JP4646410B2 - 弱毒化（−）鎖ｒｎａウイルスワクチンのクローン化ヌクレオチド配列からの産生 - Google Patents

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Description

【０００１】
発明の背景
（-）鎖RNAウイルスは、重要できわめて破壊的な病原体の多様な目（モノネガウイルス）を含む。この群内のヒト病原体には、いくつかの遺伝子型の狂犬病ウイルス（RaV）、麻疹ウイルス（MeV）、ムンプスウイルス（MuV）、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）及びパラインフルエンザウイルス（PIV）が含まれる。RSVの場合、この病原体は、1歳以下の幼児における肺炎及び気管支炎の原因として他の微生物病原体より重要である。RSVは、呼吸器疾患による小児の入院5例のうち1例以上でその原因であり、米国だけで年間推定91,000例の入院と4,500例の死亡の原因となっている。ヒトPIVウイルス（例、HPIV1、HPIV2及びHPIV3）も、主に幼児及び小児において気管支炎、咽頭炎及び肺炎を引き起こし、ヒト集団において甚大な被害をもたらしている。Karron et al., J. Infect. Dis. 172: 1445-50 (1995); Collins et al. "Parainfluenza Viruses", p. 1205-1243. B. N. Fields et al., eds., Fields Virology, 3rd ed., vol. 1. Lippincott-Raven Publ., Philadelphia (1996); Murphy et al., Virus Res. 11: 1-15 (1988)。ヒトPIVウイルスによる感染症は気道感染症で入院する乳幼児及び小児の約20％の原因になっている。
【０００２】
RSV及びPIVに対する有効なワクチンを開発する何十年もの研究にもかかわらず、上記ウイルスに関連した重篤な罹病と有意な死亡を防ぐための安全かつ有効なワクチンは承認されていない。モノネガウイルスの他の重要なメンバーにも有効なワクチン開発が待たれているか、又は改良されたワクチンがあれば利益が得られるだろう。（-）鎖RNAウイルスに対する生ワクチンの開発に対する1つの障害は、弱毒化と免疫原性の間に適切な均衡をはかることが難しいことにある。弱毒化ウイルスの遺伝子安定性も問題となり得る。RSVの場合のワクチン開発はまた、細胞培養におけるRSVの増殖が比較的不良であること、ウイルス粒子が不安定であることによっても妨げられている。RSV感染のもう1つの特徴は、誘発される免疫が後続の感染に対して完全には防御しないということである。これには、気道内腔表面にウイルス感染を制限することにおける免疫系の相対的な非効率性、局所粘膜免疫の短時間性、迅速かつ広汎なウイルスの複製、若年者の免疫学的未熟性による低い免疫応答性、胎盤由来の母性血清抗体による免疫抑制、及び高度に糖鎖結合したGタンパク質のようなウイルス特性といった、数多くの要因が貢献する。また、以下に述べるように、RSVは2種の抗原性亜群A及びBとして存在し、一方の亜群に対する免疫が他方には効かない。
【０００３】
1960年代半ばには、ホルマリンで不活性化したRSVがRSVに対するワクチンとして試験されたが、RSVの感染又は疾患に対して防護することはできなかったし、実はウイルスによる後続の感染の症状を増悪させた（Kim et al., Am. J. Epidemiol., 89: 422-434 (1969), Chin et al., Am. J. Epidemiol., 89: 449-463 (1969); Kapikian et al., Am. J. Epidemiol., 89: 405-421 (1969)）。さらに最近では、RSVヘのワクチン開発は弱毒化RSV突然変異体に集中している。Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694 (1968)は、候補ワクチンであるように十分弱毒化したと思われるRSVの低温継代突然変異体（cpRSV）について報告した。この突然変異体は、その野生型（wt）親ウイルスに比較して26℃でやや高まった増殖効率を示したが、その複製は温度感受性でも、有意に低温適応してもいなかった。しかしながら、この低温継代突然変異体は、成人に対しては弱毒化されていた。以前にRSVに感染した幼児や小児（血清陽性者）に対しては満足すべきほどに弱毒化され、免疫原性があったが、このcpRSV突然変異体は、血清陰性幼児の上気道に対して低レベルのビルレンスを保持していた。
【０００４】
同様に、Gharpure et al., J. Virol. 3: 414-421 は、やはり有望なワクチン候補である温度感受性RSV（tsRSV）突然変異体の単離を報告した。1つの突然変異体、ts-1を研究室とボランティアにおいて詳しく評価した。この突然変異体は、成人ボランティアに無症候性の感染を産生し、免疫化後45日目の野生型ウイルスを用いたチャレンジに対して抵抗性をもたらした。ここでも、血清陽性の幼児及び小児が無症候性の感染をうけたのに対し、血清陰性幼児では鼻炎や他の軽微な症状の徴候を発現した。さらに、ts表現型の不安定性が検出された。もっとも、部分的又は完全に温度感受性を消失しているウイルスはワクチンから回収されるウイルスのわずかな比率であって、軽微な鼻炎以外の疾患の徴候には関連していなかった。
【０００５】
こういった研究は、ある種の低温継代及び温度感受性のRSV株があるワクチンでは十分弱毒化されておらず、特に血清陰性幼児では、軽微な疾患の症状を引き起こすのに対し、他のものは過剰に弱毒化されてしまい、保護免疫応答を誘発するほど十分に複製し得ないことを示した（Wright et al., Infect. Immun., 37: 397-400 (1982)）。さらに、候補ワクチン突然変異体の遺伝子不安定性はその温度感受性の表現型の消失をもたらし、有効なRSVワクチンの開発をさらに妨げている。概論として Hodes et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145: 1158-1164 (1974), McIntosh et al., Pediatr. Res. 8: 689-696 (1974), 及び Belshe et al., J. Med. Virol., 3: 101-110 (1978) を参照のこと。
【０００６】
低温継代のようなコントロールし難い生物学的方法を介して適切に弱毒化したRSV株を創出する方法を放棄した研究者は、精製したRSVの被膜糖タンパク質を使用してサブユニットのワクチン候補を試験した。この糖タンパク質はコトンラットの肺においてRSV感染に対する抵抗性を誘発した。Walsh et al., J. Infect. Dis. 155: 1198-1204 (1987)。しかし、この抗体は中和活性が非常に弱く、精製したサブユニットワクチンでげっ歯動物を免疫化すると、これまで処理されたRSVワクチンを想起させる疾患の亢進をもたらした（Murphy et al., Vaccine 8: 497-502 (1990)）。
【０００７】
F又はGの被膜糖タンパク質を発現するワクシニアウイルス組換体をベースとするワクチンも研究された。こういった組換体は、元のウイルス対照物から区別し得ないRSVの糖タンパク質を発現し、ワクシニア-RSV F及びG組換体で皮内感染させたげっ歯動物は、ウイルス感染を中和する高レベルの特異抗体を発現した。実際、ワクチン-F組換体をコトンラットに感染すると、下気道におけるRSVの複製に対するほぼ完全な抵抗性と上気道における有意の抵抗性を促進した（Olmsted et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7462-7466 (1986)）。しかしながら、ワクシニア-F及び-G組換体でチンパンジーを免疫化すると、上気道におけるRSVチャレンジに対しほとんど防護を提供せず（Collins et al., Vaccine 8: 164-168 (1990)）、下気道では防護に一貫性がなかった（Crowe et al., Vaccine 11: 1395-1404 (1993)）。
【０００８】
生物学的に弱毒化したウイルス株、サブユニットワクチン、及びRSVや他の（-）鎖RNAウイルスを治療するための他のワクチン開発戦略が有望でないために、新規ワクチンを開発する新たな方法、特に、組換えワクチン候補物を操作して生存能力のある弱毒化組換体において新たな表現型の特性を産生するように遺伝子変化を取り込む方法への必要性が強調される。しかしながら、RSVや他の（-）鎖RNAウイルスのゲノムRNAを操作することはこれまで困難とされてきた。これに関する主要な障害には、これらウイルスの裸のゲノムRNAに感染性がないこと、組織培養における不十分なウイルス増殖、複製サイクルの冗長さ、ビリオンの不安定性、ゲノムの複雑性、及び遺伝子産物の組織化の難しさが含まれる。
【０００９】
PIV3の場合、2種の生きた弱毒化ワクチン候補が特に注目されている。この候補物の1つが、HPIV3に抗原性が関連し、HPIV3に対して動物を保護することが示された、ウシPIV3（BPIV3）株である。BPIV3は、ヒト幼児及び小児において弱毒化され、遺伝的に安定し、免疫原性がある（Karron et al., J. Inf. Dis. 171: 1107-14 (1995a); Karron et al., J. Inf. Dis. 172: 1445-1450, (1995b)）。第二のPIVワクチン候補物である、JS cp45はHPIV3のJS野生（wt）株の低温適応突然変異体である（Karron et al., (1995b), 同上；Belshe et al., J. Med. Virol. 10: 235-42 (1982)）。この生きた弱毒化、低温継代（cp）PIV3ワクチン候補物は、in vivoでのウイルス複製後も安定である、温度感受性（ts）、低温適応（ca）、及び弱毒化（att）の表現型を示す。cp45ウイルスは、実験動物におけるヒトPIV3チャレンジに対して防護し、血清陰性のヒト幼児及び小児において弱毒化され、遺伝的に安定であり、免疫原性である（Hall et al., Virus Res. 22: 173-184 (1992); Karron et al., J. Infect. Dis. 172 (6): 1445-1450 (1995b), 同上）。
【００１０】
組換えDNA技術は、感染性の（-）鎖RNAウイルスをcDNAから回収し、ウイルス・クローンを遺伝子操作して新規なワクチン候補物を構築し、その弱毒化レベルと表現型の安定性を速やかに評価することを可能にした（概説については、Conzelmann, J. Gen. Virol. 77: 381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 11354-58, (1996) を参照のこと）。この文脈で、必須ウイルスタンパク質の存在下でcDNAコード化された抗ゲノムRNAからの組換体によるレスキューが報告されているのは、感染性の呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、ヒトパラインフルエンザウイルス3（HPIV3）、狂犬病ウイルス（RaV）、小疱性口内炎ウイルス（VSV）、麻疹ウイルス（MeV）、センダイウイルス（SeV）、リンダーペスト・ウイルス、シミアン・ウイルスS型、及びウシRSVである（例えば、Garcin et al., EMBO J. 14: 6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14: 5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13: 4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 8388-92 (1995); Hoffman et al., J. Virol. 71: 4272-4277 (1997); Kao et al., Genes to Cells 1: 569-579 (1996), Roberts et al., Virology 247 (1), 1-6 (1998); Baron et al., J. Virol. 71: 1265-1271 (1997)；国際特許出願第WO97／06270号；Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567 (1995); Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997)；1997年7月15日に出願された米国特許出願第08／892,403号［公開国際特許出願第WO98／02530号、及び優先米国特許出願第60／047,634号｛1997年5月23日出願｝、第60／046,141号｛1997年5月9日出願｝、及び第60／021,773号｛1996年7月15日出願｝に対応する］；Juhasz et al., J. Virol. 71 (8): 5814-5819 (1997); He et al. Virology 237: 249-260 (1997); Whitehead et al., Virology 247 (2): 232-9 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 72 (5): 4467-4471 (1998b); Jin et al. Virology 251: 206-214 (1998); Bucholz et al. J. Virol. 73: 251-259 (1999); 及び Whitehead et al., J. Virol. 73: 3438-3442 (1999) を参照のこと、いずれも参照により本明細書に組込まれている）。
【００１１】
組換え（-）鎖RNAウイルスを回収して修飾する逆遺伝子工学の方法は利用可能であるが、モノネガウイルス内のRSV、PIV及び他の病原体に起因する重篤な健康問題を軽減するための安全かつ有効なワクチンを設計するための追加のツール及び方法については当技術分野において緊要なニーズが残っている。この文脈において残っている課題には、適切に弱毒化した、免疫原性があり、遺伝的に安定したワクチン候補物を達成することの難しさがある。この目標を達成するためには、弱毒化突然変異を同定して、組換えウイルス株へ取り込ませる既存の方法をさらに拡大しなければならない。驚くべきことに、本発明はこの目標を達成し、以下に説明するような追加の利点を提供する。
【００１２】
発明の要約
本発明は、ワクチン使用に適した弱毒化組換え（-）鎖RNAウイルスを設計及び産生するための新規な方法及び組成物を提供する。本発明の方法によれば、組換え（-）鎖RNAウイルスがこのウイルスをコードする1つ又はそれ以上の単離ポリヌクレオチド分子から産生される。このことは、このウイルスの組換えゲノム又はアンチゲノムをコードする1つ又はそれ以上のポリヌクレオチド分子を、感染性ウイルス又はウイルス粒子を産生するのに必要な必須ウイルスタンパク質とともに、細胞又は無細胞系において同時発現させることによって達成される。
【００１３】
前記ウイルスの組換えゲノム又はアンチゲノムは、異種の突然変異（-）鎖RNAウイルスにおける弱毒化突然変異の部位に対応する1種又はそれ以上のアミノ酸位置においてウイルスの組換えタンパク質の内部で突然変異をコードするように修飾される。このように取り込み又は反復の形式で「導入」される突然変異が、驚くべきことに、組換えウイルスに弱毒化の表現型を与える。このようにして、候補ワクチンウイルスは、主題ウイルスによる感染を受けやすい宿主において、選択される（-）鎖RNAウイルスに対する免疫応答を誘発するように組換え的に設計される。
【００１４】
本発明の関連した側面では、弱毒化組換え（-）鎖ウイルスゲノム又はアンチゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド分子及びベクターが提供される。上記の側面に一致して、本発明のゲノム又はアンチゲノムは、異種の突然変異（-）鎖RNAウイルスにおける弱毒化突然変異の部位に対応するアミノ酸位置において、ウイルスの選択された組換えタンパク質の内部で突然変異をコードする。
【００１５】
さらに本発明において提供されるのは、主題ウイルスによる感染の予防又は治療のために上記のように突然変異させた弱毒化組換え（-）鎖RNAウイルスを取り込む方法及び組成物である。
【００１６】
本発明の好ましい態様では、組換え（-）鎖RNAウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、パラインフルエンザウイルス（PIV）又は麻疹ウイルスのいずれかである。上記態様のそれぞれに関連して、異種の突然変異（-）鎖RNAウイルスは、異種RSV、ヒトパラインフルエンザウイルス（HPIV1、HPIV2、HPIV3）、ウシPIV（BPIV）、センダイウイルス（SeV）、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、シミアン・ウイルス5（SV5）、ムンプスウイルス（MuV）、麻疹ウイルス（MeV）、イヌ・ジステンパーウイルス（CDV）、狂犬病ウイルス（RaV）、又は小疱性口内炎ウイルス（VSV）である。
【００１７】
本発明の方法によれば、様々なターゲットタンパク質が、異種タンパク質の内部における対応部位で1つの（-）鎖RNAウイルスから弱毒化突然変異を導入するのに適用される。モノネガウイルス目全体では、厳密に言えば5種のターゲットタンパク質が保存され、特定の領域又はドメインにつき中等度から高度の配列同一性を示す。特に、この目の既知メンバーはすべて相同な5種のタンパク質の配列を共有する：ヌクレオキャプシドタンパク質（N）、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）、非糖鎖結合マトリックス（M）タンパク質、少なくとも1つの表面糖タンパク質（HN、H又はG）、及び大ポリメラーゼ（L）タンパク質である。これらのタンパク質はすべて、異種の突然変異ウイルスにおいて同定される弱毒化突然変異の部位に対応する部位で、組換えウイルスのタンパク質における1種又はそれ以上の保存残基を変化させることによって弱毒化突然変異を取り込むのに有用なターゲットとなる。
【００１８】
本発明のより詳細な側面では、モノネガウイルス内の特定の科、亜科、属又は種間でのみ共有される追加のタンパク質もターゲットになり得る。例えば、パラミクソウイルス科の全メンバーはいずれも少なくとも2つの表面糖タンパク質、HN（又はH又はG）及びFを有する。レスピロウイルス、ルブラウイルス及びモルビリウイルス属のほとんどすべてのメンバーは、システインリッチのVタンパク質を有する。レスピロウイルス及びモルビリウイルスはまた相同なCタンパク質をコードする。ニューモウイルスとルブラウイルスの亜集合（シミアン・ウイルス5（SV5）及びムンプスウイルス（MuV）は相同な表面糖タンパク質SHを共有する。ニューモウイルス属（ウシ、ヒツジ及びヤギのRSVとマウスニューモウイルス［本明細書ではマウスRSVと呼ぶ］を含む）のなかでは、いくつかの追加のタンパク質、NS1、NS2、M2（ORF1）及びM2（ORF2）が保存されている。トリニューモウイルスにはNS1及びNS2がないが、M2（ORF1）、M2（ORF2）及びSHタンパク質を有する。上記タンパク質のいずれもが注目するターゲットタンパク質を共有する分類群間での弱毒化突然変異の異種導入に有用なターゲットを提供する。
【００１９】
この文脈では、本発明の方法は、第一の（-）鎖RNAウイルスにおける弱毒化突然変異の同定に基づいている。突然変異は、突然変異部位を特徴づけるアミノ酸位置における野生型配列に対する突然変異体に関して同定されるが、組換え弱毒化のターゲットウイルスである異なるウイルスにおける相同タンパク質に対する配列比較の指標を提供する。弱毒化突然変異は、すでに知られているか、又は生物学的に誘導された突然変異ウイルスを産生して特徴づけるのに適用される突然変異誘発及び逆遺伝学の技術によって同定され得る。他のやり方では、注目する弱毒化突然変異は、de novo で、例えば部位特異的突然変異誘発や従来のスクリーニング法によって産生され、特徴づけられる場合がある。
【００２０】
（-）鎖RNAウイルスにおいて同定されるそれぞれの弱毒化突然変異は、1種又はそれ以上の異種の（-）鎖ウイルスにおける相同タンパク質に対する配列比較の指標を提供する。この文脈では、既存の配列並置が分析され得るか、又は従来の配列並置法を利用して、分析用に配列比較を産生し、弱毒化突然変異を担うタンパク質と弱毒化のターゲット組換えウイルスである異なるウイルスの相同タンパク質との間で、対応するタンパク質領域及びアミノ酸位置を同定する。弱毒化突然変異を特徴づける1つ又はそれ以上の残基がターゲットウイルスタンパク質の対応するアミノ酸位置で保存されている「野生型」同一性から変化している場合、ターゲットウイルスのゲノム又はアンチゲノムは、アミノ酸の欠失、置換又は挿入をコードするように組換え的に修飾され、ターゲットウイルスタンパク質における保存残基を変化させ、それにより組換えウイルスに類似した弱毒化の表現型を与える。
【００２１】
弱毒化組換え（-）鎖ウイルスを構築するこの合理的な設計法では、1つの（-）鎖RNAウイルスにおける弱毒化突然変異を特徴づけるアミノ酸位置での野生型残基の同一性は、ターゲットウイルスタンパク質において対応するアミノ酸位置で、厳密に、又は保守的置換により保存され得る。このように、ターゲットウイルスタンパク質において対応する残基は、異種の突然変異ウイルスにおける弱毒化突然変異により変化されていることが見出された野生型残基に対し、同一であるか、又はアミノ酸側鎖の構造及び機能について保存的に関連し得る。いずれの場合でも、組換えウイルスにおける類似の弱毒化は、本発明の方法により、保存された残基を変化させるアミノ酸の欠失、置換又は挿入をコードするようにターゲットウイルスの組換えゲノム又はアンチゲノムを修飾することによって、達成され得る。この文脈では、異種の突然変異ウイルスにおける弱毒化突然変異を特徴づける変化に保守的に対応する保存残基の変化をコードするようにゲノム又はアンチゲノムを修飾することが好ましい。例えば、あるアミノ酸の置換が対応する野生型配列に比較して突然変異ウイルスの突然変異部位を特徴づけるとすれば、この組換えウイルス内の対応する残基において置換を設計すべきである。好ましくは、この置換は突然変異ウイルスタンパク質に存在する置換残基に同一であるか又は保守的であろう。しかしながら、突然変異タンパク質内の置換残基に関してネーティブなアミノ酸残基を突然変異部位で非保守的に変化させることも可能である（例えば、他のアミノ酸を使用して、野生型残基の同一性及び機能を破壊又は妨害することによる）。欠失及び挿入により特徴づけられる突然変異の場合、これらは組換えウイルスへの対応する欠失又は挿入として導入し得るが、欠失又は挿入されたタンパク質フラグメントの特定のサイズ及びアミノ酸配列は多様に変化し得る。
【００２２】
本発明の他の側面では、組換え（-）鎖ウイルス内に取り込まれる突然変異は、所望される弱毒化の表現型に追加又は関連して様々な表現型を与え得る。このように、このウイルスの組換えタンパク質内に取り込まれる代表的な突然変異は、弱毒化の表現型に追加又は関連して、温度感受性（ts）、低温適応（ca）、小プラーク（sp）、又は宿主範囲制限（hr）表現型、又は増殖又は免疫原性の変化を与え得る。
【００２３】
本発明の代表的な態様では、ts又は非ts突然変異が（-）鎖ウイルス、例えばHPIV3の大ポリメラーゼLタンパク質の内部に取り込まれる。弱毒化突然変異が異種の突然変異（-）鎖RNAウイルス（例、RSV）において同定されるが、これは、注目の突然変異を含むPIV3と保守的なタンパク質構造関連性を共有する任意のウイルスであり得る。より詳細な態様では、異種の突然変異ウイルスにおける弱毒化突然変異は、ヒトRSV cpts530（ATCC VR 2452）のLタンパク質の521位にあるフェニルアラニンのアミノ酸置換を含む
他の代表的な態様では、ts又は非ts弱毒化突然変異が、パラインフルエンザウイルス（PIV）、例えばヒトPIV1（HPIV1）、ヒトPIV2（HPIV2）、ヒトPIV3（HPIV3）、ウシPIV（BPIV）、又はマウスPIV（MPIV又はセンダイウイルス）の組換えタンパク質の内部に取り込まれる。組換えゲノム又はアンチゲノムは、組換えウイルスのN、P、C、D、V、M、F、HN又はLタンパク質の内部でアミノ酸の置換、欠失又は挿入をコードするように修飾される。この突然変異は組換えウイルスにts又は非ts弱毒化の表現型を与え得る。好ましい側面では、異種の突然変異（-）鎖RNAウイルスにおける弱毒化突然変異が生物学的に誘導される突然変異体HPIV3株JS cp45の突然変異に対応し、好ましくは、HPIV3 JS cp45のLタンパク質内部におけるアミノ酸置換である。この文脈における代表的な突然変異には、HPIV3 JS cp45のLタンパク質の942位におけるチロシンのアミノ酸置換、HPIV3 JS cp45のLタンパク質の992位におけるロイシンのアミノ酸置換、及び／又はHPIV3 JS cp45のLタンパク質の1558位におけるスレオニンのアミノ酸置換が含まれる。
【００２４】
本発明の組換えPIVを構築するのに使用する、異種の（-）鎖RNAウイルスにおいて同定されるさらに追加の突然変異は、HPIV3 JS cp45のFタンパク質内部におけるアミノ酸置換を含む。1つの例では、異種ウイルスにおける弱毒化突然変異は、HPIV3 JS cp45のFタンパク質の420位におけるイソロイシンのアミノ酸置換を含む。他のやり方では、弱毒化突然変異は、HPIV3 JS cp45のFタンパク質の450位におけるアラニンのアミノ酸置換を含み得る。同様に、組換えPIVの弱毒化は、RSVにおいて同定される弱毒化突然変異に類似の突然変異をコードするように組換えPIVゲノム又はアンチゲノムを修飾することによって達成し得る。以下に説明するそのような実施例では、RSVにおいて同定される弱毒化突然変異がRSVのLタンパク質の521位におけるフェニルアラニンのアミノ酸置換を含む。PIVゲノム又はアンチゲノムは、異種RSV突然変異体における弱毒化突然変異を特徴づける変化に保守的に対応する保存残基の変化をコードするように修飾される。1つの態様では、突然変異が組換えHPIV3タンパク質の内部に取り込まれ、前記HPIV3のLタンパク質の対応する456位におけるフェニルアラニンのアミノ酸置換を含む。
【００２５】
本発明内のさらに追加のPIV候補ワクチン候補物は、センダイウイルス（SeV）において同定される弱毒化突然変異に類似の突然変異をコードするように組換えPIVゲノム又はアンチゲノムを修飾することによって達成し得る。以下に説明するそのような実施例では、弱毒化突然変異がSeVのCタンパク質の170位におけるフェニルアラニンのアミノ酸置換を含む。PIVゲノム又はアンチゲノムは、異種SeV突然変異体における弱毒化突然変異を特徴づける変化に保守的に対応する保存残基の変化をコードするように修飾される。1つの態様では、突然変異が組換えHPIV3タンパク質の内部に取り込まれ、HPIV3のCタンパク質の164位におけるフェニルアラニンのアミノ酸置換を含む。
【００２６】
さらに代表的な態様では、ts又は非ts弱毒化突然変異が麻疹ウイルス（MeV）の組換えタンパク質の内部に取り込まれる。弱毒化突然変異が同定される異種の突然変異（-）鎖RNAウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、ヒトパラインフルエンザウイルス（HPIV）1、HPIV2、HPIV3、ウシPIV（BPIV）、センダイウイルス（SeV）、ニューカッスル病ウイルス（NDV）、シミアン・ウイルス5（SV5）、ムンプスウイルス（MuV）、麻疹ウイルス（MeV）、イヌ・ジステンパーウイルス（CDV）、狂犬病ウイルス（RaV）、又は小疱性口内炎ウイルス（VSV）であり得る。好ましくは、異種の突然変異（-）鎖ウイルスはHPIV3 JS cp45である。より詳細な態様では、HPIV3 JS cp45において同定される弱毒化突然変異はLタンパク質の942位におけるチロシンか又は992位におけるロイシンのアミノ酸置換を含む。
【００２７】
組換え（-）鎖RNAウイルスがキメラウイルスである、本発明のさらに追加の態様が提供される。特に、このウイルスは、1つの種、亜群又は株の（-）鎖RNAウイルスの一部又は全部のゲノム又はアンチゲノムを、異なる種、亜群又は株の（-）鎖RNAウイルスの異種遺伝子又は遺伝子セグメントと組み合わせて含んでなる組換えゲノム又はアンチゲノムを有する。弱毒化突然変異は、所望により、異種遺伝子又は遺伝子セグメントによりコードされるタンパク質又はタンパク質領域の内部に取り込まれ得る。好ましい側面では、このキメラウイルスは、1つのPIVの種、亜群又は株の一部又は全部のゲノム又はアンチゲノムを、異種PIVの種、亜群又は株のHN及びF糖タンパク質遺伝子の少なくとも1つの遺伝子又は遺伝子セグメントと組み合わせて有するPIVである。他の態様では、キメラウイルスはRSVであり、ここでは組換えゲノム又はアンチゲノムが異種RSVの種、亜群又は株由来のF、G及びSH糖タンパク質遺伝子の1つの遺伝子又は遺伝子セグメントを取り込む。好ましくは、ヒトRSV亜群AのF及びG糖タンパク質遺伝子は、RSV Aのバックグラウンドにおいて、ヒトRSV亜群BのF及びG糖タンパク質遺伝子により置換されている。
【００２８】
本発明の他の側面では、組換え（-）鎖RNAウイルスが、組換えゲノム又はアンチゲノムへの追加の変化によってさらに修飾されるか又は弱毒化される。1つの態様では、組換えゲノム又はアンチゲノムが、生物学的に誘導される突然変異（-）鎖RNAウイルスから採られる1つ又はそれ以上の追加の弱毒化突然変異をコードするようにさらに修飾される。例えば、組換えRSVでは、ゲノム又はアンチゲノムが生物学的に誘導される突然変異RSV株のパネル内に存在する少なくとも1つ及び全数までの弱毒化突然変異をコードするように修飾され、前記パネルはATCC VR 2450、cpts RSV 248／404（ATCC VR 2454）、cpts RSV 248／955（ATCC VR 2453）、cpts RSV 530（ATCC VR 2452）、cpts RSV 530／1009（ATCC VR 2451）、cpts RSV 530／1030（ATCC VR 2455）、RSV B-1 cp52／2B5（ATCC VR 2542）、及びRSV B-1 cp-23（ATCC VR 2579）を含んでなる。他のやり方では、組換えPIVにおいて、組換えゲノム又はアンチゲノムがHPIV3 JS cp45の内部に存在する少なくとも1つ及び全数までの弱毒化突然変異をコードする。好ましくは、本明細書で考慮される弱毒化突然変異の少なくとも1つは、突然変異を特定するコドンにおける多数のヌクレオチド変化により安定化される。
【００２９】
本発明の他の側面では、組換え（-）鎖RNAウイルスが、増殖特性の変化、弱毒化、温度感受性、低温適応、小プラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性の変化から選択される表現型の変化を特定するヌクレオチド修飾によりさらに修飾されるか又は弱毒化される。例えばRSVでは、組換えゲノム又はアンチゲノムが、遺伝子の欠失、又は遺伝子発現の除外のような、SH、NS1、NS2又はG遺伝子の修飾を取り込む場合がある。RSV及び他の（-）鎖RNAウイルスにおける他のヌクレオチド修飾は、cis作用性調節配列又は組換えゲノム又はアンチゲノムの内部におけるヌクレオチドの欠失、挿入、付加又は再配置を含む。
【００３０】
他の関連した側面において、本発明は、弱毒化されて、このウイルスによる感染を受けやすい宿主において免疫応答を誘発する、単離された組換え（-）鎖RNAウイルスを提供する。このウイルスは、組換えゲノム又はアンチゲノムと、このRNAウイルスの感染性ウイルス粒子を産生するのに必要なウイルスタンパク質を含む。組換えゲノム又はアンチゲノムは、このウイルスの組換えタンパク質の内部において、異種の突然変異（-）鎖RNAウイルスにおいて同定される弱毒化突然変異のアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置での突然変異をコードするように修飾される。この組換えタンパク質内部に取り込まれる突然変異は、組換えウイルスに弱毒化の表現型を与える。
【００３１】
さらに提供されるのは、組換え（-）鎖RNAウイルスの組換えゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子である。組換えゲノム又はアンチゲノムは、同様に、このウイルスの組換えタンパク質の内部において、異種の突然変異（-）鎖RNAウイルスにおいて同定される弱毒化突然変異のアミノ酸位置に対応するアミノ酸位置での突然変異をコードするように修飾される。この組換えタンパク質内部に取り込まれる突然変異は、組換えウイルスに弱毒化の表現型を与える。関連した側面では、機能可能的に連結した転写プロモーター、上記に示したような組換え（-）鎖RNAウイルスの組換えゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子、及び転写ターミネーターを含む発現ベクターが提供される。
【００３２】
本発明はまた、（-）鎖RNAウイルスに対する保護を誘発するように個体の免疫系を刺激する方法を提供する。この方法には、上記のような弱毒化組換え（-）鎖ウイルスの免疫学的に十分な量を生理学的に許容される担体とともに個体へ投与することが含まれる。関連した側面では、（-）鎖RNAウイルスに対する免疫応答を誘発する免疫原性組成物が提供される。この組成物は、本発明の弱毒化組換え（-）鎖ウイルスの免疫学的に十分な量を生理学的に許容される担体とともに含む。好ましくは、弱毒化組換え（-）鎖ウイルスは、RSV、PIV又は麻疹ウイルスである。
【００３３】
特定の態様の説明
本発明の方法は、ワクチン使用に適した弱毒化組換え（-）鎖RNAウイルスを提供する。組換え（-）鎖RNAウイルスは、このウイルスをコードする1つ又はそれ以上の単離ポリヌクレオチド分子から産生される。組換えウイルスの産生は、（i）このウイルスの組換えゲノム又はアンチゲノム及び（ii）感染性ウイルス又はサブウイルス粒子を産生するのに必要な必須ウイルスタンパク質をコードする1つ又はそれ以上のポリヌクレオチド分子を、細胞又は無細胞系において同時発現させることによって達成される。
【００３４】
前記組換えウイルスの組換えゲノム又はアンチゲノムは、異種の突然変異（-）鎖RNAウイルスにおける弱毒化突然変異の部位に対応する1種又はそれ以上のアミノ酸位置においてウイルスの組換えタンパク質の内部で突然変異をコードするように修飾される。異種の（-）鎖RNAウイルス内に同定される弱毒化突然変異は、このように組換えウイルス内部の対応する部位へ「導入」され、組換えウイルスに弱毒化の表現型を与える。導入される突然変異は、典型的には異種の突然変異ウイルスに同定される弱毒化突然変異に同一であるか又は保守的であるが、非保守的な置換もなし得る。このようにして、組換え（-）鎖RNAウイルスへ導入される突然変異を取り込むことによって、候補ワクチンウイルスは、主題ウイルスによる感染を受けやすい宿主において、そのウイルスに対する所望の免疫応答を誘発するように設計される。
【００３５】
本発明は、異種の（-）鎖RNAウイルスにおける弱毒化突然変異の同定に基づいて弱毒化ワクチンウイルスを合理的に設計する新規なパラダイムを具体化する。異種ウイルスにおける弱毒化突然変異は、例えば、突然変異ウイルスとその非弱毒化親ウイルスとの従来のヌクレオチド又はアミノ酸配列比較により、異種の突然変異ウイルスにおける注目タンパク質内の1つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失、置換又は挿入へマップされる。この文脈では、親ウイルスは典型的には、少なくとも弱毒化の表現型について野生型である生物学的に誘導した株である。しかしながら、部分的に弱毒化した突然変異株も使用し得る。ここでは、人工的な突然変異誘発や天然の多型性により追加の弱毒化突然変異が生じる場合がある。さらに、弱毒化突然変異が導入され、後でマップされ得る親ウイルスには、既知の逆遺伝学の方法によりcDNAウイルス・クローンから提供されるような人工的に産生したウイルスが含まれる。
【００３６】
このように、異種の（-）鎖RNAウイルスにおいて同定される弱毒化突然変異は、すでに知られているか、又は従来の突然変異技術及び／又は逆遺伝学技術により産生及び／又は同定され得る。これらの技術は、例えば野生型又は非弱毒突然変異ウイルスのcDNAクローンの部位特異的突然変異誘発を、弱毒化誘導体を同定する従来のスクリーニング法と組み合わせて、生物学的に誘導される突然変異ウイルスを産生して特徴づけること、または注目の弱毒化突然変異を de novo で産生して特徴づけることに適用し得る。感染性ウイルス・クローンのレスキュー及び遺伝子操作についての逆遺伝子法は、モノネガウイルス全体の代表的なウイルス群について知られている（概論として、Conzelmann, J. Gen. Virol. 77: 381-89 (1996); Palese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 11354-58, (1996) を参照のこと）。
【００３７】
例えば、感染に必須なウイルスタンパク質、即ちヌクレオキャプシドN、リンタンパク質P、及び大ポリメラーゼサブユニットL（例えば、Garcin et al., EMBO J. 14: 6087-6094 (1995); Lawson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 4477-81 (1995); Radecke et al., EMBO J. 14: 5773-5784 (1995); Schnell et al., EMBO J. 13: 4195-203 (1994); Whelan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 8388-92 (1995)；及び国際公開特許第WO97／06270号を参照のこと、これらはいずれも参照により本明細書に組込まれている）と同時発現されるcDNAコード化アンチゲノムRNAからの感染性ウイルス・クローンのレスキューが、狂犬病ウイルス（RaV）、小疱性口内炎ウイルス（VSV）、麻疹ウイルス（MeV）、及びセンダイウイルス（SeV）リンダーペスト（Baron et al., J. Virol. 71: 1265-1271 (1997)）及びシミアン・ウイルスS（He et al. Virology 237: 249-260 (1997)、5頁参照）について報告されている。
【００３８】
感染性呼吸器合胞体ウイルス（RSV）のレスキューも、ヌクレオキャプシドN、リンタンパク質P、大ポリメラーゼサブユニットL、及びかつては特徴づけられなかったM2 ORF1遺伝子の産物とともに同時発現される、cDNAコード化アンチゲノムRNAを使用する新規な系の開発により達成されている（1996年9月27日出願の米国特許出願第08／720,132号［これは、1995年9月27日出願の米国暫定出願第60／007,083号の継続出願である］と1997年7月15日出願の米国特許出願第08／892,403号［これは、公開された国際特許出願第WO98／02530号に対応し、1997年5月23日出願の米国暫定特許出願第60／047,634号、1997年5月9日出願の60／046,141号、及び1996年7月15日出願の60／021,773号の一部継続出願である］を参照のこと。これらはいずれも参照により本明細書に組込まれている）。上記の開示内容には、生物学的に誘導されるRSV突然変異体から採られる弱毒化突然変異を取り込む組換えRSVクローンを含む、感染性組換えRSVの産生に使用する代表的な構築体の説明が含まれる。そのような構築体の1つは、D53-530-部位（）と明示されるRSV突然変異体のcpts530の弱毒化突然変異を取り込んだ組換えウイルス・クローンである。RSVクローンのレスキュー及び遺伝子操作の方法及び組成物に関するさらなる説明は、Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567 (1995); Juhasz et al., Vaccine 17: 1416-1424 (1999); Juhasz et al., J. Virol. 71 (8): 5814-5819 (1997); Whitehead et al., Virology 247 (2): 232-9 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 72 (5): 4467-4471 (1998b); 及び Whitehead et al., J. Virol. 73 (4): 3438-3442 (1999) に提供されている。これらは参照により本明細書に組込まれている。
【００３９】
もう1つの重要な例では、感染性パラインフルエンザウイルス（PIV）のレスキューも、N、P及びLタンパク質と同時発現されるcDNAコード化アンチゲノムRNAを使用することによって達成されている（例えば、1998年5月22日出願の米国特許出願第08／892,403号［これは、公開された国際特許出願第WO98／53078号に対応し、1997年5月23日出願の米国暫定特許出願第60／047,575号、及び60／059,385号の一部継続出願である］を参照のこと。これらはいずれも参照により本明細書に組込まれている）。上記の参考文献には、感染性PIVクローンを産生するのに使用する以下のプラスミドに関する記述が含まれている：p3／7（131）（ATCC 97990）；p3／7（131）2G（ATCC 97989）；及びp218（131）（ATCC 97991）；いずれもブダペスト条約の規約により、バージニア州、マナッサス、ブルヴァール大学、10801、アメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）、20110-22092に保管されている。
【００４０】
（-）鎖RNAウイルスのレスキュー及び操作の逆遺伝学系の開発により、主題のウイルス種に特異的な有用な組換えワクチンを開発するための弱毒化突然変異の詳細分析及びマッピングが可能になる。これまで、モノネガウイルス目では、組換え法による弱毒化突然変異の導入は試験されても達成されてもいない。それでも、RSV、PIV、麻疹及び他のモノネガウイルスメンバーのような代表的な分類群について同定された広範囲の弱毒化突然変異株は、逆遺伝学により提供される強力な手段と組み合わせて、本発明の方法での異種導入に有用な突然変異を決定するための豊かな源として役立つ。
【００４１】
異種の（-）鎖RNAウイルスにおける弱毒化突然変異は、本発明の異種の組換えウイルス内に取り込むための生物学的に誘導される突然変異株において同定され得る。主題の突然変異は天然で起こり得るか、又は既知の突然変異誘発法により、野生型か部分的に弱毒化した親株へ導入され得る。例えば、弱毒化突然変異ウイルス株は、化学的変異原が加えられる細胞培養におけるウイルス増殖時の化学的突然変異誘発によって、増殖制限性の突然変異を導入する次善温度に継代させたウイルスの選択によって、又は細胞培養において小プラーク（sp）又は温度感受性（ts）ウイルスを産生する突然変異したウイルスの選択によって産生され得る（例えば、米国特許出願第08／327,263号を参照のこと。これは参照により本明細書に組込まれている）。
【００４２】
「生物学的に誘導される」突然変異体とは、組換え手段では産生されない突然変異ウイルスを意味する。従って、生物学的に誘導されるウイルスには、基準の野生型配列からのゲノム変異を有する天然に存在する突然変異体、例えば部分的に弱毒化した突然変異PIV株が含まれる。同様に、生物学的に誘導される突然変異体には、組換え法、特に人工的な突然変異誘発及び選択法を用いずに親ウイルス株から誘導される突然変異体が含まれる。
【００４３】
生物学的に誘導される（-）鎖RNAウイルスを産生する1つの有名な方法は、野生型又は部分弱毒化のウイルスを、徐々に低くなる弱毒化温度の細胞培養に通貨させることを含む。例えば、RSVの場合、野生型ウイルスは典型的には約34〜37℃で培養される。部分弱毒化突然変異体は、細胞培養（例、一次ウシ腎臓細胞）において次善温度、例えば20〜26℃で継代させることによって産生される。このように、cp突然変異体又は他の部分弱毒株、例えばts-1又はspRSVは、MRC-5又はVero細胞における継代により、より低い温度、約20〜24℃、好ましくは20〜22℃で効率的に増殖するように適応される。この低温継代時の突然変異体RSVの選択は、部分弱毒の親株に比較して、誘導株における残余のビルレンスを実質的に消失させる。
【００４４】
他のやり方では、野生型又は部分弱毒の親ウイルスを化学的突然変異誘発させることによって、特定の突然変異を生物学的に誘導されるウイルスへ導入し得る。例えば、ts突然変異を導入するか、又はすでにtsであるウイルスの場合は、弱毒化を及び／又はts表現型の安定性を高めることを弱毒化誘導体へ与えるのに十分な追加のts突然変異を導入する。（-）鎖RNAウイルスへts突然変異を導入する手段には、例えば、Gharpure et al., J. Virol. 3: 414-421 (1969) 及び Richardson et al., J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978) に記載の一般的な方法により、約10-3〜10-5M、好ましくは10-4Mの濃度の、5-フルオロウリジン又は5-フルオロウラシルのような変異原の存在下でウイルスを複製させること、約100μg／mlの濃度のニトロソグアニジンにウイルスを曝露することが含まれる。他の化学的変異原も使用し得る。ほとんどのウイルス遺伝子においてts突然変異から弱毒化を生じ得るが、この目的に特に適したターゲットは、高度に保存されたポリメラーゼ（L）遺伝子であることが見出されている。
【００４５】
本発明における使用についての代表的な弱毒化ウイルスにおける複製の温度感受性レベルは、いくつかの制限温度での複製と許容温度でのそれを比較することによって決定される。ウイルスの複製が、許容温度での複製に比較して100倍又はそれ以上低下する最低の温度はシャットオフ温度と呼ばれる。実験動物とヒトでは、代表的な突然変異RSV株の複製とビルレンスは、いずれもこの突然変異体のシャットオフ温度にほぼ相関する。シャットオフ温度が39℃である突然変異体の複製は中等度に制限されるが、シャットオフ温度が38℃の変異体は十分に複製せず、疾患の症状は上気道に主に限定される。35〜37℃のシャットオフ温度を有するウイルスは、典型的にはヒトにおいて完全に弱毒化される。このように、tsである、本発明に使用される弱毒化の生物学的に誘導される突然変異体RSVは、約35〜39℃、及び好ましくは35〜38℃の範囲にあるシャットオフ温度を有する。ts突然変異を部分弱毒株へ追加すると、本発明のワクチン組成物に有用な多数弱毒化されたウイルスが産生される。
【００４６】
候補ワクチンとしての数多くの弱毒化RSV株は、低温継代の間にすでに弱毒化されたウイルスへ複数の突然変異を導入する複数回の化学的突然変異誘発を使用することによって開発された（例えば、Connors et al., Virology 208: 478-484 (1995); Crowe et al., Vaccine 12: 691-699 (1994a)；及び Crowe et al., Vaccine 12: 783-790 (1994b)、参照により本明細書に組込まれている）。受入れられているげっ歯類及びチンパンジーモデル、並びにヒト成人及び幼児におけるこれら生物学的に誘導される突然変異体の評価は、これら候補ワクチン株のあるものが遺伝学的に安定であり、高度に免疫原性であり、及び弱毒化されていることを示している。本発明のPIV及び他の（-）鎖RNAウイルスについて、弱毒化突然変異ウイルスについての同様の説明が提供されている（例えば、米国特許出願第08／892,403号、及び対応する国際特許出願第WO98／02530号；米国特許出願第09／083,793号、及び対応する国際特許出願第WO98／53078号を参照のこと、いずれも参照により本明細書に組込まれている）。
【００４７】
本発明の方法によれば、突然変異体のDNA又はアミノ酸の親株、例えば野生型、又は部分弱毒株のそれとの比較を含む、弱毒化突然変異ウイルスのヌクレオチド配列分析を利用して、弱毒化突然変異を特定のヌクレオチド及びアミノ変化へマップすることができる。しばしば、これらの変化は個々のアミノ酸置換を含むが、本発明の方法により保存的に導入される他の突然変異には、多数のアミノ酸置換、アミノ酸挿入又は欠失、並びにターゲットタンパク質内の保存領域又はドメインのより広汎な変化が含まれる。
【００４８】
上記の逆遺伝学法を利用することによって、弱毒化突然変異ウイルスにおいて同定されるヌクレオチド及びアミノ酸の変化を、すでに特徴づけられたcDNAコード化ウイルスへ導入することが可能であり、それによって当業者は、サイレントの偶発的な突然変異と所望される表現型の変化の原因となる突然変異とを識別することができる。これに関し、主題の突然変異は別個に、様々な組み合わせで、感染性RSVクローンのゲノム又はアンチゲノムへ導入される。この方法により、親ウイルス及び誘導ウイルスの表現型の特徴が評価されるとともに、弱毒化、温度感受性、低音適応、小プラークサイズ、宿主制限などの所望される特徴の原因となる突然変異がさらに同定される。
【００４９】
このように同定され、マップされた突然変異は、本明細書に記載の異種導入法を使用して組換え（-）鎖RNAウイルスを設計するための候補突然変異の豊かな源を提供する。（-）鎖RNAウイルスにおけるそのような弱毒化突然変異を同定して特徴づける代表的な開示は、米国特許出願第08／892,403号、及び対応する国際特許出願第WO98／02530号；及び米国特許出願第08／083,793号、及び対応する国際特許出願第WO98／53078号に提供される。参照により本明細書に組込まれているこれら及び他の参考文献は、本発明の方法による異種ウイルス・クローンへの導入の候補となる弱毒化突然変異の「メニュー」を提供する。
【００５０】
例えば、米国特許出願第08／892,403号及び対応する国際特許出願第WO98／02530号は、cpts RSV 248（ATCC VR 2450）、cpts RSV 248／404（ATCC VR 2454）、cpts RSV 248／955（ATCC VR 2453）、cpts RSV 530（ATCC VR 2452）、cpts RSV 530／1009（ATCC VR 2451）、cpts RSV 530／1030（ATCC VR 2455）、RSV B-1 cp52／2B5（ATCC VR 2542）、及びRSV B-1 cp-23（ATCC VR 2579）と明示される代表的な突然変異体を含む、RSV（ニューモウイルス亜科；ニューモウイルス属）の低温継代（cp）及び温度感受性（ts）突然変異体を記載する。上記の生物学的に誘導される突然変異体から、弱毒化突然変異の代表的なパネルがマップされ、特徴づけられているが、それにはPhe521に対してLeu、Gln831に対してLeu、Met1169に対してVal、及びTyr1321に対してAsnといった弱毒化の置換により例示されるような、Phe521、Gln831、Met1169、Tyr1321の親残基／配列位置におけるアミノ酸置換をもたらす、大ポリメラーゼ遺伝子Lにおける特定のヌクレオチド変化が含まれる。これら突然変異のそれぞれは高度に保存されたLタンパク質において生じ、突然変異ウイルスにts表現型を与える。しかしながら、RSVや他の（-）鎖RNAウイルス、並びに他の保存タンパク質に追加の突然変異が同定され、これがtsと、例えば低温継代（cp）、小プラーク（sp）、低温適応（ca）又は宿主範囲制限（hr）突然変異株に存在するような非ts弱毒化の表現型を含む広範囲の弱毒化表現型を与える。
【００５１】
このように、本発明の方法による組換え（-）鎖ウイルスに取り込まれる代表的な突然変異の追加メニューは、遠縁のパラミクソウイルス、ヒトPIV3（パラミクソウイルス亜科；レスピロウイルス属）についても同定されている。そのような突然変異のパネルの1つは、生物学的に誘導された（低温継代）HPIV3突然変異ウイルス株のJS cp45において同定され、特徴づけられている（参照により本明細書に組込まれている、米国特許出願第08／083,793号及び対応する国際特許出願第WO98／53078号を参照のこと）。この株の内部でマップされ、特徴づけられている突然変異には、Tyr942、Leu992及び／又はThr1558の親残基／配列位置でポリメラーゼL遺伝子においてts弱毒化アミノ酸置換をコードするヌクレオチド変化がある。代表的なJS cp45突然変異Lタンパク質では、Tyr942がHisに置換され、Leu992がPheに置換され、及びThr1558がIleに置換されている。これらの突然変異は、番号で示した突然変異を単独又は組み合わせて取り込んでいる、r942、r992、r1558、r942／992、r992／1558、r942／1558及びr942／992／1558と明示される組換体を含む、様々なPIV組換体に成功して取り込まれている。
【００５２】
HPIV3 JS cp45において同定される他の代表的な突然変異は、HPIV3のF及びCタンパク質における弱毒化アミノ酸置換をコードするようにマップされ、特徴づけられている。これには、Ile96のThrへの置換により例示されるような、JS HPIV3の親残基／位置のIle96でのP遺伝子のCタンパク質における非ts弱毒化アミノ酸置換をコードする突然変異が含まれる。HPIV3のFタンパク質において同定されるさらなる代表的な突然変異は、Ile420がValへ、及びAla450がThrへ置換されることにより例示されるような、Ile420及びAla450の親残基／配列位置におけるアミノ酸置換をコードする。
【００５３】
（-）鎖ウイルス遺伝子の非コード領域もこのように同定される。例えば、弱毒化突然変異には、RSV M2遺伝子開始配列におけるヌクレオチド7605での弱毒化塩基置換により例示されるような、遺伝子開始配列における単一又は多数の塩基変化が含まれ得る。そのような突然変異が異種の（-）鎖RNAウイルス内の保存ヌクレオチド位置へマップされる場合、それらはまた本発明の方法による異種分類群間の導入へも適用される。
【００５４】
このように（-）鎖RNAウイルスにおいて同定されるそれぞれの弱毒化突然変異は、1種又はそれ以上の異種の（-）鎖ウイルスにおける相同タンパク質に対する配列比較の指標を提供する。本発明のこの側面を実施するには、既存の配列並置が分析され得るか、又は従来の配列並置法を利用して配列比較を実施し、1つの（-）鎖RNAウイルスにおいて同定される弱毒化突然変異を担うタンパク質と、組換え弱毒化のターゲットウイルスである異なるウイルスの相同タンパク質との間で、対応するタンパク質領域及びアミノ酸位置を同定する。この実践の焦点は、第一（異種）のウイルスにおける弱毒化突然変異に関連している、つまり親株が突然変異表現型を欠いている親の配列から変化している1つ又はそれ以上の残基を同定することである。配列並置により、ターゲット（組換え）ウイルスタンパク質の対応するアミノ酸位置において同一であるか又は保存されたアミノ酸残基が存在することによって、突然変異体の親配列が保存されているかどうかが決定される。典型的には、このように保存されている「野生型」配列要素はタンパク質の保存領域又はドメインにおいて生じるものだが、アミノ酸残基の単離された残基及びブロックもモノネガウイルス内の異なる分類群間で広く保存されていて、弱毒化突然変異の異種RNAウイルス間の異種導入にとって同じくらい有用なターゲットを提供し得る（ここでは、突然変異変化を担っている保存配列要素の全部又は一部がコピーされるか、又は組換えウイルスへ移入されて新規な弱毒化誘導体を産生する）。
【００５５】
モノネガウイルス間の様々な保存タンパク質は、1つの異種（-）鎖RNAウイルスにおいて見出されるか又は産生される弱毒化突然変異を異なる組換えウイルスへ導入するのに有用な本発明のターゲットを提供する。このことは、モノネガウイルス内の様々な分類群間で構造及び機能が著しく保存されているためである。この目全体で、5種のターゲットタンパク質が過去の共通祖先ウイルスから誘導された、受け入れられた相同タンパク質として普遍的に保存されている。上記タンパク質は、特に共通の機能属性を共有すると主張されている特定の領域又はドメインにおいて、典型的には中等度から高度の配列同一性を示す。特定すると、既知の（-）鎖RNAウイルスは、ヌクレオキャプシドタンパク質（N）、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）、非糖鎖結合マトリックス（M）タンパク質、少なくとも1つの表面付着糖タンパク質（HN、H又はG）、及び大ポリメラーゼ（L）タンパク質を含んでなる、相同なタンパク質の組成を共有する。これらのタンパク質は、ターゲットウイルスと異種の親ウイルスとの間で共有され、それにより突然変異誘導体又は構築体が弱毒化の表現型を特定するアミノ酸変化を示すことが同定される、1つ又はそれ以上の保存残基の変化による弱毒化突然変異を導入するのに有用なターゲットの代表となる保存された配列要素をそれぞれ示す。モノネガウイルスの特定の科、亜科、属又は種の間でのみ共有されている追加のタンパク質もこのようにターゲットになる。
【００５６】
モノネガウイルス目は、フィロウイルス、パラミクソウイルス、ボルナウイルス及びラブドウイルスの科を含み、これらはいずれも単独の（-）鎖RNAゲノムを有するウイルスからなる。Pringle, Arch Virol. 117: 137-140 (1991)。この群の命名に関する要約が、科／亜科／一般的なタイプ特有の群分けに関する同定を含め、Pringle, Arch Virol. 142 (11): 2321-2326 (1997) に提供されている。代表的なモノネガウイルスの分類、及び拡張したパラミクソウイルスの分類を本明細書の表1に示す。線状の（-）鎖RNAゲノムを有するこれら3種のウイルス科の遺伝子構成に明らかな共通の特徴から、特にこれらウイルスにおいて遺伝的組換えが起こるとしても稀にしか起こらず、従って表現型の関係が遺伝的連続性を反映するという事実に照らせば、それらを目としてともに群分けすることが正当化される。
【００５７】
【表１】
Figure 0004646410
【００５８】
ボルナウイルス及びフィロウイルス科は、単一の属により表される。ボルナウイルス属は単一の種のみ含有する（ボルナ病ウイルス）。フィロウイルス属（代表種：マールブルグウイルス）には、付着（G）タンパク質のヌクレオチド配列及び抗原性の多様性と異なる発現により4つの種が認められている。ラブドウイルス科には5種の属、べジクロウイルス、リッサウイルス、エフェメロウイルス、サイトラブドウイルス、及びヌクレオラブドウイルスが含まれ、これらは配列及び抗原性の違いに加え、宿主範囲、補助遺伝子の存在、及び細胞内の増殖部位によっても識別される。パラミクソウイルス科は2種の亜科により表される：3種の属、レスピロウイルス（代表種：HPIV1）、モルビリウイルス（代表種：MeV）及びルブラウイルス（代表種：MuV）を有するパラミクソウイルス亜科と、ニューモウイルス亜科（代表種：ヒトRSV）である。トリニューモウイルスを含む属を追加することが考慮されている。
【００５９】
この属のすべてのメンバーで5〜10種の遺伝子があり、転写はウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼにより単一の推定3’端プロモーターから開始される。ある種のニューモウイルスを例外として、遺伝子の順序は厳格に保存されている。Pringle, Arch Virol. 142 (11): 2321-2326 (1997) の図1では、モノネガウイルス内の異なる科、亜科及び属を代表する16種のウイルスについて遺伝子が比較され、この遺伝子群が記載の様々な分類群間の相同体として分類され、群分けされている。このように、VSVには最少数が5種の遺伝子を有することが示されている：ヌクレオタンパク質（N）、リンタンパク質（P）、マトリックスタンパク質（M）、付着タンパク質（G）、及びポリメラーゼタンパク質（L）である。ボルナウイルス科のボルナ病ウイルス、フィロウイルス科のエボラウイルス、及びラブドウイルスの8種のメンバーは基本5種の遺伝子パターン（N-P-M-G-L）を示し、エボラウイルスと8種のラブドウイルスの4種ではGとLの間に、又は残る4種のラブドウイルスの3種ではPとMの間に、1つ又はそれ以上の遺伝子が挿入されている。パラミクソウイルス亜科のパラミクソウイルスは複雑性の増加を示す；基本5種の遺伝子パターンが、P遺伝子の遺伝情報の多数コーディングと、M及び付着タンパク質（H又はHN）間の追加被膜タンパク質遺伝子（F）の挿入により増強されていて、ある種のルブラウイルスではさらにSHにより増強されている。パラミクソウイルスのすべては少なくとも2種の表面糖タンパク質、HN（又はHかG）及びFを有する。レスピロウイルス、ルブラウイルス及びモルビリウイルス属のほとんどすべてのメンバーは、システインリッチなVタンパク質を有する。レスピロウイルス及びモルビリウイルスはまた、相同なCタンパク質をコードする。ニューモウイルスとルブラウイルスの亜集合（シミアン・ウイルス5（SV5）及びムンプスウイルス（MuV））は相同の表面糖タンパク質、SHを共有する。ニューモウイルス属（ウシ、ヒツジ及びヤギのRSVと、マウスのニューモウイルス［本明細書ではマウスRSVと呼ぶ］を含む）のなかでは、いくつかの追加のタンパク質、NS1、NS2、M2（ORF1）及びM2（ORF2）が保存されている。ニューモウイルス亜科のパラミクソウイルスは、基本パターンから独特の変異を示し、その最も重要なことは追加の遺伝子を有することである。トリ、ヒト及びマウスのニューモウイルスでは、M2遺伝子が異なるリーディングフレームにある2種のタンパク質をコードし、そのいずれもin vitroでのRNA合成に対し顕著な効果を及ぼす。ヒト及びマウスのニューモウイルスでは、機能不明の非構造タンパク質であるNS1及びNS2をコードする2種の遺伝子が3’-リーダー領域とNとの間に位置している。トリニューモウイルスは基本パターンに最も近く、2種の特有な3’端NS遺伝子を欠き、M2遺伝子の挿入を除けば、標準的なパラミクソウイルス遺伝子の順序を保持している。このゲノム組成の保存パターンは、外からの遺伝情報の導入よりは、遺伝子内領域の拡張と遺伝子重複による進化を示唆する。Pringle, Semin. Virol. 8: 49-57, 1997。
【００６０】
上記のように、本発明の方法は、第一の（-）鎖RNAウイルスにおける弱毒化突然変異の同定に基づいていて、この突然変異は突然変異体を野生型の配列との比較によりマップされ、突然変異部位を特徴づける主題のアミノ酸位置が同定される。好ましくは、これらの突然変異は、主題の変化が確かに弱毒化の表現型を特定することを証明するために、非弱毒化、又は部分弱毒化の組換えウイルス・クローンへ取り込まれる。この文脈における一群の代表的な弱毒化突然変異が本明細書の開示において提供され、他の弱毒化突然変異も、本明細書の記載による既知の変異原及び逆遺伝子技術によって容易に同定し得る。1つの（-）鎖RNAウイルスにおいて同定されるそれぞれの弱毒化突然変異は、1つ又はそれ以上の異種の（-）鎖ウイルスにおける相同タンパク質に対して配列を比較するための指標を提供する。
【００６１】
本発明の上記側面を実施するには、既存の配列並置が分析され得るか、又は従来の配列並置法を利用して、分析用に配列比較を産生し、弱毒化突然変異を担うタンパク質と弱毒化のターゲット組換えウイルスである異なるウイルスの相同タンパク質との間で、対応するタンパク質領域及びアミノ酸位置を同定する。弱毒化突然変異を特徴づける1つ又はそれ以上の残基がターゲットウイルスタンパク質の対応するアミノ酸位置で保存されている（つまり、同一であるか、又は保守的に関連しているアミノ酸残基により代表される）、親の、例えば野生型の同一性から変化している場合、ターゲットウイルスのゲノム又はアンチゲノムは、アミノ酸の欠失、置換又は挿入をコードするように組換え的に修飾され、ターゲットウイルスタンパク質における保存残基を変化させ、それにより組換えウイルスに類似した弱毒化の表現型を与える。
【００６２】
本発明のこの側面を実施する配列並置及び分析は、相同の「対」遺伝子、遺伝子セグメント、タンパク質及び／又はタンパク質ドメインに集中し、ここでは統計的な配列比較の基礎を提供するために、ポリヌクレオチド又はアミノ酸の参照配列が規定の配列として使用される。例えば、参照配列は、cDNA又は遺伝子の規定セグメント、完全なcDNA又は遺伝子配列、又はタンパク質又はその一部分の配列であり得る。
【００６３】
一般に、対遺伝子又は遺伝子セグメントを規定するのに使用するための参照配列は、少なくとも20ヌクレオチドの長さ、頻繁には少なくとも25ヌクレオチドの長さ、及びしばしば少なくとも50ヌクレオチドの長さであり、タンパク質及びタンパク質セグメントでは、少なくとも20アミノ酸の長さである。2種のポリヌクレオチド又はアミノ酸配列がそれぞれ（1）2種のポリヌクレオチド又はタンパク質間で同様である配列（即ち、完全なポリヌクレオチド又はタンパク質の配列の一部）を含み、及び（2）2種のポリヌクレオチド又はタンパク質の間で変化している配列をさらに含む場合、2種（又はそれ以上）のポリヌクレオチド又はタンパク質間での配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」全体について2つの主題配列の配列を比較して、局所領域の配列同一性又は類似性を同定して比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用されるように、少なくとも20個の連続したヌクレオチド又はアミノ酸の位置からなる概念上のセグメントを意味し、ここで少なくとも20個の連続したヌクレオチド又はアミノ酸の参照配列に対しある配列が比較され、ここで比較ウィンドウにあるポリヌクレオチド又はアミノ酸の部分は、2つの配列の最適並置について、参照配列（追加又は欠失を含まない）に比較して20％又はそれ以下の追加又は欠失（即ち、ギャップ）を含む場合がある。
【００６４】
比較ウィンドウを並置するための最適並置法は、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) の局所相同アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970) の相同並置アルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) の類似性サーチ法（いずれも参照により本明細書に組込まれている）、上記アルゴリズムのコンピュータ化法（Genetics Computer Group, 575 Science Dr., マジソン、WIのWisconsin Genetics Software Package Release 7.0のGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA；いずれも参照により本明細書に組込まれている）、又は視察により実施され得て、様々な方法により産生される最適の並置（即ち、比較ウィンドウ全体で最も高い比率の配列類似性をもたらす）が選択される。
【００６５】
「配列同一性」という用語は、本明細書で使用されるように、2種のポリヌクレオチド又はタンパク質の配列が比較ウィンドウ全体で同一である（即ち、ヌクレオチド-ヌクレオチド又は残基-残基ベースで）ことを意味する。「配列同一性比率」という用語は、比較ウィンドウ全体で2種の最適並置された配列を比較すること、同一の核酸塩基（例えば、A、T、C、G、U又はI）又はアミノ酸残基が適合位置の数を生じる両配列間で起こる位置の数を決定すること、適合した位置の数を比較ウィンドウの位置の全数（つまり、ウィンドウの大きさ）で割ること、及びこの結果を100倍して配列同一性比率のパーセントを得ることによって算出される。
【００６６】
「実質的同一性」という用語は、本明細書で使用するように、少なくとも20のヌクレオチド又はアミノ酸の位置の比較ウィンドウ、しばしば少なくとも25〜50のヌクレオチド又はアミノ酸のウィンドウの全体で、少なくとも85％の配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95％の配列同一性、及びときには99％又はそれ以上の配列同一性を共有する2種のポリヌクレオチド又はアミノ酸の配列の特性を意味し、ここで配列同一性比率は、比較ウィンドウ全体で参照配列の20％又はそれ以下になる欠失又は追加を含み得る比較配列に対して参照配列を比較することによって算出される。参照配列はより大きな配列の亜集合であり得る。
【００６７】
タンパク質とタンパク質内部の構造要素に対して適用されるように、「配列同一性」という用語は、諸配列が対応する位置で1つ又はそれ以上の同一アミノ酸を共有することを意味する。「配列類似性」という用語は、2種の配列が対応する位置で、例えば保守的置換により、1つ又はそれ以上の保守的に関連しているアミノ酸を共有することを意味する。「実質的な配列同一性」という用語は、2種のペプチド配列が、デフォルトギャップウェートを使用するGAP又はBESTFITプログラムによるように最適に並置されたとき、少なくとも85％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％又はそれ以上（例えば、99％）の配列同一性を共有することを意味する。「実質的類似性」という用語は、2種のペプチド配列が配列類似性に対応する比率を共有することを意味する。
【００６８】
保守的な配列関連性は、2種の配列間の対応する位置のアミノ酸残基が同一ではないが、保守的なアミノ構造関連性で異なるときにも存在する。この文脈では、保守的なアミノ酸置換は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基の一般的な相互交換性を意味する。例えば、脂肪族の側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群はセリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群はアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族の側鎖を有するアミノ酸の群はフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり；塩基性の側さを有するアミノ酸の群はリジン、アルギニン及びヒスチジンであり；イオウ含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステイン及びメチオニンである。好ましい保守的なアミノ酸置換の群は：バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、及びアスパラギン-グルタミンである。20種の従来アミノ酸の立体異性体（例、D-アミノ酸）、α,α-2置換アミノ酸のような非天然アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来的なアミノ酸も本発明のポリペプチドに適した成分であり得る。非従来的なアミノ酸の例には：4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、ω-N-メチルアルギニン、及び他の類似アミノ酸とイミノ酸（例、4-ヒドロキシプロリン）が含まれる。さらに、アミノ酸はグリコシル化、リン酸化などにより修飾され得る。
【００６９】
本発明の上記側面の実施を促進するには、モノネガウイルス目の中に保存されているウイルスタンパク質の既知の分子系統学が参照される。この点で、広汎な研究が正確な分子レベルでのタンパク質関連性の詳細な評価を提供してきた。これらの研究には、モノネガウイルス間の保存タンパク質についての詳細な配列比較が含まれ、保存された構造ドメイン、配列要素、及びこれらタンパク質内部の束縛され、単離された残基についての広く受入れられたマップがもたらされている。これらの保存されたタンパク質ドメイン、配列要素、及び束縛された残基のそれぞれは、異種の弱毒化突然変異ウイルス由来の弱毒化突然変異を異なる組換えウイルスへ本発明の方法により保存導入するのに有用なターゲットを提供することによって、本発明の実施を促進する。
【００７０】
例えば、Poch et al., J. Gen. Virol. 5: 1153-62, (1990)（参照により本明細書に組込まれている）は、ラブドウイルス（VSV及びRaV）とパラミクソウイルス（SeV、NDV及びMeV）のLタンパク質を含む、モノネガウイルス内の5種のLタンパク質について、演繹アミノ酸配列の詳細な比較を提供する。従来の並置法（参照により本明細書に組込まれている）は、多様なウイルス科由来のこれらLタンパク質がそのほとんどの長さに沿って高度の相同性があること---強く不変のアミノ酸が比較的よく保存されている領域により分離された保存ブロックの中に埋め込まれていることを示す。このように、異種の（-）鎖RNAウイルス由来のこれら異なるLタンパク質は、連鎖状の機能ドメインの保守的な構造を有する。例えば、Lタンパク質には、RNA合成の活性部位を含有すると考えられる高度に保存された中心領域が含まれる。ストリンジェントに保存された単離残基を含む、他の保存構造ドメイン、モチーフ及び配列要素も同定され、そのいくつかは保存された中心コアの周囲に分布し、ポリメラーゼ活性にとって重要であると考えられている。Lタンパク質に同定される、これらの保存配列要素（参照により本明細書に組込まれている、Poch et al., J. Gen. Virol. 5: 1153-62, (1990) 及び Poch et al., EMBO J. 8 (12) 3867-3874, (1989)、特に図1を参照のこと）は、弱毒化突然変異が産生され、マップされた異種の親株のLタンパク質配列と比較するための詳細な情報を提供する。このように、本明細書に組み込まれている公表文献に提示された配列決定法及びデータを含む、上記及び他の配列決定法及びデータを使用して、弱毒化突然変異を特徴づける残基が、ターゲットウイルスのLタンパク質における対応するアミノ酸の位置で保存されている（即ち、同一であるか、又は保守的に関連したアミノ酸の残基により表される）親の、例えば野生型の同一性から変化しているかどうかが容易に決定され得る。この決定は、異種ウイルスにおいて同定される弱毒化突然変異の、組換えターゲットウイルスのアンチゲノム又はゲノムへの取り込みが成功するための高い確率を示す。
【００７１】
モノネガウイルス全体の様々なLタンパク質相同体間の構造保存に関するさらなる詳細が、参照により本明細書に組込まれている Stec et al., Virology 183: 273-287 (1991) に提供される。この配列分析は、3種のパラミクソウイルス、レスピロウイルス属由来の2種（PIV3及びSeV）とルブラウイルス属由来の1種（NDV）、モルビリウイルス属由来の1種のパラミクソウイルス（MeV）、及びラブドウイルス科由来の2種のウイルス（RaV及びVSV）についてのL遺伝子及びタンパク質の公表された配列に基づいていて（例えば、Schubert et al., 1985; Shioda et al., 1986; Yusoff et al., 1987; Blumberg et al., 1988; Galinski et al., 1988; 及び Teart et al., 1988 を参照のこと。これらはいずれも参照により本明細書に組込まれている）、RSVについての追加の配列情報及び並置結果を提供する。上記の結果により、パラミクソウイルス及びラブドウイルス科内での著しい配列保存性に関する Poch et al., 同上の教示が確認され、さらに追加の保存された構造ドメイン、モチーフ及び配列要素が同定される。
【００７２】
簡潔に言うと、Stec et al. の開示は、従来の並置法に依存し、これは、他の同様の方法のなかで、本発明において有用である。特に、Stec et al. は、それぞれ12及び6の欠失及びギャップのペナルティと、Dayhoff et al., "Atlas of Protein Sequence and Structure" (M. O. Dayhoff, Ed.), Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Silver Spring, MD (1978) の類似性スコアリングマトリックスを使用する、受入れられた Wilbur and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730 (1983) の方法を使用して、異種の（-）鎖RNAウイルス配列を並置した（これらはいずれも参照により本明細書に組込まれている）。類似性スコアリングシステムは、表1に列挙されたRSVと他の（-）鎖RNAウイルスのLタンパク質間の対合グローバルドットマトリックス並置を構築するために使用された。上記の方法により、明瞭な配列関連性の領域がRSV Lタンパク質と遠縁のパラミクソウイルス及びラブドウイルスのLタンパク質との間で検出された。図3に示すように、RSV Lタンパク質と他のそれぞれとの配列関連領域は、同じ順序で直線上に並び、アミノ近位領域に集中し、各分子の約1／5を代表する。同一の配列類似性パターンが、Poch et al. (1989), 同上により実施されたSeV、MeV、NDV、RaV及びVSVのLタンパク質の5群並置を含む、他のパラミクソウイルス及びラブドウイルスのLタンパク質のかつての並置に認められた（Blumberg et al., 1988, Galinski et al., 1988; Teart et al., 1988、いずれも参照により本明細書に組込まれている）。
【００７３】
Stec et al.，同上の7群並置では、RSV Lタンパク質が、他の（-）鎖RNAウイルスに比較して、約70個のアミノ酸のアミノ末端拡張と約100個のアミノカルボキシ末端切れを含有することが決定された。しかしながら、この変化は保守的な構造要素を同定する並置法の信頼性には影響せず、RSV Lタンパク質が上流の隣りにあるM2遺伝子（かつては22Kと呼ばれた）と重複しているL遺伝子により部分的にコード化されるという事実によると考えられている（Collins et al., 1987、参照により本明細書に組込まれている）。
【００７４】
Stec et al.，同上の開示は、様々な分類群間でほとんど正確に保存されている異種の（-）鎖RNAウイルスのLタンパク質にある多数の短セグメントの存在を確認する。これらのほとんど同一なセグメントは、RSV Lタンパク質において保存され、Stec et al.の図4（参照により本明細書に組込まれている、箱で囲んだ配列を参照のこと）に示される高度保存領域のなかに存在することも示されている。これら6種のセグメント内のアミノ酸の同一性は、7種のタンパク質間で30〜80％異なる。同定されたセグメント内の数多くの残基が、並置を実施した7種の異なる（-）鎖RNAウイルス間で不変である。さらに、注目されるのは、これら保存セグメント内で置換が起こった場合、多くが保守的な置換により特徴づけられることである。かつて注目されたように、2種のウイルス科の各メンバー間にこれらセグメントの高度の同一性があることは、それらがLタンパク質の機能にとって重要であることを示唆する。
【００７５】
より特定の詳細では、Stec et al.，の図4にあるモノネガウイルス内の多様な分類群間で並置されたLタンパク質の最も高度に保存された領域はまた、Poch et al., (1989), 同上により同定されたモチーフに一致する4種の特徴的なポリメラーゼモチーフ（下線を施し、A-Dと明示されている）も含有する。4種のポリメラーゼモチーフに相同なこれら領域は、アミノ酸696〜887の間にあるRSV Lタンパク質において同定された。4種のモチーフのうち3つ（A-C）は、上記パラミクソウイルス及びラブドウイルスのLタンパク質の高度保存セグメントに一致する。Dセグメントはこれらウイルス間であまり保存されていないが、この要素の典型である単一不変のリジンと保存されたグリシン（それぞれ、RSVのK-886とG-877）を含有する。
【００７６】
（-）鎖RNAウイルス間で共有され、本発明のターゲットタンパク質として有用である他のタンパク質についても、同じように詳細な配列の並置及び分析が公表されている。この点で、参照により本明細書に組込まれている Barr et al., J. Gen. Virol. 72: 677-685 (1991) は、モノネガウイルスの異種メンバー間でNタンパク質の配列保存を分析した。特に、この研究は、RSV及びPVMのNタンパク質の予測アミノ酸配列間で高レベルのアミノ酸同一性（60％）があることを示した（参照により本明細書に組込まれている、図7を参照のこと）。アミノ酸残基1〜150と150〜393がそれぞれ38％と74％の同一性を含有するのに対し、残基245〜315は71個のうち68個の同一アミノ酸を含有する（96％の同一性）。これらタンパク質のこの高い保存性は、RSVとPVMのNタンパク質が血清学的に関連しているという観察事実に一致している（Gimenez et al., 1984; Ling & Pringle, 1989）。
【００７７】
PVMとモノネガウイルスのより多様なメンバーのNタンパク質のアミノ酸配列をコンピュータマトリックス比較しても、保存領域が明らかになる（Barr et al.,同上、図5）。この文脈における配列保存は、PVM及びエボラウイルスのNタンパク質間にまで及ぶ。さらに、分節化しない（-）鎖ウイルスの広汎な群のメンバーに由来するNタンパク質のヒドロパシープロフィール（hydropathy profile）は、パラミクソウイルスとモノネガウイルス間で最大の配列類似性がある領域において互いに似ている（Galinski et al., 1985, 参照により本明細書に組込まれている）。各タンパク質のアミノ末端から130〜170残基ではじまる約180個のアミノ酸が交互の疎水性及び親水性の領域を形成する。これらアミノ酸配列についての2次構造予測（Garnier et al., 1978, 参照により本明細書に組込まれている）は、この保存されたヒドロパシー領域が高比率のα-ヘリックスではじまり、高比率のβ-シート及び逆ターンで終わる可能性があることを示唆する。上記のデータは、これら保存タンパク質が類似のヒドロパシー領域全体で類似の折りたたみ構造を有する可能性があることを示唆する。
【００７８】
有名なCLUSTALプログラムを使用する、保存ヒドロパシー領域に集中した代表的なNタンパク質に関するさらなる並置研究（Higging & Sharp, Gene 33: 237-244 (1988), 参照により本明細書に組込まれている）は、さらに追加の保存タンパク質ドメイン、構造モチーフ、及び単離された保存アミノ酸残基を指摘する（Barr et al., 図7、ボックスA、B及びCを参照のこと）。この研究から、SeV、VSV、及びPVMのNタンパク質間の保存が、PVM配列のカルボキシ末端の半分の規定領域において特に高いことが見出された（図7、ボックスC）。この領域は、99未満のウィンドウを用いたエボラウイルスとPVMとのDIAGON比較でも同定された。この諸配列内で、2つの短い類似領域も検出された。いずれも、単一の保存塩基性アミノ酸により中断される疎水性領域を含む（K又はR；図7のボックスA及びB）。対応する領域には、他のパラミクソウイルス及びラブドウイルスのNタンパク質で、同様の隙間がある。これらの領域における同一性のレベルは、Barr et al. の表1に記載されている。最高の同一性比率はあるウイルス科の中で見られるが、特に保守的置換を考慮するとき、ウイルス科の間のこれら領域にも高レベルの類似性が示される。
【００７９】
本発明の実施を促進するのは、モノネガウイルスの異種メンバー間での高度の分子保存を確認する、個別の公表された並置である。例えば、参照により本明細書に組込まれている Parks et al., Virus Res. 22: 259-279, (1992) は、10種の異なるパラミクソウイルスに由来するNタンパク質のアミノ酸配列のコンピュータ支援並置について説明する。参考文献の図3に示されるように、Nタンパク質の中央付近の特徴的な領域（SV5の残基323-340）は、様々な分類群のNタンパク質間で、不変の疎水性モチーフF-X4-Y-X4-S-Y-A-M-G（ここでXは任意の残基である）を含む、広範囲の配列保存性を含有する。陰電荷のアミノ酸であるグルタミン酸塩とアスパラギン酸塩が多い、第二の高度保存ドメインが、Nタンパク質のC末端領域で同定された（SV5の残基455-469）。
【００８０】
Nタンパク質の分子保存に関するもう1つの研究で、参照により本明細書に組込まれている Miyahara et al., Arch. Virol. 124: 255-268 (1992) は、HPIV-1のNタンパク質のアミノ酸配列を、12種の他のパラミクソウイルス、HPIV-2（Yuasa et al., Virology 179: 777-784 (1990)）；HPIV3（Galinski et al., Virology 149: 139-151 (1986)）、HPIV-4A及び4B（Kondo et al., Virology 174: 1-8 (1990)）、SV5及びSV41（Tsurudome et al., J. Gen. Virol. 72: 2282-2292 (1991)）、MuV（Elango, Virus Res. 12: 77-86 (1989)）、SeV（Morgan et al., Virology 135: 279-287 (1984)）、PIV-3（Sakai et al., Nucleic Acids Res. &: 2927-2944 (1987)）、NDV（Ishida et al., Nucleic Acids Res. 14: 6551-6564 (1986)）、MeV、及びCDV（Rozenblatt et al., J. Virol. 53: 684-690 (1985)）の対応する配列と比較した（上記参考文献は、それぞれ参照により本明細書に組込まれている）。
【００８１】
Miyahara et al., の図3に示されるように、HPIV1のN遺伝子は、SeVと広汎な相同性を示す；ヌクレオチド及びアミノ酸の同一性は、それぞれ70.8％及び87.8％であった。HPIV-1のNタンパク質もHPIV-3（63.1％）及びBPIV-3（63.3％）と高いアミノ酸同一性を示したが、NDV（20.9％）、MeV（20.5％）、CDV（19.6％）、SV41（18.6％）、SV5（17.9％）、HPIV-4A（17.9％）、HPIV-4B（17.5％）、HPIV-2（11.5％）及びMuV（17.1％）には低い同一性を示した。プロテアーゼ感受性の「ヒンジ」がSeV Kタンパク質の2つの規定ドメイン連結部で見出された；（1）RNAと直接相互作用するアミノ末端ドメイン、及び（2）組立てられたヌクレオキャプシドの表面に存在するカルボキシル末端ドメインである（Heggeness et al., Virology 114: 555-562 (1981), 参照により本明細書に組込まれている）。
【００８２】
Miyahara et al., に詳しく記載されているように、あらゆるパラミクソウイルスのNタンパク質で26個のアミノ酸が保存され、保存されたNドメインがアミノ酸260-360の間のNタンパク質に同定された。さらに、HPIV-1とSVのNタンパク質には、40個のグリシンのうち37個が、13個のプロリンのうち13個が保存されていて、これらSeVタンパク質が共通の3次構造を維持することを示唆している。
【００８３】
Miyahara はまた、HPIV-1のMタンパク質と他の13種のパラミクソウイルスとの間でMタンパク質の配列を比較した（例えば、Miyahara et al. の図4を参照のこと）。これらの異種ウイルスも、Mタンパク質配列要素の高度の構造保存性を示した。例えば、HPIV-1とSeVは、Mについてそれぞれ72.6％及び88.4％のヌクレオチド及びアミノ酸の同一性レベルを示した。HPIV-1はまた、HPIV-3（65.7％）及びBPIV-3（65.4％）と高レベルの保存を、MeV（36.4％）、CDV（34.6％）及びRPV（36.7％）と中等度の保存性を示した。HPIV-1の5個のシステインの全部、22個のプロリンの20個、25個のグリシンの24個がSeVに保存され、このうちのほとんどすべてがPIV-3でも保存されていた。上記の知見は、Mタンパク質の3次構造がHPIV-1、SeV、HPIV-3及びBPIV-1に保存されている可能性があることを示す。さらに、比較したすべてのパラミクソウイルスのMタンパク質で14個のアミノ酸が保存されていた。
【００８４】
追加の配列並置及び分析が、モノネガウイルスにおいてやはり普遍的に保存されていて、従って本発明における突然変異の異種導入に特に有用なターゲットであるPタンパク質について公表されてきた。例えば、参照により本明細書に組込まれている Kondo et al., Virology 178: 321-326 (1990) を参照のこと。この文脈では、SeV（Giorgi et al., Cell 35: 82-836 (1983); Neubert, Nucleic Acids Res. 17: 10-101 (1989), 参照により本明細書に組込まれている）及びPIV3（Luk et al., Virology 153: 318-325 (1986), 参照により本明細書に組込まれている）のPタンパク質が大きさにおいて近似していて、それぞれ568個と603個のアミノ酸からなる。様々な分類群、例えばMuV、SV5、PIV-2及びNDVの中でP遺伝子は、それぞれ、391、392、395及び395個のアミノ酸を含有するタンパク質をコードする（Takeuchi et al., J. Gen. Virol. 69: 2043-2049 (1988); Thomas et al., Cell 54: 891-902 (1988)；及び Sato et al., Virus Res. 7: 241-255 (1987)）。MeV及びCDVのPタンパク質は、大きさにおいて中間的である（Barret et al., Virus Res. 3: 367-372 (1985); Bellini et al., J. Virol. 53: 908-919 (1985)）。
【００８５】
Kondo et al., Virology 178: 321-326 (1990) により比較されたすべての異種ウイルスのP特異領域は、利用される従来法（参照により本明細書に組込まれている）により並置され得る。PIV-4A、PIV-4B、SV5、PIV-2、MuV、NDV、MeV、CDV、PIV-3及びSeVの間で特徴的な保守的構造要素が同定された（参照により本明細書に組込まれているKondoの論文の図2を参照）。このように、Pタンパク質の分子系統学に関するこの研究や他の公表された研究は、異種突然変異ウイルス由来の弱毒化突然変異の組換えウイルス株への取り込みのターゲットを評価するのに突然変異部位を並置するためのさらに追加の保存タンパク質ドメイン、構造モチーフ、アミノ酸セグメント及び単離残基を同定する。
【００８６】
モノネガウイルス内で代表される全範囲のタンパク質に適用される本発明の実施を促進するさらなる配列並置及び分析も提供される。簡潔に言えば、参照により本明細書に組込まれている Yuasa et al., Virology 179: 777-784 (1990) は、ヒト及び非ヒトパラインフルエンザウイルス、PIV-4A、PIV-4B、MuV、NDV、MeV、PIV-3、BPIV-3、SeV及びRSVの3’遺伝子末端及びN遺伝子に保存された構造要素を同定する（例えば、図2及び4参照）。Kawano et al., Virology 174: 308-313 (1990) は、8種の異種パラミクソウイルスについてHNタンパク質の例示的な並置及び分子分析を提供する（例えば、図2を参照のこと）。Tsurudome et al., J. Gen. Virol. 72: 2282-2292 (1991) は、HPIV-2、SV5及びSV41のNタンパク質について例示的な並置及び分析を提供する（例えば、図3を参照のこと）。Spriggs et al., 1986, Virology 152: 241-251 (1986) は、RSVを含む異種パラミクソウイルスに構造的に保存されたFタンパク質の要素を同定する。Higuchi et al., J. Gen. Virol. 73: 1005-1010 (1992)（例えば、図4参照）、Kawano et al., Nuc. Acids Res. 19 (10): 2739-2746 (1991)（例えば、図2及び6参照）、Muhlberger et al, Virology 187: 534-547 (1992)（例えば、図4及び6参照）及び Ogawa et al., J. Gen. Virol. 73: 2743-2750 (1992)（例えば、図3参照）は、モノネガウイルスの大集合分類群間のLタンパク質と3’及び5’非コーディングゲノム末端についてのものである。モノネガウイルス内のN、P、C、L、M、HN、F、SH、V、D及び追加のORFと遺伝子産物間の分子保存について詳述する追加の引用文献を含む、より総合的な概説が Collins et al., Fields Virology, Fields et al. eds., 3rd edition, Chapter 41: 1205-1241, Lippincott-Raven, Philadelphia (1996) により提供される。上記研究はいずれも参照により本明細書に組込まれていて、本発明の教示による組換えワクチンウイルス内に弱毒化突然変異を取り込むためのターゲット部位を代表する規定の位置において保存された構造要素を同定する並置及び図表を含む。
【００８７】
本発明のより詳細な側面では、異種ウイルスにおいて同定された突然変異の導入により弱毒化された組換え（-）鎖RNAウイルスは、キメラウイルス、例えばキメラRSV又はPIVウイルスとして設計される。本発明のキメラ（-）鎖ウイルスは、感染性のキメラウイルス又はサブウイルス粒子を産生する1種以上のウイルス株又は亜群からヌクレオチド配列を取り込むように組換え的に設計される。このようにして、ヒト及び非ヒト霊長類を含む、哺乳動物の宿主において免疫応答を誘発させるように候補ワクチンウイルスが組換え的に設計される。本発明によるキメラウイルスは、特定のウイルス亜群又は株に対する免疫応答を誘発させるか、又は多数のウイルス亜群又は株に対する多特異的な応答を誘発させる場合がある。
【００８８】
代表的な態様では、上記のような弱毒化突然変異を取り込むキメラウイルスはまた、例えば、異種RSV由来の対配列を置換してキメラRSVゲノム又はアンチゲノムを産生することによって、主題ウイルスの組換えゲノム又はアンチゲノムへ加えられるか、又は取り込まれる異種ウイルスの異種遺伝子又は遺伝子セグメントを有し得る。このようにして、本発明のキメラウイルスには、異なるウイルスの株又は亜群の追加又は置換の「ドナー」遺伝子又は遺伝子セグメントと組み合わせた1つのウイルス株又は亜群ウイルスに由来する、一部又は全部の「レシピエント」ウイルスゲノム又はアンチゲノムが含まれる。
【００８９】
本発明の好ましい側面では、キメラ弱毒化ウイルスは、異なるヒトRSV A又はB亜群ウイルス由来の異種遺伝子又は遺伝子セグメントと複合した、一部又は全部のヒトRSV A又はB亜群のゲノム又はアンチゲノムからなるRSVである。この組換えウイルスを産生するには、1つのRSV株又は亜群由来の異種ドナー遺伝子又は遺伝子セグメントを、ドナー遺伝子又は遺伝子セグメントの挿入又は追加の骨格として役立つレシピエントゲノム又はアンチゲノムと組み合わせるか、又はそれで置換する。このように、レシピエントゲノム又はアンチゲノムは、異種の遺伝子又は遺伝子セグメントを移入して発現するベクターとして作用し、新規な構造及び／又は表現型の特徴を示すキメラRSVを産生する。好ましくは、選択されたレシピエントRSV株内への異種の遺伝子又は遺伝子セグメントの追加又は置換は、非修飾レシピエント及び／又はドナーの対応する表現型に比較して新規な表現型効果、例えば弱毒化、増殖変化、免疫原性の変化、又は他の所望される表現型の変化を産生する。
【００９０】
RSV Aゲノム内にある対のF及びG糖タンパク質遺伝子を置換する、ヒトRSV B亜群の糖タンパク質遺伝子FとGを両方取り込む、代表的な、弱毒化キメラRSVが開発され、特徴づけられてきた。この代表的なキメラは（i）Gln831をLeuへ、及びTyr1321をAsnへという温度感受性のアミノ酸置換を特定する突然変異のパネル；（ii）M2遺伝子の遺伝子開始配列における温度感受性のヌクレオチド置換；及び（iii）RSV N遺伝子におけるVal267のIleへの置換、及びRSVのポリメラーゼ遺伝子LにおけるCys319のTyrへの置換とHis1690のTyrへの置換というアミノ酸置換を特定する低温継代RSVから採った弱毒化突然変異のパネル；又は（iv）SH遺伝子の欠失から選択される弱毒化点突然変異を取り込むようにさらに修飾されている（例えば、米国特許出願第09／291,894号を参照のこと）。好ましくは、キメラウイルスの上記及び他の例は、同一であるか又は異なる突然変異ウイルスから誘導され得る少なくとも2種の弱毒化突然変異を取り込む。
【００９１】
1998年5月22日出願の米国特許出願第09／083,793号（国際公開特許第WO98／53078号に対応）と1997年5月23日出願の優先暫定特許出願第06／047,575号（いずれも参照により本明細書に組込まれている）に記載のような、HPIV-1及びHPIV-3由来の異種配列、並びにPIV3突然変異体、cp45から採られる弱毒化突然変異を取り込む、代表的な、弱毒化キメラPIVも開発され、特徴づけられてきた。より最近、cp45において同定される弱毒化突然変異のすべては、Fタンパク質におけるそれを例外として、弱毒化組換えHPIV-3キメラにおいて成功して取り込まれている。
【００９２】
異種の免疫原性タンパク質、ドメイン及びエピトープを導入してキメラ（-）鎖RNAウイルスを産生することは、免疫化された宿主において新規な免疫応答を産生するのに特に有用である。異なるウイルス亜群又は株のレシピエントゲノム又はアンチゲノムの内部で1つのドナーウイルスの亜群又は株由来の免疫原性遺伝子又は遺伝子セグメントを追加又は置換することにより、ドナーの亜群又は株、レシピエントの亜群又は株、又はドナーとレシピエント両方の亜群又は株に対して向けられた免疫応答を産生し得る。この目的を達成するために、キメラタンパク質、例えば、異なるウイルスのエクトドメインに融合した1つのウイルス株又は亜群に特異的な細胞質テール及び／又は膜貫通ドメインを有する免疫原性タンパク質を発現するキメラウイルスも構築し得る。このタイプの他の代表的な組換体は、同一の免疫原性領域のような同一のタンパク質領域を発現し得る。
【００９３】
キメラゲノム又はアンチゲノム内の（cis作用性の要素及びコーディング領域を含む）遺伝子全体を追加するか又は置換することはしばしば有用であるが、注目のドナー遺伝子の一部だけを導入することも有用である。きわめて一般的には、cis作用性の調節要素や遺伝子内配列のような非コーディングヌクレオチドは、ドナー遺伝子コーディング領域とともに導入される必要はない。さらに、多種多様な遺伝子セグメントは、新規で有用な特性を有するキメラウイルスを発現する、キメラゲノム又はアンチゲノム内に含まれる有用なドナーポリヌクレオチドを提供する。このように、異種の遺伝子セグメントは、有益にも、1つのウイルス由来の選択されたタンパク質の細胞質テール、膜貫通ドメイン又はエクトドメイン、エピトープ部位又は領域、結合部位又は領域、活性部位又は活性部位含有領域、等をコード化し得る。上記及び他の遺伝子セグメントは、もう1つのウイルスの対遺伝子セグメントについて付加又は置換され、新規のキメラ組換体、例えば、別のウイルス糖タンパク質のエクトドメインに融合したあるウイルスの糖タンパク質の細胞質テール及び／又は膜貫通ドメインを有するキメラタンパク質を発現する組換体を産生する。この点で有用なゲノムセグメントは、タンパク質の小機能性ドメイン、例えばエピトープ部位をコードする遺伝子セグメントの場合の約15〜35ヌクレオチドから、より大きなドメイン又はタンパク質領域をコードする遺伝子セグメントについての約50、75、100、200-500及び500-1500又はそれ以上のヌクレオチドの範囲をとる。
【００９４】
導入される弱毒化突然変異を担うキメラウイルスを構築するには、バックグラウンドのゲノム又はアンチゲノムに対して異種遺伝子を全部又は一部付加又は置換して、キメラゲノム又はアンチゲノムを形成し得る。この突然変異は、異種遺伝子（即ちドナー遺伝子）又は遺伝子セグメントにおいて、1つ又はそれ以上の追加の突然変異とともに存在する場合があるか、又は部分的又は完全なレシピエントアンチゲノム又はゲノム「バックグラウンド」のなかに導入し得る。置換により産生されるキメラの場合、あるウイルス由来の選択されるタンパク質又はタンパク質領域（例えば、細胞質テール、膜貫通ドメイン又はエクトドメイン、エピトープ部位又は領域、結合部位又は領域、活性部位又は活性部位含有領域、等）が、異なるウイルスゲノム又はアンチゲノムにおける対の遺伝子又は遺伝子セグメントについて置換され、野生型又は親の株に比較して所望の表現型の変化を有する新規組換体を産生する。本明細書で使用されるように、「対」の遺伝子、遺伝子セグメント、タンパク質又はタンパク質領域は、異なる源由来の2種の対ポリヌクレオチドを意味し、異なるウイルス亜群又は株間の種及び対立変異体を含む、単一の種又は株の異なる遺伝子、又は同一遺伝子の異なる変異体が含まれる。
【００９５】
対の遺伝子及び遺伝子セグメントは、典型的には少なくとも中等度の構造類似性を共有する。例えば、対の遺伝子セグメントは、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、エクトドメイン、結合部位又は領域、エピトープ部位又は領域、等のような注目するタンパク質の共通構造ドメインをコードし得る。典型的には、それらは共通の生物学的機能も共有するものである。例えば、対の遺伝子セグメントによりコード化されるタンパク質ドメインは、共通の膜スパン機能、特定の結合活性、免疫学的認識部位、等を提供し得る。本発明の弱毒化キメラウイルスを構築するのに使用する対の遺伝子及び遺伝子セグメントは、広範な大きさ及び配列の変異を有する多数の交換可能種を包含する。しかしながら、対の遺伝子及び遺伝子セグメントの選択は、上記に定義されたような、主題の対照物間の実質的配列同一性に依存する。この文脈では、選択されたポリヌクレオチドの参照配列が、ドナー又はレシピエントのゲノム又はアンチゲノムのいずれか一方に存在する配列又は配列の一部である。この参照配列は規定の配列として使用され、配列比較の基礎を提供する。例えば、参照配列は、cDNA又は遺伝子の規定セグメント、又は完全なcDNA又は遺伝子の配列であり得る。
【００９６】
よく知られたcDNAをベースとする方法が、異種ウイルスにおいて同定される弱毒化突然変異を取り込む組換えキメラウイルス及びサブウイルス粒子の大きなパネルを構築するのに有用である。これらの組換え構築体は、ワクチン剤としての使用のために改善された弱毒化及び免疫原性の特徴を提供する。この文脈において所望される表現型の変化のなかには、弱毒化の表現型からの復帰変異への抵抗、培養又は選択された宿主環境における弱毒化の改善、（例えば、誘発される免疫応答の増強又は消失により決定されるような）免疫原性の特徴、選択されるウイルス産物の転写及び／又は翻訳のアップレギュレーション又はダウンレギュレーション、等がある。
【００９７】
本発明の追加の側面では、異種ウイルスにおいて同定される弱毒化突然変異を取り込む弱毒化組換えウイルスが、変化した弱毒化の表現型を特定する1つ又はそれ以上の追加の弱毒化突然変異を導入することによって、さらに修飾される。上記の突然変異は de novo で産生され、合理的な設計の突然変異誘発戦略により弱毒化効果について試験され得る。他のやり方では、弱毒化の点突然変異が生物学的に誘導される突然変異、例えばRSV又はPIV ts又はcp突然変異体において同定され、その後、本発明の弱毒化組換えウイルスへ取り込まれる。このようにさらに弱毒化される組換体は、キメラウイルスであり得る。
【００９８】
ワクチン株のなかに取り込むための生物学的に誘導されるRSVにおけるさらなる弱毒化突然変異は、天然で起こり得るか、又は上記に記載の既知の突然変異誘発法、及び、参照により本明細書に組込まれているUSSN08／327,263において野生株へ導入され得る。
【００９９】
「生物学的に誘導される」突然変異体とは、組換え手段では産生されない突然変異ウイルスを意味する。従って、生物学的に誘導されるウイルスは、任意の（-）鎖RNAウイルス種、亜群又は株、例えば、突然変異のゲノム配列を有する天然に存在するRSV又はPIV、又は基準の野生型配列からのゲノム変異を有する（例えば弱毒化の表現型を特定する突然変異を有する）RSV又はPIVであり得る。同様に、生物学的に誘導される突然変異体には、特に人工的な突然変異誘発及び選択法により親株から誘導される突然変異体が含まれる。
【０１００】
上記のように同定されるさらなる弱毒化突然変異は「メニュー」へ編集され、所望されるように、単独又は組み合わせて導入され、弱毒化、免疫原性、弱毒化表現型からの復帰変異への遺伝抵抗性、等の所望される好適なレベルへ候補ワクチンウイルスを調整する。好ましくは、本発明の組換え突然変異ウイルスは、以下のようなメニューから同定される、少なくとも1つ、及びより好ましくは、2つ又はそれ以上の弱毒化点突然変異の取り込みにより弱毒化される：例えば、cpts RSV 248（ATCC VR 2450）、cpts RSV 248／404（ATCC VR 2454）、cpts RSV 248／955（ATCC VR 2453）、cpts RSV 530（ATCC VR 2452）、cpts RSV 530／1009（ATCC VR 2451）、cpts RSV 530／1030（ATCC VR 2455）、RSV B-1 cp52／2B5（ATCC VR 2542）、及びRSV B-1 cp-23（ATCC VR 2579）のようなRSV突然変異体のパネルである。追加の突然変異は、例えば、小プラーク（sp）、低温適応（ca）又は宿主範囲制限（hr）突然変異株において同定されるような、ts、cp、又は非ts又は非cp弱毒化突然変異を有するウイルスを含む、非特異的又は異種のウイルスから取り込まれ得る。弱毒化突然変異は、遺伝子のコーディング部分、又はcis調節配列のような非コーディング領域において選択され得る。例えば、弱毒化突然変異には、RSV M2遺伝子開始配列におけるヌクレオチド7605での単一塩基置換により例示されるような、遺伝子開始配列における単一又は多数の塩基変化が含まれ得る。このように、組換えワクチン候補物の弱毒化は、血清陰性の幼児を含む、1種又はそれ以上の患者クラスにおける使用について微調整され得る。cDNAからウイルスを産生する能力により、上記の突然変異を、個別にか又は様々に選択された組み合わせにおいて、完全長のcDNAクローンへ定常的に導入することが可能になり、その後、導入された突然変異を含有する回収された組換えウイルスの表現型は容易に決定され得る。
【０１０１】
所望の表現型、例えば、cp又はts表現型に関連した特定の弱毒化突然変異を同定し、感染性組換えクローンへ取り込むことによって、本発明は、同定される突然変異のところか、又はそのごく近傍に、他の部位特異的な修飾を提供する。生物学的に誘導されるウイルスにおいて産生されるほとんどの弱毒化突然変異が単一アミノ酸の置換であるのに対し、他の「部位特異的」な突然変異はまた、組換え技術により本発明の組換えウイルスへ取り込まれ得る。本明細書で使用されるように、部位特異的突然変異には、1〜3、約5〜15個又はそれ以上の変化した（例えば、突然変異誘発により、野生型配列から、選択された突然変異株の配列から、又は親の組換えクローンから変化した）ヌクレオチドの挿入、置換、欠失又は再配置が含まれる。そのような部位特異的突然変異は、選択される弱毒化突然変異のところか、又はその領域の内部で取り込まれ得る。他のやり方では、突然変異は、ウイルス・クローン内の様々な他の文脈、例えばcis作用性の調節配列、又はタンパク質の活性部位、結合部位、免疫原性エピトープ等をコードするヌクレオチド配列か又はその近くで導入され得る。部位特異的ウイルス突然変異体は、典型的には所望される弱毒化の表現型を保持するが、弱毒化に無関係である実質的に変化した表現型の特徴、例えば強められるか又は拡張された免疫原性、又は改善された増殖を示すことがある。所望の部位特異的突然変異体のさらなる例には、弱毒化突然変異を特定するコドンにおいて追加の、安定化させるヌクレオチド突然変異を取り込む組換えウイルスが含まれる。可能ならば、親の突然変異体又は組換えクローンにおいて弱毒化のアミノ酸変化を特定するコドンにおいて2種又はそれ以上のヌクレオチド置換を導入し、弱毒化表現型からの復帰変異に遺伝的に抵抗する組換体を得る。他の態様では、部位特異的なヌクレオチド置換、付加、欠失又は再配置が、例えば、ターゲットされたヌクレオチド位置に対して1〜3、5〜10及び15ヌクレオチドまで上流（コード化されるウイルスタンパク質に関してN末端の方向）又は下流（C末端方向）、又はさらに5’又は3’で導入され、例えば既存のcis作用性調節要素を構築するか又は除去させる。
【０１０２】
単一及び複数の点突然変異と部位特異的突然変異に加え、本発明の弱毒化組換ウイルスへの変化には、遺伝子全体又は遺伝子セグメントの挿入、置換又は再配置が含まれる。上記の突然変異は、変化の種類に依存して、ドナー又はレシピエントのゲノム又はアンチゲノムにおける少数の塩基（例えば、15〜30塩基、35〜50塩基まで、又はそれ以上）、又は大きなヌクレオチドブロック（例えば、50〜100、100〜300、300〜500、500〜1000塩基）を変化させ得る（即ち、少数の塩基が免疫原性エピトープを挿入するか又は除去すること、又は小さな遺伝子セグメントを変化させるために変化され得るのに対し、大きな塩基のブロックは遺伝子又は大きな遺伝子セグメントが付加、置換又は再配置されるときに関わる）。
【０１０３】
追加の側面では、本発明は、さらに修飾される組換えウイルスの同一又は異なる遺伝子に関わる追加タイプの突然変異で、異種ウイルス由来の組換え（-）鎖ウイルスcDNAへ導入される突然変異（例、cp及びts突然変異）が補充される。この点でウイルスタンパク質は、発現レベルに関して選択的に変化され得るか、又は、単独であるか又は他の所望の修飾と一緒に、全部又は一部において、付加、欠失、置換され得て、追加の新規ワクチンの特徴をもった組換え弱毒化ウイルスを産生する。
【０１０４】
このように、異種ウイルス突然変異体から採られる弱毒化突然変異に加えるか、又はそれと組み合わせて、本発明はまた、組換え工学に基づいて組換えワクチン候補物を弱毒化するか、又は他の方法で修飾するためのある範囲の追加方法を提供する。本発明のこの側面によれば、多種多様な変更が、組換えゲノム又はアンチゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド配列において産生され得る。より特定すると、組換えPIVにおいて所望の構造及び表現型上の変化を達成するために、本発明は、親ゲノム又はアンチゲノム由来の選択されたヌクレオチド又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、導入、又は再配置させる修飾、並びに親ゲノム又はアンチゲノム内で遺伝子全体又は遺伝子セグメントを欠失、置換、導入又は再配置させる突然変異の導入を考慮する。
【０１０５】
弱毒化組換えウイルスの所望される修飾は、典型的には、所望される表現型の変化、例えばウイルス増殖、温度感受性、宿主の免疫応答を誘発する能力、弱毒化、等における変化を特定するために選択される。上記の変化は、例えば、特定の遺伝子又は遺伝子領域（例えば、細胞質、膜貫通又は細胞外ドメインのようなタンパク質の構造ドメイン、免疫原性エピトープ、結合領域、活性部位、等をコードする遺伝子セグメント）を除去、導入又は再配置させる親クローンの突然変異誘発により、ドナー又はレシピエントのゲノム又はアンチゲノムのいずれかで生じ得る。この点で注目の遺伝子には、任意のウイルス遺伝子、例えば、RSVの場合の3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5’、並びに他のウイルス由来の異種遺伝子が含まれる。
【０１０６】
さらに提供されるのは、例えば、選択されたRSVコーディング配列の中に終止コドンを導入すること、機能可能的に連結したプロモーターに対して遺伝子の位置を変化させること、上流に開始コドンを導入して発現速度を変化させること、転写シグナルを修飾して（例えば、位置を変えること、既存の配列を変えること、又は既存の配列を異種配列で置換することによって）表現型（例、増殖、転写への温度制限、等）を変化させること、及びウイルス複製、選択された遺伝子の転写、又は選択されたタンパク質の翻訳における定量的又は定性的な変化を特定する、他の欠失、置換、付加及び再配置によって、選択された遺伝子の発現を変化又は又は制限させる、組換えワクチン候補物における修飾である。
【０１０７】
他のタイプの弱毒化突然変異を分析して組換えワクチン候補物へ組込む能力は、組換えクローンにおける広範囲のターゲットされた変化に広がる。例えば、RSVにおけるSH遺伝子の欠失により、高められた増殖を含む、新規な表現型の特徴を有する組換えRSVを生じる。このように、本発明の組換えRSVでは、SH遺伝子の欠失（又は、他の非必須遺伝子又は遺伝子セグメントの欠失）を、組換えウイルスにおいて、弱毒化の表現型を特定する1種又はそれ以上の追加の突然変異（例えば、生物学的に誘導される弱毒化突然変異体から採られる1つ又はそれ以上のさらなる弱毒化突然変異によって所望により補充される、異種ウイルスから採られる1種又はそれ以上の点突然変異）と組み合わせる。ある態様では、RSVのSH遺伝子又はNS2遺伝子が、cpts248／404、cpts530／1009、cpts530／1030、又は他の選択される突然変異RSV株から採られる1つ又はそれ以上のcp及び／又はts突然変異とともに欠失され、様々な突然変異の複合効果により、高められたウイルス収量、強められた弱毒化、及び表現型の復帰への抵抗性を有する組換えRSVを産生する。
【０１０８】
1つの代表的なSH（-）RSVクローンの場合、修飾されたウイルスゲノムは14,825ntの長さであり、野生型より398ヌクレオチド少ない。例えばP、M、F及びM2遺伝子のようなRSVゲノムの随所にある他のコーディング又は非コーディング領域において、ゲノムサイズを減少させる同様の突然変異を設計することによって、本発明は、キメラRSVの増殖を向上させるための容易に得られるいくつかの方法及び材料を提供する。
【０１０９】
さらに、本発明の方法により弱毒化された感染性ウイルスへ組込むための多種多様な他の遺伝子変化が組換えゲノム又はアンチゲノムにおいて産生され得る。（例えば、異なるウイルス遺伝子、又は異なるウイルス株又はタイプ由来の）追加の異種遺伝子又は遺伝子セグメントが、全体又は部分的に挿入され、遺伝子の順序が変化され、遺伝子の重複が取り除かれ、ゲノムプロモーターがそのアンチゲノム対で置換され、遺伝子の一部が除去されるか又は置換され、さらに遺伝子全体でさえ欠失される場合がある。特有な制限部位を様々な遺伝子内領域又は随所に挿入することのような種々の操作を促進するために、配列における様々な又は追加の修飾がなされ得る。外来の配列を挿入する能力を高めるために非翻訳遺伝子配列を除去し得る。
【０１１０】
本発明においてさらに提供されるのは、組換えクローンから遺伝子又は遺伝子セグメントを除去することなく、選択された遺伝子又は遺伝子セグメントの発現を変化させるか又は抑制する、弱毒化組換えワクチン候補ウイルスにおける遺伝的修飾である。例えば、このことは、選択されたコーディング配列のなかに終止コドンを導入すること、遺伝子の位置を変えること、又は上流の開始コドンを導入してその発現速度を変化させること、又は転写シグナルを変えて表現型（例、増殖、転写に対する温度制限、等）を変化させることによって達成し得る。
【０１１１】
この文脈で好ましい突然変異には、cis作用性シグナルに対して向けられた突然変異が含まれ、これは、例えばウイルスのミニゲノムの突然変異分析により同定され得る。例えば、リーダー及びトレーラーと隣接配列の挿入及び欠失分析はウイルスのプロモーターと転写シグナルを同定し、RNA複製又は転写の様々な程度の抑制に関連した突然変異の系列を提供した。これらcis作用性シグナルの飽和突然変異誘発（これによりヌクレオチド選択肢のそれぞれに対し各位置が順番に修飾される）はまた、RNA複製又は転写を抑制する（又は、2つの事例では増加させる）多くの突然変異を同定した。これら突然変異のいずれでも本明細書に記載のように、組換えアンチゲノム又はゲノムへ挿入され得る。
【０１１２】
完全なアンチゲノムcDNAを使用してtrans作用性のタンパク質とcis作用性のRNAを評価して操作することは、ウイルスのミニゲノムの使用により支援され（例えば、参照により本明細書に組込まれている、Grosfeld et al., J. Virol. 69: 5677-5686 (1995) を参照のこと）、そのヘルパー依存的な状態は、あまりに阻害的なので複製-非依存性の感染性ウイルスにおいて回収されない突然変異体の特徴づけにおいて有用である。
【０１１３】
本発明の組換えウイルス内の他の突然変異は、ゲノムの3’末端をアンチゲノム由来のその対で置換することを含み、このことはRNAの複製及び転写における変化に関連している。さらに、遺伝子内の領域（Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4594-4598 (1986), 参照により本明細書に組込まれている）は、短縮されるか又は延長され得るか、又は配列含量において変化され得て、天然に存在する遺伝子重複（Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5134-5138 (1987),参照により本明細書に組込まれている）は、本明細書に記載の方法により除去され得るか、又は異なる遺伝子内領域へ変化され得る。
【０１１４】
1つの例示的な態様では、天然のコドン使用法を効率的な翻訳に一致するように設計され、合成cDNAへ組立てられたものへ置換することによって、RSVの保護的F及びG抗原のような特定タンパク質の発現レベルが増加され得る。この文脈では、コドン使用法が哺乳動物ウイルスタンパク質の翻訳レベルにおける主要な要因であることが示されている（Haas et al., Current Biol. 6: 315-324 (1996)）。主要な保護抗原である、RSVのF及びGタンパク質をコードするmRNAのコドン使用法の試験は、この使用法が弱い発現と一致していることを示す。このように、選択された遺伝子について向上された発現を達成するために、本発明の組換え法によりコドン使用法を改善することができる。
【０１１５】
もう1つの例示的な態様では、選択されたウイルス遺伝子の翻訳開始部位（好ましくは、3位のヌクレオチドを含む）周辺の配列が、単独でか又は上流の開始コドンの導入と組み合わせて修飾され、翻訳のアップ又はダウンレギュレーションを特定することによって、弱毒化組換えウイルスの遺伝子発現をモジュレートする。
【０１１６】
より特定の態様では、弱毒化RSV遺伝子の発現は、このウイルスの選択された遺伝子の転写GSシグナルを変化させることによってモジュレートし得る。1つの例示的な実施例では、NS2のGSシグナルが規定の突然変異（例、以下に記載の404（M2）突然変異）を包含するように修飾され、ウイルス複製に対するts制限に加える。さらに追加の弱毒化RSVクローンは、転写GEシグナルへ様々な修飾を取込むことができる。例えば、NS1及びNS2遺伝子の、N遺伝子について置換されたか突然変異を受けたGEシグナルを有するRSVクローンを産生すると、読み過ごしmRNAレベルの減少と、下流遺伝子からのタンパク質発現の増加を生じる。生成した組換えウイルスは、増加した増殖動態と増加したプラークサイズを示し、RSVゲノム内のcis作用性調節要素の修飾によりRSVの増殖特性を変化させる実施例を1例のみ提供する。
【０１１７】
もう1つの実施例では、弱毒化組換えRSVのGタンパク質の特異的な発現が、G mRNAの修飾により高められる。Gタンパク質は、膜結合型と分泌型の両方として発現され、後者の形態は、G翻訳オープンリーディングフレーム内の開始部位での翻訳開始により発現される。この分泌される形態は発現されるGタンパク質の半分と同じくらいを占める場合がある。（配列変化、欠失、等により）内部の開始部位を消去すると、それ単独か、又は上流の開始部位の配列コンテクストを変化させることとともに、所望されるGタンパク質発現の変化をもたらす。Gの分泌形態の消去は、例示のキメラRSVへの宿主免疫応答の質を改善するが、これはGの可溶形態が中和抗体を捕捉する「おとり」として作用するためと考えられるからである。また、可溶性Gタンパク質は、Th2に偏った応答を選好的に刺激することにより、免疫病理を強めることとも関連づけられている。
【０１１８】
他の態様では、弱毒化組換えウイルス遺伝子の発現レベルが転写レベルで修飾される。1つの側面では、RSV遺伝子マップにおいて選択される遺伝子の位置が、プロモーターのより近位か又はプロモーターのより遠位へ変化され、それによりこの遺伝子は、それぞれより効率的又はより非効率的に発現されるだろう。この側面によると、特定の遺伝子についての発現のモジュレーションが達成され、野生型レベルに比較して、2倍、典型的には4倍、10倍又はそれ以上までの遺伝子発現の減少又は増加をもたらす。1つの例では、RSVのNS2遺伝子（RSV遺伝子マップで2番目の順序）がSH遺伝子（6番目の順序）に位置で置換され、NS2発現の予測された減少をもたらす。選択されるRSV遺伝子発現の位置変化による増加は、10倍又はそれ以上まで達成し得るが、逆に位置置換された遺伝子についての発現レベルにおける同時減少をしばしば伴う。
【０１１９】
他の代表的な態様では、ウイルス遺伝子が、単独又はいっしょに、組換えウイルス遺伝子マップ内にあるプロモーターのより近位か又はより遠位の部位へ転位され、より高いか又はより低いレベルの遺伝子発現をそれぞれ達成する。上記及び他の転位変化は、例えばRNA複製に関わる選択されたウイルスタンパク質の発現の減少により、弱毒化の表現型を有する新規クローンを産生する。
【０１２０】
本発明のより詳細な側面では、弱毒化した組換えウイルスは、ウイルス遺伝子、例えばRSVのNS2遺伝子の発現を、例えば2つのタンデム翻訳終止コドンを翻訳のオープンリーディングフレーム（ORF）へ導入することによって、この遺伝子又はそのセグメントを欠失させずに翻訳レベルで抑止することによって、さらに修飾される。このことにより、選択された遺伝子が、その遺伝子を欠失しないまま翻訳のレベルで静止状態になる、生存可能なウイルスが産生される。これら「ノックアウト」ウイルスの形態は、組織培養における増殖速度の低下と小プラークサイズを示す。このように、本発明の方法及び組成物は、主要なウイルス保護抗原の1つでもなく、ウイルス増殖にとって必須でもないウイルス遺伝子の発現を抑止する、さらに追加される新たなタイプの弱毒化突然変異を提供する。この文脈では、遺伝子又は遺伝子セグメントの欠失なく産生される「ノックアウト」ウイルスの表現型は、ターゲットタンパク質の合成を回復する可能性がある補正の突然変異を効果的に排除するために、本明細書に記載のように、欠失突然変異誘発により選択的に産生され得る。上記及び他のノックアウトウイルスを産生する方法は当技術分野でよく知られている（例えば、Kretzschmar et al., Virology 216: 309-316 (1996); Radecke et al., Virology 217: 418-422 (1996)；及び Kato et al., EMBO J. 16: 178-187 (1987)；及び Schneider et al., Virology 277: 314-322 (1996), いずれも参照により本明細書に組込まれている）。
【０１２１】
本発明の感染性組換えウイルス・クローンはまた、本明細書に開示される方法及び組成物により、免疫原性を高め、野生型又は親の組換えウイルスでの感染により提供される以上の保護レベルを誘導するように設計され得る。例えば、異種のウイルス株又はタイプ、例えばPIV由来の免疫原性エピトープが、キメラのゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列における適切なヌクレオチド変化により、組換えクローン、例えばRSVへ付加し得る。他のやり方では、ウイルスは、所望されるか又は所望されない免疫反応に関連した免疫原性エピトープを（例えば、アミノ酸の挿入、置換又は欠失により）付加するか又は除去するように設計され得る。
【０１２２】
本発明の方法では、追加の遺伝子又は遺伝子セグメントがレシピエントのゲノム又はアンチゲノムの中か又はその近傍に挿入され得る。これらの遺伝子は、レシピエント遺伝子とともに制御され得るか、又は独立した転写シグナルセットの制御下にあり得る。注目の遺伝子には、サイトカイン（例、IL-2〜IL-15、特にIL-2、IL-6及びIL-12等）、γ-インターフェロン、及びヘルパーT細胞エピトープに多いタンパク質をコードするものが含まれる。これらの追加タンパク質は、分離したタンパク質としてか、又はSHのようなウイルスタンパク質の1つの第二コピーから設計されるキメラとしてのいずれかで発現され得る。これにより、ウイルスに対する免疫応答を定量的かつ定性的に修飾及び改善する能力が提供される。
【０１２３】
本発明の例示的な態様では、外来の遺伝子又は遺伝子セグメント、及びある場合は非コーディングヌクレオチド配列の、組換えウイルスゲノム内への挿入は、ゲノムの長さの所望される増加をもたらし、追加の所望される表現型の効果を引き起こす。ゲノム長さの増加は、挿入物の長さに一部依存して、生成したウイルスの弱毒化をもたらす。さらに、異種の源に由来するある種のタンパク質、例えばサイトカインの、本発明の組換え弱毒化ウイルスへの発現は、このタンパク質の作用によりこのウイルスのさらなる弱毒化をもたらす。このことがワクシニアウイルスにおいて発現されるIL-2について述べられていて（例えば、Flexner et al., Nature 33: 259-62 (1987)）、γ-インターフェロンについても期待されている。
【０１２４】
本発明の組換えウイルス内での全ウイルス遺伝子又は遺伝子セグメントの変化に関わる欠失、挿入、置換及び他の突然変異によりきわめて安定なワクチン候補物が産生されるが、これは免疫抑制された個体の場合、特に重要である。こういった変化の多くが生成するワクチン株の弱毒化をもたらすのに対し、他の変化は様々なタイプの所望される表現型の変化を特定するものである。例えば、宿主の免疫に特異的に干渉するタンパク質をコードする、ある種のウイルス遺伝子が知られている（例えば、Kato et al., EMBO J. 16: 578-87 (1997) を参照のこと、参照により本明細書に組込まれている）。組換えワクチンウイルスにおけるそのような遺伝子の除去は、ビルレンス及び病態形成を抑制する、及び／又は免疫原性を改善することが期待される。
【０１２５】
本発明の組換えウイルスをさらに弱毒化するための追加の突然変異には、ワクチン使用のために好ましい宿主範囲制限と他の所望される表現型を与える異種遺伝子又はcis作用性要素の導入が含まれる。代表的な態様では、例えば、Pastey et al., J. Gen. Virol. 76: 193-197 (1993); Pastey et al., Virus Res. 29: 195-202 (1993); Zamora et al., J. Gen. Virol. 73: 737-741 (1992); Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 74: 2001-2004 (1993); Mallipeddi et al., J. Gen. Virol. 73: 2441-2444 (1992);及び Zamora et al., Virus Res. 24: 115-121 (1992),（いずれも参照により本明細書に組込まれている）において提供されるように、及び本明細書に開示される教示により、ウシRSVの構造及び機能のすでに知られた側面に基づいて、ヒトRSVへ導入するためのウシRSV配列が選択される。本発明の他の態様では、キメラRSV内に導入するための注目の突然変異は、組織培養に適合した、Gタンパク質の細胞質テールを欠く、マウスニューモウイルス（ヒトRSVのマウス対応物）の非病原性株に則ってモデル化される（Randhawa et al., Virology 207: 240-245 (1995)）。従って、本発明の1つの側面では、所望の弱毒化を達成するために、1つ又はそれ以上のヒトRSV糖タンパク質、F，G及びSHの細胞質及び／又は膜貫通ドメインが、異種の対配列（例えば、マウスニューモウイルスのF、G又はSHタンパク質の細胞質又は膜貫通ドメイン由来の配列）を使用して、弱毒化した組換えRSVの中で付加、欠失、修飾又は置換される。もう1つの実施例として、組織培養におけるウイルス増殖及び／又は感染性及び病態形成に対する新規な効果を達成するために、Fタンパク質の開裂部位か又はその近くにあるヌクレオチド配列、又はGタンパク質の推定付着ドメインが、点突然変異、部位特異的な変化、又は遺伝子全体又は遺伝子セグメントが関わる変化によって修飾され得る。
【０１２６】
組換えワクチンウイルスに対する上記の修飾に加え、特有な制限部位を様々な遺伝子間領域又は随所へ挿入することのような操作を促進するために、ウイルス・クローンにおいて様々な又は追加の修飾がなされ得る。外来配列を挿入する収容力を増加させるために、非翻訳遺伝子配列を除去し得る。
【０１２７】
本発明のもう1つの側面では、単離された弱毒化感染性ウイルスを産生する組成物（例えば、異種ウイルスにおいて同定される突然変異を取り込んだ組換え（-）鎖RNAウイルスゲノムを含んでなる、単離ポリヌクレオチド及びベクター）が提供される。上記の組成物及び方法を使用して、組換えゲノム又はアンチゲノムと選択されるウイルスタンパク質、例えば（RSVの場合は）ヌクレオキャプシド（N）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（P）、大（L）ポリメラーゼタンパク質、及びRNAポリメラーゼ伸長因子から、感染性ウイルス及びサブウイルス粒子が産生される。本発明の関連した側面では、上記の構造及び表現型の変化を組換えウイルスへ導入し、感染性の弱毒化ワクチンウイルスを産生するための方法及び組成物が提供される。
【０１２８】
先に規定した突然変異の感染性の組換えウイルスへの導入は、上記に参照したような様々な既知の方法により達成される。「感染性クローン」とは、感染性ウイルス又はサブウイルス粒子を産生する鋳型として役立ち得るゲノム又はアンチゲノムRNAへ転写され得る、cDNAか又はその合成又は他の方法の産物を意味する。従って、規定された突然変異は、従来技術（例、部位特異的突然変異誘発）によりゲノム又はアンチゲノムのcDNAコピーへ導入され得る。本明細書に記載のように、アンチゲノム又はゲノムcDNAサブフラグメントを使用して完全なアンチゲノム又はゲノムcDNAを組み立てることは、各領域が個別に操作され（より小さいcDNAは大きいものより容易に操作される）、次いで容易に完全なcDNAへ組立てられるという利点がある。このように、完全なアンチゲノム又はゲノムcDNA、又はそのサブフラグメントは、オリゴヌクレオチドへ向けられた突然変異誘発の鋳型として使用され得る。このことは、Bio-Rad Laboratories（リッチモンド、CA）のMuta-gene（登録商標）キットを使用するような単鎖ファージミド形態の中間体、又はStratagene（ラジョア、CA）のChameleon突然変異誘発キットのような鋳型として二本鎖プラスミドを直接使用する方法によるか、又はオリゴヌクレオチドプライマーか注目の突然変異を含有する鋳型のいずれかを利用するポリメラーゼ連鎖反応によりなし得る。次いで、突然変異したサブフラグメントを完全なアンチゲノム又はゲノムcDNAへ組み立てることができる。多種多様な他の突然変異誘発技術が知られていて、アンチゲノム又はゲノムcDNAにおいて注目の突然変異を産生することの使用に利用し得る。突然変異は単一のヌクレオチド変化から1つ又はそれ以上の遺伝子又はゲノム領域を含有する大きなcDNA切片の置換まで変化し得る。
【０１２９】
このように、1つの代表的な態様では、Bio-Radから入手し得るMuta-geneファージミドのin vitro突然変異誘発を使用することによって、突然変異が導入される。RSVゲノム又はアンチゲノムの一部をコードするcDNAはプラスミドpTZ18Uへクローン化され、CJ236細胞（Life Technologies）を変換するのに使用される。ファージミド調製物は、製造業者により推奨されるようにして調製される。オリゴヌクレオチドは、変化したヌクレオチドをゲノム又はアンチゲノムの所望される位置で導入することにより突然変異誘発のために設計される。次いで、遺伝学的に変化させたゲノム又はアンチゲノムのフラグメントを含有するプラスミドを増幅し、突然変異した切片を完全長のゲノム又はアンチゲノムクローンへ再導入する。
【０１３０】
本発明はまた、異種ウイルスにおいて同定される突然変異を取り込んだ弱毒化した感染性組換えウイルスを、1つ又はそれ以上の単離ポリヌクレオチド、例えば1つ又はそれ以上のcDNAから産生する方法を提供する。主題のウイルスゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAは、例えば感染性RSVを形成するのに必要なウイルスタンパク質と細胞内又はin vitroで同時発現するように構築される。「アンチゲノム」とは、後代ウイルスゲノムの合成の鋳型として役立つ単離された（＋）センスのポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくは、複製中間体のRNA、又はアンチゲノムに対応する、ゲノムの（＋）センスバージョンを合成するための鋳型であるcDNAを構築し、転写、複製するヌクレオキャプシドの産生を促進するタンパク質をコードする相補配列の（＋）センス転写物とハイブリダイズする可能性を最少化する。本発明の目的のためには、組換えウイルスのゲノム又はアンチゲノムは、それによりコードされるウイルス又はサブウイルスの粒子が感染性となるのに必要な遺伝子又はその部分を含有すればよい。さらに、その遺伝子又はその部分は1つ以上のポリヌクレオチド分子により提供される場合がある。つまり、遺伝子は別個のヌクレオチド分子からの相補性などにより提供される場合がある。
【０１３１】
組換えウイルスとは、組換え発現系から直接又は間接的に誘導されるか、又はそれから産生されるウイルス又はサブウイルス粒子から増殖される、完全なウイルス又はウイルス様サブウイルス粒子を意味する。組換え発現系は、ウイルスの遺伝子発現において調節的な役割を有する少なくとも1つの遺伝要素又は諸要素、例えばプロモーター、ウイルスRNAへ転写される構造配列又はコーディング配列、及び適切な転写開始及び終止の配列のアセンブリーを含んでなる、機能可能的に連結した転写単位を含む組換え発現ベクターを利用する。
【０１３２】
cDNA発現ゲノム又はアンチゲノムから感染性ウイルスを産生するには、既知の方法により、（i）RNA複製の可能なヌクレオキャプシドを産生する、及び（ii）後代のヌクレオキャプシドRNAをRNA複製と転写の両方についてコンピテントにするように、ゲノム又はアンチゲノムを発現させる。ゲノムのヌクレオキャプシドによる転写が他のタンパク質を提供し、生産的な感染を開始させる。他のやり方では、生産的な感染に必須な追加のウイルスタンパク質が同時発現により供給され得る。
【０１３３】
ウイルスのアンチゲノムは、本発明における使用のために、例えばクローン化cDNAセグメントを組み立てること、完全なアンチゲノムを集合して表すこと、ウイルスmRNA又はゲノムRNAの逆転写コピーのポリメラーゼ連鎖反応（PCR；例えば、参照により本明細書に組込まれている、米国特許第4,683,195号及び4,683,202号，及び PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, San Diego (1990) に記載されている）により構築され得る。例えば、アンチゲノム又はその部分を含有するcDNAは、プラスミド、又は様々に利用されるコスミド、ファージ、又はDNAウイルスベクターのような好適な発現ベクターにおいて組立てられる。このベクターは、突然変異誘発及び／又はアセンブリーを促進するように設計された独自の制限部位を含有する合成ポリリンカーの挿入により修飾され得る。RSVのようなある場合には、特定のベクター（pBR322）の使用により、他のやり方ではヌクレオチドの欠失又は挿入を支援する可能性があるウイルス配列が安定化される。同様に、プラスミドの増殖は、他のやり方では（例えば、RSVのnt4499の近くで）発生する人工的な重複及び挿入を回避する、特定の菌株（例、DH10B）の選択により促進され得る。
【０１３４】
本発明のある態様では、転写し、複製するウイルスのヌクレオキャプシドを産生するのに必要なタンパク質をコードする相補配列が、1つ又はそれ以上のヘルパーウイルスにより提供される。そのようなヘルパーウイルスは野生型であるか又は突然変異体であり得る。好ましくは、ヘルパーウイルスは、cDNAによりコード化されるウイルスから表現型で識別され得る。例えば、ヘルパーウイルスと免疫学的に反応するがcDNAによりコード化されるウイルスとは反応しないモノクローナル抗体を提供することが望ましい。そのような抗体は中和抗体であり得る。ある態様では、この抗体がアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用され、ヘルパーウイルスを組換えウイルスから分離することが可能である。そのような抗体の獲得を支援するには、突然変異をcDNAへ導入し、RSVのHN又はF糖タンパク質遺伝子にあるように、ヘルパーウイルスからの抗原多様性を提供することができる。
【０１３５】
多種多様なヌクレオチドの挿入及び欠失がウイルスのゲノム又はアンチゲノムにおいてなされ、修飾された、弱毒化ウイルス・クローンを産生し得る。パラミクソウイルス及びモルビリウイルス属のメンバーは、典型的には「6の規則」に従う。つまり、ゲノム（又はミニゲノム）は、そのヌクレオチドの長さが6の倍数である（キャプシドに包まれたNタンパク質に対してヌクレオチド残基が正確にスペーシングするための必要条件と考えられている）ときにのみ複製する。
【０１３６】
異種ウイルスにおいて同定される突然変異を取り込んだ組換え（-）鎖RNAウイルスをコードするcDNAを構築する別の手段には、サブユニットcDNA成分の数が1ないし2つである少ない断片へ減少させるように（例えば、参照により本明細書に組込まれている Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699 (1994) に記載されているような）改善されたPCR条件を使用する逆転写PCRによるものが含まれる。他の態様では、様々なプロモーター（例、T3、SP6）又はリボザイム（例、デルタ肝炎ウイルスのそれ）が使用され得る。大きいサイズのゲノム又はアンチゲノムをさらによく収容するために様々なDNAベクター（例、コスミド）が増殖のために使用し得る。
【０１３７】
ウイルスのゲノム又はアンチゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド（例、cDNA）と、分離しているか又はcisにある、必要なウイルスタンパク質は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入、形質導入などにより、生産的なウイルス感染を支持し得る細胞、例えばHEp-2、FRhL-DBS2、MRC、及びVero細胞へ挿入される。単離されたポリヌクレオチド配列のトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム介在性トランスフェクション（Wigler et al., Cell 14: 725 (1978); Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Graham and Van der Eb, Virology 52: 456 (1973)）、エレクトロポレーション（Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845 (1982)）、DEAE-デキストラン介在性トランスフェクション（Ausubel et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY (1987)）、カチオン脂質介在性トランスフェクション（Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73-79 (1993))又は市販のトランスフェクション試薬、例えばLipofectACE（登録商標）（Life Technologies）により培養細胞へ導入され得る（上記参考文献はいずれも参照により本明細書に組込まれている）。
【０１３８】
ウイルスタンパク質は、ゲノム又はアンチゲノム、及びそれらの様々な組み合わせをコードするものと同じであるか又はそれとは別であり得る1種又はそれ以上の発現ベクターによりコードされる。追加のタンパク質は、それ自身のベクターか又は必須ウイルスタンパク質をコードするベクターによりコードされ、所望により含まれる場合がある。ゲノム又はアンチゲノム、及びトランスフェクトされたプラスミド由来のタンパク質の発現は、例えば、（T7 RNAポリメラーゼの発現系、例えば、T7 RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスMVA株の組換体を用いた感染、トランスフェクション又は形質導入により提供される）T7 RNAポリメラーゼのプロモーターの制御下にあるそれぞれのcDNAにより達成される（Wyatt et al., Virology, 210: 202-205 (1995), 参照により本明細書に組込まれている）。ウイルスのタンパク質、及び／又はT7 RNAポリメラーゼはまた、形質転換された哺乳動物細胞からか、又はmRNA形成されたmRNA又はタンパク質のトランスフェクションにより提供され得る。
【０１３９】
他のやり方では、アンチゲノム又はゲノムの合成が転写-翻訳を組み合わせた反応でin vitro（無細胞）において実施された後に、細胞へトランスフェクションされる。又は、アンチゲノム又はゲノムのRNAは、in vitroで合成され、ウイルスタンパク質を発現する細胞へトランスフェクトされ得る。
【０１４０】
本発明により候補ワクチンウイルスを選択するには、生存能、弱毒化及び免疫原性の判断基準を既知の方法により決定する。本発明のワクチンにおいて最も所望されるであろうウイルスは、生存能を維持し、安定した弱毒化の表現型を有し、（より低いレベルであっても）免疫化された宿主において複製を示し、野生型ウイルスからの後続の感染により引き起こされる重篤な疾患に抗する保護を与えるほど十分な免疫応答の産生を、ワクチン接種を受けた人において効果的に誘発しなければならない。この文脈では、本発明のウイルスは、生存能力があり、従来の突然変異より弱毒化されているだけでなく、これまで研究されたものよりin vivoで遺伝学的により安定であり、保護免疫応答を刺激し、ある事例では、多数の修飾により提供される保護を拡張する（例えば、様々なウイルス株又は亜群に抗する保護を誘導する、又は様々な免疫学的基礎、例えば分泌対血清の免疫グロブリン、細胞性免疫、等により保護する）能力を保持している。
【０１４１】
異種ウイルスにおいて同定される突然変異を取り込んだ組換え（-）鎖RNAウイルスを増殖させるには、ウイルス増殖を可能にする数多くの細胞系を使用し得る。ワクチン用の弱毒化ウイルスを増殖させるのに好ましい細胞系には、DBS-FRhL-2、MRC-5及びVero細胞が含まれる。最高のRSV収率が普通達成されるのは、Vero細胞のような上皮細胞系を用いた場合である。細胞は、典型的には、約0.01〜1.0又はそれ以上の範囲にある感染多重度でウイルスに接種され、ウイルスの複製に許容される条件の下で、例えば、約30〜37℃で約3〜5日間、又はウイルスが十分な力価に達するのに必要なほどの長さで培養される。ウイルスは細胞培養から除去され、典型的には既知の精製法（例えば、遠心分離）により細胞成分から分離され、当業者に周知の方法を使用して所望のようにさらに精製され得る。
【０１４２】
本明細書に記載のように弱毒化された組換えウイルスは、ワクチンに使用するのに十分な弱毒化、表現型復帰への抵抗性、及び免疫原性を確かめるために、様々な既知の、全般に受け入れられたin vitro及びin vivoモデルで試験され得る。in vitroアッセイでは、修飾されたウイルス（例えば、多様に弱毒化された、生物学的に誘導されるか又は組換えのウイルス）を、ウイルス複製の温度感受性（即ち、ts表現型）、及び小プラーク表現型について試験する。修飾されたウイルスは、ウイルス感染の動物モデルにおいてさらに試験される。RSVについての多種多様な動物モデルが Meignier et al., eds., Animal Models of Respiratory Syncytial Virus Infection, Merieux Foundation Publication, (1991)（参照により本明細書に組込まれている）に説明され、要約されている。RSV感染のコトンラットモデルが米国特許第4,800,078号及び Prince et al., Virus Res. 3: 193-196 (1985)（参照により本明細書に組込まれている）に記載され、ヒト及び非ヒト霊長類における弱毒化及び効力を合理的に予測するものと考えられている。さらに、チンパンジーを用いるRSV感染の霊長類モデルは、Richardson et al., J. Med. Virol. 3: 91-100 (1978); Wright et al., Infect. Immun. 37: 397-400 (1982); Crowe et al., Vaccine 11: 1396-1404 (1993)（いずれも参照により本明細書に組込まれている）に詳しく説明されているように、ヒトにおける弱毒化及び効力を合理的に予測する。広範囲の（-）鎖RNAウイルスについて他のモデルが知られている。組換え（-）鎖RNAウイルスの弱毒化及び免疫原性のレベルに関して上記動物モデルから導かれるデータの相関性は一般的に受け入れられている。例えば、感染したコトンラットにおけるRSV中和抗体の治療効果は、RSVに感染したサル及びヒトの免疫療法についての後続の経験と高い相関性があることが示されている。実際、コトンラットは、RSV中和抗体を用いた免疫療法に対する、感染したサル、チンパンジー及びヒトの応答性についての十分信頼し得る実験上のサロゲートであると思われる。例えば、治療される動物の血清中の抗体レベルにより測定される、コトンラットにおける治療効果に関連したRSV中和抗体の量（即ち、1：302〜1：518の血清RSV中和力価）は、サル（1：539の力価）又はヒトの幼児又は小児（即ち、1：877）について示されるものと同一の範囲にある。コトンラットにおける治療効果は、肺におけるウイルス力価の100倍又はそれ以上の低下により明らかだったが（Prince et al., J. Virol. 61: 1851-1854）、サルでは、治療効果は肺のウイルス力価の50倍低下であると観察された（Hemming et al., J. Infect. Dis. 152: 1083-1087 (1985)）。最後に、重篤なRSV気管支炎又は肺炎で入院した幼児及び小児における治療効果は、治療群における酸素発生の有意な増加と治療された患者の上気道から回収されるRSVの量の有意な減少により明らかだった（Hemming et al., Antimicrob. Agents Chemother. 31: 1882-1886 (1987)）。従って、上記の試験結果に基づけば、コトンラットは、幼児及び小児におけるキメラ及び非キメラRSVワクチンの成功を予測し得るモデルを構成する。マウスを含む他のげっ歯類も同様に有用であろう。なぜなら、これらの動物はRSV複製を適度に許容し、ヒトと同様のコア体温を有するからである（Wright et al., J. Infect. Dis. 122: 501-512 (1970) 及び Anderson et al., J. Gen. Virol. 71: (1990)）。他の（-）鎖RNAウイルスについても同様のモデルが利用可能であり、広く知られている。
【０１４３】
上記の説明により、及び以下の実施例に基づいて、本発明はまた、ワクチン使用のための単離された感染性弱毒化ウイルス組成物を提供する。ワクチンの成分である弱毒化ウイルスは、単離され、典型的には精製された形態である。単離されたとは、感染された個体の鼻咽腔のような、野生型ウイルスのネーテブな環境以外に存在するRSVを意味する。より一般的には、単離されたとは、細胞培養又は他の人工培地の成分としての弱毒化ウイルスを含むことを意味する。例えば、本発明の弱毒化RSVは、細胞培養から分離されてスタビライザーに加えられた、被感染細胞の培養によって産生され得る。
【０１４４】
本発明のワクチンは、有効成分として、本明細書に記載のような異種ウイルスにおいて同定される突然変異を担う組換え（-）鎖RNAウイルスの免疫学的有効量を含有する。組換えウイルスはワクチン製剤に直接使用され得るか、又は凍結乾燥され得る。凍結乾燥されたウイルスは、典型的には約4℃で維持される。使用のために用意するときは、凍結乾燥ウイルスは、安定化溶液、例えば生理食塩水、又はSPG、Mg++及びHEPESを含んでなる溶液において、以下にさらに記載されるようなアジュバントと一緒か又は一緒でなく、復元される。生物学的に誘導されるか又は組換え的に修飾されるウイルスは、生理学的に許容される担体又はアジュバントとともに宿主へ導入され得る。有用な担体は当技術分野で周知であり、例えば、水、緩衝水、0.4％生理食塩水、0.3％グリシン、ヒアルロン酸、等が含まれる。生成した水溶液は、そのまま使用されるようにパッケージされ得るか、又は凍結乾燥され、凍結乾燥された調製物は、上記のように、投与前に滅菌溶液と組み合わせられる。この組成物は、pH調整剤及び緩衝剤、張度調整剤、湿潤剤等のような、生理学的条件に近似させるために必要とされるような製剤的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリル酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、等を含有し得る。許容されるアジュバントには、不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、又はアルムが含まれ、これらは当技術分野でよく知られている材料である。好ましいアジュバントにはまた、StimulonTM QS-21（Aquila Biopharmaceuticals, Inc., ウチェスター、MA）、MPLTM（3-0-脱アシル化モノホスホリル脂質A；RIBI ImmunoChem Research, Inc., ハミルトン、MT）、及びインターロイキン-12（ジェネティクスインスティチュート、ケンブリッジ、MA）が含まれる。
【０１４５】
エアゾール、飛沫、経口、局所又は他の経路により、本明細書に記載のような弱毒化ウイルスワクチン組成物で免疫化すると、宿主の免疫系は、1つ又はそれ以上のウイルスタンパク質、例えばRSV F及び／又はG糖タンパク質に特異的な抗体を産生することによってワクチンへ応答する。ワクチン接種の結果として、宿主は、主題のウイルスによる感染に対して少なくとも部分的にか又は完全に免疫になるか、又はそれに関連した中等度ないし重篤な疾患を発症することに抵抗的になる。
【０１４６】
本発明のワクチンは、単一のウイルス株又は抗原性の亜群、例えばRSV A又はBに対するか、又は多数の株又は亜群に対する免疫応答を誘発する弱毒化ウイルスを含み得る。この文脈では、キメラワクチンウイルスは、モノ特異的な免疫応答か、又は多数の株又は亜群に対するポリ特異的な免疫応答を誘発し得る。他のやり方では、様々な免疫原の特徴を有するキメラウイルスは、1つのRSV株、又は多数のRSV株又は亜群に対して有効な保護を誘発するために、ワクチン混合物において複合され得るか、又は調整された治療プロトコールにおいて別々に投与され得る。
【０１４７】
ワクチンが投与される宿主は、主題のウイルス又は近縁のウイルスによる感染を受けやすく、ワクチン接種されるウイルスの抗原に対する保護的な免疫応答を産生し得る哺乳動物であり得る。従って、好適な宿主には、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、げっ歯類などが含まれる。従って、本発明は多種多様なヒト及び家畜に使用するワクチンを創出する方法を提供する。
【０１４８】
本発明の弱毒化組換えウイルスを含有するワクチン組成物は、主題のウイルスに罹患しやすいか又は他のやり方で感染するリスクがある患者へ、この主題ウイルスに抗する各個体の免疫応答能力を誘導するか又は増強するのに十分である「免疫学的有効量」を投与される。ヒトの場合、本発明の弱毒化ウイルスは、例えば Wright et al., Infect Immun. 37: 397-400 (1982), Kim et al., Pediatrics 52: 56-63 (1973), 及び Wright et al., J. Pediatr. 88: 931-936 (1976)（いずれも参照により本明細書に組込まれている）におけるRSVについての記載のような十分確立されたヒトワクチンのプロトコールにより投与される。簡略に言うと、成人又は小児は、典型的には0.5ml量の生理学的に許容される希釈剤又は担体中にある、免疫学的有効量のRSVワクチンの飛沫により経鼻で接種される。このことは、非複製ワクチンを用いた腸管外の免疫化に比較して、簡便性と安全性の利点を有する。それはまた、RSVへの抵抗において主要な役割を担う、局所の気道免疫の直接刺激を提供する。さらに、この形式の予防接種は、通常ごく若い人に見出されるRSV特異的な母由来の血清抗体の免疫抑制効果を有効に回避する。また、RSV抗原の腸管外投与が免疫病理的な合併症と関連づけられるときがあるのに対し、生きたウイルスでは、このことは一度も観察されていない。
【０１４９】
あらゆる被検者で、投与される弱毒化ウイルスワクチンの正確な量と投与の時期及び反復回数は、患者の健康状態及び体重、投与形式、製剤の性質、等に基づいて決定される。投与量は、一般に、患者あたり約103〜約106プラーク形成単位（RFU）又はそれ以上のウイルス、より一般的には患者あたり約104〜105PFUウイルスの範囲をとる。いずれの場合も、ワクチン製剤は、抗ウイルス免疫応答を有効に刺激するか又は誘導するのに十分な本発明の弱毒化ウイルスの量を提供すべきであり、これは他の方法のなかでも、例えば補体結合、プラーク中和、及び／又は酵素結合性免疫吸着剤検定により決定され得る。これに関連し、各個人は上気道疾患の徴候及び症状についてモニターされる。チンパンジーへの投与では、本発明のワクチンの弱毒化ウイルスは、ワクチンを接種されたものの鼻咽腔において、野生型ウイルスよりも約10倍又はそれ以上低いレベル、又は不完全に弱毒化したウイルスのレベルに比較して10倍又はそれ以上低いレベルで増殖する。
【０１５０】
新生児及び幼児では、十分な免疫レベルを誘発するために頻回投与が必要とされる場合がある。RSV感染に対しては、投与を生後1ヶ月以内に開始し、小児期には、ネーティブ（野生型）のRSV感染に抗する十分な保護レベルを維持するのに必要なように、2ヶ月、6ヶ月、1年及び2年のような間隔で投与すべきである。同様に、例えば、医療ワーカー、デイケアワーカー、幼児の家族、高齢者、易感染性の心肺機能を有する個人のような、反復性又は重篤なRSV感染に特に罹りやすい成人は、保護免疫応答を確立及び／又は維持するために頻回の免疫接種を必要とする場合がある。誘発された免疫のレベルは、中和する分泌及び血清の抗体量を測定することによってモニターすることが可能であり、所望される保護レベルを維持するのに必要なように、投与量を調整するか、又は予防接種を繰り返すことが可能である。さらに、様々なレシピエント群に対する投与に対して様々なワクチンウイルスが適用され得る。例えば、サイトカインか又はT細胞エピトープに豊富な追加のタンパク質を発現する設計された組換え体は、幼児よりも成人に対して特に有利であり得る。本発明により産生されるワクチンは、多数の亜群又は株に抗する保護を達成するために、別の亜群又は株のウイルスの抗原を発現するウイルスと組み合わせることが可能である。他のやり方では、ワクチンウイルスは、本明細書に記載のような1つのクローンへ、設計された多数のウイルス株又は亜群の保護エピトープを取り込み得る。
【０１５１】
典型的には、様々なワクチンウイルスが使用される場合、それらは混合物において同時に投与されるが、それらはまた、別々にも投与され得る。例えば、2種のRSV亜群のF糖タンパク質は、アミノ酸配列において約11％しか異ならないので、この類似性が、RSV又はF抗原で免疫化され、異種の株でチャレンジされた動物において観察されるような、交叉保護免疫応答の基礎となる。このように、1つの株を用いた免疫化が同じであるか又は異なる亜群の異なる株に抗する保護となる場合がある。しかしながら、RSVの抗原性亜群A又はBのG及びF糖タンパク質をワクチンに存在させることが好ましいであろう。
【０１５２】
本発明の弱毒化組換えワクチンは、個体が後に野生型ウイルスに感染したときに、肺炎及び気管支炎のような重篤な疾患に抗して保護する免疫応答の産生を誘導する。自然に循環しているウイルスはまだ感染を引き起こすことが可能であり得るが、予防接種と野生型ウイルスの後続感染による抵抗性の可能な追加の結果として疾患の症状を生じる可能性は大いに低下している。予防接種の後では、相同の（同じ亜群の）野生型ウイルスをin vitro及びin vivoで中和し得る、宿主により産生された血清及び分泌性の抗体が検出されるレベルにある。多くの事例で、この宿主抗体は、異なる非ワクチン亜群の野生型ウイルスも中和するものである。
【０１５３】
本発明の好ましい弱毒化ウイルスは、ヒトの中で自然に循環している野生型ウイルスに比較して、ビルレンスのごく実質的な減少を示す。キメラウイルスは十分に弱毒化され、感染の症状は免疫化されたほとんどの個体で発生しない。ある事例では、この弱毒化ウイルスは予防接種を受けてない個人へ伝播する可能性が依然あり得る。しかしながら、このビルレンスは十分弱められているので、予防接種を受けたか又は偶発的な宿主において重篤な下気道感染は起こらない。
【０１５４】
本発明のワクチンウイルスの弱毒化レベルは、例えば、免疫化した宿主の、例えば気道に存在するウイルスの量を定量し、候補ワクチン株として評価された野生型又は他の弱毒化ウイルスにより産生されるものとその量を比較することによって決定され得る。例えば、本発明の弱毒化RSVは、野生型ウイルスの複製レベルに比較して、チンパンジーのようなごく罹患しやすい宿主の上気道において、複製がより高度に、例えば10〜1000倍以下に制限されている。さらに、チンパンジーの上気道における弱毒化RSVワクチン株の複製レベルは、血清陰性のヒト幼児において不完全に弱毒化していることがかつて示された、RSV A2 ts-1突然変異のそれより低いはずである。上気道におけるウイルス複製に関連している鼻漏の発症をさらに低下させるには、理想的なワクチン候補ウイルスは、上気道と下気道の両方で制限された複製レベルを示すべきである。しかしながら、本発明の弱毒化ウイルスは、予防接種を受けた個体に保護を与えるのに十分なほど感染性であり免疫原性である。感染した宿主の鼻咽腔におけるRSVのレベルを決定する方法は文献においてよく知られている。鼻咽頭の分泌物を吸引するか又は洗い出すことにより検体が得られ、研究室の方法により組織培養などでウイルスを定量する。例えば、Belshe et al., J. Med. Virology 1: 157-162 (1997), Friedewald et al., J. Amer. Med. Assoc. 204: 690-694 (1968); Gharpure et al., J. Virol. 3: 414-421 (1969)；及び Wright et al., Arch. Ges. Virusforsch. 41: 238-247 (1973) を参照のこと。これらはいずれも参照により本明細書に組込まれている。ウイルスは、好便にも、チンパンジーのような宿主動物の鼻咽腔において測定され得る。追加の（-）鎖RNAのレベル及びビルレンスを決定する他の方法は広く知られていて、容易に実施される。
【０１５５】
本明細書において開示される本発明は、制限ではなく例示のために提供される以下の実施例によりさらに明らかになる。本発明の記述のために本明細書に引用されるすべての公表物及び特許文書はあらゆる目的のためのそのまま参照により本明細書に組込まれている。
【０１５６】
【実施例】
実施例I：HPIV3 JS cp45及びRSV cp530及びセンダイ・ウイルスにおいて同定される弱毒化突然変異の、異種の（-）鎖RNAウイルス内に保存された配列要素へのマッピング
この実施例は、1つの（-）鎖RNAウイルスにおいて同定される突然変異が、モノネガウイルス目内の異種ウイルスにある、対応する保存アミノ酸配列要素に容易にマップし得ることを示す。1種又はそれ以上の異種（-）鎖RNAウイルスの中で（同一的又は保守的に）保存されている親配列に比較した構造変化により特徴づけられるこれらの突然変異は、親のタンパク質の配列要素を共有する組換えウイルス内に取り込む可能性がある候補突然変異を提供する。
【０１５７】
本発明のこの側面を具体化するために、HPIV3突然変異株のJS cp45内にある既知の突然変異のパネルを分析した。この突然変異パネルには、Tyr942、Leu992及び／又はThr1558の親残基／配列位置でポリメラーゼL遺伝子におけるts弱毒化アミノ酸置換が含まれる。より特定すると、JS cp45突然変異Lタンパク質は弱毒化突然変異を示し、ここでは親のTyr942がHisに置換され、Leu992がPheに置換され、及び／又はThr1558がIleに置換されている（参照により本明細書に組込まれている、米国特許出願第08／083,793号及び対応する国際特許出願第WO98／53078号を参照のこと）。本発明の好ましい側面によると、これらの突然変異は、この変化を同定するために親配列に対してマップされただけでなく、その弱毒化効果とクローン化された感染性ウイルスへの回復可能性を確かめるために、単独又は組み合わせて、PIV組換体（r942、r992、r1558、r942／992、r992／1558、r942／1558及びr942／992／1558）へ成功して取り込まれた。
【０１５８】
追加の代表的な突然変異をHPIV3 JS cp45突然変異において評価し、HPIV3のF及びCタンパク質における弱毒化アミノ酸置換をコードするようにマップし、特徴づけた。この突然変異には、Ile96のThrへの置換により例示されるような、JS HPIV3の親残基／位置のIle96でのP遺伝子のCタンパク質における非ts弱毒化アミノ酸置換が含まれる。HPIV3のFタンパク質において同定されるさらなる代表的な突然変異は、Ile420がValへ、及びAla450がThrへ置換されることにより例示されるような、Ile420及びAla450の親残基／配列位置におけるアミノ酸置換をコードする。
【０１５９】
HPIV3においてこのように同定されるそれぞれの弱毒化突然変異は、他の（-）鎖ウイルスにおける相同タンパク質に対する配列比較の指標を提供した。本発明のこの側面を明示するために、上記に概説した方法により従来の配列並置を実施し、HPIV3のL及びFタンパク質において同定される突然変異を異種の（-）鎖RNAウイルスのパネル（HPIV1、センダイ・ウイルス、HPIV2、BPIV3、MeV及びRSV）中の対応する部位へマップした。表2に示されるように、この実施は、選択された突然変異体の親配列要素とそれと比較した異種ウイルスの野生型配列との間の高度な保存をきわめて著明に示した。このような結果が驚くべきであったのは、進化的に保存された配列要素は重要な機能上の意義を有するものであり、突然変異を受けたときには、単なる弱毒化より重大な表現型への効果（例えば生存能又は感染性の喪失）を生じると予測されるからである。
【０１６０】
【表２】
Figure 0004646410
【０１６１】
【表３】
Figure 0004646410
【０１６２】
表2に示される例示的な並置をみると、分析したL及びFの突然変異それぞれが、実質的に保存され、同一であるか又は保守的なアミノ酸残基の存在により特徴づけられる親配列要素を、示したウイルス分類群間の対応位置で変化させたことが注目される。例えば、親残基のTyr942をHisへ変化させるcp45 Lタンパク質の突然変異は、センダイ、HPIV2、HPIV3、BPIV3及びMeVのLタンパク質それぞれで対応する野生型位置での同一のチロシン残基の保持により示されるように、きわめて保守的にマップされた（表2）。同様に、Pheより置換されたLeu992を特徴とするcp45 L突然変異は、センダイ、HPIV3、BPIV3及びMeVのLタンパク質間で同一に保存されている親の残基／位置にマップされる。Ile420がValへ、及びAla450がThrへ置換されている、cp45 Fタンパク質における2つの同定された突然変異はまた、HPIV3及びBPIV3の間で同一に保存された残基／位置を示すが、Ile420からValへの突然変異体の親残基は、さらにHPIV1でも同一に保存されている。HPIV3 JS cp45において同定される弱毒化突然変異の部位に対応する追加の保存された配列要素も表2に示されている。
【０１６３】
別の異種配列並置を実施して、突然変異株RSV cp530において同定される例示的なRSV弱毒化突然変異の保存を評価した。この突然変異はcp530のLポリメラーゼにおける521位でフェニルアラニンがロイシンへ置換していることにより特徴づけられ、この突然変異はこのタンパク質のより大きい保存された構造ドメインの内部で起こる。表3に示されるように、13種の主題分類群で対応する野生型の位置で同一のフェニルアラニン残基が保持されていることにより示されるように、Phe521での突然変異もきわめて保守的にマップされた（表3；図1、パネルA）。
【０１６４】
【表４】
Figure 0004646410
【０１６５】
さらに別の異種配列並置を実施して、既知の弱毒化突然変異の部位に対応する保存された構造要素を同定する能力を実証した。この例では、センダイ・ウイルスのCタンパク質の170位に同定された弱毒化突然変異を異種ウイルス、HPIV-1、HPIV-3及びBPIV-3のCタンパク質にある対応配列に対してマップした（表4参照；対応する配列における最初の残基の位置を記数する）。ここでも、この突然変異は、多様な分類群間で同一に保存された親の残基／配列位置におけるアミノ酸の変化により特徴づけられた。
【０１６６】
【表５】
Figure 0004646410
【０１６７】
上記の知見をまとめると、弱毒化突然変異の部位に対応する配列要素の驚くべき保存を示す。この基礎において、本発明の合理的な設計法を開始し、1つの異種ウイルスにおいて同定される弱毒化の配列変化を異なる組換えウイルスへ、例えば組換えゲノム又はアンチゲノムの同一又は保守的な変化により導入し、弱毒化した組換えクローンを産生した。上記方法の実践的な開発を以下の実施例により明示する。
【０１６８】
実施例II：RSV cpts530L由来の弱毒化突然変異の組換えHPIV3ワクチン候補物への異種導入
このように、モノネガウイルス目内の異種分類群の間で保存された構造要素に対応する部位で弱毒化突然変異を同定し、系統発生の境界を越えた弱毒化突然変異の異種導入という概念を、重要な疾患ウイルスのRSVをモデルとして使用して検証した。この文脈で、本実施例は、パラミクソウイルス科のニューモウイルス属のウイルスであるRSVにおいて同定される弱毒化（att）突然変異を、遠縁のレスピロウイルス属のメンバーであるPIV3へ導入し得ることを示す。上記ウイルスは、パラミクソウイルス科内の2種の異なる亜科である、ニューモウイルスとパラミクソウイルスをそれぞれ代表する。
【０１６９】
より特定すると、弱毒化の表現型を特定する突然変異の規定部位（RSV Lタンパク質のPhe521）で親のRSV配列を変化させた、第一の異種ウイルス（RSV cpts530）における弱毒化突然変異を、選択したターゲットウイルスであるHPIV3のLタンパク質にある対応位置（F456L）にある同一に保存された残基へマップした（表3）。従って、このように保存された野生型HPIV3の配列要素を、RSVとHPIV3間での弱毒化突然変異の異種導入についての潜在ターゲットとして試験した。
【０１７０】
この導入を達成するために、弱毒化突然変異を担っている保存された配列要素の全部又は一部を、好ましくは組換えウイルスへコピーするか又は移入し、新規の弱毒化誘導体を産生する。突然変異の変化を組換えウイルスへ同一にコピーすることが好ましいが、この忠実性のレベルは必要とされない。反対に、ターゲットとしてこのように同定された親又は野生型の残基は、突然変異を特徴づける残基とは無関係であり得る1つ又はそれ以上の残基を含んでなる突然変異の部位で、欠失され得るか又はアミノ酸挿入により置換され得る。好ましくは、主題の突然変異が1つ又はそれ以上のアミノ酸置換により特徴づけられる場合、突然変異の部位に位置で対応する、組換えウイルスの親クローンの残基が、突然変異体の配列において同定される置換残基に保守的に関連している1つ又はそれ以上の残基により置換される。より好ましくは、突然変異の部位に対応する、組換えウイルスの親クローンの残基が、突然変異体の配列において存在するものと同一である1つ又はそれ以上の残基により置換される。
【０１７１】
このように、本実施例では、cpts530のLポリメラーゼにある521位のaaにおけるフェニルアラニンからロイシンへの突然変異が、ts及び弱毒化（att）表現型を特定することが特徴づけられた。いくつかの遠縁のパラミクソウイルスのLタンパク質におけるこの領域の配列並置（表3）は、このフェニルアラニンが広く保存されていることを明らかにした。逆遺伝学を使用して、野生型PIV3のLタンパク質にある456位の類似したフェニルアラニンをロイシンへ突然変異させた（F456L）。r456Lと命名したこの生成ウイルスはts（プラーク形成のシャットオフ温度が40℃）であり、ハムスターの下気道ではなく、上気道における複製が組換え野生型（rwt）PIV3のそれに比較して10倍低下していた。上記の結果は、導入された、フェニルアラニンからロイシンへの突然変異により、2種の遠縁のパラミクソウイルスにおいて同等レベルの温度感受性及び弱毒化が特定されたことを示す。
【０１７２】
また、本実施例では、2種のrPIV3候補ワクチンウイルス（一方は、Lタンパク質において3つのcp45 tsミスセンス突然変異を担うrcp45L、他方は全15のcp45突然変異を担うrcp45）へF456突然変異を導入すると、さらにウイルスをin vivoで弱毒化することが示された。より特定すると、2種の最近開発された組換えPIV3ワクチン候補物へF456L突然変異を導入した。一方はrcp45であり、生物学的に誘導されたPIV3ワクチン候補物であるcp45の組換えバージョンであり、他方のrcp45Lは、Lタンパク質における3つのアミノ酸置換だけがcp45突然変異として存在するバージョンである（公開された国際特許出願第98／53078号；Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998); Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381 (1999), いずれも参照により本明細書に組込まれている）。F456L突然変異をrcp45又はrcp45Lへ付加すると、in vivoにおける温度感受性及び弱毒化のレベルが増加し、rcp45-456は免疫原性であり、表現型も安定していた。rcp45L-456及びrcp45-456ウイルスは、その親のrcp45L及びrcp45よりもハムスターにおける複製の点で100〜1000倍制限されていた。rcp45-456を用いた免疫化は、PIV3チャレンジウイルスの複製に対し中等度の抵抗レベルを誘発した。チンパンジーでは、rcp45-456は、rcp45より気道において5倍以上制限され、同等の中〜高レベルのPIV3特異的な血清抗体を誘発した。チンパンジーから単離したrcp45及びrcp45ー456ウイルスは、2週間の複製経過の間、それぞれの開始ウイルスと同レベルの温度感受性を維持し、その表現型の安定性を示した。
【０１７３】
従って、RSVF521L突然変異に対応するF456L突然変異のcp45組換えウイルスへの導入は、組換えウイルスの弱毒化において漸進的な増加をもたらし、PIVワクチン候補物における弱毒化の微調整に対するこの突然変異導入の有用性を示している。異種のパラミクソウイルス（この例では様々な亜科を代表する）において同定される突然変異を導入する能力は、新規なパラインフルエンザウイルスワクチンを開発する能力を大いに高める。
【０１７４】
ウイルス及び細胞
本実施例の対照として使用するrPIV3 JS wt（本明細書ではrwtと呼ぶ）、rcp45L、及びrcp45ウイルスはかつて産生されたものである（公開された国際特許出願第98／53078号；Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998); Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381 (1999),いずれも参照により本明細書に組込まれている）。rPIV3は、既報のように（Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); Hall et al., Virus Res. 22 (3): 173-184, 1992; Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998), 参照により本明細書に組込まれている）、シミアンLLC-MK2細胞（ATCC CCL 7.1）において増殖した。T7ポリメラーゼを発現する、修飾されたワクシニアウイルスのAnkara（MVA-T7）（Wyatt et al., Virology 210 (1): 202-205 (1995)）は、Linda WyattとBernard Mossの厚意により提供された。HEp-2（ATCC CCL 23）及びLLC-MK2細胞は、2％ FBSと硫酸ゲンタマイシン（50μg／mL）を補充したOptiMEM I（Life Technologies、ゲイサースブルグ、MD）か、又は10％ FBS、硫酸ゲンタマイシン（50μg／mL）及び4mM グルタミンを補充したEMEMにおいて維持した。
【０１７５】
rwtにおける点突然変異の構築
感染性ウイルスを回収するのにかつて使用されたPIV3 JS wtのアンチゲノムcDNAクローンであるp3／7（131）2G＋（Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998); Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381 (1999)）の、PIV3 nt7437〜11312（XhoI-SphI）を含むサブゲノムフラグメントを、標準的な分子クローニング技術を使用して、このフラグメントを受け入れるように修飾したpUC19ベクターへクローン化した。既報（Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998); Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381 (1999)）のようにTransformer Mutagenesis キット（クローンテク、CA）を使用して2つの点突然変異を導入することにより、このcDNAを修飾した。上記2つの変化は、rPIV3アンチゲノムRNAの完全な（＋）センス配列により数えて、10011位（TからC）及び10013位（CからG）であった。このことにより、F456Lのコドン変化、並びにマーカーとしての重複したサイレントXmn部位が導入された（図1）。突然変異誘発の後、制限エンドヌクレアーゼフラグメントを完全に配列決定し、標準的な分子クローニング技術を使用して、完全長のクローンであるp3／7（131）2G＋へ直接クローン化するか、又はcp45突然変異を担う誘導体へクローン化した。
【０１７６】
F456L突然変異を担う組換えPIV3の回収
F456L突然変異と3つのサポートプラスミド、pTM（N）、pTM（P no C）及びpTM（L）を担う完全長のアンチゲノムcDNA誘導体を、LipofectACE（Life Technologies, MD）を使用して6穴プレート（コスター、MA）のHEp-2単層へトランスフェクトし、この単層を既報（Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998)）のようにMVA-T7で感染させた。プラスミドpTM（P no C）は、既報のpTM（P）（Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997)）プラスミドで、その翻訳開始コドンがAUGからACGへ（メチオニンからスレオニンへ）変化するようにC ORFが修飾されたバージョンである。32℃で4日インキュベーションした後、トランスフェクション収穫物をT-25フラスコにおいてLLC-MK2細胞上に継代し、これを32℃で4〜8日インキュベートした。澄明にした培地上澄液を、既報（Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); Hall et al., Virus Res. 22 (3): 173-184, 1992; Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998),）のようにLLC-MK2細胞上で3回プラーク精製にかけた。それぞれの生物学的にクローン化した組換えウイルスをLLC-MK2細胞において32℃で2回増幅し、さらなる特徴づけのためにウイルスを産生した。ウイルスは、澄明にした培地からポリエチレングリコール沈澱により濃縮し（Mbiguino and Menezes, J. Virol. Methods 31: 161-170 (1991)）、ウイルスRNA（vRNA）をTRIzol Reagent（Life Technologies）で抽出した。ランダムヘキサマープライマーを用いたSuperscript II Preamplification System（Life Technologies）を使用して、vRNAに対し逆転写を実施した。Advantage cDNA PCRキット（クローンテク、CA）と、PIV3ゲノムの様々な部分に特異的なセンス及びアンチセンスプライマーを使用して、制限エンドヌクレアーゼ消化及び／又は配列分析のフラグメントを増幅した。このPCRフラグメントを、突然変異の構築の間に認識部位が創出されたか又は消去された制限酵素のそれぞれを用いた配列決定及び／又は制限酵素分析により分析した。
【０１７７】
F456L突然変異を担うrPIV3の許容及び制限温度でのプラーク形成効率（EOP）
対照及び組換えウイルスのin vitroプラーク形成の温度感受性レベルを、既報（Hall et al., Virus Res. 22 (3): 173-184, 1992）のように6日間インキュベートしたLLC-MK2細胞の単層培養物において、32℃、及び35℃〜41℃の温度の範囲で決定した。プラークを、モルモット赤血球で血球吸着させた後にメチルセルロースの層を除去して計数するか、他のやり方では、単層に存在するウイルスプラークを2種のPIV3特異的抗HNマウスmAbである101／1及び454／11の250倍希釈の混合液で免疫ペルオキシダーゼ染色した（Murphy et al., Vaccine 8 (5): 497-502 (1990); Murphy et al. (1990); van Wyke Coelingh, Winter, and Murphy Virology 143 (2): 569-582 (1985), いずれも参照により本明細書に組込まれている）。
【０１７８】
rPIV3突然変異ウイルスのatt表現型についてのハムスターにおける評価
PIV3について血清陰性である4週齢のゴールデンシリアンハムスター（Charles River Laboratories, NY）に、rwt又は突然変異rPIV3の1つの106.0TCID50を含有するL15培地0.1mlを鼻腔内に接種した。感染4日目にハムスターを屠殺し、肺と鼻甲介を採取し、既報（Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997; Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998)）のようにウイルスを定量した。ハムスターの各群につき、32℃で平均のlog10TCID50／グラムを算出した。
【０１７９】
rcp45-456のハムスターにおける免疫原性及び効力
5匹のハムスター3群に、（i）L15培地（プラセーボ）、（ii）rcp45の106.0TCID50、又は（iii）rcp45-456の106.0TCID50の0.1mlを鼻腔内に接種した。感染前と感染後42日目にハムスターから採血し、PIV3に対する血清の血球凝集阻害（HAI）抗体力価を既報（van Wyke Coelingh, Winter, and Murphy, 1985）のように決定した。44日目、106.0TCID50rwtの鼻腔内投与によりハムスターをチャレンジした。4日後に鼻甲介と肺を採取し、組織ホモジェネートにおけるrwtの力価を上記のように決定した。
【０１８０】
rPIV3突然変異ウイルスのatt表現型についてのチンパンジーにおける評価
RSV及びPIV3について血清陰性であり、体重6.6〜10.0kgである雌雄の若いチンパンジーを大型のガラス隔離室に対で収容し、既報のように維持した（Crowe et al., 1994a; Hall et al., J. Infect. Dis. 167: 958-962 (1993)）。チンパンジーの群を、rcp45又はrcp45-456の106.0TCID50を含有する接種物1mlで鼻腔内（IN）及び気管内（IT）経路により各部位で感染させた。ウイルスを接種した後、流出しているウイルスの定量用に鼻咽頭スワブ及び気管洗浄サンプルを既報（Hall et al., 1993; Karron et al., 1997）のように採取した。鼻咽頭スワブサンプルは、1〜10日目と13日目に採取し、気管洗浄サンプルは2、4、6、8及び10日目に採取した。鼻漏の程度を毎日評価し、0〜4のスコアを当てた（0＝鼻漏なし；1＝微量；2＝軽度；3＝中等度；4＝重度）。rcp45及びrcp45-456のウイルスを、同一のプロトコールに従う2つの個別実験で評価した。実験1では、2匹のチンパンジーにrcp45を、4匹にrcp45-456を接種し、実験2では各ウイルスを2匹の動物に与えた。第二の実験を実施したのは、第一の実験で観察された2種のウイルス間の増殖の違いを確かめるためである。2組のデータはウイルスの増殖及び免疫原性に関して区別し得なかったので、一緒にして平均化した。IN及びIT経路によりPIV3のwt JS株の104TCID50を受けた4匹の動物からのデータは既報（Hall et al., 1993）の通りであって、比較のためにここに提示する。
【０１８１】
rPIVの複製のチンパンジーにおける特徴づけ
鼻咽頭スワブ及び気管洗浄サンプルにおけるウイルスの量を、既報（Crowe et al., 1994a; Hall et al., 1993）のように、LLC-MK2単層において32℃で決定し、log10TCID50／mlとして表現した。チンパンジーの鼻咽頭及び気管洗浄サンプルに存在するウイルスを、広汎な細胞変性効果が検出されるまで、24穴プレートのLLC-MK2単層において32℃で増殖させた。上記rPIV3単離物の温度感受性レベルを、上記のように、LLC-MK2単層上のプラーク形成効率を決定することによって評価した。チンパンジーの検体又は単離物を用いたすべての試験には、クリンダマイシン（100μg／ml）、シプロフロキサシン（100μg／ml）、ゲンタマイシン（100μg／ml）、及びアンホテリシン B（2.5μg／ml）からなる抗生物質のカクテルが含まれた。
【０１８２】
結果
F456L突然変異のrwtへの導入はts表現型を与える
上記のように、RSV cpts530はtsであり、マウスの気道における複製について弱毒化している（Crowe et al., 1994b）。RSV cpts530のLタンパク質におけるフェニルアラニン-521での単一アミノ酸置換は、温度感受性（プラーク形成のシャットオフ温度が39℃）と弱毒化（マウスの上気道における複製の10倍低下）の原因となる（Crowe et al., 1994b; Juhasz et al., 1997）。RSV及びPIV3を含む、13種の異なるパラミクソウイルスのLタンパク質の配列並置は、RSV Lの521位のフェニルアラニンが高度に保存されていることを明らかにした（表3；図1、パネルA）。HPIV3の場合、対応するアミノ酸はPIV3 Lポリメラーゼの456位に現れる。RSV（521）対PIV3（456）でこの残基の位置番号が異なることは、RSVのLタンパク質が、他の属からのパラミクソウイルスに比較して、約70個のアミノ酸のアミノ末端拡張を有するというこれまでの観察事実に一致している（Stec et al., Virology 183: 273-287 (1991)）。PIV3のLタンパク質の456位における突然変異があれば、異種のRSV cpts突然変異体のものと同様のts及びatt表現型を与えるかどうかを判定するために、rwtの456位のフェニルアラニンを同じようにロイシンへ突然変異誘発させた（F456L）。このコーディング変化は、wtへの復帰の確率を下げるために、2つのヌクレオチド置換を含むように設計した。また、この突然変異は、サイレントのXmnI制限エンドヌクレアーゼ認識部位の導入により特徴づけた（図1、パネルC）。この突然変異を完全長の感染性rwtのcDNAプラスミドへ導入し、既報（Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998); Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381 (1999)）のように組換えウイルスを回収した。回収されたR456L突然変異体（図1、パネルC）は、精製されたvRNAのRT-PCRと制限酵素消化及び配列決定による分析に基づいて、XmnIマーカー及びF456L突然変異を保有することが確かめられた。F456L突然変異のrwtへの導入は40℃のシャットオフ温度をあたえたが（表5）、これはRSV cpts530のそれより1℃高く、ニューモウイルスにおいて同定されるts突然変異が遠縁のレスピロウイルスへ導入され、同一ではないが、同等のts表現型を与え得ることを示している。
【０１８３】
【表６】
Figure 0004646410
【０１８４】
組換えrcp45ベースの弱毒化ウイルスへF456L突然変異を導入すると温度感受性が高まる
cp45はLタンパク質に3種の特定のアミノ酸置換を有するが、これはts及びatt表現型の主要な決定要因であることがすでに示されている（Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998)）。cp45はまた12種の他の突然変異をLの外側に有するが、これにはts及びatt突然変異が含まれる（Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381 (1999)）。rcp45と、rcp45のL遺伝子の突然変異を3つだけ担うウイルス（rcp45L）へF456Lを導入した。このことをしたのは、F456L突然変異により特定される温度感受性が、3つのcp45 L突然変異か又は15のcp45突然変異のフルセットにより特定されるものと相加的であるかどうかを判定するためである。注目すべきことに、rcp45L-456は、rcp45Lでの39℃に比較して35℃のシャットオフ温度を有し、温度感受性レベルの大幅な増加を明らかにした（表5）。rcp45-456突然変異体は、rcp45での38℃に比較して、37℃の中間的なシャットオフ温度を有していた。F456L突然変異により特定される温度感受性はrcp45L及びrcp45における突然変異により特定されるものに相加的であるが、この効果の強度はこの2種のウイルスについて明らかに異なっていた。このように、より多くの数の突然変異を含有するrcp45-456は、予期に反してrcp45L-456ほどtsではなかった。cp45 ts突然変異間の複雑な相互作用の証拠は、cp45突然変異の様々な組み合わせを含有する他のrPIV3ウイルスについて以前から観察されているが、この諸効果の根底にあるものは理解されていない（Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998) 及び Skiadopoulos et al., J. Virol. 73 (2): 1374-1381 (1999)）。
【０１８５】
突然変異体rPIV3のハムスターにおける複製及び免疫原性
ハムスターに、rwtの106.0TCID50、又はF456L突然変異を単独か、又はcp45特異的突然変異とともに担うウイルスを含む、いくつかの突然変異rPIV3の1つをIN接種した（表6）。4日後、肺と鼻甲介を採取し、各ウイルスの複製レベルを決定した。F456L単独はr456Lの複製に対し中等度の効果を与え、鼻甲介において約10倍の低下をもたらし、肺における複製には明瞭な制限をもたらさなかった。この弱毒化レベルは、マウスの上気道におけるRSV cpts530突然変異体のそれと同等である（Crowe et al., Vaccine 12 (8), 691-699 (1994a)）。驚くべきことに、F456L突然変異のrcp45L又はrcp45のいずれかへの付加は、上気道において複製が有意により制限される組換え体をもたらした。このことは、F456L突然変異が、上記突然変異ウイルスの両方のハムスター上気道における複製の弱毒化を大いに高め得ることを示す。
【０１８６】
【表７】
Figure 0004646410
【０１８７】
rcp45-456導入突然変異体が免疫応答を誘発するかどうかを判定するために、血清陰性ハムスターへrcp45-456、rcp45、又はL15培地の106.0TCID50をIN投与した。42日後、血清サンプルを採取し、44日目にrwtで動物にチャレンジした。rcp45-456又はrcp45での免疫化は、それぞれ中等度又は高度の力価の血清HAI抗体を誘発し、rwtチャレンジウイルスの複製に対する抵抗性を誘導した（表7）。rcp45-456を用いた感染により誘導される抗体及び抵抗性のレベルは、rcp45により誘導されるものより少なかった。rcp45-456により与えられる免疫応答及び保護のより低いレベルは、ハムスターの気道における複製のその有意により低いレベルを反映する可能性がある。
【０１８８】
【表８】
Figure 0004646410
【０１８９】
rcp45-456突然変異体はチンパンジーにおいてrcp45より弱毒化される
rcp45-456突然変異がハムスターでは過剰に弱毒化されるように見えたので、我々は、ヒトに最も近縁である非ヒト霊長類であるチンパンジーにおいてその複製及び免疫原性のレベルを決定しようとした。2つの個別確認実験において、チンパンジーの群にrcp45-456かrcp45のいずれか一方を各部位につき106.0TCID50をIN及びITで接種した。感染後10日及び13日目にそれぞれ気管洗浄サンプル及び鼻咽頭スワブを採取し、各検体におけるウイルスの力価を決定した。rcp45-456とrcp45はPIV3 wtに比較して上気道及び下気道での複製がきわめて制限され（表8）、各突然変異ウイルスがチンパンジーにおける複製について弱毒化されることを示した。上記（表6）のように、F456L突然変異をcp45へ付加する効果は、ハムスターの上気道において2500倍以上複製を低下させた。対照的に、チンパンジーで評価した場合、この効果は上気道と下気道の両方において5倍の減少にとどまった（表8及び図2）。この違いは2つの独立した実験において観察された。第一の実験では2匹の動物がrcp45を受け、4匹がrcp45-456を受け、第二の実験では各ウイルスが2匹の動物へ投与された。
【０１９０】
【表９】
Figure 0004646410
【０１９１】
上気道におけるウイルス流出の日々変動パターンを比較すると、rcp45-456ウイルスはrcp452比較してより低いピークの力価に達するが、その流出はよりゆっくりと減衰することが示された（図2）。このパターンは、非ヒト霊長類におけるRSV突然変異体の高められた弱毒化レベルに特徴的であることがかつて示された（Prince et al., Infect. Immun. 26 (3): 1009-13, 1979）。この高められた弱毒化レベルはまた、有意に低い平均ピーク鼻漏スコアにも反映された（表8）。このように、F456L突然変異のrcp45への導入は、チンパンジーの気道に対する弱毒化の漸進的な増加をもたらした。
【０１９２】
rcp45及びrcp45-456のts表現型はチンパンジーにおける複製後に維持される
rcp45-456及びrcp45を感染させたチンパンジーから得た単離物の温度感受性レベルを試験して、この2種の組換体が高度に許容的な宿主における複製後にそのts表現型を保持するかどうかを判定した。得られる単離物の数が多いため、単離物を2回の試験に分けて評価した。実験1からの各2匹の動物に由来する単離物の分析を表9に示し、全動物の要約を表10に示す。同一の対照ウイルス懸濁液の温度感受性レベルは2回の実験で1℃だけ異なっていた（表10）が、これはこのアッセイにおける実験の変動性を示すものである。例えば、rcp45-456とrcp45でプラークが観察されなかった温度はそれぞれ実験1では38℃と39℃であり、実験2ではそれぞれ39℃と40℃であった（表10）。この程度の実験変動性は時々観察されるものである。重要なのは、いずれの実験でもrcp45-456とrcp45のプラーク形成シャットオフ温度の違いが一貫して1℃あったことである。2回の試験間の実験変動性のために、それらは表10において別々にまとめる。各単離物はts表現型を保持し、単離物の温度感受性レベルは、チンパンジーの気道における複製の経過を通して対照インプットウイルスのそれと違わなかった。重要にも、38℃及び39℃でプラーク形成をするrcp45-456単離物の比率はrcp45単離物のそれより低く、in vitroで観察されるrcp45-456の温度感受性のより高いレベルがin vivoでの複製後も維持されることを示した。
【０１９３】
【表１０】
Figure 0004646410
【０１９４】
【表１１】
Figure 0004646410
【０１９５】
上記の結果は、RSV cpts530における突然変異、即ちLタンパク質の521位における親フェニルアラニンの置換が、PIV3のLタンパク質の対応位置（456）へ導入される場合と同等の温度感受性及び弱毒化レベルを与えることを示す。RSVとPIV3はパラミクソウイルス科の個別の亜科、即ちニューモウイルスとパラミクソウイルスをそれぞれ代表する。両ウイルスは、特に、アミノ末端（RSVのaa422-938とPIV3の357-896）の近くに存在し、Poch et al. (J. Gen. Virol. 5: 1153-62 (1990); 及び Stec et al. Virology 183: 273-287 (1991)) に記載された4つの高度保存ポリメラーゼモチーフを包含する、約540〜570個のアミノ酸の領域において、そのLタンパク質について明瞭で、統計的に有意な配列関連性を共有する（Stec et al. Virology 183: 273-287 (1991)）。上記の突然変異は、RSVの521位とPIV3の456位というこの一般領域において存在するが、Poch et al. により同定された第一保存モチーフの上流約175残基のところにある。注目すべきは、この残基が、本研究で試験した13種の異種パラミクソウイルスの間で、C末端から12残基の位置にロイシン残基が位置しているように、厳格に保存されていることである（図1、パネルA）。この厳格な保存にもかかわらず、RSV cpts突然変異体において521 L突然変異を前もって同定し、HPIV3 Lタンパク質の保存された位置へこの突然変異を導入することに成功することがなければ、PIV3 Lタンパク質のアミノ酸配列にある2233種の位置の中で、この残基が条件致死的な弱毒化組換体を産生する突然変異誘発に好適なターゲット部位であることを予測することは可能でなかっただろう。上記の結果に照らせば、本発明の方法を拡張し、モノネガウイルス、特にパラミクソウイルスの多様なメンバー間で最近同定された多数の弱毒化突然変異を含むことが可能である（Bukreyev et al., J. Virol. 71 (12), 8973-8982; Garcin et al., Virology 238 (2): 424-431 (1997); Juhasz et al., Vaccine 17: 1416-1424 (1999); Juhasz et al., J. Virol. 71 (8): 5814-5819 (1997); Kato et al., EMBO J. 16 (3): 578-587 (1997a); Kato et al., J. Virol. 71 (10): 7266-7272 (1979b); Kondo et al., J. Biol. Chem. 268 (29): 21924-21930 (1993); Kurotani et al., Genes Cells 3 (2): 111-124 (1998); Skiadopoulos et al., J. Virol. 72 (3): 1762-8 (1998); Whitehead et al., J. Virol. 73: 871-877 及び 73: 3438-3442 (1999); Whitehead et al., Virology 247 (2): 232-239 (1998a); Whitehead et al., J. Virol. 73 (2): 871-877 (1999b); Whitehead et al., J. Virol. 72 (5): 4467-4471 (1998b), いずれも参照により本明細書に組込まれている）。
【０１９６】
上記の知見は新規のPIVワクチン候補物を提供し、RSVから他のパラミクソウイルスへの弱毒化突然変異の導入も可能にする。ここでは保存された親の残基／位置へ突然変異がマップされる。さらにこの文脈では、RSVの521L突然変異が、JS wt PIV3の血球凝集-ノイラミニダーゼ（HN）及びF遺伝子がPIV1のそれにより置換された、最近開発されたキメラPIV3組換体への移入に従う（Tao et al., J. Virol. 72 (4), 2955-2961 (1998), 参照により本明細書に組込まれている）。このキメラ組換体はcp45突然変異体において同定される1つ又はそれ以上の追加の突然変異の取り込みによりさらに弱毒化され得るが、この突然変異は、今日では、JS wt PIV3バックグラウンド内で置換されたPIVIのHN及びF遺伝子を担う、感染性の弱毒化キメラPIV3-1クローンの中に（F及びHN遺伝子において生じる3つの突然変異を除き）そのまま取り込まれている。
【０１９７】
実施例III
センダイ・ウイルスのCタンパク質にある弱毒化突然変異の組換えHPIV3ワクチン候補物への異種導入
本実施例は、170位でのフェニルアラニン（F）からセリン（S）への置換により特徴づけられる、センダイ・ウイルス（SeV）のCタンパク質における既知の弱毒化突然変異（Itoh et al., J. Gen. Virol. 78: 3207-3215 (1997), 参照により本明細書に組込まれている）の、組換えHPIV3クローン中の対応する位置への異種導入を説明する。上記と表4において示されるように、HPIV3のCタンパク質にある同一に保存された配列位置／残基のF164へF170の親配列要素をマップするが、この要素はSeV及びBPIV-3にも保存されている。
【０１９８】
HPIV3のC ORFへ点突然変異を導入することにより、このSeVのF170S突然変異を組換えHPIV3ウイルスであるrF164Sへ導入し、164位のアミノ酸をフェニルアラニン（F）からセリン（S）へ変化させた。生成したrF164S組換体は、驚くべきことに、下気道よりも上気道でより弱毒化された。このパターンは温度感受性の弱毒化突然変異で見られるものと反対であり、それにより組換えの生きた弱毒化ワクチンウイルスにこの新規な突然変異を含ませることが上気道において残存するビルレンスを低下させるのに有用であることが判明するだろう。このrF164S組換体はまた、野生型HPIV3を用いたチャレンジに対する保護も与えた。
【０１９９】
HPIV3のP及びCタンパク質は、mRNAの分離して重複するORFから翻訳される（図3）。すべてのパラミクソウイルスがPタンパク質をコードするのに対し、レスピロウイルス及びモルビリウイルス属のメンバーだけはCタンパク質をコードする。それぞれのウイルスはC ORFから発現されるタンパク質の数と、ウイルスのin vitro及びin vivoにおける複製の重要性において多様に異なる。HPIV3及び麻疹ウイルス（MeV）が単一のCタンパク質のみを発現する（Bellini et al., J. Virol. 53: 908-19 (1985); Sanchez et al., Virology 147: 177-86 (1985); Spriggs et al., J. Gen. Virol. 67: 2705-2719 (1986)）のに対し、センダイ・ウイルス（SeV）は、C ORFから独立して読まれ始める4種のタンパク質、C’、C、Y1及びY2を発現する（これらの翻訳開始部位はmRNAにおいてこの順で出現する）（Curran, et al., Enzyme 44: 244-9 (1990); Lamb et al., p. 181-214, D. Kingsbury (ed.), The Paramyxoviruses, Plenum Press, New York (1991)）。
【０２００】
4種のC由来タンパク質がすべて消去された生存能のある組換えSeVはin vitroできわめて非効率に複製することが見出されたが（Kurotani et al., Genes Cells 3: 111-124 (1998)）、Cタンパク質を個別に消去すると複雑な効果を示した（Cadd et al., J. Virol. 70: 5067-74 (1996); Curran et al., Virology 189: 647-56 (1992); Latorre et al., J. Virol. 72: 5984-93 (1998)）。
【０２０１】
Cタンパク質の170位でフェニルアラニン（F）からセリン（S）への置換をもたらす単一の点突然変異を担う組換えSeVはマウスで弱毒化されたが、細胞培養では、その複製は阻害されなかった（Garcin et al., Virology 238: 424-431 (1997); Itoh et al., J. Gen. Virol. 78: 3207-15 (1997)）。SeVとはきわだって対照的に、C（-）麻疹ウイルス（MeV）は、Vero細胞で効率的に複製したが（Radecke et al., Virology 217: 418-21 (1996)）、ヒト末梢血では複製の制限を示し、in vivoではやや弱毒化されるだけであると見られた（Escoffier et al., J. Virol. 73: 1695-8 (1999); Valsamakis et al., J. Virol. 72: 7754-61 (1998)）。
【０２０２】
様々なMeV及びSeVのC突然変異体の複製が動物において変化することは、このタンパク質が、生きた弱毒化HPIV3ワクチンの開発において有用な弱毒化突然変異の導入の潜在ターゲットであることを示唆する。この実施例では、逆遺伝学の方法を使用して、HPIV3のC ORFへ突然変異を導入し、162のアミノ酸でF→Sの変化を創出したが、これは異種の弱毒化SeV突然変異体では170位のアミノ酸でのF→S変化に相当する。
【０２０３】
細胞及びウイルス
HEp-2及びシミアンLLC-MK2単層細胞培養は、2％胎仔血清、硫酸ゲンタマイシン（50μg／mL）及び4mM グルタミンを補充したOptiMEM I（Life Technologies、ゲイサースブルグ、MD）において維持した。バクテリオファージのT7ポリメラーゼを発現する、修飾されたワクシニア株のAnkara（MVA）組換えウイルスは、L. WyattとB. Moss両博士の厚意により提供された（Wyatt et al., Virology, 210: 202-205 (1995)）。JS野生型（wt）PIV3株と、その弱毒化ts誘導体であるJS cp45を既報（Hall et al., Virus Res. 22: 173-184 (1992)）のようにLLC-MK2細胞で増殖した。
【０２０４】
cDNA
JS wtウイルスの完全な15462ntアンチゲノム｛p3／7（131）2G｝をコードする完全長のcDNAクローンはかつて記載された（Genbank受入れ番号：＃Z11575）（Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997)）。C ORFの164位アミノ酸でのフェニルアラニンからセリンの変化をコードする突然変異したcDNAを構築するための鋳型としてこのクローンを使用した（表11、図3）。p3／7（131）2GのPml1-BamHIフラグメント（PIV3アンチゲノムのnt1215-3903）を、多重クローニング領域にPmlI部位を含むように修飾しておいたプラスミドpUC119｛pUC119（Pml1-BamHI）｝へサブクローン化した。次いで、Kunkelの方法（Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382, 1987）を使用してpUC119（Pml1-BamHI）に対し部位特異的突然変異誘発を実施し、種々の突然変異をC ORFへ導入した。
【０２０５】
【表１２】
Figure 0004646410
【０２０６】
C ORFにF164S突然変異を有するウイルス（rF164S）をコードするアンチゲノムcDNAの構築
完全長アンチゲノムのnt2284位にAからGへの変化を導入する突然変異原のプライマーを使用して、C ORFのアミノ酸164位でフェニルアラニン（F）からセリン（S）への変化を創出した。この突然変異はP ORFでもサイレントであった。この完全長クローンのPmlI-BamHIフラグメントをそのまま配列決定し、導入された突然変異を確認し、他の突然変異が偶発的に導入されなかったことを確かめた。次いでこのフラグメントを既報（Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997)）のように完全長クローンのp3／7（131）2Gへ戻してクローン化し、アンチゲノムcDNAクローンを創出した。
【０２０７】
cDNAからの組換えC F164S突然変異体の回収
C F164S突然変異を担う完全長のアンチゲノムcDNAを、LipofectACE（Life Technologies）を使用して、サポートプラスミド｛pTM（N）、pTM（P no C）及びpTM（L）｝とともに、6穴プレート（コスター、ケンブリッジ、MA）のHEp-2細胞へトランスフェクトし、既報（Durbin et al., Virology 235: 323-332, 1997）のようにMVA-T7で感染させた。pTM（P no C）は、既報（Durbin et al., Virology 234: 74-83 (1997)）のpTM（P）プラスミドに同一であるが、ただしそのC転写開始部位ががAUGからACGへ突然変異され、C ORFの第一アミノ酸がメチオニンからスレオニンへ変化している。32℃で3日インキュベーションした後、トランスフェクション収穫物をT-25フラスコにおいて新鮮なLLC-MK2細胞単層上に継代し、32℃で5日間インキュベートした（継代1と呼ぶ）。F164S収穫物に存在するウイルスの量は、既報（Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997)）のように、PIV3 HN-特異的モノクローナル抗体を用いた免疫ペルオキシダーゼ染色により視覚化されるプラークのあるLLC-MK2単層培養物についてのプラーク力価検定により決定した。
【０２０８】
継代1収穫物の上澄液に存在するF164S組換えウイルスを、既報（Hall et al., Virus Res. 22: 173-184 (1992)）のようにLLC-MK2細胞上で3回プラーク精製にかけた。第3回目のプラーク精製からの生物学的にクローン化した組換えウイルスをLLC-MK2細胞において32℃で2回増幅し、さらなる特徴づけのためにウイルスを産生した。
【０２０９】
回収された組換えウイルスの配列分析
既報（Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997)）のように、被感染細胞の単層から澄明にした培地からポリエチレングリコール沈澱によりウイルスを濃縮した。製造業者の推奨法に従って、このRNAをTRIzol試薬（Life Technologies）で精製した。Advantage RT for PCRキット（クローンテク、パロアルト、CA）を用いて、推奨法によりRT-PCRを実施した。対照反応は、逆転写酵素が反応から省かれていることを除くと同一であって、PCR産物がウイルスRNAだけに由来し、あり得る混在cDNAプラスミドには由来しないことを確かめた。種々のプライマーを使用して、完全長アンチゲノムのヌクレオチド1595〜3104に及ぶPCRフラグメントを産生した。このフラグメントには、組換えウイルスのC、D及びV ORF全体が含まれる。次いで、サイクルジデオキシヌクレオチド配列分析（New England Biolabs, ベヴァリー、MA）を使用して、配列を決定した。
【０２１０】
免疫沈降法によるタンパク質の分析
多重抗原ペプチド（MAP）技術により、2つの異なるCペプチド（Research Genetics, ハンツビル、AL）に対する2種のPIV3 C特異的抗血清をウサギにおいて産生した。この2種のペプチドは、Cタンパク質のアミノ酸領域30〜44及び60〜74に及んだ。各Cペプチドの8つのコピーを分岐したキャリアーコア上に置き、フロイントアジュバントとともにウサギ（ペプチド1種につきウサギ2匹）へ別々に注射した。このウサギを2及び4週目に指定のMAPで追加免疫し、4、8及び10週目に採血した。いずれの抗血清も、免疫原として使用したCペプチドを高力価で認識し、放射免疫沈降アッセイ（RIPA）においてHPIV3被感染細胞からCタンパク質を沈澱させた。
【０２１１】
LLC-MK2細胞のT25細胞単層を、rF164S又は組換えJS wtウイルス（rJS）のいずれかに感染多重度5で感染させるか、又は偽感染させ、32℃でインキュベートした。感染24時間後に、単層をメチオニン（-）DMEM（Life Technologies）で洗浄し、メチオニン（-）DMEMにおいて10μCi／μlの35S-メチオニンの存在下でさらに6時間インキュベートした。次いで、細胞を採取し、3回洗浄し、1mlのRIPA緩衝液｛1％（w／v）デオキシコール酸ナトリウム、1％（v／v）Triton X-100、0.2％（w／v）SDS、150mM NaCl、50mMTris-HCl，pH7.4｝に再懸濁させ、凍結融解し、65000xGでペレット状にした。この細胞抽出物を新鮮なエッペンドルフ管へ移し、各サンプルへ両方のC抗血清（各5μl）の混合液を加え、一定に混合しながら、4℃で2時間インキュベートした。HPIV3のHN糖タンパク質を認識する（van Wyke Coelingh et al., J. Virol. 61: 1473-1477 (1987)）、mAb454／11及び101／1の混合物10μlを各サンプルへ加え、回収されたウイルスが実際にHPIV3であることを確かめた。各サンプルへプロテインAセファロースビーズ（シグマ、セントルイス、MO）の10％懸濁液200μlを加え、4℃で一晩一定に混合することにより、免疫複合体を沈澱させた。各サンプルを変性させ、減量し、製造業者の推奨により4-12％ポリアクリルアミドゲル（NuPAGE, Novex, サンディエゴ、CA）により分析した。このゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーにより分析した。
【０２１２】
rPIV3の多サイクル複製
T25フラスコ中のLLC-MK2細胞の単層を0.1のMOIでrF164S又はrJSに同一2検体で感染させ、5％ CO2において32℃でインキュベートした。5日間連続で24時間ごとに各フラスコからサンプル250μlを採取し、各時点で同量の新鮮培地に置換した。96穴プレートのLLC-MK2細胞単層において各サンプルを32℃で7日間インキュベートし、力価を検定した。血球吸着によりウイルスを検出し、log10TCID50／mlとして記録した。
【０２１３】
動物試験
4〜6週齢のゴールデンシリアンハムスター21匹の群に、rF164S、rJS、cp45（生物学的に誘導したJS wtウイルスの生きた弱毒化誘導体）、又は呼吸器合胞体ウイルス（RSV）の105PFUを含有するEMEM（Life Technologies）を各動物につき0.1ml、鼻腔内に接種した。接種後3、4及び5日目に、RSVを受けたハムスターを除き、各群5匹のハムスターを屠殺し、肺と鼻甲介を採取した。鼻甲介と肺をホモジェナイズして、それぞれ10％と20％（w／v）のL-15（Quality Biologicals、ゲイサースブルグ、MD）懸濁液を調製し、このサンプルを速やかに凍結した。サンプルに存在するウイルスにつき、96穴プレートのLLC-MK2細胞単層において32℃で7日間インキュベートし、力価を検定した。血球吸着によりウイルスを検出し、5匹のハムスター各群の各日につき、平均log10TCID50／gを算出した。各群の残る6匹から、接種後0及び28日目に血清を採取した。各ウイルスに対する血清抗体反応を、既報（van Wyke Coelingh et al., Virology 143: 569-582 (1985)）の血球凝集阻害（HAI）アッセイにより評価した。28日目に、RSVで免疫化したものを含む、各群の残るハムスターに生物学的に誘導したPIV3 JS wtウイルスの106PFUで鼻腔内チャレンジした。チャレンジ後4日目に動物を屠殺し、肺と鼻甲介を採取し、上記のように処理した。チャレンジサンプル中に存在しているウイルスの量を上記のように決定した。
【０２１４】
アフリカミドリザル（AGM）4匹の群それぞれに、rF164S、JSwt、又はcp45の106PFUを、アカゲザルにおける先の研究（Durbin et al., Vaccine 16: 1324-30 (1998)）についての記載のように、鼻腔内及び気管内に接種した。接種後12日間連続して鼻咽頭スワブサンプルを採取し、摂取後2、4、6、8及び10日目に気管洗浄サンプルを採取した。この検体は瞬間冷凍し、すべての検体が採取されるまで-70℃で保存した。サンプルに存在するウイルスにつき、32℃で7日間インキュベートした96穴プレートのLLC-MK2細胞単層において、力価を検定した。血球吸着によりウイルスを検出し、各日につき、平均log10TCID50／mlを算出した。接種後0及び28日目に各サルから血清を採取し、様々な変異体とPIV3野生型（JS）を用いた実験上の感染に対するPIV3 HAI抗体の応答を決定した。接種後28日目に、生物学的に誘導したPIV3野生型ウイルスの106PFUを1mlの接種液で鼻腔内及び気管内に投与して、AGMをチャレンジした。チャレンジ後0、1、2、4、6、8、10及び12日目に鼻咽頭スワブサンプルを採取し、チャレンジ後2、4、6、8及び10日目に気管洗浄サンプルを採取した。検体を瞬間冷凍し、保存し、存在するウイルスを上記のように力価検定した。
【０２１５】
結果
組換え突然変異体rF164Sの回収
Cタンパク質のaa残基164がFからSへ変化している、突然変異ウイルスrF164Sをコードする、HPIV3のアンチゲノムcDNAを調製した。この突然変異は、重複するP ORFにおいては翻訳上サイレントであった（表11）。
【０２１６】
アンチゲノムcDNAを、3種のPIV3サポートプラスミド｛pTM（P no C）、pTM（N）、pTM（L）｝とともに、HEp-2細胞へトランスフェクトし、この細胞を、T7 RNAポリメラーゼを発現するMVAで同時に感染させた。C ORFに突然変異を含有するrPIV3の回収率を、同様にトランスフェクト-感染されたHEp-2細胞培養のそれと、p3／7（131）2G［組換えJSwt PIV3（rJS）がかつて回収された完全長のPIV3アンチゲノムを発現するプラスミド（Durbin et al., Virology 235: 323-332 (1997)）］を使用して比較した。32℃で3日インキュベーションした後、トランスフェクトされた細胞を収穫し、この上澄液をT-25フラスコにおいて新鮮なLLC-MK2細胞単層上に継代し、32℃で5日間インキュベートした（継代1）。32℃で5日間の後、rJS及びrF164SのLLC-MK2細胞単層は3〜4＋の細胞変性効果（CPE）を示した。プラーク単離による3回の生物学的クローニングの後で、組換え突然変異体をLLC-MK2細胞において2回増幅し、さらなる特徴づけのためにウイルスの懸濁液を産生した。
【０２１７】
回収されたウイルスが本当に予測されたrF164s突然変異体であることを確かめるために、C、D及びVのORFを含有するP遺伝子部分を含む、HPIV3アンチゲノムのnt1595-3104に及ぶDNAのフラグメントを増幅するプライマー対を使用するRT-PCRにより、このクローン化ウイルスを分析した。PCR産物の産生はRTを含むことに依存していて、このことはRNAからの誘導であって、混在するcDNAからの誘導ではないことを示す。このRT-PCR産物についてヌクレオチド配列決定を実施し、導入された突然変異の存在を確認した。導入された突然変異はクローン化組換体から増幅されたnt1595-3104に及ぶRT-PCRフラグメントに存在するものであることが確かめられ、他の偶発的な突然変異は見出されなかった。
【０２１８】
放射免疫沈降アッセイ（RIPA）を実施して、rF164S突然変異ウイルスをrJS wtウイルスと比較した。細胞を感染させ、感染後24〜30時間35S-メチオニンの存在下でインキュベートし、細胞溶解液を調製した。等量の全タンパク質を抗C及び抗HN抗体とともにインキュベートし、次いでこの抗体をプロテインAセファロースビーズに結合させた。rJSとrF164SはいずれもHN及びCタンパク質をコードした（図4）。rF164Sにより発現されるCタンパク質は親のrJSにより発現されるものと同一のサイズであり、しかも同量発現された（図4）。
【０２１９】
細胞培養におけるrF164Sの複製
同一2検体のLLC-MK2細胞単層培養物を0.1のMOIでrF164S又はrJSに感染させ、32℃で5日間インキュベートした。各培養液から培地を24時間ごとにサンプリングし、この材料の力価を後に検定し、細胞培養液における各ウイルスの複製を評価した。rF164Sの複製は、ウイルスの産生速度と最終力価の両方、並びに高温での複製能力に関し、親のrJS wtのそれと実質的に識別し得なかった。
【０２２０】
ハムスターにおけるrF164Sの複製
次に、ハムスターの上気道及び下気道における複製能力について、rF164s突然変異体ウイルスを親rJS wtと比較した。ハムスターの群に、生物学的に誘導したワクチン候補物であるrF164S又はcp45を動物あたり105pfu鼻腔内接種した。rJSに比較すると、rF164Sの複製は、ハムスターの上気道において100〜500倍、下気道において10倍以上低下した（表12）。rF164SとrJSで感染させたハムスターはHPIV3に対して有意な抗体応答を有し、PIV3チャレンジウイルスの複製の高レベル制限を示した。
【０２２１】
【表１３】
Figure 0004646410
【０２２２】
【表１４】
Figure 0004646410
【０２２３】
霊長類におけるrF164Sの複製
rF164Sの弱毒化表現型及び保護効力をさらに評価するために、この組換え突然変異ウイルスを4匹のAGMの群へ投与し、その上気道及び下気道における複製を、cp45及びJSwtのそれと比較した。rF164Sの複製はAGMの上気道において100倍又はそれ以上低下していた。このウイルスについて上気道で観察された弱毒化はcp45のそれに匹敵した（表14）。rF164SはAGMの下気道では中等度に（＜10倍）制限された。この組換えウイルスはHPIV3へのHAI抗体応答を誘発した（表14）。28日目に、免疫化したAGMに、生物学的に誘導したJS wtウイルスの106PFUをIN及びITで与えてチャレンジした。rF164S又はcp45ワクチン候補ウイルスを受けた動物は、AGMの上気道と下気道のいずれでもチャレンジウイルスの複製に抗して完全に保護した。
【０２２４】
【表１５】
Figure 0004646410
【０２２５】
上記の実施例をまとめると、SeVにおけるF170S突然変異が、LLC-MK2シミアン細胞における増殖にウイルスを適応させることによって生物学的に産生された（Garcin et al., Virology 238: 424-431 (1997)、及び Itoh et al., J. Gen. Virol. 78: 3207-15 (1997)）。F170S突然変異を有する組換えSeVはin vitroにおいて高められた複製を示すが、この突然変異体は、SeV C’／C突然変異体の複製が阻害されているように、マウスにおける複製においてきわめて制限されている（Garcin et al., Virology 238: 424-431 (1997) 及び Latorre et al., J. Virol. 72: 5984-93 (1998)）。SeV及びHPIV3のCタンパク質は38％しか相同でないので、SeVのF170S突然変異をHPIV3へ移入することがin vivoでの弱毒化を引き起こすことを見出したのは驚くべきであった。
【０２２６】
HPIV3の組換体であるrF164Sは、SeVの170位に対応するHPIV3のアミノ酸残基に突然変異を担うものであり、in vitroでの複製において制限されなかったが、ハムスターの上気道と下軌道の両方で、AGMの上気道及び下気道で有意に弱毒化されていた。rF164Sは、wtPIV感染に匹敵する血清抗体応答を誘発し、wt HPIV3でのチャレンジに抗してハムスターとAGMの両方を完全に保護した。上記の結果は、rF164S突然変異がHPIV3に抗する生きた弱毒化ワクチンを開発するのに有用であろうことを示す。
【０２２７】
生物材料の保管
以下の材料は、ブダペスト条約の規約により、VA、マナッサス、ブルヴァール大学、10801、アメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション、20110-22092に保管されている。
Figure 0004646410
【０２２８】
上記の発明を、理解の明確化のために図表及び実施例によりやや詳しく説明したが、ある種の変更及び改良が付帯した特許請求の範囲内で実施され得ることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1、パネルAは、RSV Phe-521（矢印で示す）を含む、RSV（SEQ ID NO. 44）、PIV3（SEQ ID NO. 45）、麻疹（SEQ ID NO. 46）及びセンダイ（SEQ ID NO. 47）ウイルスのLポリメラーゼタンパク質のアミノ酸配列の並置を提供する。各タンパク質の少なくとも3つの残基の正確な適合からコンセンサス配列（SEQ ID NO. 48）を産生した。示した配列の最初のアミノ酸の数字位置を示す。4種のウイルスすべてに保存されている残基を太字で示す。下線を施した残基は、PIV2、イヌジステンパーウイルス、シミアン・パラインフルエンザウイルス41、シミアン・パラインフルエンザウイルス5、トリニューモウイルス、ニューカッスル病ウイルス、へンドラウイルス、及びリンダーペストウイルス（それぞれ、受入れ番号：P26676、P24658、P35341、Q88434、Y09630、U665312、X05399、AF017149、P41357）のLポリメラーゼタンパク質でも保存されている。RSV cpts530におけるフェニルアラニン521位のロイシンへの突然変異は、PIV3のLポリメラーゼにおけるaa456に対応する。
図1、パネルBは、PIV3 rwtへ導入されたF456L突然変異及びcp45突然変異の概略図を提供する。導入されたcp45突然変異の相対位置は（*）であり、F456L突然変異は（◆）である。
図1、パネルCは、wt配列（SEQ ID NO. 49）に比較したF456L突然変異（SEQ ID NO. 50）をコードするヌクレオチド配列（（＋）鎖）を示す。完全なrwtアンチゲノムにより記数されたPIV3ヌクレオチド配列をwtウイルスについて示し、突然変異体の配列を以下に示す。ヌクレオチド変化に下線を施し、F456L突然変異を担うコドンを太字で示す。突然変異配列に導入されたXmn1制限エンドヌクレアーゼ認識部位をイタリック体で示す。
【図２】 図2は、チンパンジーの上気道におけるrcp45及びrcp45-456の複製を示す。rcp45-456（□；n＝6）又はrcp45（■（黒四角）；n＝4）で感染させた動物から、示された感染後の日数で採取した鼻咽頭スワブ標本におけるウイルス力価の平均値を示す。示した数値間の統計学的有意差は：（a）p＜0.005；（b）p＜0.05；（c）p＜0.025（スチューデントのt検定）である。（d）検出限界は、0.5log10TCID50／ml以下である。
【図３】 図3は、HPIV3 P／C／D／V ORFの編成を図示する（尺度は正しくない）。P mRNAの3種のリーディングフレームを示し（＋1、＋2及び＋3）、P、C、D及びVのORFを矩形で表す。アミノ酸の長さを示す。RNA編集部位の位置を垂線として示し、その配列モチーフを示し、完全なHPIV3アンチゲノム配列におけるヌクレオチド位置により記数する。
図3、パネルAは、非編集P mRNAの編成を図示する。P及びCのORFの翻訳開始部位を含有する配列が示され、完全なアンチゲノム配列により記数される。完全アンチゲノム配列におけるP、C、D及びVのORFのヌクレオチド位置は：P、1784-3595；C、1794-2392；D、2442-2903；V、2792-3066である。P mRNAに対し、P ORFを開くAUGは80-82の位置にある。
図3、パネルBは、2つの非鋳型G残基（GG）（SEQ ID NO. 53）の挿入を編集部位（SEQ ID NO. 51）に含有するP mRNAの編集バージョンの編成を図示する。このことは、フレーム＋2にあるP ORFの上流端がフレーム＋3にあるD ORFに融合するように、リーディングレジスターを変化させる。生成したキメラタンパク質は、D ORFによりコードされるC末端131アミノ酸に融合したP ORFによってコードされるN末端241アミノ酸を含有する。
【図４】 図4は、rF164SにおけるCタンパク質の発現を示すラジオイムノ沈降アッセイの結果を示す。レーン（a）では、35S-標識細胞溶解液をポリクローナルC特異的ウサギ抗血清で免疫沈降させた。rJS及びrF164溶解液には、Cタンパク質（開き矢印）に対応する22kDのバンドが明らかに存在している。レーン（b）では、細胞溶解液をHPIV3 HNタンパク質に特異的な2種のモノクローナル抗体の混合物により免疫沈降させた。HNタンパク質に対応する64kDのバンド（閉じ矢印）が各ウイルス溶解液に存在していることにより、それらが実際にHPIV3であり、同レベルのタンパク質を発現することが確かめられた。偽レーンは、非感染細胞から採取した組織培養の溶解液を示す。
【図５】 図5は、親ウイルスのrJSに比較した組換え突然変異ウイルスrF164Sのマルチサイクル複製の結果を示す。ウイルスの力価はTCID50／mlとして示し、同一2検体の平均である。
【配列表】
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Claims (11)

  1. 単離され、弱毒化された組換えパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）をコードする１種以上の単離ポリヌクレオチド分子から前記ＰＩＶを産生する方法であって：
    細胞又は無細胞系において、組換えゲノム又はアンチゲノムをコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む１つ以上の発現ベクターと感染性ＰＩＶ粒子を産生するのに必要な必須ウイルスタンパク質を同時発現させることを含んでなり、前記組換えゲノム又はアンチゲノムは、前記ＰＩＶの組換えタンパク質の内部において、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ） ｃｐｔｓ５３０（ＡＴＣＣ ＶＲ ２４５２）のＬタンパク質の５２１位にあるフェニルアラニンに対応するアミノ酸位置での突然変異をコードするように修飾され、前記組換えタンパク質の内部に取り込まれる前記突然変異が前記組換えＰＩＶに弱毒化の表現型を与える、前記方法。
  2. 組換えＰＩＶがヒトＰＩＶ３（ＨＰＩＶ３）であり、前記組換えタンパク質の内部に取り込まれる前記突然変異が前記ＨＰＩＶ３のＬタンパク質の４５６位にあるフェニルアラニンのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 単離され、弱毒化された組換えＰＩＶをコードする１種以上の単離ポリヌクレオチド分子から前記ＰＩＶを産生する方法であって：
    細胞又は無細胞系において、組換えゲノム又はアンチゲノムをコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子を含む１つ以上の発現ベクターと感染性ＰＩＶ粒子を産生するのに必要な必須ウイルスタンパク質を同時発現させることを含んでなり、前記組換えゲノム又はアンチゲノムは、前記ＰＩＶの組換えタンパク質の内部において、センダイウイルス（ＳｅＶ）のＣタンパク質の１７０位にあるフェニルアラニンに対応するアミノ酸位置での突然変異をコードするように修飾され、前記組換えタンパク質の内部に取り込まれる前記突然変異が前記組換えＰＩＶに弱毒化の表現型を与える、前記方法。
  4. 組換えＰＩＶがヒトＰＩＶ３（ＨＰＩＶ３）であり、前記組換えタンパク質の内部に取り込まれる前記突然変異が前記ＨＰＩＶ３のＣタンパク質の１６４位にあるフェニルアラニンのアミノ酸置換を含む、請求項３に記載の方法。
  5. 単離された弱毒化組換えＰＩＶであって：
    組換えゲノム又はアンチゲノムと感染性ＰＩＶ粒子を産生するのに必要な必須ウイルスタンパク質を含んでなり、前記組換えゲノム又はアンチゲノムは、前記ＰＩＶの組換えタンパク質の内部において、ヒトＲＳＶ ｃｐｔｓ５３０（ＡＴＣＣ ＶＲ ２４５２）のＬタンパク質の５２１位にあるフェニルアラニンに対応するアミノ酸位置での突然変異をコードするように修飾され、前記組換えタンパク質の内部に取り込まれる突然変異が前記組換えＰＩＶに弱毒化の表現型を与える、前記ＰＩＶ。
  6. 組換えＰＩＶがヒトＰＩＶ３（ＨＰＩＶ３）であり、前記組換えタンパク質の内部に取り込まれる前記突然変異が前記ＨＰＩＶ３のＬタンパク質の４５６位にあるフェニルアラニンのアミノ酸置換を含む、請求項５に記載の弱毒化組換えＰＩＶ。
  7. 単離された弱毒化組換えＰＩＶであって：
    組換えゲノム又はアンチゲノムと感染性ＰＩＶ粒子を産生するのに必要な必須ウイルスタンパク質を含んでなり、前記組換えゲノム又はアンチゲノムは、前記ＰＩＶの組換えタンパク質の内部において、ＳｅＶのＣタンパク質の１７０位にあるフェニルアラニンに対応するアミノ酸位置での突然変異をコードするように修飾され、前記組換えタンパク質の内部に取り込まれる突然変異が前記組換えＰＩＶに弱毒化の表現型を与える、前記ＰＩＶ。
  8. 組換えＰＩＶがヒトＰＩＶ３（ＨＰＩＶ３）であり、前記組換えタンパク質の内部に取り込まれる前記突然変異が前記ＨＰＩＶ３のＣタンパク質の１６４位にあるフェニルアラニンのアミノ酸置換を含む、請求項７に記載の弱毒化組換えＰＩＶ。
  9. 請求項５〜８のいずれか１項に記載の組換えＰＩＶの組換えゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
  10. 機能可能的に連結した転写プロモーター、請求項５〜８のいずれか１項に記載の組換えＰＩＶの組換えゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子、及び転写ターミネーターを含んでなる発現ベクター。
  11. 免疫学的に十分な量の請求項５〜８のいずれか１項に記載の弱毒化組換えＰＩＶを生理学的に許容される担体とともに含む、ＰＩＶに対する免疫応答を誘発するための免疫原性組成物。
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