KR100899030B1 - 프로모터 인접 유전자로부터 보호적 항원을 발현하는호흡기 신시티움 바이러스 백신 - Google Patents

프로모터 인접 유전자로부터 보호적 항원을 발현하는호흡기 신시티움 바이러스 백신 Download PDF

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Abstract

재조합 바이러스의 게놈 또는 안티게놈 내에 위치이동을 일으킨 유전자를 가진 재조합 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV)는 인간 및 기타 포유류에서 감염성이면서 약독화된 상태이다. 유전자 위치이동한 RSV는 재조합 게놈 또는 안티게놈 내에 유전자 또는 게놈 분절을 삽입, 결실 또는 재배열시킴으로써 구성되며 항-RSV 면역 반응을 유도하기 위한 백신 제제에 유용하다. 유전자 또는 게놈 분절이 RSV 유전자 지도에서 해당 유전자의 야생형 위치에 비해 프로모터에서 더 가깝거나 더 먼 위치로 이동한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자 및 벡터도 제공된다. 이렇게 유전자의 위치를 이동시키면 위치 이동의 특성과 정도에 따라 유전자의 발현에 선택적인 증가 또는 감소를 가져온다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 당단백질 코딩 유전자를 프로모터에서 더 가까운 위치로 이동시킴으로써 RSV 당단백질이 상향조절된다. 유전자 위치이동된 RSV 를 만들어내는 조작에서 주목되는 유전자는 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F, 또는 G 유전자 또는 유전자의 일부이거나 유전자 외의 부분일 수 있는 게놈 분절을 포함한다. 본 발명의 유전자 위치이동한 RSV 내에 다양한 추가적인 돌연변이 및 뉴클레오티드 변형을 제공하여 원하는 표현형 및 구조적 효과를 얻게 된다.
Figure R1020027017577
유전자 위치이동, 호흡기 신시티움 바이러스, 약독화 백신, 프로모터 인접 유전자

Description

프로모터 인접 유전자로부터 보호적 항원을 발현하는 호흡기 신시티움 바이러스 백신 {Respiratory Syncytial Virus Vaccines Expressing Protective Antigens from Promotor-Proximal Genes}
<관련된 출원에 대한 상호참조>
본 출원은 크렘플 (Krempl) 등에 의해 2000년 6월 23일 제출된 미국 가출원 제60/213,708호에 대한 우선권을 주장한다.
인간 호흡기 신시티움 바이러스(HRSV)는 전세계적으로 심각한 소아 호흡기 질환의 주된 바이러스이다 (Collins et al., Fields Virology 2:1313-1352, 1996). RSV는 1살 이하의 유아에서 폐렴 및 세기관지염의 원인으로서 모든 다른 미생물 병원체를 능가한다. 사실상 모든 아이들은 2살까지 감염되고, 재감염은 더 큰 아이들 및 젊은 성인에서 상당한 빈도로 발생한다 (Chanock et al., Viral Infections of Humans, 3rd ed., A.S. Evans, ed., Plenum Press, N.Y. (1989)). 호흡기계 질환에 의해 소아 병원에 입원하는 5개 경우 중 1개 이상이 RSV 때문이고, RSV는 미국에서만 1년에 100,000건의 입원과 4,500건의 사망을 일으키는 것으로 평가된다. (Heilman, J. Infect Dis., 161:402-6, 1990). 또한, 유아기의 심각한 호흡기 감염은 천식을 유발 또는 악화시킬 수 있다는 증거가 있다 (Sigurs, et al., Pediatrics 95:500-5, 1995).
인간 RSV는 통상적으로 소아 집단과 연관하여 생각되지만, 노인들에서도 심각한 질병의 중요 물질로 여겨진다 (Falsey et al., J. Infect. Dis. 172:389-394, 1995). 인간 RSV는 또한 골수 이식 수령자와 같이 특정 면역기능저하 개체에서 생명을 위협하는 질병을 유발한다 (Fouillard, et al., Bone Marrow Transplant 9:97-100, 1992).
인간 RSV 치료용으로 리바비린(ribavirin)이라는 1 종의 화학요법제가 입수가능하다. 그러나, 이 효능 및 용도는 논의 여지가 있다. 또한, 풀링된(pooled) 공여체 IgG (Groothuis, et al., N Eng J Med 329:1524-30, 1993) 또는 인간화 RSV-특이적 모노클로날 항체를 포함하는 RSV 중재용으로 허가받은 제품이 있다. 이들은 고 위험도의 개체에 수동 면역예방제로 투여된다. 이들 제품이 유용하기는 하지만, 이들은 고비용 및 장기 효능 결여와 같은 다른 인자로 인하여 널리 사용되기에는 부적합하다. 다른 단점으로는 혈액 매개 바이러스 전파의 가능성 및 제조 및 저장의 어려움 및 비용을 들 수 있다. 게다가, 감염성 질병, 특히 바이러스 기원의 질병의 제어 역사는 백신의 1차적 중요성을 지적한다.
RSV에 대해 효과적인 백신제제를 개발하기 위한 수십년 간의 연구에도 불구하고, RSV 감염과 관련된 심각한 이환율 및 현저한 사망율을 억제하기 위한 안전하고 효과적인 백신이 아직 개발되지 않았다. 성공적인 백신 개발의 실패는 부분적으로 어린 유아들이 RSV 항원에 대한 혈청 및 분비 항체 반응을 감소시킨다는 사실에 관련된다. 그러므로, 이들 유아들이 RSV로부터 더 심각한 감염을 당하게는 되지만, 누적적인 면역성이 더욱 심각한 바이러스의 충격에 대해 더 큰 아이들 및 성 인을 방어하는 듯하다.
최근 RSV 감염에서의 면역 기전에 관심이 집중되고 있다. 분비 항체는 상기도를 방어하는 데 가장 중요한 것으로 보이지만, 높은 수준의 혈청 항체는 하기도에서의 RSV 감염에 대한 내성에 주요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. RSV-특이성 세포독성 T 세포 및 유도된 면역성의 또다른 이펙터 암 (effector arm)은 또한 RSV 감염을 해결하는 데 중요하다. 그러나, 상기 후자의 에펙터가 이전의 면역화에 의해 강화되어 바이러스 감염에 대한 증가된 내성을 일으킬 수 있으나, 효과는 오래가지 않는다. F 및 G 표면 당단백질은 RSV의 2개의 주요한 방어 항원이고, RSV를 중화시키는 항원을 유도하고 감염에 대한 장기간 내성을 갖는 오직 2개의 RSV 단백질이다 (Collins et al., Fields Virology, Fields et al., eds., 2:1313-1352. Lippincott-Raven, Philadelphia. (1996); Connors et al., J. Virol. 65(3):1634-7 (1991)). 제3 RSV 표면 단백질, SH는 RSV를 중화시키는 항체 또는 RSV 감염에 대한 현저한 내성을 유도하지 않는다.
생 RSV 백신 개발에 대한 하나의 장애는 부분적으로 일부 약독화 바이러스의 유전적 불안정성, 세포 배양에서 RSV의 상대적으로 불충분한 성장 및 바이러스 입자의 불안정성으로 인한 약독화와 면역원성 사이의 적당한 균형을 이루는 데 어려움이 있다는 것이다. 자연 감염에 의해 유발되는 면역 외에는 후속 감염에 대해 완전히 방어되지 않는다. 아마도 호흡기도의 내강 표면 상의 바이러스 감염을 억제하는 데 있어서 면역계의 상대적 비효율성, 오래가지 않는 국소적 점막 면역성, 신속하고 강력한 바이러스 복제, 면역학적 비성숙에 의한 아이들의 감소된 면역 반 응, 태반을 통해 모체로부터 유도된 혈청 항체에 의한 면역 억제, 및 G 단백질의 높은 수준의 글리코실화와 같은 바이러스의 특정한 성질을 포함한 수많은 인자가 여기에 기여할 것이다. 또한, 하기에 기술되겠지만, 인간 RSV는 2개의 항원 아군 A 및 B로서 존재하고, 하나의 아군에 대한 면역성은 다른 아군에 대해 그 효과가 감소한다.
죽을 때까지 RSV는 수회 재감염될 수 있지만, 재감염은 통상적으로 이전의 감염에 의해 유도된 방어적 면역성에 의해 심각성이 감소되고, 그로 인해 면역학적 예방이 가능하다. 생 약독화된 RSV 백신은 비강으로 투여되어 온화한 면역화 감염을 시작할 것이다. 이는 비경구 경로와 비교해서 간결하고 안전한 잇점을 갖는다. 이는 또한 국소적 호흡기 면역성을 직접적으로 자극하고, RSV에 대한 내성에 주요한 역할을 한다. 이는 또한 전형적으로 매우 젊은 사람에게서 나타나는 RSV-특이적 모체로부터 유도된 혈청 항체의 면역 억제 효과를 제거한다. 또한, RSV 항원을 비경구 투여하면 때때로 면역병리학적 합병증을 일으킬 수 있으나 (Murphy et al., Vaccine 8(5):497-502 (1990)), 이는 생 바이러스로는 나타나지 않았다.
포르말린 불활성화 바이러스 백신을 1960년대 중반에 RSV에 대하여 시험하였으나, RSV 감염 또는 질병을 방어하는 데는 실패했고, 사실 바이러스에 의한 이후 감염에 의한 증상을 악화시켰다. (Kim et al., Am. J. Epidemiol., 89:422-434 (1969); Chen et al., Am. J. Epidemiol., 89:449-463 (1969); Kapikian et al., Am. J. Epidemiol., 89:405-421 (1969)).
더욱 최근에, RSV 백신 개발은 약독화된 RSV 돌연변이에 집중되었다. 문헌 [Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204:690-694 (1968)]은 충분히 약독화된 것으로 보이는 RSV의 저온 계대 배양된 (cold passaged) 돌연변이 (cpRSV)가 백신 후보물임을 보고하였다. 이 돌연변이는 야생형 (wt) 부모 바이러스와 비교하여 26oC에서 약간 증가된 성장 효율을 나타냈지만, 그의 복제는 온도 민감성도 아니고 현저하게 저온 적응되지도 않았다. 그러나, 저온 계대 배양된 돌연변이는 성인에 대해 약독화되었다. RSV로 이전에 감염되었던 유아 및 아이들에 대해 만족스럽게 약독화되고 면역원성이라 하더라도 (즉, 혈청 양성 개체들), cpRSV 돌연변이는 혈청 음성 유아의 상기도에 대해 낮은 독성을 가졌다.
유사하게는, 문헌 [Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421 (1969)]은 유망한 백신 후보이기도 한 온도 민감성 RSV (tsRSV) 돌연변이의 분리를 보고하였다. 하나의 돌연변이체인 ts-1을 실험실에서 그리고 지원자들에서 집중적으로 평가하였다. 돌연변이체는 성인 지원자에게 무증상 감염을 일으켰고, 면역화시키고 45일 후에 야생형 바이러스의 감염에 대해 내성이 생겼다. 또한, 혈청 양성 유아 및 아이들은 무증상 감염되었으나, 혈청 음성 유아는 비염 및 다른 경미한 증상의 징후를 나타내었다. 또한, ts 표현형의 불안정성이 검출되었다. 부분적 또는 완전한 온도 민감성 상실을 나타내는 바이러스가 백신 접종자로부터 회수가능한 바이러스 일부를 나타낼지라도, 이는 경미한 비염 이외의 질병의 신호와 연관되지 않았다.
이들 및 다른 연구는 특정한 저온 계대 배양되고 온도 민감성인 RSV 균주가 불충분하게 약독화되어 몇몇 백신을 맞은 개체들, 특히 혈청 음성 유아에서 경미한 증상의 질병을 일으켰지만, 다른 균주들은 과도하게 약독화되어 방어적 면역 반응을 유도하기 위해 충분히 복제하는 데 실패하였음을 보여 주었다 (Wright et al., Infect. Immun., 37:397-400 (1982)). 또한, 후보 백신 돌연변이체의 유전적 불안정성은 그들의 온도 민감성 표현형의 손실을 초래하였고, 나아가 효과적인 RSV 백신의 개발을 방해하였다. 일반적으로 문헌 [Hodes et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 145:1158-1164 (1974), McIntosh et al., Pediatr. Res. 8:689-696 (1974), 및 Belshe et al., J. Med. Virol., 3:101-110 (1978)] 참조.
생-약독화된 RSV 백신 대신에, 연구자들은 정제된 RSV 외피 (envelope) 당단백질을 사용하여 서브단위 백신 후보를 시험하였다. 당단백질은 코튼 랫트 (cotton rats)의 폐에서 RS 바이러스 감염에 대해 내성을 유도하였으나 (Walsh et al., J. Infect. Dis. 155:1198-1204 (1987), 항체는 매우 약한 중화 활성을 가지고 정제된 서브단위 백신으로 설치류를 면역화시키면 질병이 악화되었다 (Murphy et al., Vaccine 8:497-502 (1990)).
F 및 G 외피 당단백질을 발현시키는 재조합 우두 바이러스 백신이 또한 시험되었다. 이들 재조합체는 원래 바이러스 대응물과 구별할 수 없는 RSV 당단백질을 발현시키고, 우두-RSV F 및 G 재조합체로 피내 감염된 설치류는 바이러스 감염성을 중화시키는 높은 수준의 특이 항체를 발생시켰다. 사실, 우두-F 재조합체로 코튼 랫트를 감염시키면 하기도에서 RSV의 복제에 대해 거의 완전한 내성 및 상기도에서 현저한 내성이 자극되었다. (Olmsted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7462-7466 (1986)). 그러나, 우두-F 및 G 재조합체로 침팬지를 면역화시키면 상기도에서는 RSV 감염에 대해 거의 방어를 거의 나타내지 않았고 (Collins et al., Vaccine 8:164-168 (1990)) 하기도에서는 방어가 일관성이 없었다 (Crowe et al., Vaccine 11:1395-1404 (1993)).
효과적인 RSV 백신을 개발하기 위한 상기 다양한 노력에도 불구하고, RSV에 대해서는 아직 허가받은 백신이 없다. 선행 접근법의 만족스럽지 않은 전망은 RSV 백신 개발을 위한 신규 전략, 특히 생존가능한 약독화된 RSV 재조합체에 신규 표현형 성질을 얻는 유전적 변화를 도입하기 위해 재조합 RSV를 조작하는 방법을 강조한다. 그러나, RSV 및 다른 비분적 음성 센스 RNA 바이러스의 게놈 RNA 조작은 이제까지 어려운 것으로 증명되었다. 이러한 점에서 주요한 장애는 이들 바이러스의 나출된 (naked) 게놈 RNA의 비감염성, 조직 배양에서의 열악한 성장, 긴 복제 주기, 바이러스 입자 불안정성, 복합체 게놈, 및 유전자 생성물의 불응성 조직화 등이다.
재조합 DNA 기술은 cDNA로부터 감염성 비분절 음성 가닥 DNA 바이러스를 회수하고, 바이러스 클론을 유전학적으로 조작하여 신규한 백신 후보물질을 구성하고, 약독화 및 표현형 안정성의 수준을 신속하게 평가하는 것을 가능하게 하였다 (Conzelmann, J. Gen. Virol. 77:381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11354-58 (1996) 참조). 이와 관련하여, 재조합 레스큐 (rescue)는 필수 바이러스 단백질의 존재 하에서 cDNA-코딩된 안티게놈 RNA로부터 감염성 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV), 파라인플루엔자 바이러스 (PIV), 광견병 바이러스 (RaV), 소포성 구내염 바이러스 (VSV), 홍역 바이러스 (MeV), 우역 바이 러스 및 센다이 바이러스 (SeV)에 대해 보고되었다 (예를 들면, Garcin et al., EMBO J. 14:6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14:5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13:4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:8388-92 (1995); Hoffman et al., J Virol. 71:4272-4277 (1997); Pecters et al., J. Virol. 73:5001-5009 (1999); Kato et al., Genes to Cells 1:569-579 (1996); Roberts et al., Virology 247(1), 1-6 (1998); Baron et al., J Virol. 71:1265-1271 (1997); 국제 공개 WO 제97/06270호; 1995년 9월 27일 출원된 미국 가특허 출원 제60/007,083호; 1996년 9월 27일 출원된 미국 특허 출원 제08/720,132호; 1996년 7월 15일 출원된 미국 가특허 출원 제60/021,773호; 1997년 5월 9일 출원된 미국 가특허 출원 제60/046,141호; 1997년 5월 23일 출원된 미국 가특허 출원 제60/047,634호; 1999년 11월 30일 출원된 미국 특허 제5,993,824호 (국제 공개 WO 제98/02530호에 상응함); 1999년 4월 13일 콜린스(Collins) 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 제09/291,894호; 1999년 4월 13일 머피(Murphy) 등에 의해 출원된 미국 가특허 출원 제60/129,006호; Collins, et al., Proc Nat. Sci. USA 92:11563-11567, 1995; Bukreyev, et al., J. Virol 70:6634-41, 1996; Juhasz et al., J. Virol. 71(8):5814-5819 (1997); Durbin et al., Virology 235:323-332 91997); He et al., Virology 237:249-260 (1997); Baron et al., J. Virol. 71:1265-1271 (1997); Whitehead et al., Virology 247(2):232-9 (1998a); Buchholz et al., J. Virol. 73:251-9 (1999); Whitehead et al., J. Virol. 72(5):4467-4471 (1998b); Jin et al., Virolory 251:206-214 (1998); 및 Whitehead et al., J. Virol. 73:(4)3438-3442 (1999) 및 Bukreyev, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 2367-72 (1999) 참조, 각 문헌은 본원에 참고로 삽입됨).
상기 개발에 기초하여, cDNA로부터 감염성 RSV를 회수하고, RSV 클론에 다양한 유전적 조작을 설계하고 이행하여 신규 백신 후보물을 구성하는 것이 가능하여 졌다. 그 후, 다른 요망되는 표현형의 특성 중에서 표현형 안정성 및 약독화의 수준을 평가하고 조정할 수 있다. 따라서, 남아있는 과제는 단독으로 또는 다른 유형의 유전적 조작과 함께 적용할 수 있는 광범위하고 다양한 유전적 조작의 메뉴를 개발하여 광범위한 백신 용도에 유용한 감염성 약독화 RSV 백신을 구성하는 것이다. 이러한 관계에 있어서, 당업계에는 RSV에 기인하는 심각한 건강 문제를 완화하는 안전하고 효과적인 백신의 엔지니어링을 가능하게할 수 있는 추가 도구 및 방법에 대한 긴급한 요구가 남아있다. 놀랍게도, 본 발명은 감염성 약독화 RSV 백신 후보물을 구성하기 위한 추가 도구를 제공하여 이러한 요구를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 상대적인 유전자 순서 또는 하나 이상의 유전자 또는 게놈 분절의 공간 위치를 이동시켜 인간 및 다른 포유동물에서 감염성이며 약독화되고 면역원성된 재조합 백신 바이러스를 발생시키기 위해 수식된 재조합 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV)를 제공한다. 본 발명의 재조합 RSV는 통상적으로 주 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 대형 중합효소 단백질 (L), RNA 중합효소 신장 인자, 및 재조합 게놈 또는 안티게놈 내에서 하나 이상의 위치이동한 RSV 유전자 또는 게놈 분절을 갖는 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함한다. 본 발명의 특정한 면에서, 재조합 RSV는 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 하나 이상의 변위 (displacement) 폴리뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 재배열에 의해 프로모터에서 더 가깝거나 프로모터에서 더 먼 위치로 이동될 수 있는 하나 이상의 위치이동한 유전자 또는 게놈 분절을 특징으로 한다. 변위 폴리뉴클레오티드는 재조합 게놈 또는 안티게놈의 비코딩 영역 (NCR)내에 삽입되거나 재배열될 수 있거나, 또는 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈내로 별개의 유전자 유닛 (GU)로서 도입될 수 있다.
본 발명의 대표적인 실시태양에서, 단리된 감염성 재조합 RSV는 RSV NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 또는 G 유전자 및 게놈 분절, 및 RSV 게놈 및 그의 분절의 리더, 트레일러 또는 유전자간 영역으로부터 선택된 RSV 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)로부터 선택될 수 있는 하나 이상의 변위 폴리뉴클레오티드의 첨가, 결실 또는 재배열에 의해 구성된다. 더욱 상세한 실시태양에서, 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 폴리뉴클레오티드 삽입물, 및 결실 또는 재배열된 요소 (element)는 RSV NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 또는 G 유전자 및 게놈 분절, 및 RSV 게놈 및 그의 분절의 리더, 트레일러 또는 유전자간 영역으로부터 선택된 하나 이상의 소 RSV (BRSV) 또는 인간 RSV (HRSV) 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)로부터 선택된다.
본 발명의 특정한 면에서, 변위 폴리뉴클레오티드는 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성한다. 이러한 방법의 변위 폴리뉴클레오티드의 결실은 재조합 게놈 또는 안티게놈 내에서 하나 이상의 "이동된" RSV 유전자 또는 게놈 분절이 야생형 RSV (예, HRSV A2 또는 BRSV 캔사스 스트레인) 게놈 또는 안티게놈 내에서의 이동된 유전자(들) 또는 게놈 분절의 위치에 비해 프로모터에서 더 가까운 위치로 이동되도록 한다. 이러한 방법으로 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있는 대표적인 변위 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 RSV NS1, NS2, SH, M2(ORF2) 또는 G 유전자(들) 또는 이들의 게놈 분절(들)로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 보다 상세한 실시양태에서, RSV NS1 유전자를 포함하는 치환 폴리뉴클레오티드가 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성한다. 별법으로, RSV NS2 유전자를 포함하는 치환 폴리뉴클레오티드가 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다. 별법으로, RSV SH 유전자를 포함하는 치환 폴리뉴클레오티드가 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다. 별법으로, RSV M2 (ORF2)를 포함하는 치환 폴리뉴클레오티드가 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다. 별법으로, RSV G 유전자를 포함하는 치환 폴리뉴클레오티드가 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다.
추가의 실시양태에서, RSV 유전자 또는 게놈 분절을 포함하는 다중 치환 폴리뉴클레오티드가 결실될 수도 있다. 예를 들면, RSV F 및 G 유전자가 모두 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다. 별법으로, RSV NS1 및 NS2 유전자가 모두 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다. 별법으로, RSV SH 및 NS2 유전자가 모두 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다. 별법으로, RSV SH, NS1 및 NS2 유전자가 모두 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 하나 이상의 치환 폴리뉴클레오티드가 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에 첨가, 치환 또는 재배열되어 하나 이상의 이동된 RSV 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)의 위치이동을 야기시키는 단리된 감염성 재조합 RSV가 제공된다. 이들 변환 중에서, 삽입 및 재배열될 유전자 및 게놈 분절은 시험 유전자 또는 게놈 분절을 상응하는 (예를 들면, 소 또는 인간) 야생형 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에 각각의 대상 (삽입된 또는 재배열된) 유전자 또는 게놈 분절의 각각의 위치에 비해 프로모터에서 더 가깝거나 프로모터에 먼 위치로 도입하거나 재배열할 수 있다. 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에 첨가, 치환 또는 재배열될 수 있는 치환 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 RSV NS1, NS2, SH, M2 (ORF2), F, 및(또는) G 유전자(들) 또는 그의 게놈 분절(들)으로부터 선택될 수 있다.
보다 상세한 실시양태에서, 치환 폴리뉴클레오티드는 1종 이상의 RSV 당단백질 또는 RSV 당단백질의 면역원성 도메인 또는 에피토프를 코딩하는 1종 이상의 RSV 유전자 또는 게놈 분절을 포함하는 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입 또는 재배열되기 위해 선택된다. 예시 실시양태에서, 이들 치환 폴리뉴클레오티드는 RSV F, G, 및(또는) SH 당단백질 또는 그의 면역원성 도메인 또는 에피토프를 코딩하는 유전자 또는 게놈으로부터 선택된다. 예를 들면 F, G 및 SH로부터 선택 된 1종 이상의 RSV 당단백질 유전자(들)은 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 유전자(들)의 야생형 유전자 순서 위치에 비해 프로모터에서 더 가깝거나 더 먼 위치로 첨가, 치환 또는 재배열될 수 있다.
예시의 실시양태에서, RSV 당단백질 유전자 G는 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 G의 야생형 유전자 순서 위치에 비해 프로모터에서 더 가까운 유전자 순서 위치로 재배열된다. 보다 상세한 측면에서, RSV 당단백질 유전자 G는 상기 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 유전자 순서 위치 1로 이동된다. 다른 예시 실시양태에서, RSV 당단백질 유전자 F는 예를 들면 F 유전자를 재조합 게놈 또는 안티게놈 내에서 유전자 순서 위치 1로 이동시킴으로써 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 프로모터에서 더 가까운 위치로 재배열된다. 추가의 예시 실시양태에서, RSV 당단백질 유전자 G 및 F는 모두 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 각각의 야생형 유전자에 비해 프로모터에서 더 가까운 유전자 순서 위치로 재배열된다. 보다 상세한 측면에서, RSV 당단백질 유전자 G는 유전자 순서 위치 1로 이동되고 RSV 당단백질 유전자 F는 유전자 순서 위치 2로 이동된다.
당단백질 유전자 이동을 특징으로 하는 추가의 구조에서, 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 (여기서, 1종 이상의 RSV NS 1, NS2, SH, M2 (ORF2), 또는 G 유전자(들) 또는 그의 게놈 분절(들)이 결실됨) 내에서 첨가, 치환 또는 재배열된 F, G 및 SH, 또는 그의 게놈 분절로부터 선택된 1종 이상의 RSV 당단백질 유전자(들)을 갖는 재조합 RSV가 제조된다. 그러므로 RSV F, G, 또는 SH의 유전자 또는 게놈 분절은 배경 (background)에서 첨가,치환 또는 재배열될 수 있는데, 여기서 RSV NS1 유전자를 포함하는 치환 폴리뉴클레오티드는 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티 게놈을 형성한다. 별법으로, RSV F, G 또는 SH의 유전자 또는 게놈 분절은 배경에서 첨가, 치환 또는 재배열될 수 있는데, 여기서 RSV NS2 유전자를 포함하는 치환 폴리뉴클레오티드는 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다. 별법으로, RSV F, G, 또는 SH의 유전자 또는 게놈 분절은 배경에서 첨가, 치환 또는 재배열될 수 있는데, 여기서 RSV SH 유전자를 포함하는 치환 폴리뉴클레오티드가 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성한다.
하기 한 실시예에서, RSV 당단백질 유전자 G는 SH 유전자 결실을 갖는 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 G의 야생형 유전자 순서 위치에 비해 프로모터에서 더 가까운 유전자 순서 위치로 재배열된다. 보다 상세한 측면에서, RSV 당단백질 유전자 G는 재조합 백신 후보물 G1/△SH에 의해 예시된 바와 같이 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 유전자 순서 위치 1로 이동된다. 다른 실시예에서, RSV 당단백질 유전자 F는 SH 유전자 결실을 갖는 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 프로모터에서 더 가까운 인접 위치로 재배열된다. 보다 상세한 측면에서, F 유전자는 재조합 F1△SH에 의해 예시된 바와 같이 유전자 순서 위치 1로 이동된다. 추가의 하기 실시예에서, RSV 당단백질 유전자 G 및 F는 모두 △SH 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 G 및 F의 야생형 유전자 순서 위치에 비해 프로모터에서 더 가까운 유전자 순서 위치로 재배열된다. 보다 상세한 측면에서, RSV 당단백질 유전자 G는 재조합 G1F2/△SH에 의해 예시된 바와 같이 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 유전자 순서 위치 1로 이동되고 RSV 당단백질 유전자 F는 유전 자 순서 위치 1로 이동된다.
유전자 위치이동된 RSV의 추가의 실시예는 F, G 및 SH로부터 선택된 당단백질 유전자(들)의 특징적 이동을 제시하는데, RSV NS 1, NS2, SH, M2 (ORF2), 및 결실된 G 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)로부터 선택된 다중 유전자 또는 게놈 분절을 갖는 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 제조된다. 한 실시예에서, RSV SH 및 NS2 유전자 모두 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성하고, RSV 당단백질 유전자 G 및 F 중 하나 또는 둘 다는 재조합 RSV 게놈 내에서 프로모터에서 더 가까운 유전자 순서 위치로 재배열된다. 보다 상세한 측면에서, G는 재조합 G1F2/△NS2△SH에 의해 예시된 바와 같이 유전자 순서 위치 1로 이동되고 F는 유전자 순서 위치 2로 이동된다. 다른 실시예에서, 모든 RSV SH, NS1 및 NS2 유전자는 결실되어 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 또는 안티게놈을 형성하고, RSV 당단백질 유전자 G 및 F 중 하나 또는 둘 다는 재조합 백신 후보물 G1F2/△NS2△NS2△SH에 의해 예시된 바와 같이 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 프로모터에서 더 가까운 위치로 재배열된다.
본 발명의 추가 측면에서, 유전자 위치이동된 RSV가 인간-소 키메릭 RSV과 결합하거나 또는 인간-소 키메릭 RSV내에 도입된다. 이들 측면 내에서, 재조합 게놈 또는 안티게놈은 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈에 있어서 상이한 RSV로부터 1종 이상의 이종 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)과 결합한 부분 또는 완전 인간 RSV (HRSV) 또는 소 RSV (BRSV) 배경 게놈 또는 안티게놈을 포함한다. 상이한 HRSV 또는 BRSV의 이종 유전자 또는 게놈 분절은 부분 또는 완전 HRSV 또는 BRSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내에서 대응 유전자 또는 게놈 분절의 야생형 유전저 순서 위치에 비해 프로모터에서 더 가깝거나 더 먼 위치에 첨가 또는 치환될 수 있다. 본원에서 제시한 상기 실시예에서, 재조합 바이러스 rBRSV/A2-G1F2의해 예시된 바와 같이 인간 RSV 당단백질 유전자 G 및 F는 각각 유전자 순서 위치 1 및 2에서 치환되어 부분 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내의 야생형 위치 7 및 8에서 각각 결실된 대응 G 및 F 당단백질 유전자를 치환한다. 보다 상세한 측면에서, F, G, SH 및 M으로부터 선택된 1 종 이상의 인간 RSV 외피 연관 유전자는 F, G, SH 및 M으로부터 선택된 1 종 이상의 인간 RSV 외피 연관 유전자가 결실된 부분 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내에 첨가 또는 치환된다. 하기 한 실시예에서, 인간 RSV 외피-연관 유전자 F, G 및 M은 재조합 바이러스 rBRSV/A2-MGF에 의해 예시된 바와 같이 모든 외피-연관 유전자 F, G, SH 및 M이 결실된 부분 소 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈 내에 첨가된다.
본 발명의 또다른 별법의 실시양태에서, RSV M2 (ORF1)가 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 프로모터에 더 가까운 위치로 이동된 단리된 감염성 재조합 RSV가 제시된다. 이 유전자 이동의 결과는 재조합 바이러스의 상향조절된 전사이다.
본 발명의 추가의 측면에서, 재조합 게놈 또는 안티게놈이 결과의 바이러스 또는 서브바이러스 입자 중의 약독화된 표현형을 규정하는 1 이상의 약독화 돌연변이를 도입함으로써 추가로 변형된, 약독화된 유전자 위치이동된 RSV가 제조된다. 약독화 돌연변이는 드 노보로 생성될 수 있고, 합리적인 설계의 돌연변이유발 전략 에 따라서 효과를 약화시키기 위해 시험될 수 있다. 별법으로, 약독화 돌연변이는 존재하는 생물학적으로 유래된 돌연변이체 RSV에서 동정될 수 있고, 따라서 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV로 혼입될 수 있다.
본 발명의 재조합 RSV에 도입된 유전자 위치 변화와 함께, 키메릭 바이러스의 약독화를 증가 또는 감소시키는 추가 돌연변이를 도입함으로써 약독화 표현형을 조정하는 것이 종종 바람직하다. 따라서, 후보 백신 균주는 예를 들면, 공지의 생물학적으로 유도된 돌연변이체 RSV 균주의 패널로부터 확인된 돌연변이와 같은 1종 이상, 바람직하게는 2종 이상의 상이한 약독화 돌연변이의 혼입에 의해 추가로 약독화될 수 있다. 바람직한 인간 돌연변이 RSV 균주는 저온 계대 배양 (cp) 및(또는) 온도 민감성 (ts) 돌연변이체, 예를 들면, "cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSB B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542), 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)"로 표시되는 돌연변이체이다 (각각은 미국 20110-2209 버지니아주, 마나싸스, 유니버시티 블루바드 10801에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 부다페스트 조약으로 기탁되고, 상기 확인된 수탁 번호를 부여받음). 생물학적으로 유도된 돌연변이체의 이 예시적 집단으로부터, 백신 용도를 위한 재조합, 인간-소 키메릭 RSV에서의 약독화 수준의 보정(calibrating)을 위한 집단 내 임의의 다른 돌연변이(들)과 각각 결합될 수 있는 많은 "메뉴"의 약독화 돌연변이가 제공된다. 추가의 돌연변이는 예를 들면, 작은 플라크 (sp), 저온 적응되거나 (ca) 또는 숙주 범위 제한된 (hr) 돌연변이체 균주에서 동정된 바대로 비-ts 및 비-cp 약독화 돌연변이를 갖는 RSV로부터 유래될 수 있다. 돌연변이는 인간 또는 소 안티게놈 서열에 혼입될 수 있으며, 인간, 소 또는 다른 RSV 돌연변이체에서 확인된 약독화 돌연변이는 돌연변이를 수용체 게놈의 상응하는 동종 부위에 맵핑하고, 그의 거명에 의해 본 발명에 포함되는 머피(Murphy) 등의 1999년 4월 13일자 미국 가특허 출원 제60/129,006호에 기술된 바와 같이 수용체의 천연서열을 돌연변이체 유전자형에 돌연변이 (동일 또는 보존적 돌연변이에 의해)시키는 것에 의해 이종 RSV 수용체 (예를 들면, 각각 소 또는 인간 RSV)에 전달될 수 있다.
그러므로 본 발명의 보다 상세한 실시양태에서, 재조합 게놈 또는 안티게놈이 돌연변이 인간 RSV 균주의 패널 (상기 패널은 cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542) 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)을 포함함) 내에 존재하는 하나 이상 그리고 완전 보체 이하의 약독화 돌연변이를 혼입하는 유전자 위치이동된 RSV가 제시된다. 특정 실시양태에서, 재조합 게놈 또는 안티게놈은 상이한 돌연변이체 RSV 균주로부터 적응된 약독화 돌열변이를 혼입한다.
RSV 백신용으로 설계되고 선택된 유전자 위치이동된 RSV는 종종 2 이상, 때로는 3 이상의 약독화 돌연변이를 지녀서 광범위한 임상 용도의 만족스러운 약독화 수준을 달성한다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 약독화 돌연변이는 RSV 중합효소 유전자 L (공여체 또는 수용체 유전자 중)에서 발생하고, 온도-민감성 (ts) 표현형을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 약독화 표현형을 규정하는 중합효소 단백질에서의 아미노산 변화를 규정하는 하나 이상의 뉴클레오티드 치환(들)을 포함한다. 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV는 L외에도 임의의 추가 RSV 유전자 중에 예를 들면, M2 유전자 중에 약독화 돌연변이를 혼입할 수 있다. 그러나, 이와 관련하여 바람직한 인간-소 키메릭 RSV는 Asn43을 Ile로, Phe521을 Leu로, Gln831을 Leu로, Met1169를 Val로, Tyr1321을 Asn으로 변화시키는 것과 같이, RSV 중합효소 유전자 L 중의 아미노산 Asn43, Cys319, Phe521, Gln831, Met1169, Tyr1321 및(또는) His1690에서의 아미노산 변화를 야기시키는 대형 중합효소 유전자 L중의 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 혼입한다. 또한, 이들 위치에서의 다른 별도의 아미노산 변화, 특히 확인된 돌연변이체 잔기에 관한 보존적 변화는 확인된 돌연변이체 치환과 유사한 효과를 가져올 수 있다. 본 발명의 인간-소 키메릭 RSV에 혼입하기 위한 추가의 바람직한 돌연변이는 RSV N 유전자의 Val267, RSV F 유전자의 Glu218 및(또는) Thr523에서의 아미노산 치환, 및 유전자 M2의 유전자-개시 서열에서의 뉴클레오티드 치환을 규정하는 약독화 돌연변이를 포함한다. 이들 돌연변이 충분한 수를 포함하여 및 그 이하의 본원에 확인된 하나 이상의 약독화 돌연변이의 모든 조합은 인간-소 키메릭 RSV에 혼입되어 백신 수용체의 선택된 집단 또는 광범위한 집단에 사용되기 위한 적당하게 약독화된 재조합 바이러스를 생성할 수 있다.
본 발명의 다른 보다 상세한 실시양태에서, 재조합 게놈 또는 안티게놈이 예를 들면 RSV N 유전자에서의 Val267, RSV F 유전자에서의 Glu218 및(또는) Thr523, RSV 중합효소 유전자 L에서의 Asn43, Cys319, Phe 521, Gln831, Met1169, Tyr1321 및(또는) His 1690인 아미노산 치환, 및 M2의 유전자-개시 서열에서 뉴클레오타이드 치환을 규정하는 하나 이상 내지 완전 보체 이하의 약독화 돌연변이를 혼입하는 유전자 위치이동된 RSV가 제시된다. 특정 측면에서, 재조합 게놈 또는 안티게놈은 하나 이상, 통상 3개, 4개 또는 5개, 그리고 때때로 이들 약독화 돌연변이 모두를 포함하는 완전 보체를 혼입한다. 종종 하나 이상의 약독화 돌연변이는 코돈에서 다수의 뉴클레오티드 변화, 예를 들면 돌연변이에 의해 안정화된다.
본 발명의 인간-소 키메릭 RSV에 혼입하기 위한 약독화 돌연변이는 공여체 또는 수용체 RSV 유전자의 코딩 부분 또는 시스-조절 서열과 같은 비코딩 영역에서 선택될 수 있다. 비코딩 돌연변이의 예로는 뉴클레오티드 7605 (재조합 서열 중 뉴클레오티드 7606)에서의 M2 유전자 개시 서열 중의 단일 또는 다수 염기 치환에 의해 예시되는 바와 같이 유전자 개시 서열 중의 단일 또는 다수 염기 변화를 포함한다.
본 발명에 따른 감염성 키메릭 RSV는 모든 RSV 또는 RSV 유사 바이러스 유래 (예를 들면, 인간, 소, 생쥐 (생쥐의 폐렴 바이러스), 또는 조류 (칠면조 비기관염 바이러스) 폐렴바이러스) 또는 다른 외피 바이러스 유래(예를 들면, 파라인플루엔자 바이러스 (PIV))의 이종 코딩 또는 비코딩 뉴클레오티드 서열을 혼입할 수 있다. 이종 서열의 예로는 인간-소 키메릭 RSV 중의 상이한 인간 RSV 균주 유래의 서열과 결합된 한 가지 인간 RSV 균주 유래의 RSV 서열이 포함된다. 예를 들면, 본 발명의 키메릭 RSV는 2 이상의 야생형 또는 돌연변이 RSV 균주, 예를 들면, cpts RSV 248, cpts 248/404, cpts 248/955, cpts RSV 530, cpts 530/1009, 또는 cpts 530/1030으로부터 선택되는 돌연변이 균주 유래의 서열을 혼입할 수 있다. 별법으로, 키메릭 RSV는 2 이상의 야생형 또는 돌연변이 인간 RSV 아군, 예를 들면, 인간 RSV 아군 A 및 아군 B 서열의 조합을 혼입할 수 있다. 또 추가의 측면에서, 하나 이상의 인간 RSV 코딩 또는 비코딩 폴리뉴클레오티드는 이종 RSV 또는 비-RSV 바이러스 유래의 대응 서열로 단독으로 또는 하나 이상의 선택된 약독화 돌연변이 (예를 들면, cp 및(또는) ts 돌연변이)와 함께 치환되어 신규 약독화된 백신 균주를 생성할 수 있다.
본 발명의 유전자 위치이동된 RSV cDNA, 벡터 및 바이러스 입자 내에 혼입된 돌연변이는 개별적으로 또는 함께 전장 RSV cDNA에 혼입될 수 있으며, 도입된 돌연변이를 포함하는 구조(rescued) 바이러스의 표현형은 쉽게 확인될 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 생물학적으로 유도된 약독화 바이러스 대 야생형 RSV에 의해 나타나는 아미노산 변화, 예를 들면 cpRSV 또는 tsRSV에 의해 나타나는 변화는 유전자 위치이동된 RSV 내로 함께 혼입되어 요망되는 수준의 약독화를 얻는다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 유전자 위치이동된 RSV는 하나 이상의 RSV 균주 또는 군 (예를 들면, 인간 RSV A 및 RSV B 아군 모두)를 포함하는 상이한 병원체, HPIV3, HPIV2 및 HPIV1을 포함하는 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 홍역 바이러스 및 다른 병원체 (예를 들면, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입된 미국 가특허 출원 제60/170,195호, 동 제09/458,813호, 및 동 제09/459,062호를 참조)로부터의 항원 결정기를 혼입하는 "벡터"로 용이하게 설계될 수 있다. 다양한 실시 태양 내에서, 재조합 게놈 또는 안티게놈은 하나 이상의 이종 병원체의 항원 결정기 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 이종 유전자 또는 게놈 분절과 결합된 부분적 또는 완전한 RSV "벡터 게놈 또는 안티게놈"을 포함한다. 이종 병원체는 이종 RSV (즉, 상이한 균주 또는 아군의 RSV)일 수 있으며, 이종 유전자 또는 게놈 분절은 RSV NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(PRF2), L, F 또는 G 단백질 또는 이의 단편 (예를 들면, 면역원성 도메인 또는 에피토프)을 코딩할 수 있다. 예를 들면, 벡터 게놈 또는 안티게놈은 부분적 또는 완전한 RSV A 게놈 또는 안티게놈일 수 있으며, 이종 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)은 RSV B 아군 바이러스의 항원 결정기(들)을 코딩할 수 있다.
별도의 실시태양에서, 유전자 위치이동된 RSV 벡터 게놈 또는 안티게놈은 부분적 또는 완전한 BRSV 게놈 또는 안티게놈이며, 항원 결정기(들)을 코딩하는 이종 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)은 하나 이상의 HRSV의 것이다. 예를 들면, 부분적 또는 완전한 BRSV 게놈 또는 안티게놈은 F, G 및 SH로부터 선택되는 하나 이상의 HRSV 당단백질 유전자를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들) 또는 게놈 분절(들), 또는 HRSV의 F, G 및(또는) SH의 세포질 도메인, 막통과 도메인, 엑토도메인 또는 면역원성 에피토프 부분(들)을 코딩하는 하나 이상의 게놈 분절(들)을 혼입할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 이종 항원 결정기를 운반하도록 "벡터"로 설계된 유전자 위치이동된 RSV는 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV)와 같은 비-RSV 병원체의 하나 이상의 항원 결정기를 혼입할 수 있다. 한 예시적 실시태양에서, 하나 이상의 HN 및(또는) F 당단백질(들) 또는 항원성 도메인(들), 이의 단편(들) 또는 에피토프(들)을 코딩하는 하나 이상의 HPIV1, HPIV2 또는 HPIV3 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)은 부분적 또는 완전한 HRSV 벡터 게놈 또는 안티게놈에 첨가 또는 혼입된다. 더욱 상세한 실시태양에서, HPIV1, HPIV2 또는 HPIV3 HN 또는 F 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 전사 단위는 재조합 벡터 게놈 또는 안티게놈으로 첨가 또는 혼입된다.
또 다른 별도의 실시태양에서, 벡터 게놈 또는 안티게놈은 부분적 또는 완전한 HRSV 또는 BRSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하고, 이종 병원체는 홍역 바이러스, 아군 A 및 아군 B 호흡기 신시티움 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 인간 유두종(papilloma) 바이러스, 제1형 및 제2형 인간 면역결핍 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 필로바이러스 (filovirus), 분야바이러스 (bunyavirus), 플라비바이러스 (flavivirus), 알파바이러스 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택된다. 후보 병원체의 예시적 리스트에 기초하여, 선택된 이종 항원 결정기(들)은 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질, 아군 A 또는 아군 B 호흡기 신시티움 바이러스 F, G, SH 및 M2 단백질, 유행성 이하선염 바이러스 HN 및 F 단백질, 인간 유두종 바이러스 L1 단백질, 제1형 또는 제2형 인간 면역결핍 바이러스 gp160 단백질, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 사이토메갈로바이러스 gB, gC, gD, gE, gG, gH, gI, gJ, gK, gL 및 gM 단백질, 광견병 바이러스 G 단백질, 엡스타인 바 바이러스 gp350 단백질; 필로바이러스 G 단백질, 분야바이러스 G 단백질, 플라비바이러스 E 및 NS1 단백질, 및 알파바 이러스 E 단백질 및 이의 항원성 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 이종 병원체는 홍역 바이러스이고, 이종 항원 결정기(들)은 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질 및 이의 항원성 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택된다. 상기 키메릭 구성을 달성하기 위하여, 홍역 바이러스 HA 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 전사 단위는 HRSV 벡터 게놈 또는 안티게놈에 첨가 또는 혼입될 수 있다.
따라서, 본 발명은 선택된 조합으로 다수의 표현형-특이적 돌연변이를 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈에 도입하여 약독화된 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 제조할 수 있는 유전자 위치이동된 RSV 클론, 폴리뉴클레오티드 발현 구조물 (또한 벡터로 지칭됨) 및 입자를 제공한다. 통상의 표현형 평가와 연결된 이 과정은 약독화, 온도 민감성, 변경된 면역원성, 저온 적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한 등과 같은 요망되는 특성을 갖는 유전자 위치이동된 RSV를 제공한다. 따라서, 확인된 돌연변이는 "메뉴"로 편집되고 다양한 조합으로 도입되어 선택된 수준의 약독화, 면역원성 및 안정도로 백신 바이러스를 보정한다.
본 발명의 다른 추가 측면에서, 약독화 돌연변이가 있거나 없는 유전자 위치이동 RSV는 뉴클레오티드 변형을 갖도록 구성되어 요망되는 표현형적, 구조적 또는 기능적 변화를 수득한다. 전형적으로, 선택된 뉴클레오티드 변형은 예를 들면, 성장 특성, 약독화, 온도 민감성, 저온 적응, 플라크 크기, 숙주 범위 제한 또는 면역원성의 변화와 같은 표현형 변화를 규정할 것이다. 이러한 견지에서의 구조적 변화는 조작 및 동정의 용이성을 위해 cDNA를 코딩하는 RSV로의 제한 부위의 도입 또는 제거를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 유전자 위치이동된 RSV 내의 뉴클레오티드 변화는 유전자의 결실, 또는 그 발현의 제거에 의한 바이러스 유전자의 변형을 포함한다. 이와 관련하여 돌연변이에 대한 표적 유전자는 부착 (G) 단백질, 융합 (F) 단백질, 작은 소수성 (SH), RNA 결합 단백질 (N), 인단백질 (P), 대형 중합효소 단백질 (L), 전사 신장 인자 (M2 ORF1), RNA 조절 인자 M2 ORF2, 매트릭스 (M) 단백질 및 2 개의 비구조적 단백질인 NS1 및 NS2를 포함한다. 이들 단백질 각각은 완전히 또는 부분적으로, 단독으로 또는 다른 요망되는 변경과 함께 결실, 치환 또는 재배열되어 신규 키메릭 RSV 재조합체를 이룰 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, SH, NS1, NS2, G 또는 M2-2 유전자는 유전자 위치이동된 RSV에서 변형된다. 예를 들면, 이들 유전자 각각이 결실되거나 그 발현이 제거되어 (예를 들면, 종결 코돈의 도입에 의해), 얻어진 재조합 RSV 클론의 표현형을 변화시켜 성장, 약독화, 면역원성 또는 다른 요망되는 표현형 특성을 개선할 수 있다. 예를 들면, 재조합 게놈 또는 안티게놈에서의 SH 유전자 결실은 증가된 시험관내 성장 및(또는) 생체내 약독화와 같은 신규 표현형 특성을 갖는 RSV를 생성할 것이다. 관련된 측면에서, SH 유전자 결실, 또는 NS1, NS2, G 또는 M2-2 유전자 결실과 같은 다른 선택된 비필수적 유전자 또는 게놈 분절의 결실이 유전자 위치이동된 RSV에서 단독으로, 또는 생물학적으로 유도된 약독화 RSV 돌연변이체로부터 직접 채택된 점 돌연변이와 같은 약독화된 표현형을 규정하는 하나 이상의 상이한 돌연변이와 함께 (또는 예를 들면, 돌연변이를 규정하는 코돈에 다수 뉴클레오 티드 변화를 도입하는 것에 의해 변형된 형태로) 구성된다. 예를 들면, SH, NS1, NS2, G 또는 M2-2 유전자는 cpts248/404, cpts530/1009, cpts530/1030 또는 다른 선택된 돌연변이체 RSV 균주로부터 채택된 하나 이상의 cp 및(또는) ts 돌연변이와 함께 결실되어, 상이한 돌연변이의 연합 효과로 인한 바이러스 수율의 증가, 약독화 증강, 면역원성 개선 및 및 약독화 표현형으로부터의 복귀변이에 대한 유전적 저항성을 갖는 유전자 위치이동된 RSV를 생성한다.
별도 뉴클레오티드 변형은 유전자 위치이동된 RSV 중의 선택된 유전자에 대한 시스 작용 조절 서열의 결실, 삽입, 첨가 또는 재배열을 포함할 수 있다. 일례로, 1개의 RSV 유전자의 시스 작용 조절 서열은 상이한 RSV 중의 동일 유전자의 대응 시스 작용 조절 서열 또는 상이한 RSV 유전자의 시스 작용 조절 서열일 수 있는 이종 조절 서열에 상응하도록 변화된다. 예를 들면, 유전자 종결 신호는 동일 RSV 균주 중의 상이한 유전자의 유전자 종결 신호로의 전환 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 다른 실시태양에서, 뉴클레오티드 변형은 키메릭 게놈 또는 안티게놈 내의 번역 개시 부위의 삽입, 결실, 치환 또는 재배열을 포함하여, 예를 들면 단백질의 선택된 형태에 대한 별도 번역 개시 부위를 제거할 수 있다. 일례로, RSV G 단백질의 분비 형태에 대한 번역 개시 부위가 제거되어 이러한 형태의 G 단백질의 발현을 변경하고, 따라서 요망되는 생체내 효과를 생성한다.
또한, 다양한 다른 유전적 변경은 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈에서 단독으로 또는 생물학적으로 유도된 돌연변이체 RSV로부터 채택된 하나 이상의 약독화 돌연변이와 함께 생성될 수 있다. 예를 들면, 비-RSV 원천에서 유래 하는 유전자 또는 게놈 분절은 전체로 또는 부분적으로 삽입될 수 있다. 예를 들면, 외래 서열 삽입에 대한 용량을 증가시키기 위해 비번역 유전자 서열을 제거할 수 있다. 다른 추가 측면에서, 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자 또는 벡터를 비-RSV 서열, 예를 들면 사이토카인, T-헬퍼 에피토프, 제한 부위 마커, 또는 의도하는 숙주에서의 보호적 면역 반응을 유도할 수 있는 미생물 병원체 (예를 들면, 바이러스, 세균 또는 곰팡이)의 단백질을 코딩하도록 변형할 수 있다. 유전자 위치이동된 RSV 안티게놈에서의 상이한 또는 부가의 변형은 조작을 용이하게 하기 위해 일으킬 수 있는데, 그 예로는 다양한 유전자간 영역 또는 다른 곳에 유일한 제한 부위 (예를 들어, G와 F 유전자 사이의 유일한 StuI 부위)의 삽입이 있다.
점 돌연변이, 위치 지향성(site-specific) 뉴클레오티드 변화 및 전체 유전자 또는 게놈 분절을 포함하는 변화를 일으키는 뉴클레오티드 삽입, 재배열, 결실 또는 치환을 비롯하여, 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 상기 변형 모두는 부분적 또는 완전한 RSV 게놈 또는 안티게놈에, 또는 키메릭 RSV 중 이종 공여체 유전자 또는 게놈 분절이나 수용체, 배경 게놈 또는 안티게놈 내에 일으킬 수 있다. 각 경우에, 이들 변화는 바람직하게는 약독화, 온도 민감성, 저온 적응, 작은 플라크 크기, 숙주 범위 제한, 유전자 발현의 변경, 또는 면역원성 에피토프에서의 변화를 초래하는 표현형 변화 등의, 얻어진 재조합 RSV에서의 하나 이상의 표현형 변화(들)을 규정할 것이다.
본 발명의 다른 측면에서, 단리된 유전자 위치이동된 감염성 RSV를 제조하기 위한 조성물 (예를 들면, 단리된 폴리뉴클레오티드 및 RSV 코딩 cDNA를 혼입한 벡터) 및 방법이 제공된다. 이들 조성물 및 방법을 사용하여, 유전자 위치이동된 감염성 RSV 입자 또는 서브바이러스 입자가 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질 (P), 큰 (L) 중합효소 단백질 및 RNA 중합효소 신장 인자와 공동발현되는 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 생성된다. 본 발명의 관련 측면에서, 상기 언급한 구조적 및 표현형적 변화를 재조합 유전자 위치이동된 RSV에 도입하여 약독화된 감염성 백신 바이러스를 생성하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
한 실시태양에서, 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 또한, N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질을 코딩하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 동일 또는 상이한 발현 벡터가 제공된다. 이들 단백질은 또한 게놈 또는 안티게놈 cDNA로부터 직접 발현될 수 있다. 벡터(들)은 바람직하게는 세포 또는 무세포 용균물에서 발현 또는 공동발현되고, 이에 의해 유전자 위치이동된 감염성 RSV 입자 또는 서브바이러스 입자를 제조한다.
RSV 게놈 또는 안티게놈 및 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 (바람직하게는 RSV의 M2(ORF1)의 생성물) 단백질은 동일 또는 상이한 발현 벡터에 의해 공동 발현될 수 있다. 일부 경우, N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질은 각각 상이한 발현 벡터 상에서 코딩된다. 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는 이로부터 감염성 바이러스 또는 바이러스 입자의 생산을 가능하게 하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 본 발명의 별도의 측면에서, 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈은 다수의 인간 RSV 균주 또는 아군 (A 및 B) 유래의 서열 뿐만 아니라 다른 비인간 (예를 들면, 쥐) RSV 서열을 포함할 수 있다. 다른 별도의 측면에서, 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈은 비-RSV 서열, 예를 들면 PIV 또는 다른 음성 가닥 RNA 바이러스의 점 돌연변이, 단백질, 단백질 도메인 또는 면역원성 에피토프를 코딩하는 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결된 인간 및 소 RSV 유래의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 혼입할 수 있다.
유전자 위치이동된 RSV를 제조하기 위한 상기 방법 및 조성물은 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자, 또는 이의 유도체를 생성한다. 감염성 바이러스는 진정 RSV 바이러스 입자에 필적하고, 이것과 같이 감염성이다. 이는 직접적으로 신선한 세포를 감염시킬 수 있다. 감염성 서브바이러스 입자는 통상적으로 적합한 조건하에서 감염을 개시할 수 있는 바이러스 입자의 아성분(subcomponent)이다. 예를 들면, 게놈 또는 안티게놈 RNA 및 N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질을 포함하는 뉴클레오캡시드는, 세포의 세포질에 도입된다면 감염을 개시할 수 있는 서브바이러스 입자의 예이다. 본 발명에서 제공되는 서브바이러스 입자는 감염성에 필수적이지 않은 하나 이상의 단백질(들), 단백질 분절(들), 또는 다른 바이러스 성분(들)이 결여된 바이러스 입자를 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터, 및 RSV의 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질을 코딩하는 하나 이 상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터 (동일 또는 상이한 벡터)를 포함하는 세포 또는 무세포 용균물을 제공한다. 이들 단백질 중 하나 이상은 게놈 또는 안티게놈 cDNA로부터 발현될 수 있다. 발현시, 게놈 또는 안티게놈 및 N, P, L 및 RNA 중합효소 신장 인자 단백질이 결합되어 유전자 위치이동된 감염성 RSV 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 생성한다.
본 발명의 유전자 위치이동된 약독화 RSV는 감염된 인간 숙주에서 방어적 면역 반응을 유발할 수 있고, 면역화 숙주에서 심각한 호흡기 질환의 허용할 수 없는 증상을 유발하지 않을 만큼 이미 충분히 약독화되어 있다. 약독화 바이러스 또는 서브바이러스 입자는 세포 배양 상층액에 존재할 수도, 배양액으로부터 단리될 수도, 또는 부분적 또는 완전히 정제될 수도 있다. 바이러스는 또한 동결건조될 수 있으며, 필요에 따라 저장 또는 숙주로의 송달을 위하여 다양한 다른 성분과 결합될 수 있다.
본 발명은 생리학적으로 허용가능한 담체 및(또는) 아주반트(adjuvant) 및 단리된 유전자 위치이동된 약독화 RSV를 포함하는 신규 백신을 제공한다. 한 실시태양에서, 백신은 하나 이상, 바람직하게는 둘 이상의 약독화 돌연변이 또는 상기 기술된 바와 같은 다른 뉴클레오티드 변형을 갖는 유전자 위치이동된 RSV를 포함한다. 백신은 약독화 바이러스 103 내지 106 PFU의 용량으로 제제화될 수 있다. 백신은 단일 RSV 균주 또는 항원성 아군 (예를 들면, A 또는 B)에 대하여, 또는 다수 RSV 균주 또는 아군에 대하여 면역 반응을 유발하는 유전자 위치이동된 약독화 RSV 를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV는 다수 RSV 균주 또는 아군에 대해 단일특이성 면역 반응 또는 다중특이성 면역 반응을 각각 유발할 수 있다. 유전자 위치이동된 RSV는 하나 또는 다수 RSV 균주 또는 아군에 대해 더욱 효과적인 방어를 위한 상이한 면역원성 특성을 갖는 다른 RSV와 백신 제제에서 결합될 수 있다.
관련된 측면에서, 본 발명은 포유류 대상체에서 RSV의 균주 또는 아군 하나 이상에 대해 면역 반응을 유발하는, 개체의 면역체계를 자극하는 방법을 제공한다. 이 방법은 생리학적으로 허용가능한 담체 및(또는) 아주반트 중의 면역학적으로 충분한 양의 유전자 위치이동된 약독화 RSV의 제제를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 면역원성 조성물은 하나 이상, 바람직하게는 둘 이상의 약독화 돌연변이 또는 상기 기술된 바와 같은 요망되는 표현형을 규정하는 다른 뉴클레오티드 변형을 갖는 유전자 위치이동된 RSV를 포함하는 백신이다. 백신은 약독화 바이러스 103 내지 106 PFU의 용량으로 제제화될 수 있다. 백신은 단일 RSV 균주 또는 항원성 아군 (예를 들면, A 또는 B)에 대하여, 또는 다수 RSV 균주 도는 아군에 대하여 면역 반응을 유발하는 유전자 위치이동된 약독화 RSV 바이러스를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 유전자 위치이동된 RSV는 다수 RSV 균주 또는 아군에 대해 단일특이성 면역 반응 또는 다중특이적 면역 반응을 유발할 수 있다. 별법으로, 상이한 면역원성 특성을 갖는 유전자 위치이동된 RSV는 백신 혼합물로 결합되거나, 대등한 치료 프로토콜로 개별적으로 투여되어 하나의 RSV 균주에 대하여 또는 다수 RSV 균주 또는 아군에 대하여 더욱 효과적인 방어를 유발할 수 있다. 바람직하게는, 면역원성 조성물은 예를 들면, 분무, 액적(droplet) 또는 에어로졸에 의해 상기도에 투여된다. 종종, 조성물은 RSV에 대한 항체에 혈청음성인 개체, 또는 RSV에 대한 태반을 통하여 획득된 모체 항체를 소유하는 개체에 투여될 수 있다.
도 1은 RSV 게놈 내의 프로모터 인접 위치를 향한 G 유전자의 이동, 또는 F 유전자의 이동 또는 G 유전자와 F 유전자 모두의 이동을 나타낸다. 맨 위의 그림은 앞서 설명한 바와 같이 SH 유전자가 결실되고 (Whitehead et al., J. Virol. 73: 3438-3442, 1999; 본원에 참고문헌으로 삽입됨) BlpI 제한 효소 부위가 프로모터 인접 NS1 유전자의 상류 비코딩 영역에 부가된, Blp/△SH로 명명한 RSV 게놈을 설명한다. 별표한 M 유전자의 유전자 말단 (GE) 신호는 그 유전자가 SH 유전자의 결실 과정에 도입된 단일 뉴클레오티드 변화[이로써 앞서 설명된 바와 같이(Whitehead et al., J. Virol. 73 : 3438-3442,1999; 본원에 참고문헌으로 삽입됨), 자연적으로 발생하는 SH GE 신호와 동일하게 된다]를 함유한다는 것을 나타낸다. 그림 아래의 두 박스는 게놈 Blp/△SH의 구조와, △SH/Blp 게놈의 프로모터 인접 말단 (좌측 박스) 및 M-G-F-M2 영역 (우측 박스)에 도입되어 게놈 G1/△SH, Fl/△SH 및 GlF2/△SH를 형성하는 변경 부위를 상세히 보여준다. 모든 조작은 RSV 안티게놈 RNA의 클로닝된 cDNA (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567, 1995; Collins et al., Virology 259: 251-255, 1999; 및 Whitehead et al., J. Virol. 73: 3438-3442, 1999; 본원에 참고문헌으로 삽입됨)를 이용해 수행했고, 뉴클레오티드 위치는 야생형 재조합 RSV (SH 유전자 함유)의 완전 안티게놈 서열에 따라 넘버링했다 (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567, 1995; Murphy et al., 미국특허 제5,993,824호; 각 문헌은 본원에 참고문헌으로 삽입됨). "상류 (upstream)" 및 "하류 (downstream)"는 각각 프로모터 인접 방향 및 프로모터로부터 먼 방향(프로모터는 도 1에 도시된 좌측에 있는 음성-센스 게놈 RNA의 3' 리더 말단에 위치함)을 칭한다.
게놈 Blp/△SH: 앞서 설명된 RSV의 SH 결실 변이체의 뉴클레오티드 92 및 97 (Whitehead et al., J. Virol. 73: 3438-3442, 1999; 본원에 참고문헌으로 삽입됨)은 G 및 A로부터 (맨 위 그림에서 소문자로 표시되어 있음) 각각 C 및 C (굵은 대문자)로 변경되어 NS1 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 ATG 번역 개시 코돈 (굵은 이태리체)의 한개 뉴클레오티드 앞에 BlpI 부위 (밑줄 표시)가 만들어진다. Blp/△SH 게놈의 M-G-F 영역 (우측 박스)는 SH 결실을 설명한다 (SH 유전자는 보통은 M 유전자와 G 유전자 사이에 위치한다).
게놈 Gl/△SH: 이 게놈은 프로모터 인접 위치에서 BlpI 부위에로 삽입된 G 유전자를 함유한다 (좌측 박스). G cDNA 삽입체는 다음과 같이 구성한다: 완전 G ORF 및 하류의 G 비코딩 서열 및 GE 신호 (뉴클레오티드 4692 내지 5596)를 만들고 이어서 6개의 뉴클레오티드 IG 서열 (자연적으로 발생하는 G-F IG 서열인 CATATT (서열 1)의 처음 6개 뉴클레오티드를 나타냄), 이어서 NS1 유전자의 10개 뉴클레오티드 GS 신호(박스 표시)의 카피 1개를 만든다. 이 클로닝된 유전자 서열의 양끝에 BlpI 부위를 위치시키고 게놈 Blp/△SH의 BlpI 부위 내로 클로닝시킨다. 이로 써 RSV GS 및 GE 신호의 제어하에 G ORF가 프로모터 인접 위치내로 위치하게 된다. 동일한 게놈에서 M 유전자와 F 유전자 사이의 하류 위치로부터 G 유전자를 결실(결실 지점은 큰 화살표로 표시되어 있음)시켜 이제 M 유전자와 F 유전자 사이에는 G-F IG 서열만이 놓인다.
게놈 Fl/△SH : 이 게놈은 프로모터 인접 위치에서 BlpI 부위에로 삽입된 F 유전자를 함유한다. F cDNA 삽입체는 다음과 같이 구성된다: 완전 F ORF 및 하류의 비코딩 서열 및 GE 신호 (뉴클레오티드 5662 내지 7551)를 만들고 이어서 6개의 뉴클레오티드 IG 서열 (자연적으로 발생하는 F-M2 IG 서열인 CACAAT (서열 2)의 처음 6개 뉴클레오티드를 나타냄), 그리고 NS1 유전자의 10개 뉴클레오티드 GS 신호가 위치한다. 이 클로닝된 서열의 양끝에 BlpI 부위를 위치시키고 게놈 Blp/△SH의 BlpI 부위 내로 클로닝시킨다. 이로써 RSV GS 및 GE 신호의 제어하에 F ORF가 프로모터 인접 위치내로 위치하게 된다. 동일한 게놈에서 G 유전자와 M2 유전자 사이의 하류 위치로부터 F 유전자를 결실(결실 지점은 큰 화살표로 표시되어 있음)시켜 이제 이들 두 유전자 사이에는 F-M2 IG 서열만이 놓인다.
게놈 G1F2/△SH: 이 게놈은 각각 제1 및 제2 프로모터 인접 위치에서 BlpI 부위에 단일 cDNA로서 삽입된 G 및 F 유전자를 함유한다. 이 G-F cDNA 삽입체는 다음을 함유하도록 구성된다(상류에서 하류로 가는 순서): 완전 G ORF, 그의 하류 비코딩 및 GE 신호, G-F IG 서열, 완전 F 유전자, F-M2 IG 서열 (CACAAT) (서열 2)로부터의 6개 뉴클레오티드 및 NS1 GS 신호. 이 cDNA의 양끝에 BlpI 부위를 위치시키고 게놈 Blp/△SH BlpI 부위에 삽입한다. 이로써 G 및 F 유전자가 프로모터를 기준으로 각각 위치 1 및 2에 놓이게 된다. 동일 게놈에서 G 및 F 유전자를 M 유전자와 M2 유전자 사이의 하류 위치로부터 결실시켜 (결실지점은 큰 화살표로 표시함), M 유전자와 M2 유전자 사이에는 이제 F-M2 IG 서열만이 있게 된다.
도 2. 생체내 트랜스펙션 및 1차 계대배양 중에 감염성 재조합 바이러스의 생산. HEp-2 세포를 정해진 개별 안티게놈 플라스미드 및 문헌(Murphy et al., 미국 특허 제5,993,824호)에 기재된 N, P, L 및 M2-1 서포트 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 배지 상청액을 3일 후에 수확하고 HEp-2 세포에서 일련의 비희석 계대배양을 수행하였고, 배지 상청액을 3 내지 7일 간격으로 수확하였다. 각 수확물의 샘플을 취하여 급속동결하고 후에 플라크 분석법에 의해 동등하게 분석하였다. 자신의 cDNA들, 즉 Blp/△SH, Gl/△SH 등과 동일하게 바이러스에 명칭을 부여하였다. Blp/△SH, Gl/△SH, F/△SH 및 G1F2/△SH에 대한 데이터가 제공되어 있다. 32℃에서 트랜스펙션시키고 이어서 37℃에서 계대배양하였다.
도 3A. 야생형 RSV (SH 유전자 함유), 및 △SH (BlpI 부위를 함유하지 않음), Blp/△SH, Gl/△SH 및 GlF2/△SH 변이 바이러스의 0.1의 MOI에서의 생체내 복제. Vero (위쪽 패널) 또는 HEp-2 세포 (아래쪽 패널)의 복제 배양액을 감염시키고 37℃에서 배양하였다. 정해진 시점에서 2중의 단층을 각각의 바이러스마다 수확하고 배지 상청액을 급속 동결시켰다. 이를 나중에 플라크 분석법에 의해 동등하게 분석하였다.
도 3B는 Hep-2 (위) 및 Vero (아래) 세포 단층을 3.0의 입력 다중 감염도로 감염시킨 후에 Blp/SH, Gl/SH, F1/SH 및 G1F2/SH 바이러스의 단일 단계 생장을 나 타낸다. 복제 세포 단층을 감염시키고 37 ℃에서 배양하고 정해진 시점에 2중 의 단층을 수확하고 배지 상청액을 급속 동결시켰다.
도 4. Vero 세포에서 Blp/△SH, G1/△SH 및 G1F2/△SH 바이러스에 의한 G 단백질의 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석. 도 3A의 위쪽 패널에서 매 시점에 세포를 수확하고 전체 단백질을 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅을 이용해 분석하였다. G 단백질의 펩티드에 특이적인 토끼 항혈청과 함께 배양하여 블롯을 전개시켰다. 결합된 항체를 화학발광에 의해 가시화하였다. G 단백질은 2가지 형태, 즉 90 kDa 성숙 형태 및 50 kDa 불완전 글리코실화 형태로 이동하였다.
도 5. G 및 F 단백질이 위치 1 및 2로 이동된 약독화 RSV의 구조. 패널 A: 앞서 기재된 바와 같이 SH 및 NS2 유전자가 결실되고 (Teng and Collins, J. Virol. 73: 466-473, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73: 3438-3442, 1999; 본원에 참고문헌으로 삽입됨), 상기 도 1에 기재된 바와 같이 각각 위치 1 및 2로 G 및 F 유전자가 이동된 재조합 RSV G1F2/△NS2△SH의 구조. 패널 B: SH, NS1 및 NS2 유전자가 결실되고 G 및 F 유전자가 각각 위치 1 및 2로 이동된 재조합 RSV G1F2/△NS1△NS2△SH의 구조.
도 6은 BRSV G 및 F 유전자가 결실되고 HRSV의 G 및 F 유전자가 프로모터 인접 위치에 놓인 키메라 rBRSV/HRSV 게놈의 구조를 상세히 보여준다. BRSV 유전자는 빗금으로 표시하고 HRSV 유전자는 밝게 표시했다. 뉴클레오티드 서열 위치 번호는 완전 rBRSV 안티게놈을 기준으로 하고(Buchholz et al., J. Virol. 73: 251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000; GenBank 수탁 번호 AF092942 또는 완전 rHRSV 안티게놈; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 11563-11567, 1995; 각각은 본원에 참고문헌으로 삽입됨); HRSV 서열을 나타내는 서열 위치 번호에 밑줄로 표시했다. 도 6에서, 패널 A는 종래의 연구(Buchholz et al., J. Virol. 73: 251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000)에서 삽입된 NotI, SalI 및 XhoI 부위를 함유하는 rBRSV의 구조를 상세히 나타낸다. 도 6에서, 패널 B는 rBRSV/A2-GlF2를 형성하는 rBRSV에서의 변경 부위를 나타낸다. BRSV G 및 F 유전자는, SalI 및 XhoI를 절단하고 결과의 적합한 접착성 말단을 재라이게이션하여 결실시킨다. HRSV 게놈의 G 및 F 유전자를 함유하는 뉴클레오티드 4692 내지 7557의 영역을, cDNA의 각 말단에 도입하고자 하는 목적한 변화 부위를 함유한 프라이머를 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭된 PCR 산물은 (상류에서 하류로 가는 순서로): NotI 부위, BlpI 부위, 완전 HRSV G ORF, 그의 하류 비코딩 및 GE 신호, HRSV G-F IG 서열, 완전 HRSV F 유전자, HRSV F-M2 IG 서열로부터의 6개 뉴클레오티드 (CACAAT), NS1 GS 신호, BlpI 부위 및 NotI 부위를 함유했다. 이 cDNA를 rBRSV의 위치 67에 있는 유니크 Notl 부위내로 클로닝시켰다. 도 6, 패널 C는 rBRSV/A2-Gl F2의 게놈 RNA의 구조를 설명한다.
도 7은 HEp-2 인간 (좌측 패널) 및 MDBK 소 (우측 패널) 세포에서 RBRSV, rHRSV (rA2), rBRSV/A2, 및 rBRSV/A2-Gl F2의 다주기 생장을 나타낸다. 2중의 세포 단층을 정해진 바이러스로 0.1의 MOI로 감염시키고 37℃에서 배양하고 배지 분취액을 정해진 시점에 수확하고 급속 동결하여, -70℃에서 보관하고 2개씩 역가를 적정하였다. 각각의 수치는 2개 웰의 평균 역가이다.
도 8은 rBRSV/A2-GlF2, rBRSV/A2, 또는 rA2로 감염된 HEp-2 세포의 간접 면역형광법을 나타낸다. 세포를 0.1의 MOI로 감염시키고 37℃에서 96시간 동안 배양하고, 아세톤으로 고정시키고, 투과시키고, HRSV의 G 단백질에 대해 특이적인 모노클로날 항체 021/1G와, 또는 HRSV의 F 단백질에 대해 특이적인 모노클로날 항체 44F와 반응시켰다. 쥐 IgG에 대해 특이적인 태그를 붙인 항체를 이용해 항체 결합를 가시화하였다.
도 9는 HRSV의 M, G 및 F 유전자를 함유하는 키메라 rBRSV/HRSV의 구성을 상세히 보여준다. BRSV 유전자는 빗금으로 표시했고 HRSV는 밝게 표시했다. HRSV 유전자를 나타내는 서열 위치 번호는 밑줄로 표시했다. 도 9, 패널 A는 rBRSV/A2의 P 유전자와 M 유전자 사이의 유전자간 영역(P-M IG) 내의 위치 3204에서 유니크 MinI 부위를 함유하는 변경을 묘사한 것이다. IG의 서열이 도시되어 있고, 소문자는 원래 뉴클레오티드 해당 부분을 나타낸다. 밑줄 표시한 문자는 5개 뉴클레오티드 치환에 의해 형성된 Mlul 부위를 나타낸다. 뉴클레오티드 서열 위치 번호는 완전 rBRSV 안티게놈을 기준으로 하고(Buchholz et al., J. Virol. 73: 251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74: 1187-1199, 2000; GenBank 수탁번호 AF092942 또는 완전 rHRSV 안티게놈; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567,1995); HRSV 서열을 나타내는 서열 위치 번호는 밑줄로 표시했다. 도 9, 패널 B는 rBRSV/A2의 rBRSV/A2-MGF를 형성하는 변경을 설명한다. BRSV M 및 SH 유전자를 함유하는 MluI-SalI 단편을 절단하고 HRSV M 유전자를 함유하는 MluI- SalI 단편으로 대체했다. HRSV M 유전자를 함유하는 MluI-SalI 단편은 박스 내에 표시했다. 또한 BRSV P 유전자 말단 서열을 포함하는 MluI 부위의 바로 상류 서열, 및 M 유전자와 G 유전자 사이의 유전자간 서열 (M-G IG)을 포함하는 SalI 부위의 바로 하류 서열, HRSV G 유전자 출발 신호 및 G ORF를 시작하는 ATG (굵은 이태리체) 를 포함한다. 도 9, 패널 C는 rBRSV/A2-MGF 게놈의 구조를 나타낸다.
도 10은 재조합 BRSV의 게놈 (rBRSV, 맨위) 및 5개의 BRSV/HRSV 키메라 바이러스 [특정 BRSV 유전자(빗금친 사각형)를 그의 HRSV 상대 유전자 (밝은 사각형)으로 대체)]의 구조를 묘사한 것이다. 또한, 아래쪽 2개 바이러스에서는 G 및 F 유전자를 그의 정상 위치에서 위치 3 및 4 또는 1 및 2로 이동시켰다. rBRSV의 그림에서, 몇개의 제한 부위를 표시하였다. 다양한 구성에 사용된 제한 부위를 표시하였다. Kpnl 부위는 원래 존재하며 나머지는 필요에 따라 도입하였다. (Buchholz, et al., J. Virol., 73: 251-9, 1999; Buchholz, et al., J. Virol., 74: 1187-1199, 2000, 본원에 참고문헌으로 삽입됨).
도 11은 BRSV/HRSV 키메라 바이러스 rBRSV/A2-G3F4 (위쪽 패널) 및 HEx (아래쪽 패널)를 rHRSV (rA2) 및 rBRSV 모 바이러스뿐 아니라 앞서 기재된 키메라 바이러스 rBRSV/A2-GF (앞에서는 rBRSV/A2로 칭함; Buchholz, 2000, 상게서) 및 rBRSV/A2-GlF2와 비교한 다주기 생장을 나타낸 것이다. Vero 세포의 단층 배양액을 0.1의 입력 감염 다중도로 감염시키고 37 ℃에서 배양하였다. 위를 덮은 배지로부터 샘플을 정해진 시간에 수확하고 바이러스 역가는 제한 희석법으로 측정하였다. 1개의 웰 당 0.1 ml의 단계식 10배 바이러스 희석액에 104 BHK-21 세포를 0.1 ml 부피로 첨가하였다. 48 시간 후에 세포를 80% 아세톤 중에 고정하고 HRSV M 단백질과 상호 반응성인 BRSV M 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 간접 면역형광 분석을 하고 감염 세포의 포커스를 계수했다. (참조, Buchholz et al., J. Virol. 73: 251-9,1999 (본원에 참고문헌으로 삽입됨).
도 12는 인간 HEp-2 세포 (위쪽 패널) 대 소 MDBK 세포 (아래쪽 패널) 상에 정해진 바이러스에 의해 형성된 플라크 또는 포커스의 크기를 HRSV (HEp-2 세포) 또는 BRSV (MDBK 세포)와 비교한 백분율로 표시하여 비교한 것이다.
도 13A 및 도 13B는 N 및(또는) P 유전자가 그의 HRSV 상대 유전자로 대체된 재조합 BRSV 게놈의 구조를 나타낸다. 도 13A는 rBRSV 골격 내에 치환 부위가 있는 키메라를 나타낸다. 도 13B는 골격이 rBRSV/A2-NSl+2 바이러스인 키메라를 나타낸다.
도 14: 3'에서 5'로의 (-) 센스 RNA로서 도시한 (각각의 코딩된 mRNA는 직사각형으로 표시하고 비 mRNA-코딩 유전자 외부 및 유전자간 영역을 수평선으로 표시함), SH 유전자 내에 결실부위를 함유한 재조합 rRSV/6120의 게놈 RNA를 나타내는 도면. 모 RSV 안티게놈 cDNA는 앞서 설명한 바와 같고(Collins, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567, 1995), 추가로 G-F 유전자간 영역에 XmaI 부위 변경을 함유한다. (Bukreyev, et al., J. Virol. 70: 6634-6641, 1996, 본원에 참고문헌으로 삽입됨). 이 cDNA를 (i) 번역 정지 코돈을 비롯한 SH ORF의 마지막 네개 코돈에서 5개의 번역되지 않는 뉴클레오티드 치환부위를 함유하도록 및 (ii) SH 유전자의 하류 비-번역 영역으로부터 완전 안티게놈 서열의 112개 뉴클레 오티드 (위치 4499-4610; 박스 표시)가 결실되도록 변경하였다. 구성에 사용된 XhoI 및 PadI 부위는 이태리체로 표시하고 표지하였고, SH 유전자 말단 신호에는 밑줄 표시를 하고 SH 코돈은 3개조로 나타내고, 뉴클레오티드 치환부위는 소문자로 결실 서열은 서열 위치를 표시하여 박스로 나타내었다.
도 15A 내지 15B: 전장 재조합 rRSV 모 D53과 비교하여 SH 유전자에 결실부위를 함유하는 rRSV/6120의 생장 속도. HEp-2 세포의 단층 배양액의 세가지 세트(도 15A, 도 15B 및 도 15C)를 0.005의 입력 다중 감염도로 감염시켰다. 흡착기간 후에, 세포를 37 ℃에서 배양하였다. 12 시간 경과후에, 배지 전체를 수거하고 다음의 역가적정을 위해 분취액을 급속 동결시켰다. 세포를 3회 세척하고 새 배지를 첨가하여 배양을 계속했다. 실험 종료시에, 플라크 분석에 의해 샘플을 분석하여 바이러스 역가를 결정하였다.
특정 실시양태의 설명
본 발명은 인간 및 다른 포유동물에서 감염성을 나타내며 약독화되어 있는 백신 바이러스를 만들기 위해 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에 하나 이상의 유전자의 유전자 순서 또는 공간적 위치를 이동시킴으로써 변형시킨 재조합 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)를 제공한다. 전형적으로, 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈은 게놈 내의 삽입, 결실, 또는 제2의 "치환 폴리뉴클레오티드"의 재배열을 통해 직접적으로 또는 간접적으로 하나 이상의 "이동되는" 유전자 또는 유전자 절편의 위치를 바꾸어, "이동되는" 대상 유전자 또는 게놈 절편을 프로모터에 보다 가까운 또는 프로모터로부터 보다 먼 위치로 위치를 이동시킴으로써 변형시킨다. 이 관계 에서 유전자 또는 게놈 절편 위치의 이동은 유전자 이동을 도입하기 전에 모 RSV 게놈 또는 안티게놈에서 대상 유전자 또는 유전자 절편의 위치에 대하여 결정되는데, 예를 들어, 유전자 이동 전에 야생형 RSV 게놈 또는 안티게놈 (예컨대, HRSV A2 또는 BRSV 칸사스 균주) 또는 본원에 개시된 재조합 모 RSV 게놈 또는 안티게놈에서 대상 유전자 또는 게놈 절편의 위치에 대해 결정된다.
본 발명의 특정 측면에서, 유전자 위치이동 RSV는 부분 또는 완전 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 삽입, 결실 또는 하나 이상의 치환 폴리뉴클레오티드의 재배열에 의해 프로모터에서 더 가깝거나 더 먼 위치로 이동되는 하나 이상의 이동 유전자 또는 게놈 절편을 특징으로 한다. 치환 폴리뉴클레오티드는 상이한 또는 "이종" RSV로부터의 RSV 유전자 또는 게놈 절편을 비롯하여 RSV 유전자 또는 게놈 절편을 포함할 수 있다 (예를 들어, 상이한 RSV의 게놈 또는 안티게놈 내에 삽입된 이종 유전자 또는 게놈 절편의 경우). 또는, 치환 폴리뉴클레오티드는 파라인플루엔자 바이러스 (PIV) 또는 홍역 바이러스와 같은 비-RSV 병원체를 비롯하여 비-RSV 공급원으로부터 유래될 수 있다. 치환 폴리뉴클레오티드는 단백질 또는 단백질의 일부, 예컨대, 당단백질의 면역원성 도메인 또는 에피토프를 코딩할 수 있거나, 비-코딩 및 비-센스 폴리뉴클레오티드 서열을 비롯하여 불완전하거나 손상된 코딩 서열을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 재조합 RSV는 부분 또는 완전 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 삽입, 결실 또는 하나 이상의 치환 폴리뉴클레오티드의 재배열에 의해 프로모터에서 더 가깝거나 더 먼 위치로 이동될 수 있는 하나 이상의 위치이 동 유전자 또는 게놈 절편을 특징으로 한다. 일부 측면에서, 치환 폴리뉴클레오티드는 RSV 유전자 또는 게놈 절편이다. 다른 측면에서, 치환 폴리뉴클레오티드는 완전한 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 가지고 있지 않다. 보다 구체적인 실시양태에서, 치환 폴리뉴클레오티드는 길이가 150 내지 4,000개의 뉴클레오티드인 폴리뉴클레오티드 삽입물을 포함한다. 치환 폴리뉴클레오티드는 재조합 게놈 또는 안티게놈의 비-코딩 영역 (NCR) 내로 삽입되거나 재조합될 수 있거나, 별개의 게놈 단위 (GU)로서 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에 도입될 수 있다.
본 발명의 재조합 RSV 내에서의 유전자 위치이동은 전형적으로 게놈 또는 안티게놈 "프로모터"에 대해 결정된다. RSV 프로모터는 중합효소에 의해 인식되는 보존 서열 요소인 중합효소 개시 부위를 함유한다. 프로모터는 대략 30개의 3' 말단 뉴클레오티드 내에서 게놈 또는 안티게놈의 3 말단에 위치한다. RSV 게놈의 경우, 프로모터는 전사 및 복제 둘 다를 지시한다. 그러나, 전사 신호를 갖지 않고 단지 천연적으로 복제만을 조절하는 안티게놈 "프로모터"는 공지된 전사 신호의 삽입에 의해 전사를 지시하도록 변형시킬 수 있다. 본 발명을 기술하기 위해서는, RSV 프로모터는 게놈 또는 안티게놈의 3' 말단에 있는 것으로 해석되므로, 본원에 사용되는 "프로모터에서 가까운" 및 "프로모터에서 먼"이라는 용어는 각각 게놈 또는 안티게놈의 3' 말단쪽으로 향하는 방향 또는 3' 말단쪽으로부터 멀어지는 방향을 말한다.
따라서, 본 발명은 단리된 폴리뉴클레오티드 분자, 벡터 (발현 제작물), 및 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈이 삽입된 재조합 바이러스를 제공하는데, 여기서 하나 이상의 유전자 또는 유전자 절편은 RSV 유전자 지도에서의 해당 유전자의 모 위치 또는 야생형 위치와 비교할 때 재조합 게놈 또는 안티게놈 내에서 프로모터에 보다 가까운 또는 프로모터로부터 보다 먼 위치로 이동되어 있다. 이 방식으로 유전자 위치를 이동시키는 것은 위치이동의 성질 및 정도에 따라 하나 이상의 위치 "이동" 유전자의 발현에 있어서의 선택된 증가 또는 감소를 제공한다. 한 실시양태에서, RSV 당단백질은 하나 이상의 당단백질-코딩 유전자를 프로모터에 보다 가까운 위치로 이동시킬 때 상향조절된다. 유전자 위치가 이동된 RSV를 만들기 위해 조작하고자 하는 원하는 유전자에는 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 및 G 유전자 중 어느 하나, 또는 한 유전자의 일부이거나 유전자 외의 것일 수 있는 게놈 절편이 포함된다. 다양한 다른 돌연변이 및 뉴클레오티드 변형도 본 발명의 유전자 위치이동 RSV에 도입되어 원하는 표현형 및 구조적 효과를 제공할 수 있다.
인간-소 RSV의 재조합 제작은 포유동물, 특히 인간에서 감염성을 나타내고 임상에서 사용하기 위한 면역원성 조성물을 생성하는 데 유용한 바이러스 입자 또는 서브바이러스 입자를 발생시킨다. 본 발명은 유전자 위치가 이동된 약독화 RSV를 디자인하고 생산하기 위한 신규 방법 및 조성물뿐 아니라, RSV 감염의 예방 및 치료를 위한 방법 및 조성물도 제공한다. 본 발명에 따른 유전자 위치이동 RSV 및 면역원성 조성물은 특정한 RSV 하위군 또는 균주에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있거나, 다수의 RSV 하위군 또는 균주에 대한 다특이적 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 유전자 위치이동 RSV는 인간 및 다른 포유동물에서 감염성을 나타 내고 약독화되어 있다. 관련 측면에서, 본 발명은 RSV 감염에 민감한 숙주에서 RSV에 대한 원하는 면역 반응을 일으키기 위한 다양한 조성물에 유용한 유전자 위치이동 약독화 RSV를 디자인하고 생산하는 신규 방법을 제공한다. 본 발명의 이들 측면에는 단리된 신규 폴리뉴클레오티드 분자, 신규 벡터, 및 유전자 위치이동 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 분자가 도입된 감염 세포도 포함된다. 본 발명에 따른 유전자 위치이동 RSV는 특정한 RSV 하위군 또는 균주에 대한 면역 반응, 또는 다수의 RSV 하위군 또는 균주에 대한 다특이적 반응을 일으킬 수 있다.
관심있는 다양한 병원체에 대한 원하는 면역 반응을 일으키기 위해 다른 병원체의 항원성 결정인자를 도입하기 위한 벡터로서 유전자 위치이동 약독화 RSV를 디자인하고 생산하는 데 사용되는 다른 조성물 및 방법도 제공된다. 또한, 본 발명은 RSV 및 다른 병원체에 의해 초래되는 감염 및 질환의 예방 및 치료를 위해 유전자 위치이동 RSV를 도입하는 방법 및 조성물을 제공한다.
본 발명은 cDNA로부터 감염성 재조합 RSV를 생산하기 위한 최근의 진보된 방법들에 기초한 일련의 발견을 완성시키고 보충한다. 이 연구를 기초로, RSV 유전자 발현 및 복제에서 RNA 및 단백질 구조의 역할을 직접 조사할 수 있었다. 이러한 조사는 미국 가특허 출원 제60/007,083호 (1995년 9월 27일 출원), 미국 특허 출원 제08/720,132호 (1996년 9월 27일 출원), 미국 가특허 출원 제60/021,773호 (1996년 7월 15일 출원), 미국 가특허 출원 제60/046,141호 (1997년 5월 9일 출원), 미국 가특허 출원 제60/047,634호 (1997년 5월 23일 출원), 미국 특허 제5,993,824호 (1999년 11월 30일 허여됨, 국제 특허 공개 WO 98/02530에 상응함), 미국 특허 출원 제09/291,894호 (Collins et al., 1999년 4월 13일 출원), 미국 가특허 출원 제60/129,006호 (Murphy et al., 1999년 4월 13일 출원), 문헌 (Crowe et al., Vaccine 12: 691-699, 1994; and Crowe et al., Vaccine 12: 783-790, 1994; Collins, et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567, 1995; Bukreyev, et al., J Virol 70: 6634-41, 1996; Juhasz et al., J. Virol. 71 (8): 5814-5819, 1997; Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997; Karron et al., J. Infect. Dis. 176: 1428-1436, 1997; He et al. Virology 237: 249-260, 1997; Baron et al. J. Virol. 71: 1265-1271, 1997; Whitehead et al., Virology 247 (2): 232-9, 1998a; Whitehead et al., J. Virol. 72 (5): 4467-4471, 1998b; Jin et al. Virology 251: 206-214, 1998; Bukreyev, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 2367-2372, 1999; Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 11259-11264, 1999; Juhasz et al., Vaccine 17 : 1416-1424, 1999; Juhasz et al., J. Virol. 73: 5176-5180, 1999; Teng and Collins, J. Virol. 73: 466-473, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73: 9773-9780, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73: 871-877, 1999; and Whitehead et al., J. Virol. 73: 3438-3442,1999, Jin, et al., Virology, 273: 210-8, 2000; Jin, et al., J. Virol., 74: 74-82, 2000; Teng, et al., J. Virol. 74: 9317-21, 2000)에 기재 및 보고되어 있다 (이들 각각의 문헌은 그 전체 내용이 본 명세서에 포함되는 것으로 함).
본 발명의 유전자 위치이동 RSV에 대한 다수의 상기 문헌들은 RSV에서 천연 발생 유전자 순서의 변형에 초점을 맞추었다. 예를 들어, NS1, NS2, SH 및 G 유전 자 각각은 감염성 RSV 재조합체에서 성공적으로 개별적으로 결실됨으로써, 바이러스 프로모터에 대하여 상류 유전자의 위치가 이동되었다. 본 발명의 다른 재조합체에서, NS1 유전자와 NS2 유전자는 결실되어, 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내에서 프로모터에서 가까운 방향으로 남아있는 유전자가 이동되었다. 예를 들어, NS1과 NS2가 결실된 경우, N은 위치 3에서 위치 1로 이동하고, P는 위치 4에서 위치 2로 이동한다. 본 발명의 다른 실시양태에서 임의의 다른 RSV 유전자의 결실은 더 하류에 위치하는 유전자의 (프로모터에 대하여) 위치를 유사하게 이동시킬 것이다. 예를 들어, SH는 야생형 바이러스에서 위치 6번을 차지하고, 그의 결실은 위치 5의 M (또는 임의의 다른 하류 유전자)에 영향을 주지 않지만 G를 프로모터에 대하여 위치 7에서 위치 6으로 이동시킨다. 유전자 결실은 생물학적으로 유도된 돌연변이 바이러스에서도 (드물게) 일어날 수 있음을 알아야 한다 (Karron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13961-13966, 1997; 이 문헌의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 함). "상류" 및 "하류"는 각각 프로모터에서 가까운 방향 및 프로모터로부터 먼 방향을 말한다는 것을 알아야 한다 (프로모터는 음성-센스 게놈 RNA의 3' 리더 말단에 위치함).
본 발명의 유전자 위치이동 RSV를 사용한 유전자 순서 이동 변형 (즉, 재조합 바이러스 게놈에서 하나 이상의 유전자가 프로모터에서 더 가깝거나 더 먼 위치로 이동하는 위치 변화)은 변경된 생물학적 성질을 갖는 바이러스를 생성시킨다. 예를 들어, NS1, NS2, SH, G, NS1 및 NS2를 갖지 않는 RSV, 또는 SH 및 G를 갖지 않는 RSV는 시험관내, 생체내, 또는 둘 다에서 약독화되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이 표현형은 주로 특정 바이러스 단백질 발현의 상실에 기인한 것으로 생각된다. 그러나, 변경된 유전자 지도도 관찰된 표현형에 기여하는 것으로 생각된다. 이 효과는 몇몇 세포 유형에서 야생형보다 더 효율적으로 생장하는 SH-결실 바이러스에 의해 잘 설명되는데, 이는 유전자 결실, 및 유전자 순서와 게놈 크기의 변화 (가능한 경우)로부터 발생되는 전사 효율, 복제 효율 또는 둘 다의 증가 때문인 것으로 생각된다. NS1 및(또는) NS2가 결실된 RSV와 같은 다른 바이러스에서, 유전자 순서의 변화로 인해 일어날 수 있는 변화된 생장은 RSV 단백질(들) 발현의 상실로 인한 보다 우성인 표현형에 의해 가려졌다.
살아있는 약독화 백신으로서 RSV의 성질을 개선시키기 위해, 다른 변화를 성공적으로 도입하여 RSV의 유전자 순서를 변경시켰다. 본 발명의 효과를 입증하는 특정 실시예에서, RSV의 G 및 F 유전자는 따로따로 나란히 이동시켜 야생형 RSV의 유전자 순서에 대해 프로모터에 보다 더 가까운 위치로 이동시켰다. 상기 두 단백질은 정상적으로 RSV 유전자 순서 (NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L)에서 위치 7 (G) 및 8 (F)을 차지한다. 성공적인 회수의 가능성을 높이기 위해, SH 유전자가 결실되어 있는 RSV 버젼에서 G 및 F의 이러한 위치 조작을 수행하였다 (Whitehead et al., J. Virol. 73: 3438-42 (1999), 본 명세서에 포함되는 것으로 함). 이것은 이 바이러스가 시험관내에서 보다 큰 플라크를 형성하기 때문에 바이러스 회수를 용이하게 한다 (Bukreyev et al., J. Virol. 71: 8973-82, 1997, 본 명세서에 포함되는 것으로 함). 그 다음, G 및 F를 개별적으로 위치 1로 이동시키거나, 각각 위치 1 및 2로 함께 이동시켰다.
놀랍게도, G 또는 F가 위치 1로 이동되어 있는 재조합 RSV, 또는 G 및 F가 각각 위치 1 및 2로 이동되어 있는 재조합 RSV를 용이하게 회수하였다. 이 결과는 소수포성 구내염 바이러스 (VSV)를 사용한 선행 연구와는 상당히 다른데, 상기 선행 연구에서 단지 2개의 위치에 의한 단일 VSV 당단백질 유전자의 이동은 바이러스 생장에 매우 치명적이었다 (Ball et al., J. Virol. 73: 4705-4712, 1999; 본 명세서에 포함되는 것으로 함). 이러한 변이된 바이러스를 회수하는 능력도 놀라운데, 이는 RSV가 비효율적으로 복제하고 복잡한 유전자 순서를 갖고 당단백질 유전자의 이동이 다수의 위치 변화를 수반하기 때문이다. 실제로, 재정렬된 RSV는 적어도 야생형 유전자 순서를 갖는 그들의 모 RSV 만큼 생장하였다. 상술한 바와 같이, 이것은 RSV의 경우 특히 중요한데, 이는 야생형 바이러스가 세포 배양물 중에서 비효율적으로 생장하고, 시험관내에서의 추가 복제 감소가 백신 제제를 사용할 수 없게 만들기 때문이다. 따라서, 모든 NS1-NS2-N-P-M 단백질이 생장 적응도에서의 별다른 감소 없이 프로모터에 대해 하나 이상의 위치 만큼 옮겨질 수 있다는 것은 놀라운 것이다. 또한, G 당단백질 발현의 조사는 G 단백질의 발현이 그의 모 바이러스의 G 단백질 발현보다 수배 많은 정도로 증가되었음을 보여주었다. 이는 제1 위치에서 G 및(또는) F를 함유하는 백신 바이러스가 다른 바이러스 단백질과 비교할 때 보다 많은 몰량의 이들 보호 항원을 발현하고, 따라서 원하는 백신 성질을 갖는 백신이라는 것을 의미한다.
상기 문헌에 보다 더 상세히 기재된 바와 같이, NS2 유전자가 자발적으로 결실되었거나, NS1 및 NS2 유전자가 함께 결실되어 있는 2종의 고도로 약독화된 RSV 백신 후보를 사용하여 유전자 순서를 광범위하게 변형시켰다. 이들 두 백신 후보에서, G 및 F 당단백질은 각각 위치 1 및 2로 이동하였고, G, F 및 SH 당단백질은 그들의 하류 원위치로부터 결실되었다. 따라서, 회수된 GlF2△NS2△SH 및 G1F2/△NS1△NS2△SH 각각은 G 및 F 유전자의 이동 이외에 결실된 2 개 내지 3개의 유전자를 갖는다. 수반된 변화 정도를 나타내기 위해, 야생형 RSV (NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L)와 GlF2/△NS2△SH 바이러스 (G-F-NS1-N-P-M-M2-L) 또는 △NS1△NS2△SH (G-F-N-P-M-M2-L)의 유전자 순서를 비교할 수 있다. 이는 프로모터에 대하여 대부분 또는 모든 유전자의 위치가 바뀌었음을 보여준다. 그럼에도 불구하고, 고도로 약독화된 이들 유도체들은 세포 배양물 중에서 생장하는 능력을 보유하였다.
살아있는 약독화된 백신으로서의 RSV의 성질을 개선시키기 위해, 인간-소 키메라 RSV에서 RSV의 유전자 순서를 변화시키기 위한 추가 변화가 성공적으로 도입된 바 있다 (미국 특허 출원 제09/602,212호, 2001년 1월 18일자로 WO 01/04335로 공개된 PCT 출원에 상응하는 출원으로서 2000년 1월 23일 부촐즈 등 (Bucholz et al.)에 의해 출원됨, 그의 우선권은 1999년 7월 9일 출원된 미국 가출원 제60/143,132호임, 상기 특허 문헌들의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 함). 하기 실시예에서 설명되는 바와 같이, HRSV의 G 및 F 유전자가 재조합 소 RSV (rBRSV) 백그라운드 (background) 내로 치환된 감염성 재조합 인간-소 키메라 RSV (rBRSV/HRSV)를 성공적으로 제작하고 회수하였다. 생성된 인간-소 키메라는 두 개의 HRSV 유전자, 즉 G 및 G 유전자와, BRSV로부터 유래된 8개의 유전자, 즉 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 및 L 유전자를 함유한다. 그의 기본 치환 당단백질 구조 이 외에, HRSV의 G 및 F 유전자는 rBRSV 백그라운드에서, 즉 RSV 게놈에서 F 및 G 유전자의 야생형 유전자 순서 위치에 대하여 프로모터에 보다 더 가까운 위치로 이동되어 있다. 보다 구체적으로, F 및 G 유전자는 프로모터에 대한 그들의 일반적인 위치, 즉 각각 유전자 위치 7 및 8에서 각각 위치 1 및 2로 이동시켰다. 생성된 키메라 재조합 바이러스 rBRSV/A2-GlF2는 면역형광도에 의해 검출될 때 야생형 HRSV의 F 및 G 단백질 발현도와 매우 유사한 F 및 G 단백질 발현도를 나타내었는데, 이 결과는 G 및 F 유전자가 프로모터에서 가까운 위치로 이동되었기 때문에 G 및 F 당단백질의 발현이 증가된 것으로 해석된다. 본 발명의 rBRSV/A2-GlF2 바이러스가 그의 유전적 백그라운드에서 BRSV 유전자와 동일한 유전자 배열을 갖기 때문에, 이러한 강한 숙주 범위 제한 표현형을 공유하는 것으로 생각된다. 이 관계에서, 생체내 두 보호 항원의 증가된 발현은 이 바이러스의 면역원성을 높여 매우 바람직한 백신 성질이 생기게 할 것이다.
RSV는 모노네가바이러스 (Mononegavirus) 목의 비절편화 음성 가닥 RNA 바이러스이다. 모노네가바이러스는 소수포성 구내염 바이러스 (VSV) 및 공수병 바이러스에 의해 대표되는 라브도비리대 (Rhabdoviridae) 과; 보나 질환 바이러스에 의해 대표되는 보나비리대 (Bornaviridae) 과; 마부르그 (Marburg) 바이러스 및 에볼라 (Ebola) 바이러스에 의해 대표되는 필로비리대 (Filoviridae) 과; 및 파라믹소비리대 (Paramyxoviridae) 과를 포함하는 크고 다양한 바이러스 목을 구성한다. 파라믹소비리대 과는 두 개의 하위과, 즉 센다이, 홍역, 유행성 이하선염 및 파라인플루엔자 바이러스를 포함하는 파라믹소비리내; 및 호흡기 세포융합 바이러스를 포함 하는 뉴모비리내로 세분화된다.
모노네가바이러스의 게놈은 선형 배열로 정렬된 5개 (VSV) 내지 11개 (RSV)의 유전자를 함유하는 단일 RNA 가닥이다. 모노네가바이러스 게놈은 직접 단백질을 코딩하기 보다는 (그러므로 "음성 센스"로 불림) 하나 이상의 단백질을 각각 코딩하는 상보적 양성-센스 mRNA를 코딩한다. 전형적으로, 유전자는 짧은 유전자-개시 신호로 시작되서 짧은 유전자-종결 신호로 끝난다. 이 신호들은 통상 8개 내지 12개의 뉴클레오티드로 구성되어 있고, 통상적으로 주어진 한 바이러스의 유전자 사이에 고도로 보존되어 있고, 관련 바이러스 사이에는 다소 약한 정도로 보존되어 있다.
RSV의 경우, 게놈의 길이는 15.2 kb를 넘고, 게놈은 11개의 확인된 단백질을 코딩하는 10개의 분리된 주 mRNA로 전사된다. 구체적으로, RSV 유전자 순서는 3'-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5'이고, M2 mRNA는 두 개의 단백질, 즉 겹쳐진 ORF로부터 M2-1 및 M2-2를 코딩한다. RSV의 유전자-개시 및 유전자-종결 신호도 RNA 복제 및 프로모터 기능에 관여하는 서열들과 함께 확인되었고 진행중인 연구에서 분석된 바 있다 (Bukreyev et al., J. Virol. 70 : 6634-6641, 1996; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 9663-9667, 1991; Mink et al., Virolog 185 : 615-624, 1991; Grosfeld et al., J. Virol. 69 : 5677-5686, 1995; Hardy and Wertz, J. Virol. 72: 520-526, 1998; Hardy et al., J. Virol. 73: 170-176, 1999; Kuo et al., J. Virol. 70: 6143-6150, 1996; Kuo et al., J. Virol. 70: 6892-6901, 1996; Samal and Collins, J. Virol. 70: 5075-5082, 1996; Kuo et al., J. Virol. 71: 4944-4953, 1997; Fearns and Collins, J. Virol. 73: 388-397, 1999; 이들 각 문헌의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 함).
모노네가바이러스의 3' 말단은 폴라머라제의 엔트리를 지시하는 프로모터를 함유한다 (Lamb and Kolakofsky, Fields Virology. 1: 1177-1204, 1996; and Wagner and Rose, Fields Virology, 1121-1136, 1996; 이들 각 문헌의 내용는 본 명세서에 포함되는 것으로 함). 이 프로모터는 게놈의 3' 말단에서 유전자 외의 리더 영역에 완전히 또는 부분적으로 포함되어 있다. 그 다음, 중합효소가 유전자-개시 및 유전자-종결 신호에 의해 제어되는 정지-재시작 방식으로 게놈의 3'에서 5'으로 일직선으로 전사한다. 각 유전자의 유전자-개시 신호는 상응하는 mRNA 합성의 개시를 지시하고, 유전자-종결 신호는 폴리아데닐화, 종결 및 상응하는 mRNA의 방출을 지시한다. 그 다음, 중합효소는 기질에 결합된 상태로 남아 다음 하류 유전자-개시 신호에서 재개시한다. 이 과정은 3'에서 5' 순서로 유전자가 순서대로 전사되도록 반복된다 (Lamb and Kolakofsky, Fields Virology 1: 1177-1204, 1996; Wagner and Rose, Fields Virology. 1121-1136, 1996; Abraham and Banerjee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73 : 1504-1508, 1976; Ball and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73: 442-446, 1976; Ball, J. Virol. 21: 411-414, 1977 ; Banerjee et al., J. Gen. Virol. 34: 1-8, 1977; Iverson and Rose, Cell 23: 477-484, 1981; Iverson and Rose, J. Virol. 44: 356-365, 1982; Banerjee et al., Pharmacol. Ther. 51 : 47-70, 1991; 이들 각 문헌의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 함).
상기 나열된 RSV 단백질들 중 4개는 뉴클레오캡시드/중합효소 단백질, 즉주 뉴클레오캡시드 N 단백질, 인단백질 P, 중합효소 단백질 L, 전사 항-종결 단백질 M2-1이다. 3개는 표면 당단백질, 즉 부착 G 단백질, 침투 및 세포융합체 형성을 담당하는 융합 F 당단백질, 및 미지의 기능을 하는 소수성 소 SH 단백질이다. 매트릭스 M 단백질은 비리온 형성에 관여하는 내부 비리온 단백질이다. 미지의 기능을 하는 두 개의 비구조적 단백질 NS1 및 NS2가 있다. 마지막으로, RNA 조절 인자 M2-2를 코딩하는 M2 mRNA에는 제2의 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 있다.
G 및 F 단백질은 주요 중화 및 보호 항원이다 (Collins, et al., Fields Virology 2: 1313-1352, 1996; Connors, et al., J. Virol. 66: 1277-81, 1992). RSV 재감염에 대한 내성은 이러한 단백질에 대하여 특이적인 혈청 및 점막 항체에 의해 주로 매개된다. RSV-특이적 세포독성 T 세포는 또한 RSV 감염에 의해 유도되며, 다수의 상이한 단백질에 대하여 지시될 수 있지만, 이러한 이펙터가 재감염에 대한 장기 내성에 대하여 중요한 기여자인지의 여부는 아직 밝혀지지 않았다. 그러나, CD8+ 및 CD4+ 세포는 둘 다 면역 반응을 조절하는데 있어서 중요할 수 있으며, 바이러스 발병기전에 관여할 수 있다 (Johnson, et al., J. Virol. 72: 2871-80, 1998; Srikiatkhachorn and Braciale, J. Exp. Med. 186: 421-32, 1997). 따라서, F 및 G는 가장 중요한 항원 결정자이지만, 다른 단백질도 면역 반응에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다.
RSV 분리주는 모노클로날 항체와의 반응성에 따라 2가지 항원성 아군, 즉 A 및 B로 분리될 수 있다 (Anderson, et al., J. Infect. Dis. 151: 626-33, 1985, Mufson, et al., J. Gen. Virol. 66: 2111-24,1985). 두 아군은 게놈 전체에 걸쳐 차이를 나타내지만, G 단백질의 엑토도메인 (ectodomain)에서 가장 상이하고, 아미노산 서열 차이 (％)는 50％를 초과할 수 있으며, 항원성 차이는 단일특이적 폴리클로날 항혈청의 반응성을 기준으로 95％이다 (Johnson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5625-9, 1987; Johnson, et al., J. Virol. 61: 3163-6, 1987). F 단백질은 RSV A 및 B 아군 사이에서 아미노산 서열 차이가 약 10％이며, 항원성 차이는 50％이다 (Johnson, et al., J. Virol. 61: 3163-6,1987; Johnson and Collins, J. Gen. Virol. 69: 2623-8,1988). 따라서, 두 아군은 백신중에 존재해야 한다.
RSV 및 다른 모노네가바이러스는 프로모터와 가장 가까운 유전자가 가장 효율적으로 전사되고, 이어서 각 유전자가 점차 감소하는 전사 효율을 나타내도록 유전자 전사를 감소시키는 구배를 나타내는 것으로 보고되었다 (Lamb and Kolakofsky, Fields Virology, 1: 1177-1204, 1996; Wagner and Rose, Fields Virology, 1121-1136, 1996; Abraham and Banerjee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 1504-1508, 1976; Ball and White, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 442-446, 1976; Ball, J. Virol. 21: 411-414, 1977; Banerjee et al., J. Gen. Virol., 34: 1-8, 1977; Iverson and Rose, Cell 23: 477-484, 1981; Iverson and Rose, J. Virol. 44: 356-365, 1982; Banerjee et al., Pharmacol. Ther. 51: 47-70, 1991; 이들 각각의 문헌은 본원에 참고로 포함된다). 이러한 유전자 발현의 구배가 보고되었으며, 부분적으로 RSV의 특징을 이룬다 (Collins and Wertz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3208-3212, 1983; Collins et al., J. Virol. 49: 572-578, 1984; Dickens et al., J. Virol. 52: 364-369, 1984; 이들 각각의 문헌은 본원에 참고로 포함된다). 이러한 구배는 부분적으로는 이후의 전사 동안 중합효소의 "이탈 (fall-off)"로 인한 것으로 생각된다. 가장 간단한 모노네가바이러스 중 하나인 래브도바이러스 (rhabdovirus) VSV에 대한 연구는 이러한 이탈이 주로 유전자사이 영역에서 일어나는 것으로 제안하지만 (Iverson and Rose, Cell 23: 477-484, 1981; Iverson and Rose, J. Virol. 44: 356-365, 1982; 이들 각각의 문헌은 본원에 참고로 포함된다), 큰 L mRNA의 양이 불균형적으로 낮은 것은 또한 유전자내에 상당한 이탈이 있음을 시사한다.
모노네가바이러스들 사이에서 보고된 유전자 전사의 구배는 감염된 세포내에서 다양한 바이러스 mRNA의 상대적인 몰 비율을 결정하는 주요 인자인 것으로 생각된다. 즉, 이러한 현상은 바이러스 단백질의 상대적인 몰 비율을 결정하는 주요 인자인 것으로 생각된다. 모든 모노네가바이러스는 다음과 같은 5가지 단백질 또는 그의 대응물을 코딩하는 유전자를 갖는다: RNA-결합 뉴클레오캡시드 단백질 N, 포스포단백질 P, 내부 비리온 매트릭스 단백질 M, 부착 단백질 G, HA 또는 HN, 및 대형 중합효소 단백질 L. 또한, 이들은 항상 3'에서 5'의 순서로 N-P-M-G-L로 나타난다. 한가지 해석은 이와 같은 게놈 조직이 모노네가바이러스들 사이에서 다량의 N 및 P 단백질, 소량의 L, 및 중간량의 M 및 G에 대하여 공통의 필요성을 반영한다는 것이다. 또는, 모노네가바이러스에서 상동 재조합의 결여는 바이러스에 대하여 반드시 최적은 아닌 조상 유전자의 순서를 보유하게 한다는 것이 제안되었다 (Ball et al., J. Virol., 73: 4705-4712, 1999; 이 문헌은 본원에 참고로 포함된다).
억제된 유전자 순서 및 전사의 극성 성질은 모노네가바이러스 사이에서 유전자 발현의 조절에 있어서 중요한 인자인 것으로 제안되었다. 그러나, 다른 제2의 인자가 또한 시스-작용성 RNA 신호 효율의 차이, 여러 mRNA 번역 효율의 차이, 및 단백질 프로세싱 및 안정성의 차이를 비롯하여 한가지 이상의 모노네가바이러스 단백질 발현의 상대적인 수준에 영향을 주는 것으로 생각된다.
간단한 원형 모노네가바이러스인 VSV는 5개의 유전자를 갖는다 (Wagner and Rose, Fields Virology, 1121-1136, 1996; Schubert et al., J. Virol. 51: 505-514, 1984; 이들 문헌은 본원에 참고로 포함된다). 그러나, 다른 모노네가바이러스는 11개 (RSV) 또는 12개 (마우스의 폐렴 바이러스)의 많은 유전자를 갖는다 (Barr et al., J. Virol., 68: 5330-5334, 1994; 이 문헌은 본원에 참고로 포함된다). 이들로는 모든 파라믹소바이러스 및 뉴모바이러스에 존재하는 융합 F 유전자, 일부 파라믹소바이러스에 존재하는 C, D 및 V 유전자, 및 대부분의 뉴모바이러스에 존재하는 NS1, NS2, SH 및 M2 유전자와 같은 것들이 포함된다. 또한, VSV 및 RSV에 공통적일 수 있는 5가지 단백질들 (N, P, M, G 및 L)사이에서 조차, L에 대하여만 분명한 서열 관련성이 존재하며, 이러한 관련성은 낮다 (Poch et al., Embo. J. 8: 3867-3674, 1989; Stec et al., Virology 183: 273-287, 1991; 이들 문헌은 본원에 참고로 포함된다).
트랜스- 및 시스-작용성 성분의 구조 및 기능에 있어서의 차이와 함께 유전 자 산물의 배열 및 구조에 있어서의 이러한 폭넓은 차이를 가정하면, 한가지 모노네가바이러스, 예를 들어 VSV의 특징 및 특성은 RSV와 같은 다른 모노네가바이러스에 대해 직접 추정될 수 없다. 이러한 불확실성은 RSV 중합효소가 3개보다는 4개의 단백질로 구성되며, 추가의 단백질 하나는 VSV에서 대응물을 갖지 않는 M2-1 전사 종결방지 인자라는 사실에 의해 예증된다 (Hardy and Wertz, J. Virol. 72: 520-526, 1998; Hardy et al., J. Virol. 73: 170-176, 1999; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 81-85, 1996; Fearns and Collins, J. Virol. 73: 5852-5864, 1999; 이들 문헌은 본원에 참고로 포함된다). 이는 재조합 RSV의 효율적인 회수에 있어서 중요한 것으로 입증되었다 (Collins et al., Virology 259: 251-255,1999; 이 문헌은 본원에 참고로 포함된다). 또한, RSV RNA 합성은 VSV에서 대응물을 갖지 않는 적어도 2가지 단백질, 즉 NS1 및 M2-2에 의해 추가로 조절된다 (Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 11259-64, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73 : 3438-3442, 1999; Atreya et al., J. Virol. 72: 1452-61, 1998; Jin et al., J. Virol. 74: 74-82, 2000; 이들 문헌은 본원에 참고로 포함된다).
또한 VSV 유전자의 발현 및 조절의 많은 중요한 특징은 많은 다른 모노네가바이러스, 특히 VSV에 대하여, 예를 들어 VSV 유전자 발현의 조절에서 말단 상보성 (Wertz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8587-8591, 1994; Whelan and Wertz, J. Virol. 73: 297-306, 1999; Peeples and Collins, J. Virol. 74: 146-155, 2000; 이들 문헌은 본원에 참고로 포함됨), 유전자 발현에 직접 관여하는 고 도로 보존된 VSV 유전자사이 영역 (Barr et al., J. Virol. 71: 1794-1801, 1997; 이 문헌은 본원에 참고로 포함됨) (RSV의 것은 그렇지 않다 (Kuo et al., J. Virol. 70: 6143-6150, 1996; 이 문헌은 본원에 참고로 포함됨)), 다른 모노네가바이러스 군에 존재하지 않는 VSV 게놈 패키지 신호 (Whelan and Wertz, J. Virol. 73: 307-315, 1999; 이 문헌은 본원에 참고로 포함됨), 및 VSV 유전자 발현 및 N 단백질에 의한 복제의 조절 (Wagner and Rose, Fields Virology, 1121-1136, 1996; Fearns et al., Virology 236: 188-201, 1997; 이들 문헌은 본원에 참고로 포함됨)의 포함과 같은 어떤 관련성을 갖는 것으로 보이지 않는다. 이러한 특징은 RSV에서는 나타나지 않는 것으로 보이지만 (Peeples and Collins, J. Virol. 74: 146-155, 2000; 이 문헌은 본원에 참고로 포함됨), 대조적으로 RSV는 시스-작용성의 기능성 요소가 결여된 다른 유전자사이 서열 (Kuo et al., J. Virol. 70: 6143-6150, 1996; 이 문헌은 본원에 참고로 포함됨), 부위-특이적 감쇠를 매개하는 유전자 중복 (Fearns and Collins, J. Virol. 73: 388-397, 1999; Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5134-5138,1987; 이들 문헌은 본원에 참고로 포함됨), 및 L 유전자의 발현에 있어서 중요한 중합효소 추적 메카니즘의 존재 (Fearns and Collins, J. Virol. 73: 388-397, 1999; 이 문헌은 본원에 참고로 포함됨)를 비롯하여 VSV에서는 나타나지 않는, 유전자 발현 및 조절의 중요한 특징을 갖는다. 특히, 순차적 전사를 조절하는 전사 종결방지 인자의 존재 (Fearns and Collins, J. Virol. 73: 5852-5864, 1999; 이 문헌은 본원에 참고로 포함됨), 특이적 조절 단백질, 부위-특이적 감쇠, 및 유전자-결합-특이적 전사 조절 (Hardy et al., J. Virol. 73: 170-176, 1999; 이 문헌은 본원에 참고로 포함됨)은 VSV와의 상황과는 크게 다르다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 유전자 위치 변경은 RSV NS1, NS2, SH 및(또는) G 유전자 중 하나 이상의 결실에 의해 달성되며, 이러한 결실은 상기 인용된 참고문헌에 각각 개시되어 있다. 다른 유전자 또는 게놈 분절의 결실은 나머지 RSV 유전자에 대하여 유전자 위치를 변화시키기 위해 상기 확인된 RSV 유전자 또는 게놈 분절 중 어떤 것을 포함하여 구성될 수 있다. 보다 상세한 실시양태에서, 상기 언급된 참고문헌에서 NS1 및 NS2 유전자 한쌍의 결실로 예시된 바와 같이, 여러 유전자 또는 게놈 분절이 결실된다 (Bukreyev et al., J. Virol. 71: 8973-8982, 1997; Teng and Collins, J. Virol. 73: 466-473, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73: 3438-3442, 1999; 이들 문헌은 본원에 참고로 포함된다).
재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈내에서 하나 이상의 유전자 또는 게놈 분절의 결실은 (예를 들어, 하류 유전자에서 하나 이상의 유전자 위치를 프로모터 근처의 방향으로 이동시킴으로써) 모든 하류 유전자를 프로모터 가까이로 이동시키는 효과를 갖는다. 예를 들어, RSV NS1 및 NS2 유전자는 게놈 지도에서 제1 및 제2 유전자이며, 이들의 공동 결실은 나머지 모든 유전자의 위치를 변경한다. 따라서, NS1 및 NS2가 함께 결실되는 경우, N은 위치 3으로부터 위치 1로, P는 위치 4로부터 위치 2로 이동한다. 또는, 유전자 순서내에서 임의의 다른 유전자의 결실은 훨씬 더 하류에 위치하는 유전자들의 위치 (프로모터에 대해 상대적임)에만 영향을 줄 것이다. 예를 들어, SH는 야생형 바이러스에서 프로모터에 대해 상대적인 위치 6을 차 지하고 있으며, 그의 결실은 위치 5의 M (또는 임의의 다른 상류 유전자)에는 영향을 주지 않지만, G를 위치 7에서 위치 6으로 이동시킨다. 유전자 결실은 또한 생물학적으로 유도된 바이러스에서 (드물게) 일어날 수 있음을 유의해야 한다. 예를 들어, 세포 배양에서 대규모로 계대배양된 아군 B RSV는 SH 및 G 유전자를 자발적으로 결실시켰다 (Karron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13961-13966, 1997; 이 문헌은 본원에 참고로 포함된다). "상류" 및 "하류"는 각각 프로모터의 근처 및 프로모터와 떨어진 방향을 의미한다 (프로모터는 네가티브-센스 게놈 RNA의 3' 리더 말단에 있다).
본 발명내에서 유용한 유전자 순서 재배열의 두번째 예는 유전자, 게놈 분절 또는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈내에 삽입하여 재조합 게놈 또는 안티게놈에서 유전자 순서를 바꾸거나 프로모터에 상대적인 유전자 위치의 변경을 도입하는 것을 포함한다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 (Bukreyev et al., J. Virol. 70: 6634-6641, 1996; Bukreyev et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 2367-2372, 1999; Moriya et al., FEBS Lett. 425: 105-111, 1998; Singh and Billeter, J. Gen. Virol. 80: 101-106, 1999)을 참조한다). 삽입된 각각의 유전자는 프로모터에 상대적인 한 위치에서 모든 하류의 유전자들을 치환한다. 이들 및 다른 치환 폴리뉴클레오티드는 재조합 게놈 또는 안티게놈의 비-코딩 영역 (NCR)으로 삽입 또는 재배열되거나, 별도의 유전자 단위 (GU)로서 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈내에 혼입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "RSV 유전자"는 일반적으로 mRNA를 코딩하는 RSV 게놈의 부분을 의미하며, 통상적으로는 뉴클레오티드 10개로 이루어진 유전자-개시 (GS) 신호를 갖는 상류 말단에서 시작하여 뉴클레오티드 12 또는 13개로 이루어진 유전자-종결 (GE) 신호를 갖는 하류 말단으로 끝난다. 본 발명에 사용되는 이러한 10개의 유전자는 RSV에 대하여 공지되어 있으며, 즉 NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 및 L이다. "유전자"라는 용어는 또한 본원에서 "번역 오픈 리딩 프레임 (ORF)"을 의미하는 것으로 사용된다. ORF는 보다 구체적으로는 중요한 RSV 단백질을 코딩하는 번역 오픈 리딩 프레임으로 정의되며, 이 단백질 중 11개, 즉 NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2-1 (또는 M2(ORF1)), M2-2 (또는 M2(ORF2)), 및 L이 현재 알려져 있다. 즉, "유전자"라는 용어는 서브게놈 RNA를 코딩하는 게놈 RNA 서열, 및 ORF를 상호교환적으로 의미한다 (후자 용어는 특히 RSV M2 유전자의 경우와 같은 상황에 적용되며, 여기서 단일 mRNA는 다른 단백질을 코딩하는 2개의 중복 ORF를 포함한다) (Collins et al., J. Gen. Virol. 71: 3015-3020, 1990; Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 11259-11264, 1999; Ahmadian et al., EMBO J. 19: 2681-2689, 2000; Jin et al., J. Virol. 74: 74-82, 2000 (이들 각 문헌은 본원에 참고로 포함된다)). "유전자"라는 용어가 프로모터 위치에 상대적인 유전자 위치를 결정하는데 사용되는 경우, 이 용어는 통상적으로 전사 유전자-개시 및 유전자-종결 신호 모티프에 의해 경계를 이루는 mRNA-코딩 서열을 엄격하게 의미한다 (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4594-4598, 1986; Kuo et al., J. Virol. 70: 6892-6901, 1996; 이들 문헌은 본원에 참고로 포함된다).
"게놈 분절"은 RSV 게놈에서 유래하는 일정 길이의 연속 뉴클레오티드를 의미하며, 이는 ORF, 유전자 또는 유전자외 영역의 일부, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 유전자 위치 변경 RSV내에서 삽입체, 치환체, 결실 요소, 또는 재배열 요소로 사용되도록 선택될 수 있는 유전자 및 게놈 분절로는 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 또는 G 단백질, 또는 이들의 일부를 코딩하는 유전자 또는 게놈 분절이 포함된다. 조절 영역, 예를 들어 유전자외 리더 또는 트레일러 영역이 또한 고려될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 키메라 RSV는 RSV, F, G 또는 SH 당단백질을 코딩하는 하나 이상의 이종 유전자(들)을 혼입시킨다. 또는, 재조합 RSV는 RSV, F, G 또는 SH 당단백질의 세포질 도메인, 막횡단 도메인, 엑토도메인 또는 면역원성 에피토프를 코딩하는 게놈 분절을 혼입시킬 수 있다. 이러한 면역원성 단백질, 도메인 및 에피토프는 이들이 면역화된 숙주에서 새로운 면역 반응을 일으키기 때문에 유전자 위치 변경 RSV에서 특히 유용하다. 특히, G 및 F 단백질, 및 이들 내부의 면역원성 도메인 및 에피토프는 주요 중화 및 보호 항원을 제공한다. 또한, 비-RSV 단백질, 예를 들어 유행성 이하선염 및 SV 바이러스에 존재하는 SH 단백질을 코딩하는 유전자 및 유전자 단편을 본 발명의 유전자 위치 변경 RSV내에 혼입시킬 수 있다. 조절 영역, 예를 들어 유전자외 3' 리더 또는 5' 트레일러 영역, 및 유전자-개시, 유전자-종결, 유전자사이 영역, 또는 3' 또는 5' 비코딩 영역이 또한 이종의 (다른 RSV 종 또는 아군, 또는 PIV, 홍역, 유행성 이하선염 등과 같은 비-RSV 공급원으로부터 발생) 치환 또는 첨가물로 서 유용하다.
예를 들어, 인간 RSV 아군 또는 종으로부터의 하나 이상의 면역원성 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)의 소의 수용체 게놈 또는 안티게놈으로 또는 그들 내부로의 부가 또는 치환은 하나 이상의 특이적 인간 RSV 아군 또는 종을 비롯하여 인간 공여체 바이러스에 대하여 지시되는 면역 반응을 일으킬 수 있는 재조합 키메라 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 형성하지만, 소의 백본은 백신 개발에 있어서 유용한 후보가 되는 키메라를 제조하는 약화된 형질을 제공한다. 이러한 예시적인 한 실시양태에서, 하나 이상의 인간 RSV 당단백질 유전자 F, SH 및(또는) G를 부분적인 또는 완전한 소의 게놈 또는 안티게놈에 부가하거나 그들내에 치환하여, 감염성 숙주에서 항-인간 RSV 면역 반응을 유도하는 약화된 감염성 인간-소 키메라를 형성한다. 다른 "키메라" 실시양태에서, 유전자 위치 변경 RSV는 여러 인간 RSV 종 유래의 면역원성 단백질, 단백질 도메인 또는 에피토프, 예를 들어 RSV 아군 A 및 B 모두로부터의 두가지 F 또는 G 단백질 또는 그의 면역원성 부위를 코딩하는 이종 유전자 또는 게놈 분절을 혼입시킨다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 유전자 위치 변경 RSV 게놈 또는 안티게놈은 인간 및 소의 당단백질 도메인 또는 면역원성 에피토프를 모두 갖는 재조합 바이러스 또는 서브바이러스 입자에서 키메라 당단백질을 코딩한다. 예를 들어, 인간 RSV F, SH 또는 G 당단백질에서 유래하는 당단백질의 엑토도메인을 코딩하는 이종 게놈 분절을, 소의 배경 게놈 또는 안티게놈에서 상응하는 소의 F, SH 또는 G 당단백질의 세포질 및 엔도도메인을 코딩하는 게놈 분절과 함께 연결시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 따라, 부분적인 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈에서 이종 유전자 또는 게놈 분절로 대응 유전자 또는 게놈 분절을 치환하여 인간-소 키메라 RSV를 구성할 수 있다. 또는, 이종 유전자 또는 게놈 분절을 완전한 (또는 다른 유전자 또는 게놈 분절이 결실된 경우에는 부분적인) RSV 배경 게놈 또는 안티게놈과 함께 여분의 유전자 또는 게놈 분절로 부가할 수 있다. 예를 들어, 각각 RSV 아군 A 및 B로부터의 2가지 인간 RSV G 또는 F 유전자 또는 게놈 분절을 포함시킬 수 있다.
흔히, 치환 유전자 또는 게놈 분절 (이종 유전자 또는 게놈 분절 포함)은 부분적인 또는 완전한 RSV 게놈 또는 안티게놈내의 유전자사이 위치에 부가된다. 또는, 유전자 또는 게놈 분절은 게놈의 다른 비코딩 영역, 예를 들어 5' 또는 3' 비코딩 영역내 또는 다른 위치에 위치시킬 수 있으며, 비코딩 뉴클레오티드가 부분적인 또는 완전한 게놈 또는 안티게놈내에 존재한다. 한 측면으로, 비코딩 조절 영역은 효율적인 복제, 전사 및 번역에 필요한 시스-작용성 신호를 포함하며, 따라서 본원에 개시된 치환 유전자 또는 게놈 분절, 또는 다른 돌연변이를 도입하여 이러한 기능의 변경을 위한 표적 부위를 제공한다. 본 발명의 보다 상세한 측면으로, 감쇠 돌연변이를 시스-작용성 조절 영역내에 도입하여, 예를 들어 (1) 조직 특이적 감쇠 (Gromeier et al., J. Virol. 73: 958-64, 1999; Zimmermann et al., J. Virol. 71: 4145-9, 1997), (2) 인터페론에 대한 증가된 감응성 (Zimmermann et al., J. Virol. 71: 4145-9, 1997), (3) 온도 감응성 (Whitehead et al., Virology 247: 232-9, 1998), (4) 일반적인 복제 수준의 억제 (Men et al., J. Virol. 70: 3930-7, 1996; Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5177-5181, 1991), 및(또는) (5) 숙주 특이적인 복제 억제 (Cahour et al., Virology 207: 68-76, 1995)를 일으킨다. 예를 들어 점 돌연변이, 관련 바이러스 사이의 서열 교환, 또는 결실에 의해 이러한 감쇠 돌연변이를 다양한 방식으로 형성함으로써 본 발명의 약화된 유전자 위치 변경 RSV를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 재조합 RSV가 다수의 유전자 또는 게놈 분절의 결실, 삽입, 치환 또는 재배열에 의해 변경된 유전자 위치 변경 RSV가 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 선택된 "유전자 세트"는 이러한 방법들 중 한가지에 의해 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈내로, 그들내에 또는 그들로부터 공동으로 전달된다. 개별적으로 또는 공동으로 전달되는 유전자 군이 선택될 수 있는 RSV 유전자의 예로는 RSV N, P, NS1, NS2, M2-1 및 M 유전자를 들 수 있으며, 이들을 단독으로 또는 임의의 조합으로 인간 또는 소의 RSV 게놈 또는 안티게놈내로 전달하여 약화된 유전자 위치 변경 유도체를 생성시킬 수 있다. 보다 상세한 측면으로, 인간 또는 소 RSV의 N 및 P 유전자 둘 다를 (예를 들어, 공동 결실시키거나 HRSV 게놈 또는 안티게놈에서 소의 RSV로부터의 대응 N 및 P 유전자로 치환하여) 공동으로 결실, 삽입, 치환 또는 재배열시킨다. 이러한 유전자의 공동 전달은 RSV 게놈에서 특정 유전자들 사이의 기능적 공동작용에 의해 촉진되며, 게놈에서 유전자 쌍이 인접하는 경우에 종종 나타난다. 따라서, 다른 실시양태에서, NS1 및 NS2 유전자는 둘 다, 예를 들어 인간 RSV가 소의 RSV로부터의 대응 NS1 및 NS2 유전자에 의해 치환됨으로써 공동으로 전달된다. 또 다른 실시양태에서, RSV의 M2-1, M2-2 및 L 유 전자 중 2개 이상이 공동으로 전달된다. 높은 수준의 숙주-범위 억제가 요구되는 본 발명의 여러 백신 후보의 경우, 인간 RSV의 N, P, NS1, NS2, M2-1 및 M 유전자 각각은 소의 RSV로부터의 대응 N, P, NS1, NS2, M2-1 및 M 유전자에 의해 치환된다.
인간-소 키메라 RSV내에서 유전자의 공동 전달은 또한 인간 항원성 유전자의 소의 배경 게놈 또는 안티게놈내로의 도입으로 지시된다. 여러 실시양태에서, F, G, SH 및 M으로부터 선택되는 하나 이상의 인간 RSV 엔벨로프-관련 유전자는 부분적인 또는 완전한 소의 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈내에 부가 또는 치환된다. 예를 들어, F, G, SH 및 M으로부터 선택되는 하나 이상의 인간 RSV 엔벨로프-관련 유전자는, F, G, SH 및 M으로부터 선택되는 하나 이상의 엔벨로프-관련 유전자가 결실된 부분적인 소의 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈내에 부가 또는 치환될 수 있다. 보다 상세한 측면으로, 인간 RSV 엔벨로프-관련 유전자 F, G 및 M으로 정의된 유전자 세트로부터의 하나 이상의 유전자는, 엔벨로프-관련 유전자 F, G, SH 및 M이 결실된 부분적인 소의 RSV 배경 게놈 또는 안티게놈내에 부가된다. 이러한 특징을 지닌 것으로 하기 실시예에 설명된 인간-소 키메라 RSV의 예는 rBRSV/A2-MGF이다.
본 발명의 다른 측면에서는, 이종 뉴클레오티드 서열의 RSV 백신 후보물로의 삽입을 별도로 이용하여 예를 들어 상부 기도에 대한 후보 백신 재조합체의 약독화 수준을 조절한다. 따라서, 동물 숙주에서의 바이러스를 약독화시키고 외래 단백질의 발현을 지시하는 rRSV로 뉴클레오티드 서열을 삽입하거나, 또는 뉴클레오티드 삽입을 별도로 이용하여 후보 백신 바이러스를 약독화시키는 것이 가능하다. 이러 한 본 발명의 측면을 달성하기 위한 일반적인 도구 및 방법은 예를 들면 미국 특허 가출원 제60/170,195호, 미국 특허 출원 제09/458,831호 및 동 제09/459,062호 (각각 본원에 참고문헌으로 채택됨)에 제공되어 있다. 이렇게 제공된 본 발명의 한 예시적인 실시태양에서는, 선택된 RSV 유전자 접합사이에서의 홍역 HA ORF의 삽입에 의해 생체내 바이러스 복제가 제한될 것이다. 이러한 본 발명의 측면에서, 선택된 유전자 삽입물은 비교적 크다 (약 1900 nt 이상). 본원의 문맥상, 얻어진 재조합 바이러스의 선택가능한 약독화 정도가 삽입물의 크기에 의해 규정된다. 이종 바이러스에서 유도된, 예를 들면 단일 유전자 단위 (GU)로서 도입되고 임의의 상당한 ORF를 결여하도록 구체적으로 설계된 다양한 길이의 치환 서열은 게놈 길이가 증가함으로 인해 선택가능한 약독화에 영향을 나타낸다 (즉, 추가 mRNA의 발현에 대해서). RSV 유전자의 하류 비코딩 영역(NCR)에 유사한 크기의 삽입물이 도입된 다른 구조물도 또한 본 발명내에서 유용하다.
약독화에 대한 유전자 삽입의 영향을 지배하는 규칙의 일부를 정의하기 위하여, 다양한 길이의 유전자 단위를 야생형 RSV 골격에 삽입하여 약독화에 대한 유전자 단위 길이의 효과를 조사할 수 있다. 상당한 ORF를 함유하지 않도록 엔지니어링된 유전자 단위 삽입에 의해 그 유전자의 발현된 단백질의 효과와 독립적으로 유전자 단위 길이의 효과를 평가할 수 있다. 이러한 이종 서열은 PIV 골격에 NH과 L 유전자 사이에서 168 내지 3918 크기의 여분의 유전자 단위로서 삽입되었다. 또한, 유사한 크기의 삽입물을 PIV의 HN 유전자의 3'-비코딩 영역에 위치시켜 여분의 유전자가 첨가되지 않은 대조용 cDNA 구조물 및 바이러스를 제조하였다. 이러한 바이러스를 제조하여 전체 게놈 길이의 증가 및 약독화에 대한 유전자수의 영향을 평가하였다. 여분의 유전자 단위의 삽입으로, 발현된 단백질의 전체 풍부성 및 비율 모두에 영향을 주는 삽입 부위 하류의 유전자의 전사가 감소될 것으로 기대된다. 본원에서 입증된 바와 같이, 길이 약 3000 nt 초과의 유전자 삽입물 또는 확장물에 의해 햄스터의 상부 및 하부 기도에 대한 야생형 바이러스가 약독화되었다. 또한, 길이 약 2000 nt의 유전자 삽입물에 의해 상부 기도에 대한 rHPIV3cp45L 백신 후보물이 약독화되었다. 따라서, RSV의 필적할만한 유전자 삽입물은 후보 백신 바이러스를 약독화하고 제2 바이러스에 대한 보호 효과를 유발하는 2중 효과를 갖는다. 추가의 단백질을 발현할 수 없는 유전자의 3'-비코딩 영역중 유전자 확장물은 또한 그 자체로서 저절로 약독화될 수 있다. 이러한 본 발명의 방법내에서 유전자 삽입물 길이는 약독화의 결정인자이다.
본 발명내에서 사용하기 위한 유전자 순서 전위의 별도의 예에는 상당한 길이의 폴리뉴클로오티드 (예, 100 초과의 뉴클레오티드)의 도입 또는 결실이 없는, 1 이상의 천연 유전자의 다른 천연 유전자에 대한 위치의 변화가 포함된다. 예를 들면, 인간 또는 인간-소 키메릭 RSV의 F 및 G 유전자는 이들의 천연 유전자 순서 위치에서 더욱 프로모터에 인접한 위치로 유전자의 재조합 게놈 또는 안티게놈으로의 절제 및 재삽입에 의해 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈의 길이를 실질적으로 변경시키지 않으면서 이동될 수 있다.
이러한 유전자 위치 및(또는) 유전자 순서의 변형으로 전형적으로는 생물학적 성질이 변경된 바이러스가 수득된다. 예를 들면, 1 이상의 선택된 유전자, 예 를 들면 NS1, NS2, SH, 또는 G, NS1와 NS2가 함께, 및 SH와 G가 함께 결여하는 본 발명의 재조합 RSV는 시험관내, 생체내, 또는 모두에서 약독화될 수 있다. 이러한 표현형은 특이적 바이러스 단백질의 발현의 손실로 주로 약독화되는 듯한 한편, 변경된 유전자 지도 또한 표현형에 기여하는 듯하다. 이 효과는 아마 유전자 결실으로 인하고 유전자 순서 및 가능한 게놈 크기 변화를 일으키는 전사, 복제 또는 이들 모두의 효율의 증가로 인해, 일부 세포 유형에서 야생형보다 더욱 효과적으로 성장되는 SH-결실 바이러스로 관찰되는 결과에 의해 잘 설명된다.
cDNA로부터 감염성 RSV를 생성하는 능력은 cDNA 중간체를 통하여 감염성 바이러스로 미리 확인된 변화를 도입하는 방법을 제공한다. 이 방법을 사용하여 예를 들면, 시스 작용 RNA 신호 중의 1 이상의 뉴클레오티드 치환 및(또는) 1 이상의 바이러스 단백질에 1 이상의 아미노산 치환 및(또는) 1 이상의 유전자 결실 또는 그(들) 유전자 발현의 제거를 포함하여, 약독화된 돌연변이를 포함하는 야생형 재조합 RSV 균주 A2의 일련의 감염성 약독화된 유도체를 제조하였다 (Bukreyev et al., J. Virol. 71:8973-8982, 1997; Whitehead et al., J. Virol. 72:4467-4471, 1998; Whitehead et al., Virology 247:232-239, 1998; Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11259-11264, 1999; Juhasz et al., Vaccine 17:1416-1424, 1999; Juhasz et al., J. Virol. 73:5176-5180, 1999; Teng and Collins, J. Virol. 73:466-473, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:871-877, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999; Collins et al., Adv. Virus Res. 54:423-451, 1999; 1999년 7월 9일자 출원된 미국 특허 가출원 제60/143,097호; 미국 특허 출원 제09/611,829호 및 WO 01/04321로 공개된 그의 상응하는 PCT 출원, 각각 본원에 참고문헌으로 채택됨).
균주 A2는 항원 아군 A를 나타내며, 효과적인 RSV 백신은 또한 다른 항원 아군인 아군 B를 나타낼 것이다. G 및 F 당단백질은 주요 안티게놈 결정인자 및 RSV 주요 방어 항원이다 (Connors et al., J. Virol. 65(3):1634-7 (1991); Murphy et al., Virus Research 32:13-36, 1994; Collins et al., Fields Virology 2:1313-1352, 1996; 및 Crowe et al., New Generation Vaccines, 711-72, 1997, 각각 본원에 참고문헌으로 채택됨). 따라서, 재조합 균주 A2의 G 및 F 유전자는 항원 아군 B의 B1 균주로부터의 그의 상대물로 대체되었다 (Whitehead et al., J. Virol. 73:9773-9780, 1999, 본원에 참고문헌으로 채택됨). 이는 야생형 및 약독화된 균주 A2 골격을 사용하여 달성하였다. 재조합 바이러스가 수득되었으며, "키메라화"는 바이러스 복제를 검출가능하게 방해하지는 않았다. 이는 구체적으로는 약독화된 균주 A2를 사용하여 아군 B의 항원 결정인자를 발현하는 (계류중 출원), 백신 바이러스의 신속 제조 방법을 입증하였다. 따라서, 일단 적절하게 약독화된 아군 A 유전자 위치이동된 RSV 백신 바이러스는 임상적인 시도로 확인되며, 그의 골격을 변경하여 신속 제조 방법으로 필적할만한 아군 B 백신을 제조할 수 있으며, 2개의 바이러스를 조합하여 2가 백신을 제조할 수 있다.
또한, 상기와 같이 채택된 참고문헌에는 본 발명내에서 유용한 RSV가, 다양한 게놈 위치, 바람직하게는 유전자간 영역내에 배치된 여분의 보충 유전자로서 첨가된 외래 유전자를 발현시킬 수 있다는 것이 입증되어 있다. 이러한 개념을 이용 하여 보충 유전자로서 G 당단백질의 아군 B를 발현시키기도 하는 재조합 균주 A2 바이러스를 제조하였다. 따라서, 단일 바이러스는 항원 결정인자의 2개의 아군을 발현시켰다. 본원에 포함된 또다른 예에는 면역원성을 감소시키지 않으면서 약독화를 일으키는 추가된 유전자로서의 인터페론 감마의 발현이 포함되며, 또한 RSV에 대한 면역원성 반응을 매개하는 것으로 제안되어 온 T 헬퍼 림프구 하위세트 2의 자극의 상대적인 수준을 감소시키는 방법이 제공된다 (1999년 7월 13일자 출원된 미국 특허 가출원 제60/143,425호; 미국 특허 출원 제09/614,295호 및 WO 01/04271로 공개된 그의 상응하는 PCT 출원 참조, 각각 본원에 참고문헌으로 채택됨).
본 발명의 또다른 실시태양에서는 유전자 위치이동에 혼입되는 생 바이러스 백신의 약독화에 대한 상이한 근거가 제공되는데, 이 약독화는 일부 숙주 범위 효과를 기초로 한다. 이와 관련하여, 본원에서는 HRSV와 BRSV 간에 게놈 분절, 전체 유전자 또는 다수 유전자를 도입함으로써 약독화된 키메릭 RSV를 제공한다. HRSV와 BRSV 간의 숙주 범위 차이는 침팬지에서 BRSV의 겨우 검출가능하거나 검출할 수 없는 성장과 비교하여 동일 동물에서 HRSV의 고허용성 성장에 의해 예증된다. 침팬지는 인간에 필적하는 바이러스 복제 및 질병을 나타내는, 널리 수용되고, 인간에서의 RSV 감염 및 면역원성 활성의 신뢰할만한 모델이다. 본원에서 하기 설명하는 바와 같이, 침팬지에서 관찰되는 키메릭 RSV의 숙주 범위 차이는 편리한 예비적 검정을 제공하는 세포 배양에서 관찰되는 숙주 범위 차이와 연관된다.
본 발명의 키메릭 인간-소 RSV에서 관찰되는 숙주 범위 효과는 일반적으로 HRSV 및 BRSV 간에 관찰되는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 차이와 관련된다. 예 를 들면, 단백질 각각에 대한 HRSV 및 BRSV 간의 아미노산 동일성 백분율은 NS1 (69％), NS2 (84％), N (93％), P (81％), M (89％), SH (38％), G (30％), F (81％), M2-1 (80％), L (77％)이다. HRSV 및 BRSV간의 광범위한 유전적 차이로 인하여 (HRSV의 N 유전자를 BRSV의 것으로 대체하는 것은 예를 들면, 약 26 아미노산 차이를 포함함), 본 발명의 키메릭 소-인간 RSV는 특히 백신 후보물로 유용하다. 본원에 하기 예시되는 바와 같이, BRSV G 및 F 당단백질을 HRSV의 것으로 대체하는 것은 재조합 BRSV의 침팬지에서 복제 허용성을 증가시킨다. 각각 다수 아미노산 또는 뉴클레오티드 차이를 가져오는 다수 유전자 및 게놈 분절의 관여는 복귀변이(reversion)에 대해 매우 안정한 약독화에 대한 광범위한 근거를 제공한다. 이러한 방식의 약독화는 개별 돌연변이의 복귀변이가 중요한 또는 완전한 독성의 재획득을 가져올 수 있는 것인, 1 이상의 점 돌연변이에 의해 약독화된 HRSV 바이러스와 크게 대조적이다. 또한, HRSV에서의 공지된 약독화 점 돌연변이는 전형적으로 온도 민감성 표현형을 생성한다. 이는 온도 민감성 표현형이 구체적으로 제1 스크린으로 사용되어 HRSV의 돌연변이원에 대한 노출 후의 변화된 후손(progeny)를 확인하기 때문이다. 온도 민감성과 연관된 약독화의 한가지 문제점은 바이러스가 상부 기도에서는 약독화되는 반면 하부 기도에서는 복제가 몹시 제한될 수 있다는 것이다. 이는 기도내에 온도가 하부 기도에서는 더 높고 (더욱 제한적이고), 상부 기도에서는 더 낮은 (덜 제한적인) 온도 구배가 있기 때문이다. 약독화 바이러스가 상부 기도에서 복제되는 능력은 충혈, 비염, 열 및 중이염을 포함한 합병증을 일으킬 수 있다. 따라서, 온도 민감성 돌연변이에 의해 단독으로 이루어진 약독화는 이상적이지 않을 것이다. 반대로, 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV에 존재하는 숙주 범위 돌연변이는 대부분의 경우 온도 민감성을 제공하지 않을 수 있다. 따라서, 약독화의 이러한 신규 방법은 (i) 유전적으로 및 표현형적으로 더욱 안정하며, (ii) 다른 생 백신 접근법보다 상부 기도에서의 잔류 독성과 연관성이 덜 할 수 있다.
BRSV 및 HRSV 간의 서열 디버전스의 양은 상기 언급한 HRSV A 및 B 아군 간의 것보다 약 2 배이다. 따라서, F 단백질은 BRSV 및 HRSV 간에 약 20％ 아미노산 디버전스를 가지며, G 단백질은 약 70％ 디버전스를 갖는다 (Lerch, et al., J. Virol. 64:5559-69, 1990; Lerch, et al., Virology 181:118-31, 1991; Mallipeddi and Samal, J. Gen. Virol. 74:2001-4, 1993; Mallipeddi and Samal, Vet. Microbiol. 36:359-67, 1993; Samal et al., Virology 180:453-456, 1991; Samal and Zamora, J. Gen. Virol. 72:1717-1720, 1991; Zamora and Samal, Virus Res. 24;115-121, 1992; ibid, J. Gen, Virol. 73:737-741, 1992; Mallipeddi and Samal, J. Gen. Virol. 73:2441-2444, 1992, Pastey and Samal, J. Gen. Virol. 76:193-197, 1995; Walravens et al., J. Gen. Virol. 71:3009-3014, 1990; Yunnus et al., J. Gen. Virol. 79:2231-2338, 1998, 각각 본원에 참고문헌으로 채택됨).
본원에 참고문헌으로 채택된 선행 기술 개시내용에서는, 재조합 BRSV를 변경하여 G 및 F BRSV 유전자를 그들의 인간 RSV 상대물로 대체하였다. BRSV 골격상에 인간 RSV의 항원성 결정인자를 포함하는 얻어진 키메릭 BRSV/HRSV 바이러스는 그의 BRSV 부모에서보다 침팬지에서 보다 효과적으로 복제되었으나, 고도의 약도화는 유 지되었다. 이는 G 및 F 유전자가 BRSV의 숙주 범위 제한에 기여한다는 것을 나타내지만, 1 이상의 다른 유전자도 또한 숙주 범위 제한을 규정한다는 것을 보여주었다. 이는 상기한 유전자 위치 변화를 특징으로 하고 인간 RSV G 및 F 항원성 결정인자를 함유하는 최적 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스를 구성하기 위한 출발점을 나타내며, 여기서 얻어진 재조합 RSV는 숙주 범위 제한을 제공하는 1 이상의 BRSV 유전자의 존재에 의해 약독화된다 (Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000; 1999년 7월 9일자 출원된 미국 특허 출원 제60/143,132호; 각각 본원에 참고문헌으로 채택됨).
본 발명의 보충적 측면으로 본원에 개시된 cDNA로부터 재조합 RSV를 제조하고, 돌연변이 및 뉴클레오티드 변형의 전체 범위를 제조하고 시험하기 위한 물질 및 방법의 상세한 설명은 예를 들면 다음 문헌에 설명되어 있다: 1995년 9월 27일 출원된 미국 특허 가출원 제60/007,083호; 1996년 9월 27일 출원된 미국 특허 출원 제08/720,132호; 1996년 7월 15일 출원된 미국 특허 가출원 제60/021,773호 및 미국 특허 출원 제08/892,403호 (현재 미국 특허 제5,993,834호로 특허허여됨); 1997년 5월 9일 출원된 미국 특허 가출원 제60/046,141호; 1997년 5월 23일 출원된 미국 특허 가출원 제60/047,634호; 1999년 11월 30일 특허허여된 미국 특허 제5,993,824호 (국제 특허 공개 WO 제98/02530호에 상응함); 1999년 4월 13일 콜린스(Collins) 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 제09/291,894호 및 상응하는 PCT 출원 공개 WO 제00/61737호; 1999년 4월 13일 머피(Murphy) 등에 의해 출원된 미국 특허 가출원 제60/129,006호; Crowe et al., Vaccine 12:691-699, 1994; 및 Crowe et al., Vaccine 12:783-790, 1994; Collins et al., Proc Nat Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995; Bukreyev, et al., J. Virol. 70:6634-41, 1996, Juhasz et al., J. Virol 71(8):5814-5819, 1997; Durbin et al., Virology 235;323-332, 1997, Karron et al., J. Infect. Dis. 176:1428-1436, 1997); He et al., Virology 237:249-260, 1997; Baron et al., J. Virol. 71:1265-1271, 1997; Whitehead et al., Virology 247(2):232-9, 1998a; Whitehead et al., J. Virol. 72(5):4467-4471, 1998b; Jin et al., Virology 251:206-214, 1998; Bukreyev, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2367-2372, 1999; Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11259-11264, 1999; Juhasz et al., Vaccine 17:1416-1424, 1999; Juhasz et al., J. Virol. 73:5176-5180, 1999; Teng and Collins, J. Virol. 73:466-473, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:9773-9780, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:871-877, 1999; 및 Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999.
cDNA로부터 재조합 RSV를 제조하는 예시적 방법은 RSV 안티게놈 RNA 및 RSV N, P, M2-1 및 L 단백질의 조직 배양 세포 내로 공동 감염된 플라스미드로부터 전형적으로 세포내 공동발현하는 것을 포함한다. 재조합 바이러스로 부르는 감염성 cDNA 유도된 바이러스가 생성되게 하는 생산성 감염을 시작한다. 일단 생성되면, 재조합 RSV는 생물학적으로 유도된 바이러스와 동일한 방식으로 쉽게 증식되고, 재조합 바이러스 및 대응 생물학적으로 유도된 바이러스는 전자가 1 이상의 도입된 변화를 마커로 포함하여 변형되지 않는 한 구별될 수 없다.
더욱 상세한 측면에서, 상기 채택된 문헌들은 RSV를 돌연변이, 단리 및 특성화하여 약독화 돌연변이체 균주 (예를 들면, 온도 민감성 (ts), 저온 계대 배양 (cp) 저온 적응 (ca), 작은 플라크 (sp) 및 숙주 범위 제한 (hr) 돌연변이체 균주)를 얻기 위한 것, 및 약독화 표현형을 규정하는 유전적 변화를 확인하기 위한 본 발명에 유용한 방법 및 과정을 기술한다. 이들 방법과 함께, 상기 문헌들은 생쥐 및 비인간 영장류 모델 시스템을 포함하여 허용되는 모델 시스템에서 인간 RSV A 및 B 아군을 포함하는 생물학적으로 유도되고, 재조합적으로 제조된 약독화 인간 RSV의 복제, 면역원성, 유전적 안정성 및 보호 효과를 결정하는 과정을 상술한다. 또한, 이들 문헌은 RSV 감염의 예방 및 치료용 일가 및 이가 백신을 포함하는 면역원성 조성물을 개발 및 시험하는 일반적 방법을 상술한다.
cDNA로부터 감염성 RSV를 생성하는 능력은 cDNA 중간체를 통하여 감염성 바이러스로 미리 확인된 변화를 도입하는 방법을 제공한다. 이 방법은 예를 들면, 바이러스 단백질에 1 이상의 아미노산 치환, 1 이상의 유전자 결실 또는 유전자 발현의 제거 및(또는) 바이러스 표현형에 요망되는 효과를 발생시키는 시스 작용 RNA 신호 중의 1 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 재조합 백신 후보물과 같은 넓은 범위의 RSV의 감염성 약독화된 유도체를 제조하는 것을 설명한다 (예를 들면, 각각 본원에 참고문헌으로 채택된 Bukreyev et al., J. Virol. 71:8973-8982, 1997; Whitehead et al., J. Virol. 72:4467-4471, 1998; Whitehead et al., Virology 247:232-239, 1998; Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11259-11264, 1999; Juhasz et al., Vaccine 17:1416-1424, 1999; Juhasz et al., J. Virol. 73:5176-5180, 1999; Teng and Collins, J. Virol. 73:466-473, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:871-877, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999; 및 Collins et al., Adv. Virus Res. 54:423-451, 1999 참조).
상기 교시사항의 예는 예를 들면, 생물학적으로 유도된 지정된 cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2452), 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)로부터의 재조합 RSV 중에 채택된 cp 및 ts 돌연변이와 같은 생물학적으로 유도된 RSV 돌연변이체 중에 확인된 표현형 특이적 돌연변이를 혼입하도록 변형된 감염성 재조합 RSV를 구성하고 평가하는 방법이다. 이들 방법은 본 발명의 재조합 유전자 위치이동된 RSV의 구성에 쉽게 적응된다. 따라서, 제공되는 재조합 RSV는 예를 들면, 1 이상의 248/404, 248/955, 530/1009 또는 530/1030 생물학적 돌연변이체와 같은 동일 또는 상이한 생물학적으로 유도된 RSV 돌연변이체(들)로부터의 2 이상의 ts 돌연변이를 혼입할 수 있다. 후자와 관련하여, 다중 약독화 재조합체는 2개, 3개 또는 그 이상의 생물학적 돌연변이체로부터의 약독화 돌연변이의 조합, 예를 들면 RSV 돌연변이체 530/1009/404, 248/404/1009, 248/404/1030 또는 248/404/1009/1030 돌연변이체로부터의 약독화 돌연변이체의 조합을 가질 수 있다. 예시적 실시태양에서, 1 이상의 약독화 돌연변이체는 RSV 중합효소 유전자 중 아미노산 Asn43, Phe521, Gln831, Met1169 또는 Tyr1321에서 온 도 민감성 치환, 또는 유전자 M2의 유전자 개시 서열 중 온도 민감성 뉴클레오티드 치환을 규정한다. 바람직하게는, 이들 돌연변이는 생물학적으로 유도된 돌연변이체 RSV에서 확인되는 다음의 변화로 동일 또는 보존적 변화, 예를 들면, Asn43은 Ile, Phe521은 Leu, Gln831은 Leu, Met1169는 Val 및 Tyr1321은 Asn으로의 L 중합효소 유전자에서 확인된 보존적 치환을 포함한다.
본 발명의 유전자 위치이동된 RSV 중에 혼입될 수 있는 또 다른 돌연변이는 이종 RSV 또는 더욱 멀리 관련된 음성 가닥 RNA 바이러스에서 확인되는 돌연변이 (예를 들면, 약독화 돌연변이)이다. 특히, 1개의 음성 가닥 RNA 바이러스에서 확인되는 약독화 및 다른 요망되는 돌연변이는 각각 유전자 위치이동된 RSV내에 있는, 인간 또는 소 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 상응하는 위치로 "전달" (예를 들면, 복사)되거나, 유전자 위치이동된 RSV를 구성하는 수단일 수 있다. 간략하게, 1개의 이종 음성 가닥 RNA 바이러스 중의 요망되는 돌연변이는 RSV 수용체 (예를 들면, 각각 소 또는 인간 RSV)로 전달된다. 이는 본원에 참고문헌으로 채택된 1999년 4월 13일 머피 등에 의해 출원된 미국 특허 가출원 제60/129,006호에 기술된 바와 같이 이종 바이러스 중의 돌연변이를 매핑하고, 따라서 서열 정렬에 의해 인간 또는 소 RSV 중의 상응하는 부위를 확인하고, RSV 수용체 중의 천연 서열을 돌연변이 유전형 (동일 또는 보존적 돌연변이에 의해) 돌연변이시키는 것을 포함한다. 상기 개시사항이 교시하는 바와 같이, 이종 돌연변이체 바이러스에서 확인되는 변화와 보존적으로 상응하는 돌연변이의 대상 부위에서의 변화를 코딩하도록 키메릭 게놈 또는 안티게놈을 변형하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 아미노산 치환이 상 응하는 야생형 서열과 비교하여 돌연변이체 바이러스 중의 돌연변이 부위를 표시한다면, 유사한 치환은 재조합 바이러스에서 상응하는 잔기(들)에 엔지니어링되어야 한다. 바람직하게는, 치환은 돌연변이체 바이러스 단백질에 존재하는 치환 잔기와 동일 또는 보존적 아미노산을 포함할 수 있다. 그러나, 돌연변이체 단백질 중의 치환 잔기와 관련하여 비보존적 돌연변이 부치에서 천연 아미노산 잔기를 변화시키는 것 또한 가능하다 (예를 들면, 야생형 잔기의 기능을 혼란 또는 손상시키는 임의의 다른 아미노산을 사용). 확인되고 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV로 전달되는 예시적 돌연변이로 음성 가닥 RNA 바이러스는 다른 RSVs (예를 들면, 생쥐), PIV, 센다이 바이러스 (SeV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 조류 바이러스 5 (SV5), 홍역 바이러스 (MeV), 우역 바이러스, 개 디스템퍼 바이러스 (CDV), 광견병 바이러스 (RaV) 및 소포성 구내염 바이러스 (VSV)를 포함한다. RSV L 단백질의 위치 521에서의 페닐알라닌의 아미노산 치환 (HPIV3 L 단백질의 위치 456에서의 페닐알라닌의 치환에 상응함)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 돌연변이의 예가 개시되어 있다. 결실 또는 삽입에 의해 표시되는 돌연변이의 경우에, 이들은 재조합 바이러스 내로 상응하는 결실 또는 삽입으로 도입될 수 있으나, 결실 또는 삽입되는 단백질 단편의 입자 크기 및 아미노산 서열은 달라질 수 있다.
다양한 추가 유형의 돌연변이 또한 상기 채택된 문헌에 개시되어 있으며, 본 발명의 재조합 유전자 위치이동된 RSV로 쉽게 엔지니어링되어 약독화, 면역원성을 보정하거나, 다른 이로운 구조적 및(또는) 표현형 효과를 제공할 수 있다. 예를 들면, 제한 부위 마커는 유전자 위치이동된 게놈 또는 안티게놈 내로 통상적으로 도입되어 cDNA 구성 및 조작을 촉진한다. 채택된 문헌에 또한 기술되어 있는 것은 본 발명에 유용한 점 또는 위치 지향성 돌연변이 외의 넓은 범위의 뉴클레오티드 변형이다. 예를 들면, 추가 외래 유전자 (예를 들면, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT) 또는 루시페라제 유전자)를 발현하는 재조합 RSV를 제조하는 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 이러한 재조합체는 일반적으로 삽입된 유전자와 연관된 성장 감소를 나타낸다. 이러한 약독화는 삽입된 유전자의 길이 증가와 함께 증가되는 것으로 나타난다. 외래 유전자를 재조합 RSV로 삽입하는 것이 복제 수준을 감소시키고, 시험관내 통과 동안 안정하다는 발견은 백신용의 RSV를 약독화하는 다른 효과적인 방법을 제공한다. 따라서, 유사 또는 개선된 효과는 다른 요망되는 유전자 (예를 들면, 인터페론-
Figure 112002042527118-pct00001
, 인터루킨-2, 인터루킨-4 및 GM-CSF 등과 같은 사이토카인)의 삽입에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 방법내에서, 추가 유전자 또는 게놈 분절이 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈으로 삽입되거나 근접할 수 있다. 이들 유전자는 수용체 유전자의 통상적 제어하에 있을 수 있거나, 또는 전사 신호의 독립적 세트의 제어하에 있을 수 있다. 해당 유전자는 상기 확인된 RSV 유전자 뿐만 아니라 비-RSV 유전자를 포함한다. 해당 비-RSV 유전자는 사이토카인 (예를 들면, IL-2 내지 IL-18, 특히 IL-2, IL-6 및 IL-12, IL-18 등), 감마-인터페론 및 T 헬퍼 세포 에피토프에 풍부한 단백질을 코딩하는 것들을 포함한다. 이들 추가 단백질은 별개 단백질로, 또는 SH와 같은 RSV 단백질 1개의 2차 카피로부터 엔지니어링된 키메라로 발현될 수 있다. 이는 정량적 및 정성적으로 RSV에 대한 면역 반응을 조정 및 개선 하는 능력을 제공한다.
게놈 길이의 증가는 삽입물의 길이에 일부 의존하여 얻은 RSV의 약독화를 초래한다. 또한, 유전자 위치이동된 RSV에 삽입된 비-RSV 유전자 유래의 어떤 단백질 (예를 들면, 사이토카인)의 발현은 단백질의 작용으로 인하여 바이러스의 약독화를 초래할 수 있다. 감염성 약독화 바이러스 표현형 및 RSV 감염 세포 유래의 고수준 사이토카인 발현을 야기하는 예시적인 사이토카인은 인터루킨-2 (IL-2), IL-4, GM-CSF 및
Figure 112002042527118-pct00002
-인터페론을 포함한다. 세포 및(또는) 체액 면역 반응의 증대를 포함하는 추가 효과는 또한 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV로의 사이토카인의 도입을 수반할 수 있다.
본 발명의 유전자 위치이동된 RSV 내의 결실, 삽입, 치환 및 전체 바이러스 유전자 또는 게놈 분절의 변화를 포함하는 다른 돌연변이에 의해 매우 안정한 백신 후보물이 생성되며, 이는 면역억제된 개체의 경우에서 특히 중요하다. 이러한 변화 중 많은 것들에 의해서는 생성된 백신 균주가 약독화되는 반면, 다른 변화에 의해서는 상이한 유형의 요망되는 표현형 변화가 규정된다. 예를 들면, 악세서리 (즉, 시험관내 성장에 필수적이지 않은) 유전자는 특이적으로 숙주 면역 반응을 방해하는 단백질을 코딩하기 위한 우수한 후보물이다 (예를 들면, 본원에 참고문헌으로 삽입된 문헌[Kato et al., EMBO. J. 16:578-87, 1997] 참조). 키메릭 백신 바이러스 중 이러한 유전자의 제거는 독성 및 병원성을 감소 및(또는) 면역원성을 개선하리라 예측된다.
본 발명의 유전자 위치이동된 재조합 RSV로 혼입시키기 위한, 상기 참고문헌 에 개시된 추가의 독립적인 뉴클레오티드 변형은 선택된 RSV 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 제거를 포함한다. 따라서, RSV NS1, NS2, N, P, M, G, F, SH, M2(ORF1), M2(ORF2) 및(또는) L 유전자의 오픈 리딩 프레임 및(또는) 시스 작용 조절 서열의 부분적 또는 완전한 결실을 포함하여, RSV 유전자 또는 게놈 분절이 결실될 수 있다. 한 예에서, SH mRNA 및 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제거하여 SH 유전자의 발현이 제거된 재조합 RSV를 생성하였다. SH 유전자의 결실은 단지 회수가능한 감염성 RSV를 생성할 뿐만 아니라, 감염성 바이러스의 수율 및 플라크 크기 모두에 기초하여 조직 배양시에 실질적으로 성장이 개선되는 것이다. 조직 배양시에 SH 결실에 의해 규정된 성장 개선은 예를 들어 배양시의 RSV 수율 불량이라는 문제를 극복함으로써, 유전자 위치이동된 RSV 백신을 개발하기 위한 유용한 도구를 제공한다. 또한, 이들 결실은 유전적 복귀변이에 대해 매우 안정적이어서, 이로부터 유도된 RSV 클론은 백신 물질로 특히 유용해진다.
또한, SH-마이너스 RSV 재조합체는 생쥐의 상기도에서 부위-특이적 약독화를 나타내고, 이는 백신 개발에 신규 잇점을 제공한다. 예를 들면, cp 돌연변이체와 같은 생 바이러스 백신으로서 평가할 때, 현재의 RSV 균주는 조직 배양시에 상당한 성장 변화를 보이지 않는다. 이들은 숙주 범위의 돌연변이며, 침팬지 및 인간의 기도에서는 복제가 제한되며 하기도에서는 약 100 배 제한된다. 다른 돌연변이 유형의 예인 ts 돌연변이는 상기도에서 하기도로 갈수록 체온이 점점 상승되기 때문에 하기도에서 우선적으로 바이러스 복제가 제한되는 경향이 있다. 이들 cp 및 ts 돌연변이체와 반대로, SH-마이너스 RSV 돌연변이체는 상기도에서 더욱 크게 제한되 는 독특한 표현형을 갖는다. 이는 상기도에서의 복제 제한이 주로 코를 통해 호흡하는 취약한 연령대의 구성원에서의 백신 투여에 대한 안정성을 보장하기 위해 요구되는 것이므로, 매우 어린 유아에게 사용하는 백신 바이러스에 특히 요망된다 또한, 모든 연령군에서 상기도에서의 복제 감소는 중이염의 이환율을 감소시킬 것이다. SH 결실 돌연변이는 이들 잇점 이외에도, 예를 들면 거의 400 nt를 포함하고 전체 mRNA가 제거되었다는 성질이 있으므로, 복귀변이에 크게 저항할 수 있는 유형의 돌연변이를 나타낸다. 예를 들어 F 및 G 당단백질 유전자 발현을 상향조절하는 동시에 유전자 위치이동을 지정하기 위한 "대체 폴리뉴클레오티드"로서 SH-마이너스 결실의 유용성은 하기의 예로부터 충분히 유추된다.
또한, SH 유전자 변형과 관련하여 논의되는 것은 유용한 RSV 재조합 백신을 생성하기 위한 추가의 도구 및 방법을 제공하기 위해 인간 및 소 RSV, 및 다른 폐렴바이러스를 포함하는 상이한 RSV 중의 SH 유전자들을 비교하는 것이다. 예를 들면, 2 개의 RSV 항원성 아군 A 및 B는 특정 SH 도메인에서 보존 정도가 상대적으로 높다. 이러한 2 개의 도메인에서, RNV A 및 B의 N-말단 영역 및 추정적 막-스패닝 도메인은 아미노산 수준에서 84% 동일성을 보이는 반면, C-말단의 추정 엑토도메인은 더욱 디버전트하다 (약 50% 동일성). 2 개의 인간 RSV 아군 B 균주인 8/60 및 18537을 비교하여, 단지 1 개의 아미노산만이 상이함을 확인하였다 [Anderson et al., 상기 문헌]. 인간 대 소 RSV의 SH 단백질은 약 40% 동일하고, (i) 보존된 잔기의 비대칭 분포; (ii) 매우 유사한 소수성 프로파일; (iii) 소수성 영역의 각 측면에 하나씩 있는 2 개의 N-연결 글리코실화 부위의 존재; 및 (iv) 각 SH 단백질의 중심 소수성 영역의 카르복시말단 측 상의 단일 시스테인 잔기를 포함하는 주요한 구조적 성질을 공유한다 [Anderson et al., 상기 문헌]. 이들 및 다른 서열들의 유사성 및 차이를 평가하여, 감염성 유전자 위치이동된 RSV 클론 내에 치환 또는 삽입될 수 있는 이종 서열(들)을 선택하여, 예를 들어 다중 특이적 면역원성 효과, 또는 별도로 또는 추가로, 약독화와 같은 요망되는 효과를 갖는 백신을 수득할 수 있다.
본 발명의 별법의 실시태양에서, 부분적 유전자 결실 또는 기타 제한된 뉴클레오티드 결실을 재조합 RSV 내로 유전자조작하여 요망되는 표현형 변화를 수득한다. 한 예에서, SH 유전자의 하류 비코딩 영역의 서열을 제거하여 RSV 게놈의 길이를 감소시킨다. 부분적 유전자 결실의 이러한 예는 G-F 유전자간 영역에 Xmal 부위를 함유하는 버전의 안티게놈 cDNA를 사용하여 제조하며, 이러한 변화 자체는 코딩되는 바이러스에 영향을 미치지 않을 것이라 예측된다. RSV/6120라 지칭되는 코딩된 바이러스는 SH ORF의 마지막 3 개 코돈 및 종결 코돈에 침묵 뉴클레오티드 치환이 있으며 SH 하류 비번역 영역에서 112 개 뉴클레오티드 (재조합 안티게놈에서 위치 4499 내지 4610)가 결실되어 있다. 이러한 결실에서 유전자-종결 신호 ([Bukreyev, et al., J. Virol 70:6634-41, 1996], 본원에 참고로 삽입됨)는 무손상인 채로 남게 된다 . 이들 점 돌연변이 및 112-nt 결실은 바이러스의 임의의 단백질이 코딩되는 아미노산을 변경시키지 않으면서 임의의 공지된 바이러스 RNA 신호를 차단하거나 코딩된 mRNA의 수를 변화시키지도 않는다.
상기 6120 바이러스를 이의 전장 대응체인 D53과 대등한 다단계 성장의 효율 에 대해 분석하였고, 최고 역가가 D53 바이러스의 경우에 비해 1.5 배 내지 2 배 더 높다는 것을 재현가능하게 밝혀냈다. 따라서, 112-nt 비코딩 서열의 SH 유전자에서 약간만 부분적 결실시키면, 시험관내 성장 효율이 실질적으로 증가된다.
본 발명의 재조합 RSV에서 다른 부분적 유전자 결실 및 약간의 뉴클레오티드 결실을 쉽게 유전자조작하여 (1) 시스-작용 RNA 신호에서 떨어져 있는 각종 ORF의 개시 및(또는) 말단부에 있는 비번역 서열, (2) 유전자간 영역, 및 (3) 프로모터 활성에 필수적이지 않은 3' 리더 및 5' 트레일러 영역에서의 뉴클레오티드 결실을 포함하여 바이러스 표현형을 변경시킨다. 결실 또는 삽입할 비번역 유전자 서열의 예는 NS1, NS2, P, M, F 및 M2 유전자의 하류 비번역 영역, 즉, 재조합 안티게놈에 따라 번호를 매기면, 각각 서열 위치 519 내지 563, 1003 내지 1086, 3073 내지 3230, 4033 내지 4197, 7387 내지 7539 및 8433 내지 8490이다. 또한, 추가의 예로서, NS1, NS2 및 SH 유전자의 상류 비번역 영역으로부터 각각 nt 55 내지 96, nt 606 내지 624, nt 4231 내지 4300을 결실시킬 수 있다. 본원에서 교시하는 바에 따라 이들 서열 중 1 개 이상에서 임의의 부분적 또는 완전한 결실을 달성하여 선택된 결실에 의해 규정되는 유익한 표현형 변화에 대해 쉽게 스크리닝할 수 있는 후보물을 제공할 수 있다. 이와 관련하여서는 RSV 게놈 내 추가의 비번역 영역 역시 유용하다. 유전자-개시 및 유전자-종결 신호가 맵핑되어 있으며 중요한 위치에 대해 특성화되어 있기 때문에 ([Kuo, et al., J. Virol., 71:4944-4953; 1997], [Harmon, et al., J. Virol., 75:36-44, 2001], 각각이 본원에 참고로 삽입됨), 1 개 또는 몇 개 (예를 들어, 3 내지 10 개, 10 내지 20 개, 20 내지 45 개)의 nt를 포함하는 결실 또는 변형이 고려될 수 있다. 몇몇 경우에서, 특이적인 추가의 잇점을 얻을 수 있다. 예를 들어, G 유전자에서 유전자-개시 신호의 1 개 nt 및 비번역 서열의 2 개 nt를 포함하는 nt 4683 내지 4685의 결실은 mRNA의 최초 AUG를 제거하여, 유의한 ORF를 개시하지는 않지만 G ORF를 개시하는 그 다음 AUG로부터 리보솜을 우회시킨다고 여겨진다. 또한, 이러한 결실은 GS 신호를 회복시키고 G ORF의 번역 개시 부위를 보유한다. 따라서, 변형시킬 비번역 부위는 게놈에 대한 지식을 바탕으로 선택하거나 무작위로 선택하여 본 발명의 방법으로 신속하게 시험할 수 있다.
유전자간 서열과 관련하여, 미니게놈을 이용한 연구는 전사 및 RNA 복제에 영향을 미치지 않고 유전자간 영역이 단일 nt로 감소되거나 모두 제거될 수 있음을 밝혀냈다. 균주 A2의 유전자간 영역은 응집체 내의 다른 207 nt를 나타낸다 (재조합 안티게놈의 NS2-N 유전자간 영역은 이의 생물학적 등가물보다 1 nt만큼 더 길도록 유전자 조작되었음): 예를 들어 본원에 참고문헌으로 삽입된 문헌[Collins, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11563-11567, 1995]을 참조한다.
RSV 5' 트레일러 영역의 길이는 155 nt이므로, 대부분의 모노네가바이러스의 상응하는 영역 보다 약 100 nt 더 길고 RSV 리더 영역 보다 111 nt 더 길다. 미니게놈을 사용한 연구를 통해, 이 서열의 대부분이 필수적이지 않으며 변형시킬 후보물임이 제안되었다 ([Kuo, et al., J. Virol., 70:6892-901, 1996], 본원에 참고로 삽입됨). 예를 들어, 5' 게놈 말단 (안티게놈 프로모터 포함하여, 안티게놈의 3' 말단을 코딩함)은 무손상인 채로, L 유전자 바로 다음의 트레일러 영역의 크기를 75 nt, 100 nt, 125 nt 이상 감소시킬 수 있다. 유사하게, 44 nt 리더 영역을 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 3' 리더 말단의 처음 11 개 nt가 바이러스 프로모터의 코어를 형성하므로, 리더 영역의 나머지 서열은 결실되거나 달리 변형될 수 있다.
본 발명의 특정 실시태양에서, NS1, NS2, SH, F 및 M2 유전자에 대해 상기 기술한 1 개 이상의 비번역 서열의 결실 (부분적 또는 완전한 결실)은 게놈 길이를 806 이하로 조정가능하게 감소시켜, 상기 예에서 기술한 112-nt 결실의 경우보다 7배 초과로 더 크게 감소시킬 수 있다. 처음 9 개 유전자 사이에서 1 곳 이상의 유전자간 영역을 부분적으로 또는 완전하게 결실 (예를 들어, 각각 1 nt라는 최소 길이로 결실시킴)시키면, 198 nt 이하의 추가의 조정가능한 결실을 초래할 것이다. 트레일러 및(또는) 리더로부터의 부분적 또는 완전한 결실으로 50, 75, 100 nt 이하가 추가로 결실될 수 있다. 따라서, 예를 들어 비번역 유전자 서열로부터의 806 nt, 유전자간 영역으로부터의 198 nt 및 트레일러로부터의 100 nt을 합하여 1104 nt의 응집체를 생성할 수 있으며, 이는 본원에 기술한 112-nt 결실 보다 거의 10배 더 많은 결실을 나타낸다 (또한, RSV 게놈의 7% 초과를 나타냄).
상기 삽입된 참고문헌에 기술된 다른 실시예에서, NS2 유전자의 번역 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내로 정지 코돈을 도입했을 때, NS2 유전자 발현이 제거되었다. 상기 NS2 녹-아웃 바이러스에서 감염성 바이러스의 방출 속도는 야생형에 비해 감소되었다. 또한, 돌연변이체 및 야생형 바이러스의 플라크를 비교하여, NS2 녹-아웃의 플라크는 크기가 크게 감소된 것으로 나타났다. 따라서, 이 유형의 돌연변이 는 유전자 위치이동된 생존가능한 재조합 RSV 내로 혼입되어 표현형을 변경시킬 수 있고, 이러한 경우에는 바이러스의 성장 속도가 느려지고 시험관내 플라크 크기가 감소한다. 따라서, 이들 및 다른 녹-아웃 방법 및 돌연변이체는 시험관내 플라크 크기 감소 및 생체내 약독화 사이의 공지된 관련성에 기초하여 또다른 재조합 RSV 백신 물질을 추가로 제공한다. 또한, NS2 유전자의 완전한 제거를 통해 NS2 유전자의 발현이 제거되어, 유사한 표현형의 바이러스가 생성되었다.
성공적으로 결실된 다른 RSV 유전자로는 NS1 및 M2-2 유전자 등이 있다. NS1은 각각의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제거하여 결실시켰고, M2-2는 프레임-이동 또는 번역 개시 부위를 변경하고 정지 코돈을 도입하여 결실시켰다. 흥미롭게도, 회수된 NS1-마이너스 바이러스는 조직 배양시에 NS2 결실 바이러스의 경우 만큼은 아니지만 작은 플라크를 생성한다. NS1-마이너스 바이러스가 효율이 감소되기는 하지만 성장할 수 있다는 사실을 통해 NS1 단백질이 바이러스 성장에 없어도 되는 악세서리 단백질임이 확인되었다. NS1-마이너스 바이러스의 플라크 크기는 NS2 단백질의 코딩 서열 내에 번역 종결 코돈을 도입하여 상기 NS2 단백질의 발현을 제거한 NS2 녹-아웃 바이러스의 경우와 유사하였다. 작은 플라크 표현형은 통상적으로 약독화 돌연변이와 연관된다. 따라서, 이러한 유형의 돌연변이는 생존가능한 재조합 RSV 내로 독립적으로 혼입되어 표현형을 변경시킨다. 따라서, 이들 및 다른 녹-아웃 방법 및 돌연변이체는 시험관내 플라크 크기와 생체내 약독화 사이의 공지된 관련성에 기초하여 또다른 유전자 위치이동된 재조합 RSV 백신 물질을 추가로 제공한다. NS2 녹-아웃 돌연변이체는 천연 침팬지에서 상기도에 서 적당히 약독화된 표현형을, 하기도에서 고도로 약독화된 표현형을 나타내었다. 또한, 이 돌연변이체는 침팬지에서 질병 증상을 크게 감소시키는 반면, 야생형 바이러스 침입에 대한 상당한 내성을 자극하였다 ([Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999], 본원에 참고문헌으로 삽입됨).
삽입된 참고문헌에 제공되고, 본 발명에 유용한 추가의 방법 및 조성물은 키메릭 게놈 또는 안티게놈 내의 시스-작용 조절 서열을 변화시키는 유전자 위치이동된 RSV 내의 상이한 뉴클레오티드 변형을 포함한다. 예를 들면, RSV G 당단백질의 분비 형태에 대한 번역 개시 부위가 결실되어 이러한 형태의 G 당단백질의 발현을 혼란시킬 수 있다. RSV G 단백질은 다음의 2가지 형태로 합성된다: 정착된 제II 완전한 막 단백질 형태 및 필수적으로 모든 막 정착부 없이 분비되는 N-말단 절단 형태 [Hendricks et al., J. Virol. 62:2228-2233, 1988]. 상기 2가지 형태는 다음의 2 가지 상이한 개시 부위에서 번역이 개시되어 유도되는 것임이 밝혀졌다: 더 긴 형태는 G ORF의 최초 AUG에서 개시되고, 다른 하나는 코돈 48에 있는 ORF의 2번째 AUG에서 개시되어 단백분해에 의해 더 가공된다 [Roberts et al., J. Virol. 68:4538-4546, 1994]. 상기 2번째 개시 부위의 존재는 고도로 보존되어, 오늘날까지 서열분석된 인간, 소 및 양 RSV의 모든 균주에 존재한다. G 단백질의 수용성 형태는 중화 항체를 트래핑하기 위한 유인물로 작용하여 숙주 면역을 완화할 수 있다고 제안되었다. 또한, 수용성 G는 Th2-바이어스된 반응의 우선 자극에 포함되고, 이는 차례로 이후에 RSV에의 노출에 대한 면역병리 증가와 연관되어 있는 것으로 여겨진다. RSV 백신 바이러스와 관련하여, 항체 트래핑 또는 면역계의 불균형 적 자극을 최소화하는 것이 매우 요망되고, 분비 형태의 G 단백질 발현을 제거하는 것이 바람직할 것이다. 이는 재조합 바이러스에서 달성된 바 있다. 따라서, 이 돌연변이는 바이러스를 직접 약독화시키기 보다 재조합 바이러스에 의해 유발되는 숙주 면역 반응을 정성적으로 및(또는) 정량적으로 변경시키는데 특히 유용하다.
또한, 삽입된 참고문헌은 예시적인 유전자 (예를 들면, NS1 및 NS2)의 시스 작용 전사 신호 변경을 통한 재조합 RSV의 표현형 조정에 관해 기술하고 있다. 이들 뉴클레오티드 변형의 결과는 시스 조절 요소의 변경을 통한 유전자 발현의 변형과 일치되어, 예를 들면, 번역불가능한(readthrough) mRNA 수준을 감소시키고, 하류 유전자로부터의 단백질 발현을 증가시킨다. 얻어진 재조합 바이러스는 바람직하게는 성장 속도의 증가 및 플라크 크기의 증가를 나타낼 수 있다. 시스 작용 조절 서열에 대한 변형의 예는 RSV 유전자와 연관된 유전자 종결 (GE) 및 유전자 개시 (GS) 신호에 대한 변형을 포함한다. 이와 관련한 변화의 예는 이들 신호가 RSV N 유전자의 천연 발생적 GE 신호와 동일하게 되게 하는 NS1 및 NS2 유전자의 GE 신호의 변경을 포함한다. 얻어진 재조합 바이러스는 성장 속도 및 플라크 크기의 증가를 나타내기 때문에, 유전자 위치이동된 RSV 백신 후보물의 표현형을 유익하게 변형하는 또다른 방법을 제공한다.
또한, 상기 삽입된 참고문헌에서 제공하는 방법 및 조성물은 RSV 아군 A 및 B 모두로부터의 서열을 포함하여 약독화된 유전자 위치이동된 RSV 백신 바이러스의 제조를 가능하게 하여 예를 들면, RSV A 또는 B 백신 또는 2가 RSV A/B 백신을 얻는다 (예를 들면, 본원에 참고문헌으로 삽입하고 있는 1999년 4월 13일 콜린스 등 에 의해 출원된 미국 특허 출원 제09/291,894호 참조). 이와 관련하여, 본 발명을 추가로 확대하여, 키메라 RSV A/B 바이러스 내로 혼입되는 구체적 약독화 돌연변이는 다음을 포함한다: (i) 5개 cp 돌연변이 중 3개, 즉 N (V2671)의 돌연변이, L (C319Y 및 H1690Y)의 2개 돌연변이, 그러나 F의 2개 돌연변이는 이들이 B1 F 유전자로 치환에 의해 제거되었으므로 아님; (ii) 248 (Q831L), 1030 (Y1321N) 및 임의로는, 약독화 균주 A2 바이러스에서 확인되는 404-L (D1183E) 돌연변이; (iii) M2 유전자의 유전자 개시 신호 중 위치 9에서의 단일 뉴클레오티드 치환, 및 (iv) SH 유전자의 결실. RSV A 및(또는) RSV B 유전자 또는 게놈 분절을 수반하는 유전자 위치이동된 RSV에서의 즉시 입수가능한 다른 돌연변이는 NS1, NS2, G 또는 M2-2 유전자 결실, 및 530 및 1009 돌연변이 단독 또는 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 상세한 측면에서, 유전자 위치이동된 RSV는 다른 RSVs 및 비-RSV 바이러스 및 비-바이러스 병원체를 포함하여 이종 병원체의 보호적 항원에 대한 "벡터"로 이용된다. 이러한 측면에서, 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈은 1 이상의 이종 병원체의 항원 결정기 1 이상을 코딩하는 1 이상의 이종 유전자 또는 게놈 분절과 결합된 부분적 또는 완전한 RSV "벡터 게놈 또는 안티게놈"을 포함한다 (예를 들면, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입된 미국 가출원 제60/170,195호; 미국 특허 출원 제09/458,813호; 및 미국 특허 출원 제09/459,062호를 참조). 이와 관련한 이종 병원체는 상기 확인한 RSV 단백질 뿐만 아니라 단백질 도메인, 단편 및 이의 면역원성 영역 또는 에피토프를 코딩하도 록 선택될 수 있는 이종 RSV (예를 들면, 상이한 RSV 균주 또는 아군) 및 이종 유전자(들) 또는 게놈 분절일 수 있다. 따라서, 구성되는 RSV 벡터 백신은 다중특이적 면역 반응을 유발할 수 있고, 다른 백신 물질과 동시에 또는 대등 투여 프로토콜로 투여될 수 있다.
다른 병원체에 대한 벡터로 엔지니어링된 유전자 위치이동된 RSV는 HRSV A 또는 HRSV B로부터 선택되는 이종 HRSV를 포함하는 1 이상의 이종 RSV의 항원 결정기(들)을 코딩하는 1 이상의 이종 유전자 또는 게놈 분절을 혼입하도록 변형 또는 결합된 부분적 또는 완전한 HRSV 게놈 또는 안티게놈인 벡터 게놈 또는 안티게놈을 포함할 수 있다. 별도의 측면에서, 벡터 게놈 또는 안티게놈은 부분적 또는 완전한 HRSV 게놈 또는 안티게놈이고, 항원 결정기(들)을 코딩하는 이종 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)은 1 이상의 비-RSV 병원체의 것이다. 벡터 게놈 또는 안티게놈은 약독화를 규정하는 BRSV의 1 이상의 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)을 혼입할 수 있다. 별법으로, 벡터 바이러스는 1 이상의 HRSV 유전자 또는 게놈 분절을 혼입한 부분적 또는 완전한 BRSV 배경 게놈 또는 안티게놈을 포함할 수 있고, 여기서 유전자 위치이동된 RSV 벡터 바이러스는 비-RSV 병원체의 항원 결정기를 코딩하는 1 이상의 공여체 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)을 포함하도록 변형된다.
따라서, 본 발명의 특정 상세한 측면에서 유전자 위치이동된 RSV는 일정 범위의 비-RSV 병원체에 대한 벡터로서 제공된다 (예를 들면, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입된 미국 가출원 제60/170,195호; 미국 특허 출원 제09/458,813호; 및 미국 특허 출원 제09/459,062호를 참조). 본 발명의 이들 측면에 사용되는 벡터 게 놈 또는 안티게놈은 각각 이종 HRSV 또는 BRSV 유전자 또는 게놈 분절을 혼입한 부분적 또는 완전한 BRSV 또는 HRSV 게놈 또는 안티게놈을 포함할 수 있고, 이종 병원체는 홍역 바이러스, 아군 A 및 아군 B 호흡기 신시티움 바이러스, HPIV1, HPIV2, HPIV3, 유행성 이하선염 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 제1형 및 제2형 인간 면역결핍 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 광견병 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 필로바이러스, 분야바이러스, 플라비바이러스, 알파바이러스 및 인플루엔자 바이러스로부터 선택될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV를 구성하기 위한 HRSV 또는 BRSV 벡터 게놈 또는 안티게놈은 홍역 바이러스 HA 및 F 단백질, 또는 이의 항원성 도메인, 단편 및 에피토프로부터 선택되는 이종 항원 결정기(들)을 혼입할 수 있다. 예시적 실시태양에서, 홍역 바이러스 HA 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)를 포함하는 전사 단위는 BRSV 또는 HRSV3 벡터 게놈 또는 안티게놈에 첨가 또는 혼입된다. 별법으로, 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV는 예를 들면, HPIV1, HPIV2 또는 HPIV3 HN 또는 F 당단백질 또는 이의 면역원성 도메인(들) 또는 에피토프(들)을 코딩하는 1 이상의 유전자 또는 게놈 분절을 혼입하는 것에 의해 파라인플루엔자 바이러스 (PIV) 유래의 이종 항원 결정기(들)을 혼입하기 위한 벡터로 사용될 수 있다.
유전자 위치이동된 RSV를 제조하기 위하여 이종 면역원성 단백질, 도메인 및 에피토프를 도입하는 것은 면역화된 숙주에서 신규 면역 반응을 일으키는데 특히 유용하다. 예를 들면, 상이한 RSV 아군 또는 균주의 수용체 게놈 또는 안티게놈 내의 1개의 공여체 RSV 아군 또는 균주 유래의 면역원성 유전자 또는 게놈 분절의 첨가 또는 치환은 공여체 아군 또는 균주, 수용체 아군 또는 균주에 대하여, 또는 공여체 및 수용체 아군 또는 균주 모두에 대하여 직접 면역 반응을 일으킬 수 있다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 유전자 위치이동된 RSV는 또한 상이한 RSV의 엑토도메인에 융합된 1개의 RSV에 특이적인 세포질 테일 및(또는) 막통과 도메인을 갖는 키메라 단백질 (예를 들면, 면역원성 당단백질)을 발현하는 구성으로 하여 예를 들면, 인간-소 융합 단백질 또는 2 개의 상이한 인간 RSV 아군 또는 균주 유래의 도메인을 혼입한 융합 단백질을 제공할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈은 인간 및 소 모두의 당단백질 도메인 또는 면역원성 에피토프를 갖는 재조합 바이러스 또는 서브바이러스 입자에서 키메라 당단백질을 코딩한다. 예를 들면, 인간 RSV F, SH 또는 G 당단백질로부터의 당단백질 엑토도메인을 코딩하는 이종 게놈 분절은 상응하는 소 F, SH 또는 G 당단백질 세포질 및 엔도 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (즉, 게놈 분절)과 결합되어 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성할 수 있다.
한 실시태양에서, 백신 제제에 유용한 유전자 위치이동된 RSV는 편리하게 변형되어 순환 바이러스에 항원 드리프트를 수용할 수 있다. 전형적으로 변형은 G 및(또는) F 단백질에 존재할 수 있다. 1개의 RSV 균주 유래, 특히 그 면역원성 영역을 코딩하는 전체 G 또는 F 유전자, 또는 게놈 분절은 다수의 항원 형태를 대표하도록, 상이한 RSV 균주 또는 아군의 수용체 클론 중의 상응하는 영역의 대체에 의하여, 또는 유전자의 1 이상의 카피를 첨가하는 것에 의해 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈 cDNA로 혼입된다. 이어서, 변형된 RSV로부터 제조되는 후손 바이러스는 드러난 RSV 균주에 대한 예방접종 프로토콜에 사용될 수 있다.
본 발명의 여러 추가 실시태양은 목적하는 공여체 유전자의 일부만을 수용체 유전자 위치이동된 RSV 게놈 또는 안티게놈으로 첨가 또는 치환하는 것을 포함한다. 통상적으로, 시스-작용 조절 요소 및 유전자간 서열과 같은 비코딩 뉴클레오티드는 공여체 유전자 코딩 영역으로 전달되는 것을 요하지 않는다. 따라서, 특정 유전자의 코딩 서열 (예를 들면, 부분적 또는 완전한 오픈 리딩 프레임 (ORF))는 공여체 서열과 비교하여 대응 유전자 또는 상이한 유전자의 이종 프로모터 (예를 들면, 배경 게놈 또는 안티게놈에 존재하는 프로모터)의 조절하에 부분적 또는 완전한 배경 게놈 또는 안티게놈에 첨가 또는 치환될 수 있다. 다양한 추가 게놈 분절이 키메라 게놈 또는 안티게놈 내에 함유되기 위한 유용한 공여체 폴리뉴클레오티드를 제공하여 신규하고 유용한 성질을 갖는 유전자 위치이동된 RSV를 발현한다. 예를 들면, 이종 게놈 분절은 인간 또는 소 RSV 유래의 선택된 단백질의 당단백질 세포질 테일 영역, 막통과 도메인 또는 엑토도메인, 에피토프 부위 또는 영역, 결합 부위 또는 결합 부위를 포함하는 영역, 활성 부위 또는 활성 부위를 포함하는 영역의 일부 또는 모두를 코딩할 수 있다. 이들 및 다른 게놈 분절은 대응 게놈 분절에 대하여 완전한 배경 게놈 또는 안티게놈 또는 그 중 치환된 것에 첨가되어 신규 키메라 RSV 재조합체를 얻을 수 있다. 특정 재조합체는 키메라 단백질, 예를 들면 다른 RSV의 엑토도메인에 융합된 1개의 RSV의 세포질 테일 및(또는) 막통과 도메인을 갖는 단백질을 발현할 것이다.
본 발명의 유전자 위치이동된 RSV에 사용하기 위한 유전자 및 게놈 분절은 일정 범위의 크기 및 서열 변이를 갖는 교대 폴리뉴클레오티드의 집합을 포함한다. 이와 관련하여 유용한 게놈 분절은 단백질의 작은 기능적 도메인 (예를 들면, 에피토프 부위)를 코딩하는 게놈 분절의 경우 약 15-35 뉴클레오티드 내지 더 큰 도메인 또는 단백질 영역을 코딩하는 게놈 분절에 대한 약 50, 75, 100, 200-500 및 500-1,500 이상의 뉴클레오티드의 범위이다. 대응 유전자 및 게놈 분절의 선택은 대상 대응물 간의 게놈에서 서열 동일성 또는 선형 상관성에 의존한다. 이와 관련하여, 선택된 인간 또는 소 폴리뉴클레오티드 "참고 서열"은 공여체 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈 중에 존재하는 서열 또는 그 일부로 정의된다. 이 참고 서열은 정의된 서열로 사용되어 대응 이종 서열과의 서열 비교에 대한 이론적 기초를 제공한다. 예를 들면, 참고 서열은 cDNA 또는 유전자의 분절, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열로 정의될 수 있다. 일반적으로, 대응 유전자 및 게놈 분절을 정의하는데 사용되는 참고 서열은 길이가 20 뉴클레오티드 이상, 종종 길이가 25 뉴클레오티드 이상, 흔히 길이가 50 뉴클레오티드 이상이다. 2 폴리뉴클레오티드가 각각 (1) 2 뉴클레오티드 간에 유사한 서열 (즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 일부)를 포함할 수 있고, (2) 2 폴리뉴클레오티드 간에 디버전트한 서열을 더 포함할 수 있으므로, 2 (이상) 폴리뉴클레오티드 간의 서열 비교는 통상적으로 "비교 윈도우"에 대하여 2 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교하여 수행되어 국소적 영역의 서열 유사성을 확인 및 비교한다. 본원에서 사용된 "비교 윈도우"는 폴리뉴클레오티드 서열이 20 이상의 연속 뉴클레오티드의 참고 서열과 비교될 수 있고, 비교 윈 도우에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부가 2 서열의 최적 정렬에 대하여 (첨가 또는 결실을 포함하지 않는) 참고 서열과 비교하여 20 퍼센트 이하의 첨가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있는 20 이상의 연속적 뉴클레오티드 위치의 개념적 분절을 지칭한다. 비교 윈도우를 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 국소적 상동성 알고리즘에 의해서 (Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981), 상동성 정렬 알고리즘에 의해서 (Needleman & Wunsh, J. Mol. Biol. 48:443, 1970), 유사법 검색에 의해서 (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1998) (각각은 본원에 참고문헌으로 삽입됨), 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해서 (본원에 참고로 삽입된 Wisconsin Genetic Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 검열에 의해서 수행될 수 있으며, 다양한 방법에 의해 생성되는 최적 정렬 (즉, 비교 윈도우에 의해서 가장 높은 퍼센트의 서열 유사성이 얻어지는 것)이 선택된다. "서열 동일성"이라는 용어는 2 폴리뉴클레오티드 서열이 비교 윈도우에 의해 동일 (즉, 뉴클레오티드-뉴클레오티드 기초 상에서)함을 의미한다. "서열 동일성의 퍼센트"라는 용어는 비교 윈도우에 대하여 2개의 최적 정렬 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기 (예를 들면, A, T, C, G, U 또는 I)가 양 서열에서 발생하는 위치의 수를 확인하여 일치되는 위치의 수를 산출하고, 일치되는 위치의 수를 비교 윈도우의 총 위치 수 (즉, 윈도우 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 산출하는 것에 의해 계산된다.
예를 들면 2 개의 상이한 인간 RSVs 또는 소 및 인간 RSV 간의 상응하는 잔 기 위치는 디버전트하거나, 동일할 수 있거나, 보존적 아미노산 치환에 의해 달라질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환성을 지칭한다. 예를 들면, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산의 보존적 군은 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이며; 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산의 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군은 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다. 20 개의 보존적 아미노산의 입체이성질체 (예를 들면, D-아미노산), α,α-이치환된 아미노산과 같은 비천연 아미노산, N-알킬 아미노산, 젖산 및 다른 비통상적인 아미노산 또한 본 발명의 폴리펩티드에 적당한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 4-히드록시프롤린,
Figure 112002042527118-pct00003
-카르복시글루타메이트,
Figure 112002042527118-pct00004
-N,N,N-트리메틸리신,
Figure 112002042527118-pct00005
-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시리신,
Figure 112002042527118-pct00006
-N-메틸아르기닌 및 다른 아미노 및 이미노산 (예를 들면, 4-히드록시프롤린)을 포함한다. 게다가, 아미노산은 글리코실화, 포스포릴화 등에 의해 변형될 수 있다.
본 발명은 다양한 재조합, 유전자 위치이동된 RSV 바이러스 및 서브바이러스 입자를 구성하는 cDNA-기재 방법을 사용한다. 이들 재조합 RSV는 백신 작용제로서 의 용도에서 약독화 및 면역원성의 개선된 특성을 제공한다. 유전자 위치이동된 RSV로 조작된 원하는 표형형 변화는 배양 또는 선택된 숙주 환경에서 약독화, 약독화된 표현형으로부터 복귀변이에 대한 내성, 증가된 면역원성 특성 (예를 들어, 도출된 면역 반응의 증가 또는 감소에 의해 결정된 바와 같음), 선택된 바이러스 생성물 등의 전사 및(또는) 번역의 상향조절 또는 하향조절을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 약독화되고 유전자 위치이동된 RSV를 약독화된 표현형을 규정하는 하나 이상의 약독화된 돌연변이를 도입하여 추가로 변형시킨 키메릭 게놈 또는 안티게놈에서 제조하였다. 이들 돌연변이체를 드 노보로 생성시키고 상기 인용된 참고문헌에 기재된 합리적인 디자인 돌연변이 유발 전략에 따라 약독화 효과에 대해 시험할 수 있다. 별법으로, 약독화 돌연변이체를 생물학적으로 유도된 돌연변이 RSV에서 확인할 수 있고 따라서 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV로 혼입할 수 있다.
유전자 위치이동된 RSV 백신 균주 내에 혼입시키기 위해 생물학적으로 유도된 RSV에서 약독화된 돌연변이체는 자연적으로 발생할 수 있거나 공지된 돌연변이 유발법에 의해 야생형 RSV 균주로 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 불완전하게 약독화된 부모 RSV 균주를 세포 배양으로 바이러스를 성장시키는 동안 화학적 돌연변이 유발법으로 생성할 수 있는데, 이 때 화학적 돌연변이원을 성장 제한 돌연변이를 도입하기 위해 준최적 온도에서 계대를 수행한 바이러스 선택에 의해 또는 세포 배양에서 작은 플라크 (sp)를 생성하는 돌연변이 유발된 바이러스의 선택에 의해 첨가하였다 (본원에 참고문헌으로 인용된 1999년 7월 13일 공고된 USSN 미국 특허 제5,922,326호 및 본원에 일반적으로 개시된 바와 같음).
"생물학적으로 유도된 RSV"는 재조합적 방법에 의해 제조된 것 외의 모든 RSV를 의미한다. 따라서, 생물학적으로 유도된 RSV는 예를 들면, 야생형 게놈 서열을 갖는 자연적으로 발생된 RSV 및 참고 야생형 RSV 서열로부터의 게놈 변이를 갖는 RSV, 예를 들면 약독화된 표현형을 규정하는 돌연변이를 갖는 RSV를 포함하는 모든 아군 및 균주의 자연적으로 발생된 RSV를 포함한다. 마찬가지로, 생물학적으로 유도된 RSV는 그 중에서도 특히 인공적 돌연변이 유발법 및 선택 과정에 의해 부모 RSV 균주로부터 유도되는 RSV 돌연변이체를 포함한다.
생물학적으로 유도된 균주로부터 충분히 약독화된 RSV를 제조하기 위해서, 공지된 ts-1 또는 ts-1NG 또는 RSV 아군 A의 A2 균주 cpRSV 돌연변이체, 또는 그의 유도체 또는 서브클론과 같은 불충분하게 또는 부분적으로 약독화된 부모 균주내로 돌연변이체를 도입하는 것이 바람직하다. 이들 및 다른 부분적으로 약독화된 균주를 사용하여, 예를 들면 포유동물 숙주에서 원하는 수준의 복제 제한까지 균주를 더 약독화시키는 반면, 백신 접종자에 보호를 제공할만큼 충분한 면역원성을 유지하는 추가 돌연변이체를 발생시킬 수 있다.
아군 A 또는 B 바이러스의 부분적으로 약독화된 돌연변이체는 공지된 방법의 허용가능한 세포 기질에서 야생형 바이러스의 생물학적 클로닝 및 개발 (예를 들면, 이의 저온 계대 배양 돌연변이체), 바이러스를 화학적 돌연변이유발법으로 ts 돌연변이체를 제조 또는 작은 플라크 또는 유사한 표현형 돌연변이체의 선택 (예를 들면, 본원에 참고문헌으로 삽입된 머피 (Murphy) 등의 국제 특허 공개 제93/21310 호 참조)에 의해 제조될 수 있다. 아군 B의 바이러스에 대하여, 예시적인 부분적으로 약독화된 부모 바이러스는 아군 B의 B1 균주의 돌연변이체인 cp23이다.
다양한 공지된 선택 기술을 결합하여 비-약독화된 아군 A 또는 B 균주로부터 부분적으로 약독화된 돌연변이체를 제조할 수 있고, 이는 본원에 기술된 바와 같이 추가 유도화에 유용하다. 추가로, 약독화된 표현형을 규정하는 돌연변이는 불충분하게 약독화된 아군 A 또는 B 바이러스에서 개별적으로 또는 함께 도입되어 원하는 수준의 약독화 및 면역원성을 백신 접종자에게 부여하는 다중 한정 약독화 돌연변이를 갖는 백신 바이러스를 제조할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 충분히 약독화된 생물학적으로 유도된 RSV 돌연변이체의 제조는 다수의 공지된 방법에 의해 달성할 수 있다. 이러한 하나의 과정은 부분적으로 약독화된 바이러스를 점진적으로 낮은 약독화 온도의 세포 배양에서 계대 배양하는 것과 관련된다. 예를 들면, 야생형 바이러스가 통상적으로 약 34 내지 37 ℃에서 배양되는 반면, 부분적으로 약독화된 돌연변이체는 준최적 온도 (예를 들면, 20 내지 26 ℃)에서 세포 배양 (예를 들면, 일차 소 신장 세포)으로 계대 배양하여 제조한다. 따라서, cp 돌연변이체 또는 다른 부분적으로 약독화된 균주 (예를 들면, ts-1 또는 spRSV)는 약 20 내지 24 ℃, 바람직하게는 20 내지 22 ℃까지 온도를 낮추어, MRC-5 또는 Vero 세포의 계대 배양에 의해 더 낮은 온도에서 효과적으로 성장하도록 적응된다. 저온 계대 배양 도중의 이러한 돌연변이체 RSV의 선택은 부분적으로 약독화된 부모형과 비교하여 유도체 균주에서 모든 잔류 독성을 실질적으로 감소시킨다.
별법으로, 부분적으로 약독화된 부모 바이러스를 예를 들면 ts 돌연변이를 도입하기 위한 화학적 돌연변이유발에 의해서, 또는 이미 ts가 있는 바이러스의 경우에는 약독화된 유도체의 ts 표현형에 증가된 약독화 및(또는) 안정도를 부여하기에 충분한 추가 ts 돌연변이에 의해 생물학적으로 유도된 RSV로 특이적 돌연변이를 도입할 수 있다. ts 돌연변이를 RSV로 도입하는 방법은 약 10-3 내지 10-5 M, 바람직하게는 약 10-4 M 농도의 5-플루오로우리딘 또는 5-플루오로우라실과 같은 돌연변이원의 존재하에서의 바이러스 복제, 문헌 [Gharpure et al., J. Virol. 3:414-421, 1969] 및 [Richardson et al., J. Med. Virol. 3:91-100, 1978]에 기술된 일반적 과정에 따라 약 100 ㎍/ml의 농도로 니트로소구아니딘에 바이러스 노출, 또는 특이적 ts 돌연변이를 유전적 도입하는 것을 포함한다. 다른 화학적 돌연변이원을 또한 사용할 수 있다. 거의 모든 RSV 유전자 중의 ts 돌연변이로부터 약독화가 발생할 수 있지만, 이러한 목적으로 수용가능한 표적은 특히 중합효소 (L) 유전자임을 발견하였다.
본 발명에 사용하기 위한 예시적 약독화된 RSV에서 복제 온도 민감성의 수준은 여러 제한적 온도에서의 복제와 허용 온도에서의 복제를 비교하여 결정한다. 허용 온도에서의 복제와 비교하여 바이러스의 복제를 100 배 이상 감소시키는 가장 낮은 온도를 셧오프 (shutoff) 온도라 부른다. 실험 동물 및 인간에서, RSV의 복제 및 병독성은 모두 돌연변이체의 셧오프 온도와 관련이 있다. 39 ℃의 셧오프 온도를 갖는 돌연변이체의 복제는 적당히 제한되는 반면, 38 ℃의 셧오프를 갖는 돌연변이체는 상당히 적게 복제되고, 질병 증상은 상기도에 주로 한정된다. 35 ℃ 내지 37 ℃의 셧오프 온도를 갖는 바이러스는 전형적으로 침팬지에서 충분히 약독화되고, 인간에서 실질적으로 약독화될 수 있다. 따라서, ts인 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV 및 약독화된 생물학적으로 유도된 돌연변이체는 약 35 ℃ 내지 39 ℃, 바람직하게는 35 ℃ 내지 38 ℃의 셧오프 온도를 가질 수 있다. ts 돌연변이를 부분적으로 약독화된 균주에 첨가하는 것은 본 발명의 백신 조성물에 유용한 다중 약독화 바이러스를 생성한다.
비강내 투여용 후보 백신인 다수의 약독화된 RSV 균주는 화학적 돌연변이유발을 여러 회 사용함으로써 개발하여 저온 계대 배양 도중에 이미 약독화된 바이러스 내로 다중 돌연변이체를 도입하였다 (예를 들면, [Connors et al., Virology 208:478-484, 1995]; [Crowe et al., Vaccine 12:691-699, 1994]; 및 [Crowe et al., Vaccine 12:783-790, 1994], 본원에 참고문헌으로 인용됨). 설치류, 침팬지, 성인 및 소아에서의 평가는 특정 상기 후보 백신 균주가 비교적 유전적으로 안정하며, 매우 면역원성이고, 충분히 약독화될 수 있음을 보여준다. 이들 약독화 바이러스 일부의 뉴클레오티드 서열 분석은 증가된 약독화의 각 수준이 구체적 뉴클레오티드 및 아미노산 치환과 연관되어 있음을 지시한다. 상기 인용된 참고문헌은 또한 감염성 RSV 클론의 게놈 또는 안티게놈 내에 개별적으로 및 다양한 조합으로 돌연변이를 도입하여 표현형 차이에 의한 돌연변이와 사일런트(silent) 우연적 돌연변이를 통상적으로 어떻게 구분하는지를 개시한다. 부모형 및 유도체 바이러스의 표현형 특성의 평가와 결합된 상기 과정은 약독화, 온도 민감성, 저온 적응, 작 은 플라크 크기, 숙주 범위 제한 등과 같은 원하는 특성에 의한 돌연변이를 확인한다.
따라서, 확인된 돌연변이를 "메뉴"로 편집한 후, 유전자 위치이동된 RSV 백신 바이러스를 적합한 수준의 약독화, 면역원성, 약독화된 표현형으로부터의 복귀변이에 대한 유전적 내성 등을 보정하기 위해 바람직하게는 단일적으로 또는 함께 도입시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 키메릭 RSV는 생물학적으로 유도된 돌연변이체 RSV 균주의 패널 내의 공지된 돌연변이의 군으로 정의할 수 있는, 상기 메뉴로부터 확인되는 1 개 이상, 더 바람직하게는 2 개 이상의 약독화 돌연변이체의 혼입에 의해 약독화된다. 본원에 기술되는 돌연변이체 RSV 균주의 바람직한 패널은 저온 계대 배양 (cp) 및(또는) 온도 민감성 (ts) 돌연변이체, 예를 들면, cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542) 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579) (이들 각각은 미국 20110-2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 블러바드의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)에 부다페스트 조약의 규정하에 기탁되고, 상기 확인된 수탁 번호를 부여받았다)로 지정된 RSV 돌연변이체를 포함하는 패널이다.
생물학적으로 유도된 돌연변이체의 이러한 예시적 패널로부터, 백신용의 재조합 유전자 위치이동된 RSV에서 약독화 수준을 보정하기 위한 패널 내의 모든 다른 돌연변이(들)과 각각이 결합될 수 있는 많은 메뉴의 약독화 돌연변이가 제공된 다. 추가 돌연변이는 예를 들면, 작은 플라크 (sp), 저온 적응 (ca) 또는 숙주 범위 제한 (hr) 돌연변이체 균주에서 확인되는 바와 같이 비-ts 및 비-cp 약독화 돌연변이를 갖는 RSV 로부터 유도할 수 있다. 약독화 돌연변이는 공여체 또는 수용체 RSV 유전자의 코딩 부분, 또는 시스-조절 서열과 같은 비코딩 영역에서 선택될 수 있다. 예를 들면, 약독화 돌연변이는 뉴클레오티드 7605에서의 M2 유전자 개시 서열 중의 단일 또는 다중 염기 치환에 의해 예시되는 바와 같이 유전자 개시 서열에서의 단일 또는 다중 염기 변화를 포함한다.
백신용으로 설계되고 선택된 유전자 위치이동된 RSV는 종종 2 개 이상, 때로는 3 개 이상의 약독화 돌연변이를 가져서 광범위한 임상적 용도에 대해 충분한 수준의 약독화를 달성한다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 약독화 돌연변이가 RSV 중합효소 유전자 (공여체 또는 수용체 유전자)에서 발생하고, 온도 민감성 (ts) 표현형을 규정하는 중합효소 단백질에서의 아미노산 변화를 규정하는 뉴클레오티드 치환을 포함한다. 이와 관련된 유전자 위치이동된 RSV는 Phe521을 Leu로, Gln831을 Leu로, Met1169를 Val로, Tyr1321을 Asn으로의 변화에 의해 예시되는 바와 같이 아미노산 Asn43, Phe521, Gln831, Met1169 또는 Tyr1321에서 아미노산 변화를 일으키는 대형 중합효소 유전자 L의 하나 이상의 뉴클레오티드 치환체를 혼입한다. 별법으로 또는 추가로, 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV는 상이한 RSV 유전자 (예를 들면, M2 유전자) 중에 ts 돌연변이를 혼입할 수 있다. 바람직하게는, 2 개 이상의 뉴클레오티드 변화가 약독화 돌연변이를 규정하는 코돈 (예를 들면, ts 돌연변이를 규정하는 코돈) 중에 혼입되어, 약독화 표현형으로부터의 복귀변이의 가능성 을 감소시킨다.
본 발명의 방법에 따라, 생물학적으로 유도된 돌연변이 RSV 균주의 패널 내에 존재하는 약독화 돌연변이의 전체 상보체 하나 이상 및 그 이하를 혼입하는 유전자 위치이동된 RSV는 쉽게 구성되고, 특성화된다. 따라서, 돌연변이는 선택된 돌연변이의 패널, 예를 들면 cpts RSV 248 (ATCC VR 2450), cpts RSV 248/404 (ATCC VR 2454), cpts RSV 248/955 (ATCC VR 2453), cpts RSV 530 (ATCC VR 2452), cpts RSV 530/1009 (ATCC VR 2451), cpts RSV 530/1030 (ATCC VR 2455), RSV B-1 cp52/2B5 (ATCC VR 2542) 및 RSV B-1 cp-23 (ATCC VR 2579)로부터의 임의의 조합으로 조립할 수 있다. 상기 방법에서, 재조합 백신 후보물의 약독화는 혈청 음성 유아를 포함하는 하나 이상의 군의 환자에 사용하기 위해 세밀하게 보정할 수 있다.
더 구체적인 실시태양에서, 백신용 유전자 위치이동된 RSV는 RSV 중합효소 유전자 L 중에 Asn43, Phe521, Gln831, Met1169 또는 Tyr1321에서 온도 민감성 및(또는) 약독화 아미노산 치환, 또는 유전자 M2의 유전자 개시 서열 중에 온도 민감성 뉴클레오티드 치환을 규정하는 약독화 돌연변이 하나 이상 및 충분한 수 이하를 혼입한다. 별법으로 또는 추가로, 본원 청구항의 유전자 위치이동된 RSV는 예를 들면, RSV N 유전자 중의 Val267, RSV F 유전자 중의 Glu218 또는 Thr523, RSV 중합효소 유전자 L 중의 Cys319 또는 His1690에서 아미노산 치환을 규정하는 하나 이상의 돌연변이와 같은 저온 계대 배양 약독화 RSV 유래의 돌연변이 배양 및 충분한 수 이하를 혼입한다.
다른 상세한 실시태양에서, 본 발명의 유전자 위치이동된 RSV는 추가로 변형 되어 (i) RSV 중합효소 유전자 L 중에 Gln831을 Leu로, 및 Tyr1321을 Asn으로의 온도 민감성 아미노산 치환을 규정하는 돌연변이의 패널; (ii) 유전자 M2의 유전자 개시 서열 중의 온도 민감성 뉴클레오티드 치환; (iii) RSV N 유전자 중의 Val267 Ile, 및 RSV 중합효소 유전자 L 중의 Cys319 Tyr 및 His1690 Tyr 아미노산 치환을 규정하는 저온 계대 배양 RSV로부터 채택되는 돌연변이체의 약독화 패널; 또는 (iv) RSV SH, NS1, NS2, G 및 M2-2 유전자의 하나 이상의 발현의 결실 또는 제거로부터 선택되는 약독화 돌연변이체를 혼입한다. 바람직하게는, 유전자 위치이동된 RSV의 이들 및 다른 예들은 동일 또는 상이한 생물학적으로 유도된 돌연변이 RSV 균주로부터 유도될 수 있는 생물학적으로 유도된 돌연변이 RSV로부터 채택되는 2 개 이상의 약독화 돌연변이체를 혼입한다. 또한 바람직하게는, 이들 예시적 돌연변이체는 돌연변이를 규정하는 코돈의 다중 뉴클레오티드 변화에 의해 안정화되는 약독화 돌연변이 중 하나 이상을 갖는다.
상기 기술에 따르면, cDNA로부터 감염성 RSV를 제조하는 능력은 유전자 위치이동된 RSV 내에 특이적 조작된 변화의 도입을 허용한다. 특히, 감염성 재조합 RSV를 생물학적으로 유도된 약독화 RSV 균주 중에 특이적 돌연변이(들), 예를 들면 ts, ca, att 및 다른 표현형을 규정하는 돌연변이의 확인을 위해 이용한다. 따라서, 원하는 돌연변이가 확인되고, 재조합 유전자 위치이동된 RSV 백신 균주로 도입된다. cDNA로부터 바이러스를 제조하는 능력은 이들 돌연변이를 개별적으로 또는 다양한 선택된 조합으로 전장 cDNA 클론으로 통상적으로 혼입가능하게 하여, 도입된 돌연변이를 포함하는 얻어진 재조합 바이러스의 표현형을 쉽게 결정하게 한다.
원하는 표현형 (예를 들면, cp 또는 ts 표현형)과 연관된 특이적 생물학적으로 유도된 돌연변이를 확인하고 감염성 키메릭 RSV 클론으로 혼입하는 것에 의하여, 본 발명은 확인된 돌연변이에, 또는 이에 매우 근접한 범위 내에 다른 위치 지향성 변형을 제공한다. 생물학적으로 유도된 RSV에서 제조되는 대부분의 약독화 돌연변이가 단일 뉴클레오티드 변화인 반면, 다른 "위치 지향성" 돌연변이를 또한 재조합 기술에 의해 생물학적으로 유도 또는 재조합 RSV로 혼입시킬 수 있다. 본원에서 사용한 위치 지향성 돌연변이는 1 내지 3개, 약 5 내지 15 개 이하, 또는 그 이상의 변화된 뉴클레오티드 (야생형 RSV 서열로부터, 선택된 돌연변이 RSV 균주의 서열로부터, 또는 부모 재조합 RSV 클론으로부터 변화되어 돌연변이유발됨)의 삽입, 치환, 결실 또는 재배열을 포함한다. 이러한 위치 지향성 돌연변이는 선택된 생물학적으로 유도된 돌연변이의 영역에 또는 영역 내에 혼입시킬 수 있다. 별법으로, 돌연변이는 RSV 클론 내의 다양한 다른 환경, 예를 들면 단백질 활성 부위, 결합 부위, 면역원성 에피토프 등을 코딩하는 시스 작용 조절 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 또는 그 근방에 도입될 수 있다. 위치 지향성 RSV 돌연변이체는 전형적으로 원하는 약독화 표현형을 유지한, 약독화와 연관되지 않은 변화된 표현형 특성, 예를 들면 면역원성의 증강 또는 확장 및(또는) 성장 증가를 추가적으로 나타낼 수 있다. 원하는 위치 지향성 돌연변이체의 추가 예로는 약독화 돌연변이를 규정하는 코돈에서 추가 안정화 뉴클레오티드 돌연변이를 혼입하도록 설계된 재조합 RSV가 있다. 가능한 경우, 2 개 이상의 뉴클레오티드 치환이 부모형 돌연변이체 또는 재조합 RSV 클론에서의 약독화 아미노산 변화를 규정하는 코돈에 도입되어, 약독화된 표현형으로부터의 복귀변이에 유전적 저항성을 갖는 생물학적으로 유도되거나 재조합 RSV를 생성한다. 다른 실시태양에서, 위치 지향성 뉴클레오티드 치환, 첨가, 결실 또는 재배열은 상류 (N-말단 방향) 또는 하류 (C-말단 방향), 예를 들면 목표 뉴클레오티드 위치에 비하여 1 내지 3, 5 내지 10 및 15 개 이하의 뉴클레오티드 또는 그 이상 5' 또는 3'에 도입되어 예를 들면 존재하는 시스 작용 조절 요소를 구성 또는 제거한다.
단일 및 다수 점 돌연변이 및 부위 특정 돌연변이 이외에, 본원에 개시된 유전자 위치이동 RSV에 대한 변화는 전체 유전자 또는 게놈 분절의 결실, 삽입, 치환 또는 재배열을 포함한다. 이들 돌연변이는 변화의 성질에 따라서 (즉, 작은 수의 염기는 변화되어 면역원성 에피토프를 삽입 또는 제거하거나, 또는 작은 게놈 분절을 변화시킬 수 있는 반면, 큰 블럭(들)의 염기는 게놈 또는 큰 게놈 분절이 첨가, 치환 , 결실 또는 재배열될 때 포함됨), 공여체 또는 수용체 게놈 또는 안티게놈 중에 작은 수의 염기 (예를 들면, 15-30 염기, 35-50 염기 이하, 또는 그 이상), 큰 블럭의 뉴클레오티드 (예를 들면, 50-100, 100-300, 300-500, 500-1000 염기), 또는 거의 완전한 또는 완전한 유전자 (예를 들면, 1,000-1,500 뉴클레오티드, 1,500-2,500 뉴클레오티드, 2,500-5,000 뉴클레오티드, 5,000-65,000 뉴클레오티드 또는 그 이상)를 변화시킬 수 있다.
본 발명의 별도 측면에서, cDNA 발현 게놈 또는 안티게놈으로부터 제조되는 감염성 유전자 위치이동 RSV는 모든 RSV 또는 RSV 유사 균주 (예를 들면, 인간, 소, 생쥐 등), 또는 모든 폐렴바이러스 (예를 들면, (예전에는 칠면조 비기관염 바 이러스로 불렸던) 조류 페렴바이러스, 생쥐의 폐렴 바이러스)일 수 있다. 방어 면역 반응을 발생시키기 위하여, RSV 균주는 인간을 면역화하기 위해 사용되는 인간 RSV와 같이 면역화되는 대상에 내생인 것일 수 있다. 그러나, 내생 RSV의 게놈 또는 안티게놈은 상이한 RSV 종, 아군 또는 균주 유래, 또는 RSV 및 PIV와 같은 다른 호흡기 병원체 유래의 유전자 또는 게놈 분절의 조합과 같이 상이한 원천의 조합으로부터의 RSV 유전자 또는 게놈 분절을 발현하도록 변형될 수 있다.
다양한 공지의 방법에 의해 상기 정의한 돌연변이를 감염성 유전자 위치이동 RSV 클론에 도입할 수 있다. DNA와 관련하여 "감염성 클론"은 cDNA, 또는 주형으로 작용할 수 있는 게놈 또는 안티게놈 RNA로 전사되어 감염성 바이러스 또는 서브바이러스 입자의 게놈을 생성할 수 있는 합성 또는 기타의 생성물을 의미한다. 따라서, 통상의 기술(예, 부위 지향성 돌연변이)에 의해, 정의된 돌연변이를 게놈 또는 안티게놈의 cDNA 카피에 도입할 수 있다. 본원에 기술한 바와 같이, 안티게놈 또는 게놈 cDNA 서브단편을 사용하여 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA를 조합하는 것은 각 영역을 별도로 조작하고(더 작은 cDNA가 큰 것보다 조작하기에 더 용이하다), 이어서 완전한 cDNA로 쉽게 조합할 수 있는 장점을 갖는다. 따라서, 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA, 또는 이의 어떠한 서브단편도 올리고뉴클레오티드 지향성 돌연변이를 위한 주형으로 사용될 수 있다. 이것은 예를 들면, 뮤타-진 키트(Muta-gene(등록상표) kit, 미국 캘리포니아주 리치몬드 소재의 Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 단일 가닥 파아지미드 형태의 중간체를 경유하거나, 또는 카멜레온(Chameleon) 돌연변이유발 키트(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 Stratagene)와 같이 이중 가닥 플라스미드를 직접 주형으로 사용하는 방법을 통해서일 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 관심있는 돌연변이를 함유하는 주형을 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 의할 수 있다. 이어서, 돌연변이 서브단편을 완전한 안티게놈 또는 게놈 cDNA로 조합할 수 있다. 다양한 다른 돌연변이유발 기술이 공지되어 있고, RSV 안티게놈 또는 게놈 cDNA에서 관심있는 돌연변이를 생성하는데 사용하기 위해 입수가능하다. 돌연변이는 단일 뉴클레오티드 변화에서부터 하나 이상의 유전자 또는 게놈 영역을 함유하는 큰 cDNA 부분의 치환에 이르기까지 다양할 수 있다.
따라서, 한 예시적 실시태양에서는, 뮤타-진 파아지미드 시험관내 돌연변이유발 키트(Bio-Rad로부터 입수가능)를 사용함으로써 돌연변이를 도입한다. 즉, RSV 게놈 또는 안티게놈의 일부를 코딩하는 cDNA를 플라스미드 pTZ18U로 클로닝하고, CJ236 세포를 형질전환하는데 사용한다 (Life Technologies). 파아지미드 제제는 제조자가 제시하는 바와 같이 제조한다. 게놈 또는 안티게놈의 목적하는 위치에 변화된 뉴클레오티드를 도입함으로써 돌연변이유발을 위한 올리고뉴클레오티드를 설계한다. 이어서, 유전적으로 변화된 게놈 또는 안티게놈 분절을 함유하는 플라스미드를 증폭시킨 다음, 돌연변이된 부분을 전체 길이의 게놈 또는 안티게놈 클론에 재도입한다.
본 발명은 또한 1 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 1 이상의 cDNA로부터 감염성 유전자 위치이동 RSV를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 감염성 RSV를 형성하는데 필수적인 바이러스 단백질과 세포내 또는 시험관 내에서의 공동발현을 위한 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA가 구성된다. "RSV 안티게놈"은 후손 RSV 게놈의 합성을 위한 주형으로 작용하는 단리된 정방향 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 바람직하게는, 전사하고 복제하는 뉴클레오캡시드를 생성하는데 필수적인 단백질을 코딩하는 상보 서열, 즉, N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질을 코딩하는 서열의 정방향 전사체와 혼성화할 가능성을 최소화하기 위해, 복제 중간체 RNA 또는 안티게놈에 대응하는, RSV 게놈의 정방향 형태인 cDNA가 구성된다. RSV 미니게놈 시스템에서, RSV에 의해 보충되거나 또는 플라스미드에 의해 보충되는, 구조에서 게놈 및 안티게놈의 활성은 동등하였고, 이것은 게놈 또는 안티게놈을 사용할 수 있고, 따라서 선택은 방법론적 또는 다른 근거에 달려있다는 것을 지적한다.
전형적으로, 문헌[Mink 등, Virology 185: 615-624 (1991); Stec 등, Virology 183: 273-287 (1991); 및 Connoers 등, Virol. 208: 478-484 (1995); Collins 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:81-85 (1996), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 기술된 바와 같이, 천연 RSV 게놈은 전형적으로 상보적 바이러스 mRNA를 통해 11 종의 바이러스 단백질, 즉, 비구조적 종인 NS1 및 NS2, N, P, 매트릭스(M), 작은 소수성물질(SH), 당단백질(G), 융합(F), M2(ORF1), M2(ORF2) 및 L을 코딩하는 역방향 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 본 발명의 재조합 RSV의 게놈 또는 안티게놈은 코딩된 바이러스 또는 서브바이러스 입자가 감염성이게 하는데 필수적인 유전자 또는 이의 일부를 함유하는 것만을 필요로 한다. 나아가, 상기 유전자 또는 이의 일부는 하나를 초과하는 폴리뉴클레오 티드 분자에 의해 제공될 수 있다. 즉, 유전자는 상보 등에 의해 별도의 뉴클레오티드 분자로부터 제공될 수 있거나, 또는 유전자 또는 이의 일부는 게놈 또는 안티게놈 cDNA로부터 직접 발현될 수 있다.
재조합 RSV는 재조합 발현 시스템으로부터 직접 또는 간접적으로 유래되었거나, 또는 이로부터 생성된 바이러스 또는 서브바이러스 입자로부터 발생된 RSV 또는 RSV 유사 바이러스 또는 서브바이러스 입자를 의미한다. 재조합 발현 시스템은 적어도 유전적 인자 또는 RSV 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 인자, 예를 들면, 프로모터, RSV RNA로 전사되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 적당한 전사 개시 및 종결 서열의 조합을 포함하는 작동가능하게 연결된 전사 단위를 포함하는 재조합 발현 벡터를 사용할 것이다.
cDNA 발현 게놈 또는 안티게놈으로부터 감염성 RSV를 생성하기 위해, 게놈 또는 안티게놈을, (i) RNA 복제가능한 뉴클레오캡시드를 생산하고 (ii) 후손 뉴클레오캡시드를 RNA 복제 및 전사에 알맞게 하는데 필수적인 RNA 단백질과 공동발현시킨다. 게놈 뉴클레오티드에 의한 전사는 다른 RSV 단백질을 제공하고, 생산적인 감염을 개시한다. 별법으로, 공동발현에 의해 생산적인 감염에 요구되는 부가의 RSV 단백질을 공급할 수 있다.
클로닝한 cDNA 단편을 조합하고 집합체의 완전한 안티게놈을 제공하거나, 또는 RSV mRNA 또는 게놈 RNA의 역전사 카피의 중합효소 연쇄 반응 (PCR; 예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호, 및 PCR Protocol: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego (1990), 본원 에 참고로 인용됨)에 의해 본 발명에서의 사용을 위한 RSV 안티게놈을 구성할 수 있다. 예를 들면, 적당한 프로모터(예, T7 RNA 중합효소 프로모터) 및 리더 영역 보체로부터 SH 유전자에까지 미치는, 안티게놈의 좌측 말단을 함유하는 cDNA를 적당한 발현 벡터, 예를 들면, 플라스미드(예, pBR322) 또는 다양한 입수가능한 코스미드, 파아지 또는 DNA 바이러스 벡터에서 조합할 수 있다. 벡터는 돌연변이유발 및(또는) 조합을 용이하게 할 수 있도록 설계된 독특한 제한 부위를 함유하는 합성 폴리링커의 삽입에 의해 변화될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 기술한 플라스미드 벡터는 PstI-EcoR1 단편을 통상의 제한 효소 부위를 함유하는 합성 DNA로 대체함으로써 pBR322로부터 유도되었다. pBR322를 벡터로 사용하여 뉴클레오티드 결실 또는 삽입이 유지되었을 RSV 서열의 3716 내지 3732 뉴클레오티드를 안정화시켰고, DH10B 균주에서 플라스미드를 증식시켜서 4499 뉴클레오티드의 근처에서 일어났을 인공 복제 및 삽입을 회피하였다. 제조의 용이를 위해, L 및 트레일러 서열처럼, G, F 및 M2 유전자를 별개의 벡터에서 조합할 수 있다. 안티게놈 플라스미드의 우측 말단(예, L 및 트레일러 서열)은 목적하는 경우, 플랭킹 리보자임 및 직렬 T7 전사 종결자와 같은 부가의 서열을 함유할 수 있다. 리보자임은 단일 비바이러스 뉴클레오티드를 함유하는 3' 말단을 발생시키는 해머헤드(hammerhead) 유형(예, Grosfeld 등, J. Virol. 69: 5677-5686 (1995))일 수 있거나, 또는 비RSV 뉴클레오티드가 없는 3' 말단을 발생시키는 간염 델타 바이러스(Perrotta 등, Nature 350: 434-436 (1991))와 같은 다른 적합한 리보자임일 수 있다. 중간 단편(예, G 내지 M2 부분)이 리더 내지 SH 플라스미드의 적당한 제한 부위에 삽입되면, 이것이 L-트 레일러-리보자임-종결자 부분에 대한 수용체가 되어, 완전한 안티게놈을 발생시킨다. 본원에 기술한 한 예에서는, 리더 서열을 최적의 활성을 위해 세 개의 전사 G 잔기를 포함한 T7 RNA 중합효소에 대한 프로모터에 인접하도록 구성하였고, 전사는 이들 세 개의 비바이러스 G 잔기를 안티게놈의 5' 말단에 부여한다. 이들 세 개의 비바이러스 G 잔기를 생략하여 비바이러스 뉴클레오티드가 없는 5' 말단을 생성할 수 있다. 거의 정확한 3' 말단을 생성하기 위해, 트레일러 말단을 해머헤드 리보자임에 인접하게 구성하였고, 이것은 절단시 단일 3' 인산화 U 잔기를 코딩된 RNA의 3' 말단에 부여할 것이다.
본 발명의 특정 실시태양에서는, 하나 이상의 헬퍼 바이러스에 의해 전사 및 복제 RSV 뉴클레오티드를 생성하는데 필수적인 단백질을 코딩하는 보충 서열이 제공된다. 이러한 헬퍼 바이러스는 야생형 또는 돌연변이체일 수 있다. 바람직하게는, 헬퍼 바이러스는 RSV cDNA에 의해 코딩된 바이러스와 표현형적으로 구별될 수 있다. 예를 들면, RSV cDNA에 의해 코딩된 바이러스가 아닌 헬퍼 바이러스와 면역학적으로 반응하는 단일클론 항체를 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 항체는 중화 항체일 수 있다. 일부 실시태양에서, 항체를 헬퍼 바이러스 배경을 중화하기 위해 사용하여 재조합 바아러스의 확인 및 회수를 촉진할 수 있거나, 친화 크로마토그래피에 항체를 사용하여 헬퍼 바이러스와 재조합 바이러스를 분리할 수 있다. 재조합 RSV가 비반응성 또는 상기 항체로의 중화에 내성이 되게하는 돌연변이를 RSV cDNA로 도입할 수 있다.
유전자 위치이동 RSV 게놈 또는 안티게놈에서 다양한 뉴클레오티드 삽입 및 결실을 일으켜 적당히 약독화된 클론을 생성할 수 있다. 야생형 인간 RSV의 게놈 뉴클레오티드 길이(15,222 뉴클레오티드)는 6의 배수이고, 파라믹소바이러스 및 모빌리바이러스의 구성원은 전형적으로 "6의 규칙"을 따른다. 즉, 게놈(또는 미니게놈)은 뉴클레오티드 길이가 6의 배수인 경우에만 효율적으로 복제한다 (캡시드화 NP 단백질에 대한 뉴클레오티드 잔기의 정확한 간격을 위한 요구로 생각됨). 단일 잔기 증가에 위한 RSV 게놈 길이의 변화는 복제의 효율에 영향을 미치지 않았고, 계대배양 후 여러 개의 상이한 미니게놈 돌연변이체의 서열 분석으로부터 길이의 차는 보완적 변화없이 유지되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, RSV에는 게놈 길이가 6의 배수이어야 한다는 엄격한 요구가 결여되어 있고, 본 발명의 재조합 RSV의 복제를 좌절시키지 않고 RSV 게놈 또는 안티게놈에서 뉴클레오티드 삽입 및 결실이 일어날 수 있다.
유전자 위치이동 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 cDNA를 구성하는 별법으로는 서브유닛 cDNA 성분의 수를 하나 또는 두 개의 단편으로 줄이기 위한 예를 들면, 문헌[Cheng 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699 (1994); Samal 등, J. Virol. 70: 5075-5082 (1996), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 기술된 바와 같은 개선된 PCR 조건을 사용하는 역전사 PCR이 포함된다. 다른 실시태양에서는, 상이한 프로모터(예, T3, SP6) 또는 상이한 리보자임(예, 간염 델타 바이러스의 리보자임)을 사용할 수 있다. 큰 게놈 또는 안티게놈을 더 잘 수용하기 위해 상이한 DNA 벡터(예, 코스미드)를 사용할 수 있다.
RNA 복제에 필수적인 N, P 및 L 단백질은 복제의 진행을 위해 M2(ORF1) 단백 질과 같은 RNA 중합효소 신장 인자를 요구한다. 따라서, 음성 가닥 RNA 바이러스에 있어서 M2(ORF1) 또는 실질적으로 이와 동등한 전사 신장 인자가 요구되고, 생산적 감염 중 기능적 뉴클레오티드의 필수 성분이다.
M2(ORF1) 단백질의 요구는 전사 신장 인자로서의 역할과 일치한다. 음성 가닥 RNA 바이러스에 있어서 RNA 중합효소 신장 인자 단백질의 발현의 요구는 본 발명의 특징이다. M2(ORF1)은 키메릭 게놈 또는 안티게놈, 또는 그것과의 공동발현에 의해, 완전 M2 유전자의 발현에 의해 제공될 수 있으나, 이러한 경우에 제2 ORF2가 또한 발현될 수 있고, RNA 복제에 억제적 영향을 미친다. 따라서, 완전 M2 유전자를 사용하여 감염성 바이러스를 생성하는 경우에는, M(ORF1)이 전사 신장 활성을 제공하기에 충분하나 너무 많은 M(ORF2)가 RNA 복제를 억제하지 않는 정도로 발현되도록 두 개의 ORF의 활성이 균형을 이루어야 한다. 별법으로, ORF2가 결여되어 있거나 또는 결실 ORF2를 코딩하도록 설계된 cDNA로부터 ORF1 단백질을 제공한다. 또한, 외피 구성성분을 코딩하는 것(즉, SH, M, G, F 단백질)과 같은 부가의 바이러스 단백질 유전자의 공동 발현에 의해 바이러스 생성의 효율을 개선할 수 있다.
M2(ORF2) 관련한 이들 결과에 따르면, 본 발명의 다른 예시적 실시태양에서, M2(ORF2) (Collins and Wertz, J. Virol. 54:65-71, 1985; Collins et al., J. Gen. Virol. 71:3015-3020, 1990, Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:81-85, 1996, 각각 본원에 참고문헌으로 삽입됨)의 돌연변이를 혼입하여 신규 RSV 백신 후보물을 얻는 (본원에 참고문헌으로 삽입된 1999년 7월 9일 콜린스(Collins) 등에 의해 출원된 미국 가출원 제60/143,097호를 참조) 유전자 위치이동 RSV가 제공된다. 바람직한 측면에서, M2 ORF2의 발현은 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 변형하는 것에 의해 감소 또는 제거되어 "녹 아웃" 바이러스 클론을 얻는 M2 ORF2에 프레임 이동 돌연변이 또는 정지 코돈을 혼입된다. 별법으로, M2 ORF2는 전체 또는 부분적으로 결실되어 M2-2 단백질이 부분적으로 또는 완전히 비기능적이 되게하거나, 또는 함께 그 발현을 혼란시켜 M2 ORF2 "결실 돌연변이체" 키메릭 RSV를 얻는다. 별법으로, M2-2 ORF는 M2-2 유전자의 천연 유전자 순서 위치와 비교하여 더욱 프로모터에 인접 또는 프로모터에서 먼 위치로 게놈 또는 안티게놈에서 트랜스포지션되어 M2-2 ORF의 발현을 상승 조절 또는 하강 조절한다. 추가 실시태양에서, M2-2 ORF는 유전자 개시 및 유전자 종결 신호를 갖는 별개 유전자로 게놈 또는 안티게놈에 혼입되고, 이 변형은 M2-2 ORF의 상승 조절을 가져온다.
M2 ORF2에 돌연변이를 혼입하기 위해 더 변형된 본 발명의 유전자 위치이동 RSV는 백신 개발에 매우 요망되는 표현형 특성을 보유한다. 재조합 게놈 또는 안티게놈에서 상기 확인된 변형은 얻어진 바이러스 또는 서브바이러스 입자에서 1 이상의 요망되는 표현형 변화를 규정한다. 따라서, (i) mRNA 전사의 변화, (ii) 바이러스 단백질 발현 수준의 변화; (iii) 게놈 또는 안티게놈 RNA 복제의 변화, (iv) 바이러스 성장 특성의 변화, (v) 바이러스 플라크 크기의 변화, 및(또는) (vi) 세포병원성의 변화로 확인되는 1 이상의 특성을 나타내는 백신 후보물이 생성된다.
M2 ORF 2 결실 또는 녹 아웃 돌연변이를 혼입시킨 예시적 RSV 재조합에서, 요망되는 표현형 변화는 상응하는 야생형 또는 돌연변이체 부모형 RSV 균주의 성장과 비교하여 바이러스 성장의 약독화를 포함한다. 더욱 상세한 측면에서, 세포 배양에서의 바이러스 성장은 M2 ORF2에서의 돌연변이에 기인하여 약 10 배 이상 약독화될 수 있다. 바이러스 성장 속도론 또한 백신 개발에 유익한 방식으로 변형되었음을 보여준다.
본 발명은 또한 상응하는 야생형 또는 돌연변이체 부모형 RSV 균주의 mRNA 합성 속도와 비교하여 바이러스 mRNA 합성의 속도가 지연되어 나타나는 M2-ORF 2 결실 및 녹 아웃 돌연변이 RSV를 포함한다. 이러한 지연된 전사 속도에도 불구하고, 이들 신규 백신 후보물은 부모 바이러스와 비교하여 누적적 mRNA 합성에서의 증가를 나타낸다. 이들 표현형 변화는 통상적으로 야생형 또는 다른 부모 RSV 균주로 감염시킨 세포에서의 단백질 축적과 비교하여 감염된 세포에서 바이러스 단백질 축적의 증가와 연관된다. 동시에, 바이러스 RNA 복제는 정상 M2 ORF2 기능을 갖는 부모 RSV 균주의 것과 비교하여 M2 ORF2 유전자 위치이동 RSV에서 감소되어, 게놈 또는 안티게놈 RNA의 축적이 감소한다.
본 발명의 바람직한 측면에서, 키메릭 M2 ORF2 결실 및 "녹 아웃" RSV는 또한 약독화된 표현형을 나타내는 한편 감소되지 않은, 또는 더욱 전형적으로는 증가된 수준의 바이러스 항원(들)을 발현하도록 엔지니어링된다. 따라서, 감소되지 않은 또는 증가된 mRNA 전사 및 항원 발현으로 인하여 면역원성 단백질이 보존되는 한편, 약독화는 이종 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)의 혼입 및 수반되는 RNA 복제 및 M2-ORF 2 결실 및 녹 아웃 돌연변이에 기인한 바이러스 성장의 감소를 통해 달성된다. M2 ORF2 결실 및 녹 아웃 유전자 위치이동 RSV에서 관찰되는 다른 유용한 표현형 변화는 큰 플라크 표현형 및 상응하는 야생형 또는 돌연변이 부모 RSV 균주와 비교하여 변화된 세포병원성을 포함한다.
트랜스팩션, 전기천공법, 기계적 삽입, 형질도입 등에 의해, 유전자 위치이동 RSV 게놈 또는 안티게놈, 및 별도로 또는 시스(cis)로, 안티게놈 또는 게놈 cDNA로부터 발현된 N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드(cDNA)를 생산적 RSV 감염을 지지할 수 있는 세포, 예를 들면, HEp-2, FRhL-DBS2, MRC 및 베로(Vero) 세포에 삽입한다. 단리된 뉴클레오티드 서열의 트랜스팩션은 예를 들면, 칼슘 포스페이트 매개 트랜스팩션 (Wigler 등, Cell 14: 725 (1978); Corsaro 및 Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Graham 및 Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)), 전기천공법 (Neumann 등, EMBO J. 1: 841-845 (1982)), DEAE-덱스트란 매개 트랜스팩션 (Ausubel 등, 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., 뉴욕 (1987)), 양이온성 지질 매개 트랜스팩션 (Hawley-Nelson 등, Focus 15: 73-79 (1993) 또는 상업적으로 입수가능한 트랜스팩션제 (예, LipofectACE (등록상표), Life Technologies)에 의해 배양 세포에 도입될 수 있다 (각각의 상기 문헌은 본원에 참고로 인용됨).
N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질은 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 것과 동일 하거나 또는 별도일 수 있는 하나 이상의 cDNA 및 발현 벡터, 및 이들의 다양한 조합에 의해 코딩된다. 목적하는 경우, 자신의 벡터 또는 N, P, L 및 M2(ORF1) 단백질 및(또는) 완전 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 벡터에 의해 코딩된 부가의 단백질을 포함할 수 있다. 게놈 또는 안티게놈 및 트랜스팩션된 플라스미드로부터의 단백질의 발현은 예를 들면, 각각의 cDNA를 T7 RNA 중합효소에 대한 프로모터의 조절하에 두고, 감염, 트랜스팩션 또는 형질도입에 의해 T7 RNA 중합효소에 대한 발현 시스템, 예를 들면, T7 RNA 중합효소를 발현하는 우두 바이러스 MVA 균주 재조합체를 공급함으로써 달성할 수 있다 (Wyatt 등, Virology, 210: 202-205 (1995), 본원에 참고로 인용됨). 바이러스 단백질 및(또는) T7 RNA 중합효소는 또한 트랜스팩션된 포유류 세포로부터, 또는 예비형성된 mRNA 또는 단백질의 감염에 의해 공급될 수 있다.
별법으로, 안티게놈 또는 게놈의 합성을 시험관내(세포의 부존재)에서 전사-번역 결합 반응으로 수행한 후, 세포를 트랜스팩션시킬 수 있다. 또는, 시험관내에서 안티게놈 또는 게놈 RNA를 합성하고, RSV 단백질을 발현하는 세포를 트랜스팩션시킬 수 있다.
본 발명에 따른 후보 백신 바이러스를 선별하기 위해, 널리 공지된 방법에 따라 생존도, 약독화 및 면역원성의 기준을 결정한다. 본 발명의 백신에서 가장 바람직한 바이러스는 생존도를 유지해야 하고, 안정한 약독화 표현형을 가져야 하고, 면역화 숙주에서 복제(낮은 수준이라 할지라도)를 나타내어야 하고, 접종자에게서 야생형 바이러스로부터의 후속적 감염에 의해 유발된 심각한 질병에 대한 방어를 부여하기에 충분한 면역 반응을 효율적으로 일으켜야 한다. 분명하게는, 이제까지 공지되고 보고된 RS 바이러스 돌연변이체는 이러한 모든 기준을 만족시키지 못한다. 실제로, 공지의 약독화 RSV에 대해 보고된 결과에 기초한 예상과 달리, 본 발명의 바이러스는 생육할 수 있고 이전의 돌연변이체보다 더 약독화될 뿐만 아니라, 이전에 연구된 돌연변이체보다 생체내에서 유전적으로 더 안정하고, 방어적 면역 반응을 촉진하는 능력, 어떤 경우에서는 다수의 변화에 의해 제공된 방어의 확대, 즉, 상이한 바이러스 균주 또는 아군에 대한 방어, 또는 상이한 면역학적 기초(예, 분비 대 혈청 면역글로불린, 세포성 면역 등)에 의한 방어를 유발하는 능력을 보유한다. 본 발명의 이전에, 생체내 복제 후 ts 표현형의 유전적 불안정성은 ts 바이러스에 있어서 통칙이었다 (Murphy 등, Infect. Immun. 37: 235-242 (1982)).
백신 및 다른 목적의 유전자 위치이동 RSV 바이러스를 증식시키기 위해, RSV 성장을 허용하는 다수의 세포주를 사용할 수 있다. RSV는 다양한 인간 및 동물 세포에서 성장한다. 백신용 약독화 RS 바이러스를 증식시키기 위한 바람직한 세포주는 DBS-FRhL-2, MRC-5 및 베로 세포를 포함한다. 일반적으로 베로 세포와 같은 상피세포주를 사용하여 가장 높은 바이러스 수율을 얻는다. 전형적으로 약 0.001 내지 1.0 이상 범위의 감염 다중도에서 바이러스를 사용하여 세포를 접종하고, 바이러스의 복제를 위해 허용된 조건, 예를 들면, 약 30 내지 37 ℃에서 약 3 내지 5일 동안, 또는 바이러스가 적당한 역가에 도달하기에 필요한 만큼 배양한다. 바이러스를 세포 배양으로부터 회수하고, 전형적으로 널리 공지된 정화 방법, 예를 들면, 원심분리에 의해 세포 성분으로부터 분리하고, 목적하는 경우 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 추가로 정제할 수 있다.
본원에 기술된 대로 약독화시키고 달리 변형시킨 유전자 위치이동 RSV를 공지되고 일반적으로 허용되는 다양한 시험관내 및 생체내 모델에서 시험하여 적합한 약독화, 표현형 복귀변이에 대한 저항 및 백신용 면역원성을 확인할 수 있다. 시험관내 분석에서, 변화된 바이러스(예, 다양하게 약독화된 생물학적 유래 또는 재조합 RSV)를 바이러스 복제의 온도 민감성, 즉, ts 표현형, 및 작은 플라크 표현형에 대해 시험한다. 변화된 바이러스를 RSV 감염의 동물 모델에서 추가로 시험한다. 다양한 동물 모델이 기재되어 있고, 문헌[Meignier 등, 판, Animal Models of Respiratory Syncytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, (1991), 본원에 참고로 인용됨]에 요약되어 있다. RSV 감염의 코튼 랫트 모델이 미국 제4,800,078호 및 문헌[Prince 등, Virus Res. 3: 193-206 (1985), 본원에 참고로 인용됨]에 기재되어 있고, 인간 및 비인간 영장류에서의 약독화 및 효율에 대한 예측으로 고려된다. 뿐만 아니라, 문헌[Richardson 등, J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978); Wright 등, Infect. Immun. 37: 397-400 (1982); Crowe 등, Vaccine 11: 1395-1404 (1993), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 상세히 기재된 바와 같이, 침팬지를 사용하는 RSV 감염의 영장류 모델로부터 인간에서의 약독화 및 효율을 예측한다.
RSV 백신 후보물의 약독화 및 감염도를 평가하기 위하여 설치류 및 침팬지를 포함하는 RSV 모델 시스템은 당업게에서 널리 허용되는 것이고, 이로부터 얻은 데이타는 RSV 감염 및 약독화와 충분히 관련된다. 생쥐 및 코튼 랫트 모델이 후보 RSV 바이러스가 예를 들면 RSV 아군 B 바이러스의 경우에 침팬지에서 부적합한 성 장을 나타내는 경우에 특히 유용하다.
상기 기재 및 하기 실시예에 따르면, 본 발명은 또한 백신 용도의 단리된 감염성 유전자 위치이동 RSV 조성물을 제공한다. 백신의 한 성분인 약독화 키메릭 바이러스는 단리되고 전형적으로 정제된 형태이다. 단리되었다는 것은 야생형 바이러스의 선천성 환경, 예를 들면, 감염된 개체의 비인강 이외에 있는 RSV를 지칭한다. 더 일반적으로, 단리되었다는 것은 약독화 바이러스를 조절된 셋팅에서 증식 및 특성화될 수 있는 세포 배양 또는 다른 인공 배지의 성분으로 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 약독화 RSV를 감염된 세포 배양에 의해 생산하고, 세포 배양으로부터 분리하고, 안정화제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 RSV 백신은 활성 성분으로서 본원에서 기술한 바와 같이 생성된 RSV의 면역학적 유효량을 함유한다. 생물학적 유래 또는 재조합체 RSV는 백신 조성물에 직접 사용되거나, 또는 동결건조될 수 있다. 동결건조 바이러스는 전형적으로 약 4 ℃에서 유지될 것이다. 하기에 더 기술하는 바와 같이, 사용하기에 앞서 동결건조 바이러스는 아주반트와 함께 또는 아주반트 없이 예를 들면, 식염수 또는 SPG, MG++ 및 HEPES를 포함하는 안정화 용액에서 재구성된다. 생물학적 유래 또는 재조합으로 변경된 바이러스는 생리학적으로 허용가능한 담체 및(또는) 아주반트와 함께 숙주에 도입될 수 있다. 유용한 담체는 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 물, 완충수, 0.4％ 식염수, 0.3％ 글리신, 히알루론산 등이 포함된다. 생성된 수용액은 사용을 위해 자체로 또는 동결건조되어 포장되고, 동결건조 제제는 상기한 바와 같이 투여 전에 멸균액과 결합될 수 있다. 조성물은 pH 조절제, 완충제, 등장화제, 습윤제 등과 같은 생리적 조건과 가깝게 하기 위해 요구되는 약제학적으로 허용가능한 보조제 성분, 예를 들면, 아세트산 나트륨, 젖산 나트륨, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 모노라우린산 소르비탄, 올레산 트리에탄올아민 등을 함유할 수 있다. 허용가능한 아주반트로는 당업계에 널리 공지된 물질인 불완전 프로인트 아주반트, 인산 알루미늄, 수산화 알루미늄 또는 백반이 포함된다. 또한, 바람직한 아주반트로는 스티뮤론 QS-21 (Stimulon(등록 상표) QS-21, 메사츄세츠주 파밍엄 소재의 Aquila Biopharmaceuticals, Inc.), 엠피엘 (MPL(등록 상표), 3-0-탈아실화 모노포스포릴 지질 A; 몬타나주 해밀톤 소재의 Corixa) 및 인터루킨-12 (메사츄세츠주 캠브리지 소재의 Genetics Institute)가 포함된다.
에어로졸, 액적, 경구, 국소 또는 다른 경로를 경유하여 본원에 기술한 유전자 위치이동 RSV 백신 조성물을 사용하여 면역화할 때, 숙주의 면역체계는 하나 이상의 RSV 바이러스 단백질, 예를 들면, F 및(또는) G 당단백질에 특이적인 항체를 생성함으로써 백신에 반응한다. 예방접종의 결과로서, 숙주는 적어도 부분적으로 또는 완전히 RSV 감염에 면역화되거나, 또는 특히 하기도의 완만하거나 또는 심한 RSV 질병에 내성이 된다.
본 발명의 유전자 위치이동 RSV 백신은 단일 RSV 균주 또는 항원성 아군(예, A 또는 B), 또는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 면역 반응을 일으키는 약독화 바이러스를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 유전자 위치이동 RSV는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대하여 단일특이적 면역 반응 또는 다중특이적 면역 반응을 일으킬 수 있다. 별법으로, 상이한 면역원성 특성을 갖는 유전자 위치이동 RSV를 백신 혼합물로 결합하거나, 또는 대등 치료 프로토콜로 별도로 투여하여 하나의 RSV 균주, 또는 다수의 RSV 균주 또는 아군에 대하여 더 효과적인 방어를 일으킬 수 있다.
백신이 투여되는 숙주는 RSV 또는 밀접하게 관련된 바이러스에 감염되기 쉽고 예방접종 바이러스의 항원에 대한 방어적 면역 반응을 일으킬 수 있는 어떠한 포유류일 수 있다. 따라서, 적합한 숙주로는 인간, 비인간, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 라가모프(lagamorph), 설치류 등이 포함된다. 따라서, 본 발명은 다양한 의약 및 수의 용도의 백신을 생성하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 약독화 유전자 위치이동 RSV를 함유하는 백신 조성물을 RSV에 대한 개체의 면역 반응 역량을 유발하거나 또는 증진시키기에 충분한 "면역학적 유효량"으로 RSV 바이러스 감염에 걸리기 쉽거나 위험성이 있는 환자에 투여한다. 사람의 경우에, 본 발명의 약독화 바이러스를 문헌[Wright 등, Infect Immun. 37: 397-400 (1982); Kim 등, Pediatrics 52: 56-63 (1973); 및 Wright 등, J. Pediatr. 88: 931-936 (1976), 각각 본원에 참고로 인용됨]에 기재된 바와 같이, 잘 확립된 인간 RSV 백신 프로토콜에 따라 투여한다. 즉, 전형적으로 생리학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체 0.5 ml 중에 면역학적 유효량의 RSV 백신을 사용하여 액적으로 성인 또는 어린이를 비강내 접종한다. 이것은 비복제 백신을 사용한 비경구 면역화와 비교하여 간단하고 안전하다는 장점을 갖는다. 이것은 또한 RSV에 대한 내성에서 주요한 역할을 하는 국소 기도 면역의 직접적인 자극을 제공한다. 나아가, 이러한 형태의 예방접종은 전형적으로 매우 어린 사람에게서 발견 되는 RSV 특이성 모계 유래의 혈청 항체의 면역억제 효과를 효과적으로 우회한다. 또한, RSV 항원의 비경구 투여가 때때로 면역병리학적 합병증과 관련될 수 있는 반면, 생바이러스를 사용한 경우에는 이것이 조금도 관찰되지 않았다.
모든 대상에서, 투여된 유전자 위치이동 RSV 백신의 정확한 양, 및 투여의 시간조절 및 반복은 환자의 건강 상태 및 체중, 투여 방식, 조성물의 성질 등을 기초하여 결정할 수 있을 것이다. 투여량은 일반적으로 환자 당 약 103 내지 약 106 플라크 형성 단위(PFU) 이상의 바이러스, 더 일반적으로는 환자 당 104 내지 105 PFU 바이러스의 범위일 것이다. 어느 경우에서도, 백신 제제는 예를 들면, 다른 방법 중에서 보체 결합, 플라크 중화, 및(또는) 효소 관련 면역흡착 분석에 의해 측정할 수 있는 바와 같이, 항RSV 면역 반응을 효과적으로 자극 또는 유발하기에 충분한 양의 본 발명의 약독화 RSV를 제공해야 한다. 이와 관련하여, 또한 개체에서 상기도 질환의 증상 및 징후를 모니터한다. 침팬지에의 투여에 있어서, 백신 중의 약독화 바이러스는 피접종자의 비인강에서 야생형 바이러스보다 약 10 배 이상 더 낮은 수준으로, 또는 불완전하게 약독화된 RSV의 수준과 비교시 약 10 배 이상 더 낮은 수준으로 성장한다.
신생아 및 유아에 있어서, 충분한 수준의 면역화를 일으키기 위해 중복 투여가 요구될 수 있다. 투여는 생후 1개월 내에 시작되어야 하고, 유년기를 통해 선천성(야생형) RSV 감염에 대한 충분한 수준의 방어를 유지하기에 필요한 간격으로, 예를 들면, 2개월, 6개월, 1년 및 2년 간격으로 투여되어야 한다. 마찬가지로, 반 복되거나 또는 심한 RSV 감염에 특히 걸리기 쉬운 성인, 예를 들면, 건강 보호 근로자, 일일 근로자, 어린 아이의 가족 구성원, 노인, 손상된 심폐 기능을 갖는 개체는 방어적 면역 반응을 확립 및(또는) 유지하기 위해 다중 면역화를 요구할 수 있다. 유발된 면역화의 수준은 중화 분비 및 혈청 항체의 양 및 목적하는 수준의 방어를 유지하기 위해 필요한 조절된 투여량 또는 예방접종을 측정함으로써 모니터할 수 있다. 나아가, 상이한 백신 바이러스를 상이한 수용체 군에 투여할 수 있다. 예를 들면, 사이토킨 또는 T 세포 에피토프가 풍부한 부가의 단백질을 발현는 엔지니어링 유전자 위치이동 RSV 균주는 유아보다는 성인에게 특히 유리할 수 있다. 본 발명에 따라 생성된 RSV 백신은 또다른 RSV 아군 또는 균주의 항원을 발현하는 바이러스와 결합하여 다수의 RSV 아군 또는 균주에 대한 방어를 달성할 수 있다. 별법으로, 백신 바이러스는 본원에 기술한 하나의 RSV 클론으로 설계된 다수의 RSV 균주 또는 아군의 방어 에피토프를 포함할 수 있다.
전형적으로 상이한 백신 바이러스를 사용할 때, 이들을 혼합물로 동시에 투여할 것이나, 별도로 투여할 수도 있다. 예를 들면, 두 개의 RSV 아군의 F 당단백질은 아미노산 서열이 약 10％ 차이가 나므로, 이러한 유사성은, RSV 또는 F 항원으로 면역화하고 이종 균주로 유발시킨 한 동물에서 관찰되는 바와 같이, 교차 방어적 면역 반응에 대한 기초가 된다. 따라서, 한 균주를 사용한 면역화는 동일 또는 상이한 아군의 상이한 균주에 대하여 방어할 수 있다. 그러나, 최적의 방어는 아마도 두 아군 모두에 대해 면역화를 요구할 것이다.
본 발명의 유전자 위치이동 RSV 백신은 개체가 후속적으로 야생형 RSV에 감 염될 때, 폐렴 및 기관지염과 같은 심한 하기도 질환에 대해 방어적인 면역 반응의 생성을 일으킬 수 있다. 자연적으로 순환하는 바이러스는 특히 상기도에서 여전히 감염을 일으킬 수 있는 반면, 예방접종 및 가능하게는 야생형 바이러스에 의한 후속적인 감염에 의한 내성의 상승의 결과로서 비염의 가능성은 매우 크게 감소된다. 예방접종 후, 시험관내 및 생체내에서 상동(동일 아군의) 야생형 바이러스를 중화할 수 있는 혈청 및 분비 항체를 발생시킨 검출가능한 수준의 숙주가 존재하였다. 많은 경우에서, 숙주 항체는 또한 상이한 비백신 아군의 야생형 바이러스를 중화할 것이다.
본 발명의 바람직한 유전자 위치이동 RSV는 사람에게서 자연적으로 순환하는 야생형 바이러스와 비교할 때, 매우 실질적인 독성의 감소를 나타낸다. 유전자 위치이동 바이러스는 충분히 약독화되어 대부분의 면역화된 개체에서 감염의 징후가 일어나지 않을 것이다. 어떤 경우에서, 약독화 바이러스는 예방접종되지 않은 개체에 여전히 유포될 수 있다. 그러나, 그 독성은 충분히 제거되어서 예방접종하였거나 또는 부수적인 숙주에서 심한 하기도 감염은 일어나지 않는다.
유전자 위치이동 RSV 백신 바이러스의 약독화의 수준은 예를 들면, 면역화된 숙주의 기도에 존재하는 바이러스의 양을 정량하고, 그 양을 야생형 RSV 또는 후보 백신 균주로 평가된 다른 약독화 RSV에 의해 생성된 것과 비교함으로써 결정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약독화 키메릭 바이러스는 야생형 바이러스의 복제 수준과 비교하여, 매우 감수성인 숙주(예, 침팬지)의 상기도에서의 복제가 예를 들면, 10 내지 1000 배 미만으로 더 크게 제한될 것이다. 또한, 침팬지의 상기도에 서 약독화 RSV 백신 균주의 복제 수준은 이전에 혈청반응음성인 유아에서 불완전하게 약독화된 것으로 입증된 RSV A2 ts-1 돌연변이체보다 적어야 한다. 상기도에서 바이러스의 복제와 관련된 비루의 발생을 더 감소시키기 위해, 이상적인 후보 백신 바이러스는 상기도 및 하기도에서 제한된 수준의 복제를 나타내야 한다. 그러나, 본 발명의 약독화 바이러스는 예방접종된 개체에 방어를 부여할 수 있을 정도로 충분히 감염성이고 면역원성이어야 한다. 감염된 숙주의 비인강에서 RS 바이러스의 수준을 결정하는 방법은 문헌에 널리 공지되어 있다. 비인강 분비물을 흡인하거나 또는 세척하여 표본을 얻고, 조직 배양 등에서 실험실적 방법에 의해 바이러스를 정량한다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용된 문헌[Belshe 등, J. Med, Virology 1: 157-162 (1977); Friedewald 등, J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694 (1968); Gharpure 등, J. Virol. 3: 414-421 (1969); 및 Wright 등, Arch. Ges. Virusforsch. 41: 238-247 (1973)]을 참조한다. 바이러스는 편의상 침팬지와 같은 숙주 동물의 비인강에서 측정될 수 있다.
어떤 경우에서는, 본 발명의 유전자 위치이동 RSV 백신을 다른 물질, 특히 다른 유년기 바이러스에 대한 방어적 반응을 유발하는 백신과 결합하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 유전자 위치이동 RSV 백신을 본원에 참고로 인용된 문헌[Clements 등, J. Clin. Microbiol. 29: 1175-1182 (1991)]에 기재된 바와 같이, 파라인플루엔자 바이러스 백신과 동시에 투여할 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, 키메릭 RSV는 본원에 기술한 바와 같이, PIV와 같은 다른 기도 병원균의 방어 항원을 코딩하는 서열을 감염성 재조합 RSV를 생성하는데 사용되는 유 전자 위치이동 RSV 게놈 또는 안티게놈에 포함시킴으로써, 상기 방어 항원에 대한 벡터로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 유전자 위치이동 RSV는 기도의 일시적 유전자 요법을 위한 벡터로 사용된다. 이 태양에 따르면, 유전자 위치이동 게놈 또는 안티게놈은 관심있는 유전자 생성물을 코딩할 수 있는 서열을 포함한다. 관심있는 유전자 생성물은 RSV 발현을 조절하는 것과 동일하거나 또는 상이한 프로모터의 조절을 받는다. 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 N, P, L 및 M2(ORF1)과 공동발현시킴으로써 생성되었으며 관심있는 유전자 생성물을 코딩하는 서열을 함유하는 감염성 RSV를 환자에 투여한다. 이는 완전히 감염성 (즉, 배양된 세포를 감염시키고, 감염성 후손을 제조하기 충분함)인 재조합 RSV를 포함할 수 있거나, 또는 예를 들면 G, F 및 SH 표면 당단백질 유전자 중 1 이상이 결여되고, 안정 또는 일시적 발현에 의해 트랜스에 이들 단백질 1 이상을 제공하는 세포에서 증식되는 재조합 RSV일 수 있다. 이러한 경우, 제조된 재조합 바이러스는 효과적인 감염에 충분할 수 있으나, 감염성 입자를 제조하는데는 매우 비효과적일 수 있다. 발현된 세포 표면 당단백질이 없다는 것은 또한 감염된 세포를 제거하는 숙주 면역체계의 효율을 감소시킬 것이다. 이들 성질은 외래 유전자의 발현의 내구성 및 안전성을 증가시킬 것다.
유전자 치료와 관련해서, 투여는 전형적으로 에어로졸, 분무기, 또는 치료될 환자의 기도로의 다른 국소 적용에 의한다. 유전자 위치이동 RSV는 목적하는 유전자 생성물의 치료적 또는 예방적 수준의 발현을 야기하기에 충분한 양으로 투여된 다. 이 방법으로 투여된 대표적 유전자 생성물은 예를 들면, 일시 발현에 특히 적합한 것, 예를 들면, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 감마-인터페론, GM-CSF, G-CSF, 에리트로포이에틴, 및 다른 사이토킨, 글루코세레브로시다제, 페닐알라닌 히드록시라제, 시스틱 피브로시스 경막 전도 조절제 (CFTR), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 사이토톡신, 종양 억제 유전자, 안티센스 RNA 및 백신 항원을 코딩하는 것 등이다.
예시를 위해 하기 실시예가 주어지나, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.
실시예 I
G 및 F 유전자가 프로모터 인접 위치에 단독으로 또는 조합되어 배열되어 있는 재조합 RSV의 구성
본 실시예는 G 및(또는) F 유전자(들)로 예시된 항원성 결정기를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들) 또는 게놈 분절(들)을 보다 프로모터-인접 위치로 이동시키는 감염성 RSV의 유전자 순서의 배열을 기술한다. 하기 제시된 하나의 실시예에서, G 및 F 유전자는 그들의 야생형 유전자 순서 위치로부터 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈의 재배열된 위치 1 및 2를 차지하도록 조화하여 움직인다. 이 조작은 상기한 바와 같이 (Whitehead, et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999, 본원에 참고문헌으로 삽입됨) SH 유전자가 결실된 RSV 안티게놈 RNA (RSV ΔSH)의 클로닝된 cDNA를 사용하여 행하였다. SH 유전자가 결실된 야생형 RSV는 생체외에서 완전 야생형 RSV만큼 또는 그보다 약간 더 성장하고, 생쥐의 상부 호흡기도, 및 침팬지의 상부 및 하부 호흡기도에서 약간 약독화된다 (Bukreyev et al., J. Virol. 71:8973-8982, 1997; Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999, 본원에 참고문헌으로 삽입됨). 그 면역원성 및 보호 효능의 수준은 야생형 바이러스에 거의 필적할 만하다. 따라서, RSV ΔSH 바이러스는 야생형 바이러스에 비해 약간 약독화되나, 매우 유사한 생물학적 특성을 가지며, 이들 연구에서 모 바이러스를 나타낸다. ΔSH 바이러스의 특성은 일반적으로 RSV 결실 돌연변이체의 증가된 유전적 안정성과 조합되어, 이 배경이 유전자 위치이동된 RSV의 생성에 대한 모 재조합으로서 특히 유용하게 하고, 회수 및 돌연변이체 유도체의 조작을 용이하게 한다.
안티게놈 cDNA 및 회수된 재조합 바이러스는 상기한 공정 및 방법을 사용하여 조작되었다 (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995; Bukreyev et al., J. Virol. 70:6634-6641, 1996; Bukreyev et al., J. Virol. 71:8973-8982, 1997; Whitehead et al., J. Virol. 72:4467-4471, 1998; Whitehead et al., Virology 247:232-239, 1998; Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11259-11264, 1999; Collins et al., Virology 259:251-255, 1999; Bukreyev et al al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2367-2372, 1999; Juhasz et al., Vaccine 17:1416-1424, 1999; Juhasz et al., J. Virol. 73:5176-5180, 1999; Teng and Collins, J. Virol. 73:466-473, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:9773-9780, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:871-877, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999; 미국 특허 제5,993,824호, 본원에서 참고로 삽입됨). 안티게놈 cDNA는 3개의 서브클론으로서 조작되었다. 하나의 서브클론인 D51/ΔSH는 T7 프로모터, 및 리더 영역으로부터 M 유전자의 하류 말 단까지 게놈의 좌측 핸드 말단을 포함한다. 제2 서브클론인 pUC19-GFM2는 유전자의 중앙으로부터 G, F 및 M2 유전자를 포함한다. 제3 서브클론인 D39는 L 유전자, 및 이어서 게놈의 우측 핸드 말단으로부터 트레일러, 및 이어서 자가 분열 리보솜 서열 및 직렬 T7 전사 터미네이터를 포함한다.
돌연변이성 프라이머를 갖는 PCR은 G 및 F 유전자를 각각 또는 함께 포함하는 cDNA의 말단을 단일 G-F cDNA로서 증폭하고 변형시킨다 (도 1). 삽입을 위해 G만의 cDNA의 제조를 위해 PCR을 사용하여 완전 재조합 RSV 안티게놈 서열의 뉴클레오티드 4692-5596 (G ORF를 개시하는 ATG로부터 G 유전자-종결 신호의 하류 말단까지 스패닝)을 증폭한다. PCR 프라이머는 G 유전자-종결 신호 직후 G-F 유전자가 (IG) 영역의 최초 6 뉴클레오티드, 이어서 NS1 유전자의 10-뉴클레오티드 GS 신호의 카피를 첨가하기 위해 설계되었다 (도 1). PCR 프라이머는 또한 증폭된 cDNA의 양 말단에 BlpI 부위를 첨가하기 위해 설계되었다. 삽입을 위한 F 유전자 단독의 cDNA를 제조하기 위해 PCR을 사용하여 완전 안티게놈 서열의 뉴클레오티드 5662-7551 (F ORF를 개시하는 ATG로부터 F 유전자-종결 신호의 말단까지 스패닝)을 증폭하였다. PCR 프라이머는 F 유전자-종결 신호 직후 F-M2 IG의 최초 6 뉴클레오티드, 이어서 10-뉴클레오티드 NS1 유전자-개시 신호의 카피를 첨가하기 위해 설계되었다. PCR 프라이머는 또한 cDNA의 양 말단 상에 BlpI 부위를 위치시켰다.
삽입을 위한 G 및 F 유전자를 포함하는 cDNA를 제조하기 위해, PCR을 사용하여 완전 안티게놈 cDNA의 뉴클레오티드 4692-7551 (G ORF의 ATG로부터 F 유전자-종결 신호의 말단까지 스패닝)을 증폭하였다 (도 1). PCR 프라이머는 또한 F 유전자-말단 신호 바로 뒤에 F-M2 IG의 최초 6 뉴클레오티드, 이어서 NS1 유전자-개시 신호의 카피를 첨가하기 위해 설계되었다. PCR 프라이머는 또한 cDNA의 양 말단 상에 BlpI 부위를 첨가하기 위해 설계되었다. 모든 cDNA는 그 전체를 서열분석하여 구조를 확인하였다.
G, F 또는 G-F cDNA의 삽입을 위한 프로모터-인접 부위를 제조하기 위해, NS1 유전자의 상류 비코딩 영역을 안티게놈 위치 92 (G 내지 C, 포지티브-센스) 및 97 (A 내지 C)에서 뉴클레오티드 치환에 의해 변형시킴으로써 BlpI 부위를 생성하였다 (도 1). 이 조작은 RSV 안티게놈 RNA의 최초 419 뉴클레오티드를 포함하는 BstBI-MfeI 서브클론상에서 행하였다. 뉴클레오티드 치환은 완전 플라스미드 상에서 PCR에 의해 도입하였다 (Byrappa et al., Genome Research 5:404-407, 1995; 본원에서 참고로 삽입됨). 변형된 BstBI-MfeI 단편을 D51/ΔSH에 재삽입하고, 이 서브클론을 차례로 상기 기재된 바와 같이 구성된 G, F 및 G-F BlpI cDNA 단편을 위한 수용체로서 사용하였다. Blp1이 비대칭 헵타머 인식 서열을 갖기 때문에, 단편은 정방향으로 삽입될 수만 있다.
G, F 또는 G-F cDNA가 프로모터 인접 위치에 놓일 때, 상응하는 유전자(들)이 정상 하류 위치로부터 결실되어 각 재조합 게놈이 G 및 F의 단일 카피를 혼입하였다 (도 1). G만을 결실시키기 위해, PCR을 pUC19-G-F-M2 상에서 행하여 StuI-HpaI 단편 (뉴클레오티드 5611-6419, G-F IG로부터 F유전자의 중앙까지 스패닝)을 증폭하였다. 또한, 이 PCR은 서열 TTAATTAAAAACATATTATCACAAA (서열번호 3)를 cDNA의 상류 말단에 첨가하였다. 이 서열은 PacI 부위를 포함하여 안티게놈 cDNA 가 SH 유전자-종결 신호 내에 위치한다. 이어서 이 조각은 PacI-HpaI 단편으로서 비변형 pUC19-GFM2의 PacI-HpaI 윈도우로 도입됨으로써 G 유전자를 결실시킨다. PCR을 행한 cDNA 단편의 서열은 디데옥시뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인하였다.
이와는 달리 F만을 결실시키기 위해, pUC19-GFM2 상에서 PCR을 행하여 뉴클레오티드 4618의 PacI 부위로부터 뉴클레오티드 5596의 G 유전자-종결 신호까지 관통하는 단편을 증폭하였다. 또한, 이 PCR은 서열 CACAATTGCATGC (서열번호 4)를 cDNA의 말단의 하류에 첨가하였다. 이 서열은 F-M2 IG 서열의 상류 부분, 및 이어서 재조합 RSV 안티게놈의 F-M2 IG에 존재하는 SphI 부위를 포함하였다. PacI-SphI 단편으로서 이 cDNA를 비변형 pUC19-GFM2의 PacI-SphI 윈도우로 클로닝하여 F 유전자가 결실되었다. PCR을 행한 cDNA 단편의 서열은 디데옥시뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인되었다.
G 및 F 유전자 모두를 결실시키기 위해, SphI-BamHI 단편을 바이라파 (Byrappa et al., Genome Research, 5:404-407 (1995)) 등의 방법에 의한 PCR을 사용하여 pUC-GFM2의 뉴클레오티드 7559-8506 (F-M2 IG로부터 M2/L 오버랩으로 스패닝)를 증폭하고, 서열 TTAATTAAAAACACAATT (서열번호 5)를 cDNA의 상류 말단에 첨가하였다. 생성된 cDNA 삽입체는 SphI 부위 직전에 PacI 부위 및 F-M2 IG의 상류 부분을 포함하나 G 및 F 유전자는 결실되었다. PCR을 행한 cDNA 단편의 서열은 디데옥시뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인되었다.
이어서, 완전 안티게놈 cDNA를 상기한 바와 같이 어셈블링하였다 (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995; Bukreyev et al., J. Virol. 70:6634-6641, 1996; Bukreyev et al., J. Virol. 71:8973-8972, 1997; Whitehead et al., J. Virol. 72:4467-4471, 1998; Whitehead et al., Virology 247:232-239, 1998; Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11259-11264, 1999; Collins et al., Virology 259:251-225, 1999; Bukreyev et al al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2367-2372, 1999; Juhasz et al., Vaccine 17:1416-1424, 1999; Juhasz et al., J. Virol. 73:5176-5180, 1999; Teng and Collins, J. Virol. 73:466-473, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:9773-9780, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:871-877, 1999; Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999; 및 미국 특허 제5,993,824호, 본원에서 참고로 삽입됨). 이 어셈블리는 Blp/ΔSH, G1/ΔSH, F1/ΔSH 및 G1F2/ΔSH 안티게놈 cDNA를 코팅하는 cDNA를 생성하였다.
이들 cDNA를 N, P, M2-1 및 L 지지 플라스미드와 함께 HEp-2 세포로 각각 트랜스펙션하고 32 ℃에서 배양하였다 (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995; Collins et al., Virology 259:251-255, 1999; 미국 특허 제5,993,824호, 본원에서 참고로 삽입됨). 트랜스펙션 상층액을 3일 후 새로운 세포에 통과시킨 다음, 3 내지 7일의 수확 간격으로 37 ℃에서 HEp-2 세포에 연속해서 통과시켰다. 보다 짧은 시간 간격이 F1/ΔSH 및 G1F2/ΔSH 바이러스로 감염된 단일층에 필요했는데, 이는 이들이 신시티움의 급속한 전개 및 연속적인 세포 파괴를 나타냈기 때문이다. 이는 F 유전자 위치 변형으로 인한 방추유전자 F 단백질의 증가된 발현을 반영하기 때문인 것으로 해석되었다. 각각의 수확된 상층액의 분액을 플래쉬 동결시키고 동시에 도 2에 나타낸 바와 같이 적정하였다. 이들 결과는 G1F2/ΔSH 및 F1/ΔSH 바이러스의 회수 및 증폭 효과가 Blp/ΔSH 또는 G1/ΔSH 바이러스보다 우수하며, 또한 ΔSH 바이러스 및 야생형 바이러스와 관련하여 결정되었음을 가리킨다.
전체 RNA를 각각의 재조합 바이러스로 감염된 세포로부터 단리하고, 적절한 게놈 분절의 RT-PCR을 행하여 엔지니어링된 게놈이 설계되고 구성된 바를 확인하였다. 또한, 노던 블롯 분석으로 적절한 서브게놈 mRNA의 발현을 확인하였다.
이어서, 하기 바이러스를 생체외 항원 제조 및 성장의 동역학에 관해 비교하였다: 야생형 RSV (SH 유전자 포함), ΔSH (SH 유전자는 결실되었으나 NS1 비코딩 영역 중 BlpI 부위 포함하지 않음), Blp/ΔSH, G1/ΔSH 및 G1F2/ΔSH. HEp-2 세포 및 베로세포의 복제 단일층 배양액을 1시간의 흡착기간 (-1 내지 0시간)에 세포당 0.1 플라크 형성 단위 (PFU)의 MOI로 감염시켰다. 이어서, 단일층을 3회 세척하고 37 ℃에서 배양하였다. 바이러스 당 2개의 복제 단일층을 t = 0시간에 흡착후 즉시 시작하여 12시간 간격으로 수확하였다. 배지 상층액을 플라크 검정에 의해 후에 분석하기 위해 플러쉬 동결시키고 방출된 감염성 바이러스를 정량하였다 (도 3A). 이는 바이러스가 베로 (도 3A, 상부 패널) 및 HEp-2 (도 3A, 하부 패널) 세포에서 감염성 바이러스 제조에 그 능력이 필적할만함을 나타냈다.
동일한 실험에서, 각 시점으로부터 베로 세포 단일층 (도 3A, 상부 패널)을 수확하고 웨스턴 블롯팅에 의해 분석하여 G-단백질의 발현을 특성화하였다 (도 4). 각 시점으로부터의 전체 감염된 세포 단백질의 샘플을 변성 폴리아크릴아미드 겔 중에서 전기영동하여 니트로셀룰로스로 변환하고, G-단백질의 펩티드에 특이적인 항혈청과 함께 배양함으로써 분석하였다. 결합 항체를 검출하였으며 시판 화학발광 키트를 사용하여 정량화하였다. 항체는 G-단백질의 2개의 주요 세포 결합 형태, 즉 보다 큰 90 kDa 완전 성숙 형태 및 보다 작은 50 kDa 불완전 글리코실화 형태를 결합하였다. 이 비교는 감염성 입자의 생성이 모든 바이러스에 대해 유사하나 (도 3A, 상부 패널), 세포-결합된 G 단백질의 양은 G1/ΔSH 또는 G1F2/ΔSH 바이러스로 감염된 세포에서보다 상당히 크다는 것을 보여주었다 (도 4). 노출된 필름의 농도계에 의한 겔 밴드의 정량화는 G1/ΔSH 및 G1F2/ΔSH 바이러스가 G 단백질이 Blp/ΔSH 바이러스를 발현한 것보다 각각 6배 및 4배 발현하였음을 가리켰다.
F1/ΔSH 또는 G1F2/ΔSH 바이러스로 감염된 세포 단일층은 상기한 바와 같은 신시티움 형성을 포함하는 세포변성 효과의 빠른 개시를 나타냈다. 이는 F 단백질의 증가된 발현을 반영하는 것으로 해석되었다. 이 향상된 세포변성 효과는 백신 바이러스로의 생체내 감염이 이들 산란된 세포에 대한 세포변성원성의 작용이 더욱 신속하든 아니든 사멸하여 대체되는 외피 세포의 소량만을 포함하기 때문에 백신으로서 상기 바이러스의 사용에 금기를 나타내지 않을 것이다. 그러나, 만약 생체외 세포변성원성이 덜 신속하다면 더 높은 바이러스 역가가 성취될 수 있을 것이다. 이들 인자의 분석은 고도로 약독화된 배경 중에 유전자 위치이동된 RSV의 구성에 의해 성취될 수 있다. 본원에서 유전자 이동이 RSV의 성장을 간섭하지는 않으나, G 단백질의 전체 발현을 몇배 증가시켰다는 것이 주목할만하다.
또다른 연구로, 유전자 이동 바이러스의 HEp-2 및 베로 세포 단일층 중에서의 복제 능력을 감염의 다중도가 3.0인 실험으로 비교하였다 (도 3B). 이는 유사한 결과를 나타낸 2개의 별도의 실험으로 행하였다. 하나의 실험에 대한 데이타를 도 3B에 나타낸다. 이 단일 주기 성장 분석에서, 프로모터 인접 위치 중에 G 및(또는) F를 포함하는 3개의 바이러스 각각, 즉 G1/ΔSH, F1/ΔSH 및 G1F2/ΔSH를 대조군 바이러스 Blp/SH보다 효율적으로 복제하였다. 또한, 이 차이는 HEp-2 세포보다 베로 세포에서 더 컸다. 예를 들어, 감염 후 24시간에 G1/ΔSH 바이러스의 역가는 HEp-2 세포 중 Blp/SH 대조군에 대해 6.8 ×106 PFU/㎖이었던 것에 비해 7.2 ×106 PFU/㎖로 차이가 0.4log10이었으며, 베로 세포에서의 대표값은 G1/ΔSH 바이러스에 대해 6.6 ×106 PFU/㎖ 및 Blp/ΔSH 대조군 바이러스에 대해 5.6 ×106 PFU/㎖로 그 차이는 1.0log10이었다. 기타 유전자 이동 바이러스 각각은 또한 대조군 바이러스보다 과량의 역가를 가졌다. 즉 본 실시예에서 프로모터 인접 위치로 G 및(또는) F의 이동은, 대량 바이러스 생산의 유용한 세포주인 베로 세포 중 10배의 최대 수율로 HEp-2 및 베로 세포 모두에서 바이러스 수율의 증가를 나타냈다.
유전자 이동 재조합 바이러스는 또한 BALB/c 생쥐의 상부 및 하부 호흡기도에서의 복제 능력에 대해 조사하였다. 각 군당 18마리의 생쥐를 각각 G1/ΔSH, F1/ΔSH, G1F2/ΔSH 또는 대조군 바이러스 Blp/ΔSH로 마리 당 106 PFU씩 감염시켰 다. 각 군의 6마리를 감염 후 3, 4 및 5일째에 치사시키고, 비갑개 및 폐를 수확하여 플라크 검정에 의해 분석하여 각각 상부 및 하부 호흡기도 중 바이러스 역가를 측정하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 Blp/ΔSH 및 F1/ΔSH 바이러스의 복제 수준은 실질적으로 구분할 수 없었다. 즉, F1/ΔSH 바이러스는 생체외에서 다소 효과적으로 복제하였더라도 그 생체내 복제는 변화가 없었다. 증가된 복제 또는 발병력의 부재는 약독화 돌연변이체의 첨가에 의해 유전자 이동 바이러스의 변형을 단순화할 것이다. G1F2/ΔSH 바이러스의 복제는 특히 감염 초기에 "야생형" Blp/ΔSH 대조군보다 근소하게 낮았으며, G1/ΔSH 바이러스의 복제 역시 낮았다. 예를 들어, 3일째 G1/ΔSH 바이러스는 Blp/ΔSH 대조군에 비해 상부 및 하부 호흡기도에서 0.7log10만큼 낮았다.
프로모터 인접 위치에서 G 및(또는) F 유전자를 포함하는 재조합 RSV의 생쥐의 상부 및 하부 호흡기도에서의 복제
비갑개 평균 역가 ±SE (log10 PFU/g 조직) 폐 평균 역가 ±SE (log10 PFU/g 조직)
바이러스1 3일째 4일째 5일째 3일째 4일째 5일째
Blp/ΔSH 4.2 ±0.17 4.0 ±0.32 3.5 ±0.2 3.6 ±0.26 4.1 ±0.37 4.5 ±0.09
G1/ΔSH 3.5 ±0.24 3.4 ±0.54 3.5 ±0.24 2.9 ±0.2 3.9 ±0.34 4.6 ±0.13
F1/ΔSH 4.4 ±0.11 4.1 ±0.1 3.9 ±0.12 3.9 ±0.09 4.7 ±0.08 4.9 ±0.16
G1F2/ΔSH 3.3 ±0.50 3.5 ±0.13 3.3 ±0.13 3.1 ±0.13 4.2 ±0.28 4.1 ±0.07
1. 군당 18마리의 BLAB/C 생쥐를 0일째에 지시된 바이러스를 마리당 106 PFU로 비강접종하였다. 3, 4 및 5일째 군당 6마리를 치사시키고 비갑개 및 폐를 수확하여 플라크 검정에 의해 바이러스 역가를 측정하였다. 평균 역가는 지시된 표준 편차와 함께 나타낸다.

즉, 프로모터 인접 위치로 하나 이상의 유전자를 이동하거나, 일반적인 RSV 유전자의 재배열은 생체내 복제에 대한 바이러스를 적당히 약독화할 수 있다. 이는 약독화의 유용한 방법의 메뉴에 추가되기 때문에 약독화된 백신 균주를 설계하는 데 가치가 있다. 또한, 다른 종류 또는 유형을 대표하는 약독화 돌연변이체, 예컨대 온도 민감성 돌연변이, 온도 둔감성 돌연변이, 유전자 결실 등을 갖는 것이 중요하다. 상이한 유형의 돌연변이는 상이한 방법으로 작동하여 바이러스성 표현형에 영향을 미치고, 단일 백신 중 다중형 돌연변이의 존재는 증가된 안정성을 부여한다. 유전자 이동에 의한 약독화는 본원에서 약독화 돌연변이의 유용한 추가 종류를 나타낸다. 본 발명에 따른 유전자 이동이 적당한 약독화를 부여할 수 있다는 발견은 백신 균주의 약독화 표현형의 미세 조정에 유용한 새로운 도구를 제공한다.
본 발명 내에서 특정 유용한 약독화 돌연변이는 약독화가 특정 조건 (예, 생체외) 하에서 최소이며, 다른 조건 (예, 생체내) 하에서 최대인 "조건성" 변종이다. 생체외에서 최소이거나 효력이 없는 약독화 표현형은 세포 배양액 중에서 불량하게 성장하는 RSV 및 기타 바이러스의 경우 특히 중요한 백신 바이러스를 효과적으로 생성할 수 있도록 한다. 물론, 여기에 예시한 바와 같이 약독화 표현형은 백신 바이러스의 질병 및 반응원성을 감소시키기 위해 생체내에서 효력이 있다.
여기서 나타낸 G1/ΔSH 재조합은 특히 유전자 이동으로 인한 특징의 바람직한 조합을 예시한다. 특히, 생체외 성장은 실질적으로 10배 증가한 반면, 생체내 복제는 다소 감소하였다. 이는 상기한 바와 같이 생체내 약독화와 연결되어 백신 생성의 향상된 효율 및 향상된 항원 발현의 잇점을 제공한다.
생체내 유전자 이동 바이러스의 면역원성을 BALB/c 생쥐에서 조사하였다. 군당 생쥐 6마리를 상기한 바와 같은 바이러스 각각으로 감염시키고, 혈청 샘플을 접종 1일 전 및 접종 28일 및 56일째에 채취하였다 (표 2). 혈청 샘플을 IgG에 특이적인 당단백질-특이 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 분석하였다. G 단백질-특이 IgG의 분석은 F1/ΔSH 및 G1F2/ΔSH 바이러스에 대한 반응이 Blp/ΔSH 대조군 바이러스에 대한 것과 매우 유사함을 나타냈다. 한편, G1/ΔSH 바이러스에 대한 G-특이 반응은 다소 감소하였다 (4배 이하). 이는 상기 표 1에 기재된 바와 같이 이 바이러스의 감소된 복제에 적어도 일부 기인하는 듯하다. F-특이 반응의 분석은 F1/ΔSH 및 G1F2/ΔSH 바이러스가 G1/ΔSH 및 Blp/ΔSH 바이러스에 비해 항체 수준에서 약간 증가 (2.5 내지 4배)하였음을 나타내며, 이는 F 유전자의 프로모터 인접 위치로의 이동이 증가된 생체내 항원 발현 및 증가된 면역원성을 일으킨다는 해석과 일치한다. 또한, 이들 결과는 유전자 이동이 면역화 바이러스의 전체적인 복제가 변화하지 않는 조건 하 생체내 면역원성을 증가시킬 수 있음을 나타냈다. 이는 Δ가 야생형 모 바이러스보다 본질적으로 더 면역원성인 RSV 백신을 제조하기 위한 특정 방법을 제공하므로 매우 바람직한 결과이다. 생쥐 모델이 바이러스의 생물학적 특성을 동정하고 특성화하는 데 사용될 수 있으며, 여기에 나타낸 바와 같은 새로운 바람직한 특징을 드러낼 수 있음이 주목되어야 한다.
프로모터-인접 위치에 G 및(또는) F 유전자를 포함하는 재조합 RSV로 감염된 생쥐의 혈청 항체 반응 또는 당단백질-특이 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의한 측정
지시된 RSV 단백질에 대한 혈청 면역글로불린 G ELISA 역가 (평균 역log2±SE)2
바이러스1 군당 마리수 항 RSV G IgG 항 RSV F IgG
접종전 28일째 56일째 접종전 28일째 56일째
Blp/ΔSH 6 ≤5.3±0 9.6±0.6 11.7±0.8 ≤5.3±0 10.3±0.4 12.0±0.4
G1ΔSH 6 ≤5.3±0 9.0±0.6 9.6±0.6 ≤5.3±0 10.0±0.4 12.0±0.7
F1ΔSH 6 ≤5.3±0 9.6±0.9 11.6±0.6 ≤5.3±0 11.6±0.3 13.6±0.3
G1F2ΔSH 6 ≤5.3±0 9.3±0.7 11.6±0.8 ≤5.3±0 12.3±0.4 14.0±0.4
1. 군 당 6 마리의 BALB/C 생쥐를 0일째 접종원 0.1 ㎖ 중 106PFU의 바이러스로 비강내 접종하였다. 2. 혈청 샘플을 접종 1일 전 (접종전) 및 접종 후 28일 및 56일째에 채취하여 지시한 바와 같이 RSV G 또는 F 단백질에 대한 IgG 항체에 대해 당단백질-특이 ELISA에 의해 분석하였다. 평균 역가는 지시된 표준 편차로 나타냈다.

실시예 Ⅱ
고도로 약독화된 배경의 프로모토 인접 이동된 위치에 G 및 F 유전자를 혼입시키는 재조합 RSV
상기 기재된 유전자 이동 돌연변이를 SH 유전자가 결실된 유전자 배경에 도입하였다. 야생형 바이러스에서, 이 결실은 세포 배양액 중 성장을 다소 향상시키고 생체내에서 다소 약독화한다 (Bukreyev et al., J. Virol. 71:8973-8982, 1997; Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999, 본원에 참고로 삽입됨). 그러나, RSV-투약되지 않은 유아 및 어린이에 대한 투여에 안전한 RSV 백신 바이러스는 ΔSH 결실 단독에 의해 제공되는 것보다 더 약독화를 요구한다. 따라서, 본 실시예는 본 발명의 유전자 이동 돌연변이가 고도로 약독화된 배경에서 성공적으로 회수될 수 있음을 증명하기 위해 제공된다.
본 발명의 양태를 예시하기 위해 2개의 배경이 선택되는데, 그 중 하나는 SH 및 NS2 유전자가 결핍된 것이며, 다른 하나는 SH, NS1 및 NS2 유전자가 결핍된 것이다. 상기 삽입된 참고문헌에 기재된 바와 같이, ΔNS2 및 ΔNS1 결실은 각각 그 자체로 고도로 약독화된다 (Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999). 비록 백신 생성 조건 하에서 ΔNS2 바이러스의 수율이 야생형 바이러스에 필적할만하게 성취되더라도, 생체외에서 돌연변이를 포함하는 바이러스의 생성은 지연되거나 감소된다. 침팬지에서, ΔNS2 및 ΔNS1 바이러스는 각각 복제 및 질병에 대해 고도로 약독화되고, RSV 감염에 대해 고도로 면역원적 및 보호적이다. 각 돌연변이 단독은 그 자체나 또는 다른 돌연변이와 조합하여 재조합 백신 바이러스에 포함되기에 우수한 후보물이다. ΔNS1 및 ΔNS2 돌연변이는 함께 ΔNS2 바이러스보다 생체내에서 더욱 고도로 약독화된 바이러스를 생성한다. 본 실시예에서, 이들 결실의 추가 조합이 구성되어 추가의 유전자 위치이동된 돌연변이를 지지하는 능력에 대해 시험되었다.
안티게놈 cDNA를 G 및 F 유전자가 NS2 및 SH 유전자가 결실된 안티게놈의 위치 1 및 2로 이동하도록 구성 (G1F2/ΔNS2ΔSH (도 5, 패널 A)라 칭함)하거나, 또는 NS1, NS2 및 SH 유전자가 결실된 안티게놈의 위치 1 및 2로 이동하도록 구성 (G1F2/ΔNS1ΔNS2ΔSH (도 5, 패널 B)라 칭함)하였다. 이들 안티게놈 cDNA를 상기 실시예 Ⅰ에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스를 회수하는 데 사용하였다. 두 경우 모두, 재조합 바이러스는 쉽게 회수되어 생체외 번식되었다. 즉, 본 실시예는 프로모터 인접 위치로 이동된 G 및 F 유전자와 함께 다수의 약독화 돌연변이를 포함하는 유전자 위치이동된 RSV가 쉽게 생성되고 회수될 수 있음을 증명한다. 이들 및 기타 유전자 위치이동된 RSV는 본원에 기재된 방법에 따른 적합한 백신 후보물을 선택하기 위해 복제 및 항원 발현, 뿐만 아니라 생체내 성장, 면역원성 및 보호 효능의 수준에 대해 분석될 것이다.
상기 실시예에서, 생-약독화된 백신으로서의 특성을 개선하기 위해 RSV의 유전자 순서에 대표적 변화가 이루어졌다. 구체적으로, G 및 F 유전자는 단독으로 그리고 함께 프로모터에 보다 인접한 위치로 이동하였다. 이러한 두 단백질은 통상적으로 RSV 유전자 순서 중 7 (G) 및 8 (F)를 차지한다 (NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L). 성공적인 회수 가능성을 증가시키기 위해, SH 유전자가 제거된 RSV 버전을 조작하였다. 이어서, G 및 F는 위치 1로 개별적으로 이동하거나, 각각 위치 1 및 2로 함께 이동하였다. 놀랍게도, 재조합 RSV는 G 또는 F가 위치 1로 이동하거나, G 및 F가 각각 위치 1 및 2로 이동한 것에서 용이하게 회수되었다. 이 결과는 단일 VSV 당단백질 유전자가 단지 2곳의 위치로 이동하는 것이 바이러스 성장에 매우 해롭다는 VSV에 대한 선행 연구와 크게 상이하였다. 또한, 이러한 변형된 바이러스를 회수하는 능력은 RSV의 복제가 불충분하기 때문에 그리고 RSV가 복잡한 유전자 순서 및 다수의 위치 변화를 수반하는 당단백질 유전자의 이동을 가지기 때문에 놀라운 것이었다. 실제로, 재배열된 RSV는 적어도 야생형 유전자의 순서를 갖는 이들의 직접적인 모체와 마찬가지로 성장한다. 상기한 바와 같이, 이는 RSV에 대해 특히 중요하며, 그 이유는 야생형 바이러스가 세포 배양에서는 불충분하게 성장하고, 또한 시험관 내 복제에서의 감소는 백신 제조를 수행할 수 없게 하기 때문이다. NS1-NS2-N-P-M 단백질 모두가 성장 적응도에 있어서 현저한 감소없이 프로모 터에 대하여 하나 또는 2곳의 위치로 치환될 수 있음은 주목할 만한 것이다. 또한, G 당단백질의 발현에대한 검사는 그의 모 바이러스에 비해 최대 수배까지 증가됨을 나타냈다. 이는 제1 위치에 G 및(또는) F를 함유한 백신 바이러스가 다른 바이러스 단백질과 비교하여 이러한 보호 항원을 보다 높은 몰량으로 발현하고, 따라서 매우 바람직한 백신 특성을 갖는 바이러스를 제공함을 나타낸다.
또한, 유전자 순서에 있어서의 변경은 NS2 유전자가 상기한 바와 같이 단독으로 제거되거나, NS1 및 NS2가 함께 제거되는 선행 작업에서 제조된 2종의 크게 약독화된 백신 후보를 사용하여 달성되었다. 이러한 2종의 백신 후보에 있어서, G 및 F 당단백질은 각각 위치 1 및 2로 함께 이동하고, G, F 및 SH 당단백질은 이들의 원래 하류 위치에서 제거되었다. 따라서, 회수된 바이러스 G1F2△NS2△SH 및 G1F2/△NS1△NS2△SH은 G 및 F 유전자의 이동 이외에 개별적으로 제거된 2 및 3종의 유전자를 보유하였다. 수반된 변화의 정도를 기술하기 위하여, 야생형 RSV (NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L) 및 G1F2/△NS2△SH 바이러스 (G-F-NS1-N-P-M-M2-L) 또는 △NS1△NS2△SH (G-F-N-P-M-M2-L)의 유전자 순서를 비교할 수 있다. 이는 프로모터에 대한 대부분 또는 모든 유전자의 위치가 변화되었음을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 이러한 크게 약독화된 유도체는 세포 배양에 있어서 성장능력을 유지하며, 백신 바이러스 후보의 발생을 위한 이들의 명백한 유용성을 나타내었다.
실시예 III
프로모터에 인접 이동된 위치에 HRSV G 및 F 유전자를 포함하는 키메릭 BRSV/HRSV의 구성
본 실시예는 HRSV G 및 F 유전자가 재조합 소 RSV (rBRSV) 배경으로 치환된 감염성 rBRSV/HRSV 키메라의 구성을 기술한다. 얻은 인간-소 키메라는 HRSV 유전자 2 개 (즉, G 및 F), 및 BRSV 유래의 유전자 8개 (즉, NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 및 L)을 포함한다. 소 RSV 배경 (rBRSV/A2를 지칭) 중 G 및 F 유전자에 상응하는 야생형 위치에서 치환된 G 및 F 유전자를 갖는 인간-소 RSV 구성를 기재하고 추가의 상세한 설명이 미국 특허 출원 번호 제09/602,212호 (부홀츠 등에 의해 2000년 6월 23일에 출원됨), 이에 상응하는 PCT 출원 (2001년 1월 18일 WO01/04335호로 공개됨), 및 이의 우선권으로서 미국 가출원 제60/143,132호 (1999년 7월 9일 출원됨)에 제공되며, 이들은 각각은 본원에 참고문헌으로 삽입되었다.
rBRSV/A2의 기본적 치환된 당단백질 구성 외에도, 본 실시예에서 HRSV G 및 F 유전자는 또한 rBRSV 골격에서 더욱 프로모터에 인접한 위치, 즉 BRSV 게놈 중의 F 및 G 유전자의 야생형 유전자 순서 위치에 대하여 이동하였다. 더욱 구체적으로는, F 및 G 유전자는 프로모터에 대하여 통상의 위치, 즉 각각 유전자 위치 7 및 8로부터 각각 위치 1 및 2로 이동하였다. 이 목적을 달성하기 위하여, 뉴클레오티드 치환을 만들어 각각 위치 67, 4673 및 7471에 독특한 NotI, SalI 및 XhoI 부위를 생성한 완전한 감염성 rBRSV를 상기와 같이 제조하였다 (도 6, 패널 A)(Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000, 본원에 참고문헌으로 삽입됨). NotI 위치는 BRSV NS1 유저자의 상류 비번역 영역 내에 포함되고, SalI 및 XhoI 부위는 유전자간 영역에 있다. rBRSV 안티게놈 cDNA를 SalI 및XhoI로 소화시킨 것은 전체에서 BRSV G 및 F 유전자를 절단하였고, 리게이션되는 혼화성 점착 말단을 생성하였다 (도 6, 패널 B). G 및 F 유전자가 없고, 다음의 서열 내에 64-뉴클레오티드 SH-M2 유전자간 영역을 포함하는 rBRSV 안티게놈 cDNA가 생기게 하였다: TTAAACTTAAAAATGGTTTATGtcgaGGAATAAAATCGATTAACAACCAATCATTCAAAAAGAT (SEQ ID NO. 6) (최초 절단된 SalI 및 XhoI 부위의 4뉴클레오티드 점착 말단을 소문자로 나타냄). 비교하자면, 천연 발생 BRSV F-M2 유전자간 서열은 길이가 55 뉴클레오티드이다.
HRSV G 및 F 유전자를 포함하는 cDNA는 cDNA 말단을 변형하기 위해 사용되는 돌연변이유발 프라이머로 PCR에 의해 제조하였다. 구체적으로, PCR을 사용하여 완전한 HRSV 안티게놈 cDNA (G ORF의 ATG로부터 F 유전자 종결 신호의 말단까지 스패닝)의 뉴클레오티드 4692-7551을 증폭하였고, 프라이머는 F 유전자 종결 신호 직후에 F-M2 IG의 최초 6 뉴클레오티드에 이어서 NS1 유전자 개시 신호의 복사본을 첨가하기 위해 설계하였다. PCR 프라이머는 또한 cDNA의 양 말단 상에 BlpI 부위 및 NotI 부위를 첨가하기 위해 설계하였다. PCR하는 cDNA 단편의 서열은 디데옥시뉴클레오티드 서열분석에 의해 확인하였다. 이어서, 이 cDNA는 상기 기술한 바와 같이 G 및 F 유전자가 없는 rBRSV 안티게놈 cDNA의 독특한 NotI 부위로 NotI 단편으로 삽입하였다. 올바른 재조합체는 제한 단편 매핑으로 확인하였고, rBRSV/A2-G1 F2로 지정하였다. 코딩되는 게놈 RNA의 구조는 도 6, 패널 C에 도시한다. 도시한 바와 같이, cDNA에서 G 및 F 유전자를 프로모터에 대하여 위치 7 및 8에서 위치 1 및 2로 이동하였다.
rBRSV/A2-G1 F2의 안티게놈 RNA를 코딩하는 플라스미드는 N, P, M2-1 및 L 지지 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 상기 기술한 바와 같이 T7 RNA 중합효소를 안정적으로 발현하는 BSR T7/5 세포로 트랜스펙션하였고 (또한, 본원에 참고문헌으로 삽입한 문헌[Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000] 참조), 감염성 바이러스를 회수하였다. 회수한 rBRSV/A2-G1F2 바이러스는 인간 HEp-2 세포 및 소 MDBK 세포에서 다주기 성장의 효능에 대하여 rBRSV, rHRSV (또한 rA2로 지칭함) 및 rBRSV/A2와 비교하였다. 상기 기술한 바와 같이 (또한, 본원에 참고문헌으로 삽입한[Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000] 참조), rHRSV는 HEp-2 세포에서 rBRSV 보다 더욱 효과적으로 성장하고, rBRSV/A2 바이러스는 각 부모의 중간 효율로 성장한다. 도 11에 나타낸 바와 같이, rBRSV/A2-G1F2의 복제 효율은 rbRSV/A2의 것과 구별할 수 없었다. 따라서, 뜻밖에도 G 및 F 유전자의 위치에서의 변화는 시험관내 성장의 효율을 감소시키지 않았고, 이 신규 결과는 RSV 백신 바이러스의 효율적인 제조를 가능케한다.
면역형광을 wt HRSV 또는 키메릭 바이러스 rBRSV/A2 또는 rBRSV/A2-G1F2로 감염시킨 HEp-2 세포 상에서 수행하였다. 이는 HRSV G 또는 F 단백질에 특이적인 2 개의 모노클로날 항체 (즉, 각각 021/01G 및 44F)를 사용하여 수행하였다 (Lopez et al., J. Virol. 72:6922-6928, 1998; Melero et al., J. Gen. Virol. 78:2411-2418, 1997). 각 모노클로날 항체를 개별적으로 염색하였다. 상기 검정이 반 정량적일지라도, 검정이 wt rBRSV 및 rBRSV/A2 간에 신뢰가능하게 구분되는 것을 선 행 측정하였다 (후자의 것은 BRSV 골격 중 정상 게놈 위치에 HRSV G 및 F 유전자를 가짐). 특히, wt HRSV는 효율적이고 광범위한 항원 발현을 지시하는 면역형광의 매우 강력하고 광범위한 패턴을 나타내는 반면, rBRSV/A2는 더욱 약하고, 더 분산되고, 덜 광범위한 패턴을 나타낸다 (Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000, 본원에 참고문헌으로 삽입됨). rBRSV/A2-GIF2에 대해 수행한 유사한 검정은 이 프로모터 이동 키메릭 바이러스의 면역형광 패턴이 wt HRSV의 것과 매우 유사함을 보여준다. 이 결과는 G 및 F 당단백질의 발현 증가와 일치한다. 동시에, rBRSV/A2-G1F2와 연관된 세포병변 효과는 wt HRSV에 필적하게 감소하였고, 상기 기술된 바와 같은 rBRSV/A2의 것과 더욱 밀접히 닮았다 (Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000, 본원에 참고문헌으로 삽입함). 구체적으로, rBRSV/A2 및 rBRSV/A2-G1F2는 더 적고 작은 신시티움을 유도하였다.
따라서,본 실시예는 영장류의 기관에서 복제가 강력히 약독화된 BRSV의 배경 중에 HRSV의 주요한 방어 항원 (G 및 F 단백질)에 대한 유전자를 포함하는 rBRSV/A2 인간-소 키메릭 RSV 바이러스의 변형을 제공한다. rBRSV/A2 바이러스는 영장류에서 크게 약독화되게 하는 강력한 숙주 범위 제한을 갖는다. 본 rBRSV/A2-G1F2 바이러스가 유전적 배경에 BRSV 유전자의 동일 배열을 지니므로, 이러한 강력한 숙주 범위 제한 표현형을 공유하고, 이에 의해 2 개의 주요한 방어 항원의 발현을 증가시키는 듯 하다. 이들 2 방어 항원의 생체내 발현 증가는 바이러스의 면역원성을 증가시키리라 예측된다. 따라서, 본 실시예는 HRSV 유전자를 프로모터에 인접한 위치로 이동하는 것에 의해 rBRSV/A2 바이러스를 변형하고 개선하는 것을 제공한다. 이 강도의 위치이동, 즉 G 및 F 유전자가 프로모터 위치에 대하여 야생형 위치 7 및 8에서 신규 위치 1 및 2로 이동하는 것은 이전에 기술되지 않았다.
실시예 IV
HRSV로부터 유래하는 외피 연관 M, G 및 F 단백질을 갖는 키메릭 BRSV/HRSV의 구성
본 실시예는 상기 기술된 바와 같은 rBRSV/A2 키메라 (BRSV 숙주 범위 약독화 배경에 HRSV G 및 F 보호 항원 유전자를 갖는 것)을 닮은 항원성 키메라 바이러스의 변형을 포함하는 인간-소 키메릭 배경내에 생성된 또다른 유전자 위치이동된 RSV를 설명한다. BRSV 및 HRSV 모두는 4 개의 다음의 외피 연관 단백질을 갖는다: 주요한 보호 항원인 G 및 F 당단백질, HRSV의 중화 또는 보호 항원임이 나타나지 않는 미지의 기능의 작은 소수성 SH 단백질 (Whitehead et al., J. Virol. 73:3438-3442, 1999; Connors et al., J. Virol. 65:1634-1637, 1991, 각각 본원에 참고문헌으로 포함됨); 및 보호 항원은 아니나 비리온 조합에 중요한 비글리코실화 내부 매트릭스 M 단백질 (Teng and Collins, J. Virol. 72:5707-16, 1998, 본원에 참고문헌으로 포함됨).
본 실시예에서, 모든 4개의 BRSV 외피 연관 단백질 유전자 (즉, BRSV M, SH, G 및 F)가 결실되고, 3개의 HRSV 외피 연관 단백질 유전자 (즉, M, G 및 F)가 대신 삽입된 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스를 제조하였다. 이를 통해 SH 유전자의 길이에 상응하는 한 유전자의 길이 만큼 F 및 G 당단백질 유전자의 프로모터에 인접한 유전자 이동이 얻어진다.
상기 기술된 rBRSV/A2 구성물 (Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000, 본원에 참고문헌으로 포함됨)은 P 및 M 유전자 간의 유전자간 영역 내에 위치 3204 에서 독특한 MluI 자리를 포함하도록 변형하였다 (도 9, 패널 A;P-M IG). 이는 5 뉴클레오티드 치환의 도입을 포함한다. 뉴클레오티드 서열 위치 번호는 완전한 rBRSV 안티게놈과 관련되고 (Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000; 진뱅크 수탁 번호 AF092942 또는 문헌[Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567, 1995]의 완전한 rHRSV 안티게놈; 각각 본원에 참고문헌으로 포함됨), HRSV 서열을 지칭하는 서열 위치 번호는 밑줄을 그었다. MluI-SalI 단편을 절단하고, M 유전자를 갖는 MluI-SalI 단편에 의해 대체하였다.
도 9, 패널 B를 참고하면, HRSV M 유전자를 포함하는 cDNA를 cDNA의 말단에 변화를 도입하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭하고 변형하였다. 구체적으로, M cDNA를 그 상류 말단이 MluI 자리, 이어서 P-M 유전자간 영역의 마지막 뉴클레오티드 (HRSV 및 BRSV에서 동일한 것), 이어서 완전한 HRSV M 유전자, 이어서 HRSV SH-G 유전자간 영역의 최초 4 뉴클레오티드, 이어서 SalI 자리를 포함하도록 변형하였다. 이 cDNA의 서열은 전체로 정확함을 확인하였다. 이를 MluI 및 SalI로 소화시키고, rBRSV 안티게놈의 MluI-SalI 윈도우로 클로닝하였다. 이는 rBRSV/A2-MGF를 생성하였다. 도 9, 패널 C에 도시한 바와 같이, 이 키메라는 6 개의 BRSV 유전자 (즉, NS1, N52, N, P, M2 및 L) 및 3 개의 HRSV 외피 연관 단백질 유전자 (즉, M, G 및 F)의 골격을 포함하였다.
이 안티게놈 플라스미드는 N, P, M2-1 및 L 지지 단백질을 코딩하는 플라스미드와 함께 이전에 상세히 기술된 바와 같이 T7 RNA 중합효소를 안정하게 발현하는 BSR T7/5 세포 내로 트랜스펙션하였고 (Buchholz et al., J. Virol. 73:251-259, 1999; Buchholz et al., J. Virol. 74:1187-1199, 2000, 각각 본원에 참고문헌으로 포함됨), 감염성 바이러스를 회수하였다. 따라서, 본 실시예는 또한 G 및 F 유전자의 프로모터 인접 이동을 생성하는 유전자 삭제를 포함하는 유전자 위치이동된 RSV가 쉽게 제조되고 회수될 수 있다는 것을 입증하였다. 이 유전자 위치이동된 RSV 및 다른 유전자 위치이동된 RSV는 복제 및 항원 발현의 수준 뿐만 아니라 성장, 면역원성 및 보호 효능에 대해 시험관내 분석을 수행하여 본원 기재된 방법에 따른 적합한 백신 후보물을 선택할 것이다.
실시예 V
BRSV 골격중으로 치환된 HRSV의 비구조적 및(또는) 외피 연관 단백질을 포함하는 추가의 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스의 구성 및 회수
BRSV 골격중으로 치환된 HRSV 비구조적 NS1 및 NS2 유전자 및(또는) 외피 연관 M, SH, G 및(또는) F 유전자를 포함하는 추가의 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스를 구성하였다. 대부분의 이들 키메릭 바이러스는 바람직한 특징인 HRSV로부터 유래된 G 및 F 유전자를 포함하였는데 이는 이들이 주요한 보호 항원을 코딩하고 효과적인 HRSV 백신에 중요할 것이기 때문이다.
특정한 예시적 바이러스에서, BRSV NS1 및 NS2 유전자를 그의 HRSV 대응부로 대체하였다. NS1 및 NS2는 최근에 유형 I 인터페론-매개 항바이러스 상태의 길항 제인 것으로 나타났고(Schlender, et al., J. Virol. 74:8234-42, 2000, 본원에 참고문헌으로 포함됨), 이들 유전자의 치환은 백신 바이러스의 성장 특성 및 독성을 변형시키는 방법을 제공하였다. 이는 인터페론 길항제가 숙주 특이적인 경향이 있다는 일반적 발견에 기인한 것이었다(Young, et al., Virology, 269:383-90, 2000; Didcock, et al., J. Virol., 73:3125-33, 1999; Didcock, et al., J. Virol., 73:9928-33, 1999, 각각 본원에 참고문헌으로 포함됨). 따라서, 백신 바이러스에서 BRSV-특이적 NS1 및 NS2 유전자의 포함은 소 세포에서 그의 성장을 개선시킬 것이나 영장류 세포 및 인간 백신 접종자에서의 성장에 대해 약독화 돌연변이를 이룰 것이다.
역으로, HRSV-특이적 NS1 및 NS2 유전자는 인간 세포에서 백신 바이러스의 성장을 개선시키는 방법을 제공할 것이다. 따라서, 이는 백신 바이러스의 성장 특성 및 반응유전성(reactogenicity)을 조작하는 신규한 방법을 제공한다. 또다른 바이러스에서, HRSV-특이적 막 연관 유전자, 즉 M, SH, G 및 F의 완전한 배열을 BRSV 골격에 위치시켰다. 바이러스 입자의 다양한 단백질은 유전자 발현, 게놈 복제 및 비리온 제조동안 다양한 방식으로 상호작용하는 것으로 생각되기 때문에, 다양한 조합물을 제조하는 능력은 백신 후보물의 풍분한 원천을 제공한다.
마지막으로, 바이러스의 이러한 추가의 예시적 패널은 유전자 순서의 변화없이 치환된 유전자, 치환된 바이러스의 유전자 순서가 변경된 다른 것 뿐만 아니라 치환된 유전자의 일부가 BRSV 골격에 대해 순서 변화를 갖지 않는 반면 다른 부분은 순서 변화를 갖는 것들을 포함하였다. 따라서, 이 패널은 cDNA-유래된 바이러 스를 조작하여 폭넓은 배열의 키메릭 바이러스를 제조하고 변경된 바람직한 생물학적 특성을 갖는 생존가능한 바이러스를 회수하는 능력의 엄격한 시험을 제공하였다.
rBRSV 골격의 NS1 및 NS2 유전자를 제거하고 HRSV의 NS1 및 NS2 유전자로 대체하여 rBRSV/A2-NS1+2라 불리는 바이러스를 생성한 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스를 구성하였다(도 10, 위에서 두번째 구성). 이 구성물에 대한 골격은 도 10(상단의 구성물)에 나타나 있으며 문헌(Buchholz 등, J. Virol., 73:251-9, 1999; Buchholz 등, J. Virol., 74:1187-1199, 2000, 각각 본원에 참고문헌으로 포함됨)에 상세히 기술된 독특한 Notl, Kpnl, Sall 및 Xhol 자리를 포함하도록 변형된 rBRSV 안티게놈 cDNA이었다. 완전한 HRSV 안티게놈 서열의 위치 75 내지 1036에 걸쳐있으며 HRSV NS1 ORF, NS1/N2 유전자 연결부 및 NS2 ORF를 포함하는 단일 단편으로서 PCR에 의해 HRSV NS1 및 NS2 코딩 서열을 증폭하였다. 또한, 단편의 상류 말단은 HRSV 서열 직전 첨가된 Notl 자리 및 HRSV 위치 91에서 NS1 ORF의 비번역된 서열 상류에 첨가된 Blpl 자리를 포함하였다. PCR cDNA의 하류 말단은 HRSV 서열 직후 Kpnl 자리를 포함하였다. 이 PCR 생성물을 클로닝하고 그의 서열을 확인하였다. 그 후, 이를 rBRSV 골격의 상응하는 윈도우중으로 Notl-Kpnl 단편으로서 삽입하였다.
rBRSV에서 NS1, NS2, G 및 F의 4개의 유전자를 그의 HRSV 대응부로 대체한 또다른 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스를 제조하였다. 이 바이러스는 rBRSV/A2-NS1+2GF로서 명명되었다(도 10, 위에서 세번째 구성). 이 구성물은 rBRSV/A2- NS1+2 및 본원에서 임의로 rBRSV/A2-GF로 불리는 앞서 기재된 rBRSV/A2(도 7 및 8 참조; 미국 특허 출원 09/602,212호; Buchholz, et al., J. Virol., 74:1187-1199, 2000, 각각 본원에 참고로 포함됨)로부터의 단편을 조합함으로써 제조하였다. 구체적으로, 양쪽 구성물은 리더 영역의 플라스미드 서열 상류에 Xmal 자리 및 도 10에 나타낸 Kpnl 자리를 포함하였다. rBRSV/A2-NS1+2의 Xmal-Kpnl 단편을 rBRSV/A2-GF 플라스미드의 상응하는 윈도우중으로 전사하였다.
rBRSV에서 M, SH, G 및 F의 4개의 유전자를 그의 HRSV 대응부로 대체한 또다른 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스를 제조하였다. 이 바이러스는 rBRSV/A2-MSHGF로서 명명되었다(도 10, 위에서 네번째 구성물). 이는 P-M 유전자간 영역 이외에 MluI 자리를 첨가한 rBRSV 골격을 포함하였다(도 9 참조). 따라서, 삽입된 HRSV 서열은 그의 상류 및 하류 경계로서 도 9에 나타낸 Mlul 및 Xhol 자리를 가졌다. Mlul 및 Xhol 자리에 의해 플랭킹된 HRSV의 M-SH-G-F 서열을 갖는 이 HRSV 삽입물을 PCR에 의해 제조하였고 생성된 생성물을 클로닝하고 그의 서열을 확인하였다. 그 후, Mlul-Xhol 단편을 rBRSV 골격중 상응하는 윈도우중으로 클로닝하였다.
G 및 F 유전자를 rBRSV 골격중 제3 및 제4 위치에 위치된 그의 HRSV 대응부로 대체한 또다른 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스를 제조하였다. 이 바이러스는 rBRSV/A2-G3F4로 명명되었다(도 10, 위에서 다섯번째 구성물). 이 구성물의 경우, PCR을 사용하여 HRSV G 및 F ORF를 증폭하였다. PCR 프라이머를 G의 상류 말단에 하기의 특징을 가하도록 설계하였다: Kpn 1 자리, BRSV 유전자 말단 신호(5'-AGTTATTTAAAAA) 및 3개의 nt 유전자간 서열(CAT), 그 후 HRSV G 및 F 유전자. 증 폭된 단편의 하류 말단은 HRSV F 유전자의 하류 비번역된 영역에 HRSV 안티게놈 위치 7420에서 그 후 첨가된 Kpn I 자리에서 종결되었다. 이 PCR 생성물을 클로닝하고 그의 서열을 확인하였다. 그 후, HRSV G 및 F 서열을 갖는 Kpn I 단편을 도 6, 패널 B에 나타낸 바와 같이 G 및 F 유전자가 결핍된 rBRSV cDNA의 Kpn I 자리중으로 클로닝하였다. 정확한 배향으로 삽입물을 포함하는 재조합체는 제한 분석으로 확인하였다.
rBRSV 골격에서 G 및 F 유전자가 프로모터 인접 위치에 있는 NS1, NS2, G 및 F의 유전자를 대체한 또다른 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스를 제조하였다. 이 구성물은 HEx 또는 rBRSV/A2-G1F2NS3NS4로 명명되었다(도 10, 하단의 구성물). 이 키메라는 rBRSV/A2-G1F2의 구성물(실시예 III, 도 6, 패널 B)에 대해 상기 기재된 바와 동일한 방식으로 rBRSV/A2-NS1+2를 변형시켜 BRSV G 및 F 유전자를 제1 및 제2 위치에서 그의 HRSV 대응부로 대체함으로써 생성되었다. 구체적으로, BRSV G 및 F 유전자를 상기 기재된 바와 같이(실시예 III) SalI 및 XhoI로 소화시켜 rBRSV/A2-NS1+2 안티게놈 cDNA으로부터 절단하였다. 그 후, 상기 기재된 바와 같이(실시예 III, 도 6, 패널 B) HRSV G 및 F 유전자를 포함하는 NotI 단편을 rBRSV/A2-NS1+2 안티게놈 cDNA의 NS1 비코딩 영역에서 HRSV 서열 직전에 위치된 단일 NotI 자리중으로 클로닝하였다. 정확한 배향으로 삽입물을 포함하는 재조합체를 제한 분석으로 확인하였다.
상기 기재된 각각의 바이러스를 cDNA로부터 쉽게 회수하였고, 지금까지 회수될 수 없는 바이러스가 설계된 경우가 없었다.
새로운 rBRSV/A2-G3F4 및 HEx 바이러스를 미리 시험한 rBRSV/A2-GF 및 rBRSV/A2-GF 바이러스와 생체외에서 성장 효율에 대해 병행 시험으로 비교하였다 (상기 지적한 바와 같이 rBRSV/A2-GF 바이러스는 이전 실시예에서는 rBRSV/A2로 지칭되었으나 새로운 구조와 비교하여 명확히 하기 위해 개명되었음). 베로 세포의 단일층 배양을 0.1의 감염 다중도로 감염시키고 37 ℃에서 배양하였다. 도 11에 나타낸 시점에서 분취량을 취하고 플라크 분석으로 바이러스 적정을 측정하였다. 상기 조건 하에 BRSV는 HRSV보다 덜 효율적으로 복제하며, 이는 영장류 세포 내의 그의 숙주 범위 제한을 반영한다. 도 11에 나타낸 바와 같이 (상단), rBRSV/A2-G3F4는 다른 키메릭 바이러스 및 rBRSV와 비교하여 개선된 생체외 성장을 나타낸다. 실제로, 그의 성장 효율은 재조합 HRSV (rA2)의 성장 효율과 비슷하다. 따라서, rBRSV 바이러스의 성장은 BRSV G와 F 유전자를 이들의 HRSV 대응물로 대체하여 (rBRSV/A2-GF에서와 같음) 개선되었으며, HRSV 유전자를 프로모터 인접부에 놓아서 (rBRSV/A2-G1F2에서와 같음) 추가로 개선되며, HRSV G 및 F 유전자를 3 및 4 위치에 놓음 (rBRSV/A2-G3F4에서와 같음)으로써 추가로 개선된다. 이러한 결과는 본 발명의 바이러스의 특성이 바이러스성 유전자의 기원 및 순서를 조작함으로써 어떻게 조직적으로 조절할 수 있는가를 나타낸다.
HEx 바이러스를 동일한 방식으로 평가하였다 (도 11, 하단). 그의 성장은 rBRSV 및 rA2의 성장 사이에 속하며, 이는 상기 네 개의 유전자의 대체가 생체외에서 복제 적응도를 유지하였음을 나타내며 실제로 그의 rBRSV 모체의 성장을 능가하였다. 베로 세포는 타입 I 인터페론을 위한 구조 유전자가 부족하며 따라서 인터 페론-특이적 효과를 평가할 수 없다는 것에 주목해야 한다. 다른 한편으로, 베로 세포는 큰 규모의 백신 제조에 유용한 기질이며, 상기 세포 내의 효율적인 성장은 백신 바이러스에 있어서 중요한 특징이다.
rBRSV/HRSV 키메릭 바이러스의 패널을 인간 기원의 HEp-2 및 소 기원의 MDBK 세포의 플라크 크기에 근거하여 성장을 더 평가하였다 (도 12, 각각 상단 및 하단). 이러한 비교는 이전 실시예에 기술된 키메릭 바이러스, 즉 rBRSV/A2-GF (이전에는 rBRSV/A2로 지칭됨), rBRSV/A2-MGF 및 rBRSV-G1F2도 포함한다. HEp-2 세포에서 rHRSV는 rBRSV보다 더 큰 플라크를 생성하며, 이는 숙주 범위 제한과 일치한다 (도 12, 상단). 이러한 논의는 첫째로 NS1 및 NS2 유전자가 BRSV 기원으로 남아있는 바이러스를 고려한다. 이러한 군에서, rBRSV/A2-G3F4, rBRSV/A2-G1F2 및 rBRSV/A2-GF 바이러스는 HRSV와 BRSV의 중간 크기를 갖는 플라크를 생성하며, 상기 순서로 감소한다. 이는 성장 동역학 데이터와 완전히 일치하며, HRSV G 및 F 유전자를rBRSV 골격으로 도입시키면 HEp-2 세포 중 그의 성장을 개선하고 상기 유전자의 위치를 변경함으로써 추가로 개선시킬 수 있다는 구상을 확인하는 것이다. rBRSV/A2-MGF 및 rBRSV/A2-MSHGF 바이러스는 rBRSV보다 작은 플라크를 생성하였다. 상기 예는 이들 바이러스가 회수되어 조작될 수 있음을 나타내며, 이들의 성장 특징의 완전 특정화를 결정하기 위해서는 생체외 및 생체내의 추가의 특정화가 필요할 것이다.
NS1 및 NS2 유전자가 HRSV 기원인 바이러스에 대해서 HEp-2 세포 내의 성장도 실험하였다. 구체적으로는, NS1 및 NS2 유전자의 기원에 있어서만 상이한 한 쌍의 바이러스를 비교하였다. HRSV의 NS1 및 NS2 유전자를 갖는 바이러스가 각각의 쌍이 되는 순서로 상기 쌍을 이어서 열거하였다: rBRSV 대 rBRSV/A2-NS1+2; rBRSV/A2-GF 대 rBRSV/A2-NS1+2GF; rBRSV/A2-G1F2 대 HEx. 각각의 경우, HRSV 기원의 NS1 및 NS2 유전자의 존재는 플라크의 크기를 증가시켰으며, 이는 숙주 범위 제한의 조절을 나타낸다. 이는 NS1 및 NS2 유전자의 기원이 어떻게 HRSV 백신의 성장 특징을 예상가능한 조절 방법으로 선택할 수 있는가를 나타낸다. 이러한 예에서 두 유전자를 한 쌍으로서 조작하지만, 이들은 또한 본원의 교시에 따라 단독으로 조작될 수도 있다.
MDBK 소 세포 내의 상기 바이러스의 특정은 도 12의 하단에도 나타내어져 있다. 상기 세포 내의 숙주 범위 제한은 HEp-2 세포에서의 이전 비교와 비교하여 BRSV가 HRSV보다 더 큰 플라크를 생성하도록 반전된다. rBRSV 골격 내의 HRSV G 및 F 유전자의 존재는 성장에 대해 효과가 크지 않은 반면 HRSV 기원의 NS1 및 NS2 유전자의 존재는 바이러스를 약독화하는데, 이는 아마도 상기 HRSV-유래의 인터페론 길항제가 소 세포 내에서 덜 효율적으로 작동하기 때문이다. 소 세포 및 소 숙주는 상기 후보 HRSV 백신에 대한 주요 대상이 아니기 때문에, MDBK세포와의 상기 발견은 주로 상기 단백질의 기능과 이들의 성장에 대한 기여도의 보다 명확한 이해를 제공한다.
요약하면, 상기 실시예는 재조합 HRSV 백신 후보의 패널이 어떻게 다양하게 목적하는 성장 특성을 나타내도록 용이하게 생성될 수 있는가를 나타낸다. 선택된 후보들의 임상 평가는 본 발명의 방법에 의한 백신 후보의 안내 최적화에 대한 기 준을 제공할 것이다. 이전의 연구는 rBRSV 및 그의 rBRSV/A2-GF 유도체가 침팬지에서 약독화되었음을 나타내지만, rBRSV의 rBRSV/A2-GF 유도체는 rBRSV에 대해 개선되었음을 나타낸다 (문헌 [Buchholz, et al., J. Virol., 74:1187-1199, 2000] 참조; 본원에 참조로 인용됨). 따라서 본 발명에서 수득한 성장의 등급화된 개선은 RSV 백신 재조합물의 최적화를 향한 상당한 진보이다.
실시예 VI
HRSV 또는 BRSV 기원의 NS1 및 NS2 단백질과 BRSV 골격 내의 N 및(또는) P 유전자의 치환체를 함유하는 추가의 BRSV/HRSV 키메릭 바이러스의 구성 및 회수
인간의 파라인플루엔자 바이러스 타입 3 (HPIV3)은 영장류 중 숙주 범위 제한을 나타내는 소 대응물 (BPIV3)을 갖고, 따라서 HPIV3/BPIV3 키메릭 바이러스 기재의 약독화 HPIV3 백신의 개발의 토대를 제공한다. 유망한 한 키메라는 N ORF가 그의 BPIV3 대응물로 대체된 HPIV3 골격으로 이루어진다. 놀랍게도 상기 키메릭 바이러스는 세포 배양액 내에서 효율적으로 복제하며 영장류에 있어서 약독화 표현형을 나타내었다 (문헌 [Bailly, et al., J. Virol., 74:3188-95, 2000] 참조; 본원에 참조로 인용됨).
본 실시예에서, 개개의 BRSV 유전자가 이들의 HRSV 대응물로 대체될 수 있는가를 결정하기 위한 연구가 수행되었다. 구체적으로, N 유전자 및 P 유전자가 개별적으로 치환되었다 (도 13A 참조). 두 유전자가 함께 대체될 수 있는가를 결정하기 위한 추가의 연구가 수행되었다. 마지막으로, HRSV NS1 및 NS2 유전자를 함 유하는 골격에서도 유전자를 대체할 수 있는가를 결정하기 위한 추가의 연구가 수행되었다. 상기 치환이 BRSV G 및 F 유전자를 갖는 rBRSV 골격 내에서 이루어졌다는 것에 주목해야 한다. 최적의 HRSV 백신을 제조하기 위해, 그러한 치환이 용이하게 수행될 수 있고, 실제로 개선된 성장 특성을 일반적으로 제공할 수 있다는 것을 나타내는 본원에 기술된 교시에 따라 이들은 자연적인 유전자 순서 위치 또는 다른 위치에 삽입된 이들의 HRSV 대응물로 대체될 것이다.
BRSV N 코딩 서열을 HRSV 코딩 서열로 대체하여 BRSV/HRSV 키메라를 구성하였다. 상기 키메라는 rBRSV/A2-N으로 명명되었다 (도 13A 참조). 이러한 구성을 위해, Aat II 사이트를 N ORF의 마지막 세 코돈 내에 위치한 nt 2305-2310에서 rBRSV N 유전자로 엔지니어링하였다. 치환은 아미노산 수준에서 안정화되었다. 동일한 사이트를 HRSV 안티게놈 cDNA의 HRSV N ORF로 엔지니어링하였다. 또한, NS2의 하류 비번역 영역 내의 안티게놈 nt 1037-1042가 Kpn I 사이트로 변하도록 HRSV 안티게놈 cDNA를 변형시켰다. 상기 Kpn I-Aat II HRSV 단편을 rBRSV의 상응하는 윈도로 복제하고 대부분의 N ORF를 전달시켰다. BRSV 및 HRSV의 N ORF의 맨 마지막 몇몇 코돈은 동일한 아미노산 코딩 할당을 가지며, 따라서 잔류하는 BRSV N ORF의 몇몇 nt는 완전 HRSV N 단백질을 코딩하는데 기여한다.
BRSV P 유전자를 그의 HRSV 대응물로 대체한 BRSV/HRSV 키메라를 구성하였다. 이 키메라는 rBRSV/A2-P로 명명되었다 (도 13A 참조). 이는 상기 Aat II 사이트뿐만 아니라 상술한 Mlu I 사이트도 도입하였다 (도 9 참조). 상기 HRSV 단편을 상응하는 rBRSV의 상응하는 윈도로 전달하여 완전 P 유전자를 전달하였다. 상 기 지적한 바와 같이, 상기 단편으로 전달된 몇몇 N ORF nt는 BRSV 및 HRSV 내에 동일한 코딩 할당을 갖는다.
상술한 HRSV의 N 및 P 서열을 rBRSV로 전달한 BRSV/HRSV 키메라를 구성하여 rBRSV/A2-NP를 얻었다 (도 13A 참조). 이는 상술한 Kpn I 및 Mlu I 사이트를 도입하였다.
HRSV NS1 및 NS2 유전자를 함유한 rBRSV 골격, 즉 이전 실시예에 기술된 rBRSV/A2-NS1+2 골격으로 동일한 전달을 수행하였다. 이는 rBRSV/A2-NS1+2N, rBRSV/A2-NS1+2P 및 rBRSV/A2-NS1+2NP를 생성하였다 (도 13B 참조).
상기 재구성 바이러스의 각각은 cDNA로부터 용이하게 회수되었다. rBRSV/A2-P 바이러스는 야생형 rBRSV와 동등하게 MDBK 세포내에서 복제되었으며, rBRSV/A2-N의 복제는 대략 10 배 낮았으며 rBRSV/A2-NP 바이러스의 복제는 이들 사이에 속했다. 따라서, 다양한 성장 특성을 얻었다. 상술한 방법에 따라, 이들 바이러스는 HRSV G 및 F 유전자를 갖도록 변형될 수 있다. 또한, rHRSV 골격 내에 동등한 유전자 치환을 행할 수 있다. 즉, HRSV N 및(또는) P 유전자를 BRSV 대응물로 치환할 수 있다. NS1 및 NS2 유전자의 치환의 문맥 내에 이들 치환을 행하는 능력은 생체외에서 백신을 제조하는 최적 수준을 얻는데 있어서의 추가의 적응성과 인간 백신 접종자 내에서의 항체 생성성을 제공한다.
선행 실시예에 의해 나타나는 바와 같이, 유전자의 위치가 이동된 RSV에서 전달되는 유전자는 RSV 구조/기능의 입수가능한 지식에 기초하여 기능적 또는 구조적으로 상호작용할 것 같은 것을 선택할 수 있다. 유전자의 위치가 이동된 RSV 내 의 이 변화 및 다른 변형은 예를 들면 N 및 P 뉴클레오캡시드 단백질, M, SH, F 및 G 외피 단백질, 및 M2-1, M2-2 및 L 중합효소 성분과 같이 상호작용하는 단백질은 게놈 중에 병렬한다는 사실에 의해 더 단순화된다. 따라서, 본 발명에 따른 추가 후보 백신 균주는 예를 들면 N 및 P; M, SH, F 및 G 외피 유전자 중 2 이상; 또는 M2-1, M2-2 및 L 유전자 중 2 이상으로부터 선택되는 병렬 유전자 2 이상을 수용체 또는 배경 게놈 또는 안티게놈 중에 이종 삽입물 또는 치환으로 함께 혼입하는 것에 의해 달성될 수 있다.
예를 들면, M 및 SH 유전자는 HRSV 대응부와 r/A2에서 함께 대체될 수 있다. 이는 바이러스 외피 단백질 (G, F, SH 및 M)이 모두 HRSV의 것인 반면, 내부 단백질은 BRSV의 것인 바이러스를 생성할 수 있다. 이는 이어서 요구되는 바와 같이 인간 대응부, 예를 들면 다른 쌍으로 및 P, 다른 것을 NS1 및 NS1, 및 다른 군으로 M2-1, M2-2 및 L로 추가 BRSV 유전자의 대체할 수 있다. 각 유전자 쌍의 병렬은 치환을 단순화할 수 있다. 동시에, 개별 BRSV 유전자의 HRSV로의 삽입의 역 접근법, 비분산 HRSV G 및 F 항원 결정기의 제거는 또한 본 발명의 요망되는 백신 후보물을 얻을 수 있다. 예를 들면, 인간 RSV의 N, P, M2-1 및 M 유전자 1 이상은 이들의 소 대응부로 개별적으로 대체될 수 있다. 이어서, 회수된 재조합 바이러스는 본원에서 예시하는 바와 같이 세포 배양, 설치류 및 비인간 영장류에서 약독화 표현형에 대해 평가한다. 이 방법에서, 본 발명은 요망되는 수준의 약독화 및 다양한 대상에서 RSV의 치료 및 예방에 대한 보호적 효능을 갖는 후보 인간-소 키메릭 RSV 백신의 확인 방법을 제공한다.
실시예 VII
부분적 유전자 제거를 포함하는 RSV 백신 바이러스의 개선된 시험관내 복제
상기 설명에 따라, RSV의 시험관내 복제 효율은 게놈의 뉴클레오티드 길이의 변화에 민감하다는 것을 알 수 있다. 길이의 증가에 대해서는, 재조합 RSV의 성장 표현형을 조절하기 위한 하나의 변형은 외래 단백질을 코딩하는 추가 유전자의 삽입을 포함할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT), 반딧불이 루시페라제, 쥐 인터페론 감마 (IFNg), 쥐 인터루킨 2 (IL-2), 및 쥐 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)를 위한 코딩 서열은 G-F 유전자간 영역으로 개별적으로 삽입하였다. 각각의 이들 삽입은 시험관내 바이러스 성장의 효율을 감소시키는 효과를 나타내었다. 일례로, G-F 유전자간 영역으로 대략 0.76 kb의 CAT 전사 카세트의 삽입은 시험관내 바이러스 성장을 20배 감소시켰다. 림포킨은 쥐로부터 기원하며 인간으로부터 기원하는 HEp-2 세포에서 활성이 있는 것으로 기대되지는 않는다. 또한, 필적할만한 크기의 여러 삽입은 시험관내 RSV 성장을 감소시키는데 필적할만한 크기의 효과를 나타내었다. 이들 연구에서 보고된 억제는 여러 코딩된 외래 단백질의 발현과는 반대로 그 자체 서열의 첨가에 기인할 수 있다.
이러한 동일 유전자간 영역으로의 1.75 kb 루시페라제 카세트의 삽입은 바이러스 복제에 대해 아주 커다란 억제 효과를 나타내었으며 (50배가 넘게 감소됨), 이는 보다 많은 삽입은 보다 억제 효과가 크다는 것을 나타낸다. 또한, 게놈에서 삽입의 위치에 따라 이러한 효과가 영향받을 수도 있다는 몇몇 증거도 있었다. 예 를 들어, 0.8 kb 전사 카세트의 NS1 유전자의 비코딩 영역으로의 삽입 (프로모터 근접 부위에 위치시킴)은 바이러스 성장에 한계 억제 효과만을 나타내었다 (Hallak, et al., J Virol., 74:10508-13, 2000, 본원에 참고문헌으로 삽입됨). 관찰된 효과가 뉴클레오티드 길이만의 증가에 기인한 것인 지, 또다른 mRNA 코딩 단위의 부가에 기인한 것인 지, 아니면 이들 모두에 기인한 것인 지의 여부는 불확실한 상태이다.
다른 실시예에서, 재조합 RSV의 nt 길이의 증가는 단일 유전자간 영역에서 이루어졌다. 현재까지 분석된 천연 RSV 유전자간 영역은 길이가 1 내지 56 nt이다. SH 유전자가 결실된 재조합 바이러스에서는, M-SH 유전자간 영역이 성장에 대한 한계 억제 효과를 나타내면서 160 nt까지 증가하였다.
또다른 실시예로서, RSV 게놈은 감소되어 바이러스 표현형에 목적하는 효과를 나타낸다. 선택된 실시양태에서, 세트 NS1, NS2, SH, G 및 M2-2로부터의 하나 이상의 유전자는 단독으로 제거되거나 또는 특정 조합에서는 바이러스 감염성을 제거함이 없이 재조합 바이러스로부터 제거되었다. 각각의 제거는 제거된 단백질의 발현 손실을 초래하고, 대부분의 경우 시험관내 및 생체내 바이러스 성장의 효율 감소를 초래하였다. 유일한 예외는 SH-제거 바이러스의 성장이 시험관내에서 감소되지 않았으며, 몇몇 세포주에서는 한계적으로 증가하였다는 것이다. RSV 균주 A2 및 B1 사이의 키메라 바이러스의 구축을 포함하는 또다른 실시예에서, G 및 F 유전자 사이의 유전자간 영역은 52 nt에서 5 nt로 단축되었다 (참조: Whitehead, et al., J. Virol., 73:9773-80, 1999, 이 참고문헌은 본원에 참고로 삽입됨).
수많은 선행 보고서는 제거된 유전자 또는 유전자간 서열을 갖는 재조합 RSV의 제조를 논의하고 있다 (Bermingham and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 96:11259-64, 1999; Bukreyev, et al., J. Virol., 71:8973-82, 1997; Jin, et al., Virology, 273:210-8, 2000; Jin, et al., J. Virol., 74:74-82, 2000; Teng and Collins, J. Virol., 73:466-473, 1999; Teng, et al., Journal of Virology, 2000; Whitehead, et al., J. Virol., 73:3438-42, 1999, 이들 모두 본원에 참고문헌으로 삽입됨). 그러나, 각 경우에, 제거에는 오픈 리딩 프레임 또는 다른 중요한 게놈 특징의 변형이 수반되어, 바이러스 표현형에 대한 뉴클레오티드 제거 효과를 불확실하게 한다.
본 실시예에서는 SH 유전자의 하류 비코딩 영역으로부터 서열을 제거함으로써 RSV 게놈의 길이를 감소시키는 효과가 설명된다. 이 예시적인 부분적 유전자 제거 (도 14에 개략적으로 도시되어 있음)는 G-F 유전자간 영역에서 XmaI 부위를 함유하는 안티게놈 cDNA의 버전을 사용하여 이루어졌으며, 그 자체의 변화는 코딩된 바이러스에 영향을 미칠 것으로는 생각되지 않을 것이다. SH ORF의 말단으로부터 SH 유전자 말단 신호까지의 141-bp XhoI-PacI 윈도우를 하기 2개의 올리고뉴클레오티드로부터 형성된 합성 DNA로 대체하였다: TCGAGTtAAtACtTgaTAAAGTAGTTAAT (SEQ ID NO: 7) 및 TAACTACTTTAtcAaGTaTTaAC (SEQ ID NO: 8) (XhoI 및 PacI 제한 부위의 일부는 굵게 표시되고, SH 오픈 리딩 프레임 및 종결 코돈의 뉴클레오티드는 밑줄처져 있으며, 사일런트 뉴클레오티드 변화는 소문자로 나타나있음). RSV/6120으로 명명된 코딩된 바이러스는 SH ORF의 종결 코돈 및 마지막 3개의 코돈 에서 사일런트 뉴클레오티드 치환체를 가지며 유전자 말단 신호를 손상되지 않은 상태로 남기는 (Bukreyev, et al., J. Virol., 70:6634-41, 1996, 본원에 참고문헌으로 삽입됨) SH 하류 비전사된 영역으로부터 112 뉴클레오티드 (재조합 안티게놈에서 4499-4610 위치)가 제거된다 (도 14). 따라서 이들 점 돌연변이 및 112-nt 제거는 어떠한 바이러스 단백질의 코딩된 아미노산도 변경하지 못하고, 공지된 어떠한 바이러스 RNA 신호도 방해하지 못하고, 코딩된 mRNA의 수효도 변화시키지 못하였다.
SH 유전자의 말단에서 비코딩 변화가 행해졌으며, 이는 이 영역이 박테리아의 성장 동안 불안정하기 쉽기 때문이다. 실제로, 이들 변화는 안티게놈 플라스미드의 조작 및 전파에 중요한 성질인, 크게 개선된 박테리아에서의 안정성을 초래하였다. 따라서, RSV/6120은 코딩된 단백질, RNA 신호 또는 코딩된 mRNA의 수효에서의 변경으로 인한 제2 및 제3 효과의 교락 부재하에 게놈으로부터 서열을 제거하는 효과를 조사하기 위한 기회를 제공하였다. SH ORF의 마지막 몇몇 코돈에서 행해진 5개의 점 돌연변이는 생화학적 성질의 중대한 변화와는 관련이 없는 인간과 소의 파라인플루엔자 바이러스 타입 3 및 재조합 RSV의 여러 유전자내로 마커로서 도입된 점 돌연변이의 연구에 의해 입증된 바와 같이, 코딩된 바이러스의 생화학적 특성에 영향을 미치지 않을 것으로 기대된다 (Collins, et al., Adv. Virus Res., 54:423-51, 1999; Schmidt, et al., J. Virol., 74:8922-9, 2000; Schmidt, et al., J. Virol., 75:4594-603, 2001; Skiadopoulos, et al., J. Virol., 72:1762-8, 1998; Skiadopoulos, et al., J. Virol., 73:1374-81, 1999, Whitehead, et al., J. Virol., 72:4467-4471, 1998; Whitehead, et al., J. Virol., 73:871-7, 1999, 이들 모두 본원에 참고문헌으로 삽입됨).
6120 바이러스에 있어서, 3개의 별도의 감염 세트에서 D53이라 불리는, 그의 전장 대조물과 함께 다단계 성장의 효율을 분석하였다 (도 15A, 15B 및 15C). 도면에 도시되어 있는 바와 같이, 6120 바이러스의 피크 역가는 D53 바이러스의 그것보다 1.5 내지 2배 만큼 재현가능하게 높았다. 따라서, SH 유전자에 행해진 변형, 특히 112-nt 비코딩 제거 (게놈 길이의 0.7%를 나타냄)는 시험관내 성장 효율의 실질적인 증가를 초래하였다. RSV 백신 제조에는 시험관내 성장 효율이 조금이라도 증가하는 것이 유리하며, 이는 RSV의 특징인 비교적 비로버스트 성장이 백신 발전에 있어서 중요한 문제이고 백신 제조에 있어서 복잡한 것으로 여겨지기 때문이다.
본 명세서에 기술되어 있는 구체적인 한정된 변형은 다양한 문맥에 적용되어 재조합 백신 바이러스 성장 및 다른 표현형 특징을 최적화할 수 있는 일반적인 도구를 제공한다. 본 발견에 기초하여, RSV의 15.2 kb 게놈은 부분적인 유전자 제거 또는 다른 뉴클레오티드 제거에 의해 변형에 대한 표적 부위의 커다란 집합을 제공한다. 전형적으로는, 이와 관련하여 선택될 변화는 11 바이러스 ORF 및 그의 번역 개시 부위를 포함하지 않을 것이다 (참조: Kozak, Gene, 234:187-208, 1999, 본원에 참고문헌으로서 삽입됨). 바이러스 ORF는 게놈의 90% 이상을 설명하므로, 부분적인 제거 변형에 대한 표적 부위의 전형적인 선택은 나머지 비번역 영역 (또한, 비코딩 영역이라 일컬음) 내일 것이다. 또한, 이와 관련하여 뉴클레오티드 제거에 대한 표적 부위는 일반적으로 게놈의 5' 말단에서 발견된 안티게놈 프로모터의 상 보체 및 게놈의 3' 말단에서 발견된 11-nt 코어 프로모터 뿐만 아니라, 각각의 유전자의 측면의 10-nt 유전자 개시 및 12- 내지 13-nt 유전자 말단 신호를 포함하는 cis-작용 복제 및 전사 신호 (예를 들어, Collins, et al., Fields Virology, 2:1313-1352, 1996 참조)를 배제할 것이다.
본 실시예는 예기치않게, RSV에 의한 시험관내 성장의 효율이 실질적으로 3' 및 5' 유전자외 영역에서 또는 유전자들 사이에 또는 그 유전자들에 이어서 위치하거나 바이러스 ORF의 측면의 서열과 같은 비번역 서열을 제거함으로써 실질적으로 증가될 수 있다는 것을 예시한다. 실시예는 서열을 아주 조금만 제거하여도 개선된 바이러스 성장을 이룰 수 있다는 것을 입증한다. 이는 시험관내 성장 효율의 개선이 큰 규모로 이루어지는 백신 개발 및 제조를 용이하게 하기 때문에 매우 바람직한 결과이다.
미생물 기탁 정보
하기 물질이 부타페스트 조약의 조건하에 미국 20110-2209 버지니아주 마나싸스 유니버시티 블러바드 10801 소재 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었다.
플라스미드 수탁 번호 기탁일
cpts RSV 248 ATCC VR 2450 1994년 3월 22일
cpts RSV 248/404 ATCC VR 2454 1994년 3월 22일
cpts RSV 248/955 ATCC VR 2453 1994년 3월 22일
cpts RSV 530 ATCC VR 2452 1994년 3월 22일
cpts RSV 530/1009 ATCC VR 2451 1994년 3월 22일
cpts RSV 530/1030 ATCC VR 2455 1994년 3월 22일
RSV B-1 cp52/2B5 ATCC VR 2542 1996년 9월 26일
RSV B-1 cp-23 ATCC VR 2579 1997년 7월 15일
p3/7(131) ATCC 97990 1997년 4월 18일
p3/7(131)2G ATCC 97989 1997년 4월 18일
p218(131) ATCC 97991 1997년 4월 18일

상기 본 발명을 비록 명확한 이해를 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하였지만, 당업자들에게는 예시에 의해 제한을 두지 않는 첨부된 청구의 범위내에서 어떠한 변화 및 변형도 행해질 수 있다는 것이 명백할 것이다. 이와 관련하여, 설명의 경제성을 위해 상기 개시에 여러 출판물 및 다른 참고문헌을 인용하였다. 이들 참고문헌 각각은 본원에 모든 목적을 위해 그의 전부가 참고로 삽입된다.
<서열목록>
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SEQUENCE LISTING <110> The Government Of The United States Of America, as represented by the Department Of Health and Human Services <120> Respiratory Syncytial Virus Vaccines Expressing Protective Antigens From Promotor-Proximal-Genes <130> NIH0411 <150> 60/213,708 <151> 2000-06-23 <160> 23 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 1 catatt 6 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 2 cacaat 6 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 3 ttaattaaaa acatattatc acaaa 25 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 4 cacaattgca tgc 13 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 5 ttaattaaaa acacaatt 18 <210> 6 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 6 ttaaacttaa aaatggttta tgtcgaggaa taaaatcgat taacaaccaa tcattcaaaa 60 agat 64 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 7 tcgagttaat acttgataaa gtagttaat 29 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 8 taactacttt atcaagtatt aac 23 <210> 9 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 9 ggggcaaata agaatttgat aagtaccact taaatttaac tcccttgctt agcgatg 57 <210> 10 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 10 ttagcgatg 9 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 11 catattgggg caaataagc 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 12 cacaatgggg caaataagc 19 <210> 13 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 13 ggggcaaata caagttaatt cgcggccgcc ccctctcttc tttctacaga aaatg 55 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 14 gcggccgcta aatttaactc ccttgcttag cgatg 35 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 15 cacaatgggg caaaataagc ttagcggccg c 31 <210> 16 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 16 taaaa 5 <210> 17 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 17 taaagacgcg tt 12 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 18 agttagtaaa aataaagacg cgtt 24 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 19 ttatgtcgac tggggcaaat gcaaacatg 29 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 20 Arg Ala Arg Val Asn Thr 1 5 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 21 agagctcgag tcaacacata gca 23 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 22 tataaagtag ttaattaaaa atag 24 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Respiratory Syncytial Virus <400> 23 agagctcgag ttaatacttg ataaagtagt taattaaaaa tag 43

Claims (269)

  1. 주 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 뉴클레오캡시드 인단백질(P), 대형 중합효소 단백질(L), M2(ORF1) RNA 중합효소 신장 인자, 및 야생형 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 RSV 유전자 또는 게놈 분절의 위치에 비해 프로모터에 더 가깝거나(promoter-proximal) 프로모터에서 더 먼(promoter-distal) 위치로 위치이동을 한 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 및 G 유전자 또는 그의 게놈 분절로 구성된 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 이동된 RSV 유전자 또는 게놈 분절을 가지는 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 포함하는 감염성 재조합 호흡기 신시티움 바이러스 (RSV).
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 이동한 유전자 또는 게놈 분절이 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 하나 이상의 변위(displacement) 폴리뉴클레오티드의 결실 또는 삽입에 의해 프로모터에 더 가깝거나 프로모터에서 더 먼 위치로 이동한 감염성 재조합 RSV.
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  208. 제1항에 있어서, 하나 이상의 이동한 유전자 또는 게놈 분절이 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 유전자 순서의 재배열에 의해 프로모터에 더 가까운 위치로 이동한 감염성 재조합 RSV.
  209. 제208항에 있어서, 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈이 부분적 또는 완전한 인간 RSV(HRSV) 또는 소 RSV(BRSV) 백그라운드 게놈 또는 안티게놈에 상이한 RSV 유래의 하나 이상의 이종 유전자 또는 게놈 분절이 결합되어 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성하는 키메릭 게놈 또는 안티게놈인 감염성 재조합 RSV.
  210. 제208항에 있어서, 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 당단백질 G 또는 F 유전자가 프로모터에 대하여 유전자 순서 위치 1로 위치이동한 감염성 재조합 RSV.
  211. 제210항에 있어서, 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 제2의 당단백질 G 또는 F 유전자가 프로모터에 대하여 유전자 순서 위치 2로 위치이동한 감염성 재조합 RSV.
  212. 제210항에 있어서, 당단백질의 전사가 상향조절된 감염성 재조합 RSV.
  213. 제208항에 있어서, SH 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 결실된 감염성 재조합 RSV.
  214. 제208항에 있어서, NS2 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 결실된 감염성 재조합 RSV.
  215. 제208항에 있어서, NS1 및 NS2 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 결실된 감염성 재조합 RSV.
  216. 제208항에 있어서, RSV SH 유전자 및 RSV NS2 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 결실된 감염성 재조합 RSV.
  217. 제208항에 있어서, RSV SH 유전자, NS1 유전자 및 NS2 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 결실된 감염성 재조합 RSV.
  218. 제208항에 있어서, 이동한 유전자가 당단백질 G 유전자인 감염성 재조합 RSV.
  219. 제208항에 있어서, 이동한 유전자가 당단백질 F 유전자인 감염성 재조합 RSV.
  220. 제210항에 있어서, 유전자 순서 위치 1로 이동한 당단백질 유전자가 당단백질 G 유전자이고, 당단백질 F 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 유전자 순서 위치 2로 이동한 감염성 재조합 RSV.
  221. 제208항에 있어서, 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1로 이동하고, 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 2로 이동하고, SH 유전자가 결실된 감염성 재조합 RSV.
  222. 제208항에 있어서, 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1로 이동하고, SH 유전자가 결실된 감염성 재조합 RSV.
  223. 제208항에 있어서, 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 1로 이동하고, SH 유전자가 결실된 감염성 재조합 RSV.
  224. 제208항에 있어서, 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1로 이동하고, 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 2로 이동하고, NS2 및 SH 유전자가 결실된 감염성 재조합 RSV.
  225. 제208항에 있어서, 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1로 이동하고, 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 2로 이동하고, NS1, NS2 및 SH 유전자가 결실된 감염성 재조합 RSV.
  226. 제1항에 있어서, RSV가 약독화된 감염성 재조합 RSV.
  227. 제226항에 있어서, 약독화가 적어도 하나의 온도민감성 점 돌연변이, 적어도 하나의 비-온도민감성 점 돌연변이 또는 적어도 하나의 유전자 결실에 기인하는 감염성 재조합 RSV.
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  230. 제209항에 있어서, 인간 RSV 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1에 위치하고, 인간 RSV 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 2에 위치하며, 소 RSV NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 및 L 유전자를 포함하는 인간-소 키메라인 감염성 재조합 RSV.
  231. 제209항에 있어서, 인간 RSV 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1에 위치하고, 인간 RSV 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 2에 위치하며, 인간 RSV NS1 유전자가 유전자 순서 위치 3에 위치하고, 인간 RSV NS2 유전자가 유전자 순서 위치 4에 위치하며, 소 RSV N, P, M, SH, M2 및 L 유전자를 포함하는 인간-소 키메라인 감염성 재조합 RSV.
  232. 주 뉴클레오캡시드 단백질(N) 유전자, 뉴클레오캡시드 인단백질(P) 유전자, 대형 중합효소 단백질(L) 유전자, M2(ORF1) RNA 중합효소 신장 인자, 및 야생형 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 RSV 유전자 또는 게놈 분절의 위치에 비해 프로모터에 더 가깝거나(promoter-proximal) 프로모터에서 더 먼(promoter-distal) 위치로 위치이동을 한 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 및 G 유전자 또는 그의 게놈 분절로 구성된 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 이동된 RSV 유전자 또는 게놈 분절을 가지는 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  233. 제232항에 있어서, 하나 이상의 이동한 유전자 또는 게놈 분절이 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 하나 이상의 변위 폴리뉴클레오티드의 결실 또는 삽입에 의해 프로모터에 더 가깝거나 프로모터에서 더 먼 위치로 이동한 단리된 폴리뉴클레오티드.
  234. 제232항에 있어서, 하나 이상의 이동한 유전자 또는 게놈 분절이 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 유전자 순서의 재배열에 의해 프로모터에 더 가까운 위치로 이동한 단리된 폴리뉴클레오티드.
  235. 제234항에 있어서, 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈이 부분적 또는 완전한 인간 RSV(HRSV) 또는 소 RSV(BRSV) 백그라운드 게놈 또는 안티게놈에 상이한 RSV 유래의 하나 이상의 이종 유전자 또는 게놈 분절이 결합되어 인간-소 키메릭 RSV 게놈 또는 안티게놈을 형성하는 키메릭 게놈 또는 안티게놈인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  236. 제234항에 있어서, 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 당단백질 G 또는 F 유전자가 프로모터에 대하여 유전자 순서 위치 1로 위치이동한 단리된 폴리뉴클레오티드.
  237. 제236항에 있어서, 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 제2의 당단백질 G 또는 F 유전자가 프로모터에 대하여 유전자 순서 위치 2로 위치이동한 단리된 폴리뉴클레오티드.
  238. 제236항에 있어서, 당단백질의 전사가 상향조절된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  239. 제234항에 있어서, SH 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 결실된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  240. 제234항에 있어서, NS2 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 결실된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  241. 제234항에 있어서, NS1 및 NS2 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 결실된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  242. 제234항에 있어서, RSV SH 유전자 및 RSV NS2 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 결실된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  243. 제234항에 있어서, RSV SH 유전자, NS1 유전자 및 NS2 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈으로부터 결실된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  244. 제234항에 있어서, 이동한 유전자가 당단백질 G 유전자인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  245. 제234항에 있어서, 이동한 유전자가 당단백질 F 유전자인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  246. 제236항에 있어서, 유전자 순서 위치 1로 이동한 당단백질 유전자가 당단백질 G 유전자이고, 당단백질 F 유전자가 부분적 또는 완전한 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 유전자 순서 위치 2로 이동한 단리된 폴리뉴클레오티드.
  247. 제234항에 있어서, 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1로 이동하고, 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 2로 이동하고, SH 유전자가 결실된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  248. 제234항에 있어서, 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1로 이동하고, SH 유전자가 결실된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  249. 제234항에 있어서, 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 1로 이동하고, SH 유전자가 결실된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  250. 제234항에 있어서, 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1로 이동하고, 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 2로 이동하고, NS2 및 SH 유전자가 결실된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  251. 제234항에 있어서, 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1로 이동하고, 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 2로 이동하고, NS1, NS2 및 SH 유전자가 결실된 단리된 폴리뉴클레오티드.
  252. 제232항에 있어서, 약독화 돌연변이를 추가로 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  253. 제252항에 있어서, 약독화 돌연변이가 온도민감성 점 돌연변이, 비-온도민감성 점 돌연변이 및 유전자 결실로부터 선택된 적어도 하나인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  254. 삭제
  255. 삭제
  256. 제235항에 있어서, 인간 RSV 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1에 위치하고, 인간 RSV 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 2에 위치하며, 소 RSV NS1, NS2, N, P, M, SH, M2 및 L 유전자를 포함하는 인간-소 키메라 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  257. 제235항에 있어서, 인간 RSV 당단백질 G 유전자가 유전자 순서 위치 1에 위치하고, 인간 RSV 당단백질 F 유전자가 유전자 순서 위치 2에 위치하며, 인간 RSV NS1 유전자가 유전자 순서 위치 3에 위치하고, 인간 RSV NS2 유전자가 유전자 순서 위치 4에 위치하며, 소 RSV N, P, M, SH, M2 및 L 유전자를 포함하는 인간-소 키메라 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  258. 작동 가능하게 연결된 하기 i) 내지 iii)을 포함하는 발현 벡터:
    i) 포유동물 세포에서 전사를 촉진시킬 수 있는 프로모터;
    ii) 제232항 내지 제253항, 제256항 또는 제257항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드; 및
    iii) 포유동물 세포에서 전사를 종결시킬 수 있는 전사 종결자.
  259. 야생형 RSV 게놈 또는 안티게놈 내의 RSV 유전자 또는 게놈 분절의 위치에 비해 프로모터에 더 가깝거나(promoter-proximal) 프로모터에서 더 먼(promoter-distal) 위치로 위치이동을 한 NS1, NS2, N, P, M, SH, M2(ORF1), M2(ORF2), L, F 및 G 유전자 또는 그의 게놈 분절로 구성된 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 이동된 RSV 유전자 또는 게놈 분절을 가지는 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈, 및 RSV N, P, L 및 M2(ORF1) RNA 중합효소 신장 인자 단백질을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 가지는 발현 벡터를 무세포 용균물에서 발현시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드 분자로부터 감염성의 약독화된 재조합 RSV 입자를 제조하는 방법.
  260. 제259항에 있어서, 재조합 RSV 게놈 또는 안티게놈, 및 N, P, L 및 M2(ORF1) RNA 중합효소 신장 인자 중의 적어도 하나가 둘 이상의 다른 발현 벡터로부터 발현되는 방법.
  261. 제1항에 있어서, 재조합 게놈 또는 안티게놈이 다음 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 감염성 재조합 RSV:
    N 유전자에서 Val267이 Ile로 돌연변이; L 유전자내 Asn43이 Ile, Phe521이 Leu, Gln831이 Leu, Met1169가 Val, Tyr1321이 Asn으로 돌연변이; 및 M2 유전자의 유전자-개시 서열의 7605 위치에서 T가 C로 뉴클레오티드 치환.
  262. 제1항에 있어서, 재조합 게놈 또는 안티게놈이 사이토카인, T-헬퍼 에피토프 및 포유동물 숙주에서 미생물 병원체에 대해 보호적 면역 반응을 유도할 수 있는 상기 미생물 병원체의 단백질로부터 선택된 비-RSV 단백질을 코딩하는 감염성 재조합 RSV.
  263. 제1항에 있어서, 재조합 게놈 또는 안티게놈이 부분적 또는 완전한 RSV 백그라운드 게놈, 및 하나 이상의 이종 병원체의 하나 이상의 항원 결정자를 코딩하는 하나 이상의 이종 유전자 또는 게놈 분절을 포함하는 감염성 재조합 RSV.
  264. 생리학적으로 허용되는 담체내에 면역학적으로 충분한 양의 제1항, 제2항, 제208항 내지 제227항, 제230항, 제231항 또는 제261항 내지 제263항 중 어느 한 항의 재조합 RSV를 포함하는 면역원성 조성물.
  265. 제264항에 있어서, 103 내지 106 PFU의 용량으로 제제화된 면역원성 조성물.
  266. 제264항에 있어서, 분무, 액적(droplet) 또는 에어로졸에 의해 상부 기도에 투여되도록 제제화된 면역원성 조성물.
  267. 제232항에 있어서, 재조합 게놈 또는 안티게놈이 다음 중 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드:
    N 유전자에서 Val267이 Ile로 돌연변이; L 유전자에서 Asn43이 Ile, Phe521이 Leu, Gln831이 Leu, Met1169가 Val, Tyr1321이 Asn으로 돌연변이; 및 M2 유전자의 유전자-개시 서열의 7605 위치에서 T가 C로 뉴클레오티드 치환.
  268. 제232항에 있어서, 재조합 게놈 또는 안티게놈이 사이토카인, T-헬퍼 에피토프 및 포유동물 숙주에서 미생물 병원체에 대해 보호적 면역 반응을 유도할 수 있는 상기 미생물 병원체의 단백질로부터 선택된 비-RSV 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  269. 제232항에 있어서, 재조합 게놈 또는 안티게놈이 부분적 또는 완전한 RSV 백그라운드 게놈, 및 하나 이상의 이종 병원체의 하나 이상의 항원 결정자를 코딩하는 하나 이상의 이종 유전자 또는 게놈 분절을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
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