CN104593412A - 一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法。是通过PCR方法在1型鸭甲肝病毒核酸序列的5′端和3′端分别添加了具有自我剪切性质的核酶序列hammerhead ribozyme(ACA TCA TCT GAT GAG TCC GTG AGG ACG AAA CGG TAC CCG GTA CCG TCA T)和hepatitis delta virus ribozyme(GTC CCA TTC GCC ATT ACC GAG GGG ACG GTC CCC TCG GAA TGT TGC CCA GCC GGC GCC AGC GAG GAG GCT GGG ACC ATG CCG GCC)。该重组质粒可以直接转染细胞，转录出两端带有核酶序列的mRNA。上述核酶序列在Mg2+存在的条件下，可以实现自我剪切，故可得到病毒mRNA。本发明是一种操作简便、高效、节约的感染性克隆构建方法。
Description
(一)技术领域
本发明所涉及的是一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法，属于病毒分子生物学领域。
(二)背景技术
1型鸭甲肝病毒是一种感染1-3周龄雏鸭为主的高传染性、高死亡率的单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝病毒属(Avihepatovirus)。该病毒全长7700bp，包含5’非编码区(untranslated region,UTR)、一个大的开放阅读框(open-reading frame,ORF)和3′UTR(3’untranslated regions)和poly(A)尾。5′UTR没有帽子结构，但有内部核糖体进入位点(the internal ribosome enter site,IRES)。
目前，反向遗传学技术是深入开展鸭甲肝病毒的致病机理及蛋白功能的研究等方面研究的最有力手段。RNA病毒反向遗传系统是指以RNA病毒的基因组的cDNA为模板，分段定向克隆到载体上，体内或体外转录后重新拯救出活病毒或类似病毒物质，也成为RNA-Launched感染性克隆。对于单股正链的DHAV-Ⅰ而言，研究的核心是构建病毒的感染性cDNA分子克隆，即在获得病毒基因组全序列的基础上，借助于某些载体，将病毒的全长cDNA分子克隆入载体中，同时将RNA合酶的启动子元件序列也无缝插入分子克隆中，通过体外转录方法得到病毒mRNA，然后转染敏感细胞系，拯救出与母本病毒具有相似生物特性的活病毒。该方法具有以下弊端：1.为了确保病毒的开放阅读框被准确转录、翻译，RNA聚合酶必须无缝添加到DHAV-1序列前，即RNA聚合酶与病毒cDNA序列间不能有多余碱基，这样就使得长片段RNA聚合酶的添加异常困难。2.需要进行体外转录：鸭甲肝病毒Ⅰ型RNA-Launched感染性克隆构建完成后，首先需要利用添加在病毒序列尾端的限制性内切酶将重组阳性质粒线性化，继而将线性化的重组质粒进行体外转录，最后将体外转录产物转染易感细胞。体外转录具有操作难度大、无法保证转录出的mRNA完整性等缺点。3.转染效率低：体外转录的产物为单股、线性化的mRNA，转染效率较质粒低。4.经济负担大：目前国内外出售的体外转录试剂盒价格昂贵，增加试验经费。
(三)发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的构建方法，是一种操作简便、高效、节约的感染性克隆构建方法。
本发明在构建过程中，通过PCR方法在1型鸭甲肝病毒核酸序列的5′端和3′端分别添加了具有自我剪切性质的核酶序列hammerhead ribozyme(ACA TCA TCT GAT GAG TCC GTG AGG ACG AAA CGG TAC CCG GTA CCG TCA T)和hepatitis delta virus ribozyme(GTC CCA TTC GCC ATT ACC GAG GGG ACG GTC CCC TCG GAA TGT TGC CCA GCC GGC GCC AGC GAG GAG GCT GGG ACC ATG CCG GCC)。该重组质粒可以直接转染细胞，转录出两端带有核酶序列的mRNA。上述核酶序列在Mg2+存在的条件下，可以实现自我剪切，故可得到病毒mRNA。
一种用于构建1型鸭甲肝病毒(Duck hepatitis A virus type 1,DHAV-1)DNA-Launched感染性克隆的方法，包括以下步骤：
A、根据DHAV-1的LY0801株(GenBank登录号为FJ436047.1)RNA-launched感染性克隆和载体pIRES2-EGFP(Clontech公司)的序列，设计引物进行PCR反应。
5HeadRibo-F：5’-ACA TGG CGC GCC ACA TCA TCT GAT GAG TCC GTG AGG ACG AAA CGG TAC CCG CGT GAG GAC GAA ACG GTA CCC GGT ACC GTC ATT TTG AAA GCG GGT GCA TGC ATG GCC AT-3’
5HeadRibo-R：5’-AGG TGG ATC CAC TAT TGT CAC CTT C-3’
3endRibo-F：5’-TAG TGG ATC CAC CTG AAA CAC C-3’
3endRibo-R：5’-GCT CTA GAG TCC CAT TCG CCA TTA CCG AGG GGA CGG TCC CCT CGG AAT GTT GCC CAG CCG GCG CCA GCG AGG AGG CTG GGA CCA TGC CGG CCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA GGT AGG GTA GGG AAT AGT AAA GT-3’
pIR-XhoI-F：5’-GTC TAG ACA TAA TCA GCC ATA CCA CAT TTG TAG AGG-3’
pIR-AscI-R：5’-GAA GGC GCG CCT CGA GAT CTG AGT CCG GTA G-3’
BamH I-detect-F:ACAACTGGTGGTGCCATTTGTGT
BamH I-detect-R：TTGACTGCATGTGATCACCTGCTGG
引物设计过程中，将DHAV-1病毒基因组序列AGG TGA ATC CAC TAT TGT CAC CTT C(斜体A为3’到5’顺序、位于病毒基因组3042位碱基需要突变的碱基)突变为AGG TGG ATC CAC TAT TGT CAC CTT C(斜体G为突变后的碱基)并作为添加5’核酶的下游引物(5HeadRibo-R)，将序列TAG TGG ATTCAC CTG AAA CAC C(斜体T为5’到3’顺序、位于病毒基因组3042位碱基需要突变的碱基需要突变的碱基)突变为TAG TGG ATC CAC CTG AAA CAC C(斜体C为突变后的碱基)并作为添加3’核酶的上游引物(3endRibo-F)。为了将hammerhead ribozyme引入5’上游，同时将突变(碱基A突变为碱基G)引入病毒基因组，以5HeadRibo-F、5HeadRibo-R为上下游引物，以DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆为模板进行扩增，得到片段A。为了将hepatitis delta virus ribozyme引入3’下游，同时将突变(碱基T突变为碱基C)引入病毒基因组,以3endRibo-F、3endRibo-R为上下游引物，以DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆为模板进行扩增，得到片段B。片段A和B扩增体系为：15.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl 10×EX-Taq Buffer，2μl dNTPs(10.0mM)，2μl MgCl2(25mM)，上下游引物(片段A为5HeadRibo-F、5HeadRibo-R，片段B为3endRibo-F、3endRibo-R)各1μl，DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆阳性质粒1μl，0.2μl EX-Taq酶。片段A和B的扩增条件均为：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃4min，72℃10min。由于扩增片段A时，将突变(碱基A突变为碱基G)引入病毒基因组，扩增片段B 时将突变(碱基T突变为碱基C)引入病毒基因组，二者互补配对，以片段A、B为模板进行PCR即可达到突变DHAV-1第3042位碱基的目的。因此以片段A和片段B为模板，以5HeadRibo-F和3endRibo-R为上下游引物，扩增得到片段C。扩增体系为：15.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl 10×EX-Taq Buffer，2μl dNTPs(10.0mM)，2μl MgCl2(25mM)，5HeadRibo-F和3endRibo-R各1μl，片段A和片段B的胶回收产物各1μl，0.2μl EX-Taq酶。片段C的扩增条件为：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃7min，72℃10min。
B、以pIR-XhoI-F和pIR-AscI-R为上下游引物，以载体pIRES2-EGFP(Clontech公司)为模板进行PCR扩增。扩增体系为：15.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl 10×EX-Taq Buffer，2μl dNTPs(10.0mM)，2μl MgCl2(25mM)，pIR-XhoI-F和pIR-AscI-R各1μl，0.2μl EX-Taq酶。扩增条件为：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃5min，72℃10min。将扩增产物命名为pIR。
C、分别酶切片段C和片段pIR，反应体系为：片段C/片段pIR 40μl，10×CutSmart-Buffer5μl，XhoI与AscI(NEB公司)各2.5μl。反应条件为37℃水浴2h。分别用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪公司)回收酶切产物，进行连接，连接的体系为：片段C胶回收产物7μl，片段pIR胶回收产物1μl，10×T4Buffer 1μl，T4连接酶1μl，反应条件为4℃水浴过夜，转化DH5ɑ感受态并挑取阳性克隆，得到重组质粒即为DNA-Launched感染性克隆阳性质粒，并将其命名为pIR-DHAV-1。
(四)附图说明
图1 1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆构建方法示意图
图2 基因标记检测
图中：M：Maker2000；1,母本病毒PCR扩增结果图；2,BamHI消化母本病毒PCR产物电泳图；3,BamHI消化拯救病毒PCR产物电泳图；4,PCR扩增拯救病毒电泳图。
由于突变插入DNA-Launched感染性克隆的BamHI位点位于BamH I-detect-F和BamH I-detect-R扩增的序列范围内，因此，只有通过感染性克隆拯救的病毒粒子才在BamH I-detect-F和BamH I-detect-R扩增范围内具有此BamHI位点，野生病毒不存在此位点。因此只有通过DNA-Launched感染性克隆拯救出的病毒才能被BamHI位点切割成为1785bp和504bp的条带，野生病毒不能被BamHI位点切割。
图3 间接免疫荧光检测
图中：IFA结果：A.阴性对照组B.转染组(转染DNA-Launched感染性克隆重组质粒组)C.阳性对照组(野生病毒感染组)
IFA反应中使用的一抗为特异性的DHAV-1的单克隆抗体进行，二抗为FITC标记羊抗鼠的二抗。图中转染组和阳性对照组均出现了特异性的绿色荧光，表明通过转染DNA-Launched感染性克隆重组质粒可以得到DHAV-1病毒粒子。
(五)具体实施方式
1融合PCR反应
A、根据DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆和载体pIRES2-EGFP(Clontech公司)的序列，设计引物进行PCR。
5HeadRibo-F：5’-ACA TGG CGC GCC ACA TCA TCT GAT GAG TCC GTG AGG ACG AAA CGG TAC CCG CGT GAG GAC GAA ACG GTA CCC GGT ACC GTC ATT TTG AAA GCG GGT GCA TGC ATG GCC AT-3’
5HeadRibo-R：5’-AGG TGG ATC CAC TAT TGT CAC CTT C-3’
3endRibo-F：5’-TAG TGG ATC CAC CTG AAA CAC C-3’
3endRibo-R：5’-GCT CTA GAG TCC CAT TCG CCA TTA CCG AGG GGA CGG TCC CCT CGG AAT GTT GCC CAG CCG GCG CCA GCG AGG AGG CTG GGA CCA TGC CGG CCT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTA GGT AGG GTA GGG AAT AGT AAA GT-3’
pIR-XhoI-F：5’-GTC TAG ACA TAA TCA GCC ATA CCA CAT TTG TAG AGG-3’
pIR-AscI-R：5’-GAA GGC GCG CCT CGA GAT CTG AGT CCG GTA G-3’
BamH I-detect-F:ACAACTGGTGGTGCCATTTGTGT
BamH I-detect-R：TTGACTGCATGTGATCACCTGCTGG
引物设计过程中，将DHAV-1病毒基因组序列AGG TGA ATC CAC TAT TGT CAC CTT C(斜体A为3’到5’顺序、位于病毒基因组3042位碱基需要突变的碱基)突变为AGG TGG ATC CAC TAT TGT CAC CTT C(斜体G为突变后的碱基)并作为添加5’核酶的下游引物(5HeadRibo-R)，将序列TAG TGG ATTCAC CTG AAA CAC C(斜体T为5’到3’顺序、位于病毒基因组3042位碱基需要突变的碱基需要突变的碱基)突变为TAG TGG ATC CAC CTG AAA CAC C(斜体C为突变后的碱基)并作为添加3’核酶的上游引物(3endRibo-F)。为了将hammerhead ribozyme引入5’上游，同时将突变(碱基A突变为碱基G)引入病毒基因组，以5HeadRibo-F、5HeadRibo-R为上下游引物，以DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆为模板进行扩增，得到片段A。为了将hepatitis delta virus ribozyme引入3’下游，同时将突变(碱基T突变为碱基C)引入病毒基因组,以3endRibo-F、3endRibo-R为上下游引物，以DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆为模板进行扩增，得到片段B。片段A和B扩增体系为：15.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl 10×EX-Taq Buffer，2μl dNTPs(10.0mM)，2μl MgCl2(25mM)，上下游引物(片段A为5HeadRibo-F、5HeadRibo-R，片段B为3endRibo-F、3endRibo-R)各1μl，DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆阳性质粒1μl，0.2μl EX-Taq酶。片段A和B的扩增条件均为：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃4min，72℃10min。由于扩增片段A时，将突变(碱基A突变为碱基G)引入病毒基因组，扩增片段B时将突变(碱基T突变为碱基C)引入病毒基因组，二者互补配对，以片段A、B为模板进行PCR即可达到突变DHAV-1第3042位碱基的目的。因此以片段A和片段B为模板，以5HeadRibo-F和3endRibo-R为上下游引物，扩增得到片段C。扩增体系为：15.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl 10×EX-Taq Buffer，2μl dNTPs (10.0mM)，2μl MgCl2(25mM)，5HeadRibo-F和3endRibo-R各1μl，片段A和片段B的胶回收产物各1μl，0.2μl EX-Taq酶。片段C的扩增条件为：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃7min，72℃10min。
B、以pIR-XhoI-F和pIR-AscI-R为上下游引物，以载体pIRES2-EGFP(Clontech公司)为模板进行PCR扩增。扩增体系为：15.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl 10×EX-Taq Buffer，2μl dNTPs(10.0mM)，2μl MgCl2(25mM)，pIR-XhoI-F和pIR-AscI-R各1μl，0.2μl EX-Taq酶。扩增条件为：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃5min，72℃10min。将扩增产物命名为pIR。
2感染性克隆构建
分别酶切片段C和片段pIR，反应体系为：片段C/片段pIR 40μl，10×CutSmart-Buffer 5μl，XhoI与AscI(NEB公司)各2.5μl。反应条件为37℃水浴2h。分别用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪公司)回收酶切产物，进行连接，连接的体系为：片段C胶回收产物7μl，片段pIR胶回收产物1μl，10×T4Buffer 1μl，T4连接酶1μl，反应条件为4℃水浴过夜，转化DH5ɑ感受态并挑取阳性克隆，得到重组质粒即为DNA-Launched感染性克隆阳性质粒，命名为pIR-DHAV-1。
3转染
转染前24h，细胞6孔培养板中接种2×105～3×105个BHK-21细胞，置于37、℃5％CO2细胞培养箱培养。将1.6μl转染试剂及2μg重组质粒pIR-DHAV-1稀释于50μl无血清无抗生素的DMEM培养基中，室温放置5min。将含有转染试剂和重组质粒pIR-DHAV-1的培养基轻柔混合并置于室温放置30min并添加到用无菌的PBS缓冲液清洗3次的BHK-21细胞。
4拯救病毒粒子鉴定
A、RT-PCR鉴定
将重组质粒pIR-DHAV-1直接转染BHK-21细胞，60h后收取细胞及其上清液。反复冻融三次后(冻融条件为：-20℃冷冻1h，室温融化)，进行总RNA提取，并进行反转录。反转录的体系为：RNase-Free H2O5.5μL，5×MLV Buffer 4μL，2μl dNTPs(10.0mM)，RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μL，RTase M-MLV(RNase H-)(200U/μl)1μL，下游引物BamH I-detect-R 2μL，RNA Template 5.0μL。反应条件为42℃50min，72℃15min。以反转录产物为模板进行PCR反应，反应体系为：15.3μl ddH2O(Rnase free)，2.5μl 10×EX-Taq Buffer，2μl dNTPs(10.0mM)，2μl MgCl2(25mM)，BamH I-detect-F 1μl，BamH I-detect-R 1μl，反转录产物1μl，0.2μl EX-Taq酶。PCR扩增条件为：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃5min，72℃10min，扩增得到长度为2289bp的片段。由于突变插入DNA-Launched感染性克隆的BamH I位点位于BamH I-detect-F和BamH I-detect-R扩增的序列范围内，因此，只有通过感染性克隆拯救的病毒粒子在BamH I-detect-F和BamH I-detect-R扩增范围内才具有此BamHI位点，野生病毒在此范围内不存在此位点。将扩增出的条带用BamHⅠ进行酶切，通过DNA-Launched感染性克隆拯救出的病毒的扩增片段会被酶切为两条大小分别为1785bp和504bp的条带，而野生病毒不能被BamHI酶切，表明通过直接转染构建的重组阳 性质粒，可以得到具有预先设计标签(即插入的BamH I位点)的病毒粒子，进一步说明感染性克隆构建成功。
B、IFA鉴定
转染组：收集细胞转染产物并反复冻融3次(冻融条件为：-20℃冷冻1h，室温融化)，将冻融产物接种单层BHK-21细胞。阳性对照组：将DHAV-1LY0801株接种单层BHK-21细胞。阴性对照组：将无菌PBS缓冲液加入单层BHK-21细胞。三组均在在接种60h后去除细胞上清，置于-20℃的冷丙酮或丙酮与无水乙醇(50％：50％V)中固定细胞30min。用无菌PBS缓冲液漂洗3次，每次5min，置室温风干。加入1mL PBS缓冲液稀释鼠DHAV-1阳性血清(1：100)，置37℃细胞培养箱中孵育60min。用PBS缓冲液漂洗3次，每次5min，然后置于室温风干。加入1mL PBS稀释的FITC羊抗鼠IgG(1：100)，置于37℃细胞培养箱中孵育60min。用PBS缓冲液漂洗3次，每次5min，然后在荧光显微镜下观察荧光。IFA反应中使用的一抗为特异性的DHAV-1的单克隆抗体进行，二抗为FITC标记羊抗鼠的二抗。如图3所示，图中转染组和阳性对照组均出现了特异性的绿色荧光，表明通过转染DNA-Launched感染性克隆重组质粒可以得到DHAV-1病毒粒子。
Claims (1)
1.一种用于构建1型鸭甲肝病毒DNA-Launched感染性克隆的方法，其特征在于包括以下步骤：
A、根据DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆和载体pIRES2-EGFP的序列，设计引物进行PCR反应；
5HeadRibo-F：5’-ACA TGG CGC GCC ACA TCA TCT GAT GAG TCC GTG AGG ACG AAA CGG TACCCG CGT GAG GAC GAA ACG GTA CCC GGT ACC GTC ATT TTG AAA GCG GGT GCA TGC ATG GCCAT-3’
5HeadRibo-R：5’-AGG TGG ATC CAC TAT TGT CAC CTT C-3’
3endRibo-F：5’-TAG TGG ATC CAC CTG AAA CAC C-3’
3endRibo-R：5’-GCT CTA GAG TCC CAT TCG CCA TTA CCG AGG GGA CGG TCC CCT CGG AATGTT GCC CAG CCG GCG CCA GCG AGG AGG CTG GGA CCA TGC CGG CCT TTT TTT TTT TTT TTTTTT TTA GGT AGG GTA GGG AAT AGT AAA GT-3’
pIR-XhoI-F：5’-GTC TAG ACA TAA TCA GCC ATA CCA CAT TTG TAG AGG-3’
pIR-AscI-R：5’-GAA GGC GCG CCT CGA GAT CTG AGT CCG GTA G-3’
BamH I-detect-F:ACAACTGGTGGTGCCATTTGTGT
BamH I-detect-R：TTGACTGCATGTGATCACCTGCTGG
以5HeadRibo-F、5HeadRibo-R为上下游引物，以DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆为模板进行扩增，得到片段A；以3endRibo-F、3endRibo-R为上下游引物，以DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆为模板进行扩增，得到片段B；片段A和B扩增体系为：15.3μl ddH2O，2.5μl10×EX-Taq Buffer，2μl浓度为10.0mM的dNTPs，2μl浓度为25mM的MgCl2，上下游引物各1μl：片段A引物为5HeadRibo-F、5HeadRibo-R，片段B引物为3endRibo-F、3endRibo-R；DHAV-1的LY0801株RNA-launched感染性克隆阳性质粒1μl，0.2μl EX-Taq酶；片段A和B的扩增条件均为：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃4min，72℃10min；
再以得到的片段A和片段B为模板，以5HeadRibo-F和3endRibo-R为上下游引物，扩增得到片段C：扩增体系：15.3μl ddH2O Rnase free，2.5μl 10×EX-Taq Buffer，2μl 10.0mM dNTPs，2μl 25mM MgCl2，5HeadRibo-F和3endRibo-R各1μl，片段A和片段B的胶回收产物各1μl，0.2μl EX-Taq酶；片段C的扩增条件：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃7min，72℃10min；
B、以pIR-XhoI-F和pIR-AscI-R为上下游引物，以载体pIRES2-EGFP为模板进行PCR扩增；扩增体系：15.3μl ddH2O Rnase free，2.5μl 10×EX-Taq Buffer，2μl 10.0mM dNTPs，2μl 25mM MgCl2，pIR-XhoI-F和pIR-AscI-R各1μl，0.2μl EX-Taq酶；扩增条件：95℃10min，95℃50s，55℃50s，72℃5min，72℃10min；将扩增产物命名为pIR；
C、分别酶切片段C和片段pIR，反应体系为：片段C/片段pIR 40μl，10×CutSmart-Buffer5μl，XhoI与AscI各2.5μl；反应条件为37℃水浴2h；分别用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物，进行连接，连接体系为：片段C胶回收产物7μl，片段pIR胶回收产物1μl，10×T4 Buffer 1μl，T4连接酶1μl，反应条件为4℃水浴过夜，转化DH5ɑ感受态并挑取阳性克隆，得到重组质粒即为DNA-Launched感染性克隆阳性质粒，并将其命名为pIR-DHAV-1。
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| CN110283834A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-09-27 | 四川农业大学 | 一种3型鸭甲肝病毒突变基因isa-a117c及构建方法 |
| CN110295148A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-10-01 | 四川农业大学 | 一种快速构建3型鸭甲肝病毒反向遗传株的方法 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
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