CN105200069A - 基于rna聚合酶ⅰ的rsv微型复制基因组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组及其应用，该微型复制基因组包含RNA聚合酶Ⅰ启动子和终止子、Gaussia荧光素酶(Gaussialuciferase，Gluc)报告基因、RSV前导序列(Leaderregion/genomicpromotor)、转录起始信号(Genestartsignal，GS)、转录终止信号(Geneendsignal，GE)和尾随序列(Trailerregion/antigenomicpromoter)等顺式作用元件(Cis-actingelements)；包含RSV微型复制基因组的pHM-RSV-Gluc表达载体，其包括基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组和pHM载体序列；利用所述筛选抗RSV化合物的方法，该方法包括如下步骤：接种宿主细胞，并加入RSV病毒和待筛选化合物；转染所述pHM-RSV-Gluc质粒到宿主细胞；检测Gaussia荧光素酶信号强度；评价待筛选化合物的抗RSV病毒的效果，通过该方法可对抗RSV的药物进行高通量筛选。

Description

基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物医学领域，更具体地，涉及建立抗病毒药物的筛选方法。

背景技术

呼吸道合胞病毒(HumanRespiratorySyncytialViru，RSV)是世界范围内引起婴幼儿和两岁以下儿童下呼吸道感染的最重要的病毒性病原，同时也在老年人和免疫缺陷人群引起严重感染。目前，利巴韦林和帕利珠单抗是仅有的用于RSV治疗和预防的药物，然而利巴韦林由于喷雾给药途径、药效不佳及存在致畸作用，阻碍了其在临床应用，帕利珠单抗主要用于2岁以下高危儿童且且价格昂贵，也未得到广泛使用。因而，开发新的抗RSV药物成为亟待解决的问题。而建立高通量的抗RSV药物筛选系统是研发新的抗RSV药物的核心。

快速、简便、经济的RSV定量方法是筛选抗RSV药物的基础，随着生物技术的不断发展，愈来愈多的方法被用于RSV定量检测，但都存在一定问题，难以用于高效筛选抗RSV药物。如：实时定量PCR因其高敏感和高特异性被用于定量RSV，但该方法不能区分活病毒和死病毒，限制了其在抗RSV药物筛选中的应用；酶联免疫吸附法(ELISAs)需要大量特异性抗体，导致该方法价格昂贵，难以用于大规模筛选抗RSV药物；基于细胞病变效应(CPE)的RSV定量方法存在耗时较长、工作量较大、容易受操作人员主观因素影响等缺点，也不适用于大规模样品的检测。

随着负链RNA病毒反向遗传学技术的发展，利用N、P、M2-1、L四种蛋白和病毒编码蛋白被报告基因取代了的微型复制基因组(Minigenome)模拟RSV的复制和转录过程成为了现实。以此为基础，有研究者构建了T7聚合酶驱动的RSV微型复制基因组，并用于定量RSV和筛选抗RSV药物，获得了不错的效果。但是，T7聚合酶驱动的RSV复制系统需要通过表达T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒、瞬时转染或建立稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系等方法提供T7RNA聚合酶，导致难以在宿主细胞内获得高水平的T7RNA聚合酶，进而限制了该系统的效率。另外，T7聚合酶驱动的RSV微型复制基因组转录后，会在的3′末端留有多余的外源基因片段，为去除该多余的基因片段，需要在微型基因组3′末端添加丁肝核酶，通过丁肝核酶将多余的基因片段切除掉，由于丁肝核酶切割效率有限，因而限制了功能性微型复制基因组的转录。

真核RNA聚合酶包括三种，分别是RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ、RNA聚合酶Ⅲ，其中RNA聚合酶Ⅰ位于真核细胞细胞核内，负责转录核糖体RNA，RNA聚合酶Ⅱ位于细胞质中，负责合成信使RNA(mRNA)的前体，RNA聚合酶Ⅲ位于细胞质中，负责合成转运RNA(tRNAs)。利用真核RNA聚合酶启动子的真核表达载体，需要具有RNA聚合酶的启动子，这样的表达载体能够在真核细胞中瞬时或永久表达目标基因。用于真核表达的载体通常采用RNA聚合酶Ⅱ的启动子，但RNA聚合酶Ⅱ的启动子并不能用于制备的RSV微型复制基因组。

因而需要提供一种可在真核细胞表达的RSV微型复制基因组，及包含该RSV微型复制基因组的载体。

发明内容

本发明的要解决的第一个技术问题是提供了一种基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种包含基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组的真核表达载体。

本发明要解决的第三个技术问题是包含基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组的真核表达载体在筛选抗RSV化合物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下述技术方案：

一种基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组，其包含RNA聚合酶Ⅰ启动子和Gaussia荧光素酶(Gluc)报告基因，所述微型复制基因组序列如seqIDNo：1所示。

在基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组中，我们保留了RSV前导序列(Leaderregion/genomicpromotor)、转录起始信号(Genestartsignal，GS)、转录终止信号(Geneendsignal，GE)和尾随序列(Trailerregion/antigenomicpromoter)等顺式作用元件(Cis-actingelements)，用Gluc(Gaussialuciferase)基因替代了RSV全部编码基因，并分别在基因组两端添加了RNA聚合酶Ⅰ启动子和终止子，获得了基于RNA聚合酶Ⅰ驱动的RSV微型复制基因组。

通常在建立病毒微型复制子时，需要含有T7聚合酶的启动子，但是T7聚合酶存在技术背景中所述的两大缺点。我们发现采用含有RNA聚合酶Ⅰ启动子的RSV微型复制基因组能够避免这两缺点。

一种基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组的pHM-RSV-Gluc表达载体，所述pHM-RSV-Gluc表达载体的序列如seqIDNo：2所示。该序列全长5638bp，其中228-1390bp之间为基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组，704-1261bp之间为Gluc报告基因，234-470bp之间为RNA聚合酶1启动子。所述pHM-RSV-Gluc表达载体的构建方法如下：构建pHM质粒；构建基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组；将所述RSV微型复制基因组装入pHM质粒，即获得pHM-RSV-Gluc表达载体。

其中pHM载体的构建方法包括但不限于：以pcDNA3.1(+)质粒为模板，PCR扩增1253bp-2080bp之间的DNA片段，所用的PCR引物为的上游引物为MF，含有MluⅠ酶切位点，序列如seqIDNo：3所示，所用的PCR的下游引物为：MR，含有SmaⅠ酶切位点，序列如seqIDNo：4所示。用MluⅠ和SmaⅠ双酶切PCR扩增的DNA片段，回收827bp的酶切后的PCR扩增片段，即获得pHM插入片段。同时用MluⅠ和SmaⅠ双酶切所述pcDNA3.1(+)质粒，并回收3579bp的DNA片段，获得第一pHM载体片段，连接pHM插入片段和第一pHM载体片段，即获得pHM质粒，即删除pcDNA3.1(+)质粒上233-1157bp之间片段，即获得pHM质粒，其中所述pcDNA3.1(+)质粒233-1157bp之间片段包含CMV启动子、T7启动子、MCS和BGH反向引物序列。

所述pcDNA3.1(+)质粒购买自Invitrogen公司。

其中，含有Gluc报告基因和RNA聚合酶1启动子的RSV微型复制子的构建方法包括但不限于全基因合成方法或PCR扩增法，优选为全基因合成方法，同时为保证稳定性，进一步将合成的Gluc报告基因连接在pUC57质粒体上，获得pUC57–RSV-Gluc质粒，其中所述微型复制子的全基因合成和连接是由上海生工完成，其中所述的微型复制子也可以连接在其他的质粒上。所述pHM-RSV-Gluc表达载体的组装方法为：

利用MluⅠ和EcoRⅤ内切酶双酶切所述pUC57–RSV-Gluc载体和pHM载体，回收pUC57–RSV-Gluc质粒的酶切产物中1163bp片段，获得RSV-Gluc片段；回收pHM载体的酶切产物中4475bp的片段，获得第二pHM载体片段，用T4DNA连接酶连接RSV-Gluc片段和第二pHM载体片段，即获得pHM-RSV-Gluc载体。

其中DNA片段的PCR、酶切与回收、载体的酶切与回收以及插入片段与载体片段或质粒片段间的连接可采用本领域技术人员所熟知的技术手段。

采用相似或相同的制备原理，基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组也可以连接至其他的表达载体中或修改的表达载体中，表达载体的修改方式不限于本申请例举的方法。

所述pHM-RSV-Gluc表达载体转染到真核细胞后不能表达荧光素酶报告基因，仅当RSV病毒同时感染转染了pHM-RSV-Gluc表达载体的细胞时，才能表达荧光素酶。

在一个实施例中，为确定pHM-RSV-Gluc转染的HEp-2细胞中能够正确表达报告基因，我们将HEp-2细胞培养在96孔板，24h后，接种RSV病毒，接种病毒后24h，参照转染试剂说明书建议量转染pHM-RSV-Gluc载体，与此同时我们设立2个阴性对照组，分别为转染pHM-RSV-Gluc载体但不接种RSV组和接种RSV但不转染pHM-RSV-Gluc载体组，和1个空白对照组，为不接种RSV也不转染pHM-RSV-Gluc载体，转染后48h检测Gaussia荧光(RLU)信号。仅当转染pHM-RSV-Gluc载体并接种RSV病毒时检测到了Gaussia荧光素酶(Gluc)的荧光信号(RLU信号)，即Gluc荧光强度。

一种利用所述pHM-RSV-Gluc表达载体筛选抗RSV化合物的方法，该方法包括如下步骤：接种宿主细胞，并加入RSV病毒和待筛选化合物；转染所述pHM-RSV-Gluc质粒到宿主细胞；检测Gaussia荧光素酶信号强度；评价待筛选化合物的抗RSV病毒的效果。

所述宿主细胞为HEp-2细胞或Vero细胞，优选为HEp-2细胞。

所述宿主细胞包括阴性对照组宿主细胞、阳性对照组宿主细胞和测试组宿主细胞，其中所述阴性照组宿主细胞既不加病毒也不加化合物；阳性对照组宿主细胞加入RSV病毒，同时还加入对RSV病毒明确有抑制作用的化合物；测试组宿主细胞接种RSV病毒和待筛选的化合物；病毒对照组宿主细胞只加病毒，不加化合物。优选地，所述阳性对照与测试组宿主细胞加入RSV病毒的量相同。利用荧光素酶活性抑制率评价待筛选的化合物的抗RSV的效果，其中计算荧光素酶活性抑制率的公式如下：

所述荧光强度是指Gaussia荧光素酶(Gluc)的荧光信号(RLU信号)。

荧光素酶活性抑制率越大则表明化合物对RSV抑制效果越明显。

可以对比阳性对照组宿主细胞和测试组宿主细胞的荧光素酶活性抑制率，定性比较测试化合物对RSV的抑制作用。

在一个实施方案中，验证了RSV感染滴度与微型基因组的报告基因Gluc表达水平存在剂量-效应关系。

我们分别以0MOI、0.01MOI、0.03MOI、0.1MOI、0.2MOI、0.4MOI、0.8MOI和1MOI的RSV感染HEp-2细胞，24h后，转染pHM-RSV-Gluc表达载体，转染后48h检测Gluc表达水平。结果显示：在0MOI到0.3MOI之间，随着RSV滴度增加，RLU增大，且存在剂量-效应关系。当RSV滴度超过这一范围后，Gluc水平出现下降趋势，因而适合的感染剂量为0.1-0.3MOI。

在另一个实施方案中，优化了报告基因Gluc的检测条件：为确定合适的检测时间，分别用0.1、0.2和0.4MOI的RSV感染HEp-2细胞，感染后24h，转染pHM-RSV-Gluc表达载体，分别于转染后24h、36h、48h、60h和72h收集上清，检测Gluc表达水平，适合检测时间为转染后40-60h，最佳检测时间为转染后48h。

在一个实施方案中，在确定最佳检测时间后，我们对细胞密度进行了优化，在前期预实验的基础上，分别按1×10⁴细胞/孔、1.5×10⁴细胞/孔和2×10⁴细胞/孔的密度将HEp-2细胞传代到96孔板中，分别用0.1、0.2和0.4MOI的RSV感染HEp-2细胞，感染后24h，转染pHM-RSV-Gluc表达载体，于转染后48h收集上清，检测Gluc表达水平。1.5×10⁴-2.5×10⁴细胞/孔时是最佳的细胞转染密度

在另一个实施方案中，我们对微型复制基因组转染剂量进行了优化，分别用0.1、0.2和0.4MOI的RSV感染HEp-2细胞，感染后24h，。感染后24h，用pHM-RSV-Gluc表达载体分别以0.05、0.1、0.15或0.2μg/孔转染细胞，转染后48h收集细胞上清液，检测Gluc表达水平。当微型复制基因组浓度为0.1μg/孔，时能检测到最强的报告基因信号(P<0.05)，因此，最佳微型复制基因子转染浓度为0.1μg/孔。

在一个实施方案中，为确定最优RSV感染滴度，在96孔板中，HEp-2细胞丰度为2×10⁴细胞/孔时，分别感染0MOI、0.05MOI、0.1MOI、0.2MOI、0.4MOI、0.8MOI和1MOI的RSV，并利用MTS法对细胞活性进行了检测，随着RSV浓度的增高细胞活性呈现下降的趋势，然而在0MOI到0.3MOI之间细胞活性维持在80％以上，结合剂量-效应关系建立的实验结果及参数优化部分的实验结果表明，适合的RSV感染剂量为0.1-0.3MOI，最佳RSV感染剂量为0.2MOI。

在一个优选实施方案中，以利巴韦林和P13作为阳性药物，确认该系统可用于筛选抗RSV药物；我们将化合物P13溶解在DMSO中，分别将10^-4μM、10^-3μM、10^-2μM、10^-1μM、1μM、10¹μM和10²μM的P13与0.2MOI的RSV同时加到HEp-2细胞中，24h后转染pHM-RSV-Gluc，转染后48h收集上清，检测Gluc表达水平，同时设立相应剂量DMSO对照组。我们利用利巴韦林进行了同样的实验。

被筛选的化合物可以是单个化合物，也可以是由单个化合物组成的混合化合物。初筛后，将阳性的混合化合物样品再拆分为单个化合物，通过抗RSV高通量筛选模型进行再次筛选。

本发明的有益效果如下：

1.此方法操作简便，所需时间短，能够更快速反映病毒状况；

2.本系统检测部分于96孔板进行操作，能够实现同时对多个化合物样本进行筛选鉴定工作；

3.Gluc是已知最小的荧光素酶(185个氨基酸)，是一种能够发出很强荧光的自然分泌的蛋白，因此其插入较稳定，且具有极高的灵敏性；

4.Gluc具有稳定性，很多荧光素酶具有“瞬时发光”的特点，其荧光强度在第一时间之后会发生很大变化，从而不适合用于大量筛选，而Gluc则克服了这一问题，其不仅在细胞培养基中较稳定，对于PH、温度等的变化也不敏感，能够长期保存；

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出pUC57-RSV-Gluc质粒的酶切鉴定电泳图，其中M代表分子量标记物。

图2示出pHM-RSV-Gluc表达载体的酶切鉴定电泳图，其中M代表分子量标记物。图3示出Gluc表达的鉴定，其中RLU为荧光强度。

图4示出RSV与Gluc之间的剂量-效应关系，其中RSVtiter为RSV滴度。

图5示出Gluc荧光检测值在不同时间点强度变化曲线，hoursposttransfection为转染后时间。

图6示出细胞密度与检测结果关系，其中，cell/well为96孔板中，每孔中的细胞数单位，即细胞/孔。。

图7示出质粒转染量对Gluc表达的影响，plasmid(μg/well)为质粒的量：质粒(μg/孔)。

图8示出病毒感染量对细胞活性的影响，其中RSVtiter为RSV滴度。

图9示出阳性化合物P13与Gluc表达强度关系，其中cellviability为细胞活性。

图10示出示出利巴韦林与Gluc表达强度关系，其中Ribavlrin为利巴韦林。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1：pHM-RSV-Gluc筛选质粒的构建

1、RSV-Gluc基因合成

基因合成公司根据本实验室提供的序列对RSV-Gluc片段进行全基因合成，为保持其稳定性将片段插入pUC57载体中提供，命名为“pUC57-RSV-Gluc”。将pUC57-RSV-Gluc质粒利用MluⅠ和EcoRⅤ进行酶切鉴定，于1159bp处得到目的条带(图1)，即RSV-Gluc片段。

2、pHM-RSV-Gluc筛选质粒的构建

利用MluⅠ和EcoRⅤ分别双酶切pUC57-RSV-Gluc和改造后的pHM载体，得到RSV-Gluc片段和第二pHM载体片段，将第二pHM载体片段和RSV-Gluc片段连接，获得pHM-RSV-Gluc，并利用限制性内切酶MluⅠ和EcoRⅤ进行酶切鉴定，分别得到4507bp以及1159bp片段，核酸电泳结果如图2所示。

实施例2：Gluc表达鉴定

将HEp-2细胞接种在96孔板，24h后，加入0.1MOI的RSV病毒，加入病毒后24h，参照转染试剂说明书建议量转染pHM-RSV-Gluc表达载体，与此同时设立阴性对照组1、阴性对照组2和空白对照组，其中阴性对照组1转染表达载体但不接种RSV，阴性对照组2接种RSV但不转染表达载体组，空白对照组不接种RSV也不转染表达载体，转染后48h检测RLU信号。结果显示如图3所示，与阴性对照组1、阴性对照组2和空白对照组相比，实验组RLU能达到一个相对较高的值(P<0.05)，表明只有当RSV存在时，Gluc才表达；缺少RSV或pHM-RSV-Gluc中任意一个，RLU都与空白组没有差异(P>0.05)，由此我们初步判断Gluc的表达是依赖于RSV的。

实施例3：剂量-效应关系建立

分别以0MOI、0.01MOI、0.03MOI、0.1MOI、0.2MOI、0.4MOI、0.8MOI和1MOI的RSV感染HEp-2细胞，24h后，转染pHM-RSV-Gluc表达载体，转染后48h检测Gluc表达水平。结果显示：在0MOI到0.2MOI之间，随着RSV滴度增加，RLU增大，且存在剂量-效应关系，结果如图5所示。

实施例4：检测条件的优化

1.确定合适的检测时间：

分别用0.1、0.2和0.4MOI的RSV感染HEp-2细胞，感染后24h，转染pHM-RSV-Gluc表达载体，分别于转染后24h、36h、48h、60h和72h收集细胞上清液，检测Gluc表达水平。如图5所示，在转染后48h，三个不同RSV滴度感染组Gluc表达水平均达到峰值(P<0.05)，表明最佳检测时间为转染后48h。

2.优化宿主细胞密度：

在上述实验的基础上，分别按1×10⁴细胞/孔、1.5×10⁴细胞/孔和2×10⁴细胞/孔的密度将HEp-2细胞传代到96孔板中，分别用0.1、0.2和0.4MOI的RSV感染HEp-2细胞，感染后24h，转染pHM-RSV-Gluc表达载体，于转染后48h收集细胞上清液，检测Gluc表达水平。如图6所示，当细胞密度为2×10⁴细胞/孔时能够检测到最大信号强度(P<0.05)，当细胞密度为2×10⁴细胞/孔时，三个不同RSV滴度感染组的Gluc表达水平均达到最大，因此在后续实验中我们按细胞密度为2×10⁴细胞/孔的细胞密度进行。

3.优化微型复制基因组转染剂量：

96孔板中，HEp-2细胞丰度为2×10⁴细胞/孔时，分别感染0.1、0.2和0.4MOI的RSV，感染后24h，用pHM-RSV-Gluc表达载体分别以0.05、0.1、0.15或0.2μg/孔转染细胞，转染后48h收集细胞上清液，检测Gluc表达水平。如图7所示，当微型复制基因组浓度为0.1μg/孔，时能检测到最强的报告基因信号(P<0.05)，因此，最佳微型复制基因子转染浓度为0.1μg/孔。

4.确定最佳RSV感染滴度：

96孔板中，HEp-2细胞丰度为2×10⁴细胞/孔时，分别感染0MOI、0.05MOI、0.1MOI、0.2MOI、0.4MOI、0.8MOI和1MOI的RSV(如图4)，并利用MTS法对细胞活性进行了检测，如图8所示，随着RSV浓度的增高细胞活性呈现下降的趋势，然而在0MOI到0.3MOI之间细胞活性维持在80％以上，结合剂量-效应关系建立的实验结果及参数优化部分的实验结果表明，适合的RSV感染剂量为0.1-0.3MOI，最佳RSV感染剂量为0.2MOI。

实施例5：系统验证

96孔板中，HEp-2细胞丰度为2×10⁴细胞/孔时，将化合物P13溶解在DMSO中，分别以10^-4μM、10^-3μM、10^-2μM、10^-1μM、1μM、10μM和100μM的P13与0.2MOI的RSV同时加到细胞中，24h后以0.1μg/孔细胞转染pHM-RSV-Gluc表达载体，转染后48h收集细胞上清液，检测Gluc表达水平，同时设立相应剂量的DMSO对照组。当化合物P13浓度为10^-1μM时，与DMSO对照组相比，Gluc表达水平显著下降(图9，P<0.05)；当P13浓度达到1μM时，Gluc表达量几乎完全被抑制。

同时，我们也利用MTS法对细胞活性进行了检测，结果表明在所有实验剂量组中，细胞活性均保持在80％以上，提示我们P13对RSV的抑制作用并不是由其细胞毒性引起的，此外我们的结果还发现DMSO溶剂对Gluc的表达存在一定程度的影响，但并不是主要影响因素。基于这些结果，我们认为此系统能够正确反映P13化合物对RSV的抑制作用。

我们利用利巴韦林进行了同样的实验，结果表明系统同样体现出其对RSV的抑制作用，当利巴韦林浓度为10^-3μM时，与空白对照组相比，Gluc表达水平显著下降(P<0.05)；当利巴韦林浓度达到1μM时，Gluc表达量几乎完全被抑制，且利巴韦林对RSV的抑制作用呈现明显的量效关系，如图10所示。同时，我们也利用MTS法对细胞活性进行了检测，结果表明在所有实验剂量组中，细胞活性均保持在80％以上。上述实验结果表明该系统能够用于筛选抗RSV药物。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组，其特征在于，包含RNA聚合酶Ⅰ启动子和Gaussia荧光素酶(Gluc)报告基因，所述微型复制基因组序列如seqIDNo：1所示。

2.一种包含基于RNA聚合酶Ⅰ的RSV微型复制基因组的pHM-RSV-Gluc表达载体，其特征在于，所述pHM-RSV-Gluc表达载体的序列如seqIDNo.2所示。

3.一种利用权利要求2所述表达载体筛选抗RSV化合物的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：接种宿主细胞，并加入RSV病毒和待筛选化合物；转染所述pHM-RSV-Gluc质粒到宿主细胞；检测Gaussia荧光素酶信号强度；评价待筛选化合物的抗RSV病毒的效果。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细胞接种于96孔板中，宿主细胞的接种密度为1.5-2.5×10⁴细胞/孔，优选地为2×10⁴细胞/孔。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述96孔板中，宿主细胞感染RSV的量为MOI＝0-1/孔，更优选地，宿主细胞感染RSV的量为MOI＝0.1/孔。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述96孔板中，转染到宿主细胞中的pHM-RSV-Gluc质粒的量为0.05-0.2μg/孔，优选地为0.1μg/孔。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，加入RSV病毒和待筛选化合物后，细胞继续培养24h，然后转染pHM-RSV-Gluc载体。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括阴性对照组宿主细胞和/或阳性对照组宿主细胞。

9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞包括HEp-2细胞和vero细胞，优选为HEp-2细胞。

10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，转染后40-60h检测Gaussia荧光素酶信号强度，优选地，转染后48h检测Gaussia荧光素酶信号强度48h。