CN100491530C - 从克隆的核苷酸序列制备减毒嵌合呼吸道合胞病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

通过将一或多个来自一个RSV亚型或毒株的异源基因或基因片段导入到不同亚型或毒株的受体RSV背景中来生产呼吸道合胞病毒(RSV)及其疫苗组合物。产生的嵌合RSV病毒或亚病毒颗粒是感染性的且是减毒的，优选通过导入所选的决定减毒表型的突变到嵌合基因组和反基因组中来产生例如温度敏感性(ts)和/或冷适应性(ca)疫苗毒株。可选择的，嵌合RSV和其疫苗组合物引入了其他的决定目的结构和/或表型特征的突变在感染性的嵌合RSV中。通过在嵌合RSV克隆中插入、缺失、替换或重排一或多个所选的核苷酸序列、基因或基因片段，该嵌合RSV引入了目的突变。本发明提供了开发抗不同的RSV毒株新疫苗的方法，通过使用一个常规的减毒骨架作为载体来表达异源毒株的保护性抗原。个体的免疫系统被刺激来诱导抗自然RSV感染的保护，优选以多价方式来获得抗多种RSV毒株和/或亚基的保护。

Description

从克隆的核苷酸序列制备减毒嵌合呼吸道合胞病毒疫苗
相关申请
本申请要求了1997年7月15日递交的US08/892403专利申请的优先权并且是其部分继续申请；所述美国专利是在先申请1997年5月23日递交的US60/047634，1997年5月9日申请的US60/046141，1996年7月15日递交的US60/021773的继续申请，上述每一申请均引入本文作为参考。
发明背景
人呼吸道合胞病毒(RSV)作为导致不足一岁婴儿的肺炎和细支气管炎的病因比其它所有的微生物病原体都厉害。实际上，所有儿童在两岁龄内均会被感染，且在较大一点的小孩和青年人身上发生再感染的频率也较高(Chanock等，人的病毒感染(Viral Infections of Humans)，第三版，A.S.Evans编辑，Plenum出版社，N.Y.(1989))。RSV导致了因患呼吸道疾病被住院治疗的儿童中的五分之一以上，且仅在美国每年就导致大约91,000人住院治疗和4,500人死亡。尽管大多数健康的成年人没有严重RSV感染的疾病，但稍老年的病人以及无免疫应答的个体通常会遭受来自该病原体的严重且可能危及生命的感染。
尽管人们已进行了几十年的研究来开发有效的抗RSV的疫苗制剂，但仍然没有获得安全和有效的疫苗来降低严重RSV感染的发病率和死亡率。开发成功疫苗失败的一部分原因是因为实际上较小的婴儿对RSV抗原的血清抗体和分泌性抗体的应答较弱。因此，这些个体会遭受更严重RSV感染，积累的免疫力显示出对年龄较大的儿童和成年人的抗严重病毒感染的保护。一种抗病毒化合物，三氮唑核苷，已表现出具有治疗严重感染婴儿的治疗的潜力，但是没有迹象表明其能缩短婴儿住院时间或减少对婴儿支持性治疗的需求。
RSV感染的免疫机制最近已成为热点，分泌抗体在上呼吸道的保护上显得最为重要，而高水平的血清抗体被认为在下呼吸道抗RSV感染中起重要作用。纯化的含有高滴度RSV中和抗体的人免疫球蛋白对于一些用于婴儿以及年幼儿童的严重下呼吸道疾病的免疫治疗是有用的，免疫球蛋白制剂有一些缺点，例如可能会传递血液传染的病毒以及制备和储藏困难且代价昂贵。
RSV特异的细胞毒性T细胞，另一个诱导出的免疫的效应器，对于消除RSV感染也是重要的。然而尽管后一效应器可通过前一免疫来增加对病毒攻击的抗性，作用是短暂的。F和G表面糖蛋白是两种主要的抗RSV的保护抗原，并且是仅有的两种表现出诱导RSV中和抗体和对攻击的长期抗性的RSV蛋白(Collins等，Fields Virology，Fields等编辑，2：1313-1352，Lippincott-Raven，Philadelphia(1996)；Connors等，J.Virol.65(3)：1634-7(1991))。第三种RSV表面蛋白，SH，不诱导RSV-中和抗体或对RSV攻击的明显抗性。
活RSV疫苗开发的一个难点在于在减毒和免疫原性之间很难获得一种合适的平衡。减毒疫苗的遗传稳定性也是一个障碍。疫苗开发也受到RSV在细胞培养物中较差的生长以及病毒颗粒的不稳定性的影响。RSV感染的另一个特征是诱导产生的免疫力不充分用以抵抗后来的感染。大量的因素可能决定了这种情况，包括免疫系统对限制呼吸道的腔表面的病毒感染的相对无效，局部粘膜免疫力的短效特性，病毒复制的快速和广泛性，免疫学上尚未成熟的年轻人的降低的免疫应答，经胎盘得到的母亲血清抗体的免疫抑制，以及病毒的特定特征例如G蛋白高度糖化。另外，如下所述，RSV存在两个抗原亚型，且抗一个亚型的免疫力比其抗另一个亚型的免疫力相对较弱。
尽管RSV在一生中可重复感染多次，但重复感染通常因上次感染所诱导的保护性免疫力而减少，因此免疫预防是可行的。一种活减毒RSV疫苗将被通过鼻内给药来启动适度的免疫性感染。其与非肠道途径相比具有简便和安全的优点。其也提供了局部呼吸道免疫的直接刺激，其在抗RSV中起主要的作用。其也消除了来自RSV特异性的母亲血清抗体的免疫抑制影响。另外，当非肠道RSV抗原给药时，有时与免疫病并发症相关联(Murphy等，疫苗(Vaccine)8(5)：497-502(1990))，但在活病毒情况下从未观察到。
在二十世纪60年代中叶，甲醛灭活的病毒疫苗作为抗RSV的疫苗被测试，但在抗RSV感染或疾病的保护上没有获得成功，且事实上随后的病毒感染呈现恶化的症状。(Kim等，Am.J.Epidemiol.89：422-434(1969)，Chin等，Am.J.Epidemiol.89：449-463(1969)；Kapikian等，Am.J.Epidemiol.89：405-421(1969))。
最近，RSV疫苗的开发已聚焦于减毒RSV突变株上。Friedewald等，J.Amer.Med.Assoc.204：690-694(1968)报道了RSV的一种冷传代突变株(cpRSV)，其被充分减毒成为候选疫苗。此突变株与野生型(wt)亲代病毒相比，显示出轻微增加的在26℃生长的能力，但其复制既没有温度敏感性也没有明显的冷适应性。然而，却将冷传代突变株减毒用于成年人。尽管对于已被RSV感染的婴幼儿(例如，血清反应阳性的个体)，cpRSV已令人满意地被减毒并且具有免疫原性，但cpRSV仍保留对于血清反应阴性婴儿上呼吸道的低水平毒性。
类似的，Gharpure等人，J.Virol.3：414-421(1969)报道了作为有价值的候选疫苗的温度敏感性RSV(tsRSV)突变株。一种突变株ts-1，被广泛地用于实验室和自愿受试者中。突变体在成年自愿者中产生无症状感染且在致免疫45天后对野生型病毒攻击产生抗性。对比血清反应呈阳性的婴儿和遭受无症状感染的儿童，血清反应呈阴性的婴儿呈现鼻炎征兆和其它轻微的症状。此外，ts表型的稳定性被检测到，尽管表现出部分或全部温度敏感性缺失的病毒占可从疫苗重新获得的病毒的较小比例，且不与除轻微鼻炎疾病以外的疾病征兆相关联。
这些和其它的研究显示特定的冷传代和温度敏感性RSV株被不充分减毒且在疫苗接种者导致轻微的疾病特征，尤其血清反应阴性的婴儿，而其它的被超减毒且不能充分的复制来引起保护性的免疫应答，(Wright等，Infect.Immun.，37：397-400(1982))。此外，候选疫苗突变株的遗传不稳定性导致其温度敏感性表型的缺失，进一步阻碍了有效的RSV疫苗的开发。通常参见，Hodes等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.145：1158-1164(1974)，McIntosh等，Pediatr.Res.8：689-696(1974)，以及Belshe等，J.Med.Virol.3：101-110(1978)。
抛弃了通过不确定的生物学方法例如冷传代构建合适减毒RSV株的方法，研究者通过纯化的RSV包膜糖蛋白来测试亚型疫苗候选毒株。糖蛋白在棉鼠的肺中诱导对RSV感染的抗性，Walsh等，J.Infect. Dis.155：1198-1204(1987)，但是抗体具有非常弱的中和活性，且用纯化的亚型疫苗免疫啮齿动物会导致疾病的加强，这使人联想到先前已处理过的RSV疫苗(Murphy等，Vaccine 8：497-502(1990))。
表达F或G包膜糖蛋白的基于疫苗病毒重组体的疫苗已被进行研究。这些重组体表达不能被从真正病毒对应物中区别开的RSV糖蛋白，用疫苗-RSV F和G重组体经皮感染的啮齿动物表现出高水平的中和病毒感染力的特异性抗体。事实上，棉鼠用疫苗F重组体感染可刺激出对RSV在下呼吸道复制的几乎完全的抗性以及在上呼吸道中的明显的抗性。Olmsted等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：7462-7466(1986)。然而，用疫苗F和G重组体免疫黑猩猩，在上呼吸道中几乎没有提供抗RSV攻击的保护(Collins等，Vaccine 8：164-168(1990))，其在下呼吸道中提供的保护前后不一(Crowe等，Vaccine 11：1395-1404(1993))。
针对RSV和其它负链RNA病毒的生物减毒疫苗株、亚型疫苗以及其它疫苗开发策略的不成功使得迫切需要一种新的方法来开发新的疫苗，特别是人工重组候选疫苗的方法来加入遗传变化，以生产具有新表型特性的活减毒RSV重组体。然而，对RSV和其它反义RNA病毒的基因组RNA的操纵处理至今仍是很难的。此方面的主要障碍包括这些病毒的裸露的基因组RNA的非感染性、病毒在组织培养物中的不良生长、冗长的复制循环、病毒体的不稳定性、染色体组复杂以及基因产物结构的难以控制。
重组DNA技术使得从cDNA重新获得有感染力的负链RNA病毒、遗传操作病毒克隆来构建新的候选疫苗、以及快速估计其减毒和表型稳定性的水平成为可能(综述参见Conzelmann，J.Gen.Virol.77：381-89(1996)；Palese等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：11354-58，(1996))。在此文中，已报道了在必需病毒蛋白的存在下由cDNA编码的反基因组RNA来重组拯救传染性的呼吸道合胞病毒(RSV)、人类副流感病毒3(HPIV3)、狂犬病病毒(RaV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MeV)、仙台病毒(Sev)、牛瘟病毒、S型猿猴病毒和牛RSV(参见，例如，Garcin等，EMBO J.14：6087-6094(1995)；Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：4477-81(1995)；Radecke等，EMBO J.14：5773-5784(1995)；Schnell等，EMBO J.13：4195-203(1994)；Whelan等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：8388-92(1995)；Hoffman等，J.Virol.71：4272-4277(1997)；Kato等，Genes to Cells 1：569-579(1996)，Roberts等，Virology 247(1)，1-6(1998)；Baron等，J.Virol. 71：1265-1271(1997)；国际申请WO97/06270；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 92：11563-11567(1995)；Durbin等，Virology 235：323-332(1997)；专利申请U.S.No.08/892,403，申请于1997年7月5日，(相应于国际申请WO 98/02530，优先权为美国临时申请60/047,634(申请于1997年5月23日)、60/046,141(申请于1997年5月9日)和60/021,773(申请于1996年7月15日))；Juhasz等，J.Virol.71(8)：5814-5819(1997)；He等Virology237：249-260(1997)；Whitehead等，Virology 247(2)：232-9(1998a)；Whitehead等，J.Virol.72(5)：4467-4471(1998b)；Jin等，Virology251：206-214(1998)；Bucholz等，J.Virol.73：251-259(1999)；以及Whitehead等，J.Virol.73：(4)3438-3442(1999)，所述文献均引入本文作参考)。
RSV疫苗开发的其它困难是很难获得能有效抵抗广泛的现有及新兴RSV株和亚型的候选疫苗。特别是，与多价疫苗提供抗RSV A和RSV B亚型的保护一样，提供一种RSV亚型B-特异性疫苗病毒也是有用的。在此文中，最近的研究已聚焦于在病毒株之间传送抗原决定簇的嵌合病毒的开发。例如，人副流感病毒3型(PIV3)的HN和F糖蛋已被人副流感病毒1型(PIV1)的HN和F糖蛋白替换，产生的嵌合病毒在细胞培养物和实验动物中生长，其具有与野生型亲本相似效力(Tao等，J.Virol.72(4)：2955-61(1998)，引入本文作为参考)。也有报道一种嵌合麻疹病毒其H和F糖蛋白被水泡性口膜炎病毒G糖蛋白替换，其插入的同时伴随或不伴随麻疹病毒F的相应部分对G糖蛋白细胞质和跨膜区的替换(Spielhofer等，J.Virol.72(3)：2150-9(1998))。这样产生一种据报道在生长上减少50％的嵌合病毒。在第三个例子中，Jin等，Virology 251(1)：206-14(1998)报道一种亚型A病毒其表达作为附加基因的亚型B RSV的G蛋白(Jin等，Virology 251(1)：206-14(1998))。然而，由于F蛋白也表现明显的亚型特异性，优选在亚型B特异性疫苗中表达两种亚型B糖蛋白。此外，嵌合A-B病毒的生产将不产生没有经进一步修饰获得适当减毒和毒性的有活力的候选疫苗。
因此，本领域迫切需要制备安全和有效疫苗的工具和方法来缓解RSV带来的严重的健康问题，尤其是有效地抵抗RSV的多种已存在的和新兴毒株和亚型的那些。十分令人惊讶的是，本发明满足了这些以及其它相关的需求。
发明的概述
本发明提供了嵌合的重组呼吸道合胞病毒(RSV)，其具有感染性并在人类或其它哺乳动物中引起预防的或治疗的免疫应答。在相关方面，本发明提供了用于设计和产生适用于疫苗的减毒、嵌合RSV的新的方法和组分。本发明的这些方面包括新的经分离的多核苷酸分子和载体，其引入了含有包含结合不同RSV株或亚型病毒的一个或多个异源基因或基因片段的一个RSV株或亚型病毒的部分或全部RSV基因组或反基因组的嵌合RSV基因组或反基因组的分子。本发明也提供了引入嵌合、重组RSV的方法和组合物用于RSV感染的预防和治疗。
本发明的嵌合RSV被重组改造以引入来自不止一个RSV株或亚型的核苷酸序列来产生感染性嵌合病毒或亚病毒颗粒。在此方法中，候选疫苗病毒被重组改造来启动易受RSV感染的哺乳动物包括人类和非人类灵长目动物的抗RSV的免疫应答。本发明的嵌合RSV可以启动对特定RSV亚型或毒株的免疫应答，或抗多个RSV亚型或毒株的多重特异性应答。
本发明的示范嵌合RSV引入了一个嵌合RSV基因组或反基因组，以及主要的核壳(N)蛋白、核壳磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)以及RNA聚合酶延伸因子。其它RSV蛋白可能被包含在不同的组合物中来提供广泛的有感染性亚病毒颗粒以及完全病毒颗粒。
本发明的嵌合RSV含有来自结合了不同RSV株或亚型病毒的一个或更多异源基因或基因片段来形成嵌合RSV基因组或反基因组的一个RSV株或亚型病毒的部分或完整RSV基因组或反基因组。本发明一个较优选的方面，嵌合RSV引入了结合不同人RSV亚型或株的一个或更多异源基因或基因片段的一个RSV亚型或株的部分或完整RSV基因组或反基因组。例如，一种嵌合RSV可引入一种含有结合一个或更多来自人RSV B亚型病毒的异源基因或基因片段的部分或完整人RSV A亚型基因组或反基因组的嵌合基因组或反基因组。
来自一个RSV株或亚型的异源基因或基因片段是指“供体”基因或多核苷酸，其与“受体”基因组或反基因组结合或在其中进行替换。受体基因组或反基因组典型的充当“骨架”或载体来引入异源基因或基因片段以产生表现出新表型特征的嵌合RSV。例如，与未修饰的受体和/或供体相比，异源基因或基因片段在所选择受体RSV株中的插入或替换可导致减毒、生长变化、改变的免疫活性或其它的人们期望的表型变化。本发明的可被筛选用作异源基因插入或增加的基因和基因片段包括编码NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白或其部分的基因或基因片段。
在本发明的一个优选的实施方案中，嵌合RSV引入了一个或多个编码RSV F、G或SH糖蛋白的异源基因。可选择的，嵌合RSV可引入一个编码RSV F、G或SH糖蛋白的细胞质域、跨膜域、胞外结构域或免疫原性抗原决定簇的基因片段。这些免疫原性蛋白、结构域或抗原决定簇在嵌合RSV中是非常有用的，因为其可以在被免疫的宿主中产生新的免疫应答。
例如，来自供体RSV亚型的一个或多个免疫原性基因或基因片段在不同RSV亚型或毒株的受体基因组或反基因组中的增加或替换可产生免疫应答直接抗供体亚型或毒株或同时抗供体和受体亚型或毒株。在一个实施方案中，一个或多个人RSV亚型B糖蛋白基因F、G和SH或其细胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域或其免疫原性抗原决定簇，被加入到RSV A基因组或反基因组或在其中进行替换。
本发明的另一个方面，产生了减毒的、嵌合RSV，其嵌合基因组或反基因组通过导入一或多个决定减毒表型的减毒点突变被进一步的修饰。这些点突变可被从头产生并通过合理设计的诱变方法来测定减毒效果。可选择的，减毒点突变在生物学上获得的突变RSV中得以鉴别并被引入到本发明的嵌合RSV中。
优选的，本发明的嵌合RSV被减毒，通过引入至少一个、更优选的两个或多个在生物学上获得的一组已知突变体RSV株中鉴别的减毒点突变。在此描述的优选的突变体RSV株为冷传代(cp)和/或温度敏感性(ta)突变体，例如突变体“cpts RSV 248(ATCC VR 2450)，cptsRSV 248/404(ATCC VR 2454)，cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)，cptsRSV 530(ATCC VR 2452)，cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)，cptsRSV 530/1030(ATCC VR 2455)，RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)和RSV B-1 cp-23(ATCC VR 2579)”(每个均依据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 Boulevard大学，Manassas，弗吉尼亚20110-2209，美国，且得到的保藏号如上)。此示范生物学上获得的突变体，提供了减毒突变的大“目录”，其每一个可被结合任意其它的突变来校准用于疫苗的重组嵌合RSV的减毒水平。其它突变可获自具有如在小噬斑(sp)、冷适应(ca)或宿主-范围受限制的(hr)突变型毒株中被鉴定的非-ts和非-cp减毒突变的RSV。
本发明的另一个方面，带有或不带有减毒点突变的嵌合RSV，通过非位点核苷酸修饰发生突变以产生理想的表型、结构或功能的变化。典型的，所选的核苷酸修饰特指表型的改变，例如，生长特性的改变、减毒、温度敏感性、冷适应性、噬斑大小、宿主范围限制或免疫原性。结构或功能的改变包括导入或消除限制性位点到编码cDNA的RSV中以方便操作和鉴定。
在一个优选的实施方案中，嵌合RSV中的SH、NS1、NS2或G基因被修饰，例如，通过基因缺失或表达清除。可选择的，核苷酸修饰可包括用于所选RSV基因的顺式作用的调控序列的缺失、插入、增加或重排。
在一个实例中，一个RSV基因的顺式作用的调控序列被改变来对应异源的调控基因，其可为与不同RSV中相同基因或不同RSV基因的顺式作用的调控序列对应的顺式作用调控序列。例如，基因末端信号可通过不同基因在相同RSV株中的基因末端信号的倒置或替换被修饰。
在一个独立的实施方案中，核苷酸修饰可包含嵌合基因组或反基因中翻译起始位点的插入、缺失、替换或重排，从而例如消除另一个用于所选蛋白形式的翻译起始位点。在一个实例中，RSV G蛋白的分泌形式的翻译起始位点被消除来修饰这种G蛋白形式的表达且在体内产生期望的作用。
本发明的嵌合RSV基因组或反基因组的其它修饰包括导入非RSV分子例如细胞因子、T-辅助抗原决定簇、限制性位点标记或能够在哺乳动物宿主中启动抗病原体保护性免疫应答的微生物病原体的蛋白到嵌合基因组或反基因组中的修饰。在一个实施方案中，嵌合RSV被构建，引入来自副流感病毒(PIV)的基因或基因片段，例如PIV HN或F糖蛋白或免疫原性结构域或其抗原决定簇。
设计和筛选用于疫苗的嵌合RSV通常至少具有两个且有时三个或多个减毒突变来获得广泛用于临床用途的令人满意的减毒水平。在一个实施方案中，至少一个减毒突变产生在RSV聚合酶基因中(在供体或受体基因中)，它包括核苷酸的替换，该核苷酸替换导致聚合酶中的氨基酸发生变化，其决定减毒表型并可涉及或不涉及温度敏感性(ts)表型。在此文中，嵌合RSV在大聚合酶基因L中引入一或多个核苷酸替换，结果在氨基酸Phe521、Gln831、Met1169或Tyr1321处中产生氨基酸变化，变化的实例为：Leu替换Phe521，Leu替换Gln831，Val替换Met1169，以及Asn替换Tyr1321。其它在此位点的可选择的氨基酸变化可产生与所证实的突变替换类似的效果。在此文中，优选修饰嵌合基因组或反基因组来编码突变中的受试位点的改变，其通常保守性地对应于在突变病毒中鉴定的改变。例如，与相应的野生型序列相比，如果氨基酸替换标记一个突变病毒中的突变位点，则在重组病毒的相应残基处应设计类似的替换。优选的替换涉及一个相同或保守的氨基酸成为突变体病毒蛋白的替换残基。然而，涉及突变体蛋白的替换残基，也有可能在突变位点上非-保守性地改变天然的氨基酸残基(例如，通过使用任意其它的氨基酸来干扰或减少野生型残基的特性和功能)。在缺失或插入突变的情况下，这些可作为相应的缺失或插入序列被导入重组病毒中，然而缺失或插入的蛋白片段的具体大小和氨基酸序列可以变化。本发明的嵌合RSV可在任意其它除了L的RSV基因，例如在M2基因中引入ts突变。
优选的，两或多个核苷酸变化被引入到决定减毒突变的密码子中，例如，决定ts突变的密码子。因此减少了从减毒表型反转的可能性。
减毒突变可被选择在供体或受体RSV基因的编码部分或非编码区例如顺式调控序列中。示例的非编码突变包括基因起始序列的单个或多个碱基变化，例如M2基因起始序列中的核苷酸7605的单个或多个碱基替换(重组体序列中核苷酸7606)。
本发明的另一个方面，提供了组合物(例如，经分离的多核苷酸和引入编码RSV的cDNA的载体)和方法来用于产生经分离的感染性嵌合RSV。利用这些组合物和方法，感染性嵌合RSV产生于嵌合RSV基因组或反基因组、核壳(N)蛋白、核壳磷蛋白(P)、大(L)聚合酶蛋白和RNA聚合酶延伸因子。在本发明的相关的方面，组合物和方法被提供用于导入上述的结构和表型变化到重组嵌合RSV中来产生感染性减毒疫苗病毒。
在一个实施方案中，提供了一个含有经分离的编码嵌合RSV基因组或反基因组的多核苷酸分子的表达载体。也提供了相同的或不同的含有一或多个经分离的编码N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的多核苷酸分子的表达载体。载体优选在细胞中或无细胞溶胞产物中表达或共表达，因此产生感染性嵌合RSV颗粒或亚病毒颗粒。
RSV基因组或反基因组以及N、P、L和RNA聚合酶延伸因子(优选RSV的M2(ORF1)的产物)蛋白可通过相同或不同的表达载体被共表达。在一些例子中，N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白被通过不同的表达载体编码。编码嵌合RSV或反基因组的多核苷酸分子可以是不同的人RSV亚型或毒株的嵌合体，例如含有可操作地连接于亚型B RSV的序列的亚型A RSV的序列的多核苷酸。可选择的，嵌合基因组或反基因组可以是人和非人(例如，牛或鼠科动物)RSV序列的嵌合体。在本发明的另一个可选择的方面，嵌合的基因组或反基因组可以是RSV和非-RSV序列的嵌合体，例如含有可操作地连接于PIV序列的人RSV序列的多核苷酸。嵌合基因组和反基因组，可通过一或多个核苷酸的插入、重排、缺失或替换，包括点突变、位点特异性核苷酸变化，以及涉及整个基因或基因片段导入异源供体基因或基因片段或受体基因组或反基因组的变化，而被进一步修饰。这些改变一般针对在产生的重组RSV中的一或多个表型的变化，例如导致减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑大小、宿主范围限制性、基因表达的改变或免疫原性抗原决定簇的改变等表型的变化。
上述的用于生产嵌合RSV的方法和组合物产生感染性病毒或亚病毒颗粒或其衍生物。一种感染性病毒与真正的RSV病毒相似并具有相似的感染性。其可直接感染新鲜的细胞。一种感染性亚病毒颗粒一般是一种在合适的条件下可启动感染的病毒颗粒的亚型分。例如，含有基因组或反基因组RNA和N、P、L和M2(ORF1)蛋白的核壳为一种亚病毒颗粒，其如果被导入到细胞的细胞质中能够启动感染。本发明提供的亚病毒颗粒尤其包括，缺少一或多种蛋白、蛋白片段或其它对于感染力不必要的病毒组分的病毒颗粒。
本发明的感染性嵌合RSV可引入来自任意RSV或类RSV病毒，例如，人、牛、鼠(鼠的肺炎病毒)或禽类RSV(火鸡鼻气管炎病毒)，或来自其它的有包膜病毒例如副流感病毒(PIV)的异源的、编码或非编码的核苷酸序列。在一些实例中，重组的RSV含有一人RSV基因组或反基因组序列与一或多个异源RSV序列连接形成的嵌合体。示例的异源序列包括与不同人RSV毒株的序列结合的来自一个人RSV毒株的RSV序列。例如本发明的嵌合RSV可引入来自两或多个野生型或突变RSV毒株的序列，例如选自cpts RSV 248、cpts 248/404、cpts248/955、cpts RSV 530、cpts 530/1009或cpts 530/1030的突变体毒株。可选择的，嵌合RSV可引入来自两个或多个野生型或突变体RSV亚型的序列，例如，RSV亚型A和亚型B序列的结合体。在另一个方面，一或多个人RSV的编码或非编码多核苷酸被用来自牛或鼠的对应序列替换，单独替换或结合一或多个所选择的减毒点突变，例如，cp和/或ts突变，来产生新的减毒疫苗毒株。在另一个实施方案中，嵌合的牛-人RSV包括用对应牛NP基因或基因片段替换人RSV NP基因或基因片段，其嵌合体可选择性地被构建来引入SH基因缺失，一或多个cp或ts点突变，或这些突变以及其它在此公开的突变的不同组合。
在本发明的一个实施方案中，提供了经分离的多核苷酸，表达载体，以及用于生产嵌合RSV的方法，其中的基因组或反基因组与供体或受体序列相比发生了重组改变。特别的，突变基于其改变嵌合RSV克隆的结构和/或功能的能力被引入到嵌合RSV基因组或反基因组中，例如，通过改变所选蛋白的结构、表达和/或功能或顺式作用的RNA序列来产生所期望的表型变化。期望的表型变化包括，例如，培养基中病毒生长、温度敏感性、噬斑大小、减毒的变化以及免疫原性的变化。
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有一个具有至少一个来自生物学上获得的突变RSV的减毒点突变的嵌合RSV基因组或反基因组的经分离的多核苷酸和表达载体。在此实施方案中，至少一个点突变存在于涉及决定ts表型的核苷酸替换的聚合酶基因L中。示例的RSV克隆和载体引入一个导致在聚合酶基因的Phe521、Gln831、Met1169或Tyr1321处发生氨基酸变化的核苷酸替换。优选的，两个或三个突变被引入到特指减毒突变的密码子中来增加遗传稳定性的水平。其它的实例RSV引入至少两个减毒ts突变。
本发明的被引入到嵌合cDNA、载体和病毒颗粒中的突变可被单独或联合导入到全长RSV cDNA中且含有导入突变的被拯救病毒的表型可被很容易地测定。在示例实施方案中，通过减毒的、生物学上获得的病毒对比野生型RSV例如通过cpRSV或tsRSV来显示的氨基酸变化，被引入到重组RSV中来产生理想的减毒水平。
本发明也提供了引入了以所选的组合方法导入到嵌合基因组或反基因组中产生减毒的感染性病毒或亚病毒颗粒的多重表型特异性突变的嵌合RSV克隆、载体和颗粒。该方法与常规表型鉴定结合，提供了具有所期望的例如减毒、温度敏感性、改变的免疫原性、冷适应性、小噬斑大小、宿主范围限制性等特性的嵌合RSV。如此确定的突变可以合并成一个“目录”并以各种组合导入来校准疫苗病毒到所选择的减毒、免疫原性和稳定性的水平。
在优选的实施方案中，本发明提供了包括用涉及相同或不同基因的其他类型的突变来补充一种或多种来自生物学上获得的RSV的突变例如，cp和ts突变。在此文中的突变的靶基因包括吸附(G)蛋白、融合(F)蛋白、小的疏水蛋白(SH)、RNA结合蛋白(N)、磷蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)、转录延伸因子(M2)、M2ORF2、基质(M)蛋白以及两种非结构蛋白NS1和NS2。这些蛋白的每一种可被全部或部分选择性的缺失、替换或重排，单独或与其它期望的修饰联合，来获得新的嵌合RSV重组体。
在一方面，使SH基因在供体或受体中缺失来产生具有新表型特性的嵌合RSV，包括增强体外生长和/或在体内的减毒。在相关方面，此基因缺失，或另一个所选非必要的基因或基因片段的缺失，例如NS1或NS2基因缺失，被联合在带有一个或多个独立的决定减毒表型的突变的嵌合RSV中，所述突变例如直接(或以经修饰的形式，例如通过导入多个核苷酸变化到特指突变的密码子中)来自生物学上获得的减毒RSV突变体的点突变。
例如，SH基因的缺失可与一或多个得自cpts248/404，cpts5530/1009，cpts 530/1030或另一个所选的突变RSV毒株的cp和/或ts突变联合，来产生具有增加的病毒产量、增强的减毒以及从减毒表型反转的遗传抗性的嵌合RSV，这取决于不同突变的联合效果。
此外，其它的遗传改变可单独或与生物学上获得的突变体RSV的一或多个减毒点突变联合在嵌合RSV基因组或反基因组中产生。例如，来自非RSV来源的基因或基因片段可被整个或部分插入。可选择的，基因排列可被改变，基因重叠去除，或RSV基因组启动子用其反基因组的相应物替换。可进行嵌合基因组或反基因组的不同的或其它的修饰来促进操作，例如单一限制性位点在不同基因间隔区域(例如，G和F基因间的单一的Stul位点)中或在别处的插入。可通过去除非翻译基因序列来增强插入外源序列的能力。
可选择的，编码嵌合RSV基因组或反基因组的多核苷酸分子或载体可通过修饰来编码非RSV序列，例如，能够在目的宿主中引起保护性免疫应答的细胞因子、T-辅助抗原决定簇、限制性位点标记或微生物病原体(例如，病毒，细菌或真菌)蛋白。
本发明的另一个实施方案提供了一种含有包括经分离的编码上述嵌合RSV基因组或反基因组的多核苷酸的表达载体以及包括一或多个经分离的编码RSV的N、P、L和RNA聚合酶延伸因子蛋白的表达载体(相同的或不同的)的细胞或无细胞溶解产物。一旦表达，基因组或反基因组和N、P、L和RNA聚合酶延伸因子结合产生感染性RSV病毒或亚病毒颗粒。
本发明的减毒嵌合RSV能够在被感染的人宿主中启动保护性的免疫应答，且充分的减毒使其在免疫宿主中不会引起严重的不能接受的呼吸道疾病的症状。减毒的嵌合病毒或亚病毒颗粒可存在于细胞培养物的上清液中，从培养物中分离，或部分或全部纯化。病毒也可被冻干，且可与如所期望的其它不同的组分混合用于储藏或运送到宿主中。
本发明进一步提供了一种含有生理学上可接受的载体和/或佐剂以及上述的经分离的减毒嵌合RSV的新疫苗。在一个实施方案中，疫苗含有包含至少一个、优选两个或多个减毒突变或其它的如上述核苷酸修饰的嵌合RSV。疫苗可被配制成103到106 PFU减毒病毒的剂量。疫苗可含有减毒嵌合病毒，其启动免疫应答抵抗单一RSV毒株或亚型例如A或B，或抗多个RSV毒株或亚型。在此方面，本发明的嵌合RSV可单独地启动单特异性免疫应答或多特异性的免疫应答抗多个RSV毒株或亚型。嵌合RSV可与其它具有不同免疫原性的用于更有效地保护抵抗一或多个RSV毒株或亚型的嵌合RSV或非嵌合RSV联合用于疫苗制剂中。
在相关的方面，本发明提供了一种用于刺激个体免疫系统在哺乳动物受验者中启动免疫应答抵抗一或多个RSV的毒株或亚型的方法。该方法包括给药一种在如上所述在生理学上可接受的载体和/或佐剂中的免疫充分量的减毒嵌合RSV制剂。在一个实施方案中，免疫组合物是一种含有至少一个、优选两个或多个减毒突变或其它如上述的核苷酸修饰的嵌合RSV的疫苗。疫苗可被配制成103到106 PFU减毒病毒的剂量。疫苗可含有启动免疫应答抵抗单一RSV毒株或亚型例如A或B或抗多个RSV毒株或亚型的减毒嵌合病毒。在此文中，嵌合RSV可启动单特异性的免疫应答或抗多个RSV毒株或亚型的多特异性的免疫应答。可选择的，具有不同的免疫原性的嵌合RSV可被联合在疫苗混合物中或依据协同治疗建议分别给药，引起更有效的保护抵抗单RSV毒株或抵抗多个RSV毒株或亚型。
附图的简要说明
附图1是表示一系列亚型A呼吸道合胞病毒在鼠的肺中以及在黑猩猩中复制之间的大体上全部相关的图。
附图2和3表示了编码RSV反基因组RNA的cDNA的构建，其中附图2显示了cDNA和所编码的反基因组RNA的结构(不成比例)。为了本发明附图以及下面所有的实施例的描述，所用的具体cDNA和病毒是亚型A RSV的毒株A2。反基因组的图表包括以下特征：T7启动子在5′-末端赋予非病毒G三联密码子，四个序列标记在位置1099(其使长度上增加了一个核苷酸(nt))，1139，5611，和7559处(从新限制位点的第一个碱基开始数起)，核酶和串联T7终止子，3′末端通过核酶裂解(裂解的位点用箭头表示)产生单一的非病毒3′-磷酰化U残基。注意，非病毒5′-GGG和3′-U残基并不包括在此处以及其后的反基因组中所给的长度值中。然而，在位置1099处的核苷酸插入被包括在内，因此cDNA衍生的反基因组的编号方式是此位置的下游反基因组比生物学上获得的反基因组大一个核苷酸。D46(基因组本身为负义)的5′到3′正义序列被描述在SEQ ID NO：1中，其中在位置4处的核苷酸可为C或G。另外也应注意在此图表中限制性位点的序列位置自始至终被作为描述的向导且不单独限定涉及的所有核苷酸。长度值被赋予限制性片段且自始至终是描述性的，因为长度赋值可基于一些因素例如消化后留下的粘性末端而变化。整体表示完整反基因组的克隆cDNA片段也被显示。方框表示了BamHI位点从质粒载体中的去除，一种促进装配的修饰：天然存在的BamHI-SalI片段(BamHI位点显示于正义链的上列，加下划线)被用PCR-产生的BglII-SalI片段替换(BglII显示于下列，加下划线；其4个核苷酸的粘性末端，用斜体字显示，与BamHI的相匹配)。结果产生一个单核苷酸变化(中列，加下划线)其在氨基酸水平是沉默的。附图3显示了包含在由cDNA编码的反基因组RNA中的序列标记，其中的序列为正义的且相对于前导区的第一个核苷酸被编号为1而进行编号；分别代表RSV亚型A和B的毒株A2和18537之间的相同之处，用圆点表示；代表cDNA中的限制性位点的序列用加下划线表示；基因起始(GS)和基因末端(GE)转录信号加方框；位置1141处的N翻译读码框的起始密码子用斜体字表示，限制性位点显示在每一序列的下面。在上方的序列中，单一的C残基被插入到位置1099处来产生NS2-N基因间隔区域的AflII位点，紧挨N翻译读码框上游的位置1139和1140处的AG被CC替换产生新的NcoI位点。在中间的序列中，位置5612和5616处的G和U被分别替换，在G-F基因间隔区域产生新的StuI位点。在下方序列中，位置7560处的C替换在F-M2基因间隔区域产生一个新的SphI位点。
附图4描述了涉及突变插入，完整反基因组构建体的装配，以及重组病毒回收的cDNA(大致成比例)的结构。四种类型的突变被插入到显示于下列的pUC118-或pUC119-cDNA亚克隆中，即在L基因中六个沉默限制性位点(在上面D53图表加下划线的部分)，两个在F基因中的HEK变化(H)，5个cp变化(cp)，以及对不同生物学诱变步骤特异的突变：248，404，530，1009，和1030(如所显示的)。诱变处理的亚克隆被插入到显示于中列的D50(表示从前导序列到带有紧挨前导序列上游的T7启动子的M2-L重叠的起始部分的RSV反基因组)或D39(表示从M2-L重叠到带有核酶的非转录尾区以及紧挨非转录尾区下游的T7终止子的RSV反基因组)中间质粒中。适当的D50和D39被装配到显示在上列的全长D53反基因组cDNA中(RTT表示其后是两个T7转录终止子的锤头核酶的位置)。
附图5提供了6个被用于回收重组RSV的突变体反基因组cDNA的图谱。重组子的ts表型被描述在附图的右边。
附图6显示了编码含有侧接于RSV转录信号的CAT ORF的RSV反基因组的D46/1024CAT cDNA的构建(不成比例，RSV特异性片段显示为实心框且CAT序列显示为空心框)。CAT基因转录盒的来源为RSV-CAT微基因组cDNA 6196(图表上方)。RSV-CAT微基因组含有前导区，GS和GE信号，非编码(NC)RSV基因序列，CAT ORF，以及在GS信号前和GE信号后的XmaI限制性内切酶位点。这些元件的核苷酸长度被显示，XmaI位点周围的序列(正义的)被显示在图表的上方。一个8个核苷酸的XmaI接头被插入到亲本质粒D46的StuI位点来构建质粒D46/1024。D46是完整的反基因组cDNA且等价于D53；命名的不同是为了表示这些代表不同的制备方法。质粒6196的Xma-XmaI片段被插入到质粒D46/1024中来构建质粒D46/1024CAT。D46 cDNA编码的RNA被显示在下方，包括T7启动子赋予的5′-末端非病毒G残基以及通过锤头核酶的裂解赋予的3′-末端磷酰化U残基；所给反基因组的核苷酸长度不包括这些非病毒核苷酸。L基因被错开描绘来显示基因重叠。
附图7是编码RSV反基因组(顶部)亲本野生型D46质粒的图表(不成比例)和D46/6368衍生物的图，其中的SH基因已被缺失(底部)。RSV被显示为空心矩形，GS和GE转录信号在上游和下游末端显示为实心方框。用于产生RNA转录本(右)的3′末端的T7噬菌体启动子(左)和锤头核酶和T7终止子被显示为小的空方框。D46的ScaI和PacI片段被用短的合成片段替换，产生D46/6368。D46中SH基因的侧翼序列，以及D46/6368的工程区域的序列，在各自的质粒图谱上用方框表示。D46中Scal-PacI片段的序列以及在D46/6368中替换其的序列，被显示为粗体并用向上的箭头区别开。M GE，SH GS，SH GE和G GS位点用上划线表示。D46/6368中的新M-G基因间隔区域在图表的底部被标记为65来显示其核苷酸长度。SH-负型(SH-minus)D46/6368构建体的正义T7转录本被图示于底部；T7启动子赋予的3个5′-末端非病毒G残基以及3′-末端磷酰化U残基被显示(Collins等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA. 92：11563-11567(1995)，引入本文作为参考)。这些非病毒核苷酸未被包括在长度值中。
附图8提供了来自用D46野生型或D46/6368SH-负型病毒感染来确定SH部位缺失的细胞的总细胞内RNA的RT-PCR分析的结果。RT采用与SH基因上游退火的正义引物来进行。PCR还采用与SH基因下游退火的负义引物。泳道：(1和5)由1Kb DNA序列梯组成的标记(Life Technologies，Gaithersburg，MD)；(2)经RT-PCR的D46/6368RNA；(3)经RT-PCR的D46 RNA；(4)单独PCR的D46/6368 RNA。PCR产物在2.5％琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色。一些标记DNA片段的核苷酸长度被显示于右边。
附图9显示了D46野生型或D46/6368 SH-负型病毒编码的RNA的Northern印迹杂交；总胞内RNA被从感染的细胞内分离并用于没有在先变性步骤的寡聚(dT)色谱层析的试验，所选的RNA也包括夹心杂交的染色体组RNA。RNA在甲醛-琼脂糖凝胶上电泳并印迹到硝化纤维膜上。复制的印迹分别与M，SH，G，F，M2，或L基因的用[32P]标记的DNA探针杂交，如下所显示，泳道：(1)D46/6368 RNA；(2)D46RNA；(3)未感染的HEp-2细胞RNA。基因组MA(gen.)，mRNA(大字母)以及通读转录本(小字母)被显示在左边。通读转录本P-M和M-G(M探针)的位置重合，同样转录本G-F和F-M2(F探针)的位置也重合。0.24-9.5kb RNA梯分子量标记的位置(Life Technologies)被显示在右侧，其中的标记平行移动并通过用[32P]标记的λ噬菌体DNA杂交来观察。
附图10显示了在用D46野生型或D46/6368 SH-负型病毒感染的HEp-2细胞中合成的[35S]标记的RSV蛋白的SDS-PAGE电泳的结果。蛋白用抗纯化病毒体的抗血清进行免疫沉淀反应并且通过在预制的梯度4％-20％Tris-甘氨酸凝胶(Novex，San Diego，CA)电泳来分析。病毒蛋白的位置显示在左侧；标记蛋白(Kaleidoscope PrestainedStandards，Bio-Rad，Richmond，CA)的位置和分子量(用千道尔顿表示)显示在右侧。
附图11-13提供了D46野生型或D46/6368 SH-负型病毒在HEp-2细胞(附图11)，293细胞(附图12)以及AGMK-21细胞(附图13)中的生长曲线。三份在25cm2培养瓶中的细胞单层被用2PFU/细胞的各病毒感染，并在37℃培养。在所显示的时间点取等分试样，-70℃保存，通过抗体染色在噬斑试验中进行平行滴定。每一显示的点为三种感染细胞单层的平均滴度。
附图14和15表示了在用D46野生型毒株，D46/6368 SH-负型病毒，或生物学上获得的cpts248/404病毒鼻内接种的鼠的上(附图14)和下呼吸道(附图15)中的病毒复制的动力学曲线。24个一组的小鼠用106PFU的所述病毒进行鼻内接种。每组中的6个小鼠在所指定的天被处死并切下鼻甲和肺组织进行匀浆，感染病毒的水平通过个体样本的噬斑试验来测定并确定平均对数的滴度。
附图16显示了SH-负型病毒的基因次序和转录产物与其野生型对应物的比较。上组概述了由SH-负型病毒产生的与野生型亲本重组病毒产生的特定mRNA量的比较。胞内mRNA被从用SH-负型病毒或野生型病毒感染的细胞中分离并通过基因特异性探针Northern印迹杂交来分析。测定杂交放射性的量，且显示SH-负型病毒病毒产生的各种mRNA对野生型亲代的相对丰度。下组显示了野生型病毒从M基因(基因次序的位置5)到L基因(位置10)的基因次序。这与SH-负型病毒的相比较，其G，F，M2和L基因的基因次序中的位置通过SH基因的缺失被改变了。
附图17描述了D46反基因组质粒，其通过SH基因的缺失被修饰且在此情况下不插入任何异源基因到重组病毒中。SH基因的侧翼序列被描述在上部。MGE，M-SR基因间的(IG)，SH GS，SH GE以及SR-G IG序列被显示。通过缺失被去除的部分被加下划线，被缺失的点用向上的三角形表示。此缺失产生的反基因组是D46/6340。
附图18描述了导入串联的翻译终止密码子到编码NS2蛋白的翻译读码框(ORF)中。质粒D13包含反基因组cDNA的左手末端，其包括T7启动子(带阴影的框)，前导区，以及NS1，NS2，N，P，M和SH基因。仅D13的cDNA插入序列被显示。含有T7启动子和NS1和NS2基因的AatII-AflII片段被亚克隆到pGem载体中，并且定点突变来修饰序列所示区域中的NS2 ORF。密码子18到26的野生型序列被显示(编码的氨基酸被显示在下面)，且上面三个核苷酸是三个被用来导入两个终止子密码(ter)和XhoI位点(加下划线)作为标记的替代物。产生的cDNA和后来回复的病毒被称为NS2-剔除(KO)。
附图19比较了在HEp-2细胞中通过野生型RSV(D53)以及NS2-剔除RSV的感染病毒的产量。三份单层试样用每种病毒以3pfu/细胞的复数感染，且以所示的间隔取样品通过噬斑试验和免疫染色来定量测定。
附图20描述了NS1和NS2基因的基因末端(GE)信号的改变。显示了质粒D13从T7启动子(阴影)到位置4623的PacI位点的反基因组cDNA左手末端的cDNA插入。含有T7启动子和NS1和NS2基因的AatI-AflII片段被亚克隆到pGem载体中。通过在两个位点同时定点诱变来修饰，即NS1和NS2的GE信号被修饰与天然N基因中的信号相同。野生型NS1和NS2 GE信号的序列被显示(且通过相对于完整反基因组的序列位置来鉴定)，核苷酸替换被显示在线的上面。NS2GE信号的野生型序列中的破折号表示通过突变使GE信号的长度增加了一个核苷酸。
附图21描述了编码NS1蛋白的多核苷酸序列的缺失，D13 cDNA的左手边部分被显示在底部：D13含有反基因组cDNA的左手边部分，从前导序列到SH基因的末端，在紧靠前导区上游有T7启动子。缺失点(向上的箭头)的两侧的序列被显示在上部。缺失跨度从紧挨NS1 ORF的翻译起始位点前到紧挨NS2 ORF的翻译起始位点前。因此，其具有使NS1 GS和上游非编码区与NS2 ORF融合的作用。此排除了任何可能延伸到取决于其前导区邻近位置的NS1基因中的顺式作用序列元件的干扰。
附图22描述了编码NS2 mRNA的多核苷酸序列的缺失。如上所述，显示了D13 cDNA的左手边部分并显示了缺失点(向上的箭头)的两侧的序列。缺失的跨度从紧挨NS1基因的下游到紧挨NS2基因的下游。因此，编码NS2 mRNA的序列被全部缺失，但没有其它的序列被破坏。产生的cDNA和其后回收的重组病毒被称为ΔNS2。
附图23描述了G蛋白分泌形式的翻译起始位点的消除。298个氨基酸的G蛋白被显示为一个空心矩形，其中含有信号-锚序列。位置45到53的氨基酸序列被显示在上方来图解核苷酸替换，其改变氨基酸48从甲硫氨酸为异亮氨酸以及改变氨基酸49从异亮氨酸为缬氨酸。前一突变消除分泌形式翻译起始位点。两个突变也产生了MfeI位点，其提供了一种方便的用于检测突变的方法。产生的cDNA和其后回收的病毒被称为M48I(甲硫氨酸-48到异亮氨酸-48)。
附图24显示了由野生型RSV(D53)产生感染性病毒以及由回收的D53/M481膜G突变型病毒的两个分离物产生的感染性病毒的比较的结果。
附图25A显示了RSV毒株A2的反基因组RNA(抗原亚型A)且描述了F和G基因用其毒株B1的对应物(抗原亚型B)的替换。每一矩形代表一个编码单一mRNA的基因，在每一矩形的左边和右边末端的灰色的和实心方框分别代表基因起始(GS)和基因末端(GE)转录信号。在基因组的每一末端的细线代表前导(左末端)和非转录尾区(右末端)基因外区域，矩形之间的细线代表基因间隔区。在反基因组的水平通过分别在G基因之前和F基因之后的PacI和SphI位点进行基因替换。L基因被绘成错位来表示其和上游的M2基因重叠，具体的图与此实例中并无密切关系。
附图25B和25C图解了嵌合rAB病毒中的序列(正义)，也即重组RSV毒株A2，其中F和G糖蛋白基因被毒株B1的所替换。所显示的序列含有SH-G(B部分)和F-M2(C部分)的连接处。得自毒株A2骨架的序列被显示在下面的例子中，来自毒株B1供体的序列显示于上面的例子中。在A2和B1序列之间连接处的最后A2特异性核苷酸被依据未修饰的重组A2基因组序列编号。SH基因末端(GE)和F信号被加上方框。PacI和SphI的识别位点被用斜体字表示。IG：基因间隔区。
附图26显示了毒株B1G和F基因的cDNA的为了提高在E.coli中生长的稳定性的修饰。两个正义序列被显示：上面(标记“新”)的是被修饰的B1序列，且下面(“野生型”)的为野生型B1序列。被显示的序列包括G翻译读码框(ORF)的下游末端，其编码的氨基酸(显示为在序列下面的单字母代码)，G GE信号(加框的)，G-F基因间隔区，F基因起始(GS)信号(加框的)。在新序列中的加下划线的位置代表替换；在新序列中的破折号代表缺失；在野生型序列中的破折号代表新序列中的插入。在新序列中产生的一个MfeI位点用粗斜体表示。显示了来自G-F基因间隔区的一个47个核苷酸的序列，在产生新序列中被缺失。
附图27图解了得自血清反应阴性的黑猩猩的上(上组；鼻咽擦拭)呼吸道和下(下组；气管灌洗)呼吸道的嵌合重组体AB wt RSV和ABcp248/404/1030衍生物的复制。此基于表46的数据。在每一图表中的浅色的水平点线为检测能力较低限。横木状标示显示了标准误差。
具体实施方案的描述
本发明提供了被减毒并能够在易受RSV感染的哺乳动物患者中启动预防性或治疗的免疫应答的感染性嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)。也提供了用于设计和生产减毒嵌合RSV的新方法和组合物，以及用于RSV感染的预防和治疗的方法和组合物。
本发明的嵌合RSV被重组工程改造以引入来自不止一个的RSV毒株或亚型的核苷酸序列来生产感染性的嵌合病毒或亚病毒颗粒。通过此方式，候选的疫苗病毒被重组工程改造以启动在哺乳动物宿主包括人和非人类灵长目动物中的抗RSV免疫应答。本发明的嵌合RSV可以启动对特定RSV亚型或毒株的免疫应答，或其可以启动抗多个RSV亚型或毒株的多特异性应答。
在本发明的实施方案中，一个RSV的异源基因、基因片段或单或多核苷酸被加到部分和整个RSV基因组或反基因组中，或在其中通过来自异源RSV的对应序列替换产生嵌合的RSV基因组或反基因组。本发明的嵌合RSV包括与不同RSV毒株或亚型病毒额外的或替代的“供体”基因或基因片段结合的RSV毒株或亚型病毒的部分或整个“受体”RSV基因组或反基因组。
在本发明的优选方面，嵌合RSV引入了部分或整个和一个结合来自不同的人RSV亚型或毒株的异源基因或基因片段的RSV亚型或毒株的人RSV基因组或反基因组。例如，优选的嵌合RSV引入了一个含有与来自不同人RSV A或B亚型病毒的异源基因或基因片段结合的部分或整个人RSV A或B亚型基因组或反基因组的嵌合基因组或反基因组。
来自一个RSV毒株或亚型的异源供体基因或基因片段被结合于或被替换到受体基因组或反基因组中，后者作为一个骨架用于插入或增加供体基因或基因片段。因此，受体基因组或反基因组作为一个载体来传递和表达异源基因或基因片段从而产生表现新的结构和/或表型特性的嵌合RSV。优选的，异源基因或基因片段添加或替换到所选择的受体RSV毒株中，与相应的未修饰的受体和/或供体的表型相比产生新的表型结果，例如减毒、生长变化、改变的免疫原性或其它目的表型变化。
在一个嵌合RSV基因组或反基因组中用作异源插入或添加的基因或基因片段包括编码NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G蛋白及其部分的基因或基因片段。在本发明优选的实施方案中，嵌合RSV引入了编码RSV F、G或SH糖蛋白的异源基因。可选择的，嵌合RSV可以引入编码仅仅部分的所选择蛋白例如RSV F、G或SH糖蛋白的胞质区、跨膜区、胞外区或免疫原性抗原决定簇的基因片段。
在另一个实施方案中，用于疫苗制剂的嵌合RSV可被适当的修饰来适应流动病毒中的抗原变化。典型的修饰在是G和/或F蛋白中。来自一个RSV毒株的整个G或F基因或其编码部分免疫原性区的基因片段通过不同RSV毒株或亚型的受体克隆的相应区域的替换或通过加入一或多个基因例如一些抗原形式的拷贝被引入到嵌合RSV基因组或反基因组cDNA中。产生自被修饰的RSV克隆的子代病毒可被用在抗新兴RSV毒株的接种方法中。
因此，导入异源免疫原性蛋白、区域或抗原决定簇来产生嵌合RSV对于在免疫宿主中产生新的免疫应答是特别有用的。在不同RSV亚型或毒株的受体基因组或反基因组中，来自一个供体RSV亚型或毒株的免疫原性基因或基因片段的添加或替换能够产生直接抗供体亚型或毒株、受体亚型或毒株或抗供体和受体亚型或毒株二者的免疫应答。为了达到此目的，嵌合RSV也可以被构建表达一个嵌合蛋白，例如，具有与不同RSV胞外区融合的对RSV毒株或亚型特异的胞质尾区和/或跨膜区的免疫原性蛋白。这种类型的其它的重组体可表达重复蛋白区，例如重复免疫原性区。
虽然通常在嵌合基因组或反基因组中添加或替换整个基因(包括顺式作用的元件和编码区)是有用的，其也用于转移目的供体基因的部分。通常，非编码核苷酸例如顺式作用的调控元件和基因间隔序列不需和供体基因编码区一起被转移。此外，不同基因片段提供了有用的供体多核苷酸以包含在嵌合基因组或反基因组中，表达具有新的或有用特性的嵌合RSV。因此，异源基因片段可以编码来自于一个RSV的所选择蛋白的一个细胞质尾区、跨膜区或胞外区、抗原决定位点或区、一个结合位点或区、一个活性位点或含有活性位点的区等等。这些或其它的基因片段可以被添加或用于替换另一个RSV中的对应基因片段来产生新的嵌合重组体，例如表达具有融合于另一个RSV胞外区的一个RSV的细胞质尾和/或跨膜区的嵌合蛋白的重组体。在编码蛋白小功能区如抗原决定簇位点的基因片段的情况下，有用的基因片段大约长15-35个核苷酸，编码较大区域或蛋白区的基因片段大约长50、75、100、200-500和500-1,500或更多核苷酸。
为了构建嵌合RSV，异源基因可整个或部分地被添加在背景基因组或反基因组中或替换来形成嵌合基因组或反基因组。在由替换产生的嵌合体的情况下，来自一个RSV的所选择的蛋白或蛋白区(例如，胞质尾，跨膜区或胞外区，抗原决定位点或区，一个结合位点或区，一个活性位点或含有活性位点的区，等等)被不同RSV基因组或反基因组中的对应基因或基因片段替换来产生具有与野生型或亲本RSV毒株相比发生目的表型改变的新的重组体。此处所用“对应”基因、基因片段、蛋白或蛋白区指的是来自异源的两个相对应多核苷酸，包括单个RSV毒株的不同基因，或不同变体的相同基因，包括在不同的RSV亚型或毒株的种和等位基因变体。
对应基因和基因片段具有至少中度的结构相似性。例如，对应基因片段可以编码目的蛋白的共同结构域例如胞质区，跨膜区或胞外区，抗原决定位点或区，一个结合位点或区等等。典型的，其也具有共同的生物功能。例如，由对应基因片段编码的蛋白区可以提供一个共同的跨膜功能，特异性结合活性，免疫识别位点等等。典型的，对应基因和基因片段的产物之间共有的目的生物活性在量上非常相似，例如，其差别不多于30％，优选的不多于20％，更优选的不多于5-10％。
本发明所用的对应基因和基因片段包括具有一定大小和序列变化的不同种的集合。然而，对应基因和基因片段的选择依赖于受验对应物的基本序列相似性。在此文中，所选择的多核苷酸“参照序列”被限定为存在于供体或受体基因组或反基因组中的序列或其部分。此参照序列被用作己定序列，为序列比较提供基准。例如，该参照序列可被限定为cDNA或基因的片段，或整个cDNA或基因序列。
通常，一个用于限定对应基因或基因片段的参照序列至少具有20个核苷酸的长度，通常至少25个核苷酸长度，且经常至少50个核苷酸长。由于两个多核苷酸每一(1)包括一个在两个多核苷酸之间相似的序列(例如整个核苷酸序列的一部分)，且(2)可进一步包括在两个核苷酸之间有区别的部分，在两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较一般通过用“比较窗口”比较两个多核苷酸来鉴定和比较序列相似性的局部区域而进行。此处所用的“比较窗口”，是指至少20个连续核苷酸概念上的片段，其中一个多核苷酸序列可以与至少20个连续核苷酸的参照序列相比较，且其中的在比较窗口中的多核苷酸序列的部分可含有与参照序列相比20％或更少的添加或缺失(即，缺口)，用于两个序列的最佳比对。可通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性对比规则，通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性对比规则，通过Pearson & Lipman，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜寻法(其均引入本文作为参考)，通过用电脑处理运行这些规则(Wisconsin Genetics SoftwarePackage Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI，其引入本文作为参考)，或通过检验，进行用于对比比较窗口的最佳序列比对，并选择出通过不同的方法产生的最佳程序(即，在比较窗口产生最大的序列相似性百分比)。
此处所用的“序列同一性”，是指在比较窗口中的两个多核苷酸序列为相同的(即在核苷酸对核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”通过在比较窗口中比较两个最佳比对序列来计算。测定在两个序列中产生的相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)的位置数来产生相配的位点数，通过用在比较窗口中的总位点数(即窗口的大小)除相配的位点数，且将结果乘以100来得到序列同一性的百分数。此处所用的术语“基本同一性”表示多核苷酸序列的特性，其中多核苷酸序列包括在至少20个核苷酸位置、经常至少25-50个核苷酸的比较窗口中与参照序列相比，至少85％序列同一性的序列，优选的至少90％到95％的序列同一性的序列，通常为至少99％的序列相似性的序列，其中序列同一性百分比的计算是通过参照序列与可能包括比较窗口中总共20％或更少的参照序列的缺失或添加的多核苷酸序列来进行的。参照序列可以是较大序列的子集。
除了这些核苷酸序列的相互关系外，由本发明的嵌合RSV编码的蛋白和蛋白区也典型的被选择具有保守的关系，即，与所选的参考多肽有基本序列同一性或序列相似性。被用于多肽时，术语“序列同一性”是指在相应的位点具有相同氨基酸的肽。术语“序列相似性”是指在相应的位点具有相同或相似氨基酸(例如保守替换)的肽。术语“基本序列同一性”是指两个多肽序列例如通过利用默认缺口权重的GAP或BESTFIT程序进行最佳比对时具有至少80％的序列同一性，优选至少90％的序列同一性，更优选至少95％或更多(例如99％的序列同一性)的序列同一性。术语“基本相似性”是指两个多肽序列具有相应的序列相似性百分比。
优选的，不相同的残基位置通过保守的氨基酸替换来区分。保守的氨基酸替换是指具有相似侧链残基的可互换性。例如具有脂肪侧链的氨基酸的保守组为甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的氨基酸的组为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸的组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸的组为苯丙氨酸，酪氨酸，和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组为赖氨酸，精氨酸，和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸的组为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换组：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，和天门冬酰胺-谷氨酰胺。20个常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α，α二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它的非常规氨基酸也可以应用于本发明的多肽组分。非常规氨基酸的实例包括：4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸以及其它的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。此外，氨基酸可以通过糖基化、磷酸化等进行修饰。
本发明在此公开了基于cDNA构建重组体、RSV病毒和亚病毒颗粒的方法。这些重组构建物提供了改进的用于疫苗制剂的减毒和免疫原性的特性。在此文中目的表型的改变为抗减毒表型反转，提高培养物或在所选择的宿主环境中减毒性，免疫原性特性(例如通过增强或减低所启动的免疫应答检测的)，所选病毒产物的转录和/或翻译的上调控或下调控等等。
本发明的一个优选的方面，产生的减毒嵌合RSV的嵌合基因组或反基因组通过导入一或多个决定减毒表型的减毒点突变被进一步修饰。这些点突变可被从头产生并通过合理的突变策略设计检测减毒效果。可选择的，减毒点突变在生物学上获得的突变体RSV中被鉴定然后被引入到本发明的嵌合RSV中。
用于引入到嵌合疫苗毒株中的生物学上获得的RSV减毒点突变可天然存在或通过公知的诱变方法被导入到野生型RSV毒株中。例如可通过化学诱变来产生不完全减毒亲本RSV毒株：在病毒生长的细胞培养物中添加化学诱变剂，并通过选择适于导入生长限制突变的亚适宜温度下能传代的病毒，或通过选择在细胞培养物中产生小噬斑(sp)的突变病毒进行。这些通常描述在USSN 08/327,263，引入本文作为参考。
“生物学上获得的RSV”是指不是通过重组方法产生的任何RSV。因此，生物学上获得的RSV包括天然存在的所有亚型和毒株，例如包括具有野生型基因组序列的天然存在的RSV和具有来自参照野生型RSV序列的基因组变化的RSV，例如，具有决定减毒表型的突变的RSV。同样地，生物学上获得的RSV包括来源于通过其它的人工诱变和选择方法获得的亲本RSV毒株。
为产生来自生物学上获得的株的令人满意的减毒RSV，优选突变被导入不完全或部分减毒的亲本毒株例如RSV亚型A的A2毒株或其衍生物或亚克隆的公知的ts-1或ts-1NG或cpRSV突变体。利用这些或其它部分减毒的毒株，可产生其它突变以进一步减毒，例如在哺乳动物的宿主中产生目的水平的限制性复制同时保留充分的免疫原性来赋予疫苗保护性。
可通过公知在适宜的细胞底物中生物学克隆野生型病毒的方法产生亚型A或B病毒的部分减毒突变株并开发例如冷传代的突变株，对病毒进行化学诱变产生ts突变株，或选择小噬斑或相似的表型突变株(参见，例如，Murphy等，国际申请WO 93/21310，引入本文作为参考)。对于亚型B的病毒而言，部分减毒亲本病毒例如为cp 23，其是亚型B的B1毒株的一个突变体。
多种已知的筛选技术可结合此处描述的可用于进一步衍生的非减毒亚型A或B毒株来产生部分减毒突变株。进一步的，特异于减毒表型的突变可通过单独导入或结合不完全减毒的亚型A或B病毒来产生疫苗病毒，其具有多种赋予疫苗目的水平的减毒和免疫原性的减毒突变。
如上所述，充分减毒的生物学上获得的RSV突变株的产生可通过很多已知的方法来进行。在此方法中包括在渐低的减毒温度下的细胞培养物中传代培养部分减毒的病毒。例如，野生型病毒一般被培养在34-37℃，部分减毒的突变株则在细胞培养物(例如初级牛肾细胞中)中在亚适温例如20-26℃下传代产生。因此，cp突变株或其它的部分减毒株，例如ts-1或spRSV被调整到在较低温度大约低到20～24℃，优选20-22℃下在MRC-5或Vero细胞中通过传代进行有效的生长。与部分减毒的亲本相比，在冷传代中选择突变体RSV显著地减少了衍生毒株中任何残余的毒性。
可选择的，特异性的突变可被导入生物学上获得的RSV中，通过将部分减毒亲本病毒进行化学诱变，从而例如导入ts突变，或在已存在ts的情况下添加其它的ts突变来充分赋予减毒衍生体的ts表型以增加的减毒性和/或稳定性。导入ts突变到RS病毒的方法包括在诱变剂例如大约10-3到10-5M浓度、优选约10-4M的5-氟尿嘧啶核苷或5-氟尿嘧啶的存在下复制病毒，将病毒暴露于大约100μg/ml的亚硝基胍中，根据通常描述的方法，例如，Gharpure等，J.Virol.3：414-421(1969)和Richardson等，J.Med.Virol.3：91-100(1978)，或遗传导入特异性ts突变。其它的化学诱变剂也可被应用。虽然用于此目的适宜靶点已被发现为聚合酶(L)基因，但减毒可由几乎任何RSV基因的ts突变获得，。
本发明中所用减毒RSV的复制温度敏感性的水平被通过与在一些限制性温度下相比较其在允许温度下的复制来测定。病毒的复制与在允许温度下的复制相比减少100倍或更多的最低温度被定义为截止温度。在实验动物和人中，RSV的复制和毒性均与突变株的截止温度相关。具有39℃截止温度的突变株的复制被适当的限制，而具有38℃截止温度的突变株的复制较好并且病的症状主要限制在上呼吸道。具有35-37℃截止温度的病毒一般在人体中被完全减毒。因此，本发明的生物学上获得的减毒突变株和嵌合RSV(其为ts)具有的截止温度范围为35到39℃，优选的35到38℃。添加ts突变到部分减毒株，产生本发明疫苗组分中有用的多重减毒病毒。
通过多次化学诱变将多个突变引入在冷传代时已减毒的病毒中，已开发出许多作为鼻内给药的候选疫苗的减毒RSV毒株(例如，Connors等，Virology 208：478-484(1995)；Crowe等，Vaccine 12：691-699(1994)；以及Crowe等，Vaccine 12：783-790(1994)，引入本文作为参考)。在啮齿动物、黑猩猩、成人和婴儿中的评估表明这些候选疫苗毒株中的一些是相对稳定遗传的，具有高度免疫原性，并可被令人满意的减毒。一些这样的减毒病毒的核酸序列分析(如下面所例举)表明每一个提高的减毒水平与具体核苷酸和氨基酸的替换相关。本发明提供了通过导入单独和不同组合的突变到感染性RSV克隆的基因组或反基因组中而在沉默偶发突变和决定表型差异的突变之间进行辨别的能力。本方法结合亲本和衍生病毒的表型特征的评估来鉴定负责目的特性例如减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑大小、寄主范围限制等的突变。
被鉴定的突变被编辑成“目录”且然后被依据所期望的目的单独或联合导入，来调整嵌合疫苗病毒到减毒性、免疫原性、减毒表型反转抗性等适宜的所需的水平。优选的，本发明的嵌合RSV通过引入至少一个、更优选两个或多个来自该目录所鉴定的减毒点突变而被减毒，其可被定义为一组生物学上获得的突变体RSV毒株集合中的已知突变。此处所述的突变体RSV的优选集合为冷传代(cp)和/或温度敏感性(ts)突变株，例如含有RSV突变体的集合，被命名为cpts RSV 248(ATCC VR 2450)、cpts RSV 248/404(ATCC VR 2454)、cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)、cpts RSV 530(ATCC VR 2452)、cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)、cpts RSV 530/1030(ATCC VR 2455)、RSV B-1cp52/2B5(ATCC VR 2542)和RSV B-1 cp-23(ATCC VR 2579)(每一种均依据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801Boulevard University，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A.，且获得如上登记号)。
自此生物学上获得的突变体的实例集合，减毒突变的大目录被提供，其每一个减毒突变体可与集合中的任何其它的突变结合用于调整用作疫苗的重组嵌合RSV的减毒水平。其它的突变可获自具有非-ts和非-cp的在例如小噬斑(sp)，冷适应(ca)或寄主范围限制性(hr)突变株中被鉴定的减毒突变的RSV。减毒突变可在供体或受体基因的编码区或非编码区例如顺式调控序列中被选择。例如，减毒突变可以包括基因起始序列的单个或多个碱基变化，例如在M2基因起始序列的核苷酸7605处的单个或多个碱基改变。
被设计和筛选用作疫苗的嵌合RSV通常具有至少两个、有时三个或多个减毒突变以达到用于广谱临床应用的令人满意的减毒水平。在一个实施方案中，至少一个减毒突变发生在RSV聚合酶基因(在供体或受体基因中)中且包括决定聚合酶蛋白中的一个决定温度敏感性(ts)表型的氨基酸变化的核苷酸替换。在此文中的嵌合RSV在大聚合酶基因L中引入一个或多个核苷酸替换，在氨基酸Phe521、Gln831、Met1169或Tyr1321中产生的一个氨基酸变化，例如，Leu替换Phe521，Leu替换Gln831，Val替换Met1169，和Asn替换Tyr1321。可选择的或附加的，本发明的嵌合RSV可以引入不同RSV基因的一个ts突变，例如在M2基因中。优选的两个或多个核苷酸变化被引入到决定减毒突变的密码子例如决定ts突变的密码子中从而降低减毒表型反转的可能性。
根据本发明的方法，嵌合RSV可被容易地构建并被表征为引入了存在于生物学上获得的突变体RSV毒株集合中的至少一个到全部的减毒点突变。因此，突变可从可选择的突变体集合中任意的组合，例如，cpts RSV 248(ATCC VR 2450)、cpts RSV 248/404(ATCC VR2454)、cpts RSV 248/955(ATCC VR 2453)、cpts RSV 530(ATCC VR2452)、cpts RSV 530/1009(ATCC VR 2451)、cpts RSV 530/1030(ATCCVR 2455)，RSV B-1 cp52/2B5(ATCC VR 2542)和RSV B-1 cp-23(ATCC VR 2579)。在此方式中，嵌合疫苗候选物的减毒可被调整用于一组或多组病人，包括血清反应阴性婴儿。
在更具体的实施方案中，用作疫苗的嵌合RSV引入了在RSV聚合酶基因L中的Phe521、Gln831、Met1169或Tyr1321位置处决定温度敏感性氨基酸替换，或基因M2中的起始序列中的温度敏感性核苷酸替换中至少一个到全部完整的减毒突变。可选择的或额外的，权利要求中的嵌合RSV可引入至少一个到全部来自冷传代减毒RSV的突变，例如一个或多个在RSV N基因中决定Val267氨基酸替换的突变，在RSVF基因中决定Glu218或Thr523氨基酸替换的突变，在RSV聚合酶基因L中决定Cys319或His1690氨基酸替换的突变。
在另一个具体的实施方案中，本发明的嵌合RSV具有人RSV B亚型糖蛋白基因F和G特性，所述基团在人RSV A基因组或反基因组中插入或替换来产生被进一步修饰加入一个或多个从生物学上获得的突变体RSV中得到的减毒点突变的嵌合克隆。在不同的实例中，嵌合RSV具有人RSV B糖蛋白基因F和G，其用以替换RSV A基因组中的对应F和G糖蛋白基因，其被进一步的修饰来引入选自以下的减毒点突变：(i)在RSV聚合酶基因L中的决定温度敏感性氨基酸替换Gln831到Leu，以及Tyr1321到Asn的突变集合；(ii)在基因M2的基因起始序列中的一个温度敏感性核苷酸替换；(iii)来自冷传代RSV的RSV N基因中决定氨基酸替换Val267到Ile，以及RSV聚合酶基因L中的Cys319到Tyr与His1690到Tyr的减毒突变集合；或(iv)SH基因的缺失。优选的嵌合RSV的这些和其它的实例引入了来自于相同或不同的生物学上获得的RSV毒株的至少两个减毒点突变。同样优选的，这些实例中的突变体具有一个或多个通过在决定突变的密码子中的多个核苷酸变化所稳定的减毒突变。
根据上述描述，从cDNA产生感染性RSV的能力允许在嵌合RSV中导入具体的工程变化。具体的，感染性重组RSV被用于鉴定生物学上获得的减毒RSV毒株的具体突变，例如，决定ts、ca、att和其它表型的突变。目的突变被鉴定并被导入到重组嵌合RSV疫苗毒株中。从cDNA产生cDNA病毒的能力允许这些突变单个的或不同选择性组合被常规引入到全长cDNA克隆中，然后含有导入突变的经拯救重组病毒的表型能被较容易地测定。
通过鉴定和引入特异性的与目的表型例如cp和ts表型相关的生物学上获得的突变到感染性的嵌合RSV克隆中，本发明提供了其它的在或接近被鉴定的突变的位点特异性修饰。尽管生物学上获得的大多数RSV减毒突变为单核苷酸突变，其它的“位点特异性”突变也可以通过重组技术引入到生物学上可获得或重组体RSV中。此处的位点特异性突变包括从1到3直至5到15或更多的被改变的核苷酸(例如，改变自野生型RSV序列，自所选择的突变体RSV毒株的一段序列或自用于诱变的重组亲本RSV克隆)的插入、替换、缺失或重排。这样的位点特异性突变可被引入到所选择的生物学上获得的点突变上或区域内部。可选择的，突变可被导入RSV克隆的其它不同部分，例如在或邻近一个顺式调节序列或编码蛋白活性位点、结合位点、免疫原性抗原决定簇的核酸序列等等。位点特异性RSV突变体一般保留一个目的减毒表型，但是可能表现与减毒不相关的基本上被改变的表型特性，例如增强的或扩大的免疫原性，或改进的生长。进一步的目的位点特异性突变体的实例包括设计用来将其他的稳定核苷酸突变引入到决定减毒点突变的密码子中的重组RSV。在可能的情况下，两个或多个核苷酸替换被导入到决定亲本突变体或重组RSV克隆中减毒氨基酸变化的密码子中，产生具有对从减毒表型反转的遗传抗性的生物学上获得的或重组的RSV。在其它的实施方案中，位点特异性核苷酸替换、添加、缺失或重组被导入相应于靶核苷酸位置上游(N端方向)或下游(C端方向)，例如从1到3、5-10直至15个核苷酸或更接近5′或3′，例如，以构建或消除一个已经存在的顺式作用的调节元件。
除了单个和多个点突变和位点特异性突变以外，此处所公布的嵌合RSV的变化包括整个基因或基因片段的缺失、插入、替换或重排。这些突变可能改变在供体或受体基因组或反基因组中的少量的碱基(例如从15-30个碱基直至35-50个碱基或更多)，或大量核苷酸(例如，50-100、100-300、300-500、500-1,000个碱基)，依赖于突变的特性，例如，少量碱基可通过插入或消除一个免疫原性的抗原决定簇或改变一个小基因片段来改变，而当基因或大基因片段被添加、替换、缺失或重排时涉及了大量的碱基。
在其它的方面，本发明用其它类型的突变补充由生物学上获得的RSV导入嵌合RSV克隆中的突变如cp和ts突变，所述其它类型的突变涉及在进一步修饰的嵌合RSV克隆中的相同或不同基因。RSV编码10个mRNA和10或11个蛋白。其中三个为跨膜表面蛋白(被称为附着G蛋白)、涉及穿透的融合F蛋白和小的疏水SH蛋白。G和F是主要的病毒中和与保护抗原。四种其它的蛋白与病毒的核壳相关，被称为RNA结合蛋白N、磷蛋白P、大的聚合酶蛋白L以及转录延伸因子M2 ORF1。基质M蛋白是内病毒体的一部分且可能介导核壳和包膜之间的关联。最后，有两个非结构蛋白，功能未知的NS1与NS2。这些蛋白可被选择性的在表达水平上改变，或整个或部分的添加、缺失、替换或重排，单独或与其它的目的修饰联合产生表现新疫苗特性的嵌合RSV。
因此，除了来自于生物学上获得的减毒突变以外，本发明也提供了一些其它的方法用于基于感染性RSV克隆的重组基因工程的嵌合RSV的减毒。根据本发明的此方面，不同的改变可以在编码用于引入到感染性克隆的嵌合RSV基因组或反基因组的分离多核苷酸序列中产生。更具体的，为了得到嵌合RSV中目的结构和表型变化，本发明允许导入从亲本嵌合基因组或反基因组中缺失、替换、导入或重排一个所选择核酸或大多数核酸的修饰，以及在一个嵌合RSV克隆中缺失、替换、导入或重排整个基因或基因片段的突变。
感染性嵌合RSV的目的修饰一般用于决定目的表型改变，例如，病毒生长、温度敏感性、启动宿主免疫应答的能力、减毒等等的改变。这些变化可通过例如亲本RSV克隆的突变引入供体或受体基因组或反基因组中，以消除、导入或重排一个具体的基因或基因区(例如一个编码蛋白结构域如细胞质、跨膜或胞外区、免疫原性抗原决定簇、结合区、活性位点等等的片段)。此处的目的基因包括RSV基因组的所有基因：3′-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5′，以及来自其它的RSV、其它病毒和此处所述的其它非RSV来源的异源基因。
本发明也提供了在嵌合RSV中的仅仅改变或去除一个被选择基因的表达的修饰，例如通过在一个所选择的编码序列导入终止密码子，改变相对于可操作连接的启动子的RSV基因的位置，导入一个上游起始密码子来改变表达速率，修饰(例如通过改变位点、改变已知序列或用异源序列替换已知序列)GS和/或GE转录信号来改变表型(例如，生长、在转录中的温度限制等等)以及决定病毒复制、被选择基因的转录或被选择蛋白的翻译的量和质的变化的其它的缺失、替换、导入和重排。
分析和引入其它类型减毒突变到嵌合RSV中用于疫苗开发的能力扩展到在RSV克隆中的靶改变的广泛的集合。例如SH基因的缺失产生具有新表型特性例如增强的生长的重组RSV。在本发明中，SH基因的缺失(或任何其它的所选择的非必要基因或基因片段的缺失)，被结合到具有决定减毒表型的一个或多个其它突变的嵌合RSV中，其它突变例如为，来自于从生物学上获得的减毒RSV突变株的一个或多个点突变。在一个实施方案中，缺失SH基因或NS2基因与一个或多个来自cpts 248/404、cpts530/1009、cpts530/1030或另一个所选择的突变体RSV毒株的一个或多个cp和/或ts突变来产生取决于不同突变结合效果的具有增加的病毒产量、增强的减毒性以及对表型反转的抗性的重组体RSV。
在此方面，对于生长非必要的任何RSV基因，例如SH、N、P、NS1和NS2基因，在嵌合RSV中可被去除或修饰来产生在毒力、致病性、免疫原性和其它的表型特性上的目的效果。例如通过非必要基因例如SH基因的缺失导致培养物中增强的病毒生长。未由理论推出的，该作用可能部分归因于病毒基因组核苷酸长度的减少。在SH-负型克隆的情况下，修饰的病毒基因组为14,825核苷酸长度，比野生型少398个核苷酸。通过在例如RSV基因组的其它编码或非编码区如P、M、F和M2基因中改造减少基因组大小的相似突变，本发明提供了一些容易获得的方法和材料来用于改进嵌合RSV的生长。
此外，不同的其它遗传改变可在RSV基因组或反基因中产生，用于单独或与一个或多个来自于生物学上获得的突变RSV的减毒点突变一起插入到感染性嵌合RSV中。可整个或部分插入其它异源(例如来自不同RSV基因、不同RSV毒株或类型或非RSV来源的)基因和基因片段，改变基因的顺序，去除基因重叠序列，用其反基因组对应物替换RSV基因组，去除或替换部分基因，甚至缺失整个基因。序列中不同的或其它的修饰可被用于促进操作，例如在不同的基因间隔区或其他区域插入特殊的限制性位点。非翻译基因序列可被去除以增加插入外源序列的能力。
本发明也提供了一种嵌合RSV中的基因修饰，其在没有从嵌合RSV克隆中去除基因和基因片段的条件下改变或去除所选择的基因或基因片段的表达。例如可通过在所选择的编码区中导入终止子，改变基因位点或导入上游起始密码子来改变其表达速率，或改变GS和/或GE转录信号来改变表型(例如，生长、转录的温度限制等等)来进行。
在此文中的优选的突变包括顺式作用信号的直接突变，其可通过例如RSV微基因组的突变分析被鉴定。例如，前导、尾部和侧翼序列的插入和缺失分析鉴定了病毒启动子和转录信号并且提供了一系列与RNA的复制或转录的减少的变化程度相关联的突变。这些顺式作用信号的饱和诱变(由此每一位置依次被修饰到可选择的核苷酸)已证实了很多突变，其减少了(或一种情况下增加)RNA的复制或转录。任意的这些突变可按照此处所述被插入到嵌合反基因组或基因组中。
反式作用蛋白和顺式作用的RNA序列利用完整反基因组cDNA进行的评价和操作通过利用RSV微基因组被促进(参见，Grosfeld等，J.Virol.69：5677-5686(1995)，引入本文作为参考)，其辅助依赖的地位在这些突变的鉴定中是有用的，其中的突变在复制非依赖的感染病毒中抑制性太强以至于不能被回收。
本发明嵌合RSV中的其它突变包括用其来自反基因组的对应物代替基因组的3′末端，其与RNA的复制与转录的变化相关联。此外，基因间隔区(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4594-4598(1986)，引入本文作为参考)可在序列上被缩短或延长或改变，且天然存在的基因重叠(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5134-5138(1987)，引入本文作为参考)可通过此处所述的方法被去除或改变为一个不同的基因间隔区。
在一个实施方案中，通过用合成制得并能有效翻译的序列来替代天然序列，增加了特定RSV蛋白(如保护性F和G抗原)的表达水平。在此文中，显示了密码子选择在哺乳动物病毒蛋白的翻译的水平中是一个主要的因素(Haas等，Current Biol.6：315-324(1996))。对编码RSV的作为主要保护性抗原的F和G蛋白的mRNA的密码子选择的检测，显示了其选择与低量的表达是一致的。因此，密码子选择可通过本发明的重组的方法被改进，以获得所选择基因的改进表达。
在另一个实施方案中，通过单独修饰所选RSV基因的翻译起始位点(优选包括-3位置的核苷酸)周围的序列或与导入上游起始密码子结合，通过特异性的正或负调控来翻译调节嵌合RSV基因的表达。可选择的，或结合其它的在此公开的RSV修饰，嵌合RSV基因表达可通过改变所选病毒基因的转录GS信号被调控。在一个实施方案中，NS2的GS信号被修饰以包含限定的突变(例如，如下所述的404(M2)突变)来在病毒的复制上添加一个ts限制。
本发明的其它的嵌合RSV克隆可引入修饰到转录GE信号上。例如，RSV克隆可被产生，其用于替换或突变N基因GE信号的NS1和NS2基因GE信号，结果导致通读mRNA水平的降低和下游基因的蛋白表达的增加。假如RSV生长特性通过在RSV基因组中顺式作用调控元件的修饰被改变，产生的嵌合病毒将显示增加的生长动力和增加的噬斑大小。
在另一个示范的实施方案中，G蛋白的表达通过G mRNA的修饰被增加。G蛋白被表达为膜结合的和分泌的形式，后一种形式通过在G翻译读码框中的起始位点上启动翻译而被表达。分泌的形式可占表达的G蛋白的一半。中间的起始位点的消除(例如，通过序列改变、缺失等等)，单独或与上游起始位点的序列的改变一起，在G蛋白表达中产生目的变化。G的分泌形式的消除将改进宿主对嵌合RSV免疫应答的质量。因为G的溶解形式被认为充当一个诱捕中和抗体的“引捕器”。另外，可溶解性G蛋白显示Th2-偏向应答的优先刺激并表现出增强的免疫病理作用。
在可选择的实施方案中，嵌合RSV基因表达的水平在转录的水平上被改变。在一方面，RSV基因图谱中的所选基因的位置可被改变到一个更接近或更远离启动子的位置，因此基因将分别的被更多或更少有效地表达。根据本发明的此方面，特异性基因表达的调节可被获得来产生与野生型的水平相比增加或减少两倍，更典型的四倍，直到十倍或更多倍的基因表达。在一个实例中，NS2基因(在RSV基因图谱中的第二个)定位替换SH基因(第六个)，在NS2的表达中产生预知的减少。所选RSV基因的取决于位置改变的增加的表达可通过在基因的定位相互替换获得10倍、30倍、50倍、100倍和更多的表达水平的同量的减少。
在其它的示范实施方案中，F和G基因被单独或一起转座到一个嵌合RSV基因图谱中的更接近或更远离启动子的位置来分别获得更高或更低的基因表达的水平。这些或其它的转座变化产生新的具有减毒表型的嵌合RSV克隆，例如取决于涉及RNA复制的所选病毒蛋白的降低表达。
在本发明的一个具体的方面，提供了嵌合RSV，其中病毒基因例如NS2基因表达在翻译水平上被消除，通过，例如，导入两个串联翻译终止密码子到翻译读码框(ORF)中。此产生有活力的且其中所选基因已在翻译水平沉默而没有基因缺失的病毒。这些“剔除”病毒的形式将在组织培养物中显示出减少的生长速率和小的噬斑尺寸。因此，本发明的方法和组合物提供了其它的减毒突变的新类型，其去除了并非主要保护性抗原的病毒基因的表达。在此文中，产生的没有基因或基因片段缺失的“剔除”病毒表型也可通过如在此描述的缺失诱变产生，来有效地消除回复了靶蛋白合成的校正突变。
其它的一些嵌合RSV的基因“剔除”可通过改变设计来生成。例如，插入翻译终止密码子到ORF中，或破坏RNA编辑位点，提供可选择的沉默或减弱所选基因的表达。用于产生这些或其它剔除的方法是本领域公知的(参见，例如，Kretzschmar等，Virology 216：309-316(1996)；Radecke等，Virology 217：418-412(1996)；以及Kato等，EMBO J. 16：178-587(1987)；以及Schneider等，Virology 277：314-322(1996)，每一个引入本文作为参考)。
本发明的感染性嵌合RSV克隆可根据在此描述的方法和组合物被工程改造来增强免疫原性和诱导比用野生型RSV或亲本嵌合RSV感染更高的保护水平。例如，来自异源RSV毒株或型，或来自非RSV来源例如PIV的免疫原性抗原决定簇可通过在编码嵌合基因组或反基因组的多核苷酸中适宜的核苷酸变化被添加嵌合克隆中。可选择的，嵌合RSV可被工程改造来增加或去除(例如，通过氨基酸插入、替换或缺失)与期望的或不期望的免疫反应相关联的免疫抗原决定簇。
在本发明的方法中，额外的基因或基因片段可被插入到或临近于受体RSV基因组或反基因组。这些基因被受体基因共同调控，或被一系列独立转录信号调控。目的基因包括上面鉴定的RSV基因以及非RSV基因。目的非RSV基因包括这些编码细胞因子(例如IL-2到IL-15，特别是IL-2、IL-6和IL-12等等)，γ-干扰素，以及富含在T辅助细胞抗原决定簇中的蛋白。这些额外的蛋白可被表达为经分离的蛋白，或来自一个RSV蛋白例如SH的第二拷贝的嵌合工程改造的嵌合体。此提供了在定性和定量上修饰和改进抗RSV的免疫应答的能力。
在本发明的示范的实施方案中，嵌合RSV基因组的外源基因或基因片段(在一些情况下为非编码的核苷酸序列)的插入，导致期望的基因组长度的增加，产生其它的目的表型。增加的基因组长度导致部分依赖于插入序列的长度的产物RSV的减毒。此外，来自于被插入到本发明嵌合RSV中的非RSV基因的特定蛋白例如细胞因子的表达将导致取决于蛋白作用的病毒的减毒。此已被描述于在疫苗病毒中表达的IL-2中(例如Flexner等，Nature 33：-259-62(1987))并被期望用于γ干扰素。
涉及本发明嵌合RSV中的整个基因或基因片段的变化的缺失、插入、替换和其它的突变产生高稳定性的候选疫苗，其对免疫抑制个体非常重要。很多这样的变化导致产生的疫苗毒株的减毒，而其它的将决定目的表型变化的不同类型。例如特定的已知编码蛋白的病毒基因其特异性地阻碍宿主免疫(参见，例如，Kato等，EMBO.J.16：578-87(1997)，引入本文作为参考)。在嵌合疫苗病毒中去除此种基因被希望减少毒力和致病性和/或改善免疫原性。
在本发明的另一些方面，由cDNA表达的基因组或反基因组产生的感染性嵌合RSV可是任意的RSV或类RSV毒株，例如，人、牛、鼠科动物RSV等等，或任意肺病毒，例如，小鼠肺炎病毒或火鸡鼻气管炎病毒。为了产生保护性的免疫应答，RSV毒株可以是一个对于被免疫的受试者内源的毒株，例如被用于免疫人的人RSV。然而，为了表达来自不同来源例如来自不同RSV种、亚型或毒株或来自一个RSV和另一个呼吸道病原体例如PIV的RSV基因或基因片段组合，同源RSV的基因组或反基因组可被修饰。
在本发明的特定实施方案中，嵌合RSV被提供，其中在人RSV中的基因或基因片段被来自非人RSV例如牛或鼠RSV的对应异源基因或基因片段替换。可选择的，嵌合RSV可引入来自人RSV的基因或基因片段到非人RSV受体或背景克隆，例如，牛或鼠RSV。此上下文中的RSV基因或基因片段的替换、缺失和添加可包括部分或所有的一或多个NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)和L基因，或G和F基因的非免疫部分。另外，人或非人RSV顺式作用序列，例如启动子或转录信号，可被分别用非人或人对应的序列替换。因此，提供了一种方法来通过插入人减毒基因或顺式作用的序列到牛RSV基因组或反基因组中产生活减毒牛RSV。
根据宿主范围的限制且有利于疫苗的应用的其他目的表型来选择带有异源基因或顺式作用元件的嵌合人/非人RSV。在一个实施方案中，基于已知牛RSV结构和功能，人RSV被选择导入到牛RSV序列中，例如，Pastey等，J.Gen.Viol.76：193-197(1993)；Pastey等，Virus Res.29：195-202(1993)；Zamora等，J.Gen.Virol.73：737-741(1992)；Mallipeddi等，J.Gen.Virol.74：2001-2004(1993)；Mallipeddi等，J.Gen. Virol. 73：2441-2444(1992)；以及Zamora等，Virus Res. 24：115-121(1992)，每一个被引入本文作为参考，并与在此公开的技术一致。
在本发明的其它实施方案中，仿照G蛋白胞质尾区缺失的小鼠肺炎病毒组织培养适应型非病原株(人RSV的鼠对应物)(Randhawa等，Virology 207：240-245(1995))，将感兴趣的突变引入重组RSV中。相应地，在本发明的一个方面，人RSV糖蛋白F、G和SH的一或多个细胞质和/或跨膜区被添加、缺失、修饰或用异源的对应序列(例如，来自鼠肺炎病毒的F、G或SH蛋白的细胞质区或跨膜区)在嵌合RSV中替换来获得目的减毒。作为另一个实例，在或邻近F蛋白的切割位点的或推定的G蛋白的附着区的核苷酸序列，可通过点突变、位点特异性突变，或通过涉及整个基因或基因片段改变的修饰来获得新的组织培养中的病毒生长和/或感染性的和致病性的影响。
因此，用于给药于人的感染性嵌合RSV可以是已被修饰含有来自例如牛或鼠RSV或PIV的基因例如用于减毒的目的人RSV。例如通过插入来自PIV的基因或基因片段，PIV和RSV二价疫苗可被提供。可选择的，一个异源的RSV种、亚型或毒株，或不同的呼吸道病原体例如PIV，可被修饰，例如，以含有编码抗原决定簇或启动抗人RSV感染保护的蛋白的基因。例如，人RSV糖蛋白基因可替换牛糖蛋白基因来产生嵌合基因，其现在带有位于牛背景中的人RSV表面糖蛋白，当在人中启动抗人RSV毒株的保护性免疫应答时，将保留在人宿主中的取决于余下的牛遗传背景的复制的限制能力。
在本发明的一个实施方案中，嵌合的牛-人RSV引入了一个人RSVNP基因或基因片段为对应的牛NP基因或基因片段所替换，其嵌合物可操作的被构建来引入其它基因的改变，例如，点突变或基因缺失。例如，人RSV编码序列(例如，NS1、NS2、NP等等的)或非编码序列(例如，启动子、基因末端、基因起点、基因间隔或其它顺式作用的元件)用对应的牛或鼠RSV序列的替换被期望产生具有不同的可能减毒和其它表型作用的嵌合RSV。具体的，宿主范围和其它的目的作用被期望产生于被导入人RSV背景的非人基因，其中所述非人基因不在人细胞中有效行使功能，例如，来自异源基因或蛋白与在生物学上相互作用的人RSV序列或蛋白的不相容性(例如，用于病毒转录、翻译、装配的通常与替换的序列或蛋白协同操作的序列或蛋白等等)。
在本发明的一个更具体的方面，嵌合RSV被用作其它病原体特别是呼吸道病原体例如副流感病毒(PIV)的保护性抗原的载体。例如，嵌合RSV可被工程改造引入编码来自PIV的保护性抗原的序列来产生感染性的、减毒的疫苗病毒。PIV cDNA的克隆以及其它的描述在1998年五月22号递交的美国专利申请09/083,793“从克隆的核苷酸序列制备副流感病毒疫苗”(相应的国际申请为WO98/53078)，以及其1997年5月23日申请的优先权在先申请No.60/047,575中，每一个被引入本文作为参考。此公开物包括下述被用于生产感染性PIV病毒克隆的质粒的描述：p3/7(131)(ATCC 97990)；p3/7(131)2G(ATCC97889)；以及p218(131)(ATCC 97991)；每个质粒均依据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)10801 Boulevard大学，Manassas，弗吉尼亚20110-2209，美国，且得到如上的保藏号。
与本发明的此方面相符，本发明提供了一个嵌合RSV，其含有RSV基因组或反基因组序列以及至少一个PIV序列的嵌合体，例如，含有来自RSV和PIV1、PIV2、PIV3或牛PIV二者的序列的多核苷酸。例如，RSV的个别基因可被用来自人PIV例如PIV1、PIV2或PIV3的HN和/或F糖蛋白基因的对应基因替换。可选择的，所选的异源基因片段例如PIV1、PIV2或PIV3的HN或F的细胞质尾区、跨膜区和胞外区可替换RSV克隆的相同基因、RSV克隆中的不同基因或RSV基因组或反基因组中的非编码序列中对应基因片段。在一个实施方案中，来自HPIV3的HN或F的基因片段替换RSV类型A中的对应基因片段，来产生编码嵌合蛋白的构建体，嵌合蛋白例如为，具有一个细胞质尾区和/或融合于RSV胞外区来产生新减毒病毒、和/或抗PIV和RSV二者的多价疫苗的RSV的跨膜区的融合蛋白。
除了上述的对重组RSV的修饰外，可在RSV克隆中进行不同的或其它的修饰来促进操作，例如在不同的基因间隔区或其它地方插入独特的限制性位点(例如，G和F之间的独特的Stul位点)。也可去除非翻译基因序列来增加用于插入外源序列的能力。
在本发明的另一个方面，提供了一种组合物(例如，经分离的多核苷酸和引入了嵌合RSV编码性cDNA的载体)用于生产经分离的感染性嵌合RSV。通过这些组合物和方法，感染性的嵌合RSV被产生自嵌合RSV基因组或反基因组，核壳(N)蛋白，核壳磷蛋白(P)，大(L)聚合酶蛋白，和RNA聚合酶延伸因子。在本发明的相关方面，提供了组合物和方法来导入上述结构和表型变化到重组嵌合RSV来产生感染性的减毒疫苗病毒。
通过一些公知的方法，可以将前面所限定的突变导入到一个感染性嵌合RSV克隆中。“感染性克隆”是指cDNA或其产物(合成或通过其它途径获得)，其可以被转录到能够作为模板来产生感染性病毒或亚病毒颗粒的基因组的基因组或反基因组RNA中。因此，限定的突变可通过常规的技术(例如，定点诱变)被导入基因组或反基因组的cDNA拷贝中。利用反基因组或基因组cDNA亚片段来装配在此描述的完整反基因组或基因组cDNA具有一个优点，其每个区域可被分开独立操作(小cDNA比大cDNA更容易操作)且然后被很容易的装配到一个完整的cDNA中。因此，完整的反基因组或基因组cDNA，或其任意的亚片段，可被用作模板来直接寡核苷酸诱变。此可以通过单链噬菌粒形式的中间体，例如使用Bio-Rad Laboratories的
Figure C00806217D00571
试剂盒(Richmond，CA)或用双链质粒直接作为模板例如Stratagene的Chameleon诱变试剂盒(La Jolla，CA)的方法，或通过利用含有目的突变的寡核苷酸引物的聚合酶链式反应。突变的亚片段可然后被装配到完整的反基因组或基因组cDNA中。其它的各种诱变技术是已知的且可被用于产生RSV反基因组或基因组cDNA中的目的突变。可以从单核苷酸变化到含一或更多基因或基因组区域的大cDNA片段进行突变。
因此，在一个实施方案中，突变通过利用来自Bio-Rad的Muta-基因噬菌粒体外诱变试剂盒被导入。简言之，将编码RSV反基因组或基因组部分的cDNA克隆到质粒pTZ18U中，并被用于转化CJ236细胞(Life Technologies)。噬菌粒的制备按照生产商的建议，寡核苷酸被设计成能通过在反基因组或基因组的目的位置导入改变的核苷酸而诱变。含有遗传改变的反基因组或基因组片段的质粒然后被扩增且突变的部分被再导入到全长基因组或反基因组克隆中。
导入限定的突变到感染性RSV中的能力已有很多应用，包括RSV分子生物学和致病机理的分析。例如，RSV蛋白包括NS1、NS2、SH、M2(ORF1)和M2(ORF2)蛋白的功能，可通过导入消除或降低其表达的水平或其产生突变蛋白的突变来研究和操纵。在下面一个示范实施方案中，构建重组的RSV，其病毒基因(称为SH基因)的表达通过mRNA编码序列和侧翼转录信号的缺失被消除。令人吃惊的是，不但此病毒能回收，而且其在组织培养生长效率高。事实上，其生长能力基于在感染性病毒的产量以及噬斑大小大体上超过野生型。此种来自SH缺失以及其它的本发明的RSV衍生体的在组织培养物上改进的生长为开发RSV疫苗提供了有用的工具，其克服了RSV生长较差的问题，在其它系统中疫苗病毒的产生较为复杂。这些缺失高度稳定地抗遗传反转，使得由此获得的RSV克隆特别有用于作为疫苗制剂。
本发明也提供了用于生产来自一或多个经分离的多核苷酸例如一或多个cDNA的感染性嵌合RSV的方法。依据本发明，编码RSV基因组或反基因组的cDNA被构建，在细胞内或体外与必要的病毒蛋白一起共表达来形成感染性RSV。“RSV反基因组”是指经分离的正义多核苷酸分子，其作为模板用于子代RSV基因组的合成。优选的，cDNA被构建为对应于复制中间体RNA的RSV基因组或反基因组的正义形式，使得与编码产生转录、复制性核壳必需的蛋白的完整序列例如编码N、P、L和M2(ORF1)蛋白的序列的正义转录物杂交的可能性最小。在RSV微基因组系统中，无论被RSV或被质粒补充，基因组和反基因组在拯救上是同样活跃的，表明了基因组或反基因组可被利用且因此此选择可被用于方法或其它地方。
天然RSV基因组一般含有负义多核苷酸分子，其通过该分子互补的病毒mRNAs编码11种病毒蛋白，即，非结构类NS1和NS2、N、P、基质蛋白(M)、小疏水的蛋白(SH)、糖蛋白(G)、融合蛋白(F)、(ORF1)、M2(ORF2)和L，大体上如描述在Mink等，Virology185：615-624(1991)；Stec等，Virology 183：273-287(1991)；以及Connors等，Virology 208：478-484(1995)，每一个引入本文作为参考。为了实现本发明的目的，本发明的重组RSV的基因组或反基因组仅需要含有这些对于赋予由其编码的病毒或亚病毒感染性所必需的基因或其片段。此外，基因或其部分可通过不止一个多核苷酸分子被提供，即，一个基因可通过来自经分离的核酸分子的互补物或类似物被提供。
“重组RSV”是指直接或间接来自重组表达系统或繁殖自由此产生的病毒或亚病毒颗粒的RSV或RSV类似病毒或亚病毒颗粒。重组的表达系统利用含有包括至少一个遗传元件或在RSV基因表达中具有调控作用的元件的可操作连接转录单元的重组的表达载体。所述元件例如，一个启动子，一个被转录到RSV RNA中的结构或编码序列，以及合适的转录启动和终止序列。
为了从cDNA表达的基因组或反基因组产生感染性的RSV，基因组或反基因组与这些对于(i)产生能够RNA复制的核壳，以及(ii)产生能够进行RNA复制和转录的子代核壳所必需的RSV蛋白一起共表达。基因组核壳的转录提供了其它的RSV蛋白以及启动有效感染。可选择的，有效感染必需的其它RSV蛋白可通过共表达来补充。
RSV反基因组可被构建用于本发明中，通过例如，装配克隆的cDNA片段，提供完整的反基因组，通过RSV mRNA或基因组RNA的逆转录拷贝的聚合酶链反应(PCR；描述在，例如，U.S.专利No.4,683,195和4,683,202，和PCR协议：方法和应用指南(PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications)，Innis等编辑，学院出版社，SanDiego(1990)，引入本文作为参考)。例如，含有来自合适启动子以及互补于SH基因的前导区(例如，T7RNA聚合酶启动子)的反基因组的左手末端的cDNA，被装配在合适的表达载体中，例如一个质粒(例如，pBR322)或各种可获得的装配型质粒、噬菌体或DNA病毒载体中。可通过诱变和/或插入含有独特的被设计用于促进装配的限制性位点的合成多接头中来修饰载体。例如，一个在此描述的质粒载体，通过用含有适当的限制性酶位点的合成DNA替代PstI-EcoR1片段而获自pBR322。pBR322作为载体的应用稳定了RSV序列的3716-3732核苷酸，其保留了核苷酸缺失或插入，且质粒的繁殖是在细菌株DH10B中避免了人为的复制和在核苷酸4499附近的插入。为了易于制备，G、F和M2基因可被装配在一个经分离的载体中，同样可以是L和尾区序列。反基因组质粒的右手末端(例如，L和尾区序列)可含有其它的目的序列，例如侧翼核酶和串联的T7转录终止子。核酶可为锤头状(例如，Grosfeld等，J.Virol.69：5677-5686(1995))，其能够产生含有一个单非RSV核苷酸的3′末端，或可为任意其它合适的核酶例如丁型肝炎病毒的核酶(Perrotta等，Nature 350：434-436(1991))其能够产生无非RSV核苷酸的3′末端。一个中等片段(例如，G-到-M2部分)被插入到依次为L-尾区-核酶-终止子的受体的前导-到-SH质粒的合适的限制性位点中，产生一个完整的反基因组。在此描述的一个实例中，前导末端被构建来毗邻包括三个决定最佳活性的转录G残基的T7RNA聚合酶的启动子，转录使这些三个非病毒G加到反基因组的5′末端。这三个非病毒G残基可被缺失来产生无非病毒核苷酸的5′末端。为了产生正确的3′末端，尾区末端被构建邻近于锤头核酶，其在裂解后将单一的3′-磷酰化U残基加到编码的RNA的3′末端。
在本发明的特定的实施方案中，编码产生转录、复制RSV核壳所必需的蛋白的互补序列被一或多个辅助病毒所提供。这样的辅助病毒可以是野生型或突变体。优选的，辅助病毒可以与RSV cDNA编码的病毒中在表型上区别开。例如，人们期望提供与辅助病毒而不与RSV
cDNA编码的病毒进行免疫反应的单克隆抗体。此种抗体可以是中和抗体。在一些实施方案中，抗体可以被用在亲合色谱层析中来从重组病毒中分离辅助病毒。为了获得这种抗体，突变可以被导入到RSV
cDNA中来提供与辅助病毒不同的抗原差异，例如在HN或F糖蛋白基因中。
可以在RSV基因组或反基因组中导入多种核苷酸插入和缺失来产生减毒、嵌合的克隆。野生型人RSV(15222个核苷酸)基因组的核苷酸长度为6的倍数，副粘病毒和麻疹病毒属典型地符合“6倍数规则”，例如，只有当核苷酸的长度是6的倍数时基因组(或微基因组)才有效地复制(被认为是对应于包壳NP蛋白的核苷酸的精确间距所必需的)。单个碱基的增加导致的RSV基因组长度的变化对于复制的效率没有影响，且一些不同的微基因组突变体传代后的序列分析表明长度的差异被保持且无代偿的变化。因此，RSV没有基因组长度为严格6倍数的要求，且可以在RSV基因组或反基因组中产生核苷酸插入和缺失而不会使得本发明的重组RSV的复制失败。
可选择的构建编码RSV基因组或反基因组的cDNA的方法包括利用改进的PCR条件(例如，描述在Cheng等，美国国家科学院学报91：5695-5699(1994)；Samal等，J.Virol.70：5075-5082(1996)，其均引入本文作参考)逆转录PCR来减少亚基cDNA组件的数目到一或两个。在另一个实施方案中，不同的启动子(例如，T3，SP6)或不同的核酶(例如，丁型肝炎病毒的核酶)可被使用。不同的载体(例如，装配型质粒)可被用于增殖来更好的适应大尺寸的基因组或反基因组。
RNA复制所必需的N、P和L蛋白需要RNA聚合酶延伸因子例如M2(ORF1)蛋白来用于连续的转录。因此，M2(ORF1)或对于负链RNA病毒大体上相等的转录延伸因子是感染性RSV的产生所要求的且是功能性核壳产生有效感染的过程中的必需组分。
对M2(ORF1)的需求与其作为转录延伸因子的作用是一致的。对负链RNA病毒的RNA聚合酶延伸因子蛋白的表达的需求是本发明的一个特征。通过完整M2基因的表达或通过嵌合基因组或反基因组或通过共表达，M2(ORF1)可被添加，尽管在后种形式中，第二ORF2也可被表达且具有对RNA复制的抑制作用。因此，为了使用完整的M2基因生产感染性病毒，两个ORF的活性将被平衡来允许M(ORF1)的充分表达提供转录延伸因子而没有如此多的M(ORF2)来抑制RNA复制。可选择的，从工程改造除去ORF2的或编码缺陷ORF2的cDNA来获得ORF1蛋白。病毒生产的效率也可通过其它病毒蛋白基因例如编码包膜组件(即，SH、M、G、F蛋白)的基因的共表达被改进。
经分离的编码RSV基因组或反基因组和(单独地或同时地)N、P、L和M2(ORF1)蛋白的多核苷酸(例如，cDNA)通过转染、电穿孔、机械插入、转导等被插入到能够延长RSV有效感染的细胞例如HEp-2、FRhL-DBS2、MRC和Vero细胞中。经分离的多核苷酸序列的转染可被导入到培养细胞中，例如，通过磷酸钙介导的转染(Wigler等，Cell 14：725(1978)；Corsaro和Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603(1981)；Graham和Van der Eb，Virology 52：456(1973))，电穿孔(Neumann等，EMBO J. 1：841-845(1982))，DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wileyand Sons，Inc，NY(1987)，阳离子脂质介导的转染(Hawley-Nelson等，Focus 15：73-79(1993))或商业上可获得的转染剂例如
Figure C00806217D00621
(Life Technologies)(每个上述的参考文献引入本文作为参考)。
N、P、L和M2(ORF1)蛋白通过一或多个其可是与编码基因组或反基因组的载体相同或不同的表达载体及其不同组合被编码。其他的蛋白可被包括，如所期望的，由其自己的载体或编码N、P、L或M2(ORF1)蛋白和/或完整的基因组或反基因组的载体编码。基因组或反基因组以及来自转染的质粒的蛋白的表达可被获得，例如，通过每一个在被T7RNA聚合酶的表达系统通过感染、转染或转导来供给的T7RNA聚合酶的启动子调控下的cDNA，所述表达系统例如一个表达T7RNA聚合酶的疫苗病毒MVA毒株重组体(Wyatt等，Virology，210：202-205(1995)，引入本文作为参考)。也可从转化的哺乳动物细胞或通过预形成的mRNA或蛋白的转染来提供病毒蛋白和/或T7 RNA聚合酶。
可选择的，反基因组或基因组的合成可体外(非细胞的)在联合的转录-翻译反应中进行，然后通过转染到细胞中。或反基因组或基因组RNA可被体外合成并转染到表达RSV蛋白的细胞中。
为了筛选本发明的候选嵌合疫苗病毒，通过已知的方法测定生存力、减毒和免疫原性。本发明的最期望被用在疫苗中的病毒必须保留存活能力，具有稳定的减毒表型，在免疫宿主中表现复制(尽管在较低的水平)，以及在能充分赋予抵抗对由野生型病毒感染引起的不同疾病的保护的疫苗中有效地启动免疫应答。显然，迄今已知和报道的所有RS病毒突变体都不能满足这些条件。实际上，与基于报道已知减毒RSV的结果的期望相反，本发明的病毒不仅比以前的突变体有活力和更为减毒，而且比这些以前研究的突变体在体外更遗传稳定—保留了刺激保护性免疫应答的能力以及在一些实例中扩展了由多重修饰赋予的保护，例如诱导抗不同病毒毒株或亚型的保护，或通过不同免疫学基础的保护，例如，对血清免疫球蛋白的分泌，细胞免疫性等。在本发明之前，ts表型在体内复制的遗传不稳定性已成为ts病毒的规律(Murphy等，Infect.Immun.37：235-242(1982))。
为了繁殖RSV病毒用于疫苗和其他的目的，大量的允许RSV生长的细胞系被应用。RSV生长在各种人和动物细胞中。用于繁殖减毒RS病毒用于疫苗应用的优选的细胞系包括DBS-FRhL-2、MRC-5和Vero细胞。最高的病毒产量经常是通过上皮细胞系例如Vero细胞来获得。典型的细胞被用病毒以从大约0.001到1.0或更高的感染复数接种，并且被培养在允许病毒复制的条件下，例如大约30-37℃培养3-5天，或在足够使病毒达到充分的滴度的条件下。病毒被从细胞培养物中移出并与细胞组分分开，典型的是通过公知的纯化方法，例如，离心，且可利用本领域公知的方法进行进一步的目的纯化。
此处所描述的被减毒的嵌合RSV可通过多种公知的和体内和体外普遍接受的模型检测来证实充分的减毒，对表型反转的抗性，和用于疫苗应用的免疫原性。在体外的方法中，被修饰的病毒(例如，多重减毒的、生物学上获得的或重组的RSV)被用于病毒复制的温度敏感性即ts表型和小噬斑表型的检测。很多种动物模型已被描述并被概述于Meignier等编辑，呼吸道合胞病毒感染的动物模型，MerieuxFoundation Publication，(1991)，其被引入本文作为参考。RSV感染的棉鼠模型被描述于U.S.4,800,078和Prince等，病毒研究(Virus Res.).3：193-206(1985)，其被引入本文作为参考，且被认为预示了在人和非人灵长类动物中的减毒和效力。此外，利用黑猩猩的RSV感染的灵长类模型预示了用于人的减毒和效力，如具体描述在Richardson等，J. Med.Virol.3：91-100(1978)；Wright等，Infect.Immun.37：397-400(1982)；Crowe等，Vaccine 11：1395-1404(1993)，每一个被引入本文作为参考。
来自啮齿类和黑猩猩的与RSV候选株的减毒水平相关的相关数据可通过参考附图1来证明，附图1是一个显示呼吸道合胞亚型A病毒在小鼠的肺中复制与在黑猩猩中的复制的相互关系的曲线图。复制的相对水平与wt RSV的相比大体上相同，使得允许小鼠作为一个模型来初步分析候选疫苗减毒水平的特征。小鼠和棉鼠的模型在那些候选RS病毒在黑猩猩中不能充分生长的情况下是特别有用的。
而且，RSV中和抗体在感染的棉鼠中的治疗效果表现出与随后进行的RSV感染的猴和人的免疫治疗实验高度相关。实际上，棉鼠是受感染猴、黑猩猩和人用RSV中和抗体作免疫治疗观察应答反应的可靠的实验代用品。例如，与棉鼠中治疗效果有关的RSV中和抗体的量(由被治疗动物的血清中这些抗体的水平确定)(即血清RSV中和滴度为1：302-1：518)与猴(即滴度为1：539)或婴幼儿(即1：877)的范围相同。棉鼠中的治疗效果表现为肺中病毒滴度减低100倍或更高(Prince等，J.Virol.61：1851-1854)，而猴中的治疗效果观察到肺病毒滴度降低50倍。(Hemming等，J.Infect.Dis.152：1083-1087(1985))。最后，在患严重RSV细支气管炎和肺炎住院的婴幼儿中治疗效果表现为，治疗组中氧合作用显著增加和经治疗患者的上呼吸道中可回收的RSV量大大降低。(Hemming等，Antimicrob.Agents Chemother.31：1882-1886(1987))。因此，根据这些研究，棉鼠是预示RSV疫苗成功用于婴幼儿的有关模型。其它鼠类，包括小鼠，也同样适用，因为这些动物允许RSV复制，并且体内温度更接近人类(Wright等，J.Infect.Dis.122：501-512(1970)和Anderson等，J.Gen.Virol.71：(1990))。
依照前面所述的并基于下面的实施例，本发明提供了用于疫苗的经分离的感染性嵌合RSV组合物。作为疫苗组分的减毒嵌合病毒为经分离的和典型的纯化的形式。“经分离的”是指所述RSV其不是在野生型病毒的自然环境的，例如感染个体的鼻咽中。更具体的，经分离的是指包括作为细胞培养物或其他人工培养基的组分的减毒病毒。例如，本发明的减毒RSV可通过感染的细胞培养物来产生，分离自细胞培养物并被添加到一个含有其他非天然产生的RSV的稳定剂中，例如那些被选择通过中和单克隆抗体对F蛋白的抗性的方式来减毒。
本发明的嵌合RSV疫苗含有如在此所述产生的RSV的免疫有效量的有效组分。生物学上获得的重组RSV可被直接应用在疫苗制剂中，或冻干。冻干的病毒将典型的被保存在大约4℃。当准备使用时，冻干的病毒在稳定剂中重建，稳定剂例如为盐水或含SPG、Mg++和HEPES，有或没有佐剂，具体地描述如下。用生理上可接受的载体和/或佐剂，生物学上获得的或重组修饰的病毒可被导入宿主。有用的载体是本领域公知的，包括，例如水，缓冲水，0.4％生理盐水，0.3％甘氨酸，透明质酸以及其它类似的。产生的水溶液可被包装来使用，或冻干，冻干的制剂与如上所述的无菌水在给药前混合。组合物可含有药理学上可接受的接近生理条件必需的辅助物质，例如pH调整和缓冲剂、渗涨度调节剂、润湿剂以及类似的物质，例如、醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、单月桂酸脱水山梨糖醇、油酸三乙醇胺等。可接受的佐剂包括不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾，其均为本领域公知的物质。优选的佐剂包括StimulonTM QS-21(AquilaBiopharmaceuticals，Inc，Farmingham，MA)，MPLTM(3-0-脱酰单磷酰基脂质A；RIBI ImmunoChem Research，Inc，Hamilton，MT)，和白介素-12(Genetics Institute，Cambridge，MA)。
用嵌合RSV疫苗组合物的免疫如此处所述通过气雾剂、滴剂、口服、局部或其它的途径进行，之后宿主的免疫系统通过产生对一或多个RSV病毒蛋白的特异性抗体对疫苗产生应答，例如，F和/或G糖蛋白。接种宿主的结果为对RSV感染的至少部分或完全免疫，或对中度或严重疾病尤其是下呼吸道疾病的抗性。
本发明的嵌合RSV疫苗可含有启动免疫应答来抵抗单一RSV或抗原亚型例如A或B或抗多个RSV毒株或亚型的减毒嵌合病毒。在此文中，嵌合RSV可启动单特异性免疫应答或多特异性免疫应答抗多个RSV毒株或亚型。可选择的，具有不同免疫原性特性的嵌合RSV可被结合在疫苗混合物中或在协同治疗中单独给药来启动更有效地抗一个有效的RSV毒株，或抗复合RSV毒株或亚型。
被给予疫苗的宿主可为任意易受RSV或非常相关的病毒感染的且能够产生对疫苗病毒的抗原的保护性的免疫应答的哺乳动物。因此，合适的宿主包括人、非人灵长目动物、牛、马、猪、绵羊、公山羊、兔、啮齿动物等等。相应地，本发明提供了生产人用或兽用疫苗的方法。
含有本发明减毒嵌合RSV的疫苗组合物被以“免疫有效量”给药于易受或具有RS感染危险的患者，“免疫有效量”是对于诱导或增强个体的抗RSV的免疫应答能力是充分的剂量。在人受体的情况下，本发明的减毒病毒被给药，通过恰当的既定人RSV疫苗协议，如描述在例如Wright等，Infect.Immun.37：397-400(1982)，Kim等，Pediatrics 52：56-63(1973)，以及Wright等，J.Pediatr.88：931-936(1976)，其引入本文作为参考。简而言之，成年人和小孩通过滴剂被鼻内接种免疫有效量的RSV疫苗，一般在0.5ml的生理学上可接受的稀释剂或载体中。其与非复制疫苗非肠道免疫相比具有简单和安全的优点。也提供了局部呼吸道免疫的在抵抗RSV中起到重要的作用的直接刺激。此外，此种接种的方式有效地避开RSV特异性的来自母亲血清的抗体的免疫抑制作用。同时，RSV抗原的非肠道给药可有时与免疫病原性并发症相关联，其在活病毒中从未被观察到。
在所有的受治疗者中，嵌合RSV疫苗给药的精确剂量以及时间选择以及重复给药将基于患者的健康和体重的状态、给药的方式、组合物的特性被测定。剂量通常每患者103到大约106或更高的噬斑形成单位(PFU)，更一般地为每患者104到105 PFU病毒。在任意情况下，疫苗制剂将提供对有效刺激或诱导抗RSV免疫应答充分的本发明的减毒RSV的量，例如，可通过补体活化法、噬斑中和和/或酶联免疫法以及其它的方法被检测。在这点上，还监测个体的呼吸道疾病的症状。当给药于黑猩猩时，减毒病毒在接种者的鼻咽中的生长与野生型病毒相比在水平上大约10％或更低，或与不完全减毒RSV相比大约10％或更低。
在新生儿和婴儿中，需要多次给药以引发足够水平的免疫。给药应当从出生的第一个月开始，在整个儿童时期间隔给药，例如在2个月、6个月、1岁和2岁时，这是维持充分的抗天然(野生型)RSV感染保护水平所必需的，同样，特别易受反复或严重的RSV感染的成年人，例如医务人员、护理人员、幼儿的家庭成员、老年人、心肺功能衰弱的人可能需要进行多次免疫，以建立和/或维持保护性免疫应答。诱导出的免疫性水平可通过测定中和性分泌和血清抗体的量来进行监测，并按照需要调整剂量或重复接种疫苗，以维持所需水平的保护力。另外，不同的人群可给药不同的疫苗病毒。例如，表达细胞因子或富含T细胞抗原决定簇的附加蛋白的工程化RSV株特别适用于成年人而不是儿童。根据本发明制得的RSV疫苗可以与表达RSV的其它亚型或株的抗原的病毒结合，以实现抗多种RSV亚型或株的保护性。例如这些株的保护性抗原决定簇可以工程化插入一个如上所述的RSV克隆中。
通常是混合不同的病毒并同时给药，但是也可分开给药。例如，由于两个RSV亚型的F糖蛋白只有约11％的氨基酸序列不同，因此该相似性是交叉保护性免疫应答(在用RSV或F抗原免疫并用异源株攻击的动物中发现)的基础。因此，用一株免疫可抵抗相同或不同亚型的不同株。
本发明的疫苗会产生免疫应答，当个体在此后被野生型RSV感染时，该免疫应答可以抵抗严重的下呼吸道疾病，例如肺炎和细支气管炎。尽管天然传播病毒仍能引起感染，尤其是上呼吸道感染，但是由于疫苗接种鼻液溢的可能性大大降低，且可能会增加对此后野生型病毒感染的抵抗力。在疫苗接种后，由宿主产生了可检测水平的能在体外和体内中和同源(相同亚型)野生型病毒的血清和分泌型抗体。在许多情况下，宿主抗体也能中和不同的非疫苗亚型的野生型病毒。
与人体内天然生长的野生型病毒相比，本发明的减毒RSV表现出毒力有非常显著地降低。嵌合病毒是充分减毒的，以致于在大多数免疫个体中没有出现感染症状。在一些情况下，减毒病毒仍能传染给未接种疫苗的个体。然而，它的毒力被充分去除，这样在接种疫苗的或偶见的宿主中均不会发生严重的下呼吸道感染。
疫苗病毒的减毒水平可以这样来确定：例如，测定存在于免疫宿主呼吸道中的病毒的量，将该量与野生型RSV或作为候选疫苗株评价的其它减毒RS病毒产生的量比较。例如，与野生型病毒的复制水平相比，本发明的减毒病毒在高度易感的宿主(如黑猩猩)上呼吸道中复制的限制程度更高(例如复制减少10-1000倍)。同样，减毒RSV疫苗株在黑猩猩上呼吸道中的复制水平应低于以前已经证明在血清抗体阴性婴儿中有不完全的减毒性的RSV A2 ts-1突变株的复制水平。为了进一步减少鼻液溢的产生(与病毒在上呼吸道中的复制有关)，理想的候选疫苗病毒应当在上呼吸道和下呼吸道中均有受限制的复制水平。然而，本发明的减毒病毒对人必须有足够的感染性和免疫原性以赋予接种疫苗者保护力。用于测定受感染宿主鼻咽中的RS病毒水平的方法是文献中熟知的。样品通过吸取或洗出鼻咽分泌物获得，并通过实验方法定量组织培养物中的病毒。参见Belshe等，J.Med.Virology1：157-162(1977)，Friedewald等，J.Amer.Med.Assoc.204：690-694(1968)；Gharpure等，J.Virol.3：414-421(1969)；以及Wright等，Arch. Ges.Virusforsch.41：238-247(1973)。病毒可在宿主动物(黑猩猩)鼻咽中被方便地测定。
在一些情况下，希望将本发明的RSV疫苗与诱导抗其它传染因子的保护性应答的疫苗，尤其是其他儿童期病毒结合。例如，本发明的RSV疫苗可以与副流感病毒疫苗同时给药，如Clement等，在J.Clin. Microbiol.29：1175-1182(1991)中所述的，引入本文作为参考。在本发明的另一方面，通过将编码那些保护性抗原的序列导入(用来产生感染性RSV)的RSV基因组或反基因组中(如本文所述)，可将嵌合RSV用作其它呼吸道病原体例如副流感病毒的保护性抗原的载体。
本发明还有一个方面是将嵌合RSV用作呼吸道的瞬时基因治疗的载体。根据这一实施方案，嵌合RSV基因组或反基因组插入一个能编码感兴趣基因产物的序列，目的基因产物受到与控制RSV表达的启动子相同或不同的启动子的控制。通过共表达重组RSV基因组或反基因组与N，P，L和M2(ORF1)蛋白，以及含有编码目的基因产物的序列，产生了感染性RSV，将其给药给患者。
给药通常用气雾剂、喷雾或其它局部方式施用到待治疗患者的呼吸道中。嵌合RSV的给药量应足以使所需基因产物的表达达到治疗或预防水平。该方法中给药的典型基因产物例子包括，编码例如特别是用于瞬时表达的基因产物，如白介素-2、白介素-4、γ-干扰素、GM-CSF、G-CSF、红细胞生成素以及其它细胞因子、葡糖脑苷脂酶、苯丙氨酸羟化酶、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶、细胞毒素、肿瘤抑制基因、反义RNA和疫苗抗原。
提供下列实施例用来说明，而不是对本发明的限制。
实施例I
冷传代RSV诱变衍生株的分离和鉴定
本实施例描述了化学诱变不完全减毒的、宿主范围受限制的cpRSV来生产减毒程度更高的衍生性ts和sp突变株，以优选用于RSV疫苗的制备。
制备冷传代RSV(cpRSV)的亲代原种。使Flow Laboratories Lot3131病毒(在人体内不完全减毒的cpRSV亲代病毒)在25℃、MRC-5细胞中传代两次，25℃、在MRC-5细胞中末端稀释(terminally dilute)两次，然后在MRC-5细胞中传代三次，产生诱变用的cpRSV悬液。
使亲代原种在MRC-5细胞、32℃、含浓度为4 x 10-4M的5-氟尿嘧啶的培养基中生长，诱导cpRSV突变。基础研究证明该浓度是最佳的，其依据是，与不含5-氟尿嘧啶的培养基相比，病毒滴度降低100倍。然后在维持生长在琼脂铺层的Vero细胞上通过噬斑测定进行分析，在培育适当时间间隔后，用中性红染料对噬斑进行染色。挑取854个噬斑，使每个噬斑的子代分别生长在新鲜的单层Vero细胞上进行增殖。当Vero细胞的致细胞病变效应达到最大时，分别收获每个接种了cpRSV诱变病毒单个噬斑子代的各个组织培养物。在32℃和38℃下在Hep-2细胞上对这些噬斑库进行滴定，选出表现出温度敏感性(ts)或小噬斑(sp)表型的子代病毒。进一步对所有有SP表型(与亲代病毒相比，32℃时的噬斑大小减少50％或更多)或ts表型(与32℃时的相比，在限制性温度[37℃—40℃]下的滴度减少100倍或更多)的病毒进行评价。使这些病毒株在Vero细胞上连续经噬斑纯化三次进行生物克隆，然后在Vero细胞上扩增。在32℃、37℃、38℃、39℃和40℃下滴定克隆株(用噬斑形成效率(EOP)试验)，以确认sp和ts表型。由于一些克隆病毒株甚至在允许温度(32℃)下的滴度也相当低，因而使这些病毒在HEp-2细胞中传代一次，以产生病毒悬液用于体外分析。诱变的cpRSV子代的表型列在表1中。
表1 冷传代RSV的9个衍生株(cpts或cpsp突变体)在HEp-2细胞中允许和限制温度下的噬斑形成效率
1截止温度定义为观察到噬斑滴度降低100倍或更多的倍数最低限制温度(表中的粗体表示)
*小噬斑表型(小于野生型噬斑大小的50％)
**微小噬斑表型(小于野生型噬斑大小的10％)
一个突变株子代有小噬斑表型，RSV cpsp143(sp指小噬斑(sp)表型)，其余的突变株子代有ts表型。RSV cpts突变株在体外培养单层上37-40℃范围内产生噬斑的能力有所不同，cpts368保留了在40℃下形成噬斑的能力，而温度最敏感(ts)病毒cpts248不能在38℃下形成噬斑。因此，一些诱变的cpRSV子代在噬斑形成的温度敏感性方面明显与其cpRSV亲代病毒不同。
小鼠中的复制和遗传稳定性研究
下面研究了BALB/c小鼠上呼吸道和下呼吸道中cpRSV衍生的突变株的复制水平(表2)。发现cpts530和cprs248这两个温度敏感性最高(见表1)的突变株，其在小鼠鼻甲中的复制限制程度在约7-12倍之间(表2)。然而，没有一种病毒与cpRSV亲代病毒相比在肺中的复制受到限制。这种鼻甲中的复制比肺中的复制更受限制的特征不是tsRSV突变株的特征，而tsRSV通常是在温度较高的下呼吸道中的复制更受限制(Richmaa和Murphy，Rev.Infect.Dis.1：413-433(1979))。肺和鼻甲中产生的病毒保留了原来病毒的ts特征(数据未列出)。本发明显示了，将ts突变结合到cp亲代病毒的突变背景中导致产生cpRSV的ts子代，该子代在体内复制后的ts表型稳定性比以前研究的ts突变株所观察到的更高。
为了进一步研究cpRSV衍生突变株的ts表型的遗传稳定性水平，研究温度最敏感的两个诱变cpRSV子代(即cprs248和cpts530)在裸鼠肺和鼻甲中的病毒噬斑形成效率。选择裸鼠是因为其先天性缺少功能性T细胞而丧失免疫功能，因此在这些宿主中病毒可复制很长时间。这种更长时间的复制有利于产生表型改变的病毒突变株。鉴定第12天时的病毒(注意，在正常的小鼠中，在这一时间不再检测到有病毒)，发现保留了未变化的ts表型(表3)。如所预计的，测试中作为阳性对照的ts-1突变株在体内表现出不稳定的ts表型。因此，与以前在啮齿类中对ts突变株病毒的评价相反，结果表明延长在小鼠内的复制后，获得了cpRSV衍生突变株的ts表型的高水平稳定性，这表明在本发明的病毒中有着显著的、以前从未获得的、非常需要的特性。
表2 cpts和cpsp—RSV突变株在BALB/c小鼠1中的复制32℃下的病毒滴度
(8个动物组织的log10phf/g组织平均值±标准误差)
                             第4天             第5天
Figure C00806217D00731
1在第0天从鼻内给予小鼠106.3p.f.u的0.1ml接种物，然后在第4或5天杀死。
Figure C00806217D00741
在黑猩猩中
然后在血清阴性的非常接近人类的宿主黑猩猩中评价cpRSV ts衍生株的减毒水平。黑猩猩或枭猴中的实验按照Richardson等，J.Med. Virol.3：91-100(1979；Crowe等，Vaccine 11：1395-1404，1993))中描述的常规步骤来进行，这些内容引入本文作为参考。将含有约104噬斑形成单位(PFU)的诱变减毒病毒的1ml悬液鼻内给予每个动物。另一种方法是将RSV以104 PFU的剂量接种到上呼吸道和下呼吸道各部位。每天从黑猩猩中取样，取样10天，然后每隔3-4天取样直至第20天。黑猩猩下呼吸道的取样可按照Snyder等，J.Infect.Dis.154：370-371(1986)和Crowe等，Vaccine 11：1395-1404(1993)中的方法采用气管灌洗。4-6周后一些动物用野生型病毒攻击。每天取鼻咽样品，评价动物呼吸道疾病症状。将鼻液溢评分为从0至4+，2+或更高被认为有明显的上呼吸道疾病。
如上所述从鼻和喉咙擦拭样品以及气管灌洗液分离病毒，接种入RSV-敏感的HEp-2细胞中。也可用HEp-2细胞通过噬斑方法直接测定病毒的量(如Scnitzer等，J.Virol.17：431-438(1976)中所述，这些内容引入本文作为参考)。在给予病毒前和接种后3-4周时收集血清样品，以测定RSV中和抗体(如Mills等，J.Immununol.107：123-130(1970)中所述，这些内容引入本文作为参考)。
研究温度最敏感的和减毒的cpRSV衍生株(cpts248)，并将其与野生型RSV以及cpRSV亲代病毒比较(表4)。与野生型相比，cpRSV亲代病毒在鼻咽中的复制稍有减少，鼻液溢量有所降低，而在下呼吸道中的病毒复制减少600倍左右。很明显，cp病毒在黑猩猩下呼吸道中的复制明显受限制，这是以前在动物或人体内评价cpRSV时没有确定的非常需要的特性。更明显地，cpts248病毒在鼻咽中复制受限制是野生型的10倍，这种受限制伴有鼻液溢的显著减少。这些发现表明，cpRSV衍生的突变株有两个活RSV疫苗非常需要的特性，即在非常易感的血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中均有减毒性的证据。下面评价了在用cpts248免疫的黑猩猩呼吸道中的病毒的遗传稳定性(表5)。呼吸道分泌物中的病毒有ts表型，这可以第8天第3号黑猩猩的病毒检测中看出，该病毒在40℃下的滴度减少100倍，并且在40℃下有小的噬斑表型，这些表明病毒复制仍然是温度敏感性的。它代表了该实验前鉴定的最具遗传稳定的ts突变株。cprs248和cpts530的ts表型稳定性增加反映了cp突变对于提供体内ts表型的突变的遗传稳定性有作用。因此，在cp3131亲代病毒中已有的突变内的ts突变表现出比它们不存在时预计的更具稳定性。该重要性能以前没有观察或报道过。用cpts248感染黑猩猩可诱导高滴度的血清中和抗体和抗F和G糖蛋白的抗体(表6)。很明显，用cpts248免疫可保护动物抵御野生型RSV攻击(表7)，这表明，该突变株可作为有效的疫苗病毒用于与人非常接近的宿主中。
上述发现表明，cpts248病毒有活RSV疫苗所需的许多性能，其包括：1)上呼吸道和下呼吸道中的减毒性；2)在体内复制甚至在免疫抑制动物体内延长复制后，遗传稳定性增加；3)令人满意的免疫原性；和4)显著的抗野生型RSV攻击的保护性。cpts530病毒具有与cpts248相似的噬斑形成温度敏感性，小鼠鼻甲中的相似程度的复制限制性，以及在免疫缺陷裸鼠中的高度遗传稳定性，因此它也可作为RS病毒疫苗株。
表4 cpts—RSV248、cp-RSV或野生型RSV A2在血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中的复制
Figure C00806217D00771
a IN表示只进行鼻内给药，剂量为104p.f.u的1.0ml接种物；IN+IT表示鼻内给药和气管内给药，每处的剂量为104p.f.u的1.0ml接种物。
b 表示感染后回收得到病毒的最后一天。
c 平均鼻液溢评分用在病毒排出的峰值日前后8天的日评分总数除以8表示。最高评分为4；最低评分为0。
d 表明仅在指定日分离得到病毒。
表5 从用cptsRSV248感染的实验动物中获得的最初鼻咽(NP)擦拭或气管灌洗(TL)样品中病毒的遗传稳定性
指定温度下的RSV的滴度(log10pfu/ml)
Figure C00806217D00781
NT＝未测试到
a 从这些黑猩猩的每一初始的含病毒鼻咽擦拭样品或气管灌洗样品中产生分离物(一次传代的病毒悬液，平均滴度log10pfu/ml为4.0)，在32℃、39℃和40℃下测试噬斑形成效率。没有分离物能够在39℃下形成噬斑。黑猩猩3和4的分离物没有用这种方式测试。
b 39℃时的滴度对32℃时滴度的百分数：NP擦拭(第7天)＝0.2％，NP擦拭(第8天)＝6T，TL(第8天)-20％，TL(第10天)＝16％。所有的噬斑只有小噬斑表型；没有发现有野生型大小的噬斑。
c 40℃滴度对32℃滴度的百分数为0.2％。所有噬斑是微小噬斑表型；没有检测到野生型大小的噬斑。
表6 用RSV cpts-248、cpRSV或RSV A2野生型感染的黑猩猩的血清抗体应答
Figure C00806217D00791
表7 用cpts-248免疫黑猩猩诱导出对抗第28天RSV A2野生型病毒攻击的抵抗力
Figure C00806217D00792
*平均鼻液溢评分用在病毒排出的峰值的8天内的评分总数除以8表示。最高评分为4。评分为0表示在10天观察期内从未检测到有任何鼻液溢。
进一步的减毒
由于RS病毒在婴儿下呼吸道中产生了比这些实验研究中所用的1-2年龄黑猩猩更多的病征，而且认为在黑猩猩中有满意的减毒性的突变株在血清阴性婴幼儿中不会有这样的性能，因此对cpts248和530衍生株(具有并不典型的ts突变株在上呼吸道中复制受限制和减毒的性能，以及更高水平的遗传稳定性)进行进一步诱变。
选择体外温度敏感性程度高于cpts248的或具有小噬斑表型的子代病毒，以进行进一步研究。用5-氟尿嘧啶诱变产生具有一个或多个附加ts突变的cpts248突变衍生株(表8)。鉴定比cpts248亲代株更具温度敏感性的ts突变株，其中一些有小噬斑(sp)表型。将这些cpts248衍生株对小鼠给药。在小鼠的上呼吸道和下呼吸道中，cpts248/804、248/955、248/404、248/26、248/18和248/240突变株的复制比其cpts248亲代病毒的复制更受限制(表9)。因此，鉴定得到比其cpts248亲代病毒更减毒的cpts 248活突变株，这些cpts 248的衍生株在小鼠中表现出范围较宽的复制效率，其中cpts 248/26最受限制。小鼠鼻甲和肺中的病毒的ts表型几乎与所给药病毒相同，这表明了遗传稳定性。高度减毒的cpts 248衍生株cpts 248/404病毒在鼻咽中的复制限制程度是野生型的1000倍。有至少三个减毒突变的cpts248/404突变株在四只血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中的复制也高度受限制，而且感染不会引起鼻液溢(表10)。该病毒再一次表现出了比野生型更高的复制受限程度，在鼻咽中减少60000倍，在肺中减少100000倍。因此，随后用RSV野生型病毒攻击的两只黑猩猩有很高的抵抗力(表11)。
用上述相似方式通过化学诱变衍生获得cpts248/404的5个小噬斑突变株。用HEp-2细胞上的32℃噬斑滴定筛选扩增一次的噬斑子代悬液的小噬斑(sp)表型，而且病毒的工作悬液如上所述进行制备。
诱变的cpts248/404病毒的5个噬斑子代表现出稳定的sp表型。每个突变株的截止温度为35℃或更低(表12)，这表明cpts248/404病毒的各个sp衍生株也获得附加的ts突变。在用106.3p.f.u.的cpts248/404的sp衍生株对Balb/c小鼠进行鼻内接种后，在用任何这些sp衍生株接种的小鼠鼻甲中没有检测到病毒。然而，在一个例子中却在肺中检测到较低滴度的病毒。这些结果表明，与野生型RSV相比，在鼻甲中的复制限制大于300倍，在肺中的复制限制大于10000倍。
也进一步获得cpts530病毒的ts衍生株(表13)。如同cpts248衍生株一样，cpts530的衍生株在小鼠体内的复制比cpts530亲代株更受限制。一个突变株cpts-530/1009在小鼠鼻甲中的复制受限制程度为亲代的30倍。该cpts530衍生株在血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中的复制也高度受限制(表14)。在鼻咽中，cpts530的复制受限制程度是野生型的30倍，而cpts530/1009是野生型的100倍。与野生型病毒相比，两种cpts突变株在下呼吸道中均是高度受限制的(20000至32000倍)，甚至当突变株直接接种到气管中时也是如此。同样，先用cpts530/1009、cpts530或cpRSV感染的黑猩猩在鼻咽中也表现出明显的病毒复制受限制，而且在以后用野生型RSV鼻内和气管内联合攻击时也不产生明显鼻液溢(表15)。另外，预先用任一种突变株感染的黑猩猩，显示下呼吸道中有抗野生型攻击病毒复制的完全抵抗力。
根据以前的研究获得的实验结果完全不能预计到这些结果。例如，以前的研究结果表明，从5-氟尿嘧啶一轮诱变衍生得到的RSV ts突变株的体内特性不能事先预测。而且，尽管用这种方式首次获得的四个ts突变株中的一个有与其它突变株相同的噬斑形成截止温度，但是当其在易感活性黑猩猩和易感婴幼儿中进行测试时，其是过度减毒的(Wright等，Infect.Immune.37(1)：397-400(1982))。此表明，ts表型(导致37-38℃的噬斑形成截止温度)的获得并不能可靠地产生具有易感黑猩猩、婴幼儿所需要的减毒水平的突变株。实际上，目前为止已知的ts突变株的研究结果不能提供任何根据来得出这样的结论，即通过冷传代然后连续两轮化学诱变将三个独立的突变(或一系列突变)引入RSV，可以产生活突变株，该突变株保留了对黑猩猩(外推到婴幼儿)的感染活性，并有用于防治RSV病的活病毒疫苗所需的减毒水平、免疫原性和保护效率。
上述结构明显表明，本发明的cpRSV的某些ts衍生株具有令人满意的感染力，并在小鼠和黑猩猩中表现出显著程度的减毒。这些突变株在体内复制后是减毒的，并且在遗传上是高度稳定的。这些突变株也在黑猩猩中诱导出显著的抗RSV感染的抵抗力。因此，这些cpRSV的衍生株是适用于用来防治严重的人RSV疾病的活RSV疫苗的病毒株。
表8 RSV cpts248经附加5-氟尿嘧啶诱变衍生获得的10个突变株的噬斑形成效率
1截止温度定义为在HEp-2细胞中观察到的噬斑滴度降低100倍或更多的倍数时的最低限制温度(表中的粗体字表示)
*小噬斑表型(小于野生型噬斑大小的50％)
**微小噬斑表型(小于野生型噬斑大小的10％)
Figure C00806217D00831
表10 血清阴性黑猩猩的上呼吸道和下呼吸道中cpts-RSV 248/404、cpts-RSV248/18、cpts-RSV248、cp-RSV或野生型RSV A2的复制
Figure C00806217D00841
a IN表示只进行鼻内给药；IN+IT表示鼻内给药和气管内给药。
b 表示感染后回收得到病毒的最后一天。
c 平均鼻液溢评分用在病毒排出的峰值日周围8天的评分总数除以8表示。最高评分为4；最低评分为0。
d 表明仅在指定日分离得到的病毒。
# 这些动物与表4和7中的动物相同。
Figure C00806217D00851
Figure C00806217D00861
Figure C00806217D00871
Figure C00806217D00891
被动获得的血清RSV抗体对黑猩猩中cpts突变株的影响
为了测定被动获得的血清RSV抗体对于本发明各种cpts突变株在黑猩猩体内的减毒性、免疫原性和保护效率的影响，在血清阴性黑猩猩中评价cpts248、cpts 248/404和cpts530/1009的体内复制(表16)，该黑猩猩在免疫前两天输注了RSV免疫球蛋白。将抗体被动地传递人，以模拟婴儿体内环境(婴儿体内有来自母体的RSV抗体)。通过这种方式，就可以评估每个指定突变株在被动RSV抗体存在下的免疫原性，从而确定高度减毒的病毒是否在婴儿中的复制也有如此程度的降低，婴儿有适中或高的被动抗体滴度故防止了诱导产生保护性免疫应答。通过这种方式也可确定在被动获得的抗体存在下抗体应答免疫的特征，并可确定抗体应答病毒攻击的程度和功能活性。当将那些动物的感染情况与未输注的血清阴性黑猩猩比较时，鼻咽中的病毒复制水平以及相关的减毒突变株的临床评分并未由于血清RSV抗体的存在而改变，或只有少量改变。相反，被动获得抗体的存在会有效地防止下呼吸道中cpts248的病毒复制。由于其它两个突变株在肺中本来就已高度受限制，因此，不能评价被动抗体对那些突变株的相似作用。
人RSV免疫球蛋白的输注产生了中等高水平的RSV F血清抗体(滴度为1:640-1:1600)以及中和抗体(滴度为1:199-1:252)，但是没能检测到超过背景的相应量血清RSV G抗体(表17)。在用cpts248/404、cpts530/1009或cpts248进行免疫前先输注人RSV抗体的黑猩猩在免疫后42天内与未输注的接种动物在接种后28天时的测试结果相比只产生了十分之一的RSV F抗体和约一半滴度的中和抗体。由于输注的人IgG含有大量的RSV F和RSV中和抗体，因此在42天时血清样品中残余的输注抗体不能与应答免疫接种重新产生的抗体区分开。假定人血清IgG抗体在黑猩猩中的寿命为一半(Prince等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 85：6944-6948)，则在用cpts接种后42天时观察到的F和中和抗体水平要高于预计的剩余输注量。此外，输注抗体的动物免疫接种后产生的RSV G抗体应答确证这些黑猩猩体内建立了对接种的免疫应答反应。
在黑猩猩免疫接种4-6周后用野生型RSV进行攻击。每个动物在其下呼吸道中表现出完全的抵抗力，无论是否在免疫接种前两天输注了人IgG(表18)。未输注的动物产生了抗攻击的适当量的中和抗体应答，或没有产生(表17)。相反，尽管输注后的黑猩猩中病毒复制受到极大地限制，但是它们却一致应答野生型病毒攻击，产生异常高滴度的RSV中和抗体(表17和18)。而且，在抗体存在下进行免疫接种后，最减毒的病毒cpts248/404(病毒复制水平和免疫作用最低)却有最高的攻击后中和抗体滴度(表17)。相反，三组输注动物中接种减毒程度最差的减毒病毒cpts248却有最低的攻击后中和抗体滴度。除了在抗体存在下的免疫接种诱导出的抗体量有所增加外，抗体质量(定义为中和抗体与ELISA F抗体滴度之比)大大超过血清阴性动物中免疫接种作用诱导产生的质量(表17)。输注免疫的动物在攻击后产生的抗体的中和/ELISA F比约比非输注动物中抗体高10-20倍，该现象在所有组中是一致的，无论采用何种突变株来免疫接种(表17)。
在用活病毒疫苗进行免疫接种时，被动获得的抗体的存在可能以三种不同的方式来改变对疫苗的免疫应答。首先，疫苗病毒的复制水平会有显著下降，从而降低免疫原性。这可能是被动获得的RSV抗体限制了疫苗病毒，尤其是最缺陷的突变株的复制，并大大降低它们的免疫原性。这些结果在这里表现为减毒程度最差的突变株(cpts248)在下呼吸道中的复制实际上由于被动获得的血清IgG RSV抗体的存在而被消除；而在上呼吸道的复制看来没有受到明显的影响。测试的减毒程度最低的突变株cpts248在抗体存在下在下呼吸道中的复制受到大于等于200倍的限制(即完全限制)。减毒程度较高的突变株cpts530/1009和cpts248/404在下呼吸道中的复制水平高度受限制，甚至是在血清阴性动物中也是如此。因此，不能检测到被动抗体对病毒复制的明显效果。用三种减毒突变株的每一种进行免疫接种在上呼吸道和下呼吸道均诱导出了抗野生型攻击的高度保护性，无论在免疫接种时是否存在被动获得的RSV抗体。因此，在被动免疫接种的黑猩猩上呼吸道中，疫苗病毒的复制水平足以诱导出与非输注动物中相当的对野生型病毒攻击的高水平抵抗力。
第二，被动抗体可通过降低诱导出的抗体量和功能活性来改变抗感染的免疫应答。由于这个原因，对应答被动抗体存在下活病毒免疫接种的抗体的数量和性质进行分析。免疫接种的、输注的动物在免疫接种后血清ELISA IgG F抗体的滴度比未输注的血清阴性动物的免疫接种后低10倍。在这些动物中，血清RSV中和抗体应答也稍有降低，平均比未输注动物低2倍。由于免疫接种后测得的一些ELEA F和中和抗体是来自输注的剩余抗体，因此由于预先存在的抗体引起的中和抗体和F抗体应答的实际下降可能比表观下降值更显著。而且，所用的人免疫球蛋白制品含有少量的抗RSV G糖蛋白的抗体(表17)。这可通过用候选疫苗病毒感染的黑猩猩体内IgG RSV G糖蛋白抗体应答来表明(petted)。G抗体应答证明至少有4倍或更多的增加，这表明每个被动免疫接种的动物被疫苗病毒感染，包括用不会排出病毒的cpts248/404免疫接种的黑猩猩。对免疫接种的G抗体应答的数量看来不会受被动转移抗体的不良影响。
第三，在被动获得的抗体存在下进行免疫接种的动物，对RSV野生型病毒攻击的抗体应答可以改变。在没有输注抗体存在下进行免疫接种的黑猩猩有显著的抵抗以后RSV攻击的抵抗力。另外，这些动物不能产生对攻击病毒的明显抗体应答。尽管6个输注的免疫接种动物均表现出显著的RSV抗性，但还是发现对攻击有大大增强的抗体应答。在用cpts530/1009或cpts248/404免疫接种的受治疗动物中攻击后F或G抗体水平至少增加10倍，而中和抗体应答增加800倍。这些结果表明，在出生后不久就开始用活的减毒突变株对具有母体抗体的婴儿进行免疫接种会刺激产生有效的抵抗力，并会伴有增强的高质量的二次抗体应答。在没有攻击病毒显著复制时，应答二次感染而产生的增强免疫应答的机理还未知道。免疫接种时血清抗体的存在在允许输注动物中有适量抗体应答免疫接种的同时，也促进了B细胞库的产生，该B细胞库使抗体在以后的RSV攻击时能产生高功能活性。
本文报道的结果是非常显著的，因为第一次表明活的减毒RSV病毒疫苗在动物模型中是有效的，而该动物模型模拟了RSV疫苗目标群体(即具有从母体胎盘传递而被动获得的RSV中和抗体的4-6周龄婴儿)。这一发现的重要性可以从上述事实可明显看出，即被动转移RSV抗体会抑制cpts疫苗的复制、使其没有免疫原性和保护性的这种预计，令人惊奇地并没有得到支持。
Figure C00806217D00941
Figure C00806217D00951
Figure C00806217D00961
实施例II
用冷适应来使cpRSV突变株减毒
本实施例描述了通过在逐渐降低的温度下使株系进一步传代将生长限制突变引入不完全减毒的宿主范围受限制的cpRSV株中，以产生更具令人满意的减毒性的人疫苗用衍生株。
这些冷适应(ca)方法用来在血清阴性儿童体内不完全减毒的cpRSV 3131病毒中进一步引入减毒。
在第一种策略中，如实施例1所述，通过在MRC-5细胞中25℃下传代来制备冷传代RSV A2(cpRSV 3131)(从Flow Laboratories获得)的亲代原种。简单地说，是以≥0.01的感染复数将冷传代病毒接种MRC-5或Vero细胞培养单层中，在下次传代前培育感染的细胞3-14天。使病毒在20-22℃下传代超过20次，以获得更减毒的病毒。迅速传代的方法(一旦有迹象表明病毒复制时(即3-5天)立即传代)优选用来选择能在低温下有效复制的突变株。另外，从非洲绿猴初级肾细胞中分离获得RSV亚型B株(St.Louis/14617/85克隆1A1)，使其在MRC细胞中传代并克隆(lAl-MRC14)，并32-22℃下在MRC-5或Vero细胞中冷传代52次。
第二种策略采用未克隆的亲代cpRSV 3131病毒的生物克隆衍生株。该病毒在牛胚胎肾细胞(BEK)[用来最初获得cpRSV 3131病毒的组织，参见Friedewaid等，J.Amer.Med.Assoc.204：690-694(1968)]中进行生物克隆。然后使克隆的病毒在低温下Vero细胞中每隔10天传代。或者，通过在MRC-5细胞中两次连续末端稀释来克隆cpRSV3131。并在MRC-5或Vero细胞中每隔10天传代一次。
第三种策略包括选择在低温下产生大噬斑的突变株。已经鉴定出在25℃下产生大噬斑的一个RSV 3131衍生病毒，称为噬斑D1。该病毒衍生自cp3131-1(BEK)谱系cp3131-17(BEK)谱系的第三次传代水平(P3)。使P3病毒产生的最大噬斑在32℃下扩增，然后在25℃下再次产生噬斑。再次选择最大的噬斑，扩增，再产生噬斑。在经过5轮后，获得大噬斑的突变病毒D1。D1通过25℃下两轮附加的噬斑到噬斑纯化来生物克隆。
生物克隆病毒D1在25℃下产生了明显比cp3131或野生型病毒A2大的噬斑。这样，依靠25℃下有大噬斑的标准，D1具有冷适应性。噬斑形成效率的研究结果证明，D1不是温度敏感的。在37℃，D1噬斑与野生型RSV或cp3131没有区别，这表明D1在该温度下的生长不受限制。同样，D1在37-40℃(即测试的最高温度)在Vero细胞单层中也产生了广泛的致细胞病变效应。
实施例III
将其它减毒突变引人ts-RSV
本实施例描述了用ts突变株作为亲代病毒，以产生减毒更完全的病毒株。为了该目的，选择两个RSV A2ts突变株，即ts-4和ts-1 NG1。选用两种不同的方法来将附加突变引入RSV ts突变株中。第一种方法是：对不完全减毒的RSV ts突变株进行化学诱变，选择噬斑形成温度更敏感的诱变子代进行进一步的分析。第二种方法是：使RSVts突变株在低温下传代，选择有ca表型的nts突变株，即在亚适温下复制能力高于野生型亲代病毒。
从Flow Laboratories Lot M4的活的呼吸道合胞病毒(A-2)ts-1NG-1突变株、MRC-5中生长的病毒中制备ts-1NG1病毒的亲代原种。该突变株(通过二轮硝基胍诱变从ts-1突变株衍生获得)有两个或多个非依赖型ts突变，但仍会在易感黑猩猩中诱导出显著的鼻液溢。使该病毒在32℃下Vero细胞中传代2次，以产生用于诱变的ts—1NG-1悬液。然后使病毒在4 x 10-4M的5-氟尿嘧啶存在下生长以在复制时诱导其它的突变，或在5-氟尿嘧啶处理后在36℃暴露在5-氮胞苷下。然后在维持在琼脂铺层下的Vero细胞上进行噬斑测定来分析诱变的原种，并在培育适当时间后，用显微镜鉴定噬斑。挑取586个噬斑，使每个噬斑的子代在Vero细胞的新鲜单层上生长来分别扩增。当Vero细胞上的致细胞病变效应达到最大时，分别收获接种有诱变的ts-1 NG-1病毒单个噬斑子代的每个组织培养物。在32℃和36℃下在HEp—2细胞上对这些噬斑库进行滴定，选出比ts-1 NG-1更温度敏感性的子代病毒。进一步对所有温度敏感性高于ts-1 NG-1(即，与32℃时的相比，在限制性温度[36℃]下的滴度减少100 倍或更多)的病毒进行评价。鉴定温度敏感性高于tsRSV ts-1 NG-1亲代病毒的6个噬斑子代，使这些株在Vero细胞上连续噬斑纯化三次来进行生物克隆，然后在Vero细胞上扩增。在32℃、35℃、36℃、37℃和38℃下滴定克隆株(噬斑形成效率(EOP)测定)以确认它们的ts表型。在HEp-2细胞中测定获得噬斑形成效率数掘进一步确认了6个突变栋的表型(表19)。
两个温度最敏感的病毒A-20-4和A-37-8在小鼠中的减毒程度高于它们的ts-1 NG1亲代病毒，这表明温度敏感性的增加伴随有减毒的增强(表20)。这些病毒对小鼠具有感染性，因为它们诱导了抗体应答。对于黑猩猩来说，ts-1 NG1/A-20-4病毒是减毒的(表21)，而且用ts-1 NG1/A-20-4感染黑猩猩可诱导出对野生型病毒攻击的抵抗力(表22)。没有明显的鼻液溢发生。
用ts-1 NG1病毒诱变的相同方法来诱变ts-4病毒。也用冷传代来将突变引入ts-4病毒。在22℃下冷传代43次后，ts-4病毒复制形成高滴度。鉴定6个比RSV ts-4亲代病毒更具温度敏感性的噬斑子代(表23)。Ts-4cp-43在Balb/c小鼠中的复制更受限制(表24)。
表19 ts-1 NG1衍生株的噬斑形成效率
a.3次噬斑纯化
*小噬斑表型(<野生型噬斑大小的50％)
**微小噬斑表型(<野生型噬斑大小的10％)
ND＝未进行
表20 ts-1 NG1亲代和子代病毒在Balb/c小鼠中的复制
a指定组织的log10pfu/g平均值±标准误差。6个动物/组
Figure C00806217D01021
Figure C00806217D01031
表24.RSV ts-4和RSV ts-4 cp-43在Balb/c鼠中的复制1
Figure C00806217D01041
1鼠第0天在轻度麻醉下鼻内给予106.3p.f.u.的剂量，然后在第4天用CO2窒息法处死。
实施例IV
RSV亚型B候选疫苗
本实施例描述了RSV亚型B病毒候选疫苗的开发。本发明用于亚型A突变体开发的相同方法被用于亚型B病毒。野生型B-1RSV病毒亲本原液在Vero细胞中在低温下(20—25℃)冷传代52次，在传代第19到52次时对病毒进行噬斑纯化。对由第52代传代悬浮液衍生的三个克隆进行各自独立的检测，其中一个克隆，命名为RSV B-1cp52/2B5，在棉鼠的上呼吸道和下呼吸道中表现为高度减毒，被选作进一步的检测(表25)。对几个克隆在不同传代水平上所作的检测表明RSV B-1 cp52/2B5突变体保持了几种突变，它们各自导致了相应的减毒表型。在免疫抑制的棉鼠中经过了延长的复制后，RSV B-1 cp52/2B5突变体保留了它的减毒表型(表26)。这种高水平的遗传稳定性的发现，是与它含有3种造成减毒表型的突变相一致的。
在加勒比绿猴(表27和28)和黑猩猩(表29)中进行了对亚型B突变体的进一步检测，使用和亚型A突变体相似的方式。用RSV B-1cp-23或者cp52/2B5免疫的猴子对RSV B-1野生型病毒复制有抵抗性，显示出用RSV B-1野生型病毒的高度减毒衍生物进行感染可以诱导对野生型感染的抗性(表27)。
在血清反应阴性的黑猩猩中的结果和在绿猴中的结果一样，清楚表明RSV B-1 cp52/2B5在上呼吸道和下呼吸道中减毒。
用5-氟尿嘧啶对RSV B-152/2B5突变体作进一步的突变，然后对获得的噬斑在32和38℃筛选ts表型。筛选出的cpts突变体在Vero细胞中经噬斑纯化3次，然后在Vero细胞中扩增2次。结果鉴定出7株RSV B-lcp52/2B5的cpts突变体(表30)，并研究了它们在棉鼠中的复制水平(表31)。其中一个突变体，被命名为cpts 176，被进一步诱变并获得了一系列的突变衍生物，它们比RSV B-1 cpts 176亲本病毒，在体外更具温度敏感性(表32)。
和本发明的亚型A突变体一样，亚型B突变体对棉鼠、猴子和黑猩猩有感染性，并表现出很大程度的减毒作用。尽管在体内是减毒的，RSV B-1 cp突变体病毒在猴子中可诱导对野生型攻击的抗性。RSVB-1 cpts52/2B5病毒的ts突变体被减毒，在棉鼠的鼻咽和肺中表现出比RSV B-1 52/2B5更受限制水平的复制。
表25.在两个单独的实验中RSV B-1野生型和5个由RSV B-1衍生的噬斑纯化的冷传代突变体在棉鼠中的复制。
*通过将实验1中32℃培养10天，实验2中培养7天的Vero细胞单层培养物匀浆进行滴定测定病毒的回收。
**用1055pfu的所示病毒鼻内感染的棉鼠。
nd＝未做
表26.来自RSV B-1 cp52/2B5感染的免疫抑制棉鼠的第14天分离物*和对照相比在棉鼠中的生长。
Figure C00806217D01061
*分离物是通过将免疫抑制的棉鼠第14天的原始鼻甲匀浆液中的病毒经Vero细胞组织培养传代1次而得到的病毒悬浮物。
a8个棉鼠的组是在第0天用0.1ml接种物中所示病毒以105.5pfu感染的。
b()表示从中可测到1.2log10pfu/g或更多病毒的动物的数量。
c()表示从中可检测到1.5log10pfu/g或更多病毒的动物的数量。
表27.RSV A2和RSV B-1野生型和由RSV B-1衍生的两个冷传代突变体相比较在加勒比绿猴中的复制，然后用同源或异源RSV A2或B-1野生型攻击。
Figure C00806217D01071
a动物在第0天进行病毒气管内和鼻腔内感染，每部位均用0.1ml接种物中的105.5p.f.u病毒感染。
b对RSV A-2在HEp-2细胞单层培养物，对RSV B-1和其衍生物在Vero细胞单层培养物进行噬斑试验测定的log10p.f.u/ml滴度。
*只在指定日检测到病毒。
表28.用RSV A2、RSV B-1或B-1 cp衍生株感染，然后一个月后用同源或异源野生型病毒攻击的加勒此绿猴的中和抗体反应。
Figure C00806217D01081
Figure C00806217D01091
Figure C00806217D01101
表31.RSV B-1 cp52/2B5衍生的7个ts突变体在棉鼠中复制水平
Figure C00806217D01111
1第0天在轻度麻醉下用4.5-5.8 log10pfu对棉鼠进行鼻腔内接种，然后在第4天时，用CO2窒息法处死。
2只含有病毒的样品的滴度。括号中显示了含有病毒的样品的比率。
表32 与对照相比，自RSV B-1 cpts 176衍生的14个突变体中的噬斑形成效率
Figure C00806217D01112
**微小噬斑表型(<野生型噬斑大小的10％)
1截止温度定义为观察到噬斑滴度有100倍或更多减少的最低的限制性温度(表中的粗体数字)
为帮助检测和操纵候选RSV B亚型疫苗，测定了完整的野生型B-1病毒的核苷酸序列[SEQ ID NO：2]。这个序列被与减毒的B-1衍生物cp-52/2B5(cp52)相比较，如上所述。序列分析显示了跨越SH和G基因大部的cp52中的大量缺失，两个基因中都没有预测的读码框。更具体来说，cp-52病毒的跨越SH和G基因的大部分区域缺失，只保留了SH基因起始信号和G基因的3’(下游)末端部分和它的基因末端信号。残留的SH：G区域能够编码一个～91个核苷酸的无读码框嵌合转录本。Northern印迹分析表明cp-52有多个含SH：G通读mRNA的多个单一转录本，这与跨越SH：G基因连接的缺失突变是一致的。Western印迹和免疫染色试验证实cp-52病毒不能产生完整的G糖蛋白。除了长片段缺失外，cp-52病毒还含有7个核苷酸变化(表33)，其中5个是编码变化(1个在F基因中，4个在G基因中)，一个是沉默的(F基因)，一个在非编码G：F基因间隔区。重要的是，这个RSV突变体除了缺少SH和G蛋白外，在组织培养中保留了高度的感染性。这些资料显示了一组新的有活力复制的缺失突变体，它提供了开发重组RSV疫苗候选物的另一种或者组合方法。
表33.RSV B1和cp-52的序列比较
Figure C00806217D01121
*正义(+)
+cp-52中跨越SH和G基因的4249-5540位的核苷酸缺失。
**cp-23中的突变。
在cp-52传代过程中不同传代阶段分离的亚型B突变体，依赖于传代水平引入各种cp-52突变(表34)。这部分的亚型B突变体包括RSVB-1 cp-12，RSVB-1 cp-23，RSV B-1 cp-32，RSV B-1 cp-42。表34显示了(作为负义链)在例举的B亚型突变的分布，使得可以对这些所描述的毒株中的突变的减毒效果的特征进行进一步的提炼。例如，cp-23引入了cp-52中的5626，6460，14164和14596位核苷酸的突变(表34)，但是在cp-52中缺失的SH和G基因区与亲本B-1野生型毒株没有区别。cp-42引入了和cp-52同样的SH和G缺失，cp32含有SH和G基因中的大段序列缺失。
表34 RSV B1，RSV B1 cp12、cp23、cp32、cp42和cp52的序列比较
Figure C00806217D01131
·跨SH和G基因的核苷酸区(位置4249-5540)在cp52中缺失。
··cp52中缺失的SH和G基因区，在cp23中与B1亲本比较没有变化。
*这些核苷酸与cp23和cp52中非常相似。
**L聚合酶2030位氨基酸的亮氨酸也存在于RSV2B中。
实施例V
二价RSV亚型A和B疫苗。
亚型A和B病毒的研究表明，在Vero细胞单层培养中，野生型A2和B-1病毒，cpts530/1009和RSV B-1 cp52/25衍生物，在体外没有相互间干扰。棉鼠中二价感染的体内试验结果如表34所示。这些结果证实了体外实验的结果，A-2和B-1野生型RSV，cpts530/100g和RSV B-1 cp52/2B5相互间没有干扰。因此，可以预期，既然二价疫苗的每种组分在双重感染中都和单一感染中观察到复制水平一样，那么可以用各种疫苗来诱导抗野生型病毒的同型免疫反应。每种病毒可单独诱导抗RSV野生型感染的同型抗性。
表35.用RSV A2和RSV B-1病毒或突变体衍生物对棉鼠进行二价感染，未显示出体内干扰
病毒在所示组织中的回收(log 10 fu/g)
Figure C00806217D01141
*第0天用0.1ml接种物以105pfu鼻内感染各组的6个动物。
实施例VI
聚合酶(L)基因的单突变引发ts表型
本实施例描述了用不完全减毒的宿主范围限制性cpRSV通过化学诱变产生聚合酶基因(L)中的专一性突变，从而产生ts毒株cpts 248和cpts530，它们被更进一步减毒以适合用于RSV疫苗的制备。如上面的实施例中所述的，cpts248被发现是减毒的，具免疫原性，在血清检测阳性的黑猩猩中能完全产生对野生型感染的保护性，体内复制中比先前测定的tsRSV突变体遗传上更稳定。如上所述，用cpts248毒株进行化学诱变以进一步减少残留的反应原性，获得了一系列的突变体，包括cpts248/404，它们提高了温度敏感性或是具小噬斑表型。用同样的方法，由cpts530衍生出cpts530/1009。
通过比较这些病毒的完整的基因组序列与先前测定的cpRSV亲本病毒的序列，确定了cpts248和cpts530的增加的减毒作用和ts表型的遗传基础。测定了cpRSV的完整的核苷酸序列，并与RSV A2野生型病毒(一种不是直接传代毒株部分的实验室病毒株)上的序列，以及它的低传代的野生型亲本病毒(RSV A2/HEK7)的序列进行比较。cpRSV比起它的RSV A2/HEK7亲本病毒有5个核苷酸变化的差别，一个在核蛋白(N)中，两个在融合蛋白(F)基因，两个在聚合酶(L)基因中。测定了cpts248，cpts248/404，cpts530，cpts530/1009和cpts530/1030的共15,222位的完整的核苷酸序列和氨基酸序列。
如实施例1所述，通过随机化学诱变由cpRSV亲本获得RSV突变体cpts248和cpts530衍生物。为用于感染细胞，产生用作纯化的病毒RNA来源的病毒悬浮物，是含有病毒的澄清的组织培养物上清液，该病毒在生物克隆后在Vero细胞单层培养物液体培养基中传代四次(即琼脂中的Vero细胞单层进行三次噬斑到噬斑传代)。
细胞单层被用cpts248，cpts248/404，cpts530，cpts530/1009或cpts530/1030病毒以0.1的感染复数(moi)感染。当适度的CPE(致细胞病变效应)被观察到后(平均感染后4-5天)，由感染的细胞单层制备总RNA。吸弃上清液，收集的细胞用异硫氰酸胍裂解，然后用酚-氯仿提取。用Superscript II TM反转录酶(Life Technologies)、随机六聚体引物对RNA进行反转录，反应条件如生产商提供的操作方法中所述。
获得的cDNA用TE-100离心纯化柱与引物分离(Clontech公司，Palo Alto，CA)，并被用作聚合酶链反应(PCR)的模板以产生一系列的10个跨越整个RSV基因组的重叠的cDNA克隆。由原型A2病毒的核苷酸序列设计寡聚核苷酸引物(Mink等，Virology 185：615-624(1991)；Stec等，Virology 183：273-287(1991)；Collins等，Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.88：96659667(1991)；Connors等，Virology208：478-484(1995))，该引物如前面所示可扩增RSV A2野生型病毒和它的衍生物，cpRSV亲本病毒。含尿嘧啶的寡聚核苷酸引物被用于使用CloneAmp尿嘧啶DNA糖基化酶系统(Life Technologies公司)来将RSV序列克隆入pAMP1载体中，PCR反应根据制造商的说明进行(Perkin-Elmer公司，Norwalk，CT)，进行34个循环，每一循环92.5℃1分钟，55℃1分钟和72℃3分钟。片段在1％琼脂糖/TAE凝胶中电泳，用Geneclean II系统(Bio 101，Vista，CA)回收，克隆入pAMP1载体中。由分别的PCR反应中获得各个片段的两个或多个克隆。为对3’前导区进行分析，如Mink等，Virology 185：615-624(1991)所述在50μl反应体系中对病毒RNA(vRNA)进行多腺苷酸化。随后37℃温育10分钟，反应用2μl 0.5M EDTA终止。通过酚氯仿提取和乙醇沉淀来纯化多腺苷酸化的RNA产物，然后反转录成cDNA，通过PCR扩增，用3′RACE系统(Life Technologies公司)进行快速扩增克隆。同样的，为分析5’尾区域，vRNA被反转录成cDNA，使用末端脱氧腺苷酸转移酶和dCTP加尾，用柱子纯化，制成双链，用PCR扩增，用5’RACE系统(Life jechnologies公司)克隆。
克隆的cpts248 cDNA，从双链质粒上，使用合成的寡聚核苷酸引物(质粒引物或RSV专一性引物)，[α35S]dATP和测序酶2.0(UnitedStates Biochemicals，Cleveland，OH)，用双脱氧核苷酸法进行测序。通过正向和反向测定两个或更多克隆，和对未克隆的PCR产物进行测序，证实了检测的序列和以前发表的亲本病毒cpRSV序列的差别。
使用不同方法对cpts248/404，cpts530，cpts530/1009和cpts530/1030的核苷酸序列进行测定。通过感染细胞的总RNA或vRNA的RT-PCR，获得代表cpts RSV突变体病毒基因组的3到10个相互重叠的cDNA克隆。使用Tag试剂盒(ABI，Foster city，CA)在NCI Frederick癌症中心(Frederick，MD)，对噬菌体M13中构建的对应于各个质粒插入的M13超声随机文库进行自动DNA测序，从而测定了各个克隆的完整的核苷酸序列。对两条链进行了测序，并使用测序酶2.0(USB，Cleveland，OH)对另一个独立衍生的RT-PCR产物进行了手工测序，从而确证cpRSV和cpRSV突变体序列的差异。如上所述测定了3’和5’端序列。
测定cpts248，cpts248/404，cpts530，cpts530/1009和cpts530/1030毒株的完整的核苷酸序列。在独立的这些cptsRSV突变体的cDNA衍生克隆中证实了与已发表的cpRSV和RSV A2/HEK7(野生型)亲本病毒相关的改变(Conners等，Virology 208：478-484(1995))，通过对另外一个cpRSV克隆进行测序再次检查了这一改变。一个cpRSV病毒(与A2/HEK7野生型病毒比较)的序列的错读被鉴定出来。错读存在于反基因组3’端的1938位，由异源核苷酸构成(正义链的G或者A)，由此推测它将编码一个391氨基酸的核壳蛋白(N)的267位氨基酸的氨基酸变化(Val或者Ile)。因此，cpRSV其实由混合种群的病毒构成。如上所述，这导致最初(Conner等，同上)检测1938位的变化的失败。一个在1938位有A突变的病毒是cpts248衍生物和cpts530姐妹克隆的直接亲本。因此，作为cpts衍生物的直接亲本病毒的cpRSV含有5种与A2/HEK亲本相比下的氨基酸变化。
cpRSV和cpts248突变体的单一氨基酸差异在10,989位核苷酸(A到T的变化)(表36)。这一突变存在于聚合酶(L)翻译读码框，编码一个预期的在2,165个氨基酸的L蛋白质中的gln向leu的氨基酸变化。cpts248/404突变体和它的cpts248亲本比较有两个核苷酸差异，一个是L基因中的12,046位核苷酸(T向A)，一个是M2基因的转录起始信号序列的7605位核苷酸(T向C)。L基因中的核苷酸替换导致L蛋白质中1183位氨基酸由asp向glu的变化。因此在cpRSV的两轮独立的诱变后，cpts248/404病毒含有L基因中的两个核苷酸变化(对应于两个氨基酸替换)，和M2基因转录起始信号中的一个核苷酸变化。比起它的野生型祖先A2/HEK7，cpts248/404突变体有7个氨基酸(四个在L中，两个在F，一个在N中)和M2基因中转录起始信号的一个核苷酸的不同。
表36.cp-RSV，cpts-248，cpts-248/404突变体病毒的核苷酸序列的差别
Figure C00806217D01181
1正义链
2基因组长度增加1个核苷酸。
cpts530不同于亲本病毒株cpRSV之处在于10,060位单个附加的由C到A的核苷酸替换，导致L蛋白质521位由phe向leu氨基酸的变化(表37)。cpts530/1009突变体在12,002位有一个单个的核苷酸替换(A到G)，导致L蛋白质中1169位氨基酸的met向val的替换。cpts530/1009突变体和它的野生型祖先A2/HEK7相比有七个氨基酸的不同(四个在L中，两个在F中，一个在N中)。
cpts530/1030在12,458位核苷酸有另外一个增加的核苷酸替换(T向A)，导致L蛋白质1321位氨基酸Tyr向Asn的替换。cpts530/1030突变体和它的野生型祖先A2/HEK比较有七个氨基酸的不同(四个有L中，两个在F中，一个在N中)。
表37.cp-RSV，cpts-530，cpts-530/1009突变体病毒间的核苷酸序列的差异
1正义
因此，cpts248和cpts530各自的ts和减毒表型与聚合酶基因中的单个核苷酸变化有关。cpts530，cpts530/1009或cpts530/1030的ts和减毒表型效应的增加，也各自与L中的一个氨基酸变化有关。在这四个例子中(即cpts248，cpts530，cpts530/1009和cpts530/1030)中L的单个、但是不同的氨基酸替换赋予祖先毒株以ts和减毒表型。cpRSV中的五个突变有关的氨基酸替换，增加了在动物中复制后ts表型的稳定性。cpts248和cpts248/404中观察到的减毒和温度敏感性的增加与两个核苷酸变化有关，其中之一或二者可对ts和减毒表型有影响。L中的四个特异性的位点(即，cpts530，cpts530/1009，cpts530/1030和cpts248病毒的那些专一性位点)各自单独地与ts和减毒表型有关，通过对此处的发现进行总结，确定cpts248/404中的一个或两个位点是RSV基因组或L蛋白质的核心区域，它们的变化能导致减毒作用。尽管L蛋白质中的四个位点的特异性突变是专一性的氨基酸替换，很可能在这些位点和在一特异性位点的大约五个氨基酸相邻的氨基酸上的其它氨基酸替换和框内插入或缺失，也能够导致减毒作用。
L中编码氨基酸的变化看来不涉及副粘病毒聚合酶蛋白的高度保守性区域，设想的ATP结合位点(Stec等，Virology 183：273-287(1981))，也不涉及与RNA依赖性的RNA和DNA聚合酶基元同源的区域(Poch等，EMBO J 8：3867-3874(1989))。更有可能这些突变的效应是在氨基酸水平而不是在核苷酸水平的，因为突变不在基因组的3’和5’末端或者短的基因起始和基因末端序列中。这些RNA区域被认为含有所有的有效加帽、转录、复制和包装入病毒所需的顺式作用RNA序列(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9665-9667(1991)；Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：81-85(1996)，引入本文作为参考)。
这些结果提供了tsRSV突变体的第一个全长序列。这些结果显示，可以通过导致氨基酸变化或例如GS序列变化的单个核苷酸变化或例如GS序列变化的单个核苷酸替换来对肺病毒进行减毒。既然cpts248和cpts530病毒的ts表型在体内和体外都具有高度稳定性，很显然实际上这种表型被发现与单一的、不同的氨基酸变化有关。重要的是，cpts248/404，cpts530/1009和cpts 530/1030含有至少三个突变，其能影响减毒表型，两个是ts，一个是非ts的(如，五个cp突变)，这是对这些病毒在体外和体内的高度稳定性的部分不确定的解释。
测定RSV疫苗病毒和它们的亲本病毒的完整序列，使得可以在基因水平对疫苗病毒在其制备和被临床实验志愿者排出的过程中的稳定性进行解释。cpts248、cpts530、cpts248/404、cpts530/1009和cpts530/1030病毒减毒和ts表型的遗传基础的确定提供了重要的新的机会。根据下面所述的重组步法，可以很方便地通过全长RSV cDNA的定点诱变产生新的疫苗候选物，由突变cDNA可获得感染性的病毒。例如，可以向例如cpts248/404病毒的cDNA克隆引入521位(在cpts530突变体中)或1169位(在cpts530/1009突变体中)氨基酸突变之一或二者，或其它想要的减毒或稳定性突变。用这种途径，可以提高cpts248/404病毒的减毒水平，通过常规途径可以产生具安全性和免疫原性的具体减毒水平的疫苗毒株。同样地，可以通过专一性引入cpts248/404病毒中的一个或几个减毒突变来提高cpts 530/1009和cpts 530/1030突变体的减毒水平。这些例子中的组合重组病毒，引入了来自生物学上获得的突变株的多个减毒突变，克服了使用传统方法分离和产生遗传上稳定的、令人满意的减毒病毒的许多困难。而且，通过向已知赋予减毒表型的特异性氨基酸的编码密码子引入可能的两个或多个核苷酸替换，可以增强这些重组cpts RSV突变体的表型稳定性。通过全长RSVcDNA的定点诱变可以增强减毒表型的稳定性。
实施例VII
编码RSV反基因组的cDNA的构建
如图2所示，构建了编码RSV A2毒株的反基因组的cDNA克隆。使用合成的寡核苷酸作为引物，以从纯化的病毒体分离的胞内RSVmRNA或基因组RNA为模板，通过反转录(RT)和聚合酶链式反应(PCR)合成了cDNA片段。最后的cDNA被加到T7RNA聚合酶启动子的前导端，该T7启动子含有三个被转录的G残基以提高活性；转录导致这三个非病毒的G被加到反基因组的5’端。为产生接近正确的3’端，cDNA非转录尾被构建到邻近前述的锤头状核酶上，它的裂解将一个3’-磷酸化的U残基加到所编码RNA的3端(Grosfeld等，J.Virol.69：5677-5686(1995)，此处引入作为参考)。核酶序列后面跟随着一对串联的T7RNA聚合酶终止序列。(将三个5’G残基和一个3’U残基加到cDNA编码的RSV微基因组，它含有氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因，这种添加当RSV互补时，对CAT的表达没有影响。)
图2显示cDNA和所编码的反基因组RNA的结构。图示的反基因组(顶端)包括下列特征：T7启动子来源的5’-端非病毒G三联体；1099位(它添加了一个核苷酸的长度)，1139，5611，7559位的四个序列标记，核酶和串联的T7终止序列，由核酶切割(切割部位如箭头所示)提供的单个非病毒3’-磷酸化U残基。
通过RSV mRNA或基因组RNA的RT-PCR构建了整体形式代表反基因组中的克隆的cDNA片段(图2，中部)。完整的反基因组cDNA被称为D46或D53；不同的名字代表同一个质粒的不同制备物。含有反基因组左手端的cDNA，跨越T7启动子和与SH基因互补的前导序列，被叫做D13，被装配到pBR332质粒中(图2，底部)，其中天然存在的BamHI位点被诱变消除，PstI-EcoRI片段被人工合成的含有单一限制性位点(包括BstBI，BstXI，PacI，BamHI，MluI)的多接头替换，以促进装配。图2中的框显示了被去除的BamHI位点。天然存在的BamHI-SalI片段(BamHI位点以正义方向标示在顶行，下划线标出)，被用PCR产生的BglII-SalI片段(BglII位点示在底行，下划线标出，它的4-nt粘性末端[斜体字]与BamHI的一致)代替。这导致在氨基酸水平沉默的一个单一核苷酸变化(中部，下划线标出)。这些对载体的修饰有利于将单一BamHI位点引入反基因组cDNA中从而构建cDNA。
G、F和M2基因被装配到各自的质粒上，L、非转录尾、侧翼的核酶和串联的T7转录终止序列也同样被装配。然后将G-到-M2片段插入到前导序列-到-SH质粒的PacI-BamHI窗口。然后以此作为受体将上述L-非转录尾-核酶-终止序列片段插入到BamHI-MluI窗口，获得完整的反基因组。
通过向RT-PCR中使用的寡聚核苷酸引物中引入改变，而在起初构建的过程中向反基因组cDNA引入了四个限制性位点标记(图3)。这样做可以促进装配，提供鉴定重组病毒的方法，产生了向感染性RSV中引入改变的能力。三个位点在基因间隔区域，第四个在非翻译基因区，它们涉及总共五个核苷酸替换和一个单核苷酸插入。这将所编码反基因组的长度比野生型反基因组的长度提高了一个核苷酸，成为总共15,223nt(SEQ ID NO：1，它显示了D46的5’到3’的正义序列，而基因组自身是负义的；注意位点4可以是G或C)。
如图3所示，序列标记被插入到cDNA编码的反基因组RNA中。序列是正义的，将对应于前导序列互补序列的第一个nt记为1；毒株A2和18537之间的同一性(Johnson和Collins，J.Gen.Virol 69：2901-2906(1988)，此处引入作为参考)(两毒株分别代表亚型A和B)，被用点号显示出来；代表cDNA中限制性位点的序列用下划线标示；GS和GE转录信号被用方框标示；1141位的N翻译读码框的起始密码子被用斜体字标示，序列标记显示在每个序列的下方。在顶部的序列中单个的C残基被插入到1099位以在NS2-N基因间隔区域产生一个AflII位点，紧挨N翻译读码框的1139和1140位的AG被CC替换以产生一个新的NcoI位点。在中部的序列中，5612和5616位的G和U的替换，分别在G-F基因间隔区产生新的StuI位点。而在图3的底部的序列中，在7560位的一个C替换在F-M2基因间隔区产生一个新的SphI位点。
在装配前，对所有的cDNA进行完整测序，在大多数例子中测定几个独立的cDNA。编码单个RSV蛋白的质粒如上所述，Grosfeld等，J Virol.69：5677-5686(1995)和Collins等，同上(1995)，各篇此处引入作为参考。装配后也对完整的cDNA进行完整测序。
实施例VIII
重组RSV的转染和回收
本发明的由cDNA表达的反基因组产生感染性RSV的方法涉及它与那些RSV蛋白质的共表达，这些表达是足以(i)产生能够进行RNA复制的反基因组核壳，以及(ii)使后代基因组核壳能进行RNA复制和转录。基因组核壳的转录提供了所有其它的RSV蛋白质，可引起有效感染。
含反基因组编码cDNA的质粒，与编码N、P、L和M2(ORF1)蛋白质的质粒被一起转染进HEp-2细胞中，该细胞已经被表达T7RNA聚合酶的最近被描述的重组MVA疫苗病毒株感染(Wyatt等，Virol.210：202-205(1995))，此外引入作为参考)。MVA病毒株是一种宿主范围突变体，它可在禽类细胞中生长，而在哺乳动物细胞中病毒体成熟的后期有阻断，因此，极大地减少了感染性病毒的产生。在HEp-2细胞中，MVA重组子与更普遍使用的基于WR的重组子(Fuerst等，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 83：8122-8126(1986))，在T7聚合酶的表达水平上和细胞病原性上是一致的，而在后代产生的水平上是足够地低，可以使上清液带很小的细胞病原性而传代给新鲜细胞。这样可以促进任何重组RSV的回收，该RSV可以在转染的疫苗病毒感染的细胞中回收。
重组RSV的转染和回收进行如下。向六孔碟的每一个孔中的单层HEp-2细胞培养物中加入1ml感染-转染培养基，该培养基是通过将5种质粒混合入终体积为0.1ml的Opti-MEM(Life Technocogies)培养基而制备，即为0.4μg的反基因组、N和P质粒，和各为0.1μg的L和M2(ORF1)质粒。这些与含有12μl LipofectACE(LifeTechnologies)的0.1ml Opti-MEM结合。室温温育15分钟，与含有2％热灭活的胎牛血清和1.5×106pfu编码重组T7RNA聚合酶的重组MVA疫苗病毒株(wyatt等，同上)的0.8ml OptiMEM合并。将合并液加入到细胞中，一天后用含2％血清的Opti-MEM替换。培养物在32℃培养，在第三天收获。32℃培养是因为发现MVA病毒是轻度温度敏感性的，在这种低温下更为有效。
转染三天后澄清的培养物上清被传代到新鲜的HEp-2细胞上，用甲基纤维素(为后面的抗体染色)或者琼脂糖(用于噬斑分离)覆盖。在甲基纤维素下温育5天后，固定细胞，用直接辣根过氧化物酶法染色，使用RSV F蛋白质的三种鼠单克隆抗体混合物结合，然后加入连接辣根过氧化物酶的抗鼠抗体，一般操作程序依照Murphy等，Vaccine8：497-502(1990)进行。
在细胞病原性背景中大量检测出RSV样噬斑，推断是低水平的MVA-T7重组病毒的原因。这些噬斑含有足够量的RSV F蛋白质，这通过褐黑的颜色显示出来，它们并显示出RSV的致细胞病变效应，即，合胞体形成。
在琼脂糖下培养的RSV样噬斑被从平板上挑下，用中性红染色。对它们进行繁殖并通过噬斑试验和抗体染色与实验室的RSV A2病毒株进行比较。由转染培养物衍生的噬斑与实验室病毒株非常相似。一个差别是转染培养物衍生的噬斑比实验室病毒株稍小，而它的中心稍微不透明。重组病毒与特定的野生型分离物的表型有所差异，可能在于细胞到细胞的传递上稍受限制，并表现出减小的细胞致死率。与释放病毒的繁殖有关，重组病毒和实验室病毒在HEp-2细胞中的回收量在32℃或37℃是一样的。在先前的研究中，重组和实验室病毒在细胞内RSV mRNA和蛋白质的积累上有显著差异。
使用三对位于四个插入标记侧边的引物通过RT-PCR对噬斑纯化的、经三次传代的重组RSV和实验室病毒进行了平行分析。三个独立的噬斑纯化的重组RSV分离物与未感染的对照培养物进行了平行扩增。用聚乙二醇和高盐(Zoller和Smith，DNA 3：479-488(1984))处理澄清的培养物上清以沉淀病毒，并用TrizolTM(Life Technologes)从沉淀中提取RNA。这些RNA，与附加的未加RNA的对照或加入0.1μg来自实验室A2病毒株的分离物对照进行平行实验，用脱氧核糖核酸酶处理，再纯化，分别与50ng随机六聚体退火，在标准RT条件下(40μl反应)加或不加反转录酶进行温育(Connors等，Virol.208：478-484(1995)，此处引入作为参考)。对每一个反应样使用三个不同的合成的脱氧寡聚核苷酸引物对进行PCR(35个循环，94℃45秒，37℃30秒，72℃1分钟)。引物对(A)：正义链，925-942位，负义链，1421-1440位，获得预期的516bp(重组病毒中517bp)的产物，它包括分别在NS2和N基因连接处和N基因中的AflII和NcoI位点。引物对(B)：正义链，5412-5429位，负义链，5930-5949位，获得一个预期的538bp的产物，它跨越插入在G和F基因间连接处的SphI位点。引物对(C)：正义，7280-7297，负义7690-7707，获得一个428bp的片段，它跨越插入在F和M2基因间的SphI位点。在含有1％琼脂糖和2％低融点琼脂糖的中性胶上，PCR产物与HaeIII消化的X174DNA分子长度标记通过电泳进行平行分析，并用溴乙锭染色观察。获得期望大小的PCR产物。各个产物依赖于RT步骤，显示出它们各自衍生自RNA而非污染的cDNA。
用限制酶消化分析PCR产物。用AflII或者NcoI消化引物对A的产物的消化，获得的片段相应为177和340bp(AflII)或者217和300bp(NcoI)。用StuI消化引物对B的产物的消化，获得的片段对应于预期的201和337bp的片段。用SphI消化引物对C的反应产物的消化，获得相应于147和281bp的预期产物。如上用凝胶电泳分析消化的产物。用AflII消化时，未消化的PCR产物残留的存在是由于不完全消化造成的，这被重新消化所证实。因此，限制酶消化分析显示，代表重组病毒的PCR产物具有预期的限制性位点标记，而代表实验室病毒株的那些没有。克隆的PCR产物的核苷酸序列分析证实了跨越限制性位点标记的序列。
如表38所示，当与N、P、L和M2(ORF1)互补时，RSV产物的效率是相当高的，在三个实验中，每0.4μg反基因组cDNA以及1.5×106细胞有9.9到94.8个噬斑。既然这些噬斑来自液体履盖层，存在于原初转染的每个孔中的被感染的细胞数是未知的。几乎每个转染的孔中(表38，56个孔中的54个)都产生病毒。既然每个被感染的孔中释放的RSV的收获量通常是很低的(～10pfu)，甚至在理想条件下也如此，且既然许多孔都获得这个量的倍数(高至169个噬斑)，很可能几种产RSV的细胞存在于许多孔的转染细胞中。
如果缺少任何质粒，都无RSV可回收，如表38所示。对M2(ORF1)的要求，也可用完整的基因，M2(ORF1)来满足，假设加入的cDNA水平较低(每1.5×106细胞中0.016μg)(表38)。在较高加入水平上，病毒的产生量被极大地减小，显示了与M2(ORF2)相关的微基因组RNA合成的抑制，也在有效感染的完整基因组中起作用。
这些结果显示感染性RSV的产生高度依赖于M2(ORF1)蛋白以及N、P和L的表达。而且，它显示了M2(ORF1)表达的优选方法是从ORF2被缺失的基因工程cDNA来表达，尽管含有两个ORF的完整的cDNA也支持RSV的产生。
因此，本发明表明RSV转录不同于先前描述的非片段性负链RNA病毒的地方在于，它要求第四种蛋白质，本文称为M2(ORF1)，以前被叫做22K或M2(Collins等，J.Virol.54：65-71(1985))。M2(ORF1)蛋白质被发现是一种RNA聚合酶延伸因子，它对于持续的序列转录是非常重要的，因此是必须提供的(例如，被基因组或反基因组编码，或者被单独的质粒或共享载体中的序列反式表达)(见例如，Collins等，Proc.Natl.Acod.Sci.USA 93：8185(1996))，这一要求提供了作为本发明的一部分的一种可能性，即向感染性RSV中引入特异性的预决定的改变。
表38.依赖于M2ORF1表达的感染性RSV的产生
Figure C00806217D01281
*转染培养物的上清液(106细胞/孔)在新鲜HEp-2细胞中传代，用甲基纤维素覆盖，用F-特异性的单克隆抗体染色。
§读数如下：19个孔中有0个噬斑，2个孔有1个噬斑，2个孔各具2个噬斑，以及1个孔具3个噬斑。
实施例IX
修饰以引入RSV毒株cpts530的表型专一性突变的一个感染性的重组RSV的构建
本实施例叙述了使用本文描述的重组方法，将特异性的预决定的突变引入感染性的RSV中。如上面所述，完整的cpts530 RSV核苷酸序列被测定，5个已知的存在于亲本cpRSV中的突变被保留在更进一步减毒的衍生物cpts530中。10060位核苷酸的位置被鉴定出存在另一个附加的核苷酸变化，它造成大聚合酶(L)蛋白质521位氨基酸的苯丙氨酸向亮氨酸的变化(表37、39)。这一单一氨基酸替换，单独或与cp突变一起引入野生型A2 RSV的全长cDNA克隆中。对回收自突变cDNA的感染性病毒的分析表明，这一单一突变决定了重组cp530在HEp-2细胞单层培养物在40℃时噬斑形成的完全限制，而温度敏感性的水平不必受5个cpRSV突变存在的影响。这些发现证实，L蛋白质突变中的521位苯丙氨酸向亮氨酸的变化决定了cpts530的ts表型。相似地，一个附加的核苷酸变化被鉴定出存在于重组的cpts530/1009中，相比较于它的cpts530亲本病毒(表37)。12002位的核苷酸替换导致L中1169位的氨基酸变化。此处野生型病毒中的甲硫氨酸在cpts530/1009突变体中被缬氨酸替换。这个突变也被引入重组RSV中，获得的病毒是温度敏感性的。这些发现表明1169位甲硫氨酸向缬氨酸的突变，决定了cpts530/1009比cpts530具有更高水平的温度敏感性。
使用RSV-CAT或RSV-荧光素酶微基因组(见上)，通过酶学实验或者Nothern印迹分析证实了530、530/1009和530/1030重组病毒的温度敏感性。例如，当升高温度到37℃时，相对于野生型L蛋白质，选定的突变体的荧光素酶活性对应于1009、530和双突变体pTM1-L载体质粒分别为18.4％、1.5％和0.4％。这些例举的突变还将L的功能相比较于野生型L蛋白质减少(对于1009)70％活性，(对530)40％活性，(对530/1009L蛋白质)12.5％活性。单独使用微基因组系统或结合此处公开的重组病毒法，也可鉴定出这些突变对于转录和复制的效应。
表39.向RSV全长cDNA克隆中引入的突变
注释：野生型和突变体的核苷酸的差别在相应的位点用下划线标示。限制性内切酶好识别位点用斜体表示。引入的核苷酸变化产生氨基酸替换的密码子用粗体表示。星号表示存在于生物学上获得的突变体病毒中的单个核苷酸变化。编号系统反映了全长cDNA中的一个核苷酸插入。
1显示引入突变的基因。
为将cpts530和cpts1009专一性突变引入特定的、减毒重组RSV疫苗病毒中，如下使用了本文所述的cDNA为基础的回收系统。先前所述的RSV A2野生型全长cDNA克隆(Collins等，如上，(1995))，被用作起始结构来包括cDNA克隆中1099nt位置一个C的核苷酸插入(产生一个AflII位点)，和在4座位上的总共6个附加的核苷酸替换。因此，天然存在的病毒和cDNA衍生的重组病毒的编号系统，自1099位以后有一个nt的差别。上面表36和37的核苷酸编号，代表的是天然存在的病毒的位置，而cDNA克隆(表39)和cDNA克隆衍生的重组病毒的编号要多一个核苷酸。6个核苷酸替换之一是前导序列第4位nt的G向C的基因组正义变化。这一核苷酸变化，在非重组RSV中被检测出来，没有发现它对组织培养或在鼠中的病毒复制的温度敏感性有作用(Firestone等，Virology 255：419-522(1996)，此处引入作为参考)。表39列出了在这个和后面的实施例中插入RSV cDNA中的各种突变。
中间克隆(D50和D39)被用于组装全长RSV cDNA克隆D53，它编码正义RSV反基因组(图4)。D50质粒含有从前导序列到T7启动子下游的M2-L重叠序列的RSV基因组，而D39质粒编码全长L基因和非转录尾区，接着是锤头状核酶和两个T7终止序列(大约长度为7kb)，以BamHI和MluI限制性位点为边界。用于在转染中拯救感染性病毒的全长cDNA克隆(D53)，是通过将D39质粒的BamHI-MluI片段插入到D50质粒中而获得的(见美国专利申请08/720,132；和已公开PCT申请PCT/US96/15524，此处引入各篇作为参考)。D50被进一步分成几段，每段各插入噬菌粒中以用于进行诱变；一个片段是含有N基因的XbaI-EcoRI片段(cDNA pUC118.D50N)，一个是含有F和M2基因的StuI-BamHI片段(pUC118.F-M2)。D39被进一步分成两段，每一段被置入单独的噬菌粒质粒中：一段(左手半部分，cDNA pUC119.L1)从BamHI位点到12255位核苷酸的pmlI位点(注意，这里所称的限制性位点的序列位置以及整个的序列位置，是为了便于描述，且单独并不限定所有涉及的核苷酸)，另一半(右手半部分，cDNA pUC119.L2)从PmlI位点到T7终止子的末端。
如图4底行所示，使用标准方法，将突变引入pUC118和pUC119为基础的构建体中(见例如，Kukel等，Methods Enzymol.54：367-382(1987)，此处引入作为参考)。将质粒在大肠杆菌dut ung毒株(此例为CJ236)中繁殖，通过辅助噬菌体此例是M13KO7的感染，制备单链DNA。制备各含有一个或多个目的核苷酸变化的磷酸化合成寡聚核苷酸，单独或共同与单链模板退火，用T4DNA聚合酶进行直接DNA合成。产物被进行连接，转化进非dut ung的大肠杆菌毒株，此例是DH5α或DH10B。通过限制酶消化，或者诱变区的核苷酸序列分析，筛选转化克隆的小量制备DNA中突变的存在。含有合适突变的片段被从pUC构建体物中转移进D50或D39质粒中，它又接着被装配进被称为D53的全长克隆中。如上所述，通过将D53质粒用编码N、P、L和M2(ORF1)蛋白质的四种载体质粒混合物补充，在HEp-2细胞中回收重组病毒。
此处和后面的实施例涉及的四种类型的突变，描述了引入生物学上获得的生突变的特定重组RSV(见表36，37，39)：
(1)第一组突变涉及六个引入L基因中的翻译沉默的新的限制性位点标记，总称为“位点”突变。六个位点是Bsu36I、SnaBI、PmeI、RsrII、BstEII和另一个下游的SnaBI位点，图4中D53显示图上用下划线标示。这六个改变，统称为“位点”突变，被引入以方便cDNA构建。同时，已知在D55质粒和载体质粒，即N，P，M2(ORF1)和L质粒的转染过程中，它们之间可能会发生重组(Garcin等，EMBO J.14：6087-6094(1995)，此处引入作为参考)。这些L中的限制性位点存在于D3构建体中，但是不存在于L载体质粒中，因此提供了一个证实L中的重组不曾发生的标记。这是相当重要的，既然许多突变存在于L中。
(2)第二组突变涉及F基因中的两个氨基酸变化(图4，表39)。cpRSV，以及它的所有衍生物，衍生自被称为HEK-7的野生型病毒。原始的D53cDNA与HEK-7序列的不同之处在于七个位置的单核苷酸替换。一个是核苷酸4，它在原始的D53中是C(负义)，而在HEK病毒中是G。然而，生物学上获得的病毒显示含有两种排布，能够在两者间摆动，而这种差异被认为是偶然的，不在这里作进一步考虑。四个其它的核苷酸替换在氨基酸水平是沉默的；有两个改变在F中，在6222位和6387位，一个在F-M2基因间隔区域的7560位，一个在L中的10515位。这些也没有显著性的意义，不作进一步考虑。最后，有两个在F基因中的核苷酸替换，它们各导致了氨基酸替换(表39)。这两个改变，一起被称为“HEK”排布，被引入D53，因此所编码的重组野生型病毒在氨基酸水平与生物学上获得的cpts突变体的HEK-7野生型亲本是一样的。注意，这两个变化也各被引入一个新的限制酶识别位点，以监测cDNA中以及回收的病毒中所引入的突变的存在。
(3)第三组突变涉及cpRSV病毒中的五个氨基酸替换，一起被称为“cp”突变。这些存在于所有的生物学上获得的cpts病毒中，并形成减毒表型。存在于所有生物学上获得的cpRSV中，这些氨基酸变化是由于单个的核苷酸变化所造成的。如表39所示，当氨基酸编码性变化被引入cDNA以制备重组病毒时，五个中的四个中的编码性变化涉及两个核苷酸替换，这便得到重组RSV对回复成野生型具高度的抗性。注意，这些变化中的四个被设计引入新的限制酶位点，而第5个被设计成消除现有位点，因此提供了一种通过重组病毒产生的cDNA或RT-PCR产物中限制性位点的存在或缺失，来监测突变存在的方法。
(4)第四组突变涉及单个、生物学上获得的cpts病毒的专一性点突变(表39，图4)，它们由获得它们的生物学步骤来命名。例如，下面实施例中的来自cpRSV的cpts248/404衍生病毒涉及到两步诱变。第一次获得cpts248病毒，它具有一个单氨基酸变化，其被称为248突变。用cpts248所作的第二个诱变步骤，获得了cpts248/404病毒，它含有一个L中的氨基酸变化，被称为404(L)突变，和一个M2基因起始(GS)信号中的核苷酸变化，被称为404(M2)突变。其余的突变，即530、1009和1030，各自涉及不同的单氨基酸变化。404(M2)突变是有价值的，因为它涉及GS转录信号(不涉及蛋白编码序列)，以及这个突变显示在微基因组系统中对mRNA的合成是重要的。(Kuo等，J.Virol.71：4944-4953(1977)(此处引入作为参考))。如表36，37和39所示，248、404(L)和1009突变的氨基酸编码性变化，被使用双核苷酸替换插入到重组病毒中以提高遗传稳定性。同样，248、404(M2)、404(L)和1009突变在重组病毒中被设计引入一个新的限制位点以用于监测目的，而1030突变被设计消除一个已存在的位点。
在本实施例中，由D50和D39质粒衍生出几种基于pUC118和pUC119的构建物并将目的突变引入这些构建体中(图4，5)。含有合适突变的片段被从pUC构建体中转移回D50或D39质粒上，如图所示，它又接着被组装进全长克隆中。用这种方法，产生6种不同的D53全长衍生物克隆(图4，5)。在图5中D53构建体缺少F中的两个HEK突变(见图4)。
使用
Figure C00806217D0134145243QIETU
噬菌粒体外诱变试剂盒(Bio-Rad，Hercules，CA)，按制造商的建议进行诱变。诱变的构建体转化入感受态的E.coliDH10B(Life Technologies)中。通过限制酶消化(见下)，或者诱变区域的核苷酸序列分析，对转化子克隆的小量制备DNA筛选突变的存在。
六个翻译沉默限制性位点标记，530突变(531Phe→Leu)，和5个cp突变(表39)被引入基于pUC的质粒中，如图4和图5所示，被亚克隆进D50和D39质粒中。使用含上面所述突变的不同组合的D50和D39构建体，装配了各种全长cDNA构建体。
在最终的cDNA构建体中，530和cp突变的存在被序列分析所证实，而沉默限制性位点的存在可通过限制性内切酶的分析来确实。使用各种限制酶(例如，HpaI，AccI，HindIII，PstI)对基于D53的构建体进行了分析，将新产生的全长cDNA克隆的限制位点图谱，与先前拯救的野生型cDNA克隆的图谱进行了比较。这种限制性分析被用来检测是否在全长质粒的细菌扩增过程中有100或更多核苷酸的插入或缺失。
如前面所述进行转染(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：11563—11567(1995)，此处引入作为参考)。简要地说，在MOI为1时，用表达T7RNA聚合酶(MVA-T7)的重组疫苗病毒MVA株对单层HEp-2细胞进行感染，并用带有D53反基因组构建体和N、P、L和M2(ORF1)pTM1载体质粒的LipofectACE(Life Technologies)进行转染。在第三天，上清液(澄清的培养基)被传代到新鲜的HEp-2细胞上以扩增所拯救的病毒。感染后的第5天收获来自第一次扩增的病毒悬浮液，接着以不同的稀释度接种到HEp-2细胞单层上，用甲基纤维素覆盖以进行噬斑计数或用琼脂糖覆盖以进行噬斑收集和生物克隆。用单克隆抗体-辣根过氧化物酶染色法进行噬斑计数，如前所述(Murphy等，Vaccine，8：497-502(1990)，此处引入作为参考)。收集的重组病毒通过三次连续的噬斑纯化被生物克隆化，然后通过HEp-2细胞上的两次传代后产生病毒悬浮物。生物克隆对于产生均一的回收病毒是重要的，因为在第一次的拯救过程中，代表RSV全长cDNA的质粒和含有RSV基因的载体质粒间可能会发生重组(Garcin等，EMBO J，14：6087-6094(1995)，此处引入作为参考)。这些生物克隆和扩增的病毒悬浮物被用作重组病毒的进一步的分子遗传学和表型分析。对每个cDNA构建体来说产生两个生物克隆的重组病毒(图5)，除cpL530位点和cp530位点，对它们二者来说只产生一个生物克隆。在每个例子中，当具有姐妹克隆时，它们可基于下述的遗传学和生物学分析进行区别。相应于D53-530位点的一个代表性的前述构建体(被命名为A2ts530-S cllcp，或ts530位点)，根据布达佩斯条约，被保藏于ATCC，给予的登记号为VR-2545。
上述产生的重组RSV被进行遗传分析以确定是否它们的确含有各个引入的突变。用生物克隆的重组病毒感染HEp-2单层细胞，如上所述，在感染后4到5天收集总RNA。使用随机六聚体引物进行RT反应，获得的cDNA被用作模板，用AdvantageTM cDNA PCR试剂盒(Clontech Lab.Inc.，Palo Alto，CA)进行PCR，获得三个片段，它们代表了几乎全长的重组RSV基因组。相应于RSV基因组的PCR片段在1-5131，5949-10751和8501-15179nt间。同样，一个代表L基因530突变区域的544bp的片段被产生。这个短的PCR片段被用于循环测序(便用71001delta TAQTM*循环测序试剂盒，USB，Cleveland，OH)，以确证回收的重组病毒中530突变的存在或不存在，而大的PCR产物被用于限制酶消化以确证用特异性限制位点标记的、沉默限制性位点标记和cp突变的存在。
为确证根据上述方法产生的重组RSV引入了目的表型，即，该表型是由引入的序列变化所决定的，对重组RSV和非重组对照病毒的噬斑形成效率(EOP)进行了测定。具体地，在温度受到控制的水浴中，使用HEp-2单层培养物进行32，37，38，39和40℃的噬斑滴度分析，如上所述(Crowe等，Vaccine，11：1395-1404(1993)；Firestone等，Virology225：419-522(1996)，各篇此处引入作为参考)。使用抗体染色法，如上所述进行噬斑的鉴定和计数。
表40列出了重组病毒和野生型和生物学上获得的突变体cpts30病毒的温度敏感性水平。这些数据显示引入沉默限制性位点或cp突变不赋予ts表型。这后者的观察与我们以前的发现即cpRSV是ts+病毒是一致的(Croue等，Vaccine，12：691-699(1994))。
表40.各种温度下重组和生物学上获得的病毒在HEp-2细胞中噬斑形成效率的比较
Figure C00806217D01361
a不同RSV株噬斑形成效率的测定，是在所示温度(℃)，通过对半固体履盖五天的单层HEp-2细胞进行噬斑滴定而检测得的。
b病毒滴度是两个试验的平均值，除了r-位点和rcp位点的数据是采自单个试验的。
c生物学上获得的对照病毒。
上述的发现证实生物学上获得的cpts530病毒的ts表型是由上面鉴定的这个减毒RSV病毒株所特有的单核苷酸突变所决定的。通过将530突变引入A2野生型ts+亲本病毒的全长cDNA克隆中，然后回收含有530突变的ts重组病毒，在这一部分中证实了对cpts530病毒株的遗传学分析。对这一病毒以及另外的含530突变和cp突变的重组病毒的温度敏感性水平的分析揭示，由530突变决定的温度敏感性水平，不受五种cp突变的影响。因此，本发明的方法和组合物鉴定了530突变为ts表型特异性的突变，它使得cpts530病毒在模型宿主中比它的cpRSV亲本更进一步减毒(Crowe等，Vaccine，12：783-90(1994)，Crowe等，Vaccine，13：847-855(1995)，此处引入作为参考)。
除上面的发现外，将1009突变或1030突变引入重组RSV中，与cpts530突变相结合，产生重组子，它的温度敏感性水平与生物学上获得的cpts530/1009和cpts530/1030 RSV突变体分别都是一样的。
上面的发现描述了几种用于开发活减毒RSV疫苗的有用的重组方法和RSV克隆。将选定的突变插入重组RSV，以及从RSV A2 cDNA克隆中获得突变的回收方法是相对有效的。用于本实施例的反基因组cDNA克隆被进行原初结构的修饰，以含有五个不同座位的变化，包括6个核苷酸替换和一个核苷酸插入。诱变的病毒含有另外的十二个座位的突变，包括24个另外的核苷酸替换。只有530突变表现出在组织培养中可检测到的表型，这一事实暗示这一大的RNA基因组的操作是相对容易的。尽管由疫苗病毒酶介导的载体质粒与全长克隆间的重组可能会发生(Garcin等，EMBO J.14：6087-6094(1995)，从此处对具有其来源cDNA克隆中的突变的病毒的分析表明，这种重组发生的频率是足够低的。因此，以依次的方法引入进一步减毒的突变是比较方便和容易的，由此可获得所需水平的减毒。
本发明的RSV回收系统在减毒突变的直接鉴定上的应用，和已成功建立的操作重组RSV的方法，使得可以将其它的突变引入进有活力的感染性RSV克隆中，并进行鉴定。此前对cpRSV病毒的临床研突和序列分析的结果表明，cpRSV中的一组五个非ts突变对血清检测阳性的人来说是减毒突变(Connors等，Virology，208：478-84(1995)，Friestone等，Virology，225：419-522(1996)，FriedeWald等，JAMA，203：690-694(1968)，Kim等，Pediatrics，48：745-755(1971)，各篇此处引入作为参考)。使用这里介绍的方法，筛选了被验证对减毒和/或ts表型具有特异性的这些和其它突变，然后将它们组装进减毒突变目录中。这些和其它的减毒突变，ts和非ts二者，可以被引入RSV A2野生型病毒中去产生活减毒病毒，其具有病毒活力和减毒的合适的平衡。在这一方面，530和其它的已鉴定的ts突变的有利之处，在于它们不在G和F糖蛋白中，这些糖蛋白在人中诱导对RSV的保护性免疫反应。这样可以开发一种减毒RSV cDNA骨架，它在F和G外有突变，它可作为cDNA底物，其中，RSV亚型B的F和G糖蛋白或具不同流行病学的亚型A链可以用以A2F和G糖蛋白替换。用这种方法，有活力的减毒RSV疫苗能快速更新为亚型A链的抗原性漂移，而亚型B疫苗成分也能被快速产生。
实施例X
一种被修饰引入RSV病毒株cpts248/404的表型特异性突变的感染性重组RSV的构建
这个实施例叙述了用本文描述的重组步骤和材料，将预定的减毒突变引入感染性RSV中的另一个实施方案。
先前的对RSV A2 cpts248突变体的序列分析也鉴定了L基因中的一个单突变，在氨基酸831位的谷氨酰胺向亮氨酸的替换(表39；Crowe等，Virus Genes，13：269-273(1996)。本文的方法证明它具减毒作用和是温度敏感性的。更进一步减毒的RSV突变体cpts248/404的序列分析揭示了两个另外的突变，一个在M2基因起始序列的一核苷酸变化和一个在L蛋白质1183位氨基酸的天冬氨酸向谷氨酸的替换(表39；Firestone等，Virology，225：419-522(1996)，此处引入作为参考)。
生物学上获得的减毒RSV病毒株cpts248/404被根据上述的方法重构建成重组病毒(rA2cp/248/404)。编码rA2cp/248/404病毒的cDNAD53是通过插入位点HEK，cp，248和404变化而构建的(表39)。重组病毒(rA2cp/248/404)被回收，噬斑纯化和扩增。通过病毒RNA RT-PCR及其后的限制酶消化或核苷酸测序或二者，分析重组病毒中突变的存在。rA2cp/248/404重组子是用pTMLwt或者pTML 248/404载体质粒来回收的，后者含有生物学上获得的cpts 248/404突变体中L的所有突变(表39，不包括特异于530，1009或1030病毒的突变)。使用pTML248/404作为载体质粒，通过与载体质粒的同源重组而避免在全长克隆中的248/404突变的丢失。
从D53 DNA回收重组病毒，其中只有该位点和HEK突变存在(rA2，表41)，说明这些变化如预期的是表型沉默的变化。回收含有这些点突变、HEK和cp突变的重组病毒(表41，称为rA2cp)，以评估由cp突变决定的表型特征。同样，如表41所示，构建了分别含有这些位点，HEK和cp背景的病毒，以及含有(i)248突变(rA2cp/248)，(ii)两个404突变(rA2cp/404)，和404(M2)突变(rA2cp/404(M2))，和404(L)突变(rA2cp/404(L))的那些病毒。
这些病毒被平行评估在HEp-2细胞中在32℃、36℃、37℃、38℃和39℃形成噬斑的能力。这一比较显示所有病毒都在32℃形成噬斑，显示出不同病毒制备物的滴度的相互间差别是在大约三个log10单位，它是在独立制备的RSV中通常观察到的实验性变化的范围内，将附加的“位点”和HEK突变引入野生型重组病毒中(获得A2病毒)，不会改变病毒在升高温度时的生长能力，与生物学上获得的野生型病毒(A2wt病毒)相比较。另外引入cp突变(获得rA2cp病毒)也不会改变它在升高温度时的生长能力。这是所期待的结果，因为衍生突变的生物学上获得的cpRSV不具有ts表型；它的突变是宿主范围变化性的。L中的404突变不是ts突变，既然rA2cp/404(L)不是ts的。然而，这一突变，可能会被证实是减毒的，这将通过根据本文的方法作进一步的分析而确定。因此，cpts 248/404病毒中的两个专一性突变只有404M2突变是ts的。进一步添加248和404突变(获得rA2cp/248/404病毒)，导致ts表型，它基本上与生物学上获得的等价病毒是等价的，这通过在36℃-37℃形成噬斑的能力是非常匹配的而被证实，它们在更高温度形成微小噬菌体。向重组病毒中引入各种突变预期对在组织培养中的生长没有影响，而附加的突变预期会产生ts表型。每种类型的突变所获得的结果与这些预期是一致的，显示了RSV基因组可以可合理性预计的方式被操作。
表41.筛选的RSV突变体的噬斑形成效率
1重组(r)病毒经过噬斑纯化和Hep-2细胞扩增。注意重组和生物学上获得的病毒的原种被调整含有等量的pfu/ml；此处所见的变化的水平是针对RSV分离物在从噬斑扩增早期典型的水平。每个重组病毒含有L基因位点和F基因HEK突变。“转染子”一列指的是转染和生成噬斑的过程。
2生物学上获得的病毒：A2野生型和cpts248/404(WLVP L16210B-150)。
微小噬斑大小。
表41显示了248和404诱变步骤的特异性突变的进一步分析。具体地，这些病毒的构建使用了点突变，HEK和cp背景，以及(i)248突变(获得病毒rA2cp/248)，(ii)两个404突变(病毒rA2cp/404)；或者(iii)404(M2)突变(病毒rA2cp/404(M2))(表39)。这三个病毒中的每一个都表现出ts表型，提供了这些突变是ts型的直接证据。248突变提供了低水平的温度敏感性，而404(M2)是高度ts型的，并不受404(L)突变的添加所影响。显然404(M2)突变是ts型的，虽然它是在转录起始，或基因起始(GS)或信号区的点突变，而这种类型的突变从来没有显示为ts型的。
实施例XI
结合了预测的从多个减毒亲本病毒来的减毒突变的重组RSV的构建
本实施例描述了产生一个多重减毒重组RSV(rA2cp/248/404/530)的组合设计，该RSV中引入三个来自同一生物学上获得的RSV病毒株(具体为cpts248/404)的突变，和来自另一RSV病毒株(cpts530)的减毒突变。这一重组RSV例证了通过基因工程的逐步减毒突变来提高RSV疫苗中的减毒水平的本发明的方法，其中多个突变产生了疫苗病毒株的更加减毒的表型，并提供了增强的遗传稳定性。
实施例IX和X的cDNA和方法被用于构建含位点，HEK，cp，248，404和530变化的D53 cDNA(表39)。这涉及来自四个独立的生物学上获得的病毒，即cpRSV，cpts248，cpts248/404和cpts530的减毒突变的组合。重组病毒(rA2cp/248/404/530)被回收，噬斑纯化和扩增。通过病毒RNA的RT-PCR和限制性酶消化或核苷酸测序或二者，来分析突变的存在。rA2cp/248/404/530缺少L中的248突变，但是含有530突变和其它的248/404突变。
对rA2cp/248/404病毒在HEp-2细胞中在32℃，36℃，37℃，38℃和39℃形成噬斑的能力进行了评估，如上所述(表41)。所有病毒在32℃形成噬斑，在这个温度的生长效率都是和野生型一样的。rA2cp/248/404/530病毒与生物学上获得的cpts248/404病毒的ts表型是基本一样的，证据是它们在37℃形成噬斑的能力大大减小。因此，530突变加入到rA2cp/248/404背景中并不增强它的ts表型，然而，重组子缺少L中的248突变。
基于这一实施例和前一实施例，本发明使得可以回收广泛范围的重组病毒，它们含有来自一系列突变的两个或更多ts突变。这些突变被鉴定和证明来自生物学上获得的RSV突变体，例如248，404，530，1009或1030生物突变体。这些重组病毒的实例包括具有248/404/530突变，248/404/1009突变，248/404/530/1030突变，248/404/1009/1030突变，或其它的本文公开的减毒突变的组合的RSV。另外，引入一个或多个已鉴定来自生物学上获得的RSV突变体的ts突变的重组RSV，可与本文公开的其它的突变相结合，比如调节RSV基因表达的减毒基因缺失或突变。一个这样的实例是将248/404突变与SH基因缺失结合在一个重组克隆中，由此获得了一个活的疫苗侯选物。本发明也提供了一组其他的组合突变，它们可能引入一个或多个来自生物学上获得的RSV的ts突变，一个或多个此处公布的其它突变，例如，基因或基因片段的缺失，替换，添加或重排。cp突变，它是减毒的宿主范围而非减毒的ts突变，也可能包含本发明的一个或多个其它突变。这提供了一系列病毒，它们代表了在减毒作用、免疫原性和遗传稳定性方面的单独或组合的广泛范围，这些来自生物学上获得的RSV突变的减毒突变，可以进一步与本文鉴定的各种其它的结构修饰相组合，其决定了在重组RSV中的目的表型变化，获得的RSV具有更优越的疫苗特征。
实施例XII
表达附加的外源基因的感染性呼吸道合胞病毒的回收
上面所述的方法被用于构建一个重组RSV，它含有一个附加的编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)的基因。CAT编码序列靠近RSV特异性的基因起始和基因终止基元，即病毒RNA依赖的RNA聚合酶的转录信号。Kuo等，J.Virol.70：6892-6901(1996)(此处引入作为参考)。RSV/CAT嵌合转录盒被插入到完整cDNA编码的正义RSV反基因组的G和F基因的基因间隔区域，表达CAT的感染性重组RSV被回收。CATmRNA被有效表达，而G和F mRNA的水平与野生型重组RSV的表达水平相当。含CAT的病毒的和野生型病毒在主要病毒蛋白质的合成水平是一样的。
质粒D46被用于构建编码含CAT基因的RSV反基因组RNA的cDNA构建体。(质粒D46和D53，后者如上面所描述，是同一种反基因组cDNA的不同制备物)。D46编码完整的、15,223个核苷酸的RSV反基因组(比野生型RSV长一个核苷酸)，被用于产生重组的感染性RSV，如上所述。在构建过程中，反基因组cDNA被修饰以含有四个新的限制性位点作为标记。其中一个是StuI位点，位于G和F基因的基因间隔区(野生型基因组的3’-5’序列的5611-5616位)，该位点被选作外源CAT基因的插入位点。一个拷贝的CAT ORF在上游末端为RSV GS信号所侧接，在下游末端为RSV GE信号所侧接，它衍生自前述的RSV-CAT微基因组(Collins等，J.Virol.70：6892-6901(1996)，此处引入作为参考)。这个RSV/CAT转录盒被插入到StuI位点获得D46/1024CAT cDNA(根据布达佩斯条约，保藏于ATCC，给予的登记号为VR-2544)，该插入将所编码的反基因组的长度增加到总共15,984核苷酸。尽管野生型RSV编码10种主要的亚基因组mRNA，预期的来自D46/1024CAT反基因组的重组病毒编码CAT基因作为第11种mRNA。构建策略如图6所示。
如上所示，由cDNA编码的反基因组RNA产生感染性的RSV，涉及到五种编码反基因组RNA或N，P，L或M2(ORF1)蛋白质的cDNA在HEp2细胞中的共表达，它们对病毒RNA复制和转录是必需和足够的。cDNA表达由基于MVA病毒株的疫苗-T7重组子病毒所提供的T7RNA聚合酶所驱动。MVA-T7重组子病毒产生的感染性子代足以导致传代过程中广泛的细胞病原性，因此在转染后24小时加入疫苗病毒复制的抑制剂阿糖胞苷，并维持在前6次传代中。然而，阿糖胞苷的使用不是必需的，在本文的后面的实施例中没有使用。
两种被检测的反基因组cDNA被用作RSV的回收：D46 cDNA和D46/1024CAT cDNA。用D46/1024CAT重组病毒感染的细胞表达足够水平的CAT酶。对每种病毒来说，转染上清液被传代到新鲜细胞，在五到六天的时间间隔中，进行总共八个连续传代，感染复数少于每细胞0.1PFU。
D46/1024CAT基因组中的CAT序列位于RSV GS和GE信号的邻边，因此会以一个附加的、经分离的多腺苷酰化mRNA的形式表达。这种预测的mRNA的存在是通过对第八次传代的D46/1024CAT病毒或D46病毒感染的细胞的RNA的Northern杂交而进行检测。用负义CAT特异的核酸探针(riboprobe)进行杂交，检测到一个主带，它的合适的大小符合预测的CAT mRNA，其含有735个核苷酸而不包括多聚(A)。它可被寡聚(dT)乳胶颗粒有效截留，显示出它是被多腺苷酰化的。在一些例子中，小量的偏大CAT特异性条带被检测到，它的合适的大小符合G-CAT通读mRNA。在进行用于制备细胞内RNA的感染之前，D46/1024CAT病毒进行八次传代。这时没有较短形式的CAT mRNA存在的证据，如果CAT基因缺失则应可检测到这种形式。
用CAT，SH，G或F基因特异性的核酸探针对复制印迹进行杂交，后两个基因邻近被插入的CAT基因。杂交显示两种病毒的亚基因组SH，G和F mRNA的表达是一样的。用磷酸成像术来比较D46/1024CAT和D46的三个RSV mRNA带的每一个的杂交放射性活性的量。D46/1024CAT和D46的放射性活性的比率对每种mRNA来说经测定为：SH，0.77；G，0.87；F，0.78，活性的偏差显示可能D46/1024CAT比起D46来说，稍微少量的RNA被上样，尽管也可能D46/1024CAT RSV总体水平的mRNA积累稍微有些少。三种比率是一样的这种情况表明，这些mRNA各自的表达水平对D46/1024CAT与D46比较来说大约是一样的。因此，CAT基因插入G和F基因间没有明显影响这两种基因的转录水平。
为对病毒蛋白质合成进行分析，用[35S]甲硫氨酸标记感染的HEp-2细胞，直接或在标记抗原能基本完全回收的条件下免疫沉淀后，通过PAGE分析细胞裂解物。用兔抗纯化的RSV的抗血清进行沉淀，结果表明D46/1024CAT和D46病毒表达相同量的主要病毒蛋白质F1、N、P、M和M2。对各种病毒回收相同水平的M2蛋白质是重要的，因为它的基因在所插入的CAT基因的下游。由紧靠插入下游的基因编码的F蛋白质的积累，也通过使用三种抗F单克隆抗体混合物进行免疫沉淀而检测。由每种病毒回收了相同水平的F1亚基。上面所提到的主要病毒蛋白质的磷酸成像分析进行了几次独立的实验，显示出样品间的变化，但是总体上两种病毒在回收的蛋白质的水平上没有明显差别。抗CAT抗体的沉淀在D46/1024CAT的情况下回收到单一条带，而在D46病毒的情况下没有。总的标记蛋白的分析表明N，P和M蛋白质可以不通过免疫沉淀检测(尽管后者的检测，因其与一些细胞蛋白质的共迁移而受到干扰)，并证明两种病毒产生相同的蛋白质类型。D46/1024CAT模式中的与CAT蛋白质有关的位置与D46的模式比较，含有更大的放射性，这些被通过独立的磷酸成像试验所证实。这暗示CAT蛋白质可不用沉淀法而被从总的标记蛋白质中检测出来，尽管这种证据常常在未感染的和D46感染的模式中，受共迁移的背景条带的存在的干扰。
RT-PCR被用于证实重组RSV基因组中预期位置CAT基因的存在。从D46/1024CAT和D46RSV八次传代的细胞沉淀物中分离总的细胞内RNA。从邻近插入位点即RSV中5611-5616位的StuI限制性内均酶位点，选择了两条引物：上游的正义引物对应于5412-5429位，下游的负义引物对应于5730-5711位。正义引物被用于RT步骤，两条引物都被用于PCR步骤。
D46病毒的RT-PCR获得单一产物，它对应于预期的318核苷酸的片段，代表没有附加外源基因序列的G/F基因连接处。D46/1024CAT病毒RNA的分析，获得一单一产物，它的电泳迁移，与预期的1079核苷酸的片段具良好的一致性，代表含有插入的CAT转录盒的G/F基因连接处。后者的PCR获得一单一的主带；可测的小产物的不存在显示重组基因组群体不含有许多在这个区域中有缺失的分子。当对D46/1024CAT病毒RNA进行PCR分析而不进行RT步骤时，没有观察到任何条带，从而证实该分析对RNA是特异性的。因此，RT-PCR分析证实了D46/1024CAT重组病毒的基因组RNA中预期长度的插入在预期位置的存在。
酶表达被用于测定CAT基因的稳定性。从第三次传代开始的所有传代的细胞沉淀都用于检测CAT表达。对D46/1024CAT病毒来说，所有这些试验中显示14C标记的氯霉素被转化成乙酰化的形式。为研究表达的稳定性，从第三次或第八次传代的20个或25个单噬斑中而来的病毒，被分别用于分析CAT的表达。所有样品都是阳性的，通过等量的细胞裂解物的试验判断，从第八次传代来的分离物的每一个的CAT的表达都是一样的。这表明各个分离物编码的CAT蛋白的活性仍保持未受突变影响。
为检测噬斑的形态和大小，从第二次传代开始，从每一传代步骤中收获八分之一的培养基上清(即0.5ml)，用于感染六孔板中的新鲜HEp-2细胞，在甲基纤维素的履盖下温育五到七天。这些细胞被固定并通过用抗RSV F蛋白质的单克隆抗体温育来染色，然后加入第二种连接辣根过氧化物酶的抗体。先前已观察到，当接种到先前未受感染的黑猩猩的呼吸道时，由cDNA D46产生的重组RSV与天然存在的野生型RSV分离物的复制和致病能力以及体外一个温度范围内的噬斑形成效率无显著差别。因此，D46重组RSV被认为是致病性野生型病毒株。通过抗体染色对D46和D46/1024CAT重组病毒产生的噬斑进行了比较。两种病毒的噬斑形态是非常相似的，尽管基于测定每个病毒的30个随机选择的噬斑表明，含CAT的重组子噬斑的平均大小为D46病毒的90％。
在一步生长周期中对组织培养中的D46和D46/1024CAT的复制效率进行了比较。用各种病毒感染三份单层细胞，在12小时间隔取样，并通过噬斑试验计数。结果显示，相对于D46，D46/1024CAT病毒的产生被延迟，所达到的最大滴度是低20倍的。
这些结果显示出，可以构建重组的、独立于辅助病毒的RSV来表达外源基因，在这个例子中是CAT基因。重组RSV表达预期的多腺苷酰化亚基因组mRNA，该mRNA编码CAT蛋白质，蛋白质用酶分析和放射免疫沉淀进行分析。其它实例中产生的RSV重组体带有插入到相同的CAT位点的荧光素酶基因，或者插入到SH和G基因间的CAT或荧光素酶基因。这些病毒也表现出减弱的生长，而许多回收的野生型重组病毒表现出未减弱的生长。这表明减弱的生长实际上与插入的基因有关，而不是由于基因组中的其它的随机突变。当增加插入的基因的长度时，减毒的水平也表现出增加。将外源基因插入到重组RSV中能够减弱它的复制水平并能在体外传代过程中保持稳定，这一发现暗示提供了另外一种可用于疫苗减毒的方法。同样，向重组RSV中插入表达具有抗病毒活性的蛋白的基因，比如γ-干扰素和IL-2，以及其它基因，可获得的病毒的减毒作用是由于所表达的抗病毒蛋白的活性。
除了证实回收的RSV具有修饰的生长特征外，本实施例还描述了重组RSV和其它的非节段化的负链病毒基因表达的重要方法和优势。例如，这些资料证实外源编码序列可以作为单独的转录盒引入，并作为单独的mRNA进行表达。这些结果也显示了RSV对基因组长度的大幅增加的忍耐性，例如本例中的CAT基因由762核苷酸增加到15,984个核苷酸(野生型RSV的1.05倍)。被成功回收的荧光毒酶基因几乎是三倍长。
病毒RNA依赖的RNA聚合酶已知具有易错的性质，因为它缺少校读和修复机制。在RNA病毒基因组中，突变的频率估计平均每一位点高达10-4-10-5(Holland等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，176：1-20(1992)，以及其它文献)。在此处产生的重组D46/1024CAT RSV中，外源基因的正确表达与病毒复制无关，而且不会积累突变。这里描述的传代所涉及的感染复数小于每细胞0.1 PFU，每一传代的时间显示涉及到了多轮感染。尽管从RSV感染的组织培养细胞中的感染性病毒的收获量比较低，细胞内的大分子合成是比较多的，感染性病毒的较少的收获看来代表装配步骤的低效率而不是低水平的RNA复制。CAT在八次连续传代中的保持涉及到多轮的RNA复制。令人惊讶地在第八次传代时，检测的25个分离物中非必需CAT基因均完整保留并能编码具全部功能的蛋白质。而且，由第八次传代分离的RNA的RT-PCR分析没有检测到CAT基因内的缺失。
另一个感染性RSV-CAT重组体被构建，其中CAT转录盒被插入XmaI位点，该位点是通过基因工程方法引入SH-G基因间隔区域的(它是比上述的F-G基因间隔区域靠近启动子一个位置)。这个重组子的生长特征和D46/1024 CAT重组子是一样的，而CAT表达的水平大约为两倍到三倍高，与它更接近启动子的位置是一致的。这显示出当外源基因插入到基因组中另外一个不同的位点时，它的表达水平也会相应改变。原则上，编码外源蛋白的转录单位插入到基因组的任何部分都是可以接受的，只要插入不破坏mRNA编码单位和不干扰建立在基因组两端的顺式作用序列元件。
另一感染性RSV也被回收，其中的CAT基因被荧光素酶(LUC)标记基因替换。LUC编码序列大约1,750bp(为CAT大小的三倍)，长于除F和C外的任何RSV基因。它被插入到SH-G或G-F基因间隔区域，并回收了感染性重组病毒。在组织培养的生长过程中，LUC病毒相对于CAT病毒来说被进一步减毒，暗示基因组长度的增加导致生长效率的降低。这些CAT和LUC病毒的分析，可以确定外源基因的长度对于基因表达和生长的影响，如多大程度上是由于附加的转录信号的引入，多大程度上是由于增加的基因长度。
在小复制子系统中，RSV-CAT微基因组被修饰以便在正义反基因组而非微基因组中，这一转录单位处于“正义”取向。因此，只有当反基因组复制中间物可被聚合酶转录时，才有亚基因组mRNA被制备。有趣的是，当与质粒表达的N，P，L和M2 ORF1蛋白质互补时，这些反向RSV-CAT微基因组能够合成亚基因组的、多腺苷酰化的可翻译mRNA。有效的mRNA合成依赖于M2O RF1蛋白质，微基因组转录也是这样。mRNA比较于它的反基因组模板的水平，与mRNA比较于由标准小复制子制备的微基因组模板的比率是一样的。这显示出反基因组和微基因组一样，能够接受外源转录单位。因此，进行外源基因的表达，可以不将它置入基因组的转录方向上。这样的好处是，外源基因不是基因组转录程序的一部分，不会干扰这些基因表达的相对水平。
因为两个RSV抗原亚型的大部分抗原差异是在G糖蛋白上，可以构建表达异源亚型G蛋白的重组RSV，从而获得二价疫苗。一些其它呼吸道病毒例如人副流感3病毒的包膜蛋白基因，也可插入并用重组的RSV表达。其它用途包括免疫调节剂例如白介素6的表达，以增强感染性RSV的免疫原性。其它用途，比如使用这里描述的被修饰RSV作为基因治疗的载体。
实施例XIII
具有SH基因缺失的重组RSV
这个实施例描述了一种重组RSV的获得，其中通过去除编码SHmRNA和蛋白质的多核甘酸序列，消除了SH基因的表达。SH蛋白质是一种小蛋白质(毒株A2中为64个氨基酸)，它含有14-41位氨基酸的可能的跨膜结构域。它在膜中的方向是C-端暴露在外，在C-末端和N-末端都具有可能的糖基化位点(Collins等，J.Gen.Virol.71：3015-3020(1990)，引入本文作为参考)。在被感染的细胞中，毒株A2的SH蛋白质以四种主要的形式积累：(i)SH0(Mr7500)，最多的全长未糖基化形式(Olmsted等J.Virol.63：2019-2029(1989)这些内容引入本文作为参考)；(ii)SHg(Mr 13,000-15,000)，它是含有一个N-连接的糖链的全长形式；(iii)SHp(Mr 21,000-40,000)，它是Shg的经修饰形式，其中的N-连接糖链又被加入聚乳糖胺聚糖而修饰(Anderson等，Virology191：417-430(1992)，这些内容引入本文作为参考)；(iv)SHt(Mr 4800)，一个截断的非糖基化形式，它从另外一个甲硫氨酸密码子(23位)起始，并与其他形式不同，未表现出转运到细胞表面。SH0和SHp形式被从纯化的病毒体中检测到，暗示了它在病毒体形态形成水平的选择性(Collins等，同上(1993))。
在副粘病毒中，表面上相似的SH蛋白质也在猿猴病毒5(Hiebert等，J.Virol.55：744-751(1985)，这些内容引入本文作为参考)，牛RSV(Samal等，J.Gen.Virol.72：1715-1720(1991)，此处引入作为参考)，腮腺炎病毒(Elango等，J.Virol.63：1413-1715(1992)，此处引入作为参考)，和火鸡鼻气管炎病毒(Ling等，J.Gen.Virol.73：1709-1715(1992)，此处引入作为参考)中。线状病毒的小的疏水蛋白VP24，被认为是一种表面蛋白，也是一种可能的副粘病毒SH蛋白质的对应物(Burkreyev等，Biochem.Mol.Biol.Int.Lnt.35：605-613(1995)，此处引入作为参考)。
先前未知SH蛋白质的功能。在表达质粒编码的蛋白质的细胞的融合试验中，RSV蛋白质对CV-1细胞的有效融合要求F，G和SH蛋白质的共表达(Heminway等，Virology 200：801-805(1994)，此处引入作为参考)。未由理论推断的RSV SH蛋白质的几种功能可能是：(i)它可能增强病毒的附着或穿透(Heminway等，同上)；(ii)它可能与病毒体的形态形成有关；或者(iii)它在病毒生长中可能具有“间接”功能而不是直接功能，比如最后在仙台病毒V蛋白中所描述的那样，它与宿主免疫系统的组分相互作用(Kato等，EMBO J 16：178-587(1987)，此处引入作为参考)。上述的功能(i)或者(ii)可能涉及对膜的透过性进行修饰的活性，这由其它的一些病毒的疏水蛋白质所暗示(Maramorosh等(编辑)，Advances in Virus Research 45：61-112(1995)；Schubert等，FEBS Lett(1996)；Lamb等，Virology 229：1-11(1997)，各篇此处引入作为参考)。SH蛋白质的所有这些可能的活性可以在本发明中被引入，根据上述的方法和策略，从而得到有附加优势的RSV重组疫苗。
为产生SH基因功能被选择性破坏的重组RSV，SH基因被从亲本RSV克隆上完全删除。上面所述的D46质粒是一个这样的克隆，它编码完整的RSVA2反基因组RNA，其被用于成功获得重组RSV(美国专利申请08/720/132，美国临时专利申请60/007,083，各篇此处引入作为参考)。这种反基因组比天然存在的基因组长一个核苷酸，含有几种任选的限制性位点标记。D46质粒被修饰以便完整的SH基因被缺失，获得质粒D46/6368(图7)。
质粒D46/16368的构建涉及两种亲本亚克隆，即D50，它含有的T7启动子连接在包括前导区至L基因起点的基因组的左手边末端，而D39，它含有M2末端和L基因，其连接在锤头状核酶的下游末端，和两个串联的T7转录终止序列。D50质粒被用ScaI(完整的15,223核苷酸反基因组序列的4189位)和PacI(4623位)消化，获得的435bp的片段被用由两互补寡聚核酸构建的一个短DNA片段替换。在这个例举的缺失中，435-bp片段位于ScaI和PacI位点间，其相应于M基因的下游末端、它的GE信号和除GE信号最后的六个核苷酸外的完整SH基因(图7)。它被用两个合成的部分互补的寡聚核苷酸，5’-ACTCAAATAAGTTAATAAAAAATATCCCGGGAT-3’[SEQ ID NO：3](正义链，M GE序列被用下划线标示，XmaI位点被用斜体表示，而在左边和右边的ScaI半位点和PacI粘性末端分别用粗斜体表示)和5’-CCCGGGATATTTTTTATTAACTTATTTGAGT[SEQ ID NO：4](负义链)替换。这个cDNA，被称为D50/6368，被用于接受含有反基因组残余的D39的BamHI-MluI片段。由此获得了D46/6368质粒，它编码除缺失序列外的完整的反基因组，此反基因组长14,825nt，比由野生形质粒D46编码的反基因组短398nt。用双脱氧核苷酸序列分析证明了插入的序列。任选地引入一个XmaI位点，因此在后面的工作中插入片段可以很容易地置入这个位置。
病毒的转染，生长和传代，噬斑纯化，病毒噬斑的抗体染色，可根据上面所述的方法来进行，但是上述方法可有两处改变：(i)阿糖胞苷，即一种疫苗病毒的抑制剂没有使用，(ii)用于转染的HEp-2细胞在32℃或37℃培养，而所有回收的病毒在37℃繁殖。
为评价总RNA和聚腺苷酸化RNA的量，刮下细胞并重新悬浮在100μl的水中，总细胞内RNA用TrizolTM试剂(Life Technologies)分离，根据制造商的建议进行操作(除了在异丙醇沉淀后RNA用酚-氯仿提取两次，之后乙醇沉淀)。聚腺苷酸化RNA用Oligotex mRNA试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)分离。
为进行反转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)，SH基因区被复制进cDNA并扩增。总的细胞内RNA被用于反转录，使用Superscript II(LifeTechnologies)，用正义合成的寡聚核苷酸5’-GAAAGTATATATTATGTT-3’[SEQ ID NO：5]作引物进行反转录。这个引物与SH基因上游的3958-3975位核苷酸互补。一小份cDNA产物被用作PCR模板，使用于上面提到的寡聚核苷酸和负义寡聚核苷酸5’-TATATAAGCACGATGATATG-3’[SEQ ID NO：6]作为引物。后一引物对应于基因组的4763-4782位核苷酸，它位于SH基因的下游。在起初2分钟，进行变性步骤，此间加入Taq DNA聚合酶，然后进行33个循环(94℃变性1分钟，39℃退火1分钟；72℃延伸2分钟)。产物然后在2.5％琼脂糖凝胶上进行分析。
为进行Northern杂交，在甲醛存在的情况下在琼脂糖凝胶上进行电泳来分离RNA，并转移给硝酸纤维素膜。用[32P]-CTP-标记的M、SH、G、F、M2和L基因DNA探针进行杂交，这些探针是体外用合成的六聚体(Boehringer Mannbeim，Indianapolis，IN)随机引发，用Klenow聚合酶从cDNA分别合成的。使用Moleculor Dynamics(Sunnyvale，CA)磷成像仪445SI对杂交的放射活性进行定量测定。
如上所述进行35S甲硫氨酸标记，免疫沉淀，和聚丙烯酰胺凝胶电泳(Bukreyev等，同上)。使用预制的4-20％ Tris-甘氨酸凝胶(Novex)进行电泳。
为进行体外生长分析，HEp-2,293，CV-1，Vero，MRC-5，非洲绿猴肾细胞(AGMK)，牛鼻甲和MDBK细胞单层被用于一步生长分析。对每种类型的细胞来说，三个25-cm2的摇瓶被用107PFU的D46/6368(SH-负型)或D46(野生型重组体)病毒进行感染。含2％胎牛血清(FBS)(Summit)的Opti-MEM(Life Technologies)被用于HEp-2，Vero，293，BT，MRC-5和AGMK细胞，含1％或2％ FBS的E-MEM(LifeTechnologies)被分别用于MDBK或BT细胞。37℃吸附3小时后，用4ml培养基洗涤细胞3次，加入4ml培养基，然后在37℃，5％CO2条件下培养细胞。然后，在各次接种后(见下)，取出200μl培养物上清液，使之含100mM硫酸镁和50mM HEPES缓冲液(pH7.5)速冻，-70℃贮存直到测定效价；取出的每一份样都用等量的新鲜培养基替换。为了测定效价，用10倍稀释的样品感染HEp-2细胞(24孔板上)，用含2％FBS和0.9％甲基纤维素(MCB试剂)的Opti-MEM覆盖。培养7天后，弃去培养基，用80％甲醇在4℃固定细胞单层。用RSV F蛋白质特异性的三种单克隆抗体的混合物与噬斑温育，然后加入连接有辣根过氧化物酶的羊抗鼠IgG(Murphy等，Vaccine 8：497-502(1990)，这些内容引入本文作为参考)。
在上述的步骤后，对重组的缺少SH基因的感染性RSV进行回收，其中质粒D46/6368与编码N，P，L和M2 ORF1蛋白质的质粒共转染进HEp-2细胞，同时细胞用表达T7RNA聚合酶的MVA疫苗病毒株进行感染。用D46野生型cDNA在同样条件下转染平行的培养物。转染后三天收集培养物上清液并传代一次。37℃培养6天后，代表每一原始转染的培养物上清试样被铺到新鲜的HEp-2细胞上，在甲基纤维素的覆盖下培养六天，通过与RSV F蛋白特异性的三种单克隆抗体反应然后与连接了辣根过氧化物酶的二抗反应而进行染色。野生型重组病毒和SH-负型病毒的噬斑形态非常相似，除了后者的噬斑是大一些外。引人注意的是，由每种对照和SH-负型病毒所形成的噬斑都含有合胞体。
为证实所回收D46/6368病毒基因组中SH基因的缺失，用第一次传代的野生型或SH-负型重组病毒来感染细胞，回收总的细胞内RNA，用RT-PCR进行分析。用与SH基因上游即基因组中3958-3957位退火的正义引物进行RT。用同一引物以及相应于SH基因下游4763-4782位核苷酸的负义引物进行PCR。如图8所示，野生型D46病毒获得一个相应于预期的3958和4782位间的824bp片段的单一PCR产物(泳道3)，在D46/6368病毒情况中，PCR产物较短，对应于含有缺失的预期的426bp片段(泳道2)。PCR产物的产生依赖于RT步骤，表明它们像期待的那样衍生自RNA而非DNA。因此，RT-PCR分析表明D46/6368病毒基因组含有预期的在SH座位的398核苷酸的缺失。
为检测SH基因的上游和下游的基因的转录，从D46或D46/6368病毒感染的细胞中分离聚腺苷酸化mRNA，用Northern印迹杂交分析(图9)。在聚腺苷酸化筛选前，细胞内的RNA没有被变性；因此，如下所示，由于对mRNA的夹心式杂交，筛选出的mRNA也含有基因组RNA。这使得可以同时对mRNA和基因组进行分析，在同样的凝胶泳道中可以比较mRNA相对于基因组RNA的丰度，因此可以比较泳道间的mRNA的丰度。印迹用[32P]标记的DNA探针进行杂交，探针是利用随机引发从cDNA克隆合成的，因此含有双极性的探针，筛选的探针分别代表M，SH，G，F，M2，和L基因(图9)。
SH探针与野生型D46病毒的亚基因组SH mRNA和基因组RNA杂交，但不与D46/6368的杂交(图9)。其它RSV基因的特异性探针在各种情况下，都能够和两种病毒的基因组及预期的大的单顺反子mRNA杂交。另外，大量的先前描述的双顺反子通读mRNA也在两种病毒中被检测到，例如F-M2，G-F和P-M mRNA。
G特异性探针与对D46/6368病毒具特异性的新的条带杂交，其表明是M和G基因的通读。这种组合可能是插入性SH基因的缺失。同样条带，对D46/6468而非D46具特异性，显示出另外只与M特异性的探针杂交。
接着对D46与D46/6368的每种mRNA相对合成水平进行了定量。对每对的比较来说，给定凝胶泳道中的mRNA量是相对于基因组的量来定量的。这种比较显示D46/6368比较D46以如下所显示的比率表达mRNA(D46/6368对D46)：M(1.1)，G(1.3)，F(0.61)，M2(0.32)，和L(0.17)。
为比较D46对D46/6368 RSV克隆合成的病毒蛋白质，用感染复数为2PFU每细胞的病毒感染HEp-2细胞，在感染后16到20小时，用[35S]甲硫氨酸温育来进行标记。制备细胞裂解物，直接分析，或在用兔抗纯化的RSV病毒体抗血清免疫沉淀后进行分析。总蛋白和免疫沉淀的蛋白质加到4-20％梯度凝胶上进行PAGE(图10)。
对D46病毒来说，免疫沉淀蛋白包括未糖基化形式的SH蛋白质，SH0，和N-糖基化的形式，SHg，而两种蛋白在D46/6368病毒中都不明显(图10)。SH0蛋白质也能够从D46情况下的总的感染细胞蛋白质中检测到，但是对D46/6368则不然。另外，D46与D46/6368相比较所合成蛋白的样式基本上没有明显差别。免疫沉淀蛋白质中N，P，M，F1，和M2蛋白质的磷成像分析显示，两种病毒中合成这些蛋白的量是等价的(图10)。
如上所述，通过噬斑分析对D46和D46/6368病毒进行了初步比较，显示出它们的体外生长表现出差异。因此，我们进一步比较了HEp-2细胞中两种病毒的噬斑大小。特别注意的是要使单层细胞是年轻的，没有过度生长，既然这种变化能够影响噬斑大小。37℃，甲基纤维素覆盖下培养7天后，用甲醇固定单层细胞并照像。这显示了噬斑大小的重要差别。对每种病毒测定了30个噬斑，显示出D46/6368病毒的噬斑比D46病毒平均大70％。
进行了进一步的实验，对表示不同种和不同组织来源的8种不同的细胞系进行生长曲线分析，以比较D46和D46/6368病毒的复制效率(表42)。用两种病毒之一对三份各类型细胞单层进行感染，以12或24小时的间隔取样，用噬斑测定和抗体染色进行定量。令人惊奇的是，在三个细胞系(即Hep-2,293和AGMK-21细胞)中，D46/6368病毒产生了高于D46野生型的滴度。在HEp-2细胞中(图11)，在感染后36小时时，子代D46/6368病毒的滴度比D46病毒高2.6倍。在293细胞中(图12)，感染后36小时时D46/6368病毒的收获量比D46病毒大两倍，而在感染后60和84小时时，该差别分别增加到4.8和12.6倍。在AGMK-21细胞中(图13)，感染后36小时时D46/6368病毒收获量是D46的32倍。在MRC-5，Vero，CV-1，MDBK和BT细胞中突变株和野生型病毒的复制没有显著差别，这表明SH-负型RSV的生长基本上不受宿主范围效应的影响。
表42
在不同的细胞系中D46/6368病毒的复制与D46病毒的复制的比较D46/6368病毒复制
Figure C00806217D01561
本文的这些以及其它发现证明，SH基因的缺失不仅产生可回收感染性RSV，而且产生的重组RSV在组织培养中的生长能力有显著的增加，这些判断是基于感染性病毒的收获量和噬斑大小。这种由于SH缺失而表现出组织培养生长能力的增加为开发RSV疫苗提供了有用的工具，例如克服了RSV在培养物中收获量低的问题。而且，这些缺失是高度稳定的，能够抗遗传反转，这使得由其衍生得到的RSV克隆特别适于用作疫苗制剂。
为了评价典型的SH-缺失克隆在小鼠中的复制，免疫原性和保护效率，选取24只一组、无呼吸病原的13周龄BALB/c小鼠，第0天在轻度甲氧氟烷麻醉下，以106PFU/动物、0.1ml接种物经鼻接种，接种物是野生型重组D46病毒、SH-负型重组D46/6368病毒或生物学上获得的冷传代(cp)温度敏感性(ts)病毒cpts248/404(Firestone等，同上，(1996)，此处引入作为参考)。后一种病毒在啮齿类，黑猩猩和人中已进行了广泛的鉴定，它在小鼠的上呼吸道和下呼吸道中的复制是高度受限制的。在接种后4、5、6和8天时，各组的6只小鼠被CO2窒息法处死，然后分别获取其鼻甲和肺组织，匀浆，用前述的抗体染色法在噬斑试验中对病毒计数。
在上呼吸道中，SH-负型D46/6368病毒表现出减毒表型(表14)。在本实施例中，其复制水平比野生型病毒低10倍，与cpts248/404病毒相似。相反，在下呼吸道中(图15)，D46/6368的复制水平与野生型非常相似，而cpts248/404病毒受高度限制。在另外的研究中表明，亲代D46cDNA编码的SH-负型重组病毒在完全允许的实验动物幼龄黑猩猩中，在上呼吸道中(图15)，该病毒具轻度减毒表型，而在下呼吸道中具中度减毒表型。这个突变体在黑猩猩中引起与野生型RSV相比大大减弱的疾病症状，而激发对于野生型病毒攻击的显著的抗性。Whitehead等，J.Virol.73：(4)3438-3442(1999)，此处引入作为参考。
前面的资料显示，从实验室毒株装配的亲代重组病毒，具有在许可宿主中复制和毒力所需的全套完整基因。这些和其他例举的基因缺失RSV毒株的特性，有助于提供了许多可用于疫苗的方法和毒株。
为了进一步评价重组RSV的免疫原性和保护效率，用野生型重组体和它的SH-负型衍生物，或cpts248/404病毒如上所述对另外四组小鼠进行接种，或模拟感染。四周后麻醉小鼠，取血清样品，经鼻给予106PFU/动物的生物衍生RSV A2株作鼻内接种。4天后处死动物，收集鼻甲和肺组织，并如上所述测定感染性RSV。在ELISA中用免疫亲和纯化的F糖蛋白中来测定与RSV F蛋白结合的血清IgG抗体(Murphy等，同上，1990)。
D46野生型、SH-负型D46/6368病毒和cpts248/404病毒的免疫原性试验表明，在第0天被三种病毒任一种感染的小鼠产生了高水平的F特异性血清抗体(表43)。所有这些测试宿主的上呼吸道和下呼吸道中均有对RSV攻击病毒复制的高度抵抗力。因此，SH-负型突变体与其野生型亲本在小鼠中诱导RSV特异性血清抗体和保护能力方面没有区别。
表43.RSV D46/6368 SH-负型病毒具有免疫原性，并保护小鼠的上呼吸道和下呼吸道抵抗野生型病毒攻击
Figure C00806217D01581
1在第0天用106pfu的所示病毒对BAIB/c小鼠鼻内免疫。
2在ELISA中用来自RSV亚型A的免疫纯化的F糖蛋白对血清IgG抗体反应定量。
3在第28天小鼠鼻内给予106pfu的RSV A2，4天后处死。
4野生型重组病毒。
5SH-负型重组病毒。
不同RSV和不同肺病毒的SH基因的比较为生产有用的RSV重组疫苗提供了其它有用的工具和方法。例如，两个RSV抗原性亚型A和B在某些SH结构域中表现出相对高度的保守性。在两个这样的结构域中，RSV A和B的N-末端区域和推定的跨膜结构域在氨基酸水平上表现出84％的同一性，而推断的C端胞内结构域有更大的差异性(约50％同一性)(Collins等，同上，1990)。对两个人RSV亚型B的病毒株8/60和18537的SH基因进行比较，确定只有一个氨基酸不同(Anderson等，同上)。人和牛RSV的SH蛋白有约40％的同一性，它们共有的主要结构特征包括(i)与上述相似的保守残基的不对称分布；(ii)非常相似的疏水性分布；(iii)疏水区的两侧的有两个N-连接的糖基化位点的存在；和(iv)在每个SH蛋白的中间疏水区的羧基端侧有一个半胱氨酸残基。(Anderson等，同上)。通过评估这些以及其它序列的相似性和差异性，能够筛选出用于替换或插入到感染性RSV克隆中的异源序列，例如用来产生有多种特异性免疫原性效应的疫苗。
在本实施例中，对D46和D46/6368的转录分析获得了其它重要的发现。两种病毒的总体转录水平基本上相同，但是Northern印迹分析揭示了在单个mRNA种类的积累中存在某些差别。应注意，两种病毒中位于SH基因上游的M基因的转录是基本相同的。然而，SH基因的缺失却使其下游邻近的G基因的转录增加(图16)。根据这些结果，所选RSV基因的转录水平可通过改变RSV图谱中基因的各自极性或邻近程度来方便地变化。例如，D46病毒的G基因在基因次序中是第7个，但是SH基因的缺失使其处在第6个位置，从而使其转录水平增加。其它重组病毒系统中报道的与基因次序变化相关的转录的增加，低于2.5到3倍(例如，参见kuo等，同上(1996))。
前述研究中揭示的另一重要的发现是，在SH-负型突变株中，G基因下游的各个基因(F、M2和L)的表达效率较低，而且这些下游基因显示出D46/6368的极性梯度比野生型D46病毒更陡(图16)。值得注意的是，SH缺失的工程化D46/6368的M-G基因间隔区的长度为65个核苷酸。相比较而言，病毒株A2中最长的天然存在的基因间隔区是44个核苷酸的M-SH、46个核苷酸的F-M2和52个核苷酸的G-F基因间隔区，而病毒株18537的F-M2基因间隔区有56个核苷酸(Johnson等，J.Gen.Virol.69：2901-2906(1988)，此处引入作为参考)。病毒株A2中天然存在的基因间隔区，大小范围从1到52个核苷酸，对转录通读的效果和双顺反子微基因组的极性影响上基本没有显著差别(Kuo等，同上，1996)。然而，根据本发明的方法对长度长于52nt的G-F区域进行检测，证明在大于这一长度后，聚合酶受到更严重的影响。因此，在SH-负型缺失克隆中发现的基因次序改变导致了G基因转录的增加要比预期的低，以及下游基因转录降低，也许都是由于基因工程所致的M和G间基因间隔区长度的增加。在这方面，调整本发明中RSV克隆基因间隔区的选定长度，预计可为生产有用的RSV疫苗提供额外的工具和方法。
上述发现为改变RSV基因表达水平提供了其它两种方法。第一种方法是，非必需基因的缺失可上调下游基因的表达水平。第二种方法是，插入长度超过野生型基因间隔区的插入可以降低下游基因的转录水平。预计下游基因表达水平的降低可以产生在许可宿主，如黑猩猩和人中具减毒表型的重组RSV。
SH-负型病毒可在组织培养物中良好生长并且在上呼吸道中表现出位点特异性减毒，这提供了疫苗开发的新的优势。现在作为活病毒评估的RSV毒株，含有例如cp突变(在渐低的温度下长期传代时获得；以产生cpRSV株)。例举的cp突变涉及N、F和L中的5个氨基酸替换，它们不产生温度敏感性或冷适应。另外，这些突变对组织培养物中的生长能力没有显著影响。它们是有宿主范围的突变，因为它们在黑猩猩和人下呼吸道中的复制受限制大约100倍。另一类典型的突变即ts突变已经通过cpRSV的化学诱变获得。这类突变倾向于优先限制下呼吸道中的病毒复制，因为从上呼吸道到下呼吸道存在体温增加的梯度。与这些cp和ts突变相反，这里描述的SH-负型突变株有不同的表型，它在上呼吸道中更受限制。这是用于婴幼儿疫苗病毒特别需要的，因为在这一易感年龄组主要通过鼻孔呼吸，需要限制上呼吸道中的病毒复制以确保疫苗给与的安全。另外，在任何一个年龄组中，减低上呼吸道中的复制会降低中耳炎的发病率。除了这些优点外，SH缺失突变(包括例如近400个核苷酸和整个mRNA的消除)的特征表示了一类非常难以回复的突变。
实施例XIV
含有SH基因缺失而不引入异源序列的重组RSV
本实施例描述了一种重组RSV的产生，其中通过去除编码SH蛋白的多核苷酸序列而消除SH蛋白表达，而且不像前述实施例XIII那样引入异源序列。在本实施例中，一种SH编码序列被去除的RSV克隆D46/6368，它还与天然存在的基因间隔区最长(52个核苷酸)的A2病毒株相比，具有的特征是M-G基因间隔区长度被增加至为65个核苷酸。该工程改造的基因间隔区含有包括SmaI位点的异源序列。这些变化产生了某些有利的结果，例如下游基因的转录效率降低。然而，为了其它应用，希望在不伴随异源序列引入的情况下进行缺失或改变，如本实施例所述(图17)。
本文如上所述的D13质粒(见实施例VII)含有T7启动子，该启动子与包括前导区、NS1、NS2、N、P、M和SH基因的基因组(全部15223个核苷酸的反基因组序列中1到4623位的序列位置)的左手端相连。ScaI(位置4189)至PacI(位置4623)片段被用两个部分互补的合成的寡聚核苷酸替换，两个寡聚核苷酸是：ACTCAAATAAGTTAAT(SEQ IDNO：7)(正义链，在左侧的ScaI半位点用斜体字表示，在右侧的PacI粘性末端用斜体字表示，GE信号部分用下划线表示)和TAACTTATTTGAGT(SEQ ID NO：8)(负义链，在右侧的ScaI半位点用斜体字表示，GE信号部分是下划线表示)。该突变使M GE信号、M-SH基因间隔区和完整的SH基因缺失，结果将SH GE信号上移代替M基因GE信号。没有异源核苷酸序列的引入。获得的cDNA称为D13/6340，将其连接G-F-M2 cDNA片段(见实施例VII)，产生D50/6340，D50/6340从前导区跨越到L基因的开始处。
D50/6340的StuI-BamHI片段(从位置5613到8501，包括F和M2基因)被切下，用等价的片段D50-COR#1替换，D50-COR#1片段是等基因的，除了含有如上所述的F基因的两个“HEK”变化。获得的D50/6340HEK被用于接受D39位点#12的BamHI-MluI片段，它含有残余的反基因组cDNA和邻近的核酶和T7转录终止序列(见实施例IX)。D39位点#12是D39的一个形式，它含有“位点”突变(见表39)。这样产生了质粒D46/6340HEK，它编码一个缺失SH基因的反基因组，其含有“HEK”和“位点”变化。D46/6340的反基因组cDNA比它的亲本D46c DNA序列短417bp。合成的ScaI PacI插入序列被双脱氧核苷酸测序所证实。通过上面所述的方法，成功地用cDNA回收了重组病毒。回收的D46/6340 SH缺失病毒，在噬斑表型和生长特征上，与实施例XIII中所述的D46/6368 SH缺失病毒类似。
实施例XV
NS2蛋白表达的剔除
本实施例描述了消除RSV蛋白NS2的合成。在本例中选择的消除方法是将终止密码子引入翻译读码框(ORF)中。
D13是表示完整反基因组cDNA左手端的cDNA，其包括T7启动子、前导区、以及NS1、NS2、N、P、M和SH基因(序列位置1-4623)(图18)。将该cDNA的AatII—AflII片段(含有T7启动子和NS1和NS2基因)亚克隆入pGem载体中，对其进行寡核苷酸定向诱变，以将两个翻译终止密码子和一个XhoI位点(在翻译水平上是沉默的，用作标记)引入NS2ORF中(图18)。确认突变的序列，将AatII—AflII片段插人D13中，然后将D13与含有G、F和M2基因的PacI-BamHI片段连接，产生含有插入突变的cDNA D50。然后将D50与D39的插入物连接，从而产生用来回收重组病毒的完整反基因组cDNA。重组RSV中突变的存在通过RT—PCR产物的测序和XhoI消化来确认。另外，通过用抗合成肽(表示NS2的C端)的兔抗血清进行Western印迹分析来确定NS2蛋白合成的缺乏。
图19显示了采用上述用于SH-负型病毒的测定方法就NS2剔除病毒与重组野生型病毒的生长曲线所作的比较。这些结果证明NS2剔除病毒的感染性病毒释放速度比野生型低。另外，该突变株和野生型病毒的噬斑比较表明NS2剔除病毒的噬斑大大减小。因此这类突变可引入活的重组RSV中，以产生改变的表型(在本例中是病毒生长速度的降低和体外噬斑的减小)。因此，根据已知的体外噬斑的减小和体内减毒之间的相互关系，这些以及其它剔除方法和突变株可提供更多种类的重组RSV疫苗制剂。
实施例XVI
通过改变顺式作用调节序列元件来对RSV表型进行调节
本实施例描述了通过改变例举的NS1和NS2基因的顺式作用转录信号来调节重组RSV病毒的生长能力。
对亚克隆的表示基因组左手末端的D13的AatII—AflII片段进行寡核苷酸定向诱变，以将变化引入NS1和NS2基因的GE信号中(图20)。NS1 GE信号有一个核苷酸替换，而NS2的GE信号有三个替换和一个插入。这些变化可将各信号变成与天然存在的N基因GE信号相同。
用双脱氧核苷酸测序法来确认这些突变，将AatII—AflII片段替换成D13(D13取自上述步骤)，从而构建成含有这些突变的完整D53DNA。用该克隆来回收重组病毒。
在Hep-2细胞中分析GE-突变病毒，并与野生型病毒噬斑大小和生长曲线作比较。结果表明，其噬斑比野生型大(平均大30％)，而生长速度和病毒产量均有所增加。这些结果与通过改变顺式调节元件而导致基因表达的改变是一致的，例如降低了通读mRNA的水平，增加了下游基因的蛋白表达。获得的重组病毒表现为生长动力学的提高和噬斑增大，本文仅仅提供了一个实例，通过改变基因组或反基因组中顺式作用调节元件来改变RSV表型。本文的这些以及其它实例证明了具有广泛决定表型变化的各种特异性RSV突变可用于提供有效的疫苗制剂。
实施例XVII
具有NS1基因缺失的重组RSV
本实施例描述了重组RSV的制备，其中由于除去了编码NS1蛋白的多核苷酸，NS1蛋白不被表达。NS1蛋白是139个氨基酸的小蛋白，它由3′-5′RSV基因图谱中的第一个基因编码(Collins和Wertz，Proc. Natl.Acad.Sci.USA 80：3208-3212(1983)以及Collins和Wertz，Virol.243：442-451(1985))。其mRNA是RSV mRNA中丰度最高的，这与转录梯度的存在这一发现是一致的，即基因表达的效率随着到启动子3’端距离的增加而降低。NS1蛋白被认为是表达丰度最高的RSV蛋白之一，但是还需要进行仔细的定量比较。尽管它的高丰度，NS1蛋白的功能却还未得到明确鉴定。在重建的RSV微基因组系统中，微基因组的转录和RNA复制由质粒所提供的病毒蛋白来驱动(Grosfeld等，J.Virol.69：5677-5686(1995)，Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：81-85(1996))中，NS1蛋白看来是转录和RNA复制的负调节蛋白。因此，它可能是调节蛋白。其中非常可能其它的功能还有待鉴定。NS1蛋白在其它副粘病毒中没有已知的对应物。未与理论相结合的NS1的几种可能的功能如下：<i>它可能是如上所述的病毒调节因子；(ii)它可能参与病毒生长循环的其它一些方面；(iii)它可能与宿主细胞反应，例如以防止编程性细胞死亡；和(iv)它可能参与宿主免疫系统反应，从而来抑制宿主防御系统的反应(如产生干扰素、抗原加工或B或T细胞的发挥功能)。NS1蛋白的所有这些潜在的活性也许会为RSV重组疫苗提供其它优点。
为了产生NS1基因功能受到选择性破坏的重组RSV，编码NS1蛋白的序列被全部从亲代RSV cDNA中缺失。在该例举的缺失中，诱变反应的底物是前文所述的质粒D13，它含有完整反基因组cDNA左手端的cDNA，包括T7 RNA启动子、前导区、以及NS1、NS2、N、P、M和SH基因(序列位置1-4623)。诱变根据Byrappa等的方法(Byrappa等，Genome Res.5：404-407(1995))进行，制备具有所需变化位于质粒反方向的合成引物，PCR扩增，然后连接并转化入细菌中。正向PCR引物是GACACAACCCACAATGATAATACACCAC(SEQ ID NO：9)(NS2 ORF的第二个密码子用斜体字表示)，反向PCR引物是CATCTCTAACCAAGGGAGTTAAATTTAAGTGG(SEQ ID NO：10)(NS2 ORF的起始密码子的互补处用斜体字表示)。以D13作为模板，用高保真性聚合酶进行PCR。获得从紧靠NS1 ORF的AUG起始位点上游到紧靠NS2 ORF AUG起始位点上游的缺失(图21)。这导致了529bp的缺失，包括NS1编码序列、NS1GE信号、NS1-NS2基因间隔区和NS2 GS信号。它将NS1基因的上游末端(即它的GS和非蛋白编码区)与NS2 ORF融合。这部分保留的NS1基因可以表达，因为它紧靠前导区，因此可能含有转录或RNA复制中重要的序列。含有突变的区域用序列分析来确认。然后将Aat2和Avr2位点(图21)间约2,230bp的节段切下并插入新的D13拷贝中，该步骤可以预防RSVcDNA中其它地方可能出现的PCR错误。用含有NS1缺失的D13质粒(D13 Δ NS1)来构建含有“HEK”和“位点”变化的完整反基因组(D53ΔNS1)。
然后用D53 Δ NS1质粒来回收病毒。令人感兴趣的是，回收的RSVΔ NS1病毒在组织培养物中产生了小噬斑。用RT-PCR来确认缺失的存在。RSV Δ NS1病毒能够生长(尽管效率较低)的事实说明NS1蛋白是辅助蛋白，不是病毒生长所必需的。RSV Δ NS1病毒的噬斑大小与上述的NS2剔除病毒(由于在NS2编码序列中引入翻译终止密码子而使NS2蛋白不能被表达(实施例XV))的噬斑大小相似。小的噬斑表型通常与减毒突变有关。因此这类突变可引入活的重组RSV中以产生改变的表型。因此，根据体外噬斑大小与体内减毒性之间的相互关系，这些以及其它剔除方法和突变株可以提供更多的重组RSV疫苗制剂。
实施例XVIII
具有NS2基因缺失的重组RSV
本实施例描述了一种重组RSV的产生，其中NS2蛋白质的表达，被通过编码该蛋白质的多核苷酸序列的去除而消除。在上述实施例XV中，重组病毒(称为NS2剔除或NS2-KO)是通过在NS2编码序列中引入两个翻译终止密码子，而不是去除编码序列，以消除NS2基因的表达而制得的。原型NS2剔除病毒中NS2蛋白表达的消除与小噬斑表型以及体外病毒生长的动力学降低有关。随后的分析表明，在NS2剔除病毒传代时，可能会回收少量病毒，其回复成具有野生型生长能力。序列分析表明，引入的两个翻译终止密码子已经突变成有义密码子，尽管其编码排布与亲代野生型病毒中的不同。经Western印迹分析，这足以恢复NS2蛋白的合成，从而解释了野生型表型出现的原因。本方案提供了改进，因为除去了全部NS2基因，从而使相同位点的回复不可能发生。
NS2蛋白是124个氨基酸的小蛋白，它由基因次序中的第二个基因编码(Collins和Wertz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3208-3212(1983)，以及Collins和Wertz，Virol.243：442-451(1985))。它的mRNA是RSV mRNA中第二高丰度的，NS2蛋白被认为是最高丰度表达的RSV蛋白之一，但是详细的定量比较还有待完成。尽管它是高丰度的，但是NS2蛋白的功能还有待鉴定。在重建的RSV微基因组系统(微基因组的转录和RNA复制由质粒提供的病毒蛋白来推动)(Grosfeld等，J.Virol.69：5677-5686(1995)，Collins等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 93：81-85(1996))中，NS2蛋白对转录和RNA的复制有适度的负调节作用。由于需要有相对高水平的NS2蛋白表达水平来观察这一作用，因此它的显著性还不清楚。因此，和NS1蛋白的一样，NS2的功能可能是：(i)是病毒调节因子；(ii)参与病毒生长循环的其它一些方面；(iii)与宿主细胞反应，以防止编程性细胞死亡；和(iv)与宿主防御系统反应，从而抑制宿主免疫系统的反应如产生干扰素，抑制抗原加工，或抑制B或T细胞的功能。根据这里描述的方法和策略，NS2蛋白的所有这些潜在活性，可以在本发明中结合起来，从而为RSV重组疫苗提供新的优势。
为了产生NS2基因功能被选择性破坏的重组RSV，编码其mRNA的序列被从亲代RSV cDNA中缺失。在该例举的缺失例中，诱变反应的底物是前文所述的质粒D13，它含有完整反基因组cDNA左手端，其包括T7RNA启动子、前导区、以及NS1、NS2、N、P、M和SH基因(序列位置1-4623)。根据Byrappa等的方法(Byrappa等，Genome Res.5：404-407(1995))进行诱变，使具有所需变化的合成引物朝向质粒上的相反方向，然后进行PCR扩增，连接并转化入细菌中。正向PCR引物是TTAAGGAGAGATATAAGATAGAAGATG(SEQ ID NO：11)(NS2N基因间隔区的序列用下划线表示，N GS信号的第一个核苷酸用斜体字表示)，反向PCR引物是GTTTTATATTAACTAATGGTGTTAGTG(SEQ ID NO：12)(与NS1GE信号互补处用下划线表示)。将D13用作模板，用高保真性聚合酶进行PCR。缺失从紧靠NS1GE信号的下游到紧靠NS2 GS信号的下游(图22)。因此突变缺失了522个核苷酸，它们包括NS1-NS2基因间隔区和全部的NS2基因(图22)。
通过序列分析来确认在含有缺失的D13质粒中的突变区域。然后，将Aat2和Avr2位点(图22)间约2,230bp的节段切下并插入新的D13拷贝中，该步骤可以排除RSV cDNA中各处出现的PCR差错的可能性。用含有NS2缺失的D13质粒(D13ΔNS2)来构建含有所有“HEK”和“位点”变化的完整反基因组(D53 Δ NS2)。
然后用D53 Δ NS2质粒来回收病毒。如上对NS2剔除病毒的(参见实施例XV)叙述，RSVΔNS2形成了小噬斑。用RT—PCR来确认缺失的存在。RSV Δ NS2病毒能够生长(尽管效率较低)的事实说明NS2蛋白是辅助蛋白，不是病毒生长所必需的。小的噬斑表型通常与减毒突变有关，因此可引入活的重组RSV中以产生改变的表型。根据这些发现，NS-2负型突变株在幼年黑猩猩的上呼吸道中表现出中度减毒的表型，而下呼吸道中则表现出高度减毒的表型。该突变株在黑猩猩中引发的疾病症状大大减弱，而同时激发对野生型病毒攻击的显著抗性。Whitehead等，J.Virol.73：(4)3438-3442(1999)，此处引入作为参考。因此，根据体外噬斑大小与体内减毒性之间的相互关系，这些以及其它剔除方法和突变株将提供更多的重组RSV疫苗制剂。
实施例XIX
G糖蛋白分泌形式的翻译起始位点的消除
本实施例描述了一种重组RSV的制备，其中G糖蛋白的分泌形式的翻译起始位点被消除。RSV G蛋白以两种形式合成：作为锚定形式的类型II整合膜蛋白，和作为一种N端消除形式的蛋白，后者基本上缺少任何膜固着点并且被分泌出来(Hendricks等，J.Virol.62：2228-2233(1988))。这两种形式看来是由两个不同的起始位点处的翻译引发来得到的：较长的形式在G ORF的第一个AUG处起始，第二种形式在密码子48处的ORF的第二个AUG处起始，并被蛋白酶解进一步加工(Roberts等，J.Virol.68：4538-4546(1994))。第二个起始位点的存在是高度保守的，它存在于目前已测序的所有人、牛和羊RSV中。已经指出，G糖蛋白的可溶形式可通过作为捕获中和抗体的诱饵来中和宿主免疫性。同样，已经指出，可溶性G蛋白能优先刺激Th2偏向性应答，该应答与随后接触RSV时的免疫病理学增强有关。对于RSV疫苗病毒，非常希望使抗体捕获或免疫系统的偏性刺激程度减到最小，因此希望消除分泌形式的G糖蛋白的表达。这类突变的作用是定性和/或定量地改变宿主免疫应答，而不是使病毒直接减毒。
在Byrappa等的PCR诱变方法(Byrappa等，Genome Res.5：404-407(1995))中，将带有G、F、M2基因的质粒pUC19(参见实施例VII)用作模板。正向引物是：TTATAATTGCAGCCATCATATTCATAGCCTCGG(SEQ ID NO：13)，反向引物是：GTGAAGTTGAGATTACAATTGCCAGAATGG(SEQ ID NO：14)(两个核苷酸变化的互补处用下划线表示)。这导致了两个氨基酸编码性改变(见图23)，即AUG-48变为AUU-48，它消除了翻译起始位点，和AUA-49变为GUA-49，它产生一个用于检测突变的MfeI位点的插入。
用双脱氧核苷酸测序法来确认突变位点周围的序列。然后将含有G基因的PacI-StuI片段替换进质粒D50，如前文所述它含有从前导区到L基因开始处的9个基因。然后它被用来构建完整的反基因组cDNAD53/GM48I，以用于回收病毒。这些突变显示出，当G cDNA以与其它RSV基因分离的形式被重组病毒表达时，分泌形式的G的表达被消除(Roberts等，J.Virol.68：4538-4546(1994))。
测定两种回收的D53/M48I病毒的分离物的体外生长动力学，并与野生型重组RSV相比较(图24)。结果表明，两种病毒比野生型生长更缓慢，滴度更低。这一生长上的差别可能是由于G蛋白的表达减少的缘故，预期这将发生，因为分泌形式的AUG 48被除去，而本实施例中膜结合形式的AUG-1没有被修饰以增加其表达。事实上，G ORF的AUG-1的表达被认为是不理想的，因为位于G序列中前面的是另一读框的另外一个AUG，这个读框开放了与G ORF的AUG-1相重叠的一个短ORF，因此降低了其表达水平。可以预期的是，反基因组cDNA中另外的修饰消除了这个ORF，因此可能会恢复全部生长特征。另外，位置48和49处的突变，单独作用或一起作用，可能会损害G蛋白的功能。位置49的氨基酸可能会恢复成天然的编码排布，而位置48可能被选择以不同的氨基酸替换，从而可能会恢复全部生长性能。这些可能性可以方便地用这里所述的方法和材料来评价。无论如何，D53/GM48I病毒的回收，表明分泌形式的转录起始位点可以被消除，该病毒现在可在实验动物和人中进行评价。
实施例XX
RSV亚型B的减毒嵌合RSV疫苗的产生
本实施例描述了特导于亚型B RSV的活减毒嵌合疫苗的产生。前面的实施例描述了各种RSV亚型A的活减毒疫苗的产生，其具有所选减毒突变，包括由生物学上获得的突变体而来的，以及由一系列其它的在RSV A基因组中的特定的核苷酸变化而来的。各种变化可被用于单独地，或者以相结合的形式，导入全长cDNA克隆中，各种回收病毒的表型可以方便地进行分析和证实，以获得所需水平的减毒用于疫苗。
一种活减毒RSV疫苗理想地应该能够有效地抵抗各种RSV毒株和/或亚型。在这方面来说，RSV应被认为是血清学单一类型的，既”然抵抗任何一种毒株的共价血清会中和其它毒株。然而，很长时间已经被认识到交叉中和的效率在不同毒株间是不同的(Coates，Alling和Chanock，1966)。后来，用单克隆抗体和用序列分析的研究显示出，RSV毒株可以被分成两个抗原亚型，A和B(Anderson等，J.Infect.Dis.151(4)：626-33(1985)；Collins等，J.Gen.Virol.71(Pt7)：1571-6(1990)；Johnson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.84(16)：5625-9(1987)：Mufson等，J.Gen.Virol.，66(Pt10)：2111-24(1985)。
RSV A和B亚型的基因序列的差异存在整个基因组中，但是差异的程度是不均一的。两个有最大差异的区域是G和SH蛋白质的细胞外区域，它们在氨基酸水平上的差异分别是56和50％的差异(Collins等，J.Gen.Virol.71(Pt7)：1571-6(1990)；Johnson等，J.Gen.Virol69(Pt10)：2623-8(1998)；Johnson等，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84(16)：5625-9(1987b)，各篇此处引入作为参考。F糖蛋白，第三种RSV跨膜表面蛋白，在氨基酸水平上在亚型间的差别为11％(Johnson等，J. Gen.Virol.69(Pt10)：2623-8(1988))。两种主要的保护性抗原，G和F蛋白质，在两个亚型间的百分抗原相关性经测定分别为5％和50％(Johnson等，J.Virol.61(10)：3163-6(1987a))。这些差别的存在，表明两种抗原亚基应该存在于一个RSV疫苗中，特别是G糖蛋白。
对亚型B来说，尚未得到相当量的减毒疫苗候选物或由其产生病毒的cDNA试剂。然而，一个起始的一组活减毒亚型B病毒已被制备(Crowe等，J.Infect.Dis.173(4)，829-39(1996a))。尽管这些候选物由于SH和G基因的自发缺失，因而在用作疫苗时可能不是令人满意的(Karron等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(25)：13961-6(1997a))，他们提供了用于本发明的嵌合RSV的有用的突变。
本实施例提供了一种RSV亚型B-特异性的疫苗病毒，其中减毒的亚型A病毒被用于表达亚型B RSV的F和G糖蛋白。因为F和G蛋白质是主要的保护性抗原，赋予大多数的RSV亚型以特异性，这种嵌合病毒能够刺激抗亚型B的强烈的免疫反应。可以用两种可选的方法来实现这一策略。一种是将亚型B病毒的G糖蛋白基因作为添加的基因插入到亚型A背景中。这个病毒因此编码两种G蛋白质，一种是亚型A的，一个是亚型B的。在这一方面Jin等，Virology251(1)：206-14(1998)描述了一种亚型A病毒，它表达作为添加基因的亚型B糖蛋白。(Jin等，Virology 251(1)：206-14(1998))。然而，既然F蛋白质也表现出显著的亚型特异性，优选在一种亚型B特异性的疫苗中表达两种亚型B糖蛋白。而且，可期待对亚型B病毒作进一步修饰以获得与本文的教导一致的合适的减毒和免疫原性。
获得亚型B疫苗的第二种更为期待的策略在本实施例中被公开，它的方法是去除亚型A重组cDNA骨架中的G和F基因，用亚型B的G和F基因来替换。因此，提供了一种嵌合RSV，它含有亚型A的内部蛋白质，和亚型B的外部保护性抗原。根据本发明的方法，通过将上面所鉴定的减毒突变，对称性地结合进亚型A背景中，从而使病毒获得合适水平的减毒。这种含有亚型B保护性抗原的减毒病毒然后可以与生物学上获得的或重组减毒的亚型A病毒相结合，从而得到涵括两种抗原亚型的双成分RSV疫苗。
根据上面所述的一般方法，代表一个亚型例如RSV亚型A的病毒株的基因组或反基因组cDNA被修饰。因此F和G表面糖蛋白基因被来自异源亚型的病毒，这里是亚型B的对应物替换。这一cDNA然后被用于通过上面所述的方法，包括用表达RSV核壳和聚合酶蛋白质的质粒所支持的反基因组成基因组cDNA对培养的细胞进行转染，从而获得感染性的嵌合病毒(也见于，Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：11563-11567(1995)；美国临时专利申请60/007,083，各篇此处引入作为参考)。既然获得的病毒带有作为主要保护性抗原的异源亚型F和G糖蛋白，它所诱导的免疫反应能高效抵抗异源亚型病毒后来的感染。
在本实施例中，RSV糖蛋白或其它的相关的基因或基因节段，可以被单独替换。然而，对于保护性抗原来说，对异源亚型病毒的保护效应更为期待，如果两种或更多的免疫原性蛋白质或抗原决定簇存在(通过整个蛋白质或者它们的免疫原性区域的导入)。其它基因也可以被替换或作为添加基因被包括。例如，编码第三种RSV表面糖蛋白SH的基因，也可以被它的异源亚型对应物替换，或作为嵌合RSV中的额外的糖蛋白被添加。见例如，Burkreyev等J.Virol.71(12)：8975-82(1997)，此处引入作为参考。序列替换可以涉及单独或组合一起的任何RSV基因或遗传元件。例如，它们可能涉及翻译读码框(ORF)的一部分，完整的ORF，包括转录信号顺式作用元件的完整的基因，或它们的功能片段的组合的替换。在本实施例中，转移的基因位于被它们的受体对应物占据的同样的基因组位置，但这并非是一定的。例如，供体基因也可移动至更靠近或远离病毒启动子以增加或减少表达。
为实施本发明的这一部分，亚型A或B RSV都可被用作受体，而其它的亚型作为供体。在此处描述的这个实施例中，亚型A的骨架是亚型B的糖蛋白基因的受体。同样，任何亚型A或B毒株都可被使用，尽管这里描述的具体实施例涉及A2和B1毒株。将来可能会出现另外的亚型或显著的抗原变异体，并能方便地用于基因或基因片段变换或转移的有用的受体和/或供体序列。
结合本实施例，RSV cDNA被进行进一步的修饰以使cDNA可以被操作，以及如果发现需要的话，以最大的稳定性进行繁殖。RSV序列的不稳定性是普遍的，并被认为在细菌中的繁殖过程中比较明显。然而RSV序列的不稳定性在细胞培养物中病毒传代时也可观察到。具体地，生物学上获得的亚型B cpRSV的G基因，在Vero细胞中的传代过程中被缺失。在这个实施例中，通过常规方法测定，毒株B1G基因的基因末端信号是不稳定的。改变序列而且不改变氨基酸编码或严重破坏顺式作用信号，可以获得能不产生意外变化并能够成功扩增的cDNA。
本实施例中所描述和应用的第三部分策略是通过导入选定组合的减毒突变从而对嵌合RSV的骨架进行修饰。例如，毒株A2骨架可以通过导入各种突变修饰，例如cp突变，ts突变，和各种上面所鉴定的其它突变，以获得所要的功能或表型特征，例如，提高病毒的减毒作用。这些突变可能涉及赋予这部分所需要特征的任何替换，插入，缺失或重排。例如，SH基因缺失产生大噬斑和一些细胞系中改善的生长的附加特性。其它所要的特征包括，但不限于，增加的抗原表达，减小的反应原性，增加或改变了的免疫原性。重要的是，以顺序步骤和各种不同组合导入这些突变的能力，使可能获得减毒效应和免疫原性以及其它的所要的特征之间的经细调的平衡。
如本实施例所示的，重组嵌合A/B病毒在细胞培养和黑猩猩中表现出类似野生型，和介于亲本毒株A2和B1间的生长特征。这显示出完全活的嵌合病毒可以很方便地产生，并可进一步操作以获得所需的变化。在细胞培养中不受限制的生长对于疫苗病毒的生产是重要的。同时，完全活的类似于野生型的病毒是后面用直接方式减毒的更合适的底物。而且，既然嵌合A/B病毒的生长特征与亲本A2相比没有非常明显的不同，在A2毒株中鉴定的所需突变的导入，预期在AB嵌合体中具相似的效应。
如下面所进一步描述的，根据本发明的方法，开发了一组六个A/B嵌合病毒，它们被通过将各种已知减毒突变的组合插入到A2RSV背景中而得到修饰。这些实施例表明，这里所叙述的许多其它的对于嵌合A/B病毒的修饰，能够方便地获得以开发出新增的疫苗毒株。如所预期的，A/B嵌合病毒衍生物在细胞培养中显示的表型与相应的重组减毒毒株A2疫苗候选物是一致的，显示出当从亲本毒株转移到嵌合衍生物时，减毒表型是可合理预测的。例如，在三个病毒中SH基因的缺失导致噬斑大小的增加，而将1030突变导入到两个病毒中导致噬斑大小的减小，这与减毒突变是一致的。可以预期，一些变化的结合会产生一些与预期不完全相同的结果。无论如何，这种发明提供了增加调节的方法。
在本实施例中，RSV毒株A2被用作广范围的疫苗候选物和如上已鉴定的表型特异性突变的供体。在这一方面，如下描述详细说明了代表性的重要的减毒突变，它们被导入嵌合受体背景中，尽管实际上，它们也可能会被导入供体基因中。所述的特异性的减毒突变型包括(i)五个cp突变中的三个，即一个在N中(V267I)和两个在L中(C319Y和H1690Y)中的突变，但是没有F中的两个，既然它们已被用B1F.基因的替换所去除；(ii)248(Q831L)，1030(Y1321N)和可选择地，404-L(D1183E)突变，它们在减毒毒株A2病毒中被鉴定，(iii)M2基因的基因起始信号的位点9的单核苷酸替换，和(iv)SH基因的缺失。其它可方便获得的突变包括但是不限于，NS1或NS2基因缺失，或530或1009突变的单独或组合形式。
通常RSV cDNA在细菌中的操作或增殖过程中会保持有不想要的序列变化。例如，第一个成功用于产生重组RSV的毒株A2反基因组cDNA，它的M和SH基因表现出独立的不稳定性的问题，这种问题可通过使用低拷贝数质粒(30℃生长而非37℃)和不同的细菌株而得以改善(Collins等，1995)。G基因还常常与不稳定性相关。而且，RSVG基因显示出在细胞培养中在一定的RSV生长条件下不稳定(Kerran等，1992)。为解决这一问题，通过改变氨基酸序列而使氨基酸编码不变化，可以获得稳定的毒株B1G基因的序列。尽管这种改变变换了顺式作用信号，这种变化应该不会严重改变它的功能。这些修饰使得cDNA可用于操作和繁殖而不带非计划中的改变。
“野生型”嵌合AB病毒的构建和回收
如上面所提到的，基于减毒的RSV亚型A病毒开发有效的RSV的亚型B疫苗的策略是用带有亚型B的G和F基因的限制性片段来替换毒株A2中的反基因组cDNA的G和F基因(图25A-C)。A2反基因组cDNA某些具有天然存在的PacI位点，其位于SH基因末端信号中。在构建反基因组cDNA时，将一个SphI位点插入到F-M2基因基因间隔区域(Collins等，1995)。因此，毒株A2中的带有G和F基因的cDNA片段，可以用带有亚型B供体株如B1株的G和F基因的cDNA来替换。如同在毒株B1中一样，如果合适的PacI和SphI位点，不存在于亚型B毒株中，它们可以被使用通常的方法，用诱变寡聚核苷酸在PCR中产生。
B1病毒被通过RT PCR产物的分析而完整地测序，它因此提供了共有序列。基于对人的志愿者的研究，显示它是一种野生型病毒(Karron等，1997a，此处引入作为参考)。B1病毒生长在HEp-2细胞培养物上，通过用聚乙二醇沉淀而从澄清的培养基中浓集。病毒体RNA被提取和纯化(Collins等，1995)，用作反转录(RT)的模板，使用随机六聚体引物，通过传统方法进行RT反应(Collins等，1995)。获得的cDNA被用于聚合酶链式反应以扩增单一cDNA中的两个基因。PCR使用的正义寡聚核苷酸在G基因前面的基因间隔区域的起始位置引发(GCATGGATCCTTAATTAAAAATTAACATAATGATGAAT TATTAGTATG[SEQ ID NO：15]，注意PacI位点用粗斜体表示，用于克隆起始的PCR产物的BamHI位点被用斜体表示，亚型B专一性序列用下划线表示)而负义引物经F基因下游一侧的基因间隔区中部杂交GTGTTGGATCCTGATTGCATGCTTGAGGTTTTTATGTAACTATG AGTTAAG[SEQ ID NO：16](标注如上，除了SphI位点用粗斜体表示外)。引物被设计以将一个PacI位点导入G基因前面的基因间隔区的上游末端，将一个SphI位点导入F基因后的基因间隔区。PacI和SphI位点位于BamHI位点的两边，用于将起始的PRC产物克隆入pBR322的BamHI位点。
通过核苷酸测序，完整地分析了四个克隆的G-F cDNA。每个cDNA克隆被发现在G基因末端信号上包含有相似的错误。这个信号(AGTTATTCAAAAA[SEQ ID NO：17])以5个A残基终止，但是在各个克隆中它延伸到30或更多的A。另外，各个cDNA含有至少一个在G或F基因中其它处的另外一个突变。这些错误可能是被RSV聚合酶，RT，PCR中使用的DNA聚合酶，或者在细菌中的繁殖所引入。通过限制性片段的交换，可以消除除基因末端突变外的所有这些差异。检测了另外的克隆的DNA的这个区域，每个都被发现含有一个伸长的GE信号。含有正确GE信号序列的单一cDNA克隆被鉴定出来，但是在细菌中进一步繁殖后它也变得延长。这暗示延长发生在细菌中的繁殖过程中。在更低温度生长和使用其它的毒株，没有获得含有这个信号正确序列的克隆。
通常一定的DNA序列很难稳定地在细菌中繁殖，从DNA序列测定得知它们的原因通常是不明显的。例如，除非使用特定的毒株和生长条件，否则A2毒株反基因组cDNA是不稳定的。因为毒株和生长条件的变化不能稳定B1cDNA，它的序列被修饰以使它更稳定。为获得这一目的，G基因下游末端和下游基因间隔区的大量的核苷酸改变如下：(i)对G读码框的最后11个密码子，在不改变氨基酸编码排布的情况下，对各个密码子的第三个核苷酸的核苷酸排布作改变；(ii)GORF的终止密子被改变为另外一种终止密码子排布；(iii)四个核苷酸被引入ORF和基因末端信号间的G基因的下游非翻译区中，(iv)通过两个核苷酸替换改变了G基因末端信号，使A序列中长度上减少一个核苷酸，因此信号变得对毒株A2的F基因的信号是一致的，以及(v)G-F基因间隔区缩短47个核苷酸，并引入一个MfeI位点(见图26)。
用基于RCR的步骤进行诱变，其中含有所需变化的两个邻接的寡聚核苷酸被用作引发模板上两个相反方向的DNA合成，PCR后得到的线状DNA被连接环化(Byrappa，Gavin和Gupta，1995)。正义寡聚核苷酸如下(编码的核苷酸被隔断成三联体，不同于wt B1序列的核苷酸排布用下划线表示，导入的MfeI位点用粗体字，G基因末端和F基因起始信号用斜体字)：
C CAC GCC TAATGAGTTATATAAAACAATTGGGGCAAATAACCATG GAG[SEQ ID NO：18]，
负义寡聚核苷酸如下(标注如上所述)：
GA CTG AGT GTT CTG AGT AGA GTT GGA TGT AGA GGGCTC GGA TGC TG[SEQ ID NO：19]。
使用上面所示的两种寡聚核苷酸引物，以上面所述的G-F cDNA用作模板，进行PCR。PCR产物用凝胶纯化，连接环化，并克隆进大肠杆菌DH10B中(Life Technologies)。鉴定出六个大小合适、含全长插入序列的克隆的cDNA，对含有基因末端信号的区域的序列分析表明六个克隆中的各个含有正确的序列。进行全长测序的一个cDNA，MH5-7，含有正确的序列。它的含有亚型B的G和F基因的PacI-SphI片段然后被切下用于构建嵌合的反基因组cDNA。
反基因组毒株A2c DNA D53具有下列特征。首先，它含有前导序列位置4上的G向C(负义)的替换，被称为4C突变，如前面所述(Collins等，1995)。这种改变在特定的生物学上获得的减毒毒株RSV中被描述，但是没有与减毒表型相关联。然而，它被描述为RNA复制的正调节剂(Grosfeld，Hill和Collins，1995)，它还提高了感染病毒从cDNA回收的效率，尽管它并未显示出影响细胞培养中的病毒收获(Collins等，1995)。其次，D53含有五个核苷酸替换和一个单核苷酸插入，它们将限制性位点标记放在四个位置：紧挨NS2基因的下游，N ORF的上游，G和F基因之间，F和M基因之间(Collins等，1995)。通过将一套六个翻译沉默限制性位点标记插入到L基因中，而对反基因组cDNA作进一步的修饰，这些一起被称为“位点”突变(Whitehead等，1988b)。
不希望用含有B1G和F基因的片段替换D53cDNA的PacI-SphI片段，因为PacI和SphI位点在D53质粒中不是独特的。因此，对亚克隆D50进行了这种替换，D50它含有反基因组cDNA的左手端，从3’基因外前导区，通过前面的九个基因，到L基因的起始位点(Collins等，1995；Whitehead等，1998b)。在这个D50质粒中，PacI和SphI位点是独特的，对它进行了直接限制性片段交换。反基因组cDNA的留下部分，即L基因和非转录尾区和相连的T7启动子，被包含在质粒D39的位点中，这个cDNA然后被以BamHI-MluI片段插入到B/D50的BamHI-MluI窗口中。
获得的完整的嵌合反基因组cDNA被用于通过上述补充自共转染的质粒表达的N，P，M2-1和L蛋白质的方法而产生病毒。这样获得了重组嵌合病毒rAB的回收，该病毒含有wt A2背景中的B1G和F基因。这种新的病毒可方便地在细胞培养中扩增，形成的噬斑大小与wt rA2的相似。细胞培养中病毒产生的水平与野生型亲本的基本一样。B1G和F糖蛋白的表达，和A2 G和F糖蛋白表达的缺失，可以通过使用分别对亚型B和A的G蛋白具特异性的单克隆抗体的免疫过氧化物酶染色而证明。A2骨架中B1基因的存在，可以通过使用B1序列特异性的寡聚核苷酸引物、从rAB病毒体中纯化的RNA的RT-PCR而证实。简要来说，构建了嵌合AB cDNA，并成功地用于回收感染性的AB嵌合病毒，其具有与它在存活力方面与亲本非常相似相一致的特性。
尽管通过用它们的毒株B1对应物直接替换毒株A2G和F基因，将B1-特异性基因起始和基因末端转录信号引入了A2背景中，但考虑到这两种病毒的这些信号是非常相似的，因此并不认为这是一个重要的因素。例如G和F基因的基因起始信号在亚型间是相当保守的，而对于毒株A2，F基因的基因末端信号具有一单核苷酸变化(AGTTATATAAAA[SEQ ID NO：20]，下划线的位置在毒株B1中为C)。G基因的基因末端信号有三个核苷酸变化(AGTTACTTAAAAA[SEQ ID NO：21]，对于毒株A2是正义链，下划线的部位对于毒株B1是TTC)，但是如上面所提到的，它被修饰成与毒株A2的F基因一样，因此完全适应于毒株A2的聚合酶。B1 cDNA和A2骨架的连接涉及到SH-G和F-M2基因间隔区域。前者的序列长度固定在44个核苷酸，这对于A2和B1病毒来说是一样的，PacI位点被设计用于保持这种间隔。F-M2基因间隔区的长度对毒株A2和B1来说分别是46和45个核苷酸，AB嵌合体被设计具有后者的长度。如上所述，G-F基因间隔区载长度被减少到5个核苷酸，它比它的A2和B1病毒对应物更短，它们各自是52个核苷酸。而且，尽管天然存在的RSV的基因间隔区，在基因连接处间和病毒间显示出明显的序列和长度的多样性，毒株A2中的那些对于微基因组复制和转录的作用是等价的，因此此处导入基因间隔区的变化将是沉默的(Kuo等，1996，此处引入作为参考)。
A2骨架中具减毒突变的AB嵌合RSV的构建和回收
根据本发明的一般教导，毒株B1 G-F cDNA被替换入含有各种减毒突变组合的A2骨架中，以产生作为亚型B疫苗候选物的AB病毒。这些减毒突变包括：(i)cpRSV中的五个氨基酸替换中的三个的替换，即N(V267I)中的一个和L中的两个(C319Y和H1690Y)的突变，但是没有F中的两个，既然他们被通过B1F基因的替换而去除；(ii)在减毒株A2病毒cpts248、cpts248/404和cpts 530/1030的L蛋白质中鉴定出来的248(Q831L)、1030(Y1321N)和可选地404-L(D1183E)氨基酸替换；(ii)cpts248/404M2的基因起始信号的位置9的核苷酸替换，和(iv)SH基因的缺失。在L基因的突变中，这些突变被插入含有L基因的D39质粒中，如上所述，然后如上所述，与B/D50质粒相结合以获得完整的反基因组cDNA。对于D50中的突变，限制性片段替换被用于取代随后与D39连接的B/D50中的或B/D53中的相关的区域。每一种突变被引入新的限制性位点，或者消除天然存在的位点而进行标记，这一天然存在的位点如前所述在氨基酸水平是沉默的(Juhasz等，1998；Juhasz等，1997；Whitehead等，1998a；Whitehead等，1998b，各篇此处引入作为参考)。在所有这些例子中，由诱变进行的对反基因组cDNA各区域结构的修饰，被通过核苷酸序列分析而证实。总共制备了六种修饰的AB反基因组cDNA。每种反基因组cDNA然后被用于如上所述回收感染性病毒，在各个例子中嵌合病毒都被成功回收。各个重组病毒中各种设计的突变的序在，被通过反转录(RT)-聚合酶链反应，接着进行限制性分析和核苷酸测序而证实。六种被回收的含有减毒突变的不同的重组AB嵌合体列于表44中。特别地，这些减毒嵌合体包括rAB，它是一种由野生型毒株A2骨架和野生型B1的G和F基因构建的减毒嵌合体。其余病毒含有毒株A2骨架中的各种减毒突变，代表抗亚型B的候选疫苗。各种病毒能够在细胞培养物中繁殖。这些显示了产生含许多不同组合突变的AB嵌合体的可行性。
表44 基于重组AB嵌合病毒的RSV亚型B疫苗候选物
Figure C00806217D01811
两种引入的突变期望能基于他们对毒株H2的作用而产生在细胞培养中可分辨的表型。例如，ΔSH突变体的引入产生大的噬斑，而1030突变体则产生减小的噬斑大小。含有这些突变的各种AB嵌合体表现出适当的行为。例如，三个缺失SH基因的嵌合体产生的噬斑大小，大于相应的含有SH基因的那些。这暗示这些嵌合体具有适度的与缺失有关的减毒表型。同样，1030突变添加到rABcp248/404和rABcp248/404ΔSH导致噬菌斑大小相对于缺少1030突变的对应物的减小。这显示出，无论何时导入预期能够改变细胞培养物的表型的突变，期待的改变能够在嵌合病毒中观察到。可能一些组合与预期不一致。无论如何，这提供了增加表型变化的方法。很可能与这些突变相关的其它表型，比如体内减毒，也可被赋予AB嵌合体。
另外，如表45所示，通过测定不同温度下的噬斑形成效率，分析了下列病毒的温度敏感性表型：生物学上获得的A2和B1wt病毒，wt嵌合rAB病毒，含有减毒突变的下列rAB衍生物：rABcp，它含有N(V267I)和L(C319Y和H1690Y)中的cp突变；rABΔSH，SH基因缺失的rAB；rABcpΔSH，它含有前面提到的cp变化和SH缺失；rABcp248/404ΔSH，它是也含有248(L蛋白中的Q831L)和404(L蛋白中的D1183E，和M2基因起始信号中的点突变)突变的rABcpΔSH的一种形式；和rABcp248/404/1030，它是含有248和404突变以及1030突变(L蛋白质中的Y1321N)的rABcp的一种形式。如表45中所示，生物学上获得的A2和B1病毒不是温度敏感性的。含有B糖蛋白替换的病毒显示出轻微的敏感性，带有40℃的截止温度。具有cp和ΔSH突变是没有作用的，估计是因为它们在毒株A2中不赋予ts表型。248、404和1030突变的结合，获得的病毒分别具有37℃和36℃的截止温度，各例中在更低温度下形成小噬斑。这些结果与同样的两群突变置入wet A2重组背景中所观察到的结果基本上没有区别。因此，有可能在rAB嵌合体中如实重构这些ts表型。
表45.AB嵌合RSV衍生物的温度敏感性
Figure C00806217D01821
a截止温度被定义为观察到的滴度有100倍或更多减小时的最低限制温度。截止温度下的病毒滴度用粗体表示。
*微小噬菌斑大小
棉鼠和黑猩猩呼吸道中rAB病毒的生长
嵌合重组rAB病毒，被在棉鼠(一种广泛接受的模型动物)中评估它在呼吸道中的生长能力，其中RSV A2和B1的复制是相当的。每组5-6只动物进行鼻内接种，用106pfu每只动物的wt rAB病毒或它的ΔSH，cp或cpΔSH衍生物。因为与ΔSH突变相关联的减毒表型在啮齿类中是很少的，而与cp突变群相关的减毒表型由于它的宿主范围性质而是不可检测的，起始研究的目的是仅仅为了证明体内活性。在感染后第4天，收集鼻甲和肺，并用噬斑试验来测得病毒滴度。亲本A2和B1病毒以106.0-106.5 pfu每克组织的滴度复制。野生型嵌合rAB病毒和它的含有减毒突变的衍生物以102和104pfu g间的滴度复制。这显示出野生型和突变AB病毒在实验动物中是有活性的。同时，它给出了一种可能性，嵌合体中糖蛋白的交换本身是一个减毒变化，尽管如下所示这显示出是啮齿类专一性的效应。
黑猩猩是在RSV生长和疾病方面非常类似于人的实验动物。因此，wt rAB嵌合病毒被给予四个血清检测阴性的幼年黑猩猩，每只动物以105 pfu的滴度，以1ml接种物在鼻内或气管内接种。另外的三只动物被用推断的减毒衍生物rABcp248/404/1030以同样方法进行接种。从第一天到第10天和第12天，每日取鼻咽擦拭样，在第2、5、6、8和12天，取气管灌洗样(表46)。为进行比较，其它动物接受104或105噬斑形成单位(PFU)/部位的剂量，如表所示。表中给出了从第1天到第12天，每只动物在上呼吸道(鼻咽擦拭)和下呼吸道(气管灌洗)中的病毒释放量，以及对升高的0到4范围的峰值鼻液溢评分。这也显示于图27中。rAB嵌合体在鼻甲和气管中的复制的平均滴度为4.3log10和4.1 log10pfu/ml。这超过了生物学上获得的wt B1病毒。而且，与野生型B1病毒相比，rAB病毒引起程度相当或更严重的疾病症状(鼻液溢)。相反地，rABcp248/404/1030病毒是高度受限制的。这一病毒不会从任何气管灌洗液中回收，代表了大于2,500倍的复制的减少，而在上呼吸道中，rABcp248/404/1030病毒，以平均峰值滴度为2.0log10pfu/ml进行复制，比rAB wt的复制低200倍。没有与rABcp248/404/1030病毒相关的疾病症状。这些发现表明将减毒突变引入A2背景中，限制了复制，并消除了疾病症状。
为进一步表明本发明的成功的运用，将wt rAB嵌合体的复制与wt A2病毒的复制进行比较。表47显示了对表46的wt病毒的数据的总结，以及涉及两种毒株A2的历史对照：(i)接受104pfu/位点的剂量的rA2的四个动物，以及(ii)以104pfu/位点的剂量接受生物学上获得的A2的四个动物。比较显示wt B1病毒以比wt A2野生型病毒低的效率复制，无论其是生物学上获得的或是重组的。而且，嵌合体AB病毒的生长介于亲本A2和B1病毒间。rAB与它的亲本比较，介于二者间的生长暗示，A2骨架和B1糖蛋白都对生长适应性起作用，rAB病毒在棉鼠中较差的生长可能是由于宿主范围的限制减低了啮齿类中而非灵长类中的适应性。啮齿类中的复制水平可以普遍地用于预期黑猩猩和人类中的水平。然而，一些啮齿类和灵长类的不相关性偶尔会被观察到，如本例中。
表47.rAB黑猩猩研究小结。
Figure C00806217D01851
前面的结果显示出亚型A病毒的(这个实施例中是病毒株A2的)G和F糖蛋白，可以被亚型B病毒(这个实施例中是病毒株B1)中的对应物替换，而不损害它的活性。嵌合体病毒在最具许可性的动物和人类感染的最可靠模型即黑猩猩中可进行复制，而且可以通过向毒株A2骨架中引入已知的减毒突变而对嵌合的AB病毒减毒。
尽管为了便于理解，本发明通过实施例和图例进行了详细的说明，显而易见地在所附的权利要求范围内可以进行一些变化和修饰。
有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
Figure C00806217D01861
表PCT/RO/134(1998年7月)
有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
表PCT/RO/134(1998年7月)
有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
Figure C00806217D01881
表PCT/RO/134(1998年7月)
有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
Figure C00806217D01891
表PCT/RO/134(1998年7月)
有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
Figure C00806217D01901
表PCT/RO/134(1998年7月)
有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
Figure C00806217D01911
表PCT/RO/134(1998年7月)
有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
Figure C00806217D01921
表PCT/RO/134(1998年7月)
有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
(PCT细则13bis)
Figure C00806217D01931
表PCT/RO/134(1998年7月)
序列表
<110>美国政府健康及人类服务部
<120>从克隆的核苷酸序列制备减毒嵌合呼吸道合胞病毒疫苗
<130>NIH-0135
<150>09/291,894
<151>1999-04-13
<150>PCT/US00/08802
<151>2000-03-31
<150>08/892,403
<151>1997-07-15
<150>60/047,634
<151>1997-05-23
<150>60/046,141
<151>1997-05-09
<150>60/021,773
<151>1996-07-15
<160>21
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>15223
<212>DNA
<213>呼吸道合胞病毒
<400>1
Figure C00806217D01951
Figure C00806217D01961
Figure C00806217D01971
Figure C00806217D01981
Figure C00806217D02021
Figure C00806217D02031
Figure C00806217D02041
Figure C00806217D02061
<210>2
<211>15225
<212>DNA
<213>呼吸道合胞病毒
<400>2
Figure C00806217D02071
Figure C00806217D02081
Figure C00806217D02101
Figure C00806217D02111
Figure C00806217D02121
Figure C00806217D02141
Figure C00806217D02151
Figure C00806217D02161
Figure C00806217D02181
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>M基因正链片段
<400>3
Figure C00806217D02182
<210>4
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>M基因负链片段
<400>4
Figure C00806217D02191
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SH基因上游正链引物
<400>5
Figure C00806217D02192
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>SH基因下游负链引物
<400>6
Figure C00806217D02193
<210>7
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>M基因正链片段
<400>7
Figure C00806217D02201
<210>8
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>M基因负链片段
<400>8
Figure C00806217D02202
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于进行NS1基因缺失的正向PCR引物
<400>9
Figure C00806217D02203
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于进行NS1基因缺失的反向PCR引物
<400>10
Figure C00806217D02211
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于进行NS2基因缺失的正向PCR引物
<400>11
Figure C00806217D02212
<210>12
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于进行NS2基因缺失的反向PCR引物
<400>12
Figure C00806217D02213
<210>13
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于消除G基因起始位点的正向PCR引物
<400>13
Figure C00806217D02221
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于消除G基因起始位点的反向PCR引物
<400>14
Figure C00806217D02222
<210>15
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在G基因之前的基因间区域的正链引物
<400>15
Figure C00806217D02223
<210>16
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于在G基因下游的基因间区域的负链引物
<400>16
Figure C00806217D02231
<210>17
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>G基因末端信号
<400>17
Figure C00806217D02232
<210>18
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带有G基因末端和F基因起始信号的正链引物
<400>18
<210>19
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>带有G基因末端和F基因起始信号的负链引物
<400>19
Figure C00806217D02241
<210>20
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RSV A2的F基因末端信号
<400>20
Figure C00806217D02242
<210>21
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>RSV A2的G基因末端信号
<400>21
Figure C00806217D02243

Claims (58)

1.一种分离的感染性嵌合呼吸道合胞病毒RSV，包括主要核壳蛋白N，核壳磷蛋白P，大聚合酶蛋白L，RNA聚合酶延伸因子M2 ORF1，以及含有第一RSV的部分或完整基因组或反基因组的部分或完整嵌合RSV基因组或反基因组，其中不同的RSV毒株或亚型病毒的异源基因或基因组片段已插入或替换第一RSV的部分或完整基因组或反基因组的对应基因或基因组片段，所述嵌合基因组进一步包括至少一个选自下列的突变：
(i)G ORF的最后11个密码子中第3个核苷酸的沉默突变；
(ii)G ORF的终止密码子突变成替代的终止密码子；
(iii)在ORF和基因末端信号之间的G基因下游非翻译区插入4个核苷酸；
(iv)G基因末端信号被2个核苷酸替换改变，并且A道长度上减少1个核苷酸，以致信号变成与毒株A2的F基因相同，具有核苷酸序列AGTTATATAAAA；
(v)47个核苷酸从G-F基因间区域缺失，并在部分或完整嵌合RSV基因组或反基因组的G-F基因间区域引入一个MfeI位点。
2.权利要求1的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括一个或多个点突变，选自：L蛋白位置Y1321的突变；L蛋白位置F521的突变；L蛋白位置M1169的突变；L蛋白位置Q831的突变；L蛋白位置D1183的突变；L蛋白位置C319的突变；L蛋白位置H1690的突变；N蛋白位置V267的突变；以及M2基因起始信号中位置9的单一核苷酸替换。
3.权利要求1的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括SH基因的缺失。
4.权利要求1的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因中至少一个基因的缺失。
5.权利要求1的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因的同时缺失。
6.权利要求3的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因中至少一个基因的缺失。
7.权利要求6的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因的同时缺失。
8.权利要求2的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括SH基因的缺失。
9.权利要求2的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因中至少一个基因的缺失。
10.权利要求8的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因中至少一个基因的缺失。
11.权利要求8的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因的同时缺失。
12.权利要求9的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组包括NS1和NS2基因的同时缺失。
13.权利要求2的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组包括至少2个所述进一步点突变。
14.权利要求2的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组包括L蛋白位置Q831的突变；
L蛋白位置D1183的突变；
M2基因起始信号中位置9的单一核苷酸替换；以及
进一步包括SH基因的缺失。
15.权利要求2的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组包括
L蛋白位置D1183的突变；L蛋白位置C319的突变；以及L蛋白位置H1690的突变。
16.权利要求1的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括
L蛋白位置D1183的突变；
L蛋白位置Q831的突变；
M2基因起始信号中位置9的单一核苷酸替换；以及
L蛋白位置Y1321的突变。
17.权利要求16的嵌合RSV，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括SH基因的缺失。
18.权利要求1的嵌合RSV在制备用于刺激个体免疫系统诱导免受RSV影响的药物中的应用。
19.权利要求2的嵌合RSV在制备用于刺激个体免疫系统诱导免受RSV影响的药物中的应用。
20.权利要求18的应用，其中嵌合RSV的给药剂量为103-106PFU。
21.权利要求19的应用，其中嵌合RSV的给药剂量为103-106PFU。
22.权利要求18的应用，其中嵌合RSV给药至上呼吸道。
23.权利要求19的应用，其中嵌合RSV给药至上呼吸道。
24.权利要求18的应用，其中嵌合RSV通过喷雾，小滴或气溶胶给药。
25.权利要求19的应用，其中嵌合RSV给药至RSV抗体为血清阴性的个体，或具有经胎盘获得的针对RSV的母体抗体的个体。
26.权利要求18的应用，其中嵌合RSV为人RSV A和RSV B的嵌合体，针对人RSV A或RSV B引发免疫反应。
27.权利要求18的应用，其中嵌合RSV为人RSV A和RSV B的嵌合体，同时针对人RSV A和RSV B引发免疫反应。
28.权利要求18的应用，其中嵌合RSV为人RSV A和RSV B的嵌合体，针对人RSV A或RSV B引发免疫反应，并与免疫足够量的针对人RSV A或RSV B能够引发免疫反应的第二减毒RSV共给药，从而同时针对人RSV A和RSV B引发免疫反应。
29.权利要求28的应用，其中嵌合RSV和第二减毒RSV同时以混合物的形式给药。
30.针对RSV引发免疫反应的免疫原性组合物，其在生理可接受的载体中包括免疫足够量的权利要求1的嵌合RSV。
31.针对RSV引发免疫反应的免疫原性组合物，其在生理可接受的载体中包括免疫足够量的权利要求2的嵌合RSV。
32.权利要求30的免疫原性组合物，其配制剂量为103-106PFU。
33.权利要求31的免疫原性组合物，其配制剂量为103-106PFU。
34.权利要求30的免疫原性组合物，其配制成通过喷雾剂，滴剂或气雾剂而给药至上呼吸道。
35.权利要求31的免疫原性组合物，其配制成通过喷雾剂，滴剂或气雾剂而给药至上呼吸道。
36.权利要求30的免疫原性组合物，其中嵌合RSV为人RSV A和RSV B的嵌合体，针对人RSV A或RSV B引发免疫反应。
37.权利要求30的免疫原性组合物，其中嵌合RSV为人RSV A和RSV B的嵌合体，同时针对人RSV A和RSV B引发免疫反应。
38.权利要求30的免疫原性组合物，其中嵌合RSV为人RSV A和RSV B的嵌合体，针对人RSV A或RSV B引发免疫反应，以及其中所述组合物进一步包括免疫足够量的针对人RSV A或RSV B能够引发免疫反应的第二减毒RSV，从而所述组合物同时针对RSV A和RSVB引发免疫反应。
39.分离的多核苷酸分子，包括的多核苷酸编码含有第一RSV的部分或完整基因组或反基因组的部分或完整嵌合RSV基因组或反基因组，其中不同的RSV毒株或亚型病毒的异源基因或基因组片段已插入或替换第一RSV的部分或完整基因组或反基因组的对应基因或基因组片段，所述嵌合基因组进一步包括至少一个选自下列的突变：
(i)G ORF的最后11个密码子中第3个核苷酸的沉默突变；
(ii)G ORF的终止密码子突变成替代的终止密码子；
(iii)在ORF和基因末端信号之间的G基因下游非翻译区插入4个核苷酸；
(iv)G基因末端信号被2个核苷酸替换改变，并且A道长度上减少1个核苷酸，以致信号变成与毒株A2的F基因相同，具有核苷酸序列AGTTATATAAAA；
(v)47个核苷酸从G-F基因间区域缺失，并在部分或完整嵌合RSV基因组或反基因组的G-F基因间区域引入一个MfeI位点。
40.权利要求39的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括一个或多个点突变，选自：L蛋白位置Y1321的突变；L蛋白位置F521的突变；L蛋白位置M1169的突变；L蛋白位置Q831的突变；L蛋白位置D1183的突变；L蛋白位置C319的突变；L蛋白位置H1690的突变；N蛋白位置V267的突变；以及M2基因起始信号中位置9的单一核苷酸替换。
41.权利要求39的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括SH基因的缺失。
42.权利要求39的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因中至少一个基因的缺失。
43.权利要求39的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因的同时缺失。
44.权利要求41的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因中至少一个基因的缺失。
45.权利要求41的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因的同时缺失。
46.权利要求40的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括SH基因的缺失。
47.权利要求40的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因中至少一个基因的缺失。
48.权利要求46的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因中至少一个基因的缺失。
49.权利要求40的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括NS1和NS2基因的同时缺失。
50.权利要求46的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组包括NS1和NS2基因的同时缺失。
51.权利要求40的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组包括至少2个所述进一步点突变。
52.权利要求40的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组包括L蛋白位置D1183的突变；L蛋白位置C319的突变；L蛋白位置H1690的突变，以及N蛋白位置V267的突变。
53.权利要求40的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组包括L蛋白位置D1183的突变；L蛋白位置Q831的突变；M2基因起始信号中位置9的单一核苷酸替换；以及进一步包括SH基因的缺失。
54.权利要求40的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组包括L蛋白位置Q831的突变；L蛋白位置D1183的突变；M2基因起始信号中位置9的单一核苷酸替换，以及L蛋白位置Y1321的突变。
55.权利要求54的分离的多核苷酸，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括SH基因的缺失。
56.从一个或多个分离的多核苷酸分子生产感染性减毒嵌合RSV颗粒的方法，所述多核苷酸分子编码所述RSV，所述方法包括：
在细胞或无细胞裂解液中表达含有多核苷酸分子的表达载体，所述多核苷酸分子包括的多核苷酸编码含有第一RSV的部分或完整基因组或反基因组的部分或完整嵌合RSV基因组或反基因组，其中不同的RSV毒株或亚型病毒的异源基因或基因组片段已插入或替换第一RSV的部分或完整基因组或反基因组的对应基因或基因组片段，所述嵌合基因组进一步包括至少一个选自下列的突变：
(i)G ORF的最后11个密码子中第3个核苷酸的沉默突变；
(ii)G ORF的终止密码子突变成替代的终止密码子；
(iii)在ORF和基因末端信号之间的G基因下游非翻译区插入4个核苷酸；
(iv)G基因末端信号被2个核苷酸替换改变，并且A道长度上减少1个核苷酸，以致信号变成与毒株A2的F基因相同，具有核苷酸序列AGTTATATAAAA；
(v)47个核苷酸从G-F基因间区域缺失，并在部分或完整嵌合RSV基因组或反基因组的G-F基因间区域引入一个MfeI位点，
以及在所述细胞或无细胞裂解液中表达RSV N，P，L和RNA聚合酶延伸因子M2ORF1蛋白。
57.权利要求56的方法，其中嵌合基因组或反基因组进一步包括一个或多个点突变，选自：L蛋白位置Y1321的突变；L蛋白位置F521的突变；L蛋白位置M1169的突变；L蛋白位置Q831的突变；L蛋白位置D1183的突变；L蛋白位置C319的突变；L蛋白位置H1690的突变；N蛋白位置V267的突变；以及M2基因起始信号中位置9的单一核苷酸替换。
58.权利要求57的方法，其中嵌合RSV基因组或反基因组以及N，P，L和RNA聚合酶延伸因子蛋白通过两个或多个不同的表达载体表达。
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