JPH0622756A - 突然変異体のｒｓウイルス（ｒｓｖ）、それを含有するワクチンおよび使用方法 - Google Patents

突然変異体のｒｓウイルス（ｒｓｖ）、それを含有するワクチンおよび使用方法

Info

Publication number
JPH0622756A
JPH0622756A JP5117812A JP11781293A JPH0622756A JP H0622756 A JPH0622756 A JP H0622756A JP 5117812 A JP5117812 A JP 5117812A JP 11781293 A JP11781293 A JP 11781293A JP H0622756 A JPH0622756 A JP H0622756A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rsv
virus
cold
mutant
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP5117812A
Other languages
English (en)
Inventor
Valerie Bruce Randolph
バレリー・ブルース・ランドルフ
Joan Coflan Crowley
ジヨアン・コフラン・クローレイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wyeth Holdings LLC
Original Assignee
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by American Cyanamid Co filed Critical American Cyanamid Co
Publication of JPH0622756A publication Critical patent/JPH0622756A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18561—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/18564—Methods of inactivation or attenuation by serial passage

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【構成】 低温適応した突然変異体のＲＳＶ、詳しくは
亜群ＡおよびＢの突然変異体のＲＳＶ、該突然変異体の
ＲＳＶをエンコードする核酸分子およびこれらの突然変
異体のＲＳＶの免疫原性ポリペプチド。 【効果】 ワクチンとしてことに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、１９９２年４月２１日提出の米
国特許出願第０７／８７１，４２０号の一部継続出願
（その開示をここに引用によって加える）である。
【０００２】この出願を通して、本発明が関係する技術
水準をより完全に記載するために種々の参考文献を括弧
内に示す。各引用について完全な引用文献の情報は実施
態様の直ぐ前に記載されている。これらの参考文献の開
示をここに引用によって本発明の開示に加える。
【０００３】ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、すなわち、パラ
ミクソウイルス族の１構成員は乳児および若い子供にお
いてウイルス性肺炎および気管支炎の主要な原因であ
り、そして米国において１年当たり推定して９５，００
０人の入院患者および４，５００人の死亡の原因となっ
ている（ＩＯＭリポート、１９８５；ＨａｌｌおよびＭ
ｃＢｒｉｄｅ、１９９１；ＭｃＩｎｔｏｓｈおよびＣｈ
ｎｏｃｋ、１９９０）。重大な疾患は６週〜６カ月の年
令の乳児およびある種の根源的な疾患（例えば、免疫不
全、先天的な心臓病および気管支肺の形成異常）をもつ
子供において最も流布している。ＲＳＶの２つの主要な
亜群はＡおよびＢ、ならびに各亜群内の抗原性変異型と
同定されてきている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８５；
Ｍｕｆｓｏｎら、１９８５）。各亜群の多数の変異型は
毎年秋の終わり、冬および春の月に発生する流行病で共
に循環することが発見された（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１
９９１）。ほとんどの子供は２歳までに感染する。ＲＳ
Ｖに対する完全な免疫性は発現されず、そして再感染は
寿命通じて起こる（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９７９；
Ｈａｌｌら、１９９１）。ほとんどの感染は症候性であ
り、そして一般に温和な上部の気道の疾患に限られる。
疾患のひどさの減少は２またはそれ以上の感染に関連し
そして、ある場合において、血清抗体の高いレベルに関
連し、ＲＳＶの疾患に対する保護的免疫性反復した感染
後に蓄積することを示唆される（Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ
ら、１９７６；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、１９７９；Ｇｌ
ｅｚｅｎら、１９８１；Ｇｌｅｚｅｎら、１９８１；Ｇ
ｌｅｚｅｎら、１９８６；Ｋａｓｅｌら、１９８７／８
８；Ｈａｌｌら、１９９１）。また、２つの主要なＲＳ
Ｖの亜群の１つで感染した子供は相同の亜群で再感染に
対して多少保護されることがあるという証拠が存在する
（Ｍｕｆｓｏｎら、１９８７）。これらの観察が示唆す
るように、ひどい疾患および死亡に対して保護するため
に十分な一時的免疫性を提供する、乳児および若い子供
のためのＲＳＶワクチン接種の養生法を開発することは
可能でありかつ価値がある。
【０００４】若い子供にワクチン接種する初期の試み
（１９６６）は、非経口的に投与されるホルマリン不活
性化ＲＳＶのワクチン接種を使用した。不都合なことに
は、いくつかのフィールドテストにおけるこのワクチン
の投与は、引き続くＲＳＶによる自然の感染後における
有意に一層悪くなった疾患の発現特別に関連することが
示された（Ｋａｐｉｋｉａｎら、１９６９；Ｋｉｍら、
１９６９；Ｆｕｌｇｉｎｉｔｉら、１９６９；Ｃｈｉｎ
ら、１９６９）。このワクチンがＲＳＶの疾患を増強す
る履中は明らかではない。このＲＳＶ抗原への暴露は、
自然の疾患の免疫病理学的増強作用に導いた異常なまた
は不均衡な免疫応答を引き出すことが示唆された（Ｋｉ
ｍら、１９７６；Ｐｒｉｎｃｅら、１９８６）。ホルマ
リン不活性化ワクチンを使用することが不成功に終わっ
た後、生の弱毒化ＲＳＶワクチンの開発が強調された。
低温適応（ｃｏｌｄ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）により開
発されたワクチンの候補は血清反応陽性の大人において
ビルレンスｇａ減少したが、血清反応陰性の乳児におい
て試験した１つのワクチンは弱毒化の程度が低いことが
わかった（Ｋｉｍら、１９７１；Ｆｏｒｓｙｔｈおよび
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、１９７３）。化学的突然変異誘発に
より誘導されたＲＳＶの温度感受性（ＴＳ）突然変異体
（Ｇｈａｒｐｕｒｅら、１９６９）は、齧歯類およびヒ
ト以外の霊長類のモデルにおいて弱毒化された（Ｗｒｉ
ｇｔら、１９７０；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、１９７
８）。最初に有望であるように思われた２つの突然変異
体は血清反応陰性の乳児において弱毒化が過度である
か、あるいは低度であり、そして遺伝学的安定性を欠如
することが発見された（Ｋｉｍら、１９７３；Ｈｏｄｅ
ｓら、１９７４；ＭｃＩｎｔｏｓｈら、１９７４；Ｗｒ
ｉｇｔら、１９７６；Ｗｒｉｇｔら、１９８２）。生ウ
イルスの非経口的投与を使用する他のワクチン接種のア
プローチは効能を欠如し、そしてこのラインに沿った努
力は中止された（Ｂｅｌｓｈｅら、１９８２）。顕著に
は、これらの生ＲＳＶワクチン、ホルマリン不活性化Ｒ
ＳＶワクチンのように、疾患の増強に決して関連しなか
った。
【０００５】現在のＲＳＶワクチンの開発の努力は生ウ
イルスおよびサブユニットのアプローチの両者について
続けられている。ホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンを
使用する前の実験のために、複製しないウイルスの抗原
から構成されたワクチンの試験は非常に注意を払って進
行された。ただ１つのサブユニットのワクチンである精
製されたＦタンパク質（ＰＦＰ、Ｌｅｄｅｒｌｅ−Ｐｒ
ａｘｉｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）は現在臨床的に試
験されている。こうして、血清反応陽性の子供における
研究は自然の疾患の増強のこれまで示して来ていない。
開発されている他のサブユニットのワクチンは、バキュ
ロウイルスが生産したキメラのＦＧタンパク質（Ｂｒｉ
ｄｅａｕら、１９８９［Ｕｐｊｏｈｎ］；Ｗａｔｈｅｒ
ｎら、１９９１［Ｕｐｊｏｈｎ］）およびＦおよびＧタ
ンパク質からのペプチド（Ｔｒｕｄｅｌら、１９９１
ａ、ｂ）を包含する。生の弱毒化されたＴＳウイルスの
ＴＳ突然変異体（ＭｃＫａｙら、１９８８；Ｗａｔｔ
ら、１９９０）および組み換えワクシニアおよびＲＳＶ
のＦおよびＧタンパク質を発現するアデノウイルス（Ｏ
ｌｍｓｔｅａｄら、１９８８；Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９
９０ａ、ｂ）を使用するワクチンのアプローチは、ま
た、研究されている。生の弱毒化ウイルスまたは生のベ
クターードウイルスのワクチンは、サブユニットまたは
不活性化ウイルスのワクチンを越えたいくつかの利点を
有する。鼻内に投与された複製ウイルスは全身的免疫性
を引き出すであろう。さらに、それは非経口的投与され
たサブユニットのワクチンまたは不活性化ワクチンより
も、体液および細胞の両者の成分からなる、充実の局所
的粘膜の免疫性を与える可能性が強い。この免疫性はよ
り低い呼吸器の疾患に対する満足すべき保護的を提供
し、ならびに疾患の増強に導くことがある合併症を回避
することができる。
【０００６】低温適応、すなわち、ウイルスをそれが常
態で最適に増殖する温度より低い温度において増殖する
ように適応させる方法を使用して、ワクチンとして使用
するための弱毒化ＴＳウイルス突然変異体が開発されて
きている（概観については、ＭａａｓｓａｂおよびＤｅ
Ｂｏｒｄｅ、１９８５、参照）。この方法は、一般に、
遺伝学的損傷通常単一である化学的突然変異誘発と異な
り、多数の遺伝学的損傷の蓄積を生ずる。これらの多数
の損傷は、任意の１つの損傷の復帰が関係する表現型の
復帰を生ずる確率を減少することによって、表現型の安
定性を与えることを助ける。Ｍａａｓｓａｂは段階的低
温適応を使用して、現在臨床的試験におけるいくつかの
ＴＳインフルエンザワクチンの候補の開発に成功した
（Ｍａａｓｓａｂら、１９９０；Ｏｂｒｓｏｖａ−Ｓｅ
ｒｏｖａら、１９９０；Ｅｄｗａｒｄら、１９９１）。
これらの突然変異体は、少なくとも４つの異なる遺伝子
の中に弱毒化性突然変異を有し、弱毒化されており、免
疫原性、および表現型的に安定であるように思われる。
Ｂｅｌｓｈｅおよび共同研究者ら低温適応を使用して、
パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス３型
の弱毒化された、ＴＳ株を開発した（Ｂｅｌｓｈｅおよ
びＨｉｓｓｏｍ、１９８２；Ｍｕｒｐｈｙら、１９９
０）。この場合において、低温適応は温度を２０℃に減
少することによって初代アフリカミドリザル腎細胞にお
いて実施した。この低温適応した集団からクローニング
したいくつかのウイルスの変異型の分析により、弱毒化
のレベルおよび温度感受性は低温適応の長さを増加する
と増加すること証明された。これらの変異型はヒトにお
けるビルレンスについて減少した効力を示したが、温度
感受性表現型は臨床試験において多少不安定であった
（Ｃｌｅｍｅｎｔｓら、１９９１）。ＲＳＶは１９６０
年代の中頃においていくつかの実験室において２５〜２
６℃に首尾よく低温適応されたが、ワクチンの試験にお
いて弱毒化の低度が低いことが発見された（Ｋｉｍら、
１９７１；ＭａａｓｓａｂおよびＤｅＢｏｒｄｅ、１９
８５；ＦｏｒｓｙｔｈおよびＰｈｉｌｌｉｐｓ、１９７
３（Ｌｅｄｅｒｌｅ））。ＭａａｓｓａｂおよびＤｅＢ
ｏｒｄｅ（１９８５）が示唆するように、この理由は低
温適応を十分に低い温度で実施しなかったことにある
か、あるいは適切に弱毒化されたウイルスのクローンが
低温適応したウイルスの遺伝学的に混合された集団から
分離されなかったことにあるであろう。
【０００７】本発明は、低温適応した突然変異体のＲＳ
Ｖ、ことに亜群ＡおよびＢの突然変異体のＲＳＶを提供
する。本発明の突然変異体のＲＳＶ、およびこれらの突
然変異体のＲＳＶの免疫原性ポリペプチドをエンコード
する核酸分子は、また、本発明により提供される。上の
組成物の任意のものを含有する医薬組成物はここにおい
て提供される。これらはワクチンとしてことに有用であ
る。さらに、本発明は、ここに記載する医薬組成物を使
用して被検体をＲＳＶの感染に対してワクチン接種する
方法を提供する。
【０００８】本発明は、低温適応した突然変異体のＲＳ
ウイルス（ＲＳＶ）を提供する。この突然変異体のＲＳ
Ｖは、被検体に投与したとき、有意な疾患、例えば、呼
吸困難または中耳炎を引き起こさないで、免疫応答を引
き出すすることができる。ここで使用するとき、低温適
応した突然変異体の例は、前掲の本発明の節の背景に提
供された。本発明の１つの実施態様において、低温適応
した突然変異体のＲＳＶは突然変異体の亜群ＡのＲＳＶ
である。好ましい実施態様において、突然変異体のＲＳ
Ｖの亜群Ａのウイルスは３Ａｐ２０Ｅ、３Ａｐ２０Ｆお
よび３Ａｐ２８Ｆから成る群より選択される。また、本
発明は、低温適応した突然変異体が亜群Ｂである、低温
適応した突然変異体のＲＳＶを提供する。好ましい実施
態様において、低温適応した亜群Ｂのウイルスは２Ｂｐ
３３Ｆ、２Ｂｐ２４Ｇ、２Ｂｐ２０Ｌおよび２Ｂｐ３４
Ｌから成る群より選択される。本発明のウイルスは
（１）生ウイルスワクチンとして、（２）任意のＲＳＶ
株の弱毒化された表現型を与え、増強するか、あるいは
安定化するための遺伝学的材料源として、（３）免疫原
性ポリペプチド源として、（４）生ウイルスまたはバク
テリアのベクター（例えば、バキュロウイルス、ワクシ
ニアウイルス、アデノウイルス、弱毒化されたサルモネ
ラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））により免疫原性ポリペ
プチドの組み換え体の発現のための遺伝学的材料とし
て、（５）他のウイルスからの免疫原性タンパク質、例
えば、ＲＳＶのＦおよびＧタンパク質、インフルエンザ
のＨＡおよびＮＡタンパク質、パラインフルエンザのＨ
ＮおよびＦタンパク質の発現のためのウイルスのベクタ
ーとして、そして（６）免疫学的アッセイにおいて抗体
または酵素増幅アッセイ（例えば、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ））において核酸を検出するための試薬源と
して有用である。
【０００９】本発明は、また、親の３Ａおよび２Ｂ株の
上に表示した低温適応した突然変異体のすべての誘導さ
れた株を包含し、これらは次のものを包含するが、これ
らに限定されない：化学的突然変異誘発、低温適応、ま
たは遺伝学的組み換え、例えば、部位特異的突然変異誘
発により弱毒化された株。これらの方法は当業者によく
知られている。
【００１０】これらのウイルスを含有するワクチンおよ
び医薬組成物を後述する。
【００１１】前述の突然変異体のＲＳＶからか、あるい
はこれらの同一の突然変異体で感染した細胞から分離さ
れ、精製された免疫原性ポリペプチドは、また、本発明
により提供される。ここで使用するとき、用語「ポリペ
プチドまたはペプチド」はペプチド結合により結合され
た線状のポリマーおよびタンパク質、例えば、ＲＳＶの
抗原性タンパク質を意味することを意図する。線状のポ
リマーまたは「タンパク質断片」は、ポリペプチドが免
疫学的活性を示すことができるかぎり、種々の長さであ
ることができる。免疫学的活性を決定する方法は後述す
る。
【００１２】これらのポリペプチドは、Ｌ、Ｆ、Ｇ、
Ｍ、Ｍ２（また、２２Ｋとして知られている）、Ｐ、Ｓ
Ｈ、１Ｂ、１ＣまたはＮと表示するポリペプチドを包含
する突然変異体のＲＳＶのポリペプチドであることがで
きる。これらのポリペプチドは下に記載する方法により
精製することができ、そして下の呼吸器の疾患およびＲ
ＳＶ感染の他の疾患の症状に対して保護するためのサブ
ユニットのワクチンにおける免疫原として有用である。
精製されたＲＳＶの免疫原性ポリペプチドを互いに結合
または接合して、キメラ（または融合）ポリペプチドを
得ることができる。ポリペプチドを結合する方法は当業
者によく知られている。サブユニットのワクチンは宿主
を免疫化するために必要な関係する免疫原性材料からな
る。これらのワクチンは、遺伝子操作した免疫原、化学
的に合成された免疫原および／または真性の実質的に純
粋なＲＳＶのポリペプチドまたはキメラのポリペプチド
からなる免疫原の単独、あるいはそれらと保護的免疫応
答を引き出すことができる、同様に調製されたＲＳＶの
ポリペプチドまたはタンパク質との組み合わせを包含す
る。
【００１３】１つの実施態様において、ＲＳＶのポリペ
プチドはＲＳＶまたはＲＳＶで感染した細胞の培養物か
ら実質的に純粋な形態で分離することができる。別の実
施態様において、ＲＳＶのポリペプチドはこれらのポリ
ペプチドを生産するように操作した組み換え系またはベ
クターから分離することができる。なお他の実施態様に
おいて、ＲＳＶのポリペプチドは当業者によく知られて
いる方法により化学的合成することができる。免疫原性
ポリペプチドは、最も好ましくは、本発明の突然変異体
のＲＳＶから誘導される。また、野生型ウイルス株から
分離されたポリペプチドならびに特別にここに開示する
株から誘導された株は本発明の範囲内に包含される。
【００１４】前述したように、突然変異体のＲＳＶのポ
リペプチドは免疫原性ポリペプチドを発現する組み換え
ベクターから精製することができる。このような組み換
えはバクテリアの形質転換体、酵母菌の形質転換体、組
み換えウイルスで感染した細胞の培養物または哺乳動物
細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞の培養物を包含する。組み換えポリペプチドは問題
のエピトープの多数のコピー、異なるウイルスの亜群ま
たは株からの同一または異なるエピトープからなること
ができる。
【００１５】生産方法に無関係に、ＲＳＶのポリペプチ
ドを使用してワクチンを配合することができる。そのよ
うに実施するために、ＲＳＶのポリペプチドを適当な濃
度に調節し、そして任意のワクチンのアジュバントと配
合する。ポリペプチドは一般に０．１〜１００μｇ／ｋ
ｇ／宿主の範囲の濃度で配合することができる。生理学
的に許容される媒質を担体として使用することができ
る。これらは次のものを包含するが、これらに限定され
ない：無菌の水、生理的食塩水、リン酸塩緩衝液など。
適当なアジュバントは次のものを包含するが、これらに
限定されない：表面活性物質、例えば、ヘキサデシルア
ミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エス
テル、リソレクチン、ジメチル−ジオクタデシルアンモ
ニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’−Ｎ−
ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メ
トキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニック
ポリオール；ポリアミン、例えば、水酸化アルミニウ
ム、リン酸アンモニウムなど。また、免疫原をリポソー
ムの中に組み込むか、あるいは多糖および／またはワク
チンの配合において使用するための他のポリマーに接合
することができる。
【００１６】なお本発明の他の実施態様において、ＲＳ
Ｖのポリペプチドはハプテン、すなわち、同種の抗体と
特異的または選択的に反応することにおいて抗原性であ
るが、免疫応答引き出すことができないことにおいて免
疫原性でない分子である。このような場合において、ハ
プテン担体または免疫原性分子、例えば、それと結合し
たハプテンに免疫原性を与える大きいタンパク質、例え
ば、タンパク質の血清アルブミンに共有結合することが
できる。ハプテン−担体はサブユニットのワクチンとし
て使用するために配合することができる。
【００１７】本発明のポリペプチドは、可溶性巨大分子
の担体に結合したとき、使用することができる。好まし
くは、担体および本発明のポリペプチドまたはタンパク
質は結合後５０００ダルトンを越える。より好ましく
は、担体は５キロダルトンを越える。好ましくは、担体
はヒトを包含する動物の中の免疫原性である、天然また
は合成のポリアミノ酸である。結合方法は普通の方法で
ある。多数の結合技術は米国特許第４，６２９，７８３
号（その開示をここに引用によって加える）に開示され
ている。多数の架橋剤は次の参考文献に記載されてい
る：１９８６−８７ハンドブック・オブ・ジェネラル・
カタログ（Ｈａｎｄｂｏｏｋ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｃａｔａｌｏｇ）、ピアース・ケミカル・カンパニー
（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）
（イリノイ州ロックフォード）、ｐｐ３１１−３４０
（そのページをここに引用によって加える）。
【００１８】本発明は、また、前述の低温適応した突然
変異体のＲＳＶまたはポリペプチドをエンコードする核
酸分子を提供する。また、キメラのポリペプチドをエン
コードする核酸分子が提供される。これらの核酸はＤＮ
Ａ分子、ｃＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子、例えば、アン
チセンスＲＮＡであることができる。本発明は、また、
これらのポリペプチドをエンコードする核酸分子のそれ
と異なるが、同一の表現型の作用を生成する核酸分子を
包含する。これらの変更された、表現型的に同等の核酸
分子は「同等の核酸」と呼ぶ。本発明は、また、前述の
核酸分子と比較したとき、それから生産されたポリペプ
チドの表現型を変更しない非解読領域における変化によ
り特徴づけられる核酸分子を包含する。
【００１９】また、突然変異体のＲＳＶの非解読配列か
らなる核酸分子が提供される。これらの非解読領域は、
５’非解読領域、３’非解読領域、遺伝子間配列、また
はウイルスのゲノムの他の非解読領域を包含する。これ
らは転写、翻訳または他の調節領域を包含するが、これ
らに限定されない。また、これらの核酸分子はＤＮＡ分
子、ｃＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であることができ
る。
【００２０】さらに、中程度ないし高いストリンジェン
シーの条件下に本発明の核酸分子にハイブリダイゼーシ
ョンする核酸分子が包含される。多数の因子がハイブリ
ダイゼーションのストリンジェンシーの決定において重
要であり、これらの因子は次のものを包含する：ハイブ
リダイゼーションした核酸の種、核酸のプローブの長
さ、ＴM（溶融温度）、ハイブリダイゼーションの温度
および洗浄、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄
緩衝液の中の塩濃度、水性またはホルムアミドのハイブ
リダイゼーション緩衝液、およびハイブリダイゼーショ
ンおよび洗浄のための時間の長さを包含する。中程度な
いし高いストリンジェンシーの条件の例は、次の通りで
ある：０．９Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０９Ｍのク
エン酸ナトリウムを含む水性緩衝液の中で５５〜６５℃
においてＤＮＡ−ＤＮＡのハイブリダイゼーションを２
００ヌクレオチドより大きいプローブを使用して８時間
の間実施し、そして０．３Ｍの塩化ナトリウムおよび
０．０３Ｍのクエン酸ナトリウムを含有する水性緩衝液
の中で４２℃において洗浄する。
【００２１】本発明の核酸分子は、ＲＮＡの転写のプロ
モーター、ならびに他の調節配列に操作的に連鎖するこ
とができる。ここで使用するとき、用語「操作的に連鎖
する」は、プロモーターがＲＮＡの転写を核酸分子から
離れるように向けるような方法で位置することを意味す
る。プロモーターの例はＴ７プロモーターである。プロ
モーターおよび挿入された核酸片がプロモーターに操作
的に連鎖したクローニング部位の両者を含有するベクタ
ーは、この分野においてよく知られている。好ましく
は、これらのベクター核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉ
ｎ ｖｉｖｏで転写することができる。このようなベク
ターの例は、ポリペプチドをエンコードする核酸領域ま
たは前述の非解読領域を他のＲＳＶ型の核酸と置換し、
こうして生ずるウイルスがより強いか、あるいは安定に
弱毒化された、異なる型のＲＳＶの核酸（他の弱毒化さ
れたサブタイプを包含する）である。組み換えウイルス
またはバクテリアのベクター、例えば、アデノウイル
ス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、インフルエ
ンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、サルモネ
ラのベクターは突然変異体のＲＳＶの免疫原性ポリペプ
チドを発現するように操作され、それらの各々はこれら
の族の構成員のすべてを包含する。
【００２２】さらに、組み換えウイルスおよび本発明の
核酸分子によりエンコードされるポリペプチドが提供さ
れる。ここで使用するとき、「組み換えウイルス」は、
野生型ウイルスから遺伝学的に変更されたウイルスを意
味することを意図する。
【００２３】ウイロソームは人工的脂質のエンベロープ
（リポソーム）であり、その膜はウイルスのタンパク質
を含有し、そして核酸、薬物、タンパク質および他の活
性化合物を包含することができる物質を包膜する。これ
らのリポソームは本発明のＲＳＶからのＲＳＶエンベロ
ープのタンパク質を含有することができる。例として、
ＲＳＶのＧタンパク質はウイロソームを呼吸器の内皮細
胞にターゲッティングするであろう。Ｆタンパク質はウ
イロソームをターゲット細胞と融合させて、ウイロソー
ムの内容物をターゲット細胞に供給できるようにする。
ウイロソームは被検体に静脈内に投与することができる
が、好ましい投与方法は肺へのエアゾールによる、例え
ば、ネブライザーの使用による。ウイロソームの供給系
を構成する方法は当業者によく知られている。突然変異
体のＲＳＶのポリペプチドおよびキメラのポリペプチド
をエンコードする核酸は、宿主においてワクチンとして
ａｃｒするウイロソームの供給系によりターゲット細胞
に効率的に供給することができる。
【００２４】ここに記載する組み換えポリペプチドを生
成しそして本発明の核酸分子を発現するための宿主のベ
クター系が提供される。宿主のベクター系は、適当な宿
主の中の前述のベクターの１つからなる。本発明の目的
に対して、適当な宿主は次のものを包含するが、これら
に限定されない：真核生物の細胞、例えば、バキュロウ
イルスの発現のための哺乳動物の細胞、酵母菌の細胞ま
たは昆虫の細胞。適当な哺乳動物の細胞は次のものを含
むが、これらに限定されない：Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨ細
胞、ＷＩ−３８細胞および初代サル腎細胞。適当な宿主
は、また、原核生物の宿主細胞、例えば、バクテリアの
細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からなることができる。
【００２５】前述の任意の低温適応した突然変異体のＲ
ＳＶまたはポリペプチドまたはキメラのポリペプチドの
単独、またはそれらの組み合わせ、および製剤学的に許
容されうる担体からなる医薬組成物が、また、提供され
る。ここで使用するとき、用語「製剤学的に許容されう
る担体」は任意の標準の製剤学的担体、例えば、生理学
的に均衡した培地、リン酸塩緩衝液、生理的食塩水、
水、および乳濁液、例えば、油／水または水／油、種々
のタイプの湿潤剤またはタンパク質安定剤を包含する。
【００２６】本発明の１つの実施態様において、医薬組
成物はワクチンとして使用することを意図する。１つの
実施態様において、ウイルスを低温保護剤または安定
剤、例えば、タンパク質（例えば、アルブミン、ゼラチ
ン）、糖類（例えば、スクロース、ラクトース、ソルビ
トール）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸ナトリウ
ム）、生理的食塩水、または他の保護剤と混合する。次
いで、この混合物を輸送または貯蔵のために乾燥または
凍結乾燥し、そして投与直前に水と混合する。あるい
は、ウイルスをホルマリンまたは熱で不活性化し、そし
てアジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、生理的
食塩水および洗浄剤、例えば、リン酸塩ツイーン緩衝剤
と混合することができる。ワクチンの調製方法について
は、Ｄｕｆｆｙ（１９８２）を参照のこと。
【００２７】任意の低温適応した突然変異体のＲＳＶ、
突然変異体のＲＳＶをエンコードする核酸分子、免疫原
性ポリペプチド、またはキメラのポリペプチド、または
ＲＳＶのポリペプチドを発現することができる生きてい
るベクターからなる医薬組成物は、ＲＳＶ感染に対して
被検体をワクチン接種するために有用である。こうし
て、本発明は、有効免疫化量の前述の医薬組成物を被検
体に投与することによって、被検体をＲＳＶ感染に対し
てワクチン接種する方法を提供する。
【００２８】この被検体は動物、例えば、哺乳動物、例
えば、チンパンジーまたは好ましくはヒトであることが
できる。十分な量のワクチンを被検体に投与して、免疫
応答引き出すことができる。当業者はこのような量を容
易に決定することができる。投与は任意の有効な形態に
より、例えば、鼻内、非経口的、静脈内、経口的に投与
するか、あるいは局所的に任意の粘膜表面、例えば、鼻
内、口、眼または直腸の表面に適用することができる。
本発明の好ましい実施態様において、生ウイルスワクチ
ンを前述したように鼻内、経口的、非経口的に投与する
か、あるいは任意の粘膜表面（鼻、口、眼、直腸）に適
用することができる。不活性化全ウイルスのワクチンを
好ましくは非経口的にまたは任意の粘膜表面に投与す
る。
【００２９】また、前述の組み換えポリペプチドを生産
する方法が提供され、この方法は本発明の核酸および／
または本発明の宿主ベクター系を含有する細胞を、ポリ
ペプチドの生産を可能とする適当な条件下に増殖し、そ
して得られる生産された組み換えポリペプチドを回収す
ることからなる。
【００３０】また、精製されたポリペプチド、または前
述のキメラのポリペプチドまたは突然変異体の弱毒化低
温適応したＲＳＶとの複合体を特別に形成することがで
きる物質が提供される。本発明の１つの実施態様におい
て、この物質は抗体、例えば、モノクローナル抗体また
はキメラ抗体である。本発明の好ましい実施態様におい
て、モノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体であ
る。
【００３１】さらに、本発明は低温適応によりウイルス
を弱毒化する方法を提供する。
【００３２】本発明の突然変異体のＲＳＶの試料は、特
許手続きの目的のための微生物の寄託の国際的認識つい
てのブダベスト条約の規定（「ブダベスト条約」）に従
い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（Ａｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）米国マリイランド州２０
８５、ロックビレ、パークローンドライブ１２３０１に
受託された。ウイルスは次の受け入れ番号を与えられ
た：２Ｂｐ３３Ｆ（ＶＲ ２３６４）、２Ｂｐ２４Ｇ
（ＶＲ ２３７０）、２Ｂｐ２０Ｌ（ＶＲ ２３６
８）、２Ｂｐ３４Ｌ（ＶＲ ２３６５）、３Ａｐ２０Ｅ
（ＶＲ ２３６９）、３Ａｐ２０Ｆ（ＶＲ ２３６
７）、および３Ａｐ２８Ｆ（ＶＲ ２３６５）。
【００３３】実験 ＲＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ３Ａの親の株の継代および
特性決定 ＲＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ３Ａの親の株を分離し、そ
して適格の細胞系の中で臨床的研究の材料として使用に
合致する条件下に継代した。
【００３４】２つのＲＳＶ株、２０６４８および２３０
９５は、ロバート・ベルシェ博士（マーシャル・ユニバ
ーシティ・スクール・オブ・メディシン、ウェストバー
ジニア）により、病気の子供の鼻のスワブ試料から分離
された。これらのウイルスを後にもとの凍結鼻スワブ試
料から回収し、初代アカゲサル腎（ＰＲＭＫ）細胞の中
で２〜３回継代し、次いで出願人に送られた。
【００３５】分離株２０６４８（亜群Ｂ）をＲＳＶ ２
Ｂと名前を改めた。ウイルスをＰＲＭＫの中で３５℃に
おいて７回継代し、Ｖｅｒｏ細胞の中で３５℃において
２回継代し、プラーク精製し、そしてＶｅｒｏ細胞の中
で３６℃において３回（６回の継代）増幅した。さら
に、ウイルスをＶｅｒｏ細胞の中でさらに２回増幅し
（３６℃）、ストックを０．２ｍのフィルターで濾過
し、そしてＶｅｒｏ細胞の中でさらに２回増幅した。次
いで、マスター種子（ＲＳＶ ２Ｂ、ＭＫ７ Ｖ１２
ｂ）、中間の種子（ＲＳＶ ２Ｂ、ＭＫ７ Ｖ１３ｂ）
および使用（Ｗｏｒｋｉｎｇ）種子（ＲＳＶ ２Ｂ、Ｍ
Ｋ７ Ｖ１４ｂ）を生産した。図１参照。
【００３６】分離株２３０９５（亜群Ｂ）をＲＳＶ ３
Ａと名前を改めた。ＲＳＶ ３ＡをＰＲＭＫの中で３５
℃において８回継代した。次いで、これをＶｅｒｏ細胞
の中で３５℃において２回継代し、そして３６℃におい
て６回継代し、３回のプラーク精製段階を含んだ。ウイ
ルスをＶｅｒｏ細胞の中で３６℃においてさらに６回継
代し、０．２ｍの濾過段階を含んだ。次いで、マスター
種子（ＲＳＶ ３Ａ、ＭＫ８ Ｖ１５ｂ）、中間の種子
（ＲＳＶ ３Ａ、ＭＫ８ Ｖ１６ｂ）および使用（Ｗｏ
ｒｋｉｎｇ）種子（ＲＳＶ ３Ａ、ＭＫ８ Ｖ１７ｂ）
を生産した。図１参照。
【００３７】ＲＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ３Ａのマスタ
ー種子の亜群の特異性を亜群特異的モノクローナル抗体
を使用して確証した。ウイルスのストックは微生物の汚
染物質および外来因子を含有しないことが示された。
【００３８】ＲＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ３Ａのストッ
クおよび参照ＲＳＶ株Ａ２、Ｌｏｎｇおよび１８５３７
のＦ、ＮおよびＧタンパク質を、ラジオ免疫沈澱（ＲＩ
Ｐ）およびウェスタンブロットの手順によりモノクロー
ナル抗体を使用して分析した。ＲＳＶの亜群Ｂ株、２Ｂ
および１８５３７のＦ１サブユニットは、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル上で、ＲＳＶの亜群Ａ株、３Ａおよ
びＬｏｎｇのＦ１サブユニットよりも速く移動した。Ｒ
ＳＶ ２Ｂおよび３Ａ株および参照株のＮタンパク質の
移動の差は見られなかった。ＲＩＰゲルにおいて、Ｇタ
ンパク質は２つのバンドとして約８０〜９０Ｋｄａおよ
び約４５Ｋｄａにおいて可視であった。ＲＳＶ ３Ａお
よびＬｏｎｇの８０〜９０Ｋｄａのバンドは一緒に移動
した；しかしながら、ＲＳＶ ２Ｂの８０〜９０Ｋｄａ
のバンドは、また、より速いＲＳＶ １８５３７（亜群
Ｂ１）とよりむしろ、亜群Ａ種と一緒に移動するように
思われた。これが示唆するように、ＲＳＶ ２ＢはＡｋ
ｅｒｌｉｎｄら、１９８８に記載されているようにＢ２
亜群の１構成員であろう。ウェスタンブロットにおい
て、８０〜９０Ｋｄａおよび４５Ｋｄａのバンドの相対
的比率はＶｅｒｏ細胞の中で増殖したＲＳＶ Ｌｏｎ
ｇ、Ａ２、２Ｂおよび１８５３７についてとほぼ等しい
が、ＲＳＶ ３Ａの８０〜９０Ｋｄａのバンドの染色は
有意により大きく、Ｖｅｒｏ細胞の中で増殖したときの
この株についてのＧタンパク質のプロセシングの差を示
唆している。これらのデータが証明するように、ＲＳＶ
２ＢおよびＲＳＶ ３Ａ株についての見掛けのＭrｈ
ａＲＳＶの現在の亜群の分類と一致するが、これらの株
はプロトタイプのＲＳＶの参照株と同定ではないことを
確証する。
【００３９】マウスおよびコットンラット（ｃｏｔｔｏ
ｎ ｒａｔ）におけるＲＳＶ ２Ｂ、ＲＳＶ ３Ａおよ
びＲＳＶ Ａ２の増殖を比較した。ＲＳＶ ２Ｂおよび
ＲＳＶ ３Ａの両者は、ＲＳＶ Ａ２参照株と比較し
て、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの中の複製が劣っていた。ＲＳ
Ｖ ２ＢおよびＲＳＶ ３Ａの一定した回収は使用した
最高の接種投与量（１０6.0-6.2ＰＦＵ）において得ら
れ、そして１００倍より低い接種（１０4.3ＰＦＵ）に
おいてＲＳＶ Ａ２の回収に大きさが類似した。対照的
に、コットンラットの鼻および肺におけるＲＳＶ ２Ｂ
の増殖はＲＳＶＡ２の増殖に類似した。鼻の中のＲＳＶ
３Ａの増殖は他の株に類似した；しかしながら、肺の
中の増殖は有意に劣っていた。マウスおよびコットンラ
ットの両者の増殖のデータが示すように、ＲＳＶ ２Ｂ
およびＲＳＶ ３Ａはｉｎ ｖｉｖｏの増殖の特性がＲ
ＳＶ Ａ２の参照株と、ならびに互いに、有意に異な
る。 ＲＳＶの低温適応 ＲＳＶの低温適応のために適当な出発温度を選択するた
めに、２６℃〜３６℃の範囲の温度におけるＶｅｒｏ細
胞の中のＲＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ３Ａの親の株の増
殖を比較した。細胞を０．４のＭＯＩで感染させ、そし
てウイルスの収量および細胞変性作用（ｃｐｅ）を４日
間監視した。図２および図３に示す結果が証明するよう
に、３０℃、３２℃および３６℃において増殖させた両
者のウイルス株は反応速度論および収量が類似した。２
６℃において、ウイルスの増殖はより高い温度における
増殖より約２４時間だけ遅れた。最適な力価を達成する
ときの制限因子は、より高い温度において起こった、ウ
イルスのｃｐｅであるように思われた。ＲＳＶ ２Ｂお
よびＲＳＶ ３Ａの両者について、最適な力価は培養を
３０℃に維持することによって達成された。この温度に
おいて、ｃｐｅのより低いレベルはウイルスの増殖およ
び広がりをより長い時間にわたって続けさせた。結果が
示すように、ＲＳＶのこれらの株は３０℃〜３６℃にお
ける増殖に既によく適応した。２６℃の最大温度を低温
適応の出発温度として選んだ。なぜなら、この温度にお
けるウイルス増殖は最適より低いからであり、したがっ
て低温適応のための多少の選択的圧力を及ぼした。
【００４０】低温適応はウイルスのストックＲＳＶ ２
Ｂ（継代ＭＫ７ Ｖ１４）およびＲＳＶ ３Ａ（ＭＫ７
Ｖ１４）について開始した。これらの低温適応した集
団から適当に弱毒化された突然変異体を回収する機会を
最大とするために、ウイルスの２つのフラスコを３つの
異なる低温適応法の各々を使用して独立に継代した。こ
れにより、ＲＳＶ ２Ｂについて合計の６うの低温適応
した集団およびＲＳＶ３Ａについて６つが得られた。ウ
イルスはコンフルエントのＶｅｒｏ細胞の単層を含有す
る２５ｃｍ2のフラスコの中で継代した。各継代におい
て、感染したフラスコの中の維持培地（１０ｍｌのＭＥ
Ｍ／２％のＦＢＳ／２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）を減少した
体積の凍結培地（３ｍｌのＭＥＭ／１０％のＦＢＳ／２
０ｍＭのＨＥＰＥＳ）で置換し、そして−７０℃に急冷
し、次いで３２℃において融解することによって、ウイ
ルスを収獲した。次の継代を感染させるために、１ｍｌ
の凍結−融解リゼイトをコンフルエントのＶｅｒｏ細胞
の新鮮なフラスコに移し、ウイルスを室温（２０℃〜２
２℃）において吸収させ、次いで維持培地（ＭＥＭ／２
％ＦＢＳ／２０ｍＭのＨＥＰＥＳ）でオーバーレイし、
そして水浴の中で適当な温度（すなわち、２６℃、２２
℃、２０℃）においてインキュベーションした。
【００４１】滴定を３２℃において各凍結−融解リゼイ
トについて実施し、そしてこの材料の残部を−７０℃に
おいてウイルス変異型の将来の分離のために貯蔵した。
フラスコＥおよびＦを「ゆっくり」適応させ、２６℃に
おいて２日毎に４継代で開始し、次いで力価が相対的安
定であるように思われるか、あるいは増加するまで毎週
１回継代した。次いで、絶えず高い力価が達成されるま
で、ウイルスを２２℃において毎週継代し、そして最後
に２０℃において１〜２週毎に継代により維持した。フ
ラスコＧ、ＨおよびＩをより適度な方法により適応させ
た。ウイルスを２６℃で３日の間隔で２回継代し、次い
で毎週２２℃で５回継代し、そして最後に２０℃におい
て１〜２週毎に継代により維持した。フラスコＪおよび
Ｌを「急速に」適応させ、２２℃において５回の毎週の
継代で出発し、次いで１〜２週の間隔で２０℃において
継代した。実際の継代の条件および滴定の結果を表１お
よび表２に示し、そして表３に要約する。各継代で得ら
れた滴定の結果を図４にグラフで表示する。滴定の結果
は適応速度への株の影響を証明した。ＲＳＶ ２Ｂにつ
いて、すべての３つの低温適応法は、フラスコを２０℃
に維持したとき、高いウイルスの力価を究極的に生じ
た。対照的に、ＲＳＶ ３Ａは「遅い」方法を使用して
２０℃において適応させた（Ｅ、Ｆ）が、より急速な適
応を強制させる努力はウイルスの増殖の急な傾斜を生じ
た。これらの培養物（３Ａ：Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｌ）の継代を
中止した。
【００４２】低温適応したウイルスの集団をＴＳ変異型
の蓄積についてスクリーニングするために、５および１
７週の低温適応後に各フラスコから採ったウイルスを３
９℃／３２℃においてプラーク形成の効率（ＥＯＰ）に
ついて試験した。表４に見られるように、ほとんどの場
合において、低温継代のウイルスのプラーク形成効率は
３９℃において比較的高く（≧０．２）そして親のウイ
ルスの対照を使用して得られた値（≧０．６）に類似し
た。結果が示すように、低温適応したウイルスの集団
は、フラスコＲＳＶ ３Ａ−Ｆの可能ならば例外して、
１７までの低温継代の期間にわたって主としてＴＳとな
らなかった。
【００４３】それ以上の低温継代後、各低温適応したフ
ラスコからのウイルスをプラーク精製することによって
温度感受性突然変異体を分離する試みをした。プラーク
精製した突然変異体は、３９℃／３２℃において比較的
劣った増殖（より低い力価またはより小さいプラーク大
きさ）により最初に同定された。表５に示すこれらのア
ッセイにおいて、温度感受性として明瞭に同定すること
ができるプラーク精製したウイルスの百分率は取り上げ
たプラークの０％〜４０％の範囲であった。いくつかの
個々のフラスコ（２Ｂ−Ｈ、２Ｂ−Ｌ、３Ａ−Ｅ、３Ａ
−Ｆ）は比較的より高い百分率のＴＳ表現型を含有する
ように思われ、そしてある場合において、ＴＳ突然変異
体の百分率は経時的に増加した。しかしながら、ＴＳ突
然変異体は４２週までの低温継代期間にわたって優勢な
変異型となるように思われなかった。
【００４４】要約するために、ＲＳＶ ２ＢおよびＲＳ
Ｖ ３Ａの低温継代は、絶えず高い収量で２０℃におい
て安定に増殖するウイルスの能力に基づいて、ウイルス
の低温適応を生じた。ＥＯＰアッセイおよびＴＳ突然変
異体の分離割合の分析が示すように、ＴＳ突然変異体は
低温適応したウイルスの集団を事実上昇させたが、優勢
な種とならなかった。
【００４５】ワクチンの候補についてのスクリーニング ＴＳ突然変異体を、さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏの温度感
受性の程度、動物のモデル（マウス、コットンラット、
およびチンパンジーを包含する）における弱毒化、およ
び中和性エピトープの保持に基づいて、ワクチンの候補
についてスクリーニングおよび選抜した。
【００４６】３９週の低温適応にわたって、合計１３の
ＲＳＶ ２Ｂおよび６のＲＳＶ ３ＡのＴＳ突然変異体
を第２回のプラーク精製にかけ、そしてさらに特性決定
した。３７／３２℃、３９／３２℃および／または４０
／３２℃におけるＥＯＰの比較により、これらの突然変
異体はより高い温度においてプラーク形成の効率を減少
し、そしてある範囲の温度感受性を表すことが確証され
た（参照、表６）。
【００４７】すべての１９の前述の突然変異体の分離を
完結する前に、４つの突然変異体、ＲＳＶ ２Ｂｐ２４
Ｇ、ＲＳＶ ２Ｂｐ２０Ｌ、ＲＳＶ ３Ａｐ２０Ｅおよ
びＲＳＶ ３Ａｐ２０Ｆの群を、第１組のプラーク精製
したウイルスから、予備的特性決定のために選択した。
実際のウイルスの増殖曲線を見るために、Ｖｅｒｏ細胞
をこれらの４つの突然変異体で２のＭＯＩにおいて感染
し、そして２０℃、３２℃、３７℃および４０℃におい
て４日間インキュベーションした。図５に表示する結果
が示すように、すべての４つの突然変異体は、２０℃で
インキュベーションした培養物における力価の早期より
高い上昇、および３７℃、３９℃および４０℃でインキ
ュベーションした培養物におけるウイルスの増殖の減少
または不存在により証明されるように、低温適応されか
つ温度感受性であった。ＥＯＰおよび増殖の研究におい
て見られる温度感受性の程度に基づいて、マウスにおけ
る表現型の安定性および増殖について追加の予備的実験
を実施するために、１つの亜群Ａおよび１つの亜群Ｂの
突然変異体、ＲＳＶ ２Ｂｐ２０ＬおよびＲＳＶ３Ａｐ
２０Ｅを選択した。
【００４８】ＲＳＶ ２Ｂｐ２０ＬおよびＲＳＶ ３Ａ
ｐ２０Ｅの感染性および免疫原性をＢａｌｂ／Ｃマウス
において評価した。感染後４および５日に収獲した鼻の
洗浄液および肺の試料においてウイルスの増殖を測定
し、そして血清の中和性抗体の力価を感染後３２日に決
定した。結果を表７に示す。親のウイルスの増殖および
免疫原性は非常に低くかったが、検出可能であった。対
照的に、ウイルスは回収されず、そして中和性抗体はＴ
Ｓ株の接種後検出されず、これらの株がマウスにおいて
高度に弱毒化されたことが示された。
【００４９】究極的に分離した１９のＴＳ突然変異体の
うちで、４つのＲＳＶ ２Ｂおよび３つのＲＳＶ ３Ａ
をそれ以上のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの
特性決定のために選択した。これらの突然変異体は前述
のもとの４つの突然変異体、ならびに後の時点において
分離した３つの突然変異体を包含した。選択の基準は３
７℃および３９℃の両者における明確なＴＳ表現型の証
明および両者の亜群の表示および変化する継代法および
継代の数を含んだ。これらの７つのＴＳ突然変異体を３
回目のプラーク精製にかけ、そして増幅して小さい使用
ストックをつくった。それらの継代のヒストリーを表８
に要約する。これらの突然変異体の初期の分析は、Ｖｅ
ｒｏ細胞の中の３２℃、３７℃および３９℃におけるプ
ラーク形成効率およびプラークの形態（表９）、および
Ｖｅｒｏ細胞の中の３２℃、３７℃、３９℃および４０
℃における増殖（表１０）を含んだ。３７℃および３９
℃において、ＥＯＰは減少し、そして小さくかつ中間の
プラーク大きさが優勢であり、突然変異体がＴＳである
ことが示された。「ｗｔ」プラーク大きさの復帰突然変
異体の多少の上昇が、ＲＳＶ ２Ｂｐ３４ＬおよびＲＳ
Ｖ ３Ａｐ２０Ｆを除外したすべての変異型で見られ
た。増殖の研究において、Ｖｅｒｏ細胞を０．２のＭＯ
Ｉでウイルス株で感染させ、そしてウイルスの収量を感
染後４日に決定した。種々の温度におけるＶｅｒｏ細胞
におけるウイルスの収量を比較すると、ＰＦＵ／細胞と
して表示したウイルスの収量はより高い温度（３７℃、
３９℃、４０℃）において有意に減少することが証明さ
れた。ある場合において、ウイルスの収量はまた親の株
に関して３２℃において多少減少し、３２℃における増
殖の減衰を示した。これは３２℃のＥＯＰアッセイにお
いて観察された、より小さい大きさと一致する（表
９）。すべての株について、少なくとも１つのプラーク
が３９℃または４０℃でインキュベーションした細胞に
おいて検出され、多少の復帰突然変異体が存在すること
が示された。ＥＯＰおよびウイルスの収量の両者の研究
が証明するように、これらの７つの分離株は変化するレ
ベルの温度感受性を有し、そしてある範囲の弱毒化のレ
ベルを表すことができる。
【００５０】７つの突然変異体および親の株の反応性
を、ＢｅｅｌｅｒおよびＣｏｅｌｉｎｇｈ（１９８９）
に記載されているＦタンパク質上に抗原性部位Ａおよび
Ｃを表す２つの中和性抗体と比較することによって、中
和性エピトープの保持を検査した（表１１）。両者の抗
体はすべてのウイルス株を同様に高い希釈で中和するこ
とができ、中和性エピトープが無傷であることを示し
た。
【００５１】７つのＴＳ突然変異体の株の増殖および免
疫原性をコットンラットにおいて評価した。ラットの群
に各突然変異体を鼻内接種し、そして肺および鼻の鼻甲
介をウイルスの滴定のために感染後４日に収獲した。感
染後２０日にラットの同一の組から血清を集めて、中和
性およびＥＩＡ抗体の応答について試験した。ウイルス
の滴定および免疫原性の結果の要約を表１２に示す。Ｒ
ＳＶ ２Ｂは鼻および肺の中でよく増殖したが、すべて
の４つのＲＳＶ ２ＢのＴＳ突然変異体の増殖は非常に
劣っていた。突然変異体のうちの２つ、ＲＳＶ ２Ｂｐ
３３ＦおよびＲＳＶ ２Ｂｐ２４Ｇは、複製のわずかに
高いレベルならびに１００％の感染割合により示される
ように、ＲＳＶ ２Ｂｐ２０ＬおよびＲＳＶ ２Ｂｐ３
４Ｌより、低い弱毒化された表現型を表示した。ＲＳＶ
３Ａの親のおよびＴＳ突然変異体の株は鼻の鼻甲介の
中でよく増殖したが、肺の中で増殖が劣っていた。サザ
ン分析のＴＳ突然変異体の力価は親の株のそれより低
く、ＴＳ突然変異体を親のウイルスより多少おおく弱毒
化された。ＲＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ３Ａの親および
ＴＳ突然変異体の株で感染したラットからの血清につい
ての中和性およびＥＩＡ−Ｆ抗体の力価をまた測定し
た。中和性およびＥＩＡ−Ｆ抗体の力価のレベルはＲＳ
Ｖ ２ＢのＴＳ突然変異体について低く、見られたウイ
ルス複製の低いレベルと一致した。興味あることには、
ＲＳＶ ２Ｂｐ３３Ｆで感染した動物からの力価は低い
力価の値生体内期待されるより高く、そしてこのウイル
スについて中間のレベルの弱毒化を示すことができる。
すべての３つのＲＳＶ ３ＡのＴＳ突然変異体について
の中和性およびＥＩＡ−Ｆ抗体の滴定は、これらの突然
変異体が非常に免疫原性であり、鼻組織の中のそれらの
高いレベルの複製と一致することを証明した。
【００５２】さらに、ＲＳＶ ２Ｂｐ２０Ｌの増殖をコ
ットンラットにおいて感染後３〜７日に評価して、ウイ
ルスを回収できないことがピークの力価のタイミングの
シフトのためであるかどうかを決定した。ＲＳＶ ２Ｂ
を陽性の対照として使用した（図６）。ＲＳＶ ２Ｂの
増殖の反応速度論はＲＳＶの他の株の典型であった：ピ
ークの力価は鼻の鼻甲介において第４および５日に起こ
りそして肺において第４日に起こった。これらの結果
は、親の株について最適な収獲日として、第４日の使用
を実証する。ＲＳＶ ２Ｂｐ２０Ｌは肺において検出さ
れず、そして第３、５、６および７日に鼻の鼻甲介の滴
定において稀なプラークが見られ、このウイルスの弱毒
化が単に早期または後期の増殖のピークのためでないこ
とが証明された。
【００５３】また、ＲＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ２Ｂｐ
２０Ｌの相対的増殖および免疫原性を４歳の血清反応陽
性のチンパンジーにおいて比較した。２匹のチンパンジ
ー１０4.0および１０5.0ＰＦＵのＲＳＶ ２Ｂで鼻内感
染し、そして２匹のチンパンジーを同様にＲＳＶ ２Ｂ
ｐ２０Ｌで感染した。結果を図７および表１３に示す。
ＲＳＶ ２Ｂで感染した両者のチンパンジーは温和な上
部の呼吸器の感染を発生し、鼻の分泌およびせきから成
っていた。両者のチンパンジーは感染後３〜７日にウイ
ルスを脱落した。より高い投与量のＲＳＶ ２Ｂで感染
させたチンパンジーにおいて、脱落したウイルスの量は
より高くそして脱落はより早く起こった。ＲＳＶ ２Ｂ
ｐ２０Ｌを接種したチンパンジーのいずれも疾患の臨床
的症候またはウイルスの脱落を示さなかった。すべての
４匹のチンパンジーについての化学的および血液学的精
密検査は有意な発見を明らかにしなかった。血清の中和
性およびＥＩＡ−Ｆ、ＧａおよびＧｂ抗体の力価は、Ｒ
ＳＶ ２Ｂで感染後１４および２１日に実質的に増加し
た。ＲＳＶ ２Ｂｐ２０Ｌを接種したチンパンジーにお
いて、抗体力価の上昇は見られなかった。これらの結果
が示唆するように、血清反応陽性のチンパンジーにおい
て、親のＲＳＶ ２Ｂ株は感染性および免疫原性である
が、ＲＳＶ ２Ｂｐ２０Ｌの突然変異体は高度に弱毒化
された。
【００５４】免疫原性ポリペプチドの同定 本発明に従い、抗体および細胞仲介免疫性の両者を引き
出すの原因となるエピトープであるＲＳＶの領域を決定
することができる。これらのエピトープは、Ｂ細胞およ
びＴ細胞のエピトープを包含するが、これらに限定され
ない。免疫原性エピトープの例は、中和性および抗融合
抗体を引き出すもの、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活
性を誘発するもの、およびリンパ増殖性（ＬＰ）応答を
誘発するものである。これらの領域は３つの方法により
定めることができる。第１の方法は自然ポリペプチドの
定められたタンパク質分解的切断を使用する。第２の方
法は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の中の、ポリペ
プチド遺伝子の断片のクローニングおよび発現に関す
る。第３は合成ポリペプチドの合成に関する。すべての
３つの方法において、抗体との反応性またはＣＴＬまた
はＬＰにおける反応性、例えば、ＲＳＶを中和しかつＲ
ＳＶの融合を防止することができるモノクローナル抗体
との反応性、あるいはＲＳＶまたはＲＳＶのポリペプチ
ドで免疫化した動物から分離されたＴ細胞におけるＣＴ
ＬまたはＬＰの応答を刺激する能力を使用して、所望の
ポリペプチドを同定することができる。
【００５５】ポリペプチドの精製 ＲＳＶのポリペプチドは任意の適当な当業者に知られて
いる方法によって精製または分離することができる。例
示の目的でのみ、免疫親和性の手順を下に記載する。
【００５６】免疫親和性の精製 ＲＳＶによりエンコードされる免疫原性ポリペプチドを
分離するために、ペプチドに対して向けられたモノクロ
ーナル抗体を使用する親和クロマトグラフィーを使用す
る。モノクローナル抗体を硫酸アンモニウム沈澱により
腹水から精製し、そして重炭酸塩緩衝液（０．１ＭのＮ
ａＨＣＯ3、ｐＨ９．０、０．５ＭのＮａＣｌ）の中で
約１０ｍｇ／ｍｌの濃度に調節する。この抗体を前以て
加水分解した臭化シアン活性化セファローズ（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ）４Ｂビーズ［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）］に製造業者のインストラクションに従いカッ
プリングする。７ｍｌのビーズで構成したカラムをＰＢ
Ｓ、０．０２％のアジドの中で４℃において貯蔵する。
【００５７】ＲＳＶ感染した細胞リゼイトをカラムに１
０ｍｌ／時で４℃において適用する。試料の適用後、カ
ラムを０．１％のトリトンＸ−１００を含有する５００
ｍｌのＰＢＳで洗浄する。カラムに結合したタンパク質
を０．１ＭのグリシンｐＨ２．５、０．１％のトリトン
Ｘ−１００で６ｍｌ／時で溶離する。溶離の試料をトリ
スでｐＨ７．０に緩衝化し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より分析する。ポリペプチドの試料をプールし、ＰＢＳ
に対して透析し、そして−７０℃において貯蔵する。
【００５８】ポリペプチドの切断 モノクローナル抗体を免疫原性ポリペプチドに結合する
その能力について、放射線免疫沈澱またはＥＬＩＳＡ分
析により、試験することができる。Ｔ細胞を免疫原性ポ
リペプチドに対する反応性についてＣＴＬまたはＬＰア
ッセイにより試験することができる。
【００５９】エピトープをマッピングするために、その
ポリペプチドに沿った種々の領域に相当する合成ポリペ
プチドを調製する。次いで、これらの合成ポリペプチド
を担体のタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘ
モシアニン（ＫＬＨ）にカップリングし、次いで別々に
を使用してウサギを免疫化する。ウサギの中で生産され
た抗血清は、その抗血清を誘発する免疫原に相当するカ
ップリングしない合成ペプチドと反応するであろう。
【００６０】次いで、精製されたポリペプチドを種々の
条件下にタンパク質分解的に切断する。例えば、酵素は
（１）リジンおよびアルギニンの残基の後において特異
的に切断するトリプシン、（２）アルギニン残基の後に
おいて特異的に切断するエンドプロテイナーゼＡｒｇ−
ｃ、および（３）リジン残基の後において特異的に切断
するエンドプロテイナーゼＬｙｓ−ｃであることができ
る。残基後の切断は残基のカルボキシル末端におけるペ
プチド結合の破壊を意味する。プロテアーゼの他の組み
合わせを使用することができることを理解すべきであ
る。したがって、現在例示する組み合わせは本発明の限
定として解釈すべきではない。また、切断はモノクロー
ナル抗体の存在下または不存在下に実施することができ
る。
【００６１】切断されたタンパク質断片をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分離し、そして切断生成物をウェスタンブロ
ット分析によりモノクローナル抗体ならびに抗合成ポリ
ペプチド抗体に結合する能力について分析する。あるい
は、切断された断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、
そしてゲルから溶離するか、あるいは大きさ排除カラム
により分離し、そして細胞仲介応答を刺激する能力につ
いて、例えば、ＬＰアッセイを使用して、分析する。ポ
リペプチド内のタンパク質分解の断片の位置を、これら
の切断断片と抗合成ポリペプチド抗血清との反応性から
推定する。最後に、断片の分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
おけるその移動度により決定することができる。
【００６２】切断断片の位置とモノクローナル抗体に対
するこれらの断片の反応性との間の関係あるいは細胞仲
介応答についてのアッセイ、例えば、ＬＰアッセイにお
ける関係を分析し、そして抗体または細胞の反応性によ
り定められたＲＳＶの免疫原性エピトープを決定する。
【００６３】ポリペプチドのクローニングおよび発現 ポリペプチドをエンコードする核酸の領域を制限エンド
ヌクレアーゼの消化によりクローニングベクターから切
除し、そして適合性発現ベクターの中に結合する（前掲
参照）。発現された組み換えタンパク質をまず自然のポ
リペプチドに対するポリクローナルウサギ抗血清との反
応性についてスクリーニングして組み換え断片を同定
し、次いで適当なモノクローナル抗体との反応性につい
てスクリーニングして、あるいはＣＴＬまたはＬＰアッ
セイにおいて、免疫原性エピトープからなる断片を同定
する。
【００６４】抗原性ポリペプチド 前述したように同定された免疫原性エピトープの同定を
確証するために、とくにＲＳＶのポリペプチドのアミノ
酸残基に相当する合成ポリペプチドを調製することがで
きる。ペプチドを適当なモノクローナル抗体に対する反
応性について、か、あるいはＣＴＬまたはＬＰアッセイ
において、分析する。
【００６５】ＲＳＶに関係するタンパク質およびポリペ
プチドおよびペプチドの調製 本発明のタンパク質およびポリペプチドは広範な種類の
方法で調製することができる。ポリペプチドは、比較的
短い大きさをもつために、普通の技術に従い、溶液の中
であるいは固体の支持体上で合成することができる。種
々の自動化合成装置は商業的に入手可能であり、そして
既知のプロトコルに従い使用することができる。参照、
例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、１９８４、
固相のペプチドの合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、第２版、Ｐｉｅｒ
ｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．。ポリペプチドの構造
的性質（その３次元の立体配置は１つである）は、小さ
い数の修飾、例えば、１または２以上のアミノ酸の置
換、挿入および欠失の導入により小さく変化させること
ができる。一般に、ポリペプチドのアミノ酸配列のこの
ような置換は２０％より小さく、より通常１０％より小
さい量である。一般に、保存的置換は非保存的置換より
も有意な構造的変化を発生せいず、非保存的置換は挿入
または欠失より大きい構造的変化をつくる。保存的置換
の例は次の通りである：グリシン／アラニン；バリン／
イソロイシン；アスパラギン酸／グルタミン酸；アスパ
ラギン／グルタミン；セリン／スレオニン；リジン／ア
ルギニン；フェニルアラニン／スレオニン；および上の
逆。したがって、ＲＳＶのポリペプチドのエピトープが
未変化に止まるかぎり、本発明は修飾されたポリペプチ
ドを包含することを理解すべきである。
【００６６】また、ウイルスのエピトープは株対株の変
動を示すことができることはよく知られている。上に示
した修飾による調節は事実有利に使用することができ
る。
【００６７】本発明のポリペプチドは、それらの使用に
依存して、標識された化合物または標識されない化合物
として使用することができる。標識とは、検出可能なシ
グナルを直接または間接的に提供する部分を意図する。
種々の標識、例えば、放射性ヌクレオチド、酵素、蛍光
体、化学発光体、酵素の基質、コファクターまたは阻害
因子、粒子（例えば、磁性粒子）、リガンド（例えば、
ビオチン）およびレセプター（例えば、アビジン）など
を使用することができる。さらに、ポリペプチドは表面
に結合する種々の方法で、例えば、マイクロタイタープ
レート、ガラスビーズ、クロマトグラフの表面、例え
ば、紙、セルロースなどで修飾することができる。ペプ
チドを他の化合物または表面に接合する特定の方法は普
通であり、そして文献に十分に例示されている。参照、
例えば、米国特許第４，３７１，５１５号、米国特許第
４，４８７，７１５号およびその中に引用されている特
許。あるいは、組み換えＤＮＡ技術を使用してポリペプ
チドを生合成的に調製することができる。
【００６８】組み換えＤＮＡ技術および遺伝子の発現 組み換えＤＮＡ技術は、特定のＤＮＡ配列をＤＮＡベヒ
クル（ベクター）の中に挿入して、宿主細胞の中で複製
することができる組み換えＤＮＡ分子を形成することを
包含する。一般に、しかし必ずしもことは必要ではない
が、挿入されたＤＮＡ配列はレセプターのＤＮＡベヒク
ルに対して外来である、すなわち、挿入されたＤＮＡ配
列およびＤＮＡベクターは遺伝情報を変化しない性質を
もつ生物から誘導されるか、あるいは挿入されたＤＮＡ
配列は完全にまたは部分的に人工的であることができる
情報からなる。組み換えＤＮＡ分子の構成を可能とす
る、いくつかの一般的方法が開発された。例えば、米国
特許第４，２３７，２２４号（ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙ
ｅｒ）は、ＤＮＡを制限酵素で切断しそしてＤＮＡ片を
既知の結合法により接合する方法を使用して、このよう
な組み換えプラスミドを生産することを記載している。
【００６９】次いで、これらの組み換えプラスミドを形
質転換またはトランスフェクションにより導入し、そし
て組織培養で成長させた原核生物および真核生物の細胞
を包含する単細胞の培養物の中で複製させる。その中に
記載された技術の一般的適用可能性のために、米国特許
第４，２３７，２２４号の開示をここに引用によって加
える。組み換えＤＮＡ分子を単細胞の生物の中に導入す
る他の方法は米国特許第４，３０４，８６３号（Ｃｏｌ
ｌｉｎｇおよびＨｏｈｎ）（また、その開示をここに引
用によって加える）に記載されている。この方法はパッ
ケージング、バクテリオファージのベクター（コスミ
ド）を使用する形質導入を利用する。
【００７０】また、核酸配列を本発明のウイルス、例え
ば、ワクシニアウイルスまたは突然変異体のウイルスま
たはそのｃＤＮＡクローンの中に挿入することができ
る。このような組み換えウイルスは、例えば、プラスミ
ドのトランスフェクションあるいはウイルスで感染した
細胞の中へのバキュロウイルスの同時形質転換により発
生させることができる（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、１
９８５）。
【００７１】構成のために使用する方法に無関係に、組
み換えＤＮＡ分子は好ましくは宿主細胞と適合性であ
る、すなわち、宿主の染色体の一部分としてあるいは染
色体外の要素として宿主細胞の中で複製することができ
る。好ましくは、組み換えＤＮＡ分子または組み換えウ
イルスは、原核生物の構造遺伝子による所望の組み換え
ＤＮＡ相（すなわち、正しいリーディングフレームで）
の選択を可能とするマーカー機能を有する。このハイブ
リッドの発現は組み換えタンパク質生産物（原核生物お
よび外来アミノ酸配列のハイブリッドであるタンパク
質）を生ずる。
【００７２】真核生物の系の中の遺伝子の発現の同様な
考察は、次の文献に記載されている：エンハンサーおよ
び真核生物の遺伝子の発現（Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ＆
Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ
ｎ）、ＧｌｕｚｍａｎおよびＳｈｅｎｋ（編）、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（ＣｏｌｄＳ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、
コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク、１９８３、およ
び真核生物のウイルスのベクター（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉ
ｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ）、Ｇｌｕｚｍａｎ
（編）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨー
ク、１９８２。
【００７３】クローニングされた遺伝子の首尾よい発現
は、効率よいＤＮＡの転写、ｍＲＮＡの翻訳およびある
場合においてタンパク質の翻訳後の修飾を必要とする。
クローニングされた遺伝子からのタンパク質の生産を増
加するために、発現ベクターが開発されてきている。発
現ベクターにおいて、クローニングされた遺伝子はしば
しば強いプロモーターの次に配置され、このプロモータ
ーは必要なときに転写を開始することができるようにコ
ントロール可能である。細胞を高い密度に成長させるこ
とができ、次いでプロモーターを誘発させて転写体の数
を増加することができる。これらは、効率よく翻訳され
る場合、タンパク質の高い収量を生ずるであろう。外来
タンパク質が宿主細胞に対して有害である場合、これは
ことに価値がある系である。
【００７４】ＲＳＶのゲノムの配列の決定 ウイルスのｍＲＮＡのｃＤＮＡのコピーを配列しそして
精製したウイルスのＲＮＡの５’および３’末端を配列
することによって、ＲＳＶのゲノムの核酸配列を決定す
る。遺伝子間の領域は「リードスルー」ウイルスｍＲＮ
Ａからか、あるいはゲノムのウイルスのＲＮＡのポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により配列決定する。ＲＳＶ
Ａ２株のゲノムの配列の決定はＣｏｌｌｉｎｓ（１９
９１）により記載された。
【００７５】ウイルスのｍＲＮＡによりエンコードされ
る領域（例えば、Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｇ、Ｆ、Ｍ、Ｍ２（２２
Ｋ）、ＳＨ、１Ｂおよび１Ｃタンパク質をエンコードす
る領域）を配列決定するために、ウイルスのｍＲＮＡを
ＲＳＶ感染したＶｅｒｏ細胞の培養物からオリゴ−ｄＴ
カラムを使用して精製する。ｍＲＮＡの精製のためのプ
ロトコルおよびキットは商業的に入手可能であり、例え
ば、インビトロンゲン（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）のフ
ァーストトラック（Ｆａｓｔ ＴｒａｃｋR）キットで
ある。精製されたポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを使用して、当
業者によく知られている技術および商業的に入手可能な
キット、例えば、インビトロンゲン（Ｉｎｖｉｔｏｒｏ
ｇｅｎ）のリブラリア（ＬｉｂｒａｒｉａｎR）ＩＩｃ
ＤＮＡライブラリー構成系により、能力大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）（例えば、ＤＨ５ａ株）の中でｃＤＮＡライブ
ラリーをつくる。コロニーフィルターハイブリダイゼー
ション（ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓ、１
９７５）によりＲＳＶのｍＲＮＡに対して特異的なハイ
ブリダイゼーションプローブを使用して、アンピシリン
耐性のバクテリアのコロニーをスクリーニングする。こ
れらのプローブは放射線標識したＲＳＶの配列であり、
そして合成されたポリペプチドまたはＲＳＶから前以て
クローニングされた遺伝子の部分から成る。ハイブリダ
イゼーションプローブを構成しそして放射線標識する方
法は当業者によく知られており、そして商用キット、例
えば、ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の５’末端標識キットまたはラ
ンダムプライムドＤＮＡ標識キットは入手可能である。
ウイルスの配列を含有する（組み換えプラスミドの中
に）として同定されたによりバクテリアのコロニーを使
用してプラスミドＤＮＡを増幅し、次いでこれをサンガ
ー（Ｓａｎｇｅｒ）（１９７７）のジデオキシヌクレオ
チド方法によるか、あるいは自動化ＤＮＡ配列決定装置
（例えば、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の自動化配列決定装置お
よびＴａｑ ＤｙｅＤｅｏｘｙRターミネーターサイク
ル配列決定キット）を使用することによって配列決定す
る。ウイルスのゲノムのＲＮＡのいくつかの遺伝子間領
域は、「リードスルー」ウイルスの配列を有するクロー
ンを含有するバクテリアのコロニーにおいて同定され、
前記ウイルスの配列は隣接するウイルスの遺伝子からの
ＤＮＡプローブとハイブリダイゼーションし、そしてこ
れらの隣接する遺伝子およびこれらの遺伝子の間の非解
読領域の両者または一部分を含有する。３’末端は１Ｃ
のｍＲＮＡからの「リードスルー」として見ることがで
きる。これらの領域は前述したように配列決定する。
【００７６】精製されたゲノムのウイルスのＲＮＡを使
用して、ウイルスのｍＲＮＡにおいてエンコードされな
いウイルスの領域の配列、例えば、５’および３’非解
読領域および前述したようにして得られなかった遺伝子
間の配列を決定することができる。ゲノムのウイルスの
ＲＮＡを、次のようにしてＨｕａｎｇおよびＷｅｒｔｚ
（１９８２）の方法により精製する。ウイルスが感染し
たＶｅｒｏ細胞を急速凍結−融解により溶解し、そして
リゼイトを低速遠心により清浄にする。ウイルスをリゼ
イトから超遠心により沈澱させ、次いで超音波処理によ
り再懸濁させ、そして１０〜５０％の直線のスクロース
勾配で遠心する。可視のウイルスのバンドを集め、超音
波処理し、そして２０〜６０％のスクロース勾配で再バ
ンド化する。可視のウイルスのバンドを集め、超音波処
理し、そしてゲノムのウイルスのＲＮＡをフェノール抽
出により分離し、そしてエタノール沈澱により回収す
る。５’末端の配列は、ゲノムのウイルスのＲＮＡの
５’末端のジデオキシヌクレオチドの配列決定により決
定することができる。３’末端の配列は、３え標識した
ウイルスのＲＮＡの直接の化学的配列の分析により決定
することができる。あるいは、逆転写酵素および鋳型と
して陰性の鎖のゲノムのウイルスのＲＮＡを使用して、
抗ゲノムの極性の５’末端標識したオリゴヌクレオチド
を使用するプライマー伸長により、５’末端を決定する
ことができる。この反応からの生成物をゲル精製し、そ
して塩基特異的切断のＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ
（１９８０）技術により直接配列決定する。他の方法に
より得られなかった内部の配列（例えば、遺伝子間配
列）を配列決定するために、ＰＣＲを使用することがで
きる。この方法を使用するために、ウイルスのＲＮＡを
逆転写して最初のＤＮＡ鋳型を形成し、問題の領域のい
ずれかの側の反対の極性の鎖とハイブリダイゼーション
するオリゴヌクレオチドのプライマーを合成し、そして
その領域をＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ生成物は直接
配列決定することができるか、あるいはプラスミドのベ
クターの中に結合し、次いで配列決定することができ
る。
【００７７】いくつかの組み換えＤＮＡの発現系を例示
の目的でのみ下に記載し、そしてこれらの実施例は本発
明の範囲を限定すると解釈すべきではない。
【００７８】発現ベクターとしての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ） 多数の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のプラスミドは知られて
おり、そして外来遺伝子の発現に使用されてきている。
経済的理由で、高いレベルの発現を得るすることができ
ることは高度に好ましい。大量の所定の遺伝子生産物を
得る１つの方法は、バクテリアの細胞内に非常に高いコ
ピー数を有するプラスミド上で遺伝子をクローニングす
ることである。特定の遺伝子のコピー数を増加すること
によって、ｍＲＮＡのレベルは通常また増加し、これは
引き続いて所望のタンパク質の生産の増加に導くであろ
う。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して有害であるタンパ
ク質の配列を遺伝子のある領域がエンコードする場合、
このような領域を核酸から欠失させ、そして残りの核酸
はより短いポリペプチドをエンコードするであろう。
【００７９】発現ベクターとしてのワクシニアウイルス ワクシニアウイルスをクローニングおよび発現のベクタ
ーとして使用することができる。このウイルスはほぼ１
８７ｋｂの対の線状の二本鎖ＤＮＡゲノムを含有し、そ
して感染した細胞の細胞質内で複製する。これらのウイ
ルスはウイルスのコア内に完全な転写の酵素合成（キャ
ピング、メチル化およびポリアデニル化の酵素を含む）
を含有する。この系はウイルスの感染性のために必要で
ある。なぜなら、ワクシニアウイルスの転写調節配列
（プロモーター）は、細胞のＲＮＡポリメラーゼによら
ないで、ワクシニアのＲＮＡポリメラーゼにより転写を
開始させることができるからである。
【００８０】組み換えウイルスの中の外来ＤＮＡの発現
は、ワクシニアのプロモーターが外来遺伝子のタンパク
質の解読配列に融合することを必要とする。キメラ遺伝
子をワクシニアウイルスの中に挿入するために、プラス
ミドベクター（また、挿入ベクターと呼ぶ）が構成され
た。挿入ベクターの１つのタイプは、次のものからな
る：（１）転写開始に示すを含むワクシニアウイルスの
プロモーター；（１）外来ＤＮＡ断片の挿入のための転
写開始部位から下流のいくつかの独特制限エンドヌクレ
アーゼクローニング部位；（３）ウイルスのゲノムの相
同性の不必要な領域の中へのキメラ遺伝子の挿入を指令
するクローニング部位およびプロモーターをフランキン
グする非必須のワクシニアウイルスのＤＮＡ（例えば、
チミジンキナーゼ遺伝子）；および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）の中の複製および選抜のための複製のバクテリア由
来および抗生物質耐性マーカー。このようなベクターの
例はＭａｃＫｅｔｔ（１９８４）により記載されてい
る。
【００８１】組み換えウイルスは、外来遺伝子を含有す
る組み換えバクテリアの挿入ベクターをワクシニアウイ
ルスで感染した細胞の中にトランスフェクションするこ
とによって生産される。相同性組み換えは感染した細胞
内で起こり、そしてウイルスのゲノムの中への外来遺伝
子の挿入を生ずる。参照、例えば、米国特許第４，６０
３，１１２号、その内容をここに引用によって加える。
免疫学的技術、ＤＮＡプラークのハイブリダイゼーショ
ン、または遺伝学的選抜を使用して、所望の組み換えウ
イルスを同定および分離することができる。これらのワ
クシニアの組み換え体は、感染性のために必須な機能を
保持し、そしてほぼ３５ｋｂまでの外来ＤＮＡを収容す
るように構成することができる。
【００８２】外来遺伝子の発現は、酵素または免疫学的
アッセイ（例えば、免疫沈澱、酵素結合免疫収着アッセ
イ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、またはイム
ノブロッティング）により検出することができる。さら
に、組み換えワクシニアで感染した細胞から生産された
天然に存在する膜の糖タンパク質をグリコシル化し、そ
して細胞表面に輸送することができる。高い発現レベル
は、強いプロモーターを使用するか、あるいは単一の遺
伝子の多数のコピーをクローニングすることによって得
ることができる。
【００８３】発現ベクターとしてのバキュロウイルス また、ポリオウイルスを発現ベクターとして突然変異体
のＲＳＶの遺伝学的配列（例えば、免疫原性ポリペプチ
ド）のために使用する。このウイルスは７．５ｋｂの陽
性の極性の線状の一本鎖ＲＮＡゲノムを含有し、そして
感染した細胞の細胞質内で複製する。
【００８４】全長のポリオウイルスｃＤＮＡは感染性で
あることが発見された。このようなポリオウイルスのｃ
ＤＮＡクローンを、米国特許第４，７１９，１７７号
（その開示をここに引用によって加える）に従い構成
し、そしてウイルスの生産に使用する。外来ＤＮＡを感
染性ポリオウイルスｃＤＮＡ内に組み込んで、変更され
たウイルス粒子を生産することができる。例えば、抗原
性部位１が他の病原体のエピトープを表すように、ポリ
オウイルスは遺伝学的に変更された（ＲｏｓｅおよびＥ
ｖａｎｓ、１９９１）。
【００８５】このようなキメラのウイルスは２つの方法
により構成された。Ｂｕｒｋｅら（１９８８）により記
載されているように、抗原性部位１（ＮＡｇ−１）をエ
ンコードするＶＰ１の領域を含むポリオウイルスの感染
性ｃＤＮＡクローンの便利な制限断片をファージＭ１３
ｍｐ１８の中にサブクローニングする。ＮＡｇ−１のた
めの解読領域が外来エピトープ配列により置換されるよ
うに、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用し
て突然変異された断片を生成する。この突然変異の断片
を使用して全長のｃＤＮＡを構成する。Ｂｕｒｋｅら
（１９８９）の他の方法に従い、全長の感染性ｃＤＮＡ
を修飾して、ＮＡｇ−１をエンコードするＶＰ１の領域
が独特制限エンドヌクレアーゼ部位によりフランキング
されているカセットのベクターをつくる。次いで、ＮＡ
ｇ−１部位は外来配列をエンコードする相補的オリゴヌ
クレオチドで容易に置換することができる。
【００８６】細胞を修飾された全長のポリオウイルスｃ
ＤＮＡでトランスフェクションすることによって、変更
されたウイルス粒子を生産する。ゲノムＲＮＡの配列の
分析を使用して、回収されたウイルスが外来配列を含有
することを確証することができる。
【００８７】外来配列の発現は免疫学的アッセイ（例え
ば、免疫沈澱、中和、ＥＬＩＳＡ）により検出すること
ができる。
【００８８】発現ベクターとしてのバキュロウイルス バキュロウイルス、例えば、オートグラフィカ・カリフ
ォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒ
ｎｉｃａ）の核のポリヘドリス（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉ
ｓ）ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、また、クローニングま
たは発現のベクターとして使用することができる。感染
性形態のＡｃＮＰＶは通常ウイルスの吸蔵物の中に見い
だされる。この構造体はおおまかにポリヘドリンポリペ
プチドから構成され、この中にウイルス粒子は埋め込ま
れている。ポリヘドリン遺伝子の発現は感染サイクルの
非常に遅い時期に、成熟ウイルス粒子が形成した後に、
起こる。したがって、ポリヘドリン遺伝子の発現は必ず
しも必要でない機能である、すなわち、ポリヘドリン遺
伝子の発現の不存在下に生産された吸蔵されないウイル
ス粒子は完全に活性であり、そして培養中の細胞を感染
することができる。欧州特許出願第８４１０５８４１，
５号（Ｓｍｉｔｈら）に従い、組み換えバキュロウイル
スの発現ベクターを２工程で調製することができる。第
１に、バキュロウイルスのＤＮＡを切断して、ポリヘド
リン遺伝子またはその部分からなる断片を生成し、この
断片をクローニングベヒクルの中に挿入する。発現すべ
き遺伝子をまたクローニングベヒクルの中に挿入する；
そして、それがポリヘドリン遺伝子プロモーターのコン
トロール下にあるように、それを挿入する。この組み換
え分子を組み換え転移ベクターと呼ぶ。通常、この組み
換え転移ベクターを適当な宿主細胞の中で増幅する。第
２に、このようにして形成した組み換え転移ベクターを
バキュロウイルスのヘルパーＤＮＡと混合し、そして培
養中の昆虫細胞をトランスフェクションして、バキュロ
ウイルスのゲノムのポリヘドリン遺伝子位置においてク
ローニングされた遺伝子の組み換えおよび組み込みを実
施する。生ずる組み換えバキュロウイルスを使用して、
感受性の昆虫細胞または培養した昆虫細胞を感染させ
る。
【００８９】発現ベクターの中へのＲＳＶのポリペプチ
ドの解読配列の挿入 そのＲＳＶのポリペプチドまたはＲＳＶのポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列を、適当な発現ベクタ
ー、すなわち、挿入されたタンパク質の解読配列の転写
および翻訳のために必要な要素を含有するベクターの中
に挿入することができる。本発明の好ましい実施態様に
従い、免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列を適当な発現ベクターの中に挿入する。解読配列は
５’または３’末端または両者の末端において伸長し
て、ポリペプチドを生合成的に伸長すると同時にエピト
ープを保持させることができる。この伸長は、例えば、
標識、担体または表面への、結合のためのアームを提供
することができる。この伸長は、そうでなければ本発明
のより短い抗原性ポリペプチドのあるものにおいて欠如
することがある免疫原性を提供することができる。
【００９０】種々の宿主−ベクター系を利用して、タン
パク質を解読する配列を発現することができる。これら
は次のものを包含するが、これらに限定されない：哺乳
動物細胞の培養物、例えば、チャイニーズハムスター卵
巣細胞の宿主培養物など；ウイルス（例えば、ワクシニ
アウイルス、アデノウイルスなど）で感染した哺乳動物
細胞細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で
感染した昆虫細胞系；微生物、例えば、酵母菌のベクタ
ーを含有する酵母菌またはバクテリオファージのＤＮ
Ａ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換
されたバクテリア。１つの実施態様において、発現ベク
ターは弱毒化された腸侵入性バクテリア、例えば、サル
モネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｓｐｐ．、腸侵入性
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＩＥＣ）および赤痢菌属
（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ｓｐｐ．であることができる。こ
のようなバクテリアは消化管の内皮組織に侵入し、網内
細胞系を通して散在し、そして腸間膜のリンパ様組織に
アクセスし、ここでそれらは増殖し、そして体液および
細胞仲介の免疫性を誘発する。これらのベクターの発現
要素はそれらの強度および特異性を変化させる。利用す
る宿主−ベクター系に依存して、ある数の適当な転写お
よび翻訳要素の任意の１つを使用することができる。例
えば、哺乳動物細胞系の中でクローニングするとき、哺
乳動物細胞のゲノムから分離されたプロモーター（例え
ば、マウスのメタロチオネインプロモーター）またはこ
れらの細胞の中で増殖するウイルスから分離されたプロ
モーター（例えば、ワクシニアウイルスの７．５Ｋのプ
ロモーター）を使用することができる。また、組み換え
ＤＮＡまたは合成の技術により生産されたプロモーター
を使用して、挿入された配列を転写することができる。
【００９１】挿入されたタンパク質解読配列の効率よい
翻訳のために、特定の開始シグナルを準備しなくてはな
らないことがある。これらのシグナルはＡＴＧ開始コド
ンおよび隣接する配列を包含する。それ自身の開始コド
ンおよび隣接する配列を含むＲＳＶのポリペプチド、Ｒ
ＳＶのキメラまたはＲＳＶの遺伝子を適当な発現ベクタ
ーの中に挿入する場合、追加の翻訳コントロールシグナ
ルは不必要であることがある。しかしながら、ＲＳＶの
ポリペプチドの配列の一部分のみを挿入する場合、ＡＴ
Ｇ開始コドンを含む、外因性翻訳コントロールシグナル
を準備しなくてはならない。開始コドンはさらにタンパ
ク質解読配列のリーディングフレームと同調して、全体
の挿入の翻訳を保証しなくてはならない。これらの外因
性翻訳コントロールシグナルおよび開始コドンは、天然
および合成の種々の由来であることができる。
【００９２】ＤＮＡ断片のベクターの中への挿入につい
て前述した方法の任意のものを使用して、適当な転写／
翻訳のコントロールシグナルおよびタンパク質解読配列
から成るキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構成す
ることができる。これらの方法はｉｎ ｖｉｔｒｏの組
み換えＤＮＡ技術および合成技術およびｉｎ ｖｉｖｏ
の組み換え（遺伝学的組み換え）を包含することができ
る。
【００９３】アデノウイルスを発現ベクターとして使用
する場合、突然変異体のＲＳＶのポリペプチドの遺伝子
をアデノウイルスの転写／翻訳のコントロール複合体、
例えば、後期のプロモーターおよび３部分リーダー配列
に結合する。次いで、このキメラ遺伝子をｉｎ ｖｉｔ
ｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの組み換えによりアデノウイ
ルスのゲノムの中に挿入する。ウイルスのゲノムの非必
須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）の中の挿入は、
生活可能でありそして感染した細胞の中でＲＳＶのポリ
ペプチドを発現することができる組み換えウイルスを生
ずるであろう。さらに、挿入された配列の発現を変調す
るか、あるいはキメラ遺伝子の生産物を所望の特定の方
法で修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択する
ことができる。ある種のポリメラーゼからの発現はある
種のインデューサー（例えば、メタロチオネインのプロ
モーターについて亜鉛イオンまたはカドミウムイオン）
の存在下に増大することができる。したがって、遺伝子
操作したＲＳＶのポリペプチドの発現をコントロールす
ることができる。クローニングされた外来遺伝子のタン
パク質生産物が宿主細胞に対して致死的である場合、こ
れは重要である。さらに、タンパク質生産物の修飾（例
えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切
断）はタンパク質の機能のために重要である。異なる宿
主細胞は、タンパク質の翻訳後のプロセシングおよび修
飾について特徴ある特定のメカニズムを有する。発現さ
れた外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを
保証するために、適当な細胞系または宿主系を選択する
ことができる。
【００９４】挿入された遺伝子を複製および発現できる
組み換え発現ベクターの同定 外来遺伝子のインサートを含有する発現ベクターは３つ
の一般的アプローチにより同定か：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮ
Ａのハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝
子の機能の存在または不存在、および（ｃ）の挿入され
た配列の発現。第１のアプローチにおいて、発現ベクタ
ーの中に挿入された外来遺伝子の存在は、外来の挿入さ
れた遺伝子に対して相同性である配列からなるプローブ
を使用するＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによ
り検出することができる。第２のアプローチにおいて、
組み換えベクター／宿主系は、ベクターの中の外来遺伝
子の挿入により引き起こされた、ある種の「マーカー」
遺伝子の機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物
質に対する耐性、形質転換の表現型、バキュロウイルス
の中で吸蔵体の形成など）の存在または不存在に基づい
て同定および選択することができる。例えば、ＲＳＶの
遺伝子がベクターのマーカーグラム配列内に挿入される
場合、挿入されたＲＳＶのポリペプチドを含有する組み
換え体はマーカー遺伝子の機能の不存在により同定する
ことができる。第３のアプローチにおいて、組み換え体
により発現された外来遺伝子生産物をアッセイすること
によって、組み換え発現ベクターを同定することができ
る。このようなアッセイは遺伝子生産物の生理学的、免
疫学的または機能的性質に基づくことができる。
【００９５】いったん特定の組み換えＤＮＡ分子が同定
および分離されると、このような組み換え体が自己複製
単位（レプリコン）を構成するかどうかに依存して、い
くつかの方法を使用してそれを増殖することができる。
自己複製単位、例えば、プラスミド、ウイルス、細胞な
どは適当な細胞の環境および増殖の条件下にそれ自体増
殖することができる。自己複製単位を欠如する組み換え
体を、増殖するためにこのような単位を有する分子の中
に組み込まなくてはならないであろう。例えば、ある種
のプラスミドの発現ベクターは宿主細胞の中に導入した
とき、細胞の染色体の中に組み込んで、組み換え遺伝子
の増殖および安定な発現を確実にする必要がある。いっ
たん適当な宿主系および増殖の条件が確立されると、組
み換え発現ベクターを多量に増殖および調製することが
できる。
【００９６】発現された遺伝子生産物の同定および精製 いったんそのＲＳＶのポリペプチドを発現する組み換え
体が同定されると、遺伝子生産物を分析すべきである。
これは生産物の生理学的、免疫学的または機能的性質に
基づくアッセイにより達成することができる。究極の目
標がこのような生産物を発現する遺伝子生産物または組
み換えウイルスをワクチンの配合においておよび／また
は診断のイムノアッセイにおける抗原として使用するこ
とである場合、免疫学的アッセイはことに重要である。
【００９７】この生産物の免疫反応性を分析するために
種々の抗血清、例えば、後述する精製されたタンパク質
に対してレイズされたポリクローナル抗体を入手可能で
ある。
【００９８】タンパク質は、それが全体の遺伝子配列、
遺伝子配列の一部分のから生ずるか、あるいはキメラタ
ンパク質の生産を指令するように結合された２またはそ
れ以上の遺伝子配列から生ずるかどうかにかかわらず、
免疫反応性であるべきである。この反応性は標準の免疫
学的技術、例えば、放射線免疫沈澱、放射線競争、また
はイムノブロットにより実証することができる。
【００９９】いったんＲＳＶのポリペプチドが同定され
ると、それを分離し、そして標準の方法、例えば、クロ
マトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、および
大きさ規定カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、分
画可溶性によるか、あるいはタンパク質の精製のための
任意の標準の技術により精製することができる。
【０１００】医薬組成物の免疫潜在能力の決定 ＲＳＶに関係する生産物または医薬組成物の免疫潜在能
力は、上に同定したＲＳＶの生ウイルス突然変異体、ポ
リペプチドまたはキメラのポリペプチドのいずれかで免
疫化した後、被検動物の免疫応答をモニターすることに
よって決定することができる。ＲＳＶのポリペプチドを
感染性組み換えウイルスにより発現される場合におい
て、組み換えウイルスそれ自体を使用して被検動物を免
疫化することができる。被検動物は次のものを包含する
が、これらに限定されない：マウス、ラット（例えば、
コットンラット）、ウサギ、霊長類、例えば、アフリカ
ミドリザル、サル、チンパンジー、およびヒトの被検
体。免疫原性を導入する方法は、経口的、皮膚内、筋肉
内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内または任意の他の免疫
化の標準のルートを包含することができる。試験の被検
体の免疫応答は４つのアプローチにより分析することが
できる：（ａ）既知の技術、例えば、酵素結合免疫収着
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、イムノブロット、放射線免疫
沈澱などによりアッセイした、真性のＲＳＶ抗原に対す
る生ずる免疫血清の反応性、（ｂ）ｉｎｖｉｔｒｏでＲ
ＳＶウイルスの感染性を中和する免疫血清の能力、
（ｃ）ｉｎｖｉｔｒｏでウイルスの融合を阻止する免疫
血清の能力、および（ｄ）ＲＳＶの感染または有意な疾
患からの保護。
【０１０１】次のデータはワクチン組成物におけるＲＳ
ＶのＴＳ突然変異体の利用を実証する。コットンラット
のモデルにおけるワクチンの効能、およびアフリカミド
リザルのモデルにおけるワクチンの弱毒化、免疫原性、
および効能を証明する実験を記載する。
【０１０２】ｉ）コットンラットのモデル：追加の実験
をコットンラットにおいて実施して、相同性亜群の参照
株（ＲＳＶ１８５３７／亜群ＢおよびＲＳＶ Ａ２／亜
群Ａ）で対抗したとき、感染を防止するＲＳＶ ２Ｂお
よびＲＳＶ ３ＡのＴＳ突然変異体の効能を評価した。
コットンラット（８匹／群）を各ＲＳＶのＴＳ突然変異
体で鼻内接種した。鼻の鼻甲介および肺を、感染後４日
に、４匹のラット／群からウイルスの滴定のために収獲
した。感染後６週に、残りのラットを中和力価およびＥ
ＩＡ−Ｆ力価のために採血して、次いで適当な参照ＲＳ
Ｖ株で対抗した。対抗後４日に、鼻の鼻甲介および肺を
ウイルスの滴定のために除去した。結果を表１４および
１５に示す。前述しそして表１２に示すように、すべて
の４つのＲＳＶ ２ＢのＴＳ突然変異体の増殖は、親の
ＲＳＶ ２Ｂ株に比較して、非常に劣っていた。ＲＳＶ
２Ｂｐ３３ＦおよびＲＳＶ ２Ｂｐ２４Ｇにより引き
出された中和およびＥＩＡ抗体の力価はウイルスの回収
が劣っていいるにかかわらず相対的高く、両者の突然変
異体について中間のレベルの弱毒化を多分示す。ウイル
スの対抗に対する保護のレベルは、中和性抗体の応答の
レベルを反映し、そしてＲＳＶ ２Ｂｐ３３ＦおよびＲ
ＳＶ ２Ｂｐ２４Ｇについて高く、ＲＳＶ ２Ｂｐ２０
Ｌについて中程度であり、そしてＲＳＶ ２Ｂｐ３４Ｌ
について無効であった。すべてのＲＳＶ３Ａは鼻の鼻甲
介の中で増殖したが、肺の中の増殖において高いレベル
の弱毒化を実証した。中和性抗体およびＥＩＡ抗体の力
価は高く、そしてすべてのラットはウイルスの対抗に対
して完全に保護された。
【０１０３】結果が証明するように、弱毒化された株の
増殖はウイルスの対抗に対する保護の免疫性を引き出
し、これらの株がワクチンとして有用でありうることを
示唆した。ＲＳＶ ２Ｂｐ３４Ｌ株で保護に対するワク
チン接種が不可能である原因は、その高いレベルの弱毒
化のためにウイルスが増殖することができなかったこと
にある可能性が最も強かった。コットンラットはヒトよ
りも感受性が低いので、この株が保護できないことはＲ
ＳＶ ２Ｂｐ３４Ｌがヒトにおいて無効のワクチンであ
ることを意味しないであろう。
【０１０４】ｉｉ）アフリカミドリザルのモデル：ＴＳ
突然変異体の株ＲＳＶ ２Ｂｐ３３Ｆ、ＲＳＶ ２Ｂｐ
２４Ｇ、ＲＳＶ２Ｂｐ２０Ｌ、ＲＳＶ ３Ａｐ２０Ｅ、
ＲＳＶ ３Ａｐ２０ＦおよびＲＳＶ ３Ａｐ２８Ｆの増
殖、免疫原性、および効能をアフリカミドリザル（ＡＧ
Ｍ）において評価した。ＡＧＭはヒトＲＳＶによる感染
に対してコットンラットよりも感受性であり、そして感
染の特性は、系統発生学的関係がより近いために、ヒト
において見られるものに関係付けることができる。２頭
のチンパンジーの各々に、１０6ＰＦＵの各突然変異体
のウイルスを、鼻内および気管内のルートの組み合わせ
により接種した。鼻の洗浄液および気管支の洗浄液によ
り、ウイルスの増殖を評価した。中和性抗体およびＥＩ
Ａ抗体の応答を、感染後ほぼ０、１、２、３、４、６お
よび８週に試験した。感染後８週に、動物を１０6ＰＦ
Ｕの親の株で鼻内および気管内のルートにより対抗させ
た。ウイルスの増殖および抗体の応答を前述したように
評価した。
【０１０５】親のＲＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ３Ａの株
の増殖を図８および図９において見るすることができ
る：ワクチンの対照。両者のウイルスの株は鼻および肺
の両者において高い力価に増殖した。ウイルス性肺炎の
鼻の分泌物およびラジオグラフの証拠はＲＳＶ ２Ｂで
感染した１頭の対照サル（０３２Ｂ）において見られ、
ＲＳＶがＡＧＭにおいて疾患を引き起こすことができる
ことを証明する。これらの結果はＡＧＭ／コットンラッ
トのモデルにおける感染のこれらの特性の差を確証し、
コットンラットにおいて疾患は観察されず、そしてＲＳ
Ｖ ３Ａは肺の中で複製することができなかった。４頭
のサルのうちで３頭においてＲＳＶの親の株が疾患を引
き起こすことができなかったことは、ＡＧＭがヒトのよ
うに感受性の宿主でないことを示唆する。
【０１０６】ＲＳＶ ２ＢのＴＳ突然変異体で感染し、
次いで親の株で対抗した各サルについてのウイルスの力
価を図８に示す。ＲＳＶ ２Ｂｐ３３Ｆは２頭のサルの
うちで１頭において洗浄液の中で低いレベルに増殖し、
ＲＳＶ ２Ｂｐ２４Ｇは両者のサルにおいて洗浄液およ
び肺の中で低いレベルに増殖した。ＲＳＶ ２Ｂｐ２０
Ｌは増殖することができなかった。ＲＳＶ ２ＢのＴＳ
突然変異体が増殖したＡＧＭにおいて、サルは親の株を
使用する対抗に対して部分的ないし完全に保護された。
表１６および表１７は、各サルについてワクチン接種後
（表１６）およびウイルス対抗後（表１７）に得られた
抗体の滴定の結果を示す。これらの結果が示すように、
ウイルスが増殖したサルにおいて、感染後２．５週まで
に低いレベルの中和性抗体およびＥＩＡ抗体の力価が見
られた。親の株で対抗後、血清変換できなかったワクチ
ン接種した動物におけるか、あるいはワクチン接種しな
い動物においてより、対抗前に抗体の力価をもつワクチ
ン接種したサルにおいて、抗体の力価は完全に１週早く
増大した。これが証明するように、これらのＴＳ突然変
異体を使用するワクチン接種は免疫系をプライミングし
かつウイルスの対抗に対する保護を引き出すために十分
であった。これらのサルはヒトほど感染に対して感受性
ではないので、弱毒化されたウイルスが増殖しそして効
率よく免疫化することができなかったことは、ウイルス
が完全に感受性の宿主（すなわち、血清反応陰性のヒト
の乳児）において無効であろうことを意味しない。
【０１０７】ＲＳＶ ３ＡのＴＳ突然変異体で感染しそ
して親の３Ａ株で対抗したＡＧＭにおけるウイルスの増
殖は図９に示されている。すべての３つのＲＳＶ ３Ａ
のＴＳ突然変異体の株は、最大から最小の順序で、増殖
のとき弱毒化された：３Ａｐ２８Ｆ＞３Ａｐ２０Ｅ＞３
Ａｐ２０Ｆ。すべての３つのＴＳ突然変異体を使用する
ワクチン接種は、ウイルスの対抗に対してきわめてすぐ
れた保護を与えた。ＲＳＶ ３ＡのＴＳ突然変異体でワ
クチン接種したサルについての抗体の応答は表１８に示
されており、そしてウイルスの対抗後の応答は表１９に
示されている。すべてのワクチン接種したＡＧＭにおい
て、ＲＳＶ ３Ａｐ２８Ｆを与えた１頭のサルを除外し
て、中和性抗体およびＥＩＡ抗体の低いレベルの力価が
ワクチン接種後３週から検出された。親の株で対抗後、
ワクチン接種したサルはワクチン接種しない対照よりも
完全に１週だけ早く促進し、そして感染に対して完全に
または部分的に保護され、ワクチン接種が免疫応答をプ
ライミングし、そして保護的であることを証明する。こ
れは抗体の応答がワクチン接種後検出されなかった１頭
のＡＧＭを包含し、血清の抗体の応答の測定が保護的免
疫性のレベルを完全には表さないことを示す。
【０１０８】ＡＧＭの研究からの結果が再び証明するよ
うに、すべての６つのＴＳ突然変異体は弱毒化された。
このサルの中で複製することができる突然変異体を使用
するワクチン接種は、対抗ウイルスによる感染の防止に
おいて有効であった。
【０１０９】弱毒化の程度：ＲＳＶのＴＳ突然変異体で
あるＴＳ−１をブリア・マーフィイ（ＢｒｉａｎＭｕｒ
ｐｙ）博士、ＮＩＨ、から入手した。このＴＳ突然変異
体は本来ＲＳＶＡ２株から化学的突然変異誘発により誘
導され、そして臨床的試験において１９７０年代に血清
反応陰性のヒトの乳児において試験された。これらの試
験の帰結は、ＴＳ−１の弱毒化の程度が低く、そしてＴ
Ｓ−１が乳児において許容されないｌｆｌの疾患（鼻炎
および中耳炎）を引き起こすことを示唆した。さらに、
ＴＳ−１のＴＳ表現型はヒトにおける増殖後部分的に復
帰した。ＲＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ３ＡのＴＳ突然変
異体の増殖をＴＳ−１突然変異体の増殖と比較する実験
を実施して、ＲＳＶ ２ＡおよびＢの突然変異体の相対
的ｉｎ ｖｉｖｏ弱毒化のレベルを評価し、そしてこれ
らの２つの突然変異体および従来の臨床的試験において
他の研究者らが使用したものの間の差を証明することを
試みた。コットンラットの研究の結果を表２０に示し、
そして表１４および１５に示すコットンラットのデータ
と直接比較することができる。ＴＳ−１突然変異体は、
肺の中の増殖を比較すると最も明瞭に理解することがで
きるように、ＲＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ３ＡのＴＳ突
然変異体よりも弱毒化の程度が低かった。
【０１１０】アフリカミドリザル（ＡＧＭ）においてＴ
Ｓ−１をＲＳＶ ２Ｂｐ３３ＦおよびＲＳＶ ３Ａｐ２
８Ｆと比較する増殖の研究を実施し、そして結果を図１
０に示す。サルをウイルスで鼻内（ＴＳ−１および２Ｂ
ｐ３３Ｆ）または鼻内＋気管内（３Ａｐ２８Ｆ）感染さ
せた。２Ｂｐ３３Ｆで感染した４頭のサルのうちで１頭
および３Ａｐ２８Ｆで感染した４頭のサルのうちで２頭
においてウイルスが回収された。力価は両者の場合にお
いて比較的低く、ウイルスが弱毒化されたことを示す。
対照的に、比較的高い力価のウイルスがＴＳ−１で接種
したすべての４頭のサルにおいて回収された。４頭のサ
ルのうちの２頭において、ＴＳ−１の力価のレベルは野
生型ウイルスで感染したサルにおいて見られた力価に等
しかった。野生型ウイルスについて期待されるように、
ＴＳ−１は肺に広がらず、ＴＳ−１は多少弱毒化され
た。これらの結果が明瞭に示すように、ＲＳＶ ２Ｂｐ
３３ＦおよびＲＳＶ ３Ａｐ２８ＦはＴＳ−１と異なる
表現型の特性を有し、そして有意にいっそう弱毒化され
た。このより高い弱毒化はヒトの乳児に投与すべきワク
チンについて望ましい性質である。
【０１１１】モノクローナル抗体の分離 マウスのモノクローナル抗体の分離のために、８週齢の
マウスに生ＲＳＶを鼻内接種しおよび／または完全フロ
インドアジュバントの中で精製されたポリペプチドまた
は突然変異体のＲＳＶ１：１体積の約５０μｇを注射す
る。次いでマウスを１月の間隔でポリペプチドまたは突
然変異体のＲＳＶ、これと不完全フロインドアジュバン
トで促進することができる。次いで、記載されそして本
発明に関係する当業者に知られている手順に従い、脾細
胞を非分泌性骨髄腫細胞と融合する。多少の時間経過
後、ほぼ２週後、ハイブリドーマの上澄み液をポリペプ
チドに対する活性についてスクリーニングする。陽性の
クローンを分離し、そして増殖させる。
【０１１２】ヒトのモノクローナル抗体の分離は同様に
実施することができ、ただしＢ細胞は患者から分離し、
そしてエプスタイン−バー−ウイルス（ＥＢＶ）で形質
転換することができる。次いで、記載されそして本発明
に関係する当業者に知られている手順に従い、Ｂ細胞を
非分泌性骨髄腫細胞と融合する。多少の時間経過後、ほ
ぼ２週後、ハイブリドーマの上澄み液をポリペプチドま
たは突然変異体のＲＳＶに対する活性についてスクリー
ニングする。陽性のクローンを分離し、そして増殖させ
る。あるいは、米国特許第４，７２０，４５９号、米国
特許第４，６９３，９７５号または米国特許第４，５７
４，１１６号（それらの開示をここに引用によって加え
る）に記載されている方法を使用して、ヒトのモノクロ
ーナル抗体を調製することができる。これらのモノクロ
ーナル抗体は診断のアッセイおよび治療のために有用で
ある。
【０１１３】ウイルスの低温適応 この方法は、臨床的分離株から誘導された生ビルレント
ウイルス（ＲＳＶ）および初代アカゲザル腎細胞におい
て分離されたものを得ることからなる。次いで、これら
をＶｅｒｏ細胞の中で３５〜３６℃において継代し、そ
してプラーク精製した。好ましくは、Ｖｅｒｏ細胞はＶ
ｅｒｏ細胞の細胞系ＣＣＬ８１［アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐ
ｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣ
Ｃ）、米国マリイランド州２０８５２ロックビレ、パー
クローン１２３０１、から入手した］の継代１３３〜１
４８である。維持培地は好ましくは２％のＦＢＳ、Ｌ−
グルタミン、非必須アミノ酸および２０ｍＭのＨＥＰＥ
Ｓ、ｐＨ７．５を有するＭＥＭであり、そして凍結培地
は１０％のＦＢＳおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７．５を有するＭＥＭである。
【０１１４】Ｖｅｒｏ細胞のコンフルエントの単層を約
１．０ｍｌのウイルスの接種物で接種し、そしてウイル
スを約１〜２時間（好ましくは７０〜１２０分、最も好
ましくは９０分）間周囲温度（約１８℃〜約２５℃）に
おいて吸収させる。
【０１１５】ウイルスのフラスコを約１８℃〜約２６
℃、好ましくは約２０℃において、約２〜１２日間イン
キュベーションする。培地を除去し、そしてそれを凍結
培地で置換することによって、ウイルスを収獲する。次
いでフラスコを−７０℃において直接凍結し、次いで３
２℃の水浴の中で融解する。
【０１１６】一部分（約１ｍｌ）を凍結−融解リゼイト
から取り出し、そしてＶｅｒｏ細胞の接種に使用し、そ
してこの方法を反復する。残留する凍結−融解リゼイト
を−７０℃において貯蔵する。それを使用してウイルス
の滴定を実施し、そしてウイルスをプラーク精製するこ
とができる。
【０１１７】ウイルスをプラーク精製するために、凍結
−融解リゼイトを３２℃の水浴の中で融解する。リゼイ
トの約３〜５系統的希釈物を維持培地の中で調製する。
コンフルエントのＶｅｒｏ細胞を含有する６ウェル、２
４ウェルまたは９６ウェルのプレートをリン酸塩緩衝液
ですすぐ。ウェルの底をカバーするために十分なだけの
体積を使用して、ウェルをウイルスの希釈物で接種す
る。ウイルスの接種物を周囲温度において９０分間吸着
させる。ウェルをＭＥＭ−維持培地の中の１％のメチル
セルロースでオーバーレイする。プレートを３２℃にお
いて５日間インキュベーションする。分離されたプラー
クを典型的なシンシチウムのプラークについて見ること
によって顕微鏡で同定し、そしてウェルにしるしをつけ
る。しるしをつけた部位において小さい孔のピペットま
たはピペットの先端を使用してプラークを取り上げ、そ
して０．５ｍｌの維持培地の中で４℃において１〜３時
間乳化する。前述したようにＶｅｒｏ細胞の単層を含有
する２５ｃｍ2のフラスコまたは９６ウェルのプレート
の二重反復実験物に接種する。二重反復実験の接種した
フラスコまたはプレートに維持培地をオーバーレイす
る。１つの二重反復実験物を３２℃において、そして他
のものを３９℃において５〜１０日間インキュベーショ
ンする。３２℃においてインキュベーションしたフラス
コまたはプレートをウイルスのＣＰＥについて顕微鏡検
査する。３９℃においてインキュベーションしたフラス
コまたはプレートをＲＳＶ特異的抗原についてイムノペ
ルオキシダーゼにより染色する。容易に検出可能なＣＰ
Ｅを３２℃において示しそしてイムノペルオキシダーゼ
の染色により検出可能なＲＳＶ抗原をほとんどまたはま
ったく示さないフラスコまたはプレートを、ＴＳ突然変
異体を含有するものとして選抜する。前述の選抜したフ
ラスコまたはプレートからのウイルスを凍結−融解技術
により収獲する。このウイルスはプラーク精製した突然
変異体を表す。
【０１１８】論考 臨床的分離株から誘導された２つの親の株からのＲＳＶ
の弱毒化された株を発生するために、低温適応を使用し
た。亜群Ｂのウイルス（ＲＳＶ ２Ｂ）からの４つおよ
び亜群Ａのウイルス（ＲＳＶ ３Ａ）からの３つの合計
７つのＴＳ突然変異体を分離した。すべての７つの突然
変異体は温度感受性の表現型をＶｅｒｏ細胞の培養物の
中の表し、各々は独特の特性を有した。すべての突然変
異体はコットンラットの中の増殖において弱毒化された
が、異なる表現型を表した。ＴＳ突然変異体のうちの１
つであるＲＳＶ ２Ｂｐ２０Ｌの増殖は、血清反応陽性
のチンパンジーにおいて弱毒化されることが示された。
すべての７つの突然変異体は２つの主要な中和性エピト
ープを保持した。
【０１１９】従来、ＲＳＶの低温適応は初代または２倍
体の細胞系（ウシ胚腎臓、Ｗ１３８、およびオナガザル
の腎臓）の中で３４℃〜３７℃で開始しそして２５℃〜
２６℃に減少する温度において実施されてきた。多数の
個々の突然変異体の表現型を低温適応したウイルスから
分離する試みはなされなかった（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ
ら、１９６８；ＭａａｓａｂおよびＤｅＢｏｒｄｅ、１
９８５；Ｆｒｉｃｋｅｙ、１９６９）。ＲＳＶを低温適
応するこのアプローチは、いくつかの有意な方法でこれ
らの従来の試みと異なった。このアプローチは従来使用
された株と異なる株の亜群Ａおよび亜群Ｂのウイルスを
使用して開始した。これらの株は参照株および互いに異
なる明確な表現型の差を有した。これらの株は数回継代
してウイルスをＶｅｒｏ細胞に適応させ、そしてウイル
スをプラーク精製した。ウイルスを２倍生合成または初
代の細胞系よりむしろ連続的細胞系、Ｖｅｒｏ細胞の中
で継代した。温度の変化のいくつかの方法を使用して、
種々の突然変異体の表現型の分離の可能性を大きくし
た。低温適応を３４〜３７℃において開始し、そして２
５〜２６℃に低下させる従来ＲＳＶの低温適応法と異な
り、本発明の低温適応は２６℃（親の株はこの温度にお
いてよく増殖ことが発見されたので）または２２℃にお
いて開始し、そして増殖温度を徐々に２０℃に減少させ
た。ＭａａｓａｂおよびＤｅＢｏｒｄｅ（１９８５）が
提案するような非常に低い温度への「遅い」適応、なら
びにより速くかつより攻撃的なアプローチを試みようと
すう努力の両者をカバーするために、継代の方法を試み
た。ＲＮＡのウイルスは高い頻度で突然変異し、こうし
てウイルスの任意の集団はある数の個々のウイルスの変
異型を含有し（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９８２）、したが
って種々のウイルスの突然変異体が個々のフラスコから
種々のウイルスの継代のレベルにおいておよび異なる低
温適応の方法から分離された。これらの結果は興味ある
ものであり、そして多少予期せざるものであった。ウイ
ルスが適応する（すなわち、２０℃の温度で絶えず高い
力価に増殖する）ようになる速度は使用した株により最
も影響を受け、適応における有意な宿主に関係する因子
を意味する。ＲＳＶ ２Ｂは、急速な適応のスキームを
使用してさえ、低温に容易に適応した。対照的に、ＲＳ
Ｖ ３Ａの増殖は低い温度において劣っていた。ＲＳＶ
３Ａは遅い継代のスキームを使用して究極的に低温適
応されたが、より急速な適応のアプローチは有望に思わ
れるず、そして中止した。他の研究者らが報告した低温
適応の経験に基づいて、ＴＳ突然変異体は発生し、そし
て究極的に低温適応の集団において優勢なウイルスの変
異型となることが期待された。例えば、Ｂｅｌｓｈｅお
よびＨｉｓｓｏｍ（１９８２）の報告によると、パライ
ンフルエンザでは、ウイルス３型は２０℃において増殖
するように適応し、プラーク精製したウイルスのクロー
ンの８０％は継代１８までＴＳであり、そして１００％
は継代４５までＴＳであった。この研究において、２０
℃において実施された３２継代までを含む、３８〜４０
の低温の継代後でさえ、ＲＳＶのＴＳ突然変異体は小さ
い集団に止まった。これが示唆するように、ＴＳおよび
低温適応した表現型は、他のウイルスの中に存在するの
で、ＲＳＶの中で強く結合されないことがある。
【０１２０】弱毒化のレベルは任意のターゲット集団の
ためのワクチンの開発においてきわめて重要な因子であ
り、そして乳児および若い子供のために意図するワクチ
ンのためにとくに重要である。ウイルスは疾患を引き起
こさないように十分に弱毒化されなくてはならなず、し
かも保護的免疫性を引き出すために十分によくワクチン
の中で増殖しなくてはならない。弱毒化のために広く受
け入れられているマーカーはＴＳの表現型であり、そし
て動物のモデルにおいて増殖を減少するが、これらのマ
ーカーは類似のものだけであり、そしてターゲット集団
の中で試験を究極的に実施しなくてはならない。ＲＳＶ
３ＡのＴＳ突然変異体はＲＳＶ ３Ａの親のウイルス
と、鼻および肺の両者の中の複製の減少により、区別す
ることができる。また、ＲＳＶ ３Ａの親のウイルスは
コットンラットの肺より鼻の中で非常によく増殖する
が、ウイルスの回収はＢａｌｂ／Ｃマウスの鼻および肺
の両者において類似する。これらのデータが示唆するよ
うに、コットンラットにおいて見られた弱毒化は１より
多い因子のためであり、そしてこの因子はｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで測定して温度感受性に直接関係しない。コットン
ラットはＲＳＶの増殖について比較的非許容性であり、
そして疾患は発生せず、このモデルがヒトにおける弱毒
化のレベルの信頼性あるインジケーターでないことを示
唆する。対照的に、チンパンジーはＲＳＶ感染に対して
高度に感受性であり、そしてヒトにおいて見られるもの
に非常に類似する上部および下部の気道の疾患を発生す
る。血清反応陽性のチンパンジーにおいて、ＲＳＶ ２
Ｂの親の株は大人のヒトにおける自然のＲＳＶ感染によ
り引き起こされるものに類似する温和な上部の気道の疾
患を引き起こすことが本発明において発見された。ＲＳ
Ｖ ２Ｂｐ２０Ｌは増殖せず、このＴＳ突然変異体が許
容性宿主ならびに非許容性コットンラットにおいて弱毒
化されたことが明瞭に実証された。弱毒化のレベルは血
清反応陰性のチンパンジーにおいて最もよく評価され
た。なぜなら、前のウイルスの暴露がウイルスの対抗に
対する宿主の応答に影響を与えるからである。不都合な
ことには、血清反応陰性のチンパンジーにおける試験は
これらの動物の入手可能の制限により厳しく障害され
る。
【０１２１】ここで検査した本発明の突然変異体は、ヒ
トのターゲット集団において、弱毒化された、表現型的
に安定な、そして免疫原性のＲＳＶワクチンの所望の特
性を有する。
【０１２２】
【表１】
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
【表３】
【０１２５】
【表４】
【０１２６】
【表５】
【０１２７】
【表６】
【０１２８】
【表７】
【０１２９】
【表８】
【０１３０】
【表９】
【０１３１】
【表１０】
【０１３２】
【表１１】
【０１３３】
【表１２】
【０１３４】
【表１３】
【０１３５】
【表１４】
【０１３６】
【表１５】
【０１３７】
【表１６】
【０１３８】
【表１７】
【０１３９】
【表１８】
【０１４０】
【表１９】
【０１４１】
【表２０】
【０１４２】
【表２１】
【０１４３】
【表２２】
【０１４４】
【表２３】
【０１４５】
【表２４】
【０１４６】
【表２５】
【０１４７】
【表２６】
【０１４８】
【表２７】
【０１４９】
【表２８】
【０１５０】
【表２９】
【０１５１】参考文献 アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ＪＪ、ノーデ（Ｎｏ
ｒｄｅｎ）Ｊ、サウンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）Ｄ、
トムス（Ｔｏｍｓ）ＧＬ、スコット（Ｓｃｏｔｔ）Ｒ
（１９８０）：ＲＳウイルスの実験的感染によるＢａｌ
ｂ／Ｃマウスにおいて誘発された局所的および全身的免
疫応答の分析。ジャーナル・オブ・ゼネラル・ビロロジ
ー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ）７１：１５６１−１５７０。
【０１５２】アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ＬＪ、
ヒエルホルザー（Ｈｉｅｒｈｏｚｅｒ）ＪＣ、トウ（Ｔ
ｓｏｕ）Ｃ、ヘンドリイ（Ｈｅｎｄｒｙ）ＲＭ、フォー
ニイ（Ｆｏｒｎｉｅ）ＢＦ、ストーン（Ｓｔｏｎｅ）
Ｙ、マクイントシュ（ＭｃＩｎｔｏｓｈ）Ｋ（１９８
５）：モノクローナル抗体を使用するＲＳウイルス株の
抗原的特性決定。ジャーナル・オブ・インフェクシャス
・ディジージス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔ
ｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）１５１：６２６−６３
３。
【０１５３】アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ＬＪ、
ヘンドリイ（Ｈｅｎｄｒｙ）ＲＭ、トウ（Ｔｓｏｕ）
Ｃ、マクイントシュ（ＭｃＩｎｔｏｓｈ）Ｋ（１９９
１）：ＲＳウイルスの株のマルチセンターの研究。ジャ
ーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージス（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａ
ｓｅｓ）１６３：６８７−６９２。
【０１５４】アケルリンド（Ａｋｅｒｌｉｎｄ）Ｂ、ノ
ルバィ（Ｎｏｒｒｂｙ）Ｅ、オーベル（Ｏｒｖｅｌ
ｌ）、ムフソン（Ｍｕｆｓｏｎ）ＭＡ（１９８８）：Ｒ
Ｓウイルス：亜群Ｂ株の不均質性。ジャーナル・オブ・
ゼネラル・ビロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎ
ｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６９：２１４５−２１５
４。
【０１５５】ビーラー（Ｂｅｅｌｅｒ）ＪＡ、ケリング
（Ｃｏｅｌｎｇｈ）ＫＷ（１９８９）：ＲＳウイルスの
Ｆ糖タンパク質の中和エピトープ：融合機能への突然変
異の効果。ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６３：２９４１−２９
５０。
【０１５６】ベルシェ（Ｂｅｌｓｈｅ）ＲＢ、ヒッソム
（Ｈｉｓｓｏｍ）ＦＫ（１９８２）：パラインフルエン
ザウイルス３型の低温適応：３つの表現型のマーカーの
誘発。ジャーナル・オブ・メディカル・ビロロジー（Ｊ
ｏｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）１０：２３５−２４２。
【０１５７】ベルシェ（Ｂｅｌｓｈｅ）ＲＢ、ヴァン・
ボリス（Ｖａｎ Ｖｏｒｉｓ）ＬＰ、ムフソン（Ｍｕｆ
ｓｏｎ）ＭＡ（１９８２）：生ＲＳウイルスワクチンの
非経口的投与：フィールドテストの結果。ジャーナル・
オブ・インフェクシャス・ディジージス（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）
１４５：３１１−３１９。
【０１５８】ブリデアウ（Ｂｒｉｄｅａｕ）ＲＪ、ワル
ターズ（Ｗａｌｔｅｒｓ）ＲＲ、スティール（Ｓｔｉｅ
ｒ）ＭＷ、ワセン（Ｗａｈｔｅｎ）ＭＷ（１９８９）：
新規なキメラＦＧ糖タンパク質を使用するワクチン接種
によるヒトＲＳウイルスに対するコットンラットの保
護。ジャーナル・オブ・ゼネラル・ビロロジー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）
７０：２６３７−２６４４。
【０１５９】バーケ（Ｂｕｒｋｅ）ＫＬ、ズン（Ｄｕ
ｎ）Ｇ、フェルグソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ）Ｍ、マイナ
ー（Ｍｉｎｏｒ）ＰＤ、アーモンド（Ａｌｍｏｎｄ）Ｊ
Ｗ（１９９９）：効力のある新しいワクチンとしてのポ
リオウイルスの抗原のキメラ。ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）３３２：８１−８２。
【０１６０】バーケ（Ｂｕｒｋｅ）ＫＬ、エバンス（Ｅ
ｖａｎｓ）ＤＪ、ジェンキンス（Ｊｅｎｋｉｎｓ）Ｏ、
メレディス（Ｍｅｒｅｄｉｔｈ）Ｊ、Ｄ’ソウザ（Ｓｏ
ｕｚａ）ＥＤＡ、アーモンド（Ａｌｍｏｎｄ）ＪＷ（１
９８９）：ポリオウイルスの抗原のキメラの構成のため
のカセットベクター。ジャーナル・オブ・ゼネラル・ビ
ロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ）７０：２４７４−２４７９。
【０１６１】チャクラバルチ（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ
ｉ）ら（１９８５）：モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．）５：
３４０３−３４０９。
【０１６２】チン（Ｃｈｉｎ）Ｊ、マゴフィン（Ｍａｇ
ｏｆｆｉｎ）ＲＬ、シェアラー（Ｓｈｅａｒｅｒ）Ｌ
Ａ、シエブル（Ｓｃｈｉｅｂｌｅ）ＪＨ、レンネッテ
（Ｌｅｎｎｅｔｔｅ）ＥＨ（１９６９）：小児の人口に
おけるＲＳウイルスのワクチンおよびパラインフルエン
ザウイルスのワクチンのフィールド評価。アメリカン・
ジャーナル・オブ・エピダーモロジー（Ａｍｅｒｉｃａ
ｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＥｐｉｄｅｒｍｏｌｏｇｙ）
８９：４４９−４６３。
【０１６３】クレメンツ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ）ＭＬ、ベ
ルシェ（Ｂｅｌｓｈｅ）ＲＢ、キング（Ｋｉｎｇ）Ｊ、
ニューマン（Ｎｅｗｍａｎ）Ｆ、ウェスロム（Ｗｅｓｔ
ｈｌｏｍ）ＴＵ、チールネイ（Ｔｉｅｒｎｅｙ）ＥＬ、
ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）ＷＴ、マーフィイ（Ｍｕｒｐ
ｈｙ）ＢＲ（１９９１）：大人のボランティアおよびチ
ンパンジーにおけるウシ、低温適応したヒト、および野
生型ヒトパラインフルエンザ３型ウイルスの評価。ジャ
ーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ）２９：１１７５−１１８２。
【０１６４】コリンス（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ＰＬ（１９９
１）：ニューモウイルス属のヒトＲＳウイルス（ＲＳ
Ｖ）の分子生物学。キングスバリー（Ｋｉｎｇｓｂｕｒ
ｙ）ＤＷ（編）：「パラミクソウイルス（Ｔｈｅ Ｐａ
ｒａｍｙｘｏｖｉｒｓｕｓｅｓ）」。プレナム・パブリ
ッシング・コーポレーション（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ｐｐ１０３
−１６２。
【０１６５】コリンス（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ＰＬ、プリン
ス（Ｐｒｉｎｃｅ）ＧＡ、カマルゴ（Ｃａｍａｒｇｏ）
Ｅ、プルセル（Ｐｕｒｃｅｌｌ）ＲＨ、チャノック（Ｃ
ｈａｎｏｃｋ）ＲＭ、マーフィイ（Ｍｕｒｐｈｙ）Ｂ
Ｒ、デイビス（Ｄａｖｉｓ）ＡＲ、ルベック（Ｌｕｂｅ
ｃｋ）ＭＤ、ミズタニＳ、ハング（Ｈｕｎｇ）ＰＰ（１
９９０）：ＲＳウイルスを発現する組み換えワクシニア
ウイルスおよびアデノウイルスの保護的効能の評価。
「ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅｓ）９０」、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ）、ｐｐ７９−８４。
【０１６６】コリンス（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ＰＬ、パーセ
ル（Ｐｕｒｃｅｌｌ）ＲＨ、ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）
ＬＡ、チャノック（Ｃｈａｎｏｃｋ）ＲＭ、マーフィイ
（Ｍｕｒｐｈｙ）ＢＲ（１９９０）：ヒトＲＳウイルス
の表面糖タンパク質を発現するワクシニアウイルスの組
み換え体のチンパンジーにおける評価。ワクチン（Ｖａ
ｃｃｉｎｅ）８：１６４−１６８。
【０１６７】コリンス（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ＰＬ、ミンク
（Ｍｉｎｋ）ＭＡ、ステク（Ｓｔｅｃ）ＤＳ（１９９
１）：ＲＳウイルスのゲノムのＤＮＡの合成類似体のレ
スキューおよび外来リポーター遺伝子の発現への切頭お
よび突然変異の効果。プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）ＵＳＡ、８８：９６６３−９
６６７。
【０１６８】コンノース（Ｃｏｎｎｏｒｓ）Ｍ、コリン
ス（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ＰＬ、ファイアーストーン（Ｆｉ
ｒｅｓｔｏｎｅ）ＣＹ、マーフィイ（Ｍｕｒｐｈｙ）Ｂ
Ｒ（１９９１）：ＲＳウイルス（ＲＳＶ）Ｆ、Ｇ、Ｍ２
（２２Ｋ）、およびＮタンパク質の各々はＲＳＶ対抗に
対する耐性を誘発するが、Ｍ２およびＮタンパク質によ
り誘発される耐性は期間が比較的短い。ウイルス学誌
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ）６５：１６
３４−１６３７。
【０１６９】スフィイ（Ｄｕｆｆｙ）、ＪＩ、ワクチン
の調製技術（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
Ｔｅｃｈｎｅｑｕｅｓ）、ノイエス・データ・コーポ
レーション（Ｎｉｙｅｓ Ｄａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ）（１９８０）。
【０１７０】エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ＫＭ、キン
グ（Ｋｉｎｇ）ＪＣ、ステインホッフ（Ｓｔｅｉｎｈｏ
ｆｆ）ＭＣ、トンプソ（Ｔｏｍｐｓｏｎ）Ｊ、クレメン
ツ（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ）ＭＬ、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）
ＰＦ、マーフィイ（Ｍｕｒｐｈｙ）ＢＲ（１９９１）：
乳児および子供における生弱毒化低温適応したインフル
エンザＢ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／８６細部類のウイ
ルスワクチンの安全性および免疫原性。ジャーナル・オ
ブ・インフェクシャス・ディジージス（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）１
６３：７４０−７４５。
【０１７１】フォーシス（Ｆｏｒｓｙｔｈ）ＢＲ、フィ
リップス（Ｐｈｌｌｉｐｓ）ＣＡ（１９７３）：ＲＳウ
イルスの実験室および抗原性の研究；ＲＳ、髄膜炎菌お
よび肺炎球菌の多糖ワクチンの評価。ＮＩＨコントラク
ト・リポート（ｃｏｎｔｒａｃｔ ｒｅｐｏｒｔ）Ｎ
ｏ．ＩＤＢ−ＶＤＰ−０７−０６７。
【０１７２】フリクケイ（Ｆｒｉｃｋｅｙ）ＰＨ（１９
６９）：その親の系統からのＲＳウイルスの「低温」変
異型を分化するマーカー。インターナル・リポート（Ｉ
ｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｐｏｒｔ）−レデルレ・ラボラト
リーズ（Ｌｅｄｅｒｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）。
【０１７３】フリーデワルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）
ＷＴ、フォーシス（Ｆｏｒｓｙｔｈ）ＢＲ、スミス（Ｓ
ｍｉｔｈ）ＣＢ、チャーピュアー（Ｃｈａｒｐｕｒｅ）
ＭＡ、テャノク（Ｃｈａｎｏｃｋ）ＲＭ（１９６８）：
大人のボランティアにおいて低温増殖したＲＳウイル
ス。ジャーナル・オブ・アメリカ・メディカル・アソシ
エーション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）２０４：
６９０−６９４。
【０１７４】フルギニチ（Ｆｕｌｇｉｎｉｔｉ）ＶＡ、
エラー（Ｅｌｌｅｒ）ＪＪ、シーバー（Ｓｉｅｂｅｒ）
ＯＦ、ジョイナー（Ｊｏｙｎｅｒ）ＪＷ、ミナミタニ
（Ｍｉｎａｍｉｔａｎｉ）Ｍ、メイクレジョ（Ｍｅｉｋ
ｌｅｊｏｈｎ）Ｇ（１９６９）：２つの不活性化ＲＳウ
イルスのワクチンのフィールドテスト；水性３価のパラ
インフルエンザウイルスのワクチンおよび明礬沈澱した
ＲＳウイルスのワクチン。アメリカン・ジャーナル・オ
ブ・エピダーモロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｏｇｙ）８９：４３５
−４４８。
【０１７５】チャーピュアー（Ｃｈａｒｐｕｒｅ）Ｍ
Ａ、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ＰＦ、チャノク（Ｃｈａｎ
ｏｃｋ）ＲＭ（１９６９）：ＲＳウイルスの温度感受性
突然変異体。ウイルス学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ）３：４１４−４２１。
【０１７６】グレゼン（Ｇｌｅｚｅｎ）ＷＰ、パラデス
（Ｐａｒａｄｅｓ）Ａ、アリソ（Ａｌｌｉｓｏｎ）Ｊ
Ｅ、テイバー（Ｔａｂｅｒ）ＬＨ、フランク（Ｆｒａｎ
ｋ）ＡＬ（１９８１）：年令、性別、民族の群および母
の抗体のレベルに対する関係における低い収入の家族か
らの乳児についてのＲＳウイルスの感染の危険。ジャー
ナル・オブ・ペジアトリクス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ）９８：７０６−７１５。
【０１７７】グレゼン（Ｇｌｅｚｅｎ）ＷＰ、テイバー
（Ｔａｂｅｒ）ＬＨ、フランク（Ｆｒａｎｋ）ＡＬ、ケ
イセル（Ｋａｓｅｌ）ＪＡ（１９８６）：ＲＳウイルス
の初代感染および再感染の危険。アメリカ・ジャーナル
・オブ・ディジージズ・オブ・チルドレ（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ
Ｃｈｉｌｄｒｅｎ）１４０：５４３−５４６。
【０１７８】グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ＢＳ、バント
（Ｂｕｎｔｏｎ）ＬＡ、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ＰＦ、
カーソ（Ｋａｒｓｏｎ）ＤＴ（１９９１）：マウスにお
けるＲＳウイルスによる初代感染および再対抗の病原性
におけるＴリンパ球サブセットの役割。ジャーナル・オ
ブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔ
ｉｏｎ）８８：１０２６−１０３３。
【０１７９】グルンステイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）
Ｍ．およびホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）Ｄ．（１９７
５）：特定の遺伝子を含有するクローニングしたＤＮＡ
の分離法。プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓ）７２：３９６１−３９６５。
【０１８０】ホール（Ｈａｌｌ）ＣＢ、マクブライド
（ＭｃＢｒｉｄｅ）ＪＴ（１９９１）：ＲＳウイルス−
かぜをひいたチンパンジーから難問および治療まで。ニ
ュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ）３２５：５７−５８。
【０１８１】ホール（Ｈａｌｌ）ＣＢ、ワルシュ（Ｗａ
ｌｓｈ）ＥＥ、ロング（Ｌｏｎｇ）ＣＥ、スチナベル
（Ｓｃｈｎａｂｅｌ）ＫＣ（１９９１）：ＲＳウイルス
により再感染に対する免疫性および頻度。ジャーナル・
オブ・インフェクシャス・ディジージス（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）
１６３：６９３−６９８。
【０１８２】ヘンダーソ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ）ＦＷ、
コリアー（Ｃｏｌｌｉｅｒ）ＡＭ、クリド（Ｃｌｙｄ
ｅ）ＷＡ、デニー（Ｄｅｎｎｙ）ＦＷ（１９７９）：Ｒ
Ｓウイルスの感染、再感染および免疫性；若い子供にお
ける将来の長期にわたる研究。ニュー・イングランド・
ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）３０
０：５３０−５３４。
【０１８３】ホウデス（Ｈｏｄｅｓ）ＤＳ、キム（Ｋｉ
ｍ）ＨＷ、パロット（Ｐａｒｒｏｔ）ＲＨ、カマルゴ
（Ｃａｍａｒｇｏ）Ｅ、チャノク（Ｃｈａｎｏｃｋ）Ｒ
Ｍ（１９７４）：ｉｎ ｖｉｖｏの複製後のＲＳウイル
スの温度感受性突然変異体における遺伝学的変更（３７
９７２）。プロシーディングス・オブ・ザ・ソサイアテ
ィ・フォー・イクスペリメンタル・バイオロジー・アン
ド・メディシン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ
ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｅｎｅ）１４
５：１１５８−１１６４。
【０１８４】ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）Ｊ、スピンド
ラー（Ｓｐｉｎｄｌｅｒ）Ｋ、ホロディスキ（Ｈｏｒｏ
ｄｙｓｋｉ）Ｆ、グラバウ（Ｇｒａｂａｕ）Ｅ、ニコー
ル（Ｎｉｃｈｏｌ）Ｓ、バンデポル（Ｖａｎｄｅｐｏ
ｌ）Ｓ（１９８２）：ＲＮＡゲノムの急速な評価。サイ
エンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２１５：１５８５。
【０１８５】ハウング（Ｈａｕｎｇ）Ｙ．およびウェル
ツ（Ｗｅｌｔｚ）Ｇ．（１９８２）：ＲＳウイルスのゲ
ノムは少なくとも７つのｍＲＮＡ種をコードする陰性の
鎖のＲＮＡである。ウイルス学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）４２：１５０−１５７。
【０１８６】医薬の研究所、新しいワクチンの開発につ
いての刊行物および優先権についての委員会（１９８
５）：ＲＳウイルスに対する免疫性についての将来。
「新しいワクチンの開発：優先権の確立、Ｖｏｌ：米国
における重要な疾患（Ｎｅｗ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｐｒｉ
ｏｒｉｔｉｅｓ，Ｖｏｌ：ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｉ
ｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔ
ａｔｅｓ）」、ワシントンＤＣ：ナノナル・アカデミー
・プレス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅ
ｓｓ）、ｐｐ３９７−４０９。
【０１８７】ジョンソン（Ｊｏｈｏｎｓｏｎ）ＰＲ、オ
ルムステッド（Ｏｌｍｓｔｅｄ）ＲＡ、プリンス（Ｐｒ
ｉｎｃｅ）ＧＡ、マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）ＢＲ、ア
リング（Ａｌｌｉｎｇ）ＤＷ、ワルシュ（Ｗａｌｓｈ）
ＥＥ、コリンス（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ＰＬ（１９８７）：
ヒトＲＳウイルスの亜群ＡおよびＢの糖タンパク質の間
の抗原性の関係：免疫性に対するＦおよびＧ糖タンパク
質の寄与の評価。ウイルス学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６１：３１６３−３１６６。
【０１８８】カピキア（Ｋａｐｉｋｉａｎ）ＡＺ、ミッ
チェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）ＲＨ、チャノク（Ｃｈａｎ
ｏｃｋ）ＲＭ、シュベドッフ（Ｓｈｂｅｄｏｆｆ）Ｒ
Ａ、ステワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ＣＥ（１９６８）：
不活性化ＲＳウイルスのワクチンで前以てワクチン接種
した子供におけるＲＳウイルスの感染に対する変更され
た臨床的反応性の疫学の研究。アメリカン・ジャーナル
・オブ・エピダーモロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｏｇｙ）８９：４
０５−４２１。
【０１８９】ケイゼル（Ｋａｓｅｌ）ＪＡ、ワルシュ
（Ｗａｌｓｈ）ＥＥ、フランク（Ｆｒａｎｋ）ＡＬ、バ
クスター（Ｂａｘｔｅｒ）ＢＤ、テイバー（Ｔａｂｅ
ｒ）ＬＨ、ブレゼン（Ｇｌｅｚｅｎ）ＷＰ（１９８７／
１９８８）：ＲＳウイルスの糖タンパク質に対して血清
抗体と子供における感染に対する免疫性との関係。ウイ
ルスの免疫学（Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
１：１９９−２０５。
【０１９０】キム（Ｋｉｍ）ＨＷ、カンコラ（Ｃａｎｃ
ｈｏｌａ）ＪＧ、ブラント（Ｂｒａｎｄｔ）ＣＤ、ピレ
ス（Ｐｙｌｅｓ）Ｇ、チャノク（Ｃｈａｎｏｃｋ）Ｒ
Ｍ、ジェンセ（Ｊｅｎｓｅｎ）Ｋ、パロット（Ｐａｒｒ
ｏｔｔ）ＲＨ（１９６９）：抗原性不活性化ワクチンの
前の投与に対する乳児におけるＲＳウイルスの疾患。ア
メリカン・ジャーナル・オブ・エピダーモロジー（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｒｍ
ｏｌｏｇｙ）８９：４２１−４３４。
【０１９１】キム（Ｋｉｍ）ＨＷ、アロビオ（Ａｒｒｏ
ｂｉｏ）ＪＯ、ピレス（Ｐｙｌｅｓ）Ｇ、ブラント（Ｂ
ｒａｎｄｔ）ＣＤ、カマルゴ（Ｃａｍａｒｇｏ）Ｅ、チ
ャノク（Ｃｈａｎｏｃｋ）ＲＭ、パロット（Ｐａｒｒｏ
ｔｔ）ＲＨ（１９７１）：低温適応したＲＳウイルスの
投与に対する乳児および子供の臨床的および免疫学的応
答。小児科学（Ｐｅｄａｔｒｉｃｓ）４８：７４５−７
５５。
【０１９２】キム（Ｋｉｍ）ＨＷ、アロビオ（Ａｒｒｏ
ｂｉｏ）ＪＯ、ブラント（Ｂｒａｎｄｔ）ＣＤ、ライト
（Ｗｒｉｇｈｔ）Ｐ、ホウデス（Ｈｏｄｅｓ）Ｄ、チャ
ノク（Ｃｈａｎｏｃｋ）ＲＭ、パロット（Ｐａｒｒｏｔ
ｔ）ＲＨ（１９７３）：乳児および子供における温度感
受性（ＴＳ）突然変異体のＲＳウイルス（ＲＳＶ）の安
全性および抗原性。小児科学（Ｐｅｄａｔｒｉｃｓ）５
２：５６−６３。
【０１９３】キム（Ｋｉｍ）ＨＷ、レイキ（Ｌｅｉｋｉ
ｎ）ＳＬ、アロビオ（Ａｒｒｏｂｉｏ）ＪＯ、ブラント
（Ｂｒａｎｄｔ）ＣＤ、チャノク（Ｃｈａｎｏｃｋ）Ｒ
Ｍ、パロット（Ｐａｒｒｏｔｔ）ＲＨ（１９７６）：不
活性化ワクチンまたは感染により誘発されたＲＳウイル
スに対して細胞仲介免疫性。小児科学の研究（Ｐｅｄａ
ｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１０：７５−７８。
【０１９４】ランプレヒト（Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ）Ｃ
Ｌ、クラウセ（Ｋｒａｕｓｅ）ＨＥ（１９７６）：ＲＳ
ウイルスのための肺炎および気管支炎において母の抗体
の役割。ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジ
ージス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｄｉｓｅａｓｅｓ）１３４：２１１−２１７。
【０１９５】マアサブ（Ｍａａｓｓａｂ）ＨＦ、デボル
デ（ＤｅＢｏｒｄｅ）ＤＣ（１９８５）：生ウイルスワ
クチンとして使用するための低温適応したウイルスの開
発および特性決定。ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）３：３
５５−３６９。
【０１９６】マアサブ（Ｍａａｓｓａｂ）ＨＦ、ヘイル
マ（Ｈｅｉｌｍａｎ）ＣＡ、ハーロチェー（Ｈｅｒｌｏ
ｃｈｅｒ）ＭＬ（１９９０）：ヒトのための生ワクチン
として使用するための低温適応したインフルエンザウイ
ルス。「イルスのワクチン（Ｖｉｒａｌ Ｖａｃｃｉｎ
ｅｓ）」、ウィリイ−リス・インコーポレーテッド（Ｗ
ｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【０１９７】マクケット（ＭａｃＫｅｔｔ）（１９８
４）；ウイルス学誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）４９：８
５７−８６４。
【０１９８】マクサム（Ｍａｘａｍ）ＡＭ、ギルバート
（Ｇｉｌｂｅｒｔ）Ｗ（１９７７）：ＤＮＡを配列決定
する新しい方法。プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）７４：５６０。
【０１９９】マクサム（Ｍａｘａｍ）ＡＭ、ギルバート
（Ｇｉｌｂｅｒｔ）Ｗ（１９８０）：塩基特異的化学的
切断を使用する末端標識したＤＮＡの配列決定。メソッ
ズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６５：４９９−５６０。
【０２００】マクイントシュ（ＭｃＩｎｔｏｓｈ）Ｋ、
アーベター（Ａｒｂｅｔｅｒ）ＡＭ、スタール（Ｓｔａ
ｈｌ）ＭＫ、オル（Ｏｒｒ）ＩＡ、ホウデス（Ｈｏｄｅ
ｓ）ＤＳ、エリス（Ｅｌｌｉｓ）ＥＦ（１９７４）：ぜ
んそくの子供における弱毒化ＲＳウイルスのワクチン。
小児科学の研究（Ｐｅｄａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）８：６８９−６９６。
【０２０１】マクイントシュ（ＭｃＩｎｔｏｓｈ）Ｋ、
チャノク（Ｃｈａｎｏｃｋ）ＲＭ（１９９０）：ＲＳウ
イルス。フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）ＢＮ、ナイプ（Ｋ
ｎｉｐｅ）ＤＭ（編）：「ウイルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）」ニューヨーク：レイベ・プレス・リミテッド（Ｒ
ａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ）、ｐｐ１０４５−１０
７２。
【０２０２】マクカイ（ＭｃＫａｙ）Ｅ、ヒギンス（Ｈ
ｉｇｇｉｎｓ）Ｐ、チレル（Ｔｙｒｅｌｌ）Ｄ、プリン
グル（Ｐｒｉｎｇｌｅ）Ｃ（１９８８）：大人のボラン
ティアにおける温度感受性修飾ＲＳウイルスの免疫原性
および病原性。ジャーナル・オブ・メディカル・ビロロ
ジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ）２５：４１１−４２１。
【０２０３】ムフソ（Ｍｕｆｓｏｎ）ＭＡ、オーベル
（Ｏｒｖｅｌｌ）Ｃ、ラフナー（Ｒａｆｎａｒ）Ｂ、ノ
ルバイ（Ｎｏｒｒｂｙ）Ｅ（１９８５）：ヒトＲＳウイ
ルスの２つの明確なサブタイプ。ジャーナル・オブ・ゼ
ネラル・ビロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ
ｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６６：２１１１−２１２
４。
【０２０４】ムフソ（Ｍｕｆｓｏｎ）ＭＡ、ベルシェ
（Ｂｅｌｓｈｅ）ＲＢ、オーベル（Ｏｒｖｅｌｌ）Ｃ、
ノルバイ（Ｎｏｒｒｂｙ）Ｅ（１９８７）：２つの構成
的感染をもつ子供から回収されたＲＳウイルス株の亜群
の特性。ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイ
オロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＣｌｉｎｉｃａｌＭ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）２５：１５３５−１５３９。
【０２０５】マーフィイ（Ｍｕｒｐｈｙ）ＢＲ、ワルシ
ュ（Ｗａｌｓｈ）ＥＥ（１９８８）：ホルマリン不活性
化ＲＳウイルスのワクチンは、融合阻害活性を欠乏する
融合糖タンパク質に対する抗体を誘発する。ジャーナル
・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ）２６：１５９５−１５９７。
【０２０６】マーフィイ（Ｍｕｒｐｈｙ）ＢＲ、チール
ネイ（Ｔｉｅｒｎｅｙ）ＥＬ、ロンドン（Ｌｏｎｄｏ
ｎ）ＷＴ、ベルシェ（Ｂｅｌｓｈｅ）ＲＢ（１９９
０）：ヒトパラインフルエンザウイルス３型の低温適応
した突然変異体は弱毒化しそしてチンパンジーにおいて
保護的である。「ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」コー
ルド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）ｐｐ９１−９５。
【０２０７】ニコラス（Ｎｉｃｈｌｏａｓ）ＪＡ、ルビ
ノ（Ｒｕｂｉｎｏ）ＫＬ、レベリイ（Ｌｅｂｅｌｙ）Ｍ
Ｅ、アダムス（Ａｄａｍｓ）ＥＧ、コリンス（Ｃｏｌｌ
ｉｎｓ）ＰＬ（１９９０）：ＲＳウイルスに対して細胞
溶解性Ｔリンパ球の応答：エフェクター細胞の表現型お
よびターゲットタンパク質。ウイルス学誌（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６４：４２３２−４２
４１。
【０２０８】オブロソバ−セロバ（Ｏｂｒｏｓｏｖａ−
Ｓｅｒｏｖａ）ＮＰ、スレプスキ（Ｓｌｅｐｕｓｕｋｉ
ｎ）ＡＮ、ケンダル（Ｋｅｎｄａｌ）ＡＰ、ハーモ（Ｈ
ａｒｍｏｎ）ＭＷ、バートセバ（Ｂｕｒｔｓｅｖａ）Ｅ
Ｉ、ベルジャエブ（Ｂｅｌｊａｅｖ）ＡＬ、ロンスカジ
ャ（Ｌｏｎｓｋａｊａ）ＮＩ、メドベドバ（Ｍｅｄｖｅ
ｄｖａ）ＴＥ、エゴロブ（Ｅｇｏｒｏｖ）ＡＹ、ペクリ
ソベ（Ｐｅｋｌｉｓｏｖｅ）ＬＶ、アレキサンドロバ
（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖａ）ＧＩ（１９９０）：野生型
Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／８６および低温適応した
Ｂ／Ｌｅｎｉｇｒａｄ／１４／５５ウイルスの間の再分
類により調製された低温適応したインフルエンザＢ生弱
毒化鼻内ワクチンの子供における評価。ワクチン（Ｖａ
ｃｃｉｎｅ）８：５７−６０。
【０２０９】オルムステッド（Ｏｌｍｓｔｅｄ）ＲＡ、
ブラー（Ｂｕｌｌｅｒ）ＲＭＬ、コリンス（Ｃｏｌｌｉ
ｎｓ）ＰＬ、ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ）ＷＴ、ビーラー
（Ｂｅｅｌｅｒ）ＪＡ、プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）Ｇ
Ａ、チャノク（Ｃｈａｎｏｃｋ）ＲＭ、マーフィイ（Ｍ
ｕｒｐｈｙ）ＢＲ（１９８６）：ＲＳウイルスのＦまた
はＧ糖タンパク質を発現する組み換えワクシニアウイル
スの安全性、免疫原性および効能のヒト以外の霊長類に
おける評価。ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）６：５１９−
５２４。
【０２１０】オッペンシャウ（Ｏｐｐｅｎｓｈａｗ）Ｐ
ＪＭ、アンダーソ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）Ｋ、ウェツ（Ｗ
ｅｔｚ）ＧＷ、アスコナス（Ａｓｋｏｎａｓ）ＢＡ（１
９９０）：ＲＳウイルスの２２，０００キロダルトンの
タンパク質は、感染によりプライミングされたマウスか
らのＫd−制限された細胞障害性Ｔリンパ球のための主
要なターゲットである。ウイルス学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６４：１６８３−１６８
９。
【０２１１】プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ＧＡ、ジェンソ
ン（Ｊｅｎｓｏｎ）ＡＢ、ヘミング（Ｈｅｍｍｉｎｇ）
ＶＧ、マーフィイ（Ｍｕｒｐｈｙ）ＢＲ、ワルシュ（Ｗ
ａｌｓｈ）ＥＥ、ホースウッド（Ｈｏｒｓｗｏｏｄ）Ｒ
Ｌ、チャノク（Ｃｈａｎｏｃｋ）ＲＭ（１９８６）：ホ
ルマリン不活性化ウイルスの前の筋肉内接種によるコッ
トンラットにおけるＲＳウイルスの肺の病理学の増強。
ウイルス学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）５７：７２１−７２８。
【０２１２】リチャードソ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）Ｌ
Ｓ、ベルシェ（Ｂｅｌｓｈｅ）ＲＢ、ロンドン（Ｌｏｎ
ｄｏｎ）ＷＴ、スリイ（Ｓｌｙ）ＤＬ、プレバー（Ｐｒ
ｅｖａｒ）ＤＡ、カマーゴ（Ｃａｍａｒｇｏ）ＲＭ（１
９７８）：霊長類におけるＲＳウイルスの５つの温度感
受性突然変異体の評価：Ｉ。ウイルスの脱落、免疫原性
応答および関連する疾患。ジャーナル・オブ・メディカ
ル・ビロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）３：９１−１００．ロバーツ
（Ｒｏｂｅｒｔｓ）およびラウエル（Ｌａｕｅｒ）（１
９７９）：メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６８：４７３。
【０２１３】ロウズ（Ｒｏｓｅ）ＣＳＰ、エバンス（Ｅ
ｖａｎｓ）ＤＪ（１９９１）：ポリオウイルスの抗原性
のキメラ。トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒ
ｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）９：４
１５−４２１。
【０２１４】サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）Ｆ、ニクレン
（Ｎｉｃｋｌｅｎ）Ｓ、コウルソ（Ｃｏｕｌｓｏｎ）Ａ
Ｒ（１９７７）：プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）７４：５４６３−５４６７。
【０２１５】ストット（Ｓｔｏｔｔ）ＥＪ、タイラー
（Ｔａｙｌｏｒ）Ｇ、バール（Ｂａｌｌ）ＬＡ、アンダ
ーソ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）Ｋ、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）Ｋ
ＫＹ、キング（Ｋｉｎｇ）ＡＭＱ、ウェツ（Ｗｅｔｚ）
ＧＷ（１９８７）：ヒトＲＳウイルスの個々の遺伝子を
発現する組み換えワクシニアウイルスでワクチン接種し
た動物における免疫および組織病理学的応答。ウイルス
学誌（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）６１：
３８５５−３８６１。
【０２１６】スレンダー（Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ）ＷＭ、
ムフソ（Ｍｕｆｓｏｎ）ＭＡ、アンダーソ（Ａｎｄｅｒ
ｓｏｎ）ＬＪ、ウェツ（Ｗｅｔｚ）ＧＷ（１９９１）：
亜群ＢのＲＳウイルスの結合タンパク質の遺伝学的多様
性。ウイルス学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ）６５：５４２５−５４３４。
【０２１７】サン（Ｓｕｎ）ＣＳ、ウイデ（Ｗｙｄｅ）
ＰＲ、ナイト（Ｋｎｉｇｈｔ）Ｖ（１９８３）：ＲＳウ
イルスの感染からの正常およびガンマ照射したコットン
ラットの回復に対する肺における細胞障害活性の相関関
係。アメリカ・リビュー・オブ・レスピレイタリー・デ
ィジージズ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆＲ
ｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）１２８：６
６８−６７２。
【０２１８】ツルーデル（Ｔｒｕｄｅｌ）Ｍ、ナド（Ｎ
ａｄｏｎ）Ｆ、セグイン（Ｓｅｇｕｉｎ）Ｃ、ビンズ
（Ｂｉｎｚ）Ｈ（１９９１）：Ｇ糖タンパク質から誘導
された合成ペプチドで免疫化することによるＲＳウイル
スの感染からのＢａｌｂ／Ｃマウスの保護。ウイルス学
（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１８５：７４９−７５７。
【０２１９】ツルーデル（Ｔｒｕｄｅｌ）Ｍ、ストット
（Ｓｔｏｔｔ）ＥＪ、タイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｇ、オ
ス（Ｏｔｈ）Ｄ、メルシエール（Ｍｅｒｃｉｅｒ）Ｆ、
ナド（Ｎａｄｏｎ）Ｆ、セグイン（Ｓｅｇｕｉｎ）Ｃ、
シマード（Ｓｉｍａｒｄ）Ｃ、ラクロイクス（Ｌａｃｒ
ｏｉｘ）Ｍ（１９９１）：ＲＳＶのＦタンパク質に相当
する合成ペプチドはネズミのＢおよびＴ細胞を刺激する
が、保護を与えることができない。アーチーブス・オブ
・ビロロジー（Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）
１１７：５９−７１。
【０２２０】ワイア（Ｗａｉｒ）ＧＷ、「抗原の調製お
よび免疫化の原理」、ＪＪマシャロニス（Ｍａｒｃｈａ
ｌｏｎｉｓ）およびワール（Ｗａｒｒ）編、道具として
の抗原（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｓ Ｔｏｏｌ）−免疫化
学の応用（Ｔｈｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｓｔｒｙ）、ｐｐ２１−５８、ジ
ョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌ
ｙ ＆ Ｓｏｎｓ）（１９８２）。
【０２２１】ワルシュ（Ｗａｌｓｈ）ＥＥ、ハール（Ｈ
ａｌｌ）ＣＢ、ブリセリ（Ｂｒｉｓｅｌｌｉ）Ｍ、ブラ
ンドリス（Ｂｒａｎｄｒｉｓｓ）ＭＷ、シュレシンガー
（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ）ＪＪ（１９８７）：ウイル
スの感染に対してコットンラットを保護するためのＲＳ
ウイルスの糖タンパク質のサブユニットによる免疫化。
ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージス
（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ
ｅａｓｅｓ）１５５：１１９８−１２０４。
【０２２２】ワセ（Ｗａｔｈｅｎ）ＭＷ、カクク（Ｋａ
ｋｕｋ）ＴＪ、ブリデアウ（Ｂｒｉｄｅａｕ）Ｒ、ハウ
スクネヒト（Ｈａｕｓｋｎｅｃｈｔ）ＥＣ、コウル（Ｃ
ｏｌｅ）ＳＬ、ザヤ（Ｚａｙａ）ＲＭ（１９９１）：ヒ
トＲＳウイルスのキメラＦＧ糖タンパク質を使用するコ
ットンラットのワクチン接種は対抗のとき肺の病理学を
誘発する。ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディ
ジージス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕ
ｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）１６３：４７７−４８２。
【０２２３】ワット（Ｗａｔｔ）ＰＪ、ロビンソ（Ｒｏ
ｂｉｎｓｏｎ）ＢＳ、プリンシプル（Ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅ）ＣＲ、チレル（Ｔｙｒｅｌｌ）ＤＡＪ（１９９
０）：実験的ＲＳウイルスのワクチンを与えた大人のボ
ランティアの対抗の感受性および抗体の応答の決定。ワ
クチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）８：２３１−２３６。
【０２２４】ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ＰＦ、ウッドンド
（Ｗｏｏｄｅｎｄ）ＷＧ、チャノク（Ｃｈａｎｏｃｋ）
ＲＭ（１９７０）：ＲＳウイルスの温度感受性突然変異
体：ハムスターにおけるｉｎ ｖｉｖｏの研究。ジャー
ナル・オブ・インフェクシャス・ディジージス（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ）１２２：５０１−５１２。
【０２２５】ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ＰＦ、シノザキ
Ｔ、フリート（Ｆｌｅｅｔ）Ｗ、セル（Ｓｅｌｌ）Ｓ
Ｈ、トンプソ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）Ｊ、カルゾ（Ｋａｒ
ｚｏｎ）ＤＴ（１９７６）：乳児における生、弱毒化さ
れたＲＳウイルスのワクチンの評価。ジャーナル・オブ
・ペジアトリクス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａ
ｔｒｉｃｓ）８８：９３１−９３６。
【０２２６】ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ＰＦ、ベルシェ
（Ｂｅｌｓｈｅ）ＲＢ、キム（Ｋｉｍ）ＨＷ、バン・ボ
リス（Ｖａｎ Ｖｏｒｉｓ）ＬＰ、チャノク（Ｃｈａｎ
ｏｃｋ）ＲＭ（１９８２）：大人および子供への高度に
弱毒化した生ＲＳウイルスワクチンの投与。感染および
免疫性（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔ
ｙ）３７：３９７−４００。
【０２２７】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
【０２２８】１、低温適応した突然変異体のＲＳウイル
ス（ＲＳＶ）。
【０２２９】２、低温適応した突然変異体のＲＳウイル
ス亜群Ａ。
【０２３０】３、低温適応した突然変異体のＲＳウイル
ス亜群Ｂ。
【０２３１】４、突然変異体のウイルスが３Ａｐ２０
Ｅ、３Ａｐ２０Ｆおよび３Ａｐ２８Ｆから成る群より選
択される、上記第２項記載の低温適応した突然変異体の
ＲＳウイルス亜群Ａ。
【０２３２】５、突然変異体のウイルスが２Ｂｐ３３
Ｆ、２Ｂｐ２４Ｇ、２Ｂｐ２０Ｌおよび２Ｂｐ３４Ｌか
ら成る群より選択される、上記第３項記載の低温適応し
た突然変異体のＲＳウイルス亜群Ｂ。
【０２３３】６、低温適応した突然変異体のＲＳウイル
スおよび製剤学的に許容されうる担体からなる医薬組成
物。
【０２３４】７、低温適応した突然変異体のＲＳウイル
スから分離され、精製された免疫原性ポリペプチド。
【０２３５】８、前記ポリペプチドがＬ、Ｆ、Ｇ、Ｍ、
Ｍ２（２２Ｋ）、Ｐ、ＳＨ、１Ｂ、１ＣおよびＮから成
る群より選択される、上記第７項記載の精製された免疫
原性ポリペプチド。
【０２３６】９、低温適応した突然変異体のＲＳウイル
スから分離され、精製された免疫原性ポリペプチドおよ
び製剤学的に許容されうる担体からなる医薬組成物。
【０２３７】１０、低温適応した突然変異体のＲＳウイ
ルスをエンコードする核酸分子。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＳＶ ２Ｂの使用種子ＭＫ７Ｖ１４ｂおよび
ＲＳＶ ３Ａの使用種子ＭＫ８Ｖ１７ｂの増殖を詳細に
示すフローチャートである。
【図２】Ｖｅｒｏ細胞における２６℃〜３６℃の温度に
おけるＲＳＶ ２Ｂの増殖および細胞変性作用を示す。
【図３】Ｖｅｒｏ細胞における２６℃〜３６℃の温度に
おけるＲＳＶ ３Ａの増殖および細胞変性作用を示す。
【図４】ＲＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ３Ａの各継代にお
いて得られた滴定の結果をグラフで示す。
【図５】２０℃〜４０℃の温度におけるＶｅｒｏ細胞の
中のＲＳＶ ２Ｂ、ＲＳＶ ２Ｂｐ２４Ｇ、ＲＳＶ ２
Ｂｐ２０Ｌ、ＲＳＶ ３Ａ、ＲＳＶ ３Ａｐ２０Ｅおよ
びＲＳＶ ３Ａｐ２０Ｆの増殖曲線を示す。
【図６】感染後３〜７日のコットンラットにおけるＲＳ
Ｖ ２ＢおよびＲＳＶ ２Ｂｐ２０Ｌの増殖をグラフで
示す。
【図７】４歳の血清反応陽性のチンパンジーにおけるＲ
ＳＶ ２ＢおよびＲＳＶ ２Ｂｐ２０Ｌの相対的増殖お
よび病原性を比較する。
【図８】ＲＳＶ ２ＢのＴＳ突然変異体で感染させ、引
き続いて親の株で対抗したサルについてのウイルスの滴
定を示す線図である。
【図９】ＲＳＶ ３ＡのＴＳ突然変異体で感染させ、引
き続いて親の３Ａで対抗したアフリカミドリザルにおけ
るウイルスの増殖を示す線図である。
【図１０】ＴＳ−１をＲＳＶ ２Ｂｐ３３ＦおよびＲＳ
Ｖ ３Ａｐ２８Ｆと比較する増殖の研究を示す線図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/04 8619−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/45 (72)発明者 ジヨアン・コフラン・クローレイ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07631 イングルウツド・グレンウツドロード261

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 低温適応した突然変異体のＲＳウイルス
    （ＲＳＶ）。
  2. 【請求項２】 低温適応した突然変異体のＲＳウイルス
    亜群Ａ。
  3. 【請求項３】 低温適応した突然変異体のＲＳウイルス
    亜群Ｂ。
  4. 【請求項４】 低温適応した突然変異体のＲＳウイルス
    および製剤学的に許容されうる担体からなる医薬組成
    物。
  5. 【請求項５】 低温適応した突然変異体のＲＳウイルス
    から分離され、精製された免疫原性ポリペプチド。
  6. 【請求項６】 低温適応した突然変異体のＲＳウイルス
    から分離され、精製された免疫原性ポリペプチドおよび
    製剤学的に許容されうる担体からなる医薬組成物。
  7. 【請求項７】 低温適応した突然変異体のＲＳウイルス
    をエンコードする核酸分子。
JP5117812A 1992-04-21 1993-04-21 突然変異体のｒｓウイルス（ｒｓｖ）、それを含有するワクチンおよび使用方法 Pending JPH0622756A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US87142092A 1992-04-21 1992-04-21
US871420 1992-04-21

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH0622756A true JPH0622756A (ja) 1994-02-01

Family

ID=25357402

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP5117812A Pending JPH0622756A (ja) 1992-04-21 1993-04-21 突然変異体のｒｓウイルス（ｒｓｖ）、それを含有するワクチンおよび使用方法

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5932222A (ja)
EP (1) EP0567100B1 (ja)
JP (1) JPH0622756A (ja)
AT (1) ATE177785T1 (ja)
AU (1) AU671983B2 (ja)
CA (1) CA2094464C (ja)
DE (1) DE69323921T2 (ja)
DK (1) DK0567100T3 (ja)
ES (1) ES2130189T3 (ja)
GR (1) GR3029716T3 (ja)
NZ (1) NZ247444A (ja)
TW (1) TW275632B (ja)
ZA (1) ZA932763B (ja)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0784486B1 (en) * 1994-10-05 2006-04-05 Vanderbilt University Interleukin-12 as an adjuvant for paramyxoviridae vaccines
US6689367B1 (en) * 1995-09-27 2004-02-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
US7846455B2 (en) * 1996-07-15 2010-12-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Attenuated chimeric respiratory syncytial virus
US6015664A (en) * 1995-11-03 2000-01-18 Mcw Research Foundation Multiplex PCR assay using unequal primer concentrations to detect HPIV 1,2,3 and RSV A,B and influenza virus A, B
AU2438597A (en) * 1996-04-04 1997-10-29 Regents Of The University Of Michigan, The Attenuated respiratory syncytial virus
US6077514A (en) * 1996-04-04 2000-06-20 The Regents Of The University Of Michigan Attenuated respiratory syncytial virus
CN1232504A (zh) * 1996-09-27 1999-10-20 美国氰胺公司 在单链负义病毒目病毒内引起减毒的3'基因组启动子区和聚合酶基因中的突变
DE19729161A1 (de) 1997-07-08 1999-01-14 Basf Ag Thermisch härtbare, wässrige Zusammensetzungen
KR20010030630A (ko) * 1997-09-19 2001-04-16 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 약독화 호흡 신시티아 바이러스
CN1600852A (zh) * 1998-03-26 2005-03-30 惠氏控股有限公司 引起麻疹病毒或人呼吸道合胞病毒亚组b减毒的突变
AU2001281614A1 (en) * 2000-08-07 2002-02-18 Aventis Pasteur Limited Stabilization of immunogens derived from paramyxoviruses
AU2004299057B2 (en) * 2003-12-17 2010-06-24 Wyeth Llc Methods for porducing storage stable viruses and immunogenic compositions thereof
GB201202091D0 (en) 2012-02-07 2012-03-21 Renishaw Ireland Ltd Drug delivery apparatus
GB201202093D0 (en) * 2012-02-07 2012-03-21 Renishaw Ireland Ltd Drug storage apparatus
CN112501134B (zh) * 2020-12-09 2023-01-20 贵州医科大学附属医院 一种人呼吸道合胞病毒毒株及其应用
CN113462656B (zh) * 2021-03-24 2022-09-30 兰州生物制品研究所有限责任公司 一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU605476B2 (en) * 1986-01-14 1991-01-17 University Of North Carolina, The Vaccines for human respiratory virus
US5149650A (en) * 1986-01-14 1992-09-22 University Of North Carolina At Chapel Hill Vaccines for human respiratory virus
US5223254A (en) * 1987-09-29 1993-06-29 Praxis Biologics, Inc. Respiratory syncytial virus: vaccines
AU2715288A (en) * 1987-11-20 1989-06-14 Upjohn Company, The Human respiratory syncytialvirus vaccine derived from the 1a (9.5 kd) protein
WO1989005823A1 (en) * 1987-12-23 1989-06-29 The Upjohn Company Chimeric glycoproteins containing immunogenic segments of the glycoproteins of human respiratory syncytial virus
IL105456A (en) * 1992-04-21 1996-12-05 American Home Prod Vaccines of attenuated respiratory syncytial virus

Also Published As

Publication number Publication date
DE69323921T2 (de) 1999-08-26
ES2130189T3 (es) 1999-07-01
DK0567100T3 (da) 1999-09-27
US5932222A (en) 1999-08-03
GR3029716T3 (en) 1999-06-30
NZ247444A (en) 1994-12-22
CA2094464C (en) 2005-08-23
DE69323921D1 (de) 1999-04-22
TW275632B (ja) 1996-05-11
ATE177785T1 (de) 1999-04-15
ZA932763B (en) 1994-02-08
EP0567100B1 (en) 1999-03-17
AU671983B2 (en) 1996-09-19
EP0567100A1 (en) 1993-10-27
CA2094464A1 (en) 1993-10-22
AU3705793A (en) 1993-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100658491B1 (ko) 클론닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된 호흡기 세포 융합 바이러스 백신의 생산
JP2001517448A (ja) 弱毒化呼吸合胞体ウイルス
US20220325252A1 (en) Attenuation of human respiratory syncytial virus by genome scale codon-pair deoptimization
US9011876B2 (en) Live, attenuated respiratory syncytial virus
US10980872B2 (en) Genetically stable live attenuated respiratory syncytial virus vaccine and its production
JPH0622756A (ja) 突然変異体のｒｓウイルス（ｒｓｖ）、それを含有するワクチンおよび使用方法
JP2003530073A (ja) 弱毒化されたヒト−ウシキメラ呼吸器合胞体ウィルスワクチンの製造
KR100746979B1 (ko) 클로닝된 뉴클레오티드 서열로부터의 약독화된 키메릭호흡기 신시티움 바이러스 백신의 제조
US20220226458A1 (en) Recombinant chimeric bovine/human parainfluenza virus 3 expressing rsv g and its use
JP2004515218A (ja) プロモータへ隣接する遺伝子から保護抗原を発現する呼吸器系合胞体ウイルスワクチン
US20170080081A1 (en) Paramyxovirus Immunogens and Related Materials and Methods
US7510863B2 (en) Avian pneumovirus genes, recombinant avian pneumoviruses and methods of making
AU2008203034A1 (en) Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences

Legal Events

Date Code Title Description
A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20040413

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040712

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20040726

A912 Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912

Effective date: 20041022