NO300254B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot humant respiratorisk syncytielt virus - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot humant respiratorisk syncytielt virus Download PDFInfo
- Publication number
- NO300254B1 NO300254B1 NO902802A NO902802A NO300254B1 NO 300254 B1 NO300254 B1 NO 300254B1 NO 902802 A NO902802 A NO 902802A NO 902802 A NO902802 A NO 902802A NO 300254 B1 NO300254 B1 NO 300254B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- plasmid
- glycoprotein
- fragment
- cells
- gene
- Prior art date
Links
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 title claims abstract description 73
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 46
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 137
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 32
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 9
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims abstract description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 129
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 65
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 22
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 21
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 claims description 16
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 13
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 12
- 101000926057 Human herpesvirus 2 (strain G) Envelope glycoprotein C Proteins 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 claims description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 6
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 148
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 abstract description 107
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 abstract description 105
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 abstract 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 97
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 86
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 70
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 56
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 51
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 41
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 41
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 30
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 25
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 19
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 19
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 16
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 15
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 14
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 13
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 12
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 11
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 10
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 8
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 8
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 8
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 8
- 241000144282 Sigmodon Species 0.000 description 8
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 7
- 108700023453 human respiratory syncytial virus F Proteins 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 6
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 5
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 4
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 4
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 4
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 101710128479 Tail assembly protein G Proteins 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 4
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 3
- 241000388186 Deltapapillomavirus 4 Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 3
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 2
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 2
- 108010015329 Respiratory syncytial virus G glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108010065667 Viral Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- KQHXBDOEECKORE-UHFFFAOYSA-L beryllium sulfate Chemical compound [Be+2].[O-]S([O-])(=O)=O KQHXBDOEECKORE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- -1 casein amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000007236 host immunity Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 101150062334 int gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 208000020154 Acnes Diseases 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 102100034044 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH1B Human genes 0.000 description 1
- 101710193111 All-trans-retinol dehydrogenase [NAD(+)] ADH4 Proteins 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006448 Bronchiolitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 206010011416 Croup infectious Diseases 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101000686824 Enterobacteria phage N4 Virion DNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101000644628 Escherichia phage Mu Tail fiber assembly protein U Proteins 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000043158 Lens esculenta Species 0.000 description 1
- HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N Levamisole Chemical compound C1([C@H]2CN3CCSC3=N2)=CC=CC=C1 HLFSDGLLUJUHTE-SNVBAGLBSA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 101100285000 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700020497 Nucleopolyhedrovirus polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 description 1
- 208000036071 Rhinorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 229940103272 aluminum potassium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 201000010549 croup Diseases 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108010087005 glusulase Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 1
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229960001614 levamisole Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- HEHQDWUWJVPREQ-XQJZMFRCSA-N lipid X Chemical compound CCCCCCCCCCC[C@@H](O)CC(=O)N[C@H]1[C@@H](OP(O)(O)=O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC HEHQDWUWJVPREQ-XQJZMFRCSA-N 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 1
- 108010056929 lyticase Proteins 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 108700010867 paramyxovirus proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 208000030925 respiratory syncytial virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 101150116497 sacm1l gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000009291 secondary effect Effects 0.000 description 1
- 208000026425 severe pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000007501 viral attachment Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 description 1
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 description 1
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Område for oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot humant respiratorisk syncytielt virus, HRSV, inneholdende minst ett immunogent fragment fra både humant respiratorisk syncytielt virusglykoprotein F og G. Oppfinnelsen angår også et plasmid anvendelig ved fremgangsmåten.
HRSV ble oppdaget i 1956 og er funnet globalt. Det forårsaker sykdom i øvre og nedre luftveier, spesielt hos spebarn og småbarn. Tilnærmet 30 % av sykehusinnlagte småbarn med akutt respiratorisk sykdom har en infeksjon av respiratorisk syncytielt virus. Hos eldre barn og voksne er sykdommen mildere. Hos spebarn forårsaker denne alvorlige sykdom ofte sykehusinnleggelse.
Infeksjoner med respiratorisk syncytielt virus kan henføres til alle deler av luftveiene, er vanligvis forbundet med feber, hoste, rennende nese, og tretthet, og diagnosti-seres klinisk som bronkitt, bronkiolitt, lungebetennelse, krupp, eller virusinfeksjon. Hos eldre barn og voksne er viruset vanligvis begrenset til replikasjon i de øvre luftveier. Spebarn kan bli angrepet mer alvorlig når viruset sprer seg til lungene. Lungeskader kan bli permanente.
Primær infeksjon med respiratorisk syncytielt virus forekommer tidlig i livet, vanligvis før 4 års-alder. Blant barn er sykdom forårsaket av dette virus tilbøyelig til å forekomme minst en gang hvert år i ganske skarpt avgrensede utbrudd med flere måneders varighet. Epidemider er skarpt avgrenset, vanligvis i 3 til 5 måneder. Familiestudier har vist at barn i tidlig skolealder hyppig innfører viruset i hjemmet og infiserer yngre medlemmer av familien mer alvorlig enn andre familiemedlemmer. Den kliniske konsekvens av infek-sjonen er mer alvorlig ved det første smittetilfelle og blir mildere hos eldre individer som er imunologisk erfarne.
Sekundære effekter av respiratorisk syncytielt virus kan variere fra usynlig infeksjon til alvorlig lungebetennelse og død. Betennelse i luftveiene er ansvarlig for de fleste symptomer. Fullstendig helbredelse forekommer i de fleste tilfeller i løpet av en til tre uker og medfører pro-duksjon av antistoff som synes å vedvare gjennom hele livet. I USA har tilnærmet 30 % av 1 år gamle barn og og 95 % av 5 år gamle barn sirkulerende antistoff mot respiratorisk syncytielt virus. Reinfeksjoner hos eldre spebarn, barn, og voksne som har antistoff gir for det meste milde sykdommer i de øvre luftveier i form av forkjølelser.
Selv om lave virusutbytter i cellekultur har hindret HRSV-forskning, er viruset grundig undersøkt. HRSV er et paramyxovirus inneholdende en enkel negativ RNA-streng som transkriberes til 10 overveiende monosistroniske mRNA. Disse mRNA er isolert og translatert in vitro. Produktene er karakterisert,ved hjelp av gelelektroforese, peptidkartleg-ging og imunpresipitering,som lignende strukturelle proteiner isolert fra virioner. De strukturelle proteiner innbefatter et viktig kjernekapselprotein (N; molekylvekt ca. 42 000),
et kjernekapsel-fosfoprotein (P; molekylvek ca. 34 000), et stort kjernekapselprotein (L; molekylvekt ca. 200 000), et "envelope"-matriksprotein (M; molekylvekt ca. 26 000), et matriks-glykoprotein (ca. 22 000) og 2 "envelope"-glykoproteiner, fusjonsglykoproteinet (F; molekylvekt ca. 68 000 til 70 000) og et andre andre, methioninfattig glykoprotein (G; molekylvekt ca. 84 000 til 90 000). I tillegg er et virus-kodet protein på tilnærmet 9500 dalton og andre små proteiner kjent å være tilstede i infiserte celler, Collins et al., Identification of a tenth mRNA of HRSV and assignment of polypetides to the 10 viral genes, J. of Virol. 49:572-578
(1984) og anførte referanser deri. Ytterligere arbeider som beskriver den molekylærere biologi av HSRV innbefatter: (1) Collins, et al., Nucleotide Sequence of the gene encoding the fusion (F) glycoprotein of human respiratory syncytial virus, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 81:7683-7687 (desember 1984), beskriver gensekvensen for F-glykoproteinet; (2) Collins, et al., The IA Protein Gene of Human Respiratory Syncytial Virus: Nucleotide Sequence of the mRNA and a Related Poly-cistronic Transcript, Virology, 141:282-291 (1985), beskriver gensekvensen for lA-proteinet; (3) Collins, et al., The Envelope-Associated 22K Protein of Human Respiratory Syncytial Virus: Nucleotide Sequence of the mRNA and a Related Poly-transcript, J. of Virol., 54(No. 1):65:71 (apr. 1985), beskriver gensekvensen for 22K-proteinet; (4) Wertz, et al., Nucleotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytical virus, beskriver en vanlig type virusa membranprotein, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 82:4075:4079 (juni 1985), beskriver gensekvensen for G-proteinet; og (5) Collins, et al., Correct Sequence for the Major Nucleocapsid Protein mRNA of Respiratory Syncytial Virus, Virology, 146; 69-77 ( 1985 ), beskriver gensekvensen for oo-proteinet.
F og G glykoproteinene fra HRSV har lignende mot-stykker i de andre paramyxovira. Som HRSV har andre paramyxovira et F glykoprotein som er assosiert med fusjon av celle-membraner, P.W. Choppin og A. Scheid, Rev. Infect. Dis. 2:40-61, (1980); Merz, et al., J. Exp. Med. 151:275-288, (1980). Det aktive paramyxovirus F-protein består av to disulfid-bundne underenheter, F og F^, som er frembragt fra en inn-aktiv forløper (Fq) ved en spesifikk indre spaltning av cellulære proteaser, Scheid and Choppin, Virol. 80:54:66
(1977). Det andre viktige glykoprotein hos de fleste paramyxovira er betegnet HN-proteinet, og er assosiert med hema-glutininaktivitetene og neuraminidaseaktivitetene av disse vira. Selv om HRSV G-proteinet ikke har de ovenfor angitte enzymatiske aktiviteter, er både G- og HN-glykoproteinene assosiert med tilknytning av virus.Disse glykoproteiner er likeledes strukturelt like ved at de har et uvanlig hydro-fobisk signal/ankerområde ved deres aminoterminaler, Wertz, et al., PNAS 82:4075-4079 (1985); Elango, et al., J. Virol. 57:481-489 (1986).
Det foreligger ikke noen tilgjengelige effektive vaksiner for å bekjempe HRSV. Mange forsøk er utført for å erholde en effektiv vaksine mot HRSV. Friedewald, et al., Journal of the American Medical Association, 204:690-694
(20 mai 1968), beskriver formeringen av respiratorisk syncytielt virus i bovint embryonisk nyrevevskultur. Virus dyrket ved 34 °C eller 28 °C viste ingen nedgang i infektivitet eller virulens. Selv om HRSV som ble dyrket ved 26 °C ble forbundet med en minskning av infektivitet hos voksne, kunne det ikke betraktes å være anvendelig ved forebyggelse av infeksjon hos voksne fordi viruset hadde en begrenset infektivitet og dårlig imunogenitet.
Kim, et al., Pediatrics, 48:745-755 (november 1971) beskriver at en vaksine av inaktivert respiratorisk syncytielt virus fremstilt fra virus dyrket ved 26 °C,stimulerte utviklingen av høye nivåer av serum-antistoff hos spebarn og barn i alderen fra 6 måneder til 13 år, men den forhindret ikke infeksjon.
Mclntosh, et al., Pediatric Research, 8:689-696 (1974) omtaler to eksperimentelle vaksiner bestående av levende respiratorisk syncytielt virus, den ene fremstilt fra virus dyrket ved 26 °C, og den andre fremstilt fra en temperatur-sensitiv mutant som vokste godt ved 32 °C og ikke i det hele tatt ved 37 °C eller høyere. Den første vaksine var util-fredsstillende fordi den ikke beskyttet mot infeksjon når intervallet mellom vaksineringen og virusangrepet var lengere enn 4 måneder. Den andre vaksine var også utilfreds-stillende ved at den tydeligvis mistet dens temperatursensitivitet i noen vaksiner.
(Craighead, Journal of Infections Diseases, 131:749-753 (juni 1975) omtaler tester utført i 1966 hvori flere
grupper av forskere testet et formaldehydbehandlet, alun-ut-felt virus dyrket i vevskultur. Ved etterfølgende utsettelse for villtype-virus utviste vaksinemottakerne et markert møn-ster av luftveissykdom. Craighead konkluderte med at imuni-sering med formaldehydbehandlet virus forhøyet alvorligheten av sykdomen.
Wright, et al., Journal of Pediatrics, 88:931-936 (juni 1976) beskriver evalueringen hos barn av en temperatur-sensitiv vaksine bestående av levende,svekket, respiratorisk syncytielt virus. Mens denne vaksine, når administrert ved et doseringsnivå tilstrekkelig høyt for å infisere alle serumnegative spebarn,forårsaket en mild sykdom i øvre luftveier, tilveiebragte ikke en minskning av dosen et akseptabelt inf ektivitetsnivå.." Viruset var også genetisk ustabilt fordi det forelå bevis for tap av temperatursensitivitet hos en av de vaksinerte. Det forelå ikke bevis for potensiering av naturlig sykdom med denne vaksine og reinfeksjon forekom blant de vaksinerte.
US patenter nr. 4 122 167 og 4 145 252 beskriver en fremgangsmåte for svekkelse av virioner ved hjelp av flere passeringer i rekkefølge gjennom humane diploide lungefibro-blaster.og US patent nr. 4 517 304 beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av imunogenisk aktive HRSV-proteiner på cellemembranene til mottakelige celler dyrket i kultur. Disse celler injiseres deretter i en vert for å utløse en imunre-spons.
Det rekombinante vaksinia virus-ekspresjonssystem er kjent for adskilt ekspresjon av G og F glykoproteinene av HRSV, Ball, et al, Expression of the Major Glycoprotein G of Human Respiratory Syncytial Virus from Recombinant Vaccinia Virus Vectors, P.N.A.S., USA, 83:246-250 (1986) og Olmsted, et al., Expression of the F Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus: Comparison of the Individual Contributions of the F and G Glycoproteins to Host Immunity, P.N.A.S., USA, 83:7462-7466 (1986). Disse to glykoproteiner ble også vist å fremkalle imunbeskyttelse hos dyr mot angrep av levende HRSV-vius, Stott, et al., Human Respiratory Syncytial Virus Glycoprotein G Expressed from Recombinant Vaccinia Virus Vector Protects Mice Against Live-virus Challenge, Journal of Virology 67: 607-613 (1986); Walsh, et al., Immunization with Glycoprotein Subunits of Respiratory Syncytical Virus to Protect Cotton Rats Against Viral Infection, Journal of Infectious Diseases, 1198-1204
(1987); Wertz, et al., Expression of the Fusion Protein of Human Respiratory Syncytial Virus from Recombinant Vaccinia Virus Vectors and Protection of Vaccinated Mice, Journal of Virology, 293-301 (1987); Elango, et al., Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection Induced to Immunization of Cotton Rats with a Recombinant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Glycoprotein, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1906-1910 (1986).
Sammendrag av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot humant respiratorisk syncytielt virus, kjennetegnet ved at det til en farmakologisk egnet bærer tilsettes minst ett immunogent fragment fra både humant respiratorisk syncytielt virusglykoprotein F og G som sammen-føyes ved ligering av HRSV gpG-fragmentet fra plasmid G-I6 som avbildet i skjema 3 med plasmid pGPF-4 som avbildet i skjema 2(d), og transformeres i E. coil for å danne et polypeptid som, med start ved den N-terminale ende, er signalsekvensen fra glykoprotein-F, et immunogent fragment av glykoproteinet F og et immunogent fragment av glykoprotein G, i en mengde egnet til å beskytte mennesker mot humant respiratorisk syncytielt virus.
Oppfinnelsen angår også plasmider anvendt ved fremgangsmåten.
De følgende definerte betegnelser er anvendt i denne beskrivelse. Uttrykket "cellekultur" viser til beholdningen av voksne celler som enten stammer fra en flercellet plante eller dyr som tillater at cellene forblir levedyktige uten-for den opprinnelige plante eller dyreorganisme. Betegnelsen "nedstrøm" identifiserer sekvenser som fortsetter videre i ekspresjonsretningen; f.eks., kodingsområdet er nedstrøms fra startkodonet. Betegnelsen "mikroorganisme" innbefatter både encellede prokaryote og eukaryote organismer, som bak-terier, aktinomyceter og gjær. Betegnelsen "operon" er en fullstendig enhet av genekspresjon og regulering, innbefattet strukturelle gener, regulatoriske gener og kontrollbestand-deler i DNA gjenkjent ved regulator-genprodukt. Betegnelsen "plasmid" refererer til et autonomt, cellereplikerende, ekstrakromosomalt sirkulært DNA, og innbefatter både ekspresjonstypene og ikke-ekspresjonstypene. Der hvor en rekombinant mikroorganisme eller cellekultur beskrives som å være vertsorganisme for et ekspresjonsplasmid,innbefatter uttrykket "ekspresjonsplasmid" både ekstrakromosomalt sirkulært DNA,og DNA som er inkorporert i vertkromosomet (kromosomene). Der hvor plasmidet opprettholdes av en vertcelle, blir plasmidet enten stabilt replikert av cellene i løpet av mitose i form av en autonom struktur, eller som en inkorporert del av vertens genom. Betegnelsen "promotor" er en del av DNA som er involvert i bindingen av RNA-polymerase for å innlede transkripsjon. Uttrykket "DNA-sekvens" refererer til et enkelt-eller dobbelttrådet DNA-molekyl omfattende nukleotid-baser, adenosin, thymidin, cytosin og guanosin. Uttrykket "vesentlig ren" refererer til en sammensetning av protein som ikke inneholder noe paramyxovirusprbtexh' foruten'^ det ønskede rekombinante kimære glykoprotein. Selv om de vesentlig rene proteiner kan være forurenset med små mengder av vertcelle-bestanddeler, er proteinet fri for kontaminerende strukturelle og ikke-strukturelle virusproteiner produsert av replikerende paramyxovira. Uttrykket "egnet vert" refererer til en cellekultur eller mikroorganisme som er forenelig med et rekombinant plasmid og som vil tillate replikasjon av plasmidet, inkorporering av plasmidet i vertens genom eller ekspresjon av plasmidet. Betegnelser "oppstrøm" identifiserer sekvenser som fortsetter i den motsatte retning av ekspresjonsretningen; f.eks., den bakterielle promotor er oppstrøms fra transkripsjonsenheten, startkodonet er opp-strøms fra kodingsområdet.
Foreliggende oppfinnelse omfatter en serie molekylære genetiske manipulasjoner som kan oppnås på mange forskjellige kjente måter. Manipuleringene kan oppsummeres som erholdelse av cDNA for proteinet, kloning og replikering av cDNA i E. coli og ekspresjon av det ønskede cDNA i en egnet vert. De forskjellige tilgjengelige fremgangsmåter for ekspresjon av proteinet beskrives detaljert i det etterfølgende, etterfulgt av spesifikke eksempler på foretrukne fremgangsmåter. Den spesifikke sekvens og basenummereringsposisjonene for et spesielt polypeptid, glykoprotein FG, er vist i skjema 9.
Nomenklaturen og de generelle laboratoriefremgangs-måter som er påkrevet ved foreliggende oppfinnelse kan finnes i Maniatis, et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982 (Maniatis).
Alle E. coli-stammer dyrkes på Luria-næringsløsning (LB) med glukose, Difco's antibiotiske medium nr. 2 og M9-medium supplert med glukose og syrehydrolyserte kaseinamino-syrer. Stammer med resistanse mot antibiotika ble opprettholdt ved medikamentkonsentrasjonene beskrevet i Maniatis. Transformasjoner ble utført ifølge fremgangsmåten beskrevet av Rowekamp og. Firtel, Dev. Biol., 79:409-418 (1980).
Alle enzymer ble anvendt ifølge leverandørens instruk-sjoner. Transformanter ble analysert ved hjelp av koloni-hybridisering som beskrevet i Grunstein og Wallis, Methods i Enzymology, 68:379-388.
Etter hybridisering fjernes og oppbevares probene og filterne vaskes 5 ganger med 400 ml 0,1 % SDS, 0,2x SSC i totalt 3 timer. Filterne lufttørkes grundig, monteres, og autoradiograferes ved anvendelse av Kodak X-OMAT AR film og Dupont Cronex Lightnenging Plus forsterkerskjermer i 16 timer ved - 70 °C.
For sekvensering av plasmider fremstilles renset plasmid DNA ifølge fremgangsmåtene beskrevet i Maniatis. Endemerkede DNA-fragmenter fremstilles og analyseres ved hjelp av den kjemiske sekvenseringsmetode ifølge Maxam og Gilbert med modifikasjoner beskrevet av Collins og Wertz,
J. Virol. 54:65-71 (1985).
Nukleotidstørrelser er gitt enten i kilobaser (kb) eller basepar (bp). Disse er beregninger ut fra agarosegel-elektroforese.
Det første trinn for å oppnå ekspresjon av protein er å erholde DNA-sekvensen som koder for proteinet fra cDNA-kloner. Denne sekvens klones deretter i et ekspresjonsplasmid som er i stand til å styre transkripsjonen av genet og tillate effektiv translasjon av transskriptet. Bibliotekmetoden for å erholde cDNA som koder for protein er generelt beskrevet i Maniatis og spesielt i Collins og Wertz, cDNA Cloning and Transcriptional Mapping of Nine Polyadenylated RNAs Encoded by the Genome of HRSV, Proe. Nati. Acad. USA 80: 3208-3212
(1983) og de beslektede dokumenter Elango, N., et al., Resistance to Human Respiratory Syncytial Virus (RSV) Infection Induced by Immunization of Cotton Rats with a Recombinant Vaccinia Virus Expressing the RSV G Glycoprotein, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 1906-1910 (1986), og Olmstead R.A. et al., Expression of the F Glycoprotein of Respiratory Syncytial Virus by a Recombinant Vaccinia Virus: Comparison of the Individual Contributipns of the F and G glycoproteins to Host Immunity, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 7462-7466 (1986).
Kloner fremstilles ved å innføye cDNA i Pstl-spaltet
pBR322 til hvilke homopolymere områder av dGTP er enzymatisk tilføyet til 3'-endene ved spaltningssetet. Homopolymere områder av dCTP tilføyes enzymatisk til 3'-terminalene av cDNA-molekylene ifølge fremgangsmåtene beskrevet av Maniatis. Ideelt bør 10-30 rester av dCTP eller dGTP tilføyes for å maksimere kloningseffektiviteten. cDNA og plasmid spleises sammen og transformeres i E. coli. Klonene som inneholder cDNA med full lengde påvises ved hjelp av prober av merket virus-cDNA eller oligonukelotider som er komplementære med deler av gensekvensene, etterfulgt av restriksjonsenzymana-lyse og DNA-sekvensering.
Oligonukleotier syntetiseres kjemisk ifølge fast fase fosforamidit-triestermetoden først beskrevet av Beauchage og Caruthers, Tetrahedron Letters, 22(20):1859-1862 (1981) ved anvendelse av et automatisert syntetiserings-apparat som beskrevet i Needham-VanDevanter, et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984). Rensing av oligonucleotider utføres enten ved nativ akrylamidgelelektroforese eller ved anionebytter-HPLC som beskrevet i Pearson og.. Regnier, J. Chrom., 255:137-149 (1983).
Sekvensen av de syntetiske oligonukleotider kan bekreftes ved anvendelse av den kjemiske nedbrytningsmetode ifølge Maxam og Gilbert, Grossman og Moldave, red., Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499-560 (1980).
For å erholde ekspresjon på høyt nivå av klonet gen i et prokaryotisk system er det vesentlig å konstruere ekspresjonsvektorer som inneholder, som et minimum, en sterk promotor for å styre mRNA-transkripsjonen, et ribosom-bindings-sete for translasjonsinnledning, og en transkripsjonstermi-nator. Eksempler på regulatorisk områder som er egnet for dette formål er promotorområdet og operatorområdet av den biosyntetiske reaksjonsvei for tryptofan hos E. coli som beskrevet av Yanofsky, Kelley, og Horn, J. Bacteriol., 158: 1018-1024 (1984) og den venstregående promotor av fag-lambda (P L) som beskrevet av Herskowitz og Hagen, Ann. Rev. Genet., 14:399-335 (1980).
Proteinene som dannes i E. coli vil ikke folde seg sammen på riktig måte på grunn av tilstedeværelsen av cystein-rester og mangelen på egnede posttranslasjonelle modifikasjoner. Under rensingen fra E. coli må de uttrykte proteiner først denatureres og deretter renatureres. Dette kan oppnås ved å oppløse de E. coli-produserte proteiner i guanidin-
HC1 og redusering av alle cystein-rester med ^>-mercapto-ethanol. Proteinet renatureres deretter enten ved langsom dialyse eller ved gelfiltrering, US patent nr. 4 511 503.
Påvisning av proteiner oppnås ved fremgangsmåter kjent i teknikken,som radioimunanalyser, eller Western blotting-teknikker,eller imunutfelling. Rensning fra E. coli kan oppnås ved å følge fremgangsmåter beskrevet i US patent nr. 4 511 503.
Ekspresjon av heterologe proteiner i gjær er velkjent og beskrevet. Methods in Yeast Genetics, Sherman, et al., Cold Spring Harbor Laboratory, ( 1982), er et anerkjent arbeide som beskriver de forskjellige fremgangsmåter som anvendes
for å fremstille proteiner i gjær.
For ekspresjon på høyt nivå av et gen i gjær, er det vesentlig å forbinde genet med et sterkt promotorsystem som
i en prokaryotisk celle og i tillegg å tilveiebringe effektiv transkripsjons-terminering/polyadenyleringsekvenser fra et gjærgen. Eksempler på anvendelige promotorer innbefatter GALI,10, Johnston og Davis, Mol. og Cell. Biol., 4: 1440-1448, 1984), ADH2, Russel, et al., J. Biol. Chem. 258: 2674-2682, 1983), PH05, EMBOJ. 6:675-680, (1982), og MF QLl. Et multikopi-plasmid med en selektiv markør som Lue-2, URA-3, Trp-1, eller His-3 er også ønskelig. MF 1-promotoren er foretrukket. MF^Cl-promotoren, i en vert av paringstypen er grunnleggende, men er uvirksom i diploider eller celler med a-paringstypen. Promotoren kan imidlertid reguleres ved
å heve eller senke temperaturen i verter som har en ts-mutasjon ved en av SIR-stedene. Effekten av en slik mutasjon ved 35 °C på en ^-type celle er at det normalt hvilende gen som koder for a-paringstypen aktiveres. Ekspresjonen av det
hvilende a-paringtype -gen, inaktiverer i sin tur MF OJ.-promotoren. En senkning av veksttemperaturen til 27 °C rever-serer hele prosessen, dvs. at a-paringstypen inaktiveres og MF Ov.1 aktiveres, Hyerskowitz og Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern, Jones, og Broach, red., Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 181-209, (1982).
Polyadenyleringssekvensene tilveiebringes av 3'-endesekvensene av ethvert av de høyt uttrykte gener, som ADH1, MF 1 eller TPI, Alber og Kawasaki, J. of Mol. and Appl. Genet. 1:419-434, (1982).
Et antall gjærekspresjonsplasmider som YEp6, YEpl3, YEp24 kan anvendes som vektorer. Et gen av interesse kan sammensmeltes med enhver av de ovennevnte promotorer, og deretter ligeres til plasmidene for ekspresjon i forskjellige gjærverter. Disse plasmider er fullt ut besrevet i litteraturen, Bostein, et al., Gene, 8:17-24, (1979); Broach, et al., Gene, 8:121-133, (1979).
To fremgangsmåter anvendes ved transformering av gjærceller. I et tilfelle omdannes gjærcellene først til protoplaster ved anvendelse av zymolyase, lyticase eller glusu-lase, etterfulgt av tilsetning av DNA og polyethylenglykol (PEG). De PEG-behandlede protoplaster regenereres deretter
i et 3 % agarmedium under selektive betingelser. Detaljene ved denne fremgangsmåte er beskrevet i publikasjonene av Beggs, Nature (London), 275:104-109 (1978); og Hinnen, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75:1929:1933 (1978). Ved den andre fremgangsmåte fjernes ikke celleveggen. Cellene behandles i stedet med litiumklorid eller acetat og plasseres på selektive plater, Ito, et al., J. Bact., 153:163-168, ( 1983 ) .
cDNA kan ligeres til forskjellige ekspresjonsvektorer for anvendelse ved transformering av vertcellekulturer. Alle vektorene inneholder gensekvenser for å innlede transskrip-sjon og translasjon av proteinene som er forenelige med vertcellen som skal transformeres.
I tillegg inneholder vektorene fortrinnsvis en markør for å tilveiebringe et fenotypisk trekk for utvelgelse av transformerte vertceller, som dihydrofolatreduktase eller metallothionein. I tillegg kan en replikerende vektor inneholde et replikon.
Illustrerende for cellekulturer anvendelige for produksjonen av proteiner er celler av insekt-eller pattedyr-opprinnelse. Pattedyrcellesystemer vil ofte foreligge i form av enkle cellelag selv om pattedyrcellesuspensjoner også kan anvendes- Illustrerende eksempler på pattedyr-cellelinjer innbefatter VERO og HeLa-celler, kinesisk hamsterovarium (CHO)-cellelinjer, WI38, BHK, COS-7 eller MDCK-cellelinjer.
Som angitt ovenfor inneholder vektorene som anvendes for å transformere vertcellen fortrinnsvis gensekvenser som innleder transskripsjonen og translasjonen av proteinets gensekvens. Disse sekvenser er ofte referert til som ekstre-sjonskontrollsekvenser. Når vertcellen er av pattedyr-eller insektopprinnelse erholdes illustrerende anvendelige ekspre-sjonskontrollsekvenser fra SV-40 promotoren, Science, 222, 524-527 (1983), CMV I.E.-promotoren, Proe. Nati. Acad. Sei. 81:659-663 (1984), metallothionein-promotoren, Nature, 296, 39-42, (1982) eller baculovirus-polyhedrin-promotoren (insektceller), Virol., 131, 561-565 (1983). Plasmidet eller det replikerende eller det integrerende DNA-materiale inneholdende ekspres jonskontrollsekvensen, spaltes ved anvendelse av restriksjonsenzymer og justeres i størrelse som nødvendig eller ønskelig og ligeres med cDNA som koder for proteiner ved hjelp av fremgangsmåter velkjente i teknikken.
Når det anvendes vertceller fra høyere dyr må, som ved anvendelse av gjær, polyadenylering eller transkripsjons-terminatorsekvenser fra kjente pattedyrgener inkorporeres i vektoren. Et eksempel på en terminatorsekvens er polyadenyl-eringsekver.sen fra det bovine veksthormon-gen.
Ytterligere gensekvenser for å kontrollere replikasjon i vertcellen kan inkorporeres i vektoren, slik som de sekvenser funnet i bovin papillomavirus type-vektorer, Saveria-Campo, "Bovine papillomavirus DNA: a eukaryotic cloning vector", DNA Cloning Vol. II--A practical approach, Glover, ed., IRL Press, Arlington, Virginia 213-238 (1985).
Den foretrukne ekspresjonsvektor anvendelig for ekspresjon av proteiner i kinesisk hamsterovarium (CHO)-celler er en skyttelvektor pSVC0W7 som replikerer både i CHO og E. coli-celler ved anvendelse av ampicillinresistansgener og dihydro-folatreduktasegener som markører i henholdsvis E. coli og CHO-celler. Plasmid pSVC0W7 tilveiebringer også polyadenylering-sekvensen fra bovint veksthormon som er nødvendig for ekspresjon i CHO-celler. Plasmin pSVC0W7 spaltes og det innføyes en viruspromotor og cDNA.
Den foretrukne ekspresjonsvektor anvendelig ved dannelse av rekombinant baculovirus for ekspresjon av proteiner i insektceller er pAc373, Smith, et al., Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165 (1983). Plasmidet replikerer i E. coli-celler ved anvendelse av ampicillinresistans, og tilveiebringer den eukaryotiske promotor og polyadenyleringsignalet fra baculovirus-polyhedringenet for ekspresjon av gener. Plasmid pAc373 spaltes og et cDNA innføyes ved siden av promotoren. Dette nye plasmid co-transfekteres med baculovirus (Autograpa californica nukleær polyhedrosisvirus)-DNA i insektceller ved hjelp av utfelling med kalsiumfosfat. Rekombinant baculovirus hvori pAc373-polyhedringenet inne-holdene et cDNA har erstattet det hjemmehørende virus-poly-hedringen ved hjelp av homolog rekombinasjon, påvises ved
32
hjelp av punkt-blot-hybridisering ved anvendelse av p-merket cDNA som probe, Summers og Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas A & M University, College Station, TX, 29-30 (1986). Insektceller infisert med rekombinant baculovirus kan også differensieres ved deres oklusjons-negative morfologi fordi innføyelsen av cDNA i polyhedringenet forhindrer syntesen av dette oklusjonsdannende protein.
Den foretrukne ekspresjonsvektor som anvendes i for-bindelse med bovint papillomavirus (BPV) for ekspresjon av proteiner er pTFW9 (plasmid pTWF9 ble deponert i overenstemmelse med Budapestavtalen. Plasmid pTFW9 er opprettholdt i en E. coli-vert og er deponert hos the Northern Research Center, Peoria, Illinois, USA, 17. november 1986 og gitt aksesjonsnr. NRRL B-18141). Plasmidet replikerer i E. coli ved anvendelse av ampicillinresistans, og tilveiebringer mus-metallothionein-promotoren og SV40-polyadenyleringssignalet for ekspresjon av gener. Plasmid pTFW9 spaltes og et cDNA innføyes ved siden av promotoren. Dette nye plasmid spaltes deretter for å tillate innføyelse av BFV. Det rekombinante plasmid transfekteres i dyreceller ved hjelp av utfelling med kalsiumfosfat og steder med transformerte celler utvelges .
Vertcellene er kompetente,eller de gjøres kompetente for transfeksjon, ved hjelp av forskjellige fremgangsmåter. Det foreligger forskjellige velkjente fremgangsmåter for innføring av DNA i dyreceller. Disse innbefatter: utfelling med kalsiumfosfat, fusjon av mottakercellene med bakterielle-protoplaster inneholdende DNA, behandling av mottakercellene med liposomer inneholdende DNA, og mikroinjeksjon av DNA direkte i cellene. De transfekterte cellene dyrkes ved hjelp av velkjente fremgangsmåter i teknikken, Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Kuchler, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc., (1977). Rekombinante glykoproteiner uttrykt i et av de ovenfor nevnte eukariotiske ekspresjonssystemer isoleres fra cellesuspensjoner som er dannet ved sammenbrytning av vertcellesystemet ved hjelp av velkjente mekan-iske eller enzymatiske fremgangsmåter. Proteiner som er utformet til å utskilles fra cellene isoleres fra mediet uten sammenbrytning av cellene. For å-rense glykoproteiner er det nyttig først å anbringe den cytoplasmatiske fraksjon på en lentil-lectinkolonne som spesifikt vil binde glykoproteiner. De eluerte glykoproteiner anbringes deretter på en affinitetskolonne inneholdende antistoff.
Et typisk glykoprotein kan deles i tre områder. Ved den amino-terminale ende er et hydrofobt område benevnt signalsekvensen. Denne sekvens av aminosyrer signalerer tran-sporten av glykoproteinet til cellemembranen. Etter tran-sport fjernes signalsekvensen ved spaltning. Nedstrøms fra signalsekvensen finnes det ekstracellulære område av det modne glykoprotein. Dette område er den imunogene del av glykoproteinet fordi den ér tilgjengelig for antistoffer.
Ved den karboksy-terminale ende av glykoproteinet ligger det hydrofobe ankerområde som forårsaker at glykoproteinet be-holdes i cellemembranen. HRSV F er et typisk glykoprotein ved at det inneholder en aminoterminal signalsekvens og en karboksyterminal ankersekvens, Collins, et al., PNAS 81: 7683-7687, (1984). Imidlertid er HRSV G-glykoproteinet uvanlig fordi dets aminoterminale ende virker både som et signalområde og et ankerområde, Wertz, et al., PNAS 82:4075-4079, (1985 ) .
Et glykoprotein kan utformes til å utskilles fra celler i det omgivende medium. Dette oppnås ved å bevirke en tidlig avslutning av glykoproteinet før transkripsjon av ankerområdet, Lasky, et al., Biotechnology, 2:527-532 (1984). Tidlig avslutning kan oppnås ved å innføye et universelt translasjonsterminator-oligonukleotid i egnet sete i genets DNA. Disse oligonukleotider er kommersielt tilgjengelige. Tidlig avslutning kan også oppnås ved å endre avlesningsrammen, og således frembringe et translasjonsterminerings-kodon.
Det kimære glykoprotein beskrevet i det etterfølgende består av signalområdet og de ekstracellulære områder av HRSV F bundet til det ekstracellulære området av HRSV G, og vil bli referert til som FG. Hoveddelen av det ekstracellulære området av G-glykoproteinet er inneholdt innen kodingsområdet som omspennes av Ddel (nukleotid posisjon 302) og FoKI (nukleotid posisjon 850) restriksjonsenzymsetene. Denne sekvens koder ikke for signal/ankerområdet av glykoproteinet. Hoveddelen av det ekstracellulære området av F-glykoproteinet er inneholdt innen kodingsområdet forut for NSil (nukleotid-posisjon 1479) restriksjonsenzymsetet. Denne sekvens koder for signalområdet og hoveddelen av det antigene området, men ikke for ankerområdet av glykoproteinet.
For å innføye G-glykoproteinsekvensen i F-glykoproteinet, oppsluttes plasmid G-16 som inneholder HRSV gpG med Ddel og FoKI, og endene gjøres butte med Klenow polymerase. 550 basepar fragmentet isoleres deretter ved hjelp av agarose-gelelektroforese. Plasmid pGPF-4, inneholdende HRSV gpF-genet ble oppsluttet med Nsil. Endene ble gjort butte med T4-DNA-polymerase og ble defosforylert med bakteriell alkalisk fosfatase. 550 basepar fragmentet fra G-16 ligeres deretter i pGPF-4-plasmidet og transformeres i E. coli HB101. En av klonene, pGPFG-1, isolert fra transformasjonen, er bekreftet å inneholde de korrekte sammenbindingspunkter ved hjelp av Maxim-Gilbert sekvensering.
Når det plasseres riktig i en eukariotisk ekspresjonsvektor, er det ovenfor beskrevne FG-gen utformet for å uttrykke et kimært glykoprotein som kan transporteres til celle-overflaten og utskilles i mediet.
De ovennevnte restriksjonsenzymseter ble utvalgt fordi de tillater ekspresjon av en stor del av de relevante områder av F og G-glykoproteinene. Imidlertid kan andre deler av glykoproteinene uttrykkes ved utvelgelse av andre restriksjonsenzymseter innen F og G-kodingssekvensene for fusjonen av disse gener. F.eks. kan restriksjonsenzymene Alul, HincII eller Hinfl anvendes for spaltning ved 5'-enden av gpG-genet. Restriksjonsenzymene HphI, MboII eller XhoII kan anvendes
for spaltning ved 3'-enden av gpG-genet. Enzymene kan anvendes i enhver kombinasjon av to, med et enzym fra hver gruppe, for å gi imunogene proteinfragmenter. For gpF-genet kan Hinflll, HincII, Avall, Sspl eller HphI restriksjonsenzymer anvendes i stedet for Nsil. Linker-oligonukleotider kan anvendes for å korrigere avlesingsrammen i sammenbindingsområdene. To oligonukleotider som kan korrigere de to mulige rammeskift er Sall-linkerne
som er kommersielt tilgjengelige. Når et ankerområde er ønsket i glykoproteinet kan dessuten et linker-oligonukleotid tilsettes ved det andre sammenbindingspunkt for å tillate syntese av gpF-ankerområdet. Alternative strategier kan utformes for ekspresjonen av et FG-fusjonsprotein ved innføy-else eller utslettelse av forskjellige sekvenser. Hoved-kriteriet for proteinet er at en signalsekvens og de imunologisk viktige områder av de to glykoproteiner bibeholdes.
Innføyelse av FG-genet i CHO, BPV, eller baculovirus-ekspresjonsvektorer er allerede beskrevet.
Det FG-kimære glykoprotein gir fordeler i forhold til ekspresjon av de individuelle glykoproteiner. Fordi FG er et enkelt protein, fordrer det kun halvparten av arbeidet og reagensene for rensning sammenlignet med F og G-glykoproteinene hver for seg. Det FG-kimære glykoprotein utskilles dessuten i mediet og letter rensningen. F-glykoproteinet kan konstrueres som et utskilt glykoprotein ved avkutting forut for ankerområde -sekvensene. Imidlertid inneholder HRSV G-glykoproteinet et signal/ankerområde ved dets aminoterminale ende. Derfor vil avkutting av dette glykoprotein ikke frembringe en utskilt form. Signal/ankerområdet kan erstattes med et signalområde fra et fremmed glykoprotein, men dette ville innføre fremmede proteinsekvenser i den potensielle vaksine.
HRSV F- og G-glykoproteinene er uttrykt ved anvendelse av et vacciniavirus-ekspresjonssystem og disse rekombinante vira er anvendt som vaksiner ved beskyttelsen av bomullsrotter mot HRSV-infeksjon, Olmsted, et al., PNAS 83: 7462-7466, (1986). Vacciniavirus som uttrykker F-glykoproteinet viste seg vesentlig mer imunogent og tilveiebragte bedre beskyttelse enn vacciniavirus som uttrykte G-glykoproteinet, Olmsted et al., se ovenfor. Vaksinering med begge vira syntes ikke å ha en tilleggseffekt i forhold til F alene Olmsted, et al., se ovenfor. I motsetning til dette synes det utskilte FG-glykoprotein å være mer imunogent og tilveiebringe bedre beskyttelse enn en utskilt form av F-glykoproteinet. Vaksinasjon av bomullsrotter med FG-proteinet pro-duserer dessuten en høyere prosentdel av nøytraliserende antistoff som definert av ELISA til nøytraliseringsforholdet.
Et eksperiment ble utformet for å sammenligne imuno-geniteten av FG og avkuttet F (Ft). Fordi de rekombinante glykoproteiner ikke kunne påvises i ConA (et lee tin som binder glykoproteiner) rensede ekstrakter ved Comassie-blått-farving av proteiner som ble underkastet elektroforese i SDS-PAGE-geler (trolig mindre enn 1 % av proteinet), ble en in-direkte fremgangsmåte anvendt for å bestemme ekvivalente lengder av glykoproteinene. Densitometerkurver av autoradio-35
grammer inneholdende S-methionin-merket protein som var blitt underkastet elektroforese på en SDS-PAGE-gel, ble anvendt for å bestemme den relative mengde av FG og Ft i prøvene (FG og Ft inneholder det samme antall methionin-rester). Disse samme prøver ble deretter analysert ved hjelp av ELISA, og det ble bestemt at ekvivalente mengder av FG reagerer 3 ganger bedre enn Ft i den foreliggende ELISA-
analyse. Mengde FG eller Ft i de fremstilte vaksinasjons-prøver ble deretter bestemt ved hjelp av ELISA og utjevnet ved hjelp av det ovenfor angitte forhold. De anvendte grupper i undersøkelsen var FG, Ft (høy dose), Ft (lav dose), og gp50 (negativ kontroll). Bomullsrottene vaksineres tre ganger i Freund's hjelpemiddel, 500 ^g totalt protein pr. dose. Mengde spesifikt glykoprotein i FG-gruppen er ekviva-lent med den lave dose Ft-gruppe. Den høye dose Ft-gruppe mottok 3 ganger mer spesifikt glykoprotein. Et sammendrag av dataene fra denne undersøkelse er vist nedenfor.
Den ovenfor angitte undersøkelse viser effektfullheten av det kimære FG-glykoprotein ved anvendelse av råpreparater av FG i Freund's hjelpemiddel. For å demonstrere effektfullheten av FG til å indusere høye titere av nøytraliserende antistoff og beskytte bomullsrotter mot RSV-angrep, ble det utført en undersøkelse ved anvendelse av høyere rensede pre-parater av FG formulert i et hjelpemiddel akseptabelt for human anvendelse (alun). FG ble renset til 50 % homogenitet ved anvendelse av en to-trinns fremgangsmåte som omfattet kationebytte og monoklonalt antistoff-affinitetskolonner. Ft-glykoproteinet ble renset til 50 % homogenitet ved hjelp av lentil-lektin-kromatografi etterfulgt av monoklonalt antistoff -af f initetskromatograf i . Bomullsrotter ble vaksinert to ganger med disse glykoproteiner adsorfiert i alu.n (2,5 mg alun/dose). En gruppe rotter ble vaksinert intranasalt med levende RSV som en positiv kontroll. En gruppe rotter ble vaksinert med alun-hjelpemidlet som en negativ kontroll. Rotter fra hver gruppe ble testet for serumantistoff og nøy-traliserende antistoff. Rottene ble utsatt for RSV-angrep og lungene ble analysert for virus.
Anvendte regler for å representere plasmider og fragmenter i plansjene 1-6, er ment å være synonyme med konven-sjonelle sirkulære fremstillinger av plasmider og deres fragmenter. I motsetning til de sirkulære avbildninger representerer de rettlinjede avbildninger i plansjene både sirkulært og lineært dobbelstrenget DNA med innledning eller trans-skripsjon forekommende fra venstre til høyre (5' til 3'). Stjerner (<*>) representerer brodannelsen av nukleotider for å fullføre den sirkulære form av plasmidene. Fragmenter er ikke merket med stjerne fordi de er lineære stykker av dobbelstrenget DNA. Endonuklease-restriksjonsseter er vist ovenfor linjen. Genmarkører er vist under linjen. Striper som forekommer under diagrammene som representerer plasmidet eller fragmentene anvendes for å angi antall basepar mellom to punkter på DNA. De innbyrdes mellomrom mellom markører an-gir ikke virkelige avstander, men er kun ment å angi deres relative posisjoner i den illustrerte DNA-sekvens.
Eksempler
Eksempel 1 Fjerning av G-C-halene fra F-glykoprotein-genet.
For å erholde maksimal ekspresjon av F-glykoproteinet, er det nødvendig å fjerne G-C-nukleotidene som anvendes for å innføye cDNA i plasmid pBR322 fra 5'-enden (i forhold til det opprinnelige mRNA) av cDNA. For å kunne oppnå en egnet innføyelse av gpFG cDNA i den foretrukne ekspresjonsvektor for CHO-celler, pSVC0W7 (beskrevet nedenfor), er det nødvendig å tilføre et BamHI-sete oppstrøms fra proteinkod-ingssekvensen. For å oppnå dette innføyes cDNA av F-glykoproteinet i pUC12 (PL Pharmica Labs, Piscataway, NJ). Fremgangsmåter for syntesen av cDNA-klon F5-25 inneholdende den fullstendige sekvens for F-glykoproteinet er beskrevet. Collins, et al., Nucleotide sequence of the gene encoding the fusion (F) glykoprotein of human respitory syncytial virus, J. Virol., 81:7683-7687.
A. Oppbygging av pGPF2 - plansje 1
cDNA av F-glykoproteinet er flankert av Pstl-seter (plansje 1), imidlertid foreligger også interne Pstl-seter. Plasmid pF5-25 oppsluttes derfor delvis med Pstl og fragment 1 (1,9 kb) isoleres fra en gel. Fragment 1 ligeres til plasmid pUCl2 (Bethesda Res. Labs,, Rockville, MD) som er oppsluttet med Pstl. Et plasmid med 5'-enden av gpF-genet beliggende ved siden av Xbal-setet i pUCl2 utvelges og betegnes pGPF2 (4,6 kb). Denne orientering bekreftes ved spaltning med Nsil og Hindlll som danner et fragment med tilnærmet 400 basepar.
B. Oppbygging av pGPF3 og pGPF4 - plansje 2
For å fjerne G-C-nukleotidene fra 5<1->enden av cDNA, åpnes pGPF2 med Xbal og endene behandles med bakteriell alkalisk fosfatase for å gi fragment 3. Fragment 3 oppsluttes deretter med Sali,som spalter av en liten bit mellom Xbal og Pstl-setene,og behandles deretter med Klenowenzym for å gjøre endene butte. Etter behandling med Klenowenzym oppsluttes fragment 3 med Lambda-exonuklease som fordrer et 5'-fosfat og etterlater et 3'-overheng. På grunn av at 5'-fosfatet er fjernet ved enden oppstrøms fra gpF, vil exonukleasen operere nedstrøms mot gpF-sekvensen. Exonukleasen tillates tilstrekkelig tid for å fjerne nukleotider på den andre siden av G/C-haleområdet inn i ledersekvensen. En syntetisk sekvens inneholdende de første 15 baser av ledersekvensen hybridiseres til fragment 4 og de manglende baser tilføyes med Klenow-
enzym og endene ligeres med T4-ligase for å gi pGPF3 (4,6
kb) som transformeres i E. coli hvoretter sekvensen bekreftes.
For å fjerne G-C-nukleotidene fra 3<1->enden av cDNA, åpnes pGPF3 med Hindlll og behandles med exonuklease Bal 31
i en tid som er tilstrekkelig for å tillate oppslutning gjenom G-C-nukleotidene. Endene gjøres butte med Klenow-enzym og cDNA-klonet befries fra vektor-DNA ved oppslutning med BamHI. cDNA-fragmentet isoleres fra en gel og ligeres til plasmid pUC12 som er oppsluttet med BamHI og HincII (HincII er forenelig med butte ender) for å gi pGPF4. Plasmidet transformeres i E. coli og et egnet klon som er tilstrekkelig oppsluttet med Bal31 identifiseres ved sekvensering. Alternativt kan G-C-nukleotidene fjernes ved oppslutning med et restriksjonsenzym som har et entydig sete opp-strøms fra G-C-nukleotidene. For gpF kan et slikt enzym være Haelll. Fordi Haelll spalter oppstrøms fra F-genets normale translasjons-termineringssignal, kan et universelt translasjons-termineringsoligonukleotid (New England Biolabs) ligeres til F-cDNA etter oppslutning med Haelll. DNA kan deretter oppsluttes med BamHI og behandles som beskrevet ovenfor for dannelse av pGPF-4.
Eksempel 2 Oppbygning av et HRSV-kimært FG-glykoprotein,Genplansje 3
A. Fremstilling av HRSV G-glykoproteingenet
Klon G2B-16 inneholdende det fullstendige kodingsom-råde for HRSV G-glykoproteinet er beskrevet (Wertz, et al., Nucleotide sequence of the G protein gene of human respiratory syncytial virus reveals an unusual type of viral mem-brane protein, PNAS, 82:4075-4079 (1985)). Klon G2B-16,inneholdende G-glykoprotein cDNA,oppsluttes med Ddel og FoKI og endene gjøres butte med E. coli DNA-polymerase (Klenow-fragment). DNA underkastes deretter elektroforese i en 1,5 % agarosegel. 550 basepar-fragmentet (fragment 4), inneholdende det relevante område av G-genet, fjernes fra gelen og DNA renses fra agarosen.
B. Innføyelse av G cDNA-fragmentet i HRSV F-glykoproteingenet
Plasmid pGPF4 (plansje 2) oppsluttes med Nsil. Endene gjøres butte med T4 DNA-polymerase og defosforyleres deretter med bakteriell alkalisk fosfatase. 550 basepar-fragmentet av G cDNA ligeres deretter til plasmid pGPF4 for å
gi det kimære FG-gen (pGPFG-1). Plasmidet transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og utvelges for den korrekte orientering av G cDNA innen F-genet ved oppslutning med Hinfl som vil danne sammenbindingsfragmenter med 875 basepar og 186 basepar. Den ukorrekte orientering av G-fragmentet vil gi sammenbindingsfragmenter med 650 basepar og 400 basepar etter oppslutning med Hinfl. Sammenbindingsområdene av et riktig orientert klon bekreftes deretter som korrekt ved Maxam-Gilbert-sekvensering.
Det ovenfor angitte eksempel vil danne et gen som koder for et kimært glykoprotein inneholdende signalområdet og det imunogene området av F-glykoproteinet bundet til det imunogene området av G-glykoproteinet. Fordi den andre for-bindelse (G til F) forårsaker et rammeskift og translasjons-terminering, vil ikke noe ankerområde være tilstede i glykoproteinet .
Eksempel 3 Anvendelse av DNA-oligonukleotidlinkere for å justere avlesningsrammen av et HRSV-kimært FG glykoprotein - plansje 4
Dersom det anvendes andre restriksjonsenzymer enn de som er vist i eksempel 2 for å knytte sammen F og G-genene, kan et rammeskift forekomme med første sammenknytningspunkt mellom F og G, noe som fører til tidlig translasjonsterminer-ing av glykoproteinet. Dette kan overvinnes ved anvendelse av oligonukleotid-linkere som gjenoppretterden korrekte avlesn-ingsramme.
A. Fremstilling av HRSV G-glykoproteingenet
Klonplasmid G2B-16,inneholdende G-glykoprotein cDNA, oppsluttes med HphI og endene gjøres butte med T4 DNA-polymerase. Sall-linkeren
(New England Biolabs) ligeres til endene av DNA. DNA oppsluttes med Sali og underkastes elektroforese i en 1,5 % agarosegel. 410 basepar-fragmentet (fragment 5) inneholdende det
relevante område av G-genet fjernes fra gelen og DNA renses fra agarosen.
B. Innføyelse av G-cDNA-fragmentet i HRSV F-glykoproteingenet
Plasmid pGPF4 oppsluttes med Nsil og endene gjøres butte med T4 DNA-plymerase. Sall-linkeren angitt ovenfor ligeres til endene av pGPF4 DNA. DNA oppsluttes med Sali og underkastes elektroforese i en 1 % agarosegel. 4,4 kb fragmentet fjernes fra gelen og DNA renses fra agarosen. 4,4 kb pGPF4 DNA-fragmentet og 410 bp G-fragmentet ligeres sammen under dannelse av pGPFG-2 og transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og utvelges for den korrekte orientering av
G cDNA innen F-genet ved oppslutning med Hinfl som vil danne sammenbindingsframgmenter med 768 basepar og 220 basepar. Den ukorrekte orientering av G-fragmentet vil gi sammenbind-ingsf ragmenter med 555 bp og 430 bp etter HinfI-fordøyelse. Sammenbindingsområdene av dette klon bekreftes deretter som korrekt ved Maxam-Gilbert sekvensering.
Det ovenfor angitte eksempel vil danne et gen som koder for et kimært FG-glykoprotein lignende glykoproteinet i eksempel 2. Det kimære glykoprotein dannet i dette eksempel vil inneholde mindre av de imunogene områder av G-glykoproteinet enn det kimære glykoprotein dannet i eksempel 2. Kimære glykoproteiner inneholdende andre områder av de to glykoproteiner kan dannes som beskrevet i eksempler 2 og 3 ved anvendelse av enzymene oppført i avsnittet "detaljert beskrivelse".
Eksempel 4 Anvendelse av DNA-oligonukleotider for å danne gener som koder for kimære FG-glykoproteiner av forskjellige lengder - plansje 5
Gener som koder for kimære FG-glykoproteiner inneholdende forskjellige områder av F og G-glykoproteinene kan dannes ved anvendelse av en kombinasjon av restriksjonsenzymer og oligonukleotider. Denne fremgangsmåte tillater F og G-glykoproteinene å bindes til ethvert ønskelig punkt på deres aminosyre-grunnstamme, noe som tillater inkorporering eller fjerning av områder som sansynlig inneholder epitoper som vil gjenkjennes av vert-imunsystemet. Individuelle aminosyrer kan også endres hvis ønskelig. Oligonukleotider syntetiseres i overenstemmelse med DNA-sekvensen fra det ønskelige punkt for binding til et egnet restriksjonsenzym-sete. Glykoproteinet oppsluttes med dette restriksjonsenzym og oligonukleotidet ligeres til genet ved restriksjonsenzym-setet for å dannet et DNA-fragment av den ønskede lengde. Oligonukleotidene syntetiseres med ender som er forenelig med restriksjonsenzym-setene for å oppnå at ligeringen foregår lett.
A. Fremstilling av HRSV F-glykoprotein-gen
Plasmid pGPF4 oppsluttes med Nsil og ligeres til enten nukleotid 1 (cDNA-nukleotider 1483-1519) eller en blanding av oligonukleotider 1 og 2. Oligonukleotider 1 og 2 (cDNA-nukleotider 1483-1564) vil forlenge glykoprotein F DNA,inkorporert i det kimære gen til DNA-sekvensene like forut for det anker-kodende område av F-glykoproteinet. DNA-sekvensene i disse to oligonukleotider kan kode for ytterligere epitoper funnet på F-glykoproteinet. Parenteser omgir nukleotidene ved 3'-enden av oligonukleotid 1, som ville være inkludert hvis det var ment å være det terminale oligonukleotid. De angitte nukleotider koder for et Hindlll-restriksjonsenzym-sete. Dersom oligonukleotid 2 også skal inkluderes,, eksluderes de angitte nukleotider på oligonukleotid 1 for å tillate ligering av 3'-enden av oligonukleotid 1 med 5<1->enden av oligonukleotid 2. 3'-enden av oligonukleotid 2 inneholder også et Hindlll-sete.
Etterfølgende ligering av oligonukleotidet (nukleotidene), oppsluttes DNA med Hindlll (Hindlll-seter i oligonukleotid ved 3'-enden av F-genet og i polylinkerområdet av pUCl2-plasmid) og plasmidet religeres. DNA transformeres i E. coli HB101 og et klon inneholdende oligonukleotidet (nukleotidene) bundet til F-genet isoleres (pGPF5). Tilstedeværelse av oligonukleotidet (nukleotidene) i klonet kan be-32
kreftes ved hybridisering av klonet med p-merket oligonukleotid (nukleotider).
B. Innføyelse av glykoprotein G cDNA i F-glykoproteingenet
Klon G2B-16 oppsluttes med Hinfl og XhoII. 277 bp fragmentet som representerer cDNA-området fra nukleotidposi-sjon 377 til 654 gelrenses. Oligonukleotider som representerer tilstøtende områder av G-cDNA ligeres deretter til enden av G-fragmentet. DNA-sekvensene i disse oligonukleotider kan kode for ytterligere epitoper funnet på G-glykoproteinet. De individuelle oligonukleotider ble utformet for å inkorporere områder som kan inneholde entydige epitoper. Oligonukleotidet ligert til 5'-enden av G cDNA kan enten bestå av oligonukleotid 3 (cDNA nukleotider 297-377) eller oligonukleotid 3 bundet til oligonukleotid 4 (cDNA-nukleotider 213-377): Oligonukleotidet ligert til 3<1->enden av G cDNA kan bestå av oligonukleotid 5 (cDNA-nukleotider 654-714), oligonukleotider 5-6 (cDNA-nukleotider 654-774), oligonukleotider 5-6-7 (cDNA-nukleotider 654-843), eller oligonukleotider 5-6-7-8 (cDNA-nukleotider 654-912). Parenteser omslutter nukleotider som kun vil være inkludert i det terminale oligonukleotid. De omsluttede nukleotider ville f.eks. ikke være inkludert i oligonukleotid 5 hvis oligonukleotid 6 skulle tilsettes. Disse omsluttede nukleotider koder for et Hindlll-sete og for et translasjons-termineringskodon i tilfelle av oligonukleotider 5, 6, 7 og 8. De omsluttede nukleotider er ikke inkludert når et ytterligere oligonukleotid (oligonukleotider) skal tilsettes for å tillate ligering mellom de forenelige ender av oligonukleotidene. 5'-enden av oligonukleotid 3 er f.eks. forenelig med 3'-enden av oligonukleotid 4 når nukleotidene som er omsluttet av parenteser ikke er inkludert i oligonukleotid 3.
Etterfølgende ligering av oligonukleotidene til G cDNA-fragmentet, oppsluttes DNA med Hindlll og det utvidete G cDNA-fragment (fragment 7) gelrenses. Det nye G cDNA-fragment ligeres deretter til F-klonet fremstilt i avsnitt A i dette eksempel (pGPF-5) som er oppsluttet med Hindlll. DNA transformeres i E. coli HB101 og et klon inneholdende G-genet i den korrekte orientering innen F-genet isoleres (pGPFG-3). Orienteringen bestemmes ved oppslutning med egnede restriksjonsenzymer. De nylig syntetiserte områder av det kimære gen bekreftes som korrekt ved Maxam-Gilbert-sekvensering. Klonet kan deretter plasseres i forskjellige ekspresjonsvektorer som beskrevet nedenfor.
C. Oligonukleotider
Eksempel 5 Oppbygging av et HRSV kimært FG-glykoprotein-gen inneholdende et ankerområde - plansje 6
Eksempler 2, 3 og 4 illustrerer syntesen av gener
som koder for kimære FG-glykoproteiner som ikke inneholder ankerområder og som derfor vil utskilles i mediet fra ut-trykkende celler. Et gen som koder for et kimært FG-glykoprotein inneholdende et ankerområde kan syntetiseres. Ankerområdet ville forårsake tilbakeholdelse av det kimære glykoprotein i cellemembranen på en måte lignende de fleste virus-glykoproteiner. Ankerområdet kan befinne seg på den karboksy-terminale ende av glykoproteinet, slik at de imunogene områder av det kimære molekyl fra både F-og G-glykoproteinene ville trenge inn i det ekstracellulære fluidum. Genet beskrevet nedenfor vil kode for et kimært glykoprotein bestående av det ekstracellulære område av HRSV F, det ekstracellulære område av HRSV G, og ankerområdet av HRSV F,i den ovenfor angitte rekkefølge fra aminoterminalen til karboksyterminalen.
A. Innføyelse av G cDNA-fragmentet i HRSV F-glykoprotein-genet
Klonet G2B-16 oppsluttes med Ddel og Foki. De følgende oligonukleotider ligeres deretter til endene av DNA-fragmentet:
Etterfølgende ligering oppsluttes DNA med Nsil og 550 bp fragmentet av G cDNA (fragment 8) gelrenses. 550 bp fragmentet
i
ligeres deretter til Nsil-oppsluttet pGPF4. DNA transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og utvelges for den korrekte orientering som beskrevet i eksempel 2. Forbindelsesområdene av et korrekt orientert klon bekreftes deretter som korrekt
ved Maxam-Gilbert-sekvensering. Dette klon (pGPFG-4) kan plasseres i forskjellige ekspresjonsvektorer som beskrevet nedenfor.
Eksempel 6 Oppbygging av et HRSV kimært GF-glykoprotein-gen
En del av det ekstracellulære område av HRSV F-glykoproteinet kan plasseres ved den karboksy-terminale ende av G-glykoproteinet. Dette kimære glykoprotein vil bestå av signal/ankeromradet fra amino-terminalen av G, hoveddelen av det ekstracellulære område av G, og en del av det ekstracellulære område av F,i den ovenfor angitte rekkefølge fra amino-terminal til karboksy-terminal.
A. Fremstilling av HRSV G-glykoprotein-genet - plansje 7
For å klargjøre klon G2B-16 for ekspresjon, må G-C-halene anvendt i cDNA-kloning fjernes og kompatible restriksjonsenzym-seter må plasseres på endene. Klon G2B-16 oppsluttes med Nlalll og FoKI. Nlalll spalter ved posisjon 18 og FoKI ved posisjon 846 på cDNA-gensekvensen. De følgende oligonukleotider ligeres deretter til cDNA-fragmentet:
Oligonukleotid 11 vil ligere til Nlalll-setet og danne et BamHI-restriksjonsenzymsete ved 5 '-enden av cDNA-fragmentet. Oligonukleotid 12 vil ligere til FoKI-setet og danne et Sall-restriksjonsenzymsete ved 3'-enden av cDNA-fragmentet. DNA underkastes elektroforese i en 1,5 % agarosegel. Det 850 bp G cDNA-fragment (fragment 9) fjernes fra gelen og DNA renses fra agarosen. G cDNA-fragmentet ligeres deretter til pUC12 som er oppsluttet med BamHI og Sali under dannelse av pGPG-1. Plasmidet transformeres i. E. coli HB101 og plasmid-DNA isoleres.
B. Innføyelse av et F cDNA-fragment i HRSV G-glykoproteingenet - plansje 8
Klon F5-25 oppsluttes med XhoII og Nsil. XhoII spalter ved posisjon 446 og Nsil ved posisjon 1483 på F cDNA-gensekvensen. De følgende oligonukleotider ligeres deretter til cDNA-fragmentet.
Oligonukleotid 13 vil ligere til XhoII-setet og vil danne et Sall-restriksjonsenzymsete ved 5'-enden av cDNA-fragmentet. Oligonukelotid 14 vil ligere til Nsil-setet og vil danne et Sall-restriksjonsenzymsete og et translasjons-termineringskodon ved 3'-enden av cDNA-fragmentet. DNA opplsuttes deretter med Sali, og det 960 bp F cDNA-fragment (fragment 10) gelrenses. F cDNA-fragmentet ligeres deretter til pGPG-1 som er oppsluttet med Sali. Plasmidet transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og utvelges for den korrekte orientering av F cDNA innen G-genet ved oppslutning med BamHI og Nsil som vil danne et 1,8 kb fragment. Den ukorrekte orientering vil danne et 850 bp fragment, forbindelsesområdene av et riktig orientert klon bekreftes deretter som korrekt ved Maxam-Gilbert-sekvensering. Dette klon (PGPGF-1) kan plasseres i forskjellige ekspresjonsvektorer som beskrevet nedenfor.
Eksempel 7 Ekspresjon av det kimære FG-glykoprotein av HRSV i CHO-celler
A. Oppbygging av pSVCOW7
Startplasmidet pSV2dhfr (tilgjengelig fra the American Type Culture Collection,eller fremstilt ifølge fremgangsmåten til S. Subraman, et al., "Expression of the Mouse Dihydro-folate Reductase Complementary Deoxyribonucleic Acid in Simian Virus 40", Molecular and Cellular Biology 2:854-864 (september 1981) oppsluttes med BamHI og EcoRI under dannelse av fragmentet (5) (5,0 kb) inneholdende genet for ampicillinresistans, SV40-utgangspunktet, og dhfr-genet. Den andre del av pSVCOW7 erholdes fra plasmid pXGH2R2 som oppsluttes med de samme restriksjonsendonukleaser som anvendes for å spalte pSV2dhfr under dannelse av fragment 5 (2,1 kb) inneholdende 3'-enden av genomisk bovint veksthormongen, dvs. BGH gDNA. Plasmid p XGH2R2 er offentlig tilgjengelig fra en E. coli HBlOl-vert, deponert hos the Northern Regional Research Laboratories in Peoria, Illinois (NRRL B-15154). Fragmenter (5 og 6) ligeres under dannelse av pSVC0W7 (7,1 kb).
B. Oppbyggning av pGPFG-IE-PA
Genene oppbygd i eksemplene 2-6 kan anvendes for ekspresjon av et kimært glykoprotein i CHO-celler. Plasmidet
pGPFG-1 vil anvendes i det følgende eksempel. De andre kimære gener behandles som beskrevet for pGPFG-1 hvis ikke annet er angitt. Sammensettingen av pGPFG-IE-PA gjennomføres i to trinn. Først innføyes gpFG cDNA fra pGPFGl i pSVC0W7 under dannelse av pGPFG-PA og deretter innføres den "immediate early" cytomegalovirus-promotor for å initiere transkripsjon av de HSRV-lignende proteiner under dannelse av pGPFG-IEPA.
Trinn 1. Plasmid pSVC0W7 spaltes med EcoRI og PuvII
og fragment 11 (600 bp),inneholdende polyadenyleringssekvensen av bovint veksthormon med en utstrektning fra PvuII-setet i det overveiende 3'-exon av BGH-genet til EcoRI-setet nedstrøms fra 3'-enden,isoleres. De følgende referanser gir en fullstendig diskusjon av BGH-polyadenyleringssekvensen: (1) Europeisk patentsøknad nr. 0112012, publisert 27. juni 1984, hvori identifiseringen og karakteriseringen av BGH genomisk DNA er beskrevet; (2) Woychik, R.P. et al., "Re-quirement for the 3' Flanking Region of the Bovine Growth Hormone Gene for Acurate Polyadenylation", Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:3944-3948 (Juli 1984); og D.R. Higgis, et al.. Nature 306:398-400 (24. november 1983), og referanser sitert deri som beskriver at nukelotidsekvensen AATAAA karakteri-serer polyadenyleringssignalet i et område 11-30 nukleotider oppstrøms (mot 5'-enden) fra 3'-enden av BGH-genet.
En andre prøve av pSVCOW7 spaltes med EcoRI og BamHI under dannelse av fragment 12 (5,8 kb). Fragment 12 kan alternativt stamme fra EcoRI/BamHI-fragmeatet fra det opp-havelige plasmid pSV2dhfr, tilgjengelig fra Bethesda Research Laboratories. Fragment 12 inneholder utgangspunktet for replikasjon fra pBR322 og et ampicillinresistansgen uttrykt i E. coli, som tillater utvelgelse av plasmidet i E. coli. Fragmentet inneholder også mus-dihydrofolatreduktase-cDNA i en oppbygning som tillater ekspresjon i pattedyrceller. Subramani, et al., Mol. Cell. Biol. 1:854-864 (1981).
Plasmid pGPFGl spaltes med Hindlll (pGPFG-3 oppsluttes med Hpal), behandles med Klenowenzym og spaltes på nytt med BamHI under dannelse av fragment 13 (2,2 kb) som gelisoleres. BamHI-setet er beliggende like oppstrøms fra cDNA som koder for de 5'-utranslaterte sekvenser av FG mRNA, og Hindlll-setet er i pUC12-vektoren beliggende noen få baser på den andre side av Pstl-setet nær 3'-enden av gpFG cDNA (Hpall-setet i pGPFG-3 er beliggende 95 bp fra 3'-enden av FG cDNA).
Fragmentene 11, 12 og 13 ligeres under dannelse av pGPFG-PA (8,6 kb), som er en replikasjonsvektor som er i stand til å pendle mellom E. coli og CHO-celler. Plasmid pGPFG-PA transformeres i E. coli.
Trinn 2. I trinn 2 omdannes pGPFG-PA til ekspresjonsplasmid pGPFG-IE-PA ved å innføye den "immediate early" gen-promotor fra human cytomegalovirus (CMV I.E. promotor). CMV I.E. promotoren erholders fra Pstl-oppslutningen av CMV-genomet. Restriksjonsendonuklease-spaltningskart over området for det humane cytomegalovirus (CMV)-genom inneholdende hoved-"immediate early"-genet (CMV I.E.) er beskrevet i detalj,Stinski, et al., J. Virol. 46:1-14, 1983; Stenberg,
et al., J. Virol. 49:190-199, 1984; og Thomsen, et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:659-663, 1984.
De refererte publikasjoner av Stinski og Thomsen beskriver et 2,0 kilobase Pstl-fragment som inneholder promotoren for hoved-"immediate early"-genet. Når dette 2,0 kb Pstl-fragment isoleres og oppsluttes med Sau3AI, erholdes et 760 basepar-fragment blant produktene. Dette 760 basepar-fragment kan skjelnes fra de andre produkter ved dets stør-relse og tilstedeværelse av et Sacl-spaltningssete og et Ball-spaltningssete innen fragmentet. På grunn av at det lett kan identifiseres, er anvendelse av dette Sau3AI-fragment den foretrukne fremgangsmåte for anvendelse av CMV I.E.-promotoren som beskrevet i foreliggende patentbeskrivelse.
Plasmid pGPFG-PA spaltes med BamHI, og et Sau3AI-fragment inneholdende CMV-"immediat early"-promotoren ligeres til det forenelige BamHI-sete. Plasmider inneholdende CMV-pro-motorfragmentet i en orientering slik at transkripsjon fra promotoren vil syntetisere et mRNA som koder for et HRSV-lignende protein, identifiseres ved spaltning av plasmidene med Sacl. Det dannede plasmid betegnes pGPFG-IE-PA, hvori CMV I.E.-promotoren er beliggende ved 5'-enden av cDNA og BGH-polyadenyleringssignalet ved 3'-enden. Plasmidet opprettholdes i E. coli inntil transfeksjon i CHO-celler.
C. Transfeksjon og dyrkning av CHO-celler.
Plasmid pGPFG-IE-PA transfekteres til kinesisk hamster-ovarieceller (CHO) som mangler dishydrofolatreduktase (dhfr), ved anvendelse av kalsiumfosfatmetoden for transfeksjon av DNA til celler, som er beskrevet i detalj av Graham, et al., Introduction of Macromolecules into Viable Mammalian Cells, Alan R. Liss Inc., N.Y., 1980, s. 3-25. Den anvendte celle-linje er den mutante DXB-11,opprinnelig tilgjengelig fra L. Chasin, Columbia University og fullstendig beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:4216-4220 (1980). De ovennevnte fremgangsmåter for transfeksjon beror på det faktum at celler som inkorporer de transfekterte plasmider ikke lenger mangler dhfr og vil vokse i Dulbecco's modifiserte Eagle's medium pluss prolin.
Dersom det kimære glykoprotein ikke inneholder et ankerområde,klares supernatanten fra CHO-celler som uttrykker utsondret kimært FG-protein ved hjelp av sentrifugering med lav hastighet. Supernatanten anbringes på en conconavalin A (eller lentil leetin) kolonne. Glykoproteinet elueres etter omfattende vask med en lineær gradient av o^-D-methylglykosid (0-0,5 M) i den ovennevnte buffer. Det eluerte glykoprotein dialyseres mot PBS inneholdende 0,1 % Triton X-100 og anbringes på en affinitetskolonne. Affinitetskolonnen består av enten polyklonale eller monoklonale antistoffer mot HRSV bundet til Sepharose 4B-perler (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) ved hjelp av kjente fremgangsmåter. Kolonnen vaskes i dialysebuffer og HRSV FG-glykoproteinet elueres med PBS inneholdende 0,IM glycin (pH 2,5) og 0,1 % Triton X-100. Glykoproteinet dialyseres mot fysiologisk saltoppløsning og undersøkes for renhet ved elektroforese på en SDS-PAGE-gel.
Dersom det kimære glykoprotein inneholder et ankerområde vaskes CHO-cellene,som uttrykker glykoproteinene,i fosfatbuffret saltløsning (PBS) og lyseres deretter i PBS inneholdende 1,0 % Triton X-100 og 1,0 % natrium deoksycholat. Etter pelletisering av kjernene anbringes det cytoplasmatiske ekstrakt på en conconavalin A-kolonne og renses som beskrevet ovenfor for utsondrede glykoproteiner.
Eksempel 8 Ekspresjon av HRSV GPFG ved anvendelse av bovint papillomavirus (BPV)
A. Oppbygningen av en kloningsvektor inneholdende en ikke-transkriberbar ekspresjonskassett egnet for replikasjon i E. coli.
Oppbyggingene av pTFW8 og pTFW9 gir et egnet start-materiale for ekspresjon av HRSV-proteiner ved anvendelse av BPV. Transkripsjonsterminatoren i det deponerte plasmid forhindrer ekspresjonen av HRSV-proteiner og må fjernes ved en ettrinns spaltning og ligering.
1. Oppbygging av PTFW8
Plasmid pdBPV-MMTneo (342-12) er beskrevet i Mol. and Cell Biol., Vol 3 (No. 11):2110-2115 (1983) og erholdt fra Peter Howley, the National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, USA. Plasmid pdBPV-MMT neo (342-12) består av 3 deler: Ett fullstendig BPV-l-genom (100 %), åpnet ved det entydige BamHI-sete; pML2 (et "poison-minus" derivat av pBR322); og en transkripsjonskassett sammensatt av muse-metallothionein-I-genpromotoren, neomycinfosfotransferase II-genet av Tn5', og ape-virus 40 "early-region" transkripsjonsprosessignalene. Plasmid pdBPV-MMT neo (34 2-12) oppsluttes først med BamHI for å fjerne BPV-sekvensene, som ble isolert og lagret for senere innførelse. Det gjenblivende fragment religeres ved anvendelse av T4-ligase under dannelse av pMMpro.nptll (6,7 kb). Fjerning av BPV-genomet letter senere genetiske manipulasjoner ved å danne entydige restriksjonseter i det gjenværende plasmid. Etter at rekombinasjonene er fullstendige,gjeninn-settes BPV-genomet.
Plasmid pMMpro.nptll oppsluttes med Bglll, et syntetisk DNA-fragment 14 inneholdende entydige restriksjonseter innføyes og ligeres ved anvendelse av T4-ligase,under dannelse av pTFW8 (6,7 kb). Plasmid pTFW8 er identisk med pMMpro.nptll med unntak av innføyelsen av entydige restriksjonseter mellom musemetallothionein I-genpromotoren og det neomycinresistente gen.
2. Oppbygging av pTWF9
Plasmid pTWF9 inneholder transkripsjonsterminatoren
Tj fra fag-lambda innføyd mellom metallothionein I-genpromotoren og det neomycinresistente gen. Transkripsjonsterminatoren kan erholdes fra Donald Courd, the National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, USA. Transkripsjonsterminatoren leveres i pKG1800sib3 som er det samme som pUS6 som beskrevet i Gene, 28:343-350 (1984), med unntak av at tJ inneholder sib3-mutasjonen som beskrevet i Guarneros et al., PNAS, 79:238-242 (1982). Under den normale infeksjonsprosess av fag-lambda, virker t^-terminatoren ved å inhibere bakteriofag int gen-ekspresjon fra P , og ved terminering av int gen-transkripsjonen som stammer fra P^. Terminatoren spaltes fra pKG1800sib3, ved anvendelse av Alul og Pvul, som fragment 15 (1,2 kb), som gelisoleres og deretter plasseres Xhol-linkere på hver ende av fragmentet. Linkerne er tilgjengelige fra New England Biolabs, MA, USA. Terminatorfragmentet bundet
ved hjelp av Xhol-komplementære ender innføyes deretter i pTWF8 som tidligere er oppsluttet med Xhol. Fragmentene ligeres deretter ved anvendelse av T4-DNA-ligase under dannelse av pTWF9 (7,9 kb). Plasmid pTWF9 ble deponert i overenstemmelse med Budapestavtalen. Plasmid pTFW9 er opprettholdt i en E. coli-vert og er deponert hos the Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA, november 1986,og
gitt aksesjonsnummer NRRL B-18141.
B. Oppbygging av pTFW/GPFG
Genene oppbygd i eksemplene 2-6 kan anvendes for ekspresjon av et kimært glykoprotein ved anvendelse av BPV. Plasmidet pGPFG-1 vil anvendes i dette eksempel. De andre kimære gener behandles som beskrevet for pGPFG-1 hvis ikke annet er angitt. For å oppbygge pTFW/GPFG, oppsluttes pGPFGl med BamHI og Hindlll (pGPFG-3 oppsluttes med BamHI og Hpall). Dets ender gjøres butte, med Klenow-enzym, og syntetiske Bglll-linkere (New England Biolabs) ligeres til endene av klonet. DNA oppsluttes med Bglll og betegnes fragment 16 (2,2 kb). Fragment 16 inneholdende gpFG-genet (2,2 Kb) isoleres deretter fra en gel. Det rensede fragment ligeres til pTFW9
som er oppsluttet med Bglll under dannelse av pTFW/GPFG (10,1 kb). C. Omdannelse av pTFW/GPFG til en eukaryot ekspresjonsvektor
Plasmid pTFW/GPFG omdannes til en eukaryot ekspresjonsvektor ved å gjeninnføye det 100 % fullstendige BPV-l-genom, fraspaltet med BamHI i trinn a i eksempel 8A. Plasmid pTFW/ GPFG spaltes med BamHI, og det BPV-1 intakte genom, et 7,9 kb fragment, innføyes under dannelse av pTFW/GPFG/BPV<*> (18,0 kb) som replikeres E. coli inntil produksjonen av glykoprotein FG ved hjelp av eukaryotiske celler er ønsket.
D. Ekspresjon av gpFG i muse-C127-celler
Før transfeksjonen i muse-C127-celler, oppsluttes pTFW/GPFG/BPV<*> med Xhol for å fjerne Tj-terminatoren, etterfulgt av religering med T4-DNA-ligase. Det dannede plasmid pTFW/GPFG/BPV (16,9 kb) vil nå styre ekspresjonen av høye nivåer av gpFG som utskilles i dyrkningsmediet. C127-cellene er tilgjengelig fra the American Type Culture Collection og dyrkes i Dulbecco's modifiserte minimale essensielle medium inneholdende 10 % kalvefosterserum. Nivåene av gpFG-proteiner i mediet til Cl27-cellene bestemmes ved hjelp av Western blot -eksperimenter med anti-RSV-antistoff og 125I-merket protein A.
HRSV gpFG renses fra dyrkningsmediet eller cellene, som beskrevet i eksempel 7.
Eksempel 9 Ekspresjon av HRSV GPFG ved anvendelse av baculovirus virus
Det følgende eksempel angår ekspresjonen av glykoprotein FG i insektcellekulturer. Alle fremgangsmåter er beskrevet i detalj i Summers, M.D. og Smith, G.E., A Manual for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures,utgitt av the College of Agriculture, Texas Agricultural Experiment Station, Texas Agricultural Extension Service, College Station, Texas, 1986. Startplasmidet pAc373 (7,1 kb) er en gene-rell baculovirus-ekspresjonsvektor med et entydig BamHI-sete umiddelbart nedstrøms fra polyhedron-promotoren for Auto-grapha californica nukleær polyhedrosis virus (AcNPV). Poly-hedronproteinet er et matrixprotein som ikke er essensielt for virusinfeksjon og replikasjon in vitro. Plasmidet er tilgjengelig fra Professor Max Summers, the Department of Ento-mology, Texas A & M University, College Station, Texas 77843 og er utførlig beskrevet i Molecular and Cell. Biology, 3(12):2156-2165 (1983).
A. Oppbygging av pAcGPFG
Genene oppbygd i eksemplene 2-6 kan anvendes for ekspresjon av et kimært glykoprotein ved anvendelse av baculovirus. Plasmidet pGPFG-1 vil anvendes i dette eksempel. De andre kimære gener behandles som beskrevet for pGPFG-1 hvis ikke annet er angitt. Plasmid pGPFGl oppsluttes med Hindlll (pGPFG-3 oppsluttes med Hpall) og endene gjøres butte med Klenowenzym. Syntetiske BamHI-linkere (New England Biolabs) ligeres til enden av DNA. DNA oppsluttes med BamHI og fragment 17 (2,2 kb), inneholdende gpFG-genet,isoleres fra en gel. Det rensede fragment ligeres til pAc373 som er oppsluttet med BamHI.
B. Transfeksjon og dyrkning av S. Frugiperda
gpFG cDNA-innføyelsen av pAcGPFG rekombineres med nativt AcNPV DNA ved kotransfeksjon i S. fugiperda. S. Frugiperda (SF9; ATCC CRL 1711) dyrkes i Grace Medium (Gibco Lab. Livonia, MI 48150), 10 % kalvefosterserum, og suppleres med Difco Lactalbumin-hydrolysat og gjærløsning. Cellene c.o-transfekteres med AcNPV DNA og pAcGPFG ved henholdsvis 1 jiAg/ ml og 2 /Hg/ml. De dannede viruspartikler erholdes ved å opp-samle mediet og fjerne cellulært materiale ved sentrifugering ved lav hastighet. Det virus-inneholdende medium anvendes deretter for å infisere S. frugiperda. Etterfølgende infeksjon av S. frugiperda ved anvendelse av disse viruspartikler, som innbefatter både nativt virus-DNA og DNA rekombinert med cDNA som koder for glykoprotein FG, vil resultere i noen celler som uttrykker HRSV-proteinet i stedet for polyhedron-proteinet. Rensing av rekombinant virus oppnås ved en serie begrenset fortynning-utspredninger i 96-brønners vevskultur-plater inneholdende S. frugiperdaceller. Brønner inneholdende
rekombinant virus påvises ved punkt-blot -hybridisering ved
32
anvendelse av pGPFGl,som er merket med p-dCTP ved nick-translasjon,som en probe. Det rekombinante virus påvises når det er tilstrekkelig rent ved hjelp av dets entydige oklu-sjon-negative plakk-morfologi. HRSV-protein, syntetisert i rekombinant baculovirus-infiserte celler, påvises ved hjelp av Western blot .-eksperimenter med anti-RSV-antistoff og 125
I<->merke:t protein A (Amersham Corp.).
HRSV-proteinet renses fra dyrkningsmediet eller fra celler som beskrevet i eksempel 7.
Eksempel 10 Oppbygging av pAcGPFG inneholdende en naturlig polyhedron-ledersekvens
Plasmid pAc373 , beskrevet i eksempel 8, inneholder en BamHI-linkersekvens ved -8-posisjonen av polyhedron-lederen for å tillate en enkel innføyelse av fremmede gener. Imidlertid kan denne oppspalting av polyhedron-ledersekvensen føre til lavere ekspresjonsnivåer av det innføyede gen enn det som vil være mulig med den naturlige polyhedron-leder. En fremgangsmåte for kobling av den naturlige polyhedron-ledersekvens til startkodonet av HRSV FG-genet er beskrevet nedenfor. Genene oppbygd i eksemplene 2-6 kan anvendes i dette eksempel for ekspresjon av et kimært glykoprotein. Plasmidet pGPFG-1 vil anvendes i dette eksempel. De andre kimære gener er be-handlet som beskrevet for pGPFG-1.
A. Fremstilling av pAcGPFG-2
Plasmid pAcGPFG (eksempel 8) oppsluttes med EcoRV og Pstl. EcoRV spalter polyhedron-ledersekvensen ved posisjon -93, mens Pstl spalter HRSV FG-kodingssekvensen ved posi-sjonene +50, +636, og +1701 i FG-kodingssekvensen, og i pUC12-polylinkerområdet ved siden av 3'-enden av FG-genet. DNA underkastet elektroforese i en 1 % agarosegel og det store fragment (9,8 kb), primært inneholdende plasmid pAc373,renses fra gelen.
Et oligonukleotid bestående av polyhedron-ledersekvensen fra posisjoner -93 (EcoRV-spaltingssete) til -1, bundet til FG-gensekvensen fra posisjoner 0 (nukleotid A i startkodonet) til +50 (Pstl-spaltningssete),syntetiseres og opp-bygges. På grunn av lengden av denne sekvens syntetiseres
DNA i form av flere forskjellige oligonukleotider som deretter ligeres sammen. Det intakte oligonukleotid ligeres til 9,8 kb-fragmentet fremstilt ovenfor. DNA transformeres i E. coli HB101. Kloner inneholdende det nye plasmid (pAcGPFG-2) isoleres og det nylige syntetiserte område bekreftes som korrekt ved Maxam-Gilbert-sekvensering.
B. Innføyelse av FG-genet i pAcGPFG-2
Plasmid pGPFG-1 (eksempel 2) oppsluttes delvis med Pstl. Pstl spalter ved posisjoner +50, +636, og +1701 i FG-kodingssekvensen, og i pUCl2-polylinkerområdet ved siden av 3'-enden av FG-genet. DNA underkastes elektroforese i en 1,2 % agarosegel. 2,2 kb-fragmentet tilsvarende det nesten intakte FG-gen (FG-posisjonen +50 til Pstl-sete i pUC12-polylinker) renses fra gelen. 2,2 kb-fragmentet ligeres deretter i plasmid pAcGPFG-2 som er oppsluttet med Pstl. DNA transformeres i E. coli HB101. Kloner isoleres og kontrol-leres for den korrekte orientering av FG-genet ved opp-slutting med EcoRV og Sspl som vil danne et 2,3 kb-fragment. Den ukorrekte orientering vil danne et 130 bp fragment. Det ovenfor angitte gen innføyes i baculovirus-genomet for ekspresjon av det HRSV-kimære FG-glykoprotein som beskrevet i eksempel 8.
Eksempel 11 Fremstilling av en vaksine
Imunogenet kan utformes i form av en vaksinedose ved hjelp av velkjente fremgangsmåter. Vaksinen kan administreres intramuskulært, subcutant eller intranasalt. For parenteral administrering, slik som intramuskulær injeksjon, kan imunogenet kombineres med en egnet bærer, f.eks. kan den administreres i vann, fysiologisk saltvann eller buffrede hjelpemidler, med eller uten forskjellige tilsetningsmidler eller imunmodulerende midler som aluminiumhydroksyd, aluminiumfos-fat, aluminium-kaliumsulfat (alun), berylliumsulfat, silicium-oksyd, kaolin, karbon, vann-i-olje emulsjoner, olje-i-vann emulsjoner, muramyl-dipeptid, bakteriell endotoksin, lipid X, Corynebacterium parvum (Propionobacterium acnes), Boretella pertussis, polyribonukleotider, natriumalginat, lanolin, lysolecithin, vitamin A, saponin, liposomer, levamisol, DEAE-dextran, blokkerte kopolymerer eller andre syntetiske hjelpemidler. Slike hjelpemidler er kommersielt tilgjengelig fra forskjellige kilder, f.eks., Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ).
Mengdeforholdet av immunogen og hjelpemiddel kan vari-eres over et bredt område så lenge som begge er tilstede i effektive mengder. F.eks. kan aluminiumhydroksyd være tilstede i en mengde av tilnærmet 0,5 % av vaksineblandingen (A^O-j-basis). På en per dose-basis kan konsentrasjonen av imunogenet variere fra tilnærmet 0,015 jjg til 1,5 mg pr. kilo-gram pr. pasient kroppsvekt. Et foretrukket doseringsområde er fra tilnærmet 1,5 ^Ug/kg til 0,15 mg/kg pasient kroppsvekt. En egnet dosestørrelse for mennesker er tilnærmet 0,1 - 1 ml, fortrinnsvis tilnærmet 0,1 ml. En dose for intramuskulær injeksjon vil følgelig f.eks. omfatte 0,1 ml inneholdende imuno-gen i blanding med 0,5 % aluminiumhydroksyd.
Vaksinen kan administreres til gravide kvinner eller til kjønnsmodne kvinner for å stimulere maternale antistoffer. Kvinnen kan revaksineres når nødvendig. Barn kan vaksineres ved 2 til 3 måneders alder etter at de maternale antistoffer er oppbrukt, og revaksineres når nødvendig, fortrinnsvis ved 6 til 10 måneders alder etter modning av imunsystemet. Barn som fødes av uvaksinerte mødre kan vaksineres ved 2 til 3 måneders alder. Vaksinen kan også være anvendelig for andre mottakelige populasjoner som eldre eller svakelige pasienter.
Vaksinen kan også kombineres med andre vaksiner mot andre sykdommer for å produsere flerverdige vaksiner. Vaksinen kan også kombineres med andre medikamenter som antibiotika.
PLANSJE 1
OPPBYGGING AV pGPF2
(a) Plasmid pF5-25 spaltes med Pstl og fragment 1 (1,9 kb) gelisoleres. (b) Plasmid pUC12 (2,7 kb) spaltes med Pstl under dannelse av fragment 2 som gelisoleres. (c) Fragmentene 1 og 2 ligeres under dannelse av pGPF2 (4,6 kb) som transformeres i E. coli.
AmpR = Ampicillin resistans T = Guanosin/cytosin-hale F = Glykoprotein F
PLANSJE 2
OPPBYGGING AV pGPF3 OG pGPF4
(a) Plasmid pGPF2 spaltes med Xbal, behandles med bakteriell alkalisk fosfatase, spaltes på nytt med Sali og behandles med Klenow-enzym under dannelse av fragment 3. (b) Fragment 3 oppsluttes nedstrøms fra Sall-setet ved anvendelse av lambda-exonuklease,og den gjenblivende 3'-hale hybridiseres til det syntetiske oligonukleotid som er komplementært med 5'-delen av ledersekvensen medden følgende sekvens av GpF cDNA. (c) Den enkel-strengede del av cDNA 3' nedstrøms fra de syntetiske oligonukleotider utfylles ved anvendelse av Klenow-enzym og endene ligeres ved anvendelse av T4-ligase under dannelse av pGPF3 (4,6 kb). (d) Plasmid pGPF3 spaltes med Hindlll og behandles med Bal 31 for å oppslutte G-C-nukleotidhalen ved 3'-enden av gpF-CDNA. gpF cDNA spaltes med BamHI (1,7 kb) isolert fra en gel og religeres til en BamHI/HincII-oppslutning av PUC12 under dannelse av pGPF4 (4,4 kb). PLANSJE 2 (forts. ) Plasmid pGPF-4
AmpR = Ampicillin resistans
T = Guanosin/cytosin-hale
F = Glykoprotein F
PLANSJE. 3
OPPBYGGING AV ET KIMÆRT FG-GLYKOPROTEINGEN
Plasmid G-16
(a) Plasmid G-16 oppsluttes med Ddel og FoKI, og endene gjøres butte med Klenow-enzym. DNA underkastes elektroforese i en 1,5 % agarosegel og fragment 4 (550 bp) renses fra agarosen.
Fragment 4
(b) Plasmid pGPF-4 (skjema 3) oppsluttes med Nsil. Endene gjøres butte med T4-DNA-polymerase og defosforyleres med bakteriell alkalisk fosfatase. Fragment 4 ligeres deretter til plasmidet under dannelse av pGPFG-1 (5,0 kb).
Plasmid GPFG-1
AmpR = Ampicilling resistans
TcR = Tetracyclin resistans
T = Gyanosin/Cytosin-hale
G = DNA sekvenser for G glykoprotein
F = DNA sekvenser for F glykoprotein
Term = Translasjonsterminasjonssignal
PLANSJE 4
ANVENDELSE AV LINKERE FOR Å JUSTERE AVLESNINGSRAMMEN FOR FG
Plasmid G-16
Sali Linker (a) Plasmid G-16 oppsluttes med HphI og endene gjøres butte med T4-DNA-polymerase• Sall-linkeren ligeres til endene av cDNA. DNA oppsluttes med Sali og fragment 5 (410 bp) gelrenses. Fragment 5 (b) Plasmid GPF4 (skjema 2) oppsluttes med Nsil og endene gjøres butte med T4-DNA-polymerase. Sall-linkeren ligeres til endene av cDNA. DNA oppsluttes med Sali og plasmidet (4,4 kb) gelrenses. Fragment 5 ligeres deretter til det gelrensede GPF4 under dannelse av pGPFG-2.
Plasmid GPFG-2
AmpR = Ampicillin resistans
TcR = Tetracyclin resistans
T = Guanidin/Cytosin-hale
F = DNA sekvenser for F glykoprotein
G = DNA sekvenser for G glykoprotein
L = Sali linker
Term = Translasjonsterminasjonssignal
PLANSJE 5
ANVENDELSE AV OLIGONUKELOTIDER FOR Å
DANNE FG-GENER AV VARIERENDE MENGDER
(a) Oligonukleotid A består av oligonukleotid 1 (36 bp) eller oligonukleotider 1 og 2 ligert sammen (81 bp). Oligonukleotid B består av oligonukleotid 3 (80 bp) eller oligonukleotider 3 og 4 ligert sammen (164 bp). Oligonukleotid C består av oligonukleotid 5 (60 bp), eller oligonukleotid 5 og 6 ligert sammen (120 bp) eller oligonukelotider 5, 6, og 7 ligert sammen (189 bp), eller oligonukleotider 5, 6, 7, og 8 ligert sammen (258 bp). Oligonukleotider A, B, og C gelrenses. (b) Plasmid GPF-4 oppsluttes med Nsil og oligonukleotid A ligeres til Nsil-setet. DNA oppsluttes med Hindlll og plasmidet religeres under dannelse av pGPF-5.
Plasmid GPF-5
(c) Plasmid G-16 oppsluttes med Hinfl og XhoII, og fragment 6 (277 bp) gelfiltreres.
PLANSJE 5 ( forts . )
(d) Oligonukleotider B og C ligeres til fragment 6. DNA oppsluttes med Hindlll og fragment 7 gelrenses (lengde av fragment 7 varierer fra 417 bp til 700 bp avhengig av de inneholdte oligonukleotider innen oligonukleotider B og C). (e) Plasmid GPF-5 oppsluttes med Hindlll og defosforyleres med bakteriell alkalisk fosfatase. Fragment 7 ligeres deretter til Hindlll-setet av pGPF-5 under dannelse av pGPFG-3.
AmpR = Ampillicin resistans
F = DNA sekvenser for F glykoprotein
G = DNA sekvenser for G glykoprotein
A = Oligonukleotid A
B = Oligonukleotid B
C = Oligonukleotid C
Term = Translasjonsterminasjonssignal
PLANSJE 6
OPPBYGGING AV ET FG-GEN INNEHOLDENDE ET ANKEROMRÅDE
Plasmid GPFG-4
(a) Plasmid G-16 oppsluttes med Ddel og FoKI. Oligonukleotider 9 og 10 ligeres til endene DNA. DNA oppsluttes med Nsil og fragment 8 (550 bp) gelrenses. (b) Plasmid GPF-4 oppsluttes med Nsil og fragment 8 ligeres til Nsil-setet under dannelse av pGPFG-4.
Plasmid G-16
AmpR = Ampicillin resistans
TcR = Tetracyclin resistans
T = Guanosin/Cytosin-hale
F = DNA sekvenser for F glykoprotein
G = DNA sekvenser for G glykoprotein
9 = Oligonukleotid 9
10 = Oligonukleotid 10
A = DNA-sekvenser kodende for ankerområdet av F-glykoprotein
Term = Translasjonsterminasjonssignal
PLANSJE 7
FREMSTILLING AV G-GEN FOR OPPBYGGING AV GF-KIMÆRT GEN
Plasmid G-16
(a) Plasmid G-16 oppsluttes Nlalll og FoKI. Oligonukleotider 11 og 12 ligeres til endene av DNA og fragment 9 (850 bp) gelrenses. (b) Plasmid pUCl2 oppsluttes med BamHI og Sali og defosforyleres med bakteriell alkalisk fosfatase. Fragment 9 ligeres til plasmidet under dannelse av pGPG-1.
Plasmid GPG-1
AmpR = Ampillicin resistans
TcR = Tetracyclin resistans
T = Guanosin/Cytosin-hale
G = DNA sekvenser for G glykoprotein
11 = Oligonukleotid 11
12 = Oligonukleotid 12
PLANSJE 8
INNFØYELSE AV G-cDNA I pGPG-1
Plasmid F5-25
(a) Plasmid F5-25 oppsluttes med XhoII og Nsil. Oligonukleotider 13 og 14 ligeres til endene av DNA. DNA oppsluttes med Sali og fragment 10 (960 bp) gelrenses. (b) PGPF-1 oppsluttes med Sali og defosforyleres med bakteriell alkalisk fosfatase. Fragment 10 ligeres deretter til plasmidet under dannelse av pGPGF-1.
Plasmid GPGF-1
AmpR = Ampicillin resistans
TcR = Tetracyclin resistans
T = Guanosin/cytosin-hale
G = DNA sekvenser som koder for G glykoprotein F = DNA sekvenser som koder for F glykoprotein
!
PLANSJE 8 ( forts. )
I
Ili = Oligonukleotid 11
12 = Oligonukleotid 12
i
13 = Oligonukleotid 13
14 = Oligonukleotid 14
i Term = Translasjonsterminasjonssignal
Claims (8)
- !• Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot humant respiratorisk syncytielt virus,karakterisert ved at det til en farmakologisk egnet bærer tilsettes minst ett immunogent fragment fra både humant respiratorisk syncytielt virusglykoprotein F og G som sammenføyes ved ligering av HRSV gpG-fragmentet fra plasmid G-16 som avbildet i skjema 3 med plasmid pGPF-4 som avbildet i skjema 2(d), og transformeres i E. coli for å danne et polypeptid som, med start ved den N-terminale ende, er signalsekvensen fra glykoprotein-F, et immunogent fragment av glykoprotein F og et immunogent fragment av glykoprotein G, i en mengde egnet til å beskytte mennesker mot humant respiratorisk syncytielt virus.
- 2. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot humant respiratorisk syncytielt virus ifølge krav 1, karakterisert ved at det det anvendes et immunologisk fragment fra humant respiratorisk syncytielt virus som omfatter aminosyresekvensen:
- 3. Plasmid,karakterisert ved at det inneholder en DNA-sekvens som er i stand til å uttrykke et polypeptid, hvor polypeptidet, med start ved den N-terminale ende, omfatter en signalsekvens og minst ett immunogent fragment fra både humant respiratorisk syncytielt virusglykoprotein F og G, som kan uttrykkes i en egnet vert valgt fra bakterieceller, gjærceller, pattedyrceller og insektceller.
- 4. Plasmid ifølge krav 3,karakterisert ved at den egnede vert er valgt fra E. coli-celler, kinesisk hamster-ovarieceller, muse-C127-celler og S. Frugipersa-celler.
- 5. Plasmid ifølge krav 3,karakterisert ved at plasmidet er under kontroll av en cytomegalovirus-promotor.
- 6. Plasmid ifølge krav 3,karakterisert ved at replikasjonen av plasmidet, mens det befinner seg i en egnet eukaryotisk vert, er under kontroll av bovint papilloma virus-DNA-sekvenser.
- 7. Plasmid ifølge krav 3,karakterisert ved at DNA-sekvensen er inneholdt i et rekombinant virus av baculovirus-familien.
- 8. Plasmid ifølge krav 7,karakterisert ved at viruset er Autogrrapha californica nukleær polyhedral virus.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13738787A | 1987-12-23 | 1987-12-23 | |
| PCT/US1988/003784 WO1989005823A1 (en) | 1987-12-23 | 1988-10-31 | Chimeric glycoproteins containing immunogenic segments of the glycoproteins of human respiratory syncytial virus |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO902802L NO902802L (no) | 1990-06-22 |
| NO902802D0 NO902802D0 (no) | 1990-06-22 |
| NO300254B1 true NO300254B1 (no) | 1997-05-05 |
Family
ID=22477194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO902802A NO300254B1 (no) | 1987-12-23 | 1990-06-22 | Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot humant respiratorisk syncytielt virus |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5194595A (no) |
| EP (1) | EP0396563B1 (no) |
| JP (1) | JP2716503B2 (no) |
| KR (1) | KR0137963B1 (no) |
| AT (1) | ATE85622T1 (no) |
| AU (1) | AU617739B2 (no) |
| CA (1) | CA1320163C (no) |
| DE (1) | DE3878468T2 (no) |
| DK (1) | DK173175B1 (no) |
| FI (1) | FI102382B1 (no) |
| HK (1) | HK166295A (no) |
| MX (1) | MX9203458A (no) |
| NO (1) | NO300254B1 (no) |
| WO (1) | WO1989005823A1 (no) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8914968D0 (en) * | 1989-06-29 | 1989-08-23 | Connaught Lab | Production of virus and purification of viral envelope proteins for vaccine use |
| US6004563A (en) * | 1990-11-07 | 1999-12-21 | American Home Products Corporation | Feline vaccine compositions and method for preventing chlamydia infections or diseases using the same |
| US5824307A (en) | 1991-12-23 | 1998-10-20 | Medimmune, Inc. | Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus |
| GB9200117D0 (en) * | 1992-01-06 | 1992-02-26 | Connaught Lab | Production of recombinant chimeric proteins for vaccine use |
| GB9207479D0 (en) * | 1992-04-06 | 1992-05-20 | Scotgen Ltd | Novel antibodies for treatment and prevention of respiratory syncytial virus infection in animals and man |
| TW275632B (no) * | 1992-04-21 | 1996-05-11 | American Cyanamid Co | |
| KR960700271A (ko) * | 1993-01-08 | 1996-01-19 | 로렌스 티. 웰츠 | 인간 호흡계 합포체 바이러스 fg 당단백질의 정제 및 리폴딩 방법(process for the purification and refolding of human respiratory syncytial virus fg glycoprotein) |
| JP3734263B2 (ja) * | 1993-05-25 | 2006-01-11 | ワイス・ホールディングズ・コーポレイション | 呼吸器シンシチウムウイルスに対するワクチンのためのアジュバント |
| US7300918B2 (en) | 1994-01-14 | 2007-11-27 | Matthias Rath | Method of producing vaccines from protein signal oligopeptides |
| DE69534077T2 (de) * | 1994-01-14 | 2005-08-11 | Rath, Matthias, Dr.med. | Verwendung von methoden zur identifizierung von hydrophilen signal-oligopeptiden |
| FR2718452B1 (fr) * | 1994-04-06 | 1996-06-28 | Pf Medicament | Elément d'immunogène, agent immunogène, composition pharmaceutique et procédé de préparation. |
| US5716821A (en) * | 1994-09-30 | 1998-02-10 | Uab Research Foundation | Prevention and treatment of respiratory tract disease |
| US5789229A (en) * | 1994-09-30 | 1998-08-04 | Uab Research Foundation | Stranded RNA virus particles |
| FR2726472B1 (fr) * | 1994-11-07 | 1997-01-31 | Pf Medicament | Proteine porteuse a effet adjuvant, complexe immunogene la contenant, leur procede de preparation, sequence nucleotidique et vaccin |
| DE4442114A1 (de) * | 1994-11-25 | 1996-05-30 | Buna Sow Leuna Olefinverb Gmbh | Nitrit-, phosphat- und aminfreies Kühl- und Wärmeübertragungsmittel |
| US5811524A (en) * | 1995-06-07 | 1998-09-22 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof |
| US6015664A (en) * | 1995-11-03 | 2000-01-18 | Mcw Research Foundation | Multiplex PCR assay using unequal primer concentrations to detect HPIV 1,2,3 and RSV A,B and influenza virus A, B |
| WO1998018819A1 (en) * | 1996-10-29 | 1998-05-07 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Purification of respiratory syncytial virus antigens |
| US20070067859A1 (en) * | 1997-07-14 | 2007-03-22 | Michel Georges | Double-muscling in mammals |
| DK2045322T3 (en) * | 1997-07-14 | 2015-10-05 | Université de Liège | DOUBLE MUSCULAR FOR MAMMALS |
| US6103466A (en) * | 1997-07-14 | 2000-08-15 | University Of Liege | Double-muscling in mammals |
| US6699478B1 (en) * | 1997-09-19 | 2004-03-02 | Wyeth Holdings Corporation | Enhanced immune response to attachment (G) protein of Respiratory Syncytial Virus |
| GB9909077D0 (en) | 1999-04-20 | 1999-06-16 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compositions |
| CA2398466A1 (en) * | 2000-01-27 | 2001-08-02 | Medimmune, Inc. | Ultra high affinity neutralizing antibodies |
| EP2341074A1 (en) * | 2000-03-01 | 2011-07-06 | MedImmune, LLC | Antibodies binding to the f protein of a respiratory syncytial virus (rsv) |
| US7179900B2 (en) * | 2000-11-28 | 2007-02-20 | Medimmune, Inc. | Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment |
| US6855493B2 (en) | 2000-11-28 | 2005-02-15 | Medimmune, Inc. | Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment |
| US7132100B2 (en) | 2002-06-14 | 2006-11-07 | Medimmune, Inc. | Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations |
| DE602005018473D1 (de) * | 2004-05-24 | 2010-02-04 | Polymun Scient Immunbio Forsch | Superbeladene liposome für die arzneimittelabgabe |
| JP2008518936A (ja) * | 2004-10-29 | 2008-06-05 | メディミューン，インコーポレーテッド | Ｒｓｖ感染症および関連状態を予防および治療する方法 |
| EP1997830A1 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-03 | AIMM Therapeutics B.V. | RSV specific binding molecules and means for producing them |
| EP3508505A1 (en) | 2007-12-24 | 2019-07-10 | ID Biomedical Corporation of Quebec | Recombinant rsv antigens |
| EP2324062A4 (en) * | 2008-07-18 | 2012-06-06 | Id Biomedical Corp Quebec | CHIMERIC RSV POLYPEPTIDE ANTIGEN |
| PE20121541A1 (es) | 2009-06-24 | 2012-12-21 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Antigenos de virus de sincicio respiratorio recombinantes |
| SG178026A1 (en) | 2009-07-15 | 2012-03-29 | Novartis Ag | Rsv f protein compositions and methods for making same |
| US8568726B2 (en) | 2009-10-06 | 2013-10-29 | Medimmune Limited | RSV specific binding molecule |
| CA2879915C (en) | 2012-08-01 | 2022-07-05 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4855224A (en) * | 1984-03-09 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned diagnostic product and method of use |
| DE3689622T2 (de) * | 1986-01-14 | 1994-06-16 | Univ North Carolina | Impfstoffe gegen menschliche respiratorische viren. |
| US5223254A (en) * | 1987-09-29 | 1993-06-29 | Praxis Biologics, Inc. | Respiratory syncytial virus: vaccines |
| US5001230A (en) * | 1988-02-18 | 1991-03-19 | Schering Corporation | T cell activation markers |
| SG106639A1 (en) * | 2000-10-10 | 2004-10-29 | Gen Electric | Apparatus and method for introducing small amounts of refractory elements into a vapor deposition coating |
-
1988
- 1988-10-31 DE DE8888909879T patent/DE3878468T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-31 EP EP88909879A patent/EP0396563B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-31 AU AU27850/89A patent/AU617739B2/en not_active Expired
- 1988-10-31 MX MX9203458A patent/MX9203458A/es unknown
- 1988-10-31 WO PCT/US1988/003784 patent/WO1989005823A1/en active IP Right Grant
- 1988-10-31 JP JP63509171A patent/JP2716503B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-31 AT AT88909879T patent/ATE85622T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-10-31 US US07/543,780 patent/US5194595A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-10-31 KR KR1019890701589A patent/KR0137963B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-11-07 CA CA000582378A patent/CA1320163C/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-06-21 FI FI903154A patent/FI102382B1/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-06-22 NO NO902802A patent/NO300254B1/no not_active IP Right Cessation
- 1990-06-22 DK DK199001532A patent/DK173175B1/da not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-11-20 US US07/979,505 patent/US5288630A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-26 HK HK166295A patent/HK166295A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2716503B2 (ja) | 1998-02-18 |
| DE3878468D1 (de) | 1993-03-25 |
| NO902802L (no) | 1990-06-22 |
| AU2785089A (en) | 1989-07-19 |
| HK166295A (en) | 1995-11-03 |
| EP0396563B1 (en) | 1993-02-10 |
| NO902802D0 (no) | 1990-06-22 |
| ATE85622T1 (de) | 1993-02-15 |
| FI102382B (fi) | 1998-11-30 |
| DK153290A (da) | 1990-08-16 |
| FI903154A0 (fi) | 1990-06-21 |
| US5194595A (en) | 1993-03-16 |
| DK173175B1 (da) | 2000-03-06 |
| CA1320163C (en) | 1993-07-13 |
| DK153290D0 (da) | 1990-06-22 |
| JPH03501723A (ja) | 1991-04-18 |
| KR900700508A (ko) | 1990-08-13 |
| AU617739B2 (en) | 1991-12-05 |
| KR0137963B1 (ko) | 1998-04-30 |
| EP0396563A1 (en) | 1990-11-14 |
| FI102382B1 (fi) | 1998-11-30 |
| MX9203458A (es) | 1992-09-01 |
| US5288630A (en) | 1994-02-22 |
| DE3878468T2 (de) | 1993-06-09 |
| WO1989005823A1 (en) | 1989-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO300254B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine mot humant respiratorisk syncytielt virus | |
| US5149650A (en) | Vaccines for human respiratory virus | |
| DK172635B1 (da) | Polypeptid og dets anvendelse i vaccine samt ekspressionssystem til dets eksprimering | |
| AU605476B2 (en) | Vaccines for human respiratory virus | |
| CA2019845A1 (en) | Compounds | |
| US8541003B2 (en) | Vectors expressing SARS immunogens, compositions containing such vectors or expression products thereof, methods and assays for making and using | |
| AU629381B2 (en) | Feline calicivirus capsid protein and nucleotide sequence | |
| AU776370B2 (en) | Recombinant RSV virus expression systems and vaccines | |
| JPH0622756A (ja) | 突然変異体のｒｓウイルス（ｒｓｖ）、それを含有するワクチンおよび使用方法 | |
| EP0538341B1 (en) | Ehv-4 glycoprotein vaccine | |
| JPH02431A (ja) | 感染のウシ鼻気管支炎ウイルスの突然変異類、それらを含有するワクチン、それらの調製法およびそれらの使用 | |
| EP0471457A2 (en) | Herpesvirus-based viral vector which expresses a foot & mouth disease virus epitope | |
| JP3026986B2 (ja) | ヒト・パラインフルエンザウイルス３型の免疫原性セグメント類を含有するキメラ糖蛋白類 | |
| DK175114B1 (da) | Rekombinant DNA-molekyle, værtscelle transformeret dermed og fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ved anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |