CN116064672A - 利用ires基因提升aav包装效率的方法及其功能基因 - Google Patents

利用ires基因提升aav包装效率的方法及其功能基因 Download PDF

Info

Publication number
CN116064672A
CN116064672A CN202211123883.6A CN202211123883A CN116064672A CN 116064672 A CN116064672 A CN 116064672A CN 202211123883 A CN202211123883 A CN 202211123883A CN 116064672 A CN116064672 A CN 116064672A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aav
gene
seq
ires
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211123883.6A
Other languages
English (en)
Inventor
请求不公布姓名
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sipeng Biotechnology Suzhou Co ltd
Original Assignee
Sipeng Biotechnology Suzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sipeng Biotechnology Suzhou Co ltd filed Critical Sipeng Biotechnology Suzhou Co ltd
Priority to CN202211123883.6A priority Critical patent/CN116064672A/zh
Publication of CN116064672A publication Critical patent/CN116064672A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2770/32052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及利用IRES基因提升AAV包装效率的方法及其功能基因。该方法包括：将功能基因序列构建入预定表达载体；构建所得表达载体转染入目标细胞经培养表达获得AAV。该功能基因序列来自或类似IRES基因，且其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6之一所示序列或其互补序列。本发明通过利用来自或类似IRES基因的功能基因序列，能有效调整Cap与Rep表达比例；将该功能基因序列应用于表达载体，能够有效提高AAV的生产效率。

Description

利用IRES基因提升AAV包装效率的方法及其功能基因
技术领域
本发明涉及一种利用IRES基因提升AAV包装效率的方法及其功能基因，属于生物医药技术领域。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是腺病毒研究过程中发现的附属病毒系，主要利用腺病毒的部分基因组元件作为组成部分；它与腺病毒的差异在于它属于单股DNA病毒，且无法在无腺病毒基因的健康细胞进行增生。通过去除或拆分病毒本身的基因元件确保载体应用具有安全保障，目前AAV载体已经用于开发基因治疗药物。此外，AAV具备多种血清型以适配不同治疗标的，在应用方面较具弹性；而与反转录病毒相比，能在基因稳定性层面对病患提供较好的安全保障。
随着细胞及基因治疗的发展，目前已经有数项AAV病毒类载体的应用进入临床后期并获取药证。然而，因病患所需的病毒载体效价极高，所以AAV病毒类载体的工业化生产效率仍是必须解决的重要课题，必须提高生产效率才能有效降低需求者的负担。
目前常规的AAV载体包装的方式之一是利用HEK293细胞系搭配三个核酸载体；其中，HEK293因其在建立过程中使用了腺病毒的基因组，故留在HEK293细胞中的E1元件可提供AAV载体包装的能力。同时，三个核酸载体分别参与载体包装的部分功能，包括(1)腺病毒的部分基因元件(Helper质粒)、(2)病毒复制及包装壳蛋白(Rep/Cap质粒)、及(3)含目标基因的病毒包裹的辨识序列(ITRs-GOI质粒)。本发明申请人主要针对病毒复制及包装壳蛋白的核酸载体(Rep/Cap质粒)进行优化。
原始的Rep/Cap质粒主要利用其基因组上的启动子(P5、P19、P40)以序列性表达Rep及Cap蛋白。Rep/Cap质粒主要利用P5及P19启动子表达Rep蛋白，而Rep蛋白主要功能为进行病毒基因组的复制，进而提供病毒的核酸元件及协助核酸元件整合入病毒载体的壳内。Cap蛋白的表达则由P40启动子调控，Cap的信使RNA可转译成VP1、VP2及VP3三个主要次级蛋白形成病毒载体的主要外部结构蛋白。Rep/Cap质粒的元件架构图见图1。
一般的Rep/Cap质粒主要通过基因组内的启动子(P5、P19、P40)程序性表达Rep及Cap蛋白进而调控病毒生产，可确保Rep及Cap的共同表达。但有研究指出，在此表达机制下，会于病毒载体后期累积高量的Rep蛋白，而Rep蛋白具有干扰细胞生长的特性，从而影响病毒载体的生产。
为了减低Rep蛋白对宿主细胞的影响，构建一个表达载体并利用表达强度不同的启动子去调控Rep及Cap基因的表达比例可作为载体优化的策略。虽然哺乳类细胞可应用的启动子包含CMV、Ef1a、SV40及PGK等，但这些元件无法确保Rep及Cap基因同时表达。而IRES及2A肽则是目前表达载体常用元件，并可于RNA转译阶段或蛋白后修饰阶段确保上下游基因共表达。
内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site：IRES)是一种发现于病毒的基因元件，而后研究者基于其特性将其利用于真核细胞的表达载体，并广泛应用于实验和制药的真核细胞蛋白表达。一般来说，信使RNA(mRNA)主要凭借其5’端加帽修饰让核糖体进行结合进而开始基因的转译，而在mRNA的5’端添加IRES元件可以让mRNA不需凭借mRNA的5’端加帽修饰，即能让核糖体进行结合进而开始基因的转译。该功能不同于mRNA的拼接，而是让多个基因共用一个启动子。因该功能主要发生于转译阶段，因此它也能同时确保IRES上下游基因的同时转录。本发明申请人以IRES为探讨方向对Rep/Cap质粒进行优化。
经检索发现，申请号CN201980069110.4、申请公布号CN112888426A的发明专利申请公开了一种用于重组腺相关病毒载体rAAV产生的质粒系统，并在其说明书中提到了内部核糖体进入位点(IRES)。申请号CN202080022021.7、申请公布号CN113631225A的发明专利申请公开了用于生产AAV颗粒的方法和系统，并在其说明书中提到使用IRES序列确保IRES之前和之后的基因的共表达，尽管IRES之后的序列可比IRES序列之前的序列以更低的水平转录和翻译。然而，上述专利文件中并没有提到如何才能利用IRES对Rep/Cap质粒进行更深度的优化，从而使AAV的生产效率尽可能达到最高。
发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种利用IRES基因提升AAV包装效率的方法，该方法能够有效提高AAV的生产效率。同时提供应用于该方法的功能基因及其用途。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种利用IRES基因提升AAV包装效率的方法，其特征是，包括以下步骤：将功能基因序列构建入预定表达载体；构建所得表达载体转染入目标细胞经培养表达获得AAV；所述功能基因序列来自或类似IRES基因，且其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6之一所示序列或其互补序列。
发明人在实践研究中利用IRES的不同转录起始位点对Rep/Cap质粒进行更深度的优化，最终发现上述功能基因序列能有效调整Cap与Rep表达比例，将该功能基因序列应用于表达载体，能够有效提高AAV的生产效率。
优选地，所述功能基因序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6之一所示序列或其互补序列。
采用以上优选方案，可进一步优化功能基因的具体序列。
优选地，构建所得表达载体中含有腺相关病毒的病毒复制蛋白基因AAV-Rep、以及腺相关病毒的病毒包装壳蛋白基因AAV-Cap；腺相关病毒的病毒包装壳蛋白基因AAV-Cap位于功能基因序列的上游，腺相关病毒的病毒复制蛋白基因AAV-Rep位于功能基因序列的下游；腺相关病毒的病毒包装壳蛋白基因AAV-Cap如SEQ ID NO.2所示；腺相关病毒的病毒复制蛋白基因AAV-Rep如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述预定表达载体为用于表达腺相关病毒的病毒复制蛋白及病毒包装壳蛋白的表达载体；所述功能基因序列来源于或类似于EMCV的IRES基因。
采用以上优选方案，可进一步优化表达载体的具体结构，及其中功能基因序列的具体位置。
优选地，所述目标细胞中还含有AAV-ITR-EGFP表达载体及AAV-Helper帮助载体；所述目标细胞包括但不限于HEK293细胞。
采用以上优选方案，可进一步优化目标细胞的具体细节特征。
本发明还提供：
一种提升AAV包装效率的功能基因，其特征是，所述功能基因序列来自或类似IRES基因，且其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6之一所示序列或其互补序列。
优选地，所述功能基因序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6之一所示序列或其互补序列。
本发明还提供：
一种含有前文所述功能基因的表达载体。
优选地，所述表达载体采用PSC-CMV载体。
本发明还提供：
前文所述功能基因或前文所述表达载体用于制备AAV或用于制备药物或用于制药生产的用途。
与现有技术相比，本发明通过利用来自或类似IRES基因的功能基因序列，能有效调整Cap与Rep表达比例；将该功能基因序列应用于表达载体，能够有效提高AAV的生产效率。
附图说明
图1为本发明背景技术提到的Rep/Cap质粒的元件架构图。
图2为本发明实施例1中构建表达载体的结构。
图3为本发明实施例1中IRES0、IRES1、IRES2、IRES3的不同结尾示意图。
图4至图7分别为本发明实施例1构建所得各表达载体的图谱。
图8为本发明实施例2的AAV-ITR-EGFP表达载体图谱。
图9为本发明实施例2的AAV-Helper帮助载体图谱。
图10为本发明实施例2的AAV生产能力评价结果图，其中，A图为采用第一种思鹏293培养基的结果，B图为采用第二种思鹏293培养基的结果。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1
按图2所示结构来构建表达载体，该表达载体中含有腺相关病毒的病毒复制及包装壳蛋白的基因；其中，IRES来源于EMCV(脑心肌炎病毒)，即序列1，如SEQ ID NO.1所示；Cap来源于AAV，如SEQ ID NO.2所示；Rep来源于AAV，如SEQ ID NO.3所示。
序列1：SEQ ID NO.1：
cgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctcccctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgcttttcatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaaccatg
AAV-Cap：SEQ ID NO.2：
cagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggtatggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacactctctctgaaggaataagacagtggtggaagctcaaacctggcccaccaccaccaaagcccgcagagcggcataaggacgacagcaggggtcttgtgcttcctgggtacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggagagccggtcaacgaggcagacgccgcggccctcgagcacgacaaagcctacgaccggcagctcgacagcggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgcggagtttcaggagcgccttaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcggacgagcagtcttccaggcgaaaaagagggttcttgaacctctgggcctggttgaggaacctgttaagacggctccgggaaaaaagaggccggtagagcactctcctgtggagccagactcctcctcgggaaccggaaaggcgggccagcagcctgcaagaaaaagattgaattttggtcagactggagacgcagactcagtacctgacccccagcctctcggacagccaccagcagccccctctggtctgggaactaatacgatggctacaggcagtggcgcaccaatggcagacaataacgagggcgccgacggagtgggtaattcctcgggaaattggcattgcgattccacatggatgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaaacaaatttccagccaatcaggagcctcgaacgacaatcactactttggctacagcaccccttgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcaaagactcatcaacaacaactggggattccgacccaagagactcaacttcaagctctttaacattcaagtcaaagaggtcacgcagaatgacggtacgacgacgattgccaataaccttaccagcacggttcaggtgtttactgactcggagtaccagctcccgtacgtcctcggctcggcgcatcaaggatgcctcccgccgttcccagcagacgtcttcatggtgccacagtatggatacctcaccctgaacaacgggagtcaggcagtaggacgctcttcattttactgcctggagtactttccttctcagatgctgcgtaccggaaacaactttaccttcagctacacttttgaggacgttcctttccacagcagctacgctcacagccagagtctggaccgtctcatgaatcctctcatcgaccagtacctgtattacttgagcagaacaaacactccaagtggaaccaccacgcagtcaaggcttcagttttctcaggccggagcgagtgacattcgggaccagtctaggaactggcttcctggaccctgttaccgccagcagcgagtatcaaagacatctgcggataacaacaacagtgaatactcgtggactggagctaccaagtaccacctcaatggcagagactctctggtgaatccgggcccggccatggcaagccacaaggacgatgaagaaaagttttttcctcagagcggggttctcatctttgggaagcaaggctcagagaaaacaaatgtggacattgaaaaggtcatgattacagacgaagaggaaatcaggacaaccaatcccgtggctacggagcagtatggttctgtatctaccaacctccagagaggcaacagacaagcagctaccgcagatgtcaacacacaaggcgttcttccaggcatggtctggcaggacagagatgtgtaccttcaggggcccatctgggcaaagattccacacacggacggacattttcacccctctcccctcatgggtggattcggacttaaacaccctcctccacagattctcatcaagaacaccccggtacctgcgaatccttcgaccaccttcagtgcggcaaagtttgcttccttcatcacacagtactccacgggacaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaaacgctggaatcccgaaattcagtacacttccaactacaacaagtctgttaatgtggactttactgtggacactaatggcgtgtattcagagcctcgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa
AAV-Rep：SEQ ID NO.3：
atgccggggttttacgagattgtgattaaggtccccagcgaccttgacgagcatctgcccggcatttctgacagctttgtgaactgggtggccgagaaggaatgggagttgccgccagattctgacatggatctgaatctgattgagcaggcacccctgaccgtggccgagaagctgcagcgcgactttctgacggaatggcgccgtgtgagtaaggccccggaggcccttttctttgtgcaatttgagaagggagagagctacttccacatgcacgtgctcgtggaaaccaccggggtgaaatccatggttttgggacgtttcctgagtcagattcgcgaaaaactgattcagagaatttaccgcgggatcgagccgactttgccaaactggttcgcggtcacaaagaccagaaatggcgccggaggcgggaacaaggtggtggatgagtgctacatccccaattacttgctccccaaaacccagcctgagctccagtgggcgtggactaatatggaacagtatttaagcgcctgtttgaatctcacggagcgtaaacggttggtggcgcagcatctgacgcacgtgtcgcagacgcaggagcagaacaaagagaatcagaatcccaattctgatgcgccggtgatcagatcaaaaacttcagccaggtacatggagctggtcgggtggctcgtggacaaggggattacctcggagaagcagtggatccaggaggaccaggcctcatacatctccttcaatgcggcctccaactcgcggtcccaaatcaaggctgccttggacaatgcgggaaagattatgagcctgactaaaaccgcccccgactacctggtgggccagcagcccgtggaggacatttccagcaatcggatttataaaattttggaactaaacgggtacgatccccaatatgcggcttccgtctttctgggatgggccacgaaaaagttcggcaagaggaacaccatctggctgtttgggcctgcaactaccgggaagaccaacatcgcggaggccatagcccacactgtgcccttctacgggtgcgtaaactggaccaatgagaactttcccttcaacgactgtgtcgacaagatggtgatctggtgggaggaggggaagatgaccgccaaggtcgtggagtcggccaaagccattctcggaggaagcaaggtgcgcgtggaccagaaatgcaagtcctcggcccagatagacccgactcccgtgatcgtcacctccaacaccaacatgtgcgccgtgattgacgggaactcaacgaccttcgaacaccagcagccgttgcaagaccggatgttcaaatttgaactcacccgccgtctggatcatgactttgggaaggtcaccaagcaggaagtcaaagactttttccggtgggcaaaggatcacgtggttgaggtggagcatgaattctacgtcaaaaagggtggagccaagaaaagacccgcccccagtgacgcagatataagtgagcccaaacgggtgcgcgagtcagttgcgcagccatcgacgtcagacgcggaagcttcgatcaactacgcagacaggtaccaaaacaaatgttctcgtcacgtgggcatgaatctgatgctgtttccctgcagacaatgcgagagaatgaatcagaattcaaatatctgcttcactcacggacagaaagactgtttagagtgctttcccgtgtcagaatctcaacccgtttctgtcgtcaaaaaggcgtatcagaaactgtgctacattcatcatatcatgggaaaggtgccagacgcttgcactgcctgcgatctggtcaatgtggatttggatgactgcatctttgaacaatag
发明人在实践研究中探讨IRES的不同转录起始位点对Rep/Cap质粒的Cap与Rep表达比例的影响，具体而言，采用图3所示的具有不同AT(U)G起始位点的序列1(即结尾各不相同的IRES0、IRES1、IRES2、IRES3，其中，IRES1基于原本序列做出改动)，结合AAV-Cap(SEQID NO.2)、AAV-Rep(SEQ ID NO.3)，并采用PSC-CMV载体分别构建表达载体，所得各载体图谱如图4至图7所示，各图中的“EMCV-IRES”即指相应的IRES0、IRES1、IRES2、IRES3。
IRES0：SEQ ID NO.4：
cgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctcccctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgcttttcatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatg
IRES1：SEQ ID NO.5：
cgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctcccctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgcttttcatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataataccatg
IRES2：SEQ ID NO.6：
cgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctcccctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgcttttcatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatg
IRES3序列为SEQ ID NO.1。
实施例2
本实施例将实施例1构建的各表达载体分别搭配AAV-ITR-EGFP表达载体(现有技术载体，图谱见图8)及AAV-Helper帮助载体(现有技术载体，图谱见图9)，于HEK293细胞中进行AAV生产能力评价。具体实验过程见本实施例的最后部分。
实验数据如图10的A图和B图所示，这些结果表明，采用IRES0、IRES1、IRES2、IRES3均可实现较好的表达效果，其中比较突出的是IRES-1、IRES-2，也即采用IRES-1或IRES-2调控腺相关病毒的病毒复制及包装壳蛋白基因的表达可以更有效地提高AAV生产能力。
本实施例涉及的具体实验过程如下：
(一)AAV表达测试
HEK293细胞(VPC2.0细胞株)利用两种市售293培养基with 4mM L-Glutamine培养扩增。注：由于各市售293培养基的氨基酸、有机盐及无机盐配比存在差异，所以采用两种市售293培养基验证IRES0-IRES3的功能是否会因培养基组分差异而导致偏差，最终结果显示IRES0-IRES3的功能不受培养基组分差异影响，保持高度一致性。
将AAV载体(包含：实施例1的各表达载体、AAV-ITR-EGFP表达载体、AAV-Helper帮助载体)利用PolyPlus转染试剂转染到HEK293细胞株。于转染后3天将细胞收集并利用酸性液裂解细胞回收AAV病毒载体。为检测AAV病毒载体的量，利用DNase去除宿主细胞残留DNA后用碱性裂解液释放AAV基因组核酸。
利用Q-PCR的方式检测释放的AAV基因组核酸拷贝数进而回推AAV病毒载体数量，进而通过比较来评价提高AAV生产能力的程度。
(二)思鹏生物293培养基AAV转染指引：FectoVIR-AAV
1.培养基及试剂：
(1)思鹏293培养基
(2)FectoVIR-AAV Transfection Reagent(PolyPlus,Ref#120-101)
(3)核酸载体：260/280比值于1.8～2.0。浓度大于1μg/μL。
(4)稀释液：与(1)相同的思鹏293培养基
2.细胞：HEK293细胞株
①于转染前18～24小时以2～2.5×106cells/mL活细胞密度进行接种细胞。
②转染当天调整细胞密度为3.0×106cells/mL活细胞密度进行转染。
3转染：
(1)准备Reagent-DNA混合物
①均匀混匀转染试剂并加入聚丙烯管(管1)中待用。
②于聚丙烯管(管2)中准备最终培养体积10％的稀释液。
③将DNA加入稀释液(管2)中并混匀(上下摇晃或震荡)。
④将DNA稀释液(管2)加入有转染试剂的管(管1)中并即时混匀(上下摇晃或漩涡震荡5秒)。
⑤将Reagent-DNA混合物于室温静置10～15分钟。
(2)转染
①将孵育完成的Reagent-DNA混合物均匀加入细胞。
(3)培养
①于转染18～22小时后添加3g/L glucose。
②于转染3天后进行病毒收获。
注：转染条件优化后，转染3天后细胞活率需高于70％。
转染条件建议：
Figure BDA0003847535400000111
注：以上表格为每mL转染体系需求。
载体比例建议：
表达载体 摩尔比 载体大小(kbp) μg DNA/mL培养基
AAV-Rep/Cap 2 Exp:9 0.95
AAV-Helper 0.5 Exp:11 0.29
AAV-ITR-EGFP 1 Exp:5 0.26
注：以上表格为按总量1.5μg DNA计算。
(三)AAV准备流程
细胞在酸性液中裂解，离心从碎片中清除，用HEPES缓冲液中和pH。
试剂：
(1)AAV释放溶液(110mM柠檬酸缓冲液pH4.2)：
55mM柠檬酸，55mM柠檬酸钠，800mM氯化钠
Figure BDA0003847535400000121
(2)AAV中和溶液：2M HEPES；pH8.0
化学物质 分子量 终浓度 g/L 10mL
Hepes 238.3 2M 476.6 4.766g
注：利用2mL ddH2O溶解Hepes。然后，使用2～3mL氢氧化钠(10N)将pH调整为8.0。最后，通过ddH2O将体积定容至10mL。
操作程序：
1.取0.5mL细胞并利用离心的方式去除培养基，750～800×g，4℃离心15min。
2.丢弃上清液。
3.轻拍后松开细胞颗粒，加入1mL PBS清洗细胞。
注：如果细胞颗粒没有充分悬浮，提取效率可能会降低。
4.通过涡旋混合分散细胞并利用离心的方式去除PBS，1000×g，4℃离心15min。
5.通过轻拍松开细胞颗粒，并加入适当体积(0.5mL)的AAV释放溶液。
注：确认完全清除PBS；PBS的残留会影响柠檬酸缓冲液的酸性进而影响病毒颗粒的提取效率。
6.通过涡旋15秒重新悬浮细胞，并在室温下静置10min。
7.涡旋15s并利用离心的方式去除细胞碎片，14000×g，4℃离心15min。
8.将上清液收集到一个新的试管中。
注：添加酚红便于进一步滴定的观察。
9.测量上清液的体积，并利用连续混合的方式加入～1/2体积的AAV中和溶液(0.1mL)。最终的pH应该在8.0左右。
注：如果加入苯酚红，溶液应从黄色(酸pH)变为粉红色(pH～8.0)颜色；混合物可以储存在-80℃。于下一步实验时利用37℃的水浴中快速解冻。
(四)AAV滴定qPCR流程
试剂：
(1)DNaseI：DNaseI，无RNase(1U/μl)；反应缓冲液(10×)。
(2)2×衣壳裂解缓冲液：
0.5M氢氧化钠，0.2MEDTA
化学物质 分子量 终浓度 g/L 10mL
氢氧化钠 40.00 0.5 M 20 0.2g
四钠盐：水合物 380.17 0.2M 76.034 0.76g
(3)0.5M三盐酸盐(pH8.0)
化学物质 分子量 终浓度 L/L 20mL
1MTris-HCl，pH8.0 N/A 0.5M 0.5 10mL
(4)
Figure BDA0003847535400000131
预混式前TaqTMII(TliRNaseHPlus)
(5)引物：
①ITR-Fwd：正向ITR序列引物(5‘-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3’)
②ITR-Rev：反向ITR序列引物(5‘-CGGCCTCAGTGAGCGA-3’)
③EGFP-F498：正向EGFP序列引物(5‘-CAAGATCCGCCACAACATCG-3’)
④EGFP-R617：反向EGFP序列引物(5‘-GACTGGGTGCTCAGGTAGTG-3’)
注：虽然使用引物对扩增ITR序列可能是一种测定不同AAV基因组的通用方法，但它可能高估了制剂的真实效度。建议对感兴趣的区域使用特定的引物(例如，短发夹盒)。
操作程序：
1.用DNaseI消化去除病毒外的DNA。
a.混合2μL病毒悬液，2μL 10×DNaseI反应缓冲液，2μL DNaseI，和14μL无核酸酶水。
b.37℃孵育20min。
2.通过碱性裂解释放病毒DNA。
a.加入20μL的2×衣壳裂解缓冲液，混合均匀。
b.在95℃下孵育10min。
c.加入10μL 0.5M Tris-HCl(pH8.0)停止裂解反应。
d.用无核酸酶的水制备稀释50倍的裂解反应。
3.用qPCR方法定量病毒DNA。
a.使用含有ITR序列的质粒，制备5倍的系列稀释液，范围从4ng/μL(～1×109dsDNA分子/μL).
(1)为了确定每ng的dsDNA分子数，使用SnapGeneViewer软件(Windows和Mac平台免费)打开质粒序列。从“工具”下拉菜单中选择“显示DNA计算”。弹出窗口将提供分子量和ng向质粒拷贝的转换。由于病毒基因组由ssDNA组成，因此对一个质粒DNA(dsDNA)分子的检测等于两个AAV载体基因组(vg)拷贝。
(2)在最终体积为10μL时，混合1.5μL的模板(标准稀释或100倍样品稀释)、0.5μL10μM的ITR-Fwd、0.5μl 10μM的ITR-Rev和5μL的
Figure BDA0003847535400000141
预混料ExTaqTMII。
(3)在以下条件下对LC480II进行PCR反应：
1st特征：
95℃30s(斜坡率4.4℃/s)：1个循环。
2ndPCR(分析方式：定量)：
95℃5s(斜坡率4.4℃/s)，60℃30s(斜坡率2.2℃/s，采集模式：单次)：40个循环。
3rd熔化(分析方式：熔化曲线)：
95℃5s(斜坡率4.4℃/s)，60℃1m(斜坡率0.11℃/s，采集模式：连续，采集方式：5/℃)：1个周期。
4th冷却
50℃30s(斜坡率2.2℃/s)：1个循环。
为了获得样品的最终滴度(以vg/μL表示)，将5000乘以标准曲线中插值定量的病毒基因组拷贝值。
综合以上各实施例，根据AAV相关文献及病毒载体生产机制，推测Cap蛋白的表达需求量高于Rep蛋白，因此本发明利用IRES连接Cap及Rep以确保转录的共伴效应，并相对减少Rep的表达量。在此基础上，发明人通过实验探讨并验证供下游基因使用的IRES元件中起始ATG(AUG)不同对AAV生产效率的影响，进而获得适当的下游基因转译起始点，以达到AAV的尽可能高的生产效益。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用IRES基因提升AAV包装效率的方法，其特征是，包括以下步骤：将功能基因序列构建入预定表达载体；构建所得表达载体转染入目标细胞经培养表达获得AAV；所述功能基因序列来自或类似IRES基因，且其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6之一所示序列或其互补序列。
2. 根据权利要求1所述的一种利用IRES基因提升AAV包装效率的方法，其特征是，所述功能基因序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6之一所示序列或其互补序列。
3. 根据权利要求2所述的一种利用IRES基因提升AAV包装效率的方法，其特征是，构建所得表达载体中含有腺相关病毒的病毒复制蛋白基因AAV-Rep、以及腺相关病毒的病毒包装壳蛋白基因AAV-Cap；腺相关病毒的病毒包装壳蛋白基因AAV-Cap位于功能基因序列的上游，腺相关病毒的病毒复制蛋白基因AAV-Rep位于功能基因序列的下游；腺相关病毒的病毒包装壳蛋白基因AAV-Cap如SEQ ID NO.2所示；腺相关病毒的病毒复制蛋白基因AAV-Rep如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的一种利用IRES基因提升AAV包装效率的方法，其特征是，所述预定表达载体为用于表达腺相关病毒的病毒复制蛋白及病毒包装壳蛋白的表达载体；所述功能基因序列来源于或类似于EMCV的IRES基因。
5.根据权利要求3所述的一种利用IRES基因提升AAV包装效率的方法，其特征是，所述目标细胞中还含有AAV-ITR-EGFP表达载体及AAV-Helper帮助载体；所述目标细胞包括但不限于HEK293细胞。
6. 一种提升AAV包装效率的功能基因，其特征是，所述功能基因序列来自或类似IRES基因，且其序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6之一所示序列或其互补序列。
7. 根据权利要求6所述的一种提升AAV包装效率的功能基因，其特征是，所述功能基因序列为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6之一所示序列或其互补序列。
8.一种含有权利要求6或7所述功能基因的表达载体。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征是，所述表达载体采用PSC-CMV载体。
10.权利要求6或7所述功能基因或权利要求8或9所述表达载体用于制备AAV或用于制备药物或用于制药生产的用途。
CN202211123883.6A 2022-09-15 2022-09-15 利用ires基因提升aav包装效率的方法及其功能基因 Pending CN116064672A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211123883.6A CN116064672A (zh) 2022-09-15 2022-09-15 利用ires基因提升aav包装效率的方法及其功能基因

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211123883.6A CN116064672A (zh) 2022-09-15 2022-09-15 利用ires基因提升aav包装效率的方法及其功能基因

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116064672A true CN116064672A (zh) 2023-05-05

Family

ID=86168878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211123883.6A Pending CN116064672A (zh) 2022-09-15 2022-09-15 利用ires基因提升aav包装效率的方法及其功能基因

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116064672A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116064624A (zh) * 2022-09-15 2023-05-05 思鹏生物科技(苏州)有限公司 利用rpl基因促进载体稳定表达的方法及其功能基因
CN116064663A (zh) * 2022-09-15 2023-05-05 思鹏生物科技(苏州)有限公司 利用rps基因促进载体稳定表达的方法及其功能基因

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107406855A (zh) * 2015-02-27 2017-11-28 诺华股份有限公司 黄病毒复制子
CN110785495A (zh) * 2017-04-18 2020-02-11 葛兰素史克知识产权开发有限公司 腺相关病毒载体的生产方法
CN111511922A (zh) * 2018-01-19 2020-08-07 牛津遗传学有限公司 用于生产aav颗粒的载体
CN112888426A (zh) * 2018-10-25 2021-06-01 百特奥尔塔公司 Aav三质粒系统
CN113631225A (zh) * 2019-01-18 2021-11-09 沃雅戈治疗公司 用于生产aav颗粒的方法和系统
CN116064624A (zh) * 2022-09-15 2023-05-05 思鹏生物科技(苏州)有限公司 利用rpl基因促进载体稳定表达的方法及其功能基因

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107406855A (zh) * 2015-02-27 2017-11-28 诺华股份有限公司 黄病毒复制子
CN110785495A (zh) * 2017-04-18 2020-02-11 葛兰素史克知识产权开发有限公司 腺相关病毒载体的生产方法
CN111511922A (zh) * 2018-01-19 2020-08-07 牛津遗传学有限公司 用于生产aav颗粒的载体
CN112888426A (zh) * 2018-10-25 2021-06-01 百特奥尔塔公司 Aav三质粒系统
CN113631225A (zh) * 2019-01-18 2021-11-09 沃雅戈治疗公司 用于生产aav颗粒的方法和系统
CN116064624A (zh) * 2022-09-15 2023-05-05 思鹏生物科技(苏州)有限公司 利用rpl基因促进载体稳定表达的方法及其功能基因

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
梁春敏, 钟翠平, 郑宁, 吴欣, 孙瑞霞, 刘银坤, 叶胜龙: "小鼠次级淋巴组织趋化因子成熟肽基因/腺相关病毒重组载体的构建", 解剖学报, no. 02, 6 April 2004 (2004-04-06), pages 147 - 151 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116064624A (zh) * 2022-09-15 2023-05-05 思鹏生物科技(苏州)有限公司 利用rpl基因促进载体稳定表达的方法及其功能基因
CN116064663A (zh) * 2022-09-15 2023-05-05 思鹏生物科技(苏州)有限公司 利用rps基因促进载体稳定表达的方法及其功能基因

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116064672A (zh) 利用ires基因提升aav包装效率的方法及其功能基因
EP3494997B1 (en) Inducible dna binding proteins and genome perturbation tools and applications thereof
JP7189943B2 (ja) 細胞の遺伝子修飾のための非組込みｄｎａベクター
JP2023081975A (ja) アデノ随伴ウイルスベクターの産生方法
US11473071B2 (en) Method for treating muscular dystrophy by targeting utrophin gene
EP4232583A1 (en) Systems, methods, and compositions for site-specific genetic engineering using programmable addition via site-specific targeting elements (paste)
US11492614B2 (en) Stem loop RNA mediated transport of mitochondria genome editing molecules (endonucleases) into the mitochondria
Chalker Transformation and strain engineering of Tetrahymena
CA3162499A1 (en) Recombinase compositions and methods of use
Almazán et al. Engineering infectious cDNAs of coronavirus as bacterial artificial chromosomes
WO2002057447A2 (en) Methods and reagents for amplification and manipulation of vector and target nucleic acid sequences
US20220396790A1 (en) High-throughput screening platform for engineering next-generation gene therapy vectors
JP2022537410A (ja) ファージ複製起点を用いたベクターの産生
Zhang et al. Novel vector construction based on alternative adenovirus types via homologous recombination
CN114514319A (zh) 用于生物制造的合成基因元件
JP2023011736A (ja) 核酸封入ａａｖ中空粒子
US20220243243A1 (en) Expression of products from nucleic acid concatemers
Giannakopoulos et al. The functional role of S/MARs in episomal vectors as defined by the stress-induced destabilization profile of the vector sequences
CN116555342A (zh) 一种经改造的pT7TS质粒及其应用
US20220380750A1 (en) Method for the production of raav and method for the in vitro generation of genetically engineered, linear, single-stranded nucleic acid fragments containing itr sequences flanking a gene of interest
Hagedorn et al. Handling S/MAR Vectors
EP4372092A1 (en) Dna origami encoding for gene expression and cotransfection
AU2018279569B2 (en) System for DNA editing and application thereof
Murphy et al. Polymerase Chain Reaction: Applications in Gene and Cell Therapy Studies
WO2024064673A2 (en) Aav evolution at single-cell resolution using split-seq

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination