CN114514319A - 用于生物制造的合成基因元件 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了用于提高腺相关病毒(AAV)的产量的重组构建体、细胞和装置。本发明还描述了使用所述构建体和所述细胞产生重组AAV的方法。

Description

用于生物制造的合成基因元件
本申请要求以下美国临时申请的权益：2019年7月23日提交的美国临时申请62/877,508；2019年7月23日提交的美国临时申请62/877,516；2019年7月23日提交的美国临时申请62/877,524；2019年7月23日提交的美国临时申请62/877,532；2019年7月23日提交的美国临时申请62/877,540；2019年7月23日提交的美国临时申请62/877,551；2019年7月23日提交的美国临时申请62/877,561；以及2019年7月23日提交的美国临时申请62/877,577，这些美国临时申请全文以引用方式并入本文。
以电子方式提交的参考序列表
本申请包含序列表，该序列表作为ASCII格式的序列表经由EFS-Web以电子方式递交，文件名为“14620-192-228_SEQ_LISTING”并且创建日期为2020年7月16日，并且大小为152,403字节。经由EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
背景技术
腺相关病毒(AAV)具有线性单链DNA(ssDNA)基因组，其在末端具有两个末端反向重复(ITR)。这些ITR位于两个病毒基因(rep(复制)和cap(衣壳))的侧翼，这两个病毒基因分别编码非结构蛋白和结构蛋白。rep基因通过使用两种启动子和选择性剪接来编码四种调控蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。更具体地讲，Rep78和Rep68由P5启动子转录，并且Rep 40和Rep52由P19启动子转录(该P19启动子嵌入在Rep78和Rep68阅读框内)。P5和P19启动子由腺病毒E1A基因激活并且在诸如使用腺病毒E1基因转化的HEK293之类的细胞中有活性。这些Rep蛋白参与AAV基因组复制。cap基因通过选择性剪接和翻译起始而产生三种衣壳蛋白VP1(毒粒蛋白1)、VP2和VP3，这三种衣壳蛋白装配成病毒的近球形蛋白外壳。AAV病毒不编码聚合酶，因此依靠细胞聚合酶进行基因组复制。
如果AAV rep和cap基因可在哺乳动物细胞中稳定整合或维持并且随后被诱导而在高密度培养中产生AAV，则有可能在哺乳动物细胞中大规模生产AAV。然而，Rep蛋白的表达可能对宿主细胞有细胞毒性或细胞抑制，从而使得难以在表达rep基因的宿主(诸如表达腺病毒E1基因的那些，诸如HEK293细胞)中形成稳定细胞系。由于AAV使用重叠阅读框编码四种Rep蛋白而这四种Rep蛋白因使用两种启动子和选择性剪接而产生，因此使用诱导型启动子控制rep基因表达并不是直截了当的。
这四种Rep蛋白的细胞毒性或细胞抑制性质妨碍了形成可使用天然rep/cap启动子产生高滴度AAV的稳定细胞系(Clark等人，(1995)Hum.Gene Ther.6:1329-1341；Chadeuf等人，(2000)J.Gene med.2:260-268)。若干团队已尝试以重组方式调控Rep表达。Yang将P5启动子替换为小鼠金属硫蛋白启动子。虽然HEK293中的稳定克隆展现出金属可诱导的rep78表达，但仅检测到低水平的rep50和rep42表达(由内部P19启动子驱动)并且细胞的生长速率大幅下降(Yang等人，(1994)J.Virol 68:4847-4856)。Ogasawara将P5启动子替换为包含侧翼有loxP的填充片段的遍在启动子，该遍在启动子可由Cre重组酶激活。rep52、rep40和cap基因都不会在被腺病毒-Cre感染的稳定克隆中诱导，这表明组成性rep52/rep40表达也对细胞有害(Ogasawara等人，(1999)J.Gen.Virol.80:2477–2480)。
Xiao和同事描述了另一种调控rep表达的方法(Qiao等人，(2002)J.Virol.76:13015-13027；Yuan等人，(2011)Hum.Gene Ther.22:613-624)。Xiao将人工内含子插入到rep基因中所有四种Rep蛋白共用的编码区中并且将包含多聚(A)序列的侧翼有loxP的终止盒单独或与puro嘌呤霉素抗性基因联合插入到该内含子中。所有Rep蛋白的表达都受到抑制，从而允许生成HEK293细胞中的稳定细胞系。(通过腺病毒感染)向细胞中递送Cre重组酶会通过重组loxP位点来切除终止盒，从而允许转录全长前体mRNA。然后通过RNA剪接精确地去除剩余的内含子序列，从而恢复所有四种Rep蛋白的编码序列，并且因此引发由整合的侧翼有ITR的转基因产生AAV。然而，由于Cre重组酶识别两个相同loxP位点，这些loxP位点在重组之后仍然相同，因此可能再进行重组，这是因为Cre既催化连接反应，又催化切除反应。
AAV rep基因仅在也表达腺病毒E1(早期区1)基因的细胞中表达。已在不表达E1基因的宿主中构建了若干稳定rep/cap细胞系，包括HeLa(Clark等人，(1995)Hum.Gen.Therap.6:1329-1341；Yang等人，(1994)J.Virol.68:4847-4856；Gao等人，(1998)Hu,Gen.Ther.9:2353-2362)、A549(Gao等人，(2002)Mol Ther.5:644-659)以及Vero(Beal等人，(2007)，第10届美国基因治疗学会年会(10th Annual Meeting of American Societyof Gene Therapy)，华盛顿州西雅图(Seattle，WA)，2007年5月30日至6月3日)。这些细胞系的最大缺点是需要E1完整的(并且通常有复制能力的)腺病毒来产生AAV，这可能以AAV病毒制剂的污染物的形式造成增加的安全风险。
已描述了AAV生产系统，其使用若干不同病毒来提供辅助功能并且将重组转基因和/或AAV基因递送到人类细胞，包括疱疹病毒(Thomas等人，(2009)Hum Gene Ther.20:861–70；Clement等人，(2009)Hum Gene Ther.20:796–806)、牛痘病毒(Wang等人，(2017)Mol.Ther.Methods Clin Devel.7:146-155)以及腺病毒(Fisher等人，(1996)Hum geneTher.7:2079-2087；Gao等人，(1998)Hum Gene Ther.2353-2362。Liu等人，(1999)GeneTher 6:293-299)。这些方法需要产生若干不同病毒(以及在一些情况下重组宿主细胞系)。还已使用杆状病毒在昆虫细胞中产生AAV(Mietzsch等人，(2014)Hum Gene Ther.25:212–22；Aslanidi等人，(2009)Proc Natl Acad Sci USA.106:5059–5064；Cecchini等人，(2011)Hum Gene Ther.22:1021–1030)。在昆虫细胞和人类细胞中产生的AAV是否在功能上等效仍然是未决的问题。
需要用重组构建体和细胞提高AAV的产量。
发明内容
在一个方面，本文提供了一种非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含经修饰的腺相关病毒(AAV)rep基因，该经修饰的AAV rep基因具有编码四种Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV rep基因以及插入到这四种Rep蛋白所共用的rep基因的编码序列中的人工内含子，其中人工内含子包含插入在5’剪接位点下游和人工内含子的分支位点上游的终止盒，并且终止盒按5’至3’顺序包含：(a)包含具有与SEQ ID NO:7的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attP位点，优选地，具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(b)剪接受体；(c)终止子；以及(d)包含具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attB位点，优选地，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点。
在一个实施方案中，剪接受体包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
在一个实施方案中，终止子包含多聚腺苷酸化信号。在一个实施方案中，终止子还包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
在一个实施方案中，终止盒包含编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ IDNO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒。
在一个实施方案中，人工内含子按5’至3’顺序包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列、终止盒和SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
在一个实施方案中，AAV rep基因包含AAV1至AAV8之一或它们的杂合体的rep基因。在一个实施方案中，AAV rep基因包含具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号190至2202的人AAV2的rep基因。在一个实施方案中，人工内含子插入在GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号996至1905之间。在一个实施方案中，人工内含子插入在GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号1052、1061、1712、1906、1022、1112、1475、1514、1700、1742、1784或1340、优选地核苷酸编号1052的紧接下游。
在一个方面，本文提供了一种非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含经修饰的AAV rep基因，该经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：(a)具有SEQ IDNO:55的核苷酸序列的AAV rep基因的5’部分；(b)人工内含子，该人工内含子按5’至3’顺序包含：(i)具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的5’内含子片段；(ii)终止盒，该终止盒按5’至3’顺序包含：(1)具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(2)具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的剪接受体；(3)具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；(4)具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的终止子；以及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及(iii)具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的3’内含子片段；以及(c)具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列的AAV rep基因的3’部分。
在一个方面，本文提供了一种非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含经修饰的AAV rep基因，该经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：(a)具有SEQ IDNO:73的核苷酸序列的AAV rep基因的5’部分；(b)人工内含子，该人工内含子按5’至3’顺序包含：(i)具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的5’内含子片段；(ii)终止盒，该终止盒按5’至3’顺序包含：(1)具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(2)具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的剪接受体；(3)具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；(4)具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的终止子；以及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及(iii)具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列的3’内含子片段；以及(c)具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列的AAV rep基因的3’部分。在一个实施方案中，终止盒包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
在一个实施方案中，非天然存在的核酸分子还包含编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的AAV cap基因。在一个实施方案中，AAV cap基因包含AAV1至AAV9及AAVDJ之一或它们的杂合体的cap基因。在一个实施方案中，AAV cap基因包含具有GenBank登录号AY530579.1的核苷酸序列的人AAV9的cap基因。在一个实施方案中，AAV cap基因还包含多聚腺苷酸化信号，优选地具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号4411至4466的AAV2的多聚腺苷酸化信号，以及增强子，优选地具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号190至313的AAV2 rep P5启动子，其中多聚腺苷酸化信号和增强子均在cap基因的编码序列下游。在一个实施方案中，非天然存在的核酸分子还包含AAV cap基因下游的侧翼有一对AAV末端反向重复(ITR)的转基因。
在一个实施方案中，非天然存在的核酸分子更进一步包含经修饰的AAV rep基因上游的第一绝缘子以及任选地侧翼有ITR的转基因下游的第二绝缘子，优选地，第一绝缘子和第二绝缘子独立地选自：(a)具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列的人抗阻遏子元件40；(b)具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列的小鼠抗阻遏子元件40；(c)具有GenBank登录号AY190749.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件04；(d)具有GenBank登录号AY190750.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件06；(e)具有GenBank登录号AY190751.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件07；(f)具有GenBank登录号AY190752.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件12；(g)具有GenBank登录号AY190753.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件13；(h)具有GenBank登录号AY190754.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件35；(i)具有GenBank登录号AY190755.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件36；(j)具有GenBank登录号AY190757.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件52；(k)具有GenBank登录号AY190758.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件53；以及(l)来自珠蛋白基因座的具有AY040835.1的核苷酸序列的两个或更多个拷贝的鸡HS4绝缘子，更优选地，第一绝缘子和第二绝缘子分别具有SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核苷酸序列。在一个实施方案中，非天然存在的核酸分子包含在经修饰的AAV rep基因上游的第一绝缘子，并且还包含分别在转基因上游和下游的第一间隔序列和第二间隔序列，其中第一间隔序列和第二间隔序列独立地选自：(a)SEQ ID NO:67的核苷酸序列；以及(b)SEQ ID NO:68的核苷酸序列。在一个实施方案中，ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；优选地，所述启动子具有SEQ IDNO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23。
在一个方面，本文提供了一种非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子按5’至3’顺序包含：(A)第一绝缘子，优选地第一绝缘子具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列；(B)经修饰的AAV rep基因，该经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：(i)AAV rep基因的5’部分，优选地AAV rep基因的5’部分具有SEQ ID NO:55的核苷酸序列；(ii)人工内含子，该人工内含子按5’至3’顺序包含：(a)5’内含子片段，优选地5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；(b)终止盒，该终止盒按5’至3’顺序包含：(1)具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(2)剪接受体，优选地剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；(3)编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；(4)终止子，优选地终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及(c)3’内含子片段，优选地3’内含子片段具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列；(iii)AAV rep基因的3’部分，优选地AAV rep基因的3’部分具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列；(C)AAV cap基因，优选地AAV cap基因包含SEQ ID NO:57的核苷酸序列；(D)侧翼有一对AAV ITR的转基因，优选地，AAV ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，并且转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23；以及(E)第二绝缘子，优选地第二绝缘子具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子按5’至3’顺序包含：(A)第一绝缘子，优选地第一绝缘子具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列；(B)经修饰的AAV rep基因，该经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：(i)AAV rep基因的5’部分，优选地AAV rep基因的5’部分具有SEQ ID NO:73的核苷酸序列；(ii)人工内含子，该人工内含子按5’至3’顺序包含：(a)5’内含子片段，优选地5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；(b)终止盒，该终止盒按5’至3’顺序包含：(1)具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(2)剪接受体，优选地剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；(3)编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；(4)终止子，优选地终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及(c)3’内含子片段，优选地3’内含子片段具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列；(iii)AAV rep基因的3’部分，优选地AAV rep基因的3’部分具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列；(C)AAV cap基因；(D)转基因，该转基因侧翼有：(1)一对AAV ITR，优选地，AAV ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，并且转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ IDNO:23；以及(2)一对间隔序列，优选地，所述间隔序列具有SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种载体，该载体包含上述非天然存在的核酸分子；优选地，所述载体是质粒；更优选地，所述质粒包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种载体，该载体包含上述非天然存在的核酸分子；优选地，所述载体是质粒；更优选地，所述质粒包含SEQ ID NO:70的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种制备上述非天然存在的核酸分子的方法。在具体实施方案中，本文提供了一种制备包含上述非天然存在的核酸分子的载体的方法；优选地，所述载体是质粒；更优选地，所述质粒包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列。在另一个实施方案中，本文提供了一种制备包含上述非天然存在的核酸分子的载体的方法；优选地，所述载体是质粒；更优选地，所述质粒包含SEQ ID NO:70的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种细胞，该细胞包含非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含经修饰的腺相关病毒(AAV)rep基因，该经修饰的AAV rep基因具有编码四种Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV rep基因以及插入到这四种Rep蛋白所共用的rep基因的编码序列中的人工内含子，其中人工内含子包含插入在5’剪接位点下游和人工内含子的分支位点上游的终止盒，并且终止盒按5’至3’顺序包含：(a)包含具有与SEQID NO:7的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attP位点，优选地，具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(b)剪接受体；(c)终止子；以及(d)包含具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attB位点，优选地，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点。
在一个实施方案中，剪接受体包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
在一个实施方案中，终止子包含多聚腺苷酸化信号。在一个实施方案中，终止子还包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
在一个实施方案中，终止盒包含编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ IDNO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒。
在一个实施方案中，人工内含子按5’至3’顺序包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列、终止盒和SEQ ID NO:15的核苷酸序列。在另一个实施方案中，人工内含子按5’至3’顺序包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列、终止盒和SEQ ID NO:66的核苷酸序列。
在一个实施方案中，AAV rep基因包含AAV1至AAV8之一或它们的杂合体的rep基因。在一个实施方案中，AAV rep基因包含具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号190至2202的人AAV2的rep基因。在一个实施方案中，人工内含子插入在GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号996至1905之间。在一个实施方案中，人工内含子插入在GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号1052、1061、1712、1906、1022、1112、1475、1514、1700、1742、1784或1340、优选地核苷酸编号1052的紧接下游。
在一个方面，本文提供了一种细胞，该细胞包含非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含经修饰的AAV rep基因，该经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：(a)具有SEQ ID NO:55的核苷酸序列的AAV rep基因的5’部分；(b)人工内含子，该人工内含子按5’至3’顺序包含：(i)具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的5’内含子片段；(ii)终止盒，该终止盒按5’至3’顺序包含：(1)具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(2)具有SEQID NO:17的核苷酸序列的剪接受体；(3)具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；(4)具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的终止子；以及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及(iii)具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的3’内含子片段；以及(c)具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列的AAV rep基因的3’部分。
在一个方面，本文提供了一种细胞，该细胞包含非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含经修饰的AAV rep基因，该经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：(a)具有SEQ ID NO:73的核苷酸序列的AAV rep基因的5’部分；(b)人工内含子，该人工内含子按5’至3’顺序包含：(i)具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的5’内含子片段；(ii)终止盒，该终止盒按5’至3’顺序包含：(1)具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(2)具有SEQID NO:17的核苷酸序列的剪接受体；(3)具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；(4)具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的终止子；以及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及(iii)具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列的3’内含子片段；以及(c)具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列的AAV rep基因的3’部分。
在一个实施方案中，终止盒包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
在一个实施方案中，上述细胞还包含编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的AAV cap基因。在一个实施方案中，AAV cap基因包含AAV1至AAV9及AAVDJ之一或它们的杂合体的cap基因。在一个实施方案中，AAV cap基因包含具有GenBank登录号AY530579.1的核苷酸序列的人AAV9的cap基因。在一个实施方案中，AAV cap基因包含AAV9的杂合体的cap基因。
在一个实施方案中，AAV cap基因还包含多聚腺苷酸化信号，优选地具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号4411至4466的AAV2的多聚腺苷酸化信号，以及增强子，优选地具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号190至313的AAV2 rep P5启动子，其中多聚腺苷酸化信号和增强子均在cap基因的编码序列下游。
在一个实施方案中，包含cap基因的细胞还包含AAV cap基因下游的侧翼有一对AAV末端反向重复(ITR)的转基因。在一个实施方案中，该细胞还包含经修饰的AAV rep基因上游的第一绝缘子以及任选地侧翼有ITR的转基因下游的第二绝缘子，优选地，第一绝缘子和第二绝缘子独立地选自：(a)具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列的人抗阻遏子元件40；(b)具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列的小鼠抗阻遏子元件40；(c)具有GenBank登录号AY190749.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件04；(d)具有GenBank登录号AY190750.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件06；(e)具有GenBank登录号AY190751.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件07；(f)具有GenBank登录号AY190752.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件12；(g)具有GenBank登录号AY190753.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件13；(h)具有GenBank登录号AY190754.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件35；(i)具有GenBank登录号AY190755.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件36；(j)具有GenBank登录号AY190757.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件52；(k)具有GenBank登录号AY190758.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件53；以及(l)来自珠蛋白基因座的具有AY040835.1的核苷酸序列的两个或更多个拷贝的鸡HS4绝缘子，更优选地，第一绝缘子和第二绝缘子分别具有SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核苷酸序列。在一个实施方案中，该细胞包含在经修饰的AAV rep基因上游的第一绝缘子，并且还包含分别在转基因上游和下游的第一间隔序列和第二间隔序列，其中第一间隔序列和第二间隔序列独立地选自：(a)SEQ ID NO:67的核苷酸序列；以及(b)SEQ ID NO:68的核苷酸序列。
在一个实施方案中，ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ IDNO:23。
在一个方面，本文提供了一种细胞，该细胞包含非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子按5’至3’顺序包含：(A)第一绝缘子，优选地第一绝缘子具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列；(B)经修饰的AAV rep基因，该经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：(i)AAV rep基因的5’部分，优选地AAV rep基因的5’部分具有SEQ ID NO:55的核苷酸序列；(ii)人工内含子，该人工内含子按5’至3’顺序包含：(a)5’内含子片段，优选地5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；(b)终止盒，该终止盒按5’至3’顺序包含：(1)具有SEQID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(2)剪接受体，优选地剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；(3)编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；(4)终止子，优选地终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及(c)3’内含子片段，优选地3’内含子片段具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列；(iii)AAV rep基因的3’部分，优选地AAV rep基因的3’部分具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列；(C)AAV cap基因，优选地AAV cap基因包含SEQ ID NO:57的核苷酸序列；(D)侧翼有一对AAV ITR的转基因，优选地，AAV ITR具有SEQID NO:20的核苷酸序列，并且转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23；以及(E)第二绝缘子，优选地第二绝缘子具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种细胞，该细胞包含非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子按5’至3’顺序包含：(A)第一绝缘子，优选地第一绝缘子具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列；(B)经修饰的AAV rep基因，该经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：(i)AAV rep基因的5’部分，优选地AAV rep基因的5’部分具有SEQ ID NO:73的核苷酸序列；(ii)人工内含子，该人工内含子按5’至3’顺序包含：(a)5’内含子片段，优选地5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；(b)终止盒，该终止盒按5’至3’顺序包含：(1)具有SEQID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(2)剪接受体，优选地剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；(3)编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；(4)终止子，优选地终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及(5)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及(c)3’内含子片段，优选地3’内含子片段具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列；(iii)AAV rep基因的3’部分，优选地AAV rep基因的3’部分具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列；(C)AAV cap基因；以及(D)侧翼有一对AAVITR的转基因，优选地，AAV ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，并且转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQID NO:23；以及(ii)一对间隔序列，优选地，所述间隔序列具有SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68的核苷酸序列。
在一个实施方案中，非天然存在的核酸分子为游离型，具有SEQ ID NO:12的核苷酸序列。在另一个实施方案中，非天然存在的核酸分子为游离型，具有SEQ ID NO:70的核苷酸序列。
在一个实施方案中，该细胞还包含编码重组酶的核酸分子，该重组酶具有与SEQID NO:2的氨基酸序列的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列；优选地，所述核酸包含具有与SEQ ID NO:3的核苷酸序列的至少85％、至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列；更优选地，所述细胞包含编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的所述重组酶的重组ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5(Ad5)病毒。
在一个实施方案中，该细胞还包含腺病毒E1A和E1B基因，优选地该细胞是911细胞、pTG6559细胞、GH329细胞、N52.E6细胞、HeLa-E1细胞、UR细胞、VLI-293细胞、HEK293细胞或PER.C6细胞。
在一个方面，本文提供了一种产生包含转基因的重组AAV的方法，该方法包括：(A)获得第一宿主细胞，该第一宿主细胞包含：(i)经修饰的AAV rep基因，该经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：(a)AAV rep基因的5’部分，优选地AAV rep基因具有SEQ ID NO:55的核苷酸序列；(b)人工内含子，该人工内含子按5’至3’顺序包含：(1)5’内含子片段，优选地5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；(2)终止盒，该终止盒按5’至3’顺序包含：(aa)具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(bb)剪接受体，优选地剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；(cc)编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；(dd)终止子，优选地终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及(ee)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及(3)3’内含子片段，优选地3’内含子片段具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列；(c)AAV rep基因的3’部分，优选地AAV rep基因的3’部分具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列；(ii)AAV cap基因，优选地AAV cap基因包含SEQ ID NO:57的核苷酸序列；以及(iii)侧翼有一对AAV ITR的转基因，优选地，ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23；(B)使用包含编码重组酶的重组酶基因的重组腺病毒感染所述第一宿主细胞以获得进一步包含所述重组酶基因的第二宿主细胞，所述重组酶具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；(C)使所述第二宿主细胞在一定条件下生长，在所述条件下产生包含所述转基因的所述重组AAV；以及(D)任选地收集重组AAV。
在一个方面，本文提供了一种产生包含转基因的重组AAV的方法，该方法包括：(A)获得第一宿主细胞，该第一宿主细胞包含：(i)经修饰的AAV rep基因，该经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：(a)AAV rep基因的5’部分，优选地AAV rep基因具有SEQ ID NO:73的核苷酸序列；(b)人工内含子，该人工内含子按5’至3’顺序包含：(1)5’内含子片段，优选地5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；(2)终止盒，该终止盒按5’至3’顺序包含：(aa)具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；(bb)剪接受体，优选地剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；(cc)编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；(dd)终止子，优选地终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及(ee)具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及(3)3’内含子片段，优选地3’内含子片段具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列；(c)AAV rep基因的3’部分，优选地AAV rep基因的3’部分具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列；(ii)AAV cap基因；以及(iii)转基因，该转基因侧翼有：(a)一对AAV ITR，优选地，ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23；以及(b)一对间隔序列，优选地，所述间隔序列具有SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68的核苷酸序列；(B)使用包含编码重组酶的重组酶基因的重组腺病毒感染所述第一宿主细胞以获得进一步包含所述重组酶基因的第二宿主细胞，所述重组酶具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性；(C)使所述第二宿主细胞在一定条件下生长，在所述条件下产生包含所述转基因的所述重组AAV；以及(D)任选地收集重组AAV。
在一个实施方案中，第一宿主细胞还包含经修饰的AAV rep基因上游的第一绝缘子以及任选地侧翼有ITR的转基因下游的第二绝缘子，优选地，第一绝缘子和第二绝缘子独立地选自：(a)具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列的人抗阻遏子元件40；(b)具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列的小鼠抗阻遏子元件40；(c)具有GenBank登录号AY190749.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件04；(d)具有GenBank登录号AY190750.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件06；(e)具有GenBank登录号AY190751.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件07；(f)具有GenBank登录号AY190752.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件12；(g)具有GenBank登录号AY190753.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件13；(h)具有GenBank登录号AY190754.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件35；(i)具有GenBank登录号AY190755.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件36；(j)具有GenBank登录号AY190757.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件52；(k)具有GenBank登录号AY190758.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件53；以及(l)来自珠蛋白基因座的具有AY040835.1的核苷酸序列的两个或更多个拷贝的鸡HS4绝缘子，更优选地，第一绝缘子和第二绝缘子分别具有SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
在一个实施方案中，第一宿主细胞包含在经修饰的AAV rep基因上游的第一绝缘子，并且还包含分别在转基因上游和下游的第一间隔序列和第二间隔序列，其中第一间隔序列和第二间隔序列独立地选自：(a)SEQ ID NO:67的核苷酸序列；以及(b)SEQ ID NO:68的核苷酸序列。
在一个实施方案中，通过向细胞中引入一个或多个核酸分子来获得第一宿主细胞，该一个或多个核酸分子包含经修饰的AAV rep基因、AAV cap基因、侧翼有ITR的转基因、第一绝缘子和第二绝缘子。在一个实施方案中，通过向细胞中引入核酸分子来获得第一宿主细胞，该核酸分子按5’至3’顺序包含第一绝缘子、经修饰的AAV rep基因、AAV cap基因、侧翼有ITR的转基因、第一绝缘子和第二绝缘子，优选地，包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列的质粒。
在一个实施方案中，通过向细胞中引入一个或多个核酸分子来获得第一宿主细胞，该一个或多个核酸分子包含经修饰的AAV rep基因、AAV cap基因、侧翼有ITR的转基因、第一绝缘子、第一间隔序列和第二间隔序列。在一个实施方案中，通过向细胞中引入一个或多个核酸分子来获得第一宿主细胞，该一个或多个核酸分子包含经修饰的AAV rep基因、AAV cap基因、侧翼有ITR的转基因、第一绝缘子、第一间隔序列和第二间隔序列，优选地，包含SEQ ID NO:70的核苷酸序列的质粒。
在一个实施方案中，重组腺病毒是包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的重组ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5(Ad5)病毒。
在一个实施方案中，宿主细胞包含腺病毒E1A和E1B基因，优选地宿主细胞是911细胞、pTG6559细胞、GH329细胞、N52.E6细胞、HeLa-E1细胞、UR细胞、VLI-293细胞、HEK293细胞或PER.C6细胞。
在一个实施方案中，用于使第二宿主细胞生长的条件包括用2-氨基嘌呤培养第二细胞。在一个实施方案中，2-氨基嘌呤浓度小于约1.25mM。在一个实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约1μM至约1.25mM。在一个实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约10μM至约1.25mM。在一个实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约100μM至约1.25mM。在一个实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约1.25mM。
在一个实施方案中，在用重组腺病毒感染第一宿主细胞后约24小时开始用2-氨基嘌呤培养第二细胞。
在一个方面，本文提供了一种组合物，该组合物包含如上所述具有编码重组酶的核酸分子的细胞以及2-氨基嘌呤。在一个实施方案中，2-氨基嘌呤浓度小于约1.25mM。在一个实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约1μM至约1.25mM。在一个实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约10μM至约1.25mM。在一个实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约100μM至约1.25mM。在一个实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约1.25mM。
在一个方面，本文提供了一种非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含编码具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列。在一个实施方案中，该非天然存在的核酸分子包含具有与SEQ IDNO:3的核苷酸序列的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种载体，该载体包含非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含编码具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种载体，该载体包含非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含编码具有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列。
在一个实施方案中，该载体还包含可操作地连接至编码丝氨酸重组酶的核苷酸序列的启动子，优选地巨细胞病毒(CMV)启动子。
在一个实施方案中，该载体还包含可操作地连接至编码丝氨酸重组酶的核苷酸序列的多聚腺苷酸化信号，诸如猿猴病毒40(SV40)多聚腺苷酸化信号。
在一个实施方案中，该载体是DNA质粒。在一个实施方案中，该载体是重组腺病毒载体。
在一个实施方案中，该载体是重组ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5(Ad5)病毒，该病毒包含在CMV启动子的控制下的编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列，其中该核苷酸序列进一步可操作地连接至SV40多聚腺苷酸化信号(NC_001669.1，nt2550至2774)。
在一个方面，本文提供了一种细胞，该细胞包含非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含编码具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85％诸如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列。在一个实施方案中，该细胞包含具有与SEQ ID NO:3的核苷酸序列的至少85％诸如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在一个方面，本文提供了一种细胞，该细胞包含载体，该载体包含非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含编码具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85％诸如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列。在另一个方面，本文提供了一种细胞，该细胞包含载体，该载体包含非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含编码具有与SEQ ID NO:3的氨基酸序列的至少85％诸如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列。
在一个实施方案中，该细胞还包含可操作地连接至编码丝氨酸重组酶的核苷酸序列的启动子，优选地巨细胞病毒(CMV)启动子。
在一个实施方案中，该细胞还包含可操作地连接至编码丝氨酸重组酶的核苷酸序列的多聚腺苷酸化信号，诸如猿猴病毒40(SV40)多聚腺苷酸化信号。
在一个实施方案中，该载体是DNA质粒。在一个实施方案中，该载体是重组腺病毒载体。
在一个实施方案中，该重组腺病毒载体包括重组ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5(Ad5)病毒，该病毒包含在CMV启动子的控制下的编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列，其中该核苷酸序列进一步可操作地连接至SV40多聚腺苷酸化信号(NC_001669.1，nt 2550至2774)。
在一个实施方案中，该细胞包含腺病毒E1A和E1B基因，优选地该细胞是911细胞、pTG6559细胞、GH329细胞、N52.E6细胞、HeLa-E1细胞、UR细胞、VLI-293细胞、HEK293细胞或PER.C6细胞。
在一个方面，本文提供了一种在细胞中进行位点特异性重组的方法，该方法包括：(a)获得包含核酸分子的细胞，该核酸分子具有：包含具有与SEQ ID NO:7的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attP位点，优选地，具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点，以及包含具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attB位点，优选地，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；(b)向该细胞引入非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子编码具有与SEQ ID NO:2的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的丝氨酸重组酶；以及(c)使该细胞在一定条件下生长以允许丝氨酸重组酶催化attP和attB位点之间的位点特异性重组。
在一个方面，本文提供了一种通过在细胞中进行位点特异性重组的过程而产生的产物，该过程包括：(a)获得包含核酸分子的细胞，该核酸分子具有：包含具有与SEQ ID NO:7的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attP位点，优选地，具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点，以及包含具有与SEQID NO:8或SEQ ID NO:9的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attB位点，优选地，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；(b)向该细胞引入非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子编码具有与SEQ ID NO:2的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的丝氨酸重组酶；以及(c)使该细胞在一定条件下生长以允许丝氨酸重组酶催化attP和attB位点之间的位点特异性重组。
在一个方面，本文提供了一种用于从细胞获得产物的过程，该过程包括：(a)获得包含核酸分子的细胞，该核酸分子具有：包含具有与SEQ ID NO:7的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attP位点，优选地，具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点，以及包含具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attB位点，优选地，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；(b)向该细胞引入非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子编码具有与SEQ ID NO:2的至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的丝氨酸重组酶；(c)使该细胞在一定条件下生长以允许丝氨酸重组酶催化attP和attB位点之间的位点特异性重组；以及(d)从该细胞产生产物并回收产物。
在一个方面，本文提供了一种非天然存在的系统，该非天然存在的系统包含：用于AAV介导的重组的装置，其中该装置任选地包含转基因元件。在一个方面，本文提供了一种用于转移非天然存在的系统的装置，该装置包含：用于AAV介导的重组的装置，其中该装置任选地包含转基因元件。
在一个方面，本文提供了一种非天然存在的系统，该非天然存在的系统包含：用于使该系统重组的重组装置，该重组装置包含：用于AAV介导的重组的装置，其中该装置任选地包含转基因元件，其中该重组装置包括在催化期间使用至少一个丝氨酸残基。在一个方面，本文提供了一种用于转移非天然存在的系统的装置，该装置包含：用于使该系统重组的重组装置，该重组装置包含：用于AAV介导的重组的装置，其中该装置任选地包含转基因元件，其中该重组装置包括在催化期间使用至少一个丝氨酸残基。
在一个方面，本文提供了一种用于制造分子的装置，其中用于制造分子的装置包括任何上述装置并且能够复制。
在一个方面，本文提供了一种用于AAV介导的位点特异性重组的过程，该过程包括：(a)用于执行获得细胞的功能的步骤，该细胞包含用于AAV介导的重组的装置，其中该装置任选地包含转基因元件；(b)用于执行使细胞在一定条件下生长的功能以允许在催化期间使用至少一个丝氨酸残基进行位点特异性重组的步骤。在一个实施方案中，该过程包括获得产物，其中，任选地该产物是治疗产物。
根据以下公开内容，包括本发明的详细描述和其优选的实施方案以及所附权利要求书，本发明的其他方面、特征和优点将显而易见。
附图说明
结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利申请的优选实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。
图1示出了SPBetac2整合酶蛋白(SEQ ID NO:1，待查序列)与沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)菌株CCMA-560的基因组中鉴定的推定丝氨酸重组酶(SEQ ID NO:2，目标序列)(序列ID：WP_029708089.1，长度为535个氨基酸)的比对统计和序列比对。这两种蛋白在氨基酸1至529范围内的蛋白水平上具有64％序列同一性。该推定丝氨酸重组酶在本文中被命名为SR21(丝氨酸重组酶21)。
图2示出了代表预插入基因座的菌株的鉴定：CCMA-560DNA序列(待查序列)与沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)菌株Fairview重叠群56_1的全基因组鸟枪序列的核苷酸464352至464839(目标序列)(序列ID：NZ_JFBY01000018.1，长度为568093个核苷酸)的比对统计和序列比对。
图3示出了SR21重组酶attP和attB位点。attP和attB位点由围绕中心二核苷酸重组交叉位点(带下划线)的对偶对称构成。对一半的位点进行编号。在attB序列中引入空位以显示预测将由从先前研究外推的锌带结构域(ZD)和重组酶结构域(RD)结合的序列的比对(Rutherford等人，(2013)Nucleic Acids Res.41:8341-8356)。这些ZD或RD结构域中的三个或四个ZD或RD结构域中相同的残基为粗体的。示出了attP(SEQ ID NO:7)与两个替代attB序列(SEQ ID NO:8)和(SEQ ID NO:9)的比对。
图4示出了报告基因的重组酶激活。质粒P41编码两种报告基因转录物。EF1α启动子所驱动的第一报告基因转录物有组成性活性并且编码由自切割F2A肽接头连接的绿色荧光蛋白(GFP)与海肾荧光素酶之间的融合蛋白。CMV所驱动的第二转录物包含SR21重组酶attB位点(SEQ ID NO:9)，后跟编码由P2A自切割肽接头连接的mCherry和萤火虫荧光素酶的反向融合蛋白编码区，以及SR21 attP位点。由于荧光素酶和mCherry相对于启动子处于相反取向，因此它们都不表达。当SR21重组酶表达时，attB和attP序列重组，这引起报告基因倒位以及萤火虫荧光素酶和mCherry表达。
图5示出了根据本申请的实施方案产生的经纯化的重组AAV样品中的AAV衣壳蛋白。从用质粒P439稳定转染、在多层细胞培养瓶(Hyperflask)容器中以20MOI(A)和40MOI(B)培养和感染的细胞中纯化样品并且对样品进行PAGE和银染。
图6示出了根据本申请的实施方案的其中插入了具有终止盒的人工内含子的rep/cap表达盒。
图7示出了根据本申请的实施方案的载体(质粒P439)。
图8示出了通过RT-PCR在P439中鉴定的RNA剪接位点的位置和序列。顶图表示在终止盒切除之后REP基因的结构。REP的5’和3’半部由β-肌动蛋白内含子的上游半部(SEQ IDNO:14)、SR21 AttL元件(SEQ ID35)和β-肌动蛋白内含子的下游半部(SEQ ID NO:15)分开。(2)β-肌动蛋白剪接供体(SEQ ID NO:71)与(3)β-肌动蛋白剪接受体(SEQ ID NO:72)之间的剪接由实线表示。(1)5’REP序列中的上游剪接供体(SEQ ID NO:64)与(3)3’β-肌动蛋白受体(SEQ ID NO:72)之间的剪接用虚线示出。下面示出了剪接供体和受体的序列。小写字母序列表示内含子序列。
图9示出了根据本申请的实施方案的载体(质粒P600)。
具体实施方式
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。
应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。
贯穿本说明书和随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”的变型形式将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文使用时，术语“包含”可用术语“含有”或“包括”替代，或者有时在本文使用时用术语“具有”替代。
当在本文使用时，“由……组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文使用时，“基本上由……组成”不排除没有实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。每当在本文中用于本申请的一个方面或实施方案的情境时，任何前述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”均可用术语“由……组成”或“基本上由……组成”替代以改变本公开的范围。
如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
除非另行指出，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围被理解为在所有情况下用术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1mg/mL至10mg/mL的浓度范围包括0.9mg/mL至11mg/mL。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
短语“序列同一性百分比(％)”或“同一性％”或“与......同一性％”在参考氨基酸序列使用时描述与组成两个或更多个比对的氨基酸序列的总长度的氨基酸残基数量相比这些氨基酸序列的相同氨基酸的匹配(“命中”)数。换言之，当比较和比对两个或更多个序列以达到如使用本领域已知的序列比较算法测得的最大对应性时，或当手动比对和目视检查时，可使用对这些序列的比对来确定相同(例如，在氨基酸序列的全长上的90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％同一性)的氨基酸残基的百分比。因此为确定序列同一性而进行比较的序列的差别可在于氨基酸的置换、添加或缺失。用于比对蛋白序列的合适程序是技术人员已知的。可例如使用诸如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST的程序，例如使用NCBI BLAST算法来确定蛋白序列的序列同一性百分比(AltschulSF等人，(1997)，Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。
如本文所用，“非天然存在的”核酸或多肽是指自然界不存在的核酸或多肽。“非天然存在的”核酸或多肽可在实验室和/或制造环境中合成、处理、制造和/或以其他方式操纵。在一些情况下，非天然存在的核酸或多肽可包含天然存在的核酸或多肽，该天然存在的核酸或多肽经过处理、加工或操纵而表现出在处理之前不存在于该天然存在的核酸或多肽中的特性。如本文所用，“非天然存在的”核酸或多肽可以是从发现其的天然源离析或分离的核酸或多肽，并且其缺少对其在天然源中相关联的序列的共价键。“非天然存在的”核酸或多肽可以以重组方式或经由其他方法诸如化学合成来制备。
如本文所用，术语“杂合体”在参考AAV cap基因使用时旨在意指包含一种血清型衣壳的部分与不同血清型衣壳的部分的组合的cap基因。该术语还包括AAV cap基因变体，其中天然存在的AAV血清型序列包含一个或多个非天然存在的突变。
如本文所用，术语“间隔序列”旨在意指除了分隔其他基因元件之外没有明显功能的非编码核苷酸的区域。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指连接或毗邻，其中如此描述的组分处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。例如，如果启动子影响编码序列的转录，则启动子可操作地连接至编码序列，或可操作地连接至感兴趣的氨基酸序列的信号序列能够使感兴趣的氨基酸序列经过膜分泌或易位。
为了帮助本申请的读者，已将说明书分成各个段落或章节，或者涉及本申请的各个实施方案。这些分割不应被认为是将段落或章节或实施方案的实质与另一段落或章节或实施方案的实质拆开。相反，本领域技术人员将理解，本说明书具有广泛的应用，并且涵盖可设想到的各个章节、段落和句子的所有组合。对任何实施方案的讨论仅意图是示例性的，并且不旨在表明本公开(包括权利要求书)的范围限于这些示例。例如，虽然本文所述的本申请的非天然存在的核酸或重组载体(例如，质粒DNA或病毒载体)的实施方案可包含特定组分，包括但不限于以特定顺序布置的某些启动子序列、增强子或调控序列、内含子、AAVRep和/或Cap的编码序列、多聚腺苷酸化信号序列等，但本领域的普通技术人员应当理解，本文所公开的概念同样可适用于可在本申请的核酸或载体中使用的以其他顺序布置的其他组分。本申请设想了以具有可在本申请的核酸或载体中使用的任何序列的任何组合使用任何适用组分，而不论是否明确描述特定组合。
如本文所用，“载体”是用于将遗传物质运送到细胞中的核酸分子，其可在该细胞中复制和/或表达。可使用本领域技术人员根据本公开获知的任何载体。载体的示例包括但不限于质粒、病毒载体(噬菌体、动物病毒和植物病毒)、粘粒和人工染色体(例如，YAC)。优选地，载体是DNA质粒。本领域的普通技术人员可根据本公开通过标准重组技术来构建本申请的载体。
本申请的载体可以是表达载体。如本文所用，术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何类型的基因构建体。表达载体包括但不限于用于重组蛋白表达的载体诸如DNA质粒或病毒载体，以及用于将核酸递送到受试者中以在受试者的组织中表达的载体诸如DNA质粒或病毒载体。本领域的技术人员应当理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白表达水平等之类的因素。
在本申请的一些实施方案中，载体是非病毒载体。非病毒载体的示例包括但不限于DNA质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体等。优选地，非病毒载体是DNA质粒。可与“DNA质粒载体”、“质粒DNA”或“质粒DNA载体”互换使用的“DNA质粒”是指能够在合适宿主细胞中自主复制的双链且大致环状的DNA序列。用于编码的多核苷酸的表达的DNA质粒通常包含复制起点、多克隆位点和选择性标记物，该选择性标记物例如可以是抗生素抗性基因。可使用的合适DNA质粒的示例包括但不限于用于熟知的表达系统(包括原核系统和真核系统)的市售表达载体，诸如可用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中产生和/或表达蛋白的pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)；可用于在酵母的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株中产生和/或表达的pYES2(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific)；可用于在昆虫细胞中产生和/或表达的
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完整杆状病毒表达系统(Thermo FisherScientific)；可用于在哺乳动物细胞中高水平组成性蛋白表达的pcDNATM或pcDNA3TM(LifeTechnologies，Thermo Fisher Scientific)；以及可用于在大多数哺乳动物细胞中高水平瞬时表达感兴趣的蛋白的pVAX或pVAX-1(Life Technologies，Thermo FisherScientific)。可通过使用常规技术和现成起始材料来修饰任何市售DNA质粒的骨架以优化宿主细胞中的蛋白表达，诸如颠倒某些元件(例如，复制起点和/或抗生素抗性盒)的取向，替换质粒内源的启动子(例如，抗生素抗性盒中的启动子)和/或替换编码所转录的蛋白的多核苷酸序列(例如，抗生素抗性基因的编码序列)。(参见例如Sambrook等人，MolecularCloning a Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press(1989))。
优选地，DNA质粒是适用于哺乳动物宿主细胞中的蛋白表达的表达载体。适用于哺乳动物宿主细胞中的蛋白表达的表达载体包括但不限于pUC、pcDNATM、pcDNA3TM、pVAX、pVAX-1、ADVAX、NTC8454等。例如，该载体可基于pUC57，其包含pUC复制起点和氨苄青霉素抗性基因(SEQ ID NO:30)。其还可包含由疱疹病毒胸苷激酶基因启动子(SEQ ID NO:26)、嘌呤霉素N-乙酰转移酶编码区(SEQ ID NO:27)和来自牛生长激素基因的多聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:28)构建的哺乳动物嘌呤霉素抗性基因盒。该载体还可包含EB病毒(EBV)OriP复制起点片段(SEQ ID NO:29)，该片段表示EBV的“对偶对称”区和“重复家族”区的复合体。
本申请的载体还可以是病毒载体。一般来讲，病毒载体是携带经修饰的病毒DNA或RNA的基因工程病毒，该经修饰的病毒DNA或RNA已呈现非感染性，但仍包含病毒启动子和转基因，因此允许通过病毒启动子来翻译转基因。由于病毒载体常常缺少感染性序列，因此它们需要辅助病毒或包装线来大规模转染。可使用的病毒载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、肠道病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、烟草花叶病毒载体、慢病毒载体等。该载体也可以是非病毒载体。
优选地，病毒载体是腺病毒载体，例如重组腺病毒载体。如本文所用，术语“重组腺病毒载体(recombinant adenovirus vector)”和“重组腺病毒载体(recombinantadenoviral vector)”及“重组腺病毒颗粒”可互换使用并且是指基因工程腺病毒，该基因工程腺病毒被设计为将感兴趣的多核苷酸插入到真核细胞中，使得随后表达该多核苷酸。可用作本发明的病毒载体的腺病毒的示例包括具有或来源于血清型Ad2、Ad5、Ad11、Ad12、Ad24、Ad26、Ad34、Ad35、Ad40、Ad48、Ad49、Ad50、Ad52(例如，RhAd52)和Pan9(也称为AdC68)的那些；这些载体可来源于例如人、黑猩猩(例如，ChAd1、ChAd3、ChAd7、ChAd8、ChAd21、ChAd22、ChAd23、ChAd24、ChAd25、ChAd26、ChAd27.1、ChAd28.1、ChAd29、ChAd30、ChAd31.1、ChAd32、ChAd33、ChAd34、ChAd35.1、ChAd36、ChAd37.2、ChAd39、ChAd40.1、ChAd41.1、ChAd42.1、ChAd43、ChAd44、ChAd45、ChAd46、ChAd48、ChAd49、ChAd49、ChAd50、ChAd67或SA7P)或恒河猴腺病毒(例如，rhAd51、rhAd52或rhAd53)。重组腺病毒载体可例如来源于人腺病毒(HAdV或AdHu)或者猿猴腺病毒诸如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV)或者恒河猴腺病毒(rhAd)。
优选地，腺病毒载体是重组人腺病毒载体，例如重组人腺病毒血清型5或者重组人腺病毒血清型26、4、35、7、48等中的任何一者。可根据本公开使用本领域已知的方法来制备可用于本申请的重组病毒载体。例如，根据遗传密码的简并性，可设计编码相同多肽的若干核酸序列。编码感兴趣的蛋白的多核苷酸可任选地经密码子优化以确保宿主细胞(例如，细菌或哺乳动物细胞)中的适当表达。密码子优化是本领域中广泛应用的技术，并且根据本公开，用于获得经密码子优化的多核苷酸的方法将为本领域技术人员所熟知。
非天然存在的核酸分子或载体可包含一个或多个表达盒。“表达盒”是指导细胞机器制备RNA和蛋白的核酸分子或载体的一部分。表达盒可包含启动子序列、开放阅读框、3’-非翻译区(UTR)，该3’-UTR任选地包含多聚腺苷酸化信号。开放阅读框(ORF)是包含从起始密码子到终止密码子的感兴趣的蛋白(例如，Rep、Cap、重组酶或感兴趣的重组蛋白)的编码序列的阅读框。表达盒的调控元件可以可操作地连接至编码感兴趣的蛋白的多核苷酸序列。
本申请的非天然存在的核酸分子或载体可包含多种调控序列。如本文所用，术语“调控序列”是指允许、有助于或调节核酸分子的功能调控的任何序列，该功能调控包括核酸或其衍生物(即mRNA)之一的复制、倍增、转录、剪接、翻译、稳定性和/或向宿主细胞或生物体中的转运。调控元件包括但不限于启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、翻译终止密码子、核糖体结合元件、转录终止子、选择标记物、复制起点等。
非天然存在的核酸分子或载体可包含优选地在表达盒内的启动子序列，以控制感兴趣的蛋白的表达。术语“启动子”在其传统意义上使用，并且是指引发可操作地连接的核苷酸序列的转录的核苷酸序列。启动子位于其转录的核苷酸序列附近的相同链上。启动子可为组成型、诱导型或阻遏型。启动子可以是天然存在的或合成的。启动子可来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物在内的源。启动子可以是同源启动子(即，来源于与载体相同的遗传源)或异源启动子(即，来源于不同载体或遗传源)。例如，如果待采用的载体是DNA质粒，则启动子可以是质粒内源的(同源)或来源于其他源(异源)。优选地，启动子位于表达盒内编码感兴趣的蛋白的多核苷酸的上游。
可使用的启动子的示例包括但不限于来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)启动子诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子诸如CMV立即早期启动子(CMV-IE)、EB病毒(EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自人基因诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。启动子还可以是天然或合成的组织特异性启动子，诸如肌肉或皮肤特异性启动子。优选地，启动子是强真核启动子，诸如巨细胞病毒(CMV)启动子(nt–672至+15)、EF1-α启动子、疱疹病毒胸苷激酶基因启动子(SEQ ID NO:26)等。
非天然存在的核酸分子或载体可包含使表达的转录物稳定、增强RNA转录物的核输出和/或改善转录-翻译偶联的附加多核苷酸序列。此类序列的示例包括多聚腺苷酸化信号和增强子序列。多聚腺苷酸化信号通常位于载体的表达盒内的感兴趣的蛋白(例如，Rep、Cap、重组酶)的编码序列的下游。增强子序列是在由转录因子结合时增强相关基因的转录的调控DNA序列。增强子序列优选地在启动子序列的下游并且可在载体的表达盒内的编码序列的下游或上游。
可使用本领域技术人员根据本公开获知的任何多聚腺苷酸化信号。例如，多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号(例如，SEQ ID NO:60)、AAV2多聚腺苷酸化信号(bp 4411-4466，NC_001401.2)、来自单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的多聚腺苷酸化信号(SEQID NO:23)、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号。优选地，多聚腺苷酸化信号是牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:28)、具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号4411至4466的AAV2的多聚腺苷酸化信号或SV40多聚腺苷酸化信号(SEQID NO:60)。
可使用本领域技术人员根据本公开获知的任何增强子序列。例如，增强子序列可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，诸如来自CMV、HA、RSV或EBV的增强子。特定增强子的示例包括但不限于土拨鼠HBV转录后调控元件(WPRE)、来源于人载脂蛋白A1前体(ApoAI)的内含子/外显子序列、人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)长末端重复(LTR)的非翻译R-U5结构域、剪接增强子、合成兔β-珠蛋白内含子或它们的任何组合。
优选地，增强子序列包含AAV的P5启动子。P5启动子是rep基因的编码序列内的顺式作用Rep依赖性元件(CARE)的一部分。已证实CARE在以顺式方式存在时能增强复制和衣壳化。如在一些AAV生产者细胞系中，CARE对于染色体整合的rep基因(如果不存在AAV ITR)的扩增也很重要。虽然不希望受理论的束缚，但据信放置于cap编码序列下游的P5启动子潜在地充当增强子以增加Cap表达，因此产生AAV，并且其还提供增强子活性以便扩增整合到染色体中的基因。
非天然存在的核酸分子或载体诸如DNA质粒还可包含细菌复制起点和抗生素抗性表达盒以用于在细菌细胞例如大肠杆菌(E.coli)中选择和维持质粒。复制起点(ORI)是引发复制的序列，从而使质粒能够在细胞内繁殖和生存。适用于本申请的ORI的示例包括但不限于ColE1、pMB1、pUC、pSC101、R6K和15A，优选地pUC。
用于在细菌细胞中选择和维持的载体通常包含可操作地连接至抗生素抗性基因的启动子序列。优选地，可操作地连接至抗生素抗性基因的启动子序列不同于可操作地连接至编码感兴趣的蛋白的多核苷酸序列的启动子序列。抗生素抗性基因可经过密码子优化，并且通常调节抗生素抗性基因的序列组成以适应细菌例如大肠杆菌(E.coli)密码子使用。可使用本领域技术人员根据本公开获知的任何抗生素抗性基因，包括但不限于卡那霉素抗性基因(Kanr)、氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr)以及赋予对氯霉素、博来霉素、壮观霉素、羧苄青霉素等的抗性的基因。
用于在哺乳动物细胞中选择和维持的载体通常包含可操作地连接至编码赋予选择性标记物的蛋白的基因的启动子序列。优选地，该基因还包含多聚腺苷酸化信号。例如，哺乳动物嘌呤霉素抗性基因盒可包含疱疹病毒胸苷激酶基因启动子(SEQ ID NO:26)、嘌呤霉素N-乙酰转移酶编码区(SEQ ID NO:27)和来自牛生长激素基因的多聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:28)。
在人类细胞中制造重组AAV需要表达AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因、腺病毒基因以及由侧翼有AAV末端反向重复(ITR)的表达盒组成的AAV可包装转基因。可将所有三种组分置于用于AAV生产的单独质粒上递送到细胞中，但现有转染方法难以放大到大规模培养。将这些元件中的一些元件掺入宿主细胞系中可使AAV生产更高效，但是一些AAV和腺病毒基因有细胞抑制或细胞毒性，从而限制了该方法。
本申请描述了非天然存在的核酸分子、载体、细胞以及使AAV rep基因可逆地失活的方法，使得AAV rep基因、AAV cap基因和可包装转基因可维持和/或整合到合适的宿主细胞中并扩增。表达重组酶的重组腺病毒感染这些细胞会再激活rep基因并且诱导AAV复制和包装。与Xiao和同事描述的方法(Qiao等人，(2002)J.Virol.76:13015-13027；Yuan等人，(2011)Hum.Gene Ther.22:613-624)不同(该方法使用Cre，即识别两个相同loxP位点并且催化连接反应和切除反应的酪氨酸重组酶)，本发明使用丝氨酸重组酶21(SR21)，即本申请的发明人新表征的丝氨酸重组酶。与Cre不同，SR21识别具有不同序列的attP和attB位点。在SR21所催化的连接反应之后，attP和attB位点发生重组并且被破坏，因此不可能再进行重组。因此，本申请的方法可比Cre所催化的方法更高效。本申请的某些实施方案包括附加特征，诸如插入在不同人工内含子、增强子、绝缘子等中的不同终止盒，这对现有技术中的方法做了进一步改进。本申请的可逆失活/再激活系统允许AAV rep基因在包装细胞生长期间受到严格控制，因此避免Rep蛋白对宿主细胞的细胞抑制/细胞毒性效应。其还提供AAVrep基因的强诱导和在AAV载体的产生期间这些载体的高产率。
丝氨酸重组酶
大丝氨酸重组酶家族的成员(诸如SR21)所催化的位点特异性重组不需要用于同源重组的细胞机器。通常，其需要识别这些位点、断开和连接该DNA的特化重组酶。基于氨基酸序列同源性和机制相关性，大多数位点特异性重组酶被分组到如下两个家族之一中：酪氨酸重组酶家族或丝氨酸重组酶家族。这些名称源于它们用来攻击DNA并且在链交换期间与之共价连接的保守亲核氨基酸残基。
丝氨酸重组酶结合并重组单独的重组识别位点，这些位点称为如下“附着位点”：attP“附着噬菌体”以及attB“附着细菌”染色体。attP和attB位点由围绕中心二核苷酸重组交叉位点的对偶对称构成。attP和attB位点的左半部和右半部由重组酶单体通过锌带(ZD)和重组酶(RD)结构域结合(Rutherford等人，(2013)Nucleic Acids Res.41:8341-8356)。
如下文在实施例中更详细描述的，在本发明中在沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)菌株CCMA-560的基因组中新鉴定了丝氨酸重组酶，其在本文中称为“丝氨酸重组酶21”或“SR21”。还在本发明中表征了SR21所识别的attP和attB位点。
在一个总体方面，本申请涉及一种非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含编码具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85％诸如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列。优选地，该非天然存在的核酸分子包含编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列。在一个实施方案中，该非天然存在的核酸分子包含具有与SEQ ID NO:3的核苷酸序列的至少85％诸如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。
在某些实施方案中，本申请涉及一种载体，该载体包含非天然存在的核酸。该载体可以是在感兴趣的细胞例如细菌细胞或哺乳动物细胞中表达丝氨酸重组酶的表达载体。在一个实施方案中，该载体在巨细胞病毒(CMV)启动子或者本文所述或本领域已知的任何其他合适启动子的控制下在哺乳动物细胞中表达丝氨酸重组酶。在某些实施方案中，该载体还可包含多聚腺苷酸化信号，诸如猿猴病毒40(SV40)多聚腺苷酸化信号或者本文所述或本领域已知的任何其他合适多聚腺苷酸化信号。
在一个实施方案中，该载体是DNA质粒，诸如具有SEQ ID NO:10的核苷酸序列的质粒P175。
在另一个实施方案中，该载体是病毒载体，诸如重组腺病毒载体。
在一个实施方案中，该载体是重组ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5(Ad5)病毒，该病毒包含编码具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85％同一性诸如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的丝氨酸重组酶的核苷酸序列，并且该编码序列在哺乳动物细胞中有功能的启动子的控制下。优选地，该启动子是CMV启动子。更优选地，重组Ad5载体按5’至3’顺序包含CMV启动子，该CMV启动子可操作地连接至编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列，该核苷酸序列可操作地连接至SV40多聚腺苷酸化信号(NC_001669.1，nt 2550至2774)。在一个实施方案中，编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的核苷酸序列与SEQ ID NO:3相同，只是细菌翻译起始密码子“TTG”被替换为“ATG”，并且引入了三个点突变以破坏SEQ ID NO:3内的限制性内切核酸酶识别位点。这些限制性内切核酸酶识别位点是Xba I位点(TCTAGA)；Sac I位点(GAGCTC)；EcoRI位点(GAATTC)。
根据本公开，可使用本领域已知的任何方法来制备编码本申请的丝氨酸重组酶的载体。
如以下实施例中更详细描述的，在本发明中鉴定了本申请的丝氨酸重组酶的attP和attB位点。在某些实施方案中，本申请的丝氨酸重组酶识别包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列或其变体的attP位点。在某些实施方案中，本申请的丝氨酸重组酶识别包含具有与SEQID NO:7的至少90％诸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attP位点。
在某些实施方案中，本申请的丝氨酸重组酶识别包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列或其变体的attB位点。在某些实施方案中，本申请的丝氨酸重组酶识别包含具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的至少90％诸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attB位点。
在一个实施方案中，本申请涉及一种在细胞中进行位点特异性重组的方法。该方法包括：
1)获得包含核酸分子的细胞，该核酸分子具有：包含具有与SEQ IDNO:7的至少90％同一性的核苷酸序列的attP位点，以及包含具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的至少90％同一性的核苷酸序列的attB位点；
2)向该细胞引入非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子编码具有与SEQ ID NO:2的至少85％同一性诸如至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的丝氨酸重组酶；以及
3)使该细胞在一定条件下生长以允许丝氨酸重组酶催化attP和attB位点之间的位点特异性重组。
在一个优选的实施方案中，本申请涉及一种在细胞中进行位点特异性重组的方法。该方法包括：
1)获得包含核酸分子的细胞，该核酸分子具有：具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点，以及具有SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的核苷酸序列的attB位点；
2)向该细胞引入非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子编码具有SEQID NO:2的氨基酸序列的丝氨酸重组酶；以及
3)使该细胞在一定条件下生长以允许丝氨酸重组酶催化attP和attB位点之间的位点特异性重组。
用于生产重组AAV的构建体、细胞和方法
如以下实施例中所示，本申请的新鉴定的丝氨酸重组酶可用于提高重组AAV的产量。
经修饰的AAV rep基因构建体
在一个总体方面，本申请涉及一种非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含经修饰的腺相关病毒(AAV)rep基因，该经修饰的AAV rep基因具有编码四种Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV rep基因以及插入到这四种Rep蛋白所共用的rep基因的编码序列中的人工内含子。人工内含子包含插入在5’剪接位点下游和人工内含子的分支位点上游的终止盒，并且终止盒按5’至3’顺序包含：(i)包含具有与SEQ ID NO:7的至少90％诸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attP位点，(ii)剪接受体；(iii)终止子；以及(iv)包含具有与SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的至少90％诸如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列的attB位点。优选地，attP位点具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列并且attB位点具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列。
如本文所用，“内含子”被广义地定义为可通过RNA剪接去除的核苷酸序列。“RNA剪接”意指从前体mRNA切除内含子以形成成熟mRNA。如本文所用，“人工内含子”是指并非基因的天然存在的内含子但仍可通过RNA剪接去除的核苷酸序列。例如，“人工内含子”可以是插入有终止盒的天然存在的内含子。
内含子(包括人工内含子)包含5′剪接位点或剪接接头、剪接受体或分支点以及3′剪接位点或剪接接头。术语“5′剪接位点”或“5′剪接接头”意指外显子-内含子接头的位置，其中该接头位于基因或核酸片段的5′片段的3′端与内含子的5′端之间，并且在内含子的5′端包含RNA剪接所需的共有序列。术语“剪接受体”或“分支点”是指位于离3′剪接位点的大约20至50bp处的核苷酸(通常为腺苷)，其有助于在RNA剪接期间的第一酯交换反应过程中形成套索结构。术语“3′剪接位点”或“3′剪接接头”意指外显子-内含子接头的位置，其中该接头位于基因或核酸片段的3′片段的5′端与内含子的3′端之间，并且在内含子的3′端还包含RNA剪接所需的共有序列。术语“共有序列”意指5′或3′剪接接头中/或附近的RNA剪接所需的核苷酸；这些序列通常是不变的或高度保守的。
大量mRNA的分析已揭示某些核苷酸在典型内含子和剪接接头中是保守的。例如，内含子的几乎不变的碱基是5′-GU和3′-AG。位于这些5′和3′保守区的侧翼的某些碱基通常以异常(非随机)频率存在。还保守的是分支点腺苷，通常为离3′剪接位点的20至50个碱基。参见例如Gao等人(2008)Nucleic Acids Research 36:2257-2267的图4，该图示出了在外显子的背景下的内含子的通用共有区，Gao等人(2008)的全部内容以引用方式并入本文。然而，长度可在40至50,000个碱基的范围内的内含子的中心区域通常不是进行剪接所必要的。通过剪接体将内含子以套索结构的形式从RNA或前体mRNA去除。外显子剪接在一起是经由两个连续酯交换反应进行的。
内含子插入到所表达的序列中可通过本领域已知的任何方法来完成。侧翼外显子背景以及待使用的实际内含子序列在新“内含子”是否将被有效地剪接掉中起着一定作用。可通过以下方式测试适用于本发明的内含子：通过计算机模拟(in silico)制备复合序列并且使用在线剪接预测程序找到给出有效RNA剪接的足够高的分数的rep基因序列和内含子序列的组合。根据本公开，可对基因组或合成序列中的任何内含子进行测试和优化以用于本发明的构建体中。
为了破坏Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的所有四种rep开放阅读框的表达，优选地将人工内含子插入到这四种Rep蛋白所共用的rep基因的编码序列中。因此，在某些实施方案中，为了破坏所有四种ORF，将人工内含子插入在AAV2的核苷酸996且一直到1905(NC_001401.2)或另一个AAV rep基因中的对应位置之后。但为了让终止盒在插入在人工内含子中时起作用，优选的是让内含子插入在rep基因的尽可能上游。
另外，在内含子插入位点的刚好上游和下游的外显子背景对于定义什么将充当可能的插入位点很重要，例如在上文所讨论的外显子的背景中的内含子的通用共有区。在一个实施方案中，共有序列CAG^G(其中^标记将在何处进行插入)在如下AAV2中的rep基因的相关区域中出现，其中编号指示在该插入前的AAV的最后一个核苷酸：1052、1061、1712和1906。在另一个实施方案中，共有序列AAG^G在AAV2的位置1022(如Qiao所使用)、1112、1475、1514、1700、1742和1784中出现。其他共有位点诸如AAG^A在例如AAV2的核苷酸1340处出现。根据本公开，还在其他AAV的rep基因中鉴定了优选的插入位点。
可用于本发明的人工内含子可来源于任何源，诸如来源于基因组文库。如下所述，可通过聚合酶链反应(PCR)使用引物从人DNA获得内含子。任何能够在细胞中进行RNA剪接的内含子均可用于本发明的方法中。在以下实施例中，内含子是人β-肌动蛋白基因的内含子。
根据本申请的实施方案，除了经由人工内含子的RNA剪接之外，还通过经由插入到人工内含子中的终止盒的DNA剪接来调控Rep蛋白的表达。终止盒包含转录终止子，该转录终止子侧翼有由丝氨酸重组酶(诸如本发明中表征的丝氨酸重组酶)特异性地识别的attP和attB位点。在一个实施方案中，终止子包含一个或多个多聚腺苷酸化信号。在另一个实施方案中，终止子包含用于有效转录终止的另一个序列，诸如来自人β-珠蛋白基因、在多聚腺苷酸化信号的下游并编码自切割RNA基序的序列，其优选地具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列。其他终止子也可用于本发明中，诸如切割其自身RNA的锤头状核酶。参见West(2008)Molecular Cell 29:600–610了解使用其他核酶替换β珠蛋白元件，并且参见Kharma(2016)Nucleic Acids Res.44:e39了解设计核酶的描述，这两篇文献的内容全部以引用方式并入本文。
在一个实施方案中，终止盒还包含编码选择性标记物的基因。在一个实施方案中，选择性标记物基因包含新霉素磷酸转移酶表达盒(neo)(SEQ ID NO:18)，该表达盒由哺乳动物启动子(例如，小鼠磷酸甘油酸激酶1)和细菌(例如，Lac zya)启动子驱动并且后跟多聚腺苷酸化信号(诸如来自SV40的多聚腺苷酸化信号)。该基因分别赋予哺乳动物细胞和细菌细胞中对新霉素和卡那霉素的抗性。虽然不希望受理论的束缚，但据信除了将选择性标记物用于细胞系形成之外，选择性标记物基因还可阻断rep基因的转录，从而增加含有经修饰的rep基因的宿主细胞的稳定性。可用于本发明中的其他选择性标记物基因包括但不限于抗生素选择基因(嘌呤霉素、潮霉素、博来霉素)、代谢基因(例如，谷氨酰胺合成酶或次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT))、诸如mCherry之类的可视标记物、诸如β-半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶之类的酶或者任何其他合适的标记物基因。
在另一个实施方案中，终止盒包含剪接受体以防止从初级mRNA转录物剪接掉终止盒。可使用任何天然存在的剪接受体位点或合成序列，只要不跳过剪接受体即可。根据本申请的实施方案，剪接受体包含适形于共有区(yTnAynn)的分支点序列，其中y是C或T并且n是任何核苷酸、多聚嘧啶串(4至24nt)、“AG”二核苷酸以及20至80bp的真核基因外显子序列(或在置于内含子序列旁边时表现得像外显子一样的合成序列)。该序列应当被NetGene2剪接预测软件识别为剪接受体位点(www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/；Brunak,S.、Engelbrecht,J.和Knudsen,S.：Prediction of Human mRNA Donor and Acceptor Sitesfrom the DNA Sequence，Journal of Molecular Biology，1991，220，49-65)，置信度得分为0.4或更好(或使用类似剪接预测软件)；得分约接近1.0越好。在一个实施方案中，剪接受体包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列(NC_000086.7，来自小鼠HPRT基因的核苷酸53001998至53002138，加上来自人刺鼠信号蛋白的29nt区域(NC_000020.11，核苷酸34262765至34262793)。
根据本申请的实施方案，将终止盒插入在人工内含子的5’剪接供体位点的下游和剪接受体“分支点”的上游。可将终止盒插入在这两个位点之间的任何位置处，只要该插入不损坏这些位点的功能即可。在一个实施方案中，将终止盒插入在这两个位点的中间。在以下实施例中所述的一个示例性实施方案中，将终止盒插入到人β-肌动蛋白基因的内含子中，使得5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列并且3’内含子片段具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
如本文所提供，在一些实施方案中，3’内含子片段可包含间隔序列，从而使REP/CAP基因太大而不能包装在AAV中。例如，AAV包装极限为大约5.0kb。因此，根据本文所提供的本公开，可生成使REP/CAP基因大于大约5.0kb的间隔序列。在一些实施方案中，间隔序列是插入在3’内含子片段中的2kb随机间隔区。因此，在以下实施例中所述的示例性实施方案中，将终止盒插入到人β-肌动蛋白基因的内含子中，使得5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列并且3’内含子片段具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列。然而，应当理解，间隔序列不必为2kb，并且可为使得REP/CAP基因大于大约5.0kb的任何长度。
任何AAV rep基因可包含在本发明的经修饰的rep基因中。例如，AAV rep基因可包含AAV1至AAV8之一或它们的杂合体的rep基因。AAV rep基因的序列可得自例如GenBank，各种AAV基因组具有以下GenBank登录号：AAV1，GenBank登录号NC_002077.1；AAV2，GenBank登录号NC_001401.2；AAV3，GenBank登录号NC_001729.1；AAV4，GenBank登录号NC_001829.1；AAV5，GenBank登录号NC_006152.1；AAV6，GenBank登录号AF028704.1；AAV7，GenBank登录号NC_006260.1；以及AAV8，GenBank登录号NC_006261.1。
在以下实施例中，使用具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号190至2202的人AAV2的rep基因。
在一些实施方案中，可对rep基因中的隐蔽剪接位点进行修饰以消除该位点处的剪接。例如，可对DNA序列进行同义突变，其中DNA序列发生突变，但该突变不会改变所编码的氨基酸。
具有经修饰的AAV rep基因和AAV cap基因的构建体
在另一个总体方面，本申请涉及一种非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含本申请的经修饰的AAV rep基因和AAV cap基因或它们的杂合体。优选地，AAVcap基因在经修饰的AAV rep基因的下游。
在一个实施方案中，AAV cap基因还包含可操作地连接至该基因的编码序列的多聚腺苷酸化信号。在以下实施例中所述的示例性实施方案中，AAV2多聚腺苷酸化信号(bp4411-4466，NC_001401.2)包含在AAV9 cap编码序列的下游。
在另一个实施方案中，AAV cap基因还包含增强子。在以下实施例中，AAV2 rep P5启动子(bp 190-313，NC_001401.2)包含在AAV2多聚腺苷酸化信号的下游。
在某个实施方案中，AAV cap基因编码衣壳蛋白VP1、VP2和VP3中的所有三种衣壳蛋白。
在其他实施方案中，AAV cap基因编码这些衣壳蛋白中的少于三种衣壳蛋白。例如，据报道AAV血清型1至5可在没有VP2的情况下在细胞中成功包装、复制和转导(Grieger等人，J Virol.2005年8月；79(15):9933–9944)。因此，在一个实施方案中，AAV cap基因编码AAV 1至AAV5中的任何一者或它们的杂合体的VP1和VP3，而不编码VP2。
任何AAV cap基因可用于本发明中。例如，AAV cap基因可以是AAV1至AAV8、AAV9、AAVDJ之一或它们的杂合体的cap基因。在一个实施方案中，cap基因是AAV9变体。AAV cap基因的序列可得自例如GenBank。参见AAV1至AAV8基因组的上述GenBank登录号。AAV9基因组具有GenBank登录号AY530579.1，并且AAVDJ具有GenBank蛋白登录号3J1Q_A。
在以下实施例中所述的一个实施方案中，使用具有GenBank登录号AY530579.1的核苷酸序列的人AAV9的cap开放阅读框。
具有经修饰的AAV rep基因、AAV cap基因和转基因的构建体
在另一个总体方面，本申请涉及一种非天然存在的核酸分子，该非天然存在的核酸分子包含本申请的经修饰的AAV rep基因、AAV cap基因和侧翼有AAV末端反向重复(ITR)的转基因。
ITR是AAV生物学中的重要顺式活性序列。ITR在AAV DNA复制中起着关键作用。除了其在AAV复制中的作用之外，ITR也是AAV基因组包装、转录、非允许条件下的负调控以及位点特异性整合所必需的。
在一个实施方案中，130bp ITR包含来源于3’AAV2 ITR的SEQ ID NO:20的核苷酸序列(核苷酸4535至4664，NC_001401.2)，其用于位于转基因的侧翼。在另一个实施方案中，使用更短的突变ITR。例如，对于更短基因而言，ITR发生突变而变得更短并且该基因可折叠成双链形式以增加表达并在感染后加速表达。参见McCarty 2008Mol Ther.2008；16(10):1648–56。
在另一个实施方案中，转基因包含启动子，优选地在哺乳动物细胞中有功能的启动子。在下述实施例中，人EF1-α启动子(包含外显子1、内含子1和外显子2的一部分)(SEQID NO:21)包含在转基因中。
在另一个实施方案中，转基因包含多聚腺苷酸化信号。在下述实施例中，来自单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的多聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:23)包含在转基因中。
在又一个实施方案中，非天然存在的核酸分子包含位于经修饰的AAV rep基因的侧翼的一对绝缘子、AAV cap基因和侧翼有ITR的转基因。在另一个实施方案中，非天然存在的核酸分子包含在经修饰的AAV rep基因的上游的单个绝缘子、AAV cap基因和侧翼有ITR的转基因。在一个实施方案中，绝缘子包含阻断基因表达的染色质相关阻遏的基因组元件(Kwaks等人，(2003)Nature Biotechnology 21:554-558；Kwaks等人，(2003)NatureBiotechnology 21:822)。
任何合适的绝缘子(诸如本文所述的那些)可用于本发明中。在一个实施方案中，绝缘子是具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列的人抗阻遏子元件40。在另一个实施方案中，绝缘子是具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列的小鼠抗阻遏子元件40。在另一个实施方案中，在另一个实施方案中，绝缘子是具有GenBank登录号AY190749.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件04。在另一个实施方案中，绝缘子是具有GenBank登录号AY190750.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件06。在另一个实施方案中，绝缘子是具有GenBank登录号AY190751.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件07。在另一个实施方案中，绝缘子是具有GenBank登录号AY190752.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件12。在另一个实施方案中，绝缘子是具有GenBank登录号AY190753.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件13。在另一个实施方案中，绝缘子是具有GenBank登录号AY190754.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件35。在另一个实施方案中，绝缘子是具有GenBank登录号AY190755.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件36。在另一个实施方案中，绝缘子是具有GenBank登录号AY190757.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件52。在另一个实施方案中，绝缘子是具有GenBank登录号AY190758.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件53。在另一个实施方案中，绝缘子是来自珠蛋白基因座的具有AY040835.1的核苷酸序列的两个或更多个拷贝的鸡HS4绝缘子。
包含一对绝缘子的非天然存在的核酸分子可具有相同或不同绝缘子作为一对来位于感兴趣的基因节段的侧翼。优选地，不同绝缘子用作一对来位于感兴趣的基因节段的侧翼。在以下实施例中所述的一个示例性实施方案中，人抗阻遏子元件40(AY190756.1，SEQID NO:24)和小鼠抗阻遏子元件40(SEQ ID NO:25)用作绝缘子。在以下实施例中所述的另一个示例性实施方案中，人抗阻遏子元件40(AY190756.1，SEQ ID NO:24)用作绝缘子。
如本文所提供，本公开的构建体还可包含AAV转基因两侧上的间隔序列以降低错误包装其他载体组分的风险。在一个实施方案中，非天然存在的核酸分子包含分别在转基因的上游和下游的第一间隔序列和第二间隔序列。在某些实施方案中，这些间隔序列是2kb间隔序列。在具体实施方案中，非天然存在的核酸分子包含在经修饰的AAV rep基因的上游的第一绝缘子，并且还包含分别在转基因的上游和下游的第一间隔序列和第二间隔序列，其中第一绝缘子和第二间隔序列独立地选自：(a)SEQ ID NO:67的核苷酸序列；以及(b)SEQID NO:68的核苷酸序列。
用于生产重组AAV的细胞和方法
从本申请的经修饰的AAV rep基因表达Rep蛋白受到DNA剪接和RNA剪接机制的严格控制，因此允许在生物反应器中生成含有经修饰的rep基因的稳定宿主细胞并使这些细胞生长到很高数量。为了进行AAV生产，首先使含有经修饰的AAV rep基因、AAV cap基因和侧翼有ITR的转基因的稳定宿主细胞生长到很高数量，然后用表达丝氨酸重组酶的复制缺陷型腺病毒感染，该丝氨酸重组酶识别经修饰的AAV rep基因中的attP和attB位点。丝氨酸重组酶所催化的attP和attB位点之间的位点特异性重组剪接掉终止盒，从而产生包含由功能性内含子分隔的5′和3′rep编码序列的前体mRNA。然后遍在细胞机器(剪接体)切除该内含子，得到编码四种Rep蛋白的mRNA，从而允许以高滴度生产AVV。
含有经修饰的AAV rep基因、AAV cap基因和侧翼有ITR的转基因的稳定宿主细胞可通过用编码这些基因的一个或多个核酸分子转导细胞来获得。在一个实施方案中，通过以下方式获得稳定宿主细胞：用编码经修饰的AAV rep基因和AAV cap基因的第一核酸分子转导细胞以获得包含经修饰的AAV rep基因和AAV cap基因的第一宿主细胞，并且进一步用编码侧翼有ITR的转基因的第二核酸分子转导第一宿主细胞。在一个实施方案中，经修饰的AAV rep基因和AAV cap基因被稳定地整合到第一宿主细胞的染色体中。在另一个实施方案中，经修饰的AAV rep基因和AAV cap基因在第一宿主细胞中保持为游离型。侧翼有ITR的转基因也可被稳定地整合到宿主细胞中或保持为游离型。
在另一个实施方案中，通过用编码经修饰的AAV rep基因、AAV cap基因和侧翼有ITR的转基因的核酸分子转导细胞来获得稳定宿主细胞。经修饰的AAV rep基因、AAV cap基因和侧翼有ITR的转基因可被稳定地整合到宿主细胞中或保持为游离型。
可在用表达丝氨酸重组酶的腺病毒感染之前使稳定宿主细胞生长到高细胞密度。
根据本公开，可使用本领域已知的任何方法将表达本申请的丝氨酸重组酶的复制缺陷型腺病毒引入到稳定宿主细胞。在一个实施方案中，复制缺陷型腺病毒是重组ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5(Ad5)病毒，该病毒包含编码具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85％同一性、优选地具有与SEQ ID NO:2的100％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。例如，该腺病毒可包含具有与SEQ ID NO:3的至少85％同一性、优选地具有与SEQ ID NO:3的至少95％同一性的核苷酸序列。
如本文所公开，本公开还包括用于通过使本文所述的细胞与2氨基嘌呤(2-AP)接触来增加AAV产量的方法和组合物。在腺病毒生命周期的晚期，该病毒抑制宿主蛋白合成。这部分上是由于晚期腺病毒100千道尔顿(kDa)蛋白的作用，该蛋白使Mnk1激酶从cap起始复合物eIF4F移位，从而引起eIF4E的去磷酸化和cap依赖性mRNA翻译的抑制(参见例如Cuesta(2004)，J.Virology 78:7707-7716)。腺病毒晚期基因转录物在其5’端包含通过称为核糖体分流的机制来促进翻译的三联体前导序列(参见例如Yueh(2000)Genes Dev 14:414-421)。在AAV生产者细胞系的背景中，预测cap依赖性翻译的抑制将阻断AAV REP和CAP基因以及AAV复制和包装所需的早期腺病毒蛋白的表达。因此，在一些实施方案中，用阻断宿主蛋白翻译关闭的化学物质培养这些细胞以使用腺病毒诱导物提高AAV生产者细胞系的效率。
在某些实施方案中，阻断宿主蛋白翻译关闭的化学物质是2-氨基嘌呤(2-AP)。已证实2-AP会阻断腺病毒所诱导的宿主蛋白合成的关闭(参见例如Zhang和Schneider(1994)J.Virology 68:2544-2555；Huang和Schneider(1990)PNAS 87:7115-7119)。用2-AP处理产生AAV的细胞能够降低感染的致细胞病变效应，包括通常因迟发感染而降解的细胞角蛋白网络的恢复(Zhang和Schneider(1994)J.Virology 68:2544-2555)。2-AP在体外抑制多种激酶，包括RNA依赖性蛋白激酶PKR(也称为真核翻译起始因子2α激酶2，EIF2AK2)(DeBenedetti(1983)J Biol Che,258:14556-14562)，但不能够阻断细胞中的PKR激活以及在腺病毒感染后发生的eIF-2α的磷酸化(Huang和Schneider(1990)PNAS 87:7115-7119)。2-AP使早期腺病毒DNA结合蛋白(DBP)水平增加了10至20倍但不增加mRNA水平(Huang和Schneider(1990)PNAS 87:7115-7119)，这与对cap依赖性翻译的效应一致。
因此，在一些实施方案中，生产包含转基因的重组AAV的方法包括用2-氨基嘌呤培养本公开的细胞。在一些实施方案中，2-氨基嘌呤浓度小于约10mM。在一些实施方案中，2-氨基嘌呤浓度小于约5mM。在一些实施方案中，2-氨基嘌呤浓度小于约2.25mM。在一些实施方案中，2-氨基嘌呤浓度小于约1.25mM。在一些实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约1μM至约1.25mM。在一些实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约10μM至约1.25mM。在一些实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约100μM至约1.25mM。在一些实施方案中，2-氨基嘌呤浓度为约1.25mM。
在具体实施方案中，在用重组腺病毒感染后约24小时，使本公开的细胞与2-氨基嘌呤接触。在一些实施方案中，在用重组腺病毒感染后约20小时，使本公开的细胞与2-氨基嘌呤接触。在一些实施方案中，在用重组腺病毒感染后约12小时，使本公开的细胞与2-氨基嘌呤接触。在一些实施方案中，在用重组腺病毒感染后约30小时，使本公开的细胞与2-氨基嘌呤接触。在一些实施方案中，在用重组腺病毒感染后约36小时，使本公开的细胞与2-氨基嘌呤接触。在一些实施方案中，在用重组腺病毒感染后约48小时，使本公开的细胞与2-氨基嘌呤接触。
实施例
本专利申请的以下实施例将进一步说明本专利申请的性质。本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖在本发明实质和范围内的修改，如本说明书所定义。
材料
细胞：HEK293细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA)，目录号CRL-1573)；PEAK-rapid(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas，VA)，目录号CRL2828)。
组织培养基和试剂：OptiMEM培养基(Thermo-fisher，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham，MA)；目录号31985-062)；DMEM，高葡萄糖(Thermo-fisher，目录号10569-010)；DMEM，无酚红(Thermo-fisher；目录号A14430-01)；Hyclone透析型胎牛血清(Thermo-fisher；目录号SH30079.03)；96孔TC板(Corning，纽约州科宁(Corning NY)；目录号3596)；6孔组织培养板，透明(Corning目录号3516)；培养板96，不透明白色(PerkinElmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham，MA)；目录号6005680)；TrypLE Select细胞解离试剂(Thermo-fisher，目录号12563-011)；杜氏磷酸盐缓冲盐水，无钙，无镁，D-PBS(Thermo-fisher，目录号14190-144)；遗传霉素(G418)50mg/ml(Thermo-fisher，目录号10131-027)；来自白黑链霉菌的嘌呤霉素二盐酸盐(Sigma Aldrich P9620)；T150细胞培养瓶150mm2(Corning，目录号CLS430825)；GlutaMax 100x(Thermo-fisher，目录号35050-061)；未经组织培养处理的6孔培养板(Corning，目录号351146)；多层细胞培养瓶M容器(Corning，目录号10030)；DMEM中的2.5％ClonaCell甲基纤维素(不含L-谷氨酰胺并且含有葡萄糖、丙酮酸钠和碳酸氢钠)(StemCell Technologies，加拿大不列颠哥伦比亚温哥华(Vancouver，British Columbia，Canada)，目录号03899-DI)。
转染试剂：Fugene-HD转染试剂(Promega，威斯康星州麦迪逊(Madison WI)，目录号E2311)；Lipofectamine 3000转染试剂(Thermo-fisher目录号L3000008)；脱氧核苷酸(Millipore-Sigma，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO)，目录号D7295-2ML)。
管：15ml锥形管(Corning，目录号430053)；1.5ml螺帽管(Sarstedt AG&Co.KG，德国，目录号72.692.005)。
纯化试剂盒和测定试剂：质粒离心微量制备试剂盒(Qiagen，德国希尔登(Hilden，Germany)，目录号27106)；CHROMA SPINTM+TE-1000柱(Takara Bio USA，加利福尼亚州山景城(Mountainview CA)，目录号636079)；Dual-Glo荧光素酶测定系统(Promega，威斯康星州麦迪逊(Madison WI)，目录号E2940)；银染试剂盒(Thermo-fisher目录号24600)；配有Phase-maker管的Trizol Plus RNA纯化试剂盒(Thermo-fisher目录号A33254)；DNA去除试剂盒(Thermo-fisher目录号AM1906)；Nucleospin凝胶和PCR净化试剂盒(Takara Bio USA，目录号740609.5)。
酶：Spe I-HF(New England Biolabs，马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich，MA)，目录号R3133S)；来自牛胰腺的II级DNA酶I(Sigma-Aldrich，目录号10104159001)；NEXT UltraII Q5预混液(New England Biolabs，目录号M05445S)。
缓冲液和化学物质：
Figure BDA0003553663860000441
缓冲液(1X缓冲液组分：50mM乙酸钾、20mM Tris乙酸盐、10mM乙酸镁、100μg/ml BSA，25℃下pH 7.9)(New England Biolabs，目录号B7204S)；全能核酸酶(Benzonase Nuclease)(Sigma-Aldrich，目录号E1014-25K)；含有1.5mM MgCl2的10x GeneAmp PCR缓冲液I(Thermo-fisher目录号N8080006)；脱氧胆酸钠(Sigma-Aldrich，目录号D6750-25g)；1M TRIS-HCL PH8.5(Thermo-fisher，目录号T1085)；10xGeneAmp PCR缓冲液I(Thermo-Fisher目录号N8080006)[100mM Tris-HCl，pH 8.3(25℃下)；500mM KCl；15mM MgCl2；0.01％明胶，溶于经高压蒸汽灭菌、去离子、超滤的水中]；10％普朗尼克F-68(Thermo-Fisher目录号24040-032)；剪切鲑鱼精DNA(10mg/ml)(Thermo-Fisher目录号AM9680)；病毒稀释缓冲液(VDB)[1x GeneAmp PCR缓冲液I，2μg/ml剪切鲑鱼精DNA和0.05％普朗尼克F-68)；β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich，目录号M3148)；腺病毒制剂缓冲液(10mM Tris(pH 7.4)、1mM MgCl2、75mM NaCl、5％蔗糖、0.02％聚山梨酸酯80、0.1mMEDTA、10mM组氨酸、0.5％EtOH)；2-氨基嘌呤，硝酸盐(Sigma-Aldrich，目录号A2380)，在DMEM+2％FBS中溶解达到100mM。
RT-PCR试剂：SuperScript III第一链合成系统(Thermo-fisher目录号188080-051)；Q5热启动高保真2X预混液(New England Biolabs，目录号M0494S)；含溴化乙锭的1％TAE小型预制琼脂糖凝胶(Bio-RAD，目录号1613016)；Dark Reader蓝光透照仪(ClareChemicals，科罗拉多州多洛雷斯(Dolores，CO)，目录号DR46B)。
数字微滴PCR：2x探针超混合液(Bio-Rad目录号186-3026)；DG32AutoDG小柱(Bio-Rad目录号1864108)；PBS中的自动微滴发生器油(Bio-Rad目录号1864110)；微滴读取仪油(Bio-Rad目录号1863004)；Eppendorf twin.tec 96孔PCR板(目录号951020346)；自动化微滴发生器(Bio-Rad目录号186-4101)；QX200微滴读取仪(Bio-Rad目录号186-4003)；配有深孔反应模块的C1000Touch热循环仪(Bio-Rad目录号185-1197)。
PrimeTime qPCR测定：这些测定的20x储备液由正向和反向PCR引物(18μM)以及含有荧光猝灭剂ZEN和黑洞淬灭剂(Black Hole Quencher)1(3IABkFQ)及FAM或HEX荧光报告染料的5′核酸酶探针(5μM)组成。测定用试样由爱荷华州克拉尔维尔(Coralville IA)的Integrated DNA Technologies,Inc.合成。qPCR测定用的引物和探针序列如下：
mCherry：引物1(SEQ ID NO:36，5'-CTGTTCCACGATGGTGTAGTC-3')；引物2(SEQ IDNO:37，5'-TGAGGTCAAGACCACCTACA-3')；探针(SEQ ID NO:38，5’-FAM-TTGGACATC-ZEN-ACCTCCCACAACGAG-3IABkFQ-3’)；
腺病毒外显子2(Ad5E2)：引物1(SEQ ID NO:39，5'-GGGTGATGCAGTAGAAGGTAAG-3')；引物2(SEQ ID NO:40，5'-ATGAAGTTCGGCGGAGATG-3')；探针(SEQ ID NO:41，5’-HEX-TCTTGTTCC-Zen-CAGCGGTCCCATC-3IABkFQ-3’)；
P5(AAV的P5启动子区)：引物1(SEQ ID NO:42，5'-GTGGTCACGCTGGGTATTTA-3')；引物2(SEQ ID NO:43，5'-GGGACCTTAATCACAATCTCGT-3')；探针(SEQ ID NO:44，5’-FAM-TTTGAAGCG-ZEN-GGAGGTTTGAACGC-31ABkFQ-3’)；
AAV REP基因：引物1(SEQ ID NO:45，5'-GTCCGTGAGTGAAGCAGATATT-3')；引物2(SEQ ID NO:46，5'-TTCGATCAACTACGCAGACAG-3’)；探针(SEQ ID NO:47，5’-FAM-TCTGATGCT-ZEN-GTTTCCCTGCAGACA-3IABkFQ-3’)；
AAV9 CAP基因：引物1(SEQ ID NO:48，5'-CCGGGTCCAAGGTATTTGTAA-3')；引物2(SEQ ID NO:49，5’-CTCAACCCAAGGCAAATCAAC-3')；探针(SEQ ID NO:50，5’-FAM-ACATCAAGA-ZEN-CAACGCTCGAGGTCT-3IABkFQ-3’)；以及
β内酰胺酶(氨苄青霉素抗性)基因：引物1(SEQ ID NO:51，5'-CCAGAAACGCTGGTGAAAGTA-3’)；引物2(SEQ ID NO:52，5'-CTCAAGGATCTTACCGCTGTTG-3’)；探针(SEQ ID NO:53，5’-FAM-TGCACGAGT-ZEN-GGGTTACATCGAACT-3IABkFQ-3’)。
PAGE电泳：4x NuPAGE LDS样品缓冲液(Thermo-Fisher，目录号NP0007)；1x MOPS运行缓冲液中的4％至12％Bis-Tris PAGE凝胶(Thermo-Fisher，目录号NP0322PK2)；20xNuPAGE MOPS SDS运行缓冲液(Thermo-Fisher，目录号NP0001)。
AAV纯化缓冲液和用品：0.2μm PES膜滤器(Thermo-Fisher目录号567-0020)；0.5×5cm POROS GoPure色谱柱，用POROS CaptureSelect AAVX树脂预充填(Thermo-fisher目录号A36652)；Amicon 15 100kDa MWCO过滤器(Millipore-Sigma目录号UFC910024)；CIMQA Disk0.34ml体积(BIA Separations，斯洛文尼亚(Slovenia))；缓冲液A(20mM TrispH7.5，400mM NaCl)；缓冲液B(25mM Tris pH7.5，40mM NaCl和1.5mM MgCl2)；缓冲液C(20mM柠檬酸钠pH 2.5，400mM NaCl)；缓冲液D(100mM柠檬酸钠，10mM Tris，pH 8.0)；缓冲液E(20mM BTP pH10.0，0.001％普朗尼克F68，10mM NaCl)；缓冲液F(20mM Bis-TRIS丙烷pH10.0，0.001％普朗尼克F68，400mM NaCl)；Bis-TRIS丙烷(BTP)(Millipore Sigma目录号B4679)。
其他设备：AKTA Explorer FPLC系统(GE Healthcare Life Sciences，马萨诸塞州马尔伯勒(Marlborough，MA))；AKTA纯化器系统(GE Healthcare Life Sciences)；Envision多标记读板仪型号2104(PerkinElmer，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham，MA))。
SR21重组酶的鉴定和重组表达
使用NCBI处的非冗余蛋白数据库的BLAST搜索并以SPBeta c2整合酶蛋白(待查序列，SEQ ID NO:1)作为待查序列，在沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)菌株CCMA-560的基因组中鉴定了推定丝氨酸重组酶(目标序列，SEQ ID NO:2)，其在蛋白水平上具有64％序列同一性(图1)。该推定丝氨酸重组酶或整合酶是推定原噬菌体插入片段的一部分。该重组酶被命名为SR21(丝氨酸重组酶21)。编码SR21的DNA序列示出在SEQ ID No:3中。
通过使用来自重组酶编码区的3’端及以后的CCMA-560DNA序列作为待查序列(SEQID NO:58)进行NCBI处的序列数据库的BLAST搜索来鉴定与不含原噬菌体插入片段的CCMA-560密切相关的细菌菌株(“Fairview”菌株)(图2)。与CCMA-560中的推定原噬菌体插入位点的上游和下游序列相对应的Fairview菌株的DNA序列在本文中称为“预插入序列”并且示出在SEQ ID NO:4中。使用该序列(SEQ ID NO:4)作为待查序列对CCMA-560菌株的基因组序列进行BLAST分析，由此鉴定了在上游94kb处的其他原噬菌体-宿主DNA接头。沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)菌株CCMA-560的右和左原噬菌体-宿主DNA接头的序列分别示出在SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中。
分别由这些宿主DNA接头(SEQ ID NO:5)和(SEQ ID NO:6)通过以下方式重建SR21重组酶attP和attB序列：交换中心相同区域(“ACTGACAAAGCGGT”)(SEQ ID NO:54)上游的序列并且挑选中心二核苷酸和使对偶对称最大化的att位点边界：attP(SEQ ID NO:7)；attB-CCMA-560(SEQ ID NO:8)。来源于沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)的Fairview菌株的宿主DNA接头(SEQ ID NO:4)的attB序列(SEQ ID NO:9)含有相对于来自菌株CCMA-560的重建attB序列(SEQ ID NO:8)的两个错配。图3示出了attP与这两个替代attB序列的比对，突出显示了对偶对称的位置。
测量哺乳动物细胞中的重组酶活性
通过基因合成(GENEWIZ，新泽西州普兰菲尔德(Plainfield，NJ))构建载体(P175)(SEQ ID NO:10)以在CMV启动子的控制下并在后跟SV40多聚腺苷酸化信号的情况下在哺乳动物细胞中表达SR21重组酶。SR21重组酶开放阅读框与SEQ ID NO:3相同，只是细菌翻译起始密码子“TTG”被替换为“ATG”，并且引入了三个点突变以破坏限制性内切核酸酶识别位点。开放阅读框的这些变化不会引起所编码的SR21重组酶氨基酸序列的任何变化。
还通过基因合成(GENEWIZ，新泽西州普兰菲尔德(Plainfield，NJ))构建重组酶报告子质粒(P41)(SEQ ID NO:11；图4)。其编码由EF1α启动子驱动的组成性表达的绿色荧光蛋白(GFP)-自切割F2A-海肾荧光素酶(rLUC)融合蛋白。其还编码重组酶激活的mCherry-自切割P2A-萤火虫荧光素酶(fLUC)报告基因，该报告基因侧翼有相对于CMV启动子处于反义取向的SR21 attP(SEQ ID NO:7)和attB(SEQ ID NO:9)信号。当SR21重组酶使attP和attB信号重组时，编码区倒位成正义取向并且表达mCherry-P2A-fLUC蛋白(参见图4)。
为了测量人类细胞中的SR21重组酶活性，将75,000个HEK293细胞接种到96孔组织培养板的每孔中的100μl高葡萄糖DMEM+10％胎牛血清中。将重组酶报告子质粒(P041)±SR21重组酶表达质粒(P175)+脱氧核苷酸(以使DNA量归一化)与OptiMEM培养基中的Fugene-HD转染试剂在室温下复合15分钟(如表1所示)并且转染到所接种的细胞的三个重复孔中。将板在37℃下温育48小时。
表1.转染条件
Figure BDA0003553663860000481
使用得自Promega的Dual Glo测定试剂盒在转染的孔中顺序地测定萤火虫荧光素酶(fLUC)和海肾荧光素酶(rLUC)。从细胞培养板的转染的孔中去除培养基并且添加100μlDMEM培养基(不含酚红)与Dual Glo荧光素酶+fLUC底物的1:1混合物。将板在室温下温育10分钟。将裂解物转移到不透明白色96孔板。使用Envision多标记读板仪测量fLUC活性。接下来，添加每孔50μl的Stop-and-Glo缓冲液+海肾底物并且在轻轻摇晃下温育该板10分钟。在相同Envision读板仪上读取海肾荧光素酶信号。
结果：与改为与脱氧核苷酸共转染时相比，在与重组酶表达质粒共转染时重组酶报告子产生多1535倍的萤火虫荧光素酶(表2)。该差异无法通过不同转染效率来解释，因为海肾荧光素酶(rLUC)活性在单独报告子转染中高5倍。该数据表明SR21重组酶在人类细胞中有很高活性并且该结果代表三个独立实验。
表2.HEK293细胞中的重组酶活性
样品 说明 fLUC rLUC fLUC活性的增加倍数
1 单独报告子 4.3E03±1.2E03 1.4E07±2.6E06
2 报告子+重组酶 6.6E06±3.9E05 3.4E06±1.6E05 1535
构建REP/CAP+转基因质粒
如果AAV复制(REP)和衣壳(CAP)基因可被稳定地整合并且随后被诱导而在高密度培养中产生AAV，则有可能在哺乳动物细胞中大规模生产AAV。然而，REP蛋白的表达有毒，从而使得难以在表达REP基因的宿主(诸如表达腺病毒E1基因的那些，诸如HEK293细胞)中形成稳定细胞系。野生型AAV使用重叠阅读框编码四种Rep蛋白，这四种Rep蛋白因使用两种启动子和选择性剪接而产生。从而，使用诱导型启动子控制REP表达并不是直截了当的。先前工作证实“终止盒”插入到人工内含子内的REP编码区中允许在HEK293细胞中生成稳定细胞系(Qiao等人，(2002)J.Virol.76:13015；Yuan等人，(2011)Hum Gene Therap.22:613-624)。使用腺病毒感染所递送的Cre重组酶切除终止盒恢复了REP表达并且引发了侧翼有ITR的转基因的AAV复制。在该示例中，构建了在包含侧翼有ITR的转基因的质粒中的REP/CAP表达盒背景中的重组酶激活的REP基因的改进型式。
使用AAV2 REP基因(人AAV2的bp 190-2202，NC_001401.2)，后跟AAV9 CAP开放阅读框(AY530579.1)、AAV2多聚腺苷酸化信号(bp4411-4466，NC_001401.2)和AAV2 REP P5启动子的第二拷贝(bp 190-313，NC_001401.2)构建了AAV REP/CAP9表达盒(SEQ ID NO:13)。
使用剪接位点预测软件(www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/处的NetGene2；Brunak,S.、Engelbrecht,J.和Knudsen,S.：Prediction of Human mRNA Donor andAcceptor Sites from the DNA Sequence，Journal of Molecular Biology，1991，220，49-65)挑选合适的位置将来自人β-肌动蛋白基因的内含子插入到REP编码区中。将内含子插入在AAV2的核苷酸编号1052的下游(NC_001401.2)并处于所有四种REP转录物共同的区域中。内含子和插入位置与Qiao等人，(2002)J.Virol.76:13015所使用的不同。随后将终止盒(下文)插入在该β-肌动蛋白内含子的上游半部和下游半部(分别为SEQ ID 14和15)之间。
终止盒
转录终止盒(SEQ ID NO:16)由以下元件构成：
·SR21 attP(SEQ ID NO:7)
·强剪接受体(SEQ ID NO:17)(NC_000086.7，来自小鼠HPRT基因的核苷酸53001998至53002138，加上来自人刺鼠信号蛋白的29nt区域(NC_000020.11，核苷酸34262765至34262793)。包含该元件是为了防止终止盒从初级mRNA转录物剪接掉。
·新霉素磷酸转移酶表达盒(SEQ ID NO:18)由哺乳动物启动子(小鼠磷酸甘油酸激酶1)和细菌(Lac zya)启动子驱动并且后跟来自SV40的多聚腺苷酸化信号。该基因分别赋予哺乳动物细胞和细菌细胞中对新霉素和卡那霉素的抗性。
·来自人β-珠蛋白基因并在多聚腺苷酸化信号下游的序列编码对于有效转录终止很重要的自切割RNA基序(Teixeira等人，(2004)Nature 432:526-30；SEQ ID No:19)。
·SR21 attB(SEQ ID NO:8)。
AAV转基因
在P439载体(SEQ ID NO:12)中AAV REP/CAP区的下游编码侧翼有AAV末端反向重复(ITR)的转基因。130bp ITR(SEQ ID NO:20)来源于3’AAV2 ITR(核苷酸4535至4664，NC_001401.2)并且插入在HPRT-E2A-mCherry转基因的上游和该转基因的3’反方向。
该转基因由人EF1-α启动子(包含外显子1、内含子1及外显子2的一部分)(SEQ IDNO:21)、编码mCherry-自剪接E2A接头–人HPRT融合基因的序列(SEQ ID NO:22)和来自单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的多聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:23)组成。
绝缘子
REP/CAP和ITR-转基因元件侧翼有阻断基因表达的染色质相关阻遏的基因组元件(Kwaks等人，(2003)Nature Biotechnology 21:554-558；Kwaks等人，(2003)NatureBiotechnology 21:822)：人抗阻遏子元件40(AY190756.1，SEQ ID NO:24)和小鼠抗阻遏子元件40(SEQ ID NO:25)。
质粒骨架
质粒骨架包含以下元件：
·由疱疹病毒胸苷激酶基因启动子(SEQ ID NO:26)、嘌呤霉素N-乙酰转移酶编码区(SEQ ID NO:27)和来自牛生长激素基因的多聚腺苷酸化信号(SEQ ID NO:28)构建的哺乳动物嘌呤霉素抗性基因盒。
·EB病毒(EBV)OriP复制起点片段(SEQ ID NO:29)，该片段表示EBV的“对偶对称”区和“重复家族”区的复合体
·编码质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因的pUC57载体序列(SEQ ID NO:30)。
完整质粒P439的序列在SEQ ID NO:12中给出。
SR21重组酶去除终止盒的测试效率
为了在人类细胞中测试SR21重组酶是否可精确去除终止盒，根据制造商的说明使用Lipofectamine 3000将载体P439(SEQ ID NO:12)和SR21重组酶表达载体P175(SEQ IDNO:10)共转染到PEAK-Rapid细胞中，并且在含有DMEM和10％FBS的培养基中在5％CO2和37℃下培养三天。去除培养基，用D-PBS洗涤细胞一次，然后将细胞与TrypLE一起在37℃下温育5分钟。将细胞转移到无菌微量离心管，通过离心沉淀，用1ml D-PBS洗涤一次，并且再次沉淀。使用被设计用于从细菌分离质粒的Qiagen离心微量制备试剂盒通过碱裂解来回收游离型质粒。
为了破坏未重组的质粒DNA，将回收的DNA的等分试样用1xCutSmart缓冲液中的酶Spe I-HF在37℃下消化1小时并在80℃下消化20分钟。使用NEXT Ultra II Q5预混液在以下循环条件下用引物P349F3(SEQ ID NO:32)和P349R9(SEQ ID NO:33)对回收的DNA进行PCR扩增：98℃1min；35x(98℃10s，72℃10s)；5min 72℃。在1％琼脂糖凝胶上进行电泳时观察到预测大小的单种PCR产物。通过使用CHROMA SPINTM+TE-1000柱进行尺寸排阻色谱法来纯化PCR产物。使用用于PCR的相同引物对PCR产物进行测序(GeneWiz)。所得序列(SEQ IDNO:34)表明SR21重组酶已通过使attP(SEQ ID NO:7)和attB(SEQ ID NO:8)序列重组而从质粒P439精确地去除终止盒，从而产生attL重组的序列(SEQ ID NO:35)。
表达SR21重组酶的重组腺病毒血清型5的构建
在Batavia Biosciences(荷兰莱顿(Leiden，the Netherlands))处通过PER.C6细胞中的同源重组规程生成了重组ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5(Ad5)病毒(Fallaux等人，(1998)Hum Gene Ther.9:1909-1917)，这正如先前针对E1缺失的载体的产生所描述的(Havenga等人，(2001)J.Virol 75:3335-3342)，不同的是使用缺少E3区的经修饰的粘粒(pWE/Ad5.AflII-rITRsp.ΔE3，专利US6340595B1)。该粘粒和质粒P321(SEQ ID NO:31)在PER.C6细胞中共表达，该质粒包含：从1至454的Ad5序列(左ITR和包装信号)、含有巨细胞病毒(CMV)启动子(nt–672至+15)、SR21重组酶编码区、猿猴病毒40(SV40)多聚腺苷酸化信号(NC_001669.1，nt 2550至2774)的转基因表达盒以及在nt 3511至6095范围内的第二Ad5序列。PER.C6细胞中P321 Ad5序列(nt 3511-6095)与粘粒pWE/Ad5.AflII-rITRsp.ΔE3之间的同源重组产生重组腺病毒。通过两步CsCl梯度分带规程来获得经纯化的病毒原液，并且将分离的病毒原液透析到腺病毒制剂缓冲液(10mM Tris(pH 7.4)、1mM MgCl2、75mM NaCl、5％蔗糖、0.02％聚山梨酸酯80、0.1mM EDTA、10mM组氨酸、0.5％EtOH)中。
稳定细胞系生成
根据制造商的说明使用Lipofectamine 3000将质粒P439(SEQ ID NO:12)转染到贴壁PEAK-RAPID细胞中，并且在T25瓶中的DMEM+10％FBS+0.05mg/ml遗传霉素中在37℃下培养。24小时后，将细胞用TrypLE处理并且转移到含有DMEM+10％FBS+0.05mg/ml遗传霉素+0.5μg/ml嘌呤霉素的T75瓶中。每周按1:10将细胞分到相同培养基中并持续连续两周。在转染后第三周，每周按1:10将细胞分到含有DMEM+10％FBS+0.05mg/ml遗传霉素+5.0μg/ml嘌呤霉素的培养基中并持续三周。
通过以下方式制备单细胞克隆：将细胞稀释到DMEM+30％FBS+1xGlutaMax+5μg/ml嘌呤霉素+0.05mg/ml遗传霉素中的1％ClonaCell甲基纤维素中，接种到未经组织培养处理的6孔板中，并且在37℃下培养三周。使用移液器，将克隆从甲基纤维素板转移到含有DMEM+10％FBS+0.05mg/ml遗传霉素+5.0μg/ml嘌呤霉素的经TC处理的96孔板中。通过标准方法使克隆在相同培养基中扩增。
筛选克隆
为了筛选用于AAV生产的克隆，将细胞分两份接种到96孔板中的100μl DMEM+10％FBS中并且在37℃下温育过夜。将SR21腺病毒在无血清DMEM中稀释到每ml 1E8个病毒基因组。将来自接种的细胞的培养基更换为100μl稀释的腺病毒并且将板在37℃下温育四天。通过添加10μl的以下混合物来裂解细胞：PBS中的5％脱氧胆酸盐+10单位全能核酸酶。将板在37℃下温育2小时。以3000rpm将板离心5分钟以使细胞碎片沉淀，并且通过数字微滴PCR(ddPCR)来定量上清液中的AAV病毒。
数字微滴PCR(ddPCR)
ddPCR定量基于Lock等人，(2014)Human Gene Therapy methods 23:115-125所描述的方法。将2μl裂解物在热循环仪中的96孔板中含有1xPCR缓冲液+20mM Tris pH 8.5+8单位DNA酶I的20μl反应液中在37℃下进行1小时DNA酶消化。用98μl病毒稀释缓冲液(VDB)稀释2μl的DNA酶消化样品，并且将2μl的该稀释液添加到含有1x PCR超混合液+mCherry转基因的1xPCR引物/探针(参见材料部分)的ddPCR反应液中。使用Bio-Rad自动化微滴制备仪形成ddPCR微滴。PCR循环如下：95℃10min；42x(94℃30s，60℃1min，72℃15s，所有三者均采用每秒2℃的循环时间)；98℃10min；4℃保持。按照制造商的说明在Bio-Rad微滴读取仪上检测FAM荧光。对产生被检测为FAM-荧光阳性微滴的最高DNA酶抗性颗粒的克隆进行扩增并进一步筛选。
筛选克隆-第二测定
将待筛选的克隆的1.25E6个细胞接种到6孔板的单个孔中的3ml DMEM+10％FBS中并且在37℃下温育2天。将生长培养基更换为3ml含有5E8个Ad5-SR21病毒颗粒的DMEM+10％FBS。使板恢复到37℃以温育3天。将细胞和培养基转移到15ml管中并且进行3次冻融循环(干冰/37℃温育)，之后以3000rpm离心5分钟以使细胞碎片沉淀。使用如上所述的mCherry测定对2μl的每种样品进行DNA酶消化和ddPCR定量。P439C4细胞在用Ad5-SR21病毒感染时产生最多AAV并且选择这些细胞以进行进一步表征(表3)。
表3.筛选测定中的AAV产量
克隆编号 总AAV(DNA酶抗性颗粒)
克隆1 4.4E+08±7.6E+07
克隆3 2.5E+09±3.4E+08
克隆4 4.4E+09±5.6E+07
克隆5 1.8E+09±1.9E+08
克隆12 7.5E+08±9.8E+07
克隆18 1.6E+08±2.6E+07
克隆20 9.8E+07±1.4E+07
克隆25 1.2E+09±6.4E+07
克隆28 1.3E+08±1.2E+07
克隆32 1.5E+09±1.3E+08
克隆36 2.8E+08±3.0E+07
克隆41 1.0E+09±8.9E+07
时程实验
进行新的实验以确定在两种不同生长温度下AAV在培养基中产生和分泌的动力学。将2ml非酶离解溶液添加到T150瓶中经PBS洗涤的P439-C4细胞单层，并且将该瓶在37℃下温育5分钟。用8ml的DMEM+10％FBS对瓶进行洗涤并且将细胞转移到50ml离心管。将细胞以1500rpm离心5分钟并且将沉淀物重悬于DMEM+2％FBS中。将细胞在相同培养基中稀释到每ml 1.25E6个细胞。将4ml细胞接种到四个6孔板的每个孔中。将DMEM+2％FBS中的1ml(2E8个病毒颗粒)Ad5-CMV-SR21腺病毒添加到孔中。将两个板在37℃下温育并且将两个板在5％CO2和32℃下温育。每天(共8天)使用细胞刮刀刮下附着的细胞，从而回收细胞和培养基，并且将样品转移到15ml锥形管。将管以3000rpm离心5分钟，并且将等分试样转移到1.5ml螺帽管并在-20℃下冷冻直至ddPCR测定。
如上所述的那样将样品分两份进行DNA酶处理，并且将每种经DNA酶处理的样品在VDB中进行三次连续稀释。在含有1x PCR预混液+1xmCherry-FAM测定+1x Ad5E2-HEX测定(参见材料部分)的ddPCR反应液中对样品进行定量。如上所述的那样执行ddPCR。
结果：
细胞培养基中的腺病毒和AAV在8天时程内增加(表4)。腺病毒复制在32℃下更慢而引起更高AAV产量，这可能是由于延迟的腺病毒致细胞病变效应。32℃下的AAV产量超过14,000个基因组拷贝/细胞。
表4 8天时程内的AAV和腺病毒产量
Figure BDA0003553663860000551
多层细胞培养瓶培养
将8.3E07个P439C4细胞接种到两个多层细胞培养瓶M容器中的550ml DMEM+10％FBS+0.5μg/mL嘌呤霉素、+50.0μg/mL G418中并且在37℃下温育3天。估计3天生长后的密度为每瓶3.6E8个细胞。通过以下方式以40MOI(1.4E10个病毒颗粒)或20MOI(7.2E09个病毒颗粒)感染瓶：在550ml的DMEM+10％FBS中稀释病毒并且将多层细胞培养瓶中的培养基更换为稀释的病毒。将细胞在5％CO2和32℃下温育7天。7天后从感染物收集上清液并且通过穿过0.2μm PES膜滤器来净化上清液。
AAVX纯化
将0.5×5cm POROS GoPure色谱柱(用POROS CaptureSelect AAVX树脂预充填到1mL床体积，附接到AKTA Explorer FPLC系统)用3ml/min流速的10个柱体积(CV)缓冲液A(20mM Tris pH7.5，400mM NaCl)平衡。以4.5mL/min的流速加载病毒悬液，然后加载10mL的缓冲液A以洗去未结合的样品。通过以下方式执行柱上DNA消化：用5ml的低盐全能核酸酶缓冲液，即缓冲液B(25mM Tris pH7.5，40mM NaCl和1.5mM MgCl2)平衡该柱，然后向该柱加载含有250单位/ml全能核酸酶的15ml缓冲液B。然后将柱在室温下温育30分钟，之后用缓冲液A进行15个柱体积洗涤。用15个柱体积缓冲液C(20mM柠檬酸钠pH 2.5，400mM NaCl)洗脱病毒，得到0.5mL级分，立即用25μL的500mM Bis-TRIS丙烷pH 10.0中和这些级分。观察到单峰洗脱。将该曲线下的所有级分合并，使用Amicon 15 100kDa MWCO(目录号UFC910024，Fisher)进行浓缩，并且通过三轮缓冲液添加/离心将缓冲液更换成缓冲液D(100mM柠檬酸钠，10mM Tris，pH 8.0)。对更换了缓冲液并浓缩的亲和色谱产物进行阴离子交换色谱以进一步从空衣壳中纯化AAV。
离子交换色谱
将亲和色谱产物(病毒悬液)在缓冲液E(20mM BTP pH10.0，0.001％普朗尼克F68，10mM NaCl)中稀释到45mL，并且在AKTA纯化器系统(GE Healthcare Life Sciences)上以2ml/min的流速加载到CIM QA Disk(BIA Separations，0.34ml体积)上。用10个柱体积的无菌过滤缓冲液E(20mM BTP pH10.0，0.001％普朗尼克F68，10mM NaCl)洗涤柱。以从100％缓冲液E到100％缓冲液F(20mM Bis-TRIS丙烷pH 10.0，0.001％普朗尼克F68，400mM NaCl)梯度的60个柱体积洗脱病毒，收集到0.5mL级分。将该曲线下的所有级分合并并使用Amicon15 100kDa MWCO(目录号：UFC910024，Fisher)通过2000×g下的5min离心来浓缩，并且将缓冲液更换成缓冲液D(100mM柠檬酸钠，10mM Tris，pH 8.0)。
蛋白显色
将2μL的浓缩洗脱液在补充有5％β-巯基乙醇的NuPage LDS样品缓冲液(4x)中进行热变性(95℃持续10min)并且在4％至12％Bis-Tris PAGE凝胶上在1x MOPS运行缓冲液中进行电泳。根据制造商的说明对凝胶进行银染。
ddPCR
使用如上所述的mCherry测定通过数字微滴PCR来测量病毒浓度。
结果
P439C4细胞在多层细胞培养瓶容器中的感染和生长在以20和40MOI感染时分别产生1.9E13和7.0E13个基因组拷贝(GC)。对于20和40MOI感染而言，这分别对应于5.2E4和1.9E5个GC/细胞。通过PAGE电泳和银染来检查病毒样品的纯度。仅与这三种AAV9衣壳同种型(VP1、VP2和VP3)的预期大小相对应的三个泳带可见(图5)。衣壳蛋白(VP1(87kDa)、VP2(72kDa)和VP3(62kDa))以大约1:1:10的预期化学计量存在，如先前针对其他重组AAV载体所报道的(Daya和Berns(2008)Clin Microbiol Rev.21:583–593)。
测量错误包装的DNA的水平
编码AAV REP或CAP基因的序列以及来源于在生产期间使用的质粒载体的原核序列可非特异性地包装到AAV颗粒中并且在用于基因治疗时代表着潜在安全风险(参见例如Schnodt和Buning，Hum Gene Ther Methods.，2017；28(3):101-108)。风险包括通过同源重组生成有复制能力的AAV，衣壳基因表达引发细胞毒性T淋巴细胞反应，以及免疫系统识别原核序列而导致炎症反应和/或基因沉默。已在通过三重转染产生的经纯化的重组AAV制剂中或所产生的细胞系中分别报道了2％、0.4％至1.0％和1.3％至6.3％的衣壳化rep、cap和原核序列(Nony等人，(2003)J.Virology 77:776-781；Gao等人，(2008)Molecular Therapy16:S105；Chaudeuf等人，(2005)Molecular therapy 12:744-753)。
为了确定与上述生产者系统相关的错误包装水平，通过ddPCR确定转染的载体中(在侧翼有ITR的转基因之外)的四个序列的丰度：a)P5启动子；b)AAV REP基因；c)AAV9 CAP基因；以及d)β-内酰胺酶(氨苄青霉素抗性)基因。将来自先前所述的20和40MOI多层细胞培养瓶培养物的经纯化的病毒制剂分三份进行DNA酶消化，在VDB中连续稀释，然后进行ddPCR。含有这些序列的病毒颗粒的浓度被表示为含有mCherry转基因的AAV颗粒的百分比(表5)。病毒A制剂(用20MOI感染性重组腺病毒产生)中的P5启动子具有0.04％的最高衣壳化率。然而，AAV产量高得多的制剂B(40MOI)中的P5衣壳化率仅为0.007％。REP、CAP和氨苄青霉素基因序列相同或更低。CAP水平为0.007％至0.009％，这低于先前针对为血友病B基因治疗试验产生的重组AAV2的四个临床批次所报道的0.016％至0.021％cap衣壳化率(Hauck等人，(2009)Molecular Therapy17:144-152)。因此，此处所述的用于产生和纯化重组AAV的方法得到与临床基因治疗计划的要求相符的极低比率的错误包装的DNA。
表5.包装在经纯化的病毒中的非转基因序列的丰度
Figure BDA0003553663860000581
示出了四个探针相对于含有mCherry转基因的颗粒而言的DNA酶抗性颗粒的平均百分比±标准偏差以用于分析两种AAV载体制剂。
终止盒切除后的REP基因的RNA剪接的RT-PCR分析
为了确定插入到构建体P439中的REP基因中的内含子是否在切除终止盒时被准确地剪接，进行RT-PCR实验。
通过离心使来自PEAK-RAPID细胞中的P439稳定池的一千万细胞沉淀并且重悬于15ml的DMEM+2％FBS+1E9个Ad5-CMV-SR21病毒颗粒中。将细胞接种到T75瓶中并且在37℃下温育四十八小时。使用细胞刮刀分离细胞。将培养基和细胞转移到15ml离心管并且以1500rpm离心10分钟以使细胞沉淀。使用配有Phase-maker管的Trizol Plus RNA纯化试剂盒从细胞沉淀物中纯化RNA。
为了去除任何污染性DNA，用来自DNA去除试剂盒的1μl DNA酶在1x消化缓冲液中在37℃下处理31μg的RNA 30分钟。添加5μl的DNA酶失活浆液并且在2分钟温育期间翻转样品若干次。将RNA样品以10,000×g离心5分钟并且将RNA转移到新的无菌管。
用SuperScript III第一链合成系统逆转录该RNA。将80μg RNA、1μl50μM Oligo-DT和1μl 10mM dNTPS混合于无菌管中并且在65℃下温育5分钟并在冰上温育2分钟。添加10μl的2x混合物(2x RT缓冲液，10mM MgCl2，20mM二硫苏糖醇，0.5μl RNA酶抑制剂(RNAse-out)和0.5μl逆转录酶)。除了逆转录酶被更换为水之外，模拟RT反应液相同。将反应液在50℃下温育50分钟并且在冰上温育2分钟。添加1μl RNA酶H并且将样品在37℃下温育20分钟。
50μl PCR反应液包含1μl逆转录RNA、25μl Q5热启动高保真2X预混液和0.5μM的两种引物。按如下方式对反应液进行热循环：
98℃1min；35个循环(98℃10s，69℃10s，72℃36s)；5min 72℃。
在1％琼脂糖凝胶上在1xTAE缓冲液和溴化乙锭中离析5μl反应液。在Dark Reader透照仪的蓝光照明下使泳带可视化。使用Nucleospin凝胶和PCR净化试剂盒从切下的泳带回收DNA。在GeneWiz(新泽西州南普兰菲尔德(South Plainfield，NJ))处使用PCR引物利用循环测序和染料终止剂化学物质对DNA进行测序。
结果：
来自模拟-RT模板的PCR反应液未产生可检测产物，这指示已从RNA样品去除了基因组DNA。使用引物AAVRT-F1(SEQ ID NO:62)和P349R9(SEQ ID NO:63)的PCR产生了类似荧光强度的两种PCR产物，这两种PCR产物来源于在已从P439切除终止盒之后剪接的转录物。一种产物是因工程化β-肌动蛋白剪接供体和受体位点(分别为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15；图8)处的剪接而产生的。第二产物是因5’REP基因中的供体位点(SEQ ID NO:64)与下游β-肌动蛋白受体之间的剪接而产生的(图8)。预测该剪接事件将相对于野生型AAV2去除REP编码序列的64bp，从而形成移码并且产生截短的REP蛋白。这表明使该上游剪接供体位点突变可增加活性REP蛋白的丰度并且使AAV生产更高效。
更新AAV构建体：P600(SEQ ID NO:70)
对质粒P439(SEQ ID NO:12)进行若干改变，从而得到构建体P600(SEQ ID NO:70)。首先，使终止盒上游的REP基因的剪接供体位点突变。简而言之，使5’REP序列中鉴定的剪接供体位点(SEQ ID NO:64)的核苷酸GT突变为AT(SEQ ID NO:65)。预测该突变将消除该位点处的剪接而不改变REP蛋白序列。
为了在终止盒切除后降低REP/CAP基因可包装进AAV衣壳中的可能性，设计了2kb随机序列(SEQ ID NO:66)并且将其插入在attB序列的下游和肌动蛋白剪接受体的上游以增加工程化内含子的大小。使用NetGene 2软件(上文所引用)鉴定潜在剪接位点并且将这些潜在剪接位点去除。该插入将REP/CAP基因的大小从4.3kb增加到6.4kb，这远高于5.0kbAAV包装极限。
基于与AAV ITR相邻的序列也可在转基因拯救期间从基因组扩增并且可能被错误包装进AAV衣壳中的假设(参见例如Schnodt和Buning，Hum Gene Ther Methods.，2017；28(3):101-108)，设计了两个随机2kb非编码间隔元件以位于转基因的侧翼，从而降低错误包装的DNA的潜在影响。一个元件(SEQ ID NO:67)插入在左AAV ITR的上游并且第二元件(SEQID NO:68)替换右AAV ITR的下游的小鼠抗阻遏子元件40(SEQ ID NO:25)。
另外，cap基因是AAV9变体(参见例如Hinderer等人，Hum Gene Ther.2018；29(3):285-298)。
最后，P439中侧翼有ITR的转基因的编码序列被替换为编码mCherry-IRES-SEAP(分泌型碱性磷酸酶)蛋白的SEQ ID NO:69。
所得构建体P600的完整序列在SEQ ID NO:70中公开并且质粒的图示在图9中示出。
从稳定池中的P600生产AAV
基本上如上文针对P439细胞所述的那样，将构建体P600转染到Peak-RAPID细胞中并且通过用0.5μg/ml嘌呤霉素选择来生成稳定池。在测定AAV产量之前将细胞以1:10传代6周。
将2.5E6个P600-PEAK-Rapid p6细胞接种到三个T25瓶中的5ml DMEM+10％FBS中并且在37℃下温育三天。在这些瓶之一中确定感染当天的细胞密度为6.6E6个活细胞，在该瓶中用TrypLE回收细胞并且使用台盼蓝拒染对细胞进行染色。将剩余两瓶中的培养基更换为11ml含有2.6E8个Ad5-CMV-SR21病毒颗粒的DMEM+2％FBS。将这些瓶在32℃下温育24小时。向一瓶中添加1ml在DMEM+2％FBS中的1.25mM 2-氨基嘌呤。向另一瓶添加1ml的DMEM+2％FBS，并且将这两瓶在32℃下再温育7天。从这些瓶回收培养基，以3,000rpm离心5分钟以使细胞和碎片沉淀。使用如上所述的mCherry测定对2μl的每种样品上清液进行DNA酶消化和ddPCR定量。
AAV产量水平示于表6中。P600稳定池在用Ad5-CMV-SR21感染时主动产生AAV。AAV病毒产量在存在2-氨基嘌呤的情况下增加2.5倍，2-氨基嘌呤是一种据报道会阻断CAP依赖性mRNA翻译的腺病毒诱导抑制的药物(参见例如Zhang和Schneider(1994)J.Virology 68:2544-2555；以及Huang和Schneider(1990)PNAS 87:7115-7119)。虽然已报道感染后1至2小时的10mM 2-AP处理阻断了腺病毒感染的致细胞病变效应并且在至少三天内是无毒的(参见例如Zhang和Schneider(1994)J.Virology 68:2544-2555；以及Huang和Schneider(1990)PNAS 87:7115-7119)，但我们发现高于1.25mM的浓度以及比24小时更早的添加对于我们AAV生产者细胞系统中的AAV生产具有抑制性。这些数据表明抑制晚期腺病毒基因程序，尤其是cap依赖性mRNA翻译的关闭，是增加生产者细胞系中的AAV产量的有用策略。
表6.
Figure BDA0003553663860000611
在人类细胞中制造重组腺相关病毒(AAV)需要表达AAV复制(REP)和衣壳(CAP)基因、腺病毒基因以及由侧翼有AAV末端反向重复(ITR)的表达盒组成的AAV可包装转基因。可将所有三种组分置于用于AAV生产的单独质粒上递送到细胞中，但现有转染方法难以放大到大规模培养。将这些元件中的一些元件掺入宿主细胞系中可使AAV生产更高效，但是一些AAV和腺病毒基因有细胞抑制或细胞毒性，从而限制了该方法。本发明描述了一种使AAVREP基因可逆地失活的方式，使得AAV REP、CAP和可包装转基因可整合到合适的宿主细胞中并扩增。表达重组酶的复制缺陷型重组腺病毒(例如，ΔE1/ΔE3)感染这些细胞会再激活REP基因并且诱导AAV复制和包装。
Figure IDA0003553663910000011
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Claims (106)

1.一种非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含经修饰的腺相关病毒（AAV）rep基因，所述经修饰的AAV rep基因具有编码四种Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV rep基因以及插入到所述四种Rep蛋白所共用的rep基因的编码序列中的人工内含子，其中所述人工内含子包含插入在5’剪接位点下游和所述人工内含子的分支位点上游的终止盒，并且所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(a) 具有与SEQ ID NO:7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的attP位点，优选地，具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(b) 剪接受体；
(c) 终止子；以及
(d) 具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的attB位点，优选地，具有SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的核苷酸序列的attB位点。
2.根据权利要求1所述的非天然存在的核酸分子，其中所述剪接受体包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的非天然存在的核酸分子，其中所述终止子包含多聚腺苷酸化信号。
4.根据权利要求3所述的非天然存在的核酸分子，其中所述终止子还包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的非天然存在的核酸分子，其中所述终止盒包含编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的非天然存在的核酸分子，其中所述人工内含子按5’至3’顺序包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列、所述终止盒和SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的非天然存在的核酸分子，其中所述AAV rep基因包含AAV1至AAV8之一或它们的杂合体的rep基因。
8.根据权利要求7所述的非天然存在的核酸分子，其中所述AAV rep基因包含具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号190至2202的人AAV2的rep基因。
9.根据权利要求8所述的非天然存在的核酸分子，其中所述人工内含子插入在GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号996至1905之间。
10.根据权利要求9所述的非天然存在的核酸分子，其中所述人工内含子插入在GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号1052、1061、1712、1906、1022、1112、1475、1514、1700、1742、1784或1340、优选地核苷酸编号1052的紧接下游。
11.一种非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含经修饰的AAV rep基因，所述经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：
(a) 具有SEQ ID NO:55的核苷酸序列的AAV rep基因的5’部分；
(b) 人工内含子，所述人工内含子按5’至3’顺序包含：
(i) 具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的5’内含子片段；
(ii) 终止盒，所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(1) 具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(2) 具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的剪接受体；
(3) 具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；
(4) 具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的终止子；以及
(5) 具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及
(iii) 具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的3’内含子片段；以及
(c) 具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列的所述AAV rep基因的3’部分。
12.一种非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含经修饰的AAV rep基因，所述经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：
(a) 具有SEQ ID NO:73的核苷酸序列的AAV rep基因的5’部分；
(b) 人工内含子，所述人工内含子按5’至3’顺序包含：
(i) 具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的5’内含子片段；
(ii) 终止盒，所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(1) 具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(2) 具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的剪接受体；
(3) 具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；
(4) 具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的终止子；以及
(5) 具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及
(iii) 具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列的3’内含子片段；以及
(c) 具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列的所述AAV rep基因的3’部分。
13.根据权利要求11或12所述的非天然存在的核酸分子，其中所述终止盒包含SEQ IDNO:16的核苷酸序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子还包含编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的AAV cap基因。
15.根据权利要求14所述的非天然存在的核酸分子，其中所述AAV cap基因包含AAV1至AAV9和AAVDJ之一或它们的杂合体的cap基因。
16.根据权利要求15所述的非天然存在的核酸分子，其中所述AAV cap基因包含具有GenBank登录号AY530579.1的核苷酸序列的人AAV9的所述cap基因。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的非天然存在的核酸分子，其中所述AAV cap基因还包含多聚腺苷酸化信号，优选地具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号4411至4466的AAV2的多聚腺苷酸化信号，以及增强子，优选地具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号190至313的AAV2 rep P5启动子，其中所述多聚腺苷酸化信号和所述增强子均在所述cap基因的编码序列下游。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子还包含所述AAV cap基因下游的侧翼有一对AAV末端反向重复（ITR）的转基因。
19.根据权利要求18所述的非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子还包含所述经修饰的AAV rep基因上游的第一绝缘子以及任选地侧翼有所述ITR的所述转基因下游的第二绝缘子，优选地，所述第一绝缘子和所述第二绝缘子独立地选自：
(a) 具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列的人抗阻遏子元件40；
(b) 具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列的小鼠抗阻遏子元件40；
(c) 具有GenBank登录号AY190749.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件04；
(d) 具有GenBank登录号AY190750.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件06；
(e) 具有GenBank登录号AY190751.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件07；
(f) 具有GenBank登录号AY190752.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件12；
(g) 具有GenBank登录号AY190753.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件13；
(h) 具有GenBank登录号AY190754.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件35；
(i) 具有GenBank登录号AY190755.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件36；
(j) 具有GenBank登录号AY190757.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件52；
(k) 具有GenBank登录号AY190758.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件53；以及
(l) 来自珠蛋白基因座的具有AY040835.1的核苷酸序列的两个或更多个拷贝的鸡HS4绝缘子，
更优选地，所述第一绝缘子和所述第二绝缘子分别具有SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
20.根据权利要求19所述的非天然存在的核酸分子，其中所述非天然存在的核酸分子包含在所述经修饰的AAV rep基因上游的所述第一绝缘子，并且还包含分别在所述转基因上游和下游的第一间隔序列和第二间隔序列，其中所述第一间隔序列和所述第二间隔序列独立地选自：
(a) SEQ ID NO:67的核苷酸序列；以及
(b) SEQ ID NO:68的核苷酸序列。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的非天然存在的核酸分子，其中所述ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，所述转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且所述编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23。
22.一种非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子按5’至3’顺序包含：
(A) 第一绝缘子，优选地所述第一绝缘子具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列；
(B) 经修饰的AAV rep基因，所述经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：
(i) AAV rep基因的5’部分，优选地所述AAV rep基因的所述5’部分具有SEQ ID NO:55的核苷酸序列；
(ii) 人工内含子，所述人工内含子按5’至3’顺序包含：
(a) 5’内含子片段，优选地所述5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；
(b) 终止盒，所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(1) 具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(2) 剪接受体，优选地所述剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；
(3) 编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；
(4) 终止子，优选地所述终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及
(5) 具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及
(c) 3’内含子片段，优选地所述3’内含子片段具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列；
(iii) 所述AAV rep基因的3’部分，优选地所述AAV rep基因的所述3’部分具有SEQ IDNO:56的核苷酸序列；
(C) AAV cap基因，优选地所述AAV cap基因包含SEQ ID NO:57的核苷酸序列；
(D) 侧翼有一对AAV ITR的转基因，优选地，所述AAV ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，并且所述转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且所述编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23；以及
(E) 第二绝缘子，优选地所述第二绝缘子具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
23.一种非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子按5’至3’顺序包含：
(A) 第一绝缘子，优选地所述第一绝缘子具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列；
(B) 经修饰的AAV rep基因，所述经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：
(i) AAV rep基因的5’部分，优选地所述AAV rep基因的所述5’部分具有SEQ ID NO:73的核苷酸序列；
(ii) 人工内含子，所述人工内含子按5’至3’顺序包含：
(a) 5’内含子片段，优选地所述5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；
(b) 终止盒，所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(1) 具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(2) 剪接受体，优选地所述剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；
(3) 编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；
(4) 终止子，优选地所述终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及
(5) 具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及
(c) 3’内含子片段，优选地所述3’内含子片段具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列；
(iii) 所述AAV rep基因的3’部分，优选地所述AAV rep基因的所述3’部分具有SEQ IDNO:56的核苷酸序列；
(C) AAV cap基因；
(D) 转基因，所述转基因侧翼有：
(1) 一对AAV ITR，优选地，所述AAV ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，并且所述转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且所述编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23；以及
(2) 一对间隔序列，优选地，所述间隔序列具有SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68的核苷酸序列。
24.一种载体，所述载体包含根据权利要求1至22中任一项所述的非天然存在的核酸分子；优选地，所述载体是质粒；更优选地，所述质粒包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列。
25.一种载体，所述载体包含根据权利要求1至21或23中任一项所述的非天然存在的核酸分子；优选地，所述载体是质粒；更优选地，所述质粒包含SEQ ID NO:70的核苷酸序列。
26.一种制备根据权利要求1至23中任一项所述的非天然存在的核酸分子的方法。
27.一种制备根据权利要求24或25所述的载体的方法。
28.一种细胞，所述细胞包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含经修饰的腺相关病毒（AAV）rep基因，所述经修饰的AAV rep基因具有编码四种Rep蛋白Rep78、Rep68、Rep52和Rep40的AAV rep基因以及插入到所述四种Rep蛋白所共用的所述rep基因的编码序列中的人工内含子，其中所述人工内含子包含插入在5’剪接位点下游和所述人工内含子的分支位点上游的终止盒，并且所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(a) 具有与SEQ ID NO:7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的attP位点，优选地，具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(b) 剪接受体；
(c) 终止子；以及
(d) 具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的attB位点，优选地，具有SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:9的核苷酸序列的attB位点。
29.根据权利要求28所述的细胞，其中所述剪接受体包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
30.根据权利要求28或29所述的细胞，其中所述终止子包含多聚腺苷酸化信号。
31.根据权利要求30所述的细胞，其中所述终止子还包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的细胞，其中所述终止盒包含编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的细胞，其中所述人工内含子按5’至3’顺序包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列、所述终止盒和SEQ ID NO:15的核苷酸序列。
34.根据权利要求28至32中任一项所述的细胞，其中所述人工内含子按5’至3’顺序包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列、所述终止盒和SEQ ID NO:66的核苷酸序列。
35.根据权利要求28至33中任一项所述的细胞，其中所述AAV rep基因包含AAV1至AAV8之一或它们的杂合体的rep基因。
36.根据权利要求35所述的细胞，其中所述AAV rep基因包含具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号190至2202的人AAV2的rep基因。
37.根据权利要求36所述的细胞，其中所述人工内含子插入在GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号996至1905之间。
38.根据权利要求37所述的细胞，其中所述人工内含子插入在GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号1052、1061、1712、1906、1022、1112、1475、1514、1700、1742、1784或1340、优选地核苷酸编号1052的紧接下游。
39.一种细胞，所述细胞包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含经修饰的AAV rep基因，所述经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：
(a) 具有SEQ ID NO:55的核苷酸序列的AAV rep基因的5’部分；
(b) 人工内含子，所述人工内含子按5’至3’顺序包含：
(i) 具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的5’内含子片段；
(ii) 终止盒，所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(1) 具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(2) 具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的剪接受体；
(3) 具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；
(4) 具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的终止子；以及
(5) 具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及
(iii) 具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列的3’内含子片段；以及
(c) 具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列的所述AAV rep基因的3’部分。
40.一种细胞，所述细胞包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含经修饰的AAV rep基因，所述经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：
(a) 具有SEQ ID NO:73的核苷酸序列的AAV rep基因的5’部分；
(b) 人工内含子，所述人工内含子按5’至3’顺序包含：
(i) 具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列的5’内含子片段；
(ii) 终止盒，所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(1) 具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(2) 具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列的剪接受体；
(3) 具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；
(4) 具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列的终止子；以及
(5) 具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及
(iii) 具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列的3’内含子片段；以及
(c) 具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列的所述AAV rep基因的3’部分。
41.根据权利要求39或40所述的细胞，其中所述终止盒包含SEQ ID NO:16的核苷酸序列。
42.根据权利要求28至41中任一项所述的细胞，所述细胞还包含编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的AAV cap基因。
43.根据权利要求42所述的细胞，其中所述AAV cap基因包含AAV1至AAV9和AAVDJ之一或它们的杂合体的cap基因。
44.根据权利要求43所述的细胞，其中所述AAV cap基因包含具有GenBank登录号AY530579.1的核苷酸序列的人AAV9的cap基因。
45.根据权利要求43所述的细胞，其中所述AAV cap基因包含AAV9的杂合体的cap基因。
46.根据权利要求42至45所述的细胞，其中所述AAV cap基因还包含多聚腺苷酸化信号，优选地具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号4411至4466的AAV2的多聚腺苷酸化信号，以及增强子，优选地具有GenBank登录号NC_001401.2的核苷酸序列的核苷酸编号190至313的AAV2 rep P5启动子，其中所述多聚腺苷酸化信号和所述增强子均在所述cap基因的所述编码序列下游。
47.根据权利要求42至46中任一项所述的细胞，所述细胞还包含所述AAV cap基因下游的侧翼有一对AAV末端反向重复（ITR）的转基因。
48.根据权利要求47所述的细胞，所述细胞还包含所述经修饰的AAV rep基因上游的第一绝缘子以及任选地侧翼有所述ITR的所述转基因下游的第二绝缘子，优选地，所述第一绝缘子和所述第二绝缘子独立地选自：
(a) 具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列的人抗阻遏子元件40；
(b) 具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列的小鼠抗阻遏子元件40；
(c) 具有GenBank登录号AY190749.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件04；
(d) 具有GenBank登录号AY190750.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件06；
(e) 具有GenBank登录号AY190751.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件07；
(f) 具有GenBank登录号AY190752.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件12；
(g) 具有GenBank登录号AY190753.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件13；
(h) 具有GenBank登录号AY190754.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件35；
(i) 具有GenBank登录号AY190755.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件36；
(j) 具有GenBank登录号AY190757.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件52；
(k) 具有GenBank登录号AY190758.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件53；以及
(l) 来自珠蛋白基因座的具有AY040835.1的核苷酸序列的两个或更多个拷贝的鸡HS4绝缘子，
更优选地，所述第一绝缘子和所述第二绝缘子分别具有SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
49.根据权利要求48所述的细胞，其中所述细胞包含在所述经修饰的AAV rep基因上游的所述第一绝缘子，并且还包含分别在所述转基因上游和下游的第一间隔序列和第二间隔序列，其中所述第一间隔序列和所述第二间隔序列独立地选自：
(a) SEQ ID NO:67的核苷酸序列；以及
(b) SEQ ID NO:68的核苷酸序列。
50.根据权利要求47至49中任一项所述的细胞，其中所述ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，所述转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且所述编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23。
51.一种细胞，所述细胞包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子按5’至3’顺序包含：
(A) 第一绝缘子，优选地所述第一绝缘子具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列；
(B) 经修饰的AAV rep基因，所述经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：
(i) AAV rep基因的5’部分，优选地所述AAV rep基因的所述5’部分具有SEQ ID NO:55的核苷酸序列；
(ii) 人工内含子，所述人工内含子按5’至3’顺序包含：
(a) 5’内含子片段，优选地所述5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；
(b) 终止盒，所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(1) 具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(2) 剪接受体，优选地所述剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；
(3) 编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；
(4) 终止子，优选地所述终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及
(5) 具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及
(c) 3’内含子片段，优选地所述3’内含子片段具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列；
(iii) 所述AAV rep基因的3’部分，优选地所述AAV rep基因的所述3’部分具有SEQ IDNO:56的核苷酸序列；
(C) AAV cap基因，优选地所述AAV cap基因包含SEQ ID NO:57的核苷酸序列；
(D) 侧翼有一对AAV ITR的转基因，优选地，所述AAV ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，并且所述转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且所述编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23；以及
(E) 第二绝缘子，优选地所述第二绝缘子具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
52.一种细胞，所述细胞包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子按5’至3’顺序包含：
(A) 第一绝缘子，优选地所述第一绝缘子具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列；
(B) 经修饰的AAV rep基因，所述经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：
(i) AAV rep基因的5’部分，优选地所述AAV rep基因的所述5’部分具有SEQ ID NO:73的核苷酸序列；
(ii) 人工内含子，所述人工内含子按5’至3’顺序包含：
(a) 5’内含子片段，优选地所述5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；
(b) 终止盒，所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(1) 具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(2) 剪接受体，优选地所述剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；
(3) 编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；
(4) 终止子，优选地所述终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及
(5) 具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及
(c) 3’内含子片段，优选地所述3’内含子片段具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列；
(iii) 所述AAV rep基因的3’部分，优选地所述AAV rep基因的所述3’部分具有SEQ IDNO:56的核苷酸序列；
(C) AAV cap基因；以及
(D) 转基因，所述转基因侧翼有：
(i) 一对AAV ITR，优选地，所述AAV ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，并且所述转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且所述编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23；以及
(ii) 一对间隔序列，优选地，所述间隔序列具有SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68的核苷酸序列。
53.根据权利要求28至51中任一项所述的细胞，其中所述非天然存在的核酸分子为游离型，具有SEQ ID NO:12的核苷酸序列。
54.根据权利要求28至50或52中任一项所述的细胞，其中所述非天然存在的核酸分子为游离型，具有SEQ ID NO:70的核苷酸序列。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的细胞，所述细胞还包含编码重组酶的核酸分子，所述重组酶具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列；优选地，所述核酸包含具有与SEQ ID NO:3的核苷酸序列的至少85%、至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列；更优选地，所述细胞包含编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的所述重组酶的重组ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5（Ad5）病毒。
56.根据权利要求52至55中任一项所述的细胞，所述细胞还包含腺病毒E1A和E1B基因，优选地所述细胞是911细胞、pTG6559细胞、GH329细胞、N52.E6细胞、HeLa-E1细胞、UR细胞、VLI-293细胞、HEK293细胞或PER.C6细胞。
57.一种产生包含转基因的重组AAV的方法，所述方法包括：
(A) 获得第一宿主细胞，所述第一宿主细胞包含：
(i) 经修饰的AAV rep基因，所述经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：
(a) AAV rep基因的5’部分，优选地所述AAV rep基因具有SEQ ID NO:55的核苷酸序列；
(b) 人工内含子，所述人工内含子按5’至3’顺序包含：
(1) 5’内含子片段，优选地所述5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；
(2) 终止盒，所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(aa) 具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(bb) 剪接受体，优选地所述剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；
(cc) 编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；
(dd) 终止子，优选地所述终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及
(ee) 具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及
(3) 3’内含子片段，优选地所述3’内含子片段具有SEQ ID NO:15的核苷酸序列；
(c) 所述AAV rep基因的3’部分，优选地所述AAV rep基因的所述3’部分具有SEQ IDNO:56的核苷酸序列；
(ii) AAV cap基因，优选地所述AAV cap基因包含SEQ ID NO:57的核苷酸序列；以及
(iii) 侧翼有一对AAV ITR的所述转基因，优选地，所述ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，所述转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且所述编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23；
(B) 使用包含编码重组酶的重组酶基因的重组腺病毒感染所述第一宿主细胞以获得进一步包含所述重组酶基因的第二宿主细胞，所述重组酶具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性；
(C) 使所述第二宿主细胞在一定条件下生长，在所述条件下产生包含所述转基因的所述重组AAV；以及
(D) 任选地收集所述重组AAV。
58.一种产生包含转基因的重组AAV的方法，所述方法包括：
(A) 获得第一宿主细胞，所述第一宿主细胞包含：
(i) 经修饰的AAV rep基因，所述经修饰的AAV rep基因按5’至3’顺序包含：
(a) AAV rep基因的5’部分，优选地所述AAV rep基因具有SEQ ID NO:73的核苷酸序列；
(b) 人工内含子，所述人工内含子按5’至3’顺序包含：
(1) 5’内含子片段，优选地所述5’内含子片段具有SEQ ID NO:14的核苷酸序列；
(2) 终止盒，所述终止盒按5’至3’顺序包含：
(aa) 具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点；
(bb) 剪接受体，优选地所述剪接受体具有SEQ ID NO:17的核苷酸序列；
(cc) 编码选择性标记物的基因，优选地具有SEQ ID NO:18的核苷酸序列的新霉素磷酸转移酶表达盒；
(dd) 终止子，优选地所述终止子具有SEQ ID NO:19的核苷酸序列；以及
(ee) 具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；以及
(3) 3’内含子片段，优选地所述3’内含子片段具有SEQ ID NO:66的核苷酸序列；
(c) 所述AAV rep基因的3’部分，优选地所述AAV rep基因的所述3’部分具有SEQ IDNO:66的核苷酸序列；
(ii) AAV cap基因；以及
(iii) 转基因，所述转基因侧翼有：
(a) 一对AAV ITR，优选地，所述ITR具有SEQ ID NO:20的核苷酸序列，所述转基因包含可操作地连接至编码序列的启动子，并且所述编码序列可操作地连接至多聚腺苷酸化信号；更优选地，所述启动子具有SEQ ID NO:21的核苷酸序列并且所述多聚腺苷酸化信号具有核苷酸序列SEQ ID NO:23；以及
(b) 一对间隔序列，优选地，所述间隔序列具有SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68的核苷酸序列；
(B) 使用包含编码重组酶的重组酶基因的重组腺病毒感染所述第一宿主细胞以获得进一步包含所述重组酶基因的第二宿主细胞，所述重组酶具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性；
(C) 使所述第二宿主细胞在一定条件下生长，在所述条件下产生包含所述转基因的所述重组AAV；以及
(D) 任选地收集所述重组AAV。
59.根据权利要求57或58所述的方法，其中所述第一宿主细胞还包含所述经修饰的AAVrep基因上游的第一绝缘子以及任选地侧翼有所述ITR的所述转基因下游的第二绝缘子，优选地，所述第一绝缘子和所述第二绝缘子独立地选自：
(a) 具有SEQ ID NO:24的核苷酸序列的人抗阻遏子元件40；
(b) 具有SEQ ID NO:25的核苷酸序列的小鼠抗阻遏子元件40；
(c) 具有GenBank登录号AY190749.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件04；
(d) 具有GenBank登录号AY190750.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件06；
(e) 具有GenBank登录号AY190751.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件07；
(f) 具有GenBank登录号AY190752.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件12；
(g) 具有GenBank登录号AY190753.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件13；
(h) 具有GenBank登录号AY190754.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件35；
(i) 具有GenBank登录号AY190755.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件36；
(j) 具有GenBank登录号AY190757.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件52；
(k) 具有GenBank登录号AY190758.1的核苷酸序列的抗阻遏子元件53；以及
(l) 来自珠蛋白基因座的具有AY040835.1的核苷酸序列的两个或更多个拷贝的鸡HS4绝缘子，
更优选地，所述第一绝缘子和所述第二绝缘子分别具有SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25的核苷酸序列。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述第一宿主细胞包含在所述经修饰的AAV rep基因上游的所述第一绝缘子，并且还包含分别在所述转基因上游和下游的第一间隔序列和第二间隔序列，其中所述第一间隔序列和所述第二间隔序列独立地选自：
(a) SEQ ID NO:67的核苷酸序列；以及
(b) SEQ ID NO:68的核苷酸序列。
61.根据权利要求57至59中任一项所述的方法，其中通过向细胞中引入一个或多个核酸分子来获得所述第一宿主细胞，所述一个或多个核酸分子包含所述经修饰的AAV rep基因、所述AAV cap基因、侧翼有所述ITR的所述转基因、所述第一绝缘子和所述第二绝缘子。
62.根据权利要求61所述的方法，其中通过向所述细胞中引入核酸分子来获得所述第一宿主细胞，所述核酸分子按5’至3’顺序包含所述第一绝缘子、所述经修饰的AAV rep基因、所述AAV cap基因、侧翼有所述ITR的所述转基因、所述第一绝缘子和所述第二绝缘子，优选地，包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列的质粒。
63.根据权利要求57、58或60所述的方法，其中通过向细胞中引入一个或多个核酸分子来获得所述第一宿主细胞，所述一个或多个核酸分子包含所述经修饰的AAV rep基因、所述AAV cap基因、侧翼有所述ITR的所述转基因、所述第一绝缘子、所述第一间隔序列和所述第二间隔序列。
64.根据权利要求63所述的方法，其中通过向细胞中引入一个或多个核酸分子来获得所述第一宿主细胞，所述一个或多个核酸分子包含所述经修饰的AAV rep基因、所述AAVcap基因、侧翼有所述ITR的所述转基因、所述第一绝缘子、所述第一间隔序列和所述第二间隔序列，优选地，包含SEQ ID NO:70的核苷酸序列的质粒。
65.根据权利要求57至62中任一项所述的方法，其中所述重组腺病毒是包含SEQ IDNO:3的核苷酸序列的重组ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5（Ad5）病毒。
66.根据权利要求57至65中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包含腺病毒E1A和E1B基因，优选地所述宿主细胞是911细胞、pTG6559细胞、GH329细胞、N52.E6细胞、HeLa-E1细胞、UR细胞、VLI-293细胞、HEK293细胞或PER.C6细胞。
67.根据权利要求57至66中任一项所述的方法，其中用于使所述第二宿主细胞生长的所述条件包括用2-氨基嘌呤培养所述第二细胞。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述2-氨基嘌呤浓度小于约1.25mM。
69.根据权利要求67或68所述的方法，其中所述2-氨基嘌呤浓度为约1µM至约1.25mM。
70.根据权利要求67或68所述的方法，其中所述2-氨基嘌呤浓度为约10µM至约1.25mM。
71.根据权利要求67或68所述的方法，其中所述2-氨基嘌呤浓度为约100µM至约1.25mM。
72.根据权利要求67或68所述的方法，其中所述2-氨基嘌呤浓度为约1.25mM。
73.根据权利要求67至72中任一项所述的方法，其中在用重组腺病毒感染所述第一宿主细胞后约24小时开始用2-氨基嘌呤培养所述第二细胞。
74.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求55所述的细胞和2-氨基嘌呤。
75.根据权利要求74所述的组合物，其中所述2-氨基嘌呤浓度小于约1.25mM。
76.根据权利要求74所述的组合物，其中所述2-氨基嘌呤浓度为约1µM至约1.25mM。
77.根据权利要求74所述的组合物，其中所述2-氨基嘌呤浓度为约10µM至约1.25mM。
78.根据权利要求74所述的组合物，其中所述2-氨基嘌呤浓度为约100µM至约1.25mM。
79.根据权利要求74所述的组合物，其中所述2-氨基嘌呤浓度为约1.25mM。
80.一种非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含编码具有与SEQ IDNO:2的氨基酸序列的至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列。
81.根据权利要求74所述的非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含具有与SEQ ID NO:3的核苷酸序列的至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。
82.一种载体，所述载体包含根据权利要求80或81所述的非天然存在的核酸。
83.根据权利要求82所述的载体，所述载体还包含可操作地连接至编码所述丝氨酸重组酶的核苷酸序列的启动子，优选地巨细胞病毒（CMV）启动子。
84.根据权利要求82或83所述的载体，所述载体还包含可操作地连接至编码所述丝氨酸重组酶的核苷酸序列的多聚腺苷酸化信号，诸如猿猴病毒40（SV40）多聚腺苷酸化信号。
85.根据权利要求82至84中任一项所述的载体，所述载体为DNA质粒。
86.根据权利要求82至85中任一项所述的载体，所述载体为重组腺病毒载体。
87.根据权利要求86所述的载体，所述载体为重组ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5（Ad5）病毒，所述病毒包含在CMV启动子的控制下的编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列进一步可操作地连接至SV40多聚腺苷酸化信号（NC_001669.1，nt 2550至2774）。
88.一种细胞，所述细胞包含非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子包含编码具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列的至少85%诸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列。
89.根据权利要求88所述的细胞，所述细胞包含具有与SEQ ID NO:3的核苷酸序列的至少85%诸如至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列。
90.根据权利要求88或89所述的细胞，所述细胞包含载体，所述载体包含所述非天然存在的核酸。
91.根据权利要求90所述的细胞，所述细胞还包含可操作地连接至编码所述丝氨酸重组酶的核苷酸序列的启动子，优选地巨细胞病毒（CMV）启动子。
92.根据权利要求90或91所述的细胞，所述细胞还包含可操作地连接至编码所述丝氨酸重组酶的核苷酸序列的多聚腺苷酸化信号，诸如猿猴病毒40（SV40）多聚腺苷酸化信号。
93.根据权利要求90至92所述的细胞，其中所述载体是DNA质粒。
94.根据权利要求90至93中任一项所述的细胞，其中所述载体是重组腺病毒载体。
95.根据权利要求94所述的细胞，其中所述重组腺病毒载体是重组ΔE1/ΔE3腺病毒血清型5（Ad5）病毒，所述病毒包含在CMV启动子的控制下的编码具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的丝氨酸重组酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列进一步可操作地连接至SV40多聚腺苷酸化信号（NC_001669.1，nt 2550至2774）。
96.根据权利要求88至95所述的细胞，所述细胞包含腺病毒E1A和E1B基因，优选地所述细胞是911细胞、pTG6559细胞、GH329细胞、N52.E6细胞、HeLa-E1细胞、UR细胞、VLI-293细胞、HEK293细胞或PER.C6细胞。
97.一种在细胞中进行位点特异性重组的方法，所述方法包括：
(a) 获得包含核酸分子的细胞，所述核酸分子具有：具有与SEQ ID NO:7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的attP位点，优选地，具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点，以及具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的attB位点，优选地，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；
(b) 向所述细胞引入非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子编码具有与SEQ ID NO:2的至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的丝氨酸重组酶；以及
(c) 使所述细胞在一定条件下生长以允许所述丝氨酸重组酶催化所述attP位点和所述attB位点之间的所述位点特异性重组。
98.一种通过在细胞中进行位点特异性重组的方法产生的产物，所述方法包括：
(a) 获得包含核酸分子的细胞，所述核酸分子具有：具有与SEQ ID NO:7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的attP位点，优选地，具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点，以及具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的attB位点，优选地，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；
(b) 向所述细胞引入非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子编码具有与SEQ ID NO:2的至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的丝氨酸重组酶；以及
(c) 使所述细胞在一定条件下生长以允许所述丝氨酸重组酶催化所述attP位点和所述attB位点之间的所述位点特异性重组。
99.一种用于从细胞获得产物的方法，所述方法包括：
(a) 获得包含核酸分子的细胞，所述核酸分子具有：具有与SEQ ID NO:7具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的attP位点，优选地，具有SEQ ID NO:7的核苷酸序列的attP位点，以及具有与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的attB位点，优选地，具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核苷酸序列的attB位点；
(b) 向所述细胞引入非天然存在的核酸分子，所述非天然存在的核酸分子编码具有与SEQ ID NO:2的至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的丝氨酸重组酶；
(c) 使所述细胞在一定条件下生长以允许所述丝氨酸重组酶催化所述attP位点和所述attB位点之间的所述位点特异性重组；以及
(d) 从所述细胞产生产物并回收所述产物。
100.一种非天然存在的系统，所述非天然存在的系统包含：
用于AAV介导的重组的装置，其中所述装置任选地包含转基因元件。
101.一种用于转移根据权利要求100所述的非天然存在的系统的装置。
102.一种非天然存在的系统，所述非天然存在的系统包含：
用于使根据权利要求100所述的系统重组的重组装置，其中所述重组装置包括在催化期间使用至少一个丝氨酸残基。
103.一种用于转移根据权利要求102所述的非天然存在的系统的装置。
104.一种用于制造分子的装置，其中所述用于制造分子的装置包括根据权利要求100至103中任一项所述的装置并且能够复制。
105.一种用于AAV介导的位点特异性重组的方法，所述方法包括：
(a) 用于执行获得细胞的功能的步骤，所述细胞包含根据权利要求100所述的装置；
(b) 用于执行使所述细胞在一定条件下生长的功能以允许在催化期间使用至少一个丝氨酸残基进行位点特异性重组的步骤。
106.根据权利要求105所述的用于AAV介导的位点特异性重组的方法，所述方法包括获得产物，其中，任选地所述产物是治疗产物。
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