JPH02431A - 感染のウシ鼻気管支炎ウイルスの突然変異類、それらを含有するワクチン、それらの調製法およびそれらの使用 - Google Patents

感染のウシ鼻気管支炎ウイルスの突然変異類、それらを含有するワクチン、それらの調製法およびそれらの使用

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JPH02431A
JPH02431A JP63278495A JP27849588A JPH02431A JP H02431 A JPH02431 A JP H02431A JP 63278495 A JP63278495 A JP 63278495A JP 27849588 A JP27849588 A JP 27849588A JP H02431 A JPH02431 A JP H02431A
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マロン・キット
Saul Kit
ソール・キツト
Haruki Otsuka
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Baylor College of Medicine
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ウィルス遺伝子によってエンコードされた抗
原性ポリペプチドが産生されないように、主要なウィル
ス糖タンパク質中に欠失および／または挿入を含有する
感染のウシ鼻気管支炎（ウシヘルペスウィルスｌ型）突
然変異に関する。その結果、それでワクチン接種した動
物は、ウィルスの糖タンパク質に対する抗体を発生せず
、そして感染のウシ鼻気管支炎ウィルスのフィールド株
（ｆｉｅｌｄ　　５ｔｒａｉｎｓ）で感染した動物と血
清学的ｔこ区別することができる。本発明は、また、そ
れを含存する感染のウシ鼻気管支炎のためのワクチン、
それを産生ずる方法およびそれを使用する方法に関する
。
■、感染のウシ鼻気管支炎 ウシヘルペスウィルスｌ型（以後ｒＢＨＶ−１」）、よ
り普通に感染のウシ鼻気管支炎つイ゛ルス（以後ｒＩＢ
ＲＶＪ）として知られている、呼吸、生殖、腸、眼、中
枢神経系、新生児、乳房、および皮膚の感染に関係付け
られて来ている［ギップス（Ｇｉｂｂｓ）、Ｅ、Ｐ、Ｊ
、　ら、ベテリナリー・プレチン（Ｖｅ　ｔ、Ｂｕ　Ｉ
　１．）（Ｌｏｎｄｏｎ）４７：３１７−３１３　（１
９７７）］。気道の病気とのｒ　ＢＲＶの関連の証拠は
、最初に、１９５０年代の初期に得られた。それ以来、
感染のウシ鼻気管支炎（以後ｒｌＢＲＪ）は世界中に広
く分布していることが明らかになった。１９６０年の中
頃までに、Ｉ　ＢＲＶによって生じた呼吸の病気は、米
国において約２５００万ドルの損失を生じた。ＩＢＲＶ
の感染に関連する追加の損失は、流産の急性発生、乳の
生産の劇的な損失、子宮炎、腸炎、および髄膜のためで
あった。１９７２年以来、Ｉ　ＢＲＶ呼吸器感染のより
厳しい形態は、カナダおよび西ドイツにおいて広く広ま
るようになった。新しいＩＢＨの突然の発生は、多分、
輸入された無症候のＩＢＲＶキャリヤーへ暴露または臨
床的病気の発症前の感染した動物への暴露から生ずる、
それゆえ、ＩＢＲＶ感染した家畜類の輸入は、ある国に
おいて制限または禁止される。
天然におよび人工的に交配された畜牛におけるＩＢＲの
広がりは、また、ことに凍結した精液の連続した広い使
用に、重大な問題を付与した。さらに、感染した雄牛か
らのＩＢＲＶの再発する脱落は、米国における人工的精
液注入工業に、およびウシ胚厚形質の広い分布に、宵意
の脅威を与える。ＩＢＲＶを、不妊症およびせい生殖不
能を生ずる、卵巣炎および卵管の病因学因子として解釈
することは、Ｉ　ＢＲＶ感染の重大性を付加する。
畜生以外の種のＩＢＲＶ感染は、ブタ、ヤギ、スイギュ
ー、ヌー、フエレット、およびミンクにおいて起こる。
実験の感染は、ブタ、ヤギ、ミュールシカ、フェレット
およびウサギにおいて確立された［ジョー（Ｊｏｏ）、
Ｈ，Ｓ、ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナ
リー・メディカル・アソシエーション（Ａｍ、Ｊ、Ｖｅ
　ｔ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、）（以後、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅ
　ｔ。
Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、）］、４５：　１９２４１９２７
　（１９８４）］。
ＩＢＲＶの感染から生ずる病気の厳しさは、ウィルスの
株および影響を受けた動物の年令に依存する。感染から
回復した後、動物は、ウィルスに再び暴露しないで、再
発する病気の臨床的徴候を示す。再暴露なしに再発する
病気は、その宿主の知覚神経節のニューロンにおいて、
ウィルスが休止している、すなわち、潜伏している、た
めに起こり、そして、長い期間後でさえ、再活性化する
ことができる［ロック（Ｒｏｃｋ）、Ｄ、Ｌ、ら、ジャ
ーナル・オブ・ゼネラル・ピロロジー（Ｊ。
Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、）（以後、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏ
ｌ、）、６７：２５１５　２５２０（１９８６）］。デ
キソメタゾーンの処置は、また、活性のＩＢＨの臨床的
症候の発現または発現なしに、ウィルス鼻の脱落を誘発
しうる。これが示唆するように、再活性化およびニュー
ロンの部位からの解放および、多分、他の組織の持続的
感染は起こる［ロッジ（Ｒｏｓｓ　ｉ）、Ｃ，Ｒ，ら、
アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサー
チ（Ａｍ、Ｊ、Ｖｅ　ｔ、Ｒｅ　ｓ、）（以後Ａｍ。
Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、）、４３：１４４０　１４４２（
１９８２）］。潜伏からのＩＢＲＶの再活性化および症
候的脱落は、また、自発的に起こりうるので、ＩＢＲＶ
のフィールド株で潜伏的に感染した畜牛はウィルスの伝
達および群れの感染の散在性の源を表す。
ＩＩ、既知のＩＢＲワクチン ｉＢＲの抑制はワクチン接種に大きく基づく。
現在、ＩＢＲワクチンの３つのタイプが用いられている
：　（１）殺したウィルスのワクチン；　（２）サブユ
ニットのワクチン；および（３）変性（以後ｒＭＬＶＪ
　）ワクチン（米国特許筒３，６３４゜５８７号；米国
特許筒３，９２５．５４４号および米国特許筒４，２９
１，０１９号）。殺した■ＢＲワクチンは、化学物質、
例えば、ホルマリンまたはエタノール、および／または
物理的因子、例えば、熱または紫外線照射でウィルスを
処理することによって生産される。サブユニットＩＢＲ
ワクチンは、ＩＢＲＶ感染した細胞培養物を非イオン性
洗浄剤で可溶化し、そして可溶化したウィルスタンパク
質を精製することによって調製される［パビウク（Ｂａ
ｂｉｕｋ）ら、ウィルス学（Ｖｉｒｏｌ、）（以後、Ｖ
ｉ　ｒｏ　ｌ−）、１５９：５’　−６６（１９８７）
］。早期のＭＬＶワクチンは非経口的投与のために設計
され、そしてウシ細胞培養物中における急速継代培養に
よって減衰されたＩ　ＢＲＶから成っていた。より最近
、非経口的投与されたＭＬＶワクチン歯、ウシまたはウ
マ培養物へのＩＢＲＶの適合によって、低温（３０°Ｃ
）における細胞培養物中の増殖への適合によって、ある
いは熱安定性ウィルス粒子の選択（５６°Ｃで４０分）
によって減衰されてきた。ＭＬＶの特殊化されたタイプ
は、鼻内に投与されたものである。これらのＭＬＶワク
チンは、ウサギ細胞培養物中の系統的継代培養によって
、あるいはＩＢＲＶを亜硝酸で処理し、次いで温度感受
性突然変異について選択することによって減衰される。
温度感受性ウィルス歯、３２°Ｃ〜３８°Ｃにおいて効
率的に複製するが、約３９°Ｃ〜４１００において復製
しないものである［トッド（Ｔｏｄｄ）、Ｊ。
Ｄ、、Ｊ、Ａｍ、Ｖｅｔ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、、１５
９　：１３７０−１３７４　（１９７１）；カース（Ｋ
ａｈｒｓ）ら、Ｊ、Ａｍ、Ｖｅ　ｔ、Ｍｅｄ。
Ａｓ５ｏｃ、、１６３：４３７−４４１　（１９７３）
；スミス（Ｓｍ　ｉ　ｔ　ｈ）　、Ｍ、Ｗ、　　ら、Ｃ
ａｎ、Ｖｅ　ｔ、Ｊ、　、ｌ　９　：　６３−７１　（
１９７８）；ジグライヒ（Ｚｙｇｒａ　１ｃｈ）、Ｎ、
ら、リサーチ・イン・ペテリナリー・サイエンス（Ｒｅ
ｓ、Ｖｅｔ、Ｓｃｉ、）（以後、Ｒｅ　ｓ、Ｖｅ　ｔ。
Ｓｃ　　ｉ、）　　、　１６　　：　　３２８−３３５
　　（１９７４）：および米国特許筒３，９０７，９８
６号、米国特許筒４，１３２．７７５号］。
前述の現在入手可能なＩＢＲワクチンは、重大な欠点を
もち、それゆえ、商業的使用において不満足であること
が証明された。より詳しくは、殺したＩＢＲワクチンは
ＭＬＶワクチンより安全である、すなわち、それらは潜
伏を確立することができず、そしてワクチン接種後の脱
落の問題を排除する、とある者によって考えられたが、
それらは製造に費用がかかり、数回投与しなくてはなら
ず、そして不利なことにはアジュバントを必要とする。
さらに、それらを使用すると、致死的超感作反応および
非致死的じんま疹の可能性が存在する。その上、殺した
ＩＢＲワクチンでワクチン接種したウシは後の時間にビ
ルシントウイルスで感染されることがあり、そしてビル
シントウイルスを脱落することがあり、それゆえ群にお
いて感染を広げることがある［フレリヒス（Ｆｒｅｒｉ
ｃｈ　ｓ）　、Ｇ、Ｎ、ら、ウィルスの研究（Ｖｉｒｕ
５Ｒｅｓ、）（以後、Ｖｉｒｕｓ　　Ｒｅｓ、）、ｉｌ
ｌ：１１６−１２２　（１９８２）；およびワイズマン
（Ｗｉ　ｓ　ｅｍａ　ｎ）　、Ａ、ら、Ｖｉｒｕｓ　　
　Ｒｅｓ、、　１０４：５３５　　５３６　　（１９７
９）］。こうして、殺したＩＢＲワクチンはＩＢＲに対
する多少の保護を提供することができるが、長期間の保
護を提供することにおいて、ＭＬＶワクチンに一般的に
劣る。
サブユニ２トのワクチンはしばしば殺した殺したウィル
スのワクチンよりも毒性に劣り、そして有意の価値をも
ち得る、新規な免疫学的作用を誘発することがある。サ
ブユニットのワクチン調製物のための技術は、カプシド
タンパク質を除去すると、同時に保護的免疫性を誘発す
る無傷の抗原性タンパク質を残す。これは、天然に感染
した動物からワクチン接種した動物を区別するための、
血清学的手順の開発の可能性をつくる。さらに、サブユ
ニットのワクチンは、抗原性であるが、生きているウィ
ルスを含有せず、こうして、他の動物に伝達されず、流
産を起こさず、あるいは潜伏を確立することができない
［ルブトン（Ｌｕｐｔｏｎ）、Ｈ，Ｗ、ら、アメリカン
・ジャーナル・オブ・ベテリナリー・リサーチ（Ａｍ、
Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、）（以後、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅ　ｔ、
Ｒｅｓ、）、４１　：　３８３−３９０　（１９８０）
；８よびしくＩｅ）Ｑ、ダーセル（Ｄａｒｃｅｌ）、Ｃ
９ら、カナデイアン・ジャーナル・オブ・コンパラティ
プ・メディシン（ｃａｎ、Ｊ、Ｃｏｍ。
Ｍｅｄ、）（以後、Ｃａｎ、Ｊ、Ｃｏｍ、Ｍｅｄ。
）、４５：８７−９１　　（１９８１）］。しかしなが
ら、サブユニットのワクチンは、殺したワクチンのよう
に、ウシを引き続いてビルシントＩＢＲＶフィールド株
に暴露したとき、一般に感染および潜伏を防止しない。
サブユニットのワクチンの他の欠点は、清製のコストが
高く、そしてアジュバントとともに数回の注射を必要と
することである。
ＭＬＶ　　ＩＢＲワクチンは、急速な保護を生成し、そ
して免疫系の細胞仲介のホルモンの成分を活性化すると
いう、授与得な利点を有する。鼻のワクチン接種の場合
において、気道におけるビルシントＩＢＲＶの後の複製
を抑制する、局在化した免疫応答は、保護に有意に寄与
する。局所的免疫応答は、鼻の分泌においてインターフ
ェロンおよび抗体の産生を包含する［クセラ（Ｋｕｃｅ
ｒａ）Ｃ，Ｊ、　　ら、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅ　ｔ、Ｒｅ　ｓ
、、３９：６０７−６１０　（１９７８）］。Ｍ　Ｌ　
ＶＩＢＲワクチンの高価な利用は、ＩＢＲの発生の頻度
を減少した。しかしながら、入手可能なＭＬＶ　　ＩＢ
Ｒワクチンの大部分は、完全は満足すべきものではない
。さらに詳しくは、ことにワクチンのウィルス自体が潜
伏を生成し、そして脱落しかつ感受性のウシに伝達しう
るとき、それらの安全性の問題が存在する。
筋肉内に（以後ＮＭＪ）投与したＭＬＶ　　ＩＢＲワク
チンの最大の利用は、ことにワクチンが誘発する流産に
よって阻止されてきた。すなわち、あるＭＬＶ　　ＩＢ
Ｒワクチンの筋肉内注射後、６０％程度に高い流産の割
合が報告された［カース（Ｋａｈ　　　ｒ　　ｓ）　　
、　　Ｒ，Ｆ、　　　、　　Ｊ、　　　Ａｍ、　　　Ｖ
ｅ　　　ｅ。
Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、、　　１７１：　　ｌ　０５５−
１０６４　（１９７７）；およびケンドリック（Ｋｅｎ
ｄｒｉｃｋ）ら、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅ　ｔ、Ｒｅ　ｓ、、２
８　：１２６９−１２８２　（１９６７）］。さらに、
現現在用されているＭＬＶ　　ＩＢＲワクチンでは、ビ
ルシントへの逆転の危険が存在する。
より安全なＭＬＶ　　ＩＢＲワクチンの研究において、
特殊化されたワクチンが開発されＩ；［トッド（Ｔｏｄ
ｄ）、Ｊ、Ｄ、　ら、Ｊ、Ａｍ、Ｖｅｔ。
Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、、１５９：１３７０−１３７４　
（１９７１）　　：カース（Ｋａｈ　ｒ　ｓ）　、Ｒ。
Ｆ、　、Ｊ、Ａｍ、Ｖｅ　ｔ、Ｍｅｄ、Ａｓ　ｓｏｃ、
、１６３：４２７−４４１　（１９７３）；スミス（Ｓ
ｍｉｔｈ）、Ｍ、ｗ、　ら、Ｃａｎ、Ｖａｔ、Ｒｅｓ、
、１９：６３　７１　　（１９７９）；ジグライヒ　　
（Ｚｙｇｒａ　　　ｉ　　ｃｈ）　　％　　　Ｎ、　　
　ら　、　　Ｒｅｓ、Ｖｅｔ、Ｓｃ　ｉ、、１６　：　
３２８−３３５　（１９７４）：およびクセラ（Ｋｕｃ
ｅｒａ）、Ｃ，Ｊ、ら、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、、
３９：６０７　６１０（１９７８）］。これらのワワク
シは、妊娠したウシへの鼻ない（以後ｒＩＮＪ）接種に
ついて免疫原性でありかつ安全であり、そしてビルシン
トＩＢＲＶに対して対抗暴露された妊娠した雌ウシにお
ける流産を防止することができる。しかしながら、それ
らはＩＮ道筋によって投与できるだけである。この理由
は、ＩＮ投与したとき、１つこのようなワクチンは上の
気道のより低いおんどにおいて制限された程度に複製す
ることにある。
しかしながら、ワクチンは通常の体温において複製する
程度が劣るか、あるいは全く複製しない［ジグライヒ（
Ｚｙｇｒａ　ｉ　ｃｈ）　、Ｎ、ら、Ｒｅ　ｓ。
Ｖｅ　ｔ、Ｓｃ　ｉ、　、１６　：　３２８　３３５　
（１９７４）１゜他方において、他のワクチンは妊娠し
た動物への１Ｍ投与のために不十分に減衰されるが、Ｉ
Ｎで与えるとき、安全である［トッド（Ｔｏｄｄ）、Ｊ
−Ｄ、　、Ｊ、Ａｍ、Ｖｅ　ｔ、Ｍｅ　ｄ。
Ａｓ５ｏｃ、、１６３：４２７　４４１　　（１９７３
）１゜さらに、ワクチン株のあるものは、ＩＮ投与後で
さえ、温和なまたは中程度の呼吸器の病気を生成し、そ
してフィールドの対抗暴露後、■ＢＲの徴候を防止しな
い［カース（Ｋａｈｒｓ）、Ｒ，Ｆ、　　ら、Ｊ、Ａｍ
、Ｖｅ　ｔ、Ｍｅｄ、Ａｓ　ｓｏｃ、、１６３：４３７
　４４１　（１９７３）］。
したがって、妊娠した雌ウシに対して安全ではない１Ｍ
投与したＭＬＶ　　ＩＢＲワクチンおよびＩＮ投与しな
くてはならない前述のＭＬＶ　　ＩＢＲワクチンのいず
れも、は現在の管理の実施の多くにうまく適合しない。
すなわち、ＩＮ道筋によって大きい数のウシのワクチン
接種は、非効率的であり、そして動物を取り扱う人に対
して潜在的に危険である。さらに、免疫化前の任資した
動物を同定するためのスクリーニングはしばしば望まし
くないかあるいはコスト的に有効ではない。
最近、ＩＢＲＶ株のチミジンキナーゼ陽性（以後ｔｋつ
、すなわち、野生型、ロスアンジェルス（Ｌｏｓ　　Ａ
ｎｇｅｌｅｓ）（以後、ＬｏｓＡｎｇｅｌｅｓ）株（Ａ
ＴＣＣＮｏ、ＶＲ−１８８）から誘導された温度抵抗性
、チミジンキナーゼ陰性（以後ｔｋ−）ＩＢＲワクチン
が開発され、これは現在入手可能なワクチンの使用を制
限する問題の多くを克服する［キット（Ｋｉｔ）、Ｓ　
、　　ら、　　Ａｒｃｈ、　　　Ｖｉ　　ｒｏ　　１．
　　、　８６　　二　６３　−８３　（１９８５）；キ
ット（Ｋｉｔ）、Ｓ、　　ら、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎ
ｅ）（以後、Ｖａｃｃｉｎｅ）、４：５５−６１　（１
９８６）；および米国特許第４，５６９，８４０号およ
び米国特許第４．７０３，０１１号、これらの文献は引
用によってその全部を加える１゜これらのＩＢＲワクチ
ンは、ウサギ皮膚およびウシ気管細胞中において３９．
１’Ｏまたは３４．５°Ｃにおいて等しくよく復製する
、プラーク精製したＩ　ＢＲＶ分離物から成る。それゆ
え、それらは「温度抵抗性」と表示される。これは「温
度感受性」と表示され、ＩＮ投与に使用されるＩＢＲＶ
株と対照的であり、３４．５°Ｃにおけるのと同様に３
９．１’Ｃ似おいてわずかに約１Ｏ−３〜ｌ０−７複製
するだけである。
３９．１℃または３４．５℃において等しくよく複製す
る能力に加えて、ｔｋ−ＩＢＲワクチンは感染した細胞
中で機能的チミジンキナーゼ酵素（以後、ｒＴＫＪ　）
を産生ずる能力を欠く。１つのワクチン、ＩＢＲＶ　（
Ｂ８−Ｄ５３）（ＡＴＣＣＮｏ、ＶＲ−２０６６）（米
国特許第４，５６９゜８４０号）、において、機能的Ｔ
Ｋの不生産性は突然変異原誘導突然変異から生ずる。第
２ワクチン、Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）ｄ　Ｉ　ｔ　ｋ　（
ＡＴＣＣＮｏ。
ＶＲ−２１１２）（米国特許第４，７０３，０１１号）
と表示する、では、機能的ＴＫの不生産性は、ＩＢＲＶ
　　ｔｋ遺伝子の解読配列からの約４００塩基対（以後
ｒｂｐＪ）の欠失ならびに、すべての３つのリーディン
グフレーム中に停止コドンをもつ４０ｂｐのオリゴヌレ
オチドのＩ　ＢＲＶｔｋ遺伝子の挿入から生ずる。２つ
の特性、すなわち、温度抵抗性およびｔｋ−は、ワクチ
ンとしてこれらの突然変異ＩＢＲＶの優越性に直接寄与
する。
前述のＩ　ＢＲＶ突然変異の温度抵抗性および（ｋ−特
性はワクチンのそれらの安全性および有用性を大きく改
良するが、ＩＢＲＶの休眠の特徴は、ＩＢＲＶ感染群の
隔離およびＩＢＲＶ感染動物の屠殺によってＩＢＨの広
がりを防止することを意図する、検疫手段の適用によっ
てＩＢＲの根絶を実施することを困難とする。すなわち
、現存するＭＬＶ　　ＩＢＲワクチンでは、病気の症候
を示さない特定の動物が休眠のＩ　ＢＲＶのキャリヤー
であるかどうかを決定することは困難である。なぜなら
、たいていの現在のワクチンは感染をマスクするからで
ある。それゆえ、健康に見える動物は実際にはキャリヤ
ーであであり、こうして、ＩＢＲの蔓延体であることが
あるので、ワクチン接種後であってさえ、検疫手段を適
用可能とするために、感染した動物および群を同定でさ
ることは重要である。本発明の実施態様はこの必要性を
満足するために開発された。
さらに、ある国においては、品種改良のため、飼育場へ
家畜を入れるため、あるいは市販のだめのいずれにかか
わらず、輸入された家畜類は、試験され、そしてＩ　Ｂ
ＲＶのキャリヤーでないことを示すことが要求される。
すなわち、動物はＩＢＲＶについて血清陰性でないかぎ
り輸入できない。
現在の殺したおよびＭＬＶ　　ＩＢＲワクチンでは、輸
送のストレスを伴う病気から動物を保護するか、あるい
は風土病の領域におけるＩ　ＢＲＶ惑染の環境によって
感受性動物にワクチン接種しなくてはならない生産者は
、家畜のワクチン接種がＩＢＲＶについて陽性の血清学
的試験を生ずるので、苛酷な経済的不利益を受ける。保
護を増大するだめの再ワクチン接種は、Ｉ　ＢＲＶの抗
体の力価をさらに増加するであろう。結局、価値ある家
畜を輸出する農業者の能力および国内で家畜を販売する
彼の能力は、制限され、そして、ワクチン接種を実施し
たか否かにかかかわらず、彼は不利益を被る。安全に投
与でき、Ｉ　ＢＲＶによって引き起こされる病気および
休眠の感染からウシを保護し、ビルシントへの逆転の可
能性が低いかあるいは存在せず、しかも、ＩＢＲＶにつ
いて陽性の血清学的試験を生成しない、ＩＢＲワクチン
は、家畜の輸出およびワクチン接種のプログラムの遂行
を、権益の恐れによって妨害されずに、可能とするであ
ろう。次いで、このような生産者は彼自身の飼育場内の
損失を最小とし、同時にそれぞれの抑制手段によって動
物の健康を維持できるであろう。
本発明に実施態様は、また、これらの要求を満足するた
めに開発された。
ＩＶ、ＩＢＲＶのゲノム ＩＢＲＶ株のゲノムは、線状の、二本鎖の、非円形的に
置換された、大きさがほぼ１３５〜１４０キロ塩基（以
後、ｒｋ　ｂＪ　）であるＤＮＡ分子から成る。電子Ｈ
＠鏡によりおよび制限ヌクレアーゼを使用するＩＢＲＶ
のゲノムの分析は、それらが大きさが約１３ｋｂである
、短い独特（以後、ｒｕｓ」）配列と表示するＤＮＡ配
列から成ることが示された。Ｕ、配列は倒立した反復配
列および末端配列（以後、それぞれ、ｒＩＲ，Ｊおよび
ｒＴＲｓ」）によって境界が定められ、それらの各々は
約１１．５ｋｂの大きさである。他の独特配列、すなわ
ち、約１００ｋｂの大きさの長い独特（以後「ＵＬ」）
配列、は、ＤＮＡ分子からなる」ハンマーシュミット（
Ｈａｍｍｅ　ｒ　ｓｃｈｍｉｄｔ）、Ｗら、Ｊ、Ｖｉｒ
ｏｌ、、５８：４３−４９　（１９８６）；工ンジエル
ス（ＥｎｇｅｌＳ）ら、Ｖｉｒｕｓ　　Ｒｅｓ、、６：
５７　７３（１９８６／８７）；およびメイフィールド
（Ｍａｙｆ　ｉｅ　１ｄ）ｊ、Ｅ、　ら、Ｊ、Ｖｉ　ｒ
ｏ　１．．４７４２５９−２６４　（１９８３））、こ
のゲノムの構造は、クラスＤヘルペルウイルスを例示し
、そして、また、仮性狂犬病ウィルス（以後ｒＰＲＶ」
）、ウマヘルベルウイルスｌ型および３型、および水痘
−帯状ベルベルウィルス中に見いだされる。このような
ゲノム構造の結果は、ＵＬに関してＵ、を逆転して、２
つのＤＮＡ分子の異性体の構造に導く能力である。いく
つかのＩＢＲＶ株の物理的地図は、制限エンドヌクレア
ーゼＨｉｎＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、Ｈｐａｌ、ＥｃｏＲＩ
およびＢｓｔＥＩＩについて確立された。ｒ　ＢＲＶ株
の制限エンドヌクレアーゼのパターンに８ける特定の差
は３つの異なる群の区別を可能としたが、これらは疫学
的特徴と相関関係をもたない［Ｖｉｒｏｔ、、５８：４
３　４９　（１９８６）；エンジエルス（Ｅｎｇｅｌｓ
）ら、Ｖｉｒｕｓ　　Ｒｅｓ、、６：５７　　７３　　
（１９８６／８７）］　　。
ＩＢＲＶは５０〜１００遺伝子をエンコードするが、ウ
ィルス遺伝子はＩ　ＢＲＶゲノムの物理的地図上に位置
した。ＩＢＲＶ　　ｔｋ遺伝子は、第１図に示すように
、ＨｉｎＩＩＩ−Ａ制限断片内にや＜０．４７地図単位
に位置する（また、米国特許筒４，７０３．０１１号の
第１図参照）。糖タンパク質ｇＩをエンコードするＩＢ
ＲＶ遺伝子は、また、Ｈｉｎｌｌｌ−Ａ中において、Ｉ
ＢＲＶ　　ｔｋ遺伝子の左に、はぼ０．４５〜０．４３
２地図単位において認められた［ローレンス（１ａｗｒ
ｅｎｃｅ）　、Ｗ、Ｃ，ら、Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　ｌ。
６０　：　４０５−４１４　（１９８６））。
本発明の１つの面は、他の糖タンパク質遺伝子、すなわ
ち、ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩの地図の位置の同定を伴う。
ここに表わすデータによると、ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ遺
伝子は、Ｉ　ＢＲＶのＨｉｎＩＩＩｉ８よびＢａｍＨＩ
−Ｅ断片中において約０゜１１〜０．１２地図単位に認
められる（第１図参照）。
Ｖ、ＩＢＲＶ糖タンパク質 現在まで研究したたいていのヘルペスウィルスのように
、ＩＢＲＶは２５より多い構造ポリペプチドを特定する
［ミスラ（Ｍｉ　ｓ　ｒａ）　、Ｖ、ら、Ｊ、Ｖｉ　ｒ
ｏ　１．．４０　：　３６７　３７８　（１９８１）；
およびヴアン・ドルネンーエン・リッチルーパン・デン
拳ハーク（Ｖａｎ　　Ｄｒｕｎｅｎ−ｅｎ　　Ｌｉｔｔ
ｅｌ−ｖａｎ　　ｄｅｎ　　Ｈｕｒｋ）、Ｓ、　　ら、
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５９：４０１−４１０　（１９８６
）］。これらのポポリペブチのうちで、現在まで、ｌＯ
またはそれより多い糖タンパク質種が同定された。ウィ
ルス特異的糖タンパク質歯、宿主細胞の血漿膜中に組み
込まれており、そして究極的にケイリオンエンベローブ
の構成成分となるので、宿主−ウィルスの関係において
重要な役割を演する。後者の能力において、それらは認
識、結合、および感受性細胞中のウィルスの侵入、シン
シチウムの形成、およびＩＢＲＶの感染に対するウシ免
疫応答の異なる応答、例えば、ウィルス能力において中
和応答感染した細胞の免疫破壊において重要な役割をも
つ。
単一特異的抗血清およびモノクローナル抗体を使用する
最近の免疫沈澱の実験によると、次の共沈する糖タンパ
ク質の３つの組み：　　（１）１８０および９７キロダ
ルトン（以後ｒｋＤ」）の分子量の糖タンパク質；１５
０ｋＤおよび７７ｋＤの分子量の糖タンパク質；および
（３）１３０ｋＤ、７４ｋＤ８よび５５ｋＤの分子量の
糖タンパク質は、ＩＢＲＶエンベロープの主要な成分で
あることが示された［マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）
、Ｒ，Ｌ、　ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５’　　ニア４５
７５３　（１９８６）］。これらの糖タンパク質は、ま
た、Ｉ　ＢＲＶ感染しＩ：細胞の表面に見いだされ、そ
して中和性単一特異的抗血清およびモノクローナル抗体
と反応する。非還元的条件下の分析により、７４ｋＤお
よび５５ｋＤの分子量の糖タンパク質は、ジサルファイ
ド結合を介して、相互作用して、１３０ｋＤの分子量の
分子量の糖タンパク質、ＩＢＲＶ　　ｇｒと表示する、
を形成することがしめされた［ヴアン・ドルネン・リッ
チルーパン０デン０ハーク（Ｖａｎ　　Ｄｒｕｎｅｎ　
　Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ　　ｄｅｎ　　Ｈｕｒｋ）、ｓ
、　　ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５９：４０１　４１０（
１９８６）］。部分的タンパク質加水分解によると、ま
た、１８０ｋＤの分子量の糖タンパク質は９７ｋＤの分
子量の糖タンパク質の二量体の形態、ＩＢＲＶ　　ｇｌ
ＩＩと表示する、であること、および１５０ｋＤの分子
量の糖タンパク質は７７ｋＤの分子量の糖タンパク質の
二量体の形態、ＩＢＲＶ　　ｇＩＶと表示する、である
こと、しかしこれらの二量体はジサルファイド結合によ
って結合していないことが示された。
さらに、約１１５ｋＤ、６４ｋＤおよび４５ｋＤの分子
量の小さい糖タンパク質、および約１０７ｋＤの分子量
の非グリコジル化タンパク質は、精製したＩＢＲＶ粒子
から、洗浄剤の処置によって除去される。■１５ｋＤの
分子量の塘タンパク質、ＩＢＲＶ　　ｇｌＩと表示する
、は、ＩＢＲＶに対するモノクローナル抗体によって沈
澱するので、ウィルス特異的であるように思われる。し
かしながら、６４ｋＤおよび４５ｋＤの分子量の糖タン
パク質は、抗ＩＢＲＶ回復期抗血清によって沈澱されな
い。６４ｋＤの分子量の糖タンパク質に対する抗血清は
感染しない細胞リゼイトから幾つかの沈澱物を沈澱させ
、これにより６４ｋＤの分子量の糖タンパク質および、
多分、４５ｋＤの分子量の糖タンパク質はＩ　ＢＲＶヴ
イケインエンベロープに関連する細胞由来のタンパク質
であることが示唆される。
ＩＢＲＶＭタンパク質または糖タンパク質複合体の各々
に対する抗原的に区別される前駆体は、モノクローナル
抗体によって同定された。ＩＢＲＶ　　ｇｌのための前
駆体は、約１１７ｋＤおよび６２ｋＤの分子量を有する
。ＩＢＲＶ　　ｇＩＩ、ＩＢＲＶ　　ｇＩＭおよびＩＢ
ＲＶ　　ｇｌＶの前駆体は、それぞれ、約１００ｋＤ、
６９ｋＤおよび６３ｋＤの分子量を有する。これらの前
駆体はエンド−β−アセチルグルコサミニダーゼＨの処
理に対して感受性であり、これによって、それらは、そ
れぞれ、約１０５ｋＤ１９０ｋＤ、６１ｋＤおよび５８
ｋＤの見掛けの分子量を有した、ＩＢＲＶ　　ｇｌ、Ｉ
ＢＲＶ　　ｇｌＩ、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩおよびＩＢＲ
Ｖ　　ｇＩＶの一次の、非グリコジル化前駆体の同時翻
訳グリコジル化によって発生した、部分的にグリコジル
化された、高級マンノース型中間体の形態を表わす［ヴ
アン・ドルネン・リッチル−パン・テン・ハーク（Ｖａ
ｎＤｒｕｎｅｎ　　Ｌｉｔｔｅｌ−ｖａｎ　　ｄｅｎＨ
ｕｒｋ）、Ｓ、　　ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ−１５９：４０
１−４１０　（１９８６）］。
今回、ヘルペスウィルスにおいて、ｌより多い糖タンパ
ク質は、感染の防止および感染からの回復を助ける、ウ
ィルス中和性抗体および細胞障害性リンパ球を誘発する
ことが認められた。例えば、単純性庖疹ウィルスｌ型（
以後「Ｈ５Ｖ−１」）糖タンパク質、ｇＢ、ｇＣ，ｇＤ
およびｇＥの各々に対する単一特異的抗血清は、ウィル
スを中和し、そしてウィルス感染した細胞の補体依存性
細胞溶解を仲介することができる［ノリルド（Ｎ。
ｒｒｉｌｄ）、Ｂ、　　ら、Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．．３
２：　７４１−７４８　（１９７９）］。同様に、単純
性庖疹ウィルス２型（以後ｒＨｓＶ−２）の糖タンパク
質、ｇＢ、ｇＣＳ　ｇＤおよびｇＥに対するモノクロー
ナル抗体は免疫溶菌を仲介する［パラカントラン（Ｂａ
ｒａｃｈａｎｄｒａｎ）、Ｎ。
ら、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、、３’　　：１１３２
−１１３７　（１９８２）］。さらに、中中和性体はＰ
ＲＶ＠タンパク質ｇＩ　ｒ、ｇ９２、およびｇｐ５０の
各々に対して産生される。さらに、ＰＲＶ　　ｇｐ５０
またはＰＲＶ　　ｇ９２のいずれかに対して向けられた
モノクローナル抗体と使用する動物の受動免疫化は、動
物を野生型感染から保護する［ハングル（Ｈａｍｐ　Ｉ
）　、Ｈ，ら、Ｊ。
Ｖｉ　ｒｏ　１．．５２　：　５８３−５９０　（１９
８４）；ベン・ポラト（Ｂｅｎ　　Ｐｏｒａｔ）、Ｔ、
　ら、Ｖｉｒｏｌ、、１５４：３２５　３３４　（１９
８６）；およびウエセイン（Ｗｅｔｈｅｎ）、Ｌ。
Ｍ、に、ら、ＶｉｒｕｓＲｅｓ、、４二１９２９　（１
９８５）］、　　■ＢＲｖ＋：関スルト、主要な糖タン
パク質、ｇｌｌ　ｇｌｌＩおよびｇＩＶｌｆ、ウシにお
いて高いレベルの中和性抗体を誘発し、そして抗体依存
性細胞障害に参加する［バビウク（Ｂａｂｉｕｋ）、Ｌ
、Ａ、　　ら、Ｖｉ　ｒｏ　１．、＋５９：５’　−６
６（１９８７）］。
ワクチン接種した動物をフィールド株で感染した動物と
区別する血清学的マーカーを有するワクチンを開発する
ために、本発明において、ウィルスの複製のために非必
須であるＩ　ＢＲＶ糖タンパク質遺伝子を同定すること
がひつようであった。
ＩＢＲＶ　　ｇｌ糖タンパク質は、Ｈ５Ｖ−１ｇＢ糖タ
ンパク質ＥロウレンシンＬａｕｒｅｎｃｅ）、Ｗ、Ｃ，
ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６０：４０５−４１４　（１９
８６）］およびＰＲＶ　　ｇ１１１！タンパク質［メツ
テンレイク−（Ｍｅｔｔｅｎ　ｌ　ｅ　ｉ　ｔ　ｅ　ｒ
）　、Ｔ、　Ｃ，ら、Ｖｉｒｏｌ、、１５２　：　６６
−７５　（１９８６）］に相当するように思われる。さ
らに、ＰＲＶ　　ｇｒＩ糖タンパク質は、ＩＢＲＶ　　
ｇｌ糖タンパク質のように、ジサルファイド結合を介し
て共有結合した、約７ＯｋＤおよび５８ｋＤの分子量の
ポリペプチドから成る。さらに、ＰＲＶ　　ｇＩＩ糖タ
ンパク質は、整列したＨ３Ｖ−１ｇＢと５０％のアミノ
酸の相同性を共有し、そしてＰＲＶ　　ｇｌｌ糖タンパ
ク質は感染した細胞からＨ３Ｖ−１ｇＢＭタンパク質を
沈澱させる［ロビンス（Ｒｏｂｂｉｎｓ）、Ａ、に、　
ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６１：２６９１−２７０１　　
（１９８７）］　。しかしながら、Ｈ３Ｖ−１ｇＢ遺伝
子村よびＰＲＶ　　ｇＩｒ遺伝子はウィルスの復製のた
めに必須であることを示す多数のデータが存在する［ス
ピア−（Ｓｐｅａｒ）、Ｐ、Ｇｏ、ヘルペスウィルス（
Ｔｈｅ　　Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ）、３：３１５
−３５６　（１９８５）、マーリン（Ｍａｒｌｉｎ）、
Ｓ。
Ｄ、ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５３：１２８　１３６　（
１９８５）、ロウシンス（Ｌａｗｒｅｎｃｅ）、Ｗ、Ｃ
，ら、Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．．６０　：　４０５−４１
４　（１９８６）；およびブジク（Ｂｚｉｋ）、Ｄ、Ｊ
、　　ら、Ｖｉｒｏｌ、、１３７：１８５−１９０　（
１９８４）］。こうして、対応するＩＢＲＶ糖タンパク
質をエンコードするＩＢＲＶ遺伝子、すなわち、ＩＢＲ
Ｖ　　ｇｌは、ＩＢＲＶの血清学的マーカーとして有望
な候補であると思われない。
ｇＣ糖タンパク質を発現できない生存し得るＨ５Ｖ−１
およびＨ３Ｖ−２の突然変異が分離された［ホランド（
Ｈｏｌｌａｎｄ）、Ｔ、Ｃ，ら、Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．
．５２　：　５６６　５７４　（１９８４）；ドレイバ
ー（Ｄｏｒａｐｅｒ）、Ｋ、Ｇ。
ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５１：５７８　５８５（１９８
４）；ホｖ　（Ｈｏｍａ）　、Ｆ、Ｌ、ら、Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ、、５８：２８１　２８９（１９８６）：お
よびジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、Ｄ、Ｃ。
ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、５８：３６−４２（１９８６）
］。同様に、ＰＲＶ　　ｇ９２遺伝子中に欠失をもつＰ
ＲＶ突然変異、ＰＲＶ　（ｄ　Ｉ　ｇ９２／ｄ　ｌ　ｔ
　ｋ）が分離された［キット（Ｋｉｔ）、Ｓ。
ら、Ａｍ、Ｊ、Ｖｅ　ｔ、Ｒｅ　ｓ、　、４８　：　７
８０−７９３　（１９８７）；および米国特許出願第８
２３．４３９号、１９８６年１月２８日提出１゜ＰＲＶ
　（ｄ　ｌ　ｇ９２／ｄ　ｌ　ｔ　ｋ）は、機能的ＴＫ
または抗原性ＰＲＶ　　ｇ９２ポリベズチドを発現しな
いが、ウサギ皮膚およびブタ気管細胞中でｌＯ”ｐ、ｆ
、ｕ、７ｍ　１以上の力価に複製する。
さらに、ＰＲＶ　（ｄ　Ｉ　ｇ９２／ｄ　Ｉ　ｔ　ｋ）
で感染した細胞からの抽出物は抗ｇ９２モノクローナル
抗体を産生ぜず、そしてＰＲＶ　（ｄ　Ｉ　ｇ９２／ｄ
ｌｔｋ）で感染したブタはＰＲＶ　　ｇ９２ポリペプチ
ドを産生じないが、他のＰＲＶポリペプチドに対する抗
体産生する。さらに、安全および効能の研究により、Ｐ
ＲＶ　（ｄ　ｌ　ｇ９２／ｄ　Ｉ　ｔ　ｋ）はブタおよ
びマウスにおいて免疫応答を誘発し、そしてそれらをＰ
ＲＶのビルシント株の致死的投与量から保護する〔キッ
ト（Ｋｉｔ）Ｓ、ら、「チミジンキナーゼおよび糖タン
パク質の遺伝子中に欠失をもつ遺伝子操作した仮性狂犬
病ウィルスのワクチン（Ｇｅｎｅｅｉｃａｌｌｙ　　Ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　　Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ　　
Ｖｉｒｕｓ　　Ｖａｃｃｉｎｅ　　Ｗｉｔｈ　　Ｄｅｌ
ｅｔｉｏｎｓ　　ｉｎ　　Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　　Ｋｉ
ｎａｓｅ　　　ａｎｄ　　　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ
　　　Ｇｅｎｅｓ）、　Ｖａｃｃｉｎｅ、　　８７、３
４５−３４９ページ、コールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−、コールド・ハーバ−（ｃｏｌｄ　　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂ、、ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂ）（１９８７）］、ＰＲＶ　　
ｇ９２遺伝子の欠失は、ブタまたはマウスにおける保護
的免疫の応答またはウィルス中和性抗体を発生するＰＲ
Ｖ　（ｄ　Ｉ　ｇ９２／ｄ　Ｉ　ｔ　ｋ）の能力を減少
しない。しかしながら、ＰＲＶ　　ｇ９２の欠失ツタめ
、ＰＲＶ　（ｄ　１ｇ９２／ｄ　Ｉ　ｔｋ）で免疫化し
た動物はＰＲＶのフィールド株で感染したものから血清
学的に区別することができる。
それゆえ、ＰＲＶ　（ｄ　Ｉ　ｇ９２／ｄ　Ｉ　ｔ　ｋ
）は安全な効能のあるワクチンを例示する［米国特許出
願第８２３，４３９号、１９８６年１月２８日提出Ｊ０
こうして、本発明において、必ずしも必要でないＩＢＲ
Ｖ糖タンパク質マーカー遺伝子のだめのよりすぐれた候
補は、Ｈ３ＶｇＣ遺伝子およびＨ５Ｖ　　ｇ９２遺伝子
に相当するＩ　ＢＲＶ遺伝子でありうると推定された。
培養した細胞中のＩ　ＢＲＶの複製のために必須でない
他の糖タンパク質遺伝子は、また、ＩＢＲＶ血清学的マ
ーカーとして有用でありうる。必須でないＩＢＲＶ糖タ
ンパク質遺伝子は、多分、ＩＢＲＶゲノムのＵ、断片中
に位置する。なぜなら、Ｈ５Ｖ−１糖タンパク質遺伝子
ｇＥ（Ｕｓ８）、ｇＧ（Ｕｓ４）およびｇｌ（Ｕｓ７）
は、Ｈ９Ｖ−ｌゲノムのＵ５部分中に認められ、そして
、それは、組織培養物中の少なくともある細胞系におい
て、ウィルスの複製のために「必ずしも必要でない（ｄ
ｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ）Ｊ　　［ロングネッ力−（Ｌｏ
ｎｇｎｅｃｋｅｒ）、Ｒ，ら、５ｃｉｅｎｃｅ）、２３
６：５７３　５７６（１９８７）］；そしてＰＲＶ糖タ
ンパク質遺伝子、ｇＩ、ｇｐ６３およびｇＸはＰＲＶゲ
ノムのＵ、セグメント中に位置し、そして、それらは、
また、培養した細胞中のウィルスの複製について「必ず
しも必要でなイ）［ペトロブスキス（Ｐｅ　ｔ　ｒｏｖ
ｓｋ　ｉｓ）、Ｅ、Ａ、　　ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６
０：１１６６−１１６９　（１９８６）；ペトロブスキ
ス（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉｓ）、Ｅ、Ａ、　　ら、Ｖｉｒ
ｏｒ、、１５９　：　１９３−１９５　　（１９８７）
；メツテンレイク−（ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ）、Ｔ
、Ｃ，Ｉａ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６１：２７６４−２７
６９　（１９８７）：８よびトムセン（Ｔｈｏｍｓｅｎ
）、Ｄ、Ｒ，ら、Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．．６１：２２９
−２３２　　（１９８７）］　　。
本発明において、位置を同定しかつ認めること、および
ＩＢＲＶ　　ｇｌｒＩ遺伝子をクローニング死活配列決
定することが、最初に可能となった。
さらに、本発明において、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子
が培養した細胞中のウィルスの複製のために必ずしも必
要でないことが、最初に決定された。
その結果、本発明において、ＩＢＲＶ　　ｇｌｒＩ遺伝
子中で突然変異を遺伝子的に操作してＩＢＲＶを提供す
ることが、最初に可能となり、ここでこのようなＩ　Ｂ
ＲＶでワクチン接種した動物が、ＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ
　Ｔ遺伝子中の欠失および／または挿入のために、ＩＢ
ＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子にょってエンコードされた抗原
性ポリペプチドを産生ずることができず、そしてＩＢＲ
Ｖ　　ｇＩＩＩ抗原の産生に逆転できない。その結果、
このようなＩＢＲＶでワクチン接種した動物をＩ　ＢＲ
Ｖのフィールド株で感染した動物特別して、検疫の手段
の適用による、ＩＢＲの病気の根絶を可能とすることが
できる。さらに、本発明において、前述のように、フィ
ールド株と区別することができ、かつｒＢＲの病気の広
がりの抑制において有効であるばかりでなく、かつまた
、それでワクチン接種した動物が、またＩＢＲＶ　　ｔ
ｋ遺伝子中の突然変異のために、ワクチンのウィルスの
キャリヤーとならず、そして病原性のフィールド株によ
る休眠の感染を獲得するようにならない、ＩＢＲワクチ
ンを提供することが、最初に可能となった。
本発明の目的は、ＩＢＲの広がりを抑制するうえで有効
なＩＢＲワクチンを提供することである。
本発明の他の目的は、それでワクチン接種した動物が、
ＩＢＲＶウィルスまたはＩ　ＢＲＶフィールド株のいず
れのキャリヤーとなる傾向がすくないＩＢＲワクチンを
提供することである。
本発明のなを他の目的は、ＩＢＲＶワクチンのウィルス
がＩＢＲＶフィールド株および他のＩＢＲワクチンのウ
ィルスと区別されるＩＢＲＶワクチンを提供することで
ある。
本発明の他の目的は、それでワクチン接種した動物がＩ
　ＢＲＶフィールド株または他のＩＢＲワクチンのウィ
ルスで感染した動物と区別されうるＩＢＲワクチンを提
供することである。
本発明のなを他の目的は、ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｒ遺伝子
における欠失および／または挿入の突然変異の結果、抗
原性ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩポリペプチドを産生できない
Ｉ　ＢＲＶを提供することである。
本発明のなお他の目的は、ＩＢＲＶｔｋ遺伝子の解読配
列ちゅの突然変異の結果、機能的ＴＫを産生ずることが
できず、かつＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子に８ける欠失
および／または挿入の突然変異の結果、抗原性ＩＢＲＶ
　　ｇｌｌＩポリペプチドを産生できない、ＩＢＲワク
チンを提供することである。
本発明の他の目的は、それでワクチン接種した動物がＩ
ＢＲＶ　　ｇｌＩＩ糖タンパク質に対する抗体を発現し
ない、ＩＢＲワクチンを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ｔｋゝに逆転することがで
きず、ｔｋ″″ウィルスと容易に区別され、そしてｇｌ
　Ｉ　Ｉ＋に逆転することができない、ＩＢＲウィルス
を提供することである。
本発明のなをさらに他の目的は、３４．５℃〜４０°Ｃ
の範囲の温度において効率よく複製することのできるＩ
ＢＲＶ、すなわち、温度抵抗性ウィルスを包含するウィ
ルスを提供することである。
本発明の追加の目的は、ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ遺伝子中
に欠失および／または挿入の突然変異を含有するＩ　Ｂ
ＲＶを産生する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、本発明の以下の詳細な説明から明
らかとなるであろう。
本発明の１つの実施態様において、前述の目的は、ＩＢ
ＲＶ　　ｇｌｆｌ遺伝子における欠失、挿入または欠失
および挿入の両者の結果、抗原性■ＢＲＶ　　ｇＴ　Ｉ
　Ｉポリペプチドを産生ずることのできないＩＢＲＶ、
および、（１）製薬学的に有効量の前記ウィルスおよび
（２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤からな
るＩＢＲ病気のためのワクチンによって達成された。
本発明の他の実施態様において、ＩＢＲＶは１、また、
ＩＢＲＶｔｋ遺伝子における突然変異の結果、機能的Ｔ
Ｋを産生ずることができない。
本発明のなお他の実施態様において、ＩＢＲＶ突然変異
は温度抵抗性ウィルスである。
前述の目的は、工程： （１）雑種プラスミドを構成し、前記プラスミドはクロ
ーニングベクターおよびＩＢＲＶのＤＮＡ断片からなり
、前記断片はＩＢＲＶ　　ｇ１Ｍ遺伝子の実質的にすべ
ておよびそのフランキング配列を含有し、 （２）ＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ　Ｉ遺伝子の実質的にすべ
てより少なくが存在すると同時に欠失に各側に隣接する
ＩＢＲＶ　　ＤＮＡ配列を保持するように、工程（１）
の雑種プラスミドからＤＮＡ配列を欠失し、 （３）、ＩＢＲＶ宿主細胞において、工程（２）の雑種
プラスミドを感染のｇｌ　Ｉ　Ｉ”　　　ＩＢＲＶＤＮ
Ａと同時トランスフェクションし、そして（４）工程（
３）において得られた子孫のウィルスをスクリーニング
してＩＢＲＶ突然変異を同定しかつそれを産生じ、前記
突然変異はＩＢＲＶｇｒ　Ｉ　Ｉ遺伝子における欠失の
結果抗原性ＩＢＲＶｇＩＩＩポリペプチドを産生ずるこ
とができない、 からなる、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子における欠失の
結果、抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌポリペプチドを産生
できないＩＢＲＶを産生する方法によって達成された。
ほかの実施態様において、異質ＤＮＡ配列を工程（２）
において欠失されたＩＢＲＶ　　ｇＩｒｌ遺伝子配列の
場所に挿入し、こうして抗原性ＩＢＲＶｇＩＩＩポリペ
プチドが産生されずかつ欠失したＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ
遺伝子の配列の各側にに隣接するＩＢＲＶ　　ＤＮＡ配
列が保持されるようにする。結局、工程（４）のＩ　Ｂ
ＲＶ突然変異は、ＩＢＲＶ　　ｇＴＩＩ遺伝子中に組合
わされた欠失および挿入の突然変異のために、抗原性Ｉ
ＢＲＶ＋ｄｌｌポリペズチドを産生ずることができない
。
さらに他の実施態様において、工程（２）は工程（２′
）と置換される：異質ＤＮＡ配列を工程（１）のプラス
ミド中に挿入し、こうしてこうして抗原性ＩＢＲＶ　　
ｇｌｌｌポリペプチドが産生されずかつ欠失したＩＢＲ
Ｖ　　ｇｌＩＩ遺伝子の配列の各側に隣接するＩＢＲＶ
　　ＤＮＡ配列が保持されるようにする。結局、工程（
４）のＩＢＲＶ突然変異は、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝
子中に組合わされた欠失および挿入の突然変異のために
、抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩポリペプチドを産生ずる
ことができない。
本発明の好ましい実施態様において、工程（３）の感染
のｇｌ　Ｉ　Ｉ”　　ＩＢＲＶ　　ＤＮＡは、機能的チ
ミジンキナーゼを産生ずることのできない■ＢＲＶ突然
変異から誘導し、こうして工程（４）の得られるｒ　Ｂ
ＲＶ突然変異は（ｋ−かつｇＩＩＩ−であるようにする
。
本発明のなを他の実施態様において、工程（３）の感染
のｇｌ　Ｉ　Ｉ”　　Ｉ　ＢＲＶ　　ＤＮＡ１ｔ温度抵
抗性ＩＢＲＶかも誘導し、こうして工程（４）の得られ
るＩ　ＢＲＶ突然変異が温度抵抗性かつｇＩＩＩ−であ
るようにする。
前述のように、前述の目的は、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺
伝子における欠失、挿入または欠失および挿入の両者の
結果、抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌＴＩポリペプチドを産生
ずることのできないＩＢＲＶ。
および、（１）製薬学的に有効量の前記ウィルスおよび
（２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤からな
るｒＢＲ病気のためのワクチンによって達成された。
本発明の他の実施態様において、ＩＢＲＶは１、また、
ＩＢＲＶ　　ｔｋ遺伝子における突然変異の結果、機能
的ＴＫを産生することができない。
本発明のなお他の実施態様において、ＩＢＲＶ突然変異
は温度抵抗性ウィルスである。
本発明の追加の実施態様において、前述の目的は、工程
： （１）雑種プラスミドを構成し、前記プラスミドはクロ
ーニングベクターおよびＩ　ＢＲＶのＤＮＡ断片からな
り、前記断片はＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ遺伝子の実質的に
すべておよびそのフランキング配列を含有し、 （２）ＩＢＲＶ　　ｇＴ　Ｉ　Ｉ遺伝子の実質的にすべ
てより少なくが存在すると同時に欠失に各側に隣接する
ＩＢＲＶ　　ＤＮＡ配列を保持するように、工程（１）
の雑種プラスミドからＤＮＡ配列を欠失し、 （３）、Ｉ　ＢＲＶ宿主細胞において、工程（２）の雑
種プラスミドを感染のｇｒ　Ｉ　Ｉ”　　ＩＢＲＶＤＮ
Ａと同時トランスフェクションし、そして（４）工程（
３）において得られた子孫のウィルスをスクリーニング
してＩＢＲＶ突然変異を同定しかつそれを産生し、前記
突然変異はＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子における欠失の結果
抗原性ＩＢＲＶｇＩＩＩポリペプチドを産生ずることが
できない、 からなる、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子における欠失の
結果、抗原性ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩポリペプチドを産生
できないＩＢＲＶを産生する方法・によって達成された
。
ほかの実施態様において、異質ＤＮＡ配列を工程（２）
において欠失されたＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ遺伝子配列の
場所に挿入し、こうして抗原性ＩＢＲＶｇＩＩＩポリペ
プチドが産生されずかつ欠失したＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ
遺伝子の配列の各側にに隣接するＩＢＲＶ　　ＤＮＡ配
列が保持されるようにする。結局、工程（４）のＩＢＲ
Ｖ突然変異は、ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子中に組合わ
された欠失および挿入の突然変異のために、抗原性ＩＢ
ＲＶｇＩＩＩポリペプチドを産生ずることができない。
さらに他の実施態様において、工程（２）は工程（２′
）と置換される：異質ＤＮＡ配列を工程（１）のプラス
ミド中に挿入し、こうしてこうして抗原性ＩＢＲＶ　　
ｇＴＩＩポリペプチドが産生されずかつ欠失したＩＢＲ
Ｖ　　ｇｌＩＩ遺伝子の配列の各側に隣接するＩＢＲＶ
　　ＤＮＡ配列が保持されるようにする。結局、工程（
４）のＩＢＲＶ突然変異は、ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝
子中に組合わされた欠失および挿入の突然変異のために
、抗Ｊ［性ＩＢＲＶ　　ｇｒ　Ｉ　Ｉポリペプチドを産
生ずることができない。
本発明の好ましい実施態様において、工程（３）の感染
のｇＩ　Ｉ　Ｉ”　　ＩＢＲＶ　　ＤＮＡは、機能的チ
ミジンキナーゼを産生ずることのできない■ＢＲＶ突然
変異から誘導し、こうして工程（４）の得られるＩＢＲ
Ｖ突然変異はｔｋ−かつｇＩＩＩ−であるようにする。
本発明のなを他の実施態様において、工程（３）の感染
のｇｌ　Ｉ　Ｉ”　　ＩＢＲＶ　　ＤＮＡは温度抵抗性
ＩＢＲＶから誘導し、こうして工程（４）の得られるＩ
ＢＲＶ突然変異が温度抵抗性かつｇｌＩＩ−であるよう
にする。
本発明のなお他の実施態様において、工程の（３）の感
染（７）ｇｌ　Ｉ　Ｉ”　　　ＩＢＲＶ　　ＤＮＡは温
度抵抗性ＩＢＲＶから誘導され、こうして工程（４）の
得られるＩ　ＢＲＶ突然変異は温度抵抗性かつｇＩＩＩ
−である。
ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ遺伝子はほぼ１，９００ｂｐの大
きさである（第３図参照）。本発明のＩＢＲＶｇＩＩＩ
突然変異は、例えば、次の工程によって産生することが
できる：　　（１）ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子の適当
な領域から７５〜１，５００ｂｐのＩＢＲＶ　　ＤＮＡ
断片を排除し、（２）解読配列の５′末端付近において
５．７．８、ＩＯおよび１ｌｂｐまたは約５０〜２００
ｂｐのＩＢＲＶＤＮＡを産生し、こうして翻訳リーディ
ングフレームを変更し、そしてＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩポ
リペプチドの合成を壊滅させ、（３）５０〜２００ｂｐ
のＩＢＲＶ　　ＤＮＡを欠失して、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩ
Ｉの主要なエピトープをエンコードするヌクレオチド配
列を排除し、（４）約１０〜２００ｂｐのＩＢＲＶ　　
ＤＮＡを欠失すると同時に異質ＤＮＡ配列を挿入し、こ
うしてポリリポソーム上で適切に処理、翻訳または翻訳
されない雑種ＲＮＡを産生じ、あるいは（５）異質ＤＮ
Ａ配列を挿入し、こうしてポリリポソーム上で適切に処
理、翻訳または翻訳されない雑種ＲＮＡを産生する。
欠失は、異なる方法、例えば、によって、産生すること
ができる＝　（１）はクローニングベクター中に挿入さ
れたＩＢＲＶ　　ｇＴＩＩ遺伝子を、１または２以上の
制限エンドヌクレアーゼで切断してＩＢＲＶ　　ｇｌｌ
ｌ遺伝子を２または３以上の部位において切断し、次い
で再結合してＩＢＲＶｇＩＩＩヌクレオチド配列を排除
するか、あるいはクローニングベクター中に挿入された
ＩＢＲＶｇｌＩＩ遺伝子を１つの部位において切断し、
次いでＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ遺伝子を制限エンドヌクレ
アーゼ処理して、ギャップを拡張しかつ切断に対してヌ
クレオチド５′および／または３を除去し、次いで再結
合する。
本発明において、欠失突然変異、ＩＢＲＶ（ＮＧ）　ｄ
ｌＬｋｄｌｇＩ　Ｉ　Ｉ　、下に詳述する、は、ＡＴＧ
翻訳開始コドンを除外して、ＩＢＲＶ　　ｇｉｌｌ遺伝
子の解読配列の実質的にすべてを含有する１゜５３ｋｂ
のＡ　ｐａ　Ｉ断片を排除することによって生成した（
第３図参照）。この欠失の大きさは、次のことを保証し
た：　（１）ワクチン接種した動物においてＩＢＲＶ　
　ｇｌｌＩ抗体の誘発することができるか、あるいはＩ
　ＢＲＶのフィールド株で感染した動物において生成さ
ＲたＩＢＲＶ　　ｇＩＩ■糖タンパク質に対する抗血清
と反応することができる、抗原決定基、例えば、エピト
ープを使用してポリペプチドは作れないであろう；そし
て（２）逆転、すなわち、ＩＢＲＶ　　ｇＩ　Ｉ　Ｉ生
成ウィルスへの逆突然変異は事実状不可能であった。本
発明において、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ欠失突然変異は、
それらの逆転の頻度が低いために、好ましい。
前述のように、他の実施態様において、欠失および／ま
たは挿入の突然変異は、欠失したＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝
子配列の場所に、あるいはＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子配列
に加えて、異質ＤＮＡ配列を含有することができる。
ここで使用するとき「異質ＤＮＡ配列」は（１）由来に
無関係に、遺伝子をエンコードしないＤＮＡ配列、すな
わち、非解読ＤＮＡ配列、例えば、ウィルス、真核動物
または原核動物の非解読配列、およびオリゴヌクレオチ
ドリンカーを包含する；（２）ＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ　
Ｉ遺伝子以外の遺伝子をエンコードするＤＮＡ配列、す
なわち、解読ＤＮＡ；または（３）ＩＢＲＶゲノム上の
その正常位置からＩＢＲＶゲノム上の他の位置に転移し
た解読ＤＮＡ配列、例えば、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝
子中に転移したＩＢＲＶｔｋ遺伝子またはＩＢＲＶ　　
ｇｌ遺伝子。
オリゴヌクレオチドリンカーは、一般に、８〜ＩＯヌク
レオチドの長さであるが、これより長い、例えば、約５
０ヌクレオチドであるか、あるいは短い、例えば、４．
５または７ヌクレオチドであることができる。オリゴヌ
クレオチドリンカーの好ましい長さは約８〜ｌＯヌクレ
オチドである。
オリゴヌクレオチドリンカーのＤＮＡ配列は臨界的では
ない。同様に、本発明において使用する他の異質ＤＮＡ
配列の大きさおよび配列は臨界的ではない。一般に、オ
リゴヌクレオチドリンカー以外の異質ＤＮＡ配列の大き
さは約０．５〜５．０ｋｂの長さである。例えば、Ｈ３
Ｖ−１，Ｈ５Ｖ−２、およびマーモセットヘルペスウイ
ルスｔｋ遺伝子は約１．３ｋｂの長さである；ニワトリ
およびヒトのｔｋ遺伝子は、それぞれ、約２．９および
４゜２ｋｂの長さである；　ｎｅｏ”遺伝子は約１．０
ｋｂの長さである；そして１ａｃＺ遺伝子さは約３．０
ｋｂの長さである。
異質ＤＮＡ配列をプラスミドＤＮＡ中に挿入する方法は
、使用する異質ＤＮＡ配列のタイプに依存する。オリゴ
ヌクレオチド中の１または２以上の部位を含有するバリ
ンドロンドローム（ｐａｌｉｎｄｒｏｍａ）の二本鎖リ
ンカ−［二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎ　ｅ
ｖ　　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　　Ｂ　１ｏｌａｂｓ）　　（
以後、Ｎ　ｅｗ　　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　　Ｂ　１ｏｌａ
ｂｓ）　］　は、よく知られた手順によって挿入であさ
る［マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）　、　Ｔ、ら、分
子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｊａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）　　（以後、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラドリー
ス（１９８２）］。異質ＤＮＡ配列は、また、末端トラ
ンスフェラーゼを使用して相補的ホモポリマーで末端を
ティリング（Ｌａｉｌｉｎｇ）することによって、プラ
スミドＤＮＡ中に挿入することができる［マニアチス（
Ｍａｎｉａｔｊｓ）　、　Ｔ　−ら、Ｍ。
Ｉｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ、コールド・スプリ
ングＨハーバ−・ラボラドリース（１９８２）］。異質
ＤＮＡ配列の長さを賢明に選択することによって、フレ
ームシフトの突然変異をＩＢＲＶ　　ｇｉｌｌ遺伝子遺
伝子中成し、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子内の欠失の効
果を増強することができる。
工程（１）のＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子の実質的にす
べておよびそのフランキング配列からなる雑種プラスミ
ドを構成するために、本発明において使用する特定のク
ローニングベクターは、クロユングベクターが選択的傾
向、例えば、薬物抵抗性、の遺伝情報を指定する遺伝子
を含有するかぎり、臨界的ではない。このようなりロー
ユングベクターの例は、ｐＢ　Ｒ３２２およびｐＢＲ３
２２に基づくベクター［セキグチ、Ｔ、ら、遺伝子（Ｇ
ｅｎａ）　　（以後、Ｇｅｎｅ）　、２１　：　２６７
−２７２　（１９８３）］、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、
ｐＫＨ４７、ｐ（ＪＣ１８およびｐＵｃ１９［ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　　
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　
　（以後、Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　
　Ｌ　ａｂ。
ｒａｔｏｒｉｅｓ）　、ｐＢ　Ｒ３２８およびｐＨＣ７
９［べ一リンガー・マンハイム・バイオケミカルス（Ｂ
　ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　　Ｂ　ｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　　（以後、Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ）　］　、ｐＫＢＩＩおよびｐＫＳＶ−１０［Ｐ−Ｌ
　　バイオケミカルス（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
　　（以後、Ｐ−ＬＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　］
　、ｐＭＡ　Ｒ４２Ｑ　（オオツカ、Ｈｏら、Ｖｉｒｏ
ｌ、、１１３：１９６−２１３　（１９８１）］　およ
びオリゴ（ｄＧ）ティルトｐＢＲ３２２［ニュー・イン
グランド・ニュークリアー（Ｎｅｖ　　Ｅ　ｎｇｌａｎ
ｄ　　Ｎ　ｕｃｌｅａｒ）　　（以後、Ｎｅｗ　　Ｅｎ
ｇｌａｎｄ　　Ｎｕｃｌｅａｒ）　］である。ｐＢＲ３
２２は本発明における好ましいクローニングベクターの
１つである。なぜなら、１１．１ｋｇの断片はＩＢＲＶ
ｇＩＩＩ遺伝子を含有し、そしてｐＢ　Ｒ３２２の単一
のＨｉｎｄｌ１１部位においてクローニングできるから
である（第２１３Ｕ）。同様に、プラスミドｐＬＡＨ−
Ｉ中に示されている２、５ｋｂのＥｃｏＲｒ／ＢａｍＨ
Ｉ断片は、ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ遺伝子を含有し、そし
てｐＢＲ３２２の独特Ｂ’ａｍＨＩおよびＥｃｏＲ１部
位においてクローニングすることができる。プラスミド
ｐＵｃＩ８は本発明において好ましい他のクローニング
ベクターである。なぜなら、ｐＵｃ１８のクローニング
部位は、容易に修飾して、例えば、ｐＵＣ１８ｄｌＥｃ
ｏＲＩの生成においてＥｃｏＲＩお欠失し、こうして得
られるプラスミドはｐＬＡＨ−１のＨ４ｎｄｌ　Ｉ　Ｉ
断片に対して７．６ｋｂのＫｐｎｌの挿入のためのＫｐ
ｎｌおよびＨ４ｎｄｌｌｌクローニングベクターを含有
するようにすることができるからである。
本発明の雑種プラスミドを増殖するために使用する特定
の宿主は、本発明に対して臨界的ではない。このような
宿主の例は、大腸菌（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）（以後、Ｅ、
ｃｏｌｉ）Ｋ１２　　ＲＲＩ　　［ポリバー（Ｂｏｌｉ
ｖａｒ）　、Ｆ　、　　ら、Ｇｅｎｅ１２　：　９５　
１１３　（１９７７）］　　；Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＫＩ２
　　ＨＢＩＯＩ　　（ＡＴＣＣＮｏ、３３６９４）；Ｅ
、ｃｏｌｉ　　ＭＭ２１　（ＡＴＣＣＮｏ、３３６７８
０）；およびＥ。
ｃｏｌｉ　　ＤＨＩ　（ＡＴＣＣＮｏ、３３８４９）。
Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＲＲＩは、好ましい宿主で
あり、そしてＦ−ｈｓｄ　　ＲＨｓｄ　　Ｍ遺伝子型を
有する。
同様に、別のベクター／クローニング系、例えば、次の
ものを使用できる：Ｅ、ｃｏｌｉまたはサツ力ロミセス
ーセレビシアエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　　（以後、Ｓ　ａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、または両者中
で増殖するプラスミド、Ｂ、スブチリス（ｓｕｂｔＮｕ
ｓ）　　（以後、Ｂ　、　５ｕｂｔｉｌｕｓ）中で増殖
するプラスミドベクター、またはイーブン（ｅｖａｎ）
ベクター、例えば、動物、例えば、マウス中で増殖する
ウシ乳頭腫ウィルス（ＡＴＣＣＮｏ、ｃＲＬ　　２６１
６）Ｅエルダー（Ｅ　Ｉｄｅｒ）、Ｊ、　Ｔ、　、Ａｎ
ｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎ、　、１５　：　２９５−３４
０　（１９８１）；ウシ（Ｕｒａ）、Ｒ−ら、メソッズ
・イン・エンジモロジ−（Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥ
　ｎｚｙｒｎｏＩｏｇｙ）　　（以後、Ｍ　ｅｔｈｏｄ
ｓ　　ｉｎ　　Ｅ　ｎｚｙｍｏｌ。
ｇｙ）、［組換え体り、ＮＡＪ　、Ｖｏｌ、　　ｌ　Ｏ
ｌ、部Ｃ（アカデミツク・プレス、ニューヨーク）（１
９８３）］。
ここで使用するとき、「フランキング配列」は、ＩＢＲ
Ｖ　　ｇｌ　Ｉ　Ｉ遺伝子解読配列から上流、下流また
は上流および下流の配列を意味する。上流の配列は転写
制御シグナル、すなわち、プロモーターおよびエンハン
サ−を含有し、ここで　ＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子の下流
の配列は転写停止およびポリアデニル化のシグナルを含
有する。
工程（＋）および（２）の雑種プラスミド中に存在しな
くてはならない精確なＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ遺伝子配列
は、欠失および／または挿入のために選択した配列、お
よび欠失および／または挿入の突然変異の遺伝子工学に
おいて使用すべき制限エンドヌクレアーゼおよびエキソ
ヌクレアーゼに依存するであろう。
工程（１）において要求されるプラスミド中の欠失およ
び／または挿入に隣接する特定のＩＢＲＶ　　ＤＮＡ配
列は、雑種プラスミド中の欠失および／または挿入の特
異性に依存するであろう。
股に、欠失および／または挿入の３′および５′部位の
両者に隣接するＩＢＲＶ　　ＤＮＡ配列の大きさは少な
くとも約４００ｂｐである。下に詳述するプラスミドｐ
ＬＡＨＫｄｌＡｒｙａｌ　（第２図参照）において、欠
失の両側の３″および５″配列は、約１．６ｋｂおよび
４．５ｋｂの長さである。
本発明において、工程（１）のＩＢＲＶ　　ｇ１１？遺
伝子および工程（３）のｇｌｌｌ”　　ＩＢＲＶ　　Ｄ
ＮＡを得るために出発物質として使用する特定のＩＢＲ
Ｖ株は、臨界的ではない。このような株の例は、Ｌｋ”
　　ＩＢＲＶ株およびｔｋ−ＩＢＲＶ株を含有する。こ
れらの株は非温度抵抗性または温度抵抗性であることが
できる。
このようなｔｋ”　Ｉ　Ｂ　ＲＶ株の例は、次のものを
包含する二ロサンジエルス（Ｌ　ｏｓ　　Ａ　ｎｇａｌ
ｅｓ）　　（以後、Ｌｏｓ　　Ａｎｇｅｌａｓ）　　（
ＡＴＣＣＮｏ、　ＶＲ−１８８）、クーパー（ｃｏｏｐ
ｅｒ）　　（以後、Ｃｏｏｐａｒ）株（ＡＴＣＣＮｏ、
ＶＲ−８６４）、ＩＰＶ株に２２　［ケンドリック（Ｋ
ｅｎｄｒｉｃｋ）　、　　Ｊ　、　Ｗ。
ら、Ｃｏｒｎｅｌｌ　　Ｖｅｔ、、４８：４５８　４９
５（１９８５）］、株ＭＯ３、ＭＯ６、ＢＦＮ−ＩＨｌ
ＢＦＮ−Ｉ　ＩＮ、ＢＦＮ−Ｉ　ＩＤ、Ｇｉｌ〜５、Ｂ
ｉ、Ｂ４、ＢＲＶ、ＬＡＥ、Ｖ３　４１５、Ｖ３４】６
、Ｖ３１８、Ｖ３９３［ダレゲルセン（Ｇ　ｒｅｇｅｒ
ｓｅｎ）、ｌ−Ｐら、Ａ　ｒｃｈ、　Ｖ　１ｒｏｌ。
８４：９１−１０３　（１９８５）］、ＢＦＡＷａｂｕ
株［アッカーマン（Ａ　ｃｋａｒｍａｎｎ）　、Ｍ　、
ら、Ｖａｔ、　Ｍｉｃｒｏｂｊｏｌ、　、９　：　５３
−６３　（１９８４）１、株Ｐ８−２　［ウニインマス
ター（Ｗ　ｅ　ｉｎｍａｓ　ｔｅｒ）　　、　　Ｃ，Ａ
、　　　ら、　　Ｖｉｒｏｌ、　　、　　１１８　　二
　１９１　−２０１　（１９８２）］　、株ＰＩＯ１Ｐ
ＩＯ，およびＰ３４［エンゲルス（Ｅｎｇｅｌｓ）　、
　Ｍ、ら、Ａｒｃｈ、Ｖｉｒｏｌ、、６７；１６９　　
１７４（１９８ｉ）］　、Ａ　１ｂｅｒｔａ　（カナダ
）分離物Ｎｏ、　　１−Ｎｏ、　　１２２　〔ミスラ（
Ｍｉｓｒａ）　、Ｖ、　　ら、Ａ　ｒｃｈ、　Ｖ　ｉｒ
。
＋、　、７６　：　３４１−３５４　（１９８３）　］
　、またはＩＢＲＶ（ＲＴＫ−ＩＢ）（米国特許第４゜
７０３．０１１号）、それらのすべてはＩＢＲＶｇＩＩ
Ｉを産生ずる。
このようなｔｋ−株の例は、温度抵抗性Ｉ　ＢＲＶ（Ｂ
８−Ｄ５３）（ＡＴＣＣＮｏ、ＶＲ−２０６６）および
Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）ｄｌｔｋ（ＡＴＣＣＮｏ、ＶＲ２
１１２）株を包含し、それらのすべてはＩＢＲＶ　　ｇ
ＩＩＩを産生する。
本発明において使用する特定のＩ　ＢＲＶ宿主細胞は、
Ｉ　ＢＲＶの許容性増殖を許すかぎり、臨界的ではない
。さらに、ＩＢＲＶ宿主細胞はｔｋ−宿主細胞またはｔ
ｋ＋宿主細胞であることができる。
このようなｔｋ＋宿主細胞の例は、次の通りである：　
Ｒａｂ　　９　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ　−１４１４
）；−次ウサギ腎細胞、二次ウサギ腎細胞；ウサギ角膜
（Ｓ　Ｉ　ＲＣ）細胞（ＡＴＣＣＮｏ−ＣＣＬ−６０）
；ウサギ腎（ＬＬＣ−ＲＫＩ）細胞（ＡＴＣＣＮｏ、Ｃ
ＣＬ−１０６）ｉ胚つシ気’ｔ　（ＥＢＴＲ）ｍ胞（Ａ
ＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ−４４）；ウシ鼻甲介（Ｂ　Ｔ）細
胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ−１３９０）；およびウシ腎
（ＭＤＢＫ）細胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ−１２２）。
Ｅアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシコン・カ
タログは、子羊、ヤギ、およびウマん細胞のあるタイプ
は、また、Ｉ　Ｂ　ＲＶ　（Ｌｏｓ　　Ａｎｇｅｌｅｓ
）　　（ＡＴＣＣＮｏ、　ＶＲ−１８８）　Ｉに対して
許容性であるこができるとを示している］、Ｒａｂ−９
は、本発明において使用する好ましいｔｋ”Ｉ　ＢＲＶ
宿主細胞である。しかしながら、現場における動物のワ
クチン接種のために使用するウィルスの産生のｔ；めに
は、ＩＢＲＶ、好ましくはワクチン接種すべき動物と同
−腫であいかつ他の感染因子を含まないＩ　ＢＲＶに対
して許容性である、米国農務省が承認した細胞系を使用
すべきであることに、注意すべきである。例えば、適当
なウシ細胞系は、承認された、マイコグラズマおよび他
のウィルス含有しない、二倍体の非腫瘍発生性のウシ鼻
甲介または腎細胞系であろう。
使用することができかつＩＢＲＶの許容性増殖を許すｔ
ｋ−Ｉ　Ｂ　ＲＶ宿主細胞の例は、Ｒａｂ−９細胞から
誘導される、ウサギＲａｂ（ＢＵ）細胞系である　［キ
ット（Ｋｉｔ）、Ｓ、ら、Ｖｉｒｏｌ、　　ｌ　３０：
　３８１−３８９　（１９８３）］。　本発明において
使用できるウサギまたはウシ由来の他のｔｋ−ＩＢＲＶ
宿主細胞は、例えば、次に従って得られる：ｔｋ−マウ
ス、ヒトおよびウサギ細胞系を分離するために従来使用
されている手順［キット（Ｋｉｔ）、Ｓ、　ら、Ｅｘｐ
Ｌｌ、　Ｃｅ１ｌ　　Ｒｅｓ、　、３１　：２９７−３
１２　（１９６３）；キット（Ｋｉｔ）、Ｓ、　　ら１
１ｎｔ、　　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、ｌ　：１９−３０　
（１９６６）；およびキット（Ｋｉｔ）、Ｓ、ら、Ｖｉ
ｒｏｌ、１３０：３８１　３８９　（１９８３）］。Ｒ
ａｂ（ＢＵ）細胞は、本発明において使用する好ましい
ｔｋ−ＩＢＲＶ宿主細胞である。なぜなら、それらは高
い力価のｔｋ”およびｔｋ−株の両者への複製を許すば
かりでなく、かつまた、１０−’モルのハイポキサンチ
ン、１０−’のアミノプテリン、４６０ＸＩＯ−’モル
のチミジンおよび１０−’モルのグリシンを含有する選
択的培地（以後、ｒＨＡＴＧ倍地」中で検出しうる程度
にｔｋ＋に逆転せず、そして許容性温度（約３４，５°
Ｃ）および非許容性温度（約３９．１’Ｏ）の両者にお
いてＩ　ＢＲＶのグラーク滴定のために使用できるから
である。ｔｋ−ＩＢＲＶ宿主細胞はＨＡＴＧ＠地中で検
出可能な程度にＬｋ＋に逆転しないことが好ましい。な
ぜなら、ｔｋ”への逆転は、ｔｋ＋およびｔｋ−ＩＢＲ
Ｖの表現型およびそれらの混合物を区別するために使用
するオートラジオグラフおよびチミジンプラークのオー
トラジオグラフのアッセイを妨害するであろうからであ
る。
工程（４）におけるＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ突然変異につ
いてスクリーニングする方法は、本発明にとって臨界的
ではない。スクリーニングは、例えば、放射線活性ＤＮ
Ａ−発錆ＤＮＡプローブを利用するドツト−プロット分
子交雑技術によって実施することができる。これらのグ
ローブは、例えば、ＩＢＲＶ　　ｇｌｒＩ欠失突然変異
が存在しないことが予測されるＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ　
Ｉ遺伝子配列、ＩＢＲＶ　　ｇ［［欠失突然変異中に存
在することが予測されるＩ　ＢＲＶ遺伝子配列、および
ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子の挿入および決定等／挿入
突然変異中に存在することが予測される異質ＤＮＡ配列
からなる。しかしながら、当業者は認識するように、分
子の交雑スクリーニングは、放射線活性二本１１ＤＮＡ
プローブを使用して、あるいは標識ＲＮＡプローブ、例
えば、７アージＴ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ボ
リメラーゼ（Ｂ　ｅｓｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅｓｅａｃｈ
　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＰ　ｒｏｍｅｇ
ａ　　Ｂ　１ｏｔｅｃ）を用いて得られるものを使用し
て、あるいは、さらには非放射線活性グローブ、例えば
、ビオチニル化ヌクレオチドプローブ系（Ｅ　ｎｚｏ　
　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　　Ｔ　ｎｃ、　）を使用して実
施することができる。
さらに、工程（４）におけるＩＢＲＶ　　ｇＩＴＩ突然
変異についてのスクリーニングは、ＤＮＡまたはＲＮＡ
のプローブの使用を必要としない他の方法によって実施
することができる。例えば、ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ糖タ
ンパク質について特異的なモノクローナル抗体を使用す
ることによって、プラーク免疫学的手順によってＩＢＲ
Ｖ　　ｇＩＩＩ発現できないウィルスについてプラーク
をスクリーニングすることができる。さらに、他のＩＢ
ＲＶＭタンパク質について特異的な抗Ｉ　ＢＲＶポリク
ローナル血清またはモノクローナル抗体、例えば、ｇｌ
、および／または異質蛋白質について特異的な抗異質蛋
白質ポリクローナル血清またはモノクローナル抗体を使
用することｔこよって、他のＩ　ＢＲＶ蛋白質または異
質蛋白質を発現するウィルスについてプラークをスクリ
ーニングすることができる。このようにして、ＩＢＲＶ
　　ｇｌＩｌの欠失および／または挿入の突然変異を同
定しかつ分離することができる。
本発明の文脈において、温度抵抗性ウィルスは非温度感
受性であるウィルスである。こうして、温度抵抗性ウィ
ルスは、非許容性温度、すなわち、約３８．５℃〜４０
℃、好ましくは３９．１’Ｏにおいて複製することがで
き、ならびにＩＢＲＶ複製体の親のウィルスまたはフィ
ールド分離体は許容性温度において複製することができ
る。対照的に、温度感受性Ｉ　ＢＲＶ株は複製に必須な
ウィルスの遺伝子中に突然変異を含有し、これによって
機能的遺伝子の産生物は許容性温度、すなわち、約３２
化合物〜３７．５°Ｃ１好ましくは３４．５°Ｃにおい
て産生されるが、非許容性温度において産生されない。
したがって、温度感受性ウィルスにおいて、感染のウィ
ルス粒子の産生は、許容性温度における産生に比較して
、非許容性処理において４〜７０グ（ｌｏｇｓ）低い。
温度抵抗性ウィルス株では、感染のウィルス粒子の産生
は許容性温度におけるのとほぼ同等である。
温度抵抗性ウィルスは、次の理由で、変性された生きて
いるワクチンとして温度感受性ウィルスよりもすぐれる
：複製に要求される無能の（ｃｒｉｐｐｌｉｎｇ）ウィ
ルスの遺伝子よりはむしろ病原性ウィルスの遺伝子中の
変更から減衰は生ずる、および（２）温度抵抗性ウィル
スは、筋肉内に、鼻内に、あるいは静脈内に安全に投与
することができ、そして、より完全なかつ延長した免疫
学的応答を誘発するように、体の深い組織中で複製する
ことができる。
対照的に、温度感受性ウィルスは低温部位、例えば、上
の気道においてのみ複製することができ、こうして、鼻
内に投与できるだけである。
本発明におけるｇｌＩｌ−ＩＢＲＶ突然変異は、Ｉ　Ｂ
ＲＶを減衰させる追加の突然変異を含有するとき、ＩＢ
Ｒ病気に対する変性された生きているウィルスのワクチ
ンとして使用することができる。
このような追加の突然変異は、ｔｋ−突然変異およびｇ
ｌｌＩ以外の非必須糖タンパク質遺伝子を包含する。例
えば、ＩＢＲＶゲノムのＵ、領域中に位置しかつＰＲＶ
　　ｇｒ　　遺伝子およびＨ３Ｖ　　ｇＥ　遺伝子に対
して相同性であるＩ　ＢＲＶ遺伝子は、ウィルスの複製
に対して非必須であることができ、そしてワクチンの保
護的性質を傷害しないで突然変異させることができる〔
ロングネカー（Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒ）　、Ｒ、ら、５
ｃｉｅｎｃｅ、　　２３６　：　５７３−５７６　（１
９８７）；およびベトロブスキー（Ｐｅｔｒｏｖｓｋｉ
ｓ）　、Ｅ、　Ａ。ら、Ｖ　＋ｒｏｌ−、ｌ　５９　：
１９３−１９５　（１９８７）］。
あるいは、本発明のｇｒｌＩ−ＩＢＲＶ突然変異は、Ｉ
ＢＲ病気に対して、殺したウィルスのワクチンとして使
用できる。ｇＩＩＩ−ＩＢＲＶ突然変異の紫外線または
ホルムアルデヒドの処理による感染性の不活性化は、腹
腔内投与後、細胞障害性Ｔ細胞およびウィルス蛋白質に
対する保護的抗体を誘発することのできるワクチンを生
ずる。
こうして、このワクチンで免疫化した動物はビルシント
ウイルスの感染に対して保護されるであろう。
さらに、非イオン性洗浄剤の抽出物（Ｎ　ｏｎｉｄｅｔ
Ｐ４０またはＴｒｉｔｏｎ　　Ｘ　−１００）を、ｇＩ
ＩＩ−ＩＢＲＶ感染ウシ細胞からつくって、サブユニッ
トのＩＢＲＶワクチンを生成することができる。これら
の抽出物は、糖タンパク質ｇＩ　Ｉ　Ｉを除外して、使
用するＩＢＲＶ株によってエンコードされる糖タンパク
質および非糖タンパク質のすべてを含有する。糖タンパ
ク質の精製後、それらはサブユニットのウィルスとして
使用できる〔ヒレマン（Ｈｉｌｌｅｍａｎ）　、Ｍ、　
Ｒ、ら、ヒトヘルペスウィルス：アン・インターディシ
ブリナリー・パースペクティブ（Ｔ　ｈｅ　　Ｈｕｍａ
ｎ　　Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ：　Ａｎ　　Ｉ　ｎｔｅ
ｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ　　Ｐ　ｅｒｓｐｓｃｔｉ
ｖｅ）、ハミアス（Ｎａｈｍｉａｓ）　、Ａ、　　Ｊ　
、らＮにューヨーク、エリセピア−）、５０３ページ（
１９８１）；アイゼンバーブ（Ｅ　ｉｓｅｎｂｅｒｇ）
　、Ｒ、Ｊ　、ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　、　　４１　
：１０９９−１１０４　（１９８２）；ロング（Ｌ　ｏ
ｎｇ）　、Ｄ　、ら、Ｉ　ｎｆ、　　Ｉ　＋ｎｍｕｎ、
、３７：７６１　７６４　（１９８４）；およびディッ
クス（Ｄｉｘ）　、Ｒ，Ｄ、ら、Ｊ　、　Ｍｅｄ。
Ｖｉｒｏｌ、　、１７　：　９−１８　（１９８５）　
］。
他の代替物として、本発明のｇｌＩＩ−ＩＢＲＶ突然変
異は、米国特許第４．７０３．０１１号に記載されるよ
うにｔｋ−Ｉ　Ｂ　ＲＶ突然変異を得るために出発物質
として使用できる。
有効量の本発明の前述のウィルスは、動物、例えば、ウ
シ、ヒツジ、ヤギおよびブタにおけるＩＢＲ病気に対す
るワクチンとして、製薬学的に許容されうる担体または
希釈剤と一緒に使用できる。
本発明において有用な製薬学的に許容されうる担体また
は希釈剤の例は、Ｉ　ＢＲＶに対する抗体を含有しない
、すなわち、ＩＢＲＶに対して血清学的に陰性である、
約２６５〜１５％の血清を含有する、生理学的に緩衝化
した、すなわち、ｐＨ７，０〜７．４、の媒質を包含す
る。無ガンマグロブリン血清は、ガンマグロブリンを含
有する血清よりも好ましい。本発明において使用すべき
血清の例は、ブタ血清、仔ウシ血清、胎児仔ウシ血清、
ウマ血清および子羊血清を包含する。ＩＢＲＶに対して
血清学的に陰性のブタからの無ガンマグロブリンブタ血
清はブタのワクチン接種に好ましい。Ｉ　ＢＲＶに対し
て血清学的に陰性のウシからの無ガンマグロブリン胎児
仔ウシ血清または無ガンマグロブリン仔ウシ血清は、ウ
シのワクチン接種に好ましい。約０．５〜３．０％（ｗ
／　ｖ）の量の血ｒｆｔｆ白質、例えば、ブタアルブミ
ンまたはウソ血清アルブミンは、血清の代わりに使用で
きる。しかしながら、ワクチン接種される動物において
アレルギーの応答を誘発する異質蛋白質を、担体または
希釈剤中に、使用することは回避することが望ましい。
ウィルスは、リン酸塩緩衝剤、グルタメート、カシトン
およびスクロースまたはソルボースを含有するか、ある
いはリン酸塩緩衝剤、ラクトース、デキストランおよび
グルタメートを含有する、普通の安定化溶液のいずれの
中にも希釈することができる。
本発明のウィルスは少なくとも１０’−１０’ｐ。
ｆ、　ｕ、　／ｍｌの力価で一７０°０−−９０°Ｃに
おいて、あるいは凍結乾燥した状態で４°Ｃ〜−２０°
Ｃにおいて貯蔵することができる。凍結乾燥したウィル
スは、無菌の蒸留水で、あるいは防腐剤、例えば、ゲン
タマイシンおよびアン７オテリシンＢまｔこはペニシリ
ンおよびストレプトマイシンを含有する水性希釈剤を使
用して、使用のために再構成することができる。
投与すべき有用な適量は、ワクチン接種すべき動物の年
令、体重および腫、および投与のモードに依存して変化
するであろう。変性した生きているウィルスのワクチン
として、適当な投与量は、例えば、約１０”−１０’ｐ
、　ｆ、　ｕ、　／動物、好ましくは約１０”＝ｌ　Ｏ
”ｐ、　ｆ、　ｕ、　／動物である。殺したウィルスと
して、適当な投与量は、例えば、変性した生きているウ
ィルスのワクチンについて使用するものよりも約１０倍
多いことができる。
本発明のワクチンは、筋肉内におよび皮下に投与するこ
とができる。
筋肉内は投与の好ましいモードである。本発明の変性し
た生きているウィルスのワクチンは、また、鼻内の投与
することができる。
次の実施例によって、本発明をさらに説明する。
以下の実施例において、すべての媒質および緩衝液は、
突起しないかぎり、ガラス蒸留水中で構成した。
実施例１ ｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＩＢＲＶ突然変異の生成Ａ１組織培養細
胞のための増殖培地 ｌＯ％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（以後ｒＢＦＳＪ）ま
たは１０％（Ｖ／Ｖ）の子羊血清、２０ミリモルの重炭
酸塩、　　１０ミリモルのＨｅｐｅｓ　（ｐＨ７。
３）、および２．０ミリモルグルタミン＋５０μｇ／ｍ
ｌのネオマイシンを補充したイーグル（Ｅ　ａｇｌｅ）
の最小必須培地（以後ｒＡＰＭＥＮｊ　）（Ｆｌｏｗ　
　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　Ｉ　ｎｃ、　）中
で、温度制御したＣＯ，インキュベーター中で、Ｒａｂ
−９細胞（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＣＬ　−１４１４）　　
（ｔｋ”宿主細胞）を増殖した。この培地を以後「増殖
培地」と呼ぶ。
Ｒａｂ−９細胞と同一であるが、２５μｇ／ｍｌのＢ　
ｒｄＵ　ｒｄを補充した増殖培地中で、Ｒａｂ（ＢＵ）
細胞［キット（Ｋｉｔ）Ｓ、　ら、Ｖｉｒｏｌ、　、ｌ
　３０：３０１−３８９（１９８３）ｌ　　（ｔｋ−宿
主細胞）を増殖した。しかしながら、この増殖培地は、
下の節Ｑに記載するプラークオートラジオグラフィー実
験の直前の継代培養のため、および下の節Ｑに記載する
プラークオートラジオグラフィー実験を実施するため、
Ｂ　ｒｄＵ　ｒｄを補充されていなかつに　。
Ｂ、ＩＢＲＶ　　ＤＮＡの精製 ＩＢＲＶ　　ＤＮＡは、Ｈ５Ｖ　　ＤＮＡ（７）調製に
ついてピグナッチ（Ｐ　ｉｇｎａｔｔｉ）らが記載する
ようにして、本質的に調製した（　Ｐ　ｉｇｎａｔｔｉ
、　Ｐ　。
Ｅ、ら、Ｖｉｒｏｌ、　、９３　：　２６０　２６４　
（１９７９）。
さらに詳しくは、２０ｍ１の増殖培地を含有するＲａｂ
−９細胞（約５ＸＩＯ’細胞／培養）の２０の８オンス
の規定ガラスびんの単層培養物を、５゜０ｐ、　ｆ、　
ｕ、　／細胞のＩＢＲＶの複数の感染（以後ｒｍ、　ｏ
、　ｉ、　Ｊで感染し、そして３４．５化合物ニオいて
３時間インキュベーションし、その時細胞のＤＮＡ合成
はウィルスの感染によって阻害されていた。次いで、１
．０μＣｉ／ｍｌおよび０゜２５μｇ／ｍｌの３Ｈ−チ
ミジンを添加してウィルスのＤＮＡ放射線活性的に標識
し、そしてインキュベーション３４．５°Ｃにおいて１
７時間以上続けた。細胞をガラスからゴムのポリスマン
で増殖培地中にこすり落すことによって置換し、６００
×ｇで遠心し、氷冷リン酸塩緩衝液で洗浄し、この緩衝
液はＩＯμｇ／ｍｌの非放射線活性のチミジンを含有し
、０．１４モルのＮａＣｌ、０．００３モルのＫＣＩ、
０．００１モルのＣａＣ１１，０，０００５モルのＭｇ
Ｃｌ、および０，０１モルのリン酸塩からなっていた（
以後「ＰＢＳ」）。次に、細胞を６００　Ｘｇで遠心し
、次いでエタノール−ドライアイス浴中で凍結した。
融解後、細胞の沈殿物（約０．７ｍ１）を９体積の溶菌
溶液中に再懸濁し、この溶液は０．２５％（ｗ／　ｖ）
のトリトンＸ−１００，１０ミリモルＥＤＴＡＳ　１０
ミリモルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７゜９）からなってい
た。次に、細胞懸濁液をダウンス（ｆ：）　□ｕｎｃｅ
）ホモジナイザーに移し、そして室温において２０〜３
０分間おだやかに混合しながらインキュベーションした
。
次いで、細胞懸濁液をガラス遠心管に移し、そしてＮａ
Ｃ１を０．２モルの最終濃度に添加した。
次に、この管を数回倒立させ、そして溶液を１゜０００
　Ｘｇで４°Ｃにおいて１０分間直ちに遠心しｔこ。
得られる上澄みをガラス管中にデカンテーションし、そ
してｌＯミリモルトリス−ＨＣ１（ｐＨ７。
５）、１．０ミリモルのＥＤＴＡからなる緩衝液（以後
ｒＴＥＪ）中で１００μｇ／ｍｌのプロテアーゼＫ　（
Ｅ、　Ｍ、　　５ｃｉｅｎｃｅ）とともに３７℃におい
て１時間インキュベーションすることによって蛋白質分
解した。次いで、１体積の９０％（Ｖ／Ｖ）の再蒸留し
たフェノールを添加し、この溶液を倒立により混合し、
２０，０００ｘｇで遠心し、そして水相、すなわち、上
の相をポリアロマ−遠心管に移した。次いで、固体の酢
酸ナトリウムを４．０％（ｗ／　ｖ）の濃度に添加し、
名を２体積の氷冷エタノールで沈殿させ、そして−２０
℃において１夜インキユベーシヨンした。その後、沈殿
をスピア：ｌ　（Ｓｐｉｎｃｏ）　ＳＷ２５０−ター内
で４°Ｃおよび１６，０００において遠心することによ
って集め、２．０ｍｌのＴＥ緩衝液中に溶解し、そして
４℃においてＴＥ緩衝液に対して透析した。
次いで、得られるＤＮＡ溶液をポリアロマ−遠心管に移
し、ＴＥ緩衝液中のＣｓＣｌを５７％（Ｗ／ｖ）　　（
ρ＝　１−７１５ｇ／ｃｍ”）に添加した。次に、ＤＮ
Ａを２２．５℃および４４，０００ｒｐｍにおいてスビ
ンコＮｏ、５０Ｔｉローター内で４６時間遠心した。次
いで、１２滴の分画をポリアロマ−管の底から集め、そ
して４．０μｌのアリコートを液体シンチレーション分
光光度計で計数して、ＩＢＲＶ　　ＤＮＡ含有分画を探
した（ρ−１、７２７ｇ／ａｍ”）　、合計２５の分画
が集められたとき、一般に分画１３−１５はＩＢＲＶ　
　ＤＮＡを含有した。
次いで、ＩＢＲＶ　　ＤＮＡ含有分画をプールし、そし
て４℃において約２４時間ＴＥ緩衝液を数回交換して透
析した。ＤＮＡの濃度は蛍光測定法によって決定した。
ＩＢＲＶ　　ＤＮＡの収量は１０’の細胞から約２５μ
ｇであった。
ＩＢＲＶ　　ＤＮＡの同定は、サブマリンゲル装置（Ｂ
　ｅＬｈｅｓｄａ　　Ｒｅｓｅａｃｈ　　Ｌ　ａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、　　Ｉ　ｎｃ。
）中で４°Ｃにおいて電気泳動後得られた、制限エンド
ヌクレアーゼ消化ＩＢＲＶ　　ＤＮＡ断片のパターンに
よって評価した。
さらに詳しくは、得られるＤＮＡをＢａｍＨＩ、Ｋ　ｐ
ｎ　ｒまたはＨｉｎｄｌＩｒ制限エンドヌクレアーゼで
、製造会社が（Ｎ　ｅｗ　　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　　Ｂ　
１ｏｌａｂｓ。
Ｉｎｃ、）が推奨する反応条件下に切断した。次に、０
．４％（ｖ／ｖ）のブロモフェノールブルー　１２５ミ
リモルのＥＤＴＡおよび５０％（ｖ／ｖ）のグリセロー
ルからなる溶液の１／１０体積を添加して、反応を停止
させ、次いで６５℃に１０分間加熱した。各試料の２０
μｌのアリコートをアガロースゲルの試料のウェル（ｗ
ｅｌｌ）中に適用し、そして電気泳動を後述するように
実施した。
制限エンドヌクレアーゼの断片の電気泳動は、３０ミリ
モルのＮａＨ，ＰＯい　１．０ミリモルのＥＤＴＡ、４
０ミリモルのＴＲＺＭＡ塩基からなる緩衝液（以後、「
電気泳動緩衝液」）中の０゜６％（Ｖ／Ｖ）のアガロー
スゲル上で４５ボルトおよび４°Ｃにおいて１６時間実
施した。電気泳動後、ＤＮＡ断片は０．５μｇ／＋ｎ＋
の臭化エチジウムを含有する電気泳動緩衝液中でゲルを
ソーキングすることによって着色し、長波ＵＶ照明装置
で可視化し、そして写真撮影した。Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ
）　ｄｉｔｋ株のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片についての制
限エンドヌクレアーゼ地図を第１図に示す。
このようにして調製したＩＢＲＶ　　ＤＮＡは、標準の
トランス７エクシヨンアツセイにおいて約１００〜１，
０ＯＯｐ、ｆ、ｕ、／μｇのＤＮＡの感染性を有した。
ＣＳ　ＩＢＲＶ　　ＤＮＡのクローニングＩＢＲＶ（Ｌ
ｏｓ　　Ａｎｇｅｌｅｓ）　　（ＡＴＣＣＮｏ。
ＶＲ−１８８）からのＤＮＡのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片
を、次の手順によってｐＢ　Ｒ３２２のＨ４ｎｄＩＩＩ
回列部位においてクローニングした。
４、ＯｐｇのＩＢＲＶ（Ｌｏｓ　　Ａｎｇｅｌｅｓ）の
ＤＮＡを、５０ミリモルのＮａＣｌ、５０ミリモルのト
リス−ＨＣＩ（ｐＨ８，）、１０ミリモルのＭｇＣ１□
および１００μｇ／ｍ＋のウシ血清アルブミン（以後「
ＢＳＡ」）からなる緩衝液（以後ｒＨｉｎｄｌｌ切断緩
衝液」）中に溶解した。次いで、ＤＮＡを３７℃におい
て１時間４０単位のＨ１ｎｄ１１１　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｉｎｃ、　）で消化した
。反応を等体積の９０％（ｖ／　ｖ）の再蒸留したフェ
ノールの添加によって停止させ、混合し、そして相分離
のだめの遠心した。水相をｌ×ＴＥ緩衝液に対して透析
し、酢酸ナトリウムを０゜１モルの濃度に添加し、そし
てＤＮＡの沈殿を一２０℃において１夜貯蔵した。ＤＮ
Ａの沈殿を遠心によって集め、そして１．０ＸＴＥ緩衝
液中に溶解した。
次いで、こうして得られる制限エンドヌクレアーゼ断片
を、次の方法において、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｔで切断しか
つ脱リン酸化したｐＢ　Ｒ３２２と一緒にし　ｔこ　。
４．０のＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ消化したＩＢＲＶ（Ｌｏｓ
Ａ　ｎｇｅｌｅｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａを、０．５μｇのＨｉ
ｎｄｌ　Ｉ　Ｉで消化しかつ脱リン酸化したｐＢＲ３２
２（ＮｅｗＥ　ｎｇｌａｎｄ　　　Ｂ　　１ｏｌａｂｓ
、　　　Ｉ　　ｎｃ、　　）　　と　、　　５０　ミ　
９１モルのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ７，８）、ｌＯミリモ
ルのＭｇＣＦ＋　　２０ミリモルのジチオスレイトール
、１、ＯミリモルのＡＴＰおよび５０μｇ／ｍｌのＢＳ
Ａからなる溶液（以後［結合緩衝液ｊ）の０゜０５ｍ１
中において、および１．０００単位のファージＴ４　　
ＤＮＡリガーゼ（Ｎ　ｅｔ　　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　　Ｂ
ｉｏｌａｂｓ、　　Ｉ　ｎｃ、　）と、混合し、そして
４℃において１夜インキユベーシヨンした。この反応を
ＥＤＴＡの２０ミリモルまでの添加および６５℃におけ
る１０分間の加熱によって停止させた。
雑種プラスミドＤＮＡｔ−ＴＥ緩衝液中に希釈し、そし
て後述するようにＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＲＲＩバ
クテリアを形質転換するために使用した［ポリバー（Ｂ
ｏｌｉｖａｒ）　、　　Ｆ　、ら、Ｇｅｎｅ、　　２　
：　９５−１１３（１９７７）］。
バクテリアはＣａＣ１１を使用して形質転換のために調
製した［マンデル（Ｍ　ａｎｄｅ　ｌ　）　、Ｍ　、ら
、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、５３　：１５９−１
６２　（１９７０）］、詳しくは、１夜の培養物をＥ　
、　ｃｏｌｉＫ１２　　ＲＲＩの２．０　（Ａ、。。）
の密度において使用して、１．０％（Ｗ／Ｖ）のバタト
トリプトン、０．５％（ｖ／ｖ）の酵母エキスおよび０
゜５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌからなるブロス（以後「Ｍ
Ｌブロス」）を０．０２　（Ａ６００）のバクテリア密
度に接種した。バクテリアは、約０．５（Ａ６゜。）の
密度が達成されるまで、約２時間インキュベーションし
た。次いで、バクテリアを遠心によって沈殿させ、そし
て１／４体積の水冷５０ミリモルのＣａＣｌ、中に懸濁
させた。氷上の５時間のインキュベーション後、バクテ
リアを再び沈殿させ、そして１／４０体積の水冷５０ミ
リモルのＣａＣ１，中に懸濁させた。
次に、ＴＥ緩衝液中の０．ｌｎ＋１の雑種プラスミドＤ
ＮＡ、約１０〜Ｉ　ＯＯｎｇ、を０．２〜ＩのＣａＣ１
□処理したバクテリアに添加した。この混合物を４℃に
３０分間保持した。次いで、形質を４℃に５分間上昇さ
せ、そして０．３〜ＩのＭＬブロスを添加した。その債
、インキュベージコンを４５分間３７℃において、おだ
やかに浸透しながら、統けた。試料は３０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを補充したトリプチカーセ（ｔｒｙｐｔｉ
ｃａｓｅ）ダイズ寒天平板（Ｂ　Ｂ　Ｌ　　Ｍ　ｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ　　Ｓ　ｙｓＬｅｍｓ）上に配置した
。
得られるクローンの所望の雑種プラスミドＤＮＡについ
ての急速なスクリーニングは、次のように実施した： 雑種プラスミドＤＮＡを含有するバクテリアのｌ夜の培
養物を、３０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５、
０ｍｌのＭＬダブロス中接種し、そして３７°Ｃにおい
て約１，５（Ａｉ。。）の密度にインキュベーションし
た。次いで、このバクテリアの培養物を１．５ｍｌのエ
ツペンドルフポリプロピシン管に移し、そしてエッペン
ドルフの遠心機中で約１分間室温において遠心してバク
テリアを沈殿させた。次に、バクテリアを、２．Ｏｎ＋
ｇ／ｍｌの卵リゾチーム、５０ミリモルのグルコース、
１０ミリモルのシクロヘキサンジアミテトラアセテート
（以後ｒＣＤＴＡＪ　）および２５ミリモルのトリス−
ＨＣｌからなる緩衝液（ｐＨ（８，０）（以後［リゾチ
ーム溶液Ｎｏ、ｌＪ）中に再懸濁し、次いで４℃で３０
分間インキュベーションした。
次に、０．２ｍｌの０．２Ｎ　　ＮａＯＨ＋１．０％（
Ｗ／Ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＩｇｒＳＤＳＪ）
をバクテリアの懸濁液に添加し、管を撹拌し、そして４
化合物に５分間保持した。その後、（ｌ１５ｍｌの３．
０モルの酢酸ナトリウム（つＨ４，８）を添加し、管を
おだやかに倒立させ、その間ＤＮＡの「凝固物」が形成
した。ＤＮＡを４°Ｃに１時間保持して、染色体のＤＮ
Ａ、蛋白質、および高分子量のＤＮＡを沈殿させた。次
に、沈殿をエツベンドルフの遠心機で室温において５分
間遠心し、雑種プラスミドＤＮＡを含有するほぼ０．４
ｍｌの透明な上澄み流体を第２エツベンドル７の遠心機
の管に移した。次いで、２．５体積のエタノール（はぼ
１．０ｍ１）をＨ２管に添加し、これを−２０℃に３０
分間配置した。沈殿した雑種プラスミドＤＮＡをエッペ
ンドルフの遠心機による室温における２分間の遠心によ
って集めた。
次いで、雑種プラスミドＤＮＡを０．１モルの酢酸ナト
リウムおよび０．００５モルのトリス−ＨＣｌからなる
溶液（ｐＨ８，０）のＯ，１ｍｌ中に溶解し、エタノー
ルで再沈殿させ、再び遠心によって集め、そして最後に
１００μｌのＯ，ＩＸＴＥ緩衝液中に溶解した。
次いで、雑種プラスミドＤＮＡのｌＯμｌのアリコート
を５０μｌのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ切断緩衝液中に希°釈
し、そして２．０単位のＨｉｎｄｌＩＩを添加した。６
０分の消化期間に引続いて、試料を０゜４％（Ｗ／Ｖの
ブロモフェノールブルー　１２５ミリモルのＥＤＴＡＢ
よび５０％（Ｖ／Ｖ）のグリセロールからなる溶液のｌ
／１０体積と混合し、そして得られる溶液の約２０μｌ
を０．６％（Ｗ／　Ｖ）のアガローススラブゲルに、前
述のように、電気泳動分析のために適用した。この分析
により、雑種プラスミドがＨｉｎｄｌＩＩインサートを
含有するかどうかが明らかになり、そして、含有する場
合、インサートの大きさ（ｋｂ）を決定した［バーポイ
ム（Ｂ　ｉｒｎｂｏｉｍ）　、Ｈ、Ｃ、ら、Ｎｕｃｌ、
　　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｃｈ、　７　：１５１
３　１５２３　（１９７３）１゜ このようにして、アガロースゲルの電気泳動においてＩ
ＢＲＶ　　Ｈｉｎｄｌ　ｒ　Ｉ−１断片と同時に移動す
る、１１．７ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌインサートを含有す
る１６．１ｋｂのプラスミドが分離され、そしてｐＬＡ
Ｈ−１と表示した（第１図および第３図参照）。
雑種プラスミドＤＮＡの大規模な調製のため、前述の急
速スクリーニング手順について雑種プラスミドＤＮＡを
製造するために使用したバクテリアと比較して、２００
倍の量の雑種プラスミド形買転換したバクテリアを使用
したが、ただし最初のエタノール沈殿後、ｌＯＯｏｏで
１０分間加熱しである５、０ミリモルのトリス−ＭＣＩ
（ｐＨ８゜０）中の１．Ｏｍｇ／ｍｌのＲナーゼからな
る原溶液からの０．５ｍｇの膵臓ＲナーゼＡ　（Ｗｏｒ
ｔｈｉｎｇｔｏｎＢ　１ｏｃｈｅｉｉｃａｌ　　Ｃｏｒ
ｐ）で、試料を３７°Ｃにおいて３０分間処理した。次
いで、等しい体積のフェノールを添加し、試料を撹拌し
、前述のように遠心して相を分離した。次いで、水性相
を取り出し、前述のようにエタノールで沈殿させ、そし
て遠心によって集めた。次いで、沈殿を０．２ｍｌのＴ
Ｅ緩衝液中に溶解し、５０ミリモルのＮａＣｌ、１００
ミリモルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１．０ミリ
モルのＥＤＴＡ中において１０．４ｍｌの直線の１０−
４０％（ｗ／　Ｖ）のスクロース勾配上で層状にし、そ
して４°Ｃおよび２４，０００ｒｐｍにおいて２０時間
スピンコＳＷ４１０−ター内で遠心しｔ；。ポリアロマ
−遠心管の底から１５滴の分画を集めて、プラスチ／ク
トレーのウェル中に入れた。合計３５滴の分画が得られ
た。次いで、５．０μｍのアリコートを、鉛樹津のよう
にアガロースゲルの電気泳動によってスクリーニングし
た。雑種プラスミドＤＮＡを含有する分画をプールし、
Ｏ，ＩＸＴＥ緩衝液に対して透析し、そしてさらに研究
のために４°Ｃで貯蔵した。
Ｄ、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩについての構造遺伝子のマツ
ピング 前の研究が示すように、ＰＲＶ　　ｇ９２遺伝子はＨ５
Ｖ−１８よびＨ５Ｖ−２と相同性であり［ロビンス（Ｒ
ｏｂｂｉｎｓ）　、Ａ、　Ｋ、ら、Ｊ　、　Ｖ　１ｒｏ
１．．５８　：　３９−３４７　（１９８６）；および
キット（Ｋｉｔｔ）　、Ｓ、　　ら、Ａｍ、　　Ｊ　、
　Ｖｅｔ、　　Ｒｅｓ、　、４８ニア８０−７９３　（
１９８７）］　およびまた］水痘−帯状ヘルペスｇｐＢ
（Ｎｏ、　　１４）遺伝子はＨ３Ｖ−１ｇｃ遺伝子と相
同性である［デイビソン（Ｄａｖｉｓｏｎ）　、Ａ、　
　Ｊ　、　　ら、Ｊ　、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ。
、６７：１７５９−１８１６（１９８６）］、ＰＲＶ　
　ｇ９２遺伝子は培養した細胞中のＰＲＶの増殖のため
に必須ではなく、およびＰＲＶ　　ｇ９２を発現しなか
ったＰＲＶの突然変異を構成した［キット（Ｋｉｔｔ）
　、Ｓ、　ら、Ａｍ、　　Ｊ　、　Ｖｅｔ、　　Ｒｅｓ
、　、４８　：　７８０−７９３　（１９８７）；およ
び米国特許出願第８２３．４３９号、１９８６年１月２
８日提出１゜したがって、ＰＲＶ　　ｇ９２遺伝子は、
また、培養した細胞中の増殖のために必須ではないＩＢ
ＲＶ糖タンパク貿遺伝子と相同性であり、そしてこのｒ
ＢＲｖＭタンパク質遺伝子は放射線活性ＰＲ￥　　ｇ９
２ＤＮＡプローブを使用する分子ハイブリダイゼーショ
ン（サザンプロット）によって検出できるであろう。
この仮説を試験するため、ＰＲＶ　　ｇ９２遺伝子を０
．４ｋｂのＫｐｎｌ／ＢａｍＨＩ断片を７ア一ジＭ１３
ｍｐ１９中でサブクローニングし、そして−重鎖３２ｐ
標識グローブを調製した（米国特許出願第８２３．４３
９号、工９８６年１月２８日提出）。ＰＲＶｇ９２遺伝
子（０，４ｋｂのＫｐｎｌ／ＢａｍＨＩ）グローブを使
用するサザンプロット分析により、厳格な条件下のｐＬ
ＡＨ−１中のＩＢＲＶ　　ＤＮＡのクローニングしｊ：
Ｈ４ｎｄｌ　Ｉ　Ｉ　−Ｉ断片への分子ハイブリダイゼ
ーションが明らかさとされた（第１図および第２図参照
）。厳格な条件下のハイブリダイゼーションは、下の節
しに記載するように実施した。追加の分子ハイブリダイ
ゼーシａ７の実験により、ＰＲＶ　　Ｋｐｎｌ／Ｂａｍ
ＨＩグローブに対して相同性の配列は、ｐＬＡＨ−１の
２．５ｋｂのＢａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲＩ断片内に位置
した。下の節Ｅに記載するように、この２．５ｋｂのＢ
ａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲＩ断片をｐＢ　Ｒ３２２のＢａ
ｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位においてサブクローニング
し、そして得られたプラスミドをｐＬＡ　Ｅ　Ｂと表示
した（第２図参照）、ＰＲＶ　　Ｋｐｎｌ／ＢａｍＨＩ
プローブは、また、厳格なハイブリダイゼーション条件
下にｐＬ　Ａ　Ｅ　Ｂに強くハイブリダイゼーションす
る。さらに、ｐＬＡ　Ｅ　Ｂの２．５ｋｂのＩ　ＢＲＶ
　　ＢａｍＨｉ／ＥｃｏＲＩ断片の位置は、Ｈ５Ｖ−１
ゲノム上のｇｃ遺伝子およびＰＲＶゲノム中のｇ９２遺
伝子の位置に騒動するＩ　ＢＲＶゲノム上の位置（０，
１１〜０．１２地図単位）に認められた。したがって、
ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子はＰＲＶ　　ｇ９２遺伝子
およびＨ３Ｖ−１ｇｃ遺伝子と相同性であることがわか
った。
Ｅ、ｐＬＡＥＢの構成 節Ｅ−Ｇにおける次の工程を実施して、ｐＬＡＨ−Ｔか
らのＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ遺伝子をｐＢＲ３２２にサブ
クローニングし、そしてＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ解読配列
の実質的にすべてをサブクローニングしたＩＢＲＶ　　
ｇＩ　Ｉ　Ｉ　　ＤＮＡから欠失しに　。
１．０μｇのｐＢ　Ｒ３２２および１．０μｇのｐＬＡ
Ｈ−１を混合し、そして１５０ミリモルのＮａＣ１，６
，０ミリモルのトリス−ＨＣＩ（ｐｉ−１８゜０）、６
．０ミリモルのＭｇＣＩ２．１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ
からなる緩衝液の２．０μｍ中ｌこおいて４０単位のＢ
ａｍＨＩで３７°Ｃにおいて１時間消化し、次いで５０
ミリモルのＮａＣｌ、１００ミリモルのトリス−ＨＣＩ
（ｐＨ７，５）、５．０ミリモルのＭｇＣｌ２．１００
　μｇ／ｍｌのＢＳＡからなる緩衝液の１００μｌ中に
おいて４０単位のＥｃｏＲＩで３７℃において１時間消
化した。切断したＤＮＡを等しい体積のフェノール：ク
ロロホルム（１：１）で抽出し、そして２体積のエタノ
ールで沈殿し、７アージＴ４リガーゼで結合し、そして
前述のようにＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＲＲＩＪａｌ
胞を形質転換するために使用した。アンピシリン抵抗性
のコロニーを６．４ｋｂのプラスミドの存在についてス
クリーニングした。このプラスミドをｐＬ　Ａ　ＥＢと
表示した。このプラスミドの制限エンドヌクレアーゼの
分析は、第２図に示すｐＬ　Ａ　Ｅ　Ｂの構造を確証し
た。
Ｆ％　ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ遺伝子のヌクレオチド配列 ２．５ｋｂのＢａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲＩ断片のヌクレ
オチド配列＋ｐＬＡ　Ｅ　ＢのＢａｍＨＩ部位から５′
〜ＢｇｌｌＩ部位に延びる０、６ｋｂの断片を下に記載
するようにして決定した（第１図および第２図参照）。
ＢａｍＨｒからＢｇｌｌＩ制限部位に延びるｐＬＡＨ−
ＩのＩ　ＢＲＶヌクレオチド配列の部分を、７ア一ジＭ
１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９の二本鎖の複製形態
（ＲＦ）中でサブクローニングした［）（Ｈｕ）、Ｎ、
Ｔ、　ら、Ｇｅｎｅ１１７　：　２７１−２７２　（１
９８２）；およびメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）Ｊ、ら
、Ｇｅｎｅ、１９：２６９　２７６　（１９８２）１゜
これらの２つのファージの使用は、２つの向きにおける
小さい重複ＤＮＡ断片のクローニングを可能とした。次
いで、Ｅ、ｃｏｌｉ’　　Ｋ１２ＪＭ１０３バクテリア
（Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｂ　ｉ。
ｊａｂｓ、　　Ｉ　ｎｃ、　）中の組み換ファージＭ１
３誘導体の複製は、配列決定反応のために使用できる一
発錆ファージＤＮＡの合成を生じた。
配列決定反応は慣用のジデオキシヌクレオチド鎖停止方
法によって実施した［サンガー（Ｓ　ａｎｇｅｒ）、Ｆ
、ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　、１４３　：１６
１−１７８　（１９８０）；サンガー（Ｓ　ａｎｇｅｒ
）、Ｆ、ら、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　
ａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７４　　：　５４３６　
　５４６７（１９７７）］。反応混合物は、鋳型として
ＩＢＲＶ　　ＤＮＡの一発錆７アージＭ１３ｍｐ１８ま
たは７ア一ジＭ１３ｍｐ１９のサブクローン、鋳型の各
々におけるＤＮＡ合成を促進するＩ；めにＭ１３ペンタ
デカマー（Ｎ　ｅｗ　　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　　Ｂ　１ｏ
ｌａｂｓ。
Ｉｎｃ、）または自動化ＤＮＡ合成装置−ミクロシン（
Ｍｙｃｒｏｓｙｎ）　ｌ　４５０　（Ｓｙｓｔｅｃ、　
Ｉ　ｎｃ、　）でつくったＩＢＲＶ　　ＤＮＡの合成オ
リゴヌクレオチドプライマー配列、標識した基質として
（σ−”Ｐ）ｄＴＴＰ％Ｍ　ｇ＋　＋、適当な標識しな
いデオキシヌクレオシドトリホスフェートおよびジデオ
キシヌクレオシドトリホスフェート、およびＥ、ｃ。
１ｉ　　ＤＮＡポリメラーゼ、クレノー断片（Ｂ　ｅｔ
ｈａｓｄａ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔ
ｏＬｒｉｅｓ）を含有した。
３８°Ｃにおいて１５分間反応混合物をインキュベージ
コンした後、この反応を３８°Ｃにおいて１０分後、０
．３モルの酢酸ナトリウムおよび２００μｇの酵母菌Ｌ
ＲＮＡ［シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ　ｉｇｍａ
　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ、　）を含有する１２．
５ミリモルのＥＤＴＡ溶液のｌＯμｌの添加によって停
止させた。反応生成物をエタノールで沈殿させ、９０％
（Ｖ／Ｖ）のホルムアミド、３０ミリモルのＮａＯＨ％
　ｌＯミリモルのＥＤＴＡ。
０．０３％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルーおよび
０．３％（Ｗ／Ｖ）のキシレンシアツールからなる溶液
の１０ＰＩ中に溶解し、９０℃に１分間加熱し、そして
７，６％（ｗ／　Ｖ）アクリルアミド、０．４％（ｗ／
ｖ）のビスアクリルアミド、０゜００３％（ｖ／ｖ）の
ＴＥＭＥＤ、および０．００７％（Ｗ／Ｖ）の過硫酸ア
ンモニウムからなる８゜０％（ｖ／　ｖ）の配列決定ゲ
ル中に適用した。
これによって得られＩ：ＩＢＲＶ　　ｇＩｒｌ遺伝子の
ヌクレオチド配列を第３図に示す。ヌクレオチド配列か
ら予測された制限ヌクレアーゼ切断部位を、下表１に表
わす。
表１ １ＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子のヌクレオチド配列から予
測された制限ヌクレアーゼ切断部位 制限エンドヌクレ　配列中の第１ヌクレオチドのアーゼ 位置（ヌクレオチドＮ０１） ｐａ１ ３１９、９０９、１６４０゜ ｇｌ１ ａｍＨＩ ｓｔＩ ａｅ１ １１６９、１４２９ ｃｏ１ ｐｓｔ！ 　ｖｕ　Ｉ 　ａｃ　Ｉ ａｃｌ１ ５８、６９８、９０５ ａｌｌ ｌ　２８６、１６４６ 　ｃａ　ｌ 　ｈｏ　１ ｈｏｒｌＡ ヌクレオチド配列は、５４．６２１ダルトンの分子量の
ポリペプチドをエンコードできる１つのオープンリーデ
ィングフレーム（５０９ダルトン）を含有する。比較に
より、相同性ＰＲＶ　　ｇ９２ポリペプチドは、４７９
のコドンから成り、そして５０，８６０ダルトンの予測
する分子量を有する［ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）
　、Ａ、　Ｋ、ら、Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ、５８：３３９　　３４７（１９８６）］−
翻訳開始ココドンＡＴＧ）は、ＢａｍＨ１部位かか６３
ヌクレオチド下流に存在する。１．５２７ヌクレオチド
のオープンリーディングフレームに引続いて停止コドン
（ＴＡＧ）がＡｐａＩａからＩＯヌクレオチド上流に存
在する（第３図参照）。
ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）は、ＴＡＧ停
止コドンから６８下流に存在する。ＴＡＴＡおよびＣＡ
ＡＴ転写シグナル配列は、ＡＴＧ開始コドンに対して５
′に存在する。ＡＴＧ翻訳開始コドンより前および後に
存在する、それぞれ、ヌクレオチドＣＣＧＣＣおよびＧ
ＧＣは、翻訳の効能において役割を演すると解釈される
コンセンサス配列と同一である［コザク（Ｋｏｚａｋ）
　、Ｍ、、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　、４７　
：　ｌ　　４５　（１９８４）；およびコザク（Ｋｏｚ
ａｋ）　、Ｍ、　、Ｎａｔｕｒｅ、　　３０８　：　２
４１−２４６　（１９８４）］　、ＡＴＧ翻訳開始コド
ンから１，３２０ヌクレオチド下流およびＴＡＧ停止コ
ドンから２０８上流のヌクレオチド配列５’　−ＧＡＣ
ＧＧＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣ−３’　
は、ＡＴＧ翻訳開始コドンから１，２７０ヌクレオチド
下流および、また、ＰＲＶｇ９２停止コドンから２０８
ヌクレオチドのＰＲＶ　　ｇ９２遺伝子のそれと同一で
ある。
第３図に示すＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子によってエン
コードされるＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩポリペプチドについ
て予測されるアミノ酸配列は、他のヘルペスウィルスの
エンベロープ糖タンパク質と共通の特徴を有する。最初
の２１アミノ酸は、位置６におけるアルギニンを除外し
て疎水性である。
この配列は膜挿入のためのシグナルペプチドに対応する
ことができ、そして翻訳および移送の間に良好に除去さ
れるうる。位置４８１−４９８に存在するアミノ酸は、
また、強く疎水性であり、そして膜スパユング領域（ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ　　ｒｅｇｉｏｎ）
の特性を有する。カルボキシル末端のアミノ酸は基本部
電化を有し、そして細胞質定着（ａｎｃｈｏｒ）配列と
して機能することができる。最後に、４つの潜在的グリ
コジル化部位（Ａ２１−Ｘ−３ｅｒ／Ｔｈｒ）は、推定
のシグナル配列および膜内外記列の間の領域に存在する
。
Ｇ％ｐＬＡＥＢｄｌＡｐａｌの構成 １．０μｇのｐＬＡＥＢを、６．０ミリモルのＮａｃｌ
、６．０ミリモルのトリス−ＨＣ１（ｐＨ７。
４）および６．０ミリモルのＭｇＣ１，，６，０ミリモ
ルの２−メルカプトエタノール、１００７７ｇ／ｎ＋Ｉ
のＢＳＡからなる２０μｌの緩衝液中で２０単位のＡ　
ｐａ　Ｉで３７℃において１時間消化した。
切断したＤＮＡを等しい体積のフェノール：クロロホル
ム（１：　ｌ）で抽出し、そして２体積のエタノールで
沈殿させ、７アージＴ４リガーゼで結合し、そして戦術
のように、ＣａＣ５処理したＥ。
ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＲＲＩ細胞を形質転換するため
に使用した。アンピシリン抵抗性のコロニーヲ、約１．
５ｋｂだけｐｔ　Ａ　Ｅ　Ｂより小さいプラスミドにつ
いてスクリーニングした。このプラスミドをｐＬ　Ａ　
Ｅ　ＢｄｌＡｐａＩと表示した。このプラスミドの制限
エンドヌクレアーゼ分析は、第２図に示すｐＬ　Ａ　Ｅ
　ＢｄｌＡｐａＩの構造を確証した。
Ｈ，ｐＵＣｌ　８ｄｌＥｃｏＲＩの構成プラスミドｐＵ
ｃ１８およびｐＵｃ１９は、ベセスダ・リサーチ・ラボ
ラトリーズ（Ｂ　ｅＬｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　　
Ｌ　ａｂｏｒａｔｏＬｒｉｅｓ）から商業的に入手可能
な、よく知られたクローニングベクターである。それら
はｐＢ　Ｒ３２２のＰｖｕｌ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩ断片
を含有する。この断片は、アンピシリン抵抗性遺伝子（
β−ラクタマーゼ）８よびＤＮＡ複製の由来を有する。
ｌａｃ　Ｚ遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）の一部およ
びＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９配列決定ベクタ
ーの多数のクローニング部位を含有するＨａｅＩＩ断片
［コオーディネイツ（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）　２４
０　６８５　］　を、ｐＢ　Ｒ３２２断片と組み合わせ
て、もとのｐＵＣを形成し、これからｐＵｃ１８および
ｐＵｃ１９を誘導した。ＤＮＡ断片は多数のクローニン
グ領域中に位置する独特制限エンドヌクレアーゼ部位中
に挿入することができる。挿入は、適当な宿主菌株の形
質転換のときのβ−ガラクトシダーゼ活性の損失によっ
て監視する。プラスミドｐＵｃ１８およびｐＵｃ１９は
、多数のクローニング領域中に、反対の向ぎであるが、
同一の制限エンドヌクレアーゼを含有する。
本発明の構成の目的で、ｐＵｃ１８クローニングベクタ
ーを、後述するように、まず修飾して、ＥｃｏＲＩクロ
ーニング部位を除去した。なぜなら、Ｈａｅｌｌ断片中
のＥｃｏＲＩ断片は、ＩＢＲＶ　　ｇ■Ｉ■遺伝子のサ
ブクローニングにおいて後続する工程を妨害するであろ
うらかでる。
さらに詳しくは、ｌｏｐｇのｐＵｃ１８を、５０ミリモ
ルのＮａＣｌ、１００ミリモルトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７
，５）　、５．０ミリモルのＭｇＣ１！、１００μｇ／
ｍｌのＢＳＡからなる２０μｌの緩衝液中において２０
単位のＥｃｏＲＩとともに３７°Ｃにおいて１時間イン
キュベーションした。このＥｃ。
ＲＩ消化したｐＵｃ１８を、５０ミリモルのＮａＣ１１
３０ミリモルの酢酸ナトリウム（ｐＨ４，６）、１．０
ミリモルのＺｎＣ１□からなる１００μｍの緩衝液中に
おいて３００単位のヤエナリヌクレアーゼ［７アーマシ
ア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）　］　とともにインキュベ
ーションし、そして２体積のエタノールで沈殿させた。
次いで、８００単位のファージＴ４リガーゼ（Ｎ　ｅｗ
　　Ｅ　ｎｇｌａｎｄ　　Ｂ　１ｏｌａｂｓ、　　Ｉ　
ｎｃ、　）、５０ミリモルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，
８）、１０ミリモルのＭｇＣｌ、、２０ミリモルのジチ
オスレイトール、１．０ミリモルのＡＴＰ、および５０
μｇ／ｍｌのＢＳＡからなる緩衝液の４０μｌ中におい
て、結合を４°Ｃで１８時間実施した。結合したＤＮＡ
を、前述のように、使用してＣａＣｌ□処理したＥ、ｃ
ｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＲＲＩ細胞を形質転換した。アン
ピシリン抵抗性コロニーを増殖し、そしてプラスミドを
ＥｃｏＲＩ　Ｈｉｎｄｌ　Ｔ　Ｉ、ＫｐｎｌおよびＰｓ
ｔＩで消化することによって分析した。
このようにして得られたプラスミドはＥｃｏＲ１部位を
失っていたが、ｐＵｃ１８の他の制限エンドヌクレアー
ゼ部位のすべてを保持していた。このプラスミドをｐＵ
Ｃｌ　８ｄｌＥｃｏＲＩと表示した。
Ｉ、ｐＬ、Ａ）（ＫのｗＩｔｒ！ｔ この工程の目的は、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子を含有
する、ｐＬＡＨ−１のＫｐｎｌ／ＨｉｎｄＩ　Ｉ　１断
片を、ｐＵＣ１８ｄｌＥｃｏＲＩに移すことである（第
２図参照）。
１．０μｇのｐＵＣＩ　８ｄｌＥｃｏＲＩａｄｌ　、Ｏ
ｍｇのｐＬＡＨ−１を混合し、そして６．０ミリモルの
ＮａＣｌ、６，０ミリモルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７゜
５）、６．０ミリモルＭｇＣｌ、１．０ミリモルのジチ
オスレイトール、ｌ　ＯＯｐ　ｇ／ｍｌのＢＳＡからな
る緩衝液の２０μｌ中において４０単位のＫｐｎｌで３
７℃において１時間消化し、次いで、５０ミリモルのＮ
ａＣｌ、５０ミリモルのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８，０）
、１０ミリモルのＭｇＣ１，１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ
からなる緩衝液の１００μｍ中において４０単位のＨｉ
ｎｄｌ　Ｉ　Ｉで３７°Ｃにおいて１時間消化した。切
断したＤＮＡを等しい体積のフェノール：クロロホルム
（１：　１）で抽出し、そして２体積のエタノールで沈
殿させ、ファージＴ４リガーゼで結合し、そして、前述
のように、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＲＲＩを形質転
換するために使用した。形質転換したＥ、ｃｏｌｉ　　
Ｋ１２　　ＲＲｌのアンピシリン抵抗性コロニーをｌｏ
、２ｋｂのプラスミドの存在についてスクリーニングし
た。
このプラスミドをｐＬ　Ａ　ＨＫと表示した。このプラ
スミドの制限エンドヌクレアーゼ分析は、第２図に示す
ｐＬＡ　ＨＫの構造を確証した。
Ｊ　、　ｐＬ　Ａ　ＨＫｄｌＡｐａＩの構成この工程の
目的は、ｐＬＡＥＢｄｌＡｐａｌのＥｃ。
Ｒ１／ＢａｍＨ１部位をｐＬ　Ａ　ＨＫのＥｃｏＲＩ／
ＢａｍＨ１部位と交換することであった（第２図）。ｐ
Ｌ　Ａ　Ｅ　ＢｄｌＡｐａＩと異り、ｐＬＡＨＫｄｌＡ
ｐａｌはＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ　ｒ遺伝子のＡＴＧ翻訳
開始シグナルに対して５″の長い３．０ｋｂのＩ　ＢＲ
Ｖヌクレオチドフランキング配列を含有する。したがっ
て、ｐＬ　Ａ　ＨＫｄｌＡｐａ　Ｉは、相同組み換えに
よってＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ欠失突然変異をｇＩＩＩ＋
ＩＢＲＶ中に移送するために、ｐＬ　Ａ　Ｅ　ＢｄｌＡ
ｐａＩよりも有用である。
１．０μｇのｐＬ　Ａ　ＨＫおよび１．０μｇのｐＬＡ
ＥＢｄｌＡｐａｌを、前述のように、混合し、そしてＢ
ａｍＨＩおよび次いでＥｃｏＲＩで消化した。切断した
ＤＮＡを結合して、前述のように、ＣａＣ，処理したＥ
、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＲＲｌを形質転換するために
使用した。アンピシリン抵抗性コロニーを、ｐＬ　Ａ　
ＨＫよりも１．５ｋｇだけ小さいプラスミドについてス
クリーニングした。このプラスミドをｐＬ　Ａ　Ｈｄｌ
Ａｐａ　Ｉと表示した。このプラスミドの制限エンドヌ
クレアーゼ分析は、第２図に示すｐＬＡＨＫｄｌＡｐａ
ｌの構造を確証した。
ＫＳＩ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌＬｋｄｌｇｌ　Ｉ　Ｉ
（７）構成 ｔｋ−Ｉ　Ｂ　ＲＶであり、そしてＩＢＲＶ　　ｇｌＩ
Ｉ遺伝子中の欠失の結果抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩポ
リペプチドを製造できない、Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）ｄｌ
ｔｋｄｌｇＩ　Ｉ　Ｉを得るために、ｔｋ−ＩＢＲＶ（
ＮＧ）　ｄｌｔｋ菌株（ＡＴＣＣＮｏ、　ＶＲ２１１２
）の感染のｇｌ　Ｉ　Ｉ”　　ＤＮＡを、米国特許第４
，５１４．４９７号および米国特許、第４．７０３゜０
１１号に記載されるようにして、プラスミドｐＬ　Ａ　
ＨＫｄｌＡｐａｌから誘導された５、３ｋｂのＨｉｎｄ
ｌ　Ｉ　Ｉ−Ｋｐｎｌ断片と同時感染した（第１図およ
び第２図参照）。
より詳しくは、ｌＯμｇのｐＬ　Ａ　ＨＫｄｌＡｐａ　
Ｉを、６．０ミリモルのＮａＣｌ、６．０ミリモルのト
リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、６．０ミリモルのＭｇ
Ｃ１，１，０ミリモルのジスレイトール、および１００
　ｐ　ｇ／ｍｌのＢＳＡからなる緩衝液の２０μｌ中で
３７℃において９０分間５０単位のＫｐｎＩで消化した
。このＤＮＡを２体積のエタノールで沈殿させ、５０単
位のＨｒｎｄｌ　Ｉ　Ｉ、　５０ミリモルのＮａＣｌ、
５０ミリモルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８゜０）、１００
ミリモルのＭｇＣｌ、および１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ
からなる緩衝液の５０μｌ中に再溶解し、そして３７℃
において９０分間インキュベーションした。この反応混
合物をフェノール：クロロホルム（１：　ｌ）で抽出し
、そして０．１×ＴＥ緩衝液に対してよく透析した。消
化したプラスミドＤＮＡを０．１ＴＥ緩衝液中に１０μ
ｇＺｍ目こ希釈し、そしてろ過滅菌した。
Ｒａｂ−９細胞を６０ｍｍのペトリ皿に接種しく２ＸＩ
Ｏ’細胞１５．０ｍｌ増殖培地／皿）、ソシテ３７°Ｃ
において４８時間インキュベーションした。
次いで、次の無菌溶液を順番に試験管に添加した（１）
ＴＥ！ｉｌ衝液中の５０μｇ／ｍｌのｒ　ＢＲＶ（ＮＧ
）ｄｌｔｋ　　ＤＮＡの０．０２ｍ１；（２）０．Ｉ　
　ＴＥ緩衝液中のＫ　ｐｎ　ＩおよびＨ４ｎｄｌｌｌで
切断した１０μｇ／ｍｌのプラスミドｐＬＡＨＫｄｌＡ
ｐａＩの０．２ｍｌ； （３）０．６５ｍ１の水； （４）１６ｇ／ＩのＮａＣｌ、０．７４ｇ／ＩのＫＣｌ
、０．２５ｇ／ＩのＮ　ａｌＨＰ　Ｏ４・Ｈｘ○、２．
０ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのヘペス（Ｈｅｐｅ
ｓ）（ｐＨ７，ｃ１５）からなる２　Ｘ　Ｈｅｐｅｓｌ
ｌｌ衝液（以後、ｒ　２　Ｘ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液」）中
の２０μｇ／ｌｌ１ｌのサケ精子ＤＮＡの１．Ｑｍｌ；
および （５）０．１３ｍ１の２．０モルのＣａＣ５゜得られる
溶液を倒立により混合し、そして室温において３０分間
保持し、その間ＤＮＡ−リン酸カルシウムの沈殿が形成
した。次いで、Ｑ、５ｍｌの懸濁液をベトリ皿中のＲａ
ｂ−９細胞に直接添加した。細胞を３７°Ｃにおいて５
時間インキュベーションした。次いで、増殖培地を吸引
し、単層を５、Ｑｍｌの新鮮な増殖培地ですすぎ、次い
でｌ×Ｈｅｐｅｓ緩衝液＋１５％（ｖ／ｖ）のグリセロ
ールの溶液の１．ｏｍｌを添加した。室温において３分
間インキュベーションした後、この溶液を吸引し、単層
を増殖培地で再びすすぎ、そして５．Ｑｍｌの新鮮な増
殖培地を添加した。培養物は、広範な細胞病原性作用が
起こるまで、３日間３４．５°Ｃにおいてインキュベー
ションした。次いで、ウィルスの収穫物をＲａｂ−９細
胞中で０．５％（ｗ／ｖ）アガロース下に増殖培地のオ
ーバーレイ中で滴定した。
Ｌ、ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ突然変異についてのスクリー
ニング 上の節Ｋにおける同時トランスフェクションから得られ
た子孫のウィルスは、主として、親の■Ｂ　ＲＶ　（Ｎ
　Ｇ）　ｄｌｔｋおよび小さい集団の相同な組換え体か
ら構成されており、そしてこの組換え体においてＩＢＲ
Ｖ　　ｇｌｌｌ遺伝子の解読配列の実質的にすべては欠
失されていた。親のウィルスのうちで組換え体について
同定しかつスクリーニングするために、野生型ｔｋ”　
　Ｉ　ＢＲＶ　（ＬｏｓＡ　ｎｇｅｌｅｓ）ウィルスに
対してハイブリダイゼーションするが、ＩＢＲＶ　　ｇ
ｌｌＩ遺伝子遺伝火中をもつ組換え体に対してハイブリ
ダイゼーションしない、３２Ｐ標識ＩＢＲＶ　　ｇｌＩ
Ｉ遺伝子を使用して、分子ハイブリダイゼーション実験
を実施し　に　。
より詳しくは、上の節Ｋにおける同時トランスフェクシ
ョンからのウィルス収穫物を融解し、超音波処理し、そ
して増殖培地中で約１００ｐ、ｆ。
ｕ、／ｍｌに希釈した。Ｒａｂ−９細胞を、６０ｍｍの
ベトリ皿中に２Ｘ１０’細胞１５．０ｍｌ増殖培地／皿
で接種し、そして３７℃において４８時間インキュベー
ションし、０．２ｍｌの希釈したウィルス原料で１時間
感染させ、増殖培地中の０．５％（Ｗ／　Ｖ）のアガロ
ースでオーバーレイし、そして３４．５°Ｃにおいて３
日間インキュベーションした。プラークを０．０１％（
ｖ／ｖ）のニュートラルレッドを含有する増殖培地のオ
ーバーレイ中の第２０．５％（ｖ／ｖ）のアガロースを
添加し、そして３４．５°Ｃにおいて１夜インキユベー
シヨンすることによって可視化した。ウィルスは個々の
プラークから滅菌した楊枝で戦死し、次いでＲａｂ−９
ｍ胞あ（これは２Ｘ　Ｉ　Ｏ’Ｃ，１０，２ｍｌ増殖培
地／ウェルにおいて９６ウエルの組織培養クラスター（
ｃｏｓｔａｒ）のウェル中に接種されていた）を感染さ
せることによって分離し、そして３７℃において４８時
間インキュベージコンした。
個々のプラークからの子孫のウィルスの４８０クローン
を分離した（５Ｘ９６ウエルの組織培養クラスター）、
９６ウエルの組織培養クラスターを３４．５℃において
３日間インキュベーションし、そして−ａｏ’ｃにおい
て貯蔵し、そしてマスター平板として使用した。
Ｒａｂ−９細胞を、前述のように、１ＯＸ９６ウエルの
組織培養クラスター中に接種し、３７°Ｃで４８時間イ
ンキュベーションし、そしてウェルの各々を５０μｌの
マスター平板のウェルからの増殖培地で感染した（同一
位置において）。２つのコピーをマスター平板の各々か
らつくり、そして３４．５°Ｃにおいて４８時間インキ
ュベーションした。増殖培地を吸引によって除去し、５
０μｌの０．５Ｎ　　ＮａＣ１をウェルの各々に添加し
て、細胞を溶解しかつＤＮＡを解放しｊ；。室温におい
て１夜インキユベーシヨンした後、７５μｍの１゜０モ
ルのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ７，５）および３゜０モルの
ＮａＣ１，０，３モルのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，
０）からなる２０ＸＳＳＣ緩衝液の１２５μｍをウェル
の各々に添加した。
９６ウエルのシュレイヘル・アンド・シュウエル（Ｓ　
ｃｈｌａｉｃｈｅｒ　　ａｎｄ　　Ｓ　ｃｈｕｅｌｌ）
　　（Ｋ　ｅｅｎｅ、　Ｎ　。
Ｈ，）ろ過装置におけるニトロセルロースフィルターを
、ドツトプロット分析のために使用した。
フィルターを水およびｔｘｓｓｃで洗浄した後、ＤＮＡ
試料をフィルターに添加し、ニトロセルロースフィルタ
ーを乾燥し、次いで８０℃に２時間真空乾燥器中で加熱
した。５０ｍ１の３ｘＳＳＣ。
０．０２％（ｖ／ｖ）のフィコール（Ｆ　１ｃｌｌ）　
、Ｏ−０２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、０．０２％（ｖ／ｖ
）のポリビニルピロリドン、５０ｐｇ／ｍｌの沸騰させ
そしてアルカリ変性したサケ精子ＤＮＡ　（以後「変性
したテンハルト溶液」）を含有するプラスチックパウチ
中にフィルターを配置し、そして振盪しながら６０°Ｃ
において１夜インキユベーシヨンした。サケ精子ＤＮＡ
は約５．０ｍｇ／ｍｌの原溶液から添加し、この原溶液
は５０ｍｇのサケ精子ＤＮＡをｌｏｍｌの０．２モルの
ＮａＣ１中に溶解し、１００°Ｃに２０分間加熱してＤ
ＮＡを０．４ｋｂのセグメントに変性および剪断し、次
いでＱ、２ｍｌの１０モルのＨＣＩで中和することによ
って調製した。
次いで、変性したテンハルト溶液を、５０％（■／Ｖ）
のホルムアミド、０．６モルのＮａＣ１，０゜２モルの
トリス−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）　、０．０２モルのＥＤ
ＴＡ、Ｏ，１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、５０μｇ／ｍｌの
アルカリ変性サケ精子ＤＮＡ、および１０　ｐ　ｇｉｍ
Ｉのポリ（Ａ）からなる緩衝液（Ｉｇ「ハイブリダイゼ
ーション緩衝液」）の５０ｍ１と置換した。このバッグ
をオスター・タッチ−アーマチック−バッグ・シーラー
（Ｏｓｔｅｒ　　Ｔｏｕｃｈ　−ａ　−ｍａｔｉｃ　　
Ｂ　ａｇ　　Ｓ　ｅａｌｅｒ）を使用して密閉し、そＬ
”ｒ３７°Ｃで１時間振盪装置上でインキュベーション
した。下の節Ｍに記載するようにして得られた、Ｌａｐ
標識した一本鎖Ｍ１３グローブをバッグに添加しく約１
０　’ｃｐｍ／　ｎＩｌ　／バッグ）そして振盪装置上
で３７°Ｃにおいて４８時間までインキュベーションし
てハイブリダイゼーションを許した。
ハイブリダイゼーションが完結した後、バッグを切断し
、そして溶液をデカンテーションした。次いで、フィル
ターを注意して取り出し、そして約１００ｍ１のハイブ
リダイゼーション緩衝液を含有するトレー中に配置した
。フィルターを３０分間３７℃においておだやかに振盪
しながら５回洗浄し、次いで３７°Ｃ！ｉ：８イテ０　
、３　Ｘ　Ｓ　Ｓ　（４’３０分間洗浄し、次いでろ紙
上に配置して室温においてｌ夜乾燥した。オートラジオ
グラフィーのため、フィルターをサランラップで覆い、
そして増強スクリーンを使用してフジＸ線フィルムに一
８０°Ｃにおいて１〜２日間露出した。
候補のウィルスの各々から２つのドツトプロットを調製
した。一方はグローブＭＩ３−１とハイブリダイゼーシ
ョンさせ、そして他方はプローブＭ１３−３８とハイブ
リダイゼーションさせた。
Ｍ１３−１プローブは、ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ解読領域
の（Ｌ３６ｋｂの５ｃｌｌ断片を含有する一本鎖Ｍ　ｌ
　３ｍｐｌ　９　ＤＮＡであった。Ｍ１３−３８プロー
ブは、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩｒ遺伝子の解読領域の一部お
よび下流の配列にまたがる１、６８ｋｂの５ａｃＩ断片
を含有する一本鎖Ｍ　ｌ　３ｍｐｌ　８　ＤＮＡであっ
た。Ｍ１３−１グローブは野生型ｇＩＩＩ”ＩＢＲＶ株
とハイブリダイゼーションしたが、ＩＢＲＶｇｌｌｒ遺
伝子の解読領域を欠く組換え体とハイブリダイゼーショ
ンしなかった。しかしながら、組換え体のウィルスをＭ
１３−１プローブによって同定することは困難であった
。なぜなら、多くの野生型ウィルスは誤った陰性を与え
たからである。これは、多分、ウェルの各々におけるウ
ィルスの収量の変動性のためであった。劣って増殖する
野生型ウィルスは弱いハイブリダイゼーションのシグナ
ルを与えた。Ｍｌ３−３８グローブは、野生型ｇＩ　Ｉ
　Ｉ’および組換え体ｇｉｌｌ−の両者のウィルスとハ
イブリダイゼーションした。Ｍｌ３−１プローブとハイ
ブリダイゼーションしたプロットをＭｌ３−３８プロー
ブとハイブリダイゼーションしたものと比較することに
よって、ｇＩＩＩ−組換え体はより結論的に同定された
。なぜなら、組換え体はＭｌ３−３８プａ−ブで強いシ
グナルを与えるが、Ｍｌ３−１グローブではシグナルを
与えず、これに対してｇｌ　Ｉ　Ｉ”ＩＢＲＶウィルス
は両者のグローブで強いシグナルを与えるか、あるいは
劣った増殖の場合において、両者のプローブと劣ったシ
グナルを与えた。
組換え体ウィルスの３つクローンを、４８０の候補から
分離した。クローンをＥ１２Ａ、ＣＧ５およびＣ３Ｆと
表示した。
Ｍ１分子ハイブリダイゼーションのためのグローブの調
製 ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ遺伝子を配列決定ＳＪるためにＭ
１３ファージ中でクローニングしたＤＮＡ断片を、ツー
（Ｈｕ）　、Ｎ、Ｔ、ら、Ｇｅｎｅ、１７：　２７１−
２７７　（１９８２）に記載されるようにして、使用し
て一本鎖ＤＮＡプローブをつくっｔこ。
ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子の５ａｌＩ断片（第３図に
おけるヌクレオチド、１２８６−１．６４６）を、ファ
ージＭ１３ｍｐｌＱ中でクローニングした。
ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ遺伝子のｍＲＮＡの遺伝情報を指
定するセンス鎖をＭ１３ｍｐ１９中でクローニングして
Ｍｌ　３−１を産生じ、そしてナンでンス鎖をＭ１３ｍ
ｐ１９中でクローニングしてグローブＭ１３−４を産生
じた。５ａｌｌ断片は、ＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子の解読
領域より内側に位置した。
ＩＢＲＶ　　ｇｉｒｌ遺伝子からのＡ　ｐａ　Ｉ断片の
欠失は、また、５ａｌｌ断片を欠失する。それゆえ、プ
ローブＭ１３−ＩＳよびＭｌ３−４はＩ　ＢＲＶ（Ｎ　
Ｇ）　ｄｌｔｋ、　ｐＬ　Ａ　Ｅ　Ｂ、およびｐＬＡＨ
Ｋとハイブリダイゼーションするが、Ｉ　ＢＲＶ　（Ｎ
Ｇ）ｄｌｔｋｄｌｇ−Ｉ　Ｉ　Ｉ　、ｐＬ　Ａ　Ｅ　Ｂ
ｄｌＡｐａｌ、およびｐＬＡＨＫｄｌＡｐａＩとハイブ
リダイゼーションしない。
Ｓ　ａｃ　Ｉ断片（第３図におけるヌクレオチド８３３
−２，５１０；まＩ：ｐＬＡＥＢ参照）を、ファージＭ
１３ｍｐ１８中でクローニングした。センス鎖をプロー
ブＭ１３ｍｐ１８中でクローニングしてＭｌ３−４１を
産生じ、そしてナンセンス鎖をＭ１３ｍｐ１８中でクロ
ーニングしてグローブＭ１３−３８を産生じた。Ｓ　ａ
ｃ　Ｉ断片は解読領域の一部およびＩＢＲＶ　　ｇＩＩ
Ｉ遺伝子より３″下流のフランキング配列にまたがるの
で、グローブＭ１３−３８およびＭｌ３−４１はｐＬＡ
ＥＢＳｐＬＡＨＫおよびＩ　Ｂ　ＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌ
Ｌｋとハイブリダイゼーションするばかりでなく、かつ
また、それらのＡ　ｐａ　Ｉ欠失誘導体、ｐＬ　Ａ　Ｅ
　ＢｄｌＡｐａｌ、ｐＬＡＨＫｄｌＡｐａＩ、およびＩ
　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ）　ｄＨｋｄｌｇＩＩＩとハイブ
リダイゼーションする。プローブＭ１３−４１はＩＢＲ
Ｖ　　ｇｌＩＩ遺伝子のセンス鎖であるので、節Ｏにお
いてＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子のｍＲＮＡとのハイブ
リダイゼーションに使用した。
プローブを調製するため、２．０μｇの精製した一本鎖
ＤＮＡを５．ＯｎｇのＭ１３ハイブリダイゼーションプ
ローブブライマーと、８３ミリモルのＮａＣ１、Ｉθミ
リモルのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ７゜５）、１０ミリモル
のＭｇ０１２０５９モルのジチオスレイトールからなる
緩衝液の３０μｌ中で６５℃において１０分間アニーリ
ングし、室温に冷却し、次いで次の物質を添加した＝２
０μｌの（”Ｐ）ｄＴＴＰ　（約４００ｍＣ１／ミリモ
ル、１０ｍＣ４／ｍｌ、標準化した水溶液中、Ａ　ｍｅ
ｒｓｈａｍ）２０μｌの（”Ｐ）ｄＣＴＰ　（約４００
ｍＣ１／ミリモル、ｌＱｍｃｉ／ｍｌｓ標準化した水溶
液中、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、１．０１の１０ミリモルの
ｄＡＴＰ。
１．０ミリモルのｄＧＴＰおよび４単位のＥ、ｃｏｌＤ
ＮＡポリメラーゼ、大きい断片（クレノー酵素、Ｂ　ｅ
ｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｌ　ａｂｏｒａ
ｔｏｔｒｉｅｓ）。
この反応混合物を室温において２時間インキュベーショ
ンし、ｌＯμｌの０．２５モルのＥＤＴＡを添加し、開
この混合物を６５℃に１０分間加熱した。標識したグロ
ーブをセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−
２０のカラムクロマトグラフィー（０５ＸＩ５ｃｍ）に
よって精製した。この手順は日常的に、Ｉ　Ｏ’ｃｐｍ
／μｇのＤＮＡより太さ比活性をもつプローブを生ずる
。
Ｎ１組換え体ウィルスから精製したＤＮＡの分析 高い純度のウィルスのＤＮＡを、組換え体の３つのクロ
ーンＥ１２Ａ、Ｃ６ＧおよびＣ３Ｆから前述のようにし
て調製した。得られたＤＮＡをＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉまた
はＢａｍＨＩ　＋　ＥｃｏＲＩで消化し、そして制限エ
ンドヌクレアーゼの断片は、０．０４モルのトリズマ（
Ｔｒｉｚｍａ）塩基、０．０３モルのＮａＨ＊Ｐ○４お
よび０，０１モルのＥＤＴＡ（ｐＨ８，１）からなる緩
衝液中に沈めた０、６％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル上
で１６時間４°Ｃおよび３５ポルトにおいて電気泳動す
ることによって分離した。対照として、親ウィルスｔｋ
−Ｉ　Ｂ　ＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋからのＤＮＡを同
一の方法で処理し　ｌこ　。
得られるゲルを電気泳動緩衝液中において０゜５μｇ／
ｍ＋の臭化エチジウムで着色し、そしてＵ■トランスイ
ルミネーターで撮影した。第４Ａ図に示す結果から明ら
かなように、これらの組換え体Ｅ１２Ａ、Ｃ６Ｇおよび
Ｃ３Ｆ、および親のＤＮＡのＨ４ｎｄｌＩＩ制限エンド
ヌクレアーゼのプロフィルは類似するが、ただしＩＯ，
５ｋｂの断片は組換え体ウィルスのＤＮＡ中に存在する
が、親のウィルスのＤＮＡ中には存在せず、そして親ウ
ィルスＤＮＡ中の１１．１ｋｇの断片の量は組換え体ウ
ィルスＤＮＡ中より大きい。これが示すように、親のｔ
ｋ−Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄＩｔｋ中の１１゜１ｋｂ
の断片はこのゲル電気泳動計において分離できない２つ
の異なる断片を含有し、そしてＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子
を含有する断片の１つは組換え体ウィルスにおいてｉｏ
、５ｋｂに大きさが減少していた。第４Ａ図が、また、
立証するように、３つの組換え体、Ｅ１２Ａ、Ｃ６Ｇ３
よびＣ３Ｆは、ＨｉｎｄＩｒＩまたはＥｃｏＲＩ　＋　
ＥａｍＨＩの消化後、同一の制限エンドヌクレアーゼの
プロフィルを有した。親のウィルスＤＮＡをＢａｍＨＩ
＋ＥｃｏＲＩで二重に消化すると、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩ
Ｉ遺伝子を含有する２、５ｋｂの断片が生じた。この断
片は組換え体ウィルスＤＮＡ中には存在しなかった。し
かしながら、親の２．５ｋｂの断片より１．４ｋｂだけ
短い、１．１ｋｂの断片は組換え体ウィルスＤＮＡ中に
存在した。この断片は臭化エチジウム着色ゲルにおいて
わずかに検出可能であった（第４Ａ図参照）が、サザン
ブリッティング後容易に観察可能である（第４Ｂ図参照
）。これらの結果が示すように、組換え体ウィルス中の
Ｉ　ＢＲＶｇｌ　Ｉ　Ｉ遺伝子は大きさが１．４ｋｂだ
け減少していた。
組換え体の１つ、Ｃ６Ｇ、および親のｔｋ−ＩＢＲＶ　
（ＮＧ）ｄｌＬｋ　　ＤＮＡをさらに分析した。この組
換え体ウィルスおよびｔｋ−Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄ
ＩｔｋかものＤＮＡをＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ
　１ＢａｍＨＩ　＋Ｈｉｎｄｒ　Ｉ　Ｉ、およびＰｓｔ
Ｉで消化し、そして、前述のように、反復実験の試料を
アガロースゲルの電気泳動にかけた。結果を第５Ａ図お
よび第５Ｂ図に示す。第５Ａ図および第５Ｂ図に示され
るように、Ｈｉｎｄｒｌｒ断片の変化は第４Ａ図に示す
ものと同一であった。さらに、第５Ａ図および第５Ｂ図
に示すように、親ウィルスの１８゜５ｋｂのＥｃｏＲＩ
断片および３．２ｋｂのＰｓＬＩ断片は、組換え体ウィ
ルス、０６Ｇ、においテ、大キさが、それぞれ、１７．
０ｋｂおよび１．７ｋｂの断片に減少した。
電気泳動後、すべての３つの電気泳動の分析がらのゲル
を、１．０モルのＫＯＨを含有するガラスバッキングの
トレー内に室温において３０分間配置し、次いで１．０
モルのトリス−ＨＣＩ　（ｐＨ７，０）および０．６モ
ルのＮａＣｌからなる緩衝液中に室温において６０分間
入れた。次いで、処理したゲルをプロット装置（Ｂ　ｅ
ｔｈｅｓｄａ　　ＲｅｓｅａｒＣｈ　　Ｌ　ａｂｏｒａ
ｔｏｔｒｉｅｓ）に移した。ニトロセルロースのフィル
ターを水中で１０分間、２ＯＸＳＳＣ中で５分間予備湿
潤し、そしてゲル上に配置した。
移送流体として２０ＸＳＳＣを使用して、プロッティン
グを約２４時間違行させた。付着するゲルをニトロセル
ロースのフィルターがら除去し、そしてフィルターを５
ｘＳＳＣですすぎ、室温において１夜合成し、次いで真
空デシケータ−内で８０℃において２時間ベーキングし
た。ニトロセルロースのフィルターを、前述のように、
プラスチックのバッグ中に入れ、５０ｍ１の変性テンハ
ルト溶液で６０℃で１夜、そしてハイブリダイゼーショ
ン緩衝液で３７°Ｃにおいて１時間予備処理した。
３つの別々のゲルからのニトロセルロースのフィルター
を、Ｍｌ３−３８プローブまたはＭｌ　３−■プローブ
とハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーショ
ンおよび洗浄のための手順は前述と同一であった。結果
を第４Ｂ図、第５Ｂ図および第６Ｂ図に示す。
第４Ｂ図および第５Ｂ図は、Ｍｌ３−３８プローブとの
ハイブリダイゼーション後のオートラジオダラムを示す
。第６Ｂ図は、Ｍｌ３−１プローブとのハイブリダイゼ
ーション後のオートラジオダラムを示す。第６Ｂ図に示
すように、Ｍｌ３−１プローブは組換え体Ｃ６Ｇウィル
スＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ断片のいずれともハ
イブリダイゼーションしないが、このプローブは親のｔ
ｋＩ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋウィルスＤＮＡの１
１゜１ｋｂのＨｉｎｄＩ　　Ｉ　Ｉ断片、１ｇ、５ｋｂ
のＥｃｏＲＩ断片、３．２ｋｂのＢａｍＨＩ　＋Ｈｉｎ
ｄｌ　Ｉ　ｒ断片とハイブリダイゼーションした。第５
Ｂ図に示すように、Ｍｌ３−３８プローブは、Ｍｌ３−
１がハイブリダイゼーションしたのと同一の制限エンド
ヌクレアーゼ断片とハイブリダイゼーションするばかり
でなく、かつまた、組換え体Ｃ６ＧウィルスＤＮＡの９
．６ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片、１７ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ断片、１．７ｋｂのＰｓｔｌ断片、および１．８ｋ
ｂのＢａｍＨＩ　＋Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片とハイブリ
ダイゼーションした。第４Ｂ図に示すように、Ｍｌ３−
３８プローブは、また、期待するように、Ｃ６ＧＳＥ１
２ＡおよびＣ３Ｆのｉｏ、４ｋｂのＨｉｎｄｌ　ｒ　Ｉ
断片および１．１ｋｂのＢａｍＨＩ　＋　Ｅｃ。
Ｒ１断片とハイブリダイゼーションした。
これらの結果が結論的に立証するように、組換え体ウィ
ルスはＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ　Ｉ遺伝子の解読領域から
約１．５ｋｂの配列を欠いており、そして組換え体は親
ｔｋ−Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋおよびｐＬＡＨ
ＫｄｌＡｐａｌの間の相同組換えによって産生されｔこ
。
クローンＣ６Ｇを、それ以上の研究のために選択し、Ｉ
　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ）　ｄｌｔｋｄｌｇｌ　Ｔ　ｒと
表示し、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（Ａ　ｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔ　ｙｐｅ　　Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ　　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受託された（ＡＴＣ
ＣＮｏ、　ＶＲ−２１８１）０、　Ｉ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ
Ｇ）　ｄＨｋｄｌｇＩ　Ｉ　Ｉ　テ感染したウシ腎細胞
中で産生されたｍＲＮＡの分析 ウシ腎細胞（以後ｒＭＤＢＫ細胞Ｊ）（ＡＴＣＣＮｏ、
ＣＣＬ　　２２）をローラーボトル（ｌＯＸ４２ｃｍ）
中で１０’細胞／２００ｍ１増殖培地／ボトルで接種し
、そして３７℃において４日間インキュベーションした
。次いで、増殖培地を除去し、そして単層培養物を３７
°Ｃにおいて１時間１０ｍ１のＩＢＲＶ（Ｌｏｓ　　Ａ
ｎｇｅｌｅｓ）またはＩＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋｄ
ｌｇｌ　Ｉ　（の懸濁液で５．０ｐ。
ｆ、　ｕ、　／細胞のｍ、　ｏ、　ｉ、において感染し
た。次に、ｌｏＯｍｌの新鮮な増殖培地をローラーボト
ルの各々に添加し、そしてインキュベーションを３７℃
において９時間続けた。インキュベーション期間の終り
において、増殖培地をデカンテーションし、そして感染
した細胞を、その場で、６，０モルのグアニジニウムイ
ンチオシアネート、５゜０モルのクエン産ナトリウム（
ｐＨ７，０）　、Ｏ。
１モルの２−メルカプトエタノール、および０゜５％（
ｗ／　Ｖ）のサルコシルからなる緩衝液の８゜０ｍｌ中
に溶解し、そして試験管に移した。この粘性溶液を２０
Ｇ１．５針に数回通過させて粘度を減少させ、ＣｓＣ１
（１，０ｇのＣｓＣｌ／　２　、５ｍｌの溶液）を添加
し、そしてこの溶液をポリアロマ−管中のＯ，１モルの
０．１モルのＥＤＴＡ中の５．７モルのＣｓＣ１の１．
５ｍｌのクツションより上で層状化した。管をベックマ
ン５Ｗ４１．１０−ター内で３９，０００ｒｐｍおよび
２０°Ｃにおいて２０時間遠心した。懸濁液をピペット
で注意して除去し、そしてＲＮＡの沈殿を、１０ミリモ
ルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、５．０ミリモルの
ＥＤＴＡＢよび１．０％（Ｗ／　Ｖ）のＳＤＳからなる
緩衝液の５．０ｍｌ中に溶解した。このＲＮＡを溶液を
５．Ｏｉｌのクロロホルムおよびｌ−ブタノールの４：
ｌ混合物で１回抽出し、そして水性層を新しい管に移し
た。有機相をｌθミリモルのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ７，
４）　、５．０ミリモルのＥＤＴＡＢよび１．０％（ｖ
／　ｖ）のＳＤＳからなる緩衝液の３．Ｏｉｌで再び抽
出した。２つの抽出液を一緒にし、０．１体積の３．０
モルの酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）および２．２体積
のエタノールを添加し、物質を−２０”Ｏで２時間貯蔵
し、次いでＲＮＡの沈殿を１０．ｏｏｏＸｇにおいて２
０分間遠心することによって集めた。
ポリアデニル化（ポリＡ）ＲＮＡを、アビ（Ａｖｉ）　
、Ｈ，ラ、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ　ｒ。
ｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　）　
Ｕ　Ｓ　Ａ、　　６９：１４０８−１４１２　（１９７
２）に記載するようにして選択した。さらに詳しくは、
オリゴ（ｄＴ）−セルロース［２型、コラポレイテイブ
・リサーチ・インコーホレーテッド（ｃｏｌｌａｂｏｒ
ａＬｉｖｅＲｅｓｅａｃｈ、　　Ｔ　ｎｃ、　）　］　
を、２０ミリモルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）　、
０．５モルのＬ　ｉＣｌ　ｓｌ、０ミリモルのＥＤＴＡ
、および０，２％（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳからなる緩衝液（
以後「装入緩衝液」）中に懸濁し、そして１．ｏｃｍの
カラムを使い捨てポリプロピレンカラム（Ｂｉｏ−Ｒａ
ｄ）中で調製した。このカラムを、順次に、０．１モル
のＮａＣ１および５，０ミリモルのＥＤＴＡからなるＩ
液の３．Ｏｉｌで、水で、カラムの流出液のｐＨが８．
０より小さくなるまで、洗浄しそして５゜Ｏｉｌの緩衝
液で洗浄した。１．Ｑｍｌの水中に溶解したＲＮＡ（２
０μｇまで）を６５°Ｃに５分間加熱し、１−Ｏｉｌの
２×装入緩衝液を添加し、次いで室温に冷却し、そして
カラムに適用した。流過する分画を集め、再び６５°Ｃ
に５分間加熱し、冷却し、そして同一カラムに再び適用
した。カラムをｌｏｍｌの装入緩衝液で洗浄し、次いで
４．Ｏｉｌの減少した濃度、すなわち、０゜１モルのＬ
ｉＣ＋を含有する装入緩衝液で洗浄した。ポリ（Ａ）　
ＲＮＡを、１０５９モルのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７゜５
）、１．０ミリモルのＥＤＴＡ、および０．０５％（Ｗ
／　Ｖ）のＳＤＳからなる緩衝液の３．Ｑｍｌで溶離し
、そして溶離した分画からＯ，１体積の酢酸ナトリウム
（ｐＨ５，２）および２．２体積のエタノールを添加し
、そして−２０°Ｃに２時間保持することによって沈殿
させた。ＲＮＡの沈殿を１０．ＯＯＯＸｇにおいて１０
分間遠心することによて集め、そして１００μｌの水中
に溶解しに　。
得られるポリ（Ａ）ＲＮＡ　（２０μｇまで）を５０°
Ｃにおいて１時間１６μｍの１．０モルのグリオキサー
ル、５０％（Ｖ／Ｖ）のジメチルスルホキ７ドおよび１
０５９モルのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７゜４）からなる緩
衝液中でインキュベーションし、そして室温に冷却した
。次いで、５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１０ミリ
モルのＮａＨｘＰ　Ｏｉ　ＣｐＨ７，０）および０６４
％（ｗ／ｖ）のブＩｆｆ　モア　エノールブルーからな
る溶液の４．０μｌを添加し、そしてＲＮＡを１０５９
モルのＮ　ａＨ２Ｐ　Ｏａ　（ｐＨ７，４）中に沈めた
１、１％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル（２０Ｘ２５ｃｍ）
上に装入し、そして３５ボルトにおいて２４時間電気泳
動した。ＨｉｎｄＩＩ■で切断した分子量のマーカーの
ファージラムダＤＮＡを、前述のように、グリオキサー
ルで処理し、そしてＲＮＡ試料と並行して電気泳動した
。
この状態における変性したＤＮＡの電気泳動の移動度は
、同一大きさのＲＮＡのそれとほぼ同一である。
電気泳動後、ゲルをＤＮＡプロット・トランスファー壷
システム（Ｂ　ｏｌｔ　　Ｔ　ｒａｎｓｆｅｒ　　Ｓ　
ｙｓｔｅｍ）（Ｂ　ｅｔｈｅｓｄａ　　Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｔｒｉｅｓ）を使用してニト
ロセルロースのシート上にブロツティングした。プロッ
トを室温において乾燥し、そして真空デシケータ内で８
０°Ｃで２時間ベーキングした。ハイブリダイゼーショ
ンは、前述のように、Ｍ１３−３８およびＭ！３−４１
プローブを使用して実施した。分子量のマーカーはニッ
ク翻訳したファージラムダＤＮＡとのハイブリダイゼー
ションによって検出した。
前述のように、Ｍ１３−３８およびＭ１３−４１プロー
ブは、ＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ　Ｉ遺伝子の解読配列の一
部および下流の配列にまたがる１、６８ｋｂの配列を含
有する一本鎖Ｍ１３ｍｐ１ｇＤＮＡである。ＩＢＲＶ　
　ｇＩＩＩ遺伝子のセンス鎖（解読鎖）はプローブＭｌ
　３−４１中でクローニングしたので、プローブＭ１３
−４１は野生型ＩＢＲＶ　（Ｌ　ｏｓ　　Ａ　ｎｇｅｌ
ｅｓ）によってコードされるＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子の
ｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするであろうことが
予測された。ＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子の解読領域が失わ
れるが、開始コドン５′末端における調節領域およびＩ
ＢＲＶｇｌＴＴ解読領域の３′末端におけるポリ（Ａ）
シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）が保持されるので、Ｉ　Ｂ　
ＲＶ　（Ｎ　Ｇ）　ｄｌｔｋｄｌｇｌ　ｒ　Ｉは野生型
ｍＲＮＡよりも約１．５ｋｂだけ小さいｍＲＮＡの遺伝
情報を指定することが期待されるであろう。結果は第７
図に示されている。
第７図に示すように、Ｍ１３−４１プローブはＩＢＲＶ
（Ｌｏｓ　　Ａｎｇｅｌｅｓ）感染した細胞の２゜３ｋ
ｂのｍＲＮＡとハイブリダイゼーションした。
このｍＲＮＡはＩ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ）　ｄＨｋｄｌ
ｇｌ　Ｉ　Ｉ感染した細胞中には存在しなかった。その
代わり、Ｍ１３−４１プローブはＩ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　
Ｇ）　ｄｌＬｋｄ１ｇｌｌＩ感染した細胞からの約０．
６ｋｂのｍＲＮＡにハイブリダイゼーションした。した
がって、２゜３ｋｂのｍＲＮＡは野生型ＩＢＲＶ　　ｇ
Ｉ　Ｉ　Ｉ遺伝子によってコードされ、そして０．６ｋ
ｂのｍＲＮＡはそれから欠失した解読配列を有するＩ　
ＢＲＶｇｉｌｌ遺伝子によってコードされるたと結論さ
れる。第７図に示すように、Ｍ１３−４１プローブは２
．３ｋｂのｍＲＮＡよりも強くなくＩＢＲＶ（Ｌ　ｏｓ
　　Ａ　ｎｇｅｌｅｓ）感染ｍ胞の３．７ｋｂのｍＲＮ
Ａとハイブリダイゼーションした。３．７ｋｂ＋７）ｍ
ＲＮＡはｒ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ）　ｄｌＬｋｄｌｇｌ
　Ｉ　Ｉ感染細胞中に存在しなかった。３．７ｋｂのｍ
ＲＮＡが、また、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子によって
、あるいはＩＢＲＶ　　ｇｉｌｌ遺伝子と部分的に重複
するあるそしてのＩＢＲＶ遺伝子によってコードされた
かどうかが明瞭ではない。
さらに、第７図に示すように、ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺
伝子の比解読鎖とハイブリダイゼーションした、Ｍ１３
−３８プローブは、ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ　　ＲＮＡ、
すなわち、０．６．２，３および３．７ｋｂのｍＲＮＡ
ｔｏハイブリダイゼーションしなかったが、Ｉ　ＢＲＶ
　（Ｌｏｓ　　Ａｎｇｅｌｅｓ）およびＩ　Ｂ　ＲＶ　
（Ｎ　Ｇ）　ｄｌｔｋｄｌｇｌ　Ｉ　Ｉの両者の７．２
．５．５．２．９．１．５および１．０５ｋｂのｍＲＮ
Ａとハイブリダイゼーションした。これらの後者のｍＲ
ＮＡは、多分、ＩＢＲＶ　　ｇＩ　Ｉ　Ｉ遺伝子の３゛
末端から下流に位置する遺伝子の相補的銀からコードさ
れるであろう。
０、　Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋｄｌｇｌ　Ｉ　
Ｉ感染細胞の抽出物からの３Ｈ−チミジン標識ＩＢＲＶ
　　ｇｌ　Ｉ　Ｉ ＭＤＢＫ細胞を４オンスのビン内で１０’細胞／１０ｍ
１の増殖培地／びんにおいて接種し、そして３７℃にお
いて２日間インキュベーションしｔこ。
次いで、ＭＤＢＫ細胞をＩ　Ｂ　ＲＶ　（Ｌｏｓ　　Ａ
ｎｇｅｌｅｓ）、Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋを得
るために使用し！二親つィルス、で、あるいはＩ　Ｂ　
ＲＶ　（ｃｏｏｐｅｒ）マタはＩ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ
）　ｄｌｔｋｄｌｇＩ　Ｉ　Ｉ　テ、約５゜Ｏｐ、　ｆ
、　ｕ、　／細胞のｍ、　ｏ、　ｉ、において３７℃で
１時間感染させた。次いで、増殖培地を除去し、そして
単層をグルコース不合増殖培地で洗浄した。
２．０％（ｖ／ｖ）透析胎児径ウシ血清および１００μ
Ｃｉの”Ｈ−Ｄ−（２，６３８）−マンノース（５４Ｃ
ｉ／ミリモル、Ａ　ｒｍａｓｈａｍ、英国）を補充した
４、０ｍｌのグルコース不含増殖培地を添加し、そして
感染した細胞を３４．５°Ｃで２０時間インキュベーシ
ョンした。増殖培地を吸引によって除去し、そして１．
０％（ｖ／　Ｖ）のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ
　４０．０．０６２５モルのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ７，
０）　、および０．９％（ｖ／ｖ）のＮａＣ１からなる
緩衝液の４００μｌを添加した。
この細胞懸濁液を一８０°Ｃで凍結し、融解し、１゜５
　ｍｌ（７）エツペンドルフの遠心機の管に移し、ソシ
て超音波処理した。
７．０μｍの抽出液を、３０μｌの抗Ｉ　ＢＲＶ血清（
ＰＣ−４）［Ｓ、マクコンネル（Ｍ　ｃＣｏｎｎｅｌｌ
）博士から提供された、フィード・ロット（ｆｅｅｄ　
　１ｏｔ）中でＩＢＲＶにより自然に感染した雌牛から
の血清１と、あるいはＩＢＲＶ　　ｇＩＩｒに対するモ
ノクローナル抗体（Ｉ　ｇＧｚ−）　　（ＭＣ２９０５
）の５．Ｏ／７１と混合し［マーシャル（Ｍ　ａｒｓｈ
ａｌｌ）　、Ｒ、Ｌ　、　　ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　
、５７　：　７４５−７５３　（１９８６）］、そして
この混合物を４°Ｃ！ｉ：１８時間保持した。次に、１
５０μｌのパンソービン（Ｐ　ａｎｓｏｒｂｉｎ）　　
［ホルマリン固定したスタフィロコッカス・アウレウス
（Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ）
　ＨＡ胞、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍｌ　を添加し、そして
この混合物を４°Ｃで４５分間インキュベーションし、
次いで１０．０００ｇおよび４℃において１０分間遠心
した。上澄みを除去し、沈殿をＰＢＳ中の０．０５％（
ｗ／ｖ）ツイーン２０の３００μｌ中に再懸濁し、そし
て反復した遠心によって３回洗浄した。最後に、沈殿を
６０μｌの０゜０６モルのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ８，９
）、２．０％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ、４．０％（ｖ／　ｖ
）の２−メルカプトエタノール、１５％（Ｖ／Ｖ）のグ
リセロール、０．０５％（Ｗ／Ｖ）のブロモフェノール
ブルーからなる緩衝液中に懸濁させ、沸騰水浴中で３分
間加熱し、そして上澄みを７．５％（ｗ／ｖ）の５ＤＳ
−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動分析にかけた［米
国特許出願第８２３．４３９号、１９８６年１月２８日
提出；およびキット（Ｋｉｔ）Ｓ、ら、Ａｍ、　　Ｊ、
　Ｖｅｔ、　　Ｒｅｓ、　、４８　：　７８０−７９３
　（１９８７）］。電気泳動後、ゲルをオートラジオグ
ラフのエンハンサ−（ｅｎｈａｎｃｅｒ）（Ａ　ｕｔｏ
ｒｌｕｏｒ）　　［ナショナル・ダイアダナスチフス（
Ｎ　ａｔｉｏｎａｌ　　Ｄ　ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）　
］で含浸させ、乾燥し、そしてフジＸ線フィルムに一８
０°Ｃにおいて露出しＩ；。
第８図に示すように、抗ＩＢＲＶウシ血清（Ｐｃ−１４
）はＩＢＲＶ感染した細胞抽出物中の野生型Ｉ　ＢＲＶ
の主要な糖タンノくり質の実質的番こすべてを沈殿させ
たが、ただし９２ｋＤ〜９７ｋＤの分子量の糖タンパク
質（ＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ　Ｉ）ｌまＩ　Ｂ　ＲＶ　（
Ｎ　Ｇ）　ｄＨｋｄｌｇＩ　Ｉ　Ｉ感染した細胞の抽出
物から沈殿しなかった。また、第８図番こ示すように、
モノクローナル抗体（ＭＣ２９０５）＋１９２ｋＤの分
子量の糖タンパク質、およびその７９ｋＤの前駆体蛋白
質を、ＩＢＲＶ（Ｌｏｓ　　ＡｎｇｅＩｅｓ）感染した
、あるいはＩ　Ｂ　ＲＶ　（ｃｏｏｐｅｒ）感染した細
胞の抽出物から沈殿させたが、ボ１ノペブチドはモツク
（ｍｏｃｋ）感染したあるし１ＣまＩＢＲＶ（Ｎ　Ｇ）
　ｄＨｋｄｌｇｌ　Ｉ　Ｉ感染した細胞の抽出物力）ら
沈殿しなかった。これらの結果が立証するように、Ｔ　
ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋｄｌｇＩ　Ｉ　Ｉは抗原性
ＩＢＲＶ　　ｇＩ　Ｉ　Ｉポリペプチド（９２ｋＤ〜９
７ｋＤの分子量）を産生することができなし１゜Ｑｌ　
ＩＢＲＶ株のＴＫ活性 二重欠失突然変異、Ｉ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ）　ｄｌｔ
ｋｄｌｇＩＩＩ、が機能的ＴＫ活性を誘発する能力を各
ことを明らかにするために、チミジンプラークのオート
ラジオグラフィーの実験をｔｋ−Ｒａｂ（ＢＵ）細胞中
で、キット（Ｋｉｔ）、Ｓ、ら、Ａｍ、Ｊ。
Ｖｅｔ、Ｒｅｓ、　、４８　：　７８０−７９３　（１
９８７）および米国特許第４．５１４，４９７号に記載
されるようにして実施した。これらの実験により、モッ
ク感染したｔｋ−Ｒａｂ（ＢＵ）細胞はウィルスのプラ
ークをもたず、そして３Ｈ−チミジンを細胞のＤＮＡ中
に組込まなかった。しかしながら、ｔｋ”　　ＩＢＲＶ
（Ｌｏｓ　　Ａｎｇｅｌｅｓ）感染したおよびｔｋ−Ｉ
　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋｄｌｇｌ　Ｉ　Ｉ感染し
たＲａ：（ＢＵ）の単層は多くのプラークを有した。
ｔｋ”　　Ｉ　Ｂ　ＲＶ　（Ｌｏｓ　　Ａｎｇｅｌｅｓ
）の子孫によってつくられたプラークは３Ｈ−チミジン
で標識されたが、ｔｋ−ｒ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄＨｋ
ｄｌｇｌ　Ｉ　［の子孫でつくられたプラークは３Ｈ−
チミジンで標識されなかった。これらの結果が立証する
ように、ＩＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋｄｌｇｌ　Ｉ　
Ｉ　（ＡＴＣＣＮｏ。
ＶＲ−２１８１）は、その親のＩＢＲＶ（ＮＧ）ｄｌｔ
ｋ（ＡＴＣＣＮｏ、ＶＲ−２１１２）と同様に、機能的
ＴＫ活性を生成することができない。
Ｒ，ＩＢＲＶ株の温度抵抗性 Ｉ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ）　ｄｌｔｋｄｌｇｌ　Ｉ　Ｉ
が温度抵抗性であることを立証するため、次の実験を実
施した。
ＭＤＢＫ細胞細胞の全面生長以下の単層（５ｕｂｃｏｎ
ｆｌｕｅｎＬ　　ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を野生型ＩＢＲ
Ｖ（ＬｏｓＡ　ｎｇｅｌｅｓ）またはＥ　Ｂ　ＲＶ　（
Ｎ　Ｇ）　ｄｌｔｋｄｌｇｌ　Ｉ■で約０．０　ｉｐ、
　ｆ、　ｕ、　／細胞のｍ、　ｏ、　ｉ、で感５℃およ
び３９．１’Ｏにおいてインキュベーションした。ウィ
ルスの収穫物を感染後３時間および４８時間に調製し、
そして米国特許環４，５１４゜４９７号に記載されるよ
うにしてＭＤＢＫ細胞中で３４．５°Ｃおよび３９．１
’Ｏにおいてプラーク滴定した。収穫物を感染後３時間
に調製したとき、はぼｌ　０１ｐ、　ｆ、　ｕ、　／ｍ
ｌのウィルスが得られた。
これは入力ウィルスの吸収および浸透直後のウィルスの
存在を表わす。結果を下表に示す。
上の表２が立証するように、それぞれ、ＩＢＲＶ　（Ｌ
　ｏｓ　　Ａ　Ｂｅ１ｅｓ）およびＩ　ＢＲＶ　（ＮＧ
）　ｄｌＬｋｄＩｇｌ　Ｊ　Ｉで３４，５°Ｃにおいて
ＭＤＢＫ細胞を感染した後４８時間において、ウィルス
の収量は７．７ＸＩＯ’および２．１Ｘｌｏ’ｐ、ｆ、
ｕ。
／ｍｌに増加した（３４．５℃における滴定）。３９．
１°ｃｒ：ｓいて増殖したＩ　ＢＲＶ　（Ｌｏｓ　　Ａ
ｎｇｅｌｅｓ）　８よびＩ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔ
ｋｄｌｇＩ　Ｉ　Ｉの４８時間の収量は、それぞれ、約
３．９ＸＩＯ’および５．１ＸＩＯ’であった（３４．
５°Ｃにおける滴定）。実験誤差の範囲内で、収量は３
９゜１℃および３４．５°Ｃにおいて実施した滴定につ
いて同様であった。こうして、組換え体ウィルス、Ｌｋ
−Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋｄｌｇＩ　Ｉ　Ｉは
野生型ＩＢ　ＲＶ　（Ｌｏｓ　　Ａｎｇｅｌｅｓ）株と
同じようによく３４．５°Ｃ〜３９．１’Ｃの温度範囲
にわたって増殖することができることが明らかである。
すなわち、いずれのウィルスも温度感受性の性質を示さ
ない。
これに関して、ｔｋ−Ｉ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ）　ｄｌ
ｔｋｄｌｇｌ［■は、また、前述のｔｋ−Ｉ　Ｂ　ＲＶ
株、すなわち、ＩＢＲＶ　（Ｂ８−Ｄ５３）およびＩＢ
ＲＶ（ＮＧ）ｄｌＬｋ（米国特許環４，５６９，８４０
号および米国特許環４，７０３，０１１号）に類似する
。
本発明は詳細にその特定の実施態様を参照して説明して
きたが、当業者にとって明らかなように、種々の変更お
よび変化はその精神および範囲を逸脱しないで可能であ
る。
本発明の主な態様および特徴は、次の通りである。
１、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子における欠失、挿入ま
たは欠失および挿入の両者の結果、抗原性ＩＢＲＶ　　
ｇｌｌｌポリペプチドを産生することのできない感染の
ウシ鼻気管支炎ウィルス。
２、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、ＩＢＲＶ　
　ｇｌ　Ｉ　Ｉ遺伝子における欠失の結果、抗原性ＩＢ
ＲＶ　　ｇｌｌｌポリペプチドを産生ずることができな
い上記第１項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
３、前記欠失は約１０〜１５００ｂｐの大きさである上
記第１項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
４、前記欠失は約７５〜２００ｂｐの大きさである上記
第３項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
５、前記挿入は約８〜５０００ｂｐの大きさである上記
第１項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
６、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、また、ＩＢ
ＲＶｔｋ遺伝子における突然変異の結果、機能的ＴＫを
産生することができない上記第１項記載の感染のウシ鼻
気管支炎ウィルス。
７、ＩＢＲＶ　　ｔｋ遺伝子における前記突然変異は欠
失突然変異である上記第６項記載の感染のウシ鼻気管支
炎ウィルス。
８、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、また、温度
抵抗性である上記第１項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウ
ィルス。
９、前記ウィルスはＩ　Ｂ　ＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋ
ｄｌｇＩＩＩ（ＡＴＣＣＮｏ、ＶＲ−２１８１）の同定
特性を有する上記第１項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウ
ィルス。
１０、前記ウィルスは凍結乾燥されている上記第１項記
載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
１１、工程： （１）雑種プラスミドを構成し、前記プラスミドはクロ
ーニングベクターおよびＩＢＲＶのＤＮＡ断片からなり
、前記断片はＩＢＲＶ　　ｇ■ｌｌ遺伝子の実質的にす
べておよびそのフランキング配列を含有し、 （２）ＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ　Ｉ遺伝子の実質的にすべ
てより少なくが存在すると同時に欠失に各側に隣接する
ＩＢＲＶ　　ＤＮＡ配列を保持するように、工程（１）
の雑種プラスミドからＤＮＡ配列を欠失し、 （３）、Ｉ　ＢＲＶ宿主細胞において、工程（２）の雑
種プラスミドを感染のｇｌ　Ｉ　Ｉ”　　　ＩＢＲＶＤ
ＮＡと同時トランスフェクションし、そして（４）工程
（３）において得られた子孫のウィルスをスクリーニン
グしてＩ　ＢＲＶ突然変異を同定しかつそれを産生じ、
前記突然変異はＩ　ＢＲＶｇｒｚ遺伝子における欠失の
結果抗原性ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩポリペプチドを産生ず
ることができない、 からなる方法によって産生された、ＩＢＲＶｇＩ１１遺
伝子における欠失の結果、抗原性ＩＢＲＶｇＩＩＩポリ
ベグチドを産生できない感染のウシ鼻気管支炎ウィルス
。
１２、前記欠失は約１Ｏ−１５００ｂｐの大きさである
上記第１１項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
１３、前記欠失は約７５〜２００ｂｐの大きさである上
記第１２項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
１４、工程（３）の感染のｇＩＩＩ”　　　ＩＢＲＶ　
　ＤＮＡは、工程（４）において得られるＩＢＲＶ突然
変異がＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ遺伝子における欠失の結果
、抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌポリペプチドを産生ずる
ことができず、かつＩＢＲＶＬｋ遺伝子における突然変
異の結果、機能的ＴＫを産生ずることができないように
、機能的ＴＫを産生することができないＩＢＲＶ突然変
異から誘導される上記第１１項記載の感染のウシ鼻気管
支炎ウィルス。
１５、機能的ＴＫを産生ずることができない前記Ｉ　Ｂ
ＲＶ突然変異は、ＩＢＲＶ　　ｔｋ遺伝子における欠失
の結果、前記ＩＢＲＶ　　Ｌｋ遺伝子を産生ずることが
できない上記第１４項記載の感染のつシ鼻気管支炎ウィ
ルス。
１６、前記ＩＢＲＶ突然変異はＩ　ＢＲＶ　（ＮＧ）ｄ
ｌｔｋである上記第１５項記載の感染のウシ鼻気管支炎
ウィルス。
１７、工程（３）の感染のｇｌ　Ｉ　Ｉ“　ＩＢＲＶ　
　ＤＮＡは、工程（４）の得られるＩ　ＢＲＶ突然変異
が、ＩＢＲＶ　　ｇｒ　Ｉ　Ｉ遺伝子における欠失の結
果、抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩポリペプチドを産生す
ることができない温度抵抗性Ｉ　ＢＲＶ突然変異である
ように、温度抵抗性ＩＢＲＶから誘導される、上記第１
１項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
１８、さらに工程（５）： （５）工程（４）の得られるＩ　ＢＲＶ突然変異ヲ温度
感受性ウィルスについて非許容温度において増殖して、
ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ遺伝子における欠失の結果、抗原
性ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩポリペプチドを産生ずることが
できない温度抵抗性ＩＢＲＶ突然変異について選択しか
つそれを産生ずる、を含む上記第１１項記載の感染のウ
シ鼻気管支炎ウィルス。
１９、前記クローニングベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐ
Ｂ　Ｒ３２５、ｐＭＢ９、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、
ｐＨＣ７９、ｐＵｃ１８、ｐＵＣ１９，７アージシヤロ
ン２８、ｐＫＢ　ｌ　ｌ、　ｐＫＳＶ　−１０およびｐ
ＭＡＲ４２０から成る群より選択される上記第１１項記
載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。　　２０、前記ク
ローニングベクターはｐＢＲ３２２である上記第１９項
記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
２１工程（２）の得られる雑種プラスミドはｐＬ　Ａ　
ＨＫｄｌＡｐａｌである上記第１１項記載の感染のウシ
鼻気管支炎ウィルス。
２２、前記ウィルスは凍結乾燥されている上記第１Ｉ項
記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
２３、欠失したＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子配列の各側
に隣接したＩＢＲＶ　　ＤＮＡ配列が保持されるように
、かつ工程（４）の得られるＩ　ＢＲＶ突然変異が、Ｉ
ＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子における欠失および挿入の両
者の結果、抗原性ＩＢＲＶｇＩ　Ｉ　１ポリペプチドを
産生ずることができないように、異質ＤＮＡ配列が工程
（２）において欠失さＲたＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ遺伝子
配列の場所に挿入される、上記第１１項記載の感染のウ
シ鼻気管支炎ウィルス。
２４、前記挿入は約８〜５ｏｏｏｂｐの大きさである上
記第２３項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
２５、工程（３）の感染のｇＩＩＩ”　　ＩＢＲＶ　　
ＤＮＡは、工程（４）において得られるＩＢＲＶ突然変
異がＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ遺伝子における欠失および挿
入の両者の結果、抗原性ＩＢＲＶｇｌ　Ｉ　ｒポリペプ
チドを産生することができず、かつＩＢＲＶ　　ｔｋ遺
伝子における突然変異の結果、機能的ＴＫを産生するこ
とができないように、機能的ＴＫを産生することができ
ないＩＢＲＶ突然変異から誘導される上記第２４項記載
の感染のラン鼻気管支炎ウィルス。
２６、機能的ＴＫを産生ずることができない前記Ｉ　Ｂ
ＲＶ突然変異は、ＩＢＲＶ　　ｔｋ遺伝子における欠失
の結果、前記ＩＢＲＶｔｋ遺伝子を産生することができ
ない上記第２５項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス
。
２７、前記ＩＢＲＶ突然変異はＩＢＲＶ（ＮＧ）旧【ｋ
である上記第２６項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィル
ス。
２８、工程（３）の感染のｇｌｌＩ”　　　ＩＢＲＶ　
　ＤＮＡは、工程（４）の得られるＩ　ＢＲＶ突然変異
が、ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子における欠失および挿
入の両者の結果、抗原性ＩＢＲＶ　　ｇ１■ｌポリペプ
チドを産生することができない温度抵抗性ＩＢＲＶ突然
変異であるように、温度抵抗性ＩＢＲＶから誘導される
、上記第２３項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
２９、さらに工程（５）： （５）工程（４）の得られるＩＢＲＶ突然変異を温度感
受性ウィルスについて非許容温度において増殖して、Ｉ
ＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子における欠失および挿入の両
者の結果、抗原性ＩＢＲＶｇｌ　Ｉ　Ｉポリペプチドを
産生することができない温度抵抗性ＩＢＲＶ突然変異に
ついて選択しかつそれを産生ずる、を含む上記第２３項
記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
３０、前記クローニングベクターは、ｐＢ　Ｒ３２２、
ｐＢ　Ｒ３２５、ｐＭＢ９、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８
、ｐＨＣ７９、ｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９．７アージシヤ
ロン２８、ｐＫＢｌ　ｌ５ｐＫＳＶ−１０およびｐＭＡ
Ｒ４２０から成る群より選択される上記第２３項記載の
感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。　　３ｍ前記クローニ
ングベクターはｐＢＲ３２２である上記第３０項記載の
感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
３２、前記ウィルスは凍結乾燥されている上記第２３項
記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
３３、工程： （１）雑種プラスミドを構成し、前記プラスミドはクロ
ーニングベクターおよびＩ　ＢＲＶのＤＮＡ断片からな
り、前記断片はＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ遺伝子およびその
フランキング配列の実質的にすべてを含有し、 （２）抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌポリペプチドが産生
されないように、かつ挿入の各側に隣接するＩＢＲＶ　
　ＤＮＡが保持されるように、異質ＤＮＡ配列を工程（
１）の雑種プラスミド中に挿入し、 （３）、ＩＢＲＶ宿主細胞において、工程（２）の得ら
れる雑種プラスミドを感染のｇＩ　Ｉ　Ｉ”ＩＢＲＶ　
　ＤＮＡと同時トランスフェクションし、そして （４）工程（３）において得られた子孫のウィルスをス
クリーニングしてＩ　ＢＲＶ突然変異を同定しかつそれ
を産生じ、前記突然変異はＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子にお
ける挿入の結果抗原性ＩＢＲＶｇＩＩＩポリペプチドを
産生することができない、 からなる方法によって産生された、ＩＢＲＶｇＩＩＩ遺
伝子における挿入の結果、抗原性ＩＢＲＶｇＩＩＩポリ
ペプチドを産生できない感染のウシ鼻気管支炎ウィルス
。
３４、前記挿入は約８〜５０００ｂｐの大きさである上
記第３３項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
３５、工程（３）の感染のｇｌｌｌ”　　ＩＢＲＶ　　
ＤＮＡは、工程（４）において得られるＩＢＲＶ突然変
異がＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子における挿入の結果、
抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩポリペプチドを産生するこ
とができず、かつＩＢＲＶＬｋ遺伝子における突然変異
の結果、機能的ＴＫを産生することができないように、
機能的ＴＫを産生することができないＩ　ＢＲＶ突然変
異から誘導される上記第３３項記載の感染のウシ鼻気管
支炎ウィルス。
３６、機能的ＴＫを産生ずることができない前記ＩＢＲ
Ｖ突然変異は、夏ＢＲＶ　　ｔｋ遺伝子における欠失の
結果、前記ＩＢＲＶ　　ｔｋ遺伝子を産生ずることがで
きない上記第３５項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィル
ス。
３７、前記ＩＢＲＶ突然変異はＩＢＲＶ（ＮＧ）ｄｌｔ
ｋである上記第３６項記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィ
ルス。
３８、工程（３）の得られるＩ　ＢＲＶ突然変異は、工
程（４）の得られるＩ　ＢＲＶ突然変異が、ＩＢＲＶ　
　ｇ■■Ｔ遺伝子における挿入の結果、抗原性ＩＢＲＶ
　　ｇＩＩＩポリペグチドを産生することができない温
度抵抗性ＩＢＲＶ突然変異であるように、温度抵抗性Ｉ
　ＢＲＶから誘導される、上記第３３項記載の感染のウ
シ鼻気管支炎ウィルス。
３９、さらに工程（５）： （５）工程（４）の得られるＩ　ＢＲＶ突然変異を温度
感受性ウィルスについて非許容温度において増殖して、
ＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ　Ｉ遺伝子における挿入の結果、
抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｒＩｒポリペプチドを産生ずるこ
とができない温度抵抗性ＩＢＲＶ突然変異について選択
しかつそれを産生する、を含む上記第３３項記載の感染
のウシ鼻気管支炎ウィルス。
４０、前記クローニングベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐ
Ｂ　Ｒ３２５、ｐＭＢ９、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、
ｐＨＣ７９、ｐＵｃ１８、ｐＵｃＩ９、ファージシャロ
ン２８、ｐＫＢ　１１．　ｐＫＳＶ　−１０およびｐＭ
ＡＲ４２０から成る群より選択される上記第３３項記載
の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。４１、前記クローニ
ングベクターはｐＢＲ３２２である上記第４０項記載の
感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
４２、前記ウィルスは凍結乾燥されている上記第３３項
記載の感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。
４３、成分： （１）製薬学的に有効量の感染のウシ鼻気管支炎ウィル
ス、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、ＩＢＲＶ　
　ｇｌｌＩ遺伝子における欠失、挿入または欠失および
挿入の両者の結果、抗原性■ＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ　Ｉポ
リペプチドを産生ずることができない、および （２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 かもなる感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン
。
４４、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、ＩＢＲＶ
　　ｇｌｌｌ遺伝子における欠失の結果、抗原性ｆＢＲ
Ｖ　　ｇｆｌｌポリペプチドを産生ずることができない
上記第４３項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のＩ；
めのワクチン。
４５、前記欠失は約ｌＯ〜１５００ｂｐの大きさである
上記第４３項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のため
のワクチン。
４６、前記欠失は約７５〜２００ｂｐの大きさである上
記第４５項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のための
ワクチン。
４７、前記挿入は約８〜５０００ｂｐの大きさである上
記第４３項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のための
ワクチン。
４８、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、また、Ｉ
ＢＲＶｔｋ遺伝子における突然変異の結果、機能的ＴＫ
を産生ずることができない上記第４３項記載の感染のウ
シ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
４９、ＩＢＲＶｔｋ遺伝子における前記突然変異は欠失
突然変異である上記第４８項記載の感染のウシ鼻気管支
炎の病気のためのワクチン。
５０、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、また、温
度抵抗性である上記第４３項記載の感染のウシ鼻気管支
炎の病気のためのワクチン。
５１、前記ウィルスはＩ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ）　ｄｌ
ｔｋｄ１ｇｌｌ夏（ＡＴＣＣＮｏ、　ＶＲ−２１８１）
の同定特性を有する上記第４３項記載の感染のウシ鼻気
管支炎の病気のだめのワクチン。
５２、前記ウィルスは凍結乾燥されている上記第４３項
記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
５３、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤は２．
５〜１５％の血清を含有する生理学的に緩衝化された媒
質であり、前記血清は感染のウシ鼻気管支炎ウィルスに
対する抗体を含有しない上記第４３項記載の感染のウシ
鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
５４、前記血清はブタ血清、仔ウシ血清、胎児仔ウシ血
清、ウマ血清および子羊血清から成る群より選択される
上記第５３項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のため
のワクチン。
５５、前記製薬学的に有効量は１０４．５〜１０７、　
Ｏｐ、　ｆ、　ｕ、である上記第３３記載ノ感染のウシ
鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
５６、前記製薬学的に有効量は１０４．５〜１０５．５
ｐ、　ｆ、　ｕ、である上記第５５項記載の感染のウシ
鼻気管支炎の病気のためのワクチン。　５７、成分： （１）製薬学的に有効量の感染のウシ鼻気管支炎ウィル
ス、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、ＩＢＲＶ　
　ｇＩＩＩ遺伝子における欠失の結果、抗原性ＩＢＲＶ
　　ｇｌＴＩポリペプチドを産生できず、そして工程： （ａ）雑種プラスミドを構成し、前記プラスミドはクロ
ーニングベクターおよびＩＢＲＶのＤＮＡ断片からなり
、前記断片はＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子の実質的にす
べておよびそのフランキング配列を含有し、 （ｂ）　ＩＢＲＶ　　ｇＩ　Ｉ　Ｉ遺伝子の実質的にす
べてより少なくが存在すると同時に欠失に各側に隣接す
るＩＢＲＶ　　ＤＮＡ配列を保持するように、工程（ａ
）の雑種プラスミドがらＤＮＡ配列を欠失し、 （ｃ）、ＩＢＲＶ宿主細胞１．：　ｊ）’　イー’Ｃ１
工ｍ　（ｂ）の雑種プラスミドを感染のｇｌ　ｒ　Ｉ”
　　　ＩＢＲＶＤＮＡと同時トランスフェクションし、
そして（ｄ）工程（ｃ）において得られた子孫のウィル
スをスクリーニングしてＩＢＲＶ突然変異を同定しかつ
それを産生し、前記突然変異はＩ　ＢＲＶｇｌ　Ｉ　Ｉ
遺伝子における欠失の結果抗原性ＩＢＲＶｇＩＩＩポリ
ペプチドを産生ずることができない、 からなる方法によって産生されたものである、および （２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 からなる感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン
。
５８、前記欠失は約ｌＯ〜１５００ｂｐの大きさである
上記第５７項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のため
のワクチン。
５９、前記欠失は約７５〜２００ｂｐの大きさである上
記第５８項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のための
ワクチン。
６０、工程（ｃ）の感染のｇｌ　Ｉ　Ｉ”　　ＩＢＲＶ
ＤＮＡは、工程（ｄ）において得られるＩＢＲＶ突然変
異がＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩ遺伝子における欠失の結果、
抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｒＩＩポリペプチドを産生ずるこ
とができず、かつＩＢＲＶ　　Ｌｋ遺伝子における突然
変異の結果、機能的ＴＫを産生ずることができないよう
に、機能的ＴＫを産生ずることができないＩＢＲＶ突然
変異から誘導される上記第５７項記載の感染のウシ鼻気
管支炎の病気のためのワクチン。
６１、機能的ＴＫを産生ずることができない前記ＩＢＲ
Ｖ突然変異は、ＩＢＲＶｔｋ遺伝子における欠失の結果
、前記ＩＢＲＶ　　Ｌｋ遺伝子を産生ずることができな
い上記第６０項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のた
めのワクチン。
６２、前記ＩＢＲＶ突然変異はＩＢＲＶ（ＮＧ）ｄｌｔ
ｋである上記第６１項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病
気のためのワクチン。
６３、工程（ｃ）の感染のｇＩ　Ｉ　Ｅ”　　　ＩＢＲ
ＶＤＮＡは、工程（ｄ）　（７）得られるＩＢＲＶ突然
変異が、ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子における欠失の結
果、抗Ｗ姓ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌポリペズチドを産生す
ることができない温度抵抗性ＩＢＲＶ突然変異であるよ
うに、温度抵抗性Ｉ　ＢＲＶから誘導される、上記第５
７項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチ
ン。
６４、さらに工程（ｅ）： （ｅ）工程（ｄ）の得られるＩ　ＢＲＶ突然変異を温度
感受性ウィルスについて非許容温度において増殖して、
ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ遺伝子における欠失の結果、抗原
性ＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｔ　Ｉポリペプチドを産生するこ
とができない温度抵抗性ＩＢＲＶ突然変異について選択
しかつそれを産生ずる、を含む上記第５７項記載の感染
のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
６５、前記クローニングベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐ
Ｂ　Ｒ３２５、ｐＭＢ９、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、
ｐＨＣ７９、ｐＵｃ１８、ｐＵｃＩ９、７アージシヤロ
ン２８、ｐＫＢ　ｌ　１．ｐＫＳＶ−１０およびｐＭＡ
Ｒ４２０から成る群より選択される上記第５７項記載の
感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
６６、前記クローニングベクターはｐＢ　Ｒ３２２であ
る上記第６５項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のた
めのワクチン。
６７、工程（ｂ）の得られる雑種プラスミドはｐＬ　Ａ
　ＨＫｄｌＡｐａｌである上記第５７項記載の感染のウ
シ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
６８、前記ウィルスは凍結乾燥されている上記第５７項
記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
６９、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤は２．
５〜Ｉ５％の血清を含有する生理学的に緩衝化された媒
質であり、前記血清は感染のウシ鼻気管支炎ウィルスに
対する抗体を含有しない上記第５７項記載の感染のウシ
鼻気管支炎の病気のだめのワクチン。
７０．前記血清はブタ血清、仔ウシ血清、胎児、仔ウシ
血清、ウマ血清および子羊血清から成る群より選択され
る上記第６９項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のた
めのワクチン。
７１、前記製薬学的に有効量は１０４．５〜１０７、　
Ｏｐ、　ｆ、　ｕ、である上記第６９項記載ノ感染のウ
シ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
７２、前記製薬学的に有効量は１０４．５〜１０５、５
ｐ、　ｆ、　ｕ、である上記第７１項記載の感染のウシ
鼻気管支炎の病気のためのワクチン。　７３、欠失した
ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ遺伝子配列の各側に隣接したＩＢ
ＲＶ　　ＤＮＡ配列が保持されるように、かつ工程（ｄ
）の得られるＩＢＲＶ突然変異が、ＩＢＲＶ　　ｇｌｌ
Ｉ遺伝子における欠失および挿入の両者の結果、抗原性
ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩポリペプチドを産生することがで
きないように、異質ＤＮＡ配列が工程（ｂ）において欠
失さＲたＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子配列の場所に挿入
される、上記第５７項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病
気のためのワクチン。
７４、前記挿入は約８〜５０００ｂｐの大きさである上
記第５７項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のための
ワクチン。
７５、工程（ｃ）の感染のｇｌ　Ｉ　Ｉ”　　ＩＢＲＶ
ＤＮＡは、工程（ｄ）において得られるＩＢＲＶ突然変
異がＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子における欠失および挿
入の両者の結果、抗原性Ｉ　ＢＲＶｇｌ　Ｉ　Ｉポリペ
プチドを産生ずることができず、かつＩＢＲＶｔｋ遺伝
子における突然変異の結果、機能的ＴＫを産生ずること
ができないように、機能的ＴＫを産生することができな
いＩＢＲＶ突然変異から誘導される上記第７３項記載の
感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
７６、機能的ＴＫを産生ずることができない前記ＩＢＲ
Ｖ突然変異は、ＩＢＲＶｔｋ遺伝子における欠失の結果
、前記ＩＢＲＶ　　ｔｋ遺伝子を産生ずることができな
い上記第７５項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のた
めのワクチン。
７７、前記Ｉ　ＢＲＶ突然変異はＩ　ＢＲＶ　（ＮＧ）
ｄｌｔｋである上記第７６項記載の感染のウシ鼻気管支
炎の病気のためのワクチン。
７８、工程（ｃ）の感染のｇＩ　Ｉ　Ｉ”　　ＩＢＲＶ
ＤＮＡは、工程（ｄ）の得られるＩＢＲＶ突然変異が、
ＩＢＲＶ　　ｇｌ　Ｉ　Ｉ遺伝子における欠失および挿
入の両者の結果、抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩポリペプ
チドを産生ずることができない温度抵抗性Ｉ　ＢＲＶ突
然変異であるように、温度抵抗性ＩＢＲＶから誘導され
る、上記第７３項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気の
ためのワクチン。
７９、さらに工程（ｅ）： （８）工程（ｄ）の得られるＩＢＲＶ突然変異を温度感
受性ウィルスについて非許容温度において増殖して、Ｉ
ＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子における欠失および挿入の両
者の結果、抗原性ＩＢＲＶ　　ｇＩ１１ポリペプチドを
産生することができない温度抵抗性ＩＢＲＶ突然変異に
ついて選択しかつそれを産生する、を含む上記第７３項
記載の感染のラン鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
８０、前記クローニングベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐ
Ｂ　Ｒ３２５、ｐＭＢ９、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８、
ｐＨＣ７９、ｐＵｃ１８、ｐＵｃ１９、ファージシャロ
ン２８、ｐＫＢ　１１．　ｐＫＳＶ　−１０およびｐＭ
ＡＲ４２０から成る群より選択される上記第７３項記載
の感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
８１、前記クローニングベクターはｐＢＲ３２２である
上記第８０項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のため
のワクチン。
８２、前記ウィルスは凍結乾燥されている上記第７３項
記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
８３、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤は２．
５〜１５％の血清を含有する生理学的に緩衝化された媒
質であり、前記血清は感染のウシ鼻気管支炎ウィルスに
対する抗体を含有しない上記第７３項記載の感染のウシ
鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
８４、前記血清はブタ血清、仔ウシ血清、胎児、仔ウシ
血清、ウマ血清および子羊血清から成る群より選択され
る上記第８３項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のた
めのワクチン。
８５、前記製薬学的に有効量は１０４．５〜１０７、　
Ｏｐ、　ｆ、　ｕ、である上記第７３項記載の感染のウ
シ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
８６、前記製薬学的に有効量は１０４．５〜１０５、５
ｐ、　ｆ、　ｕ、である上記第７１項記載の感染のウシ
鼻気管支炎の病気のためのワクチン。　８７、成分： （１）製薬学的に有効量の感染のウシ鼻気管支炎ウィル
ス、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、ＩＢＲＶ　
　ｇＩＩＩ遺伝子における挿入の結果、抗原性ＩＢＲＶ
　　ｇｌＩＩポリペプチドを産生できず、そして工程： （ａ）雑種プラスミドを構成し、前記プラスミドはクロ
ーニングベクターおよびＩＢＲＶのＤＮＡ断片からなり
、前記断片はＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子およびそのフ
ランキング配列の実質的にすべてを含有し、 （ｂ）抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩポリペプチドが産生
されないように、かつ挿入の各側に隣接するＩＢＲＶ　
　ＤＮＡが保持されるように、異質ＤＮＡ配列を工程（
ａ）の雑種プラスミド中に挿入し、（ｃ）、ＩＢＲＶ宿
主細胞において、工程（ｂ）の得られる雑種プラスミド
を感染のｇｒｒｌ”ＩＢＲＶ　　ＤＮＡと同時トランス
フェクションし、そして （ｄ）工程（ｃ）において得られた子孫のウィルスをス
クリーニングしてＩＢＲＶ突然変異を同定しかつそれを
産生じ、前記突然変異はｒ　ＢＲＶｇｌｌｌ遺伝子にお
ける挿入の結果抗原性ＩＢＲＶｇＩＩＩポリペプチドを
産生することができない、 からなる方法によって産生されたものである、および （２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 からなる感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン
。
８８、前記挿入は約８〜５０００ｂｐの大きさである上
記第８７項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のための
ワクチン。
８９、工程（ｃ）の感染のｇＩ　Ｉ　Ｔ”　　ＩＢＲＶ
ＤＮＡは、工程（ｄ）において得られるＩＢＲＶ突然変
異がＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子における挿入の結果、
抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩポリペプチドを産生ずるこ
とができず、かつＩＢＲＶｔｋ遺伝子における突然変異
の結果、機能的ＴＫを産生することができないように、
機能的ＴＫを産生することができないＩ　ＢＲＶ突然変
異から誘導される上記第８７項記載の感染のウシ鼻気管
支炎の病気のためのワクチン。
９０、機能的ＴＫを産生ずることができない前記ＩＢＲ
Ｖ突然変異は、ＩＢＲＶ　　ｔｋ遺伝子における欠失の
結果、前記ＩＢＲＶｔｋ遺伝子を産生ずることができな
い上記第８９項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のた
めのワクチン。
９１、前記ＩＢＲＶ突然変異はＩ　ＢＲＶ　（ＮＧ）ｄ
ｌｔｋである上記第８９ｑ４記載の感染のウシ鼻気管支
炎の病気のためのワクチン。
９２、工程（ｃ）の感染のｇｌ　Ｔ　Ｉ”　　　ＩＢＲ
ＶＤＮＡは、工程（ｄ）の得られるＩＢＲＶ突然変異が
、ＩＢＲＶ　　ｇｒ　Ｉ　Ｔ遺伝子における挿入の結果
、抗原性ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩポリペプチドを産生ずる
ことができない温度抵抗性ＩＢＲＶ突然変異であるよう
に、温度抵抗性ＩＢＲＶから誘導される、上記第８７項
記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
９３、さらに工程（ｅ）： （ｅ）工程（ｄ）の得られるＩＢＲＶ突然変異を温度感
受性ウィルスについて非許容温度において増殖して、Ｉ
ＢＲＶ　　ｇｌＩｒ遺伝子における挿入の結果、抗原性
ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩポリペプチドを産生することがで
きない温度抵抗性ＩＢＲＶ突然変異について選択しかつ
それを産生ずる、を含む上記第８７項記載の感染のウシ
鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
９４、前記クローニングベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐ
ＥＩ　Ｒ３２５、ｐＭＢ９、ｐＫＨ４７、ｐＢＲ３２８
、ｐＨＣ７９、ｐＵｃ、１８、ｐＵｃ１９、ファージシ
ャロン２８、ｐＫＢ　ｌ　ｌ、　ｐｘｓｖ−Ｉ　Ｑおよ
びｐＭＡＲ４２０から成る群より選択される上記第８７
項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン
。
９５、前記クローニングベクターはｐＢＲ３２２である
上記第９４項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のため
のワクチン。
９６、前記ウィルスは凍結乾燥されている上記第８７項
記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
９７、製薬学的に許容されうる担体または希釈剤は２．
５〜１５％の血清を含有する生理学的にｌＩｋ？＃化さ
れた媒質であり、前記血清は感染のウシ鼻気管支炎ウィ
ルスに対する抗体を含有しない上記第８７項記載の感染
のウシ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
９８、前記血清はブタ血清、仔ウシ血清、胎児、仔ウシ
血清、ウマ血清および子羊血清から成る群より選択され
る上記第９７項記載の感染のウシ鼻気管支炎の病気のた
めのワクチン。
９９、前記製薬学的に有効量は１０４．５〜１０７、　
Ｏｐ、　ｆ、　ｕ、である上記第８７項記載の感染のウ
シ鼻気管支炎の病気のためのワクチン。
１００、前記製薬学的に有効量は１０４．５〜１０５．
５ｐ、ｆ、ｕ、である上記第９９項記載の感染のウシ鼻
気管支炎の病気のためのワクチン。
【図面の簡単な説明】
第１図は、例えば、本発明のＩＢＲＶの誘導を概略的に
示す。詳しくは、Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌＬｋから
の感染のｇＩ　Ｉ　Ｉ”　　ＤＮＡをプラスミドｐＬＡ
ＨＫｄｌＡｐａｒからの６．３ｋｂのＢｉｎｄＩ　Ｉ　
Ｉ　−ＫｐｎＩ断片と同時トランスフェクションするこ
とニヨッテ得られる、Ｉ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ）　ｄｌ
ｔｋｄｌｇＩＩＩの構成を示す。Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）
　ｄｌｔｋウィルスＤＮＡのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ制限地
図は、また、第１図に示されている。第１図に示すよう
に、ＩＢＲＶ　　ｔｋ遺伝子の欠失突然変異およびＩＢ
ＲＶ（ＮＧ）　ｄｌｔｋにおける（Ｎ　Ｇ）配列の挿入
の突然変異は、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−Ａ断片中に位置す
る。他方において、ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ遺伝子はＨｉ
ｎｄｌ　Ｉ　ｒＩ断片中に位置する。ＢｉｎｄＩ　Ｉ　
Ｉ　−１断片の一部（Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ　−Ｂｇｌｌ
　Ｉ）の制限地図は、第１図の上部に拡大されており、
そしてＩＢＲＶｇＭＩ遺伝子の翻訳開始（ＡＴＧ）およ
びポリアデニル化（ＡＡＴＡＡＡ）のシグナルの位置を
示す。本発明の組換え体Ｉ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌＬ
ｋｄｌｇｌ　Ｉ　ＩのＨｉｎｄｌｌｌ制限地図は、また
、示されている。プラスミドｐＬＡＨＫｄｌＡｐａｒの
ための１．５３ｋｂのＡｐａｌ欠失後残るＢｉｎｄＩ　
Ｉ　Ｉ　−ＢｇＩＩＩ配列は、Ｉ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ
）　ｄＨｋｄｌｇｌ　Ｉ■のための欠失ＩＢＲＶ　　ｇ
ｌＩＩの領域中の予測される制限地図を例示するために
、第１図の下に示されている。 第２図は、例えば、本発明において使用するプラスミド
の誘導化を示す。詳しくは、第２図は、第１ｒＩ！Ｊｌ
：描く組ａｌｌ工体’）イ／Ｌ＝スＩ　ＥＲＶ　（ＮＧ
）旧ｔｋｄ１ｇｌ　Ｉ　Ｉを得るための同時トランスフ
ェクションに使用したｐＬＡＨＫｄｌＡｐａｌの構成を
示す。第２図において、Ｉ　ＢＲＶ　（Ｌｏｓ　　Ａｎ
ｇｅｌｅｓ）（ＡＴＣＣＶＲ−１８８）のＩＢＲＶ　　
ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−１断片（米国特許第４，７０３，
０１１号の第１図参照）を、まず、ｐＢＲ３２２中でク
ローニングしてプラスミドｐＬＡＨ−１を産生じた。次
いで、ｐＬＡＨ−ｒのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−Ｋｐｎｌ断
片を、プラスミドｐＵＣｌ　８ｄｌＥｃｏＲＩのＨ１ｎ
ｄＩＩＩ−Ｋｐｎ１部位においてサブクローニングした
。プラスミドｐＵＣ１８ＥｃｏＲＩはプラスミドｐＵＣ
１８から、ＥｃｏＲＩによる制限エンドヌクレアーゼ処
理、ヤエナリヌクレアーゼ処理、およびＦ［合によって
誘導した。この手順は、ＥｃｏＲＩの制限エンドヌクレ
アーゼ部位の４塩基の重複５’−Ｇ！ＡＡＴＴ　　Ｃ−
３’ ３’−ＣＴＴＡＡｆＧ−５’ を排除したが、それ以外プラスミドｐＵｃ１８を変化さ
せなかった。ｐＬ　Ａ　ＨＫは、ＩＢＲＶ　　ｇｌＩｆ
遺伝子から下流に位置する、ただ１つのＥｃ。 Ｒ１制限部位を有する。ｐＬＡＨ−ＩのＥｃｏＲＩ−Ｂ
ａｍＨＩ断片は、また、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位においてサブ
クローニングした。ｐＬ　Ａ　Ｅ　ＢのＡｐａ■切断お
よび再結合は、それぞれ、７３１．５９０および２１２
ｂｐの３つのＡｐａｌ断片を生じて、プラスミドｐＬ　
Ａ　ＨＫｄｌＡｐａ　Ｉを産生じて、合計１．５３３ｂ
ｐを欠失した。Ａ　ｐａ　Ｉ欠失は、ＩＢＲＶｇＩＩＩ
遺伝子の解読配列の大部分を除去した（第２図参照）。 最後に、ｐｔ　Ａ　ＨＫｄｌＡｐａｌのＥｃｏＲＩ　−
ＢａｍＨＩ断片を、ｐＬＡ　ＨＫのＥｃ。 Ｒ■−ＢａｍＨＩ断片と交換して、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩ
Ｉ遺伝子配列を欠く欠失プラスミドを産生じたが、５′
および３’　　ＩＢＲＶフランキング配列を保持して、
感染のｇＩ　Ｉ　Ｉ”　　　ＩＢＲＶ　　ＤＮＡとの組
換えを促進した。 第３図は、ＩＢＲＶ　　ｇｌｌｌ遺伝子およびそのフラ
ンキング配列の解読領域を含有する、ＩＢＲＶ　（Ｌ　
ｏｓ　　Ａ　ｎｇａｌｅｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａのヌクレオチ
ド配列（１，９７５塩基）を示す。この配列は、ＩＢＲ
Ｖ　　ｇｒｒｒ　　ｍＲＮＡを産生ずるために転写され
ｆ：、　Ｄ　Ｎ　Ａ鎖の補体である。Ｉ　ＢＲＶ　（Ｎ
Ｇ）　ｄｉｔｋｄｌｇｌ　Ｉ　Ｉを得るためにＩＢＲＶ
　　ｇＩ　Ｉ　Ｉ遺伝子から欠失されたＡｐａｌルミｌ
制限エンドヌクレアーゼ、第３図に示されている。また
、第３図において、ＩＢＲＶ　　ｇｌｌＩポリペプチド
の予測されたアミノ酸配列は、３文字のアミノ酸コード
の表示で表わされている。　第４Ａ図は、親の■Ｂ　Ｒ
Ｖ　（Ｎ　Ｇ）　ｄｌｔｋウィルスおよび組換え体ＩＢ
ＲＶ分離体、Ｅ１２Ａ、Ｃ６ＧおよびＣ３ＦからのＨｉ
ｎｄｌ　Ｉ　Ｉ消化したおよびＢａｍＨＩプラスＥｃｏ
ＲＩ消化したＤＮＡの臭化エチジウム着色アガロースゲ
ルの断片を示す。これらの組換え体ウィルスは、ＩＢＲ
Ｖ　　Ｌｋ遺伝子およびＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子中
に欠失を有する。レーンＭは、ＨｉｎｒＮＩｒ切断ラム
ダファージおよびＨａｅＥ　Ｉ　Ｉ切断ｌＸｌ７４７ア
ージＤＮＡマーカー断片を示す。 第４Ｂ図は、第４Ａ図に示すＩＢＲＶ株のＤＮＡ断片に
対する、３２ｐ−標識Ｍ１３−３８プローブの分子交雑
を明らかにするオートラジオグラフを示す。ＭＩ３−３
８プローブは、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子の解読領域
および下流の配列の部分にまたがる、１．６８ｋｂのＳ
　ａｃ　Ｉ断片を含有する、一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮ
Ａである（参照、第２図、プラスミドｐＬＡＨＫ）。 第５Ａ図は、親のＩ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌＬｋ（レ
ーンＬ　３．５および７）および組換え体Ｉ　ＢＲＶ分
離体、Ｉ　Ｂ　ＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋｄｌｇｌ　Ｉ
　Ｉ　（株Ｃ６Ｇ）（レーン２．４．６および８）から
のＨ４ｎｄｌＩＩプラスＢａｍＨＩ消化、ＰｓＬＩ前記
、Ｅｃ。 Ｒｒ消化およびＨｉｎｄｉ　Ｉ　Ｉ消化したＤＮＡの臭
化エチジウム着色アガロースゲルの断片を示す。 レーンＭは、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ切断ラムダファージお
よびＨａｅｌ　Ｉ　Ｉ切断ｕＸ１７４ファージＤＮＡマ
ーカー断片を示す。 第５Ｂ図は、＄５Ａ図に示すＩＢＲＶ株のＤＮＡ断片に
対する、３２ｐ−標識Ｍ１３−３８グローブの分子交雑
を明らかにするオートラジオグラフを示す。 第６Ａ図は、親のＩ　ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋ（レ
ーン１１３．５および７）および組換え体ＩＢＲＶ分離
体、ｒ　Ｂ　ＲＶ　（Ｎ　Ｇ）　ｄＨｋｄｌｇｌ　Ｉ　
Ｉ　（株Ｃ６Ｇ）（レーン２．４．６および８）からの
Ｈｉｎｄｉ　Ｉ　ＩプラスＢａｍＨＩ消化、Ｐｓｔｌ前
記、Ｅｃ。 Ｒ１消化およびＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｔ消化したＤＮＡの臭
化エチジウム着色アガロースゲルの断片を示す。 レーンＭは、Ｈｉｎｄｒｌｌ切断ラムダ７アージおよび
ＨａｅｌｌＩ切断ｌＸ１７４ファージＤＮＡマーカー断
片を示す。 第６Ｂ図は、第６Ａ図に示す、ＩＢＲＶ（ＮＧ）　ｄｌ
ｔｋのＤＮＡ断片に対するが、第６Ａ図に示すＩ　ＢＲ
Ｖ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋｄｌｇＩ　Ｉ　［７）ＤＮＡ断
片に対するものでない、３２Ｐ−標識Ｍ１３−１グロー
ブの分子交雑を明らかにするオートラジオグラフを示す
。Ｍ１３−１グローブは、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子
のセンス鎖（５ｅｎｓｅ　−５ｔｒａｎｄ）である、Ｉ
ＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子の０．３６ｋｂの５ａｃｌ断
片を含有する一本鎖Ｍ　１３ｍｐｌ　９　ＤＮＡである
（参照、第３図、ヌクレオチド１．２８６−１．６４６
）。 第７図は、ＩＢＲＶ　　ｇｌＩＩ”　　ＩＢＲＶ（Ｌａ
ｓ　　Ａ　ｎｇｅｌｅｓ）撹拌およびＩＢＲＶ　　ｇｌ
　Ｉ　Ｉ−組換え体、ｒ　Ｂ　ＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔ
ｋｄｌｇｌ　Ｉ　Ｉで感染した細胞から抽出した、ｍＲ
ＮＡ体３２ｐ標識Ｍ１３−４１およびＭ１３−３８　　
ＤＮＡプローブを使用する、分子交雑（ノザンブロッテ
ィング）実験を示す。Ｍ１３−４１プローブは、Ｉ　Ｂ
ＲＶｇＩＩＩ遺伝子のセンス鎖である、ＩＢＲＶｇＩＩ
Ｉ遺伝子の１．８６ｋｂのＳ　ａｃ　Ｉ断片を含有する
一本錆Ｍ　ｌ　３ｍｐｌ　８　ＤＮＡ　（参照、第３図
、プラスミドｐＬＡＨＫ）である。Ｍ１３−３８プロー
ブは、また、ＩＢＲＶ　　ｇＩＩＩ遺伝子の１゜８６ｋ
ｂのＳ　ａｃ　Ｉ断片を含有するが、このプローブはＩ
ＢＲＶ　　ｇｉｒｌ遺伝子の非センス鎖である。 リポソームのＲＮＡはｍＲＮＡに沿って電気泳動して分
子量のマーカーを得た。 第８図は、ｇＩ　Ｉ　Ｉ”　　Ｉ　ＢＲＶ　（Ｌｏｓ　
　ＡｎｇｅＩｅｓ）株またはｇｌ　Ｉ　Ｉ　”　　（ｃ
ｏｏｐｅｒ）株で、あるいはｇｌ　Ｉ　Ｉ−組換えＩ　
ＢＲＶ　（ＮＧ）　ｄｌｔｋｄｌｇｌＩＩで、感染した
細胞からの洗浄剤抽出物対ポリークローナル抗Ｉ　ＢＲ
Ｖウシ血清（ＰＣ−１４）またはモノクローナル抗ｇＩ
　Ｉ　Ｉ抗体（ＭＣ２９０５）を使用する免疫沈殿実験
を示す。分子量マーカーの移動は、 図面の左に示されている。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩ遺伝子における欠失、挿入また
    は欠失および挿入の両者の結果、抗原性ＩＢＲＶ　ｇＩ
    ＩＩポリペプチドを産生することのできないことを特徴
    とする感染のウシ鼻気管支炎ウィルス。 ２、工程： （１）雑種プラスミドを構成し、前記プラスミドはクロ
    ーニングベクターおよびＩＢＲＶのＤＮＡ断片からなり
    、前記断片はＩＢＲＶ　ｇＩＩＩ遺伝子の実質的にすべ
    ておよびそのフランキング配列を含有し、 （２）ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩ遺伝子の実質的にすべてより
    少なくが存在すると同時に欠失に各側に隣接するＩＢＲ
    Ｖ　ＤＮＡ配列を保持するように、工程（１）の雑種プ
    ラスミドからＤＮＡ配列を欠失し、 （３）、ＩＢＲＶ宿主細胞において、工程（２）の雑種
    プラスミドを感染のｇＩＩＩ＾＋ＩＢＲＶＤＮＡと同時
    トランスフェクションし、そして（４）工程（３）にお
    いて得られた子孫のウィルスをスクリーニングしてＩＢ
    ＲＶ突然変異を同定しかつそれを産生し、前記突然変異
    はＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子における欠失の結果抗原性Ｉ
    ＢＲＶ　ｇＩＩＩポリペプチドを産生することができな
    い、 からなる方法によって産生された、ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩ
    遺伝子における欠失の結果、抗原性ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩ
    ポリペプチドを産生できないことを特徴とする感染のウ
    シ鼻気管支炎ウィルス。 ３、工程： （１）雑種プラスミドを構成し、前記プラスミドはクロ
    ーニングベクターおよびＩＢＲＶのＤＮＡ断片からなり
    、前記断片はＩＢＲＶ　ｇＩＩＩ遺伝子およびそのフラ
    ンキング配列の実質的にすべてを含有し、 （２）抗原性ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩポリペプチドが産生さ
    れないように、かつ挿入の各側に隣接するＩＢＲＶ　Ｄ
    ＮＡが保持されるように、異質ＤＮＡ配列を工程（１）
    の雑種プラスミド中に挿入し、 （３）、ＩＢＲＶ宿主細胞において、工程（２）の得ら
    れる雑種プラスミドを感染のｇＩＩＩ＾＋ＩＢＲＶ　Ｄ
    ＮＡと同時トランスフェクションし、そして （４）工程（３）において得られた子孫のウィルスをス
    クリーニングしてＩＢＲＶ突然変異を同定しかつそれを
    産生し、前記突然変異はＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子におけ
    る挿入の結果抗原性ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩポリペプチドを
    産生することができない、 からなる方法によって産生された、ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩ
    遺伝子における挿入の結果、抗原性ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩ
    ポリペプチドを産生できないことを特徴とする感染のウ
    シ鼻気管支炎ウィルス。 ４、成分： （１）製薬学的に有効量の感染のウシ鼻気管支炎ウィル
    ス、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、ＩＢＲＶ　
    ｇＩＩＩ遺伝子における欠失、挿入または欠失および挿
    入の両者の結果、抗原性ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩポリペプチ
    ドを産生することができない、および （２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 からなることを特徴とする感染のウシ鼻気管支炎の病気
    のためのワクチン。 ５、成分： （１）製薬学的に有効量の感染のウシ鼻気管支炎ウィル
    ス、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、ＩＢＲＶ　
    ｇＩＩＩ遺伝子における欠失の結果、抗原性ＩＢＲＶ　
    ｇＩＩＩポリペプチドを産生できず、そして工程： （ａ）雑種プラスミドを構成し、前記プラスミドはクロ
    ーニングベクターおよびＩＢＲＶのＤＮＡ断片からなり
    、前記断片はＩＢＲＶ　ｇＩＩＩ遺伝子の実質的にすべ
    ておよびそのフランキング配列を含有し、 （ｂ）ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩ遺伝子の実質的にすべてより
    少なくが存在すると同時に欠失に各側に隣接するＩＢＲ
    Ｖ　ＤＮＡ配列を保持するように、工程（ａ）の雑種プ
    ラスミドからＤＮＡ配列を欠失し、 （ｃ）、ＩＢＲＶ宿主細胞において、工程（ｂ）の雑種
    プラスミドを感染のｇＩＩＩ＾＋ＩＢＲＶＤＮＡと同時
    トランスフェクションし、そして（ｄ）工程（ｃ）にお
    いて得られた子孫のウィルスをスクリーニングしてＩＢ
    ＲＶ突然変異を同定しかつそれを産生し、前記突然変異
    はＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子における欠失の結果抗原性Ｉ
    ＢＲＶ　ｇＩＩＩポリペプチドを産生することができな
    い、 からなる方法によって産生されたものである、および （２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 からなることを特徴とする感染のウシ鼻気管支炎の病気
    のためのワクチン。 ６、成分： （１）製薬学的に有効量の感染のウシ鼻気管支炎ウィル
    ス、前記感染のウシ鼻気管支炎ウィルスは、ＩＢＲＶ　
    ｇＩＩＩ遺伝子における挿入の結果、抗原性ＩＢＲＶ　
    ｇＩＩＩポリペプチドを産生できず、そして工程： （ａ）雑種プラスミドを構成し、前記プラスミドはクロ
    ーニングベクターおよびＩＢＲＶのＤＮＡ断片からなり
    、前記断片はＩＢＲＶ　ｇＩＩＩ遺伝子およびそのフラ
    ンキング配列の実質的にすべてを含有し、 （ｂ）抗原性ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩポリペプチドが産生さ
    れないように、かつ挿入の各側に隣接するＩＢＲＶ　Ｄ
    ＮＡが保持されるように、異質ＤＮＡ配列を工程（ａ）
    の雑種プラスミド中に挿入し、 （ｃ）、ＩＢＲＶ宿主細胞において、工程（ｂ）の得ら
    れる雑種プラスミドを感染のｇＩＩＩ＾＋ＩＢＲＶ　Ｄ
    ＮＡと同時トランスフェクションし、そして （ｄ）工程（ｃ）において得られた子孫のウィルスをス
    クリーニングしてＩＢＲＶ突然変異を同定しかつそれを
    産生し、前記突然変異はＩＢＲＶｇＩＩＩ遺伝子におけ
    る挿入の結果抗原性ＩＢＲＶ　ｇＩＩＩポリペプチドを
    産生することができない、 からなる方法によって産生されたものである、および （２）製薬学的に許容されうる担体または希釈剤、 からことを特徴とするなる感染のウシ鼻気管支炎の病気
    のためのワクチン。
JP63278495A 1987-11-03 1988-11-03 感染のウシ鼻気管支炎ウイルスの突然変異類、それらを含有するワクチン、それらの調製法およびそれらの使用 Pending JPH02431A (ja)

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