Hybridisierung von ³²P-markierter M13-38-Sonde an DNA- Fragmente der in Fig. 4A gezeigten IBRV-Stämme zeigen. Die M13-38-Sonde ist eine einzelsträngige M13mp18-DNA, die das 1,68 kb umfassende SacI-Fragment enthält, das sich über einen Teil der codierenden Region und in 3'-Richtung befindlicher Sequenzen des IBRV-gIII-Gens erstreckt (vgl. Fig. 2, Plasmid pLAHK).
Fig. 5A zeigt mit Ethidiumbromid angefärbte Agarosegelfragmente von mit HindIII plus BamHI verdauter, mit PstI verdauter, mit EcoRI verdauter und mit HindIII verdauter DNA aus IBRV(NG)dltk Elternviren (Spuren 1, 3, 5 und 7) und des isolierten rekombinanten IBRV-Materials IBRV(NG)dltkdlgIII (Stamm C6G) (Spuren 2, 4, 6 und 8). Spur M zeigt DNA-Markerfragmente von mit HindIII gespaltenem lambda- Phagen und mit HaeIII gespaltenem X174-Phagen.
Fig. 5B zeigt Autoradiogramme, die die molekulare Hybridisierung von ³²P-markierter M18-38-Sonde an DNA- Fragmente der in Fig. 5A gezeigten IBRV-Stämme zeigen.
Fig. 6A zeigt mit Ethidiumbromid angefärbte Agarosegelfragmente von mit HindIII plus BamHI verdauter, mit PstI verdauter, EcoRI verdauter und mit HindIII verdauter DNA aus IBRV(NG)dltk-Elternviren (Spuren 1, 3, 5 und 7) und des isolierten rekombinanten IBRV-Materials IBRV(NG)dltkdlgIII (Stamm C6G) (Spuren 2, 4, 6 und 8). Spur M zeigt DNA- Markerfragmente von mit HindIII gespaltenem lambda-Phagen und mit HaeIII gespaltenem X174-Phagen.
Fig. 6B zeigt Autoradiogramme, die die molekulare Hybridisierung von ³²P markierter M13-1-Sonde an DNA- Fragmente von IBRV(NG)dltk, der in Fig. 6A gezeigt ist, aber nicht an DNA-Fragmente von IBRV(NG)dltkdlgIII, der in Fig. 6A gezeigt ist, zeigen. Die M13-1-Sonde ist eine einzelsträngige M13mp19-DNA, die das 0,36 kb umfassende SalI-Fragment des IBRV-gIII-Gens (vgl. Fig. 3, Nucleotide 1286-1646) enthält, wobei es sich um den Sense-Strang des IBRV-gIII-Gens handelt.
Fig. 7 erläutert molekulare Hybridisierungsversuche (Northern blotting) unter Verwendung von ³²P-markierten M13-41- und M13-38-DNA-Sonden mit mRNAs, die aus Zellen extrahiert wurden, die mit dem gIII&spplus;-IBRV(Los Angeles)-Stamm und mit dem rekombinanten IBRV-gIII&supmin;-Stamm IBRV(NG) dltkdlgIII infiziert sind. Die M13-41-Sonde ist eine einzelsträngige M13mp18 DNA, die das 1,86 kb umfassende SacI-Fragment des IBRV-gIII-Gens (vgl. Fig. 2, Plasmid pLAHK) enthält, wobei es sich um den Sense-Strang des IBRV-gIII-Gens handelt. Die M13-38-Sonde ist ebenfalls eine einzelsträngige M13mp18-DNA, die das 1,86 kb umfassende SacI-Fragment des IBRV-gIII-Gens enthält, aber diese Sonde ist der Non-Sense-Strang des IBRV-gIII-Gens. Ribosomale RNA wurde zusammen mit den mRNAs einer Elektrophorese unterworfen, um Molekulargewichtsmarker bereitzustellen.
Fig. 8 erläutert Immunpräzipitationsversuche unter Verwendung polyclonaler anti-IBRV-Rinderseren (PC-14) oder monoclonale anti-gIII-Antikörper (MC2905) gegen Detergensextrakte aus Zellen, die mit dem gIII&spplus;-IBRV(Los Angeles)-Stamm oder mit dem gIII&spplus;-IBRV(Cooper)-Stamm oder mit dem rekombinanten gIII&supmin;-Stamm IBRV(NG)dltkdlgIII infiziert waren. Die Beweglichkeiten der Molekulargewichtsmarker sind links in der Figur gezeigt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Wie vorstehend erörtert wurde, werden die vorstehend genannten Aufgaben durch einen IBRV gelöst, der keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide als Folge einer Deletions- und/oder Insertionsmutation im IBRV-gIII-Gen bildet, und durch ein Vakzin für die IBR-Erkrankung, das (1) eine pharmazeutisch wirksame Menge des Virus und (2) einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel umfaßt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bildet IBRV auch keine funktionelle TK als Folge einer Mutation im IBRV-TK-Gen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der IBRV-Mutante um einen temperaturresistenten Virus.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die vorstehend beschriebenen Aufgaben durch ein Verfahren zur Herstellung eines IBRV, der keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide als Folge einer Deletion im IBRV-gIII- Gen bildet, gelöst, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
(1) Konstruktion eines Hybridplasmids, das einen Clonierungsvektor und ein DNA-Fragment von IBRV, das im wesentlichen das gesamte IBRV-gIII-Gen und flankierende Sequenzen davon enthält, umfaßt;
(2) Deletion von DNA-Sequenzen aus dem Hybridplasmid von Stufe (1), so daß weniger als im wesentlichen das gesamte IBRV-gIII-Gen vorhanden ist, während IBRV-DNA-Sequenzen, die benachbart zu jeder Seite der Deletion sind, beibehalten werden;
(3) Cotransfektion des resultierenden Hybridplasmids von Stufe (2) in IBRV-Wirtszellen mit infektiöser gIII&spplus;-IBRV-DNA; und
(4) Absuchen der in Stufe (3) erhaltenen Virusnachkommen, um einen IBRV zu identifizieren und herzustellen, der keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide als Folge einer Deletion im IBRV-gIII-Gen bildet.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird eine fremde DNA- Sequenz an der Stelle der deletierten IBRV-gIII-Gensequenzen in Stufe (2) inseriert, so daß keine antigenen IBRV-gIII- Polypeptide gebildet werden und so daß IBRV-DNA-Sequenzen, die zu jeder Seite der deletierten IBRV-gIII-Gensequenzen benachbart sind, beibehalten werden. Als Folge können die IBRV-Mutanten von Stufe (4) keine antigenen IBRV-gIII- Polypeptide aufgrund der kombinierten Deletions- und Insertionsmutationen im IBRV-gIII-Gen bilden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird Stufe (2) durch Stufe (2') ersetzt: Insertion einer fremden DNA-Sequenz in das Plasmid von Stufe (1), so daß keine antigenen IBRV-gIII- Polypeptide gebildet werden und so daß IBRV-DNA-Sequenzen, die zu jeder Seite der Insertion benachbart sind, beibehalten werden. Als Folge können die IBRV-Mutanten von Stufe (4) keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide aufgrund einer Insertionsmutation im IBRv-gIII-Gen bilden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt die infektiöse gIII&spplus;-IBRV-DNA von Stufe (3) aus einer IBRV-Mutante, die keine funktionelle Thymidinkinase bilden kann, so daß die resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) sowohl tk&supmin; als auch gIII&supmin; sind.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt die infektiöse gIII&spplus;-IBRV-DNA von Stufe (3) aus einem temperaturresistenten IBRV, so daß die resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) sowohl temperaturresistent als auch gIII&supmin; sind.
Das IBRV-gIII-Gen weist eine Größe von ungefähr 1900 bp auf (vgl. Fig. 3). Die IBRV-gIII-Mutationen der vorliegenden Erfindungen können z.B. auf folgende Weise hergestellt werden: (1) Entfernen eines 75 bis 1500 bp umfassenden IBRV- DNA-Fragments aus einer geeigneten Region des IBRV-gIII-Gens; (2) Herstellung kleinerer Deletionen von 5, 7, 8, 10 und 11 bp oder etwa 50 bis 200 bp von IBRV-DNA nahe dem 5'-Ende der codierenden Sequenzen, so daß der translationale Leserahmen verändert und die IBRV-gIII-Polypeptidsynthese beendet wird; (3) Deletion von etwa 50 bis 200 bp an IBRV-DNA, um die Nucleotidsequenzen, die für die hauptsächlichen Epitope von IBRV-gIII codieren, zu entfernen; (4) Deletion von etwa 10 bis 200 bp an IBRV-DNA und gleichzeitige Insertion einer fremden DNA-Sequenz, so daß Hybrid-RNAs gebildet werden, die auf den Polyribosomen nicht korrekt prozessiert, transportiert oder translatiert werden; oder (5) Insertion einer fremden DNA-Sequenz, so daß Hybrid-RNAs gebildet werden, die auf den Polyribosomen nicht korrekt prozessiert, transportiert oder translatiert werden.
Die Deletionen können auf verschiedene Weise hergestellt werden, z.B. durch (1) Spaltung des IBRV-gIII-Gens, das in einen Clonierungsvektor inseriert ist, mit einer oder mehreren Restriktionsendonucleasen, so daß das IBRV-gIII-Gen an zwei oder mehr Stellen geschnitten wird, und anschließende erneute Ligation, so daß IBRV-gIII-Nucleotidsequenzen entfernt werden; oder (2) Spaltung des IBRV-gIII-Gens, das in einen Clonierungsvektor inseriert ist, an einer Stelle, gefolgt von einer Exonucleasebehandlung des IBRV-gIII-Gens, so daß die Lücke ausgedehnt und Nucleotide von der 5'- und/oder 3'-Seite des Schnitts entfernt werden, und anschließende erneute Ligation.
In der vorliegenden Erfindung wurde die nachstehend ausführlich beschriebene Deletionsmutante IBRV(NG)dltkdlgIII durch Entfernen eines 1,53 kb umfassenden ApaI-Fragments hergestellt, das im wesentlichen die gesamte codierende Sequenz des IBRV-gIII-Gens mit Ausnahme des translationalen Startcodons ATG (vgl. Fig. 3) enthält. Die Größe dieser Deletion stellte sicher, daß (1) kein Polypeptid mit antigenen Determinanten, d.h. Epitopen, die fähig sind, in geimpften Tieren IBRV-gIII-Antikörper hervorzurufen, oder die fähig sind, mit Antiseren gegen IBRV-gIII-Glycoprotein, die in mit Feldstämmen von IBRV infizierten Tieren gebildet werden, zu reagieren, hergestellt wird; und (2) daß eine Rückumwandlung, d.h. eine Rückmutation zu einem IBRV-gIII bildenden Virus praktisch unmöglich ist. In der vorliegenden Erfindung werden IBRV-gIII-Deletionsmutanten aufgrund der geringen Rückumwandlungshäufigkeit bevorzugt.
Wie vorstehend erläutert wurde, können in einer Ausführungsform die Deletions- und/oder Insertionsmutanten eine fremde DNA-Sequenz anstelle der deletierten IBRV-gIII- Gensequenzen oder zusätzlich zu IBRV-gIII-Gensequenzen enthalten.
Der Ausdruck "fremde DNA-Sequenz" bedeutet hier (1) eine beliebige DNA-Sequenz, die nicht für ein Gen codiert, d.h. eine nicht-codierende DNA-Sequenz, unabhängig vom Ursprung, wie virale, eukaryontische oder prokaryontische nicht codierende Sequenzen, und unter Einschluß von Oligonucleotidlinkern; (2) eine beliebige DNA-Sequenz, die für ein vom IBRV-gIII-Gen verschiedenes Gen codiert, d.h. eine codierende DNA-Sequenz; oder (3) eine beliebige codierende IBRV-DNA-Sequenz, die von ihrer normalen Position im IBRV-Genom an eine andere Position im IBRV-Genom transloziert worden ist, wie das IBRV-tk-Gen oder das IBRV- gI-Gen, die in das IBRV-gIII-Gen transloziert worden sind.
Der Oligonucleotidlinker weist im allgemeinen eine Länge von 8 bis 10 Nucleotiden auf, er kann jedoch auch länger sein, z.B. etwa 50 Nucleotide, oder kürzer, z.B. 4, 5 oder 7 Nucleotide. Die bevorzugte Länge des Oligonucleotidlinkers beträgt etwa 8 bis 10 Nucleotide. Die DNA-Sequenz des Oligonucleotidlinkers ist nicht kritisch. In ähnlicher Weise sind Größe und Sequenzen anderer fremder DNA-Sequenzen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, nicht kritisch. Im allgemeinen beträgt die Größe der fremden DNA-Sequenzen, die von Oligonucleotidlinkern verschieden sind, etwa 0,5 bis 5,0 kb. Zum Beispiel weisen die HSV-1-, HSV-2- und Krallenaffen- Herpesvirus-tk-Gene eine Länge von etwa 1,3 kb auf; die Huhn- und Mensch-tk-Gene weisen eine Länge von etwa 2,9 bzw. 4,2 kb auf; das neo -Gen weist eine Länge von etwa 1,0 kb auf; und das lacZ-Gen weist eine Länge von etwa 3,0 kb auf.
Das Verfahren zur Insertion der fremden DNA-Sequenz in die Plasmid-DNA hängt von der Art der verwendeten fremden DNA- Sequenz ab. Palindrome doppelsträngige Linker, die eine oder mehrere Restriktionsnucleasestellen in der Oligonucleotidsequenz enthalten (New England Biolabs), können nach bekannten Verfahren inseriert werden (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Fremde DNA-Sequenzen können auch in die Plasmid-DNA inseriert werden, indem ihre Enden mit Tailing-Sequenzen komplementärer Homopolymere unter Verwendung der terminalen Transferase versehen werden (E. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Durch eine geeignete Wahl der Länge der fremden DNA-Sequenz können Rahmenverschiebungsmutationen im IBRV-gIII-Gen erzielt werden, die die Wirkung der Deletionen innerhalb des IBRV- gIII-Gens verstärken.
Der besondere Clonierungsvektor, der erfindungsgemäß zur Konstruktion des Hybridplasmids von Stufe (1), das ein DNA- Fragment von IBRV umfaßt, das im wesentlichen das gesamte IBRV-gIII-Gen und flankierende Sequenzen davon enthält, verwendet wird, ist nicht kritisch, solange der Clonierungsvektor ein für ein selektives Merkmal, z.B. Arzneimittelresistenz, codierendes Gen enthält. Beispiele derartiger Clonierungsvektoren umfassen pBR322 und auf pBR322 basierende Vektoren (T. Sekiguchi et al., Gene, Bd. 21 (1983), S. 267-272), pMB9, pBR325, pKH47, pUC18 und pUC19 (Bethesda Research Laboratories), pBR328 und pHC79 (Boehringer Mannheim Biochemicals), Phage Charon 28 (Bethesda Research Laboratories), pKB11 und pKSV-10 (P-L- Biochemicals), pMAR420 (H. Otsuka et al., Virol., Bd. 113 (1981), S. 196-213) und mit Oligo(dG)-Tailingsequenzen versehenes pBR322 (New England Nuclear). pBR322 ist einer der erfindungsgemäß bevorzugten Clonierungsvektoren, da das 11,1 kb umfassende HindIII-I-Fragment das IBRV-Virus-gIII-Gen enthält und in die einzige HindIII-Stelle von pBR322 cloniert werden kann (vgl. Fig. 2). In ähnlicher Weise enthält das 2,5 kb umfassende EcoRI/BamHI-Fragment, das in Plasmid pLAH-I gezeigt ist, das IBRV-gIII-Gen und kann an den einzigartigen BamHI- und EcoRI-Stellen von pBR322 cloniert werden. Das Plasmid pUC18 ist ein weiterer erfindungsgemäß bevorzugter Clonierungsvektor, da die Clonierungsstelle von pUC18 leicht modifiziert werden kann, z.B. um eine EcoRI-Stelle unter Bildung von pUC18dlEcoRI zu deletieren, so daß das resultierende Plasmid KpnI- und HindIII-Clonierungsstellen für die Insertion des 7,6 kb umfassenden KpnI-bis-HindIII- Fragments von pLAH-I umfaßt.
Der besondere Wirt, der erfindungsgemäß zur Züchtung der Hybridplasmide eingesetzt wird, ist erfindungsgemäß nicht kritisch. Beispiele derartiger Wirte umfassen E. coli K12 RR1 (F. Bolivar et al., Gene, Bd. 2 (1977), S. 95-113), E. coli K12 HB101 (ATCC Nr. 33694); E. coli MM21 (ATCC Nr. 336780) und E. coli DH1 (ATCC Nr. 33849). E. coli K12 RR1 ist der bevorzugte Wirt, und er weist den Genotyp F&supmin; hsd R hsd M auf.
In ähnlicher Weise können alternative Vektor/Clonierungssysteme eingesetzt werden, wie Plasmidvektoren, die in E. coli oder Saccharomyces cerevisiae oder in beiden wachsen, oder Plasmidvektoren, die in B. subtilis wachsen, oder selbst Vektoren, wie Rinder- Papillomavirus (ATCC Nr. 371112), der in tierischen Zellen, wie Maus, wächst (ATCC Nr. CRL-1616) (J.T. Elder et al., Ann. Rev. Gen., Bd. 15 (1981), S. 295-340; R. Ure et al., Methods in Enzymology, "Recombinant DNA", Bd. 101, Teil C, (Academic Press, N.Y.) (1983)).
Der Ausdruck "flankierende Sequenzen" bedeutet hier Sequenzen in 5'-Richtung, in 3'-Richtung oder sowohl in 5'-Richtung als auch in 3'-Richtung von den codierenden IBRV-gIII- Gensequenzen. Die in 5'-Richtung befindlichen Sequenzen enthalten die transkriptionalen Kontrollsignale, d.h. Promotoren und Verstärker, während die in 3'-Richtung befindlichen Sequenzen die Transkriptions-Terminations- und Polyadenylierungssignale des IBRV-gIII-Gens enthalten.
Die genauen IBRV-gIII-Gensequenzen, die in den Hybridplasmiden der Stufen (1) und (2) vorhanden sein müssen, hängen von den für die Deletion und/oder Insertion ausgewählten Sequenzen und den Restriktionsendonucleasen und Exonucleasen, die bei der gentechnischen Herstellung der Deletions- und/oder Insertionsmutante eingesetzt werden sollen, ab.
Die speziellen IBRV-DNA-Sequenzen, die zu der Deletion und/oder Insertion in dem in Stufe (1) erforderlichen Plasmid benachbart sind, hängen von den Einzelheiten der Deletion und/oder Insertion in dem Hybridplasmid ab. Im allgemeinen beträgt die Größe der IBRV-DNA-Sequenzen, die sowohl zur 3'- als auch zur 5'-Seite der Deletion und/oder Insertion benachbart sind, mindestens etwa 400 bp. Im nachstehend ausführlich beschriebenen Plasmid pLAHKdlApaI (vgl. Fig. 2) weisen die 3'- und 5'-Sequenzen an beiden Seiten der Deletion eine Länge von etwa 1,6 kb und 4,5 kb auf.
Der spezifische IBRV-Stamm, der erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial eingesetzt wird, aus dem das IBRV-DNA- Fragment, das das IBRV-gIII-Gen von Stufe (1) enthält, erhalten wird, und aus dem die infektiöse gIII&spplus;-IBRV-DNA von Stufe (3) erhalten wird, ist nicht kritisch. Beispiele derartiger Stämme umfassen tk&spplus;-IBRV-Stämme und tk&supmin;-IBRV- Stämme. Diese Stämme können entweder nicht temperaturresistent oder temperaturresistent sein.
Beispiele derartiger tk&spplus;-IBRV-Stämme umfassen die folgenden Stämme: Los Angeles-Stamm (ATCC Nr. VR-188), Cooper-Stamm (ATCC Nr. VR-864), IPV-Stamm K22 (J.W. Kendrick et al., Cornell Vet., Bd. 48 (1958), S. 458-495), die Stämme MO3, MO6, BFN-IH, BFN-IIN, BFN-IID, Gi 1 bis 5, Bi, B4, BRV, LAE, V3 415, V3 416, V3 18, V3 93 (J.-P. Gregersen et al., Arch. Virol., Bd. 84 (1985), S. 91-103), BFA-Wabu-Stamm (M. Ackermann et al., Vet. Microbiol., Bd. 9 (1984), S. 53-63), Stamm P8-2 (G.A. Weinmaster et al., Virol., Bd. 118 (1982), S. 191-201), Stämme P10 und P34 (M. Engels et al., Arch. Virol., Bd. 67 (1981), S. 169-174), Alberta (Kanada)- Isolierungen Nr. 1 bis Nr. 122 (V. Misra et al., Arch. Virol., Bd. 76 (1983), S. 341-354), oder IBRV(RTK-1B) (US- Patent 4 703 011), wobei alle diese Stämme IBRV-gIII bilden.
Beispiele derartiger tk&supmin;-IBRV-Stämme umfassen die temperaturresistenten Stämme IBRV(B8-D53) (ATCC-Nr. VR-2066) und IBRV(NG)dltk (ATCC Nr. VR-2112), wobei alle diese Stämme IBRV-gIII bilden.
Die speziellen IBRV-Wirtszellen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, sind nicht kritisch, solange sie ein permissives Wachstum von IBRV erlauben. Ferner können die IBRV-Wirtszellen tk&supmin;-IBRV-Wirtszellen oder tk&spplus;-IBRV- Wirtszellen sein.
Beispiele derartiger tk&spplus;-IBRV-Wirtszellen umfassen Rab-9 (ATCC Nr. CRL-1414); primäre Kaninchennierenzellen, sekundäre Kaninchennierenzellen; Kaninchennetzhautzellen (SIRC) (ATCC Nr. CCL-60), Kaninchennierenzellen (LLC-RK1) (ATCC Nr. CCL- 106), Rinderembryoluftröhrenzellen (EBTR) (ATCC Nr. CCL-44), Rindernasenmuschelzellen (BT) (ATCC Nr. CRL-1390) und Rindernierenzellen (MDBK) (ATCC Nr. CCL-22). (Der American Type Culture Collection Catalog gibt an, daß einige Arten von Lamm-, Ziegen-, Katzen- und Pferdezellen ebenfalls für IBRV(Los Angeles) (ATCC Nr. VR-188) permissiv sind). Rab-9 sind die bevorzugten tk&spplus;-IBRV-Wirtszellen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß für die Herstellung des Virus, der zur Impfung von Tieren im Feld verwendet wird, eine vom United States Department of Agriculture zertifizierte Zellinie, die für IBRV permissiv ist, vorzugsweise der gleichen Spezies, wie das zu impfende Tier, der frei von anderen infektiösen Agenzien ist, verwendet werden sollte. Eine geeignete Rinderzellinie wäre z.B. eine zertifizierte diploide, keinen Tumor bildende Rindernasenmuschel- oder Rindernierenzellinie, die frei von Mycoplasma und anderen Viren ist.
Ein Beispiel für eine tk&supmin;-IBRV-Wirtszelle, die eingesetzt werden kann, und die das permissive Wachstum von IBRV erlaubt, ist die Kaninchenzellinie Rab(BU), die aus Rab-9- Zellen abgeleitet wurde (S. Kit et al., Virol., Bd. 130 (1983), S. 381-389). Andere tk&supmin;-IBRV-Wirtszellen von Kaninchen oder Rind, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, können erhalten werden, indem z.B. die Verfahren angewandt werden, die bereits zur Isolierung von tk&supmin;-Maus-, Mensch- und Kaninchen-Zellinien angewandt wurden (S. Kit et al., Exptl. Cell Res., Bd. 31 (1963), S. 297-312; S. Kit et al., Int. J. Cancer, Bd. 1 (1966), S. 19-30; und S. Kit et al., Virol., Bd. 130 (1983), S. 381-389). Rab(BU)-Zellen sind die bevorzugten tk&supmin;-IBRV-Wirtszellen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, und zwar nicht nur, da sie die Replikation bis zu hohen Titern sowohl von tk&spplus;- als auch von tk&supmin;-IBRV- Stämmen erlauben, sondern auch da sie nicht nachweisbar zu tk&spplus; in einem selektiven Medium mit einem Gehalt an 10&supmin;&sup4; m Hypoxanthin; 10&supmin;&sup6; m Aminopterin; 4,0 x 10&sup5; m Thymidin; und 10&supmin;&sup5; m Glycin (nachstehend "HATG-Medium") zurückkehren und da sie zur Plaque-Titration von IBRV sowohl bei permissiven (etwa 34,5ºC) als auch bei nicht-permissiven (etwa 39,1ºC) Temperaturen verwendet werden können. Es ist wichtig, daß die tk&supmin;-IBRV-Wirtszellen nicht nachweisbar einer Rückumwandlung zu tk&spplus; in HATG-Medium unterliegen, da die Rückumwandlung zu tk&spplus; autoradiographische und Thymidin-Plaque- autoradiographische Assays, die zur Unterscheidung der Phänotypen tk&spplus;- und tk&supmin;-IBRVs und von Gemischen davon eingesetzt werden, beeinträchtigen würde.
Das Verfahren zum Absuchen auf IBRV-gIII-Mutanten in Stufe (4) ist erfindungsgemäß nicht kritisch. Das Absuchen kann z.B. durch Dot-Blot-Molekülhybridisierungstechniken unter Verwendung radioaktiver, einzelsträngiger DNA-Sonden erfolgen. Diese Sonden umfassen z.B. IBRV-gIII-Gensequenzen, von denen vorhergesagt wird, daß sie in IBRV-gIII- Deletionsmutanten fehlen, IBRV-Gensequenzen, von denen vorhergesagt wird, daß sie in IBRV-gIII-Deletionsmutanten vorhanden sind, und fremde DNA-Sequenzen, von denen vorhergesagt wird, daß sie in IBRV-gIII-Geninsertions- und IBRV-gIII-Deletions/Insertionsmutanten vorhanden sind. Der Fachmann erkennt jedoch, daß das Absuchen mittels Molekülhybridisierung mit radioaktiven doppelsträngigen DNA- Sonden oder mit markierten RNA-Sonden, wie denjenigen, die unter Verwendung von Phage T7-RNA-Polymerase oder SP6- Polymerase (Bethesda Research Laboratories und Promega Biotec) oder selbst mit nicht-radioaktiven Sonden, wie Systemen mit biotinylierten Nucleotidsonden (Enzo Biochem. Inc.) durchgeführt werden kann.
Ferner kann das Absuchen auf IBRV-gIII-Mutanten in Stufe (4) gemäß anderer Verfahren als denjenigen, die die Verwendung von DNA- oder RNA-Sonden erfordern, durchgeführt werden. Zum Beispiel können unter Verwendung monoclonaler Antikörper, die spezifisch für das IBRV-gIII-Glycoprotein sind, Plaques durch immunologische Plaqueverfahren auf Viren abgesucht werden, die kein IBRV-gIII exprimieren können. Außerdem können durch Verwendung von polyclonalen anti-IBRV-Seren oder monoclonalen Antikörpern, die spezifisch für ein anderes IBRV- Glycoprotein, z.B. gI, sind, und/oder polyclonale Seren gegen fremdes Protein oder monoclonale Antikörper, die spezifisch für ein fremdes Protein sind, Plaques auf Viren abgesucht werden, die andere IBRV-Proteine oder fremde Proteine exprimieren. Auf diese Weise können IBRV-gIII-Deletions- und/oder Insertionsmutanten identifiziert und isoliert werden.
Im Kontext dieser Erfindung ist ein temperaturresistenter Virus ein Virus, der nicht temperaturempfindlich ist. Ein temperaturresistenter Virus ist also fähig zur Replikation bei einer nicht-permissiven Temperatur, d.h. bei etwa 38,5 bis 40ºC und vorzugsweise bei 39,1ºC, und zwar ungefähr so gut wie der Elternvirus oder Feldisolierungen von IBRV bei einer permissiven Temperatur repliziert werden. Im Gegensatz dazu enthalten temperaturempfindliche IBRV-Stämme Mutationen in viralen Genen, die für die Replikation essentiell sind, wodurch funktionelle Genprodukte bei permissiven Temperaturen, d.h. etwa 32ºC bis 37,5ºC und vorzugsweise 34,5ºC, gebildet werden, nicht jedoch bei nicht-permissiven Temperaturen. Daher ist bei temperaturempfindlichen Viren die Bildung infektiöser Virusteilchen bei nicht-permissiven Temperaturen um 4 bis 7 Größenordnungen geringer im Vergleich zur Bildung bei permissiven Temperaturen. Bei temperaturresistenten Virusstämmen ist die Bildung infektiöser Virusteilchen bei nicht-permissiven Temperaturen etwa die gleiche wie bei permissiven Temperaturen.
Temperaturresistente Viren sind temperaturempfindlichen Viren als modifizierte lebende Virusvakzine überlegen, da (1) die Abschwächung aus Änderungen pathogener viraler Gene anstelle der Schwächung viraler Gene, die für die Replikation erforderlich sind, resultiert; und (2) temperaturresistente Viren sicher intramuskulär, intranasal oder intravenös verabreicht und in den tiefen Geweben des Körpers repliziert werden können, so daß sie eine vollständigere und längere immunologische Antwort hervorrufen.
Im Gegensatz dazu werden temperaturempfindliche Viren nur an Stellen niedriger Temperatur, wie im Bereich der oberen Atemwege, repliziert, so daß sie nur intranasal verabreicht werden können.
Die erfindungsgemäßen gIII&supmin;-IBRV-Mutanten können als modifizierte lebende Virusvakzine gegen IBR-Erkrankungen eingesetzt werden, wenn sie zusätzliche Mutationen enthalten, die IBRV abschwächen. Derartige zusätzliche Mutationen umfassen tk&supmin;-Mutationen und Mutationen bei nicht-essentiellen Glycoproteingenen, die von gIII verschieden sind. Zum Beispiel ist möglicherweise ein IBRV-Gen, das sich in der US- Region des IBRV-Genoms befindet und das homolog zum PRV-gI- Gen und zum HSV-gE-Gen ist, nicht essentiell für die Virusreplikation und kann mutiert werden, ohne die schützenden Eigenschaften des Vakzins zu beeinträchtigen (R. Longnecker et al., Science, Bd. 236 (1987), S. 573-576; und E.A. Petrovskis et al., Virol., Bd. 159 (1987), S. 193-195).
Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen gIII&supmin;-IBRV- Mutanten als abgetötete Virusvakzine gegen IBR-Erkrankungen eingesetzt werden. Das heißt, eine Inaktivierung der infektiösen Beschaffenheit durch ultraviolettes Licht oder durch Formaldehydbehandlung von gIII&supmin;-IBRV-Mutanten ergibt ein Vakzin, das, nach intraperitonealer Verabreichung, fähig ist, cytotoxische T-Zellen und schützende Antikörper gegen Virusproteine hervorzurufen. Mit diesem Vakzin immunisierte Tiere würden auf diese Weise gegen virulente Virusinfektionen geschützt.
Ferner können Extrakte mit nicht-ionischen Detergentien (Nonidet P40 oder Triton X-100) aus mit gIII&supmin;-IBRV infizierten Rinderzellen hergestellt werden, um Untereinheit IBRV-Vakzine zu erhalten. Diese Extrakte enthalten alle Glycoproteine und Nicht-Glycoproteine, die durch den eingesetzten IBRV-Stamm codiert werden, mit Ausnahme des Glycoproteins gIII. Nach Reinigung der Glycoproteine können sie als Untereinheitvakzine eingesetzt werden (M.R. Hilleman et al., In: The Human Herpesvirus: An Interdisciplinary Perspective, herausgegeben von A.J. Nahmias et al., (Elsevier, N.Y.) S. 503 (1981); R.J. Eisenberg et al., J. Virol., Bd. 41 (1982), S.1099-1104; D. Long et al., Inf. Immun., Bd. 37 (1984), S.761-764; und R.D. Dix et al., J. Med. Virol., Bd. 17 (1985), S. 9-18).
Als eine weitere Alternative können die erfindungsgemäßen gIII&supmin;-IBRV-Mutanten als Ausgangsmaterial eingesetzt werden, um tk&supmin;-IBRV-Mutanten, die im US-Patent 4 703 011 beschrieben sind, zu erhalten.
Eine pharmazeutisch wirksame Menge der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Viren kann zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel als Vakzin gegen die IBR- Erkrankung bei Tieren, wie Rindern, Schafen, Ziegen und Schweinen, eingesetzt werden.
Beispiele pharmazeutisch verträglicher Träger oder pharmazeutisch verträglicher Verdünnungsmittel, die erfindungsgemäß geeignet sind, umfassen beliebige physiologische gepufferte Medien, z.B. mit einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 7,4, mit einem Gehalt von etwa 2,5 bis 15 % (Vol./Vol.) Serum, das keine Antikörper gegen IBRV enthält, d.h. das seronegativ für IBRV ist. Ein Gammaglobulinserum ist ein bevorzugtes Serum, das Gammaglobulin enthält. Beispiele von Serum, das erfindungsgemäß eingesetzt werden kann, umfassen Schweineserum, Kälberserum, fötales Kälberserum, Pferdeserum und Lammserum. Gammaglobulin-Schweineserum von Schweinen, die für IBRV seronegativ sind, wird zur Impfung von Schweinen bevorzugt. Fötales Kälbergammaglobulinserum oder Kälbergammaglobulinserum von Kälbern, die für IBRV seronegativ sind, werden zur Impfung von Kälbern bevorzugt. Serumproteine, wie Schweinealbumin oder Rinderserumalbumin, können in einer Menge von etwa 0,5 bis 3,0 % (Gew./Vol.) als Ersatz für Serum eingesetzt werden. Es ist jedoch wünschenswert, die Verwendung von fremden Proteinen im Träger oder Verdünnungsmittel, die allergische Reaktionen bei dem geimpften Tier hervorrufen, zu vermeiden.
Der Virus kann in beliebigen herkömmlichen stabilisierenden Lösungen, die Phosphatpuffer, Glutamat, Casiton und Saccharose oder Sorbose oder Phosphatpuffer, Lactose, Dextran und Glutamat enthalten, verdünnt werden.
Es ist bevorzugt, daß die erfindungsgemäßen Viren bei einem Titer von mindestens 10&sup5; bis 10&sup6; p.f.u./ml bei -70ºC bis -90ºC oder in einem lyophilisierten Zustand bei 4ºC bis -20ºC gelagert werden. Der lyophilisierte Virus kann zur Verwendung mit sterilem destilliertem Wasser oder unter Verwendung eines wäßrigen Verdünnungsmittels, das Konservierungsmittel, wie Gentamycin und Amphotericin B oder Penicillin und Streptomycin enthält, rekonstituiert werden.
Die geeignete Dosis, die verabreicht werden soll, hängt vom Alter, vom Gewicht und von der Spezies des geimpften Tiers und von der Art der Verabreichung ab. Bei einem modifizierten lebenden Virusvakzin kann eine geeignete Dosierung, z.B. etwa 104,5 bis 10&sup7; p.f.u. pro Tier und vorzugsweise etwa 104,5 bis 105,5 p.f.u. pro Tier betragen. Bei einem abgetöteten Vakzin kann eine geeignete Dosierung z.B. etwa 10-fach größer als die bei einem modifizierten lebenden Virusvakzin angewandte Dosierung sein.
Die erfindungsgemäßen Vakzine können intramuskulär oder subkutan verabreicht werden. Der intramuskuläre Weg ist die bevorzugte Art der Verabreichung. Die erfindungsgemäßen modifizierten lebenden Vakzine können auch intranasal verabreicht werden.
Die nachstehenden Beispiele werden nur zur Erläuterung vorgelegt und sollen den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise beschränken.
In den folgenden Beispielen wurden alle Medien und Pufferlösungen in über Glas destilliertem Wasser hergestellt, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Herstellung von gIII&supmin;-IBRV-Mutanten

A. Züchtungsmedium für Gewebekulturzellen

Rab-9-Zellen (ATCC Nr. CCL-1414) (tk&spplus;-Wirtszellen) wurden in einem Inkubator mit kontrollierter Temperatur und CO&sub2; in Eagle's minimal-essentiellem Medium (nachstehend "APMEM") (Flow Laboratories, Inc.), das mit 10 % (Vol./Vol.) fötalem Rinderserum (nachstehend "BSF") oder 10 % (Vol./Vol.) Lammserum, 20 millimolar Bicarbonat, 20 millimolar Hepes (pH- Wert: 7,3) und 2,0 millimolar Glutamin plus 50 µg/ml Neomycin angereichert war, vermehrt. Dieses Medium wird nachstehend als "Züchtungsmedium" bezeichnet.
Rab(BU)-Zellen (S. Kit et al., Virol., Bd. 130 (1983), S. 301-389) (tk&supmin;-Wirtszellen) wurden im gleichen Züchtungsmedium wie Rab-9-Zellen gezüchtet, das jedoch mit 25 µg/ml BrdUrd angereichert war. Das Züchtungsmedium war jedoch nicht mit BrdUrd für die Passage unmittelbar vor dem Plaque- Autoradiographieversuch, der im nachstehenden Abschnitt Q beschrieben ist, und für die Durchführung der Plaque- Autoradiographieversuche, die im nachstehenden Abschnitt Q beschrieben sind, angereichert.

B. Reinigung von IBRV-DNA

IBRV-DNA wurde, im wesentlichen wie von Pignatti et al. für die Herstellung von HSV-DNA beschrieben, hergestellt (P.F. Pignatti et al., Virol., Bd. 93 (1979) S. 260-264).
Genauer gesagt wurden 20 Acht-Unzen-Vorschriftsglasflaschen- Monoschichtkulturen von Rab-9-Zellen (etwa 5 x 10&sup6; Zellen pro Kultur), die 20 ml Züchtungsmedium enthielten, mit einer Vielfachheit der Infektion (nachstehend "m.o.i.") von 5,0 p.f.u. pro Zelle an IBRV infiziert und 3 Stunden bei 34,5ºC inkubiert, wobei zu diesem Zeitpunkt die zelluläre DNA- Synthese durch die virale Infektion gehemmt wurde. Anschließend wurden 1,0 µCi/ml und 0,25 µg/ml ³H-Thymidin zugegeben, um die virale DNA radioaktiv zu markieren, und die Inkubation bei 34,5ºC wurde weitere 17 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden aus dem Glas durch Schaben im Züchtungsmedium mit einem Gummiwischer entfernt, bei 600 x g zentrifugiert, mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,14 m NaCl, 0,003 m KCl, 0,001 m CaCl&sub2;, 0,0005 m MgCl&sub2; und 0,01 m Phosphat (pH-Wert: 7,5) (nachstehend "PBS") mit einem Gehalt an 10 µg/ml nicht- radioaktivem Thymidin gewaschen. Sodann wurden die Zellen bei 600 x g zentrifugiert und anschließend in einem Ethanol- Trockeneis-Bad gefroren.
Nach dem Auftauen wurde das Zellpellet (etwa 0,7 ml) in 9 Volumenteilen einer lysierenden Lösung mit einem Gehalt an 0,25 % (Gew./Vol.) Triton X-100, 10 millimolar EDTA, 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,9) resuspendiert. Sodann wurde die Zellsuspension in eine Dounce-Homogenisator überführt und bei Raumtemperatur 20 bis 30 Minuten unter leichtem Schütteln inkubiert.
Anschließend wurde die Zellsuspension in ein Glaszentrifugenröhrchen übertragen, und NaCl wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,2 m zugegeben. Sodann wurde das Röhrchen mehrfach umgedreht, und die Lösung wurde unmittelbar bei 1000 x g bei 4ºC 10 Minuten zentrifugiert.
Der resultierende Überstand wurde in ein Glasröhrchen dekantiert und durch Inkubation mit 100 µg/ml Proteinase K (E.M. Science) in einem Puffer mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,5), 1,0 millimolar EDTA (nachstehend "TE-Puffer") 1 Stunde bei 37ºC von Proteinen befreit. Anschließend wurde 1 Volumenteil 90 %-iges (Vol./Vol.) redestilliertes Phenol zugegeben, und die Lösung wurde durch Umdrehen gemischt und bei 20 000 x g zentrifugiert. Die wäßrige Phase, d.h. die obere Phase, wurde in ein Polyallomer-Zentrifugenröhrchen überführt. Festes Natriumacetat wurde anschließend bis zu einer Konzentration von 4,0 % (Gew.-/Vol.) zugegeben. Die Nucleinsäuren wurden mit 2 Volumenteilen eiskaltem Ethanol gefällt und über Nacht bei -20ºC inkubiert. Anschließend wurde der Niederschlag durch Zentrifugation bei 16 000 U/min bei 4ºC in einem Spinco SW25-Rotor gesammelt, in 2,0 ml TE-Puffer gelöst und bei 4ºC gegen TE-Puffer dialysiert.
Die resultierende DNA-Lösung wurde anschließend in ein Polyallomer-Zentrifugenröhrchen überführt, und CsCl in TE- Puffer wurde bis zu 57 % (Gew./Gew.) (rho = 1,715 g/cm³) zugegeben. Sodann wurde die DNA 46 Stunden bei 22,5ºC bei 44 000 U/min in einem Spinco Nr. 50 Ti Rotor zentrifugiert. Anschließend wurden 12 Tropfen umfassende Fraktionen vom Boden des Polyallomerröhrchens gesammelt, und die Zählimpulse wurden für Proben von 4,0 µl in einem Flüssigscintillationsspektrometer bestimmt, um die IBRV-DNA enthaltenden Fraktionen festzustellen (rho = etwa 1,727 g/cm³). Wenn insgesamt 25 Fraktionen gesammelt wurden, dann enthielten im allgemeinen die Fraktionen 13 bis 15 IBRV-DNA.
Die IBRV-DNA enthaltenden Fraktionen wurden anschließend vereinigt und gegen mehrfach ausgetauschten TE-Puffer bei 4ºC etwa 24 Stunden dialysiert. Die Konzentration der DNA wurde fluorometrisch bestimmt. Die IBRV-DNA-Ausbeute betrug etwa 25 µg aus 10&sup8;-Zellen.
Die Identität der IBRV-DNA wurde durch das Muster der mit Restriktionsendonucleasen verdauten IBRV-DNA-Fragmente, das nach Elektrophorese bei 4ºC in einer Unterwasser- Gelvorrichtung (Bethesda Research Laboratories, Inc.) erhalten wurde, bestätigt.
Genauer gesagt wurde die resultierende DNA mit den Restriktionsendonucleasen BamHI, SalI, KpnI oder HindIII unter den vom Hersteller empfohlenen Reaktionsbedingungen (New England Biolabs, Inc.) gespalten. Sodann wurde 1/10 Volumenteil einer Lösung mit einem Gehalt an 0,4 % (Gew./Vol.) Bromphenolblau, 125 millimolar EDTA und 50 % (Vol./Vol.) Glycerin zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Anschließend wurde 10 Minuten auf 65ºC erwärmt. Anteile von 20 µl jeder Probe wurden anschließend in die Probenvertiefung eines Agarosegels gegeben, und die Elektrophorese wurde durchgeführt, wie es nachstehend beschrieben ist.
Die Elektrophorese von Restriktionsendonucleasefragmenten wurde auf 0,6 % (Gew./Vol.) Agaroseplattengelen (S. Kit et al., J. Med. Virol., Bd. 12 (1983), S. 25-36) in einem Puffer mit einem Gehalt an 30 millimolar NaH&sub2;PO&sub4;, 1,0 millimolar EDTA, 40 millimolar TRIZMA-Base (pH-Wert: 8,1) (nachstehend "Elektrophoresepuffer") bei 45 Volt, 4ºC für 16 Stunden durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die DNA- Fragmente durch Tränken des Gels in Elektrophoresepuffer mit einem Gehalt an 0,5 µg/ml Ethidiumbromid angefärbt, mit einer langwelligen UV-Lampe sichtbar gemacht und photographiert. Die Restriktionsendonucleasekarte für die HindIII-Fragmente des Stamms IBRV(NG)dltk sind in Fig. 1 gezeigt.
Auf diese Weise hergestellte IBRV-DNA wies eine infektiöse Beschaffenheit von etwa 100 bis 1000 p.f.u./ug DNA in einem Standardtransfektionsassay auf.

C. Clonierung von IBRV-DNA

Die HindIII-Fragmente der DNA von IBRV(Los Angeles) (ATCC Nr. VR-188) wurden in die HindIII-Schnittstelle von pBR322 gemäß folgendem Verfahren cloniert.
4,0 µg IBRV(Los Angeles)-DNA wurden in einem Puffer mit einem Gehalt an 50 millimolar NaCl, 50 millimolar Tris-HCl (pH- Wert: 8,0), 10 millimolar MgCl&sub2; und 100 µg/ml Rinderserumalbumin (nachstehend "BSA") (nachstehend "HindIII- Schneidepuffer") gelöst. Die DNA wurde anschließend bei 37ºC 1 Stunde mit 40 Einheiten HindIII (New England Biolabs, Inc.) verdaut. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens an 90 %-igem (Vol./Vol.) redestilliertem Phenol, Mischen und Zentrifugation zur Phasentrennung beendet. Nach Dialyse der wäßrigen Phase gegen 1 x TE-Puffer wurde Natriumacetat bis zu 0,1 m zugegeben. Anschließend wurden 2 Volumenteile Ethanol zugegeben, und die ausgefällte DNA wurde über Nacht bei -20ºC gelagert. Die ausgefällte DNA wurde durch Zentrifugation gesammelt und in 1,0 x TE-Puffer gelöst.
Die Restriktionsendonucleasefragmente, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden anschließend in der folgenden Weise mit pBR322 kombiniert, das mit HindIII geschnitten und dephosphoryliert worden war.
4,0 mg der mit HindIII verdauten IBRV(Los Angeles)-DNA wurde mit 0,5 mg mit HindIII verdauter und dephosphorylierter pBR322-DNA (New England Biolabs, Inc.) in 0,05 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert 7,8), 10 millimolar MgCl&sub2;, 20 millimolar Dithiothreit, 1,0 millimolar ATP und 50 µg/ml BSA (nachstehend "Ligationspuffer") und 1000 Phagen T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Inc.) gemischt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA bis 20 millimolar und 10-minütiges Erwärmen auf 65ºC beendet.
Die Hybridplasmid-DNA wurde in TE-Puffer verdünnt und verwendet, um E. coli K12 RR1-Bakterien zu transformieren, wie nachstehend beschrieben wird (F. Bolivar et al., Gene, Bd. 2 (1977), S. 95-113).
Die Bakterien wurden zur Transformation unter Verwendung von CaCl&sub2; vorbereitet (M. Mandel et al., J. Mol. Biol., Bd. 53 (1970), S. 159-162). Genauer gesagt wurde eine über Nacht gezogene Kultur mit einer Dichte von 2,0 (A&sub6;&sub0;&sub0;) an E. coli K12 RR1 verwendet, um 200 ml einer Brühe mit einem Gehalt an 1,0 % (Gew./Vol.) Bactotrypton, 0,5 % (Gew./Vol.) Hefeextrakt und 0,5 % (Gew./Vol.) NaCl (nachstehend "ML-Brühe") mit einer bakteriellen Dichte von 0,02 (A&sub6;&sub0;&sub0;) anzuimpfen. Die Bakterien wurden etwa 2 Stunden inkubiert, bis ihre Dichte etwa 0,5 (A&sub6;&sub0;&sub0;) erreichte. Die Bakterien wurden anschließend durch Zentrifugation pelletiert und in einem 1/4 Volumenteil eisgekühlter 50 millimolarer CaCl&sub2;-Lösung resuspendiert. Nach 5-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Bakterien erneut pelletiert und in ein 1/40 Volumen eisgekühlter 50 millimolare CaCl&sub2;-Lösung resuspendiert.
Sodann wurden 0,1 ml Hybridplasmid-DNA, etwa 10 bis 100 ng, in TE-Puffer zu 0,2 ml der mit CaCl&sub2; behandelten Bakterien gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 4ºC gehalten. Dann wurde die Temperatur 5 Minuten auf 37ºC erhöht, und 0,3 ml ML-Brühe wurden zugegeben. Anschließend wurde die Inkubation 45 Minuten bei 37ºC unter leichtem Schütteln fortgesetzt. Proben wurden auf Tryptikase-Sojabohnenagarplatten (BBL Microbiology Systems), die mit 30 µg/ml Ampicillin angereichert waren, plattiert.
Ein rasches Absuchen der resultierenden Clone auf die gewünschte Hybridplasmid-DNA (nachstehend "rasches Absuchverfahren") wurde wie folgt durchgeführt.
Eine über Nacht gezüchtete Kultur von Bakterien mit einem Gehalt an Hybridplasmid-DNA wurde in 5,0 ml ML-Brühe mit einem Gehalt an 30 µg/ml Ampicillin überimpft und bei 37ºC bis zu einer Dichte von etwa 1,5 (A&sub6;&sub0;&sub0;) inkubiert. 1,0 ml dieser Bakterienkultur wurden anschließend in ein 1,5 ml fassenden Eppendorf-Polypropylenröhrchen überführt und in einer Eppendorf-Zentrifuge etwa 1 Minute bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die Bakterien zu pelletieren. Sodann wurden die Bakterien in 0,1 ml Puffer mit einem Gehalt an 2,0 µg/ml Eilysozym, 50 millimolar Glucose, 10 millimolar Cyclohexandiamin-tetraacetat (nachstehend "CDTA") und 25 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 8,0) (nachstehend "Lysozym- Lösung Nr. 1") resuspendiert und anschließend 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Sodann wurden 0,2 ml von 0,2 n NaOH plus 1,0 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat (nachstehend "SDS") zu der Bakteriensuspension gegeben, und das Röhrchen wurde einer Vortex-Behandlung unterzogen und 5 Minuten bei 4ºC gehalten. Anschließend wurden 0,15 ml 3,0 m Natriumacetat (pH-Wert: 4,8) zugegeben, und das Röhrchen wurde leicht umgedreht, wobei sich während dieser Zeit ein "DNA-Klümpchen" bildete. Die DNA wurde 1 Stunde bei 4ºC gehalten, um eine Ausfällung von chromosomaler DNA, Protein und hochmolekularer RNA zu ermöglichen. Sodann wurde der Niederschlag in einer Eppendorf-Zentrifuge 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, und die klare, überstehende Flüssigkeit, ungefähr 0,4 ml, die die Hybridplasmid-DNA enthielt, wurde in ein zweites Eppendorf-Zentrifugenröhrchen überführt. Dann wurden 2,5 Volumenteile Ethanol (ungefähr 1,0 ml) zu dem zweiten Röhrchen gegeben, das 30 Minuten bei -20ºC angeordnet wurde. Die ausgefällte Hybridplasmid-DNA wurde durch 2- minütige Zentrifugation bei Raumtemperatur in einer Eppendorf-Zentrifuge gesammelt. Anschließend wurde die Hybridplasmid-DNA in 0,1 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 0,1 m Natriumacetat und 0,05 m Tris-HCl (pH-Wert: 8,0) gelöst, erneut mit Ethanol gefällt, erneut durch Zentrifugation gesammelt und schließlich in 100 µl 0,1 x TE- Puffer gelöst.
Dann wurde ein Anteil von 10 µl der Hybridplasmid-DNA in 50 µl HindIII-Schneidepuffer verdünnt, und 2,0 Einheiten HindIII wurden zugegeben. Nach einer Verdauzeit von 60 Minuten bei 37ºC wurde die Probe mit 1/10 Volumenteil einer Lösung mit einem Gehalt an 0,4 % (Gew./Vol.) Bromphenolblau, 125 millimolar EDTA und 50 % (Vol./Vol.) Glycerin gemischt, und etwa 20 µl der resultierenden Lösung wurde auf 0,6 % (Gew./Vol.) Agaroseplattengel zur elektrophoretischen Analyse, wie vorstehend beschrieben, aufgetragen. Diese Analyse zeigte, ob die Hybridplasmid-DNA ein HindIII-Insert enthielt, und falls dies der Fall war, die Größe, in kb, des Inserts (H.C. Birnboim et al., Nucl. Acids Res., Bd. 7 (1973) , S. 1513-1523).
Auf diese Weise wurde ein 16,1 kb umfassendes Plasmid, das ein 11,7 kb umfassendes HindIII-Insert enthielt, das zusammen mit dem IBRV-HindIII-I-Fragment bei der Agarose- Gelelektrophorese wanderte, isoliert und als pLAH-I bezeichnet (vgl. Figuren 1 und 2).
Zur Herstellung der Hybridplasmid-DNA in großem Maßstab wurde die 200-fache Menge der Hybridplasmid-transformierten Bakterien verarbeitet, im Vergleich zu den Bakterien, die zur Herstellung der Hybridplasmid-DNA für das vorstehend beschriebene rasche Absuchverfahren verwendet wurden, mit der Ausnahme, daß nach der ersten Ethanolfällung die Probe 30 Minuten bei 37ºC mit 0,5 mg pankreatischer RNase A (Worthington Biochemical Corp.) aus einer Stammlösung mit einem Gehalt an 1,0 µg/ml RNase A in 5,0 millimolar Tris HCl (pH-Wert: 8,0), die 10 Minuten auf 100ºC erwärmt worden war, behandelt wurde. Der Behandlung folgte die Zugabe von 500 µg Proteinase K (E.M. Science) in TE-Puffer bei 37ºC für 30 Minuten. Anschließend wurde ein gleiches Volumen an Phenol zugegeben, und die Probe wurde einer Vortex-Behandlung unterzogen und, wie vorstehend beschrieben, zentrifugiert, um die Phasen zu trennen. Die wäßrige Phase wurde dann entfernt, zur Fällung mit Ethanol versetzt, und der Niederschlag wurde durch Zentrifugation, wie vorstehend beschrieben, gesammelt. Sodann wurde der Niederschlag in 0,2 ml TE-Puffer gelöst und auf 10,4 ml eines linearen Saccharosegradienten mit 10 bis 40 % (Gew./Vol.) in 50 millimolar NaCl, 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,5), 1,0 millimolar EDTA geschichtet und bei 4ºC 20 Stunden bei 24 000 U/min in einem Spinco SW41-Rotor zentrifugiert. 15 Tropfen umfassende Fraktionen wurden vom Boden der Polyallomer-Zentrifugenröhrchen gesammelt und in Vertiefungen eines Kunststofftabletts gegeben. Insgesamt 35 Fraktionen wurden erhalten. Anteile von 5,0 µl wurden anschließend durch Anwendung der vorstehend beschriebenen Agarosegel-Elektrophorese abgesucht. Fraktionen mit einem Gehalt an Hybridplasmid-DNA wurden vereinigt, gegen 0,1 x TE- Puffer dialysiert und für weitere Untersuchungen bei 4ºC gelagert.

D. Kartierung der Strukturgene für IBRV-gIII

Vorhergehende Untersuchungen hatten gezeigt, daß das PRV-g92- Gen homolog zu den gC-Genen von HSV-1 und HSV-2 ist (A.K. Robbins et al., J. Virol., Bd. 58 (1986), S. 339-347; und S. Kit et al., Am. J. Vet. Res., Bd. 48 (1987), S. 780-793) und auch daß das gpV-Gen (Nr. 14) von Varicella-Zoster homolog zum gC-Gen von HSV-1 ist (A.J. Davison et al., J. Gen. Virol., Bd. 67 (1986), S. 1759-1816). Das PRV-g92-Gen ist nicht essentiell für das Wachstum von PRV in kultivierten Zellen, und Mutanten von PRV, die PRV-g92 nicht exprimieren, sind konstruiert worden (S. Kit et al., Am. J. Vet. Res., Bd. 48 (1987), S. 780-793; und US-Patentanmeldung Serien-Nr. 823 439, eingereicht am 28. Januar 1986). Daher ist das PRV- g92-Gen möglicherweise auch homolog zu einem IBRV- Glycoproteingen, das nicht essentiell für das Wachstum in kultivierten Zellen ist, und dieses IBRV-Glycoproteingen kann möglicherweise mittels molekularer Hybridisierung (Southern blotting) mit radioaktiven PRV-g92-DNA-Sonden nachgewiesen werden.
Um diese Hypothese zu testen, wurde ein 0,4 kb umfassendes KpnI/BamHI-Fragment des PRV-g92-Gens in den Phagen M13mp19 subcloniert, und eine einzelsträngige ³²P-markierte Sonde wurde hergestellt (US-Patentanmeldung Serien-Nr. 823 439, eingereicht am 28. Januar 1986). Southern-Blot-Analyse mit PRV-g92-Gensonde (0,4 kb KpnI/BamHI) zeigte eine molekulare Hybridisierung unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an das clonierte HindIII-I-Fragment von IBRV-DNA in pLAH-I (vgl. Figuren 1 und 2). Die stringente Hybridisierung wurde durchgeführt, wie sie ausführlich in Abschnitt L nachstehend beschrieben ist. Zusätzliche molekulare Hybridisierungsversuche zeigten, daß die zur PRV-KpnI/BamHI- Sonde homologen Sequenzen sich innerhalb eines 2,5 kb umfassenden BamHI/EcoRI-Fragments von pLAH-I befinden. Wie in Abschnitt E. nachstehend beschrieben wird, wurde dieses 2,5 kb umfassende BamHI/EcoRI-Fragment an der BamHI- und EcoRI- Stelle von pBR322 subkloniert, und das resultierende Plasmid wurde als pLAEB bezeichnet (vgl. Fig. 2). Die PRV-KpnI/BamHI- Sonde hybridisiert auch stark an pLAEB unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Ferner befindet sich das 2,5 kb umfassende IBRV-BamHI/EcoRI-Fragment von pLAEB an einem Ort des IBRV-Genoms (0,11 bis 0,12 Karteneinheiten), der homolog zum Ort des gC-Gens im HSV-1-Genom und des g92-Gens im PRV- Genom ist. So wurde festgestellt, daß das IBRV-gIII-Gen homolog zum PRV-g92-Gen und zum HSV-1-gC-Gen ist.

E. Konstruktion von pLAEB

Die folgenden Stufen in den Abschnitten E bis G wurden durchgeführt, um das IBRV-gIII-Gen von pLAH-I in pBR322 subzuclonieren und im wesentlichen die gesamten codierenden IBRV-gIII-Sequenzen aus der subclonierten IBRV-gIII-DNA zu deletieren.
1,0 µg pBR322 und 1,0 µg pLAH-I wurden gemischt und mit 40 Einheiten BamHI in 20 µl Puffer mit einem Gehalt an 150 millimolar NaCl, 6,0 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 8,0), 6,0 millimolar MgCl&sub2;, 100 µg/ml BSA bei 37ºC 1 Stunde verdaut und anschließend mit 40 Einheiten EcoRI in 100 µl eines Puffers mit einem Gehalt an 50 millimolar NaCl, 100 millimolar Tris- HCl (pH-Wert: 7,5), 5,0 millimolar MgCl&sub2;, 100 µg/ml BSA bei 37ºC 1 Stunde verdaut. Die geschnittenen DNAs wurden mit einem gleichen Volumen an Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert und mit zwei Volumenteilen Ethanol gefällt, mit Phage T&sub4;- Ligase ligiert und verwendet, um mit CaCl&sub2; behandelte E. coli K12 RR1-Zellen, wie vorstehend beschrieben, zu transformieren. Ampicillin-resistente Kolonien wurden auf das Vorhandensein eines 6,4 kb umfassenden Plasmids abgesucht. Dieses Plasmid wurde als pLAEB bezeichnet. Restriktionsendonucleaseanalysen des Plasmids bestätigten die in Fig. 2 gezeigte Struktur von pLAEB.

F. Nucleotidsequenz des IBRv-gIII-Gens

Die Nucleotidsequenz des 2,5 kb umfassenden BamHI/EcoRI- Fragments plus die Nucleotidsequenz des 0,6 kb umfassenden Fragments, das sich in 5'-Richtung von der BamHI-Stelle zur BglII-Stelle von pLAEB erstreckt, wurden, wie nachstehend beschrieben, bestimmt (vgl. Figuren 1 und 2).
Abschnitte der IBRV-Nucleotidsequenz von pLAH-I, die sich von der BamHI- bis zur BglII-Restriktionsstelle (vgl. Figuren 1 und 2) erstrecken, wurden in die doppelsträngige, replikative Form (RF) der Phagen M13mp18 und M13mp19 subkloniert (N.T. Hu et al., Gene, Bd. 17 (1982), S. 271-272; und J. Messing et al., Gene, Bd. 19 (1982), S. 269-276). Die Verwendung dieser beiden Phagen erlaubte das Klonieren kleiner überlappender DNA-Fragmente in zwei Orientierungen. Dann führte die Replikation der rekombinanten Phage M13-Derivate in E. coli K12 JM103-Bakterien (New England Biolabs, Inc.) zur Synthese einzelsträngiger Phagen-DNA, die für Sequenzierungsreaktionen verwendet werden konnte.
Sequenzierungsreaktionen wurden nach der herkömmlichen Didesoxynucleotid-Kettenabbruchmethode (F. Sanger et al., J. Mol. Biol., Bd. 143 (1980), S. 161-178; und F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 74 (1977), S. 5436-5467) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch enthielt einen einzelsträngigen Phage M13mp18- oder M13mp19-Subklon von IBRV-DNA als Matrize, entweder einen M13-Pentadecamer-Primer (New England Biolabs, Inc.) oder synthetische Oligonucleotid- Primersequenzen von IBRV-DNA, die mit dem DNA- Syntheseautomaten Microsyn 1450 (Systec, Inc.) hergestellt wurden, um die DNA-Synthese an jeder Matrize zu initiieren, ( -³²P)dTTP als markiertes Substrat, Mg&spplus;&spplus;, die entsprechenden unmarkierten Desoxyribonucleosidtriphosphate und Didesoxyribonucleosidtriphosphate sowie E. coli-DNA- Polymerase, Klenow-Fragment (Bethesda Research Laboratories). Nach 15-minütiger Inkubation des Reaktionsgemisches bei 38ºC wurde eine Matrizenlösung ("chase solution") mit einem Gehalt an nicht-radioaktiven Desoxyribonucleosidtriphosphaten zugegeben. Die Reaktion wurde nach 10 Minuten bei 38ºC durch Zugabe von 10 µl einer 12,5 millimolaren EDTA-Lösung mit einem Gehalt an 0,3 m Natriumacetat und 200 µg Hefe-tRNA (Sigma Chemical Co.) beendet. Die Reaktionsprodukte wurden mit Ethanol gefällt, in 10 µl einer Lösung mit einem Gehalt an 90 % (Vol./Vol.) Formamid, 30 millimolar NaOH, 10 millimolar EDTA, 0,3 % (Gew./Vol.) Bromphenolblau und 0,3 % (Gew./Vol.) Xylencyanol gelöst, 1 Minute auf 90ºC erwärmt und auf 8,0 %-ige (Gew./Vol.) Sequenziergele mit einem Gehalt an 7,6 % (Gew./Vol.) Acrylamid, 0,4 % (Gew./Vol.) Bisacrylamid, 0,003 % (Gew./Vol.) TEMED und 0,007 % (Gew./Vol.) Ammoniumpersulfat gegeben.
Die Nucleotidsequenz des IBRV-gIII-Gens, die so erhalten wurde, ist in Fig. 3 gezeigt. Restriktionsnucleaseschnittstellen, die aus der Nucleotidsequenz vorhergesagt werden, sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Restriktionsnucleaseschnittstellen, die aus der Nucleotidsequenz des IBRV-gIII-Gens vorhergesagt werden Restriktionsendonuclease Anordnung des ersten Nucleotids in der Sequenz (Nucleotid-Nr.)
Die Nucleotidsequenz enthält einen offenen Leserahmen (509 Codons), der ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 54 621 Dalton codieren kann. Zum Vergleich: das homologe PRV- g92-Polypeptid besteht aus 479 Codons und weist ein vorhergesagtes Molekulargewicht von 50 860 Dalton auf (A.K. Robbins et al., J. Virol., Bd. 58 (1986), S. 339-347).
Das translationale Initiationscodon (ATG) befindet sich 63 Nucleotide in 3'-Richtung von der BamHI-Stelle. Dem offenen Leserahmen von 1527 Nucleotiden folgt ein Terminationscodon (TAG) zehn Nucleotide in 5'-Richtung von der ApaI-Stelle (vgl. Fig. 3). Ein Polyadenylierungssignal (AATAAA) ist 68 Nucleotide in 3'-Richtung vom TAG-Terminationscodon entfernt vorhanden. Transkriptionale TATA- und CAAT-Signalsequenzen sind in 5'-Richtung, bezogen auf das ATG-Initiationscodon, vorhanden. Die Nucleotide CCGCC und GGC, die dem ATG- Translationsstartcodon vorausgehen bzw. ihm folgen, sind die gleichen wie die Consensus-Sequenzen, von denen man annimmt, daß sie eine Rolle für die Wirksamkeit der Translation spielen (M. Kozak, Microbiol. Rev., Bd. 47 (1984), S. 1-45; und M. Kozak, Nature, Bd. 308 (1984), S. 241-246). Die Nucleotidsequenz 5'-GACGGGCCCGTCGACTACACCTGC-3', die sich 1320 Nucleotide in 3'-Richtung vom ATG-Translationsstartcodon und 208 Nucleotide in 5'-Richtung vom TAG-Terminationscodon befindet, ist identisch zu der des PRV-g92-Gens, die sich 1270 Nucleotide in 3'-Richtung vom ATG-Translationsstartcodon und ebenfalls 208 Nucleotide in 5'-Richtung vom PRV-g92- Terminationscodon befindet.
Die vorhergesagte Aminosäuresequenz für das IBRV-gIII- Polypeptid, das durch das in Fig. 3 gezeigte IBRV-gIII-Gen codiert wird, weist gemeinsame Merkmale mit Hüllglycoproteinen anderer Herpesviren auf. Die ersten 21 Aminosäuren sind hydrophob, mit Ausnahme von Arginin in Position 6. Diese Sequenz könnte einem Signalpeptid zur Membraninsertion entsprechen, und sie wird möglicherweise während der Translation und des Transports entfernt. Die in den Positionen 481-498 vorhandenen Aminosäuren sind ebenfalls stark hydrophob, und sie weisen die Merkmale einer sich durch die Membran erstreckenden Region auf. Die 11 carboxyterminalen Aminosäuren weisen eine basische Ladung auf, und sie wirken möglicherweise als cytoplasmatische Ankersequenz. Schließlich sind vier mögliche Glycosylierungsstellen (Asn-X-Ser/Thr) in der Region zwischen der möglichen Signalsequenz und der Transmembransequenz vorhanden.

G. Konstruktion von pLAEBdlApaI

1,0 ug pLAEB wurden mit 20 Einheiten ApaI in 20 µl Puffer mit einem Gehalt an 6,0 millimolar NaCl, 6,0 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,4) und 6,0 millimolar MgCl&sub2;, 6,0 millimolar 2- Mercaptoethanol, 100 µg/ml BSA bei 37ºC 1 Stunde verdaut. Die geschnittene DNA wurde mit einem gleichen Volumen an Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert und mit 2 Volumenteilen Ethanol gefällt, mit Phage T&sub4;-Ligase ligiert und verwendet, um mit CaCl&sub2; behandelte E. coli K12 RR1-Zellen, wie vorstehend beschrieben, zu transformieren. Ampicillinresistente Kolonien wurden auf ein Plasmid abgesucht, das um etwa 1,5 kb kleiner als pLAEB war. Dieses Plasmid wurde als pLAEBdlApaI bezeichnet. Restriktionsendonucleaseanalysen des Plasmids bestätigten die in Fig. 2 gezeigte Struktur von pLAEBdlApaI.

H. Konstruktion von pUC18dlEcoRI

Die Plasmide pUC18 und pUC19 sind bekannte, im Handel von der Fa. Bethesda Research Laboratories erhältliche Klonierungsvektoren. Wir erhalten das PvuII/EcoRI-Fragment von pBR322. Dieses Fragment trägt das Ampicillin-Resistenzgen (β-Lactamase) und den Ursprung der DNA-Replikation. Ein HaeII-Fragment (Koordinaten 240-685), das einen Anteil des lacZ-Gens (β-Galactosidase) und eine mehrfache Klonierungsstelle der Sequenzierungsvektoren M13mp18 oder M13mp19 enthält, wurde mit dem pBR322-Fragment kombiniert, um den ursprünglichen Vektor pUC zu bilden, von dem pUC18 und pUC19 abgeleitet wurden. DNA-Fragmente können in die einzigartigen Restriktionsendonucleasestellen, die in der mehrfachen Klonierungsregion angeordnet sind, inseriert werden. Die Insertion wird durch den Verlust an β- Galactosidase-Aktivität bei der Transformation geeigneter Wirtsstämme verfolgt. Die Plasmide pUC18 und pUC19 enthalten die gleichen Restriktionsendonucleasestellen in der mehrfachen Klonierungsregion, jedoch in umgekehrter Orientierung.
Für die vorliegenden Konstruktionen wurde der Klonierungsvektor pUC18 zuerst modifiziert, wie nachstehend beschrieben wird, um die EcoRI-Klonierungsstelle zu entfernen, da die EcoRI-Stelle im HaeII-Fragment nachfolgende Stufen bei der Subklonierung des IBRV-gIII-Gens beeinträchtigen würde.
Genauer gesagt wurden 1,0 µg pUC18 mit 20 Einheiten EcoRI in 20 µl eines Puffers mit einem Gehalt an 50 millimolar NaCl, 100 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,5), 5,0 millimolar MgCl&sub2;, 100 µg/ml BSA bei 37ºC 1 Stunde inkubiert. Das mit EcoRI verdaute pUC18 wurde mit 300 Einheiten Mungobohnennuclease (Pharmacia) in 100 µl Puffer mit einem Gehalt an 50 millimolar NaCl, 30 millimolar Natriumacetat (pH-Wert: 4,6), 1,0 millimolar ZnCl&sub2; bei 37ºC 10 Minuten inkubiert, einmal mit Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert und mit 2 Volumenteilen Ethanol gefällt. Anschließend wurde die Ligation in 40 ul eines Puffers mit einem Gehalt an 800 Einheiten Phage T&sub4;-Ligase (New England Biolabs), 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,8), 10 millimolar MgCl&sub2;, 20 millimolar Dithiothreit, 1,0 millimolar ATP und 50 µg/ml BSA bei 4ºC für 18 Stunden durchgeführt. Die ligierte DNA wurde verwendet, um mit CaCl&sub2; behandelte E. coli K12 RR1-Zellen, wie vorstehend beschrieben, zu transformieren. Ampicillinresistente Kolonien wurden vermehrt, und die Plasmide wurden durch Verdau mit EcoRI, HindIII, KpnI und PstI analysiert. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid hatte die EcoRI-Stelle verloren, behielt jedoch alle anderen Restriktionsendonucleasestellen von pUC18. Dieses Plasmid wurde als pUC18dlEcoRI bezeichnet.

I. Konstruktion von pLAHK

Der Zweck dieser Stufe bestand darin, das KpnI/HindIII- Fragment von pLAH-I, das das IBRV-gIII-Gen enthält, in pUC18dlEcoRI zu übertragen (vgl. Fig. 2).
1,0 µg pUC18dlEcoRI und 1,0 µg pLAH-I wurden gemischt und mit 40 Einheiten KpnI in 20 µl eines Puffers mit einem Gehalt an 6,0 millimolar NaCl, 6,0 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,5), 6,0 millimolar MgCl&sub2;, 1,0 millimolar Dithiothreit, 100 µg/ml BSA bei 37ºC 1 Stunde verdaut. Anschließend wurde es mit 40 Einheiten HindIII in 100 µl eines Puffers mit einem Gehalt an 50 millimolar NaCl, 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 8,0), 10 millimolar MgCl&sub2;, 100 µg/ml BSA bei 37ºC 1 Stunde verdaut. Die geschnittenen DNAs wurden mit einem gleichen Volumen an Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert, mit 2 Volumenteilen Ethanol ausgefällt, mit Phage T&sub4;-Ligase ligiert und verwendet, um mit CaCl&sub2; behandelte E. coli K12 RR1-Zellen, wie vorstehend beschrieben, zu transformieren. Ampicillinresistente Kolonien der transformierten E. coli K12 RR1- Zellen wurden auf das Vorhandensein eines 10,2 kb umfassenden Plasmids abgesucht. Dieses Plasmid wurde als pLAHK bezeichnet. Restriktionsendonucleaseanalysen des Plasmids bestätigten die in Fig. 2 gezeigte Struktur von pLAHK.

J. Konstruktion von pLAHKdlApaI

Der Zweck dieser Stufe bestand im Austausch der EcoRI/BamHI- Stelle von pLAEBdlApaI gegen die EcoRI/BamHI-Stelle von pLAHK (Fig. 2). Im Gegensatz zu pLAEBdlApaI enthält pLAHKdlApaI eine lange, 3,0 kb umfassende, flankierende IBRV- Nucleotidsequenz in 5'-Richtung vom translationalen ATG- Startsignal des IBRV-gIII-Gens. Daher ist pLAHKdlApaI zur Übertragung der IBRV-gIII-Deletionsmutation in einen gIII&spplus;- IBRV durch homologe Rekombination besser geeignet als pLAEBdlApaI.
1,0 µg pLAHK und 1,0 µg pLAEBdlApaI wurden gemischt und mit BamHI und anschließend mit EcoRI, wie vorstehend beschrieben, verdaut. Die geschnittenen DNAs wurden ligiert und verwendet, um mit CaCl&sub2; behandelte E. coli K12 RR1-Zellen, wie vorstehend beschrieben, zu transformieren. Ampicillinresistente Kolonien wurden auf ein Plasmid abgesucht, das um 1,5 kb kleiner als pLAHK war. Dieses Plasmid wurde als pLAHdlApaI bezeichnet. Restriktionsendonucleaseanalysen des Plasmids bestätigten die in Fig. 2 gezeigte Struktur von pLAHKdlApaI.

K. Konstruktion von IBRV(NG)dltkdlgIII

Um IBRV(NG)dltkdlgIII zu erhalten, wobei es sich um einen tk&supmin; IBRV handelt, der als Folge einer Deletion im IBRV-gIII-Gen keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide bildet, wurde die infektiöse gIII&spplus;-DNA des tk&supmin;-Stamms IBRV(NG)dltk (ATCC-Nr. VR-2112) mit dem 6,3 kb umfassenden HindIII-KpnI-Fragment coinfiziert, das aus dem Plasmid pLAHKdlApaI (vgl. Figuren 1 und 2), wie in den US-Patenten 4 514 497 und 4 703 011 beschrieben, erhalten wurde.
Genauer gesagt wurden 10 µg pLAHKdlApaI mit 50 Einheiten KpnI in 20 µl eines Puffers mit einem Gehalt an 6,0 millimolar NaCl, 6,0 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,5), 6,0 millimolar MgCl&sub2;, 1,0 millimolar Dithiothreit und 100 µg/ml BSA bei 37ºC 90 Minuten verdaut. Die DNA wurde mit 2 Volumenteilen Ethanol gefällt, in 50 µl eines Puffers mit einem Gehalt an 50 Einheiten HindIII, 50 millimolar NaCl, 50 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 8,0), 10 millimolar MgCl&sub2; und 100 µg/ml BSA erneut gelöst und bei 37ºC 90 Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert und intensiv gegen 0,1 x TE-Puffer dialysiert. Die verdaute Plasmid-DNA wurde in 0,1 TE-Puffer auf 10 µg/ml verdünnt und steril filtriert.
Rab-9-Zellen wurden in 60 mm-Petrischalen ausgebracht (2 x 10&sup5; Zellen pro 5,0 ml Züchtungsmedium pro Schale) und 48 Stunden bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden die nachstehenden sterilen Lösungen nacheinander in das Teströhrchen gegeben:
(1) 0,02 ml an 50 µg/ml IBRV(NG)dltk-DNA in TE-Puffer;
(2) 0,2 ml an 10 µg/ml mit KpnI und HindIII geschnittenem Plasmid pLAHKdlApaI in 0,1 TE-Puffer;
(3) 0,65 ml Wasser;
(4) 1,0 ml an 20 µg/ml Lachssperma-DNA in 2 x Hepes- Pufferlösung mit einem Gehalt an 16 g/l NaCl, 0,74 g/l KCl, 0,25 g/l Na&sub2;HPO&sub4; H&sub2;O, 2,0 g/l Glucose, 10 g/l Hepes (pH-Wert: 7,05) (nachstehend "2 x Hepes-Pufferlösung");
und
(5) 0,13 ml 2,0 m CaCl&sub2;.
Die resultierende Lösung wurde durch Umdrehen gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, während sich ein DNA- Calciumphosphat-Niederschlag bildete. Anschließend wurden 0,5 ml der Suspension direkt zu Rab-9-Zellen in den Petrischalen gegeben. Die Zellen wurden 5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurde das Züchtungsmedium abgesaugt, und die Monoschicht wurde mit 5,0 ml frischem Züchtungsmedium gespült. Dann wurden 1,0 ml einer Lösung von 1 x Hepes-Puffer plus 15 % (Vol./Vol.) Glycerin zugegeben. Nach 3-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Lösung abgesaugt, die Monoschicht wurde erneut mit Züchtungsmedium gespült, und 5,0 ml frisches Züchtungsmedium wurden zugegeben. Die Kulturen wurden 3 Tage bei 34,5ºC inkubiert, bis intensive cytopathische Wirkungen auftraten. Die Kulturen wurden eingefroren und bei -80ºC gelagert. Die Virusernte wurde dann in Rab-9-Zellen unter 0,5 % (Gew./Vol.) Agarose in einer Züchtungsmedium-Deckschicht titriert.

L. Absuchen auf IBRV-gIII-Mutanten

Die durch die Cotransfektion in Abschnitt K erhaltenen Virusnachkommen umfaßten hauptsächlich IBRV(NG)dltk- Elternviren und eine kleine Population an homologen Rekombinanten, bei denen im wesentlichen die gesamte codierende Sequenz des IBRV-gIII-Gens deletiert war. Um unter den Elternviren rekombinante Viren zu identifizieren und aufzufinden, wurden molekulare Hybridisierungsversuche unter Verwendung einer ³²P-markierten IBRV-gIII-Gensonde durchgeführt, die an die Wildtyp-tk&spplus;-IBRV(Los Angeles)-Viren und an die tk&supmin;-IBRV(NG)dltk-Elternviren hybridisierte, die jedoch nicht an rekombinante Viren mit Deletionen im IBRV- gIII-Gen hybridisierte.
Genauer gesagt wurde die Virusernte aus der Cotransfektion im vorstehenden Abschnitt K aufgetaut, mit Ultraschall behandelt und in Züchtungsmedium auf etwa 100 p.f.u./ml verdünnt. Rab- 9-Zellen, die in 60 mm-Petrischalen bei 2 x 10&sup5;-Zellen pro 5,0 ml Züchtungsmedium pro Schale ausgebracht und 48 Stunden bei 37ºC inkubiert worden waren, wurden mit 0,2 ml der verdünnten Virusstammlösung 1 Stunde infiziert, mit 0,5 % (Gew./Vol.) Agarose in Züchtungsmedium überschichtet und 3 Tage bei 34,5ºC inkubiert. Plaques wurden durch eine zweite Zugabe an 0,5 % (Gew./Vol.) Agarose in einer Züchtungsmedium- Deckschicht mit einem Gehalt an 0,01 % (Gew./Vol.) Neutralrot und Inkubation bei 34,5ºC über Nacht sichtbar gemacht. Viren wurden aus den einzelnen Plaques durch Einstechen mit sterilisierten Zahnstochern und anschließende Infektion von Rab-9-Zellen, die in Vertiefungen von 96 Vertiefungen umfassenden Gewebekulturblöcke (Costar) bei 2 x 10&sup4;-Zellen pro 0,2 ml Züchtungsmedium pro Vertiefung ausgebracht und 48 Stunden bei 37ºC inkubiert worden waren, isoliert. 480 Klone der Virusnachkommen von einzelnen Plaques wurden isoliert (5 Gewebekulturblöcke mit 96 Vertiefungen). Die Gewebekulturblöcke mit 96 Vertiefungen wurden 3 Tage bei 34,5ºC inkubiert und dann bei -80ºC gelagert. Sie dienten als Stammplatten.
Rab-9-Zellen wurden, wie vorstehend beschrieben, in 10 Gewebekulturblöcke mit 96 Vertiefungen ausgebracht, 48 Stunden bei 37ºC inkubiert, und jede Vertiefung wurde mit 50 µl Züchtungsmedium aus der Vertiefung der Stammplatten (am gleichen Ort) infiziert. Zwei Kopien wurden von jeder Stammplatte hergestellt und 48 Stunden bei 34,5ºC inkubiert. Das Züchtungsmedium wurde durch Absaugen entfernt, und 50 µl 0,5 n NaOH wurden in jede Vertiefung gegeben, um die Zellen zu lysieren und die DNA freizusetzen. Nach Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht wurden 75 µl 1,0 m Tris-HCl (pH- Wert: 7.5), 125 µl 20 x SSC-Puffer mit einem Gehalt an 3,0 m NaCl, 0,3 m Natriumcitrat (pH-Wert: 7,0) in jede Vertiefung gegeben.
Nitrocellulosefilter in einer Filtrationsvorrichtung mit 96 Vertiefungen von Schleicher und Schuell (Keene, N.H.) wurden für die Dot-Blot-Analyse verwendet. Die Filter wurden mit Wasser und mit 1 x SSC vor der Auftragung der DNA-Proben auf die Filter gewaschen. Die Nitrocellulosefilter wurden getrocknet und anschließend 2 Stunden auf 80ºC in einem Vakuumexsikkator erwärmt. Die Filter wurden in einem verschließbaren Kunststoffbeutel mit einem Gehalt an 50 ml 3 x SSC, 0,02 % (Gew./Vol.) Ficoll, 0,02 % (Gew./Vol.) BSA, 0,02 % (Gew./Vol.) Polyvinylpyrrolidon, 50 µg/ml gekochter und mit Alkali denaturierter Lachssperma-DNA (nachstehend "modifizierte Denhardt-Lösung") und 10 µg/ml Poly(A) angeordnet und über Nacht bei 60ºC unter Schütteln inkubiert. Die Lachssperma-DNA wurde aus einer Stammlösung mit etwa 5,0 mg/ml zugegeben, die durch Auflösen von 50 mg Lachssperma-DNA in 10 ml 0,2 m NaOH, 20-minütiges Erwärmen auf 100ºC zur Denaturierung und Scheren der DNA zu Segmenten von etwa 0,4 kb und anschließende Neutralisierung mit 0,2 ml 10 m HCl hergestellt worden war.
Die modifizierte Denhardt-Lösung wurde anschließend durch 50 ml eines Puffers mit einem Gehalt an 50 % (Vol./Vol.) Formamid, 0,6 m NaCl, 0,2 m Tris-HCl (pH-Wert: 8,0), 0,02 m EDTA, 0,1 % (Gew./Vol.) SDS, 50 µg/ml mit Alkali denaturierter Lachssperma-DNA und 10 µg/ml Poly(A) (nachstehend "Hybridisierungspuffer") ersetzt. Der Beutel wurde unter Verwendung einer Vorrichtung der Bezeichnung Oster Touch-a-matic Bag Sealer verschweißt und 1 Stunde bei 37ºC auf einem Schüttler inkubiert. ³²P-markierte einzelsträngige M13-Sonden, die, wie im nachstehenden Abschnitt M beschrieben, erhalten wurden, wurden in den Beutel (etwa 10&sup7; cpm/ml/Beutel) gegeben und bis zu 48 Stunden bei 37ºC auf einem Schüttler inkubiert, um eine Hybridisierung zu ermöglichen. Nachdem die Hybridisierung eingetreten war, wurde der Beutel aufgeschnitten, und die Lösung wurde dekantiert. Die Filter wurden anschließend vorsichtig entnommen und auf einem Tablett mit etwa 100 ml Hybridisierungspuffer angeordnet. Die Filter wurden 30 Minuten bei 37ºC fünf mal unter leichtem Schütteln gewaschen, und anschließend wurden sie 30 Minuten bei 37ºC mit 0,3 x SSC gewaschen und dann auf einem Filterpapier angeordnet, um sie über Nacht bei Raumtemperatur zu trocknen. Zur Autoradiographie wurden die Filter mit Saran-Wrap abgedeckt und einem Fuji-Röntgenfilm mit einem Verstärkerschirm 1 bis 2 Tage bei -80ºC exponiert.
Zwei Dot-Blots von jedem ins Auge gefaßten Virus wurden hergestellt. Einer wurde mit der Sonde M13-1 hybridisiert, der andere mit der Sonde M13-38. Bei der Sonde M13-1 handelte es sich um einzelsträngige M13mp19-DNA, die ein 0,36 kb umfassendes SalI-Fragment der codierenden Region von IBRV- gIII enthielt. Bei der Sonde M13-38 handelte es sich um einzelsträngige M13mp18-DNA, die ein 1,68 kb umfassendes SacI-Fragment enthielt, da sich über einen Teil der codierenden Region und der in 3'-Richtung befindlichen Sequenzen des IBRV-gIII-Gens erstreckte. Die Sonde M13-1 hybridisierte mit Wildtyp-gIII&spplus;-IBRV-Stämmen, aber sie hybridisierte nicht mit Rekombinanten, denen die codierende Region des IBRV-gIII-Gens fehlte. Es war jedoch schwierig, die rekombinanten Viren allein mit der Sonde M13-1 zu identifizieren, da viele Wildtyp-Viren falsche negative Ergebnisse zeigten. Dies hatte wahrscheinlich seinen Grund in der Variabilität der Ausbeute an Viren in den einzelnen Vertiefungen. Schlecht gewachsene Wildtyp-Viren ergaben schwache Hybridisierungssignale. Die Sonde M13-38 hybridisierte sowohl mit Wildtyp-gIII&spplus;-Viren als auch mit rekombinanten gIII&supmin;-Viren. Durch Vergleich der mit der Sonde M13-1 hybridisierten Dot-Blots mit den mit der Sonde M13-38 hybridisierten Dot-Blots wurden die gIII&supmin;-IBRV-Rekombinanten schlüssiger identifiziert, da die Rekombinanten starke Signale mit der Sonde M13-38, jedoch kein Signal mit der Sonde M13-1 ergaben, während gIII&spplus;-IBRV-Viren starke Signale mit beiden Sonden oder, im Fall eines schlechten Wachstums, schwache Signale mit beiden Sonden ergaben.
Drei Klone rekombinanter Viren wurden aus den 480 Kandidaten isoliert. Diese Klone wurden als E12A, CG6 und C3F bezeichnet.

M. Herstellung von Sonden für die molekulare Hybridisierung

Im Phagen M13 zur Sequenzierung des IBRV-gIII-Gens clonierte DNA-Fragmente wurden zur Herstellung einzelsträngiger DNA- Sonden verwendet, wie von N.T. Hu et al., Gene, Bd. 17 (1982), S. 271-277 beschrieben ist.
Das SalI-Fragment des IBRV-gIII-Gens (Nucleotid 1286-1646 in Fig. 3) wurde in den Phagen M13mp19 cloniert. Der Sense- Strang, der für mRNA des IBRV-gIII-Gens codiert, wurde in M13mp19 cloniert, um die Sonde M13-1 herzustellen, und der Non-Sense-Strang wurde in M13mp19 cloniert, um die Sonde M13- 4 herzustellen. Das SalI-Fragment befindet sich innerhalb der codierenden Region des IBRV-gIII-Gens. Die Deletion von ApaI- Fragmenten aus dem IBRV-gIII-Gen deletiert auch das SalI- Fragment. Die Sonden M13-1 und M13-4 hybridisieren also mit IBRV(NG)dltk, pLAEB und pLAHK, sie hybridisieren jedoch nicht mit IBRV(NG)dltkdlgIII, pLAEBdlApaI und pLAHKdlApaI.
Das SacI-Fragment (Nucleotid 833-2510 in Fig. 3; vgl. auch pLAEB) wurde in den Phagen M13mp18 cloniert. Der Sense-Strang wurde in M13mp18 cloniert, um die Sonde M13-41 zu erhalten, und der Non-Sense-Strang wurde in M13mp18 cloniert, um die Sonde M13-38 zu erhalten. Da das SacI-Fragment sich über einen Teil der codierenden Region und der flankierenden Sequenzen in 3'-Richtung des IBRV-gIII-Gens erstreckt, hybridisieren die Sonden M13-38 und M13-41 nicht nur mit pLAEB, pLAHK und IBRV(NG)dltk, sondern auch mit deren ApaI- Deletionsderivaten: pLAEBdlApaI, pLAHKdlApaI und IBRV(NG)dltkdlgIII. Da es sich bei der Sonde M13-41 um den Sense-Strang des IBRV-gIII-Gens handelte, wurde sie verwendet, um mit mRNA des IBRV-gIII-Gens in Abschnitt O zu hybridisieren.
Um die Sonden herzustellen, wurden 2,0 µg gereinigter einzelsträngiger DNA mit 5,0 ng M13- Hybridisierungssondenprimer in 30 µl eines Puffers mit einem Gehalt an 83 millimolar NaCl, 10 millimolar Tris-HCl (pH- Wert: 7,5), 10 millimolar MgCl&sub2;, 20 millimolar Dithiothreit bei 65ºC 10 Minuten anelliert, auf Raumtemperatur gekühlt, und anschließend wurden folgende Substanzen zugegeben: 20 µl (³²P)dTTP (etwa 400 mCi/mMol, 10 mCi/ml in einer stabilisierten wäßrigen Lösung; Amersham), 20 µl (³²P)dCTP (etwa 400 mCi/mMol, 10 mCi/ml in einer stabilisierten wäßrigen Lösung; Amersham), 1,0 ul 10 millimolar dATP, 1,0 ul 10 millimolar dGTP und 4 Einheiten E. coli-DNA-Polymerase, großes Fragment (Klenow-Enzym; Bethesda Research Laboratories). Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, 10 ul 0,25 m EDTA wurden zugegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten auf 65ºC erwärmt. Die markierte Sonde wurde durch Sephadex G-50- Säulenchromatographie (0,5 x 15 cm) gereinigt. Dieses Verfahren ergibt routinemäßig Sonden mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 10&sup8; cpm/µg DNA.

N. Analyse gereinigter DNA aus rekombinanten Viren

Virale DNA hoher Reinheit wurde aus den drei Klonen der rekombinanten Viren E12A, C6G und C3F, die vorstehend beschrieben wurden, hergestellt. Die erhaltenen DNAs wurden mit HindIII oder BamHI plus EcoRI verdaut, und die Restriktionsendonucleasefragmente wurden durch Elektrophorese bei 35 Volt bei 4ºC für 16 Stunden auf einem 0,6 %-igen (Gew./Vol.) Agarosegel, das in einen Puffer mit einem Gehalt an 0,04 m Trizma-Base, 0,03 m NaH&sub2;PO&sub4; und 0,01 m EDTA (pH- Wert: 8,1) eingetaucht wurde, getrennt. Als Kontrolle wurde DNA aus dem Elternvirus tk&supmin;-IBRV(NG)dltk in der gleichen Weise behandelt.
Das resultierende Gel wurde mit 0,5 µg/ml Ethidiumbromid in Elektrophoresepuffer angefärbt und unter UV-Durchleuchtung photographiert. Die Ergebnisse, die in Fig. 4A gezeigt sind, zeigen, daß die HindIII-Restriktionsendonucleaseprofile der drei Rekombinanten E12A, C6G und C3F und der Eltern-DNA ähnlich waren, mit der Ausnahme, daß ein 10,5 kb umfassendes Fragment bei den rekombinanten Virus-DNAs vorhanden war, jedoch bei der Elternvirus-DNA fehlte, und daß die Menge eines 11,1 kb umfassenden Fragments in der Elternvirus-DNA größer war als in den DNAs der rekombinanten Viren. Dies zeigt, daß das 11,1 kb umfassende Fragment der DNA des Elternvirus tk&supmin;-IBRV(NG)dltk zwei verschiedene Fragment enthielt, die in diesem Gelelektrophoresesystem nicht getrennt werden konnten, und daß die Größe eines der Fragmente, das das IBRV-gIII-Gen enthält, beim rekombinanten Virus auf 10,5 kb verringert wurde. Fig. 4A zeigt auch, daß die drei Rekombinanten E12A, C6G und C3F ein identisches Restriktionsendonucleaseprofil nach Verdau mit HindIII oder EcoRI plus BamHI aufweisen. Der doppelte Verdau der Elternvirus-DNA mit BamHI plus EcoRI ergab ein 2,5 kb umfassendes Fragment, das das IBRV-gIII-Gen enthielt. Dieses Gen war in den DNAs der rekombinanten Viren nicht vorhanden. Es war jedoch ein 1,1 kb umfassendes Fragment, das um 1,4 kb kürzer ist als das 2,5 kb umfassende Elternfragment, in der DNA der rekombinanten Viren vorhanden. Dieses Fragment war in den Ethidiumbromid-gefärbten Gelen (vgl. Fig. 4A) kaum nachweisbar, es war jedoch leicht durch Southern-Blot beobachtbar (vgl. Fig. 4B). Diese Ergebnisse zeigen, daß die Größe des IBRV-gIII-Gens bei den rekombinanten Viren um 1,4 kb verringert war.
Eine der Rekombinanten, C6G, und die DNA des Elternvirus tk&supmin;- IBRV(NG)dltk wurde weiter analysiert. DNAs von diesem rekombinanten Virus und von tk&supmin;-IBRV(NG)dltk wurde mit HindIII, EcoRI, BamHI plus HindIII und PstI verdaut, und doppelte Proben wurden, wie vorstehend beschrieben, einer Agarose-Gelelektrophorese unterworfen. Die Ergebnisse sind in Figuren 5A und 6A gezeigt. Wie in den Figuren 5A und 6A gezeigt ist, waren die Änderungen bei den HindIII-Fragmenten die gleichen, wie in Fig. 4A gezeigt ist. Außerdem wurde die Größe eines 18,5 kb umfassenden EcoRI-Fragments und eines 3,2 kb umfassenden PstI-Fragments des Elternvirus auf Fragmente mit einer Größe von 17,0 kb bzw. 1,7 kb bei dem rekombinanten Virus C6G verringert.
Nach der Elektrophorese wurden die Gele von allen drei Elektrophorese-Analysen auf einem Glastablett mit 1,0 m KOH 30 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend in einem Puffer mit einem Gehalt an 1,0 m Tris-HCl (pH-Wert: 7,0) und 0,6 m NaCl 60 Minuten bei Raumtemperatur angeordnet. Die behandelten Gele wurden anschließend in eine Blot-Vorrichtung (Bethesda Research Laboratories) überführt. Ein Nitrocellulosefilter wurde vorher 10 Minuten mit Wasser und 5 Minuten mit 20 x SSC angefeuchtet und auf dem Gel angeordnet. Unter Verwendung von 20 x SSC als Übertragungsflüssigkeit ließ man das Blotting etwa 24 Stunden ablaufen. Das anhaftende Gel wurde von dem Nitrocellulosefilter entfernt, und der Filter wurde mit 6 x SSC gewaschen, über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet und dann in einem Vakuumexsikkator 2 Stunden bei 80ºC einer Wärmebehandlung unterzogen. Die Nitrocellulosefilter wurden in Kunststoffbeuteln angeordnet, über Nacht bei 60ºC mit 50 ml modifizierter Denhardt-Lösung vorbehandelt und, wie vorstehend beschrieben, 1 Stunde bei 37ºC mit Hybridisierungspuffer behandelt. Die Nitrocellulosefilter von den drei verschiedenen Gelen wurden entweder mit der Sonde M13-38 oder mit der Sonde M13-1 hybridisiert. Die Verfahren der Hybridisierung und des Waschens waren die gleichen, wie die vorstehend beschriebenen. Die Ergebnisse sind in den Figuren 4B, 5B und 6B gezeigt.
Die Figuren 4B und 5B zeigen die Autoradiogramme, die nach der Hybridisierung mit der Sonde M13-38 erhalten wurden. Fig. 6B zeigt die Autoradiogramme, die nach der Hybridisierung mit der Sonde M13-1 erhalten wurden. Wie in Fig. 6B gezeigt ist, hybridisierte die Sonde M13-1 an keines der Restriktionsendonucleasefragmente der rekombinanten C6G- Virus-DNA, während die Sonde mit einem 11,1 kb umfassenden HindIII-Fragment, einem 18,5 kb umfassenden EcoRI-Fragment, einem 3,2 kb umfassenden PstI-Fragment und einem 3,3 kb umfassenden BamHI-plus-HindIII-Fragment der DNA des Elternvirus tk&supmin;-IBRV(NG)dltk hybridisierte. Wie in Fig. 5B gezeigt ist, hybridisierte die Sonde M13-38 nicht nur mit den gleichen Restriktionsendonucleasefragmenten, mit denen die Sonde M13-1 hybridisierte, sondern sie hybridisierte auch mit einem 9,6 kb umfassenden HindIII-Fragment, einem 17 kb umfassenden EcoRI-Fragment, einem 1,7 kb umfassenden PstI- Fragment und einem 1,8 kb umfassenden BamHI-plus-HindIII- Fragment der rekombinanten C6G-Virus DNA. Wie in Fig. 4B gezeigt ist, hybridisierte die Sonde M13-38 auch mit den 10,4 kb umfassenden HindIII-Fragmenten und den 1,1 kb umfassenden BamHI-plus-EcoRI-Fragmenten der rekombinanten Virus- Kandidaten C6G, E12A und C3F, was zu erwarten war.
Diese Ergebnisse zeigen schlüssig, daß den rekombinanten Viren eine etwa 1,5 kb umfassende Sequenz aus der codierenden Region des IBRV-gIII-Gens fehlt und daß die Rekombinanten durch homologe Rekombination zwischen dem Elternvirus tk&supmin;- IBRV(NG)dltk und pLAHKdlApaI gebildet wurden.
Der Klon C6G wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt, als IBRV(NG)dltkdlgIII bezeichnet und bei der American Type Culture Collection (ATCC Nr. VR-2181) hinterlegt.

O. Analyse von mRNA, die in mit IBRV(NG)dltkdlgIII infizierten Rindernierenzellen gebildet wird

Rindernierenzellen (nachstehend "MDBK-Zellen") (ATCC Nr. CCL- 22) wurden in Rollflaschen (10 x 42 cm) bei 10&sup7; Zellen pro 200 ml Züchtungsmedium pro Flasche angeimpft und 4 Tage bei 37ºC inkubiert. Dann wurde das Züchtungsmedium entfernt, und Monoschichtkulturen wurden 1 Stunde bei 37ºC mit 10 ml einer Suspension von IBRV(Los Angeles) oder IBRV(NG)dltkdlgIII bei einem m.o.i.-Wert von 5,0 p.f.u./Zelle infiziert. Sodann wurden 100 ml frisches Züchtungsmedium zu jeder Rollflasche gegeben, und die Inkubation wurde 9 Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Am Ende der Inkubationszeit wurde das Züchtungsmedium dekantiert, und die infizierten Zellen wurden in situ in 8,0 ml eines Puffers mit einem Gehalt an 6,0 m Guanidiniumisothiocyanat, 5,0 millimolar Natriumcitrat (pH- Wert: 7,0), 0,1 m 2-Mercaptoethanol und 0,5 % (Gew./Vol.) Sarcosyl gelöst und in ein Teströhrchen überführt. Die viskose Lösung wurde mehrere Male durch eine 20Gl1/2-Nadel passiert, um die Viskosität zu verringern, CsCl (1,0 g CsCl pro 2,5 ml Lösung) wurde zugegeben, und die Lösung wurde auf 1,5 ml eines Polsters von 5,7 m CsCl in 0,1 m EDTA (pH-Wert: 7,5) in einem Polyallomerröhrchen geschichtet. Die Röhrchen wurden 20 Stunden in einem Beckman SW 41.1-Rotor bei 39 000 U/min bei 20ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde sorgfältig durch Pipettieren entfernt, und die ausgefällte RNA wurde in 5,0 ml eines Puffers mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris- HCl (pH-Wert: 7,4) 5,0 millimolar EDTA und 1,0 % (Gew./Vol.) SDS gelöst. Die RNA-Lösung wurde einmal mit 5,0 ml eines 4:1- Gemisches von Chloroform und 1-Butanol extrahiert, und die wäßrige Phase wurde in ein frisches Röhrchen überführt. Die organische Phase wurde erneut mit 3,0 ml eines Puffers mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,4), 5,0 millimolar EDTA und 1,0 % (Gew./Vol.) SDS extrahiert. Die beiden wäßrigen Extrakte wurden vereinigt, 0,1 Volumenteile 3,0 m Natriumacetat (pH-Wert: 5,2) und 2,2 Volumenteile Ethanol wurden zugegeben, die Materialien wurden 2 Stunden bei -20ºC gelagert, und anschließend wurde die ausgefällte DNA durch 20-minütige Zentrifugation bei 10 000 x g gesammelt.
Polyadenylierte RNA (Poly(A)-RNA) wurde ausgewählt, wie von H. Aviv et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 69 (1972), S. 1408-1412 beschrieben. Genauer gesagt wurde Oligo(dT)- Cellulose (Typ 2, Collaborative Research, Inc.) in einem Puffer mit einem Gehalt an 20 millimolar Tris-HCl (pH-Wert: 7,6), 0,5 m LiCl, 1,0 millimolar EDTA und 0,2 % (Gew./Vol.) SDS (nachstehend "Auftragungspuffer") suspendiert, und eine 1,0 cm-Säule wurde in einer Polypropylenwegwerfsäule (Bio- Rad) hergestellt. Die Säule wurde nacheinander mit 3,0 ml einer Lösung mit einem Gehalt an 0,1 m NaOH und 5,0 millimolar EDTA, mit Wasser, bis der pH-Wert des Ausflusses der Säule weniger als 8,0 betrug, und mit 5,0 ml Auftragungspuffer gewaschen. RNA (bis zu 20 µg), die in 1,0 ml Wasser gelöst war, wurde 5 Minuten auf 65ºC erwärmt, 1,0 ml 2 x Auftragungspuffer wurden zugegeben, anschließend wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und die Lösung wurde auf die Säule aufgetragen. Die Durchflußfraktion wurde aufgefangen, erneut 5 Minuten auf 65ºC erwärmt, abgekühlt und wieder auf die gleiche Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 10 ml Auftragungspuffer und anschließend mit 4,0 ml Auftragungspuffer mit einer verringerten Konzentration an LiCl, d.h. 0,1 m LiCl, gewaschen. Die Poly(A)-RNA wurde mit 3,0 ml eines Puffers mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris- HCl (pH-Wert: 7,5), 1,0 millimolar EDTA und 0,05 % (Gew./Vol.) SDS eluiert, und sie wurde aus der eluierten Fraktion durch Zugabe von 0,1 Volumenteile 3,0 m Natriumacetat (pH-Wert: 5,2) und 2,2 Volumenteile Ethanol sowie Belassen bei -20ºC für 2 Stunden ausgefällt. Die RNA- Niederschläge wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 10 000 x g gesammelt und in 100 µl Wasser gelöst.
Die resultierende Poly(A)-RNA (bis zu 20 µg) wurde 1 Stunde bei 50ºC in 16 µl eines Puffers mit einem Gehalt an 1,0 m Glyoxal, 50 % (Vol./Vol.) Dimethylsulfoxid und 10 millimolar NaH&sub2;PO&sub4; (pH-Wert: 7,4) inkubiert und auf Raumtemperatur abgekühlt. Anschließend wurden 4,0 µl einer Lösung mit einem Gehalt an 50 % (Vol./Vol.) Glycerin, 10 millimolar NaH&sub2;PO&sub4; (pH-Wert: 7,0) und 0,4 % (Gew./Vol.) Bromphenolblau zugegeben, und die RNA wurde auf ein 1,1 %-iges (Gew./Vol.) Agarosegel (20 x 25 cm), das in 10 millimolar NaH&sub2;PO&sub4; (pH- Wert: 7,4) eintauchte, aufgetragen und 24 Stunden einer Elektrophorese bei 35 Volt unterworfen. Als Molekulargewichtsmarker wurde mit HindIII geschnittene Phage lambda-DNA mit Glyoxal behandelt, wie vorstehend beschrieben, und Seite an Seite mit den RNA-Proben der Elektrophorese unterworfen. Die elektrophoretische Beweglichkeit der denaturierten DNA unter diesen Bedingungen ist etwa die gleiche wie die von RNA der gleichen Größe.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel auf ein Nitrocelluloseblatt unter Verwendung des DNA-Blot-Transfer- Systems (Bethesda Research Laboratories) übertragen. Die Blots wurden bei Raumtemperatur getrocknet und in einem Vakuumexsikkator 2 Stunden bei 80ºC einer Wärmebehandlung unterworfen. Die Hybridisierungen wurden mit den Sonden M13- 38 und M13-41, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Die Molekulargewichtsmarker wurden durch Hybridisierung mit Nicktranslatierter Phage lambda-DNA nachgewiesen.
Wie vorstehend erläutert wurde, handelt es sich bei den Sonden M13-38 und M13-41 um einzelsträngige M13mp18-DNAs, die eine 1,68 kb umfassende Sequenz enthalten, die sich über einen Teil der codierenden Region und in 3'-Richtung der Sequenz des IBRV-gIII-Gens erstreckt. Da der Sense-Strang (codierender Strang) des IBRV-gIII-Gens in die Sonde M13-41 cloniert war, wurde vorausgesagt, daß die Sonde M13-41 mit der mRNA des IBRV-gIII-Gens, das vom Wildtyp-IBRV(Los Angeles) codiert wird, hybridisiert. Da IBRV(NG)dltkdlgIII die codierende Region des IBRV-gIII-Gens verloren hat, jedoch die regulatorische Region am 5'-Ende des Initiationscodons und das Poly(A)-Signal (AATAAA) am 3'-Ende der IBRV-gIII- codierenden Region beibehält, ist zu erwarten, daß er für eine mRNA codiert, die um etwa 1,5 kb kürzer als die Wildtyp- mRNA ist. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 gezeigt.
Wie in Fig. 7 gezeigt ist, hybridisierte die Sonde M13-41 mit einer 2,3 kb umfassenden mRNA von mit IBRV(Los Angeles) infizierten Zellen. Diese mRNA war in mit IBRV(NG)dltkdlgIII- infizierten Zellen nicht vorhanden. Anstelle davon hybridisierte die Sonde M13-41 mit einer etwa 0,6 kb umfassenden mRNA aus mit IBRV(NG)dltkdlgIII-infizierten Zellen. Es wird daher geschlossen, daß die 2,3 kb umfassende mRNA vom Wildtyp-IBRV-gIII-Gen codiert wurde und daß die 0,6 kb umfassende mRNA von einem IBRV-gIII-Gen, von dem codierende Sequenzen deletiert wurden, codiert wurde. Wie ebenfalls in Fig. 7 gezeigt ist, hybridisierte die Sonde M13- 41 mit einer 3,7 kb umfassenden mRNA von mit IBRV(Los Angeles) infizierten Zellen weniger intensiv als mit der 2,3 kb umfassenden mRNA. Die 3,7 kb umfassende mRNA war in mit IBRV(NG)dltkdlgIII-infizierten Zellen nicht vorhanden. Es ist nicht klar, ob die 3,7 kb umfassende mRNA ebenfalls durch das IBRV-gIII-Gen oder durch ein anderes IBRV-Gen, das teilweise mit dem IBRV-gIII-Gen überlappt, codiert wurde.
Wie ferner in Fig. 7 gezeigt ist, hybridisierte die Sonde M13-38, die mit dem nicht-codierenden Strang des IBRV-gIII- Gens hybridisierte, nicht mit der IBRV-gIII-mRNA, d.h. mit den 0,6, 2,3 und 3,7 kb umfassenden mRNAs, aber sie hybridisierte mit den 7,2, 5,5, 2,9, 1,5 und 1,05 kb umfassenden mRNAs sowohl von IBRV(Los Angeles) als auch IBRV(NG)dltkdlgIII. Diese letztgenannten mRNAs werden wahrscheinlich vom komplementären Strang des Gens/der Gene, die in 3'-Richtung vom 3'-Ende des IBRV-gIII-Gens angeordnet sind, codiert.

P. ³H-Mannose-markiertes IBRV-gIII aus Extrakten von mit IBRV(NG)dltkdlgIII-infizierten Zellen

MDBK-Zellen wurden in Vier-Unzen-Flaschen mit 10&sup6;-Zellen pro 10 ml Züchtungsmedium pro Flasche ausgebracht und 2 Tage bei 37ºC inkubiert. Anschließend wurden die MDBK-Zellen mit IBRV(Los Angeles), dem Elternvirus, aus dem IBRV(NG)dltk erhalten wurde, oder mit IBRV(Cooper) oder mit IBRV(NG)dltkdlgIII mit einem m.o.i.-Wert von etwa 5,0 p.f.u./Zelle bei 37ºC für 1 Stunde infiziert. Das Züchtungsmedium wurde anschließend entfernt, und die Monoschichten wurden mit glucosefreiem Züchtungsmedium gewaschen. 4,0 ml glucosefreies Züchtungsmedium wurden mit 2,0 % (Vol./Vol.) dialysiertem fötalem Kälberserum und 100 µCi ³H-D-(2,6 3H)-Mannose (54 Ci/mMol, Amersham, England) zugegeben, und die infizierten Zellkulturen wurden 20 Stunden bei 34,5ºC inkubiert. Das Züchtungsmedium wurde durch Absaugen entfernt, und 400 µl eines Puffers mit einem Gehalt an 1,0 % (Gew./Vol.) Nonidet P40, 0,0625 m Tris-HCl (pH-Wert: 7,0) und 0,9 % (Gew./Vol.) NaCl wurden zugegeben. Die Zellsuspension wurde bei -80ºC eingefroren, aufgetaut, in ein 1,5 ml fassendes Eppendorf-Zentrifugenröhrchen überführt und mit Ultraschall behandelt.
7,0 µl des Extrakts wurden mit 30 µl anti-IBRV-Serum (PC-14) (Serum von einer Kuh, die auf natürliche Weise mit IBRV im Futter infiziert wurde, freundlicherweise bereitgestellt von Dr. S. McConnell) oder mit 5,0 µl eines monoclonalen Antikörpers (IgG2a) gegen IBRV-gIII (MC2905) (zur Verfügung gestellt von Dr. G.J. Letchworth) (R.L. Marshall et al., J. Virol., Bd. 57 (1986), S. 745-753) gemischt, und das Gemisch wurde 18 Stunden bei 4ºC gehalten. Sodann wurden 150 µl Pansorbin (Formalin-fixierte Staphylococcus aureus-Zellen, Calbiochem) zugegeben, und das Gemisch wurde 45 Minuten bei 4ºC inkubiert und anschließend 10 Minuten bei 10 000 g bei 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und das Pellet wurde in 300 µl 0,05 % (Gew./Vol.) Tween 20 in PBS resuspendiert und dreimal durch wiederholte Zentrifugationen gewaschen. Schließlich wurde das Pellet in 60 µl eines Puffers mit einem Gehalt an 0,06 m Tris-HCl (pH-Wert: 8,9), 2,0 % (Gew./Vol.) SDS, 4,0 % (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol, 15 % (Vol./Vol.) Glycerin, 0,05 % (Gew./Vol.) Bromphenolblau suspendiert, in einem Bad mit kochendem Wasser für 3 Minuten erwärmt, zentrifugiert, und der Überstand wurde einer 7,5 % (Gew./Vol.) SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse unterworfen (US-Patentanmeldung Serien-Nr. 823 439, eingereicht am 28. Januar 1986; und S. Kit et al., Am. J. Vet. Res., Bd. 48 (1987), S. 780-793). Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit einem Autoradiographieverstärker (Autofluor) (National Diagnostics) imprägniert, getrocknet und einem Fuji-Röntgenfilm bei -80ºC ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt.
Wie in Fig. 8 gezeigt ist, fällte das anti-IBRV-Rinderserum (PC-14) alle hauptsächlichen Glycoproteine von Wildtyp-IBRV in den IBRV-infizierten Zellextrakten mit der Ausnahme, daß die Glycoproteine mit einem Molekulargewicht von 92 kD bis 97 kD (IBRV-gIII) nicht aus den mit IBRV(NG)dltkdlgIII- infizierten Zellextrakten ausgefällt wurden. Wie auch in Fig. 8 gezeigt ist, fällte der monoclonale Antikörper (MC2905) das Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 92 kD und sein 79 kD umfassendes Vorläuferprotein aus mit IBRV(Los Angeles) oder IBRV(Cooper) infizierten Zellextrakten, es wurde jedoch kein Polypeptid aus Extrakten von scheininfizierten oder mit IBRV(NG)dltkdlgIII infizierten Zellen ausgefällt. Diese Ergebnisse zeigen, daß IBRV(NG)dltkdlgIII keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide (mit einem Molekulargewicht von 92 kD bis 97 kD) bilden kann.

Q. TK-Aktivität von IBRV-Stämmen

Um zu bestätigen, daß doppelten Deletionsmutanten IBRV(NG)dltkdlgIII die Fähigkeit fehlt, funktionelle TK- Aktivität zu induzieren, wurden Thymidin-Plaque- Autoradiographieversuche in tk&supmin;-Rab(BU)-Zellen durchgeführt, wie in S. Kit et al., Am. J. Vet. Res., Bd. 48 (1987), S. 780-793 und US-Patent 4 514 497 beschrieben ist. Diese Versuche zeigten, daß scheininfizierte tk&supmin;-Rab(BU)-Zellen keine Virusplaques aufwiesen und kein ³H-Thymidin der zellulären DNA einverleibten. Mit tk&spplus;-IBRV(Los Angeles) infizierte und mit tk&supmin;-IBRV(NG)dltkdlgIII infizierte Rab(BU)- Monoschichten wiesen jedoch viele Plaques auf. Durch die Nachkommen von tk&spplus;-IBRV(Los Angeles) erzeugte Plaques waren mit ³H-Thymidin markiert, durch die Nachkommen von tk&supmin; IBRV(NG)dltkdlgIII erzeugte Plaques waren jedoch nicht mit ³H-Thymidin markiert. Diese Ergebnisse zeigen, daß IBRV(NG)dltkdlgIII (ATCC Nr. VR-2181) wie der Elternstamm IBRV(NG)dltk (ATCC Nr. VR-2112) keine funktionelle TK- Aktivität bildet.

R. Temperaturresistenz von IBRV-Stämmen

Um zu bestätigen, daß IBRV(NG)dltkdlgIII temperaturresistent war, wurden die folgenden Versuche durchgeführt. Replizierte, subkonfluente Monoschichtkulturen von MDBK-Zellen wurden mit Wildtyp-IBRV(Los Angeles) oder mit IBRV(NG)dltkdlgIII bei einem m.o.i.-Wert von etwa 0,01 p.f.u./Zelle infiziert und in einem CO&sub2;-Inkubator bei 34,5ºC und 39,1ºC inkubiert. Viren wurden 3 Stunden und 48 Stunden nach der Infektion geerntet und bei 34,5ºC und 39,1ºC in MDBK-Zellen Plaque-titriert, wie in US-Patent 4 514 497 beschrieben ist. Ungefähr 10³ p.f.u./ml an Viren wurden erhalten, wenn die Ernte 3 Stunden nach der Infektion durchgeführt wurde. Dies stellt die Menge an Viren unmittelbar nach der Absorption und dem Eindringen der eingesetzten Viren dar. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Replikation für 48 Stunden bei 37,5ºC von Wildtyp-IBRV-Stämmen und mutierten IBRV-Stämmen Virusausbeute (pfu) bei Plaque-Titration bei: Virus Temperatur der Züchtung des Virus IBRV(Los Angeles)
Die vorstehende Tabelle 2 zeigt, daß 48 Stunden nach der Infektion von MDBK-Zellen bei 34,5ºC mit IBRV(Los Angeles) und IBRV(NG)dltkdlgIII die Virusausbeute auf 7,7 x 10&sup7; bzw. 2,1 x 10&sup8; p.f.u./ml (Titrationen bei 34,5ºC) angestiegen war. Die Ausbeute nach 48 Stunden an IBRV(Los Angeles) und IBRV(NG)dltkdlgIII, die bei 39,1ºC gezüchtet worden waren, betrugen etwa 3,9 x 10&sup7; bzw. 5,1 x 10&sup7; (Titrationen bei 34,5ºC). Innerhalb des experimentellen Fehlers waren die Ausbeuten für die bei 39,1ºC und 34,5ºC durchgeführten Titrationen ähnlich. Es ist also klar, daß der rekombinante Virus tk&supmin;-IBRV(NG)dltkdlgIII in einem Temperaturbereich von 34,5ºC bis 39,1ºC ungefähr genauso gut wachsen kann wie der Wildtyp-IBRV(Los Angeles)-Stamm. Das heißt, keiner der Viren zeigt temperaturempfindliche Eigenschaften. In dieser Hinsicht ähnelt tk&supmin;-IBRV(NG)dltkdlgIII auch an tk&supmin;-IBRV- Stämme, die zuvor beschrieben wurden, d.h. IBRV(B8-D53) und IBRV(NG)dltk (US-Patent 4 569 840 und US-Patent 4 703 011).
Die Erfindung ist ausführlich und mit bezug auf spezielle Ausführungsformen beschrieben worden, es ist einem Fachmann jedoch klar, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne vom Geist und Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus (IBRV), der keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide bildet, die durch die in Fig. 3 gezeigte DNA-Sequenz codiert werden, und zwar aufgrund einer Deletion, einer Insertion oder sowohl einer Deletion als auch einer Insertion im IBRV-gIII-Gen.

2. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 1, wobei der infektiöse Rinderrhinotracheitis-Virus keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide bildet, die durch die in Fig. 3 gezeigte DNA-Sequenz codiert werden, und zwar aufgrund einer Deletion im IBRV-gIII-Gen.

3. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 2, wobei die Deletion eine Größe von etwa 10 bis 1500 bp aufweist.

4. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 3, wobei die Deletion eine Größe von etwa 75 bis 200 bp aufweist.

5. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 1, wobei die Insertion eine Größe von etwa 8 bis 5000 bp aufweist.

6. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 1, wobei der infektiöse Rinderrhinotracheitis-Virus auch keine funktionelle TK bildet, und zwar aufgrund einer Mutation im IBRV-tk-Gen.

7. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 6, wobei die Mutation im IBRV-tk-Gen eine Deletionsmutation ist.

8. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 1, wobei der infektiöse Rinderrhinotracheitis-Virus auch temperaturresistent ist.

9. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 1, wobei der Virus die identifizierenden Merkmale von IBRV(NG)dltkdlgIII (ATCC Nr. VR-2181) aufweist.

10. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus, der keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide bildet, die durch die in Fig. 3 gezeigte DNA-Sequenz codiert werden, und zwar aufgrund einer Deletion im IBRV-gIII-Gen, die durch ein Verfahren erzeugt wurde, das folgende Stufen umfaßt:

(1) Konstruktion eines Hybridplasmids, das einen Klonierungsvektor und ein DNA-Fragment von IBRV, das im wesentlichen das gesamte IBRV-gIII-Gen und flankierende Sequenzen davon enthält, umfaßt;

(2) Deletion von DNA-Sequenzen aus dem Hybridplasmid von Stufe (1), so daß weniger als im wesentlichen das ganze IBRV-gIII-Gen vorhanden ist, während IBRV-DNA- Sequenzen, die zu jeder Seite der Deletion benachbart sind, beibehalten werden;

(3) Cotransfektion in IBRV-Wirtszellen des Hybridplasmids von Stufe (2) mit infektiöser gIII&spplus;-IBRV-DNA; und

(4) Absuchen der in Stufe (3) erhaltenen Virusnachkommen, um IBRV-Mutanten, die keine antigenen IBRV-gIII- Polypeptide aufgrund einer Deletion im IBRV-gIII-Gen bilden, zu identifizieren und herzustellen.

11. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 10, wobei die Deletion eine Größe von etwa 10 bis 1500 bp aufweist.

12. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 11, wobei die Deletion eine Größe von etwa 75 bis 200 bp aufweist.

13. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 10, wobei die infektiöse gIII&spplus;-IBRV-DNA von Stufe (3) aus einer IBRV-Mutante abgeleitet ist, die keine funktionelle TK bildet, so daß die resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide aufgrund einer Deletion im IBRV-gIII-Gen und keine funktionelle TK aufgrund der Mutation im IBRV-tk-Gen bilden.

14. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 13, wobei die IBRV-Mutante, die keine funktionelle TK bildet, diese aufgrund einer Deletion im IBRV-tk-Gen nicht bildet.

15. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 14, wobei es sich bei der IBRV-Mutante um IBRV(NG)dltk handelt.

16. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 10, wobei die infektiöse gIII&spplus;-IBRV-DNA von Stufe (3) aus einem temperaturresistenten IBRV abgeleitet ist, so daß die resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) temperaturresistente IBRV-Mutanten sind, die keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide aufgrund einer Deletion in IBRV-gIII-Gen bilden.

17. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 10, wobei das Verfahren zusätzlich eine Stufe (5) umfaßt:

(5) Vermehrung der resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) bei einer nicht-permissiven Temperatur für einen temperaturempfindlichen Virus, so daß temperaturresistente IBRV-Mutanten, die keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide aufgrund einer Deletion im IBRV-gIII-Gen bilden, selektiert und hergestellt werden.

18. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 10, wobei der Klonierungsvektor unter der Gruppe pBR322, pBR325, pMB9, pKH47, pBR328, pHC79, pUC18, pUC19, Phage Charon 28, pKB11, pKSV-10 und pMAR420 ausgewählt ist.

19. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 18, wobei es sich bei dem Klonierungsvektor um pBR322 handelt.

20. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem resultierenden Hybridplasmid von Stufe (2) um das in Fig. 2 gezeigte pLAHKdlApaI handelt.

21. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 10, wobei eine fremde DNA-Sequenz anstelle der in Stufe (2) deletierten IBRV-gIII-Gensequenzen inseriert ist, so daß die IBRV-DNA-Sequenzen, die zu jeder Seite der deletierten IBRV-gIII-Gensequenzen benachbart sind, beibehalten werden und so daß die resultierenden IBRV- Mutanten von Stufe (4) keine antigenen IBRV-gIII- Polypeptide sowohl aufgrund einer Deletion als auch einer Insertion im IBRV-gIII-Gen bilden.

22. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 21, wobei die fremde DNA-Sequenz eine Größe von etwa 8 bis 5000 bp aufweist.

23. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 22, wobei die infektiöse gIII&spplus;-IBRV-DNA von Stufe (3) aus einer IBRV-Mutante abgeleitet ist, die keine funktionelle TK bildet, so daß die resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide sowohl aufgrund einer Deletion als auch einer Insertion im IBRV- gIII-Gen und keine funktionelle TK aufgrund einer Mutation im IBRV-tk-Gen bilden.

24. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 23, wobei die IBRV-Mutante, die keine funktionelle TK bildet, diese aufgrund einer Deletion im IBRV-tk-Gen nicht bildet.

25. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 24, wobei es sich bei der IBRV-Mutante um IBRV(NG)dltk handelt.

26. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 21, wobei die infektiöse gIII&spplus;-IBRV-DNA von Stufe (3) aus einem temperaturresistenten IBRV abgeleitet ist, so daß die resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) temperaturresistente IBRV-Mutanten sind, die keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide sowohl aufgrund einer Deletion als auch einer Insertion im IBRV-gIII-Gen bilden.

27. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 21, wobei das Verfahren zusätzlich eine Stufe (5) umfaßt:

(5) Vermehrung der resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) bei einer nicht-permissiven Temperatur für einen temperaturempfindlichen Virus, so daß ein temperaturresistenter IBRV selektiert und hergestellt wird, der keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide sowohl aufgrund einer Deletion als auch einer Insertion im IBRV-gIII-Gen bildet.

28. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 21, wobei der Klonierungsvektor unter der Gruppe pBR322, pBR325, pMB9, pKH47, pBR328, pHC79, pUC18, pUC19, Phage Charon 28, pKB11, pKSV-10 und pMAR420 ausgewählt ist.

29. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 28, wobei es sich bei dem Klonierungsvektor um pBR322 handelt.

30. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus, der keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide, die durch die in Fig. 3 gezeigte DNA-Sequenz codiert werden, bildet, und zwar aufgrund einer Insertion im IBRV-gIII-Gen, die durch ein Verfahren erzeugt wird, das folgende Stufen umfaßt:

(2) Insertion einer fremden DNA-Sequenz in das Hybridplasmid von Stufe (1), so daß keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide gebildet werden und so daß IBRV-DNA-Sequenzen, die zu jeder Seite der Insertion benachbart sind, beibehalten werden;

(3) Cotransfektion in IBRV-Wirtszellen des resultierenden Hybridplasmids von Stufe (2) mit infektiöser gIII&spplus;- IBRV-DNA; und

(4) Absuchen der in Stufe (3) erhaltenen Virusnachkommen, um IBRV-Mutanten, die keine antigenen IBRV-gIII- Polypeptide aufgrund einer Insertion im IBRV-gIII-Gen bilden, zu identifizieren und herzustellen.

31. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 30, wobei die Insertion eine Größe von etwa 8 bis 5000 bp aufweist.

32. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 30, wobei die infektiöse gIII&spplus;-IBRV-DNA von Stufe (3) aus einer IBRV-Mutante abgeleitet ist, die keine funktionelle TK bildet, so daß die resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide aufgrund einer Insertion im IBRV-gIII-Gen und keine funktionelle TK aufgrund einer Mutation im IBRV-tk-Gen bilden.

33. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 32, wobei die IBRV-Mutante, die keine funktionelle TK bildet, diese aufgrund einer Deletion im IBRV-tk-Gen nicht bildet.

34. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 33, wobei es sich bei der IBRV-Mutante um IBRV(NG)dltk handelt.

35. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 30, wobei die infektiöse gIII&spplus;-IBRV-DNA von Stufe (3) aus einem temperaturresistenten IBRV abgeleitet ist, so daß die resultierenden IBRV-Mutanten von Stufe (4) temperaturresistente IBRV-Mutanten sind, die keine antigenen IBRV-gIII-Polypeptide aufgrund einer Insertion im IBRV-gIII-Gen bilden.

36. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 30, wobei das Verfahren zusätzlich eine Stufe (5) umfaßt:

(5) Vermehrung der resultierenden IBRV von Stufe (4) bei einer nicht-permissiven Temperatur für einen temperaturempfindlichen Virus, so daß ein temperaturresistenter IBRV, der keine antigenen IBRV- gIII-Polypeptide aufgrund einer Insertion in IBRV- gIII-Gen bildet, selektiert und hergestellt wird.

37. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 30, wobei der Klonierungsvektor aus der Gruppe pBR322, pBR325, pMB9, pKH47, pBR328, pHC79, pUC18, pUC19, Phage Charon 28, pKB11, pKSV-10 und pMAR420 ausgewählt ist.

38. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach Anspruch 37, wobei es sich bei dem Klonierungsvektor um pBR322 handelt.

39. Infektiöser Rinderrhinotracheitis-Virus nach einem der Ansprüche 1, 10, 21 und 30, wobei der Virus lyophilisiert ist.

40. Vakzin für die infektiöser Rinderrhinotracheitis- Erkrankung, das folgende Bestandteile umfaßt:

(1) eine pharmazeutisch wirksame Menge eines infektiösen Rinderrhinotracheitis-Virus gemäß einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche 1 bis 39; und

(2) einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel.

41. Vakzin für die infektiöse Rinderrhinotracheitis- Erkrankung nach Anspruch 40, wobei es sich bei dem pharmazeutisch verträglichen Träger oder dem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel um ein physiologisch gepuffertes Medium mit einem Gehalt an 2,5 bis 15 % Serum handelt, das keine Antikörper gegen den infektiösen Rinderrhinotracheitis-Virus enthält.

42. Vakzin für die infektiöse Rinderrhinotracheitis- Erkrankung nach Anspruch 41, wobei das Serum unter der Gruppe Schweineserum, Kälberserum, fötales Kälberserum, Pferdeserum und Lammserum ausgewählt ist.

43. Vakzin für die infektiöse Rinderrhinotracheitis- Erkrankung nach Anspruch 40, wobei die pharmazeutisch wirksame Menge 104,5 bis 107,0 p.f.u. beträgt.

44. Vakzin für die infektiöse Rinderrhinotracheitis- Erkrankung nach Anspruch 43, wobei die pharmazeutisch wirksame Menge 104,5 bis 105,5 p.f.u. beträgt.