KR100746979B1 - 클로닝된 뉴클레오티드 서열로부터의 약독화된 키메릭호흡기 신시티움 바이러스 백신의 제조 - Google Patents

클로닝된 뉴클레오티드 서열로부터의 약독화된 키메릭호흡기 신시티움 바이러스 백신의 제조 Download PDF

Info

Publication number
KR100746979B1
KR100746979B1 KR1020017013099A KR20017013099A KR100746979B1 KR 100746979 B1 KR100746979 B1 KR 100746979B1 KR 1020017013099 A KR1020017013099 A KR 1020017013099A KR 20017013099 A KR20017013099 A KR 20017013099A KR 100746979 B1 KR100746979 B1 KR 100746979B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rsv
chimeric
gene
delete delete
protein
Prior art date
Application number
KR1020017013099A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20020013526A (ko
Inventor
피터 엘. 콜린스
브라이언 알. 머피
스티븐 에스. 화이트헤드
Original Assignee
더 가버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬스 앤 휴먼 서비씨즈
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/291,894 external-priority patent/US6689367B1/en
Application filed by 더 가버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬스 앤 휴먼 서비씨즈 filed Critical 더 가버먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 리프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬스 앤 휴먼 서비씨즈
Publication of KR20020013526A publication Critical patent/KR20020013526A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100746979B1 publication Critical patent/KR100746979B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18541—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18543—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18561—Methods of inactivation or attenuation

Abstract

키메릭 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV) 및 그의 백신 조성물은 상이한 아군 또는 균주의 수용체 RSV 배경에 하나의 RSV 아군 또는 균주로부터의 1개 이상의 이형 유전자(들) 또는 유전자 절편(들)을 도입함으로써 제조된다. 생성되는 키메릭 RSV 바이러스 또는 서브 바이러스 입자는 감염성이고 바람직하게는 키메릭 게놈 또는 안티게놈에 약독화된 표현형을 특정하는 선택된 돌연변이를 도입함으로써 약독화되어 예를 들면, 온도 민감성 (ts)이고(이거나) 저온 적응된 (ca) 백신 균주를 생산하게 된다. 또한, 키메릭 RSV 및 그의 백신 조성물은 감염성 키메릭 RSV에 바람직한 구조 및(또는) 표현형 특징을 특정하는 다른 돌연변이를 혼입시킨다. 이러한 키메릭 RSV는 키메릭 RSV 클론에 1개 이상의 선택된 뉴클레오티드 서열(들), 유전자(들), 또는 유전자 절편(들)을 삽입, 결실, 치환 또는 재배열시켜 혼입한다. 이는 이형 균주의 방어 항원을 발현시키기 위해 벡터로서 통상적인 약독화 골격을 사용함으로써 다양한 RSV 균주에 대한 신규한 백신을 개발하는 방법을 제공한다. 개체의 면역 시스템은 천연적인 RSV 감염에 대한 방어, 바람직하게는 다중 RSV 순주 및(또는) 아군에 대한 방어를 얻기 위한 다각적인 방법으로 유도하기 위해 자극된다.
키메릭 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV), 약독화, 백신 조성물.

Description

클로닝된 뉴클레오티드 서열로부터의 약독화된 키메릭 호흡기 신시티움 바이러스 백신의 제조{PRODUCTION OF ATTENUATED CHIMERIC RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINES FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES}
<관련 출원>
본원은 1997년 5월 23일 출원된 미국 임시 출원 번호 제60/047,634; 1997년 5월 9일 출원된 제60/046,141호; 및 1996년 7월 15일 출원된 제60/021,773호의 부분 연속 출원인, 199년 7월 15일 출원된 미국 특허 출원 번호 제08/892,403호의 잇점을 청구하며 그의 부분 연속 출원이고, 상기 각각의 출원은 참고로 본원에 혼입된다.
사람 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV)는 1살 이하의 유아에서 폐렴 및 세기관지염의 원인으로서 모든 다른 미생물 병원체를 능가한다. 사실상 모든 아이들은 2살까지 감염되고, 재감염은 더 큰 아이들 및 젊은 성인에서 상당한 빈도로 발생한다 (Chanock et al., Viral Infections of Humans, 3rd ed., A.S. Evans, ed., Plenum Press, N.Y. (1989)). 호흡기계 질환에 의해 소아 병원에 입원하는 5개 경우 중 1개 이상이 RSV 때문이고, RSV는 미국에서만 1년에 91,000건의 입원과 4,500건의 사망을 일으키는 것으로 평가된다. 대부분의 건강한 성인들은 RSV 감염에 의한 심각한 질병을 갖지 않는다고 하더라고, 노인 환자들 및 면역 타협 환자들은 흔 히 이러한 병원체로부터 심각하고 생명을 위협할 수도 있는 감염을 당하게 된다.
RSV에 대해 효과적인 백신제제를 개발하기 위한 수십년 간의 연구에도 불구하고, RSV 감염과 관련된 심각한 질병율 및 현저한 사망율을 억제하기 위한 안전하고 효과적인 백신이 아직 개발되지 않았다. 성공적인 백신 개발의 실패는 부분적으로 어린 유아들이 RSV 항원에 대한 혈청 및 분비 항체 반응을 감소시킨다는 사실에 관련된다. 그러므로, 이들 유아들이 RSV로부터 더 심각한 감염을 당하게는 되지만, 총체적인 면역성이 더욱 심각한 바이러스의 충격에 대해 더 큰 아이들 및 성인을 방어하는 듯하다. 항바이러스 화합물인 리바바린 (ribavarin)은 입원 기간을 단축시키고 유아의 유지 요법에 대한 요구를 감소시킨다는 증거는 없지만 심각하게 감염된 유아의 치료 가망성이 있다.
최근 RSV 감염에서의 면역 기전에 관심이 집중되었다. 분비 항체는 상기도를 방어하는 데 가장 중요한 것으로 보이지만, 높은 수준의 혈청 항체는 하기도에서의 RSV 감염에 대한 내성에 주요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. RSV를 중화시키는 높은 역가의 항체를 함유하는 정제된 사람 면역 글로불린은 유아 및 어린 아이들의 심각한 하기도 질환에 대한 몇몇 경우의 면역요법적 치료에서 유용할 수 있다. 그러나, 면역 글로불린 제제는 혈액에서 유래되는 바이러스를 옮길 가능성 및 제조 및 보관의 어려움 및 비용과 같은, 여러가지 단점을 갖는다.
RSV-특이성 세포독성 T 세포 및 유도된 면역성의 또다른 에펙터 암 (effector arm)은 또한 RSV 감염을 해결하는 데 중요하다. 그러나, 상기 후자의 에펙터가 바이러스 감염에 대한 증가된 내성을 일으키기 위해 이전의 면역화에 의해 강화될 수 있으나, 효과는 오래가지 않는다. F 및 G 표면 당단백질은 RSV의 2개의 주요한 방어 항원이고, RSV를 중화시키는 항원을 유도하고 감염에 대한 장기간 내성을 갖는 오직 2개의 RSV 단백질이다 (Collins et al., Fields Virology, Fields et al., eds., 2:1313-1352. Lippincott-Raven, Philadelphia. (1996); Connors et al., J. Virol. 65(3):1634-7 (1991)). 제3 RSV 표면 단백질, SH는 RSV를 중화시키는 항체 또는 RSV 감염에 대한 현저한 내성을 유도하지 않는다.
생 RSV 백신 개발에 대한 하나의 장애는 약독화와 면역원성 사이의 적당한 균형을 이루는 데 있는 어려움이다. 약독화된 바이러스의 유전적 안정성이 또한 하나의 문제일 수 있다. 백신 개발은 또한 세포 배양에서의 RSV의 비교적 열악한 성장 및 바이러스 입자의 불안정성에 의해 방해된다. RSV 감염의 또다른 특징은 유도된 면역성이 이후 감염을 완전히 방어하지 않는다는 것이다. 아마도 호흡기도의 내강 표면 상의 바이러스 감염을 억제하는 데 있어서 면역계의 상대적 비효율성, 오래가지 않는 국소적 점막 면역성, 신속하고 강력한 바이러스 복제, 면역학적 비성숙에 의한 아이들의 감소된 면역 반응, 태반을 통해 모체로부터 유도된 혈청 항체에 의한 면역 억제, 및 G 단백질의 높은 수준의 글리코실화와 같은 바이러스의 특정한 성질을 포함한 수많은 인자가 여기에 기여할 것이다. 또한, 하기에 기술되겠지만, RSV는 2개의 항원 아군 A 및 B로서 존재하고, 하나의 아군에 대한 면역성은 다른 아군에 대해 그 효과가 감소한다.
죽을 때까지 RSV는 수회 재감염될 수 있지만, 재감염은 통상적으로 이전의 감염에 의해 유도된 방어적 면역성에 의해 심각성은 감소되고, 그로 인해 면역학적 예방이 가능하다. 생 약독화된 RSV 백신은 비강으로 투여되어 온화한 면역화 감염을 시작할 것이다. 이는 비경구 경로와 비교해서 간결하고 안전한 인점을 갖는다. 이는 또한 국소적 호흡기 면역성의 직접적인 자극을 제공하고, RSV에 대한 내성에 주요한 역할을 한다. 이는 또한 RSV-특이성인 모체로부터 유도된 혈청 항체의 면역 억제 효과를 제거하고, 전형적으로 매우 젊은 사람에게서 나타난다. 또한, RSV 항원을 비경구 투여하면 때때로 면역병리학적 합병증을 일으킬 수 있으나 (Murphy et al., Vaccine 8(5):497-502 (1990)), 이는 살아 있는 바이러스로는 나타나지 않았다.
포르말린 불활성화 바이러스 백신을 1960년대 중반에 RSV에 대하여 시험하였으나, RSV 감염 또는 질병을 방어하는 데는 실패했고, 사실 바이러스에 의한 이후 감염에 의한 증상을 악화시켰다. (Kim et al., Am. J. Epidemiol., 89:422-434 (1969), Chen et al., Am. J. Epidemiol., 89:449-463 (1969); Kapikian et al., Am. J. Epidemiol., 89:405-421 (1969)).
더욱 최근에, RSV 백신 개발은 약독화된 RSV 돌연변이에 집중되었다. 문헌 [Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968)]은 후보 백신이 되기 위해 충분히 약독화된 것으로 보이는 RSV의 저온 계대 배양된 (cold passaged) 돌연변이 (cpRSV)를 보고하였다. 이 돌연변이는 야생형 (wt) 부모형 바이러스와 비교하여 26oC에서 약간 증가된 성장 효율을 나타냈지만, 그의 복제는 온도 민감성 도 아니고 현저하게 저온 적응되지도 않았다. 그러나, 저온 계대 배양된 돌연변이는 성인을 위해 약독화되었다. RSV로 이전에 감염되었던 유아 및 아이들을 위해 만족스럽게 약독화되고 면역원성이라 하더라도 (즉, 혈청 양성 개체들), RSV 돌연변이는 혈청 음성 유아의 상기도에 대해 낮은 독성을 가졌다.
유사하게는, 문헌 [Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421 (1969)]은 유망한 백신 후보이기도 한 온도 민감성 RSV (tsRSV) 돌연변이의 분리를 보고하였다. 하나의 돌연변이, ts-1을 실험실에서 그리고 지원자들로 집중적으로 평가하였다. 돌연변이는 성인 지원자에게 무증상 감염을 일으켰고 면역화시키고 45일 후에 야생형 바이러스의 감염에 대해 내성을 제공하였다. 또한, 혈청 양성 유아 및 아이들은 무증상 감염되었으나, 혈청 음성 유아는 비염 및 다른 경미한 증상의 징후를 나타내었다. 또한, 온도 민감성의 부분적 또는 완전한 손실이 백신을 맞은 개체로부터 회수될 수 있는 작은 비율의 바이러스를 재현하고 경미한 비염외 다른 질병의 징후와 관련되지 않는다 하더라도, ts 표현형의 불안정성이 검출되었다.
이들 및 다른 연구는 특정한 저온 계대 배양되고 온도 민감성인 RSV 균주가 불충분하게 약독화되어 몇몇 백신을 맞은 개체들, 특히 혈청 음성 유아에서 경미한 증상의 질병을 일으켰고, 다른 균주들은 과도하게 약독화되어 방어적 면역 반응을 유도하기 위해 충분히 복제하는 데 실패하였음을 보여 주었다 (Wright et al., Infect. Immun., 37:397-400 (1982)). 또한, 후보 백신 돌연변이의 유전학적 불안정성은 그들의 온도 민감성 표현형의 손실을 초래하였고, 나아가 효과적인 RSV 백신의 개발을 방해하였다. 일반적으로 문헌 [Hodes et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 145:1158-1164 (1974), McIntosh et al., Pediatr. Res. 8:689-696 (1974), 및 Belshe et al., J. Med. Virol., 3:101-110 (1978)] 참조.
저온 계대 배양과 같은 특정되지 않은 생물학적 방법을 통해 적합하게 약독화된 RSV 균주를 제조하는 연구를 포기하고, 연구자들은 정제된 RSV 엔벨로프 (envelope) 당단백질을 사용하여 서브유닛 백신 후보를 시험하였다. 당단백질은 코튼 랫트 (cotton rats)의 폐의 RS 바이러스 감염에 대해 내성을 유도하였으나 (Walsh et al., J. Infect. Dis. 155:1198-1204 (1987), 항체는 매우 약한 중화 활성을 가지고 정제된 서브유닛 백신으로 설치류를 면역화시키면 질병이 악화되었다 (Murphy et al., Vaccine 8:497-502 (1990)).
F 및 G 엔벨로프 당단백질을 발현시키는 우두 바이러스 재조합 기저 백신이 또한 시험되었다. 이들 재조합체는 원래 바이러스 대응물과 구별할 수 없는 RSV 당단백질을 발현시키고, 우두-RSV F 및 G 재조합체로 피내 감염된 설치류는 바이러스 감염성을 중화시키는 높은 수준의 특이 항체를 발생시켰다. 사실, 우두-F 재조합체로 코튼 랫트를 감염시키면 하기도에서 RSV의 복제에 대해 거의 완전한 내성 및 상기도에서 현저한 내성이 자극되었다. (Olmsted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7462-7466 (1986)). 그러나, 우두-f 및 G 재조합체로의 침팬지 면역화는 상기도의 RSV 감염에 대해 거의 방어를 거의 나타내지 않았고 (Collins et al., Vaccine 8:164-168 (1990)) 하기도에 일관성 없는 방어를 나타내었다 (Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993)).
RSV 백신 개발을 위한 약독화된 RSV 균주, 서브유닛 백신 및 다른 전략에 대한 만족스럽지 않은 전망은 신규한 RSV 백신을 개발하기 위한 새로운 방법, 특히 생육될 수 있는 약독화된 RSV 재조합체의 새로운 표현형 성질을 얻기 위한 유전학적 변화를 혼입하기 위해 재조합 RSV를 조작하는 방법에 대한 요구를 강조하게 한다. 그러나, RSV 및 다른 역방향 프라이머 RNA 바이러스의 게놈 RNA 조작은 이제까지 어려운 것으로 증명되었다. 이러한 점에서 주요한 장애는 이들 바이러스의 나출된 (naked) 게놈 RNA의 비감염성, 조직 배양에서의 열악한 성장, 긴 복제 주기, 바이러스 입자 불안정성, 복합체 게놈, 및 유전자 생성물의 불응성 조직화 등이다.
재조합 DNA 기술은 cDNA로부터 감염성 음성-스트랜드 DNA 바이러스를 회수하고, 바이러스 클론을 유전학적으로 조작하여 신규한 백신 후보물질을 구성하고, 약독화 및 표현형 안정성의 수준을 신속하게 평가하는 것을 가능하게 하였다 (Conzelmann, J. Gen. Virol. 77:381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11354-58 (1996) 참조). 본원 명세서에서, 재조합 레스큐 (rescue)는 필수 바이러스 단백질의 존재 하에서 cDNA-코딩된 안티게놈 RNA로부터 감염성 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV), 파라인플루엔자 바이러스 (PIV), 광견병 바이러스 (RaV), 소포성 구내염 바이러스 (VSV), 홍역 바이러스 (MeV), 및 센다이 바이러스 (SeV)를 위해 보고되었다 (예를 들면, Garcin et al., EMBO J. 14:6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14:5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13:4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:8388-92 (1995); Hoffman et al., J Virol. 71:4272-4277 (1997); Kato et al., Genes to Cells 1:569-579 (1996), Roberts et al., Virology 247(1), 1-6 (1998); Baron et al., J Virol. 71:1265-1271 (1997); 국제 공개 번호 WO 97/06270; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567 (1995); 1997년 7월 15일에 출원된 미국 특허 출원번호 제08/892,403호 (공개된 국제 출원번호 WO 98/02530 및 1997년 5월 23일 출원된 미국 임시 출원번호 제60/047,634호, 1997년 5월 9일 출원된 제60/046,141호 및 1996년 7월 15일 출원된 제60/021,773호의 우선권에 상응함); Juhasz et al., J. Virol. 71(8):5814-5819 (1997); He et al., Virology 237:249-260 (1997); Baron et al., J. Virol. 71:1265-1271 (1997); Whitehead et al., Virology 247(2):232-9 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 72(5):4467-4471 (1998b); Jin et al., Virolory 251:206-214 (1998); Bucholz et al., J. Virol. 73:251-259 (1999); 및 Whitehead et al., J. Virol. 73:(4)3438-3442 (1999) 참조, 각 문헌은 본원에 참고로 혼입됨).
RSV 백신 개발에 대해 남아 있는 해결 과제는 광범위하게 존재하고 나타나는 RSV 균주 및 아군에 대해 효과적인 백신 후보물질을 얻는 어려움이다. 특히, RSV 아군 B-특이성 백신 바이러스 및 RSV A 및 RSVB 아군 모두에 대한 방어를 제공하는 다가 백신을 제공하는 것이 유용할 것이다. 본원 명세서에서, 최근 연구는 바이러스 균주 사이에 항원 결정인자를 갖는 키메릭 바이러스를 개발하는 것에 집중되었다. 예를 들면, 인자 파라인플루엔자 바이러스 유형 3 (PIV3)의 HN 및 G 당단백질은 사람 파라인플루엔자 바이러스 유형 1 (HPIV1)의 당단백질에 의해 대체되었고, 그 결과 생성되는 키메릭 바이러스는 그의 야생형 부모형과 유사한 효능으로 세포 배양 및 실험 동물에서 성장하였다 (Tao et al., J. Virol. 72(4):2955-61 (1998), 본원에 참고로 혼입됨). 또한 H 및 F 당단백질이 소포성 구내염 바이러스의 G 당단백질로 대체된 키메릭 홍역 바이러스가 보고되고, 이는 G의 세포질 및 경막 영역이 홍역 바이러스 G로 대체되는 것에 상관 없이 삽입되었다 (Spielhofer et al., J. Virol. 72(3):2150-9 (1998)). 이는 보고에 의하면 성자이 50배 감소된 키메릭 바이러스를 생산시켰다. 제3의 예에서, 문헌 [Jin et al., Virology 251(1):206-14 (1998)]은 추가의 유전자로서 아군 B RSV의 G 단백질을 발현시키는 아군 A 바이러스를 보고한다. 그러나, F 단백질이 또한 현저한 아군 특이성을 나타내므로, 아둔 B-특이성 백신에서 아군 B 당단백질 모두를 발현시키는 것이 바람직할 것이다. 또한, 케메릭 A-B 바이러스의 생산은 적합한 약독화 및 독성을 얻기 위해 추가의 변형 없이 생육될 수 있는 백신 후보물질을 생산하지 않을 것이다.
따라서, 당업계에는 RSV에 의한 심각한 건강 문제를 경감시키는 안전하고 효과적인 백신, 특히 RSV의 복합적으로 존재하고 나타나는 균주 및 아군에 대해 효과적일 백신을 제조하는 수단 및 방법에 대한 긴급한 요구가 남아 있다. 상당히 놀랍게도, 본 발명은 이들 및 다른 관련 요구를 만족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 감염성이고 사람 또는 다른 포유 동물에서 예방 또는 치료적 면역 반응을 유도하는 키메릭, 재조합 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV)를 제공한다. 관 련 측면에서, 본 발명은 백신 용도로 적합한 약독화된, 키메릭 RSV를 설계하고 제조하기 위한 신규한 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명에는 상이한 RSV 균주 또는 아군 바이러스의 1개 이상의 이형 유전자(들) 또는 유전자 단편(들)과 결합된 1개의 RSV 균주 또는 아군 바이러스의 부분적 또는 완전한 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 신규한, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자 및 이러한 분자를 혼입시킨 벡터가 포함된다. 또한 본 발명은 RSV 감염의 예방 및 치료를 위한 키메릭 재조합 RSV를 혼입시키는 방법 및 혼입시킨 조성물을 제공한다.
본 발명의 키메릭 RSV는 감염성, 키메릭 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 제조하는 1개 이상의 RSV 균주 또는 아군으로부터의 뉴클레오티드 서열을 혼입시키기 위해 재조합적으로 제조되었다. 이 방법으로, 후보 백신 바이러스는 사람 및 사람이 아닌 영장류를 포함한, RSV에 감염되기 쉬운 포유류 숙주에서 RSV에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 재조합적으로 제조되었다. 본 발명에 따른 키메릭 RSV는 특이적 RSV 아군 또는 균주에 대한 면역 반응 또는 다수의 RSV 아군 또는 균주에 대한 다특이성 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 예시적 키메릭 RSV는 키메릭 RSV 게놈 또는 항원 및 주요한 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰 중합효소 단백질 (L) 및 RNA 중합효소 신장 인자를 혼입시킨다. 추가의 RSV 단백질은 일련의 감염성 서브 바이러스 입자 및 완전한 바이러스 입자를 제공하기 위한 다양한 조합에 포함될 수 있다.
본 발명의 키메릭 RSV는 키메릭 RSV 게놈 및 안티게놈을 형성하기 위해 상이한 RSV 균주 또는 아군 바이러스의 1개 이상의 이형 유전자(들) 또는 유전자 절편(들)과 결합된 1개의 RSV 균주 또는 아군 바이러스로부터의 부분적 또는 완전한 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함한다. 본 발명의 바람직한 면에서, 키메릭 RSV는 상이한 사람 RSV 아군 또는 균주로부터의 1개 이상의 이형 유전자(들) 또는 유전자 절편(들)과 결합된 1개의 RSV 아군 또는 균주의 부분적 또는 완전한 사람 RSV 게놈 또는 안티게놈을 혼입시킨다. 예를 들면, 키메릭 RSV는 사람 RSV B 아군 바이러스로부터의 1개 이상의 이형 유전자(들) 또는 유전자 단편(들)과 결합된 부분적 또는 완전한 사람 RSV A 아군 게놈 또는 안티게놈이 포함된 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 혼입시킬 수 있다.
1개의 RSV 또는 아군으로부터의 이형 유전자 또는 유전자 절편은 "수용체" 게놈 또는 안티게놈과 결합되거나 또는 그 안에 치환된 "공여체" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 재현한다. 수용체 게놈 또는 안티게놈은 대체로 신규한 표현형 특성을 나타내는 키메릭 RSV를 얻기 위해 이형 유전자 또는 유전자 절편을 들여오기 위한 "골격" 또는 벡터로서 작용한다. 예를 들면, 선택된 수용체 RSV 균주 내 이형 유전자 또는 유전자 절편의 부가 또는 치환은 약독화, 성장 변화, 변화된 면역원성, 또는 변화되지 않은 수용체 및(또는) 공여체의 상응하는 표현형(들)과 비교하여 다른 바람직한 표현형 변화를 초래할 수 있다. 본 발명 내에서 이형 삽입물 또는 첨가물로서의 용도를 위해 선택될 수 있는 유전자 또는 유전자 절편은 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 또는 G 단백질 또는 그의 부분을 포 함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 키메릭 RSV는 RSV, F, G 또는 SH 당단백질을 코딩하는 1개 이상의 이형 유전자(들)을 혼입시킨다. 또한, 키메릭 RSV는 RSV, F, G 또는 SH 당단백질의 세포질 도메인, 경막 도메인, 엑토도메인 또는 면역원성 에피토프를 혼입시킬 수 있다. 이들 면역원성 단백질, 도메인 및 에피토프는 면역화된 숙주에서 신규한 면역 반응을 발생시킬 수 있기 때문에 키메릭 RSV 내에서 특히 유용하다.
예를 들면, 상이한 RSV 아군 또는 균주의 수용체 게놈 또는 안티게놈 내에 1개의 공여체 RSV 아군 또는 균주로부터의 1개 이상의 면역원성 유전자(들) 또는 유전자 절편(들)을 부가 또는 치환하는 것은 공여체 아군 또는 균주 또는 공여체 및 수용체 아군 또는 균주 모두에 대한 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 하나의 예시적 실시양태에서, 1개 이상의 사람 RSV 아군 B 당단백질 유전자 F, G 및 SH 또는 세포질 도메인, 경막 도메인, 엑토도메인 또는 그의 면역원성 에피토프는 RSV A 게놈 또는 안티게놈에 부가되거나 또는 그 안에 대체된다.
본 발명의 추가의 면에서, 약독화된, 케메릭 RSV는 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 약독화 표현형을 특정하는 1개 이상의 약독화 점 돌연변이를 도입함으로써 추가로 변형된다. 이들 점 돌연변이는 드 노보 경로로 발생될 수 있고 합리적인 설계의 돌연변이 전략에 따라 효과를 약화시키기 위해 시험될 수 있다. 또한, 약독화된 점 돌연변이는 생물학적으로 유도된 돌연변이 RSV에서 동정되고 이후 본 발명의 키메릭 RSV로 혼입된다.
바람직하게는, 본 발명의 키메릭 RSV는 공지의 생물학적으로 유도된 RSV 균주의 패널로부터 동정된 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상의 약독화 점 돌연변이의 혼입에 의해 약독화된다. 본원에 기술된 바람직한 돌연변이체 RSV 균주는 저온 계대 배양 (cp) 및(또는) 온도 민감성 (ts) 돌연변이체, 예를 들면, "cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSB B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542), 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)"로 표시되는 돌연변이체이다 (각각은 미국 20110-2209 버지니아주, 마나싸스, 유니버시티 블루바드 10801에 소재하는 어메리컨 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 부다페스트 조약으로 기탁됨). 생물학적으로 유도된 돌연변이체의 이 예시적 패널로부터, 백신 용도를 위한 재조합, 키메릭 RSV에서의 약독화 수준을 측정하기 위한 패널 내 다른 돌연변이(들)과 각각 결합될 수 있는 다양한 "메뉴"의 약독화 돌연변이가 제공된다. 추가의 돌연변이는 예를 들면, 작은 플라크 (sp), 저온 적응되거나 (ca) 또는 숙주 범위로 제한된 (hr) 돌연변이체 균주에서 동정된 바대로 비-ts 및 비-cp 약독화 돌연변이를 갖는 RSV로부터 유래될 수 있다.
또한 본 발명의 추가의 면에서, 키메릭 RSV는 약독화 점 돌연변이 유무에 상관 없이, 바람직한 표현형의, 구조적, 또는 기능적 변화를 얻기 위해 비점 뉴클레오티드 변화에 의해 돌연변이된다. 대체로, 선택된 뉴클레오티드 변형은 표현형 변화, 예를 들면 성장 특성, 약독화, 온도 민감성, 저온 적응, 플라크 크기, 숙주 범위 제한, 또는 면역원성에서의 변화를 특정할 것이다. 구조 또는 기능적 변화는 조작 및 동정을 용이하게 하기 위해 RSV를 코딩하는 cDNA들로 제한 부위가 도입되거나 또는 이 부위를 제거하는 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, SH, NS1, NS2 또는 G 유전자는 예를 들면, 유전자의 결실 또는 그 발현의 제거에 의해 키메릭 RSV에서 변형된다. 또한, 뉴클레오티드 변형은 선택된 RSV 유전자를 위한 시스-작용 조절 서열의 결실, 삽입, 첨가 또는 재배열을 포함할 수 있다.
하나의 실시예에서, 1개의 RSV 유전자의 시스-작용 조절 서열은 이형 조절 서열에 상응하도록 변화되고, 이는 상이한 RSV 에서 동일한 유전자의 대응물 시스-작용 조절 서열 또는 상이한 RSV 유전자의 시스-작용 조절 서열일 수 있다. 예를 들면, 유전자 말단 신호는 동일한 RSV 균주에서 상이한 유전자의 유전자 말단 신호로 변환 또는 치환됨으로써 변형될 수 있다.
다른 실시예에서, 뉴클레오티드 변형은 예를 들면, 선택된 형태의 단백질을 위한 대체적인 번역 개시 부위를 제거하기 위해, 키메릭 게놈 또는 안티게놈 내의 번역 개시 부위의 삽입, 결실, 치환 또는 재배열을 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 분비 형태의 RSV G 단백질을 위한 번역 개시 부위는 이런 형태의 G 단백질의 발현을 변화시키기 위해 제거되고 이로 인해 바람직한 생체 내 효과를 발생시킨다.
추가의 변형이 키메릭 게놈 또는 안티게놈으로 사이토킨과 같은 비RSV 분자, T-헬퍼 에피토프, 제한 부위 마커 또는 포유류 숙주에서의 병원체에 대한 방어적 면역 반응을 유도할 수 있는 미생물 병원체의 단백질을 도입시키는 변형을 포함한, 본 발명에 따른 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈에 대해 이루어 졌다. 이러한 실시양태에서, 파라인플루엔자 바이러스 (PIV)로부터, 예를 들면 PIV HN 또는 F 당단백질 또는 면역원성 도메인 또는 그의 에피토프로부터의 유전자 또는 유전자 절편을 혼입시키는 키메릭 RSV가 구성된다.
백신 용도로 설계되고 선택된 키메릭 RSV는 흔히 광범위한 임상 용도를 위해 만족스러운 수준의 약독화를 얻기 위해 2개 이상 및 때때로 3개 이상의 약독화 돌연변이를 갖는다. 하나의 실시양태에서, 1개 이상의 약독화 돌연변이가 RSV 중합효소 유전자 (공여체 또는 수용체 유전자에서)에서 발생하고 온도 민감성 (ts) 표현형을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있는 약독화 표현형을 특정하는 중합효소 단백질에서 아미노산 변화를 특정하는 1개 이상의 뉴클레오티드 치환(들)을 포함한다. 본원 명세서에서 예시적 키메릭 RSV는 Phe831이 Leu, Gln831이 Leu, Met1169이 Val 및 Tyr1321이 Asn으로 변화됨으로써 예시된, 아미노산 Phe831, Gln831 , Met1169, 및 Tyr1321에서의 아미노산 변화를 초래하는 큰 중합효소 유전자 L에 1개 이상의 뉴클레오티드 치환체를 혼입시킨다. 이 위치에서 다른 선택적인 아미노산 배정이 물론 동정된 돌연변이 치환과 유사한 효과를 얻기 위해 이루어질 수 있다. 본원 명세서에서, 돌연변이체 바이러스에서 동정된 변화에 통상적으로 상응하는 돌연변이 부위에서의 변화를 코딩하는 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 아미노산 치환이 상응하는 야생형 서열과 비교해 돌연변이체 바이러스에서의 돌연변이 부위를 표시한다면, 유사한 치환이 재조합 바이러스 에서 상응하는 잔기(들)에서 이루어질 수 있다. 바람직하게는 치환은 돌연변이체 바이러스 단백질에 존재하는 대체 잔기와 동일하거나 통상적인 아미노산을 포함할 것이다. 그러나, 돌연변이체 단백질에서 대체 잔기에 대해 비 통상적으로 돌연변이 부위에서의 천연 아미노산 잔기를 변화시키는 것이 또한 가능하다 (예를 들면, 야생형 잔기의 정체성 및 기능을 파괴하거나 또는 손상시키기 위해 다른 아미노산을 사용함으로써). 결실 또는 삽입에 의해 표시된 돌연변이의 경우에, 이들은 재조합 바이러스에 상응하는 결실 또는 삽입으로서 도입될 수 있으나, 결실되거나 삽입된 단백질 단편의 특정한 크기 및 아미노산 서열은 다를 수 있다. 본 발명의 키메릭 RSV는 예를 들면, M2 유전자에서, L 및 추가의 RSV 유전자에서 ts 돌연변이를 혼입시킬 수 있다.
바람직하게는, 2개 이상의 뉴클레오티드 변화는 약독화 돌연변이를 특정하는 코돈, 예를 들면, ts 돌연변이를 특정하는 코돈에 혼입되고, 이로 인해 약독화된 표현형으로부터의 반전의 가능성이 감소된다.
약독화 돌연변이는 공여체 또는 수용체 RSV 유전자의 코팅 부분 또는 시스 조절 서열과 같은 비코딩 영역에서 선택될 수 있다. 예시적 비코딩 돌연변이는 뉴클레오티드 7605 (재조합 서열에서 뉴클레오티드 7606)의 M2 유전자 출발 서열에서 단일 또는 다수 염기 치환에 의해 예시된 바대로, 유전자 개시 서열에서의 단일 또는 다수 염기 변화를 포함한다.
본 발명의 또다른 면에서, 조성물 (예를 들면, RSV-코딩 cDNA를 혼입시키는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 벡터) 및 방법이 단리된 감염성 키메릭 RSV를 제조하 기 위해 제공된다. 이들 조성물 및 방법을 사용하여, 감염성 키메릭 RSV는 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈, 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰 (L) 중합효소 단백질 및 RNA 중합효소 신장 인자로부터 생성된다. 본 발명의 관련된 측면에서, 조성물 및 방법이 감염성 약독화 백신 바이러스를 얻기 위해 재조합 키메릭 RSV로 상기 언급된 구조 및 표현형 변화를 도입시키기 위해 제공된다.
하나의 실시양태에서, 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 또한 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질을 코딩하는 1개 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 동일하거나 또는 상이한 발현 벡터가 제공된다. 벡터(들)은 바람직하게는 세포 용해물 또는 세포 없는 용해물에서 발현되거나 또는 공발현되고, 이로 인해 감염성 키메릭 RSV 입자 또는 서브 바이러스 입자를 생성한다.
RSV 게놈 또는 안티게놈 및 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 (바람직하게는 RSV의 M2 (ORF1)의 생성물) 단백질은 동일하거나 또는 상이한 발현 벡터에 의해 공발현될 수 있다. 몇몇 경우에, N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질은 각각 상이한 발현 벡터 상에 코딩된다. 키메틱 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코팅하는 폴리뉴클레오티드 분자는 상이한 사람 RSV 아군 또는 균주의 키메라, 예를 들면 아군 B RSV로부터의 서열과 작동 가능하게 연결된 아군 A RSV로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 키메릭 게놈 또는 안티게놈은 사람 및 사람아닌 (예를 들면, 소 또는 쥐) RSV 서열의 키메라일 수 있다. 또한 본 발명의 또다른 면에서, 키메릭 게놈 및 안티게놈은 RAV 및 비 RSV 서열의 키메라, 예를 들면 PIV 서열과 작동 가능하게 연결된 사람 RSV로부터 온 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 키메릭 게놈 또는 안티게놈은 점 돌연변이, 부위 특이성 뉴클레오티드 변화 및 이형 공여체 유전자 또는 유전자 절편 또는 수용체의 골격 게놈 또는 안티게놈 내에 도입된 전체 유전자 또는 유전자 절편을 포함하는 변화를 포함한, 1개 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 재배열, 결실 또는 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이들 변형은 대체로 약독화, 온도 민감성, 저온 적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한, 유전자 발현 변형, 또는 면역원성 에피토프 변화를 초래하는 표현형 변화와 같은, 생성되는 재조합 RSV에서의 1개 이상의 표현형 변화(들)을 특정한다.
키메릭 RSV 제조를 위한 상기 방법 및 조성물은 감염성 바이러스 또는 서브 바이러스 입자, 또는 그의 유도체를 생산한다. 감염성 바이러스는 실제 RSV 바이러스 입자에 상당하고 감염성이다. 이것은 신선한 세포를 직접 감염시킬 수 있다. 감염성 서브 바이러스 입자는 대체로 적합한 조건 하에서 감염이 개시될 수 있는 바이러스 입자의 아성분이다. 예를 들면, 게놈 또는 안티게놈 RNA 및 N, P, L 및 M2 (ORF1) 단백질을 함유하는 뉴클레오캡시드는 세포의 세포질 내로 도입될 때 감염을 개시할 수 있는 서브 바이러스 입자의 예이다. 본 발명 내에 제공된 서브 바이러스 입자는, 특히 감염을 위해 필수적이지 않은 1개 이상의 단배질(들), 단백질 절편(들), 또는 다른 바이러스 성분(들)이 없는 바이러스 입자를 포함한다.
본 발명에 따른 감염성 키메릭 RSV는 RSV 또는 RSV류 바이러스, 예를 들면, 소, 쥐 (쥐의 폐렴 바이러스), 또는 조류 (칠면조 비기관염 바이러스)로부터, 또는 또다른 엔벨럽된 바이러스, 예를 들면, 파라인플루엔자 바이러스 (PIV)로부터 얻은 이형의 코딩 또는 비코딩 뉴클레오티드 서열을 혼입시킬 수 있다. 예시적 면에서, 재조합 RSV는 1개 이상의 이형 RSV 서열(들)과 재조합적으로 연결된 사람 RSV 게놈 또는 안티게놈 서열의 키메라를 포함한다. 예시적 이형 서열은 상이한 사람 RSV 균주로부터 온 서열과 결합된 1개의 사람 RSV 균주로부터 온 RSV 서열을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 키메릭 RSV는 2개 이상의 야생형 또는 돌연변이 RSV 균주, 예를 들면 cpts RSV 248, cpts 248/404, cpts 248/955, cpts RSV 530, cpts 530/1009 또는 cpts 530/1030로부터 선택된 돌연변이체 균주로부터 온 서열을 혼입시킬 수 있다. 또한, 키메릭 RSV는 2개 이상의 야생형 또는 돌연변이체 RSV 아군, 예를 들면 RSV 아군 A 및 아군 B의 조합으로부터 온 서열을 혼입시킬 수 있다. 추가의 면에서, 1개 이상의 사람 RSV 코딩 또는 비코딩 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 1개 이상의 선택된 약독화 점 돌연변이, 예를 들면 cp 및(또는) ts 돌연변이와 조합하여, 소 또는 쥐 RSV로부터 얻은 대응물 서열로 치환되어 신규한 약독화 백신 균주를 생산한다. 하나의 실시양태에서, 키메릭 소-사람 RSV는 사람 RSV NP 유전자 또는 유전자 절편이 대응물 소 NP 유전자 또는 유전자 절편으로 치환되고, 이 키메라는 임의로 SH 유전자 결실, 1개 이상의 cp 또는 ts 점 돌연변이, 또는 이들의 다양한 조합 및 본원에 개시된 다른 돌연변이를 혼입시키기 위해 구성될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 키메릭 RSV를 제조하기 위한 단리된 폴리뉴 클레오티드, 발현 벡터, 및 방법이 게놈 또는 안티게놈이 공여체 또는 수용체 서열과 비교해 재조합적으로 변화되어 제공된다. 특히, 돌연변이는 키메릭 RSV 클론의 구조 및(또는) 기능을 변화시키는 능력에 의해 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈 내로 예를 들면, 선택된 단백질 코딩되거나 또는 시스 작용하는 RNA 서열의 구조, 발현 및(또는) 기능을 변화시키고 이로 인해 바람직한 표현형 변화를 일으킴으로서 혼입된다. 바람직한 표현형 변화는 예를 들면, 배양에서의 바이러스 성장 변화, 온도 민감성, 플라크 크기, 약독화 및 면역원성을 포함한다.
본 발명의 한 면에서, 생물학적으로 유도된 돌연변이체 RSV로부터 순응된 상의 약독화 점 돌연변이를 갖는 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 및 발현 벡터가 제공된다. 이러한 실시양태에서, 1개 이상의 점 돌연변이가 ts 표현형을 특정하는 뉴클레오티드 치환을 포함하는 중합효소 유전자 L에 존재한다. 예시적 RSV 클론 및 벡터는 Phe521, Gln831, Met1169 또는 Tyr1321의 폴리메라제 유전자에서의 아미노산 변화를 초래하는 뉴클레오티드 치환을 혼입한다. 바람직하게는, 2 또는 3개의 돌연변이는 유전학적 안정성의 수준을 증가시키기 위해 약독화 돌연변이를 특정하는 코돈에 혼입된다. 다른 예시적 RSV들은 2개 이상의 약독화 ts 돌연변이를 혼입한다.
본 발명의 키메릭 DNA, 벡터 및 바이러스 입자 내에 혼입된 돌연변이는 개별적으로 또는 조합하여 전장 RSV cDNA로 도입될 수 있고 도입된 돌연변이를 함유하는 구조된 바이러스의 표현형은 용이하게 결정될 수 있다. 예시적 실시양태에서, 약독화된 생물학적으로 유도된 바이러스 대 야생형 RSV에 의해 나타나는 아미노산 변화, 예를 들면 cpRSV 또는 tsRSV에 의해 나타나는 변화는 바람직한 수준의 약독화를 얻기 위해 재조합 RSV 내에 조합하여 혼입된다.
본 발명은 또한 약독화된 감염성 바이러스 또는 서브 바이러스 입자를 생산하기 위해 키메릭 게놈 또는 안티게놈으로 선택된 조합으로 도입된 다수의 표현형 특이성 돌연변이를 혼입시키는 키메릭 RSV 클론, 벡터 및 입자를 제공한다. 이 방법은 통상적인 표현형 평가와 결합되어 약독화, 온도 민감성, 변화된 면역원성, 냉순은 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한 등과 같은 바람직한 특성을 갖는 키메릭 RSV를 제공한다. 이렇게 동정된 돌연변이는 "메뉴"로 축적되고 선택된 수준의 약독화, 면역원성 및 안정성으로 백신 바이러스를 보정하기 위해 다양한 조합으로 도입된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 생물학적으로 유도된 RSV로부터 채택된 1개 이상의 돌연변이, 예를 들면 cp 및 ts 돌연변이를 동일하거나 또는 상이한 유전자를 포함하는 추가 형태의 돌연변이로 보충하기 위해 제공한다. 본원 명세서에서 돌연변이 목적 유전자는 부착 (G) 단백질, 융합 (F) 단백질, 작은 소수성 (SH), RNA 결합 단백질 (N), 인단백질 (P), 큰 중합효소 단백질 (L), 전사 신장 인자 (M2), M2 ORF2, 매트릭스 (M) 단백질, 및 2개의 비구조적 단백질, NS1 및 NS2를 포함한다. 이들 단백질 각각은 전체적으로 또는 부분적으로, 단독으로 또는 다른 바람직한 변형체와 조합하여 결실되고, 치환되거나 또는 재배열되어 신규한 RSV 재조합체를 얻을 수 있다.
한 면에서, SH 유전자는 시험관 내 증가된 성장 및(또는) 생체 내 약독화를 포함한, 신규한 표현형 특성을 갖는 키메릭 RSV를 얻기 위해 공여체 또는 수용체 콘텍스트에서 결실된다. 관련된 면에서, 이러한 유전자 결실, 또는 NS1 또는 NS2 유전자 결실과 같은 또다른 선택된 비필수 유전자 또는 유전자 단편 결실은 케메릭 RSV가 약독화된 표현형을 특정하는 1개 이상의 개별적 돌연변이, 예를 들면 생물학적으로 유도된 RSV 돌연변이체로부터 직접 채택된 (또는 변형된 형태로, 예를 들면 돌연변이를 특정하는 코돈에서 다수의 뉴클레오티드 변화를 도입시킴으로써) 점 돌연변이와 결합된다.
예를 들면, SH 유전자 또는 NS2 유전자는 cpts 248/404, cpts 530/1009, cpts 530/1030 또는 또다른 선택된 돌연변이체 RSV 균주로부터 채택된 1개 이상의 cp 및 ts 돌연변이와 조합하여 결실되어 상이한 돌연변이의 혼합 효과에 의해 증가된 바이러스 생산, 증가된 약독화, 및 약독화된 표현형으로부터의 반전에 대한 유전적 내성을 갖는 키메릭 RSV를 얻을 수 있다.
또한, 다양한 다른 유전학적 변화는 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈에서 단독으로 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이체 RSV로부터 채택된 1개 이상의 약독화된 점 돌연변이와 함께 제조될 수 있다. 예를 들면, 비RSV 원료로부터 얻은 유전자 또는 유전자 절편은 전체 또는 부분적으로 삽입될 수 있다. 또한, 유전자 순서는 변화되고, 오버랩 유전자는 제거되거나 또는 RSV 게놈 프로모터는 그의 안티게놈 대응물로 치환될 수 있다. 키메릭 게놈 또는 안티게놈에서 상이하거나 또는 추가적인 변형이 유전자 간 다양한 영역 (예를 들면, G 및 F 유전자간의 독특한 Stul 부위) 또는 그 밖의 곳에서 독특한 제한 부위의 삽입과 같은 조작을 용이하게 하기 위해 이루어졌다. 비번역된 유전자 서열은 외부 서열을 삽입하는 능력을 증가시키기 위해 제거될 수 있다.
또한, 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터는 비 RSV 서열, 예를 들면 사이토킨, T-헬퍼 에피토프, 제한 부위 마커, 또는 계획된 숙주에서 방어적 면역 반응을 유도할 수 있는 미생물 병원체 (예를 들면, 바이러스, 박테리아 또는 진균)의 단백질을 코딩하기 위해 변형될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 상기 기술된 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터 및 RSV 의 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질을 코딩하는 1개 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터 (동일하거나 또는 상이한 벡터)를 함유하는 세포 용해물 또는 세포 없는 용해물을 제공한다. 게놈 또는 안티게놈 및 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질을 발현시키면 결합하여 감염성 RSV 바이러스 또는 서브 바이러스 입자를 생산한다.
본 발명의 약독화된 키메릭 RSV는 감염된 사람 숙주에서 방어적 면역 반응을 유도할 수 있으나, 면역화된 숙주에서 심각한 호흡기 질병의 허용되지 않는 증상을 일으키지 않도록 하기에 충분히 약독화되지 않는다. 약독화된 키메릭 바이러스 또는 서브 바이러스 입자는 세포 배양 상징액에 존재하고, 그 배양으로부터 단리되거나, 또는 부분적으로 또는 완전히 정제될 수 있다. 바이러스는 또한 동결건조되고, 바라는 대로 보관 또는 숙주로의 이동을 위해 다양한 다른 성분과 혼합될 수 있다.
본 발명은 또한 생리학적으로 허용되는 담체 및(또는) 보조제 및 상기 기술된 단리된 약독화 키메릭 RSV를 포함하는 신규한 백신을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 백신은 상기 기술된 바대로 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상의 약독화 돌연변이 또는 다른 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 백신은 103 내지 106 PFU의 약독화된 백신의 양으로 제제화될 수 있다. 백신은 단일 RSV 균주 또는 항원 아군, 예를 들면 A 또는 B, 또는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대한 면역 반응을 유도하는 약독화된 키메릭 바이러스를 포함할 수 있다. 이런 점에서, 본 발명의 키메릭 RSV는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대한 단일 특이성 면역 반응 또는 다특이성 면역 반응을 개별적으로 유도할 수 있다. 키메릭 RSV는 단일 또는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대해 더 효과적인 방어를 위한 상이한 면역원성 특성을 갖는 다른 키메릭 RSV 또는 비키메릭 RSV와 백신 제제로서 혼합될 수 있다.
관련된 면에서, 본 발명은 포유류 숙주에서 RSV의 1개 이상의 균주 또는 아군에 대한 면역 반응을 유도하는 개체의 면역계를 자극하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 생리학적으로 허용되는 담체 및(또는) 보조제 중 면역학적으로 충분한 양의 상기 기술된 약독화된, 키메릭 RSV 제제를 투여하는 것을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 면역원성 조성물은 상기 기술된 바대로 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상의 약독화 돌연변이 또는 다른 뉴클레오티드 변형을 갖는 키메릭 RSV를 포함하는 백신이다. 백신은 103 내지 106 PFU 양의 약독화된 바이러스로 제제화될 수 있 다. 백신은 단일 RSV 균주 또는 항원성 아군, 예를 들면 A 또는 B, 또는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대한 면역 반응을 유도하는 약독화된 키메릭 바이러스를 포함할 수 있다. 본원 명세서에서, 키메틱 RSV는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대해 단일 특이성 면역 반응 또는 다특이성 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, 상이한 면역원성 특성을 갖는 키메릭 RSV는 백신 혼합물로 혼합되거나 협동적 치료 프로토콜에서 개별적으로 투여되어 1개의 RSV 균주 또는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대해 더 효과적인 방어를 유도할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 쥐의 폐에서 일련의 아군 A 호흡기 신시티움 바이러스의 복제와 침팬지에서의 복제 사이의 실질적으로 완전한 상관 관계를 설명해주는 그래프이다.
도 2 및 3은 RSV 안티게놈 RNA를 코딩하는 cDNA 구성을 보여주고, 여기서 도 2는 cDNA의 구조 및 코딩된 안티게놈 RNA (측정하기 위한 것이 아님)을 보여준다. 본 발명의 도면 및 하기 모든 실시예에서, 사용된 특이성 cDNA 및 바이러스는 아군 A RSV의 균주 A2의 것이었다. 안티게놈 도표는 하기 특징을 포함한다: T7 프로모터에 의한 5'-말단 비바이러스 G 트리플렛, 1099 (길이에 1개의 nt를 부가함), 1139, 5611 및 7559 (새로운 제한 부위의 첫번째 염기를 의미하는 번호) 위치에 있는 4개의 서열 마커, 리보자임 및 종렬 T7 터미네이터 및 리보자임 절단에 의한 3' 말단에 부여되는 단일 비바이러스 3'-인산화된 U 잔기 (절단 부위는 화살표로 표시됨). 비바이러스 5'-GGG 및 3'-U 잔기가 본원에 주어진 길이에 포함되지 않고 이후 안티게놈을 위한 것임을 주목해야 한다. 그러나, 1099 위치에서의 뉴클레오티 드 삽입이 포함되고, 그로 인해 cDNA-유도된 안티게놈의 번호는 생물학적으로 유도된 안티게놈을 위한 것보다 이 위치 아래에 있는 더 큰 하나의 뉴클레오티드이다. D46의 5' 및 3' 정방향 프라이머 서열은 서열 번호 1로 도시되고, 여기서 4 위치의 뉴클레오티드는 C 또는 G일 수 있다. 또한 이 도면 및 전체를 통해 제한 부위에 할당된 서열 위치는 설명적 안내를 위한 것이고 단독으로 포함된 모든 뉴클레오티드를 한정하지 않음을 주목해야 한다. 여기서 그리고 명세서 전체를 통해 제한 단편에 할당된 길이 값은 길이 할당은 소화 이후 남게 되는 끈적이는 말단과 같은 인자에 의해 다를 수 있으므로, 설명을 위한 것이다. 응집체에서 완전한 안티게놈을 재현하는 클로닝된 cDNA 절편이 또한 제시된다. 박스는 플라스미드 벡터로부터 BamHI 제거를 도시하고, 조립을 촉진시키는 변형: 천연적으로 나타나는 BamHI-SalI 단편 (BamHI 부위는 밑줄친 정방향 프라이머에서 맨 윗선으로 도시됨)은 PCR-발생된 BglII-SalI 단편(BglII 부위는 밑줄친 가장 아래 선으로 도시됨; 그의 4-nt 점성 말단 (이탤릭체로 표시됨)은 BamHI의 말단과 경쟁적임)으로 대체되었다. 이는 아미노산 수준에서 없는 단일 nt 변화 (밑줄친 중간선)를 초래한다. 도 3은 cDNA 코딩된 안티게놈 RNA에 함유된 서열 마커를 도시하고, 여기서 서열은 정방향 프라이머이고 선도 영역의 첫번째 nt를 1로 하여 번호가 매겨지고; 각각 RSV 아군 A 및 B를 대표하는 균주 A2와 18537 사이를 동정하고, 점으로 표시되고; cDNA에서의 제한 부위를 나타내는 서열에 밑줄이 쳐져 있고; 유전자 출발 (GS) 및 유전자 말단 (GE) 전사 신호에 박스가 쳐져 있고; 1141 위치에서 N-번역 개방된 판독틀의 개시 코돈은 이탤릭체로 되어 있고, 제한 부위는 각가의 서열 밑에 나타낸다. 맨 위 서열에서, 단일 C 잔기는 1099 위치에 삽입되어 NS2-N 유전자간 영역에 AflII를 생성시키고, N 번역 개방된 판독틀의 바로 위 1139 및 1140 위치의 AG는 CC와 대체되어 새로운 NcoI 부위를 생성시켰다. 중간 서열에서, 각각 5612 및 5616 위치에 있는 G 및 U를 치환하여 G-F 유전자간 영역에 새로운 StuI 부위를 생성시켰다. 맨 아래 서열에서, 7560 위치의 C를 치환하여 F-M2 유전자간 영역에 새로운 SphI 부위를 생성시켰다.
도 4는 돌연변이 삽입, 완전한 안티게놈 구성체의 조립, 및 재조합 바이러스의 회수에 포함되는 cDNA (측정하기 위해 대략)의 구조를 도시한다. 4개 유형의 돌연변이를 맨 아래 줄에 도시된 pUC118- 또는 pUC119-유래 cDNA 서브클론, 즉 L 유전자에 있는 6개의 잠재성 제한 부위 (맨 위 D53 도표 위에 밑줄이 쳐져 있음), F 유전자에 있는 2개의 HEK 변화 (H), 5개의 cp 변화 (cp), 및 다양한 생물학적 돌연변이 유발 단계에 특이성인 돌연변이: 248, 404, 530, 1009 및 1030 (표시된 바대로)에 삽입시켰다. 돌연변이된 서브클론을 중간 줄에 도시된 D50 (리더로부터 M2-L의 개시 부위 까지의 RSV 안티게놈이 상기 리더 바로 위의 T7 프로모터와 겹침을 나타냄) 또는 D39 (M2-L로부터 트레일러까지의 RSV 안티게놈이 상기 트레일러 바로 아래의 T7 터미네이터와 겹침을 나타냄) 중간체 플라스미드에 삽입시켰다. 적합한 D50 및 D39를 맨윗줄에 도시된 전장 D53 안티게놈 cDNA로 조립하였다 (RTT는 2개의 T7 전사 터미네이터에 의해 이어지는 해머-헤드 리보자임의 위치를 나타냄).
도 5는 재조합 RSV를 회수하기 위해 사용된 6개의 돌연변이체 안티게놈 cDNA 의 지도를 제공한다. 재조합체의 ts 표현형은 상기 도면의 오른쪽에 요약된다.
도 6은 RSV 전사 신호에 의해 플랭크 (flank)된 CAT ORF를 함유하는 RSV 안티게놈을 코딩하는 D46/1024CAT cDNA의 구성을 도시한다 (측정하기 위한 것이 아님, RSV 특이성 절편은 닫힌 박스로서 도시되고 CAT 서열은 열린 박스로서 표시됨). CAT 유전자 전사 카세트의 원료는 RSV-CAT 미니게놈 cDNA 6196이었다 (맨 위 도표). RSV-CAT 미니게놈은 선도 영역, GS 및 GE 신호, 비코딩 (NC) RSV 유전자 서열, 및 CAT ORF를 GS 신호 및 이어지는 GE 신호 앞에 있는 XmaI 제한 뉴클레아제와 함께 함유한다. 이들 요소의 뉴클레오티드 길이가 표시되고, XmaI 부위를 둘러싼 서열 (정방향 프라이머)이 도표 위에 도시된다. 8-뉴클레오티드 XmaI 링커를 부모형 플라스미드 D46의 StuI 부위에 삽입시켜 플라스미드 D46/1024를 구성하였다. D46은 완전한 안티게놈 cDNA이고 D53과 동등하며; 명명에 있어서 차이는 이들이 2개의 상이한 제제를 나타냄을 의미하는 것이다. 플라스미드 6196의 Xma-XmaI 단편을 D46/1024에 삽입하여 플라스미드 D46/1024CAT를 구성하였다. D46 cDNA에 의해 코딩된 RNA는 바닥에 도시되고, 이는 T7 프로모터에 의해 제공되는 3개의 5'-말단 비바이러스 G 잔기 및 해머헤드 리보자임의 절단에 의해 제공되는 3'-인산화 U 잔기를 포함하고; 안티게놈을 위해 제공되는 뉴클레오티드 길이는 이들 비바이러스 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. L 유전자는 유전자 오버랩을 나타내기 위해 오프셋 (offset)으로 그려진다.
도 7은 RSV 안티게놈을 코딩하는 부모형 야생형 D46 플라스미드 (맨위) 및 SH 유전자가 결실된 D46/6368 유도체 (바닥)의 도표 (측정하기 위한 것이 아님)이 다. RSV 유전자는 각각 상위 및 하위 말단 상에 닫힌 박스로 도시된 GS 및 GE 전사 신호를 갖는 열린 사각형으로 도시된다. T7 프로모터 (왼쪽) 및 RNA 전사의 3' 말단을 생성하기 위해 사용된 해머헤드 리보자임 및 T7 터미네이터는 작은 열린 박스로서 도시된다. D46의 ScaI 및 PacI 단편을 짧은 합성 단편으로 대체하여 D46/6368을 얻었다. D46에서 SH 유전자를 플랭킹하는 서열, 및 D46/6368에서 있는 제조된 영역의 서열이 각각의 플라스미드 지도 위에 있는 박스로 프레임되어 도시된다. D46에서 ScaI-PacI 단편의 서열 및 D46/6368에서의 그의 치환은 고딕체로 도시되고 윗쪽으로 향하는 화살표로 구별된다. M GE, SH GS, SH GE 및 G GS 부위는 윗줄로서 표시된다. D46/6368에서 새로운 M-G 유전자간 영역은 그의 뉴클레오티드 길이를 표시하기 위해 바닥에 있는 도표에 65로 표지된다. SH-음성 D46/6368의 정방향 프라이머 T7 전사는 바닥에 도시되고; T7 프로모터에 의해 제공된 3개의 5'-말단 비바이러스 G 잔기 및 3-말단 U 잔기가 도시된다 (Collins, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567 (1995), 이는 참고로 본원에 혼입됨). 이들 비바이러스 뉴클레오티드는 길이 측정에 포함되지 않는다.
도 8은 SH 위치에서의 결실을 확인하기 위해 D46 야생형 또는 D46/6368 SH-음성 바이러스로 감염된 세포로부터 얻은 전체 세포내 RNA의 RT-PCR 분석의 결과를 제공한다. RT는 SH 유전자의 상류를 단련시키는 정방향 프라이머 프라이머 수행되고, PCR은 및 SH 유전자의 하류를 단련시키는 역방향 프라이머 프라이머 첨가에 사용되었다. 레인: (1 및 5) 1 kb DNA 래더로 구성된 마커 (라이프 테크놀로지스, 가이커스버그, 매릴랜드); (2) RT-PCR된 D46/6368 RNA); (3) RT-PCR된 D46 RNA; (4) PCR만 된 D46/6368 RNA. PCR 생성물은 2.5% 아가로스 겔 상에 전기영동되었고 에티디움 브로마이드로 염색되었다. 몇몇 마커 DNA 단편의 뉴클레오티드 길이는 오른쪽으로 도시된다.
도 9는 D46 야생형 및 D46/6368 SH-음성 바이러스에 의해 코딩된 RNA의 노던 블롯 혼성화를 도시한다. 전체 세포 내 RNA를 감염된 세포로부터 분리하였고 선택된 RNA가 또한 샌드위치 혼성화에 의한 게놈 RNA를 포함하는 조건, 즉 이전의 변성화 단계 없이 올리고 (dT) 크로마토그래피되었다. RNA를 포름알데히드-아가로즈 겔 상에 전기 영동하고 니트로셀룰로즈 막 상에 블롯하였다. 복제 블롯을 표시된 바대로, M, SH, G ,F, M2 또는 L 유전자의 [32P]-표지된 DNA 프로브로 개별적으로 혼성화시켰다. 레인: (1) D46/6368 RNA; (2) D46 RNA; (3) 감염되지 않은 HEp-2 세포 RNA. 게놈 RNA (gen.), mRNA들 (대문자) 및 리드-트루 (read-through) 전사 (소문자)의 위치가 왼쪽에 도시된다. 리드-트루 전사 P-M 및 M-G (M 프로브) 뿐만 아니라 G-F 및 F-M2 전사 (F 프로브)는 일치한다. 평행으로 작동하고 파지 람다의 [32P]-표지된 DNA로 혼성화되어 시각화된 0.24-9.5 kb RNA 래더 분자량 마커 (라이프 테크놀로지스)는 오른쪽에 도시된다.
도 10은 D46 야생형 또는 D46/6368 SH-음성 바이러스로 감염된 HEp-2 세포에서 합성된 [32S]-표지된 RSN 단밸질의 SDS-PAGE를 도시한다. 단백질을 정제된 바이러스 입자에 대해 제기되는 항혈청으로 면역침강시키고 프리-캐스트 구배 4% -20% 트리스-글리신 겔 (노베스, 샌 디에고, CA)에서 전기 영동하여 분석하였다. 바이 러스 단백질의 위치는 왼쪽으로 표시되고, 마커 단백질 (칼레이도스코프 프리스테인드 스탠다즈, 바이오-라드, 리치몬드, CA)의 위치 및 분자량 (킬로달톤)은 오른쪽으로 도시된다.
도 11-13은 HEp-2 세포 (도 11), 293 세포 (도 12) 및 AGMK-21 세포 (도 13)에서의 D46 야생형 및 D46/6368 SH-음성 바이러스를 위한 성장 곡선을 제공한다. 25-cm2 배양 플라스크에서 삼중 세포 단일층은 각 바이러스의 세포 당 2 PFU로 감염되고 37oC에서 배양시켰다. 분획을 표시된 시간에서 취하여, -70oC에 저장하고, 항체 염색으로 플라크 분석하여 동시에 적정하였다. 나타낸 각 점은 3개의 감염된 세포 단일층의 평균 적정 농도이다.
도 14 및 15는 D46 야생형 바이러스, D46/6368 SH-음성 바이러스, 또는 생물학적으로 유도된 cpts248/404 바이러스로 비강내로 접종된 위의 상기도 및 하기도에서의 바이러스 복제 동력학을 도시한다. 24개 군의 쥐에 표시된 바이러스 106 PFU를 비강으로 접종하였다. 각 군으로부터 6 마리의 쥐를 표시된 날에 죽이고 그 비개골 및 폐 조직을 제거하여 균질화하고, 감염성 바이러스의 수준을 각 표본 상에 플라크 분석하여 결정하고 평균 log10 적정 농도를 결정하였다.
도 16은 SH-음성 바이러스의 전사 생성물 및 유전자 순서를 그의 야생형 대응물와 비교한 것을 도시한다. 상위 패널은 야생형 부모형 재조합 바이러스와 비교해 SH-음성 바이러스에 의해 생성된 특정한 mRNA의 양을 분석한 것을 요약해 준 다. 세포 mRNA를 SH-음성 또는 야생형 바이러스로 감염된 세포로부터 분리하고 유전자 특이성 프로브로 노던 블롯 혼성화하여 분석하였다. 혼성화 방사능의 양을 정량하고, SH-음성 바이러스 대 그의 야생형 부모형에 의해 생성된 각각의 개별적인 mRNa의 상대적 양이 도시된다. 하위 패널은 M 유전자 (유전사 순서에서 5 위치)로부터 L 유전자 (10 위치)까지의 야생형 바이러스의 유전자 순서를 도시한다. 이는 SH-음성 바이러스와 비교되고, 여기서 G, F, M2 및 L 유전자의 유전자 순서에서 위치는 SH 유전자의 결실에 의해 변화된다.
도 17은 재조합 바이러스에 이형 서열을 삽입하지 않는 식으로 SH 유전자를 결실시켜 변형된 D46 안티게놈 플라스미드를 도시한다. SH 유전자를 플랭킹하는 서열은 맨 위에 도시하였다. MGE, M-SH 유전자간 (IG), SH GS, SH GE 및 SH-G IG 서열이 도시된다. 결실에 의해 제거된 부위는 윗쪽으로 향하는 삼각형으로 표시된 결실 점으로 밑줄이 쳐져 있다. 이 결실로부터 생성되는 안티게놈은 D46/6340이다.
도 18은 NS2 단백질을 코딩하는 번역 개방된 판독틀 (ORF)로 종렬 번역 정지 코돈을 도입하는 것을 도시한다. 플라스미드 D13은 안티게놈 cDNA의 왼쪽 말단을 함유하고, T7 프로모터 (그늘진 박스), 선도 영역, 및 NS1, NS2, N, P, M 및 SH 유전자를 포함한다. 단지 D13의 cDNA 삽입만 도시된다. T7 프로모터 및 NS1 및 NS2 유전자를 함유하는 AatII-AflII 단편을 pGEm 벡터로 서브 클로닝하고, 부위 지향적 돌연변이가 서열에 의해 나타낸 영역에서 NS2 ORF를 변형시키기 위해 사용되었다. 코돈 18 내지 26의 야생형 서열이 도시되고 (코딩된 아미노산은 하기 나타냄), 상 기 3개의 뉴클레오티드는 마커로서 종결 코돈 (ter) 및 XhoI 부위 (밑줄 쳐져 있음)를 도입하기 위해 제조된 3개의 치환물이다. 생성되는 cDNa 및 이후 회수되는 바이러스는 NS2-낙아웃 (knockout, KO)으로 언급된다.
도 19는 HEp-2 세포에서 야생형 RSN (D53) 대 NS2-낙아웃 RSV에 의한 감염성 바이러스 제조를 비교한다. 삼중 단일층은 3개의 pfu/세포의 유입 moi에서 각 바이러스로 감염되고, 샘플은 표시된 간격으로 취해지고 플라크 분석 및 면역 염색에 의해 정량되었다.
도 20은 NS1 및 NS 2 유전자의 유전자 말단 (GE) 신호의 변화를 도시한다. T7 프로모터 (그늘짐)로부터 4623 위치의 PacI 부위까지의 안티게놈 cDNA의 왼쪽 말단을 나타내는, 플라스미드 D13의 cDNA 삽입이 도시된다. T7 프로모터 및 NS1 및 NS2 유전자를 함유하는 AatI-AflII 단편은 pGem 벡터로 서브 클로닝되었다. 이것은 2개 부위에서 동시에 부위 지향적 돌연변이 유발에 의해 변형되었다. 즉 NS1 및 NS2 GE 신호는 각각 N 유전자를 위해 천연에 존재하는 것과 동일하게 변형되었다. 야생형 NS1 및 NS2 GE 신호의 서열이 도시되고 (완전한 안티게놈 서열에 대해 서열 위치로 동정됨), 뉴클레오티드 치환이 선으로 상기 도시된다. NS2 GE 신호의 야생형 서열의 대쉬는 돌연변이가 GE 신호 길이를 1개의 뉴클레오티드 만큼 증가시켰음을 나타낸다.
도 21은 NS1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 결실을 도시한다. D13 cDNA의 왼쪽 부분이 바닥에 도시된다: D13은 리더로부터 SH 유전자의 말단까지의, 안티게놈 cDNA의 왼쪽 부분을 리더의 바로 위 T7 프로모터와 함께 함유한다. 결실 지점 (위로 향하는 화살표)의 한 쪽에 있는 서열이 맨 위에 도시된다. 결실는 NS1 ORF의 번역 개시 부위 바로 앞에서부터 NS2 ORF의 번역 개시 부위의 바로 앞까지 이루어 진다. 그러므로, NS1 GS 및 상류 비코딩 영역을 NS2 ORF로 융합시키는 효과를 갖는다. 이는 리더 부근 위치에 의해 NS1 유전자로 확장할 수 있는 시스 작용 서열 요소의 파괴를 방지한다.
도 22는 NS2 mRNA를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 결실ㅇ,ㄹ 도시한다. 상기 기술된 바대로, D13 cDNA의 왼쪽 부분이 결실 지점 (위로 향하는 화살표)의 한 쪽에 있는 서열과 함께 도시된다. 결실는 NS1 유전자의 바로 아래로부터 NS2 우전자의 바로 아래까지 이루어 진다. 그러므로, NS2 mRNA를 코딩하는 서열은 전체적으로 결실되지만, 다른 서열이 파되되지 않았다. 생성되는 cDNA 및 이후 회수되는 재조합 바이러스는 △NS2로 언급된다.
도 23은 G 단백질로부터 분지되는 것을 위한 번역 개시 부위의 제거를 도시한다. 298-아미노산 G 단백질이 안에 채워진 신호-앵커 서열을 갖는 열린 사각형으로 도시된다. 45 내지 53 위치의 아미노산 서열은 메티오닌에서 이소루이신으로 아미노산 48을 그리고 이소루이신에서 발린으로 아미노산 49을 변화시킨 2개의 뉴클레오티드 치환을 설명하기 위해 오버헤드로 도시된다. 전자의 돌연변이는 분비 형태를 위한 번역 개시 부위를 제거한다. 2개의 돌연변이는 또한 MfeI 부위를 생성하고, 돌연변이 검출을 위한 편리한 방법을 제공한다. 생성되는 cDNA 및 이후 회수되는 바이러스는 M48I (메티오닌-48 내지 이소루이신-48)로서 언급된다.
도 24는 야생형 RSN (D53)에 의해 감염성 바이러스 생산과 회수된 D52/M481 막 G 돌연변이체 바이러스의 2개의 분리체 생산의 비교를 도시한다.
도 25A는 RSV 균주 A2 (항원 아군 A)의 역방향 프라이머 게놈 RNA을 도시하고 F 및 G 유전자의 균주 B1 (항원 아군 B)의 대응물로의 치환을 설명해 준다. 각각의 정사각형은 단일 mRNA를 코딩하는 유전자를 나타내고, 각각의 정사각형의 왼쪽 및 오른쪽 말단에 있는 회색의 닫힌 박스는 각각 유전자 개시 (GS) 및 유전자 종결 (GE) 전사 신호를 나타내고, 정사각형 사이의 얇은 선은 유전자간 영역을 나타낸다. 유전자 치환은 각각 G 유전자 앞에 있고 F 유전자 뒤에 있는 PacI 및 SphI 부위를 사용하여 안티게놈 cDNA의 수준에서 이루어진다. L 유전자는 상류 M2 유전자와 겹치는 것을 설명하기 위해 오프셋으로 도시되고, 상세한 것은 이 실시예에 직접 관련되지 않는다.
도 25B 및 25C는 키메릭 rAB 바이러스, 즉 F 및 G 당단백질 유전자가 균주 B1의 유전자와 치환된 재조합 RSV 균주 A2에 있는 서열 (정방향 프라이머)을 도시한다. 도시된 서열은 SH-G (부분 B) 및 F-M2 (부분 C) 연결 부분을 함유한다. 균주 A2 골격으로부터 유래된 서열은 소문자로 도시되고, 균주 B1 공여체로부터 유래된 서열은 대문자로 도시된다. A2와 B1 서열 사이의 연결 부위에서의 최종 A2 특이성 뉴클레오티드는 변화되지 않은 재조합 A2 게놈 서열에 따라 번호가 매겨진다. SH 유전자 말단 (GE) 및 F GE 신호에 박스가 쳐져 있다. PacI 및 SphI 인식 부위는 이탤릭체로 되어 있다. IG: 유전자간 영역.
도 26은 E. coli가 성장하는 동안 안정성을 향상시키기 위해 균주 B1 G 및 F 유전자의 cDNA를 변형시키는 것을 도시한다. 2개의 정방향 프라이머 서열이 도시 된다: 윗 서열 ("new"로 표지)은 변형된 B1 서열이고, 아래 서열 ("wt")은 야생형 B1 서열이다. 도시된 서열은 G 번역 개방된 판독틀 (ORF)의 하류 말단, 그의 코딩된 아미노산 (서열 아래 단일 활자로 도시됨), G GE 신호 (박스), G-F 유전자간 영역, 및 F 유전자 출발 (GS) 신호 (박스)를 포함한다. new 서열에서 밑줄 쳐진 위치는 치환를 나타내고; new 서열에서 대쉬는 결실를을 나타내고; wt 서열에서 대쉬는 new 서열에서의 삽입을 나타낸다. new 서열에서 생성된 MfeI 부위는 고딕 이탤릭체로 되어 있다. new 서열을 생성시키는 데 있어서 결실된 G-F 유전자간 영역으로부터의 47-뉴클레오티드 서열이 표시된다.
도 27은 혈청 음성 침팬지의 상부 (맨 위 패널; 비인두 면봉) 및 하부 (아래 패널; 기관 세척) 호흡기에서의 키메릭 재조합 AB wt RSV 및 ABcp248/404/1030 유도체의 복제를 도시한다. 이는 표 46의 데이타에 의한다. 각 그래프에서 얇은 가로 점선은 검출능의 하한이다. 바는 표준 오차를 나타낸다.
본 발명은 약독화되고, RSV 바이러스에 이환가능한 포유류 환자에게서 예방 또는 치료적 면역 반응을 일으킬 수 있는 감염성 키메릭 기도 신시티움 바이러스(RSV)를 제공한다. 또한, 본 발명내에서 RSV 감염의 예방 및 치료를 위한 방법 및 조성물 뿐만 아니라 약독화된 키메릭 RSV를 디자인하고 생산하기 위한 신규한 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 키메릭 RSV는 하나를 초과하는 RSV 균주 또는 아군으로부터의 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 재조합적으로 설계되어 감염성 키메릭 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 생성한다. 이러한 방식으로, 사람 및 비사람 영장류를 포 함하여 포유류 숙주에서 RSV에 대한 면역 반응을 일으키도록 후보 백신 바이러스를 재조합적으로 설계한다. 본 발명에 따른 키메릭 RSV는 특정 RSV 아군 또는 RSV 균주에 대해 면역반응을 일으키거나, 또는 다수의 RSV 아군 또는 RSV 균주에 대해 다특이 반응을 일으킬 수 있다.
본 발명의 예시적 실시태양에서는, 이종 유전자, 유전자 단편, 또는 한 RSV의 단일 또는 다수의 뉴클레오티드가 부분 또는 완전 RSV 게놈 또는 안티게놈에 첨가되거나, 또는 거기에서 이종 RSV로부터의 대응 서열에 의해 치환되어 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 생성한다. 따라서, 본 발명의 키메릭 RSV는 상이한 RSV 균주 또는 아군 바이러스의 첨가 또는 치환 "공여체" RSV 유전자 또는 유전자 단편과 결합된, 한 RSV 균주 또는 아군 바이러스로부터의 부분 또는 완전 "수용체" RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함한다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 키메릭 RSV는 상이한 사람 RSV 균주 또는 아군으로부터의 이종 유전자 또는 유전자 단편과 결합된, 한 RSV 균주 또는 아군의 부분 또는 완전 사람 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함한다. 예를 들면, 바람직한 키메릭 RSV는 상이한 사람 RSV A 또는 B 아군 바이러스로부터의 이종 유전자 또는 유전자 단편과 결합된, 부분 또는 완전 사람 RSV A 또는 B 아군 게놈 또는 안티게놈으로 이루어진 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 포함한다.
한 RSV 균주 또는 아군으로부터의 이종 공여체 유전자 또는 유전자 단편은 공여체 유전자 또는 유전자 단편의 삽입 또는 첨가를 위한 골격으로 작용하는 수용체 게놈 또는 안티게놈 내에서 결합되거나 또는 치환된다. 따라서, 수용체 게놈 또는 안티게놈은 이종 유전자 또는 유전자 단편을 들여오고 발현하기 위한 벡터로 작용하여 신규한 구조적 및(또는) 표현형 특징을 나타내는 키메릭 RSV를 얻는다. 바람직하게는, 선택된 수용체 RSV 균주 내에서 이종 유전자 또는 유전자 단편을 첨가 또는 치환함으로써 변화되지 않은 수용체 및(또는) 공여체의 대응 표현형과 비교시 신규한 표현형 효과, 예를 들면, 약독화, 성장 변화, 변화된 면역원성 또는 기타 목적하는 표현형 변화를 얻는다.
키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 이종 삽입 또는 첨가 물질로서 유용한 유전자 및 유전자 단편으로는 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 또는 G 단백질, 또는 이의 부분을 코딩하는 유전자 또는 유전자 단편이 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 키메릭 RSV는 RSV F, G 또는 SH 당단백질을 코딩하는 이종 유전자를 포함한다. 별법으로, 키메릭 RSV는 선택된 단백질의 부분, 예를 들면, RSV F, G 또는 SH 당단백질의 세포질 도메인, 막통과 도메인, 엑토도메인(ectodamain) 또는 면역원성 에피토프만을 코딩하는 유전자 단편을 포함할 수 있다.
다른 실시태양에서, 백신 형성에 유용한 키메릭 RSV는 편의상 순환하는 바이러스에 항원성 드리프트(drift)를 포함하도록 변화될 수 있다. 전형적으로 상기 변화는 G 및(또는) F 단백질에서 일어날 것이다. 한 RSV 균주로부터의 전체 G 또는 F 유전자 또는 이의 특정 면역원성 영역을 코딩하는 유전자 단편은 상이한 RSV 균주 또는 아군의 수용체 클론에서 대응 영역의 치환에 의해, 또는 여러 개의 항원 형태가 제공되도록 상기 유전자의 하나 이상의 카피를 첨가함으로써 키메릭 RSV 게 놈 또는 안티게놈 cDNA에 포함된다. 변화된 RSV 클론으로부터 생성된 자손 바이러스는 신생 RSV 균주에 대한 예방접종 프로토콜에 사용될 수 있다.
따라서, 키메릭 RSV를 생성하기 위한 이종 면역원성 단백질, 도메인 및 에피토프의 도입은 면역화된 숙주에서 신규한 면역 반응을 일으키는데 특히 유용하다. 상이한 RSV 아군 또는 균주의 수용체 게놈 또는 안티게놈 내에서 한 공여체 RSV 아군 또는 균주로부터의 면역원성 유전자 또는 유전자 단편의 첨가 또는 치환은 공여체 아군 또는 균주, 수용체 아군 또는 균주, 또는 공여체 및 수용체 아군 또는 균주 모두에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 키메릭 단백질(예, 세포질 꼬리(tail)를 갖는 면역원성 단백질 및(또는) 상이한 RSV의 엑토도메인과 융합된 한 RSV 균주 또는 아군에 특이적인 막통과 도메인)을 발현하는 키메릭 RSV를 또한 설계할 수 있다. 이러한 유형의 다른 예시적 재조합체는 중복 면역원성 영역과 같은 중복 단백질 영역을 발현할 수 있다.
키메릭 게놈 또는 안티게놈 내에서 전체 유전자(시스 작용 인자 및 코딩 영역을 포함)를 첨가하거나 또는 치환하는 것이 종종 유용하지만, 관심있는 공여체 유전자의 일부만을 전이하는 것도 또한 유용하다. 매우 일반적으로, 시스 작용 조절 인자 및 유전자간 서열과 같은 비코딩 뉴클레오티드는 공여체 유전자 코딩 영역과 함께 전달될 필요가 없다. 또한, 신규하고 유용한 성질을 갖는 키메릭 RSV를 발현하기 위해, 다양한 유전자 단편이 키메릭 게놈 또는 안티게놈 내에서의 삽입에 유용한 공여체 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 따라서, 이종 유전자 단편은 한 RSV로부터 선택된 단백질의 세포질 꼬리, 막통과 도메인 또는 엑토도메인, 에피토프 부위 또는 영역, 결합 부위 또는 영역, 활성 부위 또는 활성 부위를 함유하는 영역 등을 유리하게 코딩할 수 있다. 이들 및 다른 유전자 단편은 첨가되거나 또는 또다른 RSV의 대응 유전자 단편으로 치환되어 신규한 키메릭 재조합체, 예를 들면, 또다른 RSV의 엑토도메인과 융합된 한 RSV의 세포질 꼬리 및(또는) 막통과 도메인을 갖는 키메릭 단백질을 발현하는 재조합체를 얻을 수 있다. 이러한 측면에서, 유용한 게놈 단편은 단백질의 기능성 소도메인(예, 에피토프 부위)을 코딩하는 유전자 단편의 경우 약 15 내지 35 뉴클레오티드로부터 더 큰 도메인 또는 단백질 영역을 코딩하는 유전자 단편의 경우에는 약 50, 75, 100, 200 내지 500 및 500 내지 1,500 이상의 뉴클레오티드의 범위이다.
키메릭 RSV를 설계하기 위해, 이종 유전자를 전체 또는 부분적으로 백그라운드 게놈 또는 안티게놈에 첨가하거나 또는 치환하여 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다. 치환에 의해 생성된 키메라의 경우, 한 RSV로부터의 선택된 단백질 또는 단백질 영역(예, 세포질 꼬리, 막통과 도메인 또는 엑토도메인, 에피토프 부위 또는 영역, 결합 부위 또는 영역, 활성 부위 또는 활성 부위를 함유하는 영역 등)을 상이한 RSV 게놈 또는 안티게놈의 대응 유전자 또는 유전자 단편으로 치환하여 야생형 또는 부모 RSV 균주와 비교시 목적하는 표현형 변화를 갖는 신규한 재조합체를 얻는다. 본원에서 사용될 때, "대응" 유전자, 유전자 단편, 단백질 또는 단백질 영역은 단일 RSV 균주에서 상이한 유전자, 또는 상이한 RSV 아군 또는 균주 중의 종 및 대립유전자 변종을 포함하는 동일 유전자의 상이한 변종을 포함하여 이종 공급원으로부터의 두 개의 대응 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
대응 유전자 또는 유전자 단편은 최소한 완만한 구조적 유사성을 공유한다. 예를 들면, 대응 유전자 단편은 세포질 도메인, 막통과 도메인, 엑토도메인, 결합 부위 또는 영역, 에피토프 부위 또는 영역 등과 같은 관심있는 단백질의 일반적인 구조적 도메인을 코딩할 수 있다. 전형적으로, 이들은 또한 일반적인 생물학적 기능을 공유할 것이다. 예를 들면, 대응 유전자 단편에 의해 코딩된 단백질 영역은 일반적인 막통과 기능, 특이 결합 활성, 면역학적 인식 부위 등을 제공할 수 있다. 전형적으로, 대응 유전자 및 유전자 단편의 생성물이 공유하는 목적하는 생물학적 활성은 정량적 측면에서 실질적으로 유사할 것이다. 즉, 이것은 30% 이상, 바람직하게는 20%, 더 바람직하게는 5 내지 10% 밖에 차이가 나지 않을 것이다.
본 발명내에서 사용하기 위한 대응 유전자 및 유전자 단편은 일정 범위의 크기 및 서열 변동을 갖는 대체적 종류의 일정 집단을 포함한다. 그러나, 대응 유전자 및 유전자 단편의 선택은 대응물 사이의 실질적인 서열 동일성에 달려 있다. 본원에서, 선택된 폴리뉴클레오티드 "참고 서열"은 공여체 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈에 존재하는 서열 또는 이의 일부로 정의된다. 이 참고 서열은 서열 비교를 위한 합리적인 기초를 제공하기 위해 정의된 서열로 사용된다. 예를 들면, 참고 서열은 cDNA 또는 유전자 단편, 또는 완전 cDNA 또는 유전자 서열일 수 있다.
일반적으로, 대응 유전자 및 유전자 단편을 정의하는데 사용하기 위한 참고 서열은 그 길이가 20개 이상의 뉴클레오티드, 자주 25개 이상의 뉴클레오티드 및 종종 50개 이상의 뉴클레오티드이다. 두 개의 폴리뉴클레오티드는 각각 (1) 두 폴리뉴클레오티드 사이에 유사한 서열을 포함할 수 있고, (2) 두 폴리뉴클레오티드 사이에 불일치하는 서열을 추가로 포함할 수 있으므로, 두 (또는 그 이상) 폴리뉴클레오티드 사이의 서열 비교는 전형적으로 "비교 창(window)"에 대하여 두 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교하여 서열 유사성을 갖는 국소 영역을 동정하고 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용될 때, "비교 창"이란 폴리뉴클레오티드 서열을 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 참고 서열과 비교할 수 있고 두 서열의 최적의 배열을 위해 비교 창에 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 일부가 참고 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 이하의 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있는 개념적 서열을 지칭한다. 비교 창을 배열하기 위한 서열의 최적의 배열은 문헌[Needleman & Wunsch, homology alignment algorithm, J. Mol. Biol. 48:443 (1970); Pearson & Lipman, search for similarity method, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), 각각 본원에 참고로 인용됨], 이들 알고리즘의 컴퓨터화 수단(위스콘신주 메디슨시 사이언스 드라이브 575 소재의 Genetics Computer Group, Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 면밀한 조사에 의해 수행될 수 있고, 다양한 방법에 의해 생성된 최적의 배열(즉, 비교 창에 대하여 가장 높은 서열 유사성 백분율을 가져오는)이 선택된다.
본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성"은 두 폴리뉴클레오티드 서열이 비교 창에 대하여 동일하다(즉, 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드를 기초로 함)는 것을 의미한다. 용어 "서열 동일성 백분율"은 최적으로 배열된 두 서열을 비교 창에 대하여 비교하고, 두 서열에서 동일한 핵산 염기(예, A, T, C, G, U 또는 I)가 일어나 는 위치 수를 결정하여 공통의 위치 수를 얻고, 공통 위치 수를 비교 창의 총 위치 수(즉, 창의 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 얻음으로써 계산한다. 본원에서 사용되는 용어 "실질적 동일성"은 폴리뉴클레오티드가 참고 서열과 비교시 20개 이상의 뉴클레오티드 위치를 갖는 비교 창, 자주 25 내지 50개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 창에 대하여 85% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90 내지 95% 이상의 서열 동일성, 더 일반적으로는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 특성을 나타내고, 서열 동일성 백분율은 참고 서열을 비교 창에 대하여 참고 서열의 총 20% 이하의 결실 또는 첨가를 포함할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열과 비교함으로써 계산한다. 참고 서열은 더 큰 서열의 서브세트(subset)일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 서열 관계 뿐만 아니라, 본 발명의 키메릭 RSV에 의해 코딩된 단백질 및 단백질 영역도 또한 선택된 참고 폴리펩티드와 보존적 관계를 갖도록, 즉, 실질적 서열 동일성 또는 서열 유사성을 갖도록 선택된다. 폴리펩티드에 있어서, 용어 "서열 동일성"은 대응하는 위치에서 동일한 아미노산을 공유하는 펩티드를 의미한다. 용어 "서열 유사성"은 펩티드가 대응하는 위치에서 동일하거나 또는 유사한 아미노산(즉, 보존적 치환)을 갖는 것을 의미한다. 용어 "실질적 동일성"은 두 펩티드가 예를 들면, 디폴트 갭 중량을 사용하는 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해 최적으로 배열될 때, 이들이 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 더 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성(예, 99%의 서열 동일성)을 공유하는 것을 의미한다. 용어 "실질적 유사성"은 두 펩티 드 서열이 대응하는 백분율의 서열 유사성을 공유하는 것을 의미한다.
바람직하게는, 동일하지 않은 나머지 위치는 보존적 아미노산 치환에 의한 차이다. 보존적 아미노산 치환이란 유사한 곁가지를 갖는 잔기의 상호변화가능성을 지칭한다. 예를 들면, 지방족 곁가지를 갖는 아미노산 군으로는 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신이 있고, 지방족 히드록실 곁가지를 갖는 아미노산 군으로는 세린 및 트레오닌이 있고, 아미드 함유 곁가지를 갖는 아미노산 군으로는 아스파라긴 및 글루타민이 있고, 방향족 곁가지를 갖는 아미노산 군으로는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이 있고, 염기성 곁가지를 갖는 아미노산 군으로는 라이신, 아르기닌 및 히스티딘이 있고, 황 함유 곁가지를 갖는 아미노산 군으로는 시스테닌 및 메티오닌이 있다. 바람직한 보존적 아미노산 치환군으로는 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이 있다. 20 개의 통상적인 아미노산의 입체이성질체(즉, D-아미노산), α,α-이중치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산과 같은 비천연 아미노산, 및 기타 비통상적인 아미노산도 또한 본 발명의 폴리펩티드에 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예로는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시라이신, ω-N-메틸아르기닌 및 기타 아미노산 및 이미노산 (예, 4-히드록시프롤린)이 포함된다. 또한, 글리코실화, 인산화 등에 의해 아미노산을 변화시킬 수 있다.
본원에 개시된 발명은 넓은 범위의 재조합체, 키메릭 RSV 바이러스 및 서브 바이러스 입자를 설계하는데 유용한 cDNA를 기초로 하는 방법을 기술한다. 이들 재조합 구조체는 개선된 약독화 특성 및 백신으로 사용하기 위한 면역원성을 제공한다. 본원에서 목적하는 표현형 변화 중에는 약독화된 표현형으로부터의 복귀, 배양 또는 선택된 숙주 환경에서 약독화의 개선, 면역원성 특징(예, 발생된 면역 반응의 증진 또는 감소로 결정됨), 선택된 바이러스 생성물의 전사 및(또는) 번역의 증진 및(또는) 감소 등이 있다.
본 발명의 한 바람직한 측면에서는, 약독화 표현형을 구체화하는 하나 이상의 약독화 점 돌연변이를 도입함으로써 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 추가로 변화되는 약독화 키메릭 RSV가 생성된다. 이 점 돌연변이는 드 느브(de novo)로 생성될 수 있고, 이론적 디자인 돌연변이유발 전략에 따라 약독화 효과를 시험할 수 있다. 별법으로, 생물학적 유래의 돌연변이체 RSV에서 약독화 점 돌연변이를 동정한 후, 본 발명의 키메릭 RSV에 포함시킨다.
키메릭 백신 균주 내에 포함시키기 위한 생물학적 유래의 RSV에서 약독화 점 돌연변이는 자연적으로 발생할 수 있거나 또는 잘 알려진 돌연변이유발 방법에 의해 야생형 RSV에 포함될 수 있다. 예를 들면, 본원 및 본원에 참고로 인용된 USSN 제08/327,263호에 일반적으로 기술된 바와 같이, 화학적 돌연변이유발원이 첨가된 세포 배양에서 바이러스 성장 중 화학적 돌연변이유발에 의해, 성장 제한 돌연변이를 도입하기 위해 부최적 온도에서 계대배양한 바이러스의 선별에 의해, 또는 세포 배양에서 작은 플라크(sp)을 생성하는 돌연변이 바이러스의 선별에 의해 불완전 약독화 부모 RSV 균주를 생성할 수 있다.
"생물학적 유래의 RSV"는 재조합 방법에 의해 생성되지 않은 모든 RSV를 의미한다. 따라서, 생물학적 유래의 RSV는 예를 들어 야생형 게놈 서열을 갖는 천연 RSV를 포함하는 모든 아군 및 균주의 천연 RSV, 및 참고 야생형 RSV 서열로부터의 게놈 변화를 갖는 RSV (예, 약독화 표현형을 구체화하는 돌연변이를 갖는 RSV)를 포함한다. 마찬가지로, 생물학적 유래의 RSV는 특히 인공적인 돌연변이 및 선별 방법에 의해 부모 RSV 균주로부터 유래된 RSV 돌연변이체를 포함한다.
생물학적 유래의 균주로부터 만족스런 약독화 RSV를 생성하기 위해, 바람직하게는 RSV 아군 A의 A2 균주의 잘 알려진 ts-1 또는 ts-1NG, 또는 cpRSV 돌연변이체, 또는 이의 유도체 또는 서브클론과 같은 불완전하거나 또는 부분적으로 약독화된 모 균주에 돌연변이가 도입된다. 이들 및 다른 부분적으로 약독화된 균주를 사용하여, 피접종자에게서 보호를 부여하기에 충분한 면역원성을 보유하는 반면, 포유류 숙주에서 예를 들면, 목적하는 수준의 제한된 복제로 균주를 더 약독화시키는 부가의 돌연변이(들)를 생성할 수 있다.
혀용가능한 세포 기질에서 야생형 바이러스를 생물학적으로 클로닝하고, 예를 들면, 이의 저온 계대배양 돌연변이체를 발생시키고, 바이러스를 화학적 돌연변이유발에 의해 ts 돌연변이체를 생성하거나, 또는 작은 플라크 또는 유사한 표현형 돌연변이체를 선별하는 잘 알려진 방법에 의해 아군 A 또는 B 바이러스의 부분적으로 약독화된 돌연변이체를 생성할 수 있다 (예, 본원에 참고로 인용된 Murphy 등, 국제 출원 제WO 93/21310호 참조). 아군 B 바이러스에 있어서, 부분적으로 약독화된 부모 바이러스의 예로는 아군 B의 B1 균주 돌연변이체인 cp 23이 있다.
공지의 다양한 선별 기술을 결합하여 비약독화 아군 A 또는 B 균주로부터 본원에 기술한 추가의 유도체화에 유용한 부분적으로 약독화된 돌연변이체를 생성할 수 있다. 나아가, 약독화 표현형을 구체화하는 돌연변이를 개별적으로 또는 결합하여 불완전 약독화 아군 A 또는 B 바이러스에 도입함으로써, 피접종자에게 목적하는 수준의 약독화 및 면역원성을 부여하는 복수의 정의된 약독화 돌연변이를 갖는 백신 바이러스를 생성할 수 있다.
상술한 바와 같이, 충분히 약독화된 생물학적 유래의 RSV 돌연변이체는 여러 공지의 방법에 의해 생성할 수 있다. 한 방법은 부분적으로 약독화된 바이러스를 점진적으로 더 낮은 약독화 온도에서 세포 배양에서 계대배양하는 것을 포함한다. 예를 들면, 야생형 바이러스는 전형적으로 약 34 내지 37 ℃에서 배양되는 반면, 부분적으로 약독화된 돌연변이체는 부최적 온도, 예를 들면, 20 내지 26 ℃의 세포 배양(예, 일차성 소 신장 세포)에서 계대배양에 의해 생성된다. 따라서, cp 돌연변이체 또는 다른 부분적으로 약독화된 균주(예, ts-1 또는 spRSV)는 MRC-5 또는 베로(Vero) 세포에서의 계대배양에 의해 약 20 내지 24 ℃, 바람직하게는 20 내지 22 ℃의 온도까지의 더 낮은 온도에서 효율적으로 성장하도록 변경된다. 저온 계대배양 중 돌변변이체 RSV의 선별은 부분적으로 약독화된 부모과 비교하여 유도체 균주에서 임의의 잔류 독성을 실질적으로 제거한다.
별법으로, 부분적으로 약독화된 부모 바이러스를 화학적 돌연변이 유발함으로써, 예를 들면, ts 돌연변이체를 도입하거나, 또는 이미 ts인 바이러스의 경우에는 약독화된 유도체 상에 증가된 약독화 및(또는) ts 표현형의 안정성을 부여하기 에 충분한 부가의 ts 돌연변이체를 도입함으로써, 특정 돌연변이를 생물학적 유래의 RSV에 도입할 수 있다. ts 돌연변이체를 RS 바이러스에 도입하기 위한 방법으로는 약 10-3 내지 10-5 M 농도의 5-플루오로우리딘 또는 5-플루오로우라실과 같은 돌연변이유발원의 존재하에서 바이러스를 복제하거나, 예를 들면, 문헌[Gharpure 등, J. Virol. 3:414-421 (1969) 및 Richardson 등, J. Med. Virol. 3:91-100 (1978)]에 기술된 일반적인 방법에 따라 바이러스를 약 100 ㎍/ml 농도의 니트로소구아니딘에 노출시키거나, 또는 특정 ts 돌연변이체를 유전적으로 도입하는 것이 포함된다. 또한, 다른 화학적 돌연변이유발원을 사용할 수 있다. 이 목적에 특히 적당한 표적은 중합효소(L) 유전자인 것으로 발견되었으나, 거의 모든 RSV 유전자에서의 ts 돌연변이에 의해 약독화가 일어날 수 있다.
본 발명내에서의 사용을 위한 예시적 약독화 RSV에서 복제의 온도 민감성 수준은 허용 온도에서의 복제를 몇 개의 제한 온도에서의 복제와 비교함으로서 결정된다. 바이러스의 복제가 허용 온도에서의 복제와 비교하여 100 배 이상 감소하는 가장 낮은 온도를 정지(shutoff) 온도라고 한다. 실험 동물 및 사람에서, RSV의 복제 및 독성은 돌연변이체의 정지 온도와 비례한다. 정지 온도가 38 ℃인 돌연변이체는 덜 잘 복제하고 질병 증후가 주로 상기도로 제한되는 반면, 정지 온도가 39 ℃인 돌연변이체의 복제는 완만히 제한된다. 정지 온도가 35 내지 37 ℃인 바이러스는 전형적으로 사람에서 충분히 약독화될 것이다. 따라서, ts인 본 발명의 약독화된 생물학적 유래의 돌연변이체 및 키메릭 RSV는 약 35 내지 39℃, 바람직하게는 35 내지 38℃ 범위의 정지 온도를 가질 것이다. 부분적으로 약독화된 균주에 ts 돌연변이체를 첨가함으로써 본 발명의 백신 조성물 내에서 유용한 약독화 바이러스가 생성된다.
저온 계대배양 중 이미 약독화된 바이러스에 다수의 돌연변이를 도입하기 위해, 화학적 돌연변이유발의 복수 라운드를 사용하여 비강내 투여용 후보 백신으로서 다수의 약독화 RSV 균주를 개발하였다 (예, Connors 등, Virology 208: 478-484 (1995); Crowe 등, Vaccine 12: 691-699 (1994); 및 Crowe 등, Vaccine 12: 783-790 (1994), 본원에 참고로 인용됨). 설치류, 침팬지, 성인 및 유아에서의 평가로부터, 이들 후보 백신 균주의 일부는 유전적으로 상대적으로 안정하고, 매우 면역원성이며, 만족스럽게 약독화될 수 있는 것으로 나타났다. 하기에 예시되는 바와 같이, 이들 약독화 바이러스의 일부에 대한 뉴클레오티드 분석으로부터, 각 증가된 약독화의 수준이 특정 뉴클레오티드 및 아미노산 치환과 관련있는 것으로 나타났다. 본 발명에 의해 돌연변이를 개별적으로 및 다양한 조합으로 감염성 RSV 클론의 게놈 또는 안티게놈에 도입함으로써, 잠재성 부수적 돌연변이와 표현형 차이를 나타내는 돌연변이를 구별할 수 있다. 부모 및 유도체 바이러스의 표현형 특성의 평가와 결합된 이 방법을 사용하여 약독화, 온도 민감성, 저온 적응성, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한 등과 같은 목적하는 특성을 나타내는 돌연변이를 동정한다.
이렇게 동정된 돌연변이를 "메뉴"로 축적한 다음, 목적하는 바에 따라 단일로 또는 결합하여 도입하여 필요한 경우 적당한 수준의 약독화, 면역원성, 약독화 표현형으로부터의 복귀에 대한 유전적 내성 등에 대해 키메릭 백신 바이러스를 검정한다. 바람직하게는, 일 군의 공지의 돌연변이로 정의될 수 있는 상기 메뉴로부터 동정된 하나 이상, 더 바람직하게는 두 개 이상의 약독화 점 돌연변이를 한 패널의 생물학적 유래의 돌연변이체 RSV 균주 내에 포함시킴으로써 본 발명의 키메릭 RSV를 약독화한다. 본원에 기술한 돌연변이체 RSV 균주의 바람직한 패널로는 저온 계대배양(cp) 및(또는) 온도 민감성(ts) 돌연변이체, 예를 들면, "cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542) 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579) (각각 미국 버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시티 볼리버드 10801 소재의 American Type Culture Collection(ATCC)과 부다페스트 조약과의 관계하에 놓여있으며, 상기 접근 번호가 부여됨)"로 표시된 RSV 돌연변이체로 이루어진 한 패널이 있다.
이 생물학적 유래의 돌연변이체의 예시적 패널로부터, 백신용 재조합 키메릭 RSV에서 약독화의 수준을 검정하기 위해 패널 내에서 어떠한 다른 돌연변이(들)와도 결합할 수 있는 큰 메뉴의 약독화 돌연변이가 제공된다. 예를 들면, 작은 플라크(sp)의 저온 적응 (ca) 또는 숙주 범위 제한(hr) 돌연변이체 균주에서 동정된 비ts 및 비cp 약독화 돌연변이를 갖는 RSV로부터 부가의 돌연변이가 유도될 수 있다. 약독화 돌연변이는 공여체 또는 수용체 RSV 유전자의 코딩 부분, 또는 시스 조절 서열과 같은 비코딩 영역에서 선택될 수 있다. 예를 들면, 약독화 돌연변이 는 뉴클레오티드 7605의 M2 유전자 개시 서열에서 단일 또는 다수의 염기 치환에 의해 예시되는 바와 같이, 유전자 개시 서열에서 단일 또는 다수의 염기 변화를 포함할 수 있다.
넓은 임상적 용도를 위한 만족스런 수준의 약독화를 달성하기 위해, 백신 용도로 디자인되고 선별된 키메릭 RSV는 종종 2 이상, 때로는 3 이상의 약독화 돌연변이를 갖는다. 한 실시태양에서는, RSV 중합효소 유전자 (공여체 또는 수용체 유전자 상의)에서 하나 이상의 약독화 돌연변이가 일어나고, 온도 민감성(ts) 표현형을 구체화하는 중합효소 단백질에서 아미노산 변화를 구체화하는 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 이와 관련하여 예시적 키메릭 RSV는 예를 들면, Phe521을 Leu로, Gln831을 Leu로, Met1169을 Val로, 및 Tyr1321을 Asn으로 변화시키는 것과 같이, 큰 중합효소 유전자 L에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함시킴으로써 아미노산 Phe521, Gln831, Met1169 또는 Tyr1321에서 아미노산 변화를 야기한다. 별법으로 또는 이에 부가하여, 본 발명의 키메릭 RSV는 다른 RSV 유전자, 예를 들면, M2 유전자에서 ts 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 약독화 돌연변이를 구체화하는 코돈, 예를 들면, ts 돌연변이를 구체화하는 코돈에 2 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함시킴으로써 약독화 표현형으로부터의 복귀 가능성을 감소시킨다.
본 발명의 방법에 따르면, 한 패널의 생물학적 유래의 돌연변이체 RSV 균주 내에, 현존하는 약독화 점 돌연변이 하나 이상 및 전부 이하를 포함하는 키메릭 RSV를 쉽게 설계하고 특성화할 수 있다. 따라서, 선택된 한 패널의 돌연변이체, 예를 들면, cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542) 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)으로부터 임의의 조합의 돌연변이를 조합할 수 있다. 이러한 방식으로, 키메릭 백신 후보의 약독화를 혈청반응음성 유아를 포함하여 하나 이상의 계층의 환자에서의 사용을 위해 세밀하게 검정할 수 있다.
보다 구체적인 실시태양에서, 백신용 키메릭 RSV는 RSV 중합효소 유전자 L의 Phe521, Gln831, Met1169 또는 Tyr1321에서 온도 민감성 아미노산 치환, 또는 유전자 M2의 유전자 개시 서열에서 온도 민감성 뉴클레오티드 치환을 구체화하는 약독화 돌연변이 하나 이상 및 전부 이하를 포함한다. 별법으로 또는 이에 부가하여, 본 발명의 키메릭 RSV는 저온 계대배양 약독화 RSV로부터의 돌연변이 하나 이상 및 전부 이하, 예를 들면, RSV N 유전자의 Val267, RSV F 유전자의 Glu218 또는 Thr523 , RSV 중합효소 L의 Cys319 또는 His1690에서 아미노산 치환을 구체화하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 키메릭 RSV는 사람 RSV A 게놈 또는 안티게놈내에 첨가되거나 또는 치환되어, 생물학적 유래의 돌연변이체 RSV로부터 채택된 하나 이상의 약독화 점 돌연변이를 포함하도록 추가로 변경되는 키메릭 클론을 형성하는 사람 RSV B 아군 당단백질 유전자 F 및 G를 특징으로 한다. 다양한 예에서, 키메릭 RSV는, RSV A 게놈내의 대응 F 및 G 당단백질 유전자를 대체하기 위해 치환되고 (i) RSV 중합효소 유전자 L에서 Gln831을 Leu으로, Tyr1321을 Asn으로 온도 민감성 아미노산 치환을 구체화하는 한 패널의 돌연변이; (ii) 유전자 M2의 유전자 개시 서열에서 온도 민감성 뉴클레오티드 치환; (iii) RSV N 유전자에서 Val267을 Ile으로, RSV 중합효소 유전자 L에서 Cys319를 Tyr으로 및 His1690를 Tyr으로 아미노산 치환을 구체화하는 저온 계대배양 RSV로부터 채택된 한 패널의 약독화 돌연변이; 또는 (iv) SH 유전자의 결실로부터 선택된 약독화 점 돌연변이를 포함하도록 추가로 변경되는 사람 RSV B 아군 당단백질 유전자 F 및 G 모두를 갖는다. 바람직하게는, 키메릭 RSV의 이들 및 다른 예는 동일하거나 또는 상이한 생물학적 유래의 돌연변이체 RSV 균주로부터 유래될 수 있는, 생물학적 유래의 돌연변이체 RSV로부터 채택된 2 이상의 약독화 점 돌연변이를 포함한다. 또한, 바람직하게는, 이들 예시적 돌연변이체는 돌연변이를 구체화하는 코돈에서 다수의 뉴클레오티드 변화에 의해 안정화된 하나 이상의 약독화 돌연변이를 갖는다.
상술한 바에 따르면, cDNA로부터 감염성 RSV를 생산할 수 있게 됨으로써, 키메릭 RSV내에 특별히 설계된 변화를 도입할 수 있게 되었다. 특히, 생물학적 유래의 약독화 RSV 균주에서 특정 돌연변이(들), 예를 들면, 감염성 재조합 RSV를 사용하여 ts, ca, att 및 기타 표현형을 구체화하는 돌연변이를 동정할 수 있다. 따라서, 목적하는 돌연변이를 동정하여 재조합 키메릭 RSV 백신 균주에 도입한다. cDNA로부터 바이러스를 생산할 수 있게 됨으로써, 이들 돌연변이를 개별적으로 또는 선택된 다양한 조합으로 전 길이의 cDNA 클론에 통상적으로 포함시킬 수 있고, 그로부터 도입된 돌연변이를 함유하는 재조합 바이러스의 표현형을 쉽게 결정할 수 있다.
목적하는 표현형(예, cp 또는 ts 표현형)과 관련된 특정 생물학적 유래의 돌연변이를 동정하고 감염성 키메릭 RSV 클론에 포함시킴으로써, 본 발명은 동정된 돌연변이 또는 이와 매우 근접한 곳에 다른 위치 특이성 돌연변이를 제공한다. 생물학적 유래의 RSV에서 발생하는 대부분의 약독화 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 변화이지만, 다른 "위치 특이성" 돌연변이도 재조합 기술에 의해 생물학적 유래의 RSV 또는 재조합 RSV에 포함될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 위치 특이성 돌연변이는 1 내지 3으로부터 약 5 내지 15 이상 까지의 변화된 뉴클레오티드(예, 야생형 RSV 서열, 선택된 돌연변이 RSV 균주 서열 또는 돌연변이유발을 받은 부모 재조합 RSV 클론으로부터 변화된 것)의 삽입, 치환, 결실 또는 재배열을 포함한다. 이러한 위치 특이성 돌연변이는 선택된 생물학적 유래의 점 돌연변이 또는 그 영역내에 포함될 수 있다. 별법으로, 상기 돌연변이는 RSV 클론내의 다양한 다른 위치, 예를 들면, 시스 작용 조절 서열, 또는 단백질 활성 부위, 결합 부위, 면역원성 에피토프 등을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 그 근처에 도입될 수 있다. 위치 특이성 RSV 돌연변이체는 전형적으로 목적하는 약독화 표현형을 보유하나, 약독화와 관련되지 않은 실질적으로 변화된 표현형 특성(예, 증진되거나 또는 광범위해진 면역원성, 또는 개선된 성장)을 나타낼 수 있다. 목적하는 위치 특이성 돌연변이체의 추가의 예로는 약독화 점 돌연변이를 구체화하는 코돈에 부가의 안정화 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하도록 디자인된 재조합 RSV가 포함된다. 가능한 경우, 부 모 돌연변이체 또는 재조합 RSV 클론에서 약독화 아미노산 변화를 구체화하는 코돈에 2 이상의 뉴클레오티드 치환을 도입하여 약독화 표현형으로부터의 복귀에 대해 유전적 내성을 갖는 생물학적 유래 또는 재조합 RSV를 얻는다. 다른 실시태양에서는, 예를 들면 존재하는 시스 작용 조절 인자를 설계하거나 또는 제거하기 위해, 위치 특이성 뉴클레오티드의 치환, 첨가, 결실 또는 재배열이 표적 뉴클레오티드 위치에 대하여 예를 들면, 5' 또는 3' 방향으로 1 내지 3 또는 5 내지 10으로부터 15개 이하 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 상류(N-말단 방향) 또는 하류(C-말단 방향)에 도입된다.
단일 및 다수의 점 돌연변이, 및 위치 특이성 돌연변이 뿐만 아니라, 본원에 기술한 키메릭 RSV의 변화는 온전한 유전자 또는 유전자 단편의 결실, 삽입, 치환 또는 재배열을 포함한다. 이들 돌연변이는 변화의 성질에 따라 소수의 염기(예, 15 내지 30으로부터 35 내지 50개 이하 또는 그 이상의 염기), 또는 큰 블럭의 뉴클레오티드(예, 50 내지 100, 100 내지 300, 300 내지 500, 500 내지 1,000개의 염기)를 변화시킬 수 있다 (즉, 면역원성 에피토프를 삽입 또는 제거하거나, 또는 작은 유전자 단편을 변화시키기 위해서는 소수의 염기가 변화될 수 있으나, 유전자 또는 큰 유전자 단편이 첨가, 치환, 결실 또는 재배열되는 경우에는 큰 블럭의 염기가 포함된다).
부가의 측면에서, 본 발명은 생물학적 유래의 RSV로부터의 키메릭 RSV 클론으로부터 채택된 돌연변이(예, cp 및 ts 돌연변이)에 추가로 변화된 키메릭 RSV 클론의 동일 또는 상이한 유전자를 포함하는 부가의 유형의 돌연변이를 보충한다. RSV는 10 개의 mRNA 및 10 또는 11 개의 단백질을 코딩한다. 이들 중 3 개는 막통과 표면 단백질, 즉, 부착 G 단백질, 투과에 관련된 융합 F 단백질, 및 작은 소수성 SH 단백질이다. G 및 F는 주요 바이러스 중화 및 방어 항원이다. 4 개의 부가의 단백질은 바이러스 뉴클레오캡시드, 즉, RNA 결합 단백질 N, 인단백질 P, 큰 중합효소 단백질 L 및 전사 신장 인자 M2 ORF1과 관련되어 있다. 매트릭스 M 단백질은 내부 비리온의 일부이고, 뉴클레오캡시드와 피막의 결합을 매개할 것이다. 마지막으로, 기능이 알려지지 않은 2 개의 비구조 단백질 NS1 및 NS2가 있다. 이들 단백질은 발현 수준에서 선택적으로 변화시킬 수 있거나, 또는 다른 목적하는 변화를 사용하여 단독으로 또는 결합하여 전체 또는 부분을 첨가, 결실, 치환 또는 재배열함으로써, 신규한 백신 특성을 나타내는 키메릭 RSV를 얻을 수 있다.
따라서, 생물학적 유래의 RSV 돌연변이체로부터 채택된 약독화 돌연변이에 부가하거나 또는 이와 결합하여, 본 발명은 또한 감염성 RSV 클론의 재조합 공학에 기초한 키메릭 RSV를 약독화시키는 일정 범위의 부가의 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면에 따르면, 감염성 클론에 포함시키기 위한 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열에서 다양한 변화가 발생될 수 있다. 더 구체적으로, 키메릭 RSV에서 목적하는 구조적 및 표현형 변화를 달성하기 위해, 본 발명은 온전한 유전자(들) 또는 유전자 단편(들)을 결실, 치환, 도입 또는 재배열하는 돌연변이 뿐만 아니라, 모 키메릭 게놈 또는 안티게놈으로부터 선택된 한 개의 뉴클레오티드 또는 다수의 뉴클레오티드를 결실, 치환, 도입 또는 재배열하는 변화를 키메릭 RSV 클론에 도입하는 것을 허용한다.
감염성 키메릭 RSV의 목적하는 변화는 전형적으로 목적하는 표현형의 변화, 예를 들면, 바이러스 성장, 온도 민감성, 숙주 면역 반응 또는 약독화를 일으킬 수 있는 능력 등의 변화를 구체화하도록 선택된다. 이들 변화는 예를 들면, 특정 유전자(들) 또는 유전자 영역(들) (예, 세포질, 막통과 또는 세포외 도메인, 면역원성 에피토프, 결합 영역, 활성 부위 등과 같은 단백질 구조 도메인을 코딩하는 유전자 단편)을 제거, 도입 또는 재배열하기 위한 부모 RSV 클론의 돌연변이유발에 의해 공여체 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈에서 야기될 수 있다. 이와 관련하여 흥미있는 유전자로는 RSV 게놈의 모든 유전자(3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5') 뿐만 아니라, 본원에 나타낸 다른 RSV, 다른 바이러스 및 다양한 다른 비RSV원으로부터의 이종 유전자가 포함된다.
또한, 예를 들면, 선택된 RSV 코딩 서열내에 종결 코돈을 도입하거나, 작동가능하게 연결된 프로모터에 대하여 RSV 유전자의 위치를 변화시키거나, 발현 속도를 변화시키기 위해 상류 시작 코돈을 도입하거나, 표현형(예, 성장, 전사에 있어서 온도 제한 등)을 변화시키기 위해 GS 및(또는) GE 전사 신호를 변화(예, 위치를 변화시키거나, 존재하는 서열을 변화시키거나, 또는 존재하는 서열을 이종 서열로 치환하는 것에 의함)시킴으로써, 선택된 유전자의 발현을 단순히 변화시키거나 제거시키는 키메릭 RSV의 변화, 및 바이러스 복제, 선택된 유전자(들)의 전사 또는 선택된 단백질(들)의 번역의 양적 또는 질적 변화를 구체화하는 다양한 다른 결실, 치환, 첨가 및 재배열이 제공된다.
백신 개발을 위해 다른 유형의 약독화 돌연변이를 분석하고 이를 키메릭 RSV 에 포함시키는 능력은 RSV 클론의 광범위한 표적화된 변화에까지 미친다. 예를 들면, SH 유전자의 결실은 증진된 성장을 포함하여 신규한 표현형 특성을 갖는 재조합 RSV를 발생시킨다. 본 발명에서, SH 유전자 결실(또는 어떠한 다른 선택된 비필수 유전자 또는 유전자 단편 결실)은 키메릭 RSV에서 약독화된 표현형을 구체화하는 하나 이상의 부가의 돌연변이, 예를 들면, 생물학적 유래의 약독화된 RSV 돌연변이체로부터 채택된 하나 이상의 점 돌연변이(들)와 결합된다. 예시적 실시태양에서, SH 유전자 또는 NS2 유전자는 cpts248/404, cpts530/1009, cpts530/1030, 또는 또다른 선택된 돌연변이체 RSV 균주로부터 채택된 하나 이상의 cp 및(또는) ts 돌연변이와 결합하여 결실되어, 상이한 돌연변이의 결합된 효과에 기인하는 증가된 바이러스 수율, 증진된 약독화 및 표현형의 반전에 대한 내성을 갖는 재조합 RSV를 발생시킨다.
이와 관련하여, 성장에 비필수적인 어떠한 RSV 유전자, 예를 들면, SH, N, P, NS1 및 NS2 유전자를 키메릭 RSV에서 제거하거나 또는 다른 식으로 변경하여 독성, 병원성, 면역원성 및 다른 표현형 특성에 대한 목적하는 효과를 얻을 수 있다. 예를 들면, SH와 같은 비필수 유전자의 결실에 의한 제거는 배양에서 증진된 바이러스 성장을 야기한다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이 효과는 부분적으로 바이러스 게놈의 감소된 뉴클레오티드 길이에 기인하는 것 같다. 한 예시적 SH 결핍 클론의 경우에, 변화된 바이러스 게놈의 길이는 야생형보다 398 뉴클레오티드가 적은 14,825 뉴클레오티드이다. 예를 들면, RSV 게놈의 다른 코딩 또는 비코딩 영역(예, P, M, F 및 M2 유전자)에서 게놈 크기를 감소시키는 유사한 돌연 변이를 설계함으로써, 본 발명은 키메릭 RSV 성장을 개선하기 위해 쉽게 얻을 수 있는 여러 방법 및 물질을 제공한다.
뿐만 아니라, 단독으로 또는 생물학적 유래의 돌연변이체 RSV로부터 채택된 하나 이상의 약독화 점 돌연변이와 함께 감염성 키메릭 RSV에 포함시키기 위한 다양한 다른 유전적 변화가 RSV 게놈 또는 안티게놈에서 발생할 수 있다. 부가의 이종 유전자 및 유전자 단편(예, 상이한 RSV 유전자, 상이한 RSV 균주 또는 유형, 또는 비RSV원으로부터의 것)이 온전하게 또는 일부로서 삽입될 수 있고, 유전자의 순서가 변화될 수 있고, 유전자 중복이 제거될 수 있고, RSV 게놈 프로모터가 이의 안티게놈 대응물로 치환될 수 있고, 유전자의 일부가 제거되거나 또는 치환될 수 있고, 심지어 전체 유전자가 결실될 수 있다. 조작을 용이하게 하기 위해, 특이 제한 부위를 다양한 유전자간 영역 또는 기타 영역에 삽입하는 것과 같은, 서열의 상이하거나 또는 부가적인 변화가 이루어질 수 있다. 외부 서열을 삽입하기 위한 용량을 증가시키 위해 비번역 유전자 서열을 제거할 수 있다.
또한, 본 발명 내에서 키메릭 RSV 클론으로부터의 유전자 또는 유전자 단편을 제거하지 않고 선택된 유전자 또는 유전자 단편의 발현을 변화시키거나 또는 제거하는 키메릭 RSV의 유전적 변화가 제공된다. 예를 들면, 이것은 선택된 코딩 서열내에 종결 코돈을 도입하거나, 유전자의 위치를 변화시키거나, 상류의 시작 코돈을 도입하여 발현 속도를 변화시키거나, 또는 GS 및(또는) GE 전사 신호를 변화시켜 표현형(예, 성장, 전사에 있어서 온도 제한 등)을 변화시킴으로써 달성될 수 있다.
이와 관련하여 바람직한 돌연변이는 예를 들면, RSV 미니게놈의 돌연변이 분석에 의해 동정될 수 있는 시스 작용 신호 방향성 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 선도, 추적자 및 플랭킹(flanking) 서열의 삽입 및 결실 분석은 바이러스 프로모터 및 전사 신호를 동정하고, RNA 복제 또는 전사를 다양한 정도로 감소시키는 것과 관련된 일련의 돌연변이를 제공하였다. 이들 시스 작용 신호의 포화 돌연변이(이것에 의해 각 위치가 각각의 뉴클레오티드 대체물로 변화됨)도 RNA 복제 및 전사를 감소(한 경우에서, 증가)시킨 다수의 돌연변이를 동정하였다. 이들 돌연변이의 어떠한 것도 본원에 기술한 키메릭 안티게놈 또는 게놈에 삽입될 수 있다.
완전 안티게놈 cDNA를 사용하는 트랜스 작용 단백질 및 시스 작용 RNA 서열의 평가 및 조작은 RSV 미니게놈의 사용에 의해 보조되고 (예, 본원에 참고로 인용된 Grosfeld 등, J. Virol. 69:5677-5686 (1995) 참조), 이러한 보조인자 의존성 상태는 복제 비의존성 감염성 바이러스에서 회복될 수 없을 정도로 억제성인 돌연변이체의 특성화에 유용하다.
본 발명의 키메릭 RSV내의 다른 돌연변이는 게놈의 3' 말단을 안티게놈으로부터의 대응물로 치환하는 것을 포함하고, 이것은 RNA 복제 및 전사의 변화와 관련되어 있다. 뿐만 아니라, 유전자간 영역(Collins 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4594-4598 (1986), 본원에 참고로 인용됨)의 서열 함량을 단축하거나 늘리거나 또는 변화시킬 수 있고, 천연 유전자 중복(Collins 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5134-5138 (1987), 본원에 참고로 인용됨)을 제거하거나 또는 본원에 기술한 방법에 의해 별개의 유전자간 영역으로 변화시킬 수 있다.
한 예시적 실시태양에서, 천연 서열을 합성하여 제조되고 효율적인 번역이 이루어지도록 디자인된 것으로 치환함으로써, F 및 G 방어 항원과 같은 특정 RSV 단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 이와 관련하여, 코돈 사용이 표유류 바이러스 단백질의 번역 수준에서 주요한 인자일 수 있다 (Hass 등, Current Biol. 6: 315-324 (1996). 주요 방어 항원인 RSV의 F 및 G 단백질을 코딩하는 mRNA의 코돈 사용의 고찰로부터 코돈 사용이 불량한 발현과 일치한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 재조합 방법에 의해 코돈 사용을 개선하여 선택 유전자에 대한 개선된 발현을 달성할 수 있다.
또다른 예시적 실시태양에서는, 선택 RSV 유전자의 번역 개시 부위 주위의 서열(바람직하게는, -3 위치의 뉴클레오티드를 포함함)이 단독으로 또는 상류의 시작 코돈의 도입과 결합하여, 번역의 증진 또는 감소를 구체화함으로써 키메릭 RSV 유전자 발현을 조절하도록 변화된다.
별법으로 또는 본원에 기술한 다른 RSV 변화와 결합하여 상기 바이러스의 선택 유전자(들)의 전사 GS 신호를 변화시킴으로써, 키메릭 RSV 유전자 발현을 조절할 수 있다. 한 예시적 실시태양에서, NS2의 GS 신호는 바이러스 복제에 ts 제한을 부과하기 위해 정의된 돌연변이(예, 하기에 기술하는 404(M2) 돌연변이)를 포함하도록 변화된다.
본 발명 내에서 부가의 키메릭 RSV 클론은 전사 GE 신호의 변화를 포함할 수 있다. 예를 들면, N 유전자의 GE 신호로 치환 또는 돌연변이된 NS1 및 NS2의 GE 신호를 갖는 RSV 클론을 생성함으로써, 감소된 수준의 리드트루(readthrough) mRNA 및 하류의 유전자로부터 유래된 단백질의 증가된 발현을 야기할 수 있다. 생성된 키메릭 바이러스는 증가된 성장 반응속도론 및 증가된 플라크 크기를 나타낼 것이며, 이것은 RSV 게놈에서 시스 작용 조절 인자를 변화시킴으로써 RSV 성장 속성을 변화시키는 한 예를 제공한다.
또다른 예시적 실시태양에서는, G mRNA의 변화에 의해 G 단백질의 발현이 증가된다. G 단백질은 막 결합형 및 분비형으로 발현되고, 분비형은 G 번역 개방 해독틀내의 개시 부위에서 번역의 개시에 의해 발현된다. 분비형은 발현된 G 단백질의 절반을 설명할 수 있다. 내부 개시 부위를 단독으로 또는 상류의 개시 부위의 서열 상태를 변화시키는 것과 함께 제거(예, 서열 변화, 결실 등에 의함)함으로써, 목적하는 G 단백질 발현을 변화시킨다. G의 가용성 형태는 중화 항체를 트랩(trap)하기 위한 "유인물(decoy)"로 작용하는 것으로 생각되므로, G 분비형의 제거는 또한 예시적 키메릭 RSV에 대한 숙주의 면역 반응의 질을 개선할 것이다. 또한, 가용성 G 단백질은 Th2 편파적 반응을 자극하는 것을 선호하기 때문에, 증진된 면역 병리학에 관련되어 왔다.
대체적 실시태양에서는, 키메릭 RSV 유전자 발현의 수준이 전사 수준에서 변화된다. 한 측면에서, RSV 유전자 지도에서 선택 유전자의 위치를 프로모터에서 더 가깝거나 또는 더 먼 위치로 변화시킬 수 있고, 이렇게 함으로써 유전자가 각각 더 또는 덜 효율적으로 발현될 것이다. 이러한 측면에 따르면, 특정 유전자의 발현을 야생형 수준과 비교하여 2 배, 더 전형적으로는 4 배로부터 10 배 이하 또는 그 이상으로 유전자 발현을 감소 또는 증가시키면서 달성할 수 있다. 한 예에서, NS2 유전자(RSV 유전자 지도에서 2 번째)는 그 위치에 있어서 SH 유전자(6 번째)로 치환되고, 이것은 NS2의 발현의 예측된 감소를 야기한다. 위치 변화에 기인한 선택 RSV 유전자의 증가된 발현은 10 배, 30 배, 50 배, 100 배 이하 또는 그 이상으로 달성될 수 있고, 종종 상호 위치적으로 치환된 유전자의 발현 수준의 비례적 감소를 수반한다.
다른 예시적 실시태양에서, 각각 더 높거나 또는 더 낮은 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해, F 및 G 유전자는 단독으로 또는 함께 프로모터에 더 가깝거나 더 먼 부위로 전좌된다. 이들 및 다른 전좌 변화는 예를 들면, RNA 복제에 관련된 선택된 바이러스 단백질의 감소된 발현에 기인하여 약독화된 표현형을 갖는 신규한 키메릭 RSV 클론을 야기한다.
본 발명의 더 상세한 측면에서, 예를 들면, 종열 번역 종결 코돈을 번역 개방 해독틀(ORF)에 도입함으로써, 유전자 또는 유전자 단편의 결실없이 바이러스 유전자(예, NS2 유전자)의 발현이 번역 수준에서 제거되는 키메릭 RSV가 제공된다. 이것은 유전자의 결실없이, 선택 유전자가 번역 수준에서 잠재되는 생바이러스를 야기한다. 이러한 형태의 "녹-아웃(knock-out)" 바이러스는 감소된 성장 속도 및 조직 배양에서 작은 플라크 크기를 나타낼 것이다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 주요 바이러스 방어 항원 중의 하나가 아닌 바이러스 유전자의 발현을 제거하는 약독화 돌연변이의 부가적이고 신규한 유형을 제공한다. 이와 관련하여, 표적 단백질의 합성을 회복할 수 있는 보정 돌연변이를 효율적으로 방해하기 위해, 본원에 기술한 결실 돌연변이에 의해 유전자 또는 유전자 단편의 결실없이 생산된 "녹아웃" 바이러스 표현형을 별법으로 생산할 수 있다.
대체적인 디자인을 사용하여 키메릭 RSV를 위한 여러 다른 유전자 "녹아웃"을 제조할 수 있다. 예를 들면, 번역 종결 코돈을 ORFs에 삽입하거나 또는 RNA 편집 부위를 붕괴시키는 것은 선택 유전자의 발현을 잠재되게 하거나 또는 약독화시키기 위한 대체적 방법을 제공한다. 이들 및 다른 녹아웃의 제조방법은 예를 들면, 문헌[Kretzschmar 등, Virology 216: 309-316 (1996); Radecke 등, Virology 217: 418-412 (1996); Kato 등, EMBO J. 16: 178-587 (1987); 및 Schneider 등, Virology 277: 314-322 (1996), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 기술된 바와 같이, 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명의 감염성 키메릭 RSV 클론은 또한 본원에 기술한 방법 및 조성물에 따라, 면역원성을 증진시키고 야생형 RSV 또는 부모 키메릭 RSV로의 감염에 의해 제공된 것보다 더 큰 수준의 방어를 유도하도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에서 적당한 뉴클레오티드 변화에 의해 이종 RSV 균주 또는 유형, 또는 PIV와 같은 비RSV원으로부터의 면역원성 에피토프를 키메릭 클론에 첨가할 수 있다. 별법으로, 키메릭 RSV를 바람직하거나 또는 바람직하지 못한 면역 반응과 관련된 면역원성 에피토프를 첨가하거나 또는 제거(예, 아미노산 삽입, 치환 또는 결실에 의함)하도록 설계할 수 있다.
본 발명의 방법 내에서, 부가의 유전자 또는 유전자 단편을 수용체 RSV 게놈 또는 안티게놈에, 또는 그 근처에 삽입할 수 있다. 이들 유전자는 수용체 유전자와 공통적인 조절하에 있을 수 있거나, 또는 독립적인 세트의 전사 신호의 조절하 에 있을 수 있다. 흥미있는 유전자로는 상기 RSV 유전자 뿐만 아니라, 비RSV 유전자도 포함된다. 흥미있는 비RSV 유전자로는 사이토킨(예, IL-2 내지 IL-15, 특히 IL-2, IL-6 및 IL-12 등), 감마-인터페론 및 T 보조 세포 에피토프가 풍부한 단백질이 포함된다. 이들 부가의 단백질은 별도의 단백질 또는 SH와 같은 RSV 단백질 중의 하나의 제2 카피로부터 설계된 키메라로 발현될 수 있다. 이것은 RSV에 대한 면역 반응을 양적 및 질적으로 변화시키고 개선할 수 있는 능력을 제공한다.
본 발명의 예시적 실시태양에서, 외부 유전자 또는 유전자 단편, 어떤 경우에서는 비코딩 뉴클레오티드 서열을 키메릭 RSV 게놈에 삽입하는 것은 게놈 길이의 목적하는 증가를 야기하고, 부가의 목적하는 표현형 효과를 일으킨다. 증가된 게놈 길이는 부분적으로 삽입체의 길이에 따라 생성된 RSV의 약독화를 야기한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 RSV에 삽입된 비RSV 유전자로부터의 일부 단백질(예, 사이토킨)의 발현은 그 단백질의 작용에 기인하여 바이러스의 약독화를 야기할 것이다. 이것은 백신 바이러스에서 발현된 IL-2에 대하여 기재되어 있고(예, Flexner 등, Nature 33: 259-62 (1987)), 또한 감마 인터페론에 대해서도 예상된다.
본 발명의 키메릭 RSV 내에서 결실, 삽입, 치환 및 온전한 바이러스 유전자 또는 유전자 단편의 변화를 포함하는 다른 돌연변이는 면역억제 개체의 경우에 특히 중요한 매우 안정한 백신 후보물질을 야기한다. 이들 변화 중의 다수는 생성된 백신 균주의 약독화를 야기할 것이나, 다른 것들은 상이한 유형의 목적하는 표현형 변화를 구체화할 것이다. 예를 들면, 특히 숙주 면역성을 간섭하는 단백질을 코딩하는 일부 바이러스 유전자가 공지되어 있다 (예, Kato 등, EMBO. J. 16: 578-87 (1997) 참조, 본원에 참고로 인용됨). 키메릭 백신 바이러스에서 이러한 유전자의 제거는 독성 및 병원성을 감소시키고(감소시키거나) 면역원성을 개선할 것으로 기대된다.
본 발명의 대체적 측면에서, cDNA 발현 게놈 또는 안티게놈으로부터 생성된 감염성 키메릭 RSV는 RSV 또는 RSV유사 균주 (예, 사람, 소, 쥐 등), 또는 폐바이러스 (예, 폐렴 바이러스인 마우스 또는 칠면조 리노트라카이티스 바이러스) 중의 어느 것일 수 있다. 방어적 면역 반응을 일으키기 위해, RSV 균주는 사람을 면역화하기 위해 사용되는 사람 RSV와 같이 면역화된 검체에 내인성인 것일 수 있다. 그러나, 내인성 RSV의 게놈 또는 안티게놈은 상이한 공급원의 조합으로부터의 RSV 유전자 또는 유전자 단편(예, 상이한 RSV종, 아군 또는 균주, 또는 RSV 및 PIV와 같은 또다른 기도 병원균으로부터의 유전자 또는 유전자 단편의 조합)을 발현하도록 변화될 수 있다.
본 발명의 일부 실시태양에서는, 사람 RSV내의 유전자 또는 유전자 단편이 비사람 RSV(예, 소 또는 쥐 RSV)로부터의 대응 이종 유전자 또는 유전자 단편으로 치환된 키메릭 RSV가 제공된다. 별법으로, 키메릭 RSV는 비사람 RSV 수용체 또는 백그라운드 클론 (예, 소 또는 쥐 RSV 클론)에 사람 RSV로부터의 유전자 또는 유전자 단편을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, RSV 유전자 또는 유전자 단편의 치환, 결실 및 첨가는 하나 이상의 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2) 및 L 유전자의 일부 또는 전체, 또는 G 및 F 유전자의 비면역원성 부분을 포함할 수 있다. 또한, 프로모터 또는 전사 신호와 같은 사람 및 비사람 RSV 시스 작용 서열을 각각 비사람 또는 사람 대응 서열로 치환할 수 있다. 따라서, 사람 약독화 유전자 또는 시스 작용 서열을 소 RSV 게놈 또는 안티게놈 백그라운드에 삽입함으로써 생약독화 소 RSV를 생성하는 방법이 제공된다.
이종 유전자 또는 시스 작용 인자를 포함하는 키메릭 사람/비사람 RSV는 숙주 범위 제한 및 백신 용도로 유리한 다른 목적하는 표현형에 대하여 선택된다. 예시적 실시태양에서, 소 RSV 서열은 예를 들면, 문헌[Pastey 등, J. Gen. Virol. 76: 193-197 (1993); Pastey 등, Virus Res. 29: 195-202 (1993); Zamora 등, J. Gen. Virol. 73: 737-741 (1992); Mallipeddi 등, J. Gen. Virol. 74: 2001-2004 (1993); Mallipeddi 등, J. Gen. Virol. 73: 2441-2444 (1992); 및 Zamora 등, Virus Res. 24: 115-121 (1992), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 제공된 바와 같이 및 본원에 기재한 기술에 따라, 소 RSV 구조 및 기능의 공지된 측면에 기초하여 사람 RSV에 도입하기 위하여 선택된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 키메릭 RSV내로의 도입을 위한 흥미있는 돌연변이는 G 단백질의 세포질 꼬리가 없는, 쥐의 폐렴 바이러스의 조직 배양 적응된 비병원성 균주(사람 RSV의 쥐 대응물)를 본받아 설계된다 (Randhawa 등, Virology 207: 240-245 (1995)). 따라서, 본 발명의 한 측면에서, 목적하는 약독화를 달성하기 위해, 사람 RSV 당단백질인 F, G 및 SH 중 하나 이상의 세포질 및(또는) 막통과 도메인이 이종 대응 서열(예, 쥐 폐렴 바이러스의 F, G 또는 SH 단백질의 세포질 및(또는) 막통과 도메인으로부터의 서열)을 사용하여 키메릭 RSV내에서 첨가, 결실, 변화 또는 치환된다. 또다른 실시예에서는, 조직 배양에서 바이러스의 성장 및(또는) 감염 및 병원성에 대한 신규한 영향을 달성하기 위해, F 단백질의 절단 부위 또는 그 근처의 뉴클레오티드 서열, 또는 G 단백질의 추정 부착 도메인을 점 돌연변이, 위치 특이성 변화, 또는 전체 유전자 또는 유전자 단편을 포함하는 변화에 의해 변화시킬 수 있다.
따라서, 인간에게 투여하기 위한 감염성 키메릭 RSV는 예를 들면 약독화를 위해, 예를 들면 소 또는 쥐 RSV 또는 PIV로부터의 유전자를 함유하도록 변화된 사람 RSV일 수 있다. 예를 들면, PIV로부터의 유전자 또는 유전자 단편을 삽입함으로써, PIV 및 RSV에 대한 이가의 바이러스를 제공할 수 있다. 별법으로, 이종 RSV종, 아군 또는 균주, 또는 PIV와 같은 별개의 기도 병원균을 예를 들면, 사람 RSV감염에 대한 방어를 일으키는 에피토프 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하도록 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 사람 RSV 당단백질 유전자를 소의 당단백질 유전자로 치환함으로써 소의 백그라운드에 사람 RSV 표면 당단백질을 포함하는 생성된 키메릭 RSV가 잔류하는 소의 유전적 백그라운드에 기인하여 사람 숙주에서 복제할 수 있는 제한된 능력을 보유하는 반면, 사람 RSV 균주에 대하여 사람에게서 방어적 면역 반응을 일으킬 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 키메릭 소-사람 RSV는 사람 RSV NP 유전자 또는 유전자 단편을 대응 소 NP 유전자 또는 유전자 단편으로 치환하는 것을 포함하고, 이 키메라는 임의적으로 부가의 유전적 변화, 예를 들면, 점 돌연변이 또는 유전자 결실을 포함하도록 구성될 수 있다. 예를 들면, 사람 RSV 코딩 서열(예, NS1, NS2, NP 등) 또는 비코딩 서열(예, 프로모터, 유전자 말단, 유전자 시작, 유전자간 또는 다른 시스 작용 인자)을 대응 소 또는 쥐 RSV 서열로 치환함으로써 다양한 가능한 약독화 및 다른 표현형 효과를 갖는 키메릭 RSV를 생성할 것으로 기대된다. 특히, 숙주 범위 및 다른 목적하는 효과는, 비사람 RSV 유전자가 예를 들면, 이종 서열 또는 단백질과 생물학적 상호작용성 사람 RSV 서열 또는 단백질(즉, 보통 바이러스 전사, 번역, 조합 등을 위해 치환된 서열 또는 단백질과 협동하는 서열 또는 단백질)과의 불양립성으로 인해 사람 세포에서 효율적으로 기능하지 못하는 사람 RSV 백그라운드내에 이입된 비사람 RSV 유전자로부터 발생하는 것으로 생각된다.
본 발명의 더 상세한 측면에서, 키메릭 RSV는 다른 병원균, 특히 파라인플루엔자 바이러스(PIV)의 방어 항원을 위한 벡터로 사용된다. 예를 들면, 키메릭 RSV는 감염성 약독화 백신 바이러스를 생성하기 위해 PIV로부터의 방어 항원을 코딩하는 서열을 포함하는 키메릭 RSV를 설계할 수 있다. 각각 본원에 참고로 인용된 미국 특허 출원(제목: PRODUCTION OF PARAINFLUENZA VIRUS VACCINES FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCE, 1998. 5. 22 출원, 출원 번호: 제09/083,793호(대응 국제 공개 번호 제WO 98/53078호)) 및 그의 우선권인 임시 출원(1997. 5. 23. 출원, 출원 번호 제60/047,575호)에서 PIV cDNA의 클로닝 및 다른 기재가 제공된다. 이 기재는 감염성 PIV 바이러스 클론을 생성하기 위해 사용될 수 있는 하기의 플라스미드에 관한 기술을 포함한다: p3/7(131) (ATCC 97990); p3/7(131)2G (ATCC 97889); 및 p218(131) (ATCC 97991) (각각 미국 버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시티 볼리버드 10801 소재의 American Type Culture Collection(ATCC)와 부다페스트 조 약과의 관계하에 놓여있으며, 상기 접근 번호가 부여됨).
본 발명의 이러한 측면에 따르면, RSV 게놈 또는 안티게놈 서열 및 하나 이사의 PIV 서열의 키메라를 포함하는 키메릭 RSV, 예를 들면, RSV 및 PIV1, PIV2, PIV3 또는 소 PIV로부터의 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 예를 들면, RSV의 각 유전자는 PIV1, PIV2 또는 PIV3의 HN 및(또는) F 당단백질 유전자와 같은 사람 PIV로부터의 대응 유전자로 치환될 수 있다. 별법으로, HPIV1, HPIV2 또는 HPIV3의 HN 또는 F의 세포질 꼬리, 막통과 도메인 또는 엑토도메인과 같은 선택된 이종 유전자 단편을 예를 들면, RSV 클론의 동일 유전자, RSV 클론의 상이한 유전자내 또는 RSV 게놈 또는 안티게놈의 비코딩 서열에 있는 대응 유전자 단편으로 치환할 수 있다. 한 실시태양에서는, 신규한 약독화 바이러스 및(또는) PIV 및 RSV에 대한 다가의 백신 면역원성을 얻기 위해, HPIV3의 HN 또는 F로부터의 유전자 단편을 RSV 타입 A의 대응 유전자 단편으로 치환하여 키메릭 단백질, 예를 들면, RSV의 엑토도메인과 융합된 RSV의 세포질 꼬리 및(또는) 막통과 도메인을 갖는 융합 단백질을 코딩하는 구조체를 생성한다.
재조합 RSV에 대한 상술한 변화 뿐만 아니라, 조작을 용이하게 하기 위해, 다양한 유전자간 영역(예, G와 F 유전자 사이의 특이 Stu1 부위) 또는 기타 영역에 특이 제한 부위를 삽입하는 것과 같은 상이하거나 부가적인 변화가 RSV 클론에서 이루어질 수 있다. 외부 서열을 삽입하기 위한 용량을 증가시키기 위해 비번역 유전자 서열을 제거할 수 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서는, 단리된 감염성 키메릭 RSV를 생성하기 위 한 조성물(예, 단리된 폴리뉴클레오티드 및 키메릭 RSV 코딩 cDNA를 포함하는 벡터)이 제공된다. 이들 조성물 및 방법을 사용하여, 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈, 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질(P), 큰 (L) 중합효소 단백질 및 RNA 중합효소 신장 인자로부터 감염성 키메릭 RSV를 생성한다. 본 발명의 관련 측면에서, 상술한 구조적 및 표현형 변화를 재조합 키메릭 RSV에 도입하여 감염성 약독화 백신 바이러스를 얻기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
다양한 공지의 방법에 의해 상기 정의한 돌연변이를 감염성 키메릭 RSV 클론에 도입할 수 있다. "감염성 클론"은 cDNA, 또는 주형으로 작용할 수 있는 게놈 또는 안티게놈 RNA로 전사되어 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 게놈을 생성할 수 있는 합성 또는 기타의 생성물을 의미한다. 따라서, 통상의 기술(예, 위치 방향성 돌연변이)에 의해 정의된 돌연변이를 게놈 또는 안티게놈의 cDNA 카피에 도입할 수 있다. 본원에 기술한 바와 같이, 안티게놈 또는 게놈 cDNA 서브단편을 사용하여 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA를 조합하는 것은 각 영역을 별도로 조작하여(더 작은 cDNA가 큰 것보다 조작하기에 더 용이하다) 완전한 cDNA로 쉽게 조합할 수 있는 장점을 갖는다. 따라서, 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA, 또는 이의 어떠한 서브단편도 올리고뉴클레오티드 방향성 돌연변이를 위한 주형으로 사용될 수 있다. 이것은 예를 들면, 뮤타-진 키트(Muta-gene(등록상표) kit, 캘리포니아주 리치몬드 소재의 Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 단일 가닥 파아지미드 형태의 중간체를 경유하거나, 또는 카멜레온(Chameleon) 돌연변이유발 키트(캘리포니아주 라 졸라 소재의 Stratagene)와 같이 이중 가닥 플라스미드를 직접 주형으로 사용하는 방법을 통해서일 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 관심있는 돌연변이를 함유하는 주형을 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의할 수 있다. 다음으로, 돌연변이 서브단편을 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA로 조합할 수 있다. 다양한 다른 돌연변이유발 기술이 공지되어 있고, RSV 안티게놈 또는 게놈 cDNA에서 관심있는 돌연변이를 생성하는데 사용하기 위해 입수가능하다. 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 변화에서부터 하나 이상의 유전자 또는 유전자 영역을 함유하는 큰 cDNA 부분의 치환에 이르기까지 다양할 수 있다.
따라서, 한 예시적 실시태양에서는, 뮤타-진 파아지미드 시험관내 돌연변이유발 키트(Bio-Rad로부터 입수가능)를 사용함으로써 돌연변이를 도입한다. 즉, RSV 게놈 또는 안티게놈의 일부를 코딩하는 cDNA를 플라스미드 pTZ18U로 클로닝하고, CJ236 세포를 형질전환하는데 사용한다 (Life Technologies). 파아지미드는 제조자가 제시하는 바와 같이 제조한다. 게놈 또는 안티게놈의 목적하는 위치에 변화된 뉴클레오티드를 도입함으로써 돌연변이유발을 위한 올리고뉴클레오티드를 디자인한다. 이어서, 유전적으로 변화된 게놈 또는 안티게놈 단편을 함유하는 플라스미드를 증폭시킨 다음, 돌연변이된 부분을 전체 길이의 게놈 또는 안티게놈 클론에 재도입한다.
정의된 돌연변이를 감염성 RSV에 도입할 수 있는 능력은 RSV 분자 생물학 및 병원론의 분석을 포함하여 다수의 적용분야를 갖는다. 예를 들면, 발현 수준을 제거 또는 감소시키거나, 또는 돌연변이체 단백질을 생성하는 돌연변이를 도입함으로써, NS1, NS2, SH, M2(ORF1) 및 M2(ORF2) 단백질을 포함하여 RSV 단백질의 기능을 검토하고 조작할 수 있다. 하기의 한 예시적 실시태양에서는, mRNA 코딩 서열 및 플랭킹 전사 신호의 결실에 의해 바이러스 유전자, 즉, SH 유전자의 발현이 제거되는 재조합 RSV가 구성된다. 놀랍게도, 이 바이러스는 회복될 수 있을 뿐만 아니라, 조직 배양에서 효율적으로 성장한다. 실제로, 감염성 바이러스의 수율 및 플라크 크기에 기초할 때, 이의 성장은 야생형에 비하여 실질적으로 증가하였다. SH 결실 및 본 발명의 다른 RSV 유도체로부터 기인한 조직 배양에서 이러한 개선된 성장은 다른 시스템에서 백신 바이러스의 생성을 곤란하게 하였던 조직 배양에서의 RSV의 불량한 수율의 문제점을 극복하는 RSV 백신을 개발하는데 유용한 도구를 제공한다. 이들 결실은 유전적 복귀에 대하여 매우 안정하고, 이로부터 유래된 RSV 클론은 백신으로서 특히 유용하다.
본 발명은 또한 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 하나 이상의 cDNA로부터 감염성 키메릭 RSV를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 감염성 RSV를 형성하는데 필수적인 바이러스 단백질과 세포내 또는 시험관내에서의 공동발현을 위한 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA가 구성된다. "RSV 안티게놈"은 손자 RSV 게놈의 합성을 위한 주형으로 작용하는 단리된 정방향 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 바람직하게는, 전사하고 복제하는 뉴클레오캡시드를 생성하는데 필수적인 단백질을 코딩하는 상보 서열, 즉, N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질을 코딩하는 서열의 정방향 전사체와 혼성화할 가능성을 최소화하기 위해, 복제 중간체 RNA 또는 안티게놈에 대응하는, RSV 게놈의 정방향 형태인 cDNA가 구성된다. RSV 미니게놈 시스템에서, RSV에 의해 보충되든 또는 플라스미드에 의해 보충되든, 구제에서 게놈 및 안티게놈의 활성은 동등하였고, 이것은 게놈 또는 안티게놈을 사용할 수 있고, 따라서 선택은 방법론적 또는 다른 근거에 달려있다는 것을 지적한다.
실질적으로 문헌[Mink 등, Virology 185: 615-624 (1991); Stec 등, Virology 183: 273-287 (1991); 및 Conners 등, Virol. 208: 478-484 (1995), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 기술된 바와 같이, 선천성 RSV 게놈은 전형적으로 상보적 바이러스 mRNA를 통해 11 종의 바이러스 단백질, 즉, 비구조적 종인 NS1 및 NS2, N, P, 매트릭스(M), 작은 소수성(SH), 당단백질(G), 융합(F), M2(ORF1), M2(ORF2) 및 L을 코딩하는 역방향 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 본 발명을 위해, 본 발명의 재조합 RSV의 게놈 또는 안티게놈은 코딩된 바이러스 또는 서브바이러스 입자가 감염성이게 하는데 필수적인 유전자 또는 이의 일부를 함유하는 것만을 필요로 한다. 나아가, 상기 유전자 또는 이의 일부는 하나를 초과하는 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 제공될 수 있다. 즉, 유전자는 상보 등에 의해 별도의 뉴클레오티드 분자로부터 제공될 수 있다.
재조합 RSV는 재조합 발현 시스템으로부터 직접 또는 간접적으로 유래되었거나, 또는 이로부터 생성된 바이러스 또는 서브바이러스 입자로부터 발생된 RSV 또는 RSV 유사 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 의미한다. 재조합 발현 시스템은 적어도 유전적 인자 또는 RSV 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 인자, 예를 들면, 프로모터, RSV RNA로 전사되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 적당한 전사 개시 및 종결 서열의 조합을 포함하는 작동가능하게 연결된 전사 유닛을 포함하는 재조합 발 현 벡터를 사용할 것이다.
cDNA 발현 게놈 또는 안티게놈으로부터 감염성 RSV를 생성하기 위해, 게놈 또는 안티게놈을, (i) RNA 복제가능한 뉴클레오캡시드를 생산하고 (ii) 손자 뉴클레오티드를 RNA 복제 및 전사에 알맞게 하는데 필수적인 RNA 단백질과 공동발현시킨다. 게놈 뉴클레오티드에 의한 전사는 다른 RSV 단백질을 제공하고, 생산적인 감염을 개시한다. 별법으로, 공동발현에 의해 생산적인 감염에 요구되는 부가의 RSV 단백질을 공급할 수 있다.
예를 들면, 클로닝한 cDNA 단편을 조합하고 집합체의 완전한 안티게놈을 제공하거나, 또는 RSV mRNA 또는 게놈 RNA의 역전사 카피의 중합효소 연쇄 반응 (PCR; 예를 들면, 미국 특허 제4,683,195 및 1,683,202, 및 PCR Protocol: A Guide to Method and Application, Innis 등, 판, Academic Press, 샌 디에고 (1990), 본원에 참고로 인용됨)에 의해 본 발명에서의 사용을 위한 RSV 안티게놈을 구성할 수 있다. 예를 들면, 적당한 프로모터(예, T7 RNA 중합효소 프로모터) 및 선도 영역 보체로부터 SH 유전자에까지 미치는, 안티게놈의 좌측 말단을 함유하는 cDNA를 적당한 발현 벡터, 예를 들면, 플라스미드(예, pBR322) 또는 다양한 입수가능한 코스미드, 파아지 또는 DNA 바이러스 벡터에서 조합할 수 있다. 벡터는 돌연변이유발 및(또는) 조합을 용이하게 할 수 있도록 디자인된 특이 제한 부위를 함유하는 합성 다중연결자의 삽입에 의해 변화될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 기술한 플라스미드 벡터는 PstI-EcoR1 단편을 통상의 제한 효소 부위를 함유하는 합성 DNA로 치환함으로써 pBR322로부터 유도되었다. pBR322를 벡터로 사용하여 뉴클레오티드 결실 또는 삽입이 유지되었을 RSV 서열의 3716 내지 3732 뉴클레오티드를 안정화시켰고, DH10B 균주에서 플라스미드를 증식시켜서 4499 뉴클레오티드의 근처에서 일어났을 인공 복제 및 삽입을 회피하였다. 제조의 용이를 위해, L 및 추적자 서열처럼, G, F 및 M2 유전자를 별개의 벡터에서 조합할 수 있다. 안티게놈 플라스미드의 우측 말단(예, L 및 추적자 서열)은 목적하는 경우, 플랭킹 리보자임 및 종열 T7 전사 종결자와 같은 부가의 서열을 함유할 수 있다. 리보자임은 단일 비바이러스 뉴클레오티드를 함유하는 3' 말단을 발생시키는 망치머리 유형(예, Grosfeld 등, J. Virol. 69: 5677-5686 (1995))일 수 있거나, 또는 비RSV 뉴클레오티드가 없는 3' 말단을 발생시키는 간염 델타 바이러스(Perrotta 등, Nature 350: 434-436 (1991))와 같은 다른 적합한 리보자임일 수 있다. 중간 단편(예, G 내지 M2 부분)이 선도 내지 SH 플라스미드의 적당한 제한 부위에 삽입되면, 이것이 L-추적자-리보자임-종결자 부분에 대한 수용체가 되어, 완전한 안티게놈을 발생시킨다. 본원에 기술한 한 예에서는, 선도 서열을 최적의 활성을 위해 세 개의 전사 G 잔기를 포함한 T7 RNA 중합효소에 대한 프로모터에 인접하도록 구성하였고, 전사는 이들 세 개의 비바이러스 G 잔기를 안티게놈의 5' 말단에 부여한다. 이들 세 개의 비바이러스 G 잔기를 생략하여 비바이러스 뉴클레오티드가 없는 5' 말단을 생성할 수 있다. 거의 정확한 3' 말단을 생성하기 위해, 추적자 말단을 망치 머리 모양의 리보자임에 인접하게 구성하였고, 이것은 절단시 단일 3' 인산화 U 잔기를 코딩된 RNA의 3' 말단에 부여할 것이다.
본 발명의 일부 실시태양에서는, 하나 이상의 보조 바이러스에 의해 전사 및 복제 RSV 뉴클레오티드를 생성하는데 필수적인 단백질을 코딩하는 보충 서열이 제공된다. 이러한 보조 바이러스는 야생형 또는 돌연변이체일 수 있다. 바람직하게는, 보조 바이러스는 RSV cDNA에 의해 코딩된 바이러스와 표현형적으로 구별될 수 있다. 예를 들면, RSV cDNA에 의해 코딩된 바이러스가 아닌 보조 바이러스와 면역학적으로 반응하는 단일클론 항체를 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 중화 항체일 수 있다. 일부 실시태양에서, 친화 크로마토그래피에 항체를 사용하여 보조 바이러스와 재조합 바이러스를 분리할 수 있다. 이러한 항체의 획득을 돕기 위해, RSV cDNA에 돌연변이를 도입하여 예를 들면, HN 또는 F 당단백질 유전자에 보조 바이러스로부터의 항원 다양성을 제공할 수 있다.
약독화 키메릭 클론을 생성하기 위해, RSV 게놈 또는 안티게놈에서 다양한 뉴클레오티드 삽입 및 결실이 일어날 수 있다. 야생형 사람 RSV의 게놈 뉴클레오티드 길이(15,222 뉴클레오티드)는 6의 배수이고, 파라믹소바이러스 및 모빌리바이러스의 구성원은 전형적으로 "6의 규칙"을 따른다. 즉, 게놈(또는 미니게놈)은 뉴클레오티드 길이가 6의 배수인 경우에만 효율적으로 복제한다 (캡시드화 NP 단백질에 대한 뉴클레오티드 잔기의 정확한 간격을 위한 요구로 생각됨). 단일 잔기 증가에 위한 RSV 게놈 길이의 변화는 복제의 효율에 영향을 미치지 않았고, 계대배양 후 여러 개의 상이한 미니게놈 돌연변이체의 서열 분석으로부터 길이의 차는 보완적 변화없이 유지되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, RSV에는 게놈 길이가 6의 배수이어야 한다는 엄격한 요구가 결여되어 있고, 본 발명의 재조합 RSV의 복제를 좌절시키지 않고 RSV 게놈 또는 안티게놈에서 뉴클레오티드 삽입 및 결실이 일어날 수 있 다.
RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 구성하는 별법으로는 서브유닛 cDNA 성분의 수를 하나 또는 두 개의 단편으로 줄이는 예를 들면, 문헌[Cheng 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699 (1994); Samal 등, J. Virol. 70: 5075-5082 (1996), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 기술된 바와 같은 개선된 PCR 조건을 사용하는 역전사 PCR이 포함된다. 다른 실시태양에서는, 상이한 프로모터(예, T3, SP6) 또는 상이한 리보자임(예, 간염 델타 바이러스의 리보자임)을 사용할 수 있다. 큰 게놈 또는 안티게놈을 더 잘 수용하기 위해 상이한 DNA 벡터(예, 코스미드)를 사용할 수 있다.
RNA 복제에 필수적인 N, P 및 L 단백질은 복제의 진행을 위해 M2(ORF1) 단백질과 같은 RNA 중합효소 신장 인자를 요구한다. 따라서, 음성 가닥 RNA 바이러스에 있어서 M2(ORF1) 또는 실질적으로 이와 동등한 전사 신장 인자가 요구되고, 생산적 감염 중 기능적 뉴클레오티드의 필수 성분이다.
M2(ORF1) 단백질의 요구는 전사 신장 인자로서의 역할과 일치한다. 음성 가닥 RNA 바이러스에 있어서 RNA 중합효소 신장 인자 단백질의 발현의 요구는 본 발명의 특징이다. M2(ORF1)은 키메릭 게놈 또는 안티게놈, 또는 그것과의 공동발현에 의해, 완전 M2 유전자의 발현에 의해 제공될 수 있으나, 이러한 경우에 제2 ORF2가 또한 발현될 수 있고, RNA 복제에 억제적 영향을 미친다. 따라서, 완전 M2 유전자를 사용하여 감염성 바이러스를 생성하는 경우에는, M(ORF1)이 전사 신장 활성을 제공하기에 충분하나 너무 많은 M(ORF2)가 RNA 복제를 억제하지 않는 정도로 발현되도록 두 개의 ORF의 활성이 균형을 이루어야 한다. 별법으로, ORF2가 결여되어 있거나 또는 결손 ORF2를 코딩하도록 설계된 cDNA로부터 ORF1 단백질을 제공한다. 또한, 외피 구성성분을 코딩하는 것(즉, SH, M, G, F 단백질)과 같은 부가의 바이러스 단백질 유전자의 공동 발현에 의해 바이러스 생성의 효율을 개선할 수 있다.
트랜스팩션, 전기천공법, 기계적 삽입, 형질도입 등에 의해, RSV 게놈 또는 안티게놈, 및 별도로 또는 시스(cis)로 N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드(cDNA)를 생산적 RSV 감염을 지지할 수 있는 세포, 예를 들면, HEp-2, FRhL-DBS2, MRC 및 베로(Vero) 세포에 삽입한다. 단리된 뉴클레오티드 서열의 트랜스팩션은 예를 들면, 칼슘 포스페이트 매개 트랜스팩션 (Wigler 등, Cell 14: 725 (1978); Corsaro 및 Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Graham 및 Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)), 전기천공법 (Neumann 등, EMBO J. 1: 841-845 (1982)), DEAE-덱스트란 매개 트랜스팩션 (Ausubel 등, 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., 뉴욕 (1987)), 양이온성 지질 매개 트랜스팩션 (Hawley-Nelson 등, Focus 15: 73-79 (1993) 또는 상업적으로 입수가능한 트랜스팩션제 (예, LipofectACE (등록상표), Life Technologies)에 의해 배양 세포에 도입될 수 있다 (각각의 상기 문헌은 본원에 참고로 인용됨).
N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질은 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것과 동일 하거나 또는 별도일 수 있는 하나 이상의 발현 벡터, 및 이들의 다양한 조합에 의해 코딩된다. 목적하는 경우, 자신의 벡터 또는 N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질 및(또는) 완전 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 벡터에 의해 코딩된 부가의 단백질을 포함할 수 있다. 게놈 또는 안티게놈 및 트랜스팩션된 플라스미드로부터의 단백질의 발현은 예를 들면, 각각의 cDNA를 T7 RNA 중합효소에 대한 프로모터의 조절하에 두고, 감염, 트랜스팩션 또는 형질도입에 의해 T7 RNA 중합효소에 대한 발현 시스템, 예를 들면, T7 RNA 중합효소를 발현하는 우두 바이러스 MVA 균주 재조합체를 공급함으로써 달성할 수 있다 (Wyatt 등, Virology, 210: 202-205 (1995), 본원에 참고로 인용됨). 바이러스 단백질 및(또는) T7 RNA 중합효소는 또한 트랜스팩션된 포유류 세포로부터, 또는 예비형성된 mRNA 또는 단백질의 감염에 의해 공급될 수 있다.
별법으로, 안티게놈 또는 게놈의 합성을 시험관내(세포의 부존재)에서 전사-번역 결합 반응으로 수행한 후, 세포를 트랜스팩션시킬 수 있다. 또는, 시험관내에서 안티게놈 또는 게놈 RNA를 합성하고, RSV 단백질을 발현하는 세포를 트랜스팩션시킬 수 있다.
본 발명에 따른 후보 키메릭 백신 바이러스를 선별하기 위해, 널리 공지된 방법에 따라 생존도, 약독화 및 면역원성의 기준을 결정한다. 본 발명의 백신에서 가장 바람직한 바이러스는 생존도를 유지해야 하고, 안정한 약독화 표현형을 가져야 하고, 면역화 숙주에서 복제(낮은 수준이라 할지라도)를 나타내어야 하고, 접종자에게서 야생형 바이러스로부터의 후속적 감염에 의해 유발된 심각한 질병에 대한 방어를 부여하기에 충분한 면역 반응을 효율적으로 일으켜야 한다. 분명하게는, 이제까지 공지되고 보고된 RS 바이러스 돌연변이체는 이러한 모든 기준을 만족시키지 못한다. 과연, 공지의 약독화 RSV에 대해 보고된 결과에 기초한 예상과 달리, 본 발명의 바이러스는 생육할 수 있고 이전의 돌연변이체보다 더 약독화될 뿐만 아니라, 이전에 연구된 돌연변이체보다 생체내에서 유전적으로 더 안정하고, 방어적 면역 반응을 촉진하는 능력, 어떤 경우에서는 다수의 변화에 의해 제공된 방어의 확대, 즉, 상이한 바이러스균주 또는 아군에 대한 방어, 또는 상이한 면역학적 기초(예, 분비 대 혈청 면역글로불린, 세포성 면역 등)에 의한 방어를 유발하는 능력을 보유한다. 본 발명의 이전에, 생체내 복제 후 ts 표현형의 유전적 불안정성은 ts 바이러스에 있어서 통칙이었다 (Murphy 등, Infect. Immun. 37: 235-242 (1982)).
백신 및 다른 목적의 RSV 바이러스를 증식시키기 위해, RSV 성장을 허용하는 다수의 세포주를 사용할 수 있다. RSV는 다양한 사람 및 동물 세포에서 성장한다. 백신용 약독화 RS 바이러스를 증식시키기 위한 바람직한 세포주는 DBS-FRhL-2, MRC-5 및 베로 세포를 포함한다. 일반적으로 베로 세포와 같은 상피세포를 사용하여 가장 높은 바이러스 수율을 얻는다. 전형적으로 약 0.001 내지 1.0 이상 범위의 감염 다중도에서 바이러스를 사용하여 세포를 접종하고, 바이러스의 복제를 위해 허용된 조건, 예를 들면, 약 30 내지 37 ℃에서 약 3 내지 5일 동안, 또는 바이러스가 적당한 역가에 도달하기에 필요한 만큼 배양한다. 바이러스를 세포 배양으로부터 회수하고, 전형적으로 널리 공지된 정화 방법, 예를 들면, 원심분리에 의해 세포 성분으로부터 분리하고, 목적하는 경우 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용 하여 추가로 정제할 수 있다.
적당한 약독화, 표현형 복귀에 대한 저항 및 백신으로 사용하기 위한 면역원성을 확인하기 위해, 본원에 기술한 바와 같이 약독화한 키메릭 RSV를 다양한 널리 공지되고 일반적으로 허용되는 시험관내 및 생체내 모델에서 시험할 수 있다. 시험관내 분석에서, 변화된 바이러스(예, 다양하게 약독화된 생물학적 유래 또는 재조합 RSV)를 바이러스 복제의 온도 민감성, 즉, ts 표현형, 및 작은 플라크 표현형에 대해 시험한다. 추가로 변화된 바이러스를 RSV 감염의 동물 모델에서 시험한다. 다양한 동물 모델이 기재되어 있고, 문헌[Meignier 등, 판, Animal Models of Respiratory Syncytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, (1991), 본원에 참고로 인용됨]에 요약되어 있다. RS 감염의 코튼(cotton) 랫트 모델이 미국 제4,800,078호 및 문헌[Prince 등, Virus Res. 3: 193-206 (1985), 본원에 참고로 인용됨]에 기재되어 있고, 사람 및 비사람 영장류에서의 약독화 및 효율에 대한 예측으로 고려된다. 뿐만 아니라, 문헌[Richardson 등, J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978); Wright 등, Infect. Immun. 37: 397-400 (1982); Crowe 등, Vaccine 11: 1395-1404 (1993), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 상세히 기재된 바와 같이, 침팬지를 사용하는 RSV 감염의 영장류 모델로부터 사람에서의 약독화 및 효율을 예측한다.
후보 RSV의 약독화 수준에 관하여 설치류 및 침팬지로부터 유래된 데이타의 상호관계는, 마우스의 폐에서 한 스펙트럼의 기도 신시티움 아군 A 바이러스의 복제를 침팬지에서의 복제와 연관시키는 그래프인 도 1에 의해 입증될 수 있다. 야 생형 RSV와 비교한 상대적인 복제 수준은 실질적으로 동일하였고, 이것은 마우스를 후보 백신 RSV의 약독화 수준을 처음에 특성화하는 모델로 작용하게 한다. 마우스 및 코튼 랫트 모델은 후보 백신 바이러스가 침팬지에서 부적당한 성장을 나타내는 경우에 특히 유용하다. RSV 아군 B 바이러스는 침팬지에서 성장이 불량한 RS 바이러스의 한 예이다.
게다가, 감염된 코튼 랫트에서 RSV 중화 항체의 치료학적 효과는 RSV에 감염된 원숭이 및 사람의 후속적 면역치료와 매우 관계있는 것으로 밝혀졌다. 과연, 코튼 랫트는 감염된 원숭이, 침팬지 및 사람의 RSV 중화 항체를 사용하는 면역치료에 대한 반응에 있어서 신뢰할만한 실험 대용물로 보인다. 예를 들면, 처리된 동물의 혈청중의 RSV 중화 항체의 양을 측정하였을 때, 코튼 랫트에서 치료학적 효과와 관련된 상기 항체의 양(즉, 1:302 내지 1:518의 혈청 RSV 중화 역가)은 원숭이(즉, 1:539 역가), 또는 유아 또는 어린이(즉, 1:877)에 대하여 입증된 것과 동일한 범위이다. 코튼 랫트에서 치료학적 효과는 폐에서 바이러스 역가가 100 배 이상 감소(Prince 등, J. Virol. 61:1851-1854)된 것에 의해 입증된 반면, 원숭이에서는 치료학적 효과가 폐 바이러스 역가가 50 배 감소(Hemming 등, J. Infect. Dis. 152: 1083-1087 (1985))된 것으로 관찰되었다. 마지막으로, 심한 RSV 기관지염 또는 폐렴으로 입원한 유아 및 어린이에서의 치료학적 효과는 처리군에서 산화의 상당한 증가 및 처리 환자의 상기도로부터 회수할 수 있는 RSV 양의 상당한 감소에 의해 입증된다 (Hemming 등, Antimicrob. Agents Chemother. 31: 1882-1886 (1987)). 따라서, 이들 연구에 기초할 때, 코튼 랫트는 유아 및 어린이에게서 키 메릭 RSV 백신의 성공을 예측하기 위한 관련 모델을 구성한다. 마우스를 포함하여 다른 설치류도 이들 동물이 RSV 복제를 허용하고 사람과 더 유사한 심부 체온을 가지므로, 마찬가지로 유용할 것이다 (Wright 등, J. Infect. Dis. 122: 501-512 (1970) 및 Anderson 등, J. Gen. Virol. 71: (1990)).
상기 및 하기의 실시예에 따르면, 본 발명은 또한 백신 용도의 단리된 감염성 키메릭 RSV 조성물을 제공한다. 백신의 한 성분인 약독화 키메릭 바이러스는 단리되고 전형적으로 정제된 형태이다. 단리되었다는 것은 야생형 바이러스의 선천성 환경, 예를 들면, 감염된 개체의 비인강 이외에 있는 RSV를 지칭한다. 더 일반적으로, 단리되었다는 것은 약독화 바이러스를 세포 배양 또는 다른 인공 배지의 성분으로 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 약독화 RSV를 감염된 세포 배양에 의해 생산하고, 세포 배양으로부터 분리하고, 다른 비천연 RS 바이러스(예, F 단백질에 대한 중화 모노클론 항체에 대한 내성에 의해 약독화되는 것으로 선별되는 것)를 함유하는 안정화제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 키메릭 RSV 백신은 활성 성분으로서 본원에서 기술한 바와 같이 생성된 RSV의 면역학적 유효량을 함유한다. 생물학적 유래 또는 재조합체 RSV는 백신 조성물에 직접 사용되거나, 또는 동결건조될 수 있다. 동결건조 바이러스는 전형적으로 약 4 ℃에서 유지될 것이다. 하기에 더 기술하는 바와 같이, 사용하기에 앞서 동결건조 바이러스는 보조제와 함께 또는 보조제 없이 예를 들면, 식염수 또는 SPG, MG++ 및 HEPES를 포함하는 안정화 용액에서 재구성된다. 생물학적 유래 또는 재조합으로 변경된 바이러스는 약리학적으로 허용가능한 담체 및(또는) 보조제와 함께 숙주에 도입될 수 있다. 유용한 담체는 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등이 포함된다. 생성된 수용액은 사용을 위해 자체로 또는 동결건조되어 포장되고, 동결건조 제제는 상기한 바와 같이 투여 전에 멸균액과 결합될 수 있다. 조성물은 pH 조절제, 완충제, 등장화제, 습윤제 등과 같은 생리적 조건과 가깝게 하기 위해 요구되는 약제학적으로 허용가능한 보조제, 예를 들면, 아세트산 나트륨, 젖산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 모노라우린산 소르비탄, 올레산 트리에탄올아민 등을 함유할 수 있다. 허용가능한 보조제로는 당업계에 널리 공지된 물질인 불완전 프로인트 보조제, 인산 알루미늄, 수산화 알루미늄 또는 백반이 포함된다. 또한, 바람직한 보조제로는 스티뮤론 (Stimulon(상표), 메사츄세츠주 파밍엄 소재의 Aquila Biopharmaceuticals, Inc.), 엠피엘 (MPL(상표), 3-0-탈아실화 모노포스포릴 지질 A; 몬타나주 해밀톤 소재의 RIBI ImmunoChem Research, Inc.) 및 인터루킨-12 (메사츄세츠주 캠브리지 소재의 Genetics Institute)가 포함된다.
에어로졸, 소적, 경구, 국소 또는 다른 경로를 경유하여 본원에 기술한 키메릭 RSV 백신 조성물을 사용하여 면역화할 때, 숙주의 면역 시스템은 하나 이상의 RSV 바이러스 단백질, 예를 들면, F 및(또는) G 당단백질에 특이적인 항체를 생성함으로써 백신에 반응한다. 예방접종의 결과로서, 숙주는 적어도 부분적으로 또는 완전히 RSV 감염에 면역화되거나, 또는 특히 하기도의 완만하거나 또는 심한 RSV 질병에 내성이 된다.
본 발명의 키메릭 RSV 백신은 단일 RSV 균주 또는 항원성 아군(예, A 또는 B), 또는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 면역 반응을 일으키는 약독화 키메릭 바이러스를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 키메릭 RSV는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대하여 단일특이 면역 반응 또는 다특이 면역 반응을 일으킬 수 있다. 별법으로, 상이한 면역원성 특성을 갖는 키메릭 RSV를 백신 혼합물로 결합하거나, 또는 협동 처리 프로토콜로 별도로 투여하여 하나의 RSV 균주, 또는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대하여 더 효과적인 방어를 일으킬 수 있다.
백신이 투여되는 숙주는 RSV 또는 밀접하게 관련된 바이러스에 감염되기 쉽고 예방접종 바이러스의 항원에 대한 방어적 면역 반응을 일으킬 수 있는 어떠한 포유류일 수 있다. 따라서, 적합한 숙주로는 사람, 비사람 영장류, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 라가모프(lagamorph), 설치류 등이 포함된다. 따라서, 본 발명은 다양한 사람 및 가축 용도의 백신을 생성하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 약독화 키메릭 RSV를 함유하는 백신 조성물을 RSV에 대한 개체의 면역 반응 역량을 유발하거나 또는 증진시키기에 충분한 "면역학적 유효량"으로 RS 바이러스 감염에 걸리기 쉽거나 위험성이 있는 환자에 투여한다. 사람의 경우에, 본 발명의 약독화 바이러스를 문헌[Wright 등, Infect Immun. 37: 397-400 (1982); Kim 등, Pediatrics 52: 56-63 (1973); 및 Wright 등, J. Pediatr. 88: 931-936 (1976), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 기재된 바와 같이, 잘 확립된 사람 RSV 백신 프로토콜에 따라 투여한다. 즉, 전형적으로 생리학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체 0.5 ml 중에 면역학적 유효량의 RSV 백신을 사용하여 소적으로 성인 또 는 어린이를 비강내 접종한다. 이것은 비복제 백신을 사용한 비경구 면역화와 비교하여 간단함 및 안전성의 장점을 갖는다. 이것은 또한 RSV에 대한 내성에서 주요한 역할을 하는 국소 기도 면역의 직접적인 자극을 제공한다. 나아가, 이러한 형태의 예방접종은 전형적으로 매우 어린 사람에게서 발견되는 RSV 특이성 모계 유래의 혈청 항체의 면역억제 효과를 효과적으로 우회한다. 또한, RSV 항원의 비경구 투여가 때때로 면역병리학적 합병증과 관련될 수 있는 반면, 생바이러스를 사용한 경우에는 이것이 조금도 관찰되지 않았다.
모든 검체에서, 투여된 키메릭 RSV의 정확한 양, 및 투여의 시간조절 및 반복은 환자의 건강 상태 및 증량, 투여 방식, 조성물의 성질 등을 기초하여 결정할 수 있을 것이다. 투여량은 일반적으로 환자 당 약 103 내지 약 106 플라크 형성 단위(PFU) 이상의 바이러스, 더 일반적으로는 환자 당 104 내지 105 PFU 바이러스의 범위일 것이다. 어느 경우에서도, 백신 조성물은 예를 들면, 다른 방법 중에서 보체 결합, 플라크 중화, 및(또는) 효소 관련 면역흡착 분석에 의해 측정할 수 있는 바와 같이, 항RSV 면역 반응을 효과적으로 자극 또는 유발하기에 충분한 양의 본 발명의 약독화 RSV를 제공해야 한다. 이와 관련하여, 또한 개체에서 상기도 질환의 증상 및 징후를 모니터한다. 침팬지에의 투여에 있어서, 백신 중의 약독화 바이러스는 피접종자의 비인강에서 야생형 바이러스보다 약 10 배 이상 더 낮은 수준으로, 또는 불완전하게 약독화된 RSV의 수준과 비교시 약 10 배 이상 더 낮은 수준으로 성장한다.
신생아 및 유아에 있어서, 충분한 수준의 면역화를 일으키기 위해 중복 투여가 요구될 수 있다. 투여는 생후 1개월 내에 시작되어야 하고, 유년기를 통해 선천성(야생형) RSV 감염에 대한 충분한 수준의 방어를 유지하기에 필요한 간격으로, 예를 들면, 2개월, 6개월, 1년 및 2년으로 투여되어야 한다. 마찬가지로, 반복되거나 또는 심한 RSV 감염에 특히 걸리기 쉬운 성인, 예를 들면, 건강 보호 근로자, 일일 근로자, 어린 아이의 가족 구성원, 노인, 손상된 심폐 기능을 갖는 개체는 방어적 면역 반응을 확립 및(또는) 유지하기 위해 다중 면역화를 요구할 수 있다.
유발된 면역화의 수준은 중화 분비 및 혈청 항체의 양 및 목적하는 수준의 방어를 유지하기 위해 필요한 조절된 투여량 또는 예방접종을 측정함으로써 모니터할 수 있다. 나아가, 상이한 백신 바이러스를 상이한 수용체 군에 투여할 수 있다. 예를 들면, 사이토킨 또는 T 세포 에피토프가 풍부한 부가의 단백질을 발현하도록 설계된 키메릭 RSV 균주는 유아보다는 성인에게 특히 유리할 수 있다. 본 발명에 따라 생성된 RSV 백신은 또다른 RSV 아군 또는 균주의 항원을 발현하는 바이러스와 결합하여 다수의 RSV 아군 또는 균주에 대한 방어를 달성할 수 있다. 별법으로, 백신 바이러스는 본원에 기술한 하나의 RSV로 설계된 다수의 RSV 균주 또는 아군의 방어 에피토프를 포함할 수 있다.
전형적으로 상이한 백신 바이러스를 사용할 때, 이들을 혼합물로 동시에 투여할 것이나, 별도로 투여할 수도 있다. 예를 들면, 두 개의 RSV 아군의 F 당단백질은 아미노산 서열이 약 11% 차이가 나므로, 이러한 유사성은, RSV 또는 F 항원으로 면역화하고 이종 균주를 사용하여 면역성 검사를 한 동물에서 관찰되는 바와 같 이, 교차 방어적 면역 반응에 대한 기초가 된다. 따라서, 한 균주를 사용한 면역화는 동일 또는 상이한 아군의 상이한 균주에 대하여 방어할 수 있다.
본 발명의 키메릭 RSV 백신은 개체가 후속적으로 야생형 RSV에 감염될 때, 폐렴 및 기관지염과 같은 심한 하기도 질환에 대해 방어적인 면역 반응의 생성을 일으킬 수 있다. 자연적으로 순환하는 바이러스는 특히 상기도에서 여전히 감염을 일으킬 수 있는 반면, 예방접종 및 가능하게는 야생형 바이러스에 의한 후속적인 감염에 의한 내성의 상승의 결과로서 비염의 가능성은 크게 감소된다. 예방접종 후, 시험관내 및 생체내에서 상동(동일 아군의) 야생형 바이러스를 중화할 수 있는 혈청 및 분비 항체를 발생시킨 검출가능한 수준의 숙주가 존재하였다. 많은 경우에서, 숙주 항체는 또한 상이한 비백신 아군의 야생형 바이러스를 중화할 것이다.
본 발명의 바람직한 키메릭 RSV는 사람에게서 자연적으로 순환하는 야생형 바이러스와 비교할 때, 매우 실질적인 독성의 감소를 나타낸다. 키메릭 바이러스는 충분히 약독화되어 대부분의 면역화된 개체에서 감염의 징후가 일어나지 않을 것이다. 어떤 경우에서, 약독화 바이러스는 예방접종되지 않은 개체에 여전히 유포될 수 있다. 그러나, 그 독성은 충분히 제거되어서 접종되었거나 또는 부수적인 숙주에서 심한 하기도 감염은 일어나지 않는다.
키메릭 백신 바이러스의 약독화의 수준은 예를 들면, 면역화된 숙주의 기도에 존재하는 바이러스의 양을 정량하고, 그 양을 야생형 RSV 또는 후보 백신 균주로 평가된 다른 약독화 RSV에 의해 생성된 것과 비교함으로써 결정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약독화 키메릭 바이러스는 야생형 바이러스의 복제 수준과 비 교하여, 매우 이환성인 숙주(예, 침팬지)의 상기도에서의 복제가 예를 들면, 10 내지 1000 배 미만으로 더 크게 제한될 것이다. 또한, 침팬지의 상기도에서 약독화 RSV 백신 균주의 복제 수준은 이전에 혈청반응음성인 유아에서 불완전하게 약독화된 것으로 입증된 RSV A2 ts-1 돌연변이체보다 적어야 한다. 상기도에서 바이러스의 복제와 관련된 비루의 발생을 더 감소시키기 위해, 이상적인 후보 백신 바이러스는 상기도 및 하기도에서 제한된 수준의 복제를 나타내야 한다. 그러나, 본 발명의 약독화 바이러스는 예방접종된 개체에 방어를 부여할 수 있을 정도로 충분히 감염성이고 면역원성이어야 한다. 감염된 숙주의 비인강에서 RS 마이러스의 수준을 결정하는 방법은 문헌에 널리 공지되어 있다. 비인강 분비물을 흡인하거나 또는 세척하여 표본을 얻고, 조직 배양 등에서 실험실적 방법에 의해 바이러스를 정량한다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용된 문헌[Belshe 등, J. Med, Virology 1: 157-162 (1977); Friedewald 등, J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694 (1968); Gharpure 등, J. Virol. 3: 414-421 (1969); 및 Wright 등, Arch. Ges. Virusforsch. 41: 238-247 (1973)]을 참조한다. 바이러스는 편의상 침팬지와 같은 숙주 동물의 비인강에서 측정될 수 있다.
어떤 경우에서는, 본 발명의 키메릭 RSV 백신을 다른 물질, 특히 다른 유년기 바이러스에 대한 방어적 반응을 유발하는 백신과 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 키메릭 RSV 백신을 본원에 참고로 인용된 문헌[Clements 등, J. Clin. Microbiol. 29: 1175-1182 (1991)]에 기재된 바와 같이, 파라인플루엔자 바이러스와 동시에 투여할 수 있다. 본 발명의 다른 측면에 서, 키메릭 RSV는 본원에 기술한 바와 같이, 파라인플루엔자와 같은 다른 기도 병원균의 방어 항원을 코딩하는 서열을 감염성 키메릭 RSV를 생성하는데 사용되는 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈에 포함시킴으로써, 상기 방어 항원에 대한 벡터로 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에서, 키메릭 RSV는 기도의 임시 유전자 요법을 위한 벡터로 사용된다. 이 태양에 따르면, 키메릭 게놈 또는 안티게놈은 관심있는 유전자 생성물을 코딩할 수 있는 서열을 포함한다. 관심있는 유전자 생성물은 RSV 발현을 조절하는 것과 동일하거나 또는 상이한 프로모터의 조절을 받는다. 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 N, P, L 및 M2(ORF1)과 공동발현시킴으로써 생성되었으며 관심있는 유전자 생성물을 코딩하는 서열을 함유하는 감염성 RSV를 환자에 투여한다.
투여는 전형적으로 에어로졸, 분무기, 또는 치료될 환자의 기도로의 다른 국소 적용에 의한다. 키메릭 RSV는 목적하는 유전자 생성물의 치료적 또는 예방적 수준의 발현을 야기하기에 충분한 양으로 투여된다. 이 방법으로 투여된 대표적 유전자 생성물은 예를 들면, 일시 발현에 특히 적합한 것, 예를 들면, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 감마-인터페론, GM-CSF, G-CSF, 에리트로포이에틴, 및 다른 사이토킨, 글루코세레브로시다제, 페닐알라닌 히드록실라제, 시스틱 피브로시스 경막 전도 조절제 (CFTR), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스페라제, 사이토톡신, 종양 억제 유전자, 안티센스 RNA 및 백신 항원을 코딩하는 것 등이다.
하기 실시예는 설명을 위해 제공되고 본 발명의 제한하지 않는다.
실시예 I
저온 계대 배양된 RSV의 돌연변이 유도체의 분리 및 특징
이 실시예는 고도로 약독화되어 RSV 백신 제제 용도로 바람직한 ts 및 co 돌연변이 유도체를 제조하기 위해 불완전하게 약독화된 숙주 범위 제한 cpRSV의 화학적 돌연변이 유발을 기술한다.
저온 계대 배양된 RSV (cpRSV)의 부모형 스톡을 제조하였다. 플로우 레버러토리즈 로트 3131 바이러스인, 사람에서 불완전하게 약독화된 cpRSV 부모형 바이러스를 25oC에서 MRC-5 세포에 2회 계대 배양시키고, 최종적으로 25oC에서 MRC-5 세포로 2회 희석하고, 이후 MRC-5에 3회 계대 배양시켜 돌연변이 유발을 위한 cpRSV 현탁액을 생성하였다.
cpRSV를 4 x 10-4 M 농도의 매질 중 5-플루오로우라실의 존재 하에서 32oC에서 MRC-5 세포에서 부모형 스톡을 성장시킴으로써 돌연변이시켰다. 이 농도는 5-플루오로우라실 없는 배지와 비교해 세포 배양에서의 성장 5일째 바이러스 적정 농도가 100배 감소한 것으로 증명되는 바대로, 예비 연구에서 최적인 것으로 나타났다. 돌연변이된 스톡을 이후 아가 오버레이 (agar overlay) 하에서 유지된 Vero 세포 상의 플라크 분석에 의해 분석하고, 이후 적합한 간격의 배양 후에 플라크를 중성 적색 염료로 염색하였다. 854개의 플라크를 취해 각 플라크의 자손형을 개별적으로 Vero 세포의 신선한 단일층 상에서 성장시켜 증폭시켰다. cpRSV-돌연변이 유발된 바이러스의 단일 플라크의 자손형으로 접종된 각 조직 배양액의 내용물을 Vero 세포 상의 세포변성 효과가 최대로 나타날 때 개별적으로 수확하였다. 온도 민감성 (ts) 또는 작은 플라크 (sp) 표현형을 나타내는 자손형 바이러스는 32 및 38oC에서 HEp-2 세포 상에 이들 플라크 풀을 적정함으로써 찾았다. sp 표현형 (32oC에서 부모형 바이러스와 비교해 50% 이상까지 감소된 플라크 크기) 또는 ts 표현형 (32oC와 비교해 제한 온도 [37 내지 40o]을 나타내는 바이러스를 추가로 평가하였다. 이들 균주를 Vero 세포 상에서 계대 플라크 정제에 의해 생물학적으로 클로닝하고, 이후 Vero 세포 상에서 증폭시켰다. 클로닝된 균주를 32o, 37o, 38o , 39o 및 40oC에서 적정하여 (플라크 형성 효능 (EOP) 분석으로) 그들의 sp 및 ts 표현형을 확인하였다. 몇몇 클로닝된 균주의 적정 농도가 허용 온도 (32o)에서 조차 비교적 낮았기 때문에, 이들 바이러스는 HEp-2 세포에 1회 계대 배양되어 시험관 내 분석용 바이러스 현탁액을 생성하였다. 돌연변이된 cpRSV 자손형의 표현형은 표 1에 나타낸다.
<표 1>
허용 및 제한 온도에서 HEp-2 세포에 저온 계대 배양된 RSV (cpts 또는 cpsp 돌연변이체)의 9개 유도체의 플라크 형성 효능
Figure 112001026244980-pct00001
1정지 온도는 100배 이상 감소된 플라크의 적정 농도가 관찰되는 가장 낮은 제한 온도로서 정의된다 (표에서 고딕체).
*작은 플라크 표현형 (<50% 야생형 플라크 크기)
**핀포인트 플라크 표현형 (<10% 야생형 프라크 크기)
돌연변이체 자손형의 중 하나는 작은 플라크 표현형, RSV cpsp143 (sp는 작은 플라크 (sp) 표현형을 의미함)을 가졌고, 나머지 돌연변이체 자손형은 ts 표현형을 가졌다. RSV cpts 돌연변이체는 37 내지 40oC의 온도 범위에서 시험관 내 단일층 배양에서 플라크를 생성하는 능력에 변화를 나타내고, cpts368은 40oC에서 플라크를 생성하는 능력을 가지나, 대부분의 온도 민감성 (ts) 바이러스, cpts248은 38oC에서 플라크를 생성하는 데 실패했다. 그러므로, 몇개의 돌연변이 유발된 cpRSV 자손형은 플라크 형성의 온도 민감성에 대해 그들의 cpRSV 부모형 바이러스와 현저한 차이를 나타낸다.
쥐에서 복제 및 유전학적 안정성 연구
BALB/c의 상기도 및 하기도에서 cpRSV 유래 돌연변이체의 복제 수준이 이후에 연구되었다 (표 2). cpts530 및 cpts248, 가장 큰 온도 민감성을 나타낸는 돌연변이체 중 2개는 쥐의 비개골에서 복제가 약 7 내지 12배 제한된 것으로 밝혀졌다 (표 1 참조). 그러나, 어떤 바이러스도 cpRSV 부모형 바이러스와 비교해 폐에서 복제가 제한되지 않았다. 폐에서보다 비개골에서 더 큰 복제 제한은 ts 돌연변이체의 특징이 아니고, 이는 일반적으로 더 따뜻한 하기도에서의 복제에서 더욱 제한된다 (Richman and Murphy, Rev. Infect. Dis. 1:413-433 (1979)). 폐 및 비개골에서 생성된 바이러스는 유입 바이러스의 ts 특징을 보유하였다 (데이타는 나타내지 않았음). 이러한 사실은 cp 부모형 바이러스 돌연변이의 배경 상의 ts 돌연변이체의 조합이 이미 연구된 ts 돌연변이체로 관찰되는 것보다 생체 내 복제 이후 ts 표현형의 안정성이 더 높은 cpRSV ts 자손형을 유도함을 제안해 주었다.
cpRSV 유래 돌연변이체의 ts 표현형의 유전학적 안정성 수준을 더 연구하기 위해, 누드 쥐의 폐 및 비개골에 존재하는 바이러스의 플라크 형성 효능이 대부분의 ts, 즉 cpts248 및 cpts530 중에 있는 2개의 돌연변이 유발된 cpRSV 자손형에 대해 연구되었다. 누드 쥐들은 관능성 T 세포가 선천적으로 없어서 면역 타협되고, 바이러스는 이들 숙주에서 더 긴 시간 동안 복제할 수 있기때문에 선택되었다. 더 긴 복제 기간은 변화된 표현형을 갖는 바이러스 돌연변이체의 출현을 돕는다. 12일에 나타난 바이러스 (주위: 정상 쥐에서, 바이러스는 이 시간에 더 이상 검출 가능하지 않다)는 특징화되었고 변화되지 않은 ts 표현형을 보유하는 것으로 밝혀졌다 (표3). 기대된 바대로, 양성 대조군으로 시험에 포함된 ts-1 돌연변이체는 생체 내에서 불안정한 ts 표현형을 나타내었다. 그러므로, 설치류에서 ts 돌연변이체 바이러스의 상기 평가와는 대조적으로, 이 결과는 설치류에서 지연된 복제에 이어지는 cpRSV 유래 돌연변이체의 ts 표현형의 높은 수준의 안정성이 얻어지고, 이는 본 발명의 바이러스의 현저하고 지금까지 얻어지지 않은 매우 바람직한 자손형을 나타내 주는 것임을 보여준다.
<표 2>
BALB/c 쥐에서 cpts 및 cpsp-RSV 돌연변이체의 복제 1
Figure 112001026244980-pct00002
1쥐에게 0일에 0.1 ml 접종원 중 106.3 p.f.u.를 비강 내로 투여하고, 이후 4일 또는 5일에 죽였다.
<표 3>
누드 쥐에서 지연된 복제 이후의 RSV cpts-248 및 cpts-530의 유전학적 안정성
Figure 112001026244980-pct00003
1나타낸 플라크 적정 농도는 19 또는 20개 샘플의 평균 log10pfu/조직 g ±표준 오차를 나타낸다.
2각 동물에게 0일에 표시된 바이러스의 0.1 ml 접종원 중 106.3 p.f.u.를 비강 내로 투여하였다.
*작은 플라트 표현형만.
침팬지에서
cpRSV ts 유도체의 약독화 수준을 이후 사람과 가장 밀접하게 관련된 숙주인, 혈청 음성 침팬지에서 평가하였다. 침팬지 또는 올빼미 원숭이에서의 시도를 문헌 [Richardson et al., J. Med. Virol. 3:91-100 (1979); Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993), 이들은 본원에 참고로 혼입됨]의 일반적인 프로토콜에 따라 수행하였다. 돌연변이 유발된 약독화 바이러스를 대략 104 플라크 형성 단위 (PFU)를 함유하는 현탁액 1 ml를 각 동물에 비강 내로 투여한다. 또다른 방법은 각 부위에 전달된 104 PFU의 양으로 상기도 및 하기도 모두에 RSV를 접종하는 것이다. 침팬지는 10일 동안 매일 샘플링되고, 이후에는 20일 동안 매 3 내지 4일에 샘플링된다. 침팬지의 하기도는 문헌 [Snyder et al., J. Infec. Dis. 154:370-371 (1986) 및 Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993)]의 프로토콜에 따라 기관 세척에 의해 샘플링될 수 있다. 몇몇 동물은 야생형 바이러스로 4 내지 6주 후에 감염된다. 동물은 비인두 표본이 취해진 날에 호흡기 질병의 징후에 대해 평가된다. 비루는 1 내지 4+로 점수가 매겨지고, 2+ 또는 그 이상은 현저한 상기도 질병이 있는 증거로서 여겨진다.
바이러스는 상기 기술된 바대로 RSV-민감성 HEp-2 세포에 접종하여 비강 및 인후 면봉 표본 및 기관 세척 용액으로부터 단리된다. 바이러스의 양은 또한 문헌 [Schnitzer et al., J. Virol. 17:431-438 (1976), 이는 본원에 참고로 혼입됨]에 기술된 HEp-2 세포를 사용하여 플라크 기술에 의해 직접 결정될 수 있다. 혈청 표본은 문헌 [Mills et al., J. Immunol. 107:123-130 (1970), 이는 참고로 본원에 혼입됨]에 기술된 바대로 RSV 중화 항체를 결정하기 위해 바이러스 투여 이전 및 접종 후 3 내지 4주에 모아진다.
대부분의 ts 및 약독화 cpRSv 유도체 (cpts248)가 연구되었고 야생형 RSV 및 cpRSV 부모형 바이러스와 비교되었다 (표 4). cpRSV 부모형 바이러스의 복제는 야생형과 비교해 비인두에서 약간 감소하였고, 야생형 바이러스와 비교해 비루양이 감소하였고, 야생형과 비교해 바이러스 복제는 대략 600배 감소하였다. 명백하게, cp 바이러스는 침팬지의 하기도에서 복제가 현저히 제한되었고, 매우 바람직한 성질이 동물 또는 사람에서 cpRSV의 이전 평가로부터 동정되지 않았다. 더욱 현저하게는, cpts248 바이러스는 야생형과 비교해 비인두에서 복제가 10배 제한되었고, 이 복제는 현저한 비루 감소와 관련되어 있다. 이러한 발견은 cpRSV 유래 돌연변이체가 생 RSV 백신으로 2개의 매우 바람직한 성질, 즉, 감염되기 매우 쉬운 혈청 음성 침팬지의 상기도 및 하기도 모두에서의 약독화 증거를 포함함을 나타낸준다. cpts248로 면역화된 침팬지의 호흡기에 존재하는 바이러스의 유전학적 안정성 수준은 이후 평가되었다 (표 5). 호흡기 분비물에 존재하는 바이러스는 ts 표현형을 보유하고, 이는 40oC에서 적정 농도가 100배 감소하고 40oC에서 작은 플라크 표현형 을 나타냄을 8일에 침팬지 번호 3으로부터 온 바이러스로도 관찰되었고, 이는 그의 복제가 여전히 온도 민감성이라는 것을 나타내준다. 이는 대부분의 유전학적으로 안정한 ts 돌연변이체가 이 실험 시간 이전에 동정되었음을 나타내준다. cpts248 및 cpts530 바이러스의 ts 표현형의 증가된 안정성은 생체 내에서 ts 표현형에 제공되는 돌연변이의 유전학적 안정성에 대한 cp 돌연변이의 효과를 반영해준다. 그러므로, cp3131 부모형 바이러스에 이미 존재하는 돌연변이의 컨텍스트에 있는 ts 돌연변이가 이들이 없을 때 기대되는 것보다 더욱 안정한 것으로 보인다. 이러한 중요한 성질은 이전에 관찰되거나 또는 보고되지 않았다. cpts248로 침팬지를 감염시키면 높은 적정 농도의 혈청 중화 항체 및 F 및 G 당단백질이 유도되었다 (표 6). 눈에 띄게는, cpts248로 면역화시켜 야생형 RSV 감염으로부터 동물을 방어하였고 (표 7), 이는 이 돌연변이체가 사람과 밀접하게 관련되어 있는 숙주에서 효과적인 백신 바이러스로 작용함을 나타내준다.
이들 상기 나타된 사실은 cpts248 바이러스가 생 RSV 백신에 바람직한 많은 성질을 가짐을 나타내준다. 이 백신은 1)상기도 및 하기도를 위한 약독화; 2) 생체 내 복제 이후, 면역 억제된 동물에서의 지연된 복제 이후에서도 증가된 유전학적 안정성; 3) 만족할만한 면역원성; 및 4)야생형 RSV의 감염에 대한 현저한 방어 효능을 포함한다. cpts530 바이러스는 cpts248과 유사한 플라크 형성의 온도 민감성, 유사한 정도의 비개골에서의 복제 제한 및 면역 결핍 누드 쥐에서의 높은 수준의 유전학적 안정성을 공유하고, 이로 이해 또한 RS 바이러스 백신 균주를 대표한다.
<표 4>
혈청 음성 침팬지의 상기도 및 하기도에서 cpts-RSV 248, cp-RSV, 또는 야생형 RAV A2의 복제
Figure 112001026244980-pct00004
aIN = 비간 내 투여만, 1.0 ml 접종원 중 104 p.f.u.의 양으로; IN + IT = 비강 내 및 기관 내 투여 모두, 각 부위에 1.0 ml 접종원 중 104 p.f.u.
b바이러스가 회수되는 감염 후 마지막날을 나타낸다.
c평균 비루 점수는 바이러스 쉐딩 피크일 주위 8일 동안 1일 점수의 합을 8로 나눈 값을 나타낸다. 4가 가장 높은 점수이고; 0이 가장 낮은 점수이다.
d 바이러스는 표시된 날에만 분리되었다.
<표 5>
cptsRSV 248로 실험적으로 감염된 동물로부터 얻어진 원래 비인두 (NP) 면봉 또는 기관 세척 (TL) 표본에 존재하는 바이러스의 유전학적 안정성
Figure 112001026244980-pct00005
NT = 시험되지 않음
a분리물 (4.0의 평균 적정농도 log10pfu/ml를 갖는 1회 계대 배양된 바이러스 현탁액)은 각각의 원래 바이러스 함유 비인두 면봉 표본 또는 기관 세척 표본으로부터 이들 침팬지에서 발생되었고 32o, 39o 및 40oC에서 플라크 형성 효능에 대해 시험되었다. 어떠한 분리물도 39oC에서 플라크를 형성할 수 없었다. 침팬지 3 및 4로부터의 분리물은 이 방법으로 시험되지 않았다.
b39oC에서의 퍼센트 적정 농도 대 32oC에서의 퍼센트 적정 농도: NP 면봉 7일 = 0.2%, NP 면봉 8일 = 6T, TL 8일 - 20%, TL 10일 = 16%. 모든 플라크는 작은 플라크 표현형만이었고; 어떠한 야생형 크기 플라크도 관찰되지 않았다.
c40oC에서의 퍼센트 적정 농도 대 32oC에서의 퍼센트 적정 농도는 0.2%였다. 모든 플라크는 핀포이트 플라크 표현형이었고; 야생형 크기 플라크는 검출되지 않았다.
<표 6>
RSV cpts-248, cp-RSV, 또는 RSV A2 야생형으로 감염된 침팬지의 혈청 항체 반응
Figure 112001026244980-pct00006
<표 7>
cpts-248로 침팬지를 면역화시키면 28일에 RSV A2 야생형 바이러스 감염에 대한 내 성이 유도된다
Figure 112001026244980-pct00007
*평균 비루 점수는 8일 동안의 피크 바이러스 쉐딩 점수 합을 8로 나눈 것을 나타낸다. 4가 가장 큰 점수이다. 0은 10일간의 관찰 기간 동안 비루가 검출되지 않았음을 나타낸다.
추가 약독화
RS 바이러스가 이들 실험적 연구에 사용된 1-2년생 침팬지보다 유아에서 더 많은 하기도 질병의 증상을 나타내므로, 침팬지를 위해 만족스럽게 약독화된 돌연변이체가 혈청 음성 유아 및 아이들을 위해 그럴수도 있다는 것을 인식하고, 상기도에서 매우 특징적이지 않은 제한된 복제 및 약독화의 ts 돌연변이체 성질 및 높은 수준의 유전학적 안정성을 갖는 cpts248 및 530 유도체가 추가로 돌연변이되었다.
cpts248보다 시험관 내에서 더 큰 정도의 온도 민감성을 나타내거나 또는 작은 프라크 표현형을 갖는 자손형 바이러스가 추가의 연구를 위해 선택되었다. 1개 이상의 추가의 ts 돌연변이체를 갖는 cpts248의 돌연변이체 유도체가 5-플루오로우라실 돌연변이 유발에 의해 생성되었다 (표 8). cpts248 부모형 균주보다 더욱 온도 민감성인 ts 돌연변이체가 동정되었고, 이들 중 몇몇은 작은 플라크 (sp) 표현형을 가졌다. 이들 cpts248 유도체가 쥐에 투여되었다. cpts248/804, 248/955, 248/404, 248/26, 248/18 및 248/240 돌연변이는 그들의 cpts248 부모형 바이러스보다 위의 상기도 및 하기도에서의 복제에 더욱 제한된다 (표 9). 그러므로, 그들의 cpts248 부모형 바이러스보다 더 많이 약독화된 cpts248의 생육 가능한 돌연변이체가 동정되었고, cpts248의 이들 유도체는 쥐에서 광범위한 복제 효능을 나타내었고, cpts248/26은 가장 제한되었다. 쥐의 비개골 및 폐에서 존재하는 바이러스의 ts 표현형은 더의 유입 바이러스의 ts 표현형과 동일하고, 이는 유전학적 안정 성을 나타내준다. cpts248의 매우 약독화된 유도체, cpts248/404 바이러스는 야생형과 비교해 비인두에서 복제가 1000배 이상 제한되었다. 3개 이상의 약독화 돌연변이를 갖는, cpts248/404 돌연변이체는 또한 4마리의 혈청 음성 침팬지의 상기도 및 하기도에서의 복제가 대단히 제한되었고 감염은 비루를 유도하지 않았다 (표 10). 또한, 이 바이러스는 야생형과 비교해 복제가 높은 정도로 감소함을 나타내었고, 비인두에서는 60,000배 감소하였고 폐에서는 100,000배 감소하였다. 그럼에도 불구하고, RSV 야생형 바이러스로 순차적으로 감염된 2마리의 침팬지는 대단히 내성이었다 (표 11).
cpts248/404의 5개의 작은 플라크 돌연변이체는 상기 기술된 것과 유사한 형태로 화학적 돌연변이 유발에 의해 유래되었다. 1회 증폭된 플라크 자손형의 현탁액을 32oC HEp-2 세포 상에서 플라크 적정에 의해 작은 플라크 (sp) 표현형에 대해 스크린하였고, 바이러스의 실시 현탁액을 상기 기술된 바대로 제조하였다.
돌연변이 유발된 cpts240/404 바이러스의 5개의 플라크 자손형은 안정한 sp 표현형을 나타내었다. 각 돌연변이체의 정지 온도는 35oC 이하였고 (표 12), 이는 cpts248/404의 이들 각각의 sp 유도체가 또한 추가의 ts 돌연변이를 얻었음을 제한해 주었다. cpts248/404의 sp 유도체 106.3 p.f.u.로 Balb/c 쥐를 비강 내 접종한 이후에, 바이러스는 이들 sp 유도체로 접종된 위의 비개골에서 검출되지 않았다. 그러나, 바이러스가 한 경우에 폐에서 낮은 적정 농도로 검출되었다. 이들 결과는 야생형과 비교해 비개골에서는 300배 이상의 복제 제한이 폐에서는 10,000배 이상 의 복제 제한이 일어남을 나타내준다.
cpts530 바이러스의 추가의 ts 유도체가 또한 생성되었다 (표 13). cpts248 유도체와 마찬가지로, cpts-530 유도체는 cpts530 부모형 균주보다 쥐에서 복제가 더욱 제한되었다. 하나의 돌연변이체, cpts-530/1009는 쥐의 비개골에서 복제가 30배 더 많이 제한되었다. 이 cpts 유도체는 또한 혈청 음성 침팬지의 상기도 및 하기도에서 복제가 대단히 제한되었다 (표 14). 비인두에서, 야생형과 비교해, cpts530은 복제가 30배 제한되는 반면, cpts530/1009는 100배 제한되었다. cpts 돌연변이체 모두는 돌연변이체가 기관에 직접 접종될 때 조차도 야생형 바이러스와 비교해 하기도에서 대단히 제한되었다 (20,000 내지 32,000배). 또한, cpts530/1009, cpts530 또는 cpRSV로 미리 감염된 침팬지는 비인두에서 바이러스 복제에 현저한 제한을 나타냈고 야생형 RSV로 순차적인 혼합된 비강 내 및 기관 내 감염에 의해 현저한 비루가 발생하지 않았다 (표 15). 또한, 돌연변이체로 미리 감염된 침팬지는 야생형 감염 바이러스의 복제에 대해 하기도에서 완전한 내성을 나타내었다.
이들 결과는 이전의 연구에서 얻어진 경험에 근거하여 완전히 기대 밖의 것이었다. 예를 들면, 이전의 연구 결과는 단일 주기의 5-플루오로우라실 돌연변이 유발로부터 유래된 RSV ts 돌연변이체의 생체 내 성질이 미리 예견될 수 없었음을 나타내었다. 또한, 이 방법으로 발생된 첫번째 4개의 돌연변이체 중 하나는 플라크 형성을 위해 다른 돌연변이체와 동일한 정지 온도를 나타내었다 하더라고, 감염되기 쉬운 침팬지 및 유아 및 어린 아이들에서 시험될 때 과도하게 약독화되었다 (Wright et al, Infect Immun. 37 (1): 397-400 (1982)). 이는 플라크 형성을 위한 37-38oC의 정지 온도를 유도하는 ts 표현형을 얻는 것이 감염되기 쉬운 침팬지, 유아 및 아이들을 위한 바람직한 정도의 약독화를 갖는 돌연변이체를 믿을만하게 생성시켜주는 것은 아니었다. 실제로, 이제까지 공지의 ts 돌연변이체로 얻은 연구 결과는 3개의 독립적인 돌연변이 (또는 돌연변이 세트)를 저온 계대 배양시켜 RSV로 도입하고 이어서 2회 연속 주기로 화학적 돌연변이 유발시켜 침팬지 (및 외삽법, 어린 유아)에 대한 감염성을 보유하고 생 바이러스 백신이 RSV 질병에 사용되기 위해 요구되는 바람직한 수준의 약독화, 면역원성 및 방어 효능을 나타내는 생육 가능한 돌연변이체를 생성시킬 수 있다는 사실을 위한 근거를 제공하는데 완전히 실패했다.
상기 나타낸 결과는 본 발명의 cpRSV의 특정한 ts 유도체가 만족스러운 정도의 감염성을 갖고 쥐 및 침팬지를 위해 현저한 정도의 약독화를 나나낸다는 것을 분명히 보여준다. 이들 돌연변이 유도체는 약독화되고 생체 내 복제 이후 유전학적으로 매우 안정함을 나타낸다. 이들 돌연변이체는 또한 침팬지에서 RSV 감염에 대한 현저한 내성을 유도한다. 그러므로, cpRSV의 이들 유도체는 심각한 사람 RSV 질병을 방어하기 위해 계획된 생 RSV 백신에서의 용도에 적합한 바이러스 균주를 대표한다.
<표 8>
추가의 5FU 돌연변이 유발에 의해 RSV cpts248로부터 유래된 10개의 돌연변이체의 플라크 형성 효능
Figure 112001026244980-pct00008
1정지 온도는 HEp-2 세포에서 100배 이상의 플라크 적정 농도 감소가 관찰되는 가장 낮은 제한 온도로서 정의된다 (표에서 고딕체).
*작은 플라크 표현형 (<50% 야생형 플라크 크기).
**핀포인트 플라크 표현형 (<10% 야생형 플라크 크기).
<표 9>
Balb/c 쥐에서 RSV cpts-248로부터 유래된 10개의 돌연변이체의 복제 및 유전학적 안정성 1
Figure 112001026244980-pct00009
1쥐에게 0일에 가벼운 마취 하에서 비강으로 106.3 p.f.u.를 투여하고, 4일에 CO2 질식시켜 죽였다.
2순차적인 연구에서, cpts-248/404의 복제 수준은 비개골 및 폐에서 각각 2.4 ±0.24 및 2.6 ±0.31인 것으로 밝혀졌다.
<표 10>
혈청 음성 침팬지의 상기도 및 하기도에서 cpts-RSV 248/404, cpts-RSV 248/18, cpts-RSV 248, cp-RSV 또는 야생형 RSV A2의 복제
Figure 112001026244980-pct00010
aIN = 비강 내 투여만; IN + IT = 비강 내 및 기관 내 투여 모두.
b바이러스가 회수된 감염 후 마지막 날을 나타낸다.
c평균 비루 점수는 바이러스 쉐딩 피크일 주위 8일 동안의 1일 점수의 합을 8로 나눈 것을 나타낸다. 4가 가장 큰 점수이고; 0이 가장 낮은 점수이다.
d바이러스는 표시된 날에만 분리되었다.
#이들은 표 4 및 7에 포함된 동물과 동일하다.
<표 11>
cpts-248/404로 침팬지를 면역화시키면 28일에 RSV A2 야생형 바이러스 감염에 대 한 내성이 유도된다
Figure 112001026244980-pct00011
a8일 동안의 피크 바이러스 쉐딩 점수의 합을 8로 나눈 것을 나타낸다. 4가 가장 높은 점수이다. 0은 10일의 관찰 기간 동안 비루가 검출되지 않았음을 나타낸다.
#이들은 표 4, 7 및 10에 포함된 동물과 동일하다.
b상기 기술된 동물로부터 얻은 것을 포함한, 혈청 중화 적정 농도는 하나의 분석에서 동시에 결정되었다.
<표 12>
RSV cpts-248/404의 5개의 작은 플라크 유도체의 Balb/c 쥐의 플라크 형성 및 복제 효능
Figure 112001026244980-pct00012
1정지 온도는 100배 이상의 플라크 적정 농도 감소가 관찰되는 가장 낮은 온도로서 정의된다 (표에서 고딕체).
2쥐에게 0일에 가벼운 마취 하에서 비강으로 106.3p.f.u.를 투여하고, 이후 조직이 바이러스 적정을 위해 수확되는 4일에 CO2 질식시켜 죽였다.
36마리 동물의 평균 log10pfu/조직 g ±표준 오차.
*작은 플라크 표현형 (<50% 야생형 플라크 크기).
**핀포이트 플라크 표현형 (<10% 야생형 플라크 크기).
<표 13>
RSV로부터 유래된 14개 돌연변이체 쥐에서 대조군과 비교된 플라크 형성 효능 및 복제 수준
Figure 112001026244980-pct00013
n.d. = 수행되지 않음
*작은 플라크 표현형 (<50% 야생형 플라크 크기).
**핀포인트 플라크 표현형 (<10% 야생형 플라크 크기).
1정지 온도는 100배 이상 감소한 플라크 적정 농도가 관찰되는 가장 낮은 제한 온도로서 정의된다 (표에서 고딕체).
2쥐에게 0일에 가벼운 마취 하에서 비강으로 106.3 p.f.u.를 투여하고, 이후 4일에 CO2 질식시켜 죽였다.
<표 14>
혈청 음성 침팬지의 상기도 및 하기도에서의 cpts-530/1009, cp-RSV, 또는 야생형 RSV A2 복제는 혈청 중화 항체를 유도한다
Figure 112001026244980-pct00014
aIN = 비강 내만; IN + IT = 비강 내 및 기관 내 투여 모두.
b바이러스가 회수되는 감염 후 마지막 날을 나타낸다.
c평균 비루 점수는 바이러스 쉐딩 피크일 주위 8일 동안의 1일 점수의 합을 8로 나눈 값을 나타낸다. 4가 가장 높은 점수이고; 0은 가장 낮은 점수이다.
d문헌 [Crowe, et al., Vaccine 12:691-699 (1994)]의 동물.
e바이러스는 표시된 날에만 분리되었다.
f문헌 [Collins, et al., Vaccine 8:164-168 (1990)]의 동물.
gHEp-2 세포 단일층 배양에서 RSV A2의 보체 증가된 60% 플라크 감소에 의해 결정되었다. 모든 적정 농도는 단일 분석에서 동시에 결정되었다. 0일에 각 동물의 역수 적정 농도는 10 미만이었다.
<표 15>
cpts-530/1009 또는 cpts-530으로 침팬지를 면역화시키면 28일에 야생형 RSV A2 바 이러스 감염에 대한 내성이 유도된다
Figure 112001026244980-pct00015
a평균 비루 점수는 8일 동안의 피크 바이러스 쉐딩 점수의 합을 8로 나눈 것 을 나타낸다.
b문헌 [Crowe, et al., Vaccine 12:691-699 (1994)]의 동물.
c문헌 [Collins, et al., Vaccine 8:164-168 (1990)]의 동물.
d상기 기술된 동물로부터 얻은 것을 포함한, 이 표에 있는 혈청 중화 적정 농도는 한 분석에서 동시에 결정되었다.
침팬지에서 cpts 돌연변이체에 대한 수동으로 얻어진 혈청 RSV 항체의 효과
침팬지에서 본 발명의 다양한 cpts 돌연변이체의 약독화, 면역원성 및 방어 효능에 대한 수동으로 얻어진 혈청 RSV 항체의 효과를 조사하기 위해, cpts248, cpts248/404, 및 cpts530/1009의 생체 내 복제가 면역화 2일 전에 RSV 면역 글로불린이 주입된 혈청 음성 침팬지에서 평가되었다 (표 16). 항체는 모체 유래 RSV 항체를 갖는 어린 유아에서 얻는 조건을 모방하기 위해 수동으로 이동되었다. 이 방법으로, 고도로 약독화된 바이러스의 복제가 방어적 면역 반응 유도를 배제하도록 유아에서 수동적 항체가 중간 내지 높은 적정 농도로 감소될 수 있는 지를 결정하기 위해 수동적인 RSV 항체 존재 하에서 각각의 표시된 돌연변이의 면역원성을 평가하는 것이 가능하였다. 수동으로 얻어진 항체 존재 하에서 면역화에 대한 항체 반응을 성질을 한정하고 바이러스 감염에 대한 항체 반응의 기능적 활성 및 정도를 한정하는 것이 또한 가능할 것이다. 약독화 돌연변이체에 대한 비인두에서의 바이러스 복제 수준 및 관련 임상 점수는 변화되지 않거나 또는 그 동물들의 감염이 주입되지 않은 혈청 음성 침팬지와 비교될 때 혈청 RSV 항체의 존재에 의해 경미하게 만 변화되었다. 반대로, 수동으로 얻어진 항체는 하기도에서 cpts248의 바이러스 복제를 방지하였다. 다른 2개의 돌연변이체가 이미 폐에서 고도로 제한되었기 때문에, 수동 항체의 유사한 효과는 그 동물들에 대해 평가될 수 없었다.
사람 RSV 면역 글로불린 주입은 꽤 높은 혈청 수준의 RSV F 항체 (적정 농도 1:640 내지 1:1600) 및 중화 항체를 생성시켰으나, 배경 위에서 검출 가능한 혈청 RSV G 항체는 감지할 수 있는 양은 아니었다 (표 17). cpts248/404, cpts530/1009, 또는 cpts248으로 면역화되기 이전에 사람 RSV 항체가 주입된 침팬지는 면역화 18일에 시험된 주입되지 않은 면역화된 동물과 비교해, 면역화 42일까지 10분의 1의 RSV F 항체량 및 절반의 중화 항체 적정 농도를 얻었다. 주입된 사람 IgG가 RSV F 및 RSV 중화 항체의 실질적인 양을 함유하였기 때문에, 42일 혈청 샘플에 존재하는 주입으로부터 얻은 잔여 항체는 면역화에 대해 드 노보로 생성된 항체와 구별될 수 없다. 침팬지에서 사람 혈청 IgG 항체의 반감기에 대해, cpts로 면역화 이후 42일에 F 및 중화 항체의 관찰된 수준은 주입 잔여분에 대해 예견되는 것보다 더 높다. 또한, 주입된 동물의 면역화 이후 RSV G 항체 반응은 이들 침팬지가 면역 반응을 면역화로 하였음을 확실히 해준다.
면역화 이후 4 내지 6주 후 침팬지는 그들의 하기도에서 완전한 내성, 즉 사람 IgG가 면역화 2일전에 주입되었는지 아닌지를 나타내 주었다 (표 18). 주입되지 않은 동물은 감염에 대해 약간의 중화 항체 반응을 나타내거나 또는 전혀 나타내지 않았다. 반대로, 바이러스 복제가 심각하게 제한되었다는 사실에도 불구하고 야생성 바이러스 감염에 대하여 주입된 침팬지는 통상적으로 높은 적정 농도의 RSV 중화 항체를 균일하게 생성시켰다 (표 17 및 18). 또한, 항체 존재 하에서 면역화 이후에 대부분의 약독화 바이러스, cpts248/404는 가장 낮은 수준의 바이러스 복제 및 면역화를 나타냈고, 가장 높은 감염 후 중화 항체 적정 농도를 가졌다 (표 17). 반대로, 가장 작은 약독화 바이러스, cpts248은 3개 군의 주입된 동물의 가장 낮은 감염 후 중화 항체 적정 농도를 가졌다. 항체 존재 하에서 면역화에 의해 유도된 항체의 양 증가에 덧붙여, ELISA F 항체 적정 농도 비율로 중화시켜 측정된, 항체의 양은 혈청 음성 동물에서 면역화에 의해 유도된 것보다 현저하게 컸다 (표 17). 감염 후 주입된 면역화 동물에서 생성된 항체의 중화/ELISA F 비율은 주입되지 않은 동물에서보다 10 내지 20배 더 컸고 면역화시키기 위해 사용된 돌연변이체와 상관 없이 모든 군에서 일정하였다 (표 17).
생 바이러스 백신으로 면역화시킨 시간에 수동으로 얻어진 항체의 존재는 3가지 구별되는 방법으로 백신에 대한 면역 반응을 변화시킬 것이다. 첫째로, 감소된 면역원성을 초래하는 백신 바이러스 복제 수준의 현저한 감소가 일어날 것이다. 수동으로 이동된 RSV 항체는 백신 바이러스 복제, 특히 가장 결핍성인 돌연변이체의 복제를 제한하고, 크게는 그들의 면역원성을 감소시키는 것이 가능할 수 있다. 여기에 나타낸 결과는 하기도에서 가장 적게 약독화된 돌연변이체 (cpts248)의 복제가 수동으로 얻어진 혈청 IgG RSV 항체 존재에 의해 실제로 취소되는 반면, 상기도에서의 복제는 눈에 띄게 영향을 받는 것으로 나타나지 않았음을 나타내준다. 가장 적게 약독화된 시험 돌연변이체, cpts248은 항체 존재 하에서 하기도에서 200배 이상 더 많이 제한되었다. 하기도에서 더 많이 약독화된 돌연변이체, cpts530/1009 및 cpts248/404의 복제 수준은 혈청 음성 동물에서 조차도 많이 제한되었다. 그러므로, 바이러스 복제에 대한 수동 항체의 현저한 효과는 검출될 수 없었다. 3개의 약독화된 돌연변이체 각각으로 면역화시키면 상기도 및 하기도 모두에서 야생형 감염에 대한 높은 수준의 방어가 유도된다. 즉 수동으로 얻어진 RSV 항체가 면역화시킨 시간에 존재하는지 아닌지를 알게 되었다. 그러므로, 수동으로 면역화된 침팬지의 상기도에서 백신 바이러스의 복제 수준은 주입되지 않은 동물에 유도된 것에 상당한 야생형 공역에 대한 높은 수준의 내성을 유도하기에 충분하였다.
둘째로, 수동 항체는 유도된 항체의 양 및 기능적 활성에 감소를 일으켜 감염에 대한 면역 반응을 변화시킬 수 있다. 이때문에, 수동 항체 존재 하에서 생 바이러스 면역화에 대한 항체 반응의 크기 및 특징이 분석되었다. 면역화되고 주입된 동물의 면역화 후 혈청 ELISA IgG F 항체 적정 농도는 주입되지 않은 혈청 음성 동물의 면역화 후 F 적정 농도보다 10배 낮았다. 혈청 RSV 중화 항체 반응은 또한 주입되지 않은 동물에서 보다 평균 2배 낮게 그 동물에서 약간 감소하였다. 면역화 후 검출된 몇몇 ELISA F 및 중화 항체가 주입으로부터의 잔여 항체를 나타내기 때문에, 이미 존재하는 항체에 의해 일어나는 중화 및 F 항체 반응의 실제 감소는 아마도 나타나는 것보다 아마 더 중요할 것이다. 또한, 사용된 사람 면역 글로불린 제제는 RSV의 G 당단백질에 대해 낮은 수준의 항체를 함유하였다 (표 17). 후보 백신 바이러스로의 감염에 대한 침팬지의 IgG RSV G 당단백질 항체 반응의 검사를 페트(pet)하였다. G 항체 반응은 4배 이상의 증가를 나타내었고, 이는 각각 의 수동으로 면역화된 동물이 바이러스를 쉐드하지 않는 cpts248/404로 면역화된 침팬지를 포함한, 백신 바이러스에 의해 감염되었음을 나타낸다. 면역화에 대한 G 항체 반응의 크기는 수동으로 이동된 항체에 의해 나쁘게 영향을 받는 것으로 나타나지 않았다.
세째로, 수동으로 얻어진 항체의 존재 하에서 면역화된 동물의 RSV 야생형 바이러스 감염에 대한 항체 반응은 변화될 수 있다. 주입된 항체의 부재 하에서 면역화된 침팬지는 이후의 RSV 감염에 대해 현저한 내성을 나타내었다. 또한, 이들 동물은 감염 바이러스에 대해 인식할만한 항체 반응을 발생시키는데 실패했다. 6마리의 주입되고 면역화된 동물 각각이 또한 RSV에 대해 현저한 내성을 나타내었다 하더라도, 감염에 대해 대단히 증가된 항체 반응이 관찰되었다. cpts530/1009 또는 cpts248/404로 면역화된 처리 동물에서 감염후 F 또는 G 항체 수준은 10배 이상 증가되었고, 중화 항체 반응은 800배 만큼 증가한 것으로 나타났다. 이들 결과는 생에 있어서 매우 일찍 시작한 생 약독화 돌연변이체로 모체 항체를 소유한 유아를 반복 면역화시키면 효과적인 내성 및 관련되는 증가된 고품질 2차 항체 반응을 자극할 것이다. 감염 바이러스의 인식할만한 복제가 없을 때 2차 감염에 대한 증가된 면역 반응의 기전은 이해되지 않는다. 면역화 시기에 혈청 항체의 존재는 주입된 동물에서의 면역화에 대한 적합한 항체 반응을 허용하면서, 이후의 RSV 감염에 이어서 고기능성 활성 항체를 생성하는 B 세포 목록의 개발을 돕는다.
본원에 보고된 결과는 처음으로 생 약독화 RSV 바이러스 백신이 RSV 백신을 위한 목적군, 즉 모체로부터의 경태반 이동의 결과로 수동으로 얻어진 RSV 중화 항 체를 갖는 4 내지 6주된 유아를 모방하는 동물 모델에서 유효한 것으로 나타났다는 점에서 대단히 중요하다. 이러한 발견의 중요성은 상기 논의된 바대로, 수동으로 이동된 RSV 항체가 cpts 백신의 복제를 억제하여 이를 비면역적이고 비방어적인 것으로 만들지 않을 것이라는 큰 기대가 놀랍게도 없었다는 사실로부터 명백하다.
<표 16>
혈청 음성 침팬지의 상기도 및 하기도에서 RSV cpts-248/44, cpts-248, 또는 cpts-530/1009의 복제, 몇몇 침팬지는 면역화 2일 전에 RSV 중화 항체가 주입되었다
Figure 112001026244980-pct00016
<표 17>
수동으로 이동된 항체의 존재 및 부재 하에서 RSV cpts-248/404, cpts-248, 또는 cpts-530/1009로 0일에 면역화되고 4 내지 6주 후에 야생형 RSV A2로 감염된 혈청 항체 반응
Figure 112001026244980-pct00017
1면역화 후 적정 농도가 결정된 날이 또한 감염이 수행된 날이었다. 즉, 항체가 주입되지 않은 동물은 28일, 주입된 동물은 42일.
2값은 감염 후 28일에 취한 샘플로부터 결정되었다. 감염은 항체가 주입되지 않은 동물에 대해 면역화 후 28일에, 주입된 동물에 대해 42일에 수행되었다.
3HEp-2 세포 단일층 배양에서 RSV A2의 보체 증가된 60% 플라크 감소에 의해 결정되었다. 중화 항체 적정 농도는 2개의 시험에서 얻은 평균 값을 나타낸다.
<표 18>
RSV cpts-248, cpts-248/404, 또는 cpts-530/1009로 침팬지를 면역화시키면 4 내지 6주 후에 야생형 RSV A2 감염에 대한 내성이 유도된다
Figure 112001026244980-pct00018
a4 내지 6주 전에 표시된 바이러스로 면역화된 동물은 RSV A2 야생형 바이러스 104 pfu로 감염되었다.
b평균 비루 점수는 8일 동안의 피크 바이러스 쉐딩 점수의 합을 8로 나눈 것 을 나타낸다.
c문헌 [Crowe, et al., Vaccine 12:691-699 (1994)]의 동물.
d문헌 [Collins, et al., Vaccine 8:164-168 (1990)]의 동물.
실시예 II
cpRSV 돌연변이를 약독화시키기 한 저온 적응 용도
이 실시예는 사람 백신에서의 용도를 위해 더욱 만족스럽게 약독화된 유도체 균주를 제조하기 위해점점 더 감소된 온도에서 균주를 추가로 계대 배양시켜 불완전하게 약독화된 숙주 범위 제한된 cpRSV 균주로 성장 제한 돌연변이를 도입시키는 것을 기술한다.
이들 저온 적응 (ca) 연구는 혈청 음성 아이들에서 불완전하게 약독화된 cpRSV 3131 바이러스에 추가의 약독화를 도입시키기 위해 사용되었다.
제1 전략 하에, 플로우 레버러토리즈로부터 얻은 저온 계대 배양된 RSV A2 (cpRSV 3131)의 부모형 스톡을 실시예 1에 기술된 바대로 25oC에서 MRC-5 세포에 계대 배양시켜 제조하였다. 간단하게는, 저온 계대 배양된 바이러스는 0.01 이상의 감염 다중도로 MRC-5 또는 Vero 세포에 접종되었고 감염된 세포는 후행하는 다음 계대 배양 전에 3 내지 14일 동안 배양되었다. 바이러스는 더 약독화된 바이러스를 유도하기 위해 20-22oC에서 20회 이상 계대 배양되었다. 신속한 계대 배양 기술은 바이러스 복제의 증거나 명백해지자 마자 (즉 3 내지 5일) 낮은 온도에서 효과 적으로 복제할 수 있는 돌연변이체 선택을 위해 바람직하였다. 따라서, RSV 아군, B 균주, St Louis/14617/85 클론 1A1은 1차 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포에서 분리되었고, MRC 세포에 계대 배양되고 클로닝되었으며 (1A1-MRC14), 32 내지 22oC에서 MRC-5 또는 Vero 세포에서 52회 저온 계대 배양되었다.
제2 전략은 클로닝되지 않은 부모형 cpRSV 3131 바이러스의 생물학적으로 클로닝된 유도체를 사용하였다. 이 바이러스는 소의 배아 신장 (BEK) 세포 [cPRSV 3131 바이러스를 처음부터 유도하기 위해 사용된 조직; Friedewell et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-695 (19687) 참조]에서 생물학적으로 클로닝되었다. 이 클로닝된 바이러스는 이후 낮은 온도에서 Vero 세포에서 10일 간격으로 계대 배양되었다. 또한, cpRSV 3131 바이러스는 MRC-5 세포에서 계대 말단 희석법 (TD2P4)에 의해 클로닝되었고 MRC-5 또는 Vero 세포에서 10일 간격으로 계대 배양되었다.
제3 전략은 낮은 온도에서 큰 플라크를 생산하는 돌연변이체의 선택을 포함하였다. 25oC에서 큰 플라크를 생산하는 플라크 D1을 표시하는 RSV 3131 유도체 바이러스가 동정되었다. 이 바이러스는 cp3131-1 (BEK) 계통 cp3131-17 (BEK) 계통의 제3 계대 배양 (P3) 수준으로부터 유도되었다. P3 바이러스에 의해 생성된 가장 큰 플라크는 32oC에서 증폭되고, 이후 25oC에서 재플라크되었다. 다시 한 번 가장 큰 플라크가 선택되고, 증폭되고, 재플라크되었다. 이러한 주기를 5회 거친 후 에, 큰 플라크 돌연변이 바이러스 D1이 얻어졌다. D1은 25oC에서 2회 추가 주기의 플라크-투-플라크 정제에 의해 생물학적으로 클로닝되었다.
생물학적으로 클로닝된 바이러스 D1은 25oC에서 cp3131 또는 야생형 바이러스 A2보다 더 큰 플라크를 특징적이고도 균일하게 생성시킨다. 그러므로 D1은 25oC에서 큰 플라크 크기 기준에 의해 저온 적응되었다. 플라크 형성 연구 효능은 D1이 온도 민감성이 아니라는 것을 나타내었다. 37oC에서, D1 플라크는 야생형 RSV 또는 cp3131의 플라크와 구별되지 않고, 이는 D1이 이 온도에서 성장이 제한되지 않는다는 것을 제안해준다. 이와 일관성있게, D1은 37 및 40oC (즉, 시험된 가장 높은 온도)에서 Vero 세포 단일층에서 강력한 세포 변성 효과를 나타낸다.
실시예 III
ts-RSV로의 추가로 약독화된 돌연변이의 도입
이 실시예는 더욱 완전하게 약독화된 균주를 생산하기 위해 부모형 바이러스로서의 ts 돌연변이체의 용도를 기술한다. 2개의 RSV A2 ts 돌연변이체 즉, ts-4 및 ts-1 NG1은 이 방법을 위해 선택되었다. 2개의 특징적인 방법은 RSV ts 돌연변이체로 추가의 돌연변이를 도입시키기 위해 선택되었다. 첫째로, 불완전하게 약독화된 RSV ts 돌연변이체는 화학적 돌연변이 유발되었고, 플라크 형성에 대해 더 온도 민감성인 돌연변이 유발된 자손형이 추가의 분석을 위해 선택되었다. 둘째로, RSV ts 돌연변이체는 ca 표현형을 갖는 RSV nts 돌연변이체를 선택하기 위해 낮은 온도에서 계대 배양되었다. 즉, 야생형 부모형 바이러스에 비교해 최적 온도 아래 온도에서 복제하는 능력이 증가되었다.
ts-1 NG1 바이러스의 부모형 스톡은 생 호흡기 신시티움 바이러스 (A-2) ts-1 NG-1 돌연변이체인 MRC-5 성장 바이러스의 플로우 레버러토리즈 Lot M4로부터 제조되었다. 니트로소구아니딘을 사용한 제2 라운드의 돌연변이 유발에 의해 ts-1 돌연변이체로부터 유도된 이 돌연변이체는 2개 이상의 독립적인 ts 돌연변이를 소유하지만, 여전히 감염되기 쉬운 침팬지에서 실질적인 비루를 유도한다. 이 바이러스는 돌연변이 유발을 위한 ts-1 NG-1 현탁액을 생성시키기 위해 32oC에서 Vero 세포에 2회 계대 배양되었다. 이 바이러스는 이후 복제 중 추가의 돌연변이를 유도하기 위해 4 x 10-4 M의 5-플루오로우라실의 존재 하에서 성장시키거나 또는 5-플루오로우라실 처리 후 36oC에서 5-아자사이티딘에 노출시켰다. 돌연변이 유발된 스톡을 이후 아가 오버레이 하에 유지된 Vero 세포상의 플라크 분석에 의해 분석되고, 적합한 배양 간격 이후, 플라크는 현미경적으로 동정되었다. 586개의 플라크를 취하고, 각 플라크의 자손형은 Vero 세포의 신선한 단일층상에서 성장시켜 따로 증폭시켰다. 돌연변이된 ts-1 NG-1 바이러스의 단일 플라크의 자손형으로 접종된 각각의 조직 배양의 내용물은 Vero 세포 상의 세포 변성 효과가 최대로 나타날 때 따로 수확되었다. ts-1 NG1보다 더 온도 민감성인 자손형 바이러스는 32 및 36oC에서 HEp-2 세포 상에서 이들 플라크 풀을 적정함으로써 구하였다. ts-1 NG1보다 더 큰 온도 민감성을 나타내는 바이러스 (즉, 32oC와 비교해 제한 온도 36oC에서 100배 이상 적정 농도가 감소)가 추가로 평가되었다. tsRSV ts-1 NG-1 부모형 바이러스보다 6개 플라크 자손형이 더많은 ts가 동정되었고 이들 균주는 Vero 세포 상에서 3회 계대 플라크 정제에 의해 생물학적으로 클로닝되었고, 이후 Vero 세포 상에서 증폭되었다. 클로닝된 균주는 32oC, 35oC, 36oC, 37oC 및 38 oC (플라크 형성 분석 효능)에서 적정되어 그들의 ts 표현형을 확인하였다. HEp-2 세포 상 분석에 의해 생성된 플라크 형성 데이타 효능은 6개 돌연변이체의 표현형을 추가로 확인시켰다 (표 19).
2개의 가장 많은 ts 바이러스인, A-20-4 및 A-37-8은 그들의 ts-1 NG1 부모형 바이러스에 비교해 쥐에서 고도로 약독화되었고, 이는 증가된 수준의 온도 민감성을 획득하는 것은 강화된 약독화에 의해 수반되는 것임을 나타낸다 (표 20). 이들 바이러스는 그들이 항체 반응을 유도하였기 때문에 쥐에 대해 감염성이었다. ts-1 Ng1/A-20-4 바이러스는 침팬지를 위해 약독화되고 (표 21) ts-1 NG1/A-20-4로 침팬지를 감염시키면 야생형 바이러스 감염에 대해 내성이 유도되었다 (표 22). 중요하게는, 비루는 나타나지 않는다.
ts-4 바이러스의 돌연변이 유발이 또한 ts-1 NG1, 바이러스의 돌연변이 유발을 위한 방법과 동일한 방법을 사용하여 수행하였다. 돌연변이는 또한 저온 계대 배양시켜 ts-4 바이러스로 도입되었다. ts-4 바이러스는 43회의 저온 계대 배양시킨 후 22oC에서 높은 적정 농도로 복제한다. RSV ts-4 부모형 바이러스보다 더 ts 인 6개의 플라크 자손형이 동정되었다 (표 23). ts-4 cp-43은 Balb/c 쥐에서 복제가 더더욱 제한되었다 (표 24).
<표 19>
ts-1 NG1 유도체의 플라크 형성 효능
Figure 112001026244980-pct00019
a3회 정제된 플라크
*작은 플라크 표현형 (<50% 야생형 플라크 크기)
**핀포인트 플라크 표현형 (<10% 야생형 플라크 크기)
ND = 수행되지 않음
<표 20>
Balb/c 쥐에서 ts-1 NG1 부모형 및 자손형 바이러스의 복제
Figure 112001026244980-pct00020
*평균 log10pfu/ 표시된 조직 g ±표준 오차. 6마리 동물/군.
<표 21>
혈청 음성 침팬지의 상기도 및 하기도에서 ts-1 NG1/A-20-4, ts-1 NG1, ts-1 또는 야생형 RAV A2의 복제
Figure 112001026244980-pct00021
aIN = 비강 내만; IN + IT = 비강 내 및 기관 내 투여 모두.
b바이러스가 회수된 감염 후 마지막 날을 나타낸다.
c평균 비루 점소는 바이러스 쉐딩 피크일 주위 8일 동안의 1일 점수의 합을 8로 나눈 값을 나타낸다. 4가 가장 높은 점소이고; 0은 가장 낮은 점소이다.
d바이러스는 표시된 날에만 분리되었다
e문헌 [Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993)]의 동물.
<표 22>
RSV ts-1 NG1/A-20-4, ts-1 NG1, 또는 ts-1 10 4 pfu로 침팬지를 면역화시키면 28일 에 10 4 RSV A2 야생형 바이러스 감염에 대한 내성이 유도된다
Figure 112001026244980-pct00022
a평균 비루 점수는 8일 동안의 피크 바이러스 쉐딩 점수의 합을 8로 나눈 것을 나타낸다. 4가 가장 높은 점수이고; 0이 가장 낮은 점수이다.
b문헌 [Crowe, et al., Vaccine 12:691-699 (1994)]의 동물.
c문헌 [Collins, et al., Vaccine 8:164-168 (1990)]의 동물.
d이 표에 있는 혈청 중화 적정 농도는 표에 나타낸 다른 표본과 동시에 새로 운 분석에서 결정되었다.
<표 23>
RSV ts-4로부터 유래되고 허용 및 제한 온도에서 HEp-2 세포에서 시험된 6개 돌연변이체의 대조군과 비교된 플라크 형성 효능
Figure 112001026244980-pct00023
1정지 온도는 100배 이상이 감소된 플라크 형성이 관찰되는 가장 낮은 제한 온도로서 정의된다 (표에서 고딕체).
*작은 플라크 표현형 (<50% 야생형 플라크 크기)
**핀포이트 플라크 표현형 (<10% 야생형 플라크 크기)
<표 24>
Balb/c 쥐에서 RSV ts-4 및 RSV ts-4 cp-43의 복제 1
Figure 112001026244980-pct00024
1쥐에게 0일에 가벼운 마취 하에서 비강으로 106.3p.f.u.를 투여하고, 이후 4일에 CO2 질식시켜 죽였다.
실시예 IV
RSV 아군 B 백신 후보물질
이 실시예는 RSV 아군 B 바이러스 백신 후보물질 개발을 기술한다. 본 발명의 아군 A 돌연변이체 개발을 위해 사용된 동일한 방법이 아군 B 바이러스를 위해 이용되었다. 야생형 B-1 RS 바이러스의 부모형 스톡은 낮은 온도 (20-25oC)에서 Vero 세포에서 52회 저온 계대 배양되었고 바이러스는 19회 계대 배양 및 52회 계대 배양에서 플라크 정제시켰다. 52회 계대 배양 현탁액으로부터 유래된 클론 중 3개는 독립적으로 평가되었고, RSV B-1cp52/2B5로 표시되는 하나의 클론이 코튼 랫트의 상기도 및 하기도에서 고도로 약독화되었기 때문에 추가의 평가를 위해 선택되었다 (표 25). cp RSV B-1 바이러스의 상이한 계대 배양 수준에서의 몇개의 클론의 평가는 RSV B-1-cp52/2B5 돌연변이체가 그의 약독화 표현형에 독립적으로 제공되는 복합 돌연변이를 유지시켰음을 나타낸다. RSV B-1cp52/2B5 돌연변이체는 면역 억제된 코튼 랫트에서의 지연된 복제 이후에 약독화 표현형을 보유하였다 (표 26). 니러한 높은 수준의 유전학적 안정성의 발견은 이것이 약독화 표현형에 제공되는 3개의 돌연변이를 포함한다는 사실과 일치한다.
아군 A 돌연변이체와 유사한 방법으로 이들을 특징화하기 위한 아군 B 돌연변이체에 대한 추가의 평가가 카리브해 녹색 원숭이 (표 27 및 28) 및 침팬지 (표 29)에서 수행되었다. RSV B-1 cp-23 또는 cp52/2B5로 면역화된 원숭이는 RSV B-1 야생형 바이러스의 복제에 내성이고, 이는 RSV B-1 야생형 바이러스의 고도로 약독화된 유도체로의 감염은 야생형 감염에 대해 내성을 유도하기에 충분하였음을 나타낸다 (표 27).
녹색 원숭이에서와 같이, 혈청 음성 침팬지에서의 결과는 상기도 및 하기도에서의 RSV B-1cp52/2B5의 약독화를 분명하게 증명해준다.
RSV B-152/2B5 돌연변이체는 5-플루오로우라실로 추가로 돌연변이 유발되었고 그 결과 생성되는 플라크를 취하여 ts 표현형에 대해 32o 및 38oC에서 스크린하였다. 선택된 cpts 돌연변이체는 Vero 세포에서 3회 플라크 정제되었고 이후 Vero 세포에서 2회 증폭되었다. 결과적으로, RSV B-1cp52/2B5의 7개 cpts 돌연변이체가 동정되었고 (표 30) 코튼 랫트에서 그들의 복제 수준이 연구되었다 (표 31). 이들 돌연변이체 중 하나, 즉 cpts176은 추가로 돌연변이 유발되고 RSV B-1cpts 176 부모형 바이러스보다 시험관 내에서 더 ts인 일련의 돌연변이체 유도체가 얻어졌다 (표 32).
본 발명의 아군 A 돌연변이체와 같이, 아군 B 돌연변이체는 감염성이고 코튼 랫트, 원숭이 및 침팬지를 위한 현저한 정도의 약독화를 나타낸다. 생체 내 약독화에도 불구하고, cp 돌연변이체 바이러스는 야생형 감염에 대해 원숭이에서 내성을 유도하였다. RSV B-1cpts52/2B5 바이러스의 ts 돌연변이체는 약독화되고 RSV B-1 52/2B5 부모형 바이러스보다 코튼 랫트의 비인두 및 폐에서 더욱 제한된 수준의 복제를 설명해준다.
<표 25>
2개의 개별적인 실험에서, RSV B-1으로부터 유래된 5개의 플라크 정제된 저온 계대 배양 돌연변이체와 비교된 RSV B-1 야생형의 코튼 랫트에서의 복제
Figure 112001026244980-pct00025
*바이러스 회수는 실험 1에서 10일 배양시키고 실험 2에서 7일 배양시킨 Vero 세포 단일층 배지 상에서 32oC에서 조직 균질물을 적정시켜 결정하였다.
**코튼 랫트는 비강으로 표시된 바이러스 105.5 pfu로 감염되었다.
nd = 수행되지 않음.
<표 26>
RSV B-1 cp52/2B5 감염된 면역 억제된 코튼 랫트로부터 얻은 14일의 분리물의 대조군되 비교된 코튼 랫트에서의 성장
Figure 112001026244980-pct00026
*분리물은 면역 억제된 코튼 랫트의 14일의 원재 비개골 균질물에서 존재하는 바이러스를 Vero 세포 조직 배양에 1회 계대 배양시켜 증폭한 이후 얻어지는 바 이러스 현탁액이었다.
a8마리 코튼 랫트의 군은 0일에 0.1 ml 접종원 중 표시된 바이러스 105.5 pfu로 감염되었다.
b()는 바이러스가 1.2 이상의 log10pfu/g으로 검출되는 동물의 수를 나타낸다.
c()는 바이러스가 1.5 이상의 log10pfu/g으로 검출되는 동물의 수를 나타낸다.
<표 27>
RSV B-1로부터 유래된 2개의 저온 계대 배양된 돌연변이체와 비교된 RSV A2 및 RSV B-1 야생형의 카리브해 녹색 원숭이의 복제, 이후 동형 또는 이형 RSV A2 또는 B-1 야생형 감염
Figure 112001026244980-pct00027
a동물은 0일에 1.0 ml 접종원 중 105.5p.f.u.의 바이러스로 각 부위에 기관 내 및 비강 내로 감염시켰다.
bLog10pfu/ml 적정 농도는 RSV A2에 대해 HEp-2- 세포 단일층 배지 상에서, RSV B-1 및 그의 유도체에 대해 Vero 세포 단일층 배지 상에서의 플라크 분석에 의해 결정하였다.
*바이러스는 표시된 날에만 검출되었다.
<표 28>
RSV A2, RSV B-1, 또는 B-1 cp 유도체로 감염되고 이후 한 달 후 동형 또는 이형 야생형 바이러스로 감염된 카리브해 녹색 원숭이의 중화 항체 반응
Figure 112001026244980-pct00028
<표 29>
기관 내 및 비강 내 동시 투여 이후 혈청 음성 침팬지에서의 RSV B-1 또는 RSV B-1 cp-52의 복제 a
Figure 112001026244980-pct00029
a이들 데이타는 3개의 개별적인 실험으로부터 혼합되었고, 제1 실험에서의 표시된 바이러스의 감염량은 104이었고, 제2 및 제3 실험에서는 105이었다.
b바이러스가 회수되는 감염 후 마지막 날을 나타낸다.
c평균 비루 점수는 바이러스 쉐딩 피크 일 주위의 8일 동안의 1일 점수의 합을 8로 나눈 것을 나타낸다. 4가 가장 높은 점수이고, 0은 가장 낮은 점수이다.
<표 30>
RSV B-1 cp52/2B5로부터 유래된 8개 돌연변이체의 플라크 형성 효능
표시된 온도 ( o C)에서의 플라크 적정 농도 (HEp-2의 Vero 세포에서의 log 10 pfu/ml)
Figure 112001026244980-pct00030
*작은 플라크 표현형 (<50% 야생형 플라크 크기)
**핀포이트 플라크 표현형 (<10% 야생형 플라크 크기)
a32oC에서 플라크는 관찰되지 않았다. 그러므로, 정지 온도는 플라크 형성 효능에 의해 결정되지 않았다. 돌연변이는 액체 배지 오버레이에서의 바이러스 생산 (TCID50)이 100배 감소되어 결정되는 HEp-2 세포 배양에서 정지 온도 38oC에서 정해졌다. 고딕체는 정지 온도를 의미한다 (100배 이상이 감소된 플라크 적정 농도가 관찰되는 가장 낮은 제한 온도로서 정의됨).
<표 31>
RSV B-1 cp-52/2B5로부터 유래된 7개의 ts 돌연변이체의 코튼 랫트에서의 복제 수준
Figure 112001026244980-pct00031
1코튼 랫트에게 0일에 가벼운 마취 하에서 4.5-5.8 log10pfu를 비강 내로 접 종하고, 이후 4일에 CO2 질식시켜 죽였다.
2바이러스만을 하유하는 샘플로부터의 적정 농도. 괄호는 바이러스를 함유하는 샘플의 분획을 나타낸다.
<표 32>
RSV B-1 cpts176으로부터 유래된 14개 돌연변이체의 대조군과 비교된 플라크 형성 효능
HEp-2 세포 단일층 배양에서의 시험관 내 플라크 형성 효능
Figure 112001026244980-pct00032
**핀포인트 플라크 표현형 (<10% 야생형 플라크 크기)
1정지 온도는 100배 이상이 감소된 플라크 적정 농도가 관찰되는 가장 낮은 제한 온도로서 정의된다 (표에서 고딕체).
RSV B 아군 백신 후보물질의 평가 및 조작을 돕기 위해, 야생형 B-1 바이러스의 완전한 뉴클레오티드 서열이 결정되었다 (서열 번호:2). 이 서열은 상기 기술된 약독화된 B-1 유도체, cp-52/2B5 (cp-52)의 서열과 비교되었다. 이 서열 분석은 SH 및 G 유전자의 대부분을 확장시키는 cp-52에서의 큰 결실을 보여주고, 유전자의 예측된 ORF를 갖지 않는다. 더욱 구체적으로, cp-52 바이러스의 SH 및 G 유전자를 확장시키는 대부분의 영역이 결실되고, 오직 SH 유전자-개시 신호 및 G 유전자 및 그의 유전자 말단 신호의 3' (하류) 말단 부분만을 보유한다. 나머지 SH:G 영역은 ORF가 없는 ~91 뉴클레오티드의 키베릭 전사를 코딩할 수 이었다. cp-52의 노던 블롯 분석은 독특한 복합 다전사가 SH:G 유전자 연결 부위를 확장하는 결실 돌연변이와 일치하는, SH:G 리드-트루 mRNA를 함유하였다. 웨스턴 블롯 및 면역 염색 분석은 손상되지 않은 G 당단백질이 cp-52 바이러스에 의해 생성되지 않는다는 것을 확인시켰다. 긴 결실에 덧붙여, cp-52 바이러스는 7개의 뉴클레오티드 차이점을 함유하고 (표 33), 이 중 5개는 코딩 변화이고 (F 유전자에서 1개, L 유전자에서 4개), 하나는 잠재성이고 (F 유전자), 하나는 비코딩 G:F 유전자간 영역에 있다. 중요하게는, 이 RSV 돌연변이체는 SH 및 G 단백질의 부재에도 불구하고 조직 배양에서 대단히 감염성이다. 이들 데이타는 재조합 RSV 백신 후보물질 개발에 대한 선택적이거나 또는 조합적인 방법을 제공하는 복제 경쟁적 결실 돌연변이체의 신규한 부류를 동정해준다.
<표 33>
RSV B1과 cp-52의 서열 비교
Figure 112001026244980-pct00033
*양성 (+) 센스
↑SH 및 G 유전자를 확장시키는 뉴클레오티드 위치 4249-5540이 cp-52에서 결실된다.
**cp-23 에 존재하는 돌연변이
cp-52 계대 배양할 때 상이한 계대 배양 수준에서 단리된 다른 아군 B 돌연변이체들은 계대 배양에 따라 다양한 cp-52 돌연변이를 혼입하였다 (표 34). 본원 명세서에서의 예시적 아군 B 돌연변이체는 RSV B-1 cp-12, RSV B-1 cp-23, RSV B-1 cp-32, RSV B-1 cp-42를 포함한다. 표 34는 예시적 B 아군 돌연변이체 중 이 특이적 돌연변이의 분포를 도시한다 (역방향 프라이머로서). 이 돌연변이의 다양한 분 포는 표시된 균주에서 이들 돌연변이의 약독화 효과를 더 상세히 특징화시킨다. 예를 들면, cp-23은 cp-52에 있는 5626, 6460, 14614 및 14596 뉴클레오티드 위치에 돌연변이를 혼입시키나 (표 34), cp-52에서 결실된 SH 및 G 유전자 영역에서 부모형 B-1 야생형 균주와 차이점이 없다. cp-42는 cp-52와 동일한 SH 및 G 결실를 혼입시키고, cp32는 SH 및 G 유전자 내에 특징적인 서열 결실이 있다.
<표 34>
RSV B1, RSV B1cp12, cp23, cp32, cp42 및 cp52 사이의 서열 비교
Figure 112001026244980-pct00034
Figure 112001026244980-pct00035
SH 및 G를 확장시키는 뉴클레오티드 영역 (4249-5540 위치)이 cp52에서 결실된다.
Figure 112001026244980-pct00036
Figure 112001026244980-pct00037
B1 부모형와의 뉴클레오티드 차이가 cp52에서 결실된 SH 및 G 유전자 영역에서 발견되지 않았다.
*이들 뉴클레오티드는 cp32 및 cp52와 동일한 것 같다.
**L-중합효소에서 아미노산 위치 2030의 루이신은 또한 RSV2B에서 발견된다.
실시예 V
2가 RSV 아군 A 및 B 백신
아군 바이러스 A 및 B로의 연구는 시험관 내, Vero 세포 단일층 배양에서 야생형 A2와 B-1 바이러스 사이 또는 cpts530/1009와 RSV B-1 cp52/2B5 유도체 사이에서 방해가 발생하지 않는다는 것을 보여준다. 코튼 랫트에서 2가 감염의 생체 내 결과는 표 34에 나타낸다. 이들 결과는 A-2와 B-1 야생형 RSV 사이, 및 cpts530/1009와 RSV B-1 cp52/2B5 사이의 방해를 보이지 않는 시험관 내 결과를 확인시킨다. 그러므로, 이가 백신의 각 성분이 단일 감염 중에 나타나는 것에 상당한 이중 감염에서의 수준으로 복제하기 때문에, 각각의 백신 바이러스는 야생형 바이러스에 대한 동형성 면역을 유도할 것으로 기대된다.
<표 35>
RSV A2 및 RSV B-1 바이러스 또는 돌연변이 유도체으로 코튼 랫트를 2가 감염시키면 생체 내 방해를 나타내지 않는다
Figure 112001026244980-pct00038
*6마리의 동물 군은 0일에 비강으로 0.1 ml 접종원 중 105pfu로 감염되었다.
실시예 VI
중합효소 (L) 유전자에서의 단일 돌연변이는 ts 표현형을 유도한다
이 실시예는 더욱 고도로 약독화되고 RSV 백신 제제에서의 용도에 적합한, ts 균주, cpts248 및 cpts530을 생성하기 위해 불완전하게 약독화된 숙주 범위로 제한된 cpRSV를 화학적 돌연변이 유발시켜 제조된 중합효소 유전자 (L)에서의 특이적 돌연변이를 기술한다. 상기 실시예에 기술된 바대로, cpts248은 혈청 음성 침팬지에서 야생형 감염에 대해 약독화되고, 면역원성이고, 완전히 방어적인 것으로 발혀졌다. 상기 기술된 바대로, cpts248 균주는 남아 있는 반응원성을 더 감소시키기 위해 화학적 돌연변이 유발시켜, cpts248/404를 포함해, 증가된 온도 민감성을 갖는 일련의 돌연변이체 또는 작은 플라크 표현형을 생성시킨다. 유사한 방법으로, cpts530/1009는 cpts530으로부터 유래되었다.
증가된 약독화를 위한 유전학적 염기 및 cpts 248 및 cpts530의 ts 표현형은 cpRSV 부모형 바이러스의 상기 결정된 서열과 이들 바이러스의 완전한 게놈 서열을 비교함으로써 결정되었다. cpRSV의 완전한 뉴클레오티드 서열은 결정되었고 RSV A2 야생형 바이러스 및 낮은 계대 배양된 야생형 부모형 바이러스 (RSV A2/HEK7)의 서열과 비교되었다 (직접 계대 배양 계통의 부분이 아닌 실험실 균주). cpRSV는 그의 RSV A2/HEK7 부모형 바이러스와 5개의 뉴클레오티드 변화에 의해 다른데, 즉 하나는 핵단백질 (N), 2개는 융합 단배질 (F) 유전자 및 2개는 중합효소 (L) 유전자에서 다르다. cpts248, cpts248/404, cpts530, cpts530/1009 및 cpts530/1030의 완전한 15,222 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 결정되었다.
무작위 화학적 돌연변이 유발에 의해 cpRSV 부모형로부터 RSV 돌연변이체 cpts248 및 cpts530의 유도체화는 실시예 1에 기술되었다. 정제된 바이러스 RNA의 원료로서 사용되기 위해 바이러스 제조용 세포를 감염시키기 위해 사용된 바이러스 현탁액은 생물학적 클로닝 이후 Vero 세포 단일층 배양에서의 액체 배지에서 4회 계대 배양된 바이러스를 함유하는 맑게 된 조직 배양 상징액이었다 (즉, 아가 하 Vero 세포 단일층에 3회 플라크-투-플라크 계대 배양시킴).
세포 단일층은 cpts248, cpts248/404, cpts530, cpts530/1009 또는 cpts530/1030 바이러스로 0.1의 감염 다중도 (moi)로 감염되었다. 전체 RNA는 적합한 cPE가 관찰될 때 (감염후 평균 4-5일) 감염된 세포 단일층으로부터 제조되었다. 상징액은 흡입에 의해 제거되고, 감염된 세포 단일층은 구아니디늄 이소티오시아네이트로 용해시키고, 이어서 페놀-클로로포름 추출시켜 수확하였다. RNA는 수퍼스크립트 II TM 전사효소 (라이프 테크놀로지스) 무작위 핵사머 프라이머 및 제조자에 의해 공급되는 프로토콜에 기술된 반응 조건을 사용하여 역전사되었다.
그 결과 생성되는 cDNA는 TE-100 스핀 컬럼 (클론테크, 팔로 알토, CA)을 사용하여 프라이머로부터 분리되고 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 주형으로 사용되어 전체 RSV 게놈을 확장시키는 일련의 10개의 오버랩하는 cDNA 클론을 생성시켰다. PCR을 위한 올리고뉴클레오티드는 프로토타입 A2 바이러스의 뉴클레오티드 서열로부터 설계되었고 (Mink et al., Virology 185:615-624 (1991); Stec et al., Virology 183:273-287 (1991); Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9663-9667 (1991); Connors et al., Virology 208:478-484 (1995)), RSV A2 야생형 바이러스 및 그의 유도체, cpRSV 부모형 바이러스 모두를 증폭시키는 것으로 이미 설명되었다. 우라실 함유 올리고뉴클레오티드 프라이머는 클론Amp 우라실 DNA 글리코실라제 시스템 (라이프 테크놀로지스)을 사용하여 pAMP1 벡터로 RSV 서열 클로닝시키기 위해 사용되었다. PCR 반응은 제조자의 프로토콜 (퍼킨 엘머, 노워크, CT)에 따라 수행되었고 각각 92.5oC에서 1분, 55oC에서 1분 및 72oC에서 3분의 34 주기 동안 수행되었다. 각 단편은 1% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동되었고, 진클린 II 시스템 (Bio101, 비스타, CA)에 의해 회수되고 pAMP1 벡터로 클로닝되었다. 각 단편의 2개 이상의 클론은 개별적인 PCR 반응으로부터 생성되었다. 3' 선도 영역 분석을 위해, 바이러스 RNA (vRNA)는 50 ㎕ 반응에서 문헌 [Mink et al., Virology 185:615-624 (1991)]에 기술된 바대로 폴리아데닐화되었다. 37oC에서 10분 동안 배양한 후, 반응은 0.5 M EDTA 2 ㎕로 정지되었다. 폴리아데닐화된 RNA 생성물은 페놀 클로로포름 및 에탄올 침전법으로 추출하여 정제하고, 이후 cDNA로 역전사시키고, PCR에 의해 증폭시키고, 3' RAGE 시스템 (라이프 테크놀로지스)으로 신속하게 증폭시켜 클로닝되었다. 유사하게는, 5' 트레일러 영역 분석을 위해, vRNA는 cDNA로 역전사되고, 컬럼 정제되고, 이중 스트랜드로 제조되고 PCR에 의해 증폭되고 5' RAGE 시스템 (라이프 테크놀로지스)를 사용하여 클로닝되었다.
cpts248을 위해 클로닝된 cDNA는 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 (플라스미드 프라이머 또는 RSV 특이성 프라이머), [α35S]dATP 및 시쿼나제 2.0 (유나이티드 스테이츠 바이오케미컬스, 클리블렌드, OH)를 사용한 디데옥시뉴클레오티드 방법으로 이중 스트랜드 플라스미드로부터 서열화되었다, 관찰된 서열과 이미 공개된 부모형 바이러스 cpRSV의 서열 사이의 차이는 정방향 및 역방향 모두로 2개 이상의 클론을 서열화시키고, 클로닝되지 않은 PCR 생성물을 서열화시킴으로써 확인되었다.
cpts248/404, cpts530, cpts530/1009 및 cpts530/1030의 뉴클레오티드 서열은 상이한 기술을 사용하여 결정되었다. cpts 돌연변이체 바이러스 게놈을 나타내는 3 내지 10개의 오버래핑 cDNA 클론은 전체 감염된 세포 RNA 또는 vRNA의 RT-PCR에 의해 생성되었다. 각 클론의 완전한 뉴클레오티드 서열은 각 플라스미드 인서트에 대해 파지 M13에서 구성된 M13 초음파 무작위 라이브러리 상에서 타크 키트 (ABI, 포스터 시티, CA)를 사용한 NCI 프레데릭 캔서 (프레데릭, MD)에서 자동화 DNA 서열에 의해 결정되었다. 스트랜드 모두가 서열화되었고 cpRSV와 cptsRSV 돌연변이체 서열 사이의 차이점이 시쿼나제 2.0 (USB, OH)를 사용하여 독립적으로 유해된 제2 RT-PCR 생성물을 수동 서열화 (상기와 같이)시켜 확인되었다. 3' 및 5'-말단 서열이 상기 기술된 바대로 결정되었다.
cpts248, cpts248/404, cpts530, cpts530/1009 및 cpts530/1030 균주의 15,222-뉴클레오티드 RNA 게놈의 완전한 뉴클레오티드 서열이 결정되었다. cpRSV 및 RSV A2/HEK7 (야생형) 부모형 바이러스 (Conners et al, Virology 208:478-484 (1995))의 공개된 서열에 대한 변화는 이들 cptsRSV 돌연변이체의 독립적으로 유래된 cDNA 클론 상에서 확인되었고, cpRSV의 추가의 클론을 서열화함으로써 cpRSV 바이러스에서 다시 체크하였다. cpRSV 바이러스의 서열에서의 모호성 (A2/HEK7 야생형 바이러스와 비교됨)이 확인되었다. 이 모호성은 역방향 프라이머 게놈의 3' 말단으로부터 1,938 위치에서 나타나고 391개의 아미노산-뉴클레오캡시드 (N) 단백질 의 아미노산 위치 267에서의 아미노산 변화 (Val 또는 Ile)를 코딩하는 것으로 예견되는 뉴클레오티드 이질성 (정방향 프라이머에서 G 또는 A)으로 이루어져 있다. 그러므로, cpRSV는 사실상 바이러스의 혼합된 군으로 구성되었다. 이는 상기 Conners et al의 문헌에서 1939 위치에서의 변화를 검출하는데 처음에 실패했음을 설명해준다. 위치 1,938에서 A 돌연변이를 갖는 바이러스는 cpts248 유도체 및 cpts530 자매 클론의 바로 위 부모형였다. 그러므로, cpts 유도체의 바로 위 부모형 바이러스인 cpRSV는 그의 A2/HEK 부모형와 5개의 아미노산 차이를 보인다.
cpRSV와 cpts248 돌연변이체의 단일 뉴클레오티드 차이는 뉴클레오티드 위치 10,989에서 찾았다 (A 내지 T 변화) (표 36). 이 돌연변이는 중합효소 2,615 아미노산 L 단백질에서 831의 아미노산 위치에서 gln이 leu로의 예측되는 아미노산 변화를 코딩하는, 중합효소 (L) 번역 개방된 판독틀 내에서 발생했다. cpts248/404 돌연변이체는 cpts248 부모형과는 2개 뉴클레오티드 차이, L 유전자의 뉴클레오티드 12,046에서 1개 (T 내지 A), 및 M2 유전자의 전사 출발 신호 서열의 뉴클레오티드 7605 (T 내지 C)에서 한개 차이가 있다. L 유전자에서 뉴클레오티드 치환은 L 단백질의 1183 위치에서 asp가 glu로 변화되게 하였다. 그러므로 cpRSV의 2회의 독립적인 돌연변이 유발 이후에, cpts248/404 바이러스는 L 유전자에서 2개의 뉴클레오티드 변화 (2개의 아미노산 치환에 상응함) 및 M2 유전자의 전사 출발 신호에서 1개의 뉴클레오티드 변화를 얻었다. 그의 야생형 부모형, A2/HEJ7와 비교해, cpts248/404 돌연변이는 7개의 아미노산 (L에서 4개, F에서 2개, 및 N에서 1개) 및 M2 유전자의 전사 출발 신호에서 1개의 뉴클레오티드가 다르다.
<표 36>
cp-RSV, cpts-248, cpts-248/404 돌연변이체 바이러스 사이의 뉴클레오티드 서열 차이
Figure 112001026244980-pct00039
1정방향 프라이머
21개 뉴클레오티드가 증가한 게놈 길이
cpts530은 10,060 위치에서 C 내지 A의 추가적인 단일 뉴클레오티드 치환에 의해 부모형 균주 cpRSV와 다르고 L 단백질의 521 위치에서 아미노산이 phe에서 leu로 변화하게 한다 (표 37). cpts530/1009 돌연변이체는 뉴클레오티드 12,002 (A 내지 G)에서 단일 뉴클레오티드 치환이 있고, 이는 L 단백질의 1169 아미노산에서 met가 val로 치환되도록 한다. 그의 야생형 부모형, A2/HEK7과 비교해, cpts530/1009 돌연변이체는 7개의 아미노산이 다르다 (L에서 4개, F에서 2개, 및 N에서 1개).
cpts530/1030 돌연변이체는 뉴클레오티드 12458 (T 내지 A)에 추가의 단일 뉴클레오티드 치환이 있고, 이는 L 단백질의 아미노산 1321에서 Tyr이 Asn으로 치환되도록 한다. 그의 wt 부모형, A2/HEK와 비교해, cpts530/1030 돌연변이체는 7개의 아미노산이 다르다 (L에서 4개, F에서 2개, 및 N에서 1개).
<표 37>
cp-RSV, cpts-530, cpts-530/1009 돌연변이체 바이러스 사이의 뉴클레오티드 서열 차이
Figure 112001026244980-pct00040
1정방향 프라이머
그러므로, cpts248 및 cpts530의 ts 및 약독화 표현형 각각은 중합효소 유전자에서의 단일 뉴클레오티드 변화와 관련되어 있다. cpts530과 cpts530/1009 또는 cpts530/1030 사이의 ts 및 약독화 표현형의 증가적 증가는 또한 각각 L에서의 1개 아미노산 변화와 관련되어 있다. 이들 4개의 예 (즉, cpts248, cpts530, cpts530/1009, 및 cpts530/1030)에서, L에서 단일의 그러나 상이한 아미노산 치환은 부모형 균주 상에 ts 및 약독화 표현형을 제공하였다. 이들 아미노산 치환은 동물에서 복제 이후 ts 표현형의 안정성을 증가시키기 위해 5개의 cpRSV 돌연변이 반응과 협동으로 작용한다. cpts248과 cpts248/404 사이에 관찰되는 약독화 및 온도 민감성에서의 증가적 증가는 2개의 뉴클레오티드 변화와 관련되어 있고, 이 중 하나 또는 둘다는 ts 및 약독화 표현형에 기여할 수 있다. ts 및 약독화 표현형과 단독으로 관련되어 있는 L에서의 4개의 특이성 부위 (즉, cpts530, cpts530/1009, cpts530/1030 및 ctps249 바이러스) 및 cpts248/404에서 1 또는 2개의 부위는 돌연변이가 약독화를 유도할 수 있는 L 단백질의 RSV 게놈의 코어 영역으로 본원에 요약된 사실에 의해 확인되었다. L 단백질의 4개 부위에서 특이성 돌연변이가 특이성 아미노산 치환이라 하더라도, 다른 아미노산 치환 및 특이 부위의 약 5개 아미노산 내에서 이들 부위 및 접촉하는 아미노산에서의 프레임 내 삽입 또는 결실이 또한 약독화를 일으킬 수 있는 것 같다.
L에서 코딩된 아미노산 변화는 파라믹소바이러스 중합효소 단백질 사이의 가장 높은 서열 보존 영역, 제안된 ATP 결합 부위 (Stec et al., Virology 183:273-287 (1991))나 RNA 의존성 RNA 및 DNA 중합효소의 모티프와 동형인 것으로 제안된 영역 (Poch et al., EMBO J. 8:3867-3874 (1989))을 포함하는 것으로 나타나지 않는다. 돌연변이가 3' 및 5' 게놈 말단이나 짧은 유전자 출발 및 유전자 말단 서열 내에 있지 않다면, 이들 돌연변이의 효과는 뉴클레오티드 수준에서보다는 오히려 뉴클레오티드 수준에서 나타나는 것 같다. 이들 RNA 영역은 효과적인 엔캡시데이션 (encapsidation), 전사, 복제, 및 바이러스 입자으로의 패키징 (packaging)을 위해 요구되는 모든 시스 작용 RNA 서열을 함유하는 것으로 여겨진다 (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9663-9667 (1991); Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:81-85 (1996), 이들 각각은 본원에 참고로 혼입된다).
이들 결과는 tsRSV 돌연변이체의 제1 전장 서열을 제공한다. 이들 결과는 또한 뉴모바이러스 (pneumovirus)가 아미노산 변화 또는 내부 변화, 예를 들면 GS 서열에서의 변화를 일으키는 단일 뉴클레오티드의 치환에 의해 약독화될 수 있음을 나타낸다. cpts248 및 cpts 530 바이러스가 시험관 내 및 생체 내 모두에서 ts 표현형에 대해 높은 수준의 안정성을 갖기때문에, 이 표현형이 상이한 단일 아미노산 변화 관련되어 있는 것으로 밝혀져 있는 것이 사실이다. 중요하게는, cpts248/404, cpts530/1009 및 cpts530/1030은 약독화 표현형, 2개의 ts 및 1개의 비ts (예를 들면, 5개의 cp 돌연변이 반응)에 기여하는 3개 이상의 돌연변이 반응을 함유하고, 이는 시험관 내 및 생체 내에서의 이들 바이러스의 높은 수준의 안정성에 대한 부분적인 비제한 설명이다.
RSV 백신 바이러스 및 그들의 부모형 바이러스의 완전한 서열 결정은 백신 바이러스 생산 및 임상 시험에서의 지원자에 의해 쉐딩 중에 백신 바이러스의 유전학적 수준에서의 안정성에 대한 분석을 허용한다. cpts248, cpts530, cpts248/404, cpts530/1009 및 cpts530/1030 바이러스의 약독화 및 ts 표현형의 유전학적 기초 결정은 중요한 새로운 기회를 제공한다. 하기 기술된 재조합 방법에 따라, 감염성 바이러스가 회수될 수 있는 전장 RSV cDNA의 부위 지향적 돌연변이 유발에 의해 신규한 백신 후보물질을 생성시키는 것이 쉽게 가능하다. 예를 들면, 예를 들면, cpts248/404 바이러스의 cDNA 클론에 아미노산 위치 521 (cpts530 돌연 변이체) 또는 1169 (cpts530/1009 돌연변이체)에서의 ts 돌연변이 반응 중 하나 또는 둘다 또는 바람직한 바대로 약독화 또는 안정화 돌연변이를 첨가하는 것이 가능하다. 이 방법으로, cpts248/404 바이러스의 약독화 수준은 증가 형태로 증가될 수 있고 안전성 및 면역원성 모두를 위해 바람직한 특정 수준의 약독화를 갖는 백신 균주는 합리적인 방법으로 생성될 수 있다. 유사하게는, cpts530/1009 및 cpts530/1030 돌연변이의 약독화 수준은 cpts248/404 바이러스에 1개 이상의 약독화 돌연변이를 특이적으로 도입시켜 증가될 수 있다. 이들 조합적인 재조합 바이러스의 예는 생물학적으로 유래된 돌연변이체 균주로부터 복합적인 약독화 돌연변이를 혼입하고, 통상적인 방법을 사용하여 유전학적으로 안정하고, 만족스럽게 약독화된 바이러스를 분리하고 생산하는 데 존재하는 많은 어려움을 극복한다. 또한, 이들 재조합 cptsRSV 돌연변이체의 표현형 안정성은 가능하면 약독화 표현형을 제공하는 것으로 알려진 특이성 아미노산을 특정하는 코돈에서 2개 이상의 뉴클레오티드 치환을 도입시켜 증가될 수 있다. 이 방법으로 약독화 표현형의 안정성은 전장 RSV cDNA의 부위 지향적인 돌연변이 유발에 의해 강화될 수 있다.
실시예 VII
RSV 안티게놈을 코딩하는 cDNA 구성
RSV 균주 A2의 안티게놈을 코딩하는 cDNA는 도 2에 도시된 바대로 구성되었다. cDNA는 프라이머로서 합성 올리고뉴클레오티드 및 템플레이트로서 정제된 바이러스 입자으로부터 단리된 세포 내 RSV mRNA 또는 게놈 RNA를 사용하여 역전자 (RT) 및 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 절편에서 합성되었다. 최종 cDNA는 T7 RNA 중합효소를 위한 프로모터에 의해 리더 말단 상에 플랭크되었고, 최적 활성을 위해 전사된 3개의 G 잔기를 포함하고; 전사는 안티게놈의 5' 말단에 이들 3개의 비바이러스성 G'들을 주게 될 것이다. 거의 정확한 3' 말단을 생성시키기 위해, cDNA 트레일러 말단은 상기 기술된 해머헤드 리보자임에 인접되도록 구성되고, 이 리보자임은 절단되어 코딩된 RNA의 3' 말단에 단일 3'-인산화 U 잔기를 줄 것이다 (Grosfeld et al., J.Virol. 69:5677-5686 (1995), 이는 본원에 참조로 혼입됨). 리보자인 서열은 T7 RNA 중합효소 터미네이터의 종렬 쌍에 의해 이어졌다. (클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제 (CAT) 수용체 유전자를 함유하는 cDNA 코딩된 RSV 미니게놈에 3개의 5' G 잔기 및 1개의 3' U 잔기를 첨가하면 RSV에 의해 상보될 때 CAT의 발현에 대해 효과를 갖지 않았다).
도 2는 cDNA 및 코딩된 안티게놈 RNA의 구조를 보여준다. 안티게놈 (맨 위에서)의 도표는 하기 특징을 포함한다: T7 프로모터에 의해 부여된 5'-말단 비바이러스성 G 트리플렛, 위치 1099 (이는 1개의 nt를 그 길이에 첨가함), 1139, 5611 및 7559 에서의 4개의 서열 마커, 리보자임 및 종렬 T7 터미네이터, 및 리보자임 절단에 의해 3' 말단에 단일 비바이러스성 3'-인산화 U 잔기 (절단 부위는 화살표로 표시됨).
완전한 안티게놈의 응집체에서 나타나는 클로닝된 cDNA 절편 (도 2, 중간)는 RSV mRNA 또는 게놈 RNA의 RT-PCR에 의해 구성되었다. 완전한 안티게놈 cDNA는 D46 또는 D53으로 불리운다; 상이한 이름은 동일한 플라스미드의 상이한 제제를 의미한다. 안티게놈의 왼쪽 말단을 함유하는 cDNA는 T7 프로모터 및 SH 유전자에 상보적이고 D13으로 불리우는 선도 영역으로부터 확장하고, 천연적으로 나타나는 BamHI 부위가 돌연변이 유발에 의해 결실되고 PstI-EcoRI 단편이 조립을 용이하게 하기 위해 설계된 독특한 제한 부위 (BstBI, BstxI, PacI, BamHI, MluI를 포함함)로 대체된 pBR32 형태 (도 2, 바닥)로 조립되었다. 도 2에서의 박스는 BamHI 부위의 제거를 나타낸다. 천연적으로 나타나는 BamHI-SalI 단편 (BamHI 부위는 정방향 프라이머에서 맨 위에 있는 선으로 나타냄, 밑줄)은 PCR 생성된 BglII-SalI 단편 (BglII 부위는 바닥 선으로 나타냄, 밑줄; 그의 4-nt 점성 말단 (이탤릭체)은 BamHI의 말단과 경쟁적임)으로 대체되었다. 이는 아미노산 수준에서 잠재성인 단일 nt 변화 (중간 선, 밑줄)를 유도하였다. 벡터에 대한 이들 변화는 안티게놈 cDNA에 독특한 BamHI 부위를 제공함으로써 cDNA 구성을 용이하게 하였다.
L, 트레일러 및 플랭킹 리보자임 및 종렬 T7 전사 터미네이터와 마찬가지로, G, F 및 M2 유전자는 개별적인 플라스미드로 조립되었다. G-투-M2 피스는 이후 리더-투-SH 플라스미드의 PacI-BamHI 윈도우에 삽입되었다. 이는 순서대로 BamHI-투-MluI 원도우에 삽입된 L-트레일러-리보자임-터미네이터 피스를 위한 수여자가 되어, 완전한 안티게놈을 생산하였다.
4개의 제한 부위 마커 (도 3)는 RT-PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머에 변화를 혼입함으로써 원재 구성 중에 안티게놈 cDNA에 도입되었다. 이는 조립을 용이하게 하고, 재조합 바이러스를 동정하는 수단을 제공하고, 감염성 RSV로 변화를 도입시키는 능력을 설명하기 위헤 행해졌다. 3개의 부위는 유전자간 영역에 있고, 4번째 부위는 비번역된 유전자 영역에 있으며, 이들은 5개의 nt 치환 및 단일 nt 삽입 반응을 포함하였다. 이는 코딩된 안티게놈의 길이를 야생형에서 총 15,223 nt까지 1개의 nt만큼 증가시켰다 (서열 번호:1, 이는 D46의 5' 내지 3' 정방향 프라이머 서열을 도시하고, 그 게놈 자체는 역방향 프라이머임; 4 위치는 G 또는 C일 수 있음을 주목해야 한다).
서열 마커는 도 3에 도시된 바대로 cDNA 코딩된 안티게놈 RNA로 삽입되었다. 서열은 상보적 선도 영역의 제1 nt에 대해 1로 번호가 매겨진 정방향 프라이머이고; 이는 각각 아군 A 및 B를 나타내는, 균주 A2와 18537 사이를 동정하고 (Johnson and Colins, J. Gen. Virol. 69:2901-2906 (1988), 본원에 참조로 혼입됨), 점으로 표시되어 있고; cDNA에서 제한 부위를 나타내는 서열은 밑줄이 그어져 있고; GS 및 GE 전사 신호는 박스가 쳐져 있으며; 1141 위치에서 N 번역 개방된 판독틀의 개시 코돈은 이택릭체로 되어 있고, 서열 마커는 각 서열 바로 아래 도시되어 있다. 맨 위 서열에서, 단일 C 잔기는 1099 위치에 삽입되어 NS2-N 유전사 사이 영역에 AflII 부위를 생성시키고, N 번역 개방된 판독틀의 바로 위 1139 및 1140 위치에서 AG는 CC로 대체되어 새로운 NcoI 부위를 생성하였다. 중간 서열에서, 각각 5612 및 5616 위치에서의 G 및 U의치환은 G-F 유전자간 영역에 새로운 StuI 부위를 생성시켰다. 또한, 도 3의 바닥 서열에서, 7560 위치에서의 C 대체는 F-M2 유전자간 영역에 새로운 SphI 부위를 생성시켰다.
모든 cDNA들은 대부분의 경우에 조립하기 전에 몇개의 독립적인 cDNA로부터 온전하게 서열화되었다. 개별적인 RSV 단백질을 코딩하는 플라스미드는 문헌 [Grosfeld et al., J. Virol. 69:5677-5686 (1995) 및 상기에 기술된 Collins et al. 문헌, 이들은 본원에 참조로 혼입되어 있음)에 기술되어 있다. 완전한 cDNA는 또한 조립된 후 온전하게 서열화되었다.
실시예 VIII
재조합 RSV의 트랜스펙션 및 회수
cDNA 발현된 안티게놈으로부터 감염성 RSV를 제조하는 본 발명의 방법은 (i) RNA 복제를 할 수 있는 안티게놈 뉴클레오캡시드를 생산하고 (ii) RNA 복제 및 전사 모두에 경쟁적인 자손형 게놈 뉴클레오캡시드를 제공하기에 충분한 RSV 단백질과의 공발현을 포함한다. 게놈 뉴클레오캡시드에 의한 전사는 모든 다른 RSV 단백질을 제공하고 생산적 감염을 개시한다.
안티게놈을 코딩하는 플라스미드 유래 cDNA는 단백질 N, P, L 및 M2 (ORF1)을 코딩하는 플라스미드와 함께 T7 RNA 중합효소를 발현시키는 최근 기술된 재조합 우두바이러스 MVA 균주로 감염되었다 (Wyatt et al., Virol. 210:202-205 (1995), 본원에 참조로 혼입됨). MVA 균주는 조류 세포에서 자유롭게 성장하는 숙주 범위 돌연변이체인 반면, 표유류 세포에서는 감염성 바이러스의 생산을 크게 감소시키는 바이러스 입자 숙성 말기 단계에 차단이 있다. HEp-2 세포에서, MVA 재조합은 T7 중합효소 및 세포 변성 수준에 대해 더욱 통상적으로 사용되는 WR-기저 재조합 (Fuerst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8122-8126 (1986))과 유사하였으나, 생성된 자손형의 수준은 충분히 낮아 상징액은 최소의 세포 변성을 갖는 신선한 세포에 계대 배양될 수 있다. 이는 트랜스펙션된 우두 바이러스 감염된 세포에서 생산될 수 있는 재조합 RSV의 회수를 용이하게 한다.
재조합 RSV의 트랜스펙션 및 회수는 하기와 같이 수행되었다. HEp-2 세포의 단일층 배양은 6-웰 디쉬의 단일 웰 당 5개의 플라스미드, 즉 안티게놈, L 및 P 플라스미드가 각각 0.4 ㎍, 및 L 및 M2 (ORF1) 플라스미드가 각각 0.1 ㎍ 를 혼합함으로써 최종 용량이 0.1 ml인 Opti-MEM (라이프 테크놀로지스) 배지로 제조된 감염-트랜스펙션 배지 1 ml를 포함하였다. 이것은 12 ㎕ LipofectAce (라이프 테크놀로지스)을 함유하는 Opti-MEM 0.1 ml와 혼합되었다. 실온에서 15분 간 배양한 후, 2% 열 불활성화된 소의 태아 혈청 및 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 재조한 MVA 균주 우두 바이러스 1.5 X 106 pfu를 함유하는 Opti-MEM 0.8 ml와 혼합되었다. 배양액을 32oC에서 배양하고 3일째 수확하였다. 32oC에서의 배양은 MVA 바이러스가 약간 온도 민감성이고 더 낮은 온도에서 더욱 더 효과적이라고 알려져 있기 때문에 사용되었다.
트랜스펙션 3일 후 맑아진 배양 상징액은 신선한 HEp-2 세포에 계대 배양되고 메틸 셀룰로즈 (이후 항체 염색을 위해) 또는 아가로즈 (플라크 분리를 위해) 위에 두었다. 메틸 셀룰로즈 하에서 5일 동안 배양한 후, 세포는 고정되고 RSV F 단백질에 대한 3개의 쥐의 단일클론성 항체 혼합물 이어서 서양 고추냉이 퍼록시다제에 연결된 항 쥐 항체를 사용하는 간접적인 서양 고추냉이 퍼록시다제 방법 이어서 문헌 [Murphy et a;., Vaccine 8:497-502 (1990)]의 일반적인 방법에 의해 염색되었다.
아마도 낮은 수준의 MVA-T7 재조합 바이러스에 기인하는 것일 세포병독성의 백그라운드에 대해 다수의 RSV 유사 플라크가 검출되었다. 플라크는 많은 양의 RSV F 단백질을 함유하고 있으며, 흑갈색 착색으로 나타나고, RSV에 특이한 세포병독 효과, 특히 합포체 형성을 나타낸다.
한천 하에서 배양된 플레이트로부터 RSC-유사 플라크를 따내어서 중성 레드로 염색하였다. 이들을 증식시켰으며 플라크 분석 및 항체 염색으로 실험실 균주인 RSV 균주 A2와 비교하였다. 감염 배양물로부터 유래한 플라크는 실험실 균주의 플라크를 상당히 닮았다. 한 가지 차이점은 감염 배양물로부터 유래한 플라크는 실험실 균주로부터 유도된 플라크에 비해 덜 명징한 중심부를 가지며 약간 작아 보인다는 것이다. 재조합 바이러스는 이 특정 야생형 분리주와 형태학적으로 상이하며, 아마도 세포간 전개(cell-to cell spread)에서 좀 더 제한되어 있으며 또한 감소된 속도의 세포 살생을 나타낸다. 방출된 바이러스의 증식에 관해서는, HEp-2 세포에서의 재조합 바이러스 대 실험실 바이러스의 수득율의 32℃ 또는 37℃에서 실질적으로 동일하였다. 예비 시험에서, 재조합 및 실험실 바이러스는 세포내 RSV mRNA 및 단백질의 축적에 관해서는 구별되지 않았다.
플라크 정제된, 3회 계대배양된 재조합 RSV를 4개의 삽입된 표지에 플랭킹하는 3쌍의 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 실험실 바이러스와 함께 분석하였다. 3개의 별개의 플라크 정제된 재조합 RSV 분리주를 감염되지 않은 대조구 배양물과 함께 증식시켰다. 청정화된 배지 상징액을 폴리에틸렌 글리콜 및 고염 (졸러(Zoller) 및 스미스(Smith) DNA 3:479-488(1984))으로 처리하여 바이러스를 침전시키고, 펠릿으로부터 RNA을 트리졸™(Trixol™)(라이프 테크놀리지(Life Technologies))로 추출하였다. 이들 RNA는 RNA를 첨가하지 않은 추가의 대조구 또는 실험실 분리주 균주 A2로부터 0.1㎍의 RNA의 추가의 대조구와 동시에 DNAse로 처리하고, 재정제하고, 50ng의 랜덤 헥사머로 각각 어닐링시키고 역전사 효소 존재 또는 부재 하에서 표준 RT 조건하에서 배양하였다 (40㎕ 반응물)(본원에 인용참증으로 삽입된 코널스(Connors)등의 Virol. 208:478-484(1995)). 세 쌍의 상이한 합성 디옥시올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 각각의 반응물의 분취액을 PCR(94℃에서 45초, 37℃에서 30초, 72℃에서 1분으로 35 사이클)하였다. 프라이머 쌍 (A):정방향(925-942 위치) 및 역방향(1421-1440 위치) 프라이머는 AflII 및 NcoI 절단 부위가 각각 NS2와 N 유전자의 접합 영역와 N 유전자 내에 각각 삽입된 516 bp의 예상된 생성물(재조합 바이러스의 경우 517bp)을 만들었다. 프라이머 쌍 (B): 정방향(5412-5429 위치) 및 역방향(5930-5949 위치) 프라이머는 G와 F 유전자 사이의 접합 영역에 삽입된 StuI 절단 영역에 걸치는 538bp의 예상 생성물을 만들었다. 프라이머 쌍 (C): 정방향(7280-7297 위치) 및 역방향(7690-7707 위치) 프라이머는 F와 M2 유전자 사이의 접합 영역에 삽입된 SphI 절단 영역에 걸치는 428bp 단편을 만들었다. 1% 한천 및 2% 저온 융해 한천을 포함한 중성 겔에서 PCR 생성물을 HaeIII 절단된 X174 DNA 분자 길이 마커(marker)와 동시에 전기영동하고 EtBr로 염색하여 가시화하여 분석하였다. 예상된 크기의 PCR 생성물이 생성되었다. 각각의 생성은 RT 단계에 의존하고, 이는 각각이 오염 cDNA 보다는 RNA에서 유래하였음을 나타낸다.
PCR 생성물을 제한 효소로 절단하여 분석하였다. 프라이머 쌍 A의 생성물의 AflII 또는 NcoI에 의한 절단은 예상된 177 및 340bp(AflII) 또는 217 및 300bp(NcoI)에 해당하는 단편들을 만들었다. 프라이머 쌍 B의 생성물을 StuI으로 절단한 것은 예상된 201 및 337bp에 해당하는 단편을 만들었다. 프라이머 쌍 C에 의한 반응물로부터의 생성물을 SphI으로 절단한 것은 예상된 147 및 281bp에 해당하는 생성물들을 만들었다. AflII로 절단되지 않은 잔여 PCR 생성물의 존재는 재절단에 의해 확인되바와 같이 불완전한 절단에 의한 것이다. 따라서, 제한 효소 절단은 재조합 바이러스를 나타내는 PCR 생성물이 예상된 제한 효소 부위 표지를 포함하는 반면, 실험실 균주를 나타내는 PCR 생성물은 그렇지 않다는 것을 보여주었다. 클론된 PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열 분석은 제한 효소 부위 표지에 걸치는 서열을 확인하였다.
표 38에 나타낸 바와 같이, N, P, L 및 M2(ORF1)에 의해 보완되었을 때, RSV 생성의 효율은 비교적 높아서, 세 번의 실험에서 0.4㎍ 유입 안티게놈 cDNA 및 1.5×106 세포 당 평균 9.9 내지 94.8의 범위였다. 이 플라크가 액체 중충으로부터 유래하였으므로, 본래의 트랜스펙션의 각각의 웰에 존재하는 감염된 세포의 수는 알 수 없었다. 거의 모든 트랜스펙트된 웰(표 38에서 56개 중 54개)이 바이러스를 생산하였다. 감염된 세포 당 방출된 RSV의 수율이 이상적인 조건하에서라도 매우 낮았기 때문에(~10 pfu), 또한 많은 웰이 이 양의 몇 배를 만들었기 때문에(169 플라크 이하), 수 개의 RSV 생성 세포가 트랜스펙트된 세포의 다수의 웰 중에 존재할 것이다.
표 38에서 나타낸 것과 같이, 플라스미드 중 하나라도 빠뜨리면 RSV는 회수되지 않았다. 그 유입 cDNA 수준이 낮다면(0.016㎍/1.5×106 세포(표 38)), M2(ORF1)에 대한 요구는 완전한 유전자 M2(ORF1+2)에 의해서도 충족될 수 있다. 높은 수준에서, 바이러스의 생산은 크게 감소하고, M2(ORF2)와 연관된 미니게놈의 생산적 감염 중에 완전한 게놈 상에서도 RNA 합성의 억제가 작용할 수 있다는 것을 제시한다.
이들 결과는 감염성 RSV의 생산이 N, P 및 L과 아울러 M2(ORF1) 단백질의 발현에 크게 의존한다는 것을 보여준다. 아울러, 비록 두 ORF를 포함한 완전한 cDNA도 RSV의 생산을 지지할 수 있지만, M2(ORF1) 발현의 최적의 방법은 ORF2가 결실된 가공된 cDNA로부터라는 것을 보여준다.
따라서, 본 발명은 본원에서 M2(ORF1)로 지칭되었으며, 종전에는 22K 또는 M2로 불린 4번째 단백질(콜린(Collins) 등, J. Virol. 54: 65-71(1985))을 요구한다는 점에서 RSV에 의한 전사는가 종전에 기술된 비분절된 역방향 RNA 바이러스의 전사와 상이하다는 것을 입증한다. M2(ORF1) 단백질은 진행하는 연속적인 전사에서 중요한 RNA 중합효소 신장 인자로 밝혀졌으며, 따라서 반드시 제공되어야 한다(예를 들어 게놈 또는 안티게놈에 의해 코딩되거나 또는 별개의 플라스미드 또는 공유된 벡터 내의 서열에 의해 트랜스로 발현됨)(예를 들어, 콜린(Collins) 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:81-85(1996) 참조). 이 요구는 본 발명의 일부로서 감염성 RSV 내로 특정한 미리 결정된 변화를 도입할 능력을 제공한다.
<표 38>
감염성 RSV의 생산은 M2 ORF 1 발현에 의존하였다
Figure 112001026244980-pct00041
*트랜스펙트된 배양물(웰 당 106 세포)로부터의 상징액을 신선한 HEp-2 세포 위에 계대배양하였으며, 메틸 셀룰로오즈로 중층하였고, 또한 F-특이적인 단일클론 항체로 염색하였다.
§하기와 같이 판독된다: 19개의 웰은 0개의 플라크를 가졌음, 2개의 웰은 각각 1개의 플라크를 가졌음, 2개의 웰은 각각 2개의 플라크를 가졌음, 또한 1개의 웰은 3개의 플라크를 가졌음.
실시예 IX
RSV 균주의 표현형 특이적 돌연변이, cpts 530을 도입하기 위해 변형된 감염성 재조합 RSV의 제조
이 실시예는 본원에서 기술된 재조합 방법을 사용하여 감염성 RSV내로 특정한 미리 결정된 돌연변이의 도입을 설명한다. 상기에서 언급된 대로, cpts530 RSV 의 완전한 뉴클레오티드 서열이 결정되었으며 또한 부모형 cpRSV에 존재하는 것으로 알려진 5개의 돌연변이가 cpts530, 아울러 약독화된 유도체에 보유되었다. 한 개의 추가의 뉴클레오티드 변화가 뉴클레오티드 (nt) 10060 위치에서 확인되었으며, 이는 거대 중합효소 (L) 단백질에서 아미노산 521 위치에서 페닐알라닐으로부터 루신으로의 변화가 생겼다(표 37, 39 참조). 이 단일 아미노산 치환은 단독으로 또는 cp 돌연변이와 함께 야생형 A2 RSV의 전장 cDNA 클론 중으로 도입되었다. 돌연변이체 cDNA로부터 회수된 감염성 바이러스의 분석은 이 단일 돌연변이가 40℃에서 HEp-2 세포 단층 배양에서의 재조합 cp530의 플라크 형성의 철처한 제한을 특징지으며 또한 온도 감수성의 수준이 cpRSV 돌연변이 존재에 의해 영향받지 않는다는 것을 나타낸다. 이들 조사 결과는 L 단백질에서 아미노산 521 위치에서 페닐알라닌으로부터 루신으로의 변환를 cpts530의 ts 표현형을 특징짓는 둘연변이라는 것을 확인하였다. 유사하게, 한 개의 추가적인 뉴클레오티드 변화가 cpts530 부모형 바이러스와 비교하여 cpts530/1009 재조합체에서 확인되었다. 이 12002 위치에서의 뉴클레오티드 치환은 야생형 바이러스에서의 메티오닌이 cpts530/1009 돌연변이 체에서 발린으로 치환된 1169위치에서의 L 에서의 아미노산 변화에 이른다. 또한 이 돌연변이는 재조합 RSV에 도입되었으며, 회수된 바이러스는 온도 민감성이었다. 이들 조사 결과는 1169 위치에서의 메티오닌에서 발린으로의 변화가 cpts530/1009의 cpts530에 비해 더 큰 수준의 온도 민감성을 특징짓는 돌연변이로 확인하였다.
530, 530/1009 및 530/1030 재조합 바이러스 중에서의 온도 민감성의 수준은 효소 분석 또는 노던 블롯 분석에 의해 관찰된 RSV-CAT 또는 RSV-루시페라아제 미니게놈(상기 참조)으로 확인되었다. 예를 들어, 37℃보다 높은 온도에서, 선택된 돌연변이에 의해 생성된 루시페라아제 활성은 야생형 L 단백질에 비해 1009, 530 및 이중 돌연변이체 pTM1-L 지지체 플라스미드에 대해 18.4%, 1.5% 및 0.4%이었다. 또한 이들 예시적인 돌연변이체는 32℃에서 야생형(wt) L 단백질과 비교하여 1009의 경우 70% 활성, 530의 경우 40% 활성, 및 530/1009 L 단백질의 경우 12.5%의 활성으로 L 기능이 감소되었다. 또한 이들 미니게놈 시스템 단독으로 또는 본원에서 기술된 재조합 바이러스 방법과 결합하여 사용하여 돌연변이의 전사 및 복제에 대한 효과가 측정될 수 있다.
<표 39>
RSV 전장 cDNA 클론에 도입된 돌연변이
Figure 112001026244980-pct00042
주의: 야생형과 돌연변이체 사이의 뉴클레오티드 차이는 해당 위치에 밑줄을 그었다. 제한 엔도뉴클레아제의 인식 영역은 이탤릭체이다. 도입된 뉴클레오티드 변화(들)이 아미노산 치환을 생성하는 코돈은 볼드체이다. 별표는 생물학적으로 유도된 돌연변이 바이러스에 존재하는 단일 뉴클레오티드 변화를 나타낸다. 번호매김 시스템은 전장 cDNA 에 삽입된 하나의 뉴클레오티드를 반영한다.
1 돌연변이가 도입된 유전자를 나타냄.
정의된 약독화된 재조합 RSV 백신 바이러스 중으로 cpts500 및 cpts1009 특이 돌연변이를 도입하기 위해서, 본원에서 기술된 cDNA-기재 회수 시스템을 다음과 같이 사용하였다. 종전에 기술된 RSV A2 야생형 전장 cDNA 클론(콜린스 등, 상기 참조 (1995))은 nt 위치 1099에서 cDNA에 단일 뉴클레오티드 C의 삽입(이는 AflII 부위를 형성함) 및 4 곳에서 총 6개의 추가 뉴클레오티드 치환을 포함하도록 본래의 구조에서 설계되었다. 따라서, 천연적으로 존재하는 바이러스 및 cDNA로부터 유래한 재조합 바이러스에 대한 뉴클레오티드 번호매김 시스템은 1099 위치 다음에 한 nt씩 어긋났다. 상기 표 36 및 37에서의 뉴클레오티드 번호 매김은 천연으로 존재하는 바이러스에 대한 위치를 나타내는 반면, cDNA 클론(표 39) 및 cDNA 클론으로부터 유래한 재조합 바이러스에 대한 뉴클레오티드 번호 매김은 한 개의 뉴클레오티드가 더 있다. 정방향 게놈 선도 서열에서 nt 4 위치에서 6개 뉴클레오티드 치환체 중 하나는 G에서 C로의 변화이다. 이 뉴클레오티드 변화는 비재조합 RSV에서 검출되었으며 또한 조직 배양물 또는 마우스에서의 바이러스 복제의 온도 민감성에 대해 영향을 주는 것으로 밝혀지지 않았다(본원에 참증으로 삽입된 파이어스톤(Firestone) 등의 Virology, 225:419-522(1996)). 표 39는 이 실시예 및 이후의 실시예들에서의 RSV cDNA 중으로 삽입된 다양한 돌연변이들을 나열하고 있다.
중간체 클론(D50 및 D39)는 정방향 RNA 안티게놈을 코딩하는 전장 RSV cDNA 클론 D53을 어셈블하기 위해 사용되었다(도 4). D50 플라스미드 선도서열부터 T7 프로모터의 M2-L 중첩부위까지의 RSV 게놈을 포함하는 반면, D39 플라스미드는 전장 L 유전자 및 트레일러(trailer) 뒤를 따르는 BamHI 및 MluI 제한 부위가 경계에 위치한 헤머헤드(hammerhead) 리보자임 및 두 개의 T7 종결자를 코딩한다. 감염성 바이러스를 얻기 위해 트랜스펙션에서 사용된 전장 RSV cDNA 클론(D53)은 D39 플라스미드의 BamHI-MluI 단편을 D50 플라스미드 중으로 삽입하여 어셈블되었다(각각이 인용참증으로 삽입된 미국 특허 출원 공개 제08/720,132호 및 PCT 출원 공개 제PCT/US96/15524호 참조). 돌연변이 유발을 용이하게 할 목적으로 각각 파지미드 플라스미드에 위치한 수 개의 조각으로 D50을 더 분리하였다: 한 조각은 N 유전자을 포함한 XbaI-EcoRI 단편(cDNA pUC118.D50N)이었으며, 한 조각은 F 및 M2 유전자를 포함한 StuI-BamHI 단편(pUC118.F-M2)이었다. D39는 각각 별개의 파지미드 플라스미드 중에 위치한 두 개의 조각으로 더 분리하였다. 한 조각(좌측 반편, cDNA pUC119.L1)은 BamHI 위치로부터 뉴클레오티드 12255의 PmlI 위치까지이며(본원 전체를 통해 제한 뷔위에 부여된 서열 위치는 설명적인 가이드로 의도되었으며 단독으로는 관여된 전체 뉴클레오티드를 정확히 정의하지 않음에 유의할 것), 다른 하나(우측 반편, pUC119.L2)은 PmlI 부위부터 T7 종결자 말단까지이다.
pUC118- 및 pUC119-기재 구조체 중으로 위치된 돌연변이는 도 4의 아래쪽 줄에 표준 방법에 따라 설명되어 있다(예를 들어 본원에 참증으로 삽입된 쿤켈(Kunkel) 등의 Methods Enzymol, 54:367-382(1987) 참조). 이 플라스미드는 대장균 dut ung 균주, 이 경우 CJ236 내에서 증식하였으며, 단쇄 DNA가 헬퍼 파지, 이 경우 M13KO7의 감염에 의해 제조되었다. 각각 목적하는 하나 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함한 인산화된 합성 올리코뉴클레오티드를 제조하였으며, 단독으로 또는 함께 단일 가닥 주형에 어닐링하였으며, T4 DNA 중합효소에 의한 DNA 합성을 지시하도록 사용되었다. 생성물을 연결하였으며 비-dut ung 대장균 균주, 이 경우 DH6알파 또는 DH10B 안으로 형질전환하였다. 형질전환체 콜로니의 미니프렙 DNA을 돌연변이 유발된 영역의 제한 효소 절단 또는 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 돌연변이의 존재를 스크린하였다. 적절한 돌연변이를 포함한 단편을 pUC 구조체로부터 D50 또는 D39 플라스미로 다시 옮겼으며, 이는 다시 D53으로 지칭된 전장 클론 중으로 어셈블되었다. 상기에서 기술된 N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질을 코딩하는 4 종의 지지 플라스미드의 혼합물로 D53 플라스미드를 보완하여 HEp-2 세포에서 재조합 바이러스를 회수하였다.
4가지 유형의 돌연변이가 생물학적으로 유도된 돌연변이를 도입하는 특정 재조합 RSV를 기술하는 이 실시예 및 후속 실시예에 관여한다(표 36, 37, 39 참조):
(1) 돌연변이의 제1군은 총체적으로 "부위" 돌연변이로 불리는 L 유전자 중으로 도입된 6개의 번역에서는 잠재성인 신규 제한 부위 표지를 포함한다. 6개의 위치는 Bsu36I, SnaBI, PmeI, RsrII, BstEII 및 두번째 하류 SnaBI 부위이며, D53 도표 위의 도 4 중에 밑줄로 표시하였다. 이들 6개의 변화는 총체적으로 "부위" 돌연변이로 지칭되며, cDNA 구조화를 용이하게 할 목적으로 삽입되었다. 또한, 재조합은 D53 플라스미드와 지지 플라스미드, 즉 N, P, M2(ORF1) 및 L 플라스미드 사 이의 트렌스펙션 중에 일어날 수 있는 것으로 알려졌다(본원에 인용참증으로 삽입된 가르신(Garcin) 등의 EMBO J. 14:6087-6094(1995)). L 내의 이들 제한 부위는 D53 구조체 중에는 위치하지만, L 지지 플라스미드 중에는 위치하지 않으며, 따라서 L 내에서 재조합이 일어나지 않음을 확인하기 위한 표지를 제공한다. 다수의 약독화 돌연변이가 L 내에서 일어나므로 이는 특히 중요하다.
(2) 돌연변이의 제2군은 F 유전자 내의 두 개의 아미노산 변화를 포함한다(도 4, 표 39). cpRSV 및 따라서 그 모든 유도체는 HEK-7로 불리는 야생형 바이러스로부터 유도되었다. 본래의 D53 cDNA 서열은 7번째 위치의 단일 뉴클레오티드 치환이라는 점에서 HEK-7과 상이하였다. 그 하나는 뉴클레오티드 4로, 이는 본래의 D53 중의 C (역방향에서) 및 HEK 바이러스 중의 G이다. 그러나, 생물학적으로 유도된 바이러스는 두 지정 중 하나를 포함하는 것으로 보이고, 둘 사이에서 변화할 수 있으며, 따라서 이 차이점은 부수적인 것으로 여겨지며 여기서 더 이상 고려되지 않았다. 4개의 다른 뉴클레오티드 치환체는 아미노산 수준에서 잠재성이었다: 이들은 F에서 6222 및 6387에서 두 개의 변화로, 하나는 7560 위치에서 F-M2 유전자간 영역에서, 또 하나는 10515 위치의 L에서의 두 개의 변화였다. 또한 이들은 중요한 것으로 생각되지 않으며, 더 이상 고려되지 않았다. 마지막으로, 이 F 유전자 내에 각각 두 개의 뉴클레오티드 치환이 있었으며, 각각은 아미노산 치환을 생성하였다. 이들 두 개의 변화는 총체적으로 "HEK" 지정으로 불리며, D53에 도입되어 코딩된 재조합 야생형 바이러스가 생물학적으로 유도된 cpts 돌연변이체의 HEK-7 야생형 부모형과 아미노산 수준에서 동일하게 된다. 또한 이들 변화 각 각은 회수된 바이러스는 물론 cDNA에 도입된 돌연변이의 존재를 관측할 목적으로 새로운 제한 효소 인식 부위를 도입하기 위해 설계되었다는 것을 주목해야 한다.
(3) 돌연변이의 제3군은 총체적으로 "cp" 돌연변이로 불리는 cpRSV 바이러스 중에서 발견되는 5개의 아미노산 치환을 포함한다. 이들은 모든 생물학적으로 유도된 cpts 바이러스 중에 존재하며 표현형의 약독화에 기여한다. 생물학적으로 유도된 cpRSV 중에서, 이들 아미노산의 각각의 변화는 단일 뉴클레오티드 변화에 의한 것이다. 표 39에 나타낸 것과 같이, 재조합 바이러스를 만들기 위한 아미노산 코딩 변화가 cDNA에 도입되었을 때, 5번 중의 4번은 각각의 코딩 변화가 두 개의 뉴클레오티드 치환을 포함하도록 만들어졌으며, 이는 야생형으로의 복귀돌연변이에 대해 재조합 RSV가 상당히 내성을 나타내게 만들었다. 이들 변화 중 4개는 새로운 제한 효소 부위를 도입하기 위해 고안된 반면, 5번째 변화는 존재하는 부위 하나를 제거하도록 고안되었으며, 따라서 재조합 바이러스로부터 생성된 cDNA 또는 PCR 생성물 중에서 제한 부위의 존재 또는 부재에 의해 돌연변이의 존재를 관찰할 수 있는 방법을 제공한다는 것을 주목해야 한다.
(4) 돌연변이의 제4군은 이들이 회득된 생물학적 단계 후에 명명된 개별적인 생물학적으로 유도된 cpts 바이러스에 대해 특이적인 점 돌연변이를 포함한다(표 39, 도 4). 예를 들어, 하기 실시예에서 cpRSV로부터 cpts248/404 바이러스의 유도는 두 단계 돌연변이 유도를 포함하였다. 첫번째 돌연변이 유도는 cpts248바이러스를 생성하였으며, 이는 이후 248 돌연변이로 불리는 단일 아미노산 변화를 유지하였다. 두번째 돌연변이 유도 단계는 cpts248에 적용되었으며, cpts248/404 바 이러스를 생성하였고, 이는 404(L) 돌연변이로 불리는 L 내의 하나의 아미노산 변화 및 404(M2) 돌연변이로 불리는 M2의 유전자 개시(GS) 신호서열 내의 뉴클레오티드 변화를 포함하였다. 나머지 돌연변이, 즉 530, 1009 및 1030 각각은 단일(상이한) 아미노산 변화를 포함하였다. 404(M2) 돌연변이는 주목할만한데, 이는 이것이 GS 전사 신호서열을 포함하기 때문이며(또한 단백질 코딩 서열을 포함하지 않으며), 또한 이 돌연변이가 mRNA 합성에 중요한 미니게놈 시스템 중에 나타났기 때문이다(본원에 인용참증으로 삽입된 쿠오(Kuo) 등의 J. Virol. 71:4944-4953(1977)). 표 36, 37 및 39에서 약술한 바와 같이, 향상된 유전적 안정성을 목적으로 248, 404(L) 및 1009 돌연변이의 아미노산 코딩 변화가 두 개의 뉴클레오티드 치환을 사용하여 재조합 바이러스 중으로 삽입되었다. 또한, 재조합 바이러스에서 248, 404(M2), 404(L) 및 1009 돌연변이 각각은 관측 목적으로 새로운 제한 부위를 도입하도록 고안된 반면, 1030 돌연변이는 하나의 존재하는 부위를 제거하기 위해 고안되었다.
본 실시예에서, 수 개의 pUC118- 및 pUC119-기재 구조체가 D50 및 D39 플라스미드로부터 유도되었으며, 목적하는 돌연변이가 이들 구조체에 도입되었다(도 4, 5). 나타낸 것과 같이 적절한 돌연변이를 포함한 단편이 pUC 구조체로부터 D50 또는 D39 플라스미드 중으로 다시 옮겨졌으며, 이는 다시 전장 클론으로 어셈블되었다. 이 방식으로 6개의 상이한 유형의 D53 전장 유도체 클론이 생성되었다(도 4, 5). 도 5에서, D53 구조체는 F 내에 두 개의 HEK 돌연변이가 결여되었다(도 4 참조).
뮤타-진
Figure 112001026244980-pct00043
(Muta-Gene
Figure 112001026244980-pct00044
) 파지미드 시험관내 돌연변이유도 키트(캘리포니아주 허큘레스(Hercules) 소재 바이오-라드(Bio-Rad)사)를 사용하여 제조자에 의해 추천된 방식으로 돌연변이 유도를 수행하였다. 돌연변이 유도된 구조체를 수용성(competent) 대장균 DH10B(라이프 테크놀로지사)으로 형질전환시켰다. 형질전환체 콜로니의 미니프렙 DNA를 돌연변이 유도된 영역의 제한 효소 절단(하기 참조) 또는 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 돌연변이의 존재를 스크린하였다.
6개의 번역에서 잠재적인 제한 효소 표지, 530 돌연변이(521phe→leu), 및 5 cp 돌연변이(표 39)가 pUC-기재 구조체에 도입되었으며, 도 4 및 도 5에 나타낸 것과 같이 D50 및 D39 플라스미드 중으로 서브클론되었다. 다양한 전장 cDNA 구조체가 상기 언급된 돌연변이의 상이한 조합을 포함한 D50 및 D39 구조체를 사용하여 어셈블되었다.
최종 cDNA 구조체에서 530 및 cp 돌연변이의 존재를 서열 분석으로 확인한 반면, 잠재적 제한 부위의 존재는 제한 엔도뉴클레아제 분석에 의해 측정하였다. 각각의 D53-기재 구조체를 다양한 제한 효소(예를 들어, HpaI, AccI, HindIII, PstI)를 사용하여 분석하였으며, 새로 생성된 전장 cDNA 클론의 제한 패턴을 이전에 회수된 야생형 전장 cDNA 클론의 그것과 비교하였다. 이 제한 분석은 전장 플라스미드의 세균성 증폭 중에 100nt 이상의 삽입 또는 결실이 일어났는지를 측정하기 위해 사용되었다.
트랜스펙션을 종전에 기술된 대로(인용참증으로 삽입된 콜린스 등의 Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92:11563-11567(1995)) 수행하였다. 간단히 말해, HEp-2 세포의 단층을 T7 RNA 중합효소를 발현하는 재조합 우두 바이러스 MVA 균주(MVA-T7)로 1 MOI로 감염시켰으며, 리포펙트ACE(LipofectACE)(라이프 테크놀로지사)를 사용하여 D53 안티게놈 구조체 및 N, P, L 및 M2(ORF1)pTM1 지지 플라스미드로 트랜스펙션하였다. 3일째에, 회수된 바이러스의 증폭을 위해 상징액(청정화된 배지)를 신선한 HEp-2 세포 상으로 계대 배양하였다. 이 첫번째 증폭으로부터 바이러스 상징액을 감염 및, 이어서 HEp-2 세포 상의 다양한 농도의 접종 후에 5일째에 회수하였으며 플라크 계산을 위해 메틸셀룰로오즈로 중층하거나 또는 플라크 수집 및 생물학적 클로닝을 위해 한천으로 중층하였다. 플라크 계산은 종전에 기술된대로(본원에 인용참증으로 삽입된 머피(Murphy) 등의 Vaccine, 8:497-502(1990)) 단일클론 항체-고추냉이 과산화효소 염색 방법을 사용하여 수행하였다. 회수된 재조합 바이러스는 3회 연속 플라크 정제에 의해 생물학적으로 클론되었으며, 이후 HEp-2 세포 상에서 2회 계대 배양 후에 바이러스 상징액을 생성하는 데 사용되었다. RSV의 전장 cDNA를 나타내는 플라스미드와 RSV 유전자를 포함한 지지 플라스미드 사이의 구제(rescue)의 첫 단계 중 재조합이 일어날 수 있으므로, 회수된 바이러스의 균일한 개체군을 보증하기 위해 생물학적 클로닝이 중요하다(본원에 인용참증으로 삽입된 가르신(Garcin) 등의 EMBO J., 14:6087-6094(1995)). 이들 생물학적으로 클로닝되고 증폭된 상징액을 재조합 바이러스의 추가의 분자 유전학적 또는 표현형 특성확인에서 사용하였다. 두 종의 생물학적으로 클론된 재조합 바이러스가 cpL530-부위 및 cp530-부위를 제외하고 각각의 cDNA 구조체에 대해 생성되었으며(도 5), 단 하나의 생물학적인 클론에 대해 생성되었다. 각각의 경우, 시스터(sister) 클론이 있을 경우, 이들은 하기에서 기술된 유전학적 및 생물학적 분석을 기준으로 분간할 수 없었다. D53-530-부위(별법으로는 A2 ts530-s cl1cp, 또는 ts530-부위로 지칭됨)에 해당하는 상술한 구조체의 대표적인 예를 부다페스트 조약 규정하에 ATCC 에 기탁하였으며, 기탁번호 VR-2545를 부여받았다.
상기에서 기술된 대로 생성된 재조합 RSVs는 이들이 실제로 각각 도입된 돌연변이를 포함하고 있는지를 측정하기 위해 유전학적으로 특성을 밝혔다. HEp-2 세포의 단층을 생물학적으로 클론된 재조합 바이러스로 감염시키고, 총 RNA를 감염 후 4 내지 5일 후에 상기에서 기술된 대로 수집하였다. 거의 전장의 재조합 RSV 게놈을 나타내는 3개의 단편을 생성하기 위해, 어드밴티지™(Advantage™) cDNA PCR 키트(캘리포니아주 팔로알토 소재의 클론테크 랩. 인크.(Clontech Lab. Inc.))를 사용한 PCR 중에서 랜덤 헥사머 프라이머 및 생성된 cDNA를 주형으로 RT를 수행하였다. PCR 단편은 nt 위치 1-5131, 5949-10751 및 8501-15179의 RSV 게놈에 해당하였다. 또한, nt 위치 9665 내지 10209 사이의 530 돌연변이의 영역 중의 L 유전자의 일부를 나타내는 544bp 단편을 생성하였다. 이 짧은 PCR 단편은 회수된 재조합 바이러스 중의 530 돌연변이의 존재 또는 부재를 확인하기 위해 사이클 서열 분석(오하이오주 클리브랜드 소재, USB사의 71001 델타 TAQ™* 사이클 시퀀싱 키트를 사용)에서 사용한 반면, 큰 PCR 생성물은 잠재적 제한 표지의 존재 및 특정 제 한 부위에 의해 표지되는 cp 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 제한 효소 절단에서 사용하였다.
상기 방법에 따라 생성된 재조합 RSV들이 목적한 표현형, 즉 삽입된 서열 변화(들)에 의해 특정된 표현형을 도입하였는지를 확인하기 위해, 재조합 RSV들 및 비재조합 대조구 바이러스의 플라크 형성 효율(EOP)을 측정하였다. 구체적으로는, 온도 조절된 수조에서 HEp-2 단층 배양을 사용하여 32, 37, 38, 39 및 40℃에서 종전에 기술된 대로(각각이 본원에 인용참증으로 삽입된 크로웨(Crowe) 등의 Vaccine, 11:1395-1404(1993); 파이어스톤 등의 Virology 225:419-522(1996)) 플라크 역가측정을 수행하였다. 플라크 확인 및 계수는 상기에서 나타낸 대로 항체 염색을 사용하여 수행하였다.
재조합 바이러스 및 야생형 및 생물학적으로 유도된 돌연변이 cpts530 바이러스의 온도 민감성 수준을 표 40에 나타내었다. 이들 데이타는 잠재적 제한 부위 또는 cp 돌연변이의 도입이 ts 표현형을 부여하지 않는다는 것을 보여두었다. 후자의 관측은 cpRSV가 ts*바이러스라는 발명자들의 종전의 조사 결과(크로웨 등의 Vaccine, 12:691-699(1994))와 일치하였다.
<표 40>
다양한 온도에서 재조합 및 생물학적으로 유도된 바이러스의 HEp-2 세포 중 에서의 플라크 형성 a 의 효율 비교
Figure 112001026244980-pct00045
a 표시된 온도(℃)에서 5일간 반고체 중충 하의 HEp-2 세포 상의 플라크 역가 측정에 의해 다양한 RSV 균주의 플라크 형성 효율을 측정하였다.
b 바이러스 역가는 2회 실험의 평균, r-부위 및 r cp-부위의 경우는 1회 실험으로부터 얻은 데이터.
c 생물학적으로 유도된 대조군 바이러스
상기 조사 결과는 생물학적으로 유도된 cpts530 바이러스의 ts 표현형이 이약독화된 RSV 균주에 독특한 상기에서 확인된 단일 돌연변이에 의해 특정화된다는 것을 확인하였다. 이와 관련하여 A2 양생형 ts * 부모형 바이러스의 전장 cDNA 클론 중으로 530 돌연변이의 도입 후 530 돌연변이를 가진 ts 재조합 바이러스의 회수에 의해 cpts530 균주의 유전학적 분석을 확인하였다. 530 및 cp 돌연변이를 포함한 이 재조합 바이러스 및 추가 재조합 바이러스의 온도 민감성 수준의 분석은 530 돌연변이에 의해 특정화된 온도 민감성 수준이 다섯 개의 cp 돌연변이에 의해 영향받지 않는다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 530 돌연변이가 그 cpRSV 부모형에 비해 모델 숙주에서 cpts530 바이러스의 추가의 약독화를 가진 ts 표현형 특이적인 돌연변이인 것을 확인하였다(각각이 본원에 인용참증으로 삽입된 크로웨 등의 Vaccine, 12:783-90(1994), 크로웨 등의 Vaccine, 13:847-855(1995))
상기 조사 결과에 추가하여, 재조합 RSV 중으로 cpts 돌연변이와 함께 1009 돌연변이 또는 1030 돌연변이의 도입은 각각의, 생물학적으로 유도된 cpts530/1009 및 cpts530/1030 RSV 돌연변이의 온도 민감성과 동일한 수준의 온도 민감성을 가진 재조합체를 생성하였다.
상기 조사 결과는 생약독화된 RSV 백신의 개발을 위한 본 발명의 재조합 방법 및 RSV 클론의 중요한 장점을 예증한다. 선택된 돌연변이의 재조합 RSV 중으로 삽입은 RSV A2 cDNA 클론으로부터 돌연변이의 회수와 마찬가지로 비교적 효율적이었다. 이 실시예에서 사용된 안티게놈 cDNA 클론은 6개 뉴클레오티드 치환 및 한 개의 뉴클레오티드를 포함하여 5개 좌에서 변화를 포함하도록 본래의 구조체에서 변형되었다. 또한 돌연변이 유도된 바이러스는 24개의 추가의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 추가의 12개 좌에서 돌연변이를 포함하는 것으로 기술되었다. 단지 530 돌연변이만이 조직 배양물에서 검출될 수 있는 표현형을 부여한다는 사실은 이 거대 RNA 게놈의 조작의 상대적인 용이성을 나타낸다. 지지 플라스미드와 전장 클 론 사이의 재조합이 우두 바이러스 효소에 의해 매개되어 일어날 수 있지만(가르신 등, EMBO J., 14:6087-6094(1995)), 여기서 분석된 10종의 각각의 바이러스가 그 유래된 cDNA 클론 중에 돌연변이를 보유한다는 점에서 그 빈도가 매우 낮다. 따라서, 목적하는 수준의 약독화를 달성하기 위해 순차적인 방식으로 RSV 중에 추가의 약독화 돌연변이를 도입하는 것이 상당히 용이하다.
약독화 돌연변이의 직접적인 확인을 위한 본 RSV 회수 시스템의 입증된 사용 및 재조합 RSV의 조작에 대한 확립된 성공은 생 감염성 RSV 클론 중으로의 다른 목적하는 돌연변이의 확인 및 삽입을 허용한다. 임상 연구 및 cpRSV 바이러스의 서열 분석으로부터의 종전의 조사 결과는 cpRSV 중에 존재하는 5개의 비-ts 돌연변이 세트가 혈청반응양성인 인간에 대한 약독화 돌연변이라는 것을 암시하였다 (각각이 본원에 인용참증으로 삽입된 콘노스(Connors)등의 Virology, 208:478-84(1995), 파이어스톤 등의 Virology, 225:419-522(1996), 프라이데왈드(Friedewald) 등의 JAMA, 203:690-694(1968), 킴(Kim) 등의 Pediatrics, 48:745-755(1971)). 이들 및 다른 돌연변이는 본원에서 기술된 방법을 사용하여 약독화된 및(또는) ts 표현형에 대한 그 확인된 특이성에 대해 선택되었으며, 이후 약독화 돌연변이의 메뉴 중으로 어셈블될 수 있다. 이들 및 다른 약독화 돌연변이, ts 및 비-ts 양자는 이후 약독화 및 면역성 사이에 적절한 균형을 위해 선택된 생 약독화된 바이러스를 생산하기 위해 RSV A2 야생형 바이러스 중으로 도입될 수 있다. 이러한 점에서, 530 및 다른 확인된 ts 돌연변이가 인간에서 RSV에 대한 방어적 면역 반응을 유도하는 G 및 F 당단백질 중에 있지 않았다는 것이 유리하였다. 이는 F 및 G 당단백질이 RSV 아 군 B 또는 역학적으로 분기된 아군 A 균주의 A2 F 및 G 당단백질 대신 사용될 수 있는 F 및 G 외측에 돌연변이를 가진 약독화된 RSV cDNA 골격이 cDNA 기질로 사용되는 개발을 허용한다. 이 방식으로, 아군 A 균주 내의 항원 연속 변이에 적응할 수 있도록 생 약독화된 RSV 백신이 급속히 갱신될 수 있으며, 또한 아군 B 백신 성분이 재빨리 제조될 수 있다.
실시예 X
RSV 균주 cpts 248/404의 표현형 특이적인 돌연변이를 도입하기 위한 변형된 감염성 재조합 RSV의 제조
이 실시예는 본원에세 기술된 재조합 방법 및 물질을 사용하여 감염성 RSV 중으로 미리 결정된 약독화 돌연변이를 도입하기 위한 추가의 설계를 설명한다.
또한 RSV A2 cpts248 돌연변이의 종전의 서열 분석은 L 유전자 중의 단일 돌연변이, 아미노산 위치 831에서 글루타민으로부터 루신으로의 치환을 확인하였다(표 39, 본원에 인용참증으로 삽입된 크로웨 등의 Virus Genes, 13:269-2273(1996)). 이 돌연변이는 본원의 방법에 의해 약독화 및 ts인 것으로 확인되었다. 추가의 약독화된 RSV 돌연변이 cpts248/404의 서열 분석은 두 개의 추가 돌연변이, M2 유전자 개시 서열 중의 nt 변화 및 L 단백질 중의 아스파르트산에서 글루타민산으로의 아미노산 치환을 밝혀냈다(표 39, 본원에 인용참증으로 삽입된 파이어스톤 등의 Virology, 225:419-522(1996)).
생물학적으로 유도된 약독화된 RSV 균주 cpts248/404는 상기에서 기술된 방법에 따라 재조합 바이러스 (rA2cp/248/404)로 재구성되었다. rA2cp/248/404 바이 러스를 코딩하는 cDNA D53은 HEK, cp, 248 및 404 부위 변화의 삽입에 의해 구성되었다(표 39). 재조합 바이러스 (rA2cp/248/404)를 회수하였으며, 플라크를 정제하고 증식시켰다. 재조합 바이러스 중의 돌연변이의 존재를 바이러스 RNA의 RT-PCR로 분석하고, 제한 효소 절단 또는 뉴클레오티드 서열 또는 둘 다를 수행하였다. rA2cp/248/404 재조합체를 pTMLwt 또는 pTM248/404 지지 플라스미드 중 하나를 사용하여 회수하였으며, 이 중 후자는 생물학적으로 유도된 cpts248/404 돌연변이 중에 존재하는 L에 모든 돌연변이를 포함하였다(표 39, 530, 1009, 또는 1030 바이러스에 특이적인 돌연변이는 포함하지 않음). pTML248/404의 지지 플라스미드로의 사용은 지지 플라스미드와의 상동 재조합에 의한 전장 클론 중에 존재하는 248/404 돌연변이의 결실을 배재하였다.
재조합 바이러스를 부위들 및 HEK 돌연변이만이 존재하는 D53 DNA로부터 회수하여 이들 변화가 예상된 바와 같이 실제로 표현형에서는 잠재성이라는 것을 입증하였다. 부위들, HEK 및 cp 돌연변이를 포함한 재조합 바이러스를 회수하여서 cp 돌연변이로 특정되는 표현형을 평가하였다. 또한, 표 41에 나타낸 바와 같이, 부위들, HEK 및 cp 백그라운드와 함께 (i) 248 돌연변이(rA2cp/248), (ii) 두 개의 404 돌연변이(rA2cp/404); 및 404(M2) 돌연변이(rA2cp/404(M2)) 및 404(L) 돌연변이(rA2cp/404(L))를 포함한 별개의 바이러스를 구성하였다.
이들 바이러스는 동시에 32℃, 36℃, 37℃, 38℃, 및 39℃에서 HEp-2 세포 중에 플라크를 형성하는 능력을 평가하였다. 이 비교는 모든 바이러스가 32℃에 서 모든 바이러스가 플라크를 형성한다는 것을 나타내었으며, RSV의 개별적인 제조 중에서 일반적으로 나타나는 실험 편차 범위 내에 있는 각각 약 3 log10 단위 내의 다양한 바이러스 제조의 역가를 나타내었다. 첨가된 "부위들" 및 HEK 돌연변이의 야생형 재조합 바이러스 중으로의 도입(바이러스 rA2를 생성함)은 생물학적으로 유도된 야생형 바이러스(바이러스 A2 wt)와 비교하여 증가된 온도에서 성장할 수 있는 능력과 관련하여 바이러스를 변화시키지 않는다. 또한 cp 돌연변이의 추가적인 도입(바이러스 rA2cp를 생성함)도 증가된 온도에서 성장할 수 있는 능력을 변화시키지 않는다. 이는 예상된 결과인데, 왜냐하면 그로부터 돌연변이가 유도된 생물학적으로 유도된 cpRSV는 ts 표현형을 가지지 않으며, 그 돌연변이는 숙주 범위 다양성이기 때문이다. L 내의 404 돌연변이는 ts 돌연변이로 보이지 않는데, rA2cp/404(L)이 ts가 아니기 때문이다. 그러나, 이 돌연변이는 본원의 방법에 따른 추가 분석에 의해 측정될 수 있는 것과 같이, 다른 방법으로는 약독화형인 것으로 입증될 수 있다. 따라서, cpts248/404 바이러스 중의 두 개의 특이적인 돌연변이는 ts이다. 248 및 404 돌연변이의 추가 첨가(rA2cp/248/404 바이러스를 생성함)는 36-37℃에서 형성되는 핀포인트(pinpoint) 플라크과 함께, 상기 온도에서 플라크를 형성할 수 있는 능력이 크게 감소된 것으로 입증된 것과 같이 그 생물학적으로 유도된 동등한 바이러스에 실질적으로 동등한 ts 표현형을 생성한다. 다양한 돌연변이가 도입된 이들 재조합 바이러스는 조직 배양물 중의 성장에 대해 영향을 미치지 않는 것으로 예상되었으며, 추가 돌연변이들은 ts 표현형을 부여하는 것으로 예상되었다. 각각의 유형의 돌연변이는 이들 예상과 일치하는 결과를 생성하였 으며, RSV 게놈이 상당히 예상할 수 있는 방식으로 조작될 수 있다는 것을 입증하였다.
<표 41>
선택된 RSV 돌연변이체의 플라크 형성 효율
Figure 112001026244980-pct00046
1 재조합(r) 바이러스는 HEp-2 세포에서 플라크 정제되고 증식되었다. 재조합 및 생물학적으로 유도된 바이러스의 스탁(stock)은 동량의 pfu/ml을 포함하도록 조정되었음에 유의해야 한다: 여기서 나타낸 변이 수준은 플라크로부터의 증식 초기 단계에서 RSV 분리주에 일반적인 것이다. 각각의 재조합 바이러스는 L-유전자 부위 및 F-유전자 HEK 돌연변이를 포함한다. "트랜스펙턴트" 행 중의 코드는 트랜스펙션 및 플라크력을 말한다.
2 생물학적으로 유도된 바이러스: A2 wt 및 cpts248/404(WLVP L1610B-150).
3 핀포인트 플라크 크기
표 41은 248 및 404 돌연변이 유도 단계에 특이적인 돌연변이의 추가 특성기술을 나타낸다. 구체적으로, 바이러스는 (i) 248 돌연변이(바이러스 rA2cp/248를 생성함), (ii) 두 개의 404 돌연변이(바이러스 rA2cp/404), 또는 404(M2) 돌연변이(바이러스 rA2cp/404(M2)) 추가와 함께 부위들, HEK 및 cp 백그라운드를 사용하여 구성되었다(표 39). 이들 돌연변이의 직접적인 확인이 ts라면, 이들 3종의 바이러스 각각은 ts 표현형을 나타낸다.
248 돌연변이는 낮은 수준의 온도 민감성을 제공하는 반면, 404(M2) 돌연변이는 매우 ts하고 404(L) 돌연변이 추가에 의해 강화되지 않았다. 이 돌연변이가 전사 개시, 또는 유전자 시작(GS) 신호 서열에서의 점 돌연변이이며, 이 유형의 돌연변이가 이제까지 ts로 나타난 적은 없었다는 점에서, 404(M2) 돌연변이가 ts라는 점은 주목할 만하였다.
실시예 XI
다중 약독화된 부모형 바이러스로부터 미리 결정된 약독화 돌연변이를 겸비한 재조합 RSV의 구조화
본 실시예 11은 생물학적으로 유도된 한 RSV 균주(구체적으로는 cpts248/404) 및 다른 RSV 균주 (cpts530)으로부터 추가의 약독화 돌연변이로부터 3개의 약독화 돌연변이를 도입하는 다중 약독화된 재조합 RSV(rA2cp/248/404/530)을 생산하기 위한 결합 설계을 설명한다. 이 재조합 RSV는 다중 돌연변이가 백신 균주의 추가의 약독화된 표현형에 기여하고 향상된 유전학적 안정성을 제공하는 RSV 백신에서의 약독화 수준을 미세하게 조정하기 위해 단계별 약독화 돌연변이를 설계하기 위한 본 발명의 방법을 예시한다.
부위들, HEK, cp, 248, 404 및 530 변화를 포함한 D53 cDNA를 구성하기 위해 상기 실시예 IX 및 X의 cDNA 및 방법을 사용하였다(표 39). 이는 4개의 별개의 생물학적으로 유도된 바이러스, 즉 cpRSV, cpts248, cpts248/404 및 cpts530으로부터의 약독화 돌연변이의 결합을 포함하였다. 재조합 바이러스 (rA2cp/248/404/530)를 회수하였으며, 플라크를 정제하고 증폭하였다. 돌연변이의 존재를 바이러스 RNA의 RT-PCR를 한 후 제한 효소 절단 또는 뉴클레오티드 서열분석 또는 둘 다에 의해 분석하였다. rA2cp/248/404/530은 L에 248 돌연변이를 결여하였으나, 530 돌연변이 및 다른 248/404 돌연변이를 보유하였다.
rAcp/248/404 바이러스를 상기에서 기술된 32℃, 36℃, 37℃, 38℃ 및 39℃에서 HEp-2세포에서 플라크를 형성할 수 있는 능력을 평가하였다(표 41). 모든 바이러스는 32℃에서 플라크를 형성하였으며 이 온도에서 성장률 면에서 야생형과 유사하였다. rAcp/248/404/530 바이러스는 ts 표현형에 관해서 생물학적으로 유도된 cpts248/404 바이러스와 실질적으로 동등하였으며, 37℃에서 플라크를 형성할 수 있는 능력이 크게 손상된 것으로 입증되었다. 따라서, 530 돌연변이의 rAcp/248/404 백그라운즈에 대한 530 돌연변이의 추가는 그 ts 표현형을 증가시키지 않았으나, 재조합체는 L에서 248 돌연변이가 결여되었었다.
이 실시예 및 상술한 실시예들에 기초하여, 본 발명은 생물학적으로 유도된 RSV 돌연변이, 예를 들어 248, 404, 530, 1009 또는 1030 생물학적인 돌연변이로부터 확인되고 입증된 돌연변이의 세트로부터 두 개 이상의 ts 돌연변이를 포함한 폭넓은 다양한 재조합 바이러스의 회수를 허용한다. 이러한 재조합 바이러스의 예는 248/404/530 돌연변이, 248/404/1009 돌연변이, 248/404/1030 돌연변이, 248/404/530/1009 돌연변이, 248/404/530/1030 돌연변이, 248/404/530/1030 돌연변이의 조합 또는 본원에서 기술된 약독화 돌연변이의 다른 조합을 가진 RSV를 포함한다. 아울러, 생물학적으로 유도된 RSV 돌연변이체로부터 확인된 하나 이상의 ts 돌연변이를 삽입하는 재조합 RSV는 약독화 유전자 결실 또는 RSV 유전자 발현을 조절하는 돌연변이와 같은 본원에서 기술된 다른 돌연변이와 결합될 수 있다. 이러한 실시예의 하나는 재조합 클론에서 248/404 돌연변이와 SH 유전자 결실을 결합하는 것으로, 이는 생 백신 후보를 만든다. 다른 조합 돌연변이의 숙주가 또한 제공될 수 있으며, 이는 생물학적으로 유도된 RSV로부터 하나 이상의 어떠한 ts 돌연변이라도 삽입할 수 있고 또한 유전자 또는 유전자 분절의 결실, 치환, 첨가 및(또는)재조합과 같은 본원에서 기술된 하나 이상의 다른 돌연변이라도 삽입될 수 있다. cp 돌연변이는 ts 돌연변이를 약독화시킨다기보다는 숙주 범위를 약독화시키는 것으로, 이는 또한 본 발명의 범위 내에 있는 하나 이상의 다른 돌연변이와 함께 포함될 수 있다. 이는 개별적인 약독화, 면역원성 및 유전적 안정성 수준 및 이들이 조합된 수준 측면에서 광범위한 스펙트럼을 나타내는 바이러스의 패널을 제공한다. 생물학적으로 유도된 RSV 돌연변이로부터의 이들 약독화 돌연변이는 본원에서 확인된 다양한 다른 구조적 변형과 함께 추가로 결합될 수 있으며, 이는 또한 재조합 RSV에서의 목적하는 표현형 변화를 특정화하여, 우수한 백신 특성을 가진 또 다른 추가의 RSV를 만들어낸다.
실시예 XII
추가의 외래 유전자를 발현하는 감염성 호흡기 신시티움 바이러스의 회수
상기에서 기술된 방법은 클로로암페니콜 아세틸 전이효소(CAT)를 코딩하는 추가의 유전자를 포함하는 재조합 RSV를 구성하는 데 사용되었다. CAT 코딩 서열은 RSV-특이적인 유전자 개시 및 유전자-말단 모티브, 바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소에 대한 전사 신호서열이 플랭킹하고 있었다(본원에서 인용참증으로 삽입된 쿠오(Kuo) 등의 J.Virol 70:6892-6901(1996)). RSV/CAT 키메라 전사 카세트는 완전한 cDNA-코딩된 정방향 RSV 안티게놈의 G 및 F 유전자 사이의 유전자간 영역 중으로 삽입되었으며, 감염성 CAT-발현 재조합 RSV를 회수하였다. CAT mRNA는 효율적으로 발현되었으며, G 및 F mRNA 수준은 야생형 재조합 RSV에 의해 발현되는 그것에 필적하였다. CAT-함유 및 야생형 바이러스는 주요 바이러스성 단백질의 합성 면에서 유사하였다.
CAT 유전자를 포함한 RSV 안티게놈 RNA를 코딩하는 cDNA의 구조화를 위해 플라스미드 D46이 사용되었다.(후자는 상기에서 기술된 플라스미드 D46이고 D53은 동일한 안티게놈 cDNA의 상이한 제조였다). 완전한 15, 223-뉴클레오티드 RSV 안티게놈(야생형 RSV의 뉴클레오티드보다 한 뉴클레오티드가 긴 것)을 코딩하는 D46을 상기에서 기술된 재조합 감염성 RSV를 제조하기 위해 사용하였다. 그 구성화 중, 안티게놈 cDNA는 4개의 새로운 제한 부위를 표지로 포함하도록 변형하였다. 이 중 하나인, G 및 F 유전자 사이의 유전자간 영역(야생형 게놈의 3'-5' 서열 중의 5611-5616 위치) 중에 위치한 StuI 부위를 외래 CAT 유전자를 위한 삽입 부위로 선택하였다. 그 상류 말단은 RSV GS 신호서열이 플랭킹하였으며 또한 그 하류 말단은 RS GE 신호 서열이 플랭킹한 CAT ORF의 카피는 종전에 기술된 RSV-CAT 미니게놈으로부터 유도되었다(본원에 인용참증으로 삽입된 콜린스(Collins) 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9663-9667(1991) 및 쿠오 등의 J. Virol. 70:6892-6901(1996)). 이 RSV/CAT 전사 카세트의 StuI 부위 중으로의 삽입은 D46/1024CAT cDNA(부다페스트 조약 규정에 의해 ATCC에 기탁되었으며 기탁 번호 VR-2544를 부여받았다)를 생성하였으며, 이는 코딩된 안티게놈의 길이를 총 15,984로 증가시켰다. 또한, 야생형 RSV가 10개의 주요 서브게놈 mRNA를 코딩하는 반면, D46/1024CAT 안티게놈으로부터 예상된 재조합 바이러스는 11번째 mRNA로 CAT 유전자를 코딩하였다. 구성화 방법은 도 6에 나타내었다.
cDNA-코딩된 안티게놈 RNA로부터의 감염성 RSV의 생산은 상기에서 기술된 대로 안티게놈 RNA 또는 N, P, L 또는 M2(ORF1) 단백질을 개별적으로 코딩하는 5개의 cDNA의 HEp-2 세포 중에서의 공동발현을 포함하였고, 이는 바이러스 RNA 복제 및 전사에 필요하고 또한 충분하였다. cDNA 발현은 MVA 균주에 기초한 백신-T7 재조합 바이러스에 의해 공급되는 T7 RNA 중합효소에 의해 지시되었다. MVA-T7 재조합 바이러스는 계대 배양에서 광범위한 세포독성을 유발하기에 충분한 감염성 자손을 생산하였고, 따라서 백신 바이러스 복제의 억제제인 사이토신 아라비노시드를 트랜스펙션 후 24시간 후에 첨가하였으며 최초 6회 계대배양 동안 유지하였다. 그러 나, 사이토신 아라비노시드의 사용이 요구되지는 않았고, 또한 본원의 이후의 실시예에서 사용되지는 않았다.
두 개의 안티게놈 cDNA의 RSV의 회수를 시험하였다:D46 cDNA 및 D46/1024CAT cDNA. 각각은 감염성 재조합 RSV를 생산하였다. D46/1024CAT 재조합 바이러스로 감염된 세포는 풍부한 수준의 CAT 효소를 발현하였다. 각각의 바이러스의 경우, 트랜스펙션 상징액은 신선한 세포에 계대 배양되었으며, 총 8개의 연속 계대 배양을 5 내지 6일 간격으로 수행하였으며, 감염 다중도는 0.1 PFU/세포 미만이었다.
D46/1024CAT 게놈 중의 CAT 서열은 RSV GS 신호 서열이 플랭킹하고 있으며, 따라서 추가의 별개의 폴리아데닐화된 mRNA로 발현되야 한다. 이 예상된 mRNA의 존재를 8차 계대배양에서 D46/1024CAT 바이러스 또는 D46 바이러스로 감염된 세포로부터의 RNA의 노던 블롯 혼성화에 의해 시험하였다. 역방향 CAT-특이적인 라이보프로브에 의한 혼성하는 예상된 CAT mRNA에 적합한 크기로 폴리(A)를 포함한 735 뉴클레오티드를 포함한 주요 밴드를 검출하였다. 이 종류는 올리고(dT) 라텍스 입자에 의해 효율적으로 보유되었으며, 폴리아데닐화된 것을 보여주었다. 몇몇 경우, 소수의 거대 CAT-특이적인 종류는 G-CAT 리드트루(readthrough) mRNA에 적당한 크기인 것이 검출되었다. 세포내 mRNA을 제조하기 위해 사용되는 감염 전에 낮은 다중도의 감염으로 D46/1024CAT 바이러스를 8회 계대배양하였다. CAT mRNA의 짧은 형태에 대한 증거는 없었으며, 만약 CAT 유전자가 결실되었다면 이 형태가 생겼을 것이다.
복제 블롯을 CAT, SH, G 또는 F 유전자(후자의 두 유전자른 삽입된 CAT 유전 자에 플랭킹함)에 특이적인 역방향 라이보프로브로 혼성화하였다. 블롯은 서브게놈 SH, G 및 F mRNA의 발현이 두 종의 바이러스와 유사하다는 것을 보여주었다. D46/1024CAT 및 D46에 대한 세 종의 RSV mRNA 밴드 각각에서의 혼성화된 방사능의 양을 비교하기 위해 포스포이미지기를 사용하였다. D46/1024CAT과 D46 사이의 방사능 비율을 각각의 mRNA에 대해 측정하였다:SH, 0.77; G, 0.87; 및 F, 0.78. 통일된 값으로부터의 편차는 아마도 D46에 비해 D46/1024CAT이 약간 적게 로딩되었다는 것을 나타낼 것이나, 또한 D46/1024CAT RSV에서 전체적인 수준의 mRNA 축적이 약간 적다는 것도 가능하다. 3개의 비율이 유사하다는 것의 증명은 이들 mRNA의 각각의 발현 수준이 D46에 대한 D46/1024CAT에 대해 대략 동일하다는 것을 확인하였다. 따라서, G와 F 유전자 사이의 CAT 유전자의 삽입은 이들 유전자 중 어느 하나의 전사 수준에도 급격한 영향을 미치지 않았다.
바이러스 단백질 합성의 특성을 기술하기 위해, 감염된 HEp-2 세포를 [35S]메티오닌으로 표지시키고, 표지된 항원의 회수가 실질적으로 완전한 조건 하에서 직접적으로 또는 하기 면역침전으로 PAGE로 세포 여액을 분석하였다. 정제된 RSV에 대해 생성된 토끼 항혈청에 의한 침전은 D46/1024CAT 및 D46바이러스 양자 모두가 주요 바이러스 단백질 F1, N, P, M 및 M2의 유사한 양을 발현하다는 것을 보여주었다. 각각의 바이러스에 대해 회수된 유사한 수준의 M2 단백질이 주목할만한데, 그 유전자가 삽입된 CAT 유전자의 하류에 있기 때문이다. 삽입 위치 바로 밑에 위치한 F 단백질의 축적 또한 3종의 항-F 단일클론 항체의 혼합물에 의한 면역침전으 로 조사하였다. 유사한 수준의 F1 단위체가 각각의 바이러스에 대해 회수되었다. 상기에서 언급된 주요 바이러스 단백질의 포스포이미지 분석이 수 개의 독립적인 실험에 대해 수행되었으며, 샘플마다 변화를 나타냈으나, 전체적으로 두 종의 바이러스는 회수된 입자 수준을 기준으로 하였을 때 구분할 수 없었다. 항-CAT 항체에 의한 침전은 D46/1024CAT6에 특이적이나 D46 바이러스에는 특이적이지 않은 단일 종을 회수하였다. 전체 표지된 단백질의 분석은 N, P 및 M 단백질이 면역침전에 의하지 않고 검출될 수 있음을 보여주었으며(비록 후자의 검출이 세포내 종과의 공동이동에 의해 복잡했지만), 두 종의 바이러스가 유사한 패턴을 나타낸다는 것을 확인하였다. CAT 단백질의 위치에 해당하는 위치는 D46과 비교하였을 때 D46/1024CAT 패턴에서보다 많은 방사능을 포함하였으며, 이는 독립적인 실험의 포스포이미지에 의해 확인되었다. 비록, 이 입증이 감염되지 않은 패턴 및 D46-감염된 패턴에서 공동이동하는 백그라운드 밴드의 존재에 의해 복잡하게 되었지만, 이는 CAT 단백질이 침전에 의하지 않고 전체 표지된 단백질 중에서 검출될 수 있다는 것을 암시한다.
재조합 RSV의 게놈의 예상된 위치에서 CAT 유전자의 존재를 확인하기 위해 RT-PCR을 사용하였다. D46/1024CAT 및 D46 RSV 양자 모두의 8차 계대 배양의 세포 펠릿으로부터 전체 세포내 RNA를 단리하였다. 삽입 부위, RSV 위치 5611-5616에서 StuI 제한 효소 부위에 플랭킹하는 두 개의 프라이머를 선택하였다: 상류 정방향 프라이머는 5412-5429 위치에 해당하고, 하류 역방향 프라이머는 5730-5711 위치에 해당하였다. RT 단계에서 정방향 프라이머를 사용하였으며, 두 프라이머는 PCR 중에 포함되었다.
D46 바이러스의 RT-PCR은 추가의 외래 서열이 없는 G/F 유전자 접합을 나타내는, 예상된 318 뉴클레오티드의 단편에 해당하는 단일 생성물을 만들었다. D46/1024CAT 바이러스 RNA의 분석은 그 전기 영동 이동성이 삽입된 CAT 전사 카세트를 포함하는 G/F 유전자를 나타내는 예상된 1079 뉴클레오티드 단편에 매우 상응하는 단일 생성물을 만들었다. 후자의 PCR은 단일 주요 밴드를 만들었다; 검출할 수 있는 보다 작은 생성물의 부재는 재조합 게놈의 집합이 그 영역에서 결실이 일어난 많은 수의 분자를 포함하지 않는다는 것을 나타내었다. PCR 분석이 RT 단계없이 D46/1024CAT 바이러스 RNA에 대해 행해졌을 때, 밴드가 보이지 않았으며, 이는 분석이 RNA에 특이적이라는 것을 확인하였다. 따라서, RT-PCR 분석은 D46/1024CAT 재조합 바이러스의 게놈 RNA 중에서 예상된 위치 중에 예상된 길이의 삽입의 존재를 확인하였다.
CAT 유전자의 안정성을 측정하기 위해 효소 발현을 사용하였다. 3차부터의 모든 계대 배양물로부터 얻은 세포 펠릿에서 CAT 발현을 시험하였다. 바이러스 D46/1024CAT의 경우, 이들 모든 시험은 [14C] 표지된 클로로암페니콜의 아세틸화된 형태로의 전환을 나타내었다. 발현의 안정성을 조사하기 위해, 20 또는 25개의 독립적인 플라크의 3차 또는 8차 계대배양으로부터 얻은 바이러스에 대해 각각 CAT 발현을 분석하였다. 모든 샘플은 양성이었으며, CAT 발현의 수준은 세포 여액의 등량의 분취량의 분석에 의해 평가된 것과 같이 8차 계대 배양물로부터 얻은 25개 분리주 각각에 대해 유사하였다. 이는 각각의 분리주에 의해 코딩된 CAT 단백질의 활성이 돌연변이에 의해 손상되지 않고 유지된다는 것을 입증하였다.
플라크 형태 및 크기를 측정하기 위해, 5 내지 7일 동안 메틸셀룰로오즈 중층하에서 배양된 6개 웰 플레이트 중의 신선한 HEp-2 세포를 감염시키기 위해 2차 계대 배양부터 각각의 계대 배양 단계에서 수집된 배지 상징액의 8분의 1을 사용하였다. 이후, 세포를 고정화시키고 RSV F 단백질에 대한 단일클론 항체로 배양 이후 고추냉이 과산화효소에 연결된 2차 항체로 배양하여 염색시켰다. 초기에, 시험관내에서의 온도 범위 전체에 걸쳐 플라크 형성의 효율 및 이전에 감염된 바 없는 침팬치의 기관지 중으로 접종되었을 때 복제하고 질환을 일으킬 수 있는 능력 면에서, cDNA D46으로부터 생성된 재조합 RSV가 자연적으로 발생하는 야생형 RSV 분리주와 구별되지 않는다는 것이 관찰되었다. 따라서, D46 재조합 RSV은 독성 야생형 균주로 생각되었었다. D46 및 D46/1024CAT 재조합 바이러스에 의해 생산된 플라크를 항체 염색에 의해 비교하였다. 각각의 바이러스에 대해 30개의 무작위 선택된 플라크의 측정에 기초하여 CAT-함유 재조합 플라크의 평균 직경은 D46 바이러스의 90%이었으나, 플라크 형태는 두 바이러스에서 매우 유사하였다.
D46 및 D46/1024CAT 바이러스의 조직 배양물 중에서의 복제 효율을 단일 단계 성장 사이클과 비교하였다. 세포의 3중 단층을 두 바이러스 중 하나에 의해 감염시키고, 샘플을 12시간 간격으로 채취하고 플라크 분석으로 정량화하였다. 이들 결과는 D46에 비해 D46/1024CAT의 생산이 지연되었으며 20배 이상 낮은 최대 역가 를 달성하였다는 것을 보여주었다.
이들 결과는 외래 유전자, 이 경우 CAT 유전자를 발현하는 재조합, 헬퍼-독립적인 RSV을 구성화하는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 재조합 RSV는 CAT 단백질을 코딩하는 예상된 폴리아데닐화된 서브게놈 mRNA의 발현을 지시하고, CAT 단백질은 효소 분석 및 방사능면역침전 둘 다에 의해 검출되었다. 다른 실시예들은 동일한 CAT 부위에 삽입된 루시퍼라아제 유전자를 가진 또는 SH와 G 유전자 사이에 삽입된 CAT 또는 루시퍼라아제 유전자를 가진 RSV 재조합체를 생산하였다. 또한 이들 바이러스는 감소된 성장을 나타내는 반면, 회수된 다수의 야생형 재조합 바이러스는 감소되지 않은 성장을 나타내었다. 이는 감소된 성장이 실제로 게놈 이외의 기회 돌연변이에 의한 것이라기보다는 삽입된 유전자와 연관되어 있다는 것을 나타낸다. 약독화 수준은 삽입된 유전자의 길이가 증가합에 따라 증가하는 것으로 보인다. 이 조사 결과는 재조합 RSV 중으로의 외래 유전자의 삽입이 그 복제 수준을 감소시키고 상기 삽입이 시험관내에서 계대 배양 중 안정하다는 것은 이것이 백신 사용을 위한 약독화에 영향을 주기 위한 또 다른 방법을 제공한다는 것을 암시한다. 또한, 다른 것들 중에서 감마 인터페론 및 IL-2와 같은 항바이러스 활성을 가진 단백질을 발현하는 재조합 RSV의 유전자 중으로의 삽입은 발현된 항바이러스 단백질의 활성으로 인해 바이러스의 약독화를 일으킬 것이다.
변형된 성장 특성을 가지는 RSV의 회수의 입증과 아울러, 본원의 실시예는 재조합 RSV 및 다른 비분절화된 역방향 바이러스의 유전자 발현을 위한 다른 중요한 방법 및 장점을 기술한다. 예를 들어, 본원에서 제공된 데이타는 별개의 mRNA 로 발현되는 별개의 전사 카세트로 도입될 수 있는 외래 코딩 서열을 제시한다. 또한 이들 결과는 RSV가 게놈 길이에서의 상당한 증가(예를 들어 총 15,984 뉴클레오티드 중으로 CAT 유전자의 경우 762 뉴클레오티드(야생형 RSV의 그것의 1.05배))에 내성이라는 것을 보여준다. 성공적으로 회수된 루시퍼라아제 유전자는 약 3배 정도 길다.
바이러스 RNA-의존성 RNA 중합효소는 교정 및 수선 기작의 부재로 인해 에러가 일어나기 쉬운 성질을 가진 것으로 알려져 있다. RNA 바이러스 게놈 중에서, 돌연변이의 빈도는 부위 당 평균 10-4-10-5로 높은 것으로 평가되었다(본원의 인용참증인 홀랜드(Holland) 등의 Curr. Top. Microbiol. Immunol. 176:1-20(1992)). 본원에서 생산된 재조합 D46/1024CAT RSV의 경우, 외래 유전자의 정확한 발현은 바이러스 복제와 무관하며 돌연변이를 축적하지 않을 것이다. 본원에서 기술된 계대 배양은 0.1 PFU/세포 미만의 감염 다중도를 포함하며, 각각의 계대 배양 수준의 지속은 다수의 감염 반복이 관여한다는 것을 나타내었다. RSV-감염된 조직 배양물로부터 감염성 바이러스의 수율이 일반적으로 낮지만, 세포내 거대분자 합성이 왕성하고, 또한 감염성 바이러스의 빈약한 수율은 RNA 복제에서보다는 패킹에서의 비효율적인 단계를 나타내는 것으로 보인다. 따라서, 8번의 연속 계대 배양을 통한 CAT의 유지는 다수의 RNA 복제 반복을 포함하였다. 비본질적인 CAT 유전자가 8차 계대 배양에서 시험된 25개의 분리주 각각에서 온전하게 유지되며 또한 완전히 기능적인 단백질을 코딩할 수 있다는 것이 놀라운 일이었다. 또한, 8차 계대 배양으 로부터 단리된 RNA의 RT-PCR은 CAT 유전자 내의 결실을 검출하지 못했다.
SH-G 유전자간 영역(이는 상기에서 사용된 F-G 유전자간 영역보다 프로모터에 보다 가까운 위치이다) 중에 설계된 XmaI 중으로 CAT 전사 카세트가 삽입된 두번째 감염성 RSV-CAT 재조합체를 구성화하였다. 이 재조합체의 성장 특성은 D46/1024CAT 재조합체의 그것과 유사한 반면, 보다 프로모터에 가까운 위치와 일관되게 CAT 발현 수준은 2배 내지 3배 정도 높았다. 이는 외래 유전자가 게놈 내의 두번째 상이한 부위 중에 삽입될 수 있으며, 그 발현 수준이 그에 따라 변화한다는 것을 설명한다. 원칙적으로, 삽입이 mRNA-코딩 단위를 파괴하지 않으며 게놈 양끝에서 발견되는 시스-작용 서열 성분을 방해하지 않는다면 게놈의 어떠한 부분이라도 외래 단백질을 코딩하는 전사 단위의 삽입을 수용할 수 있어야 한다.
또한 CAT 유전자가 루시퍼라아제(LUC) 표지 효소 유전자에 의해 치환된 것에서 감염성 재조합 RSV가 회수되었다. LUC 코딩 서열은 약1,750bp(CAT 크기의 세 배)이고, 이는 F 및 L을 제외한 RSV의 어떠한 유전자보다도 크다. 이는 SH-C 또는 G-F 유전자간 영역 중 하나에 삽입되었으며 또한 감염성 재조합 바이러스가 회수되었다. LUC 바이러스는 조직 배양물에서의 성장 면에서 CAT 바이러스에 비해 더 약독화되었으며, 이는 게놈의 크기 증가가 성장 효율의 감소에 이른다는 것을 암시하였다. 이들 CAT 및 LUC 바이러스의 특성 기술은 바이러스 유전자 발현 및 성장에 대한 외래 유전자 크기의 효과, 즉 얼마나 많이 전사 신호 서열의 추가 세트의 도입에 의한 것인지 또는 얼마나 많이 증가된 게놈 길이에 의한 것인지와 같은 효과를 측정할 것이다.
미니복제 시스템에서, RSV-CAT 미니게놈은 전사 단위가 미니게놈보다는 정방향 안티게놈에서의 "정방향" 배향이 되도록 변형되었다. 따라서, 서브게놈 mRNA는 중합효소가 안티게놈 복제 중간체의 전사를 할 수 있을 때만 만들어질 수 있다. 놀랍게도, 플라스미드 발현된 N, P, L 및 M2 ORF1 단백질에 의해 보완되었을 때, 이 역위 RSV-CAT 미니게놈은 서브게놈의 폴리아데닐화된 번역될 수 있는 mRNA을 합성할 수 있다. 효율적인 mRNA 합성은 미니게놈 전사의 경우에서와 같이 M2 ORF1 단백질에 의존한다. 그 안티게놈 주형에 대한 mRNA 수준은 표준 미니복제 단위에 의해 만들어진 미니게놈 주형에 대한 mRNA의 비율과 동일하다. 이는 안티게놈이 게놈과 마찬가지로 외래 전사 단위를 받아들일 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 게놈 전사 순서 중으로 그 유전자를 배치하지 않고서도 외래 유전자의 발현을 달성할 수 있다. 이는 외래 유전자가 게놈의 전사 프로그램의 일부가 아니며, 따라서 이들 유전자의 상대적인 발현 수준을 혼란시키지 않는다는 장점을 가진다.
항원성 차이점의 대부분이 G 당단백질 중의 두 개의 RSV 안티유전자 아군 사이에 존재하기 때문에, 다양한 백신을 만들기 위해 추가의 유전자로 이종 아군의 G 단백질을 발현하도록 재조합 RSV를 구성화할 수 있다. 또한 인간 재조합 RSV와 같은 일부 다른 기관지 바이러스의 외피 단백질 유전자도 재조합 RSV에 의한 발현을 위해 삽입될 수 있다. 다른 사용은 감염성 RSV의 면역원성을 증가시키기 위해 인터루킨 6와 같은 면역 조절자의 공동발현을 포함한다. 또한 본원에서 기술된 변형된 RSV를 사용하는 것과 같은 다른 사용도 제공된다.
실시예 XIII
SH 유전자의 결실을 가진 재조합 RSV
이 실시예는 SH mRNA 및 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 제거에 의해 SH 유전자의 발현이 제거된 재조합 RSV의 제조를 기술한다. SH 단백질은 아미노산 위치 14-41에 추정적인 막관통 도메인을 포함하는 작은(균주 A2의 경우 64개 아미노산) 단백질이다. 이는 막 중에서 C-말단이 노출되도록 위치되고 C-말단 및 N-말단 도메인 양쪽에 잠재적 글리코실화 부위가 있다(본원에 인용참증으로 삽입된 콜린 등의 J.Gen. Virol. 71:3015-3020(1990)). 감염된 세포에서, 균주 A2의 SH 단백질은 4개의 주요 형태를 축적한다: (i) 가장 흔한 전장, 비글리코실화된 형태인 SHO(Mr 7500)(본원에 인용참증으로 삽입된 올름스테드(Olmsted) 등의 J. Virol. 63:2019-2029(1989)); (ii) 단일 N-연결 탄수화물 사슬을 포함한 전장 형태인 SHg(Mr 13,000-15,000);(iii) 폴리락토르아미노글리칸의 첨가에 의해 단일 N-연결 탄수화물 사슬이 변형된 변형된 유형의 SHp(본원에 인용참증으로 삽입된 안데르슨 등의 Virology 191:417-430(1992));(iv) 두 번째 메티오닐 코돈(위치 32)으로부터 시작하며 또한 상이한 형태 중에서 단독으로 세포 표면으로 운반되지 않는 것으로 보이는 절단된 비글리코실화된 형태의 SHt(Mr 4800). SH0 및 SHp 형태는 정제된 비리온 중에서 검출되었으며, 이는 비리온 형태형성의 수준에서 선택성이 있음을 암시한다(콜린스 등(1993), 상기 참조).
파라믹소 바이러스 중에서, 표면상으로는 유사한 SH 단백질이 유인원 바이러스 5 중에서(본원에 인용참증으로 삽입된 히헤베르트 등의 J. Virol. 5:744-751(1985)), 소 RSV 중에서(본원에 인용참증으로 삽입된 사말(Samal) 등의 J. Gen. Viro. 72:1715-1720(1991)), 볼거리 바이러스 중에서 (본원에 인용참증으로 삽입된 엘란고(Elango) 등의 J. Virol. 63:1413-1415(1989)) 및 칠면조 비기관염 바이러스 중에서 (본원에 인용참증으로 삽입된 링 등의 J. Gen. Virol. 734:1709-1715(1995)) 발견되었다. 필로바이러스의 작은 소수성 VP24 단백질은 표면 단백질(버크레예브 등의 Biochem. Mol. Biol. Int. 35:605-613(1995))로 생각되며 또한 파라믹소 SH 단백질의 잠재적 대응물이다.
SH 단백질의 기능은 아직까지 정의되지 않았ek. 플라스미드 코딩된 단백질을 발현하는 세포에서의 융합 분석 중에서, RSV 단백질에 의한 효율적인 CV-1 세포의 효율적인 융합은 F,G 및 SH 단백질의 공동발현을 요구하였다(본원에 인용참증으로 삽입된 헤밍웨이 등의 Virology 200:801-805(1994)). 이론에 의해 제한받기를 원치 않으면서, RSV SH 단백질의 수 개의 기능, (i) 바이러스 부착 또는 통과를 향상시킴(헤밍웨이 등, 상기 참조); (ii) 비리온 형태발생에 관여함; 또는 (iii) 센다이 바이러스의 V 단백질에 대해 최근 기술된 것과 같은 숙주 면역 시스템 성분과의 상호작용(본원에 인용참증으로 삽입된 카토 등의 EMBO J. 16:178-587(1997))과 같은 바이러스 성장에서의 직접적인 역할과 상이한 "사치한" 기능을 가질 수 있는 기능이 존재할 수 있다. 상기 (i) 또는 (ii)의 기능은 다양한 바이러스의 일부 소수성 단백질에 대한 활성들로부터 제시된 바와 같이, 막 통과성을 변형하는 활성을 포함할 수 있다(각각이 본원에 인용참증으로 삽입된 마라모르쉬(Maramorsh) 등의 Advances in Virus Research 45:61-112(1995); 슈베르트 등의 FEBS Lett.(1996); 램(Lamb) 등의 Virology 229:1-11(1997)). SH 단백질의 이들 모든 잠재적 활성은 본원에서 기술된 방법 및 계획에 따른 본 발명의 범위 내에 들어갈 수 있으며, RSV 재조합 백신에서 추가의 장점을 만든다.
SH 유전자 기능의 선택된 파괴를 가진 재조합 RSV를 제조하기 위해, SH 유전자는 부모형 RSV 클론으로부터 그 온전성이 결실되었다. 상기에서 기술된 플라스미드 D46 플라스미드는 RSV의 균주 A2의 완전한 안티게놈 RNA를 코딩하는 그런 클론으로, 이는 재조합 RSV를 회수하기 위해 성공적으로 사용될 수 있다(각각이 본원에 인용참증으로 삽입된 미국 특허 출원 제08/720/132호, 미국 정규 특허 출원 제60/007,083호 참조). 이 안티게놈은 자연적으로 존재하는 게놈보다 1 nt 더 길고, 수 개의 선택적인 제한 부위 표지를 포함한다. D46 플라스미드는 완전한 SH 유전자가 결실되도록 변형되어, 플라스미드 D46/6368을 만든다(도 7).
플라스미드 D46/6368의 구조는 L 유전자의 시작점에 대한 선도 영역를 포함하는 게놈의 좌측 반편 말단에 부착된 T7 프로모터를 포함하는 D50, 및 해머헤드 리보자임에 대해 그 하류 말단에서 부착된 M2 및 L 유전자의 말단 및 종렬 T7 전사 종결자를 포함하는 D39, 두 개의 부모형 서브클론을 포함하였다. D50 플라스미드는 ScaI(완전한 15,223-뉴클레오티드 안티게놈 서열 중의 4189 위치) 및 PacI(위치 4623)으로 절단하였으며, 두 개의 상보적인 올리고뉴클레오티드로부터 구성화된 짧은 DNA 단편으로 생성된 435bp 단편을 치환하였다. 이 예시적인 결실에서, 435-bp 단편은 M 유전자의 가장 하류 말단에 해당하는 ScaI와 PacI 부위, 그 GE 신호 서열 및 그 GE 서열의 마지막 6개 뉴클레오티드를 제외한 완전한 SH 유전자 사이에 위치하였다(도 7). 이는 두 개의 합성의 일부 상보적인 올리고뉴클레오티드, 5'- ACT CAAATAAGTTAATAAAAAATATCCCGGG AT -3'[서열 번호:3](역방향 가닥, M GE 서열은 밑줄 그었음, XmaI 부위는 이탤릭으로 나타내었음, 또한 각각 좌측 및 우측에서의 ScaI 반편 부위 및 PacI 점착성 말단는 볼드 이택릭체로 나타내었음) 및 5'-CCCGGGATATTTTTTATTAACTTATTTG AGT -3'[서열 번호:4](역방향 가닥). 안티게놈의 나머지 부분을 포함한 D39의 BamHI-MluI를 수용하도록 D50/6368로 불리는 이 cDNA를 사용하였다. 이는 결실된 서열을 제외한 완전한 안티게놈을 코딩하는, 야생형 플라스미드 D46에 의해 코딩되는 안티게놈보다 398nt 짧은 14,825nt의 안티게놈인 플라스미드 D46/6368을 생성하였다. 삽입된 서열을 디디옥시뉴클레오티드 서열 분석으로 확인하였다. XmaI 부위는 이후의 작업에서 이 위치에서 삽입물이 쉽게 위치할 수 있도록 선택적으로 도입되었다.
트랜스펙션, 성장 및 바이러스의 계대 배양, 플라크 정제 및 바이러스 플라크의 항체 염색은 상기본원에서 기술된 방법에 따라 일반적으로 수행하였으나, 두 가지 변형이 일어났다: (i) 우두 바이러스의 억제제인 시토신 아라비노사이드가 사용되지 않았다; (ii) 트랜스펙션에서 사용된 HEp-2 세포는 32℃ 또는 37℃에서 배양되었으며, 모든 회수된 바이러스는 37℃에서 증식되었다.
총 RNA 및 폴리(A)+RNA을 평가하기 위해, 세포를 긁어 내고 100㎕의 물 중에 재현탁하였으며, 전체 세포내 RNA를 트리졸™ 시약을 사용하여 제조자 지시(하기 이소프로판올 침전물 RNA가 페놀-클로로포름으로 2회 추출된 후 에탄올 침전한다는 것을 제외하고)에 따라 분리하였다(라이프 테크놀로지사). 폴리(A)+RNA를 올리고텍스(Oligotex) mRNA 키트를 사용하여 단리하였다(캘리포니아주 채트스워쓰 소재의 퀴아진사).
역전사 및 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행하기 위해, SH 유전자 영역을 cDNA 중으로 카피하고 증폭하였다. 총 세포내 RNA를 정방향 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머로 5'-GAAAGTATATATTATGTT-3'[서열 번호:5]을 사용하여 슈퍼스크립트 II(Superscript II)(라이프 테크놀로지사)로 역전사하였다. 이 프라이머는 뉴클레오티드 3958-3975에 상보적이고, 이는 SH 유전자의 상류에 있다. 프라이머로 상기에서 언급된 올리고뉴클레오디드와 함께 역방향 올리고뉴클레오티드 5'-TATATAAGCACGATGATATG-3' [서열 번호:6]을 사용한 PCR 중에서 cDNA의 분취액을 주형으로 사용하였다. 후자의 프라이머는 게놈의 4763-4782 뉴클레오티드에 해당하고, 이는 SH 유전자의 하류이다. 이 시간 중 Taq DNA 중합효소가 첨가되는 최초 2분의 변성화 단계를 수행하였으며, 이후 33 사이클을 수행하였다(94℃에서 1분간 변성, 39℃에서 1분간 어닐링, 72℃에서 2분간 신장). 이후 생성물을 2.5% 한천 겔 상에서 분석하였다.
노던 블롯 혼성화를 위해, 포름알데히드 존재하에 한천 겔 상에서 전기영동으로 RNA를 분리하고, 니트로셀룰로오즈로 블롯팅하었다. 합성 헥사머(인디애나주 인디애나폴리스 소재의 베링거 만하임(Boerhringer Manheim))를 사용한 랜덤 프라이밍으로 클레나우(Klenow) 중합효소에 의해 cDNA로부터 시험관내에서 개별적으로 합성된 M, SH, G, F, M2 및 L2 유전자의 [32P]-CRP-표지된 DNA 프로브로 블롯을 혼성화하였다. 혼성화된 방사능 활성은 몰리큘라 다이나믹스(캘리포니아주 서니발레 소재)사의 포스포이미지기 445 SI를 사용하여 정량하였다.
35S 메티오닌 표지, 면역 침전 및 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 방법은 종전에 기술된 대로 수행하였다(부크레예브 등, 상기 참조). 전기 영동은 프리-캐스트 4%-20% 트리스-글리신 겔(노벡스(Novex)사)을 사용하여 수행하였다.
시험관내 성장 분석을 위해, HEp-2, 293, CV-1, Vero, MRC-5, 아프리카 녹색 원숭이 신장(AGMK), 소 비갑개 (BT), 및 MDBK 세포 단층을 단일 단계 성장 사이클 분석에서 사용하였다. 세포 각각의 유형에서, 3개의 25-cm2 배양물 플라스크를 D46/6368(SH-음성) 또는 D46(야생형 재조합체)의 107 PFU로 감염시켰다. 2% 소 태아 혈청(FBS)과 함께 옵티-MEM(라이프 테크놀로지사)을 HEp-2, 293, CV-1, Vero, MRC-5, AGMK에 사용하였다: 1%, 또는 2% FBS와 함께 E-MEM(라이프 테크놀로지사)을 각각 MDBK 또는 BT 세포에 사용하였다. 37℃에서 3시간 흡수 후, 세포를 4㎖ 배지로 각각 3회 세척하였으며, 4㎖ 배지를 첨가하였고, 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 배양하였다. 이후, 배양 후 다양한 시간에서(하기 참조), 배지 상징액의 200㎕ 분취액을 제거하였으며, 100nM 황산마그네슘 및 50mM의 HEPES 완충용액(pH 7.5)을 포함하도록 조정하였으며, 플래시 동결하고 역가 측정시까지 -70℃에서 보존하였다. 역가 측정을 위해, HEp-2 세포(24 웰 플레이트)를 분취액의 10배 희석액으로 감염시키고, 2% FBS 및 0.9% 메틸셀룰로오즈(MCB 시약)을 포함한 옵티-MEM으로 중층하였다. 7일간 배양 후, 배지를 제거하고, 세포 단층액을 4℃에서 80% 메탄올로 고정화였다. 플라크를 RSV F 단백질에 특이적인 3종의 단일클론 항체의 혼합물로 배 양한 후, 고추냉이 과산화효소와 접합된 염소 항-마우스 IgG로 배양하였다(본원에 인용참증으로 삽입된 머피 등의 Vaccine 8:497-502(1990)).
SH 유전자 기능이 결여된 감염성, 재조합 RSV의 회수는 상기에서 기술된 방법을 따랐으며, 여기서 D46/6368 플라스미드는 N, P, L 및 M2 ORF1 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 HEp-2 세포 중으로 함께 트랜스펙션되었으며, 세포는 T7 RNA 중합효소를 발현하는 우두 바이러스의 MVA 균주의 재조합체와 동시에 감염되었다. 병행 배양물을 동일 조건하에서 D46 야생형 cDNA로 트랜스펙션하였다. 배지 상징액을 트랜스펙션 후 3일 후에 수집하였으며 1회 계대 배양하였다. 37℃에서 6일 배양 후, 각각의 트랜스펙션을 나타내는 배지 상징액의 분취액을 신선한 HEp-2 세포 위에 플레이트하였으며, 메틸셀룰로오즈 중충하에서 6일간 배양하였으며, RSV F 단백질에 특이한 3종의 단일항체의 혼합물에 의한 반응 및 이후 고추냉이 과산화효소와 접합된 2차 항체로 염색하였다.
SH-음성 바이러스 대 야생형 재조합 바이러스의 형태는 후자의 플라크가 크다는 점을 제외하고는 매우 유사하였다. 특히, 각각의 대조구 및 SH 음성 바이러스로부터 형성된 플라크는 합포체를 포함하였다.
회수된 D46/6368 바이러스의 게놈 중의 SH 유전자의 부재를 확인하기 위해, 야생형 또는 SH 음성 재조합 바이러스의 1차 계대 배양물로 세포를 감염시켰으며,총 세포내 RNA를 회수하였으며 RT-PCR로 분석하였다. RT는 SH 유전자의 상류, 게놈 위치 3958-3975에 어닐링하는 정방향 프라이머로 수행하였다. SH 유전자의 하류인, 뉴클레오티드 4763-4782를 나타내는 역방향 프라이머와 함께 동일한 프라이 머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 도 8에서 나타낸 바와 같이, 야생형 D46 바이러스는 3958과 4782 위치 사이의 예상된 824bp 단편에 해당하는 단일 PCR 생성물을 만들었다(레인 3). D46/6368 바이러스의 경우, PCR 생성물은 보다 짧았으며, 결실을 포함한 예상된 426bp 단편에 해당하였다(레인 2). PCR 생성물의 생성은 RT 단계에 의존하고, 이는 예상한 바와 같이 이들이 DNA보다는 RNA에서 유도되었음을 보여준다. 따라서, RT-PCR 분석은 D46/6368 바이러스가 SH 좌에서 예측된 398-뉴클레오티드 결실을 포함한다는 것을 입증한다.
SH 유전자의 상류 및 하류에 위치한 유전자의 전사를 조사하기 위해, 폴리(A)+ mRNA를 D46 또는 D46/6368 바이러스로 감염된 세포로부터 분리하였으며 노던 블롯 혼성화로 분석하였다(도 9). 세포내 RNA는 폴리(A)+ 선택 전에 의도적으로 변성화되지 않았다. 따라서, 하기에서 나타낸 바와 같이, mRNA에 대한 샌드위치 혼성화로 인해 선택된 mRNA는 게놈 RNA도 포함하였다 이는 mRNA 및 게놈의 동시적인 분석을 허용하였으며, 동일한 겔 레인에 포함된 게놈 RNA에 대한 mRNA의 존재비를 관련시킬 수 있음은 레인간 mRNA의 존재비의 비교를 가능하게 했다. 랜덤 프라이밍에 의한 cDNA 클론으로부터 합성된 [32P]-표지된 DNA 프로브로 블롯을 혼성화하였으며, 따라서 이는 양 극성의 프로브를 포함하였다. 선택된 프로브는 개별적으로 M, SH, G, F, M2 및 L2 유전자를 나타내었다(도 9).
SH 프로브는 야생형 D46 바이러스의 경우에 서브게놈 SH mRNA 및 게놈 RNA 양자에 혼성화되었으나 D46/6368 바이러스의 경우에는 혼성화되지 않았다(도 9). 다른 RSV 유전자에 특이적인 프로브가 각각의 경우에 게놈에 혼성화되었으며 또한 양 바이러스의 예상된 주요 모노시스트론 mRNA에 혼성화되었다. 아울러, 종전에 기술된 다수의 디시스트론 리드트루 mRNA도 F-M2 , G-F 및 P-M mRNA와 같은 두 바이러스에 의해 검출되었다.
G-특이적 프로브는 D46/6368 바이러스에 특이적인 신규한 종에 혼성화되었으며, 이는 M 및 G 유전자의 리드트루로 보인다. 이 조합은 사이에 낀 SH 유전자의 결실에 의해 가능했다. D46/6468에 특이적이나 D46에는 특이적이지 않은 동일한 종은 추가로 M-특이적인 프로브와만 혼성화하는 것으로 보였다.
이어서 D46 대 D46/6468의 각각의 mRNA에 대해 상대적인 합성 수준을 이어서 정량하였다. 각 쌍의 비교의 경우, 주어진 겔 레인 중의 mRNA의 양을 게놈 양에 대해서 정규화하였다. 이 비교는 D46/6368 대 D46이 표시된 비율로 하기 mRNA을 발현하는 것을 보여주었다 (D46/6368 대 D46): M (1.1), G(1.3), F(0.61), M2(0.32), 및 L(0.17).
D46와 대비하여 D46/6368 RSV 클론에 의해 합성된 바이러스 단백질을 비교하기 위해, HEp-2 세포를 2 PFC/세포의 유입 감염 다중도로 감염시키고, 감염 후 16-20시간 후 [35S]메티오닌으로 배양하여 표지하였다. 세포 여액을 제조하였으며 직접적으로 또는 정제된 RSV 비리온에 대해 생성된 토끼 항혈청을 사용하여 하기 면역침전으로 분석하였다. 총 단백질 및 침전된 단백질을 4-20% 농도구배 겔 상에서 PAGE하였다(도 10).
D46 바이러스의 경우, 면역침전된 단백질의 패턴은 SH 단백질의 비글리코실화된 형태, SH0 및 N-그리코실화된 형태, SHg를 포함한 반면, 어느 쪽도 D46/6368 바이러스로 분명하지 않았다(도 10). 또한 SH0단백질은 D46의 경우 전체 감염된 세포 단백질의 패턴 중에서 검출될 수 있었지만, D46/6368의 경우는 그렇지 않았다. 달리, D46/6368과 대비하여 D46에 의해 합성된 단백질의 패턴은 실질적으로 분간할 수 없었다. 면역침전된 단백질의 패턴 중의 N, P, M, F1 및 M2 단백질의 포스포이미지 분석은 두 바이러스에 의해 동량이 만들어진다는 것을 보여주었다(도 10).
상기에서 기술된 대로, 플라크 분석에 의한 D46 및 D46/6368 바이러스의 예비 비교는 시험관내에서의 성장에 차이점이 있음을 나타내었다. 따라서, 본 발명자들은 HEp-2 세포에서 플라크 크기 면에서 두 바이러스를 더 비교해 보았다. 단층이 배양되지 얼마 안되었고 과성장하지 않았음을 보증하도록 특별한 주의를 기울여야 했는데, 이는 이러한 차이가 플라크 크기에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 37℃에서 메틸셀룰로오즈하에서 7일간 배양 후, 메탄올로 단층을 고정화시키고 사진을 찍었다. 이는 플라크 크기에서 놀라운 차이가 있음을 보여주었다. 각각의 바이러스의 30개의 플라크의 측정은 D46/6368 바이러스의 플라크가 D46 바이러스의 그것보다 평균 70% 정도 크다는 것을 보여주었다.
D46 및 D46/6368 바이러스의 복제 효율을 비교하기 위해 상이한 종 및 상이한 조직 기원을 나타내는 8종의 상이한 세포주에 대한 성장 곡선 분석을 하기 위해 추가 실험을 수행하였다(표 42). 각각의 세포 유형의 3중 단충을 두 바이러스 중 하나로 감염시키고, 샘플을 12 또는 24 시간 간격으로 채취하고, 플라크 분석 및 항체 염색으로 정량하였다. 놀랍게도, 세 종의 세포주, 즉 HEP-2, 293 및 AGMK-21 세포에서 D46/6368 바이러스가 D46 야생형에 비해 높은 역가로 성장하였다. HEp-2 세포에서(도 11), 감염 36시간 후에 자손형 D46/6368 바이러스의 역가는 D46 바이러스의 2.6배보다 컸다. 293 세포에서(도 12), 감염 36시간 후에 D46/6368 바이러스의 수율은 2배보다 컸으며, 60시간 후 및 84시간 후에는 4.8 및 12.6배가 되었다. AGMK-21 세포에서(도 13), 감염 36시간 후에 D46/6368 바이러스의 수율은 3.2배보다 컸다. MRC-5, Vero, CV-1, MDBK 및 BT 세포에서는 돌연변이체와 야생형의 복제에서 상당한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 SH-음성 RSV가 실질적으로 숙주 범위 영향을 받지 않는다는 것을 나타내었다.
<표 42>
다양한 세포주에서 D46 바이러스와 비교한 D46/6368 바이러스의 복제
세포 유형 숙주 조직 유형 D46 바이러스와 비교한 D46/6368 바이러스 복제
HEp-2 사람 후두 증가
293 사람 신장 증가
MRC-5 사람 폐 유사
Vero 원숭이 신장 유사
AGMK-21 원숭이 신장 증가
CV-1 원숭이 신장 유사
BT 소 비개골 유사
MDBK 소 신장 유사
이들 및 다른 결과는 감염성 바이러스의 수율 및 플라크 크기에 기초할 때, 회수가능한 감염성 RSV 뿐만 아니라, 조직 배양에서 실질적으로 개선된 성장을 나타내는 재조합 RSV를 발생시킨다는 것을 입증한다. SH 결실에 의해 구체화된 조직 배양에서의 이러한 개선된 성장은 배양에서 RSV의 빈약한 수율을 극복함으로써 RSV 백신을 개발하는데 유용한 도구를 제공한다. 게다가, 이들 결실은 유전적 복귀에 대하여 매우 안정적이고, 이들로부터 유래된 RSV 클론은 백신으로서 특히 유용하다.
마우스에서 예시적 SH 결실 클론의 복제, 면역원성 및 방어 효율을 평가하기 위해, 0일에 24 마리의 호흡기 병원균이 없는 13 주령의 BALB/c 마우스를 동물 당야생형 재조합 D46 바이러스, SH 결실 재조합 D46/6368 바이러스, 또는 생물학적 유래의 저온 계대배양(cp) 온도 민감성 바이러스 cpts248/404의 접종물 0.1 ml 중 106 PFU로 가벼운 메톡시플루란 마취하에서 비강내 접종하였다 (Firestone 등, supra (1996), 본원에 참고로 인용됨). 후자의 바이러스는 설치류, 침팬지 및 사람에게서 매우 심도있게 특성화되었으며, 마우스의 상기도 및 하기도에서 복제가 매우 제한되었다. 접종 후 4, 5, 6 및 8일에, 각 군으로부터의 6마리 마우스를 CO2 질식에 의해 희생시키고, 비개골 및 폐 조직을 별도로 얻고, 균질화하고, 상술한 항체 염색법을 사용하여 바이러스의 정량을 위한 플라크 분석에 사용하였다.
상기도에서, SH 음성 D46/6368 바이러스는 약독화 표현형을 나타내었다 (도 14). 본 실시예에서, 복제 수준은 야생형 바이러스보다 10 배 더 낮았고, cpts248/404 바이러스에 필적하였다. 반대로, 하기도에서(도 15), D46/6368 바이러스의 복제 수준은 야생형과 매우 유사한 반면, cpts248/404 바이러스는 매우 제한되었다. 추가의 연구에서, 부모 D46 cDNA에 의해 코딩된 SH 음성 재조합 바이러스는 충분히 허용된 실험 동물인 나이브(naive) 침팬지에서, 상기도에서 약간 약독 화된 표현형을, 하기도에서 완만하게 약독화된 표현형을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이 돌연변이체는 또한 야생형 바이러스에 의한 감염에 대한 내성을 상당히 촉진하면서 나이브 침팬지에서 야생형 RSV와 비교하여 크게 감소된 질병 증후를 나타내었다 (Whitehead 등, J. Virol. 73: (4) 3438-3442 (1999), 본원에 참고로 인용됨).
상기 데이타는 부모 재조합 바이러스가 실험실 균주로부터 입수된 대로 조합되었을 때, 허용된 숙주에서 복제 및 독성에 필요한 원래의 유전자 전부를 함유한다는 것을 나타낸다. 예시적 유전자 결실 RSV 균주의 이들 및 다른 성질로부터 숙주는 백신으로 이용가능한 방법 및 균주를 갖게 된다
재조합 RSV의 면역원성 및 방어 효율을 추가로 평가하기 위해, 마우스의 4 개의 부가 군을 상술한 바와 같이 야생형 재조합체, SH 결실 유도체 또는 cpts248/404를 사용하여 접종시키거나 또는 유사감염시켰다. 4주 후에 마우스를 마취시키고, 혈청 샘플을 채취하고, 동물 당 106 PFU의 생물학적 유래의 RSV 균주 A2를 비강내 투여로 감염 접종시켰다. 4일 후, 동물을 희생시키고, 비개골 및 폐 조직을 회수하고, 상술한 바와 같이 감염성 RSV에 대해 분석하였다. RSV 균주 감염 세포로부터 면역친화 정제된 F 당단백질을 사용하여, RSV F 단백질에 결합하는 혈청 IgG 항체를 ELISA에서 정량하였다 (Murphy 등, supra, 1990).
D46 야생형, D46/6368 SH 음성 및 cpts248/404 바이러스에 대한 면역원성 분석으로부터 ㅇ일에 세 개의 바이러스 중 어느 것에 감염된 마우스는 높은 수준의 F 특이성 혈청 항체를 나타낸 것으로 밝혀졌다 (표 43). 이들 시험 숙주 모두는 상 기도 및 하기도에서 RSV 감염 바이러스에 매우 내성이었다. 따라서, SH 음성 돌연변이체는 마우스에서 RSV 특이성 혈청 항체 및 방어를 유발할 수 있는 이의 능력을 기초로 야생형 모본으로부터 구별할 수 없었다.
<표 43>
RSV D46/6368 SH-음성 바이러스는 면역원성이고 야생형 감형에 대한 쥐의 상기도 및 하기도를 방어한다
Figure 112001026244980-pct00047
10일에 BALB/C 마우스 군을 표시한 바이러스의 106 pfu로 비강내 면역화하였음.
2혈청 IgG 항체 반응을 RSV 아군 A로부터의 면역정제된 F 당단백질을 사용하는 ELISA에서 정량화하였음.
328일에 마우스에 RSV A2의 106 pfu를 비강내 투여하고, 4일 후에 죽임.
4야생형 재조합 바이러스.
5SH 음성 재조합 바이러스.
상이한 RSV 및 상이한 폐렴 바이러스의 SH 유전자의 비교는 유용한 RSV 재조합 백신을 생성하기 위한 부가의 도구 및 수단을 제공한다. 예를 들면, 두 개의 RSV 항원성 아군인 A 및 B는 일부 SH 도메인에서 상대적으로 높은 보존을 나타낸다. 상기 두 개의 도메인에서, N-말단 영역 및 추정 막 통과 도메인은 아미노산 수준에서 84%의 동일성을 나타내는 반면, C-말단 추정 도메인은 더 불일치한다 (약 50% 동일성) (collins 등, supra, 1990). 두 개의 사람 RSV 아군 B 균주인 8/60 및 18537의 SH 유전자의 비교로부터 단일 아미노산 차이만이 동정되었다 (Anderson 등, supra). 사람 대 소 RSV의 SH 단백질은 약 40% 동일하고, (i) 상술한 것과 유사한 보존 잔기의 비대칭 분포, (ii) 매우 유사한 소수성 프로필, (iii) 두 개의 N-연결 글리코실화 부위(하나의 부위는 소수성 영역의 각 편에 존재)의 존재, 및 (iv) 각 SH 단백질의 중앙 소수성 영역의 카르복시말단 쪽의 단일 시스테인 잔기를 포함하는 주요 구조적 특징을 공유한다 (Anderson 등, supra). 이들 및 다른 서열 유사성 및 차이를 평가함으로써, 감염성 RSV 클론내에서 치환되거나 또는 삽입될 수 있는 이종 서열(들)을 선별하여 다특이 면역원성 효과를 갖는 백신을 생성할 수 있다.
D46 및 D46/6368의 전사 분석으로부터 본 실시예 내에서 다른 중요한 점을 발견하였다. 두 바이러스의 전체 전사 수준은 실질적으로 동일한 반면, 노던 블롯 분석은 각 mRNA종의 축적에 있어서 어떠한 차이를 나타내었다. 주목할 것은, SH 유전자의 상류에 위치한 M 유전자의 전사는 두 바이러스에 있어서 실질적으로 동일하였다. 그러나, SH 유전자의 결실은 그 하류 근처의 G 유전자의 전사를 증가시켰 다 (도 16). 이 결과에 기초할 때, 선택 RSV 유전자의 전사 수준은 RSV 지도상에 있는 유전자의 각 극성 또는 근접성을 변화시킴으로서 간단하게 변화될 수 있다. 예를 들면, D46 바이러스의 G 유전자는 유전자 순서에 있어서 7 번째이나, SH 유전자가 결실됨으로서 6 번째 위치에 놓여서 전사 수준의 증가를 야기한다. 이러한 유전자 순서의 변화와 관련된 전사의 증가는 다른 재조합 바이러스 시스템에서 보고된 2.5 배 미만 내지 3 배인 것으로 관찰되었다 (예, Kuo 등, supra, (1996)).
상기 연구에서 나타난 다른 중요한 점은 G 유전자의 하류의 각 유전자의 발현이 SH 결실 돌연변이체에서 덜 효율적이었고, 이들 하류의 유전자에 의해 나타나는 D46/6368 대 야생형 D46 바이러스의 극성 구배가 더 심해졌다 (도 16). 주목할 것은, SH 결실 후 남겨진 D46/6368의 M-G 유전자간 영역의 길이는 65 nt였다. 이와 비교하여, 균주 A2에서 가장 긴 천연 유전자간 영역은 44 nt M-SH, 46 nt F-M2 및 52 nt G-F 유전자간 영역이고, 균주 18537의 F-M2 유전자간 영역은 56 nt이다 (Johnson 등, J. Gen. Virol. 69: 2901-2906 (1988), 본원에 참고로 인용됨). 크기가 1 내지 52 nt 범위인 균주 A2의 천연 유전자간 영역은 이중시스트론 미니게놈에서 전사 판독 및 극성에 미치는 영향에 있어서 실질적으로 다르지 않았다 (Kuo 등, supra, 1996). 그러나, 본 발명의 방법에 따른 52 nt G-F 영역보다 더 긴 영역의 시험을 통해 상위 한계를 설정할 수 있고, 그 한계 이후에 중합효소가 더 심하게 영향을 받는다. 따라서, SH 음성 결실 클론에서 관찰된 유전자 순서의 변화에 기인한 G 유전자 전사의 예상보다 낮은 증가, 및 하류의 유전자의 감소된 전사는 M와 G 사이에 설계된 더 큰 길이의 유전자간 영역 때문일 수 있다. 이와 관련 하여, 본 발명 내의 RSV 클론의 유전자간 영역의 선택된 길이를 조절하는 것은 유용한 RSV 백신을 생성하기 위한 부가의 도구 및 수단을 제공할 것으로 기대된다.
상기 발견은 RSV 유전자 발현의 수준을 변화시키기 위한 두 개의 부가의 방법을 제공한다. 첫 째, 비필수 유전자의 결실은 하류의 유전자의 발현을 증진시킬 수 있다. 둘 째, 야생형보다 더 긴 유전자간 영역의 삽입은 하류의 유전자의 전사를 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 하류의 유전자의 발현 수준의 감소는 허용된 숙주(예, 침팬지 및 사람)에서 재조합 RSV의 약독화된 표현형을 구체화할 것으로 기대된다.
SH 음성 바이러스가 조직 배양에서 잘 성장하고 상기도에서 위치 특이성 약독화를 나타낸다는 발견은 백신 개발을 위한 신규한 장점을 제공한다. 생바이러스로서의 평가하에 있는 RSV 균주는 예를 들면, cp 돌연변이(점진적으로 더 낮은 온도에서 막대한 계대배양 중 얻어지고, cpRSV 균주를 생성함)를 함유한다. 예시적 cp 돌연변이는 N, F 및 L에서 5 개의 아미노산 치환을 포함하고, 온도 민감성 또는 저온 적응성을 부여하지 않는다. 나아가, 이들 돌연변이는 조직 배양에서의 성장에 크게 영향을 미치지 않는다. 이들은 침팬지 및 사람의 기도에서 하기도에서 복제를 약 100 배 제한하므로, 이들은 숙주 범위 돌연변이이다. 돌연변이의 다른 예시적 유형인 ts 돌연변이는 cpRSV의 화학적 돌연변이형성에 의해 얻어졌다. 이 유형의 돌연변이는 상기도로부터 하기도로의 증가하는 체온의 구배로 인하여, 하기도에서 바이러스 복제를 제한하는 것을 선호하는 경향이 있다. 이들 cp 및 ts 돌연변이체와 달리, 본원에 기술한 SH 음성 돌연변이체는 상기도에서 더 크게 제한되는 독특한 표현형을 갖는다. 주로 코를 통해 호흡하는 취약 연령 군에서는 안정한 백신 투여를 보장하기 위해 상기도에서 복제의 제한이 요구되므로, 이것은 매우 어린 유아에서의 사용을 위한 백신 바이러스에 있어서 특히 바람직하다. 나아가, 어떠한 연령 군에서도, 상기도에서 감소된 복제는 중이염으로부터의 사망률을 감소시킬 것이다. 이러한 장점 뿐만 아니라, 예를 들면, 거의 400 nt, 및 mRNA 전체의 제거를 포함하여, SH 결실 돌연변이의 성질은 복귀에 메우 내성일 어떠한 유형의 돌연변이를 제공한다.
실시예 XIV
이종 서열이 도입되지 않은, SH 유전자가 결실된 재조합 RSV
본 실시예는 상기 실시예 XIII에서 실시한 바와 같이, 이종 서열을 도입하지 않고 SH 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제거함으로써, SH 단백질의 발현이 제거된 재조합 RSV의 생성을 기술한다. 상기 실시예에서, SH 코딩 서열이 제거된 RSV 클론 D46/6368은 또한 가장 긴 천연 균주 A2 유전자간 영역의 52 뉴클레오티드와 비교하여 길이가 65 뉴클레오티드로 확대된 M-G 유전자간 영역을 특징으로 하였다. 또한, 이 유전자간 영역은 SmaI 부위를 포함하는 이종 서열을 함유하였다. 이들 변화는 하류의 유전자의 전사 효율을 감소시키는 것과 같은 일부 유리한 결과를 야기한다. 그러나, 다른 적용에 있어서, 본 실시예에서 예시된 바와 같이(도 17), 이종 서열의 도입을 수반하지 않는 결실 또는 변화를 달성하는 것이 바람직하다.
상술한(실시예 VII 참조) D13 플라스미드는 선도 영역을 포함하는 게놈의 왼 쪽 말단에 부착된 T7 프로모터, 및 NS1, NS2, N, P, M 및 SH 유전자(완전 15,223 안티게놈 서열에서 1 내지 4623의 서열 위치)를 함유한다. ScaI(위치 4189) 내지 PacI(위치 4623) 단편을 하기 두 개의 부분 상보적 합성 올리로뉴클레오티로 대체하였다: ACTCAAATAAGTTA AT [SEQ ID NO:7] (정방향 가닥, ScaI의 절반 부위는 좌측에 이탤릭체화하고, PacI 점착성 말단은 우측에 이탤릭체화하고, GE 신호 부분은 밑줄로 나타냄), 및 TAACTTATTTGAGT [SEQ ID NO:8] (역방향, ScaI의 절반 부위는 우측에 이탤릭체화하고, GE 신호 부분은 밑줄로 나타냄). 이 돌연변이는 M GE 신호, M-SH 유전자간 영역 및 완전 SH 유전자의 결실을 야기하였고, M 유전자의 GE 신호를 대체할 때까지 SH GE 신호를 이동시키는 효과를 나타내었다. 어떠한 이종 뉴클레오티드도 도입되지 않았다. 생성된 cDNA(D13/6340라고 함)를 G-F-M2 cDNA 단편과 연결(실시예 VII 참조)시켜서 선도 영역으로부터 L 유전자의 개시 부분까지 관통하는 D50/6340을 생성하였다.
D50/6340의 StuI-BamHI 단편(F 및 M2 유전자를 포함하여 위치 5613-8501을 관통함)을 절단하고, 상술한 F 유전자에 두 개의 "HEK" 변화를 함유하는 것을 제외하고는 동일유전자인 D50-COR#1의 동등한 단편으로 대체하였다. 생성된 D50/6340HEK를 사용하여 안티게놈 cDNA의 나머지, 플랭킹 리보자임 및 T7 전사 종결자를 함유하는 D39sites#12의 BamHI-MluI 단편을 수용하였다 (실시예 IX 참조). D39sites#12는 "위치" 돌연변이를 함유하는 D39이다 (표 39 참조). 이것은 SH 유전자가 결실된 안티게놈을 코딩하고 "HEK" 및 "위치" 변화를 함유하는 D46/6340HEK를 생성하였다. D46/6340 안티게놈 cDNA는 부모 D46 cDNA보다 417 bp가 더 짧다. ScaI 및 PacI 합성 삽입체 서열은 디데옥시뉴클레오티드 서열화에 의해 확인하였다. 이어서, cDNA를 사용하여 상술한 방법에 의해 재조합 바이러스를 성공적으로 회수하였다. 회수한 D46/6340 SH 결실 바이러스는 플라크 표현형 및 성장 특성에 기초할 때, 실시예 XIII에서 기술한 D46/6368 SH 결실 바이러스와 유사하였다.
실시예 XV
NS2 단백질 발현의 녹-아웃
본 실시예는 RSV 단백질인 NS2 합성의 소멸을 예시한다. 이 경우에 소멸을 위해 선택된 방법은 전사 개방 해독틀(ORF)에 종결 코돈을 도입하는 것이었다.
D13은 T7 프로모터, 선도 영역, 및 NS1, NS2, N, P, M 및 SH 유전자(서열 위치 1 내지 4623)를 포함하여 완전 안티게놈 cDNA의 왼쪽 말단을 나타내는 cDNA이다 (도 18). T7 프로모터, 및 NS1 및 NS2 유전자를 함유하는 이 cDNA의 AatII-AflII 단편을 pGem 벡터로 서브클론하고, 올리고뉴클레오티드 방향성 돌연변이유발을 받게 하여, 전사 수준에서 잠재되고 마커로 작용하는 XhoI 부위와 함께 두 개의 전사 종결 코돈을 NS2 ORF에 도입하였다 (도 18). 돌연변이 서열을 확인하고, AatII-AflII 단편을 D13에 도입한 다음, G, F 및 M2 유전자를 함유하는 PacI-BamI 단편과 연결시켜서, 삽입된 돌연변이를 함유하는 cDNA D50을 얻었다. 이어서, 이것을 D39의 삽입체와 연결하여 완전 안티게놈 cDNA를 얻고, 이것을 재조합 바이러스를 회수하는데 사용하였다. 재조합 바이러스에서 돌연변이의 존재는 RT-PCR 생성물의 서열화 및 XhoI 소화에 의해 확인하였다. 뿐만 아니라, NS2 단백질의 합성의 부존재는 NS2의 C 말단을 제공하는 합성 펩티드에 대해 야기된 토끼 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다.
도 19는 SH 음성 바이러스에 대해 상술한 방법을 사용하여, NS2 녹-아웃 바이러스를 재조합 야생형과 비교하는 성장 곡선을 나타낸다. 이 결과는 감염성 바이러스의 유리 속도가 야생형과 비교하여 NS2 녹-아웃 바이러스에서 감소되었다는 것을 입증한다. 뿐만 아니라, 돌연변이체 및 야생형 바이러스의 플라크의 비교는 NS2 녹-아웃에서 그 크기가 크게 감소하였다는 것을 나타내었다. 따라서, 이러한 유형의 돌연변이를 생육가능한 재조합 RSV에 포함시켜서 변화된 표현형(이 경우에, 바이러스의 성장 속도의 감소 및 시험관내 플라크 크기의 감소)을 얻을 수 있다. 따라서, 이들 다른 녹-아웃 방법 및 돌연변이체는 시험관내 감소된 플라크 크기와 생체내 약독화 사이의 공지된 상호관계에 기초하여, 부가의 재조합 RSV 백신 물질을 제공한다.
실시예 XVI
시스 작용 조절 서열 인자의 변화에 의한 RSV 표현형의 조절
본 실시예는 예시적 유전자인 NS1 및 NS2의 시스 작용 전사 신호를 변화시킴으로써 재조합 RSV 바이러스의 성장 속성을 조절하는 것을 예시한다.
D13의 서브클론 AatII-AflII 단편을 올리고뉴클레오티드 방향성 돌연변이유발시켜서 NS1 및 NS2 유전자의 GE 신호에 변화를 도입하였다 (도 20). NS1 GE 신호는 단일 뉴클레오티드 치환을 보유한 반면, NS2의 GE 신호는 세 개의 치환 및 하나의 삽입을 보유하였다. 이들 변화는 각 신호를 N 유전자의 천연 GE 신호와 동일하게 변화시키는 효과를 나타내었다.
이들 돌연변이는 디데옥시뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인하였고, AatII-AflII 단편을 D13으로 치환한 후, 상술한 단계를 경유하여 돌연변이를 함유하는 완전 D53 DNA를 구성하였다. 이 클론을 사용하여 재조합 바이러스를 회수하였다.
GE 돌연변이체 바이러스를 HEp-2 세포에서 분석하고, 플라크 크기 및 성장 곡선에 관하여 야생형 바이러스와 비교하였다. 이것은 플라크 크기가 야생형보다 더 크고(평균 30% 더 큼), 성장 속도 및 바이러스 수율이 증가하였다는 것을 나타내었다. 이들 결과는 예를 들면, 판독 mRNA의 수준을 감소시키고 하류의 유전자로부터의 단백질 발현을 증가시키기 위해 시스작용 인자를 변화시킴으로써 유전자 발현을 조절하는 것과 일치한다. 생성된 재조합 바이러스는 바람직하게는 증가된 성장 반응속도론 및 증가된 플라크 크기를 나타낼 것이고, 이것은 게놈 또는 안티게놈에서 시스 작용 조절인자를 변화시킴으로써 RSV 표현형을 변화시키는 유일한 한 예를 제공한다. 이들 및 다른 실시예는 효과적인 백신 물질을 제공하는데 유리한 표현형 변화에 특이적인 광범위한 RSV 돌연변이를 나타낸다.
실시예 XVII
NS1 유전자 결실을 갖는 재조합 RSV
본 실시예는 NS1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 제거에 의해 상기 단백질의 발현이 소멸된 재조합 RSV의 생성을 기술한다. NS1 단백질은 3'에서 5' 방향의 RSV 유전자 지도에서 첫 번째 유전자에 의해 코딩되는 작은 139개 아미노산종이다 (Collins 및 Wertz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3208-3212 (1983), 및 Collins 및 Wertz, Virol. 243:442-451 (1985)). 이의 mRNA는 RSV mRNA 중 가장 풍부하고, 이것은 3' 말단의 프로모터로부터 거리가 증가할수록 유전자 발현의 효율이 감소되도록 전사의 구배가 존재한다는 일반적인 발견과 일치한다. 주의깊은 정량적 비교의 수행이 남아있지만, NS1 단백질은 가장 풍부하게 발현되는 RSV 단백질 중의 하나이다. 그 풍부성에도 불구하고, NS1 단백질의 기능은 아직 명확하게 확인되지 않았다. 미니게놈의 전사 및 RNA 복제가 플라스미드에 의해 공급된 바이러스 단백질에 의해 구동되는 재구성 RSV 미니게놈 시스템(Grosfeld 등, J. Virol. 69:5677-5686 (1995), Collins 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:81-85 (1996))에서, NS1 단백질은 전사 및 RNA 복제에 대한 음성 조절 단백질로 보였다. 따라서, 이것은 조절 단백질일 수 있다. 확인해야 할 다른 기능이 존재할 가능성이 높다. NS1 단백질은 다른 파라믹소바이러스에서 공지의 대응물을 가지지 않는다. 이론에 의해 제한하려고 하는 것은 아니나, NS1 단백질의 몇몇 기능이 존재할 수 있다: (i) 이것은 위에서 제시한 바와 같이, 바이러스 조절 인자일 수 있고, (ii) 바이러스 성장 사이클의 일부 다른 측면에 관여되어 있을 수 있고, (iii) 예를 들면, 고사(apoptosis)를 방지하기 위해 숙주 세포와 상호작용할 수 있고, (iv) 예를 들면, 인터페론 생성, 항원 처리, 또는 B 또는 T 세포 기능과 같은 숙주 방어 시스템을 억제하기 위해, 숙주 면역 시스템과 상호작용할 수 있다. 이러한 모든 NS1의 잠재적 작용은 RSV 재조합 백신에서 부가의 장점을 야기할 수 있다.
NS1 유전자 기능의 선택된 붕괴를 갖는 재조합 RSV를 생성하기 위해, NS1 단 백질을 코딩하는 서열을 부모 RSV cDNA로부터 전부 제거하였다. 이 예시적 결실에서, 돌연변이유발 반응에 대한 기질은 T7 RNA 프로모터, 선도 영역, 및 NS1, NS2, N, P, M 및 SH 유전자를 포함하는 완전 안티게놈 cDNA의 왼쪽 말단(서열 위치 1 내지 4623)을 함유하는 상술한 플라스미드 D13이었다. 목적하는 변화를 포함하는 합성 프라이머를 플라스미드 상에서 마주보는 방향으로 향하게 한 후, PCR로 증폭시키고, 연결하고, 박테리아로 트랜스팩션시키는 방법 (Byrappa 등, Genome Res. 5:404-407 (1995))에 의해 돌연변이를 유발하였다. 정방향 PCR 프라이머는 GACACAACCCACAATGATAATACACCAC [SEQ ID NO:9] (NS2 ORF의 두 번째 코돈을 이틸릭체로 함)였고, 및 역방향 PCR 프라이머는 CATCTCTAACCAAGGGAGTTAAATTTAAGTGG [SEQ ID NO:10] (NS2 ORF의 시작 코돈에 대한 상보 서열을 이탤릭체로 함)였다. D13을 고 적합도의 중합효소를 사용하는 PCR에 있어서 주형으로 사용하였다. 결실은 NS1 ORF의 AUG 개시 부위의 바로 상류로부터 NS2 ORF의 AUG 개시 부위의 바로 상류에까지 관통하도록 하였다. 이것은 NS1 코딩 영역, NS1 GE 신호, NS1-NS2 유전자간 영역 및 NS2 GS 신호를 포함하는 529 bp의 결실을 야기하였다. 이것은 NS1 유전자의 상류의 말단, 즉, 이의 GS 및 비단백질 코딩 영역을 NS2 ORF와 융합시키는 효과를 나타내었다. NS1 유전자의 이 부분은 이것이 선도 영역에 인접해 있고, 따라서 전사 또는 RNA 복제에 있어서 중요한 서열을 함유할 수 있으므로, 명백히 보유되었다. 서열 분석에 의해 돌연변이를 함유하는 영역을 확인하였다. 이어서, Aat2와 Avr2 부위 사이의 ~2230 bp를 절단하여 D13의 신선한 카피에 삽입하였고, 이 단계에 의해 RSV cDNA의 기타 영역에서 PCR 오류의 가능성을 막을 것이다. NS1의 결실 을 함유하는 D13 플라스미드(D13△NS1)를 사용하여 "HEK" 및 "위치" 변화를 함유한 완전 안티게놈(D53△NS1)을 구성하였다.
이어서, D53△NS1 플라스미드를 사용하여 바이러스를 회수하였다. 흥미롭게도, 회복된 RSV△NS1 바이러스는 조직 배양에서 작은 플라크를 생성하였다. RT-PCR에 의해 결실의 존재를 확인하였다. 효율이 감소되긴 하였지만, RSV△NS1 바이러스가 성장할 수 있다는 사실은 NS1 단백질이 바이러스 성장에 없어도 되는 부수 단백질이라는 것을 나타낸다. RSV△NS1 바이러스의 플라크 크기는 전사 종결 코돈을 NS2 단백질의 코딩 서열에 도입함으로써 NS2 단백질의 발현이 소멸된(실시예 XV) 상술한 NS2 녹아웃 바이러스와 유사하였다. 작은 플라크 표현형은 일반적으로 약독화 돌연변이와 관련되어 있다. 따라서, 이러한 유형의 돌연변이를 생육가능한 재조합 RSV에 도입하여 변화된 표현형을 얻을 수 있다. 따라서, 이들 및 다른 녹아웃 방법 및 돌연변이체는 시험관내 플라크 크기와 생체내 약독화 사이의 공지의 상호관계에 기초하여, 부가의 재조합 RSV 백신 물질을 제공할 것이다.
실시예 XVIII
NS2 유전자가 결실된 재조합 RSV
본 실시예는 NS2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 제거에 의해 상기 단백질의 발현이 소멸된 재조합 RSV의 생성을 기술한다. 상기 실시예 XV에서는, 코딩 서열을 제거하는 것이 아니라 번역 종결 코돈을 코딩 서열에 도입함으로써, NS2 유전자의 발현이 소멸된 재조합 바이러스(소위 NS2 녹아웃 또는 NS2-KO)를 생성하였다.
원형 NS2-KO 바이러스에서 NS2 단백질의 발현의 소멸은 작은 플라크 표현형 및 시험관내에서 바이러스 성장의 감소된 반응속도론과 관련되어 있다. 후속적 분석은 NS2-KO의 계대배양시, 야생형 성장 특성으로 역전된 낮은 수준의 바이러스를 회수하는 것이 가능하다는 것을 나타내었다. 서열 분석은 코딩 할당이 부모 야생형 바이러스와 다르기는 하지만, 두 개의 도입된 번역 종결 코돈이 센스 코돈을 돌연변이시켰다는 것을 나타내었다. 이것은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인된 바와 같이, 야생형 표현형을 설명하는 NS2 단백질의 합성을 회복하기에 충분하였다. 본 전략은 완전 NS2 유전자가 제거되어 동일 부위 역전이 일어날 수 없으므로, 개선점을 제공한다.
NS2 단백질은 유전자 순서에서 두 번째 유전자에 의해 코딩되는 작은 124개의 아미노산종이다 (Collins 및 Wertz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:3208-3212 (1983), 및 Collins 및 Wertz, Virol. 243:442-451 (1985)). 이의 mRNA는 RSV mRNA 중 두 번째로 가장 풍부하고, 주의깊은 정량적 비교의 수행이 남아있긴 하지만, NS2 단백질은 가장 풍부하게 발현되는 RSV 단백질 중의 하나이다. 그 풍부성에도 불구하고, NS1 단백질의 기능은 확인되지 않았다. 미니게놈의 전사 및 RNA 복제가 플라스미드에 의해 공급된 바이러스 단백질에 의해 구동되는 재구성 RSV 미니게놈 시스템(Grosfeld 등, J. Virol. 69:5677-5686 (1995), Collins 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:81-85 (1996))에서, NS2 단백질은 전사 및 RNA 복제에 대하여 완만한 음성 조절 효과를 나타내었다. 이 효과를 관찰하기 위해서는 상대적으로 높은 수준의 NS2 단백질 발현이 요구되고, 따라서, 이의 중요성은 명확하지 않다. 따라서, NS1 단백질에 대해 제안된 바와 같이, NS2 단백질은 (i) 바이러스 조절 인자일 수 있고, (ii) 바이러스 성정 사이클의 일부 다른 측면에 관여되어 있을 수 있고, (iii) 예를 들면, 고사를 방지하기 위해 숙주 세포와 상호작용할 수 있고, (iv) 예를 들면, 인터페론 생성, 항원 처리, 또는 B 또는 T 세포 기능과 같은 숙주 방어 시스템을 억제하기 위해, 숙주 면역 시스템과 상호작용할 수 있다. 이러한 모든 NS1의 잠재적 작용은 본원에 기술한 방법 및 전략에 따라 본 발명 내에 포함되어 RSV 재조합 백신에서 부가의 장점을 야기할 수 있다.
NS2 유전자 기능의 선택된 붕괴를 갖는 재조합 RSV를 생성하기 위해, 이의 mRNA를 코딩하는 서열을 부모 RSV cDNA로부터 제거하였다. 이 예시적 결실에서, 돌연변이유발 반응에 대한 기질은 T7 RNA 프로모터, 선도 영역, 및 NS1, NS2, N, P, M 및 SH 유전자를 포함하는 완전 안티게놈 cDNA의 왼쪽 말단(서열 위치 1 내지 4623)을 함유하는 상술한 플라스미드 D13이었다. 목적하는 변화를 포함하는 합성 프라이머를 플라스미드 상에서 마주보는 방향으로 향하게 한 후, PCR로 증폭시키고, 연결하고, 박테리아로 트랜스팩션시키는 방법(Byrappa 등, Genome Res. 5:404-407 (1995))에 의해 돌연변이를 유발하였다. 정방향 PCR 프라이머는 TTAAGGAGAGATATAAGATAGAAGATG [SEQ ID NO:11] (NS2 N 유전자간 영역을 밑줄로 나타내고, N GS 신호의 첫 뉴클레오티드를 이탤릭체로 함)였고, 및 역방향 PCR 프라이머는 GTTTATATTAACTAATGGTGTTAGTG [SEQ ID NO:12] (NS1 GE 신호에 대한 상보 서열을 밑줄로 나타냄)였다. D13을 고 적합도의 중합효소를 사용하는 PCR에 있어서 주형으로 사용하였다. 결실은 NS1 GE 신호의 바로 하류로부터 NS2 GS 신호의 바로 상류에까지 관통하도록 하였다 (도 22). 따라서, 상기 돌연변이는 NS1-NS2 유전자간 영역 및 완전 NS2 유전자를 포함하는 522 뉴클레오티드의 결실을 야기하였다 (도 22).
상기 결실을 함유하는 D13 플라스미드에서, 서열 분석에 의해 돌연변이 영역을 확인하였다. 이어서, Aat2와 Avr2 부위 사이의 ~2230 bp를 절단하여 D13의 신선한 카피에 삽입하였고, 이 단계는 RSV cDNA의 기타 영역에서 PCR 오류의 가능성을 막을 것이다. NS2의 결실을 함유하는 D13 플라스미드(D13△NS2)를 사용하여 모든 "HEK" 및 "위치" 변화를 함유한 완전 안티게놈(D53△NS2)을 구성하였다.
이어서, D53△NS2 플라스미드를 사용하여 바이러스를 회수하였다. NS2-KO 바이러스에 대해 상술한 바와 같이(실시예 XV 참조), 회복된 RSV△NS2는 작은 플라크를 생성하였다. RT-PCR에 의해 결실의 존재를 확인하였다. 효율이 감소되긴 하였지만, RSV△NS2 바이러스가 성장할 수 있다는 사실은 NS2 단백질이 바이러스 성장에 없어도 되는 부수 단백질이라는 것을 나타낸다. 작은 플라크 표현형은 일반적으로 약독화 돌연변이와 관련되어 있고, 따라서, 이러한 유형의 돌연변이를 생육가능한 재조합 RSV에 도입하여 변화된 표현형을 얻을 수 있다. 이들 발견과 일치하게, NS2 결실 돌연변이체는 나이브 침팬지에서 상기도에서 완만하게 약독화된 표현형을, 하기도에서 매우 약독화된 표현형을 나타내었다. 이 돌연변이체는 또한 야생형 바이러스에 의한 감염에 대한 내성을 상당히 자극하면서 침팬지에서 질병 증후를 크게 감소시켰다 (Whitehead 등, J. Virol. 73:(4) 3438-3442, 본원에 참고로 인용됨). 따라서, 이들 및 다른 녹아웃 방법 및 돌연변이체는 시험관내 플라크 크기와 생체내 약독화 사이의 공지의 상호관계에 기초하여, 부가의 재조합 RSV 백신 물질을 제공할 것이다.
실시예 XIX
G 당단백질의 분비형에 대한 번역 개시 부위의 제거
본 실시예는 G 당단백질의 분비형에 대한 번역 개시 부위가 제거된 재조합 RSV의 생성을 기술한다. RSV G 단백질은 두 개의 형태로 합성된다: 고정된 타입 II 내재성 막 단백질, 및 본질적으로 모든 막 앵커(anchor)가 결핍되어 있고 분비되는 N 말단적으로 재선택된 형태(Hendricks 등, J. Virol. 62:2228-2233 (1988)). 두 형태는 두 개의 상이한 개시 부위에서 번역 개시에 의해 유도된 것으로 나타났다: 더 긴 형태는 G ORF의 첫 AUG에서 개시하고, 두 번째는 코돈 48에서 ORF의 두 번째 AUG에서 개시하고 단백질분해에 의해 추가로 가공된다 (Robert 등, J. Virol. 68: 4538-4546 (1994)). 이 두번째 개시 부위의 존재는 고도로 보존되어 있고, 현재까지 서열화된 사람, 소 및 양의 모든 균주에 존재한다. G 단백질의 가용성 형태는 중화 항체를 트랩하는 유인물로 작용함으로써 숙주 면역화를 완화시킬 수 있다고 제안되었다. 또한, 가용성 G는 Th2에 치우친 반응의 우선적 자극에 관련되어 있고, 이것이 RSV에 대한 후속적 노출시 증진된 면역병리학과 관련되어 있는 것으로 보인다. RSV 백신 바이러스에 있어서, 항체 트래핑 또는 면역 시스템의 불균등한 자극을 최소화하는 것이 매우 바람직할 것이고, 따라서, G 단백질의 분비 형태의 발현을 소멸하는 것이 바람직할 것이다. 이것은 바이러스를 직접 약독화하는 것이 아니라, 숙주 면역 반응을 질적으로 및(또는) 양적으로 변화시킴으로써 작용 하는 돌연변이의 한 유형을 제공할 것이다.
문헌[Byrappa 등, Genome Res. 5: 404-407 (1995)]의 방법에 의한 PCR 돌연변이유발에서 G, F 및 M2 유전자를 함유하는 플라스미드 pUC19(실시예 VII 참조)를 주형으로 사용하였다. 정방향 PCR 프라이머는 TTATAATTGCAGCCATCATATTCATAGCCTCGG [SEQ ID NO:13]였고, 역방향 프라이머는 GTGAAGTTGAGATTACAATTGCCAGAATGG [SEQ ID NO:14] (두 개의 뉴클레오티드 변화의 상보 서열을 밑줄로 나타냄)였다. 이것은 두 개의 아미노산 코딩 변화(도 23 참조), 즉, 번역 개시 부위를 제거하는 AUG-48의 AUU-48로의 변화, 및 돌연변이를 모니터하기 위한 MfeI 부위의 삽입에 기여하는 AUA-49의 GUA-49로의 변화를 야기하였다.
디데옥시뉴클레오티드 서열화에 의해 돌연변이 부위 주위의 서열을 확인하였다. 이어서, G 유전자를 함유하는 PacI-StuI 단편을 선도로부터 L 유전자의 시작부위의 첫 9개의 유전자를 함유하는 상술한 플라스미드 D50으로 치환하였다. 이어서, 이것을 사용하여 완전 안티게놈 cDNA인 D53/GM48I를 구성하고, 이것을 사용하여 바이러스를 회수하였다. 이들 돌연변이는 G cDNA가 재조합 우두 바이러스에 의해 다른 RSV 유전자로부터 단리되어 발현되는 조건 하에서 G의 분비 형태의 발현을 소멸하는 것으로 이미 밝혀졌다 (Roberts 등, J. Virol. 68: 4538-4546 (1994)).
회수된 D53/GM48I 바이러스 중 두 개의 단리물을 시험관 내에서 야생형 재조합 RSV와 함께 성장 반응속도론에 대해 평가하였다 (도 24). 이것은 두 바이러스가 야생형보다 좀더 서서히 성장하고, 역가가 좀더 낮다는 것을 나타내었다. 이러한 성장의 차이는, 분비 형태의 AUG-48은 제거된 반면 본 실시예에서 막 결합 형태 의 AUG-1은 발현을 증가시키도록 변화되지 않았기 때문에 일어났을 것으로 예상되는 G 단백질의 감소된 발현에 기인할 수 있다. 본질적으로, G ORF의 AUG-1의 발현은, G ORF의 AUG-1과 겹치는 짧은 ORF를 개방함으로써 이의 발현을 감소시키는 다른 해독틀에서 다른 AUG가 G 서열에서 이것에 선행하기 때문에, 부최적화되는 것으로 생각된다. 이 ORF를 제거하기 위한 안티게놈 cDNA의 부가의 변경을 통해 충분한 성장 속성을 회복할 수 있을 것으로 예상된다. 별법으로, 단독으로 또는 협동하여 작용하는 위치 48 및 49에서의 돌연변이는 G 단백질의 기능을 손상시킬 것이다. 위치 49의 아미노산을 천연 코딩 배정으로 회복시킬 수 있고, 위치 48에서 충분한 성장 속성을 회복시킬 수 있는 별도의 아미노산 치환을 선택할 수 있다. 이들 가능성은 본원에 기술한 방법 및 물질을 사용하여 쉽게 평가될 수 있다. 그럼에도 불구하고, D53/GM48I 바이러스의 회수는 분비 형태에 대한 번역 개시 부위를 제거할 수 있고, 이 바이러스를 실험 동물 및 사람에서의 평가를 위해 이용할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 XX
RSV 아군 B에 대한 약독화 키메릭 RSV 백신 바이러스의 생성
본 실시예는 아군 B RSV에 특이적인 생약독화 키메릭 백신의 생성을 기술한다. 선행하는 실시예들은 생물학적 유래의 돌연변이체로부터 선택된 돌연변이 뿐만 아니라, RSV A 게놈내의 일련의 다른 정의된 뉴클레오티드 변화를 포함하여 선택가능한 약독화 돌연변이를 갖는 다양한 RSV 아군 A 생약독화 백신의 생성을 설명한다. 이들 변화의 각각은 개별적으로 또는 총 배열의 조합으로 전체 길이의 cDNA 클론에 도입하기에 알맞고, 각 회수된 재조합 바이러스의 표현형은 백신으로 사용하기 위해 목적하는 수준의 약독화를 부여하도록 쉽게 특성화되고 확인될 수 있다.
생약독화 RSV 백신은 이상적으로는 다수의 RSV 균주 및(또는) 아군에 대해 유효해야 한다. 이와 관련하여, 어느 한 균주에 대한 회복기 환자의 혈청은 다른 균주를 중화할 것이므로, RSV는 혈청학적으로 단형인 것으로 고려된다. 그러나, 교차 중화의 효율은 상이한 균주에서 차이가 있다는 것이 오랫동안 인식되어 왔다 (Coates. Alling 및 Chanock, 1966). 보다 최근에는, 모노클론 항체를 사용한 연구 및 서열 분석에 의해, RSV 균주가 두 개의 항원성 아군 A 및 B로 분류될 수 있다는 것이 밝혀졌다 (Anderson 등, J. Infect. Dis. 151(4): 626-33 (1985); Collins 등, J. Gen. Virol. 71(Pt 7): 1571-6 (1990); Johnson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16): 5625-9 (1987b); Mufson 등, J. Gen. Virol. 66(Pt 10): 2111-24 (1985)).
게놈 전체에 있어서 RSV A와 B 아군 사이에 서열 차이가 존재하나, 차이의 정도는 균일하지 않다. 가장 불일치한 두 영역은 G 및 SH 단백질의 세포외 영역이고, 아미노산 수준에서 각각 56 및 50%가 불일치한다 (Collins 등, J. Gen. Virol. 71 (Pt 7): 1571-6 (1990); Johnson 등, J. Gen. Virol. 69 (Pt 10): 2623-8 (1988); Johnson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (16): 5625-9 (1987b), 각각 본원에 참고로 인용됨). 제3 RSV 막통과 표면 단백질인 F 당단백질은 아군 사이에 아미노산 수준에서 11% 차이가 난다 (Johnson 등, J. Gen. Virol. 69(Pt 10): 2623-8 (1988)). 두 개의 주요 방어 항원인 G 및 F 단백질에 대한 두 아군 사이의 항원 관련성 백분율은 각각 5% 및 50%로 측정되었다 (Johnson 등, J. Virol. 61(10): 3163-6 (1987b)). 이러한 차이로 인해 두 항원성 아군 모두가 RSV 백신, 특히 G 당단백질에 제공되어야 한다.
아군 B에 있어서, 필적하는 한 패널의 약독화 후보 백신 또는 바이러스를 생성하기 위한 이로부터의 cDNA 조합은 아직 입수가 불가능하다. 그러나, 생약독화 아군 B 후보 백신의 초기 군이 제조되었다 (Crowe 등, J. Infect. Dis. 173 (4), 829-39 (1996a)). 이들 후보물질들은 SH 및 G 유전자의 자연발생적 결실로 인해 백신으로 사용하기에 만족스럽지 않을 수 있으나 (Karron 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94(25): 13961-6 (1977a)), 이들은 본 발명의 키메릭 RSV 내에서 사용하기 위한 유용한 돌연변이를 제공할 것이다.
본 실시예는 약독화 아군 A 바이러스가 아군 B RSV의 F 및 G 당단백질을 발현하는데 사용되는 RSV 아군 B 특이성 백신 바이러스를 제공한다. F 및 G 단백질은 주요 방어 항원이고 대부분의 RSV 아군 특이성을 부여하므로, 이 키메릭 바이러스는 아군 B에 대한 강한 면역 반응을 촉진할 것이다.
이 전략은 두 대체적 방법을 사용하여 실행될 수 있다. 하나는 아군 B 바이러스의 G 당단백질을 부가의 유전자로서 아군 A 백그라운드에 삽입하는 것이다. 따라서, 이 바이러스는 아군 A의 G 단백질 및 아군 B의 G 단백질의 두 G 단백질을 코딩할 것이다. 이와 관련하여, 문헌[Jin 등, Virology 251(1): 206-14 (1998)]에 부가의 유전자로서 아군 B의 G 단백질을 발현하는 아군 A 바이러스가 기재되어 있다. 그러나, F 단백질도 또한 상당한 아군 특이성을 나타내므로, 아군 B 특이성 백신에서 두 아군 B 당단백질을 발현하는 것이 바람직할 것이다. 게다가, 본원의 교시에 따라 적당한 약독화 및 면역원성을 달성하기 위해 아군 B 바이러스를 추가로 변화시키는 것이 바람직하다.
RSV 아군 B 백신을 얻기 위한 두 번째의, 더 바람직한 전략은 본 실시예에서 기술되고, 아군 A 재조합 cDNA 골격으로부터 G 및 F 유전자를 제거하고 이것을 아군 B RSV의 G 및 F 유전자로 대체하는 것이다. 따라서, 아군 A의 내부 단백질 및 아군 B의 외부 방어 항원을 함유하는 키메릭 RSV가 제공된다. 그 후, 상기로부터의 약독화 돌연변이를 아군 A 백그라운드에 체계적으로 포함시킴으로써, 이 바이러스를 본 발명의 방법에 따라 목적하는 수준으로 약독화시킬 수 있다. 아군 B 방어 항원을 함유하는 이 약독화 바이러스를 생물학적 유래의 또는 재조합 약독화 아군 A 바이러스와 결합시켜서 두 항원성 아군을 커버하는 2-성분 RSV 백신을 얻을 수 있다.
본원에 기술한 일반적인 방법에 따라, 하나의 아군, 예를 들면, RSV 아군 A를 제공하는 바이러스 균주의 게놈 또는 안티게놈 cDNA를 F 및 G 표면 당단백질 유전자가 이종 아군(본 실시예에서는, RSV 아군 B)의 바이러스로부터의 대응물로 대체되도록 변화시킨다. 이어서, 이 cDNA를 사용하여 RSV 뉴클레오캡시드 및 중합효소 단백질을 발현하는 플라스미드에 의해 지지된 게놈 또는 안티게놈 cDNA로 배양된 세포를 트랜스팩션시키는 것을 포함하는 상술한 방법에 의해 감염성 키메릭 바이러스를 생성한다 (각각 본원에 참고로 인용된 Collins 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567 (1995); 및 미국 특허 출원 제60/007,083호 참조). 생 성된 바이러스는 주요 방어 항원인 이종 아군 F 및 G 당단백질을 함유하므로, 이종 아군 바이러스에 의한 후속적 감염에 대해 매우 유효한 면역성을 유발할 것이다.
본 실시예 내에서, RSV 당단백질 또는 다른 관련 유전자 또는 유전자 단편은 단일로 치환될 수 있다. 그러나, 방어 항원의 경우에는, 이종 아군 바이러스에 대한 방어 효과는 두 개 이상의 면역원성 단백질 또는 에피토프가 제공될 때(단백질 전체 또는 이의 면역원성 영역의 도입에 의해) 훨씬 더 바람직하다. 또한, 다른 유전자를 치환하거나 또는 부가의 유전자로서 포함할 수 있다. 예를 들면, 제3 RSV 표면 당단백질을 코딩하는 유전자인 SH를 이종 아군 대응물로 치환하거나, 또는 키메릭 RSV내에 여분의 당단백질로 첨가할 수 있다 (예를 들면, 본원에 참고로 인용된 Bukreyev 등, J. Virol. 71(12): 8973-82 (1997) 참조). 서열 치환은 단일 또는 조합의 어떠한 RSV 유전자 또는 유전자 단편도 함유할 수 있다. 예를 들면, 이들은 번역 개방 해독틀(ORF)의 일부, 완전 ORF, 전사 신호, 시스 작용 인자 또는 임의의 조합을 포함하는 완전 유전자, 또는 이의 기능성 단편의 치환을 포함할 수 있다. 본 실시예에서, 전이된 유전자는 이의 수용체 대응물이 차지하는 동일 게놈 위치에 놓이나, 반드시 그럴 필요는 없다. 예를 들면, 발현을 증가 또는 감소시키기 위해, 공여체 유전자를 바이러스 프로모터로부터 더 가깝거나 더 멀리 이동시킬 수 있다.
본 발명의 태양을 실시할 때, 아군 A 또는 B RSV를 수용체로 하고, 다른 군을 공여체로 하여 사용할 수 있다. 본 실시예에서는, 아군 A 골격이 아군 B 당단백질 유전자에 대한 수용체이다. 또한, 본원에 기술한 특정 실시예는 A2 및 B1 균 주를 포함하나, 어떠한 아군 A 또는 B 균주도 사용될 수 있다. 부가의 아군 또는 중요한 항원성 변종이 미래에 출현할 수 있고, 또한 유전자 또는 유전자 단편 교환 및 전이를 위한 유용한 수용체 및(또는) 공여체 서열을 용이하게 제공할 수 있다.
본 실시예와 관련하여, 필요한 경우, RSV cDNA의 변화를 추가로 수행하여 cDNA가 최대한 안정하게 조작되고 증식될 수 있게 할 수 있다. RSV 서열의 불안정성은 일반적이고, 박테리아에서 증식 중 입증되는 것으로 생각된다. 그러나, RSV 서열의 불안정성은 또한 세포 배양에서 바이러스의 계대배양 중 관찰되었다. 특히, 베로 세포에서 계대배양 중 아군 B의 생물학적 유래의 cpRSV의 G 유전자가 결실되었다. 본 실시예에서는, 균주 B1 G 유전자의 유전자 말단 신호가 통상적인 방법에 의해 불안정한 것으로 측정되었다. 아미노산 코딩을 변화시키지 않거나 또는 시스 작용 신호를 크게 교란시키지 않는 방법으로 서열을 변화시키는 것은 우발적 변화없이 성공적으로 증식할 수 있는 cDNA를 야기하였다.
본 실시예에서 기술되고 확증된 전략의 세 번째 측면은 필요한 경우 약독화 돌연변이를 선택된 조합으로 도입함으로써 키메릭 RSV 골격을 변화시킬 수 있다는 것이다. 예를 들면, cp 돌연변이, ts 돌연변이 및 상기 특성화된 다양한 다른 돌연변이를 도입하여 균주 A2를 변화시킴으로서 목적하는 기능적 또는 표현형 특성(예, 바이러스의 약독화의 개선)을 얻을 수 있다.
이와 관련하여 이들 돌연변이는 바람직한 속성을 부여하는 임의의 치환, 삽입 또는 재배열을 포함할 수 있다. 예를 들면, SH 유전자의 결실은 더 큰 플라크 크기 및 일부 세포주에서 개선된 성장의 부가적 속성을 갖는다. 다른 바람직한 속 성은 개선된 항원 발현, 감소된 반응유발, 및 개선되거나 또는 변화된 면역원성을 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 중요하게는, 이들 돌연변이를 단계별로 및 다양한 조합으로 도입할 수 있음으로써, 다른 바람직한 속성 뿐만 아니라, 약독화와 면역원성 사이에 미세하게 조절된 균형을 달성할 수 있다.
본 실시예가 나타내는 바와 같이, 재조합 키메릭 A/B 바이러스는 세포 배양 및 침팬지에서 야생형과 유사하고 모균주 A2 및 B1 대해 관찰된 것 사이의 중간인 성장 특성을 나타낸다. 이것은 충분히 생육가능한 키메릭 바이러스를 쉽게 생산할 수 있고, 목적하는 변화를 달성하기 위해 추가로 조작할 수 있음을 나타낸다. 세포 배양에서 비제한된 성장 속성은 백신 바이러스의 생산에 있어서 중요하다. 또한, 충분히 생육가능하고 야생형과 유사한 바이러스가 목적하는 방식으로 후속적으로 약독화하기 위한 가장 적당한 기질이다. 추가로, 키메릭 A/B 바이러스의 성장 속성이 A2 모균주와 그다지 다르지 않기 때문에, A2 균주에 대해 동정된 바람직한 돌연변이의 도입은 AB 키메라에서 유사한 효과를 나타낼 것으로 예상된다.
하기에 더 기술되는 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 다양한 조합의 공지의 약독화 돌연변이를 A2 RSV 백그라운드에 삽입시킴으로써 변화된 한 패널의 6 개의 A/B 키메릭 바이러스를 개발하였다. 이들 예는 본원에 기재한 키메릭 A/B 바이러스에 대한 다수의 다른 변화를 쉽게 달성하여 부가의 백신 균주를 개발할 수 있다는 것을 입증한다. 예상한 바와 같이, A/B 키메릭 바이러스 유도체는 세포 배양에서 대응하는 재조합 약독화 A2 균주 후보 백신과 일치하는 표현형을 나타내었고, 이것은 약독화 표현형이 부모 균주에서 키메릭 유도체로 전이될 때 합리적으로 예상가능하다는 것을 지적한다. 예를 들면, 상기 바이러스 중 세 개에서 SH 유전자의 결실은 플라크 크기의 증가를 야기한 반면, 1030 돌연변이를 상기 바이러스 중 두 개에 첨가함으로써 약독화와 일치하는 플라크 크기의 감소가 발생하였다. 변화의 일부 조합은 예상과 완전히 일치하지 않는 결과를 야기할 수 있을 것으로 생각될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 조절을 증가시키기 위한 수단을 제공한다.
본 실시예에서, RSV 균주 A2는 광범위한 백신 후보 및 상기 공지의 표현형 특이적 돌연변이의 측면에서 공여체로 사용된다. 이와 관련하여, 하기에서 실제로 공여체 유전자(들)에 도입될 수도 있으나, 키메릭 수용체 백그라운드에 놓여지는 대표적인 약독화 돌연변이의 이입에 대해 자세히 기술한다. 특정 약독화 돌연변이는 (i) 5 개의 cp 돌연변이 중 3 개, 즉, N(V267I)에서의 돌연변이 및 L(C319Y 및 H1690Y)에서의 2 개 (그러나, F에서 2개는 이들이 B1 F 유전자로 치환되어 제거되므로 포함되지 않음), (ii) 248(Q831L), 1030(Y1321N), 및 임의적으로 약독화 균주 A2 바이러스에서 동정된 404-L (D1183E) 돌연변이, (iii) M2유전자의 유전자 시작 신호의 위치 9에서 단일 뉴클레오티드 치환, (iv) SH 유전자의 결실을 포함한다. 다른 바로 이용가능한 돌연변이는 NS1 또는 NS2 유전자 결실, 또는 530 또는 1009 돌연변이 단독 또는 조합을 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다.
RSV cDNA가 조작 또는 박테리아에서 증식 중 원치않는 서열 변화를 받는 것은 드문 일이 아니다. 예를 들면, 재조합 RSV를 생성하기 위해 성공적으로 사용되었던 제1 균주 A2 안티게놈 cDNA는 M 및 SH 유전자에서 각각 불안정성 문제를 나타 냈고, 이것은 더 낮은 카피수의 플라스미드, 37 ℃가 아닌 30 ℃에서의 성장, 및 상이한 박테리아 균주를 사용함으로써 개선되었다 (Collins 등, 1995). G 유전자도 또한 불안정성과 자주 관련되어 있다. 추가로, RSV G 유전자는 세포 배양에서 RSV 성장의 일부 조건 하에서 불안정한 것으로 밝혀졌다 (Kerran 등, 1992). 이 문제를 해결하기 위해, 아미노산 코딩을 변화되지 않게 하도록 디자인된 방법으로 뉴클레오티드 서열을 변화시킴으로써 균주 B1 G 유전자 서열의 안정화를 달성하였다. 상기 변화는 시스 작용 신호를 변화시켰으나, 이 변화는 기능을 크게 변화시키지 않아야 한다. 이들 변화에 의해 우발적인 변화없이 cDNA를 조작하고 증식시킬 수 있다.
"야생형" 키메릭 AB 바이러스의 구성 및 회수
상기한 바와 같이, 약독화 RSV 아군 A 바이러스에 기초하여 효과적인 RSV 아군 B 백신을 개발하기 위해 이용가능한 전략중의 하나는 균주 A2 안티게놈 cDNA에 있는 G 및 F 단백질을 아군 B의 G 및 F 유전자를 함유하는 제한 단편으로 치환하는것이다 (도 25 A-C). A2 안티게놈 cDNA는 SH 유전자 말단 신호내에 천연 PacI 부위를 가지며, 안티게놈 cDNA의 구성 중 F-M2 유전자간 영역에 SphI 부위를 삽입하였다 (Collins 등, 1995). 따라서, 균주 A2의 G 및 F 유전자를 함유하는 cDNA 단편은 균주 B1과 같은 아군 B 공여체 균주의 G 및 F 유전자를 함유하는 cDNA로 치환될 수 있다. 균주 B1에서처럼, 적당한 PacI 및 SphI 부위가 아군 B 균주에서 일어나지 않는다면, 표준 방법 후에 돌연변이유발 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR 중에 이들을 생성할 수 있다.
B1 바이러스는 RT-PCR 생성물 분석에 의해 온전한 형태로 서열화되어 공통 서열을 제공하였고, 사람 지원자를 사용한 연구에 기초할 때 wt 바이러스로 밝혀졌다 (Karron 등, 1977a, 본원에 참고로 인용됨). B1 바이러스를 HEp-2 세포 배양에서 성장시키고, 폴리에틸렌 글리콜을 사용한 침전에 의해 정화된 배지로부터 농축시켰다. 비리온 RNA를 추출하여 정제하고 (Collins 등, 1995), 통상적인 방법에 의해 랜덤 헥사머 프라이머를 사용하는 역전사(RT)를 위한 주형으로 사용하였다 (Collins 등, 1995). 생성된 cDNA를 중합효소 연쇄 반응(PCR)시켜 두 유전자를 단일 cDNA로 증폭시켰다. G 유전자에 선행하는 유전자간 영역의 개시 부위에서 프라이밍하도록 디자인된 정방향 폴리뉴클레오티드 (GCATGGATCC TTAA TTAA AAATTAACATAATGATGAATTATTAGTATG [SEQ ID NO: 15]; PacI 부위는 굵은 이탤릭체로, 초기 PCR 생성을 클로닝하기 위해 사용된 BamHI 부위는 이탤릭체로, 아군 B 특이적 서열은 밑줄로 나타냄), 및 F 유전자의 하류쪽 상의 유전자간 영역의 중간에서 혼성화된 역방향 프라이머 (GTGTTGGATCCTGATT GCATG C TTGAGGTTTTTATGTAACTATGAGTTAAG [SEQ ID NO:16]; SphI 부위는 굵은 이탤릭체로 나타낸 것을 제외하고는 상기와 같음)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 프라이머는 G 및 SphI 부위에 선행하는 유전자간 영역의 상류의 말단에 있는 PacI 부위가 F 유전자 뒤의 유전자간 영역에 도입하도록 디자인되었다. 초기 PCR 생성물을 pBR322의 BamHI 부위로 클로닝하기 위해, PacI 및 SphI 부위를 각각 BamHI 부위에 의해 플랭킹하였다.
뉴클레오티드 서열화에 의해 4 개의 클로닝된 G-F cDNA를 완전히 분석하였 다. 각각의 cDNA 클론은 G 유전자 말단 신호에서 유사한 오류를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이 신호(AGTTATTCAAAAA [SEQ ID NO: 17])는 5 개의 A 잔기로 끝나나, 각 클론에서 이것은 30 이상으로 신장되었다. 뿐만 아니라, 각 cDNA는 G 또는 F 유전자의 어딘가에서 하나 이상의 부가의 돌연변이를 함유하였다. 이들 오류는 RSV 중합효소, RT, PCR에 사용된 DNA 중합효소, 또는 박테리아에서의 증식에 의해 도입되었을 수 있다. 제한 효소의 교환에 의해 유전자 말단 돌연변이를 제외한 이들 모든 차이를 제거할 수 있었다. 부가의 클로닝된 DNA를 이 영역에서 검사하였고, 각각 신장된 GE 신호를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 정확한 서열을 갖는 GE 신호를 함유한 단일 cDNA 클론을 동정하였으나, 박테리아에서 추가로 증식시켰을때 역시 신장되었다. 이것은 신장이 박테리아에서 증식 중 일어났음을 제시하였다. 더 낮은 온도에서 성장시키는 것 및 다른 박테리아 균주를 사용하는 것은 이 신호에서 정확한 서열을 갖는 클론을 제공하지 못하였다.
일부 서열이 박테리아에서 안정하게 증식하기 곤란한 것은 드문 일이 아니며, 그 이유는 종종 DNA 서열의 검사로부터 명백하지 않다. 예를 들면, 균주 A2 안티게놈 cDNA의 두 특정 영역은 특정 박테리아 군주 및 성장 조건이 사용되지 않으면 불안정하다. 박테리아 균주 및 성장 조건의 변화는 B1 cDNA를 안정화시키지 못했으므로, 더 안정화시키기 위해서 서열을 변화시켰다. 이 목적을 달성하기 위해, G 유전자의 하류의 말단 및 하류의 유전자간 영역에 있는 다수의 뉴클레오티드를 하기와 같이 변화시켰다: (i) G ORF의 마지막 11 개의 코돈에 있어서, 아미노산 코딩 배정을 변화시키지 않고, 각 코돈에서 세 번째 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 배정을 변화시키는 것, (ii) G ORF의 종결 코돈을 대체적 종결 코돈 배정으로 변화시키는 것, (iii) ORF와 유전자 말단 신호 사이의 G 유전자의 하류의 비번역 영역에 4 개의 뉴클레오티드를 도입하는 것, (iv) 신호가 균주 A2와 동일하게 되도록 두 개의 뉴클레오티드 치환에 의해 G 유전자 말단 신호를 변화시키고, A 트랙의 길이를 하나의 뉴클레오티드만큼 감소시키는 것, 및 (v) G-F 유전자간 영역을 47 뉴클레오티드만큼 단축시키고, MfeI 부위를 도입하는 것 (도 26 참조).
목적하는 변화를 함유하는 두 개의 인접한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 플라스미드 주형상에서 마주보는 방향으로 DNA 합성을 프라이밍시킨 후 생성된 선형 DNA를 연결시켜 원형으로 하는 PCR를 기초로 하는 방법을 사용하여 돌연변이를 유발하였다 (Byrappa, Gavin 및 Gupta, 1995). 정방향 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다 (코딩 뉴크레오티드에서 세 개씩 끊고, wt B1 서열과 다른 뉴클레오티드 배정을 밑줄로 하고, 도입된 MfeI 부위를 굵게 하고, G 유전자 및 F 유전자 시작 신호를 이탤릭체로 함): C CAC GCC TAATGAGTTAT AT AAAA C A A TT G GGGCAAATAACC ATG GAG [SEQ ID NO: 18]. 역방향 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다 (주석은 상기와 같음): GA CTG AGT GTT CTG AGT AGA GTT GGA TGT AGA GGG CTC GGA TGC TG [SEQ ID NO: 19).
상술한 두 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR에서 상술한 G-F cDNA를 주형으로 사용하였다. PCR 생성물을 겔 정제하고, 연결하여 원형으로 하고, 대장균 균주 DH10B (Life Technology)에서 클로닝하였다. 전체 길이의 삽입체를 함유하기에 적당한 크기인 6 개의 클로닝된 cDNA를 동정하였고, 유전자 말단 신 호를 함유하는 영역의 서열 분석은 6 개 각각이 정확한 서열을 함유한다는 것을 나타내었다. 한 cDNA인 MH5-7을 전체 서열화하였고, 정확한 서열을 함유하였다. 키메릭 안티게놈 cDNA의 구성을 위한 제조에서 아군 B G 및 F 유전자를 함유하는 이의 PacI-SphI 단편을 절단하였다.
안티게놈 균주 A2 cDNA D53은 하기 특징들을 함유하였다. 첫째, 이것은 이전에 기술(Collins 등, 1995)한 바와 같이, 선도 위치 4에서 G의 C로의 치환(소위 4C 돌연변이)을 함유하였다. 이 변화는 RSV의 일부 생물학적 유래의 약독화 균주에서 기술되었으나, 약독화 표현형과 관련되어 있지 않다. 그러나, 이것은 RNA 복제의 촉진 인자(Grosfeld, Hill 및 Collins, 1995)로서 기술되었고, 또한 세포 배양에서 바이러스의 수율에 영향을 미치는 것으로 보이지는 않으나, cDNA로부터 감염성 바이러스의 회수의 효율을 개선한다 (Collins 등, 1995). 둘째, D53은 제한 부위 마커를 4 개의 위치에 놓는 5 개의 뉴클레오티드 치환 및 단일 뉴클레오티드 삽입을 함유한다: NS2 유전자의 바로 하류, N ORF의 상류, G와 F 유전자 사이 및 F 와 M2 유전자 사이 (Collins 등, 1995). 그 후, 안티게놈 cDNA는 또한 6 개의 번역적으로 잠재적인 제한 부위 마커를 L 유전자로 도입(총칭하여 "위치" 돌연변이라 함)함으로써 추가로 변화되었다 (Whitehead 등, 1998b).
PacI 및 SphI 부위는 D53 플라스미드에 특이적이지 않으므로, D53 cDNA의 PacI-SphI 단편을 B1 G 및 F 유전자로 직접 치환하는 것은 바람직하지 않았다. 따라서, 3' 유전자외 선도 영역으로부터 첫 9 개의 유전자를 거쳐 L 유전자의 개시 부위까지의 안티게놈 cDNA의 왼쪽 말단을 함유하는 서브클론 D50 상에서 이 치환을 수행하였다 (Collins 등, 1995; Whitehead 등, 1998b). 이 D50 플라스미드에서, PacI 및 SphI 부위는 특이적이었고, 직접적 제한 단편 교환을 수행하였다. 안티게놈 cDNA의 나머지, 즉, L 유전자, 추적자 영역 및 인접 T7 프로모터를 플라스미드 D39 부위에 포함시키고, 이 cDNA를 BamHI-MluI 단편으로서 B/D50의 BamHI-MluI 창에 삽입하였다.
생성된 완전한 키메릭 안티게놈 cDNA를 사용하여, 공동트랜스팩션된 플라스미드로부터 발현된 N, P, M2-1 및 L 단백질로 보완된 상술한 방법에 의해 바이러스를 생성하였다. 이것은 wt A2 백그라운드에 B1 G 및 F 유전자를 함유하는 재조합 키메릭 바이러스 rAB의 회수를 야기하였다. 이 신규한 바이러스는 세포 배양에서 쉽게 증식되었고, 크기가 wt rA2와 유사한 플라크를 형성하였다. 세포 배양에서 생성된 바이러스의 수준은 본질적으로 야생형 부모와 동일하였다. B1 G 및 F 당단백질의 발현 및 A2 G 및 F 당단백질의 발현의 결핍은, 각각 아군 B 및 A의 G 단백질 특이성 모노클론 항체를 사용하는 면역 과산화효소 염색에 의해 입증되었다. A2 골격에서 B1 유전자의 존재는 B1 서열 특이성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 rAB 비리온으로부터 정제된 RNA의 RT-PCR에 의해 확인되었다. 요약하자면, 키메릭 AB cDNA를 구성하고, 이를 사용하여 그의 생존능력이 부모과 매우 유사한 것과 일치하는 속성을 갖는 감염성 AB 키메릭 바이러스를 회수하는데 성공하였다.
균주 A2 G 및 F 유전자를 균주 B1 대응물로 직접 치환하는 것은 B1 특이성 유전자 개시 및 유전자 말단 전사 신호를 A2 백그라운드에 도입하나, 이것은 이들 신호에서 두 바이러스 사이의 밀접한 유사성의 측면에서 중요한 인자로 고려되지 않는다. 예를 들면, G 및 F 유전자의 유전자 시작 신호는 아군 사이에 정확하게 보존되어 있고, F 유전자의 유전자 말단 신호는 단일 변화를 갖는다 (균주 A2에 있어서, AGTTATATAAAA [SEQ ID NO: 20]이고, 균주 B1에서는 밑줄친 위치가 C임). G 유전자의 유전자 말단 신호는 세 개의 변화를 가지나 (균주 A2에 있어서 정방향으로 AGTTACTTAAAAA [SEQ ID NO: 21]이고, 균주 B1에서는 밑줄친 위치가 TTC임), 상술한 바와 같이, 이것은 균주 A2의 F 유전자와 동일하도록 변화되고, 따라서 균주 A2 중합효소에 완전히 필적하게 될 것이다. B1 cDNA와 A2 사이의 연결은 SH-G 및 F-M2 유전자간 영역을 포함하였다. 전자의 길이는 A2 B1 바이러스와 동일한 44 뉴클레오티드였고, PacI 부위는 이 간격을 유지하도록 디자인되었다. F-M2 유전자간 영역의 길이는 균주 A2 및 B1에 대하여 각각 46 및 45 뉴클레오티드이고, AB 키메라는 후자의 길이를 갖도록 디자인되었다. G-F 유전자간 영역의 길이는 상술한 바와 같이 5 뉴클레오티드로 감소되었고, 이것은 A2 및 B1 바이러스에서의 대응물(각각 52 뉴클레오티드임)보다 더 짧다. 게다가, RSV의 천연 유전자간 영역은 바이러스 사이에 서열 및 유전자 연결 사이의 길이에서 상당한 다양성을 나타냄에도 불구하고, 균주 A2는 미니게놈 복제 및 전사에 대한 영향에 있어서 동동하다. 따라서, 유전자간 영역에 도입된 변화는 아마도 잠재될 것이다 (Kuo 등, 1996, 본원에 참고로 인용됨).
A2 골격에서 약독화 돌연변이를 갖는 AB 키메릭 RSV의 구성 및 회수
본 발명의 일반적인 교시에 따라, 균주 B1 G-F cDNA를 아군 B에 대한 백신 후보로서 약독화된 AB 바이러스를 생성하기 위해 약독화 돌연변이의 다양한 조합을 함유한 일련의 A2 골격으로 치환하였다. 이들 약독화 돌연변이는 (i) cp RSV의 5 개 아미노산 치환 중 3 개, 즉, N(V267I)에서의 돌연변이 및 L(C319Y 및 H1690Y)에서의 2 개 (그러나, F에서 2개는 이들이 B1 F 유전자로 치환되어 제거되므로 포함되지 않음), (ii) 248(Q831L), 1030(Y1321N), 및 임의적으로, 약독화 균주 A2 바이러스 cpts248, cpts248/404 및 cpts530/1030의 L 단백질에서 동정된 404-L (D1183E) 아미노산 치환, (iii) cpts248/404의 M2유전자의 유전자 시작 신호의 위치 9에서 뉴클레오티드 치환, 및 (iv) SH 유전자의 결실을 포함하였다. L 유전자에서의 돌연변이의 경우에는, 이들을 상술한 바와 같이 L 유전자를 함유하는 D39 플라스미드에 삽입한 다음, 상술한 바와 같은 B/D50 플라스미드와 결합하여 완전한 안티게놈 cDNA를 얻었다. D50 내에서의 돌연변이의 경우에는, 제한 단편 치환을 사용하여 B/D50(그 후, D39와 결합됨) 또는 B/D53 내의 관련 영역을 치환하였다. 각 돌연변이를 이전에 기술한 바와 같이(Juhasz 등, 1998; Juhasz 등, 1997; Whitehead 등, 1998a; Whitehead 등, 1998b, 각각 본원에 참고로 인용됨), 새로운 제한 부위를 도입하거나, 또는 아미노산 수준에서 잠재적인 천연 제한부위를 제거함으로써 표지하였다. 모든 경우에서, 돌연변이에 의해 변화된 안티게놈 cDNA 영역의 구조를 뉴클레오티드 서열 분석에 의해 확인하였다. 총 6 개의 변화된 AB 안티게놈 cDNA를 얻었다. 이어서, 각 안티게놈 cDNA를 사용하여 상술한 바와 같이 감염성 바이러스를 회수하였고, 각 경우에서, 키메릭 RSV 바이러스가 성공적으로 회수되었다. 각각의 재조합 바이러스에서 각각의 목적하는 돌연변이의 존재를 역 전사(RT)-중합효소 연쇄 반응(PCR) 후 제한 분석 또는 뉴클레오티드 서열화에 의해 확인하였다. 약독화 돌연변이를 함유하는 회수된 6 개의 상이한 재조합 AB 키메라를 표 44에 열거하였다. 특히, 이들 약독화 키메라는 야생형 균주 A2 골격 및 야생형 B1 G 및 F 유전자로 구성된 야생형 키메라인 rAB를 포함한다. 나머지 바이러스는 균주 A2 골격에 다양한 약독화 돌연변이를 함유하고, 아군 B에 대한 후보 백신을 제공한다. 각 바이러스는 세포 배양에서 증식할 수 있다. 이것은 다수의 상이한 돌연변이의 조합을 함유하는 AB 키메라를 생성할 수 있는 가능성을 예시한다.
<표 44>
제조합 AB 키메릭 바이러스 기저 RSV 아군 B
바이러스1 설명2
rAB 야생형
rABcp 저온 계대 배양 (cp) 돌연변이3
rAB△SH SH 유전자 결실
rABcp248/404△SH 및 SH 유전자의 결실
rABcp248/404/1030 (cp, 2484 및 4045 돌연변이) 및 10306 돌연변이
rABcp248/404/1030△SH rABcp248/404/1030 및 SH 유전자 결실
1. 모든 바이러스는 F 및 G 당단백질 유전자가 균주 B1으로 치환된 균주 A2임.
2. 돌연변이에 의해 부여된 예상된 속성과 일치하는 세포 배양에서의 표현형은 하기와 같다: △SH 돌연변이를 함유하는 각 바이러스는 SH 유전자를 함유하는 대응물보다 더 큰 플라크를 형성하였고, 1030 돌연변이를 함유하는 각 바이러스는 돌연변이가 없는 대응물보다 더 작은 플라크를 형성함.
3. cp 돌연변이는 N 및 L 단백질에서 3 개의 아미노산 치환이다: F에서 2 개의 치환은 유전자 치환으로 인하여 포함되지 않음.
4. 248 돌연변이는 L 단백질에서 Gln-831-Leu임.
5. 404 돌연변이는 L 단백질에서 Asp-1183-Glu 및 M2 유전자 시작 신호에서 점 돌연변이임.
6. 1030 돌연변이는 L 단백질에서 Tyr-1321-Asn임.
도입된 두 개의 돌연변이는 이들의 균주 A2에 대한 영향에 기초할 때, 세포 배양에서 인식할 수 있는 표현형을 부여할 것으로 예상될 것이다. 예를 들면, △SH 돌연변이체의 도입은 더 큰 플라크 크기를 부여하고, 1030 돌연변이체는 감소된 플라크 크기를 부여한다. 이들 돌연변이체를 함유한 각각의 AB 키메라는 적절한 거동을 보였다. 예를 들면, SH 유전자가 없는 3 개의 키메라는 SH 유전자를 함유한 대응하는 바이러스보다 더 큰 플라크를 생성했다. 이것은 이들 키메라가 또한 결실과 관련된 완만한 약독화 표현형을 가질 것이라는 것을 제시한다. 또한, 1030 돌연변이체를 rABcp248/404 및 rABcp248/404△SH에 첨가하는 것은 1030 돌연변이체가 없는 대응물과 비교하여 플라크 크기의 감소를 야기하였다. 이것은 세포 배양 표현형을 변화시킬 것으로 예상되는 돌연변이를 도입할 때마다 키메릭 바이러스에서 예상되는 변화가 관찰된다는 것을 지적한다. 일부 조합은 예상에 따르지 않을 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이것은 표현형의 변화를 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 아마도 이들 돌연변이와 관련된 다른 표현형(예, 생체내 약독화)도 또한 AB 키메라에 부여될 것이다.
뿐만 아니라, 표 45에 나타낸 바와 같이, 다양한 온도에서 플라크 형성의 효율을 측정함으로써 하기 바이러스를 온도 민감성 표현형에 대해 분석하였다: 생물 학적 유래의 A2 및 B1 wt 바이러스, wt 키메릭 rAB 바이러스, 및 약독화 돌연변이를 함유하는 하기 rAB 유도체: N(V267I) 및 L(C313Y 및 H1690Y)에서 cp 돌연변이를 함유하는 rABcp; SH 유전자가 결실된 rAB인 rAB△SH; 상술한 cp 변화 및 SH 결실을 함유하는 rABcp△SH; 248 (L 단백질에서 Q831L) 및 404(L 단백질에서 D1183E 및 M2 유전자 시작 신호에서 점 돌연변이) 돌연변이를 함유하는 rABcp△SH인 rABcp248/404△SH; 및 1030 돌연변이(L 단백질에서 Y1321N)와 함께 248 및 404 도연변이를 함유하는 rABcp인 rABcp248/404/1030. 표 45에 나타낸 바와 같이, 생물학적 유래의 A2 및 B1 바이러스는 온도 민감성을 나타내지 않았다. B 당단백질 치환을 함유하는 바이러스는 약간의 감수성을 나타내었고, 정지 온도는 40 ℃였다. cp 및 △SH 돌연변이의 포함은 어떠한 효과도 나타내지 않았고, 이것은 이들이 균주 A2에 ts 표현형을 부여하지 않으므로 예상된 것이었다. 248 및 404 돌연변이를 함께 포함하거나, 또는 248, 404 및 1030 돌연변이를 함께 포함하는 것은 정지 온도가 각각 37 ℃ 및 36 ℃인 바이러스를 야기하였고, 각각의 경우에서 다음으로 더 낮은 온도에서 작은 플라크가 형성되었다. 이들 결과는 wt A2 재조합 백그라운드에 위치한 동일한 두 일단의 돌연변이를 사용하여 관찰된 것과 본질적으로 구별이 불가능하였다. 따라서, rAB 키메라에서 이들 ts 표현형을 성실히 재구성하는 것이 가능하였다.
<표 45>
AB 키메릭 RSV 유도체의 온도 민감성
Figure 112001026244980-pct00048
*정지 온도는 100 배 이상의 역가 감소가 관찰되는 가장 낮은 제한 온도를 의미함. 정지 온도에서 바이러스 역가는 고딕체로 표기됨.
**핀-포인트(pin-point) 플라크 크기.
코튼 랫트 및 침팬지의 기도에서 rAB 바이러스의 성장
키메릭 재조합 rAB 바이러스를 RSV A2 및 B1가 필적할 만큼 복제하는 널리 허용된 모델인 코튼 랫트의 기도에서의 성장 능력에 대해 평가하였다. 5 내지 6 마리의 동물을 rAB 바이러스 또는 이의 △SH, cp 또는 cp△SH 유도체를 동물 당 106 pfu로 비강내 접종하였다. 설치류에서는 △SH 돌연변이와 관련된 약독화 표현형이 불충분하고 cp 돌연변이 세트와 관련된 표현형이 이의 숙주 범위 성질에 기인하여 설치류에서 본질적으로 검출불가능하기 때문에, 본 초기 연구의 목적은 단순히 생체내 생존 능력을 입증하는 것이었다. 감염 후 4일에, 비개골 및 폐를 회수하고, 플라크 분석에 의해 바이러스 역가를 결정하였다. 부모 A2 B1 바이러스는 조직 g 당 106.0 내지 106.5 pfu로 복제하였다. 야생형 키메릭 rAB 바이러스 및 약독화 돌연변이를 함유하는 이의 유도체는 102 내지 104 pfu g으로 복제하였다. 이것은 야생형 및 돌연변이체 AB 바이러스가 실험 동물에서 생육가능하다는 것을 나타내었다. 또한, 이것은 하기에 나타낸 바와 같이 설치류 특이성 효과인 것으로 보이나, 키메라에서 당단백질의 교환이 그 자체로 약독화 변화였을 가능성을 제기한다.
침팬지는 RSV 성장 및 질병과 관련하여 사람과 가장 밀접하게 닮은 실험 동물이다. 따라서, wt rAB 키메릭 바이러스를 4 마리의 혈청반응음성의 어린 침팬지에게 투여하고, 이 때 각각의 동물을 각 부위에 1 ml의 접종물로 105 pfu로 비강내 및 기관내 접종하였다. 추정 약독화된 유도체 rABcp248/404/1030을 사용하여 동일한 방법으로 부가의 3 마리의 동물을 접종하였다.
1일부터 10일 및 12일에 매일 비인후 면봉(swab)을 행하고, 2, 5, 6, 8 및 12일에 기관 세척을 하였다 (표 46). 비교를 위해, 다른 동물은 나타낸 바와 같이, 104 또는 105 플라크 형성 단위(PFU)/부위의 용량을 투여받았다. 표는 1 내지 12일의 상(비인후 면봉) 기도 및 하(기관 세척) 기도에서 쉐딩(shedding)에 관한 각 동물의 데이타, 및 0 내지 4의 증가하는 스케일 상의 피크 비루 점수를 제공한다. 또한, 이것은 도 27에도 예시되어 있다. rAB 키메라는 비인후 및 기관에서 각각 4.3log10 및 4.1 log10 pfu/ml의 평균 피크 역가로 복제하였다. 이것은 생물학 적 유래의 wt B1 바이러스의 복제 수준을 초과하였다. 게다가, rAB 바이러스는 wt B1 바이러스의 질병 증후의 심도와 동일하거나 또는 이를 초과하는 질병 증후(비루)를 일으켰다. 이와 달리, rABcp248/404/1030 바이러스의 복제는 매우 제한되었다. 상기도에서 rABcp248/404/1030 바이러스는 rAB wt 보다 200 배 더 낮은 2.0 log10 pfu/ml의 평균 피크 역가로 복제한 반면, 이 바이러스는 기관 세척의 어느 것으로부터도 회수되지 않았고, 복제가 2500 배를 초과하여 감소되었다. rABcp248/404/1030 바이러스에 관련된 어떠한 질병 증후도 없었다. 이들 발견은 약독화 돌연변이를 A2 백그라운드에 도입하는 것이 복제를 제한하고 질병 증후를 제거한다는 것을 예시한다.
<표 46>
침팬지의 상기도 및 하기도에서의 재조합 키메릭 바이러스 rAB의 복제
Figure 112001026244980-pct00049
a각 바이러스를 1.0 ml 접종원으로 비강내 및 기관내 투여하였음.
b투여된 바이러스는 rABcp248/404/1030이었음.
본 발명의 성공적인 실시를 더욱 입증하기 위해, wt rAB 키메라의 복제를 wt A2 바이러스와 비교하였다. 표 47은 하기 균주 A2의 두 형태를 포함하는 역사상 유명한 대조군과 함께, 표 46으로부터의 wt 바이러스에 대한 데이타의 요약을 나타낸다: (i) 부위 당 104 pfu의 용량으로 투여받은 4 마리의 동물 및 (ii) 부위 당 104 pfu의 용량으로 생물학적 유래의 A2를 투여받은 4 마리의 동물. 이 비교는 생물학적 유래이건 재조합체이건 wt B1 바이러스는 wt A2 바이러스보다 덜 효율적으로 복제한다는 것을 나타내었다. 키메릭 AB 바이러스의 성장은 부모 A2와 B1 바이러스 사이의 중간이었다. 부모과 비교한 rAB 성장의 중간적 성질은 A2 골격 및 B1 당단백질이 성장 적응도에 기여한다는 것을 제시한다. 코튼 랫트에서 rAB의 빈약한 성장은 아마도 영장류가 아닌 설치류에서 적응도를 감소시키는 숙주 범위 효과에 기인하는것 같다. 설치류에서의 복제 수준은 일반적으로 침팬지 및 사람에서의수준을 예측하는데 사용된다. 그러나, 본 경우에서 처럼, 설치류와 영장류 사이의 일부 불일치가 가끔 관찰된다.
<표 47>
rAB 침팬지 연구 요약
Figure 112001026244980-pct00050
상기 결과는 생존 능력을 교란시키지 않고, 아군 A 바이러스(본 실시예에서는, 균주 A2)의 G 및 F 당단백질이 아군 B 바이러스(본 실시예에서는, 균주 B1)의 G 및 F 당단백질로 치환될 수 있다는 것을 나타낸다. 키메라는 사람에서의 감염을 위해 가장 허용되고 가장 신뢰할 만한 모델인 침팬지에서의 복제에 충분히 적당하였다. 게다가, 키메릭 AB 바이러스는 공지의 약독화 돌연변이를 균주 A2 골격에 도입함으로써 약독화될 수 있었다.
상기 발명이 이해의 명확성을 위해 설명 및 예에 의해 어느 정도 상세하게 기술되었으나, 첨부된 청구범위의 범위내에서 일부 변화 및 수정이 가해질 수 있다는 것은 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> The Government Of The United States As Represented By The Department Of Health And Human Services <120> Production Of Attenuated Chimeric Respiratory Syncytial Virus Vaccines From Cloned Nucleotide Sequences <130> NIH-0109 <140> PCT/US00/08802 <141> 2000-03-31 <150> 09/291,894 <151> 1999-04-13 <150> 08/892,403 <151> 1997-07-15 <150> 60/047,634 <151> 1997-05-23 <150> 60/046,141 <151> 1997-05-09 <150> 60/021,773 <151> 1996-07-15 <160> 21 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 15223 <212> DNA <213> respiratory syncytial virus <400> 1 acgcgaaaaa atgcgtacaa caaacttgca taaaccaaaa aaatggggca aataagaatt 60 tgataagtac cacttaaatt taactccctt ggttagagat gggcagcaat tcattgagta 120 tgataaaagt tagattacaa aatttgtttg acaatgatga agtagcattg ttaaaaataa 180 catgctatac tgataaatta atacatttaa ctaatgcttt ggctaaggca gtgatacata 240 caatcaaatt gaatggcatt gtgtttgtgc atgttattac aagtagtgat atttgcccta 300 ataataatat tgtagtaaaa tccaatttca caacaatgcc agtactacaa aatggaggtt 360 atatatggga aatgatggaa ttaacacatt gctctcaacc taatggtcta ctagatgaca 420 attgtgaaat taaattctcc aaaaaactaa gtgattcaac aatgaccaat tatatgaatc 480 aattatctga attacttgga tttgatctta atccataaat tataattaat atcaactagc 540 aaatcaatgt cactaacacc attagttaat ataaaactta acagaagaca aaaatggggc 600 aaataaatca attcagccaa cccaaccatg gacacaaccc acaatgataa tacaccacaa 660 agactgatga tcacagacat gagaccgttg tcacttgaga ccataataac atcactaacc 720 agagacatca taacacacaa atttatatac ttgataaatc atgaatgcat agtgagaaaa 780 cttgatgaaa agcaggccac atttacattc ctggtcaact atgaaatgaa actattacac 840 aaagtaggaa gcactaaata taaaaaatat actgaataca acacaaaata tggcactttc 900 cctatgccaa tattcatcaa tcatgatggg ttcttagaat gcattggcat taagcctaca 960 aagcatactc ccataatata caagtatgat ctcaatccat aaatttcaac acaatattca 1020 cacaatctaa aacaacaact ctatgcataa ctatactcca tagtccagat ggagcctgaa 1080 aattatagta atttaaaact taaggagaga tataagatag aagatggggc aaatacaacc 1140 atggctctta gcaaagtcaa gttgaatgat acactcaaca aagatcaact tctgtcatcc 1200 agcaaataca ccatccaacg gagcacagga gatagtattg atactcctaa ttatgatgtg 1260 cagaaacaca tcaataagtt atgtggcatg ttattaatca cagaagatgc taatcataaa 1320 ttcactgggt taataggtat gttatatgcg atgtctaggt taggaagaga agacaccata 1380 aaaatactca gagatgcggg atatcatgta aaagcaaatg gagtagatgt aacaacacat 1440 cgtcaagaca ttaatggaaa agaaatgaaa tttgaagtgt taacattggc aagcttaaca 1500 actgaaattc aaatcaacat tgagatagaa tctagaaaat cctacaaaaa aatgctaaaa 1560 gaaatgggag aggtagctcc agaatacagg catgactctc ctgattgtgg gatgataata 1620 ttatgtatag cagcattagt aataactaaa ttagcagcag gggacagatc tggtcttaca 1680 gccgtgatta ggagagctaa taatgtccta aaaaatgaaa tgaaacgtta caaaggctta 1740 ctacccaagg acatagccaa cagcttctat gaagtgtttg aaaaacatcc ccactttata 1800 gatgtttttg ttcattttgg tatagcacaa tcttctacca gaggtggcag tagagttgaa 1860 gggatttttg caggattgtt tatgaatgcc tatggtgcag ggcaagtgat gttacggtgg 1920 ggagtcttag caaaatcagt taaaaatatt atgttaggac atgctagtgt gcaagcagaa 1980 atggaacaag ttgttgaggt ttatgaatat gcccaaaaat tgggtggtga agcaggattc 2040 taccatatat tgaacaaccc aaaagcatca ttattatctt tgactcaatt tcctcacttc 2100 tccagtgtag tattaggcaa tgctgctggc ctaggcataa tgggagagta cagaggtaca 2160 ccgaggaatc aagatctata tgatgcagca aaggcatatg ctgaacaact caaagaaaat 2220 ggtgtgatta actacagtgt actagacttg acagcagaag aactagaggc tatcaaacat 2280 cagcttaatc caaaagataa tgatgtagag ctttgagtta ataaaaaatg gggcaaataa 2340 atcatcatgg aaaagtttgc tcctgaattc catggagaag atgcaaacaa cagggctact 2400 aaattcctag aatcaataaa gggcaaattc acatcaccca aagatcccaa gaaaaaagat 2460 agtatcatat ctgtcaactc aatagatata gaagtaacca aagaaagccc tataacatca 2520 aattcaacta ttatcaaccc aacaaatgag acagatgata ctgcagggaa caagcccaat 2580 tatcaaagaa aacctctagt aagtttcaaa gaagacccta caccaagtga taatcccttt 2640 tctaaactat acaaagaaac catagaaaca tttgataaca atgaagaaga atccagctat 2700 tcatacgaag aaataaatga tcagacaaac gataatataa cagcaagatt agataggatt 2760 gatgaaaaat taagtgaaat actaggaatg cttcacacat tagtagtggc aagtgcagga 2820 cctacatctg ctcgggatgg tataagagat gccatggttg gtttaagaga agaaatgata 2880 gaaaaaatca gaactgaagc attaatgacc aatgacagat tagaagctat ggcaagactc 2940 aggaatgagg aaagtgaaaa gatggcaaaa gacacatcag atgaagtgtc tctcaatcca 3000 acatcagaga aattgaacaa cctattggaa gggaatgata gtgacaatga tctatcactt 3060 gaagatttct gattagttac caatcttcac atcaacacac aataccaaca gaagaccaac 3120 aaactaacca acccaatcat ccaaccaaac atccatccgc caatcagcca aacagccaac 3180 aaaacaacca gccaatccaa aactaaccac ccggaaaaaa tctataatat agttacaaaa 3240 aaaggaaagg gtggggcaaa tatggaaaca tacgtgaaca agcttcacga aggctccaca 3300 tacacagctg ctgttcaata caatgtctta gaaaaagacg atgaccctgc atcacttaca 3360 atatgggtgc ccatgttcca atcatctatg ccagcagatt tacttataaa agaactagct 3420 aatgtcaaca tactagtgaa acaaatatcc acacccaagg gaccttcact aagagtcatg 3480 ataaactcaa gaagtgcagt gctagcacaa atgcccagca aatttaccat atgcgctaat 3540 gtgtccttgg atgaaagaag caaactagca tatgatgtaa ccacaccctg tgaaatcaag 3600 gcatgtagtc taacatgcct aaaatcaaaa aatatgttga ctacagttaa agatctcact 3660 atgaagacac tcaaccctac acatgatatt attgctttat gtgaatttga aaacatagta 3720 acatcaaaaa aagtcataat accaacatac ctaagatcca tcagtgtcag aaataaagat 3780 ctgaacacac ttgaaaatat aacaaccact gaattcaaaa atgctatcac aaatgcaaaa 3840 atcatccctt actcaggatt actattagtc atcacagtga ctgacaacaa aggagcattc 3900 aaatacataa agccacaaag tcaattcata gtagatcttg gagcttacct agaaaaagaa 3960 agtatatatt atgttaccac aaattggaag cacacagcta cacgatttgc aatcaaaccc 4020 atggaagatt aacctttttc ctctacatca gtgtgttaat tcatacaaac tttctaccta 4080 cattcttcac ttcaccatca caatcacaaa cactctgtgg ttcaaccaat caaacaaaac 4140 ttatctgaag tcccagatca tcccaagtca ttgtttatca gatctagtac tcaaataagt 4200 taataaaaaa tatacacatg gggcaaataa tcattggagg aaatccaact aatcacaata 4260 tctgttaaca tagacaagtc cacacaccat acagaatcaa ccaatggaaa atacatccat 4320 aacaatagaa ttctcaagca aattctggcc ttactttaca ctaatacaca tgatcacaac 4380 aataatctct ttgctaatca taatctccat catgattgca atactaaaca aactttgtga 4440 atataacgta ttccataaca aaacctttga gttaccaaga gctcgagtca acacatagca 4500 ttcatcaatc caacagccca aaacagtaac cttgcattta aaaatgaaca acccctacct 4560 ctttacaaca cctcattaac atcccaccat gcaaaccact atccatacta taaagtagtt 4620 aattaaaaat agtcataaca atgaactagg atatcaagac taacaataac attggggcaa 4680 atgcaaacat gtccaaaaac aaggaccaac gcaccgctaa gacattagaa aggacctggg 4740 acactctcaa tcatttatta ttcatatcat cgtgcttata taagttaaat cttaaatctg 4800 tagcacaaat cacattatcc attctggcaa tgataatctc aacttcactt ataattgcag 4860 ccatcatatt catagcctcg gcaaaccaca aagtcacacc aacaactgca atcatacaag 4920 atgcaacaag ccagatcaag aacacaaccc caacatacct cacccagaat cctcagcttg 4980 gaatcagtcc ctctaatccg tctgaaatta catcacaaat caccaccata ctagcttcaa 5040 caacaccagg agtcaagtca accctgcaat ccacaacagt caagaccaaa aacacaacaa 5100 caactcaaac acaacccagc aagcccacca caaaacaacg ccaaaacaaa ccaccaagca 5160 aacccaataa tgattttcac tttgaagtgt tcaactttgt accctgcagc atatgcagca 5220 acaatccaac ctgctgggct atctgcaaaa gaataccaaa caaaaaacca ggaaagaaaa 5280 ccactaccaa gcccacaaaa aaaccaaccc tcaagacaac caaaaaagat cccaaacctc 5340 aaaccactaa atcaaaggaa gtacccacca ccaagcccac agaagagcca accatcaaca 5400 ccaccaaaac aaacatcata actacactac tcacctccaa caccacagga aatccagaac 5460 tcacaagtca aatggaaacc ttccactcaa cttcctccga aggcaatcca agcccttctc 5520 aagtctctac aacatccgag tacccatcac aaccttcatc tccacccaac acaccacgcc 5580 agtagttact taaaaacata ttatcacaaa aggccttgac caacttaaac agaatcaaaa 5640 taaactctgg ggcaaataac aatggagttg ctaatcctca aagcaaatgc aattaccaca 5700 atcctcactg cagtcacatt ttgttttgct tctggtcaaa acatcactga agaattttat 5760 caatcaacat gcagtgcagt tagcaaaggc tatcttagtg ctctgagaac tggttggtat 5820 accagtgtta taactataga attaagtaat atcaagaaaa ataagtgtaa tggaacagat 5880 gctaaggtaa aattgataaa acaagaatta gataaatata aaaatgctgt aacagaattg 5940 cagttgctca tgcaaagcac acaagcaaca aacaatcgag ccagaagaga actaccaagg 6000 tttatgaatt atacactcaa caatgccaaa aaaaccaatg taacattaag caagaaaagg 6060 aaaagaagat ttcttggttt tttgttaggt gttggatctg caatcgccag tggcgttgct 6120 gtatctaagg tcctgcacct agaaggggaa gtgaacaaga tcaaaagtgc tctactatcc 6180 acaaacaagg ctgtagtcag cttatcaaat ggagttagtg ttttaaccag caaagtgtta 6240 gdcctcaaaa actatataga taaacaattg ttacctattg tgaacaagca aagctgcagc 6300 atatcaaata tagaaactgt gatagagttc caacaaaaga acaacagact actagagatt 6360 accagggaat ttagtgttaa tgcaggcgta actacacctg taagcactta catgttaact 6420 aatagtgaat tattgtcatt aatcaatgat atgcctataa caaatgatca gaaaaagtta 6480 atgtccaaca atgttcaaat agttagacag caaagttact ctatcatgtc cataataaaa 6540 gaggaagtct tagcatatgt agtacaatta ccactatatg gtgttataga tacaccctgt 6600 tggaaactac acacatcccc tctatgtaca accaacacaa aagaagggtc caacatctgt 6660 ttaacaagaa ctgacagagg atggtactgt gacaatgcag gatcagtatc tttcttccca 6720 caagctgaaa catgtaaagt tcaatcaaat cgagtatttt gtgacacaat gaacagttta 6780 acattaccaa gtgaagtaaa tctctgcaat gttgacatat tcaaccccaa atatgattgt 6840 aaaattatga cttcaaaaac agatgtaagc agctccgtta tcacatctct aggagccatt 6900 gtgtcatgct atggcaaaac taaatgtaca gcatccaata aaaatcgtgg aatcataaag 6960 acattttcta acgggtgcga ttatgtatca aataaagggg tggacactgt gtctgtaggt 7020 aacacattat attatgtaaa taagcaagaa ggtaaaagtc tctatgtaaa aggtgaacca 7080 ataataaatt tctatgaccc attagtattc ccctctgatg aatttgatgc atcaatatct 7140 caagtcaacg agaagattaa ccagagccta gcatttattc gtaaatccga tgaattatta 7200 cataatgtaa atgctggtaa atccaccaca aatatcatga taactactat aattatagtg 7260 attatagtaa tattgttatc attaattgct gttggactgc tcttatactg taaggccaga 7320 agcacaccag tcacactaag caaagatcaa ctgagtggta taaataatat tgcatttagt 7380 aactaaataa aaatagcacc taatcatgtt cttacaatgg tttactatct gctcatagac 7440 aacccatctg tcattggatt ttcttaaaat ctgaacttca tcgaaactct catctataaa 7500 ccatctcact tacactattt aagtagattc ctagtttata gttatataaa acacaattgc 7560 atgccagatt aacttaccat ctgtaaaaat gaaaactggg gcaaatatgt cacgaaggaa 7620 tccttgcaaa tttgaaattc gaggtcattg cttaaatggt aagaggtgtc attttagtca 7680 taattatttt gaatggccac cccatgcact gcttgtaaga caaaacttta tgttaaacag 7740 aatacttaag tctatggata aaagtataga taccttatca gaaataagtg gagctgcaga 7800 gttggacaga acagaagagt atgctcttgg tgtagttgga gtgctagaga gttatatagg 7860 atcaataaac aatataacta aacaatcagc atgtgttgcc atgagcaaac tcctcactga 7920 actcaatagt gatgatatca aaaagctgag ggacaatgaa gagctaaatt cacccaagat 7980 aagagtgtac aatactgtca tatcatatat tgaaagcaac aggaaaaaca ataaacaaac 8040 tatccatctg ttaaaaagat tgccagcaga cgtattgaag aaaaccatca aaaacacatt 8100 ggatatccat aagagcataa ccatcaacaa cccaaaagaa tcaactgtta gtgatacaaa 8160 tgaccatgcc aaaaataatg atactacctg acaaatatcc ttgtagtata acttccatac 8220 taataacaag tagatgtaga gttactatgt ataatcaaaa gaacacacta tatttcaatc 8280 aaaacaaccc aaataaccat atgtactcac cgaatcaaac attcaatgaa atccattgga 8340 cctctcaaga attgattgac acaattcaaa attttctaca acatctaggt attattgagg 8400 atatatatac aatatatata ttagtgtcat aacactcaat tctaacactc accacatcgt 8460 tacattatta attcaaacaa ttcaagttgt gggacaaaat ggatcccatt attaatggaa 8520 attctgctaa tgtttatcta accgatagtt atttaaaagg tgttatctct ttctcagagt 8580 gtaatgcttt aggaagttac atattcaatg gtccttatct caaaaatgat tataccaact 8640 taattagtag acaaaatcca ttaatagaac acatgaatct aaagaaacta aatataacac 8700 agtccttaat atctaagtat cataaaggtg aaataaaatt agaagaacct acttattttc 8760 agtcattact tatgacatac aagagtatga cctcgtcaga acagattgct accactaatt 8820 tacttaaaaa gataataaga agagctatag aaataagtga tgtcaaagtc tatgctatat 8880 tgaataaact agggcttaaa gaaaaggaca agattaaatc caacaatgga caagatgaag 8940 acaactcagt tattacgacc ataatcaaag atgatatact ttcagctgtt aaagataatc 9000 aatctcatct taaagcagac aaaaatcact ctacaaaaca aaaagacaca atcaaaacaa 9060 cactcttgaa gaaattgatg tgttcaatgc aacatcctcc atcatggtta atacattggt 9120 ttaacttata cacaaaatta aacaacatat taacacagta tcgatcaaat gaggtaaaaa 9180 accatgggtt tacattgata gataatcaaa ctcttagtgg atttcaattt attttgaacc 9240 aatatggttg tatagtttat cataaggaac tcaaaagaat tactgtgaca acctataatc 9300 aattcttgac atggaaagat attagcctta gtagattaaa tgtttgttta attacatgga 9360 ttagtaactg cttgaacaca ttaaataaaa gcttaggctt aagatgcgga ttcaataatg 9420 ttatcttgac acaactattc ctttatggag attgtatact aaagctattt cacaatgagg 9480 ggttctacat aataaaagag gtagagggat ttattatgtc tctaatttta aatataacag 9540 aagaagatca attcagaaaa cgattttata atagtatgct caacaacatc acagatgctg 9600 ctaataaagc tcagaaaaat ctgctatcaa gagtatgtca tacattatta gataagacag 9660 tgtccgataa tataataaat ggcagatgga taattctatt aagtaagttc cttaaattaa 9720 ttaagcttgc aggtgacaat aaccttaaca atctgagtga actatatttt ttgttcagaa 9780 tatttggaca cccaatggta gatgaaagac aagccatgga tgctgttaaa attaattgca 9840 atgagaccaa attttacttg ttaagcagtc tgagtatgtt aagaggtgcc tttatatata 9900 gaattataaa agggtttgta aataattaca acagatggcc tactttaaga aatgctattg 9960 ttttaccctt aagatggtta acttactata aactaaacac ttatccttct ttgttggaac 10020 ttacagaaag agatttgatt gtgttatcag gactacgttt ctatcgtgag tttcggttgc 10080 ctaaaaaagt ggatcttgaa atgattataa atgataaagc tatatcacct cctaaaaatt 10140 tgatatggac tagtttccct agaaattaca tgccatcaca catacaaaac tatatagaac 10200 atgaaaaatt aaaattttcc gagagtgata aatcaagaag agtattagag tattatttaa 10260 gagataacaa attcaatgaa tgtgatttat acaactgtgt agttaatcaa agttatctca 10320 acaaccctaa tcatgtggta tcattgacag gcaaagaaag agaactcagt gtaggtagaa 10380 tgtttgcaat gcaaccggga atgttcagac aggttcaaat attggcagag aaaatgatag 10440 ctgaaaacat tttacaattc tttcctgaaa gtcttacaag atatggtgat ctagaactac 10500 aaaaaatatt agaactgaaa gcaggaataa gtaacaaatc aaatcgctac aatgataatt 10560 acaacaatta cattagtaag tgctctatca tcacagatct cagcaaattc aatcaagcat 10620 ttcgatatga aacgtcatgt atttgtagtg atgtgctgga tgaactgcat ggtgtacaat 10680 ctctattttc ctggttacat ttaactattc ctcatgtcac aataatatgc acatataggc 10740 atgcaccccc ctatatagga gatcatattg tagatcttaa caatgtagat gaacaaagtg 10800 gattatatag atatcacatg ggtggcatcg aagggtggtg tcaaaaacta tggaccatag 10860 aagctatatc actattggat ctaatatctc tcaaagggaa attctcaatt actgctttaa 10920 ttaatggtga caatcaatca atagatataa gcaaaccaat cagactcatg gaaggtcaaa 10980 ctcatgctca agcagattat ttgctagcat taaatagcct taaattactg tataaagagt 11040 atgcaggcat aggccacaaa ttaaaaggaa ctgagactta tatatcacga gatatgcaat 11100 ttatgagtaa aacaattcaa cataacggtg tatattaccc agctagtata aagaaagtcc 11160 taagagtggg accgtggata aacactatac ttgatgattt caaagtgagt ctagaatcta 11220 taggtagttt gacacaagaa ttagaatata gaggtgaaag tctattatgc agtttaatat 11280 ttagaaatgt atggttatat aatcagattg ctctacaatt aaaaaatcat gcattatgta 11340 acaataaact atatttggac atattaaagg ttctgaaaca cttaaaaacc ttttttaatc 11400 ttgataatat tgatacagca ttaacattgt atatgaattt acccatgtta tttggtggtg 11460 gtgatcccaa cttgttatat cgaagtttct atagaagaac tcctgacttc ctcacagagg 11520 ctatagttca ctctgtgttc atacttagtt attatacaaa ccatgactta aaagataaac 11580 ttcaagatct gtcagatgat agattgaata agttcttaac atgcataatc acgtttgaca 11640 aaaaccctaa tgctgaattc gtaacattga tgagagatcc tcaagcttta gggtctgaga 11700 gacaagctaa aattactagc gaaatcaata gactggcagt tacagaggtt ttgagtacag 11760 ctccaaacaa aatattctcc aaaagtgcac aacattatac tactacagag atagatctaa 11820 atgatattat gcaaaatata gaacctacat atcctcatgg gctaagagtt gtttatgaaa 11880 gtttaccctt ttataaagca gagaaaatag taaatcttat atcaggtaca aaatctataa 11940 ctaacatact ggaaaaaact tctgccatag acttaacaga tattgataga gccactgaga 12000 tgatgaggaa aaacataact ttgcttataa ggatacttcc attggattgt aacagagata 12060 aaagagagat attgagtatg gaaaacctaa gtattactga attaagcaaa tatgttaggg 12120 aaagatcttg gtctttatcc aatatagttg gtgttacatc acccagtatc atgtatacaa 12180 tggacatcaa atatactaca agcactatat ctagtggcat aattatagag aaatataatg 12240 ttaacagttt aacacgtggt gagagaggac ccactaaacc atgggttggt tcatctacac 12300 aagagaaaaa aacaatgcca gtttataata gacaagtctt aaccaaaaaa cagagagatc 12360 aaatagatct attagcaaaa ttggattggg tgtatgcatc tatagataac aaggatgaat 12420 tcatggaaga actcagcata ggaacccttg ggttaacata tgaaaaggcc aagaaattat 12480 ttccacaata tttaagtgtc aattatttgc atcgccttac agtcagtagt agaccatgtg 12540 aattccctgc atcaatacca gcttatagaa caacaaatta tcactttgac actagcccta 12600 ttaatcgcat attaacagaa aagtatggtg atgaagatat tgacatagta ttccaaaact 12660 gtataagctt tggccttagt ttaatgtcag tagtagaaca atttactaat gtatgtccta 12720 acagaattat tctcatacct aagcttaatg agatacattt gatgaaacct cccatattca 12780 caggtgatgt tgatattcac aagttaaaac aagtgataca aaaacagcat atgtttttac 12840 cagacaaaat aagtttgact caatatgtgg aattattctt aagtaataaa acactcaaat 12900 ctggatctca tgttaattct aatttaatat tggcacataa aatatctgac tattttcata 12960 atacttacat tttaagtact aatttagctg gacattggat tctgattata caacttatga 13020 aagattctaa aggtattttt gaaaaagatt ggggagaggg atatataact gatcatatgt 13080 ttattaattt gaaagttttc ttcaatgctt ataagaccta tctcttgtgt tttcataaag 13140 gttatggcaa agcaaagctg gagtgtgata tgaacacttc agatcttcta tgtgtattgg 13200 aattaataga cagtagttat tggaagtcta tgtctaaggt atttttagaa caaaaagtta 13260 tcaaatacat tcttagccaa gatgcaagtt tacatagagt aaaaggatgt catagcttca 13320 aattatggtt tcttaaacgt cttaatgtag cagaattcac agtttgccct tgggttgtta 13380 acatagatta tcatccaaca catatgaaag caatattaac ttatatagat cttgttagaa 13440 tgggattgat aaatatagat agaatacaca ttaaaaataa acacaaattc aatgatgaat 13500 tttatacttc taatctcttc tacattaatt ataacttctc agataatact catctattaa 13560 ctaaacatat aaggattgct aattctgaat tagaaaataa ttacaacaaa ttatatcatc 13620 ctacaccaga aaccctagag aatatactag ccaatccgat taaaagtaat gacaaaaaga 13680 cactgaatga ctattgtata ggtaaaaatg ttgactcaat aatgttacca ttgttatcta 13740 ataagaagct tattaaatcg tctgcaatga ttagaaccaa ttacagcaaa caagatttgt 13800 ataatttatt ccctatggtt gtgattgata gaattataga tcattcaggc aatacagcca 13860 aatccaacca actttacact actacttccc accaaatatc cttagtgcac aatagcacat 13920 cactttactg catgcttcct tggcatcata ttaatagatt caattttgta tttagttcta 13980 caggttgtaa aattagtata gagtatattt taaaagatct taaaattaaa gatcccaatt 14040 gtatagcatt cataggtgaa ggagcaggga atttattatt gcgtacagta gtggaacttc 14100 atcctgacat aagatatatt tacagaagtc tgaaagattg caatgatcat agtttaccta 14160 ttgagttttt aaggctgtac aatggacata tcaacattga ttatggtgaa aatttgacca 14220 ttcctgctac agatgcaacc aacaacattc attggtctta tttacatata aagtttgctg 14280 aacctatcag tctttttgtc tgtgatgccg aattgtctgt aacagtcaac tggagtaaaa 14340 ttataataga atggagcaag catgtaagaa agtgcaagta ctgttcctca gttaataaat 14400 gtatgttaat agtaaaatat catgctcaag atgatattga tttcaaatta gacaatataa 14460 ctatattaaa aacttatgta tgcttaggca gtaagttaaa gggatcggag gtttacttag 14520 tccttacaat aggtcctgcg aatatattcc cagtatttaa tgtagtacaa aatgctaaat 14580 tgatactatc aagaaccaaa aatttcatca tgcctaagaa agctgataaa gagtctattg 14640 atgcaaatat taaaagtttg ataccctttc tttgttaccc tataacaaaa aaaggaatta 14700 atactgcatt gtcaaaacta aagagtgttg ttagtggaga tatactatca tattctatag 14760 ctggacgtaa tgaagttttc agcaataaac ttataaatca taagcatatg aacatcttaa 14820 aatggttcaa tcatgtttta aatttcagat caacagaact aaactataac catttatata 14880 tggtagaatc tacatatcct tacctaagtg aattgttaaa cagcttgaca accaatgaac 14940 ttaaaaaact gattaaaatc acaggtagtc tgttatacaa ctttcataat gaataatgaa 15000 taaagatctt ataataaaaa ttcccatagc tatacactaa cactgtattc aattatagtt 15060 attaaaaatt aaaaatcata taatttttta aataactttt agtgaactaa tcctaaagtt 15120 atcattttaa tcttggagga ataaatttaa accctaatct aattggttta tatgtgtatt 15180 aactaaatta cgagatatta gtttttgaca ctttttttct cgt 15223 <210> 2 <211> 15225 <212> DNA <213> respiratory syncytial virus <400> 2 acgcgaaaaa atgcgtacta caaacttgca cattcggaaa aaatggggca aataagaatt 60 tgataagtgc tatttaagtc taaccttttc aatcagaaat ggggtgcaat tcactgagca 120 tgataaaggt tagattacaa aatttatttg acaatgacga agtagcattg ttaaaaataa 180 catgttatac tgacaaatta attcttctga ccaatgcatt agccaaagca gcaatacata 240 caattaaatt aaacggtata gtttttatac atgttataac aagcagtgaa gtgtgccctg 300 ataacaacat tgtagtaaaa tctaacttta caacaatgcc aatattacaa aacggaggat 360 acatatggga attgattgag ttgacacact gctctcaatt aaacggtcta atggatgata 420 attgtgaaat caaattttct aaaagactaa gtgactcagt aatgactaat tatatgaatc 480 aaatatctga tttacttggg cttgatctca attcatgaat tatgtttagt ctaactcaat 540 agacatgtgt ttattaccat tttagttaat ataaaaactc atcaaaggga aatggggcaa 600 ataaactcac ctaatcaatc aaactatgag cactacaaat gacaacacta ctatgcaaag 660 attaatgatc acggacatga gacccctgtc gatggattca ataataacat ctctcaccaa 720 agaaatcatc acacacaaat tcatatactt gataaacaat gaatgtattg taagaaaact 780 tgatgaaaga caagctacat ttacattctt agtcaattat gagatgaagc tactgcacaa 840 agtagggagt accaaataca agaaatacac tgaatataat acaaaatatg gcactttccc 900 catgcctata tttatcaatc atggcgggtt tctagaatgt attggcatta agcctacaaa 960 acacactcct ataatataca aatatgacct caacccgtaa attccaacaa aaaaaaccaa 1020 cccaaccaaa ccaagctatt cctcaaacaa caatgctcaa tagttaagaa ggagctaatc 1080 cgttttagta attaaaaata aaagtaaagc caataacata aattggggca aatacaaaga 1140 tggctcttag caaagtcaag ttaaatgata cattaaataa ggatcagctg ctgtcatcca 1200 gcaaatacac gattcaacgt agtacaggag ataatattga cactcccaat tatgatgtgc 1260 aaaaacacct aaacaaacta tgtggtatgc tattaatcac tgaagatgca aatcataaat 1320 tcacaggatt aataggtatg ttatatgcta tgtccaggtt aggaagggaa gacactataa 1380 agatacttaa agatgctgga tatcatgtta aagctaatgg agtagatata acaacatatc 1440 gtcaagatat aaatggaaag gaaatgaaat tcgaagtatt aacattatca agcttgacat 1500 cagaaataca agtcaatatt gagatagaat ctagaaaatc ctacaaaaaa atgctaaaag 1560 agatgggaga agtggctcca gaatataggc atgattctcc agactgtggg atgataatac 1620 tgtgtatagc agcacttgta ataaccaaat tagcagcagg agacagatca ggtcttacag 1680 cagtaattag gagggcaaac aatgtcttaa aaaatgaaat aaaacgctac aagggtctca 1740 taccaaagga tatagctaac agtttttatg aagtgtttga aaaacaccct catcttatag 1800 atgtttttgt gcactttggc attgcacaat catcaacaag agggggtagt agagttgaag 1860 gaatctttgc aggattgttt atgaatgcct atggttcagg gcaagtaatg ctaagatggg 1920 gagttttagc caaatctgta aaaaatatca tgctaggtca tgctagtgtc caggcagaaa 1980 tggagcaagt tgtggaagtc tatgagtatg cacagaagtt gggaggagaa gctggattct 2040 accatatatt gaacaatcca aaagcatcat tgctgtcatt aactcaattt cctaacttct 2100 caagtgtggt cctaggcaat gcagcaggtc taggcataat gggagagtat agaggtacgc 2160 caagaaacca ggatctttat gatgcagcca aagcatatgc agagcaactc aaagaaaatg 2220 gagtaataaa ctacagtgta ttagacttaa cagcagaaga attggaagcc ataaagaatc 2280 aactcaaccc taaagaagat gatgtagagc tttaagttaa caaaaaatac ggggcaaata 2340 agtcaacatg gagaagtttg cacctgaatt tcatggagaa gatgcaaata acaaagctac 2400 caaattccta gaatcaataa agggcaagtt cgcatcatcc aaagatccta agaagaaaga 2460 tagcataata tctgttaact caatagatat agaagtaacc aaagagagcc cgataacatc 2520 tggcaccaac atcatcaatc caacaagtga agccgacagt accccagaaa ccaaagccaa 2580 ctacccaaga aaacccctag taagcttcaa agaagatctc accccaagtg acaacccttt 2640 ttctaagttg tacaaagaaa caatagaaac atttgataac aatgaagaag aatctagcta 2700 ctcatatgaa gagataaatg atcaaacaaa tgacaacatt acagcaagac tagatagaat 2760 tgatgaaaaa ttaagtgaaa tattaggaat gctccataca ttagtagttg caagtgcagg 2820 acccacttca gctcgcgatg gaataagaga tgctatggtt ggtctgagag aagaaatgat 2880 agaaaaaata agagcggaag cattaatgac caatgatagg ttagaggcta tggcaagact 2940 taggaatgag gaaagcgaaa aaatggcaaa agacacctca gatgaagtgc ctcttaatcc 3000 aacttccaaa aaattgagtg acttgttgga agacaacgat agtgacaatg atctgtcact 3060 tgatgatttt tgatcagtga tcaactcact cagcaatcaa caacatcaat aaaacagaca 3120 tcaatccatt gaatcaactg ccagaccgaa caaacaaatg tccgtcagcg gaaccaccaa 3180 ccaatcaatc aaccaactga tccatcagca acctgacgaa attaacaata tagtaacaaa 3240 aaaagaacaa gatggggcaa atatggaaac atacgtgaac aagcttcacg aaggctccac 3300 atacacagca gctgttcagt acaatgttct agaaaaagat gatgatcctg catcactaac 3360 aatatgggtg cctatgttcc agtcatctgt accagcagac ttgctcataa aagaacttgc 3420 aagcatcaac atactagtga agcagatctc tacgcccaaa ggaccttcac tacgagtcac 3480 gattaactca agaagtgctg tgctggctca aatgcctagt aatttcatca taagcgcaaa 3540 tgtatcatta gatgaaagaa gcaaattagc atatgatgta actacacctt gtgaaatcaa 3600 agcatgcagt ctaacatgct taaaagtgaa aagtatgtta actacagtca aagatcttac 3660 catgaagaca ttcaacccca ctcatgagat cattgctcta tgtgaatttg aaaatattat 3720 gacatcaaaa agagtaataa taccaaccta tctaagacca attagtgtca aaaacaagga 3780 tctgaactca ctagaaaaca tagcaaccac cgaattcaaa aatgctatca ccaatgcgaa 3840 aattattccc tatgctggat tagtattagt tatcacagtt actgacaata aaggagcatt 3900 caaatatatc aagccacaga gtcaatttat agtagatctt ggtgcctacc tagaaaaaga 3960 gagcatatat tatgtgacta ctaattggaa gcatacagct acacgttttt caatcaaacc 4020 actagaggat taaatttaat tatcaacact gaatgacagg tccacatata tcctcaaact 4080 acacactata tccaaacatc atgaacatct acactacaca cttcatcaca caaaccaatc 4140 ccactcaaaa tccaaaatca ctaccagcca ctatctgcta gacctagagt gcgaataggt 4200 aaataaaacc aaaatatggg gtaaatagac attagttaga gttcaatcaa tctcaacaac 4260 catttatacc gccaattcaa tacatatact ataaatctta aaatgggaaa tacatccatc 4320 acaatagaat tcacaagcaa attttggccc tattttacac taatacatat gatcttaact 4380 ctaatctctt tactaattat aatcactatt atgattgcaa tactaaataa gctaagtgaa 4440 cataaaacat tctgtaacaa tactcttgaa ctaggacaga tgcatcaaat caacacatag 4500 tgctctacca tcatgctgtg tcaaattata atcctgtata tataaacaaa caaatccaat 4560 cttctcacag agtcatggtg tcgcaaaacc acgccaacta tcatggtagc atagagtagt 4620 tatttaaaaa ttaacataat gatgaattat tagtatggga tcaaaaacaa cattggggca 4680 aatgcaacca tgtccaaaca caagaatcaa cgcactgcca ggactctaga aaagacctgg 4740 gatactctca atcatctaat tgtaatatcc tcttgtttat acagattaaa tttaaaatct 4800 atagcacaaa tagcactatc agttctggca atgataatct caacctctct cataattgca 4860 gccataatat tcatcatctc tgccaatcac aaagttacac taacaacggt cacagttcaa 4920 acaataaaaa accacactga aaaaaacatc accacctacc ttactcaagt cccaccagaa 4980 agggttagct catccaaaca acctacaacc acatcaccaa tccacacaaa ttcagccaca 5040 acatcaccca acacaaagtc agaaacacac cacacaacag cacaaaccaa aggcagaacc 5100 accacctcaa cacagaccaa caagccgagc acaaaaccac gcctaaaaaa tccaccaaaa 5160 aaaccaaaag atgattacca ttttgaagtg ttcaacttcg ttccctgtag tatatgtggc 5220 aacaatcaac tttgcaaatc catctgtaaa acaataccaa gcaacaaacc aaagaagaaa 5280 ccaaccatca aacccacaaa caaaccaacc accaaaacca caaacaaaag agacccaaaa 5340 acaccagcca aaacgacgaa aaaagaaact accaccaacc caacaaaaaa accaaccctc 5400 acgaccacag aaagagacac cagcacctca caatccactg tgctcgacac aaccacatta 5460 gaacacacaa tccaacagca atccctccac tcaaccaccc ccgaaaacac acccaactcc 5520 acacaaacac ccacagcatc cgagccctct acatcaaatt ccacccaaaa tacccaatca 5580 catgcttagt tattcaaaaa ctacatctta gcagaaaacc gtgacctatc aagcaagaac 5640 gaaattaaac ctggggcaaa taaccatgga gctgctgatc cacaggttaa gtgcaatctt 5700 cctaactctt gctattaatg cattgtacct cacctcaagt cagaacataa ctgaggagtt 5760 ttaccaatcg acatgtagtg cagttagcag aggttatttt agtgctttaa gaacaggttg 5820 gtataccagt gtcataacaa tagaattaag taatataaaa gaaaccaaat gcaatggaac 5880 tgacactaaa gtaaaactta taaaacaaga attagataag tataagaatg cagtgacaga 5940 attacagcta cttatgcaaa acacaccagc tgccaacaac cgggccagaa gagaagcacc 6000 acagtatatg aactatacaa tcaataccac taaaaaccta aatgtatcaa taagcaagaa 6060 gaggaaacga agatttctgg gcttcttgtt aggtgtagga tctgcaatag caagtggtat 6120 agctgtatcc aaagttctac accttgaagg agaagtgaac aagatcaaaa atgctttgtt 6180 atctacaaac aaagctgtag tcagtctatc aaatggggtc agtgttttaa ccagcaaagt 6240 gttagatctc aagaattaca taaataacca attattaccc atagtaaatc aacagagctg 6300 tcgcatctcc aacattgaaa cagttataga attccagcag aagaacagca gattgttgga 6360 aatcaacaga gaattcagtg tcaatgcagg tgtaacaaca cctttaagca cttacatgtt 6420 aacaaacagt gagttactat cattgatcaa tgatatgcct ataacaaatg atcagaaaaa 6480 attaatgtca agcaatgttc agatagtaag gcaacaaagt tattctatca tgtctataat 6540 aaaggaagaa gtccttgcat atgttgtaca gctacctatc tatggtgtaa tagatacacc 6600 ttgctggaaa ttacacacat cacctctatg caccaccaac atcaaagaag gatcaaatat 6660 ttgtttaaca aggactgata gaggatggta ttgtgataat gcaggatcag tatccttctt 6720 tccacaggct gacacttgta aagtacagtc caatcgagta ttttgtgaca ctatgaacag 6780 tttgacatta ccaagtgaag tcagcctttg taacactgac atattcaatt ccaagtatga 6840 ctgcaaaatt atgacatcaa aaacagacat aagcagctca gtaattactt ctcttggagc 6900 tatagtgtca tgctatggta aaactaaatg cactgcatcc aacaaaaatc gtgggattat 6960 aaagacattt tctaatggtt gtgactatgt gtcaaacaaa ggagtagata ctgtgtcagt 7020 gggcaacact ttatactatg taaacaagct ggaaggcaag aacctttatg taaaagggga 7080 acctataata aattactatg accctctagt gtttccttct gatgagtttg atgcatcaat 7140 atctcaagtc aatgaaaaaa tcaatcaaag tttagctttt attcgtagat ctgatgaatt 7200 actacataat gtaaatactg gcaaatctac tacaaatatt atgataacta caattattat 7260 agtaatcatt gtagtattgt tatcattaat agctattggt ttgctgttgt attgcaaagc 7320 caaaaacaca ccagttacac taagcaaaga ccaactaagt ggaatcaata atattgcatt 7380 cagcaaatag acaaaaaacc acctgatcat gtttcaacaa cagtctgctg atcaccaatc 7440 ccaaatcaac ccataacaaa cacttcaaca tcacagtaca ggctgaatca tttcttcaca 7500 tcatgctacc cacacaacta agctagatcc ttaactcata gttacataaa aacctcaagt 7560 atcacaatca aacactaaat caacacatca ttcacaaaat taacagctgg ggcaaatatg 7620 tcgcgaagaa atccttgtaa atttgagatt agaggtcatt gcttgaatgg tagaagatgt 7680 cactacagtc ataattactt tgaatggcct cctcatgcct tactagtgag gcaaaacttc 7740 atgttaaaca agatactcaa gtcaatggac aaaagcatag acactttgtc tgaaataagt 7800 ggagctgctg aactggacag aacagaagaa tatgctcttg gtatagttgg agtgctagag 7860 agttacatag gatctataaa caacataaca aaacaatcag catgtgttgc tatgagtaaa 7920 cttcttattg agatcaatag tgatgacatt aaaaagctga gagataatga agaacccaat 7980 tcacctaaga taagagtgta caatactgtt atatcataca ttgagagcaa tagaaaaaac 8040 aacaagcaaa caatccatct gctcaaaaga ctaccagcag acgtgctgaa gaagacaata 8100 aaaaacacat tagatatcca caaaagcata atcataagca acccaaaaga gtcaaccgtg 8160 aatgatcaaa atgaccaaac caaaaataat gatattaccg gataaatatc cttgtagtat 8220 atcatccata ttgatttcaa gtgaaagcat gattgctaca ttcaatcata aaaacatatt 8280 acaatttaac cataaccatt tggataacca ccagcgttta ttaaataata tatttgatga 8340 aattcattgg acacctaaaa acttattaga tgccactcaa caatttctcc aacatcttaa 8400 catccctgaa gatatatata caatatatat attagtgtca taatgcttgg ccataacgat 8460 tctatatcat ccaaccataa aactatctta ataaggttat gggacaaaat ggatcccatt 8520 attaatggaa actctgctaa tgtgtatcta actgatagtt atttaaaagg tgttatctct 8580 ttttcagaat gtaatgcttt agggagttac ctttttaacg gcccttatct caaaaatgat 8640 tacaccaact taattagtag acaaagtcca ctactagagc atatgaatct taaaaaacta 8700 actataacac agtcattaat atctagatat cataaaggtg aactgaaatt agaagaacca 8760 acttatttcc agtcattact tatgacatat aaaagcatgt cctcgtctga acaaattgct 8820 acaactaact tacttaaaaa aataatacga agagctatag aaataagtga tgtaaaggtg 8880 tacgccatct tgaataaact aggactaaag gaaaaggaca gagttaagcc caacaataat 8940 tcaggtgatg aaaactcagt acttacaact ataattaaag atgatatact ttcggctgtg 9000 gaaagcaatc aatcatatac aaattcagac aaaaatcact cagtaaatca aaatatcact 9060 atcaaaacaa cactcttgaa aaaattgatg tgttcaatgc aacatcctcc atcatggtta 9120 atacactggt tcaatttata tacaaaatta aataacatat taacacaata tcgatcaaat 9180 gaggtaaaaa gtcatgggtt tatattaata gataatcaaa ctttaagtgg ttttcagttt 9240 attttaaatc aatatggttg tatcgtttat cataaaggac tcaaaaaaat cacaactact 9300 acttacaatc aatttttaac atggaaagac atcagcctta gcagattaaa tgtttgctta 9360 attacttgga taagtaattg tttgaataca ttaaataaaa gcttagggct gagatgtgga 9420 ttcaataatg ttgtgttatc acaattattt ctttatggag attgtatact gaaattattt 9480 cataatgaag gcttctacat aataaaagaa gtagagggat ttattatgtc tttaattcta 9540 aacataacag aagaagatca atttaggaaa cgattttata atagcatgct aaataacatc 9600 acagatgcag ctattaaggc tcaaaagaac ctactatcaa gggtatgtca cactttatta 9660 gacaagacag tgtctgataa tatcataaat ggtaaatgga taatcctatt aagtaaattt 9720 cttaaattga ttaagcttgc aggtgataat aatctcaata atttgagtga gctatatttt 9780 ctcttcagaa tctttggaca tccaatggtt gatgaaagac aagcaatgga tgctgtaaga 9840 attaactgta atgaaactaa gttctactta ttaagtagtc taagtacgtt aagaggtgct 9900 ttcatttata gaatcataaa agggtttgta aatacctaca acagatggcc cactttaagg 9960 aatgctattg tcctacctct aagatggtta aactattata aacttaatac ttatccatct 10020 ctacttgaaa tcacagaaaa tgatttgatt attttatcag gattgcggtt ctatcgtgaa 10080 tttcatctgc ctaaaaaagt ggatcttgaa atgataataa atgacaaagc catttcacct 10140 ccaaaagatc taatatggac tagttttcct agaaattaca tgccatcaca tatacaaaat 10200 tatatagaac atgaaaagtt gaagttctct gaaagcgaca gatcaagaag agtactagag 10260 tattacttga gagataataa attcaatgaa tgcgatctat acaattgtgt agtcaatcaa 10320 agctatctca acaactctaa tcacgtggta tcactaactg gtaaagaaag agagctcagt 10380 gtaggtagaa tgtttgctat gcaaccaggt atgtttaggc aaatccaaat cttagcagag 10440 aaaatgatag ccgaaaatat tttacaattc ttccctgaga gtttgacaag atatggtgat 10500 ctagagcttc aaaagatatt agaattaaaa gcaggaataa gcaacaagtc aaatcgttat 10560 aatgataact acaacaatta tatcagtaaa tgttctatca ttacagatct tagcaaattc 10620 aatcaagcat ttagatatga aacatcatgt atctgcagtg atgtattaga tgaactgcat 10680 ggagtacaat ctctgttctc ttggttgcat ttaacaatac ctcttgtcac aataatatgt 10740 acatatagac atgcacctcc tttcataaag gatcatgttg ttaatcttaa tgaagttgat 10800 gaacaaagtg gattatacag atatcatatg ggtggtattg agggctggtg tcaaaaactg 10860 tggaccattg aagctatatc attattagat ctaatatctc tcaaagggaa attctctatc 10920 acagctctga taaatggtga taatcagtca attgatataa gtaaaccagt tagacttata 10980 gagggtcaga cccatgctca agcagattat ttgttagcat taaatagcct taaattgcta 11040 tataaagagt atgcaggtat aggccataag cttaagggaa cagagaccta tatatcccga 11100 gatatgcagt tcatgagcaa aacaatccag cacaatggag tgtactatcc agccagtatc 11160 aaaaaagtcc tgagagtagg tccatggata aatacaatac ttgatgattt taaagttagt 11220 ttagaatcta taggtagctt aacacaggag ttagaataca gaggggaaag cttattatgc 11280 agtttaatat ttaggaacat ttggttatac aatcaaattg ctttgcaact ccgaaatcat 11340 gcattatgta acaataagct atatttagat atattgaaag tattaaaaca cttaaaaact 11400 ttttttaatc ttgatagtat cgatatggcg ttatcattgt atatgaattt gcctatgctg 11460 tttggtggtg gtgatcctaa tttgttatat cgaagctttt ataggagaac tccagacttc 11520 cttacagaag ctatagtaca ttcagtgttt gtgttgagct attatactgg tcacgattta 11580 caagataagc tccaggatct tccagatgat agactgaaca aattcttgac atgtgtcatc 11640 acattcgata aaaatcccaa tgccgagttt gtaacattga tgagggatcc acaggcgtta 11700 gggtctgaaa ggcaagctaa aattactagt gagattaata gattagcagt aacagaagtc 11760 ttaagtatag ctccaaacaa aatattttct aaaagtgcac aacattatac taccactgag 11820 attgatctaa atgacattat gcaaaatata gaaccaactt accctcatgg attaagagtt 11880 gtttatgaaa gtctaccttt ttataaagca gaaaaaatag ttaatcttat atcaggaaca 11940 aaatccataa ctaatatact tgaaaaaaca tcagcaatag atacaactga tattaatagg 12000 gctactgata tgatgaggaa aaatataact ttacttataa ggatacttcc actagattgt 12060 aacaaagaca aaagagagtt attaagttta gaaaatctta gtataactga attaagcaag 12120 tatgtaagag aaagatcttg gtcattatcc aatatagtag gagtaacatc gccaagtatt 12180 atgttcacaa tggacattaa atatacaact agcactatag ccagtggtat aattatagaa 12240 aaatataatg ttaatagttt aactcgtggt gaaagaggac ctactaagcc atgggtaggt 12300 tcatctacgc aggagaaaaa aacaatgcca gtgtacaata gacaagtttt aaccaaaaag 12360 caaagagacc aaatagattt attagcaaaa ttagactggg tatatgcatc catagacaac 12420 aaagatgaat tcatggaaga actgagtact ggaacacttg gactgtcata tgaaaaagcc 12480 aaaaagttgt ttccacaata tctaagtgtc aattatttac accgtttaac agtcagtagt 12540 agaccatgtg aattccctgc atcaatacca gcttatagaa caacaaatta tcatttcgat 12600 actagtccta tcaatcatgt attaacagaa aagtatggag atgaagatat cgacattgtg 12660 tttcaaaatt gcataagttt tggtcttagc ctgatgtcgg ttgtggaaca attcacaaac 12720 atatgtccta atagaattat tctcataccg aagctgaatg agatacattt gatgaaacct 12780 cctatattta caggagatgt tgatatcatc aagttgaagc aagtgataca aaaacagcat 12840 atgttcctac cagataaaat aagtttaacc caatatgtag aattattcct aagtaacaaa 12900 gcacttaaat ctggatctaa catcaattct aatttaatat tagtacataa aatgtctgat 12960 tattttcata atgcttatat tttaagtact aatttagctg gacattggat tctaattatt 13020 caacttatga aagattcaaa aggtattttt gaaaaagatt ggggagaggg gtacataact 13080 gatcatatgt tcattaattt gaatgttttc tttaatgctt ataagactta tttgctatgt 13140 tttcataaag gttatggtaa agcaaaatta gaatgtgata tgaacacttc agatcttctt 13200 tgtgttttgg agttaataga cagtagctac tggaaatcta tgtctaaagt tttcctagaa 13260 caaaaagtca taaaatacat agtcaatcaa gacacaagtt tgcatagaat aaaaggctgt 13320 cacagtttta agttgtggtt tttaaaacgc cttaataatg ctaaatttac cgtatgccct 13380 tgggttgtta acatagatta tcacccaaca chtatgaaag ctatattatc ttacatagat 13440 ttagttagaa tggggttaat aaatgtagat aaattaacca ttaaaaataa aaacaaattc 13500 aatgatgaat tttacacatc aaatctcttt tacattagtt ataacttttc agacaacact 13560 catttgctaa caaaacaaat aagaattgct aattcagaat tagaagataa ttataacaaa 13620 ctatatcacc caaccccaga aactttagaa aatatatcat taattcctgt taaaagtaat 13680 aatagtaaca aacctaaatt ttgtataagt ggaaataccg aatctataat gatgtcaaca 13740 ttctctaata aaatgcatat taaatcttcc actgttacca caagattcaa ttatagcaaa 13800 caagacttgt acaatttatt tccaaatgtt gtgatagaca ggattataga tcattcaggt 13860 aatacagcaa aatctaacca actttacatc accacttcac atcagacatc tttagtaagg 13920 aatagtgcat cactttattg catgcttcct tggcatcatg tcaatagatt taactttgta 13980 tttagttcca caggatgcaa gatcagtata gagtatattt taaaagatct taagattaag 14040 gaccccagtt gtatagcatt cataggtgaa ggagctggta acttattatt acgtacggta 14100 gtagaacttc atccagacat aagatacatt tacagaagtt taaaagattg caatgatcat 14160 agtttaccta ttgaatttct aagattatac aacgggcata taaacataga ttatggtgag 14220 aatttaacca ttcctgctac agatgcaact aataacattc attggtctta tttacatata 14280 aaatttgcag aacctattag catctttgtc tgcgatgctg aattacctgt tacagccaat 14340 tggagtaaaa ttataattga atggagtaag catgtaagaa agtgcaagta ctgttcttct 14400 gtaaatagat gcattttaat cgcaaaatat catgctcaag atgatattga tttcaaatta 14460 gataacatta ctatattaaa aacttacgtg tgcctaggta gcaagttaaa aggatctgaa 14520 gtttacttag tccttacaat aggccctgca aatatacttc ctgtttttga tgttgtgcaa 14580 aatgctaaat tgattttttc aagaactaaa aatttcatta tgcctaaaaa aactgacaag 14640 gaatctatcg atgcaaatat taaaagctta atacctttcc tttgttaccc tataacaaaa 14700 aaaggaatta agacttcatt gtcaaaattg aagagtgtag ttaatgggga tatattatca 14760 tattctatag ctggacgtaa tgaagtattc agcaacaagc ttataaacca caagcatatg 14820 aatatcctaa aatggctaga tcatgtttta aattttagat cagctgaact taattacaat 14880 catttataca tgatagagtc cacatatcct tacttaagtg aattgttaaa tagtttaaca 14940 accaatgagc tcaagaaact gattaaaata acaggtagtg tactatacaa ccttcccaac 15000 gaacagtaac ttaaaatatc attaacaagt ttggtcaaat ttagatgcta acacatcatt 15060 atattatagt tattaaaaaa tatgcaaact tttcaataat ttagcttact gattccaaaa 15120 ttatcatttt atttttaagg ggttgaataa aagtctaaaa ctaacaatga tacatgtgca 15180 tttacaacac aacgagacat tagtttttga cacttttttt ctcgt 15225 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive-sense M gene gragment <400> 3 actcaaataa gttaataaaa aatatcccgg gat 33 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative-sense M gene fragment <400> 4 cccgggatat tttttattaa cttatttgag t 31 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive-sense primer upstream of SH gene <400> 5 gaaagtatat attatgtt 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative-sense primer downstream of SH gene <400> 6 tatataagca cgatgatatg 20 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive-sense M gene fragment <400> 7 actcaaataa gttaat 16 <210> 8 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative-sense M gene fragment <400> 8 taacttattt gagt 14 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for NS1 gene deletion <400> 9 gacacaaccc acaatgataa tacaccac 28 <210> 10 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for NS1 gene deletion <400> 10 catctctaac caagggagtt aaatttaagt gg 32 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for NS2 gene deletion <400> 11 ttaaggagag atataagata gaagatg 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for NS2 gene deletion <400> 12 gttttatatt aactaatggt gttagtg 27 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward PCR primer for ablation of G gene start site <400> 13 ttataattgc agccatcata ttcatagcct cgg 33 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse PCR primer for ablationof G gene start site <400> 14 gtgaagttga gattacaatt gccagaatgg 30 <210> 15 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive-sense primer for intergenic region preceding the G gene <400> 15 gcatggatcc ttaattaaaa attaacataa tgatgaatta ttagtatg 48 <210> 16 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative-sense primer for intergenic region downstream of F gene <400> 16 gtgttggatc ctgattgcat gcttgaggtt tttatgtaac tatgagttaa g 51 <210> 17 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G gene-end signal <400> 17 agttattcaa aaa 13 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Positive-sense primer with G gene-end and F gene-start signals <400> 18 ccacgcctaa tgagttatat aaaacaattg gggcaaataa ccatggag 48 <210> 19 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Negative-sense primer with G gene-end and F gene-start signals <400> 19 gactgagtgt tctgagtaga gttggatgta gagggctcgg atgctg 46 <210> 20 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F gene-end signal of RSV A2 <400> 20 agttatataa aa 12 <210> 21 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G gene-end signal of RSV A2 <400> 21 agttacttaa aaa 13

Claims (123)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 주요 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질(P), 큰 중합효소 단백질(L), M2(ORF1) RNA 중합효소 신장 인자, 및 부분적 또는 완전한 키메릭 호흡기 신시티움 바이러스(RSV) 게놈 또는 안티게놈을 포함하되,
    상기 부분적 또는 완전한 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈은 한 RSV의 부분적 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈 내에 상이한 RSV 균주 또는 서브그룹 바이러스의 이종(heterologous) 유전자 또는 게놈 단편이 삽입되거나 대응(counterpart) 유전자 또는 게놈 단편을 치환하고 있으며,
    (ⅰ) G ORF의 마지막 11 개의 코돈의 세 번째 뉴클레오티드의 침묵(silent) 돌연변이;
    (ⅱ) G ORF의 종결 코돈의 대체적(alternative) 종결 코돈 배정으로의 변형;
    (ⅲ) ORF와 유전자 말단 신호 사이의 G 유전자의 하류의 비번역 영역으로의 4 개의 뉴클레오티드의 삽입;
    (ⅳ) 2 개의 뉴클레오티드 치환에 의해 G 유전자 말단 신호를 변화시키고, A 트랙의 길이를 1 개의 뉴클레오티드만큼 감소시킴으로써 상기 신호를 AGTTATATAAAA의 뉴클레오티드 서열을 가지는 균주 A2의 F 유전자의 신호로 일치; 및
    (ⅴ) G-F 유전자간으로부터 47 개의 뉴클레오티드의 결실로 구성되는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 감염성 키메릭 RSV.
  67. 제66항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 L 단백질의 위치 Tyr1321에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Phe521에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Met1169에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Gln831에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Asp1183에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Cys319에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 His1690에서의 돌연변이; N 단백질의 위치 Val267에서의 돌연변이; 및 유전자 M2의 유전자 개시 서열의 9번 위치에서의 단일 뉴클레오티드 치환으로 구성된 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 점 돌연변이를 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  68. 제66항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 SH 유전자의 결실을 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  69. 제66항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 중 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  70. 제66항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 모두의 결실을 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  71. 제68항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 중 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  72. 제71항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 모두의 결실을 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  73. 제67항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 SH 유전자의 결실을 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  74. 제67항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 중 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  75. 제73항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 중 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  76. 제73항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 모두의 결실을 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  77. 제74항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 모두의 결실을 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  78. 제67항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 2 이상의 상기 점 돌연변이를 포함하는 키메릭 RSV.
  79. 제67항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 L 단백질의 위치 Gln831에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Asp1183에서의 돌연변이; 유전자 M2의 유전자 개시 서열의 9번 위치에서의 단일 뉴클레오티드 치환; 및 추가로 SH 유전자의 결실을 포함하는 키메릭 RSV.
  80. 제67항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 L 단백질의 위치 Asp1183에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Cys319에서의 돌연변이; 및 L 단백질의 위치 His1690에서의 돌연변이를 포함하는 키메릭 RSV.
  81. 제66항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 L 단백질의 위치 Gln831에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Asp1183에서의 돌연변이; 유전자 M2의 유전자 개시 서열의 9번 위치에서의 단일 뉴클레오티드 치환; 및 L 단백질의 위치 Tyr1321에서의 돌연변이를 포함하는 키메릭 RSV.
  82. 제81항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 SH 유전자의 결실을 추가로 포함하는 키메릭 RSV.
  83. 제66항의 키메릭 RSV를 함유하는, 개체의 면역 시스템을 자극하여 RSV에 대한 방어를 유도하기 위한 약제.
  84. 제67항의 키메릭 RSV를 함유하는, 개체의 면역 시스템을 자극하여 RSV에 대한 방어를 유도하기 위한 약제.
  85. 제83항에 있어서, 103 내지 106 PFU의 투여량으로 제제화되는 약제.
  86. 제84항에 있어서, 103 내지 106 PFU의 투여량으로 제제화되는 약제.
  87. 제83항에 있어서, 상기도에 투여되는 약제.
  88. 제84항에 있어서, 상기도에 투여되는 약제.
  89. 제83항에 있어서, 스프레이, 점적 또는 에어로졸에 의해 투여되는 약제.
  90. 제84항에 있어서, 상기 키메릭 RSV가 RSV에 대한 항체에 혈청 음성이거나 또는 태반을 통해 얻어진 RSV에 대한 모체 항체를 소유하는 개체에 투여되는 약제.
  91. 제83항에 있어서, 상기 키메릭 RSV가 사람 RSV A 또는 RSV B에 대해 면역 반응을 유도하는 사람 RSV A 및 RSV B의 키메라인 약제.
  92. 제83항에 있어서, 상기 키메릭 RSV가 사람 RSV A 및 RSV B 모두에 대해 면역 반응을 유도하는 사람 RSV A 및 RSV B의 키메라인 약제.
  93. 제83항에 있어서, 상기 키메릭 RSV가 사람 RSV A 또는 RSV B에 대해 면역 반응을 유도하는 사람 RSV A 및 RSV B의 키메라이고, 사람 RSV A 또는 RSV B에 대해 면역 반응을 유도해낼 수 있는 제2의 약독화된 RSV와 함께 투여됨으로써 사람 RSV A 및 RSV B 모두에 대해 면역 반응이 유도되는 약제.
  94. 제93항에 있어서, 상기 키메릭 RSV 및 제2의 약독화된 RSV가 혼합물로서 동시에 투여되는 약제.
  95. 생리학적으로 허용되는 담체 내에 제66항의 키메릭 RSV를 포함하는 RSV에 대한 면역 반응 유도용 면역원성 조성물.
  96. 생리학적으로 허용되는 담체 내에 제67항의 키메릭 RSV를 포함하는 RSV에 대한 면역 반응 유도용 면역원성 조성물.
  97. 제95항에 있어서, 103 내지 106 PFU의 투여량으로 제제화되는 면역원성 조성물.
  98. 제96항에 있어서, 103 내지 106 PFU의 투여량으로 제제화되는 면역원성 조성물.
  99. 제95항에 있어서, 스프레이, 점적 또는 에어로졸로 상기도에 투여하기 위해 제제화된 면역원성 조성물.
  100. 제96항에 있어서, 스프레이, 점적 또는 에어로졸로 상기도에 투여하기 위해 제제화된 면역원성 조성물.
  101. 제95항에 있어서, 상기 키메릭 RSV가 사람 RSV A 또는 RSV B에 대해 면역 반응을 유도하는 사람 RSV A 및 RSV B의 키메라인 면역원성 조성물.
  102. 제95항에 있어서, 상기 키메릭 RSV가 사람 RSV A 및 RSV B 모두에 대해 면역 반응을 유도하는 사람 RSV A 및 RSV B의 키메라인 면역원성 조성물.
  103. 제95항에 있어서, 상기 키메릭 RSV가 사람 RSV A 또는 RSV B에 대해 면역 반응을 유도하는 사람 RSV A 및 RSV B의 키메라이고, 사람 RSV A 또는 RSV B에 대한 면역 반응을 유도해낼 수 있는 제2의 약독화 RSV를 추가로 포함하여, 사람 RSV A 및 RSV B 모두에 대해 면역 반응을 유도하는 면역원성 조성물.
  104. 한 RSV의 부분적 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈 내에 상이한 RSV 균주 또는 서브그룹 바이러스의 이종 유전자 또는 게놈 단편이 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하고 있으며,
    (ⅰ) G ORF의 마지막 11 개의 코돈의 세 번째 뉴클레오티드의 침묵 돌연변이;
    (ⅱ) G ORF의 종결 코돈의 대체적 종결 코돈 배정으로의 변형;
    (ⅲ) ORF와 유전자 말단 신호 사이의 G 유전자의 하류의 비번역 영역으로의 4 개의 뉴클레오티드의 삽입;
    (ⅳ) 2 개의 뉴클레오티드 치환에 의해 G 유전자 말단 신호를 변화시키고, A 트랙의 길이를 1 개의 뉴클레오티드만큼 감소시킴으로써 상기 신호를 AGTTATATAAAA의 뉴클레오티드 서열을 가지는 균주 A2의 F 유전자의 신호로 일치; 및
    (ⅴ) G-F 유전자간으로부터 47 개의 뉴클레오티드의 결실로 구성되는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 부분적 또는 완전한 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  105. 제104항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 L 단백질의 위치 Tyr1321에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Phe521에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Met1169에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Gln831에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Asp1183에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Cys319에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 His1690에서의 돌연변이; N 단백질의 위치 Val267에서의 돌연변이; 및 유전자 M2의 유전자 개시 서열의 9번 위치에서의 단일 뉴클레오티드 치환으로 구성된 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 점 돌연변이를 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  106. 제104항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 SH 유전자의 결실을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  107. 제104항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 중 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  108. 제104항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 모두의 결실을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  109. 제106항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 중 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  110. 제106항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 모두의 결실을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  111. 제105항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 SH 유전자의 결실을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  112. 제105항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 중 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  113. 제111항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 중 하나 이상의 결실을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  114. 제105항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 모두의 결실을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  115. 제111항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 NS1 및 NS2 유전자 모두의 결실을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  116. 제105항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 2 이상의 상기 점 돌연변이를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  117. 제105항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 L 단백질의 위치 Asp1183에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Cys319에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 His1690에서의 돌연변이; 및 N 단백질의 위치 Val267에서의 돌연변이를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  118. 제105항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 L 단백질의 위치 Asp1183에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Gln831에서의 돌연변이; 유전자 M2의 유전자 개시 서열의 9번 위치에서의 단일 뉴클레오티드 치환; 및 추가로 SH 유전자의 결실을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  119. 제105항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 L 단백질의 위치 Gln831에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Asp1183에서의 돌연변이; 유전자 M2의 유전자 개시 서열의 9번 위치에서의 단일 뉴클레오티드 치환; 및 L 단백질의 위치 Tyr1321에서의 돌연변이를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  120. 제119항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 SH 유전자의 결실을 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  121. 한 RSV의 부분적 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈 내에 상이한 RSV 균주 또는 서브그룹 바이러스의 이종 유전자 또는 게놈 단편이 삽입되거나 대응 유전자 또는 게놈 단편을 치환하고 있으며,
    (ⅰ) G ORF의 마지막 11 개의 코돈의 세 번째 뉴클레오티드의 침묵 돌연변이;
    (ⅱ) G ORF의 종결 코돈의 대체적 종결 코돈 배정으로의 변형;
    (ⅲ) ORF와 유전자 말단 신호 사이의 G 유전자의 하류의 비번역 영역으로의 4 개의 뉴클레오티드의 삽입;
    (ⅳ) 2 개의 뉴클레오티드 치환에 의해 G 유전자 말단 신호를 변화시키고, A 트랙의 길이를 1 개의 뉴클레오티드만큼 감소시킴으로써 상기 신호를 AGTTATATAAAA의 뉴클레오티드 서열을 가지는 균주 A2의 F 유전자의 신호로 일치; 및
    (ⅴ) G-F 유전자간으로부터 47 개의 뉴클레오티드의 결실로 구성되는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 부분적 또는 완전한 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터를 세포 또는 무세포 용해물(lysate)에서 발현시키고,
    RSV N, P, L 및 M2(ORF1) RNA 중합효소 신장 인자 단백질을 상기 세포 또는 무세포 용해물에서 발현시키는 것을 포함하는, RSV를 코딩하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 감염성 약독화된 키메릭 RSV 입자를 제조하는 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈이 L 단백질의 위치 Tyr1321에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Phe521에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Met1169에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Gln831에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Asp1183에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 Cys319에서의 돌연변이; L 단백질의 위치 His1690에서의 돌연변이; N 단백질의 위치 Val267에서의 돌연변이; 및 유전자 M2의 유전자 개시 서열의 9번 위치에서의 단일 뉴클레오티드 치환으로 구성된 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 점 돌연변이를 추가로 포함하는 방법.
  123. 제122항에 있어서, 상기 키메릭 게놈 또는 안티게놈, 및 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질이 2개 이상의 상이한 발현 벡터에 의해 발현되는 방법.
KR1020017013099A 1999-04-13 2000-03-31 클로닝된 뉴클레오티드 서열로부터의 약독화된 키메릭호흡기 신시티움 바이러스 백신의 제조 KR100746979B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/291,894 1999-04-13
US09/291,894 US6689367B1 (en) 1995-09-27 1999-04-13 Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
PCT/US2000/008802 WO2000061611A2 (en) 1999-04-13 2000-03-31 Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020013526A KR20020013526A (ko) 2002-02-20
KR100746979B1 true KR100746979B1 (ko) 2007-08-07

Family

ID=23122324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020017013099A KR100746979B1 (ko) 1999-04-13 2000-03-31 클로닝된 뉴클레오티드 서열로부터의 약독화된 키메릭호흡기 신시티움 바이러스 백신의 제조

Country Status (10)

Country Link
EP (2) EP1169457A2 (ko)
JP (1) JP2002541785A (ko)
KR (1) KR100746979B1 (ko)
CN (1) CN100491530C (ko)
AU (1) AU4065500A (ko)
BR (1) BR0011160A (ko)
CA (1) CA2369200A1 (ko)
IL (1) IL145796A0 (ko)
MX (1) MXPA01010320A (ko)
WO (1) WO2000061611A2 (ko)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0859831B1 (en) * 1995-09-27 2010-03-03 THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
US7485440B2 (en) 1995-09-27 2009-02-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of M2 ORF2
US6699476B1 (en) 1996-07-15 2004-03-02 Peter L. Collins Production of recombinant respiratory syncytial viruses expressing immune modulatory molecules
CN101012454B (zh) 1996-07-15 2011-11-16 美国政府健康及人类服务部 从克隆的核苷酸序列制备减毒呼吸道合胞病毒疫苗的方法
US7201907B1 (en) 1997-05-23 2007-04-10 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus(PIV) vaccines
US7951383B2 (en) 1997-05-23 2011-05-31 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Attenuated parainfluenza virus (PIV) vaccines
US20030082209A1 (en) 2000-07-05 2003-05-01 Skiadopoulos Mario H. Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines
US7632508B2 (en) 1997-05-23 2009-12-15 The United States Of America Attenuated human-bovine chimeric parainfluenza virus (PIV) vaccines
AU2006200619B2 (en) * 1997-09-26 2007-12-13 Medimmune, Llc Recombinant RSV virus expression systems and vaccines
CA2378552A1 (en) 1999-07-09 2001-01-18 The Government Of The United States Of America Production of attenuated, human-bovine chimeric respiratory syncytial virus vaccines
AU5918100A (en) * 1999-07-09 2001-01-30 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of M2 ORF2
AU2003270824B2 (en) 2002-09-18 2009-02-19 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Recovery of recombinant human parainfluenza virus type 2 (HPIV2) from cDNA and use of recombinant HPIV2 in immunogenic compositions and as vectors to elicit immune responses against PIV and other human pathogens
US7704491B2 (en) 2003-02-28 2010-04-27 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant human metapneumovirus and its use
BRPI0411247A (pt) 2003-06-09 2006-07-25 Wyeth Corp processo melhorado para a recuperação de vìrus de rna de filamento negativo não segmentado partindo do cdna
US8597637B1 (en) * 2010-05-18 2013-12-03 Weidong Zhang Breast cancer therapy using an engineered respiratory syncytial virus
ES2952387T3 (es) 2013-02-08 2023-10-31 Us Health Atenuación del virus respiratorio sincitial humano mediante la desoptimización de pares de codones a escala genómica
EP3515930A1 (en) 2016-09-23 2019-07-31 The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Vaccine candidates for human respiratory syncytial virus (rsv) having attenuated phenotypes
CN107384958B (zh) * 2017-07-14 2020-04-10 北京交通大学 基于反向遗传学构建的rsv反基因组质粒及其应用
CN113462656B (zh) * 2021-03-24 2022-09-30 兰州生物制品研究所有限责任公司 一种人三型副流感病毒冷适应温度敏感株及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998002530A1 (en) * 1996-07-15 1998-01-22 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
WO1999015631A1 (en) * 1997-09-26 1999-04-01 Aviron, Inc. Recombinant rsv virus expression systems and vaccines

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US708395A (en) 1901-04-15 1902-09-02 Oscar Peterson Device for digging ditches.
US2177396A (en) 1936-04-18 1939-10-24 Borden Co Milk bottle
US4614197A (en) 1984-10-15 1986-09-30 Deere & Company Chaff spreading arrangement for a combine
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4763497A (en) 1986-09-03 1988-08-16 Clover Co., Ltd. Lock device for double sliding doors
US4800078A (en) 1987-05-28 1989-01-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Immunotherapeutic method of treating respiratory disease by intranasal administration of Igb
IL105456A (en) 1992-04-21 1996-12-05 American Home Prod Vaccines of attenuated respiratory syncytial virus
ATE181112T1 (de) 1995-08-09 1999-06-15 Schweiz Serum & Impfinst Dem genom von minussträngigen rna-viren entsprechende cdna und verfahren zur herstellung von infektiösen minussträngigen rna-viren
CA2230033C (en) 1995-09-27 2010-01-26 Peter L. Collins Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
US6077514A (en) * 1996-04-04 2000-06-20 The Regents Of The University Of Michigan Attenuated respiratory syncytial virus
CA2291216A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services National Institutes Of Health Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences
US7208161B1 (en) 1997-05-23 2007-04-24 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Production of attenuated parainfluenza virus vaccines from cloned nucleotide sequences
KR100744361B1 (ko) * 1999-04-23 2007-07-30 스미스클라인비이참피이엘시이 티아졸리딘디온 유도체 및 항당뇨병제로서 그의 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998002530A1 (en) * 1996-07-15 1998-01-22 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
WO1999015631A1 (en) * 1997-09-26 1999-04-01 Aviron, Inc. Recombinant rsv virus expression systems and vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA01010320A (es) 2003-09-15
AU4065500A (en) 2000-11-14
IL145796A0 (en) 2002-07-25
BR0011160A (pt) 2002-10-08
WO2000061611A9 (en) 2002-03-28
CA2369200A1 (en) 2000-10-19
WO2000061611A2 (en) 2000-10-19
WO2000061611A3 (en) 2001-01-04
CN1364195A (zh) 2002-08-14
KR20020013526A (ko) 2002-02-20
JP2002541785A (ja) 2002-12-10
EP1690940A1 (en) 2006-08-16
CN100491530C (zh) 2009-05-27
EP1169457A2 (en) 2002-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5993824A (en) Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
US6790449B2 (en) Methods for producing self-replicating infectious RSV particles comprising recombinant RSV genomes or antigenomes and the N, P, L, and M2 proteins
US6689367B1 (en) Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
KR100746979B1 (ko) 클로닝된 뉴클레오티드 서열로부터의 약독화된 키메릭호흡기 신시티움 바이러스 백신의 제조
US7846455B2 (en) Attenuated chimeric respiratory syncytial virus
US6830748B1 (en) Recombinant RSV virus expression systems and vaccines
WO2001004321A1 (en) Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines involving modification of m2 orf2
US20120308602A1 (en) Recombinant RSV Virus Expression Systems And Vaccines
JP2004515218A (ja) プロモータへ隣接する遺伝子から保護抗原を発現する呼吸器系合胞体ウイルスワクチン
AU2004205289B2 (en) Production of attenuated respiratory sincytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
AU5591601A (en) Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
AU5592201A (en) Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
AU2005201040A1 (en) Production of attenuated chimeric respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
AU2008203034A1 (en) Production of attenuated respiratory syncytial virus vaccines from cloned nucleotide sequences
EP0859831A1 (en) Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
G170 Re-publication after modification of scope of protection [patent]
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20100728

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee