CN117051046A - 一种慢病毒载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程领域,具体涉及一种慢病毒载体及其应用。本发明提供一种慢病毒载体,所述慢病毒载体的功能元件的3’UTR区域包括10‑30bp的随机序列,并基于慢病毒载体开发了一种细胞标记技术,可以在单细胞层面实现对细胞基因组DNA和转录组RNA的同时标记。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域,具体涉及一种慢病毒载体及其应用。
背景技术
单细胞测序技术,一类应用是通过对单个细胞的RNA表达谱进行测序分析,依据RNA表达谱对群体中的细胞进行归类,挖掘新的细胞亚群及细胞功能相关的分子特征和信号通路;另一类应用,是利用基因组上细胞固有的标签(如SNP)或者外源导入的标签(如CRISPR介导的随机基因组切割),将特殊的DNA序列和细胞的身份进行一一对应。通过单细胞DNA测序,在发育和分化过程中,对早期胚胎细胞或干细胞的子代细胞进行谱系追踪,精确描绘细胞的命运图谱。综上所述,如需结合单细胞测序的两种主要应用,即细胞亚群特征表达谱鉴定和细胞谱系追踪,则需要同时在单细胞水平获取单细胞的RNA和DNA信息。现阶段,单个细胞中同时提取RNA和DNA,操作技术难度高,通量低,难以进行大规模的应用。但是,一些特殊的细胞,例如T细胞,本身RNA表达谱中携带序列特异的序列(如Tcellreceptor,TCR序列)。因此,T细胞进行单细胞RNA表达谱测序的同时,根据TCR的序列信息,可以鉴定每个T细胞的身份和对T细胞群体进行谱系追踪和细胞命运分析。因此,借鉴T细胞和TCR,开发一种技术,在单细胞水平上,高通量地同时获取单细胞RNA表达谱和相应的细胞身份,将进一步推动单细胞测序技术在干细胞和发育生物学领域中的应用。但该技术只能应用于表达TCR受体的少量特殊细胞,无法实现更广泛的细胞类群谱系的追踪和分析。
在造血干细胞中,研究者通过多种技术手段,例如利用转座子技术(transposon)和人造DNA重组位点技术(Polylox),在单细胞水平上对造血系统的细胞谱系分化进行了跟踪和研究;然而,这些方法,同样是基于DNA水平上的标签技术,研究结果有力阐明了体内造血干细胞/祖细胞与成熟血细胞之间的谱系关系,但并没能揭示这些干细胞/祖细胞的分子特征图谱,或在分化过程中起到关键作用的基因。
现有技术中针对单细胞遗传标记的技术主要有以下两种:
方法一:在细胞基因组中利用Cre等重组酶制造随机DNA序列(Polylox)。在细胞中稳定整合一段包含loxP位点的人工序列,通过表达Cre酶,可以在每个细胞中产生随机组合的重组序列。由于每个细胞中序列的重组过程是随机发生的,因此这段序列可以作为细胞的“身份标识”。带有相同标识的细胞可以认为来源于共同的祖细胞。从而可以实现对细胞分化过程的追踪。
方法二:利用CRISPR/Cas9系统构建细胞标签序列。向稳定整合了一段包含10个gRNA切割位点的目标序列的细胞中,转入表达Cas9蛋白和gRNA的载体。随后Cas9蛋白会在gRNA介导下对目标序列进行切割,在细胞非同源重组的末端修复机制的作用下,目的序列切割位点附近会随机引入插入/缺失(Indel)突变,这些随机产生的序列各不相同,可以作为细胞的标签序列,用于细胞分化轨迹的追踪。
现有技术有如下缺点:
方法一:Polylox序列长度通常较长,接近2kb,现有二代测序技术很难在一个反应中将目的序列测通。序列组装过程容易引入突变,从而影响分析的准确性。
方法二:Cas9标记技术可能引入大片段的缺失和插入,并存在一定脱靶的风险,从而增加分析的难度。
且两种方法产生的标签序列的突变类型相对有限,只能标记有限的细胞类群,并且容易出现不同细胞被相同的标签序列标记的情况,从而对分析结果的准确性产生影响;两种方法产生的标签序列通常位于基因组上,无法实现对细胞转录组和标签序列的同时检测和追踪。
因此,亟需开发一种可以大通量实现细胞基因组DNA和转录组RNA的同时标记的技术。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此,本发明一方面提供一种慢病毒载体,所述慢病毒载体包括功能元件及骨架元件,所述功能元件的3’UTR区域包括10-30bp的随机序列。
本发明提供一种适用于细胞标记的慢病毒载体,利用慢病毒载体上插入的随机序列,及慢病毒载体能插入到被转染的细胞的基因组上并稳定遗传的特征,可以实现大通量细胞基因组DNA和转录组RNA的同时标记,进而构建分子特征图谱。
根据本发明的具体实施方式,所述功能元件进一步包括启动子、报告基因、转录后调控元件、polyA信号。
根据本发明的具体实施方式,所述功能元件的启动子包括选自EF1α、CAG、PGK、Ubc中的任意一种。需要说明的是,本领域已知的任意一种通用的强启动子均适用于本发明。
根据本发明的具体实施方式,所述功能元件的报告基因包括选自绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、蓝色荧光蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因、萤火虫荧光素酶基因中的任意一种。
根据本发明的具体实施方式,所述功能元件的转录后调控元件包括WPRE。
根据本发明的具体实施方式,所述随机序列的长度为15-30bp。
根据本发明的具体实施方式,所述随机序列的长度为15-25bp。
根据本发明的具体实施方式,所述随机序列的长度为20bp。
根据本发明的具体实施方式,随机序列的长度依据所要标记的细胞数的不同而不同,最好能使得随机序列多样性高于需标记的细胞一个数量级及以上即可。
根据本发明的具体实施方式,所述随机序列的插入位点为所述功能元件的转录后调控元件及polyA信号之间。
根据本发明的具体实施方式,所述骨架元件包括5’LTR、RRE、cPPT和3’LRT。
根据本发明的具体实施方式,所述骨架元件的5’LTR的U3区的启动子包括选自巨细胞病毒启动子、肉瘤病毒启动子中的任意一种。
根据本发明的具体实施方式,所述骨架元件的3’LRT的U3区替换为经多聚腺苷酸化修饰的终止子。
根据本发明的具体实施方式,所述骨架元件的3’LRT的终止子包括选自SV40、hGH、BGH、rbGlob中的任意一种。
本发明另一方面提供上述慢病毒载体在细胞标记中的应用。
本发明又一方面提供上述慢病毒载体在构建分子特征图谱中的应用,这里的分子特征图谱,既可以是分子表达图谱,也可以是遗传图谱或者细胞图谱。
本发明再一方面提供含有上述的慢病毒载体的试剂盒,所述试剂盒用于标记细胞。
本发明再又一方面提供一种细胞亚群命运追踪方法,所述方法包括:
(a)用上述的慢病毒载体和包装质粒共转染工程细胞,收集包装好的慢病毒颗粒;
(b)用所述慢病毒颗粒转染待追踪的细胞;
(c)分选转染成功的阳性细胞,并进行单细胞转录组测序;
(d)从测序数据中提取所述随机序列信息,并将所述随机序列信息与对应的细胞ID相关联;
(e)基于转录组数据分析,将细胞进行分类,并根据参考测序数据集确定每个细胞亚群的类型;
(f)结合所述随机序列信息,追踪所述细胞亚群的分化命运和路径。
根据本发明的具体实施方式,所述工程细胞包括选自293T细胞、293FT细胞、293SF细胞中的任意一种,这里对工程细胞并没有特殊要求,本领域已知的任何能用于慢病毒包装生产的工程化细胞系均适用于本发明。
根据本发明的具体实施方式,所述转录组数据分析包括聚类分析。
根据本发明的具体实施方式,所述聚类分析软件可以是本领域已知的任何能实现单细胞转录组聚类分析的软件,比如Seurat、Scanpy中的任意一种。
本发明开发了一种基于慢病毒载体的细胞标记技术,可以在单细胞层面实现对细胞基因组DNA和转录组RNA的同时标记。该方案的流程更加简化,理论上可以实现对任意类型细胞的标记,且不需要依赖特定的动物模型或稳转细胞系。本方案使用包含N个任意碱基的随机序列作为细胞的标签序列(Barcode),其中,N个任意碱基组成的随机序列的长度不小于15bp,优选为15-30bp,以N=20为例,本发明标记序列较短,可以方便的使用二代测序技术进行检测,并且序列的多样性理论上可达到420种,确保可以对足够数量的细胞进行标记,而不用担心出现重复序列的问题。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了本发明一个具体实施方式中慢病毒标签技术流程图;
图2显示了本发明一个具体实施方式中慢病毒标签技术开发和优化的示意图;
图3显示了本发明实施例1中慢病毒载体结构示意图和测序标签序列的结果比对,其中,图3中的A显示了构建好的重组慢病毒载体结构示意图,图3中的B显示了构建好的文库的标签序列测序的比对结果;
图4显示了本发明实施例4中慢病毒载体滴度和造血干细胞转导效率,其中,图4中的A显示了三种慢病毒载体的包装滴度,图4中的B转染后细胞中目的基因的VCN,图4中的C显示了细胞中检测到的GFP阳性率,图4中的D显示了目的基因的表达效率;图4中的E显示了荧光显微镜下转染后的细胞的发光程度;
图5显示了本发明实施例5中慢病毒载体转导造血干细胞阳性率和空载率,其中,图5中的A表示慢病毒载体转导造血干细胞的阳性率,图5中的B表示转导成功的阳性干细胞中慢病毒载体的空载率;
图6显示了本发明实施例5中慢病毒载体转导造血干细胞聚类和偏好性,其中,图6中的A为慢病毒载体转导造血干细胞后,依据造血干细胞的单细胞转录组数据的细胞亚群聚类分析图,图6中的B为能检测到标签序列的造血干细胞和未检测到标签序列的造血干细胞在聚类分析图中的分布情况,图6中的C为统计的标签序列在细胞亚群中占比的偏好性。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义,否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中,术语“包含”或“包括”为开放式表达,即包括本发明所指明的内容,但并不排除其他方面的内容。
在本文中,术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生,并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况,以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中,术语“慢病毒转染技术”,具有效率高,感染范围广等特点,作为基因载体,被广泛应用于包括造血干细胞在内的各类细胞转染。
在本文中,术语“Gibson组装”最早由Daniel Gibson博士和他的同事J.CraigVenter在2009年提出。Gibson组装非常适合用于拼接多个线性DNA片段,当然也适合将目的DNA插入载体中。
在本文中,术语“中心多嘌呤序列”(central polypurine tract,cPPT),使病毒载体不受细胞分裂控制,允许广泛细胞类型的有效转导。
在本文中,直接以p**开头的指的是质粒或者质粒文库,直接lenti-开头的指的是以对应质粒或质粒文库包装出来的慢病毒载体。
一种慢病毒载体
本发明提出一种慢病毒载体,所述慢病毒载体包括功能元件及骨架元件,所述功能元件的3’UTR区域包括10-30bp的随机序列。
慢病毒可将携带的外源基因片段插入基因组中稳定遗传并表达mRNA,如图1所示,本申请的发明人发现如果在慢病毒携带外源基因的3’UTR中加入一段随机序列做为标签,那么在慢病毒感染成功的干细胞及子代细胞中,在获取单细胞RNA表达谱的同时,借助这段特异的标签序列,可鉴定细胞的身份。
一种细胞亚群命运追踪方法
本发明提出一种细胞亚群命运追踪方法,所述方法包括:
(A)将前述的慢病毒载体和包装质粒共转染工程细胞,收集包装好的慢病毒颗粒;
(B)用所述慢病毒颗粒转染细胞;
(C)分选转染成功的阳性细胞,并进行单细胞转录组测序;
(D)从测序数据中提取所述随机序列信息,并将所述随机序列信息与对应的细胞ID相关联;
(E)基于转录组数据分析,将细胞进行分类,并根据参考测序数据集确定每个细胞亚群的类型;
(F)结合所述随机序列信息,追踪所述细胞亚群的分化命运和路径。
在本发明中,随机序列可做为追溯细胞的标签使用,故也称标签序列,标签序列的插入是采用慢病毒载体半随机整合方式,整合到宿主细胞基因组中,通过对插入位点分析,发明人发现外源基因主要整合在基因间区,恰好整合在基因编码区的个别小概率事件不会对整体的分化产生影响。此外通过单细胞分析,发现几乎在所有细胞类群中都能检测到标签序列,也从侧面证明载体整合不会对细胞分化产生严重影响。
在一些具体实施方案中,发明人通过以下策略确保不会出现重复标记的问题:1)调整转导病毒载体的和目的细胞比例,使细胞数目高于病毒数,尽可能确保每一个细胞仅会被一个病毒载体标记;2)提高病毒标签序列的多样性,即文库的容量远高于目的细胞数目,这样从概率上两个细胞被同一个病毒标记的可能性较低;3)在下游分析过程中也会对高频的标签序列进行过滤,避免产生干扰。
在一些具体实施方案中,可以通过提高标签序列多样性,使文库容量远高于待标记细胞数目,根据泊松分布原理,设定合适的转导密度,可以尽可能实现不同细胞的单一标记。
根据本发明的一个具体实施方案,本发明提出一种基于慢病毒载体的细胞标记技术,如图2所示,包含以下步骤:
步骤一:基于三代慢病毒穿梭质粒pGDH,对长端重复区域(LTR)之间的区域进行改造,包括替换启动子,加入绿色荧光蛋白,在基因的3端及polyA信号前加入NTag的标签序列。标签序列在体外合成(以N=20为例),变性褪火形成双链后,再通过Gibson与其他元件已构建好的慢病毒穿梭质粒进行组装,获得携带N20Tag的慢病毒穿梭质粒库;
步骤二:构建成功的慢病毒穿梭质粒库和辅助质粒共转染293T包装细胞,收集和浓缩含有慢病毒颗粒的培养基上清;
步骤三:慢病毒转导目的细胞;
步骤四:测定病毒转导效率,荧光分选转染阳性细胞,进行单细胞RNA测序;
步骤五:从单细胞测序数据中提取含N20Tag的标签序列信息,并将标签与对应细胞ID进行关联。通过基于转录组的聚类分析方法,将细胞进行分类,并根据参考数据集确定每个细胞亚群的类型。结合标签序列信息,追踪细胞的分化命运和路径,寻找细胞干性维持相关的关键通路和基因。
根据本发明的具体实施方案,所述标签序列的长度依据要标记的细胞数不同而不同,所述标签序列长度最好能使得标签多样性高于需标记的细胞一个数量级及以上,优选为不小于15bp,进一步优选为15-30bp,再进一步优选为20bp,在上述长度范围内,在保证标签多样性、扩大文库容量的同时,也保证了所述标签能在测序数据中提取出来。
本发明将用于标记细胞身份的慢病毒载体(Lentibar)通过基因元件的设计优化,提高了病毒的包装、转导和目的基因表达效率。可以实现对大规模目的细胞的标记,本发明提出的基于慢病毒载体的细胞标记技术,可以用于单细胞转录组的大规模测序应用,对测序平台没有专属性,理论上可以兼容所有测序平台。同时简化了标签文库的制备方案,本发明的质粒文库制备时间仅需要2-3天,并且不需要单独克隆的挑选和培养,极大的降低制备难度,缩短时间,降低生产成本。此外通过针对性设计的标签序列(barcode)插入位置,和优化的功能元件(18A,WPRE),可以实现在转录组建库过程中目的序列更高效率的捕获和检测,如本发明中Barcode设置在3’UTR端及polyA信号前,相较其他位置,更有利于目的序列的捕获、检测。
下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本公开,而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1Lentibar慢病毒载体构建
本实施例使用的慢病毒骨架载体为pLentiBGI。选择pLentiBGI载体多克隆位点的一对限制性内切酶将载体线性化,本实施例具体采用的是EcoRV和BamHI,然后根据线性化载体末端序列设计Gibson组装引物扩增报告基因元件(EF1α-GFP-WPRE-polyA),通过一步Gibson组装反应将片段插入慢病毒骨架载体。其中报告基因元件(EF1α-GFP-WPRE-polyA)是由北京六合华大基因科技有限公司进行全基因合成并构建到pMV载体上。以合成序列为模板,以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物扩增目的序列并回收,引物序列如表1所示。
取0.2pmol的报告基因元件(EF1α-GFP-WPRE-polyA)和0.05pmol的线性化的pLentiBGI载体混合并使用去离子水将总体积补至10μL,加入10μL的2×Gibsonassemblymastermix(NEB,E2611L)混匀。将组装反应液置于50℃条件下反应1小时,然后立即置于冰上冷却。使用Stbl3感受态细胞(购自Invitrogen,货号C737303)进行热激转化,在氨苄青霉素抗性的固体LB平板上37℃培养16小时,挑单克隆测序鉴定。得到重组慢病毒载体pLentibar-18A。
将得到的pLentibar-18A载.体使用内切酶KpnI和SwaI进行酶切线性化并回收。使用引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4扩增得到20Nbarcode片段,将两个片段通过Gibson组装即可得到包含随机20N标签序列的载体文库pLentibar-20N-18A,引物序列如表1所示。
表1
其中,N表示C、G、T、A中的任意一种碱基。
本例所用到的pLentiBGI病毒载体是在pCDH载体(购自SBI,货号CD513B-1)基础上构建,骨架元件包括:左侧慢病毒长末端重复序列(5’LTR)、慢病毒逆响应元件(RRE)、中心多嘌呤序列(cPPT)、多克隆位点和右侧慢病毒长末端重复序列(3’LTR)。其中,慢病毒的长末端重复序列(LTR),可进一步分为U3、R和U5三个区域,本例中pLentiBGI病毒载体的左侧长末端重复序列(5’LTR)的U3区被替换为巨细胞病毒启动子(CMV promoter),右侧慢病毒长末端重复序列(3’LTR)的U3区被进一步修饰和替换为SV40多聚腺苷酸信号(即SV40polyA),从而可以提高病毒载体的安全性。
构建好的重组慢病毒载体,如图3中的A所示,主要由以下元件组成:左侧慢病毒长末端重复序列(5’LTR)、慢病毒逆响应元件(RRE)、中心多嘌呤序列(cPPT)、EF1α启动子序列、绿色荧光蛋白报告基因编码序列(GFP)、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、随机标签序列(Barcode)、polyA信号(18A)和右侧慢病毒长末端重复序列(3’LTR)。其中,随机标签序列(Barcode)为一段合成的20个随机碱基的序列,可以作为细胞身份标识。构建好的文库一代测序结果如图3中的B所示,这里测序结果如果显示碱基混合不均一可能反映出引物合成过程中存在一定偏好性,从而导致标签序列的丰度分布存在差异,进而造成高丰度标签重复标记的问题,影响细胞分化路径追踪的准确性,图3中的B显示本发明扩增出的Barcode区域为四种碱基混合的杂峰状态,且每种碱基峰高基本一致,说明该文库可以代表随机序列的各种组合,且均一性良好。
实施例2慢病毒包装
实施例1中构建的重组慢病毒载体可以与慢病毒辅助包装质粒系统(psPAX2和pMD2.G)共转染293T细胞。具体操作如下:
将4×105数量的293T细胞接种到DMEM高糖完全培养基的10cm细胞培养皿中,37℃、5%CO2培养24h至细胞密度达到70-80%。其中,DMEM高糖完全培养基中包含10%FBS、1%双抗、1%GlutaMAX、1%MEMNEAA。
取12μg重组慢病毒载体,7.8μg psPAX2和4.2μg pMD2.G质粒使用Lipofectamine3000Transfection Reagent(Invitrogen,L3000001)转染293T细胞,培养24小时后收集细胞培养上清液,使用0.45μm膜过滤,向50mL滤液中加入全能核酸酶(Benzonase)5μL,37℃消化2h,将消化后的病毒上清液转移至超速离心管中,30000g离心2h,倒去上清,使用含人血清白蛋白的培养基500μL重悬病毒,按照50μL一管分装,置于-80℃长期保存。
将293T细胞消化吹打形成单细胞悬液,进行细胞计数后,使用DMEM(10%FBS)培养基稀释成1×105cells/mL悬液,并加入终浓度为6μg/mL的polybrene(HexadimethrineBromide),充分混匀按照1mL/孔加入12孔板中。取12μL病毒液按照五倍梯度做三个稀释度,c)按照10μL/孔加入到铺好细胞的12孔板中,每种稀释度做两个重复孔,阴性对照孔加入10μLDMEM培养基。将混合均匀的孔板置于37℃,5%CO2培养箱中培养48小时。
消化收集细胞使用基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN,DP304-03)提取细胞基因组,定量后将基因组浓度稀释到40ng/μL。标准品质粒稀释成1×109拷贝/mL的标准液。依次进行十倍稀释,制备108-104拷贝/mL的稀释液。按照10μL反应体系加入2pmol荧光探针和引物混合物和4μL样品比例制备荧光定量反应液,分装到96孔荧光定量PCR板中,使用StepOnePlusReal-TimePCRSystem探针法标准程序进行荧光定量PCR反应。根据标准曲线,计算各个样品ApoB和Gag基因的拷贝数,其中,Gag基因是病毒载体上携带的,用于检测整合到宿主细胞基因组中病毒载体的拷贝数。ApoB是人的内源基因,可以用于检测评估人源细胞的数量。
通过Gag拷贝数/ApoB拷贝数计算VCN,按照以下公式计算病毒滴度:
Titer(TU/mL)=(105(细胞数量)×VCN(平均每个细胞Gag基因拷贝数))/(病毒液体积(mL))
病毒滴度需达到1×108TU/mL以上。
其中,荧光探针和引物混合物包括检测ApoB基因的特异性引物和探针,以及检测Gag基因的特异性引物和探针。ApoB基因的特异性引物的正向引物为SEQ ID NO:5所示序列,反向引物为SEQ ID NO:6所示序列,探针为SEQ ID NO:7所示序列,探针的5’端具有VIC荧光基团修饰,3’端具有TAMRA淬灭基团修饰。Gag基因的特异性引物的正向引物为SEQ IDNO:8所示序列,反向引物为SEQ ID NO:9所示序列,探针为SEQ ID NO:10所示序列,探针的5’端具有FAM荧光基团修饰,3’端具有TAMRA淬灭基团修饰。
SEQ ID NO:5:5’-TGAAGGTGGAGGACATTCCTCTA-3’
SEQ ID NO:6:5’-CTGGAATTGCGATTTCTGGTAA-3’
SEQ ID NO:7:5’-CGAGAATCACCCTGCCAGACTTCCGT-3’
SEQ ID NO:8:5’-GGTTGTAGCTGTCCCAGTATTTGTC-3’
SEQ ID NO:9:5’-GGAGCTAGAACGATTCGCAGTTA-3’
SEQ ID NO:10:5’-ACAGCCTTCTGATGTTTCTAACAGGCCAGG-3’
实施例3动员外周血造血干细胞分离和培养
健康志愿者提前6天使用普乐沙福和非格司亭进行动员,使骨髓中的造血干细胞进入外周血循环系统,然后通过单采机收集外周血单核细胞。利用Miltenyi磁珠分离试剂盒富集单核细胞中CD34+的造血干细胞。具体操作步骤如下:
加入0.3mL冷DPBS重悬单核细胞沉淀,转移到15mL圆底离心管中;加入0.1mLFcRblockingreagent和0.1mLCD34microbeads,混匀;4℃孵育30min;加入5mLDPBS混匀,300g离心5min;弃上清,0.5mLDPBS重悬细胞;MS分离柱组装到磁力板上,加0.5mL冷DPBS浸润预处理;细胞悬浮液转移到MS分离柱上,柱子上液体流干时,加入0.5mL新的冷DPBS清洗;重复该步骤两次;取下磁力板上的MS分离柱,加入1mL冷DPBS,组装好分离柱配置的注射柄,轻轻推动注射柄,使分离柱上的目的细胞被冲洗到新的15mL离心管中;300g离心5min;收集CD34+造血干细胞。纯化的造血干细胞在添加了重组人细胞因子,促血小板生成素(TPO)、Fms相关酪氨酸激酶3配体(FltL)和干细胞因子(SCF)的SCGM培养基中培养24h,细胞密度控制在1-4×106细胞/mL。
实施例4慢病毒转染
将纯化的慢病毒载体在终浓度为8μg/mL鱼精蛋白(protamine)条件下与活化后的造血干细胞孵育24h,完成病毒转导;具体操作如下:
收集体外培养预激活24小时的CD34+细胞300g离心5min去除培养基,使用2mLDPBS重悬去除激活培养基,再次离心去除DPBS,使用CD34培养基重悬细胞,将细胞浓度调整为1×105/mL,加入鱼精蛋白(protamine)至终浓度8μg/mL,吸取1mL细胞混合液到24孔板中,按MOI10-20加入病毒液并混匀在37℃,5%CO2培养箱孵育培养24小时后,重悬收集细胞,离心去除含有病毒液的培养基,使用DPBS清洗细胞后,添加新鲜培养基继续培养。
收集病毒转导后第五天的造血干细胞,300g离心5min收集细胞,加入2mLDPBS清洗两次彻底去除培养基,加入10μL细胞裂解液,充分震荡重悬细胞,使用以下程序裂解细胞:55℃10min,95℃2min,释放细胞基因组DNA。使用实施例2中的探针法荧光定量PCR通过整合载体拷贝数除以内参基因拷贝数计算得到平均载体拷贝数(VCN)。
检测所包装慢病毒载体滴度,结果如图4所示,其中,Lentibar为未经改造的慢病毒,即不插入任何转录终止信号,利用慢病毒载体自身携带的3’LTR元件终止转录;Lentibar-18A为在载体3‘UTR区域增加了一段18A的序列,以提高磁珠捕获和目的基因表达效率;Lentibar-18A-bGH为在载体3‘UTR区域加入了一个bGH的polyA信号元件,确保报告基因转录会正常形成polyA尾。这里对Lentibar的改造主要是指针对GFP报告基因在的3’UTR区域进行改造,对应图3中的A中的18A元件位置。
如图4中的A所示,三种载体的包装滴度基本一致,分别为2.09E+08、2.85E+08和2.99E+08TU/mL,说明该病毒载体具有较高的包装效率。使用相同的感染复数(MOI=10)转导人造血干细胞,培养三天后分别检测转导后细胞的VCN(图4中的B)和GFP阳性率(图4中的C)。采用GFP%与VCN的比值评估目的基因表达效率,即单位VCN表达GFP的阳性率,这个比值越高,反应报告基因的表达效率越高,更有利于后续RNA-seq建库过程中被检测到。如图4中的D所示,Lentibar-18A载体的表达效率要显著高于另外两种载体,荧光显微镜结果如图4中的E所示,因此选择Lentibar-18A作为构建标签序列(barcode)文库所用载体。
实施例5目的细胞标签序列检测
为了检测目的细胞被标记情况,使用单细胞测序技术对转导后的造血干细胞进行分析。收集转导后体外培养第四天,第七天和第十二天细胞样品,室温300g离心5min,去除培养基,加入1mLPBS重悬混匀,进行细胞计数,取大约1×105细胞,室温300g离心5min,去除上清,使用40μL含0.04%BSA的PBS重悬细胞,参照华大智造DNBelabC4单细胞文库制备试剂盒的方案完成单细胞转录组建库并上机测序。通过数据过滤,常规单细胞转录组分析和Barcode序列提取,对细胞中标记的标签序列(Barcode)进行检测和分析。
基于转导后造血干细胞转录组数据,提取目标区域的barcode序列,作为细胞的身份标识,将能够检测到慢病毒载体序列的细胞定义为阳性细胞,如图5中的A所示,体外培养第4天(D4)和第7天(D7)的阳性率维持在75%左右,到第12天(D12)下降到42.59%;将包含慢病毒载体序列但无法提取到barcode序列的样品定义为空载体,如图5中的B所示,整体的空载率在1.5%左右,说明标签序列(barcode)的组装效率较为理想。三个时间点每组单细胞建库样品中能够检测到的唯一的标签序列(barcode)分别为:1418、2018和1413个,说明标签序列具有足够的多样性和丰度用于标记大量的目的细胞。
将单细胞转录组数据根据基因表达模式相关性,可以聚类为19个细胞亚群(图6中的A),每个亚群可以代表一种具有特定功能的细胞类型。如图6中的B,显示了标签序列(图中用“N20”表示)阳性和阴性的细胞在细胞聚类图上的分布情况,图6中的C统计了标签序列(barcode)在19个亚群中占比的偏好性情况,绝大多数细胞亚群的偏好性在1左右,说明标签序列在各个亚群中分布基本一致,没有表现出显著的偏好性,因此,本发明提出的方法是一种普适的无偏好的单细胞标记方法。
本发明开发了一种基于慢病毒载体的细胞标记技术,可以在单细胞层面实现对细胞基因组DNA和转录组RNA的同时标记。该方案的流程更加简化,理论上可以实现对任意类型细胞的标记,且不需要依赖特定的动物模型或稳转细胞系。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (9)
1.一种慢病毒载体,其特征在于,所述慢病毒载体包括功能元件及骨架元件,所述功能元件的3’UTR区域包括10-30bp的随机序列。
2.根据权利要求1所述的慢病毒载体,其特征在于,所述功能元件进一步包括启动子、报告基因、转录后调控元件、polyA信号;
任选地,所述启动子包括选自EF1α、CAG、PGK、Ubc中的任意一种;
任选地,所述报告基因包括选自绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、蓝色荧光蛋白基因、β-半乳糖苷酶基因、萤火虫荧光素酶基因中的任意一种;
任选地,所述转录后调控元件包括WPRE。
3.根据权利要求2所述的慢病毒载体,其特征在于,所述随机序列的长度为15-30bp;
任选地,所述随机序列的长度为15-25bp;
任选地,所述随机序列的长度为20bp;
任选地,所述随机序列的插入位点为所述转录后调控元件及所述polyA信号之间。
4.根据权利要求1所述的慢病毒载体,其特征在于,所述骨架元件包括5’LTR、RRE、cPPT和3’LRT;
任选地,所述5’LTR的U3区的启动子包括选自巨细胞病毒启动子、肉瘤病毒启动子中的任意一种;
任选地,所述3’LRT的U3区替换为经多聚腺苷酸化修饰的终止子;
任选地,所述终止子包括选自SV40、hGH、BGH、rbGlob中的任意一种。
5.权利要求1-4中任一项所述的慢病毒载体在细胞标记中的应用。
6.权利要求1-4中任一项所述的慢病毒载体在构建分子特征图谱中的应用。
7.含有权利要求1-4中任一项所述的慢病毒载体的试剂盒,所述试剂盒用于标记细胞。
8.一种细胞亚群命运追踪方法,其特征在于,所述方法包括:
(a)用权利要求1-4中任一项所述的慢病毒载体和包装质粒共转染工程细胞,收集包装好的慢病毒颗粒;
(b)用所述慢病毒颗粒转染待追踪的细胞;
(c)分选转染成功的细胞,并进行单细胞转录组测序;
(d)从测序数据中提取所述随机序列的信息,并将所述随机序列信息与对应的细胞ID相关联;
(e)基于转录组数据分析,将所述细胞进行分类,并根据参考测序数据集确定每个细胞亚群的类型;
(f)结合所述随机序列信息,追踪所述细胞亚群的分化命运和路径。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述工程细胞包括选自293T细胞、293FT细胞、293SF细胞中的任意一种;
任选地,所述转录组数据分析包括聚类分析。
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CN115298309A (zh) * | 2020-03-20 | 2022-11-04 | 基因泰克公司 | 跟踪单细胞进化的系统和方法 |
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