JP4549188B2 - 組換えヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）のｃＤＮＡからの回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）、並びにＰＩＶおよび他のヒト病原体に対する免疫応答を誘発する免疫原性組成物における、そしてベクターとしての組換えＨＰＩＶ２の使用 - Google Patents

組換えヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）のｃＤＮＡからの回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）、並びにＰＩＶおよび他のヒト病原体に対する免疫応答を誘発する免疫原性組成物における、そしてベクターとしての組換えＨＰＩＶ２の使用 Download PDF

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Description

発明の背景
［１］本出願は、Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓらによって２００２年９月１８日に出願された米国仮出願第６０／４１２，０５３号の優先権を請求し、該出願の開示は、本明細書に援用される。
発明の背景
［２］ヒト・パラインフルエンザウイルス類（ＨＰＩＶ類）は、ヒト集団における重要な病原体であり、乳児および幼児に、深刻な下気道感染を引き起こす。ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２は、喉頭気管気管支炎（クループ）の主な病原体であり、そしてまた、肺炎および細気管支炎も引き起こしうる（Ｃｈａｎｏｃｋら，Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ．，ｐ．１３４１−１３７９，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｄ．Ｅ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｒ．Ａ．Ｌａｍｂ，Ｍ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ，およびＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ（監修）Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ中，第４版， Ｖｏｌ．１，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１）。ＨＰＩＶ３は、乳児および幼児におけるウイルス性下気道疾患のための入院の、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に次ぐ、主要原因である（Ｃｏｌｌｉｎｓら，第３版“Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”中Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｊ．Ｌ．Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ，およびＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ監修， Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１２０５−１２４３．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６；Ｃｒｏｗｅら，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：４１５−４２１，１９９５；Ｍａｒｘら，Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７６：１４２３−１４２７，１９９７）。
［３］ＨＰＩＶ類はまた、成人における気道疾患の重要な原因でもある。２０年の研究を通じて、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、およびＨＰＩＶ３が、合計で、小児気道疾患の入院のおよそ１８％に関与する病原体として同定されてきている（Ｍｕｒｐｈｙら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． １１：１−１５，１９８８）。ＨＰＩＶ類はまた、中耳炎小児において、ウイルスが誘導する中耳滲出液症例のかなりの比率に関連付けられてきている（Ｈｅｉｋｋｉｎｅｎら，Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３４０：２６０−４，１９９９）。
［４］ＨＰＩＶに対して有効なワクチンを開発するのにかなりの努力が払われているにもかかわらず、いかなるＨＰＩＶ血清型に対してもワクチンは認可されておらず、また、ＨＰＩＶ関連疾病を改善するワクチンも認可されていない。今日まで、最も見込みのある可能性は、生弱毒化ワクチンウイルスであり、これは、これらが、非ヒト霊長類で、受動的に移植された抗体の存在下であっても、効果的であることが示されているためであり、これは、母性獲得抗体を所持する非常に幼い乳児に存在する状況を模倣する実験状況である（Ｃｒｏｗｅら，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：８４７−８５５，１９９５；Ｄｕｒｂｉｎら，Ｊ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １７９：１３４５−１３５１，１９９９）。２種の生弱毒化ＨＰＩＶ３ワクチン候補、野生型ＨＰＩＶ３ ＪＳ株の温度感受性（ｔｓ）誘導体（ＨＰＩＶ３ｃｐ４５と称する）およびウシＰＩＶ３（ＢＰＩＶ３）株が、臨床的に評価中である（Ｋａｒｒｏｎら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ． １５：６５０−６５４，１９９６；Ｋａｒｒｏｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １７１：１１０７−１１１４，１９９５ａ；Ｋａｒｒｏｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １７２，１４４５−１４５０，１９９５ｂ）。生弱毒化ＰＩＶ３ｃｐ４５ワクチン候補は、低温での細胞培養における一連の継代を介して、ＨＰＩＶ３のＪＳ株から得られ、そして実験動物においてＨＰＩＶ３曝露に対して防御性であり、そして十分に弱毒化されており、遺伝的に安定であり、そして血清陰性ヒト乳児および小児において免疫原性であることが見出されている（Ｂｅｌｓｈｅら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ． １０：２３５−２４２，１９８２；Ｂｅｌｓｈｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ． ３７：１６０−５，１９８２；Ｃｌｅｍｅｎｔｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２９：１１７５−８２，１９９１；Ｃｒｏｏｋｓｈａｎｋｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ． １３：２４３−９，１９８４；Ｈａｌｌら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ２２：１７３−１８４，１９９２；Ｋａｒｒｏｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １７２：１４４５−１４５０，１９９５ｂ）。これらのＨＰＩＶ３候補ワクチンウイルスは、生物学的に得られたため、進行中の臨床試験から弱毒化レベルを調整する必要があることが見出されたとしても、そのレベルを調整するための証明された方法がない。
［５］ＨＰＩＶワクチンの開発を促進するため、組換えＤＮＡ技術によって、最近、ｃＤＮＡから感染性マイナス鎖ＲＮＡウイルスを回収（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）することが可能になった（概説に関しては、Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７７：３８１−８９，１９９６を参照されたい）。この背景において、必須ウイルスタンパク質の存在下で、ｃＤＮＡにコードされるゲノムまたはアンチゲノムＲＮＡからの感染性ウイルスの組換え体救出が、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、狂犬病ウイルス（ＲａＶ）、イヌ・ジステンパーウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、感染性造血器壊死ウイルス、サル・ウイルス５（ＳＶ５）、牛疫ウイルス、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、およびセンダイウイルス（ネズミ１型パラインフルエンザウイルス（ＭＰＩＶ１））に関して報告されてきている（例えば、各々、すべての目的のため、本明細書に完全に援用される、Ｇａｒｃｉｎら，ＥＭＢＯ Ｊ． １４：６０８７−６０９４，１９９５；Ｌａｗｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：４４７７−８１，１９９５；Ｒａｄｅｃｋｅら，ＥＭＢＯ Ｊ． １４：５７７３−５７８４，１９９５；Ｓｃｈｎｅｌｌら，ＥＭＢＯ Ｊ． １３：４１９５−２０３，１９９４；Ｗｈｅｌａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：８３８８−９２，１９９５；Ｈｏｆｆｍａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７１：４２７２−４２７７，１９９７；Ｋａｔｏら，Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ １：５６９−５７９，１９９６，Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７：１−６，１９９８；Ｂａｒｏｎら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：１２６５−１２７１，１９９７；国際公報第ＷＯ ９７／０６２７０号；Ｃｏｌｌｉｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：１１５６３−１１５６７，１９９５；Ｃｌａｒｋｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：４８３１−４８３８，２０００；Ｂｉａｃｃｈｅｓｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：１１２４７−１１２５３，２０００；Ｇａｓｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：１０７３７−１０７４４，２０００；米国特許出願第０８／８９２，４０３号、１９９７年７月１５日出願（公表国際出願ＷＯ ９８／０２５３０号、並びに先行米国仮出願第６０／０４７，６３４号、１９９７年５月２３日出願、第６０／０４６，１４１号、１９９７年５月９日出願，および第６０／０２１，７７３号、１９９６年７月１５日出願に対応する）；米国特許出願第０９／２９１，８９４号、１９９９年４月１３日出願；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／０９６９５号、２０００年４月１２日出願（米国仮特許出願第６０／１２９，００６号、１９９９年４月１３日出願に優先権を請求する）；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７７５５号、２０００年６月２３日出願（Ｂｕｃｈｈｏｌｚらによって１９９９年７月９日に出願された米国仮特許出願第６０／１４３，１３２号に優先権を請求する）；Ｊｕｈａｓｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７１：５８１４−５８１９，１９９７；Ｈｅら Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３７：２４９−２６０，１９９７；ＰｅｔｅｒｓらＪ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：５００１−５００９，１９９９；ＢａｒｏｎらＪ．Ｖｉｒｏｌ． ７１：１２６５−１２７１，１９９７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７：２３２−９，１９９８ａ；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：４４６７−４４７１，１９９８ｂ；ＪｉｎらＶｉｒｏｌｏｇｙ ２５１：２０６−２１４，１９９８；Ｂｕｃｈｈｏｌｚら Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７３：２５１−２５９，１９９９；およびＷｈｉｔｅｈｅａｄら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：３４３８−３４４２，１９９９を参照されたい）。
［６］本発明の分野のさらなる刊行物は、組換えパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ類）、特にＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、およびＢＰＩＶ３の回収を報告する（例えば、各々、本明細書に援用される、Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７；Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：８９２２−８９２９，２０００；Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８４：９９−１１２，２００１；米国特許出願第０９／０８３，７９３号、１９９８年５月２２日出願（米国仮出願第６０／０５９，３８５号、１９９７年９月１９日出願に対応する）；米国仮出願第６０／３３１，９６１号、２００１年１１月２１日出願；および米国仮出願第６０／０４７，５７５号、１９９７年５月２３日出願（国際公報第ＷＯ９８／５３０７８号に対応する）を参照されたい）。これらの報告のいくつかは、ウイルスｃＤＮＡクローンの遺伝子操作にさらに取り組み、生物学的突然変異体の表現型変化の遺伝的基礎を決定し、例えば生物学的突然変異体ＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５ウイルスの突然変異は、そのｔｓ、ｃａおよびａｔｔ表現型を特定し、そしてＢＰＩＶの遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）は、その弱毒化表現型を特定する。さらに、これらの報告および関連する刊行物のあるものは、広い範囲の異なる突然変異を有する新規ＰＩＶワクチン候補の構築とともに、こうした組換えワクチン候補が示す、弱毒化、免疫原性および表現型安定性のレベルを評価する方法を論じる（各々、本明細書に援用される、米国出願第０９／５８６，４７９号、２０００年６月１日出願（米国仮特許出願第６０／１４３，１３４号、１９９９年７月９日出願に対応する）；およびＤｕｒｂｉｎらによって１９９９年７月９日に出願された米国特許出願第０９／３５０，８２１号もまた参照されたい）。
［７］したがって、感染性野生型組換えＰＩＶ、（ｒ）ＰＩＶとともに、ｔｓおよび別の方式で修飾されている誘導体のいくつかが、現在、ｃＤＮＡから回収されている。逆遺伝学系を用いて、弱毒化および他の望ましい表現型を特定する、定義された突然変異を所持する感染性ウイルスが生成され、そして現存するワクチン候補ウイルスにおいて、弱毒化および他の表現型変化の遺伝的基礎が研究されてきている。例えば、ＨＰＩＶ３において、ｃｐ４５のＬ遺伝子に見られる３つのアミノ酸置換は、単一でまたは組み合わせて、ｔｓ表現型および弱毒化表現型を特定することが見出されてきている。さらなるｔｓおよび他の弱毒化突然変異が、ＨＰＩＶ３ゲノムの他の領域に導入可能である。
［８］さらに、ＰＩＶ３全長ｃＤＮＡにおいて、ＰＩＶ３ ＨＮおよびＦオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、選択される弱毒化突然変異を場合によって含有するＰＩＶ１と交換することによって、ＰＩＶ３ ｃＤＮＡ救出系を用いて、キメラＰＩＶ１ワクチン候補が生成されてきている。これらのｃＤＮＡに基づく方法に由来する典型的な組換えキメラウイルスには、Ｌ遺伝子中に３つの同定される突然変異すべてを所持するＨＰＩＶ３−１組換え体、ｒＰＩＶ３−１．ｃｐ４５Ｌが含まれる（本明細書に援用される、Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：１７６２−８，１９９８；Ｔａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：２９５５−２９６１，１９９８；Ｔａｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１１００−１１０８，１９９９）。ｒＨＰＩＶ３−ｌ．ｃｐ４５Ｌは、ハムスターにおいて弱毒化されており、そしてＨＰＩＶ１曝露に対して高レベルの耐性を誘導した。ｒＨＰＩＶ３−ｌｃｐ４５と称し、１５のｃｐ４５突然変異のうち１２を含有する、すなわちＨＮおよびＦで生じる突然変異を排除した、さらに別の組換えキメラウイルスが産生されている。この組換えワクチン候補は、ハムスターおよび非ヒト霊長類の上気道および下気道において、非常に弱毒化されており、そしてＨＰＩＶ１感染に対して、高レベルの防御を誘導する（各々、本明細書に援用される、Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １８：５０３−５１０，１９９９；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９７：１３６−１５２，２００２）。しかし、ＨＰＩＶ１に対する使用に関して、ＨＰＩＶ１曝露に対するキメラＨＰＩＶ３−１ワクチン候補の感染および付随する免疫原性は、ＨＰＩＶ３の免疫認識を示す宿主においては弱められる。
［９］最近、いくつかの研究は、他のワクチン代替物がまだ成功を示していない病原体に対するワクチンを開発する目的に向かって、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）抗原を発現するウイルスベクターの使用可能性に重点を置いてきている。この背景において、いくつかの報告によって、外来遺伝子が、組換え体マイナス鎖ＲＮＡウイルスゲノムまたはアンチゲノムにうまく挿入され、多様な効果を持ちうることが示唆される（各々、本明細書に援用される、Ｂｕｋｒｅｙｅｖら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：６６３４−４１，１９９６；Ｂｕｋｒｅｙｅｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６：２３６７−７２，１９９９；ＦｉｎｋｅらＪ．Ｖｉｒｏｌ． ７１：７２８１−８，１９９７；Ｈａｓａｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ７８：２８１３−２０，１９９７；Ｈｅら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３７：２４９−６０，１９９７；Ｊｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５１：２０６−１４，１９９８；Ｊｏｈｎｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７１：５０６０−８，１９９７；Ｋａｈｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５４：８１−９１，１９９９；Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：５９８２−９，１９９７；Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３：７３１０−４，１９９６；Ｍｏｒｉｙａら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４２５：１０５−１１，１９９８；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：３７２３−３２，１９９９；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：４７０４−１１，１９９８；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７：１−６，１９９８；Ｓａｋａｉら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４５６：２２１−２２６，１９９９；Ｓｃｈｎｅｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３：１１３５９−６５，１９９６ａ；Ｓｃｈｎｅｌｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：２３１８−２３，１９９６ｂ；Ｓｃｈｎｅｌｌら，Ｃｅｌｌ ９０：８４９−５７，１９９７；Ｓｉｎｇｈら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ８０：１０１−６，１９９９；Ｓｉｎｇｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７３：４８２３−８，１９９９；Ｓｐｉｅｌｈｏｆｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：２１５０−９，１９９８；Ｙｕら，Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｅｌｌｓ ２：４５７−６６，１９９９；Ｄｕｐｒｅｘら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：７９７２−７９７９，２０００；Ｓｕｂａｓｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：９０３９−９０４７，２０００；Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７８：１６８−１８２，２０００；Ｒｏｓｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：１０９０３−１０９１０，２０００；Ｔａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：６４４８−６４５８，２０００；ＭｃＧｅｔｔｉｇａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：８７２４−８７３２，２００１；ＭｃＧｅｔｔｉｇａｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：４４３０−４４３４，２００１；Ｋａｈｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：１１０７９−１１０８７，２００１；Ｓｔｏｐｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：９３６７−９３７７，２００１；Ｈｕａｎｇら，Ｊ． Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ８２：１７２９−１７３６，２００１；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：１０４９８−１０５０４，２００１；Ｂｕｋｒｅｙｅｖら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：１２１２８−１２１４０，２００１；米国特許出願第０９／６１４，２８５号、２０００年７月１２日出願（米国仮特許出願第６０／１４３，４２５号、１９９９年７月１３日出願に対応する））。ウイルス転写遺伝子開始シグナルおよび遺伝子終止シグナルの調節下で、ウイルスゲノム内に挿入すると、外来遺伝子は、別個のｍＲＮＡとして転写され、そしてかなりのタンパク質発現を生じうる。驚くべきことに、大部分の場合、外来配列は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの多数の継代中、比較的安定で、そして機能するタンパク質を発現することが可能であると報告されてきている。
［１０］しかし、ワクチンに使用するベクターをうまく開発するには、単に、安定した高レベルのタンパク質発現を示すだけでは不十分である。例えば、１９８０年初期または中期から、組換えワクシニアウイルスおよびアデノウイルスを用いて、高レベルタンパク質発現を示すことは可能であったが、それでもこれらのベクターは、ヒトに使用するワクチンを開発するには期待はずれなツールであることが立証されてきている。同様に、ベクターとして開発された大部分の非分節マイナス鎖ウイルスは、いまだにヒトワクチン使用に受け入れやすいことが示されていない。この背景の例には、有蹄動物病原体であり、いくつかの実験室の事故をのぞいて、ヒトへの投与歴がない、水疱性口内炎ウイルス；マウス病原体であり、ヒトへの投与歴がないセンダイウイルス；イヌ病原体であって、ヒトへの意図的な投与歴がないサル・ウイルス５；そして全身性に投与しなければならず、そして母性抗体、および広く使用されている、認可された麻疹ワクチンの使用のため、ほぼすべてのヒトに存在する麻疹特異的抗体によって中和されるであろう麻疹ウイルスの弱毒化株が含まれる。さらに、これらの先のベクター候補のいくつかは、免疫抑制などの副作用を有し、これはベクターとしての使用に直接矛盾する。したがって、増殖特性、指向、および他の生物学的特性が、ヒトに使用するベクターとして適切である、ベクターを同定しければならない。有効なタイミングおよび投与経路を含む、存続可能な免疫戦略を開発することがさらに必要である。
［１１］ワクチンベクターとして使用することが提唱されるモノネガウイルスには、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ＶＳＶ、および狂犬病ウイルスが含まれる。しかし、麻疹ウイルスは、ワクチンベクターとしての潜在的な使用に関して、制限を有する。例えば、麻疹ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスの防御抗原のベクターとしての使用が考慮されてきている（Ｓｉｎｇｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７３：４８２３−８，１９９９）。しかし、この組み合わされた麻疹ウイルス−Ｂ型肝炎ウイルスワクチン候補は、認可された麻疹ウイルスワクチンの示されるスケジュールに匹敵するスケジュールで、９ヶ月齢後にしか投与可能でなく、一方、現在のＢ型肝炎ウイルスワクチンは、初期乳児期に使用することが推奨されている。これは、現在の認可されている麻疹ワクチンが非経口投与され、そして母性抗体による中和および免疫抑制に感受性であり、そしてしたがって９〜１５ヶ月齢より前に投与すると有効でないためである。したがって、麻疹ウイルスは、初期乳児期に疾患を引き起こす病原体、例えばＲＳＶおよびＨＰＩＶの抗原には、劣ったベクターである。
［１２］弱毒化麻疹ウイルスワクチンは、増加した投薬量で投与した際、免疫応答の改変および過剰な死亡率と関連付けられてきており、これは少なくとも部分的に、天然麻疹ウイルス感染の一般的な特徴である、ウイルスが誘導する免疫抑制のためである可能性もある。これは、弱毒化麻疹ウイルスであっても、ワクチンベクター使用には適していない可能性もあることを示す。さらに、ベクターとして麻疹ウイルスを使用することは、この病原体を根絶しようとする地球規模の努力と矛盾するであろう。実際、これらの理由のため、生麻疹ウイルスの使用を終了して、そして麻疹ウイルス防御抗原を発現する、適切な非麻疹ベクターで、現在の麻疹ウイルスワクチンを置き換えることが望ましいであろう。
［１３］ヒトに感染することはまれな狂犬病ウイルスが、ベクターとしての使用を考慮されてきている（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７３１０−４，１９９６）が、狂犬病としてヒトには非常に致死的であるウイルスが、生弱毒化ウイルスベクターとして使用するために開発されうる可能性は低い。さらに、普遍的なヒト病原体ではない狂犬病ウイルスに対する免疫は、一般集団には必要でない。さらに、いくつかの状況においては、ベクターウイルス、およびベクターが抗原決定基のキャリアーとして用いられる病原体の両方に対する多特異性免疫応答を、ベクターが誘発可能であることが望ましい可能性がある。麻疹ウイルスは、狂犬病ウイルスより病原性が低いが、このベクター候補いずれかによる感染は、望ましくない結果を生じうる。麻疹ウイルスは、感染が広がるとウイルス血症、および関連する発疹、および上述の免疫抑制を確立する。麻疹感染中の穏やかな脳炎は、珍しくない。麻疹ウイルスはまた、亜急性硬化性脳炎と称される、まれな進行性致死的神経疾患にも関連付けられている。
［１４］狂犬病および麻疹などのベクター候補と対照的に、ＰＩＶ感染および疾患は、典型的には、部分的に気道への感染の制限によって、より限定されている。重度に免疫無防備状態の被験者で、ウイルス血症および二次的部位への伝播が起こることもあるが、これは、ＰＩＶ感染の典型的な影響ではない。急性気道疾患が、ＰＩＶと関連付けられる唯一の疾患である。したがって、ベクターとしてのＰＩＶの使用は、その生物学的特性に基づいて、末梢リンパ球とウイルスが相互作用して免疫抑制を導き、あるいは精巣または中枢神経系などの二次的器官を感染させて、他の合併症を導くなどの合併症を回避する。これらの特性はまた、ＰＩＶを免疫成功のより優れたベクター候補とし、非経口投与を必要とするベクターでの免疫に比較して、気道への直接投与などの代替経路を介して、免疫成功をより容易にそして有効に達成可能である。
［１５］ベクターに基づくワクチンアプローチが望ましい可能性があるヒト病原体の宿主の中に、麻疹ウイルスがある。生弱毒化ワクチンが３０年以上利用可能であり、そして米国においては、麻疹疾患根絶が広く成功している。しかし、世界保健機関は、なお、特に発展途上国で、年間４５００万を超える麻疹症例が生じていると概算しており、そして該ウイルスは、１年でおよそ１００万の死亡の原因となっている。この疾患が根強い１つの理由は、現在のワクチン配合物が、現在の該ワクチンを不活性化する母性抗体を克服不能であることである。
［１６］麻疹ウイルスは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の麻疹ウイルス属（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）のメンバーである（Ｇｒｉｆｆｉｎら，“Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”中，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ， Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｊ．Ｌ．Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ，およびＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ監修，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１２６７−１３１２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。麻疹ウイルスは、ヒトに対する既知の最も感染性の強い病原体の１つであり、そして呼吸経路を介して人から人に伝染する（Ｇｒｉｆｆｉｎら，“Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”中，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｊ．Ｌ．Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｔ．Ｐ． Ｍｏｎａｔｈ，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ，およびＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ監修，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１２６７−１３１２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９６）。麻疹ウイルスは、複雑な病因を有し、気道および多様な全身部位両方での複製を伴う（Ｇｒｉｆｆｉｎら，“Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”中，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｊ．Ｌ．Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ，およびＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ監修，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１２６７−１３１２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９６）。麻疹ウイルスは、本明細書において、生弱毒化ベクターワクチンが特に望ましい典型的な病原体として論じられる。以下にさらに詳細に論じる理由のため、組換えＨＰＩＶ２ベクター系に基づく麻疹ワクチンは、当該技術分野に長く感じられてきた必要性を満たし、そして他の病原体に対するワクチンを生成する、さらなる有効なベクター系に対する緊急の必要性もまた満たす。
［１７］粘膜ＩｇＡおよび血清ＩｇＧ麻疹ウイルス特異的抗体はどちらも、麻疹ウイルスの調節に関与する可能性があるが、母性獲得麻疹ウイルス特異的抗体を所持する非常に幼い乳児に、麻疹ウイルス疾患がないことから、血清抗体が、疾患耐性の主な仲介因子と同定される（Ｇｒｉｆｆｉｎら，“Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”中，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｊ．Ｌ．Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ，およびＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ監修，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１２６７−１３１２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。２つの麻疹ウイルス糖タンパク質、赤血球凝集素（ＨＡ）および融合（Ｆ）タンパク質が、主な中和抗原および防御抗原である（Ｇｒｉｆｆｉｎら，“Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”中，Ｂ．Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ， Ｊ．Ｌ．Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ，およびＳ．Ｅ． Ｓｔｒａｕｓ監修，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１２６７−１３１２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。
［１８］現在入手可能な生弱毒化麻疹ワクチンは、非経口経路によって投与される（Ｇｒｉｆｆｉｎら，“Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”中，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ，Ｊ．Ｌ．Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ，およびＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ監修，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１２６７−１３１２．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）。野生型麻疹ウイルスおよびワクチンウイルスはどちらも、抗体に非常に容易に中和され、そして麻疹ウイルスワクチンは、非常に低レベルの母性獲得麻疹ウイルス特異的中和抗体によっても、非感染性にされる（Ｈａｌｓｅｙら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３１３：５４４−９，１９８５；Ｏｓｔｅｒｈａｕｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１４７９−８１，１９９８）。したがって、ワクチンウイルスは、受動獲得母性抗体が検出不能なレベルに減少するまで投与されない。米国において、麻疹ウイルスワクチンは、ほぼすべての小児が麻疹ウイルスワクチンに容易に感染する、１２〜１５ヶ月まで投与されない。
［１９］マイナス鎖ＲＮＡウイルスワクチンの分野の最近の発展は、異種ＨＰＩＶを含む異種病原体の抗原決定基を搬送する際のＨＰＩＶ３に基づくワクチンベクターの使用を伴う。特に、ＨＰＩＶ３「ベクター」ゲノムまたはアンチゲノムを、異なるＨＰＩＶまたは非ＰＩＶ病原体の１以上の異種遺伝子と組み合わせて用いて、キメラ、二価または多価の、ＨＰＩＶ３に基づくワクチン候補を形成する、組換えＨＰＩＶ３ワクチン候補が開示されている（例えば、各々、本明細書に援用される、Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：１７６２−１７６８，１９９８；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７３：１３７４−１３８１，１９９９；Ｔａｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １９：３６２０−３６３１，２００１；Ｄｕｒｂｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：６８２１−６８３１，２０００；米国特許出願第０９／０８３，７９３号、１９９８年５月２２日出願；米国特許出願第０９／４５８，８１３号、１９９９年１２月１０日出願；米国特許出願第０９／４５９，０６２号、１９９９年１２月１０日出願；米国仮出願第６０／０４７，５７５号、１９９７年５月２３日出願（国際公報第ＷＯ ９８／５３０７８号に対応する）、米国仮出願第６０／０５９，３８５号、１９９７年９月１９日出願；米国仮出願第６０／１７０，１９５号、１９９９年１２月１０日出願；米国特許仮出願第０９／７３３，６９２号、２０００年１２月８日出願（国際公報第ＷＯ ０１／４２４４５Ａ２号に対応する）を参照されたい）。組換えキメラＨＰＩＶ３ウイルスが、異なるＰＩＶまたは異種病原体の１以上の抗原決定基をコードする１以上の異種ドナー配列、典型的には規定数外の（ｓｕｐｅｒｎｕｍｅｒａｒｙ）配列を取り込むように操作して、感染性、キメラ、二価または多価ウイルスあるいはサブウイルス（ｓｕｂｖｉｒａｌ）粒子を産生する。この方式で、ＨＰＩＶ３に基づくキメラワクチンウイルス候補を作成して、感染しやすい哺乳動物宿主において、１以上のＰＩＶに対する免疫応答、または選択するＰＩＶおよび非ＰＩＶ病原体に対する多特異性応答を誘発することも可能である。キメラＨＰＩＶ３ワクチン候補に対する多様な修飾が、弱毒化などの望ましい表現型効果を生じることが報告された。組換えおよびキメラ組換えＨＰＩＶ１ワクチン候補に関して、比較する開示が提供されている（本明細書に援用される、米国仮出願第６０／３３１，９６１号、２００１年１１月２１日出願）。
［２０］ＨＰＩＶ、並びにＲＳＶおよび麻疹ウイルスを含む他の病原体に対する有効な免疫原性組成物の開発に向かって、多くの進歩があったが、当該技術分野において、特に幼い乳児の間で、これらの病原体に起因する深刻な健康上の問題を軽減する、安全でそして有効な免疫原性組成物を操作するさらなるツールおよび方法に対する明らかな必要性が依然としてある。この背景において、依然としてある課題の中には、適切に弱毒化され、免疫原性で、そして１以上の病原体に対する広い臨床的セッティングにおいて使用するための遺伝的候補を生成する、さらなるツールに対する必要性がある。さらなる課題は、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、およびＨＰＩＶ３が、有意な交差免疫を誘発しない別個のウイルス血清型に相当するという事実から生じる。したがって、当該技術分野において、多数のＨＰＩＶ血清型に対して免疫するのに有効な免疫原性組成物に対する緊急の必要性がある。これらの目的を達成するため、弱毒化突然変異を同定し、そして組換え株に取り込むため、そしてベクターに基づく免疫原性組成物および方法を開発するため、現存する方法を拡大しなければならない。この背景において、ＨＰＩＶ２を回収しそして遺伝子操作する方法を開発して、この重要なヒトＰＩＶに対する免疫原性組成物を生成し、そして新規ベクターおよび免疫法を生成するさらなるツールを提供することが特に望ましい。驚くべきことに、本発明は、これらの必要性を満たし、そして以下に記載するように、さらなる目的および利点を実現させる。
発明の概要
［２１］本発明は、感染性組換えヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）を回収する方法および組成物を提供する。本発明はまた、免疫原性組成物および方法で使用するための感染性ＨＰＩＶ２候補に、定義され、あらかじめ決定された構造変化および表現型変化を導入する新規ツールおよび方法も提供する。
［２２］本発明の１つの態様において、感染性自己複製組換えヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）をコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子から、前記ＨＰＩＶ２を産生する方法を提供する。該方法は、一般的に、細胞または細胞不含系において、感染性ＨＰＩＶ２粒子が産生されるように、部分的または完全組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子、並びにＰＩＶ Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を含んでなる１以上の発現ベクターを同時発現させることを含む。
［２３］典型的には、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子は、ｃＤＮＡである。したがって、本発明は、より詳細な側面において、本明細書に開示するような組換えＨＰＩＶ２をコードする新規ポリヌクレオチドおよびその同等物に関する。同様に、本発明は、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子を取り込む、発現ベクターおよび構築物を含む。
［２４］ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノム、並びにＮタンパク質、Ｐタンパク質、およびＬタンパク質はすべて、単一の発現ベクターから産生されることも可能である。より典型的には、ゲノムまたはアンチゲノムは、別個の発現ベクターによって産生され、そしてＮタンパク質、Ｐタンパク質、およびＬタンパク質は、１、２、または３つのさらなる発現ベクターによって産生される。特定の態様において、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質の１以上は、本発明の組換えＨＰＩＶゲノムまたはアンチゲノムの発現によって、あるいは同一または異なるＰＩＶとの同時感染によって供給される。別の態様において、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質の１以上は、異種ＰＩＶ（例えばＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３）由来である。
［２５］本発明は、前述の方法にしたがって産生される、感染性組換え自己複製ウイルス粒子をさらに含み、この粒子には、完全ウイルスとともに、ウイルスタンパク質の１以上の非必須タンパク質または１以上の非必須部分（例えば細胞質ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞外ドメイン）を欠くウイルスが含まれる。１以上のこうした非必須構成要素（例えばＰＩＶ Ｖオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）あるいは遺伝子間ゲノム構成要素、あるいは非コードゲノム構成要素または非必須ゲノム構成要素）は、本明細書において、不完全ウイルスまたは「サブウイルス粒子」と称される。典型的なサブウイルス粒子は、完全なウイルス（すなわち完全ゲノムまたはアンチゲノム、ヌクレオカプシドおよびエンベロープを含む、組み立てられたビリオン）に存在する、選択される構造要素、例えば遺伝子、遺伝子セグメント、タンパク質、タンパク質機能ドメインなどのいずれを欠くことも可能である。例えば、本発明のサブウイルス粒子は、ゲノムまたはアンチゲノムを含有する感染性ヌクレオカプシド、並びにＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子産物を含んでなることも可能である。他のサブウイルス粒子は、他の非必須構造要素の中の、非必須遺伝子および／または産物の部分的または完全欠失または置換によって産生される。
［２６］本発明の方法にしたがって産生される、完全ウイルスおよびサブウイルス粒子は、典型的には、ＰＩＶに感染しやすい哺乳動物宿主における多数の複製周期を通じて、感染性で、そして自己複製性であり、こうした宿主には、多様なｉｎ ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞集団、当該技術分野に広く知られ、そしてヒトにおけるＰＩＶ活性を合理的に予測すると認められる、ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデル（マウス、ハムスター、コットンラット（ｃｏｔｔｏｎ ｒａｔ）、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ ｇｒｅｅｎ ｍｏｎｋｅｙ）およびチンパンジー（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ）を含む非ヒト霊長類）、並びに血清陰性および血清陽性乳児、小児、若年者、および成人を含むヒトが含まれる。しかし、ｉｎ ｖｉｖｏでの複製が非常に不全であるウイルスおよびサブウイルス粒子もまた、指定可能である。
［２７］本発明の特定の詳細な側面において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子は、野生型ＨＰＩＶ２の配列をコードする。あるいは、ゲノムまたはアンチゲノムは、生物学的に得られる突然変異体ＨＰＩＶ２由来の１以上の突然変異、または組換えによって導入される突然変異（単数または複数）の組み合わせいずれかを所持することも可能であり；これらには、組換えウイルスにおいて、望ましい表現型効果（単数または複数）を生じるように選択された、１以上のポリヌクレオチド挿入、欠失、置換、または再編成が含まれる。
［２８］したがって、本発明の方法にしたがって、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを操作して、取り扱い目的もしくはマーク付け目的のため、組換えによって導入される制限部位マーカー、または翻訳の際にサイレントである点突然変異を取り込ませることも可能である。他の態様において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子は、組換えによって導入される１以上の弱毒化突然変異を取り込むことも可能である。典型的な態様において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、組換えによって導入される、温度感受性（ｔｓ）または宿主範囲（ｈｒ）弱毒化（ａｔｔ）突然変異を１以上取り込む。
［２９］しばしば、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、異種突然変異体ＨＰＩＶ株（ＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３など）に、あるいは別の突然変異体非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばＲＳＶまたはネズミＰＩＶ１（ＭＰＩＶ１）に同定される弱毒化突然変異を１以上取り込むであろう。例えば、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを、ＨＰＩＶ２、または異種ＰＩＶ、例えば周知の候補ＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５に同定される突然変異（単数または複数）に対応する突然変異を１以上取り込むように修飾するかまたは構築することも可能である。ＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５または別の突然変異体ウイルスの有用な突然変異は、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｆ、またはＨＮから選択されるＨＰＩＶ２タンパク質、あるいは３’リーダーまたはＮ遺伝子開始配列から選択されるＨＰＩＶ２遺伝子外配列における変化を特定しうる。突然変異が特定のアミノ酸残基に関連する場合、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、しばしば、突然変異を特定するコドンにおいて、多数のヌクレオチド変化を取り込んで、復帰突然変異に対して、修飾を安定化するであろう。
［３０］本発明のさらなる側面において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、増殖特性、弱毒化、温度感受性、低温適応、プラークサイズ、宿主範囲制限の変化、または免疫原性の変化から選択される表現型変化を特定する、さらなるヌクレオチド修飾を含んでなる。これらのさらなる修飾は、ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノム内のＨＰＩＶ２ Ｎ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよび／またはＬ遺伝子、並びに／あるいは３’リーダー、５’トレーラー、遺伝子開始（ＧＳ）配列もしくは遺伝子終止（ＧＥ）配列などのシス作用配列、および／または遺伝子間領域の１以上を改変することも可能である。例えば、１以上のＨＰＩＶ２遺伝子が全体としてまたは部分的に欠失されるか、あるいはＲＮＡ編集部位における突然変異によって、フレームシフト突然変異によって、翻訳開始部位を改変する突然変異によって、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に１以上の停止コドンを導入することによって、または転写シグナルにおける突然変異によって、該遺伝子の発現が減少するかまたは除去されることも可能である。特定の態様において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、ＨＰＩＶ２ Ｖ遺伝子の部分的欠失または完全欠失によって、あるいは１以上のＨＰＩＶ２遺伝子の発現を減少させるかまたは除去するが、なお生存可能な複製適格感染性ウイルスを生じる、１以上のヌクレオチド変化によって修飾される。他の態様において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、サイトカイン、Ｔヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、または哺乳動物宿主において免疫応答を誘発可能な微生物病原体のタンパク質から選択される非ＨＰＩＶ分子をコードするように修飾される。
［３１］本発明のさらなる側面において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、部分的または完全ＨＰＩＶ２「ベクター」ゲノムまたはアンチゲノムを含んでなり、前記ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、１以上の異種病原体の１以上の抗原決定基をコードする１以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わされて、キメラＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを形成する。抗原決定基（単数または複数）をコードする該異種遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）が、部分的または完全ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムの非コード領域に隣接するかまたは該領域内にある、規定数外の遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）として付加されるか、あるいは部分的ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムにおける１以上の対応する遺伝子またはゲノムセグメントを置換することも可能である。該異種遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）に、１以上の異種コード配列、並びに／あるいは遺伝子外３’リーダーまたは５’トレーラー領域、遺伝子開始シグナル、遺伝子終止シグナル、編集領域、遺伝子間領域、あるいは３’または５’非コード領域を含んでなる１以上の異種制御要素が含まれることも可能である。
［３２］より詳細な態様において、異種病原体は１以上の異種ＰＩＶ（例えばＨＰＩＶ１および／またはＨＰＩＶ３）であり、そして異種遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）は、１以上のＰＩＶ Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよび／またはＬタンパク質（単数または複数）あるいはその断片（単数または複数）をコードする。したがって、抗原決定基（単数または複数）は、ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ３のＨＮおよびＦ糖タンパク質、並びにその抗原性ドメイン、断片、およびエピトープから選択されることが可能であり、これらを、部分的または完全ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノム内で、付加するかまたは置換する。特定の典型的な態様において、ＨＰＩＶ３またはＨＰＩＶ１のＨＮおよびＦ糖タンパク質をコードする遺伝子を、部分的ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムにおいて、対応物ＨＰＩＶ２ ＨＮおよびＦ遺伝子と置換する。より詳細な態様において、ＨＰＩＶ１の１以上の抗原決定基をコードする１以上の遺伝子またはゲノムセグメント、並びにＨＰＩＶ３の１以上の抗原決定基をコードする１以上の遺伝子またはゲノムセグメントを取り込んで、哺乳動物宿主において、ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ３に対する免疫応答を誘発可能なキメラＨＰＩＶ２を生じるように、部分的または完全ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを修飾する。この方式で、多数の異種ＰＩＶの抗原決定基をコードする複数の異種遺伝子またはゲノムセグメントを、部分的または完全ＨＰＩＶベクターゲノムまたはアンチゲノム内に付加するかまたは取り込むことも可能である。
［３３］本発明の関連する態様において、ベクターゲノムが、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス亜群Ａおよび亜群Ｂ、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、１型および２型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、およびインフルエンザウイルスから選択される異種病原体の１以上の異種抗原決定基と組み合わされている、キメラＨＰＩＶ２ウイルスを提供する。典型的な側面において、異種抗原決定基は、麻疹ウイルスＨＡおよびＦタンパク質、呼吸器合胞体ウイルス亜群Ａおよび亜群ＢのＦ、Ｇ、ＳＨおよびＭ２タンパク質、流行性耳下腺炎ウイルスＨＮおよびＦタンパク質、ヒト・パピローマウイルスＬ１タンパク質、１型または２型ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０タンパク質、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ、およびｇＭタンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、エプスタイン・バーウイルスｇｐ３５０タンパク質、フィロウイルスＧタンパク質、ブンヤウイルスＧタンパク質、フラビウイルス、プレＭ、Ｅ、およびＮＳ１タンパク質、ヒト・メタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）ＧおよびＦタンパク質、並びにアルファウイルスＥタンパク質、並びにその抗原性ドメイン、断片およびエピトープから選択される。ある特定の態様において、異種病原体は麻疹ウイルスであり、そして異種抗原決定基（単数または複数）は麻疹ウイルスＨＡおよびＦタンパク質、並びにその抗原性ドメイン、断片およびエピトープから選択される。例えば、麻疹ウイルスＨＡ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでなる転写単位をＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノム内で付加するかまたは取り込ませて、麻疹および／またはＨＰＩＶ２または別のＨＰＩＶに対して免疫するのに有用なキメラ候補を生じることも可能である。
［３４］さらなる態様において、部分的または完全ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、１以上の規定数外の異種遺伝子またはゲノムセグメントを取り込んで、キメラＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを形成するように修飾される。典型的には、規定数外の遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）は、１以上の異種抗原決定基をコードするが、本発明の組換えキメラＨＰＩＶ２内で、非コード挿入物もまた有用である。典型的な態様において、１以上の規定数外の異種遺伝子またはゲノムセグメントが、ＨＰＩＶ１ ＨＮ、ＨＰＩＶ２ Ｆ、ＨＰＩＶ３ ＨＮ、ＨＰＩＶ３ Ｆ、麻疹ウイルスＨＡおよびＦ、ＨＰＭＶ ＧおよびＦタンパク質、および／または亜群ＡまたはＢのＲＳＶのＧおよびＦタンパク質から選択されることも可能である。これらのおよび他の規定数外の異種遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）を、組換えゲノムまたはアンチゲノム内の多様な部位、例えばＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムのＮより３’の位、Ｎ／Ｐ、Ｐ／Ｍ、および／またはＨＮ／Ｌ遺伝子の間、または別の遺伝子間接合部または非コード領域で挿入することも可能である。
［３５］さらなる詳細な態様において、キメラＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、１、２、３または４の病原体由来の抗原をコードするよう操作されている。例えば、ゲノムまたはアンチゲノムは、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、１型または２型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、またはインフルエンザウイルスから選択される、１、２、３、４、またはそれより多い異なる病原体由来の抗原決定基をコードすることも可能である。
［３６］遺伝子またはゲノムセグメントが、本発明の組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノム内で付加されるかまたは置換する場合、部分的または完全ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノム内の対応物遺伝子またはゲノムセグメントの野生型遺伝子順序位に対応する位で付加されるかまたは置換することも可能であり、これはしばしば、キメラＨＰＩＶ２が、部分的または完全ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムへの異種遺伝子またはゲノムセグメントの付加または置換によって生成されている場合、当てはまる。あるいは、付加されたまたは置換した（例えば異種）遺伝子またはゲノムセグメントは、部分的または完全ＨＰＩＶ２バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム内の対応物遺伝子またはゲノムセグメントの野生型遺伝子順序位に比較して、よりプロモーター近位またはよりプロモーター遠位である位に位置することも可能である。
［３７］本発明のさらなる側面において、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムが、異種ＰＩＶまたは非ＰＩＶ病原体の異種抗原性ドメイン、断片、またはエピトープを１以上取り込むキメラ糖タンパク質をコードして、キメラゲノムまたはアンチゲノムを形成するよう修飾されている、キメラＨＰＩＶ２候補を提供する。特定の態様において、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、抗原性が別個である第二のＰＩＶ由来の異種抗原性ドメイン、断片、またはエピトープを１以上取り込むキメラ糖タンパク質をコードして、キメラゲノムまたはアンチゲノムを形成するよう修飾される。さらなる態様には、ゲノムまたはアンチゲノムが、２以上のＨＰＩＶ由来の抗原性ドメイン、断片、またはエピトープを有するキメラ糖タンパク質をコードする、キメラＨＰＩＶ２が含まれる。１つの例において、異種ゲノムセグメントは、糖タンパク質細胞質ドメイン、膜貫通ドメインまたは外部ドメインをコードし、これが、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムにおける対応する糖タンパク質ドメインを置換する。より具体的な態様において、１以上の抗原性ドメイン、断片、またはエピトープをコードする、抗原性が別個である第二のＨＰＩＶの１以上の異種ゲノムセグメントが、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノム内を置換して、前記キメラ糖タンパク質をコードする。例えば、１以上の異種ゲノムセグメントは、ＨＰＩＶ１および／またはＨＰＩＶ３ ＨＮおよび／またはＦ糖タンパク質の外部ドメインから選択されることも可能である。
［３８］本発明のキメラＨＰＩＶ２候補は、典型的には、非キメラＨＰＩＶ２組換え体に関して上述のように修飾され、例えば異種突然変異体ＰＩＶまたは他の突然変異体非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスで同定される、１以上の弱毒化突然変異の導入によって修飾されるであろう。したがって、ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノム、あるいはキメラＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムが、ＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５に同定されるような、１以上の点突然変異、例えば１以上の非コードヌクレオチドにおける点突然変異、またはアミノ酸置換、欠失または挿入を特定する点突然変異を取り込むように修飾することも可能である。
［３９］より詳細な態様において、キメラまたは非キメラＨＰＩＶ２のゲノムまたはアンチゲノムが、Ｌタンパク質中のＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５のＴｙｒ９４２、Ｌｅｕ９９２、およびＴｈｒ１５５８に対応する位で先に同定されたアミノ酸置換（単数または複数）を特定する突然変異から選択される１つまたはいずれかの組み合わせの突然変異を取り込むように修飾される。これらの典型的な突然変異の取り込みのための野生型（ｗｔ）ＨＰＩＶ２ Ｌの対応する標的は、Ｔｙｒ９４８、Ａｌａ９９８、およびＬｅｕ１５６６である。他の態様において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、異種突然変異体非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）で同定される、弱毒化突然変異のアミノ酸位に対応するアミノ酸位で、弱毒化突然変異を取り込むように修飾される。
［４０］さらなる詳細な態様において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは以下：増殖特性、弱毒化、温度感受性、低温適応、プラークサイズ、宿主範囲制限、または免疫原性の変化から選択される表現型変化を特定するさらなるヌクレオチド修飾を取り込むようにさらに修飾される。こうしたさらなるヌクレオチド修飾は、限定されるわけではないが、ＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、および／またはＬ ＯＲＦを含む１以上のＯＲＦ、並びに／あるいは３’リーダー、５’トレーラー、および／または遺伝子間領域の１以上を改変することも可能である。典型的な態様において、キメラＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、１以上のＨＰＩＶ２遺伝子が全体としてまたは部分的に欠失されるように、あるいはＲＮＡ編集部位における突然変異によって、フレームシフト突然変異によって、翻訳開始部位を改変する突然変異によって、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に１以上の停止コドンを導入することによって、または転写シグナルにおける突然変異によって、該遺伝子の発現が減少するか、除去されるか、または増加されるようにさらに修飾される。しばしば、キメラＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、ＰＩＶ Ｖ ＯＲＦまたは別の非必須遺伝子またはゲノムセグメントの部分的または完全欠失、あるいは１以上のＰＩＶ遺伝子の発現を減少させるか、除去するかまたは増加させる、１以上のヌクレオチド変化を取り込むように操作されるであろう。他の側面において、キメラＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、サイトカイン、Ｔヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、または哺乳動物宿主において免疫応答を誘発可能な微生物病原体のタンパク質から選択される非ＰＩＶ分子をコードするように修飾される。
［４１］本発明のさらに他の側面において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを、組換えによって修飾して、非ヒト（例えばウシまたはＳＶ５）ＰＩＶ由来の異種遺伝子またはゲノムセグメントを１以上取り込むキメラＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを形成して、新規表現型特性、例えば遺伝的安定性増加、あるいは弱毒化、反応性または培養中の増殖の改変を有する、ヒト−非ヒトキメラ候補を生じる。こうした組換え体は、部分的または完全ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムを、非ヒトＰＩＶ由来の１以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせて構築することによって産生可能である。例えば、部分的または完全ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムを、ＢＰＩＶ３のＮ、Ｐ、Ｌ、ＶまたはＭ遺伝子の１以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせて、ヒト−ウシ・キメラゲノムまたはアンチゲノムを形成し、そして宿主範囲（ｈｒ）弱毒化表現型を有する新規候補を産生することも可能である。より詳細な態様において、ウシ３型ＰＩＶ（ＢＰＩＶ３）Ｎ、Ｍ、Ｌ、ＶまたはＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）あるいはそのゲノムセグメントを、対応物ＨＰＩＶ２ Ｎ、Ｍ、Ｌ、ＶまたはＰ ＯＲＦあるいはゲノムセグメントと置換して、キメラＨＰＩＶ２−ＢＰＩＶゲノムまたはアンチゲノムを形成する。あるいは、異種遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）を提供してキメラウイルスを形成するＰＩＶは、ネズミ・パラインフルエンザウイルス（ＭＰＩＶ）、サル・ウイルス５（ＳＶ５）、ＳＶ４１、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、または他の動物ＰＩＶであることも可能である。
［４２］本発明のさらなる側面において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、ゲノムまたはアンチゲノムの非コード領域（ＮＣＲ）において、または別個の遺伝子単位（ＧＵ）として、長さ１５０ヌクレオチド（ｎｔ）〜４，０００ヌクレオチドの間のポリヌクレオチド挿入を取り込む。ＮＣＲおよびＧＵ挿入物を含んでなる組換えＨＰＩＶ２候補は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に複製し、そして典型的にはｉｎ ｖｉｖｏで弱毒化表現型を示す。ポリヌクレオチド挿入は、典型的には、完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を欠き、そしてしばしば、組換えＨＰＩＶ２において、弱毒化表現型を特定するであろう。ポリヌクレオチド挿入物を逆行非センス方向でＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムに導入して、そのため、挿入物がタンパク質をコードしないことも可能である。より具体的な態様において、ポリヌクレオチド挿入物は、およそ２，０００ｎｔ、３，０００ｎｔまたはそれより長い。他の態様において、ポリヌクレオチド挿入は、およそ１５，６００ｎｔ（例えば１５，６５４ｎｔ）の野生型ＨＰＩＶ２ゲノム長に比較して、３０％〜５０％以上の全長の外来配列を組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムに付加する。より詳細な側面において、ポリヌクレオチド挿入は、上気道および／または下気道における複製の、少なくとも１０〜１００倍の減少を示す、組換えＨＰＩＶ２の弱毒化表現型を特定する。
［４３］本発明の他の態様において、上述のような組換えＨＰＩＶ２またはキメラＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードするか、あるいは該ゲノムまたはアンチゲノムに対応するポリヌクレオチド分子を提供する。さらなる態様において、上述のような組換えＨＰＩＶ２またはキメラＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードし、そして適切な宿主細胞または細胞不含発現系において、ベクターの発現を導く発現制御配列（例えばプロモーターおよびターミネーター配列）に機能可能であるように連結されたポリヌクレオチドを含んでなる、ポリヌクレオチド発現ベクターまたは構築物を提供する。さらなる態様において、上述のような組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド分子を含んでなり、そしてＰＩＶのＮ、Ｐ、およびＬタンパク質をコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子を場合によって含む発現ベクターを取り込む、細胞または細胞不含発現系（例えば細胞不含溶解物）を提供する。１以上のＮ、Ｐ、およびＬタンパク質は、ＨＰＩＶ２または異種ＰＩＶから発現可能である。発現に際して、ゲノムまたはアンチゲノム、並びにＮ、Ｐ、およびＬタンパク質を組み合わせて、ウイルス粒子またはサブウイルス粒子などの感染性ＨＰＩＶ粒子を産生する。ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド分子、並びにＰＩＶのＮ、Ｐ、およびＬタンパク質をコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子は、単一のベクターによって発現されることも可能である。あるいは、ゲノム、並びに１以上のＮ、Ｐ、およびＬタンパク質は、２以上の別個のベクターに取り込まれることも可能である。
［４４］本発明の組換えＨＰＩＶ２ウイルスは、感染しやすい宿主において、多様な組成物中で、１以上のＰＩＶに対して、またはＰＩＶおよび１以上の非ＰＩＶ病原体に対して、望ましい免疫応答を生成するのに有用である。本明細書に開示するような組換えＨＰＩＶ２は、感染哺乳動物宿主において、単一または多特異性免疫応答を誘発可能であるが、なお、免疫宿主において許容し得ない疾患症状を引き起こさないように、十分に弱毒化されている。サブウイルス粒子を含む弱毒化ウイルスは、細胞培養上清に存在するか、培養物から単離されるか、あるいは部分的にまたは完全に精製されていることも可能である。ウイルスは凍結乾燥されることも可能であり、そして貯蔵または宿主への搬送のため、望ましいように、多様な他の構成要素と組み合わせることも可能である。
［４５］本発明は、生理学的に許容しうるキャリアーおよび／またはアジュバント、並びに上述のような単離弱毒化組換えＨＰＩＶ２ウイルスを含んでなる新規免疫原性組成物をさらに提供する。好ましい態様において、免疫原性組成物は、弱毒化および免疫原性の適切なバランス、並びに場合によってさらなる表現型特性を特定する、弱毒化突然変異または他のヌクレオチド修飾を、少なくとも１つ、そして好ましくは２以上有する組換えＨＰＩＶ２で構成される。免疫原性組成物は、弱毒化ウイルス１０３〜１０７ＰＦＵの用量で配合可能である。免疫原性組成物は、単一のＰＩＶ株に対して、あるいは多数のＰＩＶ株もしくは血清型またはＲＳＶおよび／またはＨＭＰＶなどの他の病原体に対して免疫応答を誘発する弱毒化組換えＨＰＩＶ２を含んでなることも可能である。これに関連して、組換えＨＰＩＶ２を、配合物中で、他のＰＩＶ株と、または生弱毒化ＲＳＶなどの他の候補ウイルスと組み合わせることも可能である。
［４６］関連する側面において、本発明は、哺乳動物被験者において、個体の免疫系を刺激して、１以上のＰＩＶに対して、またはＰＩＶおよび非ＰＩＶ病原体に対して、免疫応答を誘発する方法を提供する。該方法は、生理学的に許容しうるキャリアーおよび／またはアジュバント中の免疫学的に十分な量の組換えＨＰＩＶ２の配合物を投与することを含んでなる。１つの態様において、免疫原性組成物は、上述のような望ましい表現型および／または弱毒化レベルを特定する弱毒化突然変異または他のヌクレオチド修飾を、少なくとも１つ、そして好ましくは２以上有する組換えＨＰＩＶ２で構成される。免疫原性組成物は、弱毒化ウイルス１０３〜１０７ＰＦＵの用量で配合可能である。免疫原性組成物は、単一のＰＩＶに対して、多数のＰＩＶ、例えばＨＰＩＶ２およびＨＰＩＶ３、あるいは１以上のＰＩＶおよび麻疹またはＲＳＶなどの非ＰＩＶ病原体に対して免疫応答を誘発する組換えＨＰＩＶ２を含んでなることも可能である。
［４７］この背景において、本発明の組換えＨＰＩＶ２ウイルスは、単一特異性免疫応答、あるいは多数のＰＩＶに対して、または１以上のＰＩＶおよび非ＰＩＶ病原体に対して、多特異性免疫応答を誘発可能である。あるいは、１つのＰＩＶに対して、多数のＰＩＶに対して、または１以上のＰＩＶおよび麻疹もしくはＲＶＳなどの非ＰＩＶ病原体に対して、より有効な免疫応答を誘発する協調処置プロトコルにおいて、異なる免疫原性特性を有する組換えＨＰＩＶ２を、混合物中で組み合わせるか、または別個に投与することも可能である。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、例えばスプレー、小滴またはエアロゾルによって上気道に投与される。
［４８］本発明の他の側面において、新規組換えＨＰＩＶ１ウイルス、並びに関連組成物および方法もまた提供する。これらのＨＰＩＶ１組換えウイルスは、本明細書に記載するＨＰＩＶ２組成物および方法と組み合わせて有用であり、そして免疫原性組成物および方法内で使用するため、組換えＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２に取り込む、さらなる典型的な突然変異、および他の修飾を提供する。ＨＰＩＶ２の場合、本発明のこれらの態様は、ウイルスをコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子からの感染性自己複製組換えヒト１型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ１）の産生に基づく。これらの態様の基本的側面は、例えば、Ｍｕｒｐｈｙらによって２００２年１１月２１日に出願された米国出願第１０／３０２，５４７号、および２００３年５月３０日に公表された、対応するＰＣＴ公報第ＷＯ ０３／０４３３５８７ Ａ２号に記載される（各々、本明細書に援用される）。
［４９］特定の態様において、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子は、生物学的に得られる突然変異体ＨＰＩＶ１由来の１以上の突然変異、または組換えによって導入される突然変異（単数または複数）のいずれかの組み合わせを所持し；これらには、組換えウイルスの望ましい表現型効果を生じるように選択される１以上のポリヌクレオチド挿入、欠失、置換、または再編成が含まれる。典型的な態様において、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、組換えによって導入される温度感受性（ｔｓ）または宿主範囲（ｈｒ）弱毒化（ａｔｔ）突然変異を１以上取り込む。しばしば、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、生物学的に得られる突然変異体ＰＩＶ株、あるいは別の突然変異体非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばＲＳＶまたはネズミＰＩＶ（ＭＰＩＶ）に同定される弱毒化突然変異を１以上取り込むであろう。例えば、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムを、ＨＰＩＶ１、または周知の免疫原性組成物候補ＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５などの異種ＰＩＶに同定される突然変異（単数または複数）に対応する突然変異を１以上取り込むように、修飾するかまたは構築することも可能である。ＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５または別の突然変異体ウイルスの有用な突然変異は、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｃ、Ｆ、またはＨＮから選択されるＨＰＩＶ１タンパク質における変化、あるいは３’リーダーまたはＮ遺伝子開始配列から選択されるＨＰＩＶ１遺伝子外配列における変化を特定することも可能である。突然変異が、特定のアミノ酸残基に関連する場合、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、しばしば、突然変異を特定するコドンに多数のヌクレオチド変化を取り込んで、復帰突然変異に対する修飾を安定化するであろう。
［５０］本発明のさらなる側面において、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、増殖特性、弱毒化、温度感受性、低温適応、プラークサイズ、宿主範囲制限の変化、または免疫原性の変化から選択される表現型変化を特定する、さらなるヌクレオチド修飾を含んでなる。これらのさらなる修飾は、ＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノム内のＨＰＩＶ１ Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｃ’、Ｙ１、Ｙ２、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよび／またはＬ遺伝子、並びに／あるいは３’リーダー、５’トレーラー、遺伝子開始（ＧＳ）配列または遺伝子終止（ＧＥ）配列などのシス作用配列、および／または遺伝子間領域の１以上を改変することも可能である。例えば、１以上のＨＰＩＶ１遺伝子を全体でまたは部分的に欠失させることも可能であるし、あるいはＲＮＡ編集部位における突然変異によって、フレームシフト突然変異によって、翻訳開始部位を改変する突然変異によって、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に１以上の停止コドンを導入することによって、または転写シグナルにおける突然変異によって、該遺伝子の発現が減少するかまたは除去されることも可能である。特定の態様において、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、１以上のＣ、Ｃ’、Ｙ１、および／またはＹ２ ＯＲＦまたは他の補助遺伝子の部分的または完全欠失によって、あるいは１以上のＣ、Ｃ’、Ｙ１、および／またはＹ２ ＯＲＦまたは他の補助遺伝子の発現を減少させるかまたは除去する１以上のヌクレオチド変化によって、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムを修飾する。他の態様において、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、サイトカイン、Ｔヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、または哺乳動物宿主において免疫応答を誘発可能な微生物病原体のタンパク質から選択される非ＰＩＶ分子をコードするように修飾される。
［５１］本発明のさらなる側面において、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、部分的または完全ＨＰＩＶ１「ベクター」ゲノムまたはアンチゲノムを含んでなり、前記ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、１以上の異種病原体の１以上の抗原決定基をコードする１以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わされて、キメラＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムを形成する。抗原決定基（単数または複数）をコードする異種遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）が、部分的または完全ＨＰＩＶ１ベクターゲノムまたはアンチゲノムの非コード領域に隣接するかまたは該領域内にある、規定数外の遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）として付加されるか、あるいは部分的ＨＰＩＶ１ベクターゲノムまたはアンチゲノムにおける１以上の対応物遺伝子またはゲノムセグメントを置換することも可能である。異種遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）には、１以上の異種コード配列、並びに／あるいは遺伝子外３’リーダーまたは５’トレーラー領域、遺伝子開始シグナル、遺伝子終止シグナル、編集領域、遺伝子間領域、あるいは３’または５’非コード領域を含んでなる１以上の異種制御要素が含まれることも可能である。
［５２］本発明の関連する態様において、ベクターゲノムが、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス亜群Ａおよび亜群Ｂ、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、１型および２型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、およびインフルエンザウイルスから選択される異種病原体の１以上の異種抗原決定基と組み合わされている、キメラＨＰＩＶ１ウイルスを提供する。典型的な側面において、異種抗原決定基は、麻疹ウイルスＨＡおよびＦタンパク質、呼吸器合胞体ウイルス亜群Ａおよび亜群ＢのＦ、Ｇ、ＳＨおよびＭ２タンパク質、流行性耳下腺炎ウイルスＨＮおよびＦタンパク質、ヒト・パピローマウイルスＬ１タンパク質、１型または２型ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０タンパク質、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ、およびｇＭタンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、エプスタイン・バーウイルスｇｐ３５０タンパク質、フィロウイルスＧタンパク質、ブンヤウイルスＧタンパク質、フラビウイルス、プレＭ、Ｅ、およびＮＳ１タンパク質、ヒト・メタニューモウイルスＧおよびＦタンパク質、並びにアルファウイルスＥタンパク質、並びにその抗原性ドメイン、断片およびエピトープから選択される。
［５３］さらなる免疫原性組成物および方法の発展のため、本発明のｒＨＰＩＶ１ウイルス内で有用な修飾を、本明細書に記載するように、ｒＨＰＩＶ２ウイルスに同様に取り込むことも可能であり、そして同様に、本発明のｒＨＰＩＶ２ウイルス内で有用な修飾を、ｒＨＰＩＶ１に取り込むことも可能である。
具体的な態様の説明
［６８］本発明は、新規ヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）候補を産生し、そして使用するための方法および組成物を提供する。本発明の組換えＨＰＩＶ２ウイルスは、ヒトおよび他の哺乳動物において、感染性でそして免疫原性であり、そして１以上のＰＩＶに対して、例えば１以上のヒトＰＩＶ（ＨＰＩＶ）に対して、免疫応答を生成するのに有用である。さらなる態様において、選択されたＰＩＶおよび１以上のさらなる病原体に対して、例えば多数のＨＰＩＶに対して、あるいはＨＰＩＶ、および呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト・メタニューモウイルス、または麻疹ウイルスなどの非ＰＩＶウイルスに対して、免疫応答を誘発する、キメラＨＰＩＶ２ウイルスを提供する。誘発される免疫応答は、体液性応答および／または細胞仲介応答のいずれかまたは両方を伴うことも可能である。好ましくは、本発明の組換えＨＰＩＶ２ウイルスは弱毒化されて、弱毒化および免疫原性の望ましいバランスを生じる。したがって、本発明は、ＨＰＩＶ２および他の病原体に対して、望ましい免疫応答を誘発する剤として有用な、弱毒化ＨＰＩＶ２ウイルスを設計し、そして産生する新規方法を提供する。本発明の重要な特徴は、定義されるゲノム配列および予測可能な特性を有する組換えＰＩＶを、高頻度で産生することである。
［６９］本発明の典型的な組換えＨＰＩＶ２ウイルスは、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムとともに、ＰＩＶ主要ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオカプシド・リンタンパク質（Ｐ）、および巨大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）を取り込む。Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質は、ＨＰＩＶ２タンパク質であることも可能であるし、あるいはＮ、Ｐ、およびＬタンパク質の１以上が、異なるＨＰＩＶ、例えばＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３のものであることも可能である。さらなるＰＩＶタンパク質が、多様な組み合わせで含まれて、１以上の非必須ウイルス構成要素を欠くサブウイルス粒子およびすべての天然ウイルス構成要素を有する完全ウイルスとともに、規定数外のタンパク質、抗原決定基または他のさらなる構成要素を含有するウイルスを含む、本明細書に定義される、ある範囲の感染性ウイルスを提供することも可能である。
［７０］以下の実施例に示すように、本明細書において、元来は感染した１歳の乳児から単離された臨床的単離体である、ヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）株Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ／１９９４（Ｖ９４）のゲノムＲＮＡに関して、完全コンセンサス配列を決定した。こうして同定した配列を用いて、全長アンチゲノムｃＤＮＡを生成し、そして組換え野生型ＨＰＩＶ２（ｒＨＰＩＶ２）を回収した。
［７１］ｒＨＰＩＶ２のｉｎ ｖｉｔｒｏの複製およびハムスター気道での複製は、生物学的に得られる親ウイルスのものと類似であった。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのｒＨＰＩＶ２の生物学的特性は、ｒＨＰＩＶ２配列が野生型ウイルスに対応することを示す。このことは、組換えＨＰＩＶ２配列が、真正の野生型ウイルスのものであることを立証するため、非常に重要な知見である。したがって、このｒＨＰＩＶ２は、生弱毒化ＨＰＩＶ２および他のＰＩＶ候補を生成するため、弱毒化突然変異を組換えによって導入する新規基質として働く。
［７２］ウイルスのパラミクソウイルス科のパラミクソウイルス亜科には、ヒト１型、２型、３型、４Ａ型および４Ｂ型パラインフルエンザウイルス（それぞれ、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＨＰＩＶ４Ａ、およびＨＰＩＶ４Ｂ）が含まれる。ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、ＭＰＩＶ１、およびウシＰＩＶ３（ＢＰＩＶ３）は、ともに、レスピロウイルス属に分類され、一方、ＨＰＩＶ２およびＨＰＩＶ４は、より遠い関連であり、そしてルブラウイルス属に分類される。ＭＰＩＶ１、サル・ウイルス５（ＳＶ５）、およびＢＰＩＶ３は、それぞれ、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、およびＨＰＩＶ３の動物対応物である（本明細書に援用される、Ｃｈａｎｏｃｋら，Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ中，Ｋｎｉｐｅら（監修），ｐｐ．１３４１−１３７９，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１）。
［７３］ヒトＰＩＶは、類似のゲノム編成を有するが、Ｐ遺伝子で有意な相違が生じる（各々、本明細書に援用される、Ｃｈａｎｏｃｋら，Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ中，Ｋｎｉｐｅら（監修），ｐｐ．１３４１−１３７９，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１；Ｌａｍｂら，Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ中，Ｋｎｉｐｅら（監修），ｐｐ．１３０５−１３４０，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ２００１）。ゲノムＲＮＡの３’端およびその全長プラスセンス複製中間体アンチゲノムＲＮＡは、転写および複製を導くプロモーター要素を含有する。ヌクレオカプシドに関連するタンパク質は、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、および巨大ポリメラーゼ（Ｌ）で構成される。内部マトリックスタンパク質（Ｍ）および主要抗原決定基、融合糖タンパク質（Ｆ）および赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ糖タンパク質（ＨＮ）は、エンベロープ関連タンパク質である。遺伝子の順序は、Ｎ、Ｖ／Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬである。
［７４］Ｐ遺伝子を例外として、各ＨＰＩＶ２遺伝子は、単一のＯＲＦを含有し、そして単一のウイルスタンパク質をコードする。パラミクソウイルス亜科のＰ遺伝子は、同一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の代替翻訳開始部位の使用によって、ＲＮＡポリメラーゼ編集機構によって、リボソーム・シャントによって、またはリボソームフレームシフトを通じて、代替ＯＲＦから生成されるいくつかのタンパク質を多様にコードする（本明細書に援用される、Ｌａｍｂら，Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ中，Ｋｎｉｐｅら（監修），ｐｐ．１３０５−１３４０，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１；Ｌｉｓｔｏｎら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９：６７４２−６７５０，１９９５；Ｌａｔｏｒｒｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １８：５０２１−５０３１，１９９８）。例えば、ＭＰＩＶ Ｐ遺伝子は８つのタンパク質を発現する。これらのうちの４つ、Ｃ、Ｃ’、Ｙ１、およびＹ２は、Ｐ ＯＲＦに比較して＋１リーディングフレームに存在するＣ ＯＲＦ内の４つの異なるコドンでの翻訳開始によって発現される（各々、本明細書に援用される、Ｃｕｒｒａｎら，Ｅｍｂｏ Ｊ． ７：２４５−２５１，１９８８，Ｄｉｌｌｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６３：９７４−９７７，１９８９；Ｃｕｒｒａｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９：６４７−６５６，１９８９）。ＨＰＩＶ２ Ｐ遺伝子は、Ｐタンパク質およびさらなる１つのタンパク質、Ｖをコードする。Ｖタンパク質は、細胞培養におけるＨＰＩＶ２複製に絶対的に必要ではないようである。相同ＲＮＡ編集部位がなく、そして９〜１１の停止コドンに中断される残存Ｖコード配列が存在することに基づくと、ＨＰＩＶ１は、Ｐタンパク質をコードするが、Ｖタンパク質をコードしないようである（本明細書に援用される、Ｍａｔｓｕｏｋａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６５：３４０６−３４１０，１９９１；Ｒｏｃｈａｔら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ２４：１３７−１４４，１９９２）。
［７５］組換えＨＰＩＶ２への定義された変化を導入することを許し、そして定義されたゲノム配列を有するＨＰＩＶ２の高頻度および高忠実度生成を提供する組換え同時発現系によって、本発明にしたがった、感染性組換えＨＰＩＶ２ウイルスを産生する。これらの修飾は、あらかじめ決定された、定義される弱毒化突然変異を所持する生弱毒化ウイルス株の開発を含む、非常に多様な適用に有用である。本発明の感染性ＰＩＶは、典型的には、ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムＲＮＡをコードする１以上の単離ポリヌクレオチド分子を、転写し複製するヌクレオカプシドを生成するのに望ましいか、または少なくとも必要なウイルスタンパク質をコードする１以上のポリヌクレオチドとともに、細胞内同時発現または細胞不含同時発現によって産生される。
［７６］選択されるウイルスタンパク質と細胞内同時発現またはｉｎ ｖｉｔｒｏ同時発現して、感染性ＰＩＶを形成するため、ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードするｃＤＮＡを構築する。「ＨＰＩＶ２アンチゲノム」によって、子孫ＨＰＩＶ２ゲノムを合成するためのテンプレートとして働く、単離プラスセンスポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくは、転写し複製するヌクレオカプシドを生成するのに必要なタンパク質をコードする相補配列のプラスセンス転写物とハイブリダイズする可能性を最小限にするように、複製中間体ＲＮＡに対応するＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムのプラスセンス型であるｃＤＮＡを構築する。
［７７］本発明のいくつかの態様において、組換えＨＰＩＶ２（ｒＨＰＩＶ２）のゲノムまたはアンチゲノムは、コードされるウイルス粒子またはサブウイルス粒子を感染性にするのに必要な遺伝子またはその部分のみを含有すればよい。さらに、遺伝子またはその部分は、１より多いポリヌクレオチド分子によって提供されることも可能であり、すなわち遺伝子は、別個のヌクレオチド分子から相補性等によって、提供されることも可能である。他の態様において、ＰＩＶゲノムまたはアンチゲノムは、ヘルパーウイルスあるいはプラスミドまたはヘルパー細胞株に提供される、ヘルパーウイルスまたはウイルス機能の関与を伴わず、ウイルス増殖、複製、および感染に必要なすべての機能をコードする。
［７８］「組換えＨＰＩＶ２」によって、組換え発現系から直接または間接的に得られるか、あるいはそこから産生されるウイルス粒子またはサブウイルス粒子から増殖したＨＰＩＶ２またはＨＰＩＶ２様ウイルス粒子またはサブウイルス粒子を意味する。組換え発現系は、少なくとも、ＰＩＶ遺伝子発現において制御する役割を有する、単数または複数の遺伝要素、例えばプロモーター、ＰＩＶ ＲＮＡに転写される構造配列またはコード配列、並びに適切な転写開始配列および終結配列の組み立てを含んでなる、機能可能であるように連結された転写単位を含んでなる組換え発現ベクターを使用するであろう。
［７９］ｃＤＮＡが発現するＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムから感染性ＨＰＩＶ２を産生するため、ＲＮＡ複製が可能であるヌクレオカプシドを産生し、そして子孫ヌクレオカプシドをＲＮＡ複製および転写両方に適格であるようにするＰＩＶ（ＨＰＩＶ２または異種ＰＩＶ）タンパク質と、ゲノムまたはアンチゲノムを同時発現する。ゲノムヌクレオカプシドによる転写によって、他のＰＩＶタンパク質が提供され、そして生産力がある感染が開始される。あるいは、生産力がある感染に必要なさらなるＰＩＶタンパク質を、同時感染によって、供給することも可能である。
［８０］本発明の特定の態様において、１以上のヘルパーウイルスによって、転写し複製するＨＰＩＶ２ヌクレオカプシドを生成するのに必要なタンパク質をコードする相補配列を提供する。こうしたヘルパーウイルスは、野生型または突然変異体であることも可能である。好ましくは、ヘルパーウイルスは、ＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡにコードされるウイルスとは表現型的に区別可能である。例えば、ヘルパーウイルスと免疫学的に反応するが、ＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡにコードされるウイルスとは反応しない、モノクローナル抗体を提供することが望ましい可能性もある。こうした抗体は、中和抗体であることも可能である。いくつかの態様において、アフィニティークロマトグラフィーにおいて抗体を用いて、組換えウイルスからヘルパーウイルスを分離することも可能である。こうした抗体の入手を補助するため、ＨＮまたはＦ糖タンパク質遺伝子におけるなど、ＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡに突然変異を導入して、ヘルパーウイルスからの抗原多様性を提供することも可能である。
［８１］トランスフェクションプラスミドからのＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノム、およびタンパク質の発現は、例えば、選択されるプロモーター（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）の調節下にある各ｃＤＮＡによって、達成可能であり、これは、次に適切な発現系を用いた感染、トランスフェクションまたは形質導入によって供給される（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスＭＶＡ株組換え体などのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼに関しては、本明細書に援用される、Ｗｙａｔｔら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１０：２０２−２０５，１９９５に記載されるとおりである）。ウイルスタンパク質、および／またはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼはまた、形質転換哺乳動物細胞によっても、あるいはあらかじめ形成されたｍＲＮＡまたはタンパク質のトランスフェクションによっても提供可能である。
［８２］例えば、ＨＰＩＶ２ ｍＲＮＡまたはゲノムＲＮＡの逆転写コピーのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；各々、本明細書に援用される、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号、並びにＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｋｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら監修，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載される）などにより、全体として完全ゲノムまたはアンチゲノムに相当する、クローニングされたｃＤＮＡセグメントを組み立てることによって、本発明で使用するＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを構築することも可能である。例えば、適切なプロモーター（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）からアンチゲノムの左側末端を含有するｃＤＮＡを含んでなる第一の構築物を生成して、そしてプラスミド、コスミド、ファージ、またはＤＮＡウイルスベクターなどの適切な発現ベクターにおいて組み立てることも可能である。突然変異誘発および／または組み立てを容易にするように設計されたユニークな制限部位を含有する合成ポリリンカーの挿入によって、ベクターを修飾することも可能である。調製を容易にするため、Ｎ、Ｐ、Ｌおよび他の望ましいＰＩＶタンパク質を１以上の別個のベクター中で組み立てることも可能である。アンチゲノムプラスミドの右側端は、隣接するリボザイム、および単一またはタンデムＴ７転写ターミネーターなどのさらなる配列を、望ましいように含有することも可能である。リボザイムは、単一非ウイルスヌクレオチドを含有する３’端を生じるハンマーヘッド型であることも可能であり、または非ＰＩＶヌクレオチドを含有しない３’端を生じる肝炎デルタウイルスのもの（本明細書に援用される、Ｐｅｒｒｏｔｔａら， Ｎａｔｕｒｅ ３５０：４３４−４３６， １９９１）などの他の適切なリボザイムいずれかであることも可能である。
［８３］ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードするｃＤＮＡを構築する代替手段には、改善ＰＣＲ条件を用いて、サブユニットｃＤＮＡ構成要素の数をわずか１または２片にまで減少させる、逆転写ＰＣＲが含まれる（例えば、本明細書に援用されるＣｈｅｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：５６９５−５６９９， １９９４に記載されるとおりである）。他の態様において、異なるプロモーターも使用可能である（例えばＴ３、ＳＰＱまたはハンマーヘッド種のものなどの異なるリボザイム）。より大きいサイズのゲノムまたはアンチゲノムによりよく対応するため、増殖に、異なるＤＮＡベクター（例えばコスミド）を使用することも可能である。
［８４］ＨＰＩＶ２の「感染性クローン」または「感染性ｃＤＮＡ」によって、感染性ウイルス粒子に直接取り込まれることが可能な合成ｃＤＮＡまたは別のｃＤＮＡまたはその産物とともに、ＲＮＡであって、テンプレートとして働くことが可能なゲノムまたはアンチゲノムＨＰＩＶ２ ＲＮＡに転写されて、感染性ＨＰＩＶ２ウイルス粒子またはサブウイルス粒子を産生することも可能なものを意味する。上述のように、多様な慣用技術（例えば部位特異的突然変異誘発）によって、感染性ＨＰＩＶ２クローンのゲノムまたはアンチゲノムのｃＤＮＡコピー内に、定義される突然変異を導入することも可能である。本明細書に記載するような完全ゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡを組み立てるため、ゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡ下位断片を使用することは、各領域を別個に操作可能であり、こうした場合、小さいｃＤＮＡ構築物は、大きいｃＤＮＡ構築物より操作が容易であり、そして次いで、完全なｃＤＮＡに容易に組み立て可能であるという利点を有する。
［８５］ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）を、適切な宿主細胞に、トランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入、形質導入等によって、生産力があるＨＰＩＶ２感染を支持することが可能な細胞、例えばＨＥｐ−２、ＦＲｈＬ−ＤＢＳ２、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＲＣ−５、およびＶｅｒｏ細胞に挿入することも可能である。単離ポリヌクレオチド配列のトランスフェクションは、例えばリン酸カルシウム仲介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら，Ｃｅｌｌ １４：７２５，１９７８；Ｃｏｒｓａｒｏら，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３，１９８１；Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６， １９７３）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら，ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５，１９８２）、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌら（監修）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８７）、陽イオン性脂質仲介トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら，Ｆｏｃｕｓ １５：７３−７９，１９９３）または商業的に入手可能なトランスフェクション試薬、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）等（前述の参考文献は各々、本明細書に完全に援用される）によって、培養細胞に導入することも可能である。
［８６］ＨＰＩＶ２の感染性クローンを提供することによって、本発明は、ＨＰＩＶ２ゲノム（またはアンチゲノム）内で組換えによって産生する、広い範囲の改変を可能にし、望ましい表現型変化を特定する、定義された突然変異を生じる。組換えＨＰＩＶ２を産生する本発明の組成物および方法は、例えば選択されたＨＰＩＶ２タンパク質の機能または発現を改変する、定義された突然変異を用いて、ＨＰＩＶ２分子生物学および病因機構の詳細な解析および操作をすぐ行うのを可能にする。これらの方法および組成物を用いて、偶発的なサイレント突然変異から、望ましい表現型変化に関与する突然変異を容易に区別し、そして組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムに取り込むための表現型特異的突然変異を選択することが容易に可能になる。この背景において、ｃＤＮＡの構築中または構築後に、ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムにおいて、多様なヌクレオチド挿入、欠失、置換、および再編成を行うことも可能である。例えば、特定の望ましいヌクレオチド配列を合成し、そして好適な制限酵素部位を用いてｃＤＮＡの適切な領域に挿入することも可能である。あるいは、部位特異的突然変異誘発、アラニン・スキャニング、ＰＣＲ突然変異誘発、または当該技術分野に周知の他の技術などの技術を用いて、ｃＤＮＡに突然変異を導入することも可能である。
［８７］本発明内で提供されるＨＰＩＶ２の組換え修飾は、例えばウイルス弱毒化および免疫原性を増進し、望ましくない免疫病理に関連するエピトープを除去し、抗原ドリフトに対応するなどのために、改善された候補ウイルスの産生に向けられる。これらの目的および他の目的を達成するため、本発明の組成物および方法は、感染性組換えＨＰＩＶ２に取り込むため、非常に多様な修飾がＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムに導入されるのを可能にする。例えば、抗原決定基をコードする外来遺伝子または遺伝子セグメント（例えば防御抗原または免疫原性エピトープ）をＨＰＩＶ２クローン内に付加して、ＨＰＩＶ２、および抗原決定基（単数または複数）を得た別のウイルスまたは病原体両方に対して免疫を誘導可能な組換えＨＰＩＶ２ウイルスを生成することも可能である。あるいは、サイトカインなど、免疫系の調節因子をコードする外来遺伝子を全体としてまたは部分的に挿入して、候補ウイルスの免疫原性を増進することも可能である。本発明のＨＰＩＶ２クローン内に含まれることが可能な他の突然変異には、例えば、ＰＩＶクローン中の対応物遺伝子または遺伝子セグメントでの異種遺伝子または遺伝子セグメント（例えば糖タンパク質遺伝子の細胞質テールをコードする遺伝子セグメント）の置換が含まれる。あるいは、ＨＰＩＶ２クローン内の遺伝子の相対的な順序を変化させるか、ＨＰＩＶ２ゲノムプロモーターまたは他の制御要素をアンチゲノム対応物で置換するか、あるいは選択したＨＰＩＶ２遺伝子（単数または複数）を機能しないようにする（例えば停止コドンを導入して遺伝子の発現を妨げることを伴う、機能的除去によって）ことも可能である。ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムの多様な非コード領域またはコード領域にユニークな制限部位を挿入するなど、ＨＰＩＶ２クローンにおいて他の修飾を行って、操作を容易にすることも可能である。さらに、非翻訳遺伝子配列を除去して、外来配列を挿入する能力を増加させることも可能である。
［８８］上述のように、組換えウイルスの弱毒化を増加させるかまたは減少させるか、あるいは別の方式で該ウイルスの表現型を改変する、さらなる突然変異を導入することによって、使用のため、組換えＨＰＩＶ２ウイルスの表現型を調整することが、しばしば望ましい。本発明を補足する側面として、ｃＤＮＡから組換えＰＩＶを産生するための材料および方法、並びに本明細書に示す多様な突然変異およびヌクレオチド修飾を作成し、そして試験するための材料および方法の詳細な説明は、例えば、各々、本明細書に援用される、Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７；米国特許出願第０９／０８３，７９３号、１９９８年５月２２日出願；米国特許出願第０９／４５８，８１３号、１９９９年１２月１０日出願；米国特許出願第０９／４５９，０６２号、１９９９年１２月１０日出願；米国仮出願第６０／０４７，５７５号、１９９７年５月２３日出願（国際公報第ＷＯ９８／５３０７８号に対応する）、および米国仮出願第６０／０５９，３８５号、１９９７年９月１９日出願に提供される。
［８９］特に、これらの援用される参考文献は、ＰＩＶを突然変異誘発し、単離し、そして性質決定して、弱毒化突然変異体株（例えば温度感受性（ｔｓ）、低温継代（ｃｐ）低温適応（ｃａ）、小プラーク（ｓｐ）および宿主範囲制限（ｈｒ）突然変異体株）を得る方法および手順、並びに弱毒化表現型を特定する遺伝子変化を同定する方法および手順を記載する。これらの方法と組み合わせて、前述の援用される参考文献は、ハムスターまたはげっ歯類および非ヒト霊長類モデル系を含む、ヒト活性に適度に相関すると認められたモデル系において、生物学的に得られる弱毒化ＨＰＩＶおよび組換えによって産生される弱毒化ＨＰＩＶの複製、免疫原性、遺伝的安定性、および免疫原有効性を決定する方法を詳述する。さらに、これらの参考文献は、ＨＰＩＶに対して、一価および二価免疫原性組成物を含む免疫原性組成物を開発し、そして試験する一般的な方法を記載する。必須ＰＩＶタンパク質と同時発現されるＰＩＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするｃＤＮＡの構築および発現によって、感染性組換えＨＰＩＶ３を産生する方法もまた、上述の援用される参考文献に記載され、これらには、感染性ＨＰＩＶ３クローンを産生するのに使用可能な以下の典型的なプラスミドの説明が含まれる：ｐ３／７（１３１）（ＡＴＣＣ ９７９９０）；ｐ３／７（１３１）２Ｇ（ＡＴＣＣ ９７８８９）；およびｐ２１８（１３１）（ＡＴＣＣ ９７９９１）；各々、ブダペスト条約の条件下で、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９， Ｕ．Ｓ．Ａ．のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託され、そして上に同定する寄託番号を授与された（寄託は本明細書に援用される）。必須ＰＩＶタンパク質と同時発現されたＨＰＩＶ１組換えまたはキメラゲノムまたはアンチゲノムをコードするｃＤＮＡの構築および発現によって感染性組換えＨＰＩＶ１を産生する方法が、各々、本明細書に援用される、米国仮出願第６０／３３１，９６１号、２００１年１１月２１日出願、およびＮｅｗｍａｎら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７−９２，２００２に同様に記載される。
［９０］上で援用される参考文献にやはり開示されるのは、生物学的に得られるＰＩＶ突然変異体、例えば低温継代（ｃｐ）、低温適応（ｃａ）、宿主範囲制限（ｈｒ）、小プラーク（ｓｐ）、および／または温度感受性（ｔｓ）突然変異体株、例えばＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５突然変異体株に同定される表現型特異的突然変異を取り込むように修飾された感染性組換えＨＰＩＶを構築し、そして評価する方法である。ＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５株は、ブダペスト条約の条件下で、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、特許寄託番号ＰＴＡ−２４１９で寄託された（寄託は本明細書に援用される）。この突然変異体ウイルスおよび他の異種突然変異体ウイルスに同定される突然変異は、以下に記載するように、本発明の組換えＨＰＩＶ２に容易に取り込み可能である。
［９１］図１（パネルＡ〜Ｅ）に例示するように、異種マイナス鎖ＲＮＡウイルスに同定される多様な突然変異を、本発明の組換えＨＰＩＶ２候補に取り込んで、弱毒化または他の望ましい表現型変化を生じることも可能である。この図は、ＨＰＩＶ２野生型（ｗｔ）、ＨＰＩＶ３ ｗｔ、ＨＰＩＶ１ ｗｔ、またはＢＰＩＶ３ ｗｔ間の典型的な配列並列を提供し、異種ウイルスにおける、既知の弱毒化突然変異を含有する領域を同定する。これらの比較および類似の比較に基づいて、異種ＰＩＶまたは非ＰＩＶウイルスで先に同定される突然変異は、本発明の組換えＨＰＩＶ２への「移入」（すなわち同一の、保存的突然変異または非保存的突然変異の導入、潜在的に、並列によって同定される、相同な位または対応する位での置換、欠失または挿入を含む）に関して、ＨＰＩＶ２の対応する位にマッピングされる。本発明の組換えＨＰＩＶ２およびキメラＨＰＩＶ２候補への取り込みのため、こうした突然変異の巨大な組み立てが利用可能である（例えば、各々、本明細書に援用される、Ｎｅｗｍａｎら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７−９２，２００２；Ｆｅｌｌｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７６：１９０−２０１，２０００；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６０：１２５−３５，１９９９；およびＤｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６１：３１９−３０，１９９９）。図１に示すように、慣用的な配列並列によって、異種ウイルスにおいて、表現型変化を与えることが先に示された対応するアミノ酸位（示した野生型残基が、例えば置換によって改変されている場合）を同定する。それによって、ＨＰＩＶ２における対応するアミノ酸位を、弱毒化または他の望ましい表現型変化を生じる、組換えＨＰＩＶ２中の突然変異の標的部位と同定する。
［９２］特定の詳細な態様において、ＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５のＴｙｒ９４２、Ｌｅｕ９９２、および／またはＴｈｒ１５５８に対応する位で、Ｌタンパク質中の先に同定されたアミノ酸置換（単数または複数）を特定する突然変異から選択した突然変異の１つまたはいずれかの組み合わせを取り込むように、ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを組換えによって修飾する。これらの典型的な突然変異を取り込む、野生型（ｗｔ）ＨＰＩＶ２ Ｌの対応する標的は、Ｔｙｒ９４８、Ａｌａ９９８、およびＬｅｕ１５６６である。他の態様において、異種突然変異体非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば別のＨＰＩＶ、ウシＰＩＶ３（ＢＰＩＶ３）またはネズミＰＩＶ１（ＭＰＩＶ１）などの非ヒトＰＩＶ、または呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）などの非ＰＩＶウイルスで同定される弱毒化突然変異のアミノ酸位に対応するアミノ酸位で、弱毒化突然変異を取り込むように、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを修飾する。典型的な態様において、ＢＰＩＶ３ウイルスＬタンパク質のアミノ酸位Ｔｈｒ１７１１に同定される弱毒化突然変異を、慣用的な並列法によって同定されるように、本発明の組換えＨＰＩＶ２の対応する位（Ｓｅｒ１７２４）で取り込む（図１、パネルＡ〜Ｅ）。
［９３］より具体的な態様において、ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、ＨＰＩＶ２ ＬのＴｙｒ９４８Ｈｉｓ、Ａｌａ９９８Ｐｈｅ、Ｌｅｕ１５６６Ｉｌｅ、および／またはＳｅｒ１７２４ＩｌｅのＬタンパク質におけるアミノ酸置換（単数または複数）を特定する突然変異から選択した突然変異の１つまたはいずれかの組み合わせを取り込む（図１、パネルＢ〜Ｅ）。突然変異に関して示した標的部位での、置換および欠失を含む他の突然変異、特に前述の典型的な突然変異に対して保存的であるものが、組換えＨＰＩＶ２候補において、望ましい弱毒化を達成するのに有用である。
［９４］例えば本発明内で使用するための非ヒトＰＩＶウイルスにおける突然変異を考慮すると、ヒトおよび他の霊長類の気道において、既知の複製制限があることに基づいて、本明細書では、ＢＰＩＶ３のＫａｎｓａｓ株を研究した。霊長類におけるＢＰＩＶ３の宿主範囲弱毒化表現型の遺伝的決定基を同定するため、ＨＰＩＶ３のアンチゲノムｃＤＮＡが、類似のＨＰＩＶ３ ＯＲＦの代わりにＢＰＩＶ３のＮ、Ｐ Ｍ、またはＬ ＯＲＦを含有するように修飾した。さらに、Ｆ遺伝子およびＨＮ遺伝子を対にしてともに移入して、先に記載されるように、ＨＰＩＶ３対応物を置換した（本明細書に援用されるＳｃｈｍｉｄｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：８９２２−９，２０００）。各々、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＦおよびＨＮ、またはＬを含有するキメラ・ウシ−ヒトをｃＤＮＡから回収した。プラーク単離によって組換えキメラウイルスを生物学的にクローニングし、そしてクローニングしたウイルスからｖＲＮＡを単離し、そしてテンプレートとして用いて、ＲＴ−ＰＣＲ産物を生成した。配列決定および制限酵素解析によって、各組換えウイルスに関して、置換したＯＲＦに隣接するゲノム構造を確認した。
［９５］ＢＰＩＶ３ Ｌ ＯＲＦを所持する２つの組換えウイルス、ｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１ＩおよびｒＨＰＩＶ３−ＬＢを生成した。ｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉをまず生成したが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの複製において、非常に温度感受性であることを見出した後、配列決定し、そしてＡｌａ−４２５のＶａｌへの置換（Ａ４２５Ｖ）およびＴｈｒ−１７１１のＩｌｅへの置換（Ｔ１７１１Ｉ）を生じる、Ｌ ＯＲＦの２つの点突然変異を含有することを見出した。後者の突然変異は、アンチゲノムｃＤＮＡに存在するが、前者はこのｃＤＮＡのトランスフェクション後に自発的に起こった突然変異であった。真正ＢＰＩＶ３ Ｌ ＯＲＦ配列を有する別の組換え体を生成した（ｒＨＰＩＶ３−ＬＢ）。
［９６］感染効率０．０１でＬＬＣ−ＭＫ２細胞を感染させ、そして２４時間間隔でウイルス収量を測定することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの各キメラｒＨＰＩＶ３の複製の動力学を、野生型ｒＨＰＩＶ３およびＢＰＩＶ３親ウイルスのものと比較した。ｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉを除いて、ＢＰＩＶ３ ＯＲＦ置換を所持するすべてのキメラｒＨＰＩＶ３は、その親ウイルスと類似の速度で増殖し、そしてすべてのキメラウイルスは、感染後、第５日までに、１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌを越えるまで増殖した。これによって、置換野生型ＢＰＩＶ３タンパク質が各々、ＨＰＩＶ３主鎖の該タンパク質およびシス作用シグナルとの高い度合いの適合性を示すことが確認された。対照的に、ｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉがｉｎ ｖｉｔｒｏで複製が制限されていたことによって、ＢＰＩＶ３ Ｌポリメラーゼタンパク質のアミノ酸置換の一方または両方が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで弱毒性であることが示される。
［９７］これらの結果を考慮すると、突然変異体ｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉウイルスによって示される複製制限をさらに性質決定することに興味が持たれた。各ｒＨＰＩＶ３のＯＲＦ置換が、これらのウイルスが上昇した温度で増殖する能力を改変するかどうか決定するため、各キメラｒＨＰＩＶ３の複製の温度感受性レベルを、親ウイルスおよびｒＨＰＩＶ３ｃｐ４５のものと比較し、ｒＨＰＩＶ３ｃｐ４５は、ヒトおよび非ヒト霊長類において、適切に弱毒化され、そして免疫原性であることが先に示された、よく性質決定されたｔｓおよび弱毒化候補ＨＰＩＶ３ワクチンである。３２℃の許容温度およびより高い温度範囲で、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞上での増殖能力に関して、野生型およびキメラｒＨＰＩＶ３を評価した。驚くべきことに、ｒＨＰＩＶ３−ＬＢおよびｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉはどちらも非常にｔｓであり、ｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉは、ｒＨＰＩＶ３−ＬＢまたはｒＨＰＩＶ３ｃｐ４５どちらよりも、よりｔｓであった。上述のように、ｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉウイルスに存在するＢＰＩＶ３ Ｌ ＯＲＦは、野生型ＢＰＩＶに比較して２つのアミノ酸コード変化を含有し、そしてｒＨＰＩＶ３−ＬＢに比較した、ｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉのｔｓ表現型増加に関与するのはどちらの一方かまたは両方かを決定することに興味が持たれた。Ｔ１７１１Ｉ置換を含有するがＡ４２５Ｖ突然変異を含有しないｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉの代替ウイルスクローンが同定された。このウイルスは、ｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉと同一の遮断温度を有したことから、Ｔ１７１１Ｉ突然変異が単独で、ｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉの温度感受性レベルの増加に関与することが示される。
［９８］上述のＢＰＩＶ３ ＯＲＦは各々、ＨＰＩＶ３の類似のＯＲＦを置換した際、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）の上気道または下気道における複製制限を与えたことから、ＢＰＩＶ３の宿主範囲弱毒化表現型が多遺伝子性であることが立証された。上気道におけるウイルス複製の平均ピーク力価を比較すると、キメラｒＨＰＩＶ３は、３つの群に属し：（ｉ）ＢＰＩＶ３ ＭまたはＬ ＯＲＦあるいはＦおよびＨＮ遺伝子を所持するウイルスは、およそ１６〜３２倍制限され；（ｉｉ）ＢＰＩＶ３ ＮまたはＬＴ１７１１Ｉ ＯＲＦを所持するウイルスは、４０〜１００倍の複製制限を示し；そして（ｉｉｉ）ＢＰＩＶ３ Ｐ ＯＲＦ置換を含むキメラＨＰＩＶ３は、複製の１０００倍の制限を示したことから、ＢＰＩＶ３ Ｐ ＯＲＦが、弱毒化表現型への主要な寄与因子であることが示唆された。上気道において、ｒＨＰＩＶ３−ＰＢの複製レベルは、ＢＰＩＶ３親ウイルスのものよりさらに低いことから、ｉｎ ｖｉｖｏでの複製制限のある程度は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは明らかでない遺伝子不適合効果によるものである可能性もあることが示唆された。下気道において、キメラウイルスの一団に関して、宿主範囲制限の類似のパターンが観察された。ｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉはｉｎ ｖｉｔｒｏでの複製に関して弱毒化されており、そして非常にｔｓであったため、ｉｎ ｖｉｖｏで観察されるこのウイルスの弱毒化レベルは、宿主範囲配列に特定される複製制限および高レベルの温度感受性によって特定される複製制限との組み合わせによる可能性がある（アカゲザルの体温は約３９℃である）。
［９９］ｒＨＰＩＶ３の免疫原性を評価するため、キメラｒＨＰＩＶ３またはその親ウイルスに感染させる前、並びに感染させた後の第２８日または第３１日に、血清試料を収集して、そしてＨＰＩＶ３に対する血清ＨＡＩ抗体レベルを決定した。ＨＰＩＶ３ Ｆ糖タンパク質およびＨＮ糖タンパク質を所持するキメラ組換え体は各々、ＨＰＩＶ３に対して高レベルのＨＡＩ抗体を誘導し、一方、ＢＰＩＶ３糖タンパク質を所持するｒＨＰＩＶ３−ＦＢＨＮＢおよびＢＰＩＶ３親ウイルスは、ヒトウイルスと反応するＨＡＩ抗体を８〜１６倍低く誘導した。ｒＨＰＩＶ３ ＬＢＴ１７１１Ｉ、ｒＨＰＩＶ３−ＮＢ、およびｒＨＰＩＶ３−ＰＢは、ＢＰＩＶ３に比較して、アカゲザルの気道において、およそ２〜１０倍、より効率的でなく複製したが、これらはＨＰＩＶ３ ＨＡＩ抗体をおよそ４〜３２倍多く誘導し、これはおそらく、これらが相同ＨＰＩＶ３糖タンパク質を所持するためである。
［１００］キメラｒＨＰＩＶ３の防御効力を評価するため、サルを、野生型ＨＰＩＶ３の１０６ＴＣＩＤ５０で、ＩＮおよびＩＴ曝露した。曝露後１０日間、２日間間隔でＮＰ試料およびＴＬ試料を収集し、そして試料中に存在するウイルスを、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞上で定量化した。試験したキメラ組換え体は、非常に弱毒化されたｒＨＰＩＶ３−ＰＢおよびｒＨＰＩＶ３ ＬＢＴ１７１１Ｉを含めて、各々、ＨＰＩＶ３複製に対して高レベルの防御を提供した。曝露後に収集した血清試料の解析は、各群が、ＨＰＩＶ３に対して、類似の高力価のＨＡＩ抗体を発展させたことを示し、すべてのサルが実際に感染したことを示した。
［１０１］アカゲザルにおけるｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉの高レベルの弱毒化は、Ｌ遺伝子の宿主範囲配列、並びにＴ１７７１ＩおよびＡ４２５Ｖ点突然変異の一方または両方によって特定される複製制限の加算性を反映する。Ｔ１７１１Ｉ突然変異は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｔｓ表現型を与え、そしてしたがってまた、ｉｎ ｖｉｖｏの弱毒化表現型に関与する可能性もあるが、Ａ４２５Ｖ突然変異による寄与は、この時点では排除し得ない。ｒＨＰＩＶ３−ＬＢに対するｒＨＰＩＶ３−ＬＢＴ１７１１Ｉの弱毒化の増加は、ｔｓおよび弱毒化の宿主範囲決定要因を組み合わせて、本発明の候補ＨＰＩＶ２ウイルスの弱毒化レベルを微調整することも可能であることを例示する。
［１０２］本発明の特定の他の詳細な態様において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、非ＰＩＶ異種突然変異体非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスに同定される弱毒化突然変異のアミノ酸位に対応するアミノ酸位で弱毒化突然変異を特定する組換え体修飾を取り込む。典型的な態様において、異種突然変異体非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である。１つの特定の態様において、ＲＳＶに同定される弱毒化突然変異は、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、およびＨＰＩＶ１ Ｌタンパク質の保存される位と並列される、ＲＳＶ Ｌタンパク質の５２１位のフェニルアラニンのアミノ酸置換を含んでなる。ＨＰＩＶ２において、突然変異の保存される標的部位は、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質のＰｈｅ４６０に対応する（図１、パネルＡ）。１つの典型的な態様において、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質のＰｈｅ４６０をＬｅｕ残基に置換するか、あるいは別のアミノ酸に置換する。
［１０３］本発明の組換えＨＰＩＶ２候補において操作可能な前述の典型的な突然変異の多くは、組換えＨＰＩＶ３に基づく候補において操作および回収に成功してきている（各々、本明細書に援用される、Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：１７６２−１７６８，１９９８；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７３：１３７４−１３８１，１９９９；米国特許出願第０９／０８３，７９３号、１９９８年５月２２日出願；米国特許出願第０９／４５８，８１３号、１９９９年１２月１０日出願；米国特許出願第０９／４５９，０６２号、１９９９年１２月１０日出願；米国仮出願第６０／０４７，５７５号、１９９７年５月２３日出願（国際公報第ＷＯ ９８／５３０７８号に対応する）、および米国仮出願第６０／０５９，３８５号、１９９７年９月１９日出願）。さらに、上に援用される参考文献は、キメラＰＩＶ組換え体、例えばＨＰＩＶ１のＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子が、部分的ＨＰＩＶ３バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム内を置換し、さらにＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５に同定される弱毒化突然変異を１以上所持するように修飾されたものの構築を記載する。１つのこうしたキメラ組換え体は、ｃｐ４５のＬ遺伝子に同定される弱毒化突然変異をすべて取り込む。以来、異種（ＨＰＩＶ１）ＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子の外のｃｐ４５突然変異がすべて、ＨＰＩＶ３−１組換え体に取り込まれて、弱毒化キメラ候補を生じることも可能であることが示されている。
［１０４］本発明の組換えＨＰＩＶ２に取り込まれることも可能なさらなる突然変異は、例えば非ＰＩＶ病原体、特にＰＩＶ以外の他の非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスに同定される突然変異、例えば弱毒化突然変異である。これらの背景の各々で、１つのマイナス鎖ＲＮＡウイルスに同定される弱毒化突然変異および他の望ましい突然変異を、本発明の組換えＨＰＩＶ２のゲノムまたはアンチゲノム内の対応する位に「移入する」、例えばコピーすることも可能である。簡潔には、１つの異種マイナス鎖ＲＮＡウイルスの望ましい突然変異を、組換えＨＰＩＶ２レシピエント（「ベクター」ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノム、あるいは異種「ドナー」遺伝子またはゲノムセグメント中いずれか）に移入する。これは、各々、本明細書に援用される、１０／１９／００のＷＯ ００／６１７３７として公表され、０１／０８／０２出願の米国国内段階出願第０９／９５８，２９２号に対応し、そして１９９３年４月１３日出願の米国仮特許出願第６０／１２９，００６号に優先権を請求する、２０００年４月１２日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／０９６９５号に記載されるように、異種突然変異体ウイルスにおいて突然変異をマッピングし、レシピエントである組換えＨＰＩＶ２における対応する部位を、日常的な配列並列によって同定し、そして典型的には異種突然変異体遺伝子型に対する同一のまたは保存的突然変異に対応して、組換えＨＰＩＶ２における天然配列を突然変異させることを伴う。本発明のこの側面に付随するさらなる説明が、各々、本発明に援用される、Ｎｅｗｍａｎら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７−９２，２００２；Ｆｅｌｌｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０；２７６：１９０−２０１，２０００；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６０：１２５−３５，１９９９；およびＤｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６１：３１９−３０，１９９９に提供される。
［１０５］レシピエント組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムが、異種突然変異体ウイルスに同定される改変に保存的に対応する突然変異の対象部位で改変をコードするように、該ゲノムまたはアンチゲノムを修飾することが、しばしば望ましい。例えば、アミノ酸置換が、対応する野生型配列に比較して、突然変異体ウイルスにおいて、突然変異部位を明らかにする場合、組換えＨＰＩＶ２の対応する残基に、類似の置換を設計することも可能である。好ましくは、置換は、突然変異体ウイルスタンパク質に存在する置換残基と同一のアミノ酸または保存的なアミノ酸を特定するであろう。しかし、突然変異体タンパク質の置換残基に関して、非保存的に、突然変異部位の天然アミノ酸残基を改変することも可能である（例えば、野生型残基の機能を破壊するかまたは損なう他のアミノ酸いずれかを用いることによって）。典型的な突然変異が同定され、そして本発明の組換えＨＰＩＶ２に移入される、マイナス鎖ＲＮＡウイルスには、とりわけ、他のＰＩＶ（例えばＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、ＢＰＩＶ３およびＭＰＩＶ１）、ＲＳＶ、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、サル・ウイルス５（ＳＶ５）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、牛疫ウイルス、イヌ・ジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、狂犬病ウイルス（ＲａＶ）および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が含まれる。
［１０６］本発明の組換えＨＰＩＶ２内に取り込まれる、生物学的に得られるＰＩＶおよび他の非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスにおける弱毒化突然変異は、天然に存在するか、または野生型ＰＩＶ株に導入されて、そしてその後、周知の突然変異誘発および解析法によって、同定され、そして性質決定されることも可能である。例えば、上に援用される参考文献に記載されるように、化学的突然変異誘発物質が添加された細胞培養物におけるウイルス増殖中の化学的突然変異誘発によって、増殖制限突然変異を導入するために最適以下の温度での継代にさらされたウイルスの選択によって、または細胞培養物における小プラーク（ｓｐ）を産生する突然変異誘発されたウイルスの選択によって、不完全に弱毒化された親ＰＩＶまたは他の異種ウイルス突然変異体株を産生することも可能である。
［１０７］「生物学的に得られる」によって、組換え手段によって産生されたのではないいかなるウイルスも意味する。したがって、生物学的に得られるＰＩＶには、すべての天然存在ＰＩＶが含まれ、例えば野生型ゲノム配列を有する天然存在ＰＩＶ、および参照野生型ＰＩＶ配列からの対立遺伝子または突然変異体ゲノム変動を有するＰＩＶ、例えば弱毒化表現型を特定する突然変異を有するＰＩＶが含まれる。同様に、生物学的に得られるＰＩＶには、とりわけ、人工的突然変異誘発および直接組換えＤＮＡ操作を伴わない選択法によって、親ＰＩＶから得られるＰＩＶ突然変異体が含まれる。
［１０８］上述のように、十分に弱毒化された生物学的に得られるＰＩＶまたは他のウイルス突然変異体の産生は、いくつかの既知の方法によって達成可能である。こうした方法の１つは、部分的に弱毒化されたウイルスを、進行性に、より低い、弱毒化する温度で継代にさらすことを伴う。例えば、部分的に弱毒化された突然変異体は、最適以下の温度で細胞培養物を継代することによって産生される。したがって、低温適応（ｃａ）突然変異体または他の部分的に弱毒化されたＰＩＶ株を、培養物中で継代することによって、より低い温度で効率的な増殖に適応させる。低温継代中の突然変異体ＰＩＶのこの選択は、部分的に弱毒化された親に比較して、誘導体株における、いかなる残った毒性も、実質的に減少させる。あるいは、部分的に弱毒化された親ウイルスを化学的突然変異誘発に供することによって、生物学的に得られるＰＩＶに、特異的突然変異を導入して、例えばｔｓ突然変異を導入するか、またはすでにｔｓであるウイルスの場合、弱毒性増加および／または弱毒化誘導体のｔｓ表現型の安定を与えるのに十分なさらなるｔｓ突然変異を導入することも可能である。ＰＩＶへのｔｓ突然変異の導入手段には、一般的に知られる方法にしたがった、５−フルオロウリジンなどの突然変異誘発物質の存在下でウイルスを複製させることが含まれる。他の化学的突然変異誘発物質もまた使用可能である。弱毒化は、ほぼいかなるＰＩＶ遺伝子のｔｓ突然変異からも生じうるが、この目的のため、特に敏感に反応する標的は、ポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子であることが見出されている。いくつかの制限温度での複製と、許容温度での複製を比較することによって、本発明内で使用するための典型的な弱毒化ＰＩＶにおける複製の温度感受性レベルを決定する。許容温度での複製と比較して、ウイルスの複製が１００倍以上減少する最低の温度を、遮断温度と称する。実験動物およびヒトにおいて、ＰＩＶの複製および毒性はどちらも、該突然変異体の遮断温度と相関する。
［１０９］生物学的に得られるＰＩＶおよび他の非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスから、本明細書の解説によって、弱毒化突然変異の大きな「メニュー」が同定可能であり、これらの各々を、本発明の組換えＨＰＩＶ２における弱毒化、免疫原性、および遺伝的安定性のレベルを調整するため、他の突然変異（単数または複数）いずれかと組み合わせることも可能である。この背景において、多くの組換えＨＰＩＶ２候補は、生物学的に得られるＰＩＶまたは他の異種ウイルス突然変異体由来の１以上、そして好ましくは２以上の突然変異、例えばＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５、ＢＰＩＶ３、およびＲＳＶ由来の、上に同定される突然変異のいずれか１つまたは組み合わせを含むであろう。本発明内の好ましい組換えＨＰＩＶ２ウイルスは、こうして同定される突然変異を複数取り込むであろう。しばしば、これらの突然変異は、各突然変異を特定するコドンにおいて、複数のヌクレオチド置換によって、組換えＨＰＩＶ２の復帰突然変異に対して安定化されている。
［１１０］上述のように、「メニュー」に集められている突然変異を、望ましいように、単一で、または組み合わせて導入して、本発明の組換えＨＰＩＶ２を、弱毒化、免疫原性、弱毒化表現型からの復帰突然変異に対する遺伝的耐性等の適切なレベルに調整する。前述の説明にしたがって、ｃＤＮＡから感染性組換えＨＰＩＶ２を産生する能力は、組換えＨＰＩＶ２内に特定の操作された変化を導入することを可能にする。特に、感染性組換えＨＰＩＶ２ウイルスを、生物学的に得られる弱毒化ＨＰＩＶ２株における特定の突然変異（単数または複数）、例えばｔｓ、ｃａ、ａｔｔおよび他の表現型を特定する突然変異のさらなる同定に使用することも可能である。この方法および他の方法によって同定される、望ましい突然変異を組換えＨＰＩＶ２候補株に導入する。ｃＤＮＡからウイルスを産生する能力によって、これらの突然変異を、全長ｃＤＮＡクローンに、個々に、または多様な選択される組み合わせで、日常的に取り込むことが可能になり、その後、導入された突然変異を含有する、救出された組換えウイルスの表現型を容易に決定可能である。
［１１１］望ましい表現型、例えばｃａ表現型またはｔｓ表現型に関連する特定の突然変異を同定し、そして感染性組換えＨＰＩＶ２に取り込むことによって、本発明は、同定された突然変異での、またはそれに非常に近接した範囲の、他の部位特異的修飾を提供する。生物学的に得られるＰＩＶで産生される最も弱毒化する突然変異は単一ヌクレオチド変化であるが、他の「部位特異的」突然変異もまた、組換え技術によって、組換えＨＰＩＶ２に取り込むことも可能である。本明細書において、部位特異的突然変異には、１〜３、約５〜１５まで、またはそれより多い改変ヌクレオチド（例えば野生型ＰＩＶ配列から、選択される突然変異体ＰＩＶ株から、または突然変異誘発にさらされた親組換えＰＩＶクローンから改変されたもの）の挿入、置換、欠失または再編成が含まれる。こうした部位特異的突然変異は、選択される生物学的に得られる点突然変異で、またはその領域内で取り込まれることも可能である。あるいは、突然変異は、組換えＨＰＩＶ２クローン内の多様な他の背景において、例えば、シス作用制御配列、またはタンパク質活性部位、結合部位、免疫原性エピトープ等をコードする、ヌクレオチド配列で、あるいはその近傍で、導入されることも可能である。
［１１２］部位特異的組換えＨＰＩＶ２突然変異体は、典型的には、望ましい弱毒化表現型を保持するが、弱毒化に関連しない、改変された表現型特性、例えば免疫原性増進または拡張、および／または増殖の改善をさらに示すことも可能である。望ましい部位特異的突然変異体のさらなる例には、弱毒化点突然変異を特定するコドンにおいて、さらなる安定化ヌクレオチド突然変異を取り込むように操作された組換えＨＰＩＶ２突然変異体が含まれる。可能な場合、親突然変異体または組換えＨＰＩＶ２クローンにおいて弱毒化アミノ酸変化を特定するコドンで、２以上のヌクレオチド置換が導入され、弱毒化表現型からの復帰突然変異に、より強い遺伝的耐性を持つ組換えＨＰＩＶ２を得る。他の態様において、部位特異的ヌクレオチド置換、付加、欠失または再編成を、標的ヌクレオチド位の上流または下流、例えば１〜３、５〜１０、そして１５ヌクレオチドまで、あるいはそれ以上５’または３’に導入して、例えば現存するシス作用制御要素を構築するかまたは除去する。
［１１３］単一および多数の点突然変異および部位特異的突然変異に加えて、本明細書に開示する組換えＨＰＩＶ２への変化には、１以上の遺伝子またはゲノムセグメントの欠失、挿入、置換または再編成が含まれる。特に有用なのは１以上の遺伝子またはゲノムセグメントに関与する欠失であり、これらの欠失は、さらなる望ましい表現型効果を生じることが示されてきている（例えば、本明細書に援用される、Ｄｕｒｂｉｎらによって１９９９年７月９日に提出された米国特許出願第０９／３５０，８２１号を参照されたい）。例えば、ＨＰＩＶ１において、１以上のＣ、Ｃ’、Ｙ１、および／またはＹ２オープンリーディングフレーム（ＯＲＦまたは他の補助遺伝子）の発現は、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムを修飾して、例えば開始コドンのコード割り当てを改変する突然変異、または１以上の停止コドンを導入する突然変異を取り込むことによって減少させるかまたは除去することも可能である。あるいは、１以上のＣ、Ｃ’、Ｙ１、および／またはＹ２ ＯＲＦまたは他の補助遺伝子を全体としてまたは部分的に欠失させて、対応するタンパク質（単数または複数）を部分的にまたは完全に非機能的にするか、あるいはタンパク質発現をまったく破壊することも可能である。Ｃ、Ｃ’、Ｙ１、および／またはＹ２ ＯＲＦ（単数または複数）を欠く組換えＨＰＩＶ２を同様の様式で修飾して、典型的には補助遺伝子またはゲノムセグメント、例えばＶ ＯＲＦを欠失させるかまたは修飾することによって、遺伝子の発現を欠失させるかまたは減少させることも可能であり、そしてこれらの組換え体は、免疫原性組成物を開発するのに非常に望ましい表現型特性を所持するであろう。例えば、これらの修飾は、（ｉ）細胞培養における増殖特性改変、（ｉｉ）哺乳動物の上気道および／または下気道における弱毒化、（ｉｉｉ）ウイルスプラークサイズの変化、（ｉｖ）細胞変性効果の変化、および（ｖ）免疫原性の変化を含む、１以上の望ましい表現型変化を特定することも可能である。
［１１４］したがって、本発明のより詳細な側面において、組換えＨＰＩＶ２は、１以上の部分的または完全遺伝子欠失、ノックアウト突然変異、あるいはＨＰＩＶ２遺伝子の発現を単に減少させるかまたは増加させる突然変異を取り込む。これは、例えば、選択されるコード配列内にフレームシフト突然変異または終止コドンを導入するか、翻訳開始部位を改変するか、遺伝子の位置を変化させるか、または上流開始コドンを導入して、発現率を改変するか、ＧＳおよび／またはＧＥ転写シグナルを変化させて表現型を改変するか、またはＲＮＡ編集部位を修飾することによって、達成可能である（例えば増殖、転写に対する温度制限など）。本発明のより詳細な側面において、１以上の遺伝子、例えばＶ ＯＲＦの発現が、例えば翻訳オープンリーディングフレームに多数の翻訳終結コドンを導入するか、開始コドンを改変するか、または編集部位を修飾することによって、遺伝子またはそのセグメントを欠失させることなく、翻訳または転写レベルで除去されている、組換えＨＰＩＶ２ウイルスを提供する。これらの型のノックアウトウイルスは、しばしば、組織培養において、増殖率減少および小プラークサイズを示すであろう。したがって、これらの方法は、主要ウイルス防御抗原の１つでないウイルス遺伝子の発現を除去する、弱毒化突然変異のさらなる新規の型を提供する。この背景において、遺伝子またはゲノムセグメントの欠失なしに産生されるノックアウトウイルス表現型を、記載されるような、欠失突然変異誘発によって別の方法として産生して、標的タンパク質の合成を回復しうる、修正突然変異を有効に妨げることも可能である。当該技術分野に周知の別の設計および方法を用いて、他の遺伝子ノックアウトを作成することも可能である（例えば、各々、本明細書に援用される、Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１６：３０９−３１６，１９９６；Ｒａｄｅｃｋｅら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１７：４１８−４２１，１９９６；Ｋａｔｏら，ＥＭＢＯ Ｊ． １６：５７８−５８７，１９８７；およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７７：３１４−３２２，１９９６に記載されるとおりである）。
［１１５］本発明の組換えＨＰＩＶ２構築物に導入することも可能なヌクレオチド修飾は、ベクターゲノムまたはアンチゲノム、あるいは異種ドナー遺伝子またはゲノムセグメントにおいて、変化の性質に応じて、少数の塩基（例えば１５〜３０塩基、３０〜５０塩基まで、またはそれより多い）、ヌクレオチドの大きなブロック（例えば５０〜１００、１００〜３００、３００〜５００、５００〜１，０００塩基）、あるいはほぼ完全な遺伝子または完全な遺伝子（例えば１，０００〜１，５００ヌクレオチド、１，５００〜２，５００ヌクレオチド、２，５００〜５，０００ヌクレオチド、５，０００〜６，０００ヌクレオチドまたはそれより多い）を改変することも可能である（すなわち少数の塩基を変化させて、免疫原性エピトープを挿入するかまたは除去するか、あるいは小さいゲノムセグメントを変化させることも可能であるし、一方、遺伝子または大きなゲノムセグメントを付加し、置換し、欠失させ、または再編成させる場合は、塩基の大きなブロックが関与する）。
［１１６］関連する側面において、本発明は、生物学的に得られるＰＩＶから組換えＨＰＩＶ２クローンに採用する、補足突然変異、例えばｃａ突然変異およびｔｓ突然変異とともに、さらなる修飾組換えＨＰＩＶ２における同一遺伝子または異なる遺伝子を伴うさらなる型の突然変異を提供する。ＨＰＩＶ２遺伝子を、各々、発現レベルに関して、選択的に改変することも可能であり、あるいは全体としてまたは部分的に、単独でまたは他の望ましい修飾と組み合わせて付加し、欠失させ、置換し、または再編成して、新規特性を示す組換えＨＰＩＶ２を得ることも可能である。したがって、生物学的に得られるＰＩＶおよび／または非ＰＩＶ突然変異体から採用した弱毒化突然変異に加えて、またはこうした突然変異と組み合わせて、本発明はまた、感染性ＰＩＶクローンの組換え操作に基づいて、組換えＨＰＩＶ２の表現型を弱毒化するか、または別の方式で修飾する、ある範囲のさらなる方法も提供する。感染性クローンに取り込むための、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムにおけるドナーまたはレシピエント遺伝子またはゲノムセグメントを含む、標的遺伝子またはゲノムセグメントをコードする単離ポリヌクレオチド配列において、多様な改変を産生することも可能である。より具体的には、組換えＨＰＩＶ２において望ましい構造変化および表現型変化を達成するため、本発明は、親ゲノムまたはアンチゲノムから、選択されるヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を欠失させるか、置換するか、導入するか、または再編成する修飾とともに、組換えＨＰＩＶ２内の遺伝子全体（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）を欠失させ、置換し、導入し、または再編成する突然変異の導入を可能にする。
［１１７］したがって、例えば選択されるＰＩＶコード配列内に終止コドンを導入するか、あるいはその翻訳開始部位またはＲＮＡ編集部位を改変するか、機能可能であるように連結されたプロモーターに対して、ＰＩＶ遺伝子の相対的な位を変化させるか、上流開始コドンを導入して発現率を改変するか、ＧＳおよび／またはＧＥ転写シグナルを修飾して（例えば位を変化させるか、現存する配列を改変するか、または異種配列で現存する配列を置換することによって）表現型（例えば増殖、転写に対する温度制限など）を改変することによって、選択される遺伝子の発現を単に改変するかまたは除去する、本発明の組換えＨＰＩＶ２における修飾、およびウイルス複製、選択される遺伝子（単数または複数）の転写、または選択されるタンパク質（単数または複数）の翻訳において、定量的または定性的変化を特定する、多様な他の欠失、置換、付加および再編成を提供する。この背景において、増殖に必須でないＰＩＶ遺伝子またはゲノムセグメントはいずれも、組換えＰＩＶにおいて除去するかまたは別の方式で修飾して、毒性、病因形成、免疫原性および他の表現型特性に対して望ましい効果を生じることも可能である。コード配列に加えて、非コード領域、リーダー領域、トレーラー領域および遺伝子間領域を同様に欠失させ、置換し、または修飾することも可能であり、そしてそれらの表現型効果を、例えばミニレプリコンおよび本明細書記載の組換えＨＰＩＶ２を使用することによって、容易に解析することも可能である。
［１１８］これらの変化に加えて、組換えＨＰＩＶ２構築物中の遺伝子順序を変化させて、ＰＩＶゲノムプロモーターをそのアンチゲノム対応物で置換するか、その逆を行うことも可能であり、遺伝子の一部を除去するかまたは置換し、そして遺伝子全体を欠失させることさえ可能である。配列において、多様な遺伝子間領域または別の箇所に、ユニークな制限部位を挿入するなど、異なる修飾またはさらなる修飾を行うことも可能である。非翻訳遺伝子配列を除去して、外来配列が挿入される容量を増加させることも可能である。
［１１９］本発明の組換えＨＰＩＶ２構築物に取り込む他の突然変異には、シス作用シグナルに向けられる突然変異が含まれ、これは、例えばＰＩＶミニゲノムの突然変異解析によって、容易に同定可能である。例えば、リーダー配列、トレーラー配列および／または隣接配列の挿入解析および欠失解析によって、ウイルスプロモーターおよび転写シグナルが同定され、そしてＲＮＡ複製または転写の多様な度合いの現象と関連する、一連の突然変異が提供される。これらのシス作用シグナルの飽和突然変異誘発（これによって各位が次々に各ヌクレオチド代替物に修飾される）もまた使用して、ＲＮＡ複製または転写に影響を及ぼす、多くの突然変異を同定することも可能である。これらの突然変異はいずれも、本明細書に記載するように、キメラＰＩＶアンチゲノムまたはゲノムに挿入されることも可能である。完全アンチゲノムｃＤＮＡを用いた、トランス作用タンパク質およびシス作用ＲＮＡ配列の評価および操作は、上に援用される参考文献に記載されるように、ＰＩＶミニゲノムを用いることによって、補助される。
［１２０］本発明の組換えＨＰＩＶ２ウイルス内のさらなる突然変異にはまた、ゲノムの３’端をアンチゲノム由来の対応物で置換するか、またはその逆を行うことが含まれ、これはＲＮＡ複製および転写の変化と関連する。１つの典型的な態様において、合成によって作成され、そして効率的な翻訳と相反しないように設計されている配列で、天然配列を置換することによって、防御ＨＮ抗原および／またはＦ抗原などの特定のＰＩＶタンパク質の発現レベルを増加させることが可能である。この背景において、コドン使用は、哺乳動物ウイルスタンパク質の翻訳レベルの主要な要因でありうることが示されてきている（本明細書に援用される、Ｈａａｓら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ． ６：３１５−３２４，１９９６）。組換えＨＰＩＶ２のＨＮタンパク質およびＦタンパク質をコードするｍＲＮＡのコドン使用の組換え法による最適化は、これらの遺伝子の改善された発現を提供するであろう。
［１２１］別の典型的な態様において、ＨＰＩＶ２ベクターに取り込まれる、選択されるＨＰＩＶ２遺伝子またはドナー遺伝子の翻訳開始部位周囲の配列（好ましくはＡＵＧ開始部位に対して相対的に３’のヌクレオチドを含む）を、単独で、または上流開始コドンの導入と組み合わせて、修飾して、翻訳の上方制御または下方制御を特定することによって、遺伝子発現を調節する。あるいは、または本明細書に開示する他の組換え修飾と組み合わせて、ウイルスの選択される遺伝子（単数または複数）いずれかの転写ＧＳシグナルまたはＧＥシグナルを改変することによって、組換えＨＰＩＶ２の遺伝子発現を調節することも可能である。別の態様において、組換えＨＰＩＶ２候補の遺伝子発現レベルを、転写レベルで修飾する。１つの側面において、ＰＩＶ遺伝子マップの選択される遺伝子の位を、よりプロモーター近位またはプロモーター遠位の位に変化させることも可能であり、それによって、遺伝子は、それぞれ、より効率的にまたはより効率的でなく、発現されるであろう。この側面にしたがって、特定の遺伝子の発現調節を達成し、野生型レベルに比較して、２倍、より典型的には４倍から、１０倍またはそれを越える、減少または増加を生じることも可能であり、これにはしばしば、相互に位置的に置換された遺伝子に関して、発現レベルの同等の減少が付随する。これらの転位変化および他の転位変化は、例えばＲＮＡ複製に関与する、選択されるウイルスタンパク質発現の減少のため、弱毒化表現型を有するか、または抗原発現増加などの他の望ましい特性を有する新規組換えＨＰＩＶ２ウイルスを生じる。
［１２２］他の態様において、免疫原性組成物において有用な組換えＨＰＩＶ２ウイルスを好適に修飾して、循環ウイルスにおける抗原ドリフトを提供することも可能である。典型的には、修飾は、ＨＮタンパク質および／またはＦタンパク質におけるものであろう。１つのＰＩＶ（ＨＰＩＶ２または別のＨＰＩＶ）株または群由来の全ＨＮ遺伝子またはＦ遺伝子、あるいはその特定の免疫原性領域をコードするゲノムセグメントを、異なるＰＩＶ株または群のレシピエントクローンにおける、対応する領域で置換することによって、または多数の抗原型が存在するように遺伝子の１以上のコピーを付加することによって、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡに取り込む。次いで、修飾組換えＨＰＩＶ２から産生される子孫ウイルスを、出現するＰＩＶ株に対する免疫プロトコルにおいて、使用することも可能である。
［１２３］本発明の特定の側面において、ＨＰＩＶ２コード配列または非コード配列（例えばプロモーター、遺伝子終止要素、遺伝子開始要素、遺伝子間要素または他のシス作用要素）を、異種（例えば非ＨＰＩＶ２）対応物で置換すると、ありうる多様な弱毒化および他の表現型効果を有するキメラＨＰＩＶ２が得られる。例えば、ウシＰＩＶ３（ＢＰＩＶ３）またはネズミＰＩＶ１（ＭＰＩＶ１）タンパク質、ＳＶ５、ＳＶ４１、ＮＤＶ、タンパク質ドメイン、遺伝子またはゲノムセグメントを、組換えＨＰＩＶ２「バックグラウンド」ゲノムまたはアンチゲノムに移入することによって、宿主範囲および他の望ましい効果を操作することも可能であり、ここで、ウシ遺伝子またはネズミ遺伝子は、例えば異種配列またはタンパク質と、生物学的に相互作用するＨＰＩＶ配列またはタンパク質（すなわちウイルス転写、翻訳、組み立て等のため、置換配列またはタンパク質と通常協同する配列またはタンパク質）との不適合から、またはより典型的には、許容状態の宿主およびより許容状態でない宿主間で異なる細胞環境の細胞タンパク質またはいくつかの他の側面を伴う宿主範囲制限で、ヒト細胞において有効に機能しない。典型的な態様において、ウシおよび異種ヒトＰＩＶ構造および機能の既知の側面に基づいて、ウシＰＩＶ配列が、ＨＰＩＶ２への導入のため、選択される。
［１２４］より詳細な側面において、本発明は、ＨＰＩＶ２および非ヒトＰＩＶ、例えばＭＰＩＶ１（センダイウイルス）、ＢＰＩＶ３、ＳＶ５、ＳＶ４１、およびＮＤＶ間のキメラの構築に基づいて、組換えＨＰＩＶ２候補を弱毒化する方法を提供する（例えば、各々、本明細書に援用される、Ｓｃｈｍｉｄｔらによって２０００年６月１日に出願された米国特許出願第０９／５８６，４７９号（ＰＣＴ公報ＷＯ０１／０４３２０に対応する）；Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：８９２２−９，２０００に開示されるとおりである）。この弱毒化法は、ヒトＰＩＶのベクターに基づくキメラウイルスに非ヒトＰＩＶの１以上の遺伝子またはゲノムセグメントを導入したことによる宿主範囲効果に基づく。例えば、ＢＰＩＶおよびＨＰＩＶ類の間には、多くのヌクレオチドおよびアミノ酸配列相違があり、これが宿主範囲相違に反映される。ＨＰＩＶ３およびＢＰＩＶ３の間では、以下のタンパク質各々のアミノ酸同一性パーセントは：Ｎ（８６％）、Ｐ（６５％）、Ｍ（９３％）、Ｆ（８３％）、ＨＮ（７７％）、およびＬ（９１％）である。宿主範囲相違は、アカゲザルでＨＰＩＶ３が非常に許容性に増殖するのに対して、同じ動物において、ＢＰＩＶ３の２つの異なる株が複製制限されることに例示される（本明細書に援用される、ｖａｎ Ｗｙｋｅ Ｃｏｅｌｉｎｇｈら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １５７：６５５−６６２，１９８８）。ＨＰＩＶ３およびＢＰＩＶ３の間の宿主範囲相違の基礎は、完全には解明されないままであるが、これには多数の遺伝子および多数のアミノ酸相違が関与することが示されてきている。多数の遺伝子、およびおそらく各々、多数のアミノ酸またはヌクレオチド相違が関与するシス作用制御配列の関与は、復帰突然変異に対して非常に安定な弱毒化の広い基礎を生じる。これは、１つまたはいくつかの点突然変異によって弱毒化される、他の生弱毒化ＨＰＩＶ３ウイルスでの状況とは対照的である。この場合、個々の突然変異のいずれかの復帰突然変異は、毒性の有意な再獲得を生じる可能性もあり、また単一の残基のみが弱毒化を特定する場合、毒性の完全な再獲得を生じる可能性もある。本発明の典型的な態様において、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを、異種遺伝子またはゲノムセグメント、例えばＢＰＩＶ３または別の動物パラミクソウイルス類由来のＮ、Ｐ、Ｍ、またはＬ ＯＲＦと組み合わせる。
［１２５］上に援用される参考文献は、ウシＰＩＶ３株Ｋａｎｓａｓ（Ｋａ）および輸送熱（ＳＦ）両方を伴う、ＨＰＩＶ３／ＢＰＩＶ３キメラ組換え体が、生存可能で、そして細胞培養において、ＨＰＩＶ３またはＢＰＩＶ３親ウイルスいずれとも同程度に効率的に複製することを開示し、キメラ組換え体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複製を制限する遺伝子不適合を示さなかったことを示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に複製するこの特性は、この生物製剤を効率的に製造することを可能にするため、重要である。また、１つのウシ遺伝子しか所持しない、ＫａおよびＳＦ ＨＰＩＶ３／ＢＰＩＶ３キメラ組換え体（ｃＫａおよびｃＳＦと称する）はアカゲザルの気道において、宿主範囲制限の度合いがＢＰＩＶ３親ウイルスとほぼ同等である。特に、ｃＫａおよびｃＳＦウイルスは、ＨＰＩＶ３の複製に比較して、アカゲザルの上気道における複製に、それぞれ、６０倍または３０倍の減少を示す。この知見に基づいて、他のＢＰＩＶ３遺伝子もまた、本発明のキメラＨＰＩＶ２候補内で、望ましいレベルの宿主範囲制限を与えるであろうと予期される。したがって、本明細書の方法にしたがって、適切な組み合わせで、組換えＨＰＩＶ２ウイルスに対して、望ましいレベルの宿主範囲制限および免疫原性を与える、ＢＰＩＶ３および他の非ヒトＰＩＶの異種遺伝子およびゲノムセグメント中の、弱毒化決定要因のリストが容易に同定されるであろう。
［１２６］したがって、ＨＰＩＶ２から得られるか、またはＨＰＩＶ２を模範とする部分的または完全「バックグラウンド」ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを、非ヒトＰＩＶの１以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせて含み、キメラＰＩＶゲノムまたはアンチゲノムを形成する、キメラ・ヒト−ウシまたはヒト−ネズミ組換えＨＰＩＶ２を、本明細書に提供する。本発明の好ましい側面において、この種のキメラＨＰＩＶ２は、部分的または完全ＨＰＩＶ２バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを、例えばウシＰＩＶ由来の１以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせて取り込む。部分的または完全バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムは、典型的には、対応物、非ヒトＰＩＶの異種遺伝子またはゲノムセグメントを取り込むレシピエント・バックグラウンドとして働く。対応物ＰＩＶ由来の異種遺伝子またはゲノムセグメントは、バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムと組み合わされて、またはこれらを置換して、寄与するＰＩＶの一方または両方と比較して、新規の表現型特性を示すキメラＨＰＩＶ２を生じる、「ドナー」遺伝子またはポリヌクレオチドに相当する。例えば、選択されるレシピエントＨＰＩＶ２株内での異種遺伝子またはゲノムセグメントの付加または置換は、未修飾レシピエントおよび／またはドナーの対応する表現型（単数または複数）に比較した際、弱毒化、増殖変化、免疫原性改変、または他の望ましい表現型変化の増加または減少を生じることも可能である（例えば、各々、本明細書に援用される、Ｓｃｈｍｉｄｔらによって２０００年６月１日に出願された米国特許出願第０９／５８６，４７９号；Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：８９２２−９，２０００）。
［１２７］キメラＰＩＶベクター内で異種置換または付加として使用するため選択可能な遺伝子およびゲノムセグメントには、ＰＩＶ Ｎ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよび／またはＬタンパク質またはその部分をコードする遺伝子またはゲノムセグメントが含まれる。さらに、他のＰＩＶウイルスに見られるタンパク質とともに、非ＰＩＶタンパク質（例えば流行性耳下腺炎、ＲＳＶ、およびＳＶ５ウイルスに見られるようなＳＨタンパク質）をコードする遺伝子およびゲノムセグメントを、本発明のさらなるキメラＨＰＩＶ２組換え体に取り込むことも可能である。遺伝子外３’リーダーまたは５’トレーラー領域、および遺伝子開始領域、遺伝子終止領域、遺伝子間領域、あるいは３’または５’非コード領域などの制御領域もまた、異種置換または付加として有用である。典型的な側面において、１以上のウシまたはネズミＰＩＶ遺伝子またはゲノムセグメントを所持するキメラＨＰＩＶ２は、例えばハムスターおよび非ヒト霊長類などのヒトＰＩＶ感染の哺乳動物モデルの気道において、高い度合いの宿主範囲制限を示す。より詳細な態様において、ＨＰＩＶ２は、部分的または完全ＨＰＩＶ２バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムへの、Ｎ、Ｍ、Ｌ、Ｖ、およびＰ遺伝子およびゲノムセグメントから選択される１以上のウシＰＩＶ３遺伝子またはゲノムセグメントの付加または置換によって、弱毒化される。
［１２８］好ましくは、本発明の候補として使用するためのヒト−ウシおよび他のキメラＨＰＩＶ２に示される宿主範囲制限の度合いは、非ヒトＰＩＶまたは他の「ドナー」株それぞれに示される宿主範囲制限の度合いに匹敵する。好ましくは、制限は、真の宿主範囲表現型を有するべきであり、すなわち、問題の宿主に特異的であるべきであり、そして適切な細胞株における、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの複製を制限してはならない。さらに、１以上のウシまたはネズミＰＩＶ遺伝子またはゲノムセグメントを所持するキメラＨＰＩＶ２は、ＨＰＩＶ２感染に感受性である宿主において、望ましい免疫学的応答を誘発する。したがって、本発明は、宿主範囲効果に基づいて、ＨＰＩＶ２および他の病原体に対して、免疫原性組成物を開発するため、生ＨＰＩＶ２ウイルスベクターを弱毒化する、新たな基礎を提供する。
［１２９］本発明のヒト−非ヒト・キメラＨＰＩＶ２に提供される宿主範囲表現型効果と組み合わせて、キメラウイルスの弱毒化を増加させるかまたは減少させる、さらなる突然変異の導入によって、弱毒化表現型を調整することがしばしば望ましい。したがって、本発明のさらなる側面において、生じるウイルス粒子またはサブウイルス粒子において弱毒化表現型を特定する、１以上の弱毒化突然変異を導入することによって、キメラゲノムまたはアンチゲノムがさらに修飾されている、弱毒化されたヒト−ウシまたはヒト−ネズミ・キメラＨＰＩＶ２を産生する。これらには新規に生成され、そして合理的設計突然変異誘発戦略にしたがって、弱毒化効果に関して試験された突然変異が含まれることも可能である。あるいは、弱毒化突然変異は、現存する、生物学的に得られる突然変異体ＰＩＶおよび非ＰＩＶウイルスにおいて同定され、そしてその後、本発明のヒト−ウシまたはヒト−ネズミ・キメラＨＰＩＶ２に取り込まれることも可能である。典型的な突然変異は、ＲＮＡ制御配列またはコードされるタンパク質の損傷を特定する。
［１３０］本発明の好ましいキメラＨＰＩＶ２候補において、ヒトにおけるＰＩＶ複製および免疫原性活性と適度に相関すると認められた動物モデル（例えばハムスター、アカゲザルまたはチンパンジー）において、下気道および／または上気道における複製によって示される弱毒化は、対応する野生型または突然変異体親ＰＩＶ株の増殖に比較して、全体で少なくとも約２倍、よりしばしば約５倍、１０倍、または２０倍、そして好ましくは５０〜１００倍、そして１，０００倍まで、またはそれより多く（例えば感染後３〜８日の間に間測定した際）減少する。
［１３１］本発明の方法内で、さらなる遺伝子またはゲノムセグメントを、組換えまたはキメラＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノム内に、またはそれに近接して挿入することも可能である。例えば、多様な規定数外の異種遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）を、組換えゲノムまたはアンチゲノム内の多様な部位のいずれかに、例えばＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムのＮ遺伝子より３’に、Ｎ／Ｐ遺伝子、Ｐ／Ｍ遺伝子、および／またはＨＮ／Ｌ遺伝子の間に、あるいは別の遺伝子間接合部または非コード領域に、挿入することも可能である。典型的な遺伝子挿入の詳細を図２に例示する。挿入される遺伝子は、レシピエント遺伝子と共通の調節下にあることも可能であるし、または転写シグナルの独立のセットの調節下にあることも可能である。この背景において、関心が持たれる遺伝子には、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１８、例えばインターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターフェロン・ガンマ（ＩＦＮγ）、または顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））をコードする遺伝子も含まれる（例えば、各々、本明細書に援用される、米国出願第０９／６１４，２８５号、２０００年７月１２日出願および優先米国仮出願第６０／１４３，４２５号、１９９９年７月１３日出願）。これらのさらなるタンパク質の同時発現は、本発明の組換えＨＰＩＶ２に対する免疫応答を、量的におよび／または質的に修飾し、そして改善する能力を提供する。
［１３２］本発明の他の側面において、組換えＨＰＩＶ２候補への異種ヌクレオチド配列の挿入を別個に使用して、例えば上気道に対する、候補組換え体の弱毒化レベルを調節する。したがって、動物宿主において外来タンパク質の発現を指示するとともにウイルスを弱毒化するヌクレオチド配列を組換えＨＰＩＶ２に挿入するか、またはヌクレオチド挿入を別個に使用して、候補ウイルスを弱毒化することが可能である。弱毒化に対する遺伝子挿入の効果を支配するいくつかのルールを定義するため、多様な長さの遺伝子単位を野生型ＨＰＩＶ２主鎖に挿入し、そして弱毒化に対する遺伝子単位の長さの影響を調べることも可能である。これに関連して、新規遺伝子単位挿入は、重要なＯＲＦを含有せず、その遺伝子が発現するタンパク質の効果とは独立に、遺伝子単位の長さの効果を同定することを可能にすると意図される。これらの異種配列は、多様なサイズ、例えば長さ約１５０ｎｔ以上から長さ３，０００ｎｔまたはそれ以上の、余分な遺伝子単位として挿入されることも可能である。本明細書に立証するように、長さ約３，０００ｎｔより長い遺伝子挿入または伸長も可能である。
［１３３］長さ約１，０００または２，０００ｎｔの遺伝子単位（ＧＵ）挿入は、哺乳動物被験者の上気道に関して、ｒＨＰＩＶ２候補を実質的に弱毒化するであろう。さらに、遺伝子単位挿入は、候補ウイルスを弱毒化し、そして第二のウイルスに対する免疫原性応答を誘導する、二重の効果を有することも可能である。あるいは、さらなるタンパク質を発現不能な、ＨＰＩＶ２遺伝子の３’非コード領域（ＮＣＲ）の遺伝子伸長もまた、それ自体で、弱毒化させることも可能である。本発明のこれらの方法内で、遺伝子挿入の長さは、弱毒化の決定要因である。
［１３４］本発明の組換えＨＰＩＶ２内のＧＵおよびＮＣＲ挿入は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの効率的な複製およびｉｎ ｖｉｖｏでの複製減少に特徴付けられる、弱毒化表現型を産生し、この表現型は、他のパラミクソウイルス挿入に関して、以前には記載されていない。ＧＵ挿入から生じる弱毒化の機構は、主にｉｎ ｖｉｖｏで作用する以下の要因の１以上から生じる可能性もある。よりプロモーター遠位である遺伝子よりも、よりプロモーター近位である遺伝子が、より高い率で転写される、転写勾配があるため、余分な遺伝子単位の付加は、下流遺伝子の転写レベルを減少させうる。遺伝子産物が限定的であるか、または効率的な複製に必要な遺伝子産物の特定の比が改変されている場合、ｍＲＮＡの存在量減少から生じる、下流遺伝子産物の発現減少は、弱毒化を生じうる。転写勾配は、転写中とともに、遺伝子接合部をわたる移動中に、転写酵素複合体がテンプレートから剥がれ落ちる結果であると考えられている。あるいは、ゲノムの全体の長さおよび転写される余分なｍＲＮＡの増加によって、作成されるウイルス二本鎖ＲＮＡのレベルが増加し、これが次に、より高いレベルのインターフェロン系の抗ウイルス活性を誘導しうる。最後に、ゲノムおよびアンチゲノムの長さが増加するため、ゲノム複製の全体のレベルが減少することもありうる。これは、ゲノムＲＮＡまたはアンチゲノムＲＮＡの複製中に、テンプレートからレプリカーゼ複合体が離脱することから生じうる。ウイルス粒子へのパッケージングに利用可能なゲノムの量が減少した結果、ウイルス収量が減少する可能性もあり、これが弱毒化を生じる。
［１３５］ＮＣＲ挿入から生じる弱毒化の機構は、１以上の以下の要因から生じうる。ＮＣＲ挿入から生じる、ＨＮ ｍＲＮＡの３’端の余分な長さが、ｍＲＮＡの不安定性に寄与し、そしてＨＮタンパク質発現の減少を導きうる。あるいは、ゲノムの全長およびＨＮ ｍＲＮＡの余分な長さの増加によって、作成されるウイルス二本鎖ＲＮＡのレベルが増加して、これがインターフェロン系の抗ウイルス活性をより高いレベルで誘導することも可能である。あるいは、またはさらに、ゲノムおよびアンチゲノムの長さが増加するため、ゲノム複製の全体のレベルが減少することも可能である。これは、ゲノムＲＮＡまたはアンチゲノムＲＮＡの複製中に、テンプレートからレプリカーゼ複合体が離脱することから生じうる。ウイルス粒子へのパッケージングに利用可能なゲノムの量が減少した結果、ウイルス収量が減少する可能性もあり、これが弱毒化を生じる。最後に、ＨＮ遺伝子の３’端に余分なヌクレオチドを付加すると、ＨＮ遺伝子の３’端の余分なヌクレオチドの転写中、転写酵素複合体がテンプレートから剥がれ落ちる可能性があるため、下流遺伝子の転写レベルが減少する可能性もある。
［１３６］本発明のｒＨＰＩＶ２内の全ウイルス遺伝子またはゲノムセグメントの変化を伴う、欠失、挿入、置換および他の突然変異は、非常に安定な候補を生じ、これは免疫抑制された個体の場合に、特に重要である。これらの変化の多くは、生じる株の弱毒化を生じ、一方、他のものは、異なる種類の望ましい表現型変化を特定するであろう。例えば、アクセサリー（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖に必須でない）遺伝子は、宿主免疫に特異的に干渉するタンパク質をコードする、優れた候補である（例えば、本明細書に援用される、Ｋａｔｏら，ＥＭＢＯ．Ｊ． １６：５７８−８７，１９９７を参照されたい）。候補ウイルスにおける、こうした遺伝子の除去は、毒性および病因形成を減少させ、そして／または免疫原性を改善すると期待される。
［１３７］本発明のより詳細な態様において、異種病原体の１以上の抗原決定基を取り込むよう組換えによって修飾されたＨＰＩＶ２「ベクター」ゲノムまたはアンチゲノムを用いて、キメラＨＰＩＶ２ウイルスを構築する。ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、部分的または完全ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムで構成され、該ゲノムまたはアンチゲノムは、それ自体、弱毒化突然変異などのヌクレオチド修飾を取り込むことも可能である。ベクターゲノムまたはアンチゲノムを修飾して、異種遺伝子またはゲノムセグメントを取り込むことを通じて、キメラ構造を形成する。より具体的には、ｃＤＮＡに基づくウイルス回収系を通じて、本発明のキメラＨＰＩＶ２ウイルスを構築して、部分的または完全ベクターまたは「バックグラウンド」ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを、異種抗原決定基（単数または複数）をコードする１以上の「ドナー」ヌクレオチド配列と組み合わせて取り込む、組換えウイルスを生じる。典型的な態様において、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムを修飾して、１以上の異種ＰＩＶ（例えばＨＰＩＶ１および／またはＨＰＩＶ３）、および／または非ＰＩＶ病原体（例えばＲＳＶ、ヒト・メタニューモウイルス、または麻疹ウイルス）の抗原決定基（単数または複数）をコードする１以上の遺伝子またはゲノムセグメントを取り込む。こうして構築された、本発明のキメラＨＰＩＶ２ウイルスは、特定のＰＩＶ、例えばＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、および／またはＨＰＩＶ３に対して、あるいは非ＰＩＶ病原体に対して、免疫応答を誘発することも可能である。あるいは、ＨＰＩＶ２に基づくキメラウイルスを使用して、多数のＰＩＶ、例えばＨＰＩＶ２およびＨＰＩＶ３に対して、あるいは１以上のＨＰＩＶおよび麻疹ウイルスなどの非ＰＩＶ病原体に対して、多特異性免疫応答を誘発する、組成物および方法を提供する。キメラベクターＨＰＩＶ候補ウイルスの典型的な構築を図２に例示する。
［１３８］本発明の好ましい側面において、この背景におけるキメラＨＰＩＶ２は、異種病原体の１以上の抗原決定基をコードする１以上の異種ポリヌクレオチドを取り込む、部分的または完全ヒトＨＰＩＶ２を取り込み、このポリヌクレオチドは、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノム内で付加されるかまたは置換して、キメラＨＰＩＶ２組換え体を生じることも可能である。キメラＨＰＩＶ２ウイルスは、こうして、異種病原体に対して、選択される宿主において免疫応答を誘発する能力を獲得する。さらに、キメラウイルスは、ベクターＰＩＶおよび異種病原体の一方または両方に比較して、他の新規表現型特性を示すことも可能である。
［１３９］部分的または完全ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、一般的に、異なる病原体の異種遺伝子またはゲノムセグメントが取り込まれる主鎖として働く。しばしば、異種病原体は、異なるＰＩＶであり、これに由来する１以上の遺伝子またはゲノムセグメントが、ベクターゲノムまたはアンチゲノムと組み合わされるか、またはこれらの内部を置換する。新規免疫原性特性を提供するのに加え、ベクターＨＰＩＶ２株内での異種遺伝子またはゲノムセグメントの付加または置換は、非修飾ベクターおよびドナーウイルスの対応する表現型（単数または複数）と比較した際、弱毒化の増加または減少、増殖変化、または他の望ましい表現型変化を与えることも可能である。
［１４０］１つのＰＩＶまたは非ＰＩＶウイルスの異種遺伝子またはゲノムセグメントは、ＨＰＩＶ２の部分的または完全ゲノムまたはアンチゲノムに、規定数外のゲノム要素として付加されることも可能である。あるいは、１つのＰＩＶの１以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントが、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノム内では欠失している、対応物遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）の野生型遺伝子順序位に対応する位で置換されていることも可能である。さらなる態様において、異種遺伝子またはゲノムセグメントは、ベクターゲノムまたはアンチゲノム内の対応物遺伝子またはゲノムセグメントの野生型遺伝子順序位に比較して、よりプロモーター近位またはプロモーター遠位の位で付加されるかまたは置換して、それぞれ、異種遺伝子またはゲノムセグメントの発現を増進するかまたは減少させる。
［１４１］キメラＨＰＩＶ２を産生する、異種免疫原性タンパク質、タンパク質ドメインおよび免疫原性エピトープの導入は、免疫宿主において、新規免疫応答を生成するのに特に有用である。レシピエントＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノム内の１つのドナー病原体由来の免疫原性遺伝子またはゲノムセグメントの付加または置換は、ドナー病原体、ＨＰＩＶ２ベクター、またはドナー病原体およびベクター両方に対して向けられる免疫応答を生成しうる。
［１４２］キメラＰＩＶウイルスを操作するのに有用な一般的な方法および組成物がＨＰＩＶ３に関して開発されてきている（各々、本明細書に援用される、Ｄｕｒｂｉｎら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：１７６２−１７６８，１９９８；Ｔａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：２９５５−２９６１，１９９８；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７３：１３７４−１３８１，１９９９；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １８：５０３−５１０，１９９９；Ｔａｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１１００−１１０８，１９９９；Ｔａｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １８：１３５９−１３６６，２０００；米国特許出願第０９／０８３，７９３号、１９９８年５月２２日出願；米国特許出願第０９／４５８，８１３号、１９９９年１２月１０日出願；米国特許出願第０９／４５９，０６２号、１９９９年１２月１０日出願；米国仮出願第６０／０４７，５７５号、１９９７年５月２３日出願（国際公報第ＷＯ ９８／５３０７８号に対応する）、および米国仮出願第６０／０５９，３８５号、１９９７年９月１９日出願）。特に、上に援用される参考文献は、例えばＨＰＩＶ１のＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子が、部分的ＨＰＩＶ３バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノム内を置換する、キメラＨＰＩＶ組換え体の構築を記載し、この組換え体は、さらに修飾されて、ＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５に同定される弱毒化突然変異の１以上を所持する。１つのこうしたキメラ組換え体は、異種（ＨＰＩＶ１）ＨＮ遺伝子およびＦ遺伝子外部のＬ遺伝子ｃｐ４５に同定される弱毒化突然変異をすべて取り込み、弱毒化キメラ候補を生じる。
［１４３］しかし、ＨＰＩＶ３にあらかじめ感染させると、ＨＰＩＶ３−１組換えウイルスの免疫原性、および続くＨＰＩＶ１曝露に対するこうしたウイルスの有効性両方が部分的に制限されることが報告されている。この制限は、２つのウイルスに共有されるＨＰＩＶ３内部タンパク質に対する免疫応答のためであるようである（各々、本明細書に援用される、Ｔａｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１１００−１１０８，１９９９；Ｔａｏら， Ｖａｃｃｉｎｅ １８：１３５９−１３６６，２０００）。内部ＨＰＩＶ３タンパク質に対する免疫応答は短命であり、そして長期有効性には寄与しないようであったが、生弱毒化ＲＳＶおよびＰＩＶ免疫原性組成物に関して想定されるように、２ヶ月などの比較的短い間隔の経時的な免疫で干渉するには十分である可能性もある（序論を参照されたい）。本明細書に記載するＨＰＩＶ２逆遺伝学系は、ＨＰＩＶ３とともにＲＳＶなどの他のウイルスに以前曝露された乳児において、感染性でそして免疫原性であろう生弱毒化ＨＰＩＶ２を提供することによって、この問題を解決する。
［１４４］キメラタンパク質、例えば異なるＰＩＶまたは非ＰＩＶ病原体の異種外部ドメインに融合させた、ＨＰＩＶ２ベクターに特異的な細胞質テールおよび／または膜貫通ドメインを有する免疫原性糖タンパク質を発現する本発明のキメラＨＰＩＶ２を構築して、異種病原体に対する免疫応答を誘発する融合タンパク質を提供することもまた可能である。例えば、ＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３ ＨＮまたはＦ糖タンパク質由来の糖タンパク質外部ドメインをコードする異種ゲノムセグメントを、対応するＨＰＩＶ２ ＨＮまたはＦ糖タンパク質細胞質および膜貫通ドメインをコードするゲノムセグメントと連結して、ＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３に対する免疫応答を誘発するＨＰＩＶ２−１またはＨＩＰＶ２−３キメラ糖タンパク質を形成することも可能である。
［１４５］簡潔には、キメラ糖タンパク質を発現する本発明のＨＰＩＶ２は、主要ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオカプシド・リンタンパク質（Ｐ）、巨大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、およびキメラ糖タンパク質をコードするよう修飾されているＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムを含んでなる。キメラ糖タンパク質は、抗原的に別個の第二のＨＰＩＶの１以上の異種抗原性ドメイン、断片、またはエピトープを取り込む。好ましくは、これは、１以上の抗原性ドメイン、断片、またはエピトープをコードする第二のＨＰＩＶの１以上の異種ゲノムセグメントのＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノム内の置換によって達成され、これによって、ゲノムまたはアンチゲノムは、親ベクターウイルスとは抗原的に別個のキメラ糖タンパク質をコードする。
［１４６］より詳細な側面において、単数または複数の異種ゲノムセグメントは、好ましくは、糖タンパク質外部ドメインまたはその免疫原性部分またはエピトープをコードし、そして場合によって、異種または「ドナー」糖タンパク質の他の部分、例えばベクターゲノムまたはアンチゲノムの対応物糖タンパク質外部ドメインおよび膜貫通ドメインを置換した、外部ドメインおよび膜貫通領域両方を含む。この背景の好ましいキメラ糖タンパク質は、ＨＰＩＶ ＨＮおよび／またはＦ糖タンパク質から選択されることも可能であり、そしてベクターゲノムまたはアンチゲノムは、多数のキメラ糖タンパク質をコードするよう修飾されることも可能である。好ましい態様において、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、部分的ゲノムまたはアンチゲノムであり、そして抗原的に別個の第二のＨＰＩＶは、ＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３いずれかである。１つの典型的な態様において、ＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３ ＨＮおよびＦ糖タンパク質の糖タンパク質外部ドメイン（単数または複数）は、どちらも、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムの対応するＨＮおよびＦ糖タンパク質外部ドメインを置換する。別の典型的な態様において、ＨＮおよび／またはＦ糖タンパク質の一方または両方のＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３外部ドメインおよび膜貫通領域を、１以上の対応するＨＰＩＶ２細胞質テール領域に融合させて、キメラ糖タンパク質を形成する。本発明のこれらの側面に関するさらなる詳細は、本明細書に援用される、Ｔａｏらによって１９９９年１２月１０日に出願された米国特許出願第０９／４５９，０６２号に提供される。
［１４７］本明細書において、用語「遺伝子」は、一般的に、対象ゲノム、例えばＨＰＩＶ２ゲノムの一部を指し、ｍＲＮＡをコードし、そして典型的には、遺伝子開始（ＧＳ）シグナルの上流端で始まり、そして遺伝子終止（ＧＥ）シグナルの下流端で終わる。用語、遺伝子は、また、特にＣタンパク質などのタンパク質が、ユニークなｍＲＮＡからよりもむしろさらなるＯＲＦから発現される場合、用語「翻訳オープンリーディングフレーム」、またはＯＲＦと交換可能である。すべてのＰＩＶのウイルスゲノムはまた、ウイルス複製および転写に必要なプロモーターの一部を所持する遺伝子外リーダーおよびトレーラー領域とともに、非コード領域および遺伝子間領域も含有する。転写は３’端で開始し、そして遺伝子境界に見られる短い保存されるモチーフにガイドされる、一連の停止−開始機構によって進行する。各遺伝子の上流端は、それぞれのｍＲＮＡの開始を指示する、遺伝子開始（ＧＳ）シグナルを含有する。各遺伝子の下流末端は、ポリアデニル化および終結を指示する遺伝子終止（ＧＥ）モチーフを含有する。
［１４８］本発明のキメラＨＰＩＶ２ウイルスを構築するため、１以上のＰＩＶ遺伝子またはゲノムセグメントを全体としてまたは部分的に欠失させるか、挿入するか、または置換することも可能である。これは、部分的または完全欠失、挿入および置換が、１以上のＰＩＶ遺伝子またはゲノムセグメントいずれかのオープンリーディングフレームおよび／またはシス作用制御配列を含むことも可能であることを意味する。「ゲノムセグメント」によって、ＰＩＶゲノム由来のいかなる長さの連続するヌクレオチドも意味し、これはＯＲＦ、遺伝子、または遺伝子外領域、あるいはその組み合わせの一部であることも可能である。対象ゲノムセグメントが抗原決定基をコードする場合、ゲノムセグメントは、哺乳動物宿主において、体液性免疫応答または細胞仲介免疫応答を誘発可能な、少なくとも１つの免疫原性エピトープをコードする。ゲノムセグメントはまた、免疫原性断片またはタンパク質ドメインもコードすることも可能である。他の側面において、ドナーゲノムセグメントは、多数の免疫原性ドメインまたはエピトープをコードすることも可能であり、これには、多数の、反復するまたは異なる免疫原性ドメインまたはエピトープを含んでなる、組換えによって合成された配列が含まれる。
［１４９］本発明のこれらの側面内で使用するための異種ウイルスの典型的なゲノム配列が、ヒトＰＩＶ３株ＪＳ（本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｚ１１５７５）およびＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ（本明細書に援用されるＧａｌｉｎｓｋｉ Ｍ．Ｓ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｄ．Ｗ．（監修）Ｔｈｅ Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ中，ｐｐ．５３７−５６８，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）；ＨＰＩＶ１／Ｗａｓｈ６４（本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ４５７１０２）；ウシＰＩＶ３（ＢＰＩＶ３）株９１０Ｎ（本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｄ８０４８７）；ＢＰＩＶ３ Ｋａｎｓａｓ（本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１７８６５４）；ＢＰＩＶ輸送熱（本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１７８６５５）；ＲＳＶ Ａ２（本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０３５００６）；およびｈＭＰＶ（本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ３７１３３７）に関して記載されてきている。
［１５０］本発明の好ましい態様において、キメラＨＰＩＶ２は、ヒトＰＩＶ、またはＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２および／またはＨＰＩＶ３を含む多数のヒトＰＩＶの１以上の主要抗原決定基を所持する。これらの好ましい候補は、１以上の選択されるＨＰＩＶに対して、ヒトにおいて有効な免疫応答を誘発する。上述のように、ＨＰＩＶに対して免疫応答を誘発する抗原決定基（単数または複数）は、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムにコードされることも可能であるし、あるいは異種遺伝子または遺伝子セグメントとして、ＰＩＶベクターゲノムまたはアンチゲノム内に挿入されるかまたはこれらに連結されることも可能である。ヒトＰＩＶの主要防御抗原は、ＨＮ糖タンパク質およびＦ糖タンパク質である。しかし、すべてのＰＩＶ遺伝子は、例えばＣＴＬエピトープとして、こうした抗原決定基をコードしうる内部タンパク質遺伝子を含む、関心が持たれる抗原決定基をコードする候補である。
［１５１］本発明の好ましいキメラＨＰＩＶ２候補ウイルスは、複数のＨＰＩＶの各々由来の、またはＨＰＩＶおよび非ＰＩＶ病原体由来の１以上の主要抗原決定基を所持する。こうして構築されたキメラＨＰＩＶ２ウイルスには、同一のまたは異種（例えばＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３）ＰＩＶの抗原決定基（単数または複数）をコードする１以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントが含まれる。これらの構築物および他の構築物は、ヒトにおいて、１以上のＨＰＩＶに対する単一特異性または多特異性免疫応答いずれかを誘発するキメラＰＩＶを生じる。本発明のさらなる詳細な側面が、各々、本明細書に援用される、米国特許出願第０９／０８３，７９３号、１９９８年５月２２日出願；米国特許出願第０９／４５８，８１３号、１９９９年１２月１０日出願；米国特許出願第０９／４５９，０６２号、１９９９年１２月１０日出願；米国仮出願第６０／０４７，５７５号、１９９７年５月２３日出願（国際公報第ＷＯ ９８／５３０７８号に対応する）、米国仮出願第６０／０５９，３８５号、１９９７年９月１９日出願；米国仮出願第６０／１７０，１９５号、１９９９年１２月１０日出願；および米国特許仮出願第０９／７３３，６９２号、２０００年１２月８日出願（国際公報第ＷＯ ０１／４２４４５Ａ２号に対応する）に提供される。
［１５２］本発明の他の典型的な側面において、キメラＨＰＩＶ２は、非ＰＩＶ病原体、例えば麻疹ウイルスの１以上の主要抗原決定基を発現するよう修飾されたＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムを取り込む。本発明の方法は、一般的に、キメラＨＰＩＶ２候補内への、広い範囲のさらなる病原体由来の抗原決定基の取り込みに適応可能である。これに関連して、本発明はまた、他の病原体の中でも、亜群Ａおよび亜群Ｂ呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＨＭＰＶ、麻疹ウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、１型および２型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、およびインフルエンザウイルスに対する候補の開発も提供する。本発明の方法にしたがって、免疫原性組成物を開発する標的としうる病原体には、ウイルスおよび細菌病原体とともに、原生動物および多細胞病原体が含まれる。この背景において、本発明のキメラＨＰＩＶ２内に取り込むための、多くの重要なヒト病原体由来の有用な抗原決定基が知られるか、または容易に同定可能である。したがって、前述の典型的な病原体に関して、主要な抗原が同定されてきており、これらには、麻疹ウイルスＨＡおよびＦタンパク質；ＲＳＶのＦ、Ｇ、ＳＨおよびＭ２タンパク質、流行性耳下腺炎ウイルスＨＮおよびＦタンパク質、ヒト・パピローマウイルスＬ１タンパク質、１型または２型ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０タンパク質、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ、およびｇＭタンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、ヒト・メタニューモウイルスＦおよびＧタンパク質、エプスタイン・バーウイルスｇｐ３５０タンパク質；フィロウイルスＧタンパク質、ブンヤウイルスＧタンパク質、フラビウイルスＥおよびＮＳ１タンパク質、並びにアルファウイルスＥタンパク質が含まれる。これらの主要な抗原とともに、列挙される病原体および他のものに関して当該技術分野に知られる他の抗原は、全長タンパク質およびその構成要素抗原ドメイン、断片およびエピトープを含む、多くの抗原決定基が同定され、マッピングされ、そしてそれぞれの免疫原性活性に関して性質決定される程度に、よく性質決定されている。
［１５３］本発明内で使用するための多様な病原体の主要抗原を同定し、そして性質決定する、多くの典型的なマッピング研究の中で、ＨＰＩＶ３の赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子に向けられるエピトープマッピング研究がある（本明細書に援用されるｖａｎ Ｗｙｋｅ Ｃｏｅｌｉｎｇｈら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１：１４７３−１４７７，１９８７）。この報告は、ＨＮタンパク質に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）であって、ノイラミニダーゼ、赤血球凝集、または両方の活性を阻害する、前記モノクローナル抗体を用いることによって、ＨＰＩＶ３変異体の１６の抗原変異体の詳細な抗原構造解析を提供する。ＨＮ遺伝子の単一点突然変異を所持する各変異体は、ＨＮタンパク質の単一アミノ酸置換をコードする。ＨＮタンパク質の操作上のマップおよびトポグラフィーのマップは、置換の相対的な位置とよく相関した。ＨＮタンパク質のコンピュータが補助する解析は、ランダム親水性コイル構造によって相互連結された、主に疎水性βシートで構成される二次構造を予測した。ＨＮエピトープは予測されるコイル領域に位置した。ウイルスのノイラミニダーゼ活性を阻害するＭＡｂに認識されるエピトープは、いくつかのパラミクソウイルスＨＮタンパク質の中に構造的に保存されるようであり、そしてＨＮ分子のシアル酸結合部位に相当する可能性がある領域に位置した。
［１５４］慣用的な抗原性マッピング法を使用するこの典型的な研究は、ＨＮエピトープの完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）に重要な単一のアミノ酸を同定した。これらのエピトープの大部分は、Ｎ末端で係留されるタンパク質に関して予測されるように、分子のＣ末端側に位置する（Ｅｌａｎｇｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ５７：４８１−４８９，１９８６）。先に公表された、ＰＩＶ３ ＨＮの操作上のマップおよびトポグラフィーのマップは、使用したＭＡｂが、第三の部位（Ｃ）によって部分的に架橋される２つのトポグラフィー的に分離される部位（ＡおよびＢ）へと編成される６つの別個のエピトープ群（Ｉ〜ＶＩ）を認識することを示した。これらのエピトープ群は、単独でまたは多様な組み合わせで、本発明のキメラＨＰＩＶ２ウイルス内に取り込まれることも可能な、有用な抗原決定基の候補に相当する（各々、本明細書に援用される、Ｃｏｅｌｉｎｇｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４３：５６９−５８２，１９８５；Ｃｏｅｌｉｎｇｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６２：１３７−１４３，１９８８；Ｒａｙら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １４８：２３２−２３６，１９８６；Ｒｙｄｂｅｃｋら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ６７：１５３１−１５４２， １９８６もまた参照されたい）。
［１５５］ｖａｎ Ｗｙｋｅ Ｃｏｅｌｉｎｇｈら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６３：３７５−３８２，１９８９）によるさらなる研究によって、本発明内で使用するためのＰＩＶ抗原決定基の選択に関連するさらなる情報が提供される。この研究において、２６のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）（１４の中和抗体および１２の非中和抗体）を用いて、ＨＰＩＶ３の融合（Ｆ）糖タンパク質の抗原構造、生物学的特性、および天然変異を調べた。実験室で選択した抗原変異体およびＰＩＶ３臨床単離体の解析によって、ＭＡｂ団が、少なくとも２０のエピトープを認識し、そのうち１４が中和に関与することが示された。競合結合アッセイによって、１４の中和エピトープが３つの重複しない重要な抗原領域（Ａ、Ｂ、およびＣ）および１つの架橋部位（ＡＢ）へと編成され、そして６つの非中和エピトープが４つの部位（Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）を形成することが確認された。中和ＭＡｂの大部分は、非相互競合結合反応に関与し、これによって、これらが他の中和エピトープにおけるコンホメーション変化を誘導することが示唆された。
［１５６］呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）において、本発明内で使用するための他の抗原決定基が同定され、そして性質決定されている。例えば、本明細書に援用されるＢｅｅｌｅｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６３：２９４１−２９５０，１９８９は、ＲＳＶのＡ２株の融合糖タンパク質に特異的な１８の中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を使用して、ＲＳＶ中和および融合に関与するエピトープの詳細なトポロジーマップおよび操作上のマップを構築する。競合結合アッセイによって、３つの重複しない抗原領域（Ａ、Ｂ、およびＣ）および１つの架橋部位（ＡＢ）が同定された。１３のＭＡｂ耐性突然変異体（ＭＡＲＭ）を選択し、そしてＭＡｂとＭＡＲＭまたはＲＳＶ臨床株いずれかとの中和パターンによって、最小限１６のエピトープが同定された。部位ＡおよびＡＢエピトープの６つに対する抗体を用いて選択されたＭＡＲＭは、小プラーク表現型を示し、これは、Ｆ分子の生物学的活性領域の改変と一致する。ＭＡＲＭの解析はまた、これらの中和エピトープが、トポグラフィーとして別個であるが、コンホメーションとして相互依存する、ユニークな生物学的特性および免疫学的特性を持つ領域を占めることも示した。次いで、１８の抗Ｆ ＭＡｂを用いた交差中和アッセイにおいて、２３の臨床的単離体（１８の亜群Ａおよび５つの亜群Ｂ）を用いることによって、Ｆエピトープの抗原変動を調べた。この解析によって、該分子上の定常領域、可変領域、および超可変領域が同定され、そしてＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の中和エピトープにおける抗原変動は、非累積遺伝子不均一性の結果であることが示された。１６のエピトープのうち８つが、２３の亜群Ａまたは亜群Ｂ臨床単離体のすべてかまたは１つをのぞくすべてに見られた。これらの抗原決定基は、全長タンパク質およびその構成要素抗原性ドメイン、断片およびエピトープを含めて、すべて、上述のような新規免疫応答を誘発する、本発明のキメラＰＩＶ内に組み込む、有用な候補に相当する。（各々、本明細書に援用される、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １５１：６２６−６３３，１９８５；Ｃｏｅｌｉｎｇｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６３：３７５−３８２，１９８９；Ｆｅｎｎｅｒら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：３３５−３４０，１９８６；Ｆｅｒｎｉｅら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １７１：２６６−２７１，１９８２；Ｓａｔｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ６６：１３９７−１４０９，１９８５；Ｗａｌｓｈら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ６７：５０５−５１３，１９８６、およびＯｌｍｓｔｅｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６３：４１１−４２０，１９８９もまた参照されたい）。
［１５７］異種ＰＩＶおよび非ＰＩＶ病原体の抗原決定基を発現するため、本発明は多くの方法および構築物を提供する。特定の詳細な態様において、抗原性タンパク質をコードする遺伝子（例えば麻疹ウイルスＨＡ遺伝子）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでなる転写単位を、多様な位で、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加して、典型的なキメラＰＩＶ１／麻疹候補を生じる。典型的な態様において、キメラＨＰＩＶ２ウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）由来の防御抗原をコードする異種ヌクレオチド配列を取り込んで、感染性弱毒化候補を産生するように操作される。ＲＳＶ ｃＤＮＡのクローニングおよび本明細書に示す本発明の側面に関連する他の開示は、各々、すべての目的のため、完全に本明細書に援用される、国際公報ＷＯ９７／１２０３２号、０４／０３／９７公表、および優先米国仮特許出願第６０／００７，０８３号、１９９５年９月２７日出願に対応する、米国特許出願第０８／７２０，１３２号、１９９６年９月２７日出願；米国仮特許出願第６０／０２１，７７３号、１９９６年７月１５日出願；米国仮特許出願第６０／０４６，１４１号、１９９７年５月９日出願；米国仮特許出願第６０／０４７，６３４号、１９９７年５月２３日出願；国際公報第ＷＯ ９８／０２５３０号、１９９８年１月２２日公表に対応する米国特許出願第０８／８９２，４０３号、１９９７年７月１５日出願；国際公報第ＷＯ ００／６１６１１号、２０００年１０月１９日公表、および優先米国仮特許出願第６０／１２９，００６号、１９９９年４月１３日出願に対応する、米国特許出願第０９／２９１，８９４号、１９９９年４月１３日出願；国際公報第ＷＯ０１／０４３３５号、２００１年１月１８日公表、並びに優先米国特許出願第６０／１２９，００６号、１９９９年４月１３日出願、第６０／１４３，０９７号、１９９９年７月９日出願および第６０／１４３，１３２号、１９９９年７月９日出願に対応する米国特許出願第０９／６０２，２１２号、２０００年６月２３日出願；国際公報第ＷＯ ００／６１７３７号、２０００年１０月１９日公表；Ｃｏｌｌｉｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９２：１１５６３−１１５６７，１９９５；Ｂｕｋｒｅｙｅｖら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：６６３４−４１，１９９６，Ｊｕｈａｓｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７１：５８１４−５８１９，１９９７；Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７；Ｈｅら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３７：２４９−２６０，１９９７；Ｂａｒｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７１：１２６５−１２７１，１９９７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４７：２３２−９，１９９８ａ；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：４４６７−４４７１，１９９８ｂ；Ｊｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２５１：２０６−２１４，１９９８；およびＷｈｉｔｅｈｅａｄら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３：３４３８−３４４２，１９９９、およびＢｕｋｒｅｙｅｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６：２３６７−７２，１９９９に提供される。本明細書に援用されるかまたは示される他の報告および考察は、本発明内で有用なＲＳＶ抗原決定基を同定し、そして性質決定する。
［１５８］１以上のＲＳＶ抗原決定基を取り込むＰＩＶキメラは、好ましくは、ＨＰＩＶ２ベクターゲノムまたはアンチゲノムを、抗原性ＲＳＶ糖タンパク質、タンパク質ドメイン（例えば糖タンパク質外部ドメイン）または１以上の免疫原性エピトープをコードする異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせて含んでなる。１つの態様において、ＲＳＶ Ｆおよび／またはＧ遺伝子由来の１以上の遺伝子またはゲノムセグメントを、ベクターゲノムまたはアンチゲノムと組み合わせて、キメラＨＰＩＶ２候補を形成する。これらの構築物の特定のものは、キメラタンパク質、例えばＲＳＶの外部ドメインに融合されたＨＰＩＶ２の細胞質テールおよび／または膜貫通ドメインを有する融合タンパク質を発現して、場合によってＨＰＩＶ２およびＲＳＶ両方に対する多価免疫応答を誘発する、新規弱毒化ウイルスを生じるであろう。
［１５９］ＲＳＶおよびＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、およびＨＰＩＶ３の疫学を考慮すると、あらかじめ決定された経時的なスケジュールで、本発明の免疫原性組成物を投与することが望ましい可能性もある。ＲＳＶおよびＨＰＩＶ３は、生後４ヶ月以内に、深刻な疾病を引き起こし、一方、ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２に引き起こされる疾病の大部分は、６ヶ月齢以降に引き起こされる（各々、本明細書に援用される、Ｃｈａｎｏｃｋら，Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ中，Ｋｎｉｐｅら（監修），ｐ．１３４１−１３７９，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１；Ｃｏｌｌｉｎｓら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ中，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１２０５−１２４３，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６；Ｒｅｅｄら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １７５：８０７−１３，１９９７）。したがって、本発明の特定の経時的免疫プロトコルは、ＨＰＩＶ３および／またはＲＳＶに対する免疫応答を誘発する、本明細書記載の免疫原性組成物を（組み合わせ免疫原性組成物として）、生後初期に２回以上、最初の用量は１ヶ月齢以前に、続いて約４ヶ月齢および６ヶ月齢でＨＰＩＶ１および／またはＨＰＩＶ２に対する免疫原性組成物を投与することを伴う。
［１６０］したがって、本発明は、多数のＰＩＶおよび／またはＰＩＶおよび非ＰＩＶ病原体を含む、多数の病原体に対する新規組み合わせ免疫原性組成物および協調免疫プロトコルを提供する。これらの方法および配合物は、効率的に、ＲＳＶおよびＰＩＶ３に対する初期免疫を標的とする。１つの好ましい免疫順序は、早くも１ヶ月齢（例えば１ヶ月齢および２ヶ月齢）に、ＲＳＶおよびＰＩＶ３に対する１以上の生弱毒化免疫原性組成物を使用し、その後、４ヶ月齢および６ヶ月齢に二価ＰＩＶ１およびＰＩＶ２免疫原性組成物を使用する。したがって、本発明の方法を使用して、１以上のキメラＰＩＶ候補を含む多数のＰＩＶ免疫原性組成物を、協調して、例えば混合物中で同時に、または定義される時間的順序で（例えば毎日または毎週の順序で）別個に投与することが望ましく、ここで、各ウイルスは、好ましくは、異なる異種防御抗原を発現する。こうした協調／経時的免疫戦略は、多数のウイルス呼吸病原体に対する二次抗体反応を誘導可能であり、３つのＰＩＶウイルスおよび他の病原体の各々に対して乳児期初期に免疫する必要性に駆られて、非常に強力で非常に柔軟な免疫措置を提供する。
［１６１］本発明にしたがった他の経時的免疫は、麻疹などの異種病原体を標的とする抗体を高力価で誘導することを可能にする。１つの態様において、幼い乳児（例えば２ヶ月齢〜４ヶ月齢の乳児）を、弱毒化ＨＰＩＶ３またはキメラＨＰＩＶ２−３（ＨＰＩＶ３抗原決定基（単数または複数）を取り込む）、並びに／あるいはＨＰＩＶ３および／または異種病原体に対する免疫応答を誘発するＨＰＩＶ３ウイルス（例えば麻疹ウイルスＨＡタンパク質を発現し、そしてまたＨＰＩＶ３に対する免疫応答を誘発するよう適応したキメラＨＰＩＶ２またはＨＰＩＶ３ウイルス）で免疫する。続いて、例えば４ヶ月齢で、乳児を再び、しかし異なる二次ベクター構築物、例えばベクターの機能する偏性（ｏｂｌｉｇａｔｅ）糖タンパク質として、麻疹ウイルスＨＡ遺伝子およびＨＰＩＶ２抗原決定基を発現する組換えＨＰＩＶ２ウイルスで免疫する。第一の免疫に続いて、レシピエントは、ＰＩＶ３ ＨＮタンパク質およびＦタンパク質両方に対する一次抗体反応、そして麻疹ウイルスＨＡ抗原に対する一次抗体反応を誘発するが、ＰＩＶ２ ＨＮタンパク質およびＦタンパク質に対しては誘発しないであろう。麻疹ウイルスＨＡを発現するｒＨＰＩＶ２での二次免疫に際して、ＰＩＶ２ ＨＮタンパク質およびＦタンパク質に対する抗体が存在しないため、レシピエントは、免疫原性組成物に容易に感染し、そしてＰＩＶ２ ＨＮ防御抗原およびＦ防御抗原に対する一次抗体反応、並びに異種麻疹ウイルスＨＡタンパク質に対する高力価の二次抗体反応両方を発展させるであろう。本明細書に開示する１以上のキメラウイルスによって、最初のそして次いで二次の、麻疹または別の非ＰＩＶ病原体に対する、高力価免疫原性応答の刺激と同時に、ＨＰＩＶ３そして次いでＨＰＩＶ２に対して免疫が経時的に誘発される、同様の経時的免疫スケジュールを発展させることも可能である。この経時的免疫戦略は、好ましくは、一次ベクターおよび二次ベクターとして、異なる血清型のＰＩＶを使用して、単一の血清型のみを持つベクターの有用性を最終的に制限する要因である、一次ベクターに対して誘導される免疫を効果的に回避する。上述のようなｒＨＰＩＶ３およびｒＨＰＩＶ３−１ウイルス候補での経時的免疫の成功が報告されてきている（本明細書に援用されるＴａｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１１００−８，１９９９）が、ＨＰＩＶ１曝露に対するｒＨＰＩＶ３−１の免疫原性が減少する制限を伴った。本発明においては、ブーストウイルスの主鎖が一次ウイルスまたはベクターとは抗原的に関連しないため、この重要な制限が克服される。
［１６２］さらに、本発明のこれらの側面にしたがって、典型的な協調免疫プロトコルは、例えば１ヶ月齢、２ヶ月齢または４ヶ月齢に、一次免疫工程で同時に（例えば多特異性混合物中）投与される２、３、４、および６までまたはそれより多い別個のＨＰＩＶウイルスを取り込むことも可能である。例えば、ＲＳＶ亜群ＡのＧタンパク質、ＲＳＶ亜群ＡのＦタンパク質、ＲＳＶ亜群ＢのＧタンパク質、ＲＳＶ亜群ＢのＦタンパク質、ＨＭＰＶのＧタンパク質、ＨＭＰＶのＦタンパク質、麻疹ウイルスのＨＡタンパク質、および／または麻疹ウイルスのＦタンパク質から選択される、１以上の抗原決定基（すなわち全抗原、免疫原性ドメイン、またはエピトープ）を別個に発現する、ＨＰＩＶ２に基づく２以上のウイルスを投与することも可能である。これらの同一のＨＰＩＶ２に基づく構築物の協調ブースト投与を、２ヶ月齢で反復することも可能である。続いて、例えば４ヶ月齢で、２〜６またはそれより多い、抗原的に別個の（ベクター抗原特異性に関して）ＨＰＩＶ２に基づく生弱毒化ウイルスを二次免疫工程で投与することも可能である。例えば、二次免疫は、亜群Ａ由来のＲＳＶ Ｇ、亜群Ａ由来のＲＳＶ Ｆ、亜群Ｂ由来のＲＳＶ Ｆ、亜群Ｂ由来のＲＳＶ Ｇ、麻疹ウイルスＨＡ、および／または麻疹ウイルスＦ、あるいはこれらのタンパク質の組み合わせいずれか由来の抗原決定基を集合的に発現する、多数のＨＰＩＶ２構築物を含有する、混合物または多数の配合物の同時投与を伴うことも可能である。この二次免疫は、異種ＲＳＶおよび麻疹ウイルスタンパク質またはその抗原決定基（単数または複数）各々に対する免疫において、ブーストを提供する。６ヶ月齢で、亜群Ａ由来のＲＳＶ Ｇ、亜群Ａ由来のＲＳＶ Ｆ、亜群Ｂ由来のＲＳＶ Ｇ、亜群Ｂ由来のＲＳＶ Ｆ、ＨＭＰＶのＧタンパク質、ＨＭＰＶのＦタンパク質、麻疹ウイルスＨＡ、および／または麻疹ウイルスＦ、あるいはその抗原決定基を、別個にまたは集合的に発現する、１〜６またはそれより多い別個の生弱毒化ＨＰＩＶ２−１またはＨＰＩＶ２−３のベクターに基づく組換え体の投与を伴う三次免疫工程を協調して投与することも可能である。場合によって、免疫プロトコルのこの工程で、ｒＨＰＩＶ３およびｒＨＰＩＶ２免疫原性組成物を、ブースト配合物中で投与することも可能である。この方式で、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＲＳＶ Ａ、ＲＳＶ Ｂ、ＨＭＰＶ、および麻疹ウイルスに対する二次抗体の強い免疫特性を、乳児期の最初の６ヶ月以内にすべて誘導する。こうした協調／経時的免疫戦略は、多数のウイルス呼吸病原体に対する二次抗体反応を誘導可能であり、乳児期初期において、３つのＰＩＶウイルスおよび他の病原体の各々に対して免疫する必要性に駆られて、非常に強力で、そして非常に柔軟な免疫措置を提供する。
［１６３］本発明はしたがって、ベクターに基づく免疫原性組成物の開発に対する以前のアプローチに特有の困難を克服し、そして多様なヒト病原体に対して、生後１年の間に、乳児を免疫するユニークな機会を提供する。生弱毒化ＰＩＶ免疫原性組成物を開発する先の研究は、予期せぬことに、ｒＰＩＶ、並びにその弱毒化誘導体およびキメラ誘導体が、多様なヒト病原体に対する免疫原性組成物として外来タンパク質を発現するベクターとして、非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスの中で、独自に適したものにする特性を有することを示す。当業者は、モデル非分節マイナス鎖ウイルスよりも実質的に増殖が劣る傾向にあり、そして典型的には分子研究に関して過小評価されてきたヒトＰＩＶが、ベクターとして非常に好ましい特性を有すると立証されることは予測しなかったであろう。また、これらの免疫原性組成物の鼻内投与経路が、ベクターおよび発現される異種抗原両方に対して頑強な局所および全身性免疫応答を刺激する、非常に効率的な手段であると立証されたことも、驚くべきことである。さらに、この経路は、気道または別の箇所を感染させる異種病原体に対する免疫のさらなる利点を提供する。
［１６４］本発明は、麻疹ウイルスおよび他の微生物病原体に対して、幼い乳児を免疫する先の試みに勝る、大きな利点を提供する。まず、麻疹ウイルスなどの異種病原体の単数または複数の防御抗原を挿入されているＨＰＩＶ２組換えベクターは、１以上の弱毒化突然変異または非常に幼い血清陰性または血清陽性のヒト乳児の気道に対して、ウイルスを弱毒化させる他の修飾の取り込みによって、細かく調整された方式で、弱毒化されることも可能である。以前の臨床的評価および実施の広範に及ぶ歴史（例えば、本明細書に援用されるＫａｒｒｏｎら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ． １５：６５０−６５４，１９９６；Ｋａｒｒｏｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １７１：１１０７−１１１４，１９９５ａ；Ｋａｒｒｏｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １７２：１４４５−１４５０，１９９５を参照されたい）は、非常に幼いヒト乳児において、外来防御抗原を所持するこれらの組換え体の派生物の評価を非常に促進する。
［１６５］本発明のさらに別の利点は、異種配列を所持するキメラＨＰＩＶ２が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に複製して、免疫原性組成物の大規模産生を可能にすることである。これは、外来遺伝子の挿入によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害されうる、いくつかの一本鎖マイナスセンスＲＮＡウイルスの複製とは対照的である（Ｂｕｋｒｅｙｅｖら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：６６３４−４１，１９９６）。また、各々、ヒトにおいて深刻な疾患を引き起こし、そしてしたがってベクターとして同時に働いて、そして免疫応答を誘発することも可能な、ＨＰＩＶの３つの抗原性血清型が存在することによって、各々、同一の外来タンパク質を所持するＨＰＩＶの抗原的に別個の変異体を用いて、乳児を経時的に免疫する、ユニークな機会が提示される。この方式で、経時的免疫は、外来タンパク質への一次免疫応答の発展を可能にし、該外来タンパク質を、やはり同一のまたは異なる、単数または複数の外来タンパク質、すなわち麻疹ウイルスまたは別の微生物病原体の防御抗原も所持する、抗原的に別個のＨＰＩＶでの続く感染中にブーストすることも可能である。相同ＨＰＩＶベクターの再投与はまた、ヒトにおける多数の再感染を引き起こす能力が一般的でなく、ＨＰＩＶに特徴的な特質であるため、ＨＰＩＶおよび外来抗原両方に対する応答もブーストするであろう（本明細書に援用される、Ｃｈａｎｏｃｋら， Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ．中，ｐ．１３４１−１３７９，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ， Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｄ．Ｅ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｒ．Ａ．Ｌａｍｂ，Ｍ．Ａ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ，およびＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ（監修）Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ中，第４版，Ｖｏｌ．１，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１）。
［１６６］本発明の別の利点は、ＨＰＩＶ２ベクターへの遺伝子単位の導入が、弱毒化ウイルス産生のため、いくつかの非常に望ましい効果を有することである。まず、例えば麻疹ウイルスのＨＡ、あるいはＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３のＨＮを発現する遺伝子単位の挿入が、ＨＰＩＶ２ベクターに対して宿主範囲表現型を特定することが可能である場合、生じるＨＰＩＶ２ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に複製するが、上気道および下気道両方において、ｉｎ ｖｉｖｏの複製が制限されている。したがって、ＨＰＩＶ２ベクターの弱毒化因子として、ウイルス防御抗原を発現する遺伝子単位の挿入は、本発明の生弱毒化ウイルスの望ましい特性である。
［１６７］ＨＰＩＶ２ベクター系は、モノネガウイルス目の一本鎖マイナスセンスウイルスの他のメンバーに勝る、ユニークな利点を有する。まず、ベクターとして使用されてきた大部分の他のモノネガウイルスは、ヒト病原体に由来していない（例えばネズミＰＩＶ１（センダイウイルス）（Ｓａｋａｉら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４５６：２２１−６， １９９９）、ウシ病原体である水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：４７０４−１１，１９９８）、およびイヌＰＩＶ２（ＳＶ５）（Ｈｅら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３７：２４９−６０，１９９７））。これらの非ヒトウイルスに関しては、ベクター主鎖に存在する抗原によって、いかなるヒトウイルスに対しても、ほとんどまたは弱くしか免疫が得られないであろう。したがって、ヒト病原体の規定数外の遺伝子を発現する非ヒトウイルスベクターは、単一のヒト病原体に対してのみ、耐性を誘導するであろう。さらに、ベクターとしてＳＶ５ウイルス、狂犬病ウイルス、またはセンダイウイルスなどのウイルスを使用すると、そうでなければ人生のうちで出会わなかった可能性があるウイルスに、被験者が曝露されるであろう。
［１６８］ＨＰＩＶベクター系の重要でそして特異的な利点は、天然感染を模倣する、その好ましい鼻内投与経路が、粘膜免疫および全身免疫両方を誘導し、そして乳児に存在する母性由来血清ＩｇＧの中和効果および免疫抑制効果を減少させるであろうことである。これらの同じ利点は、例えばＲＳＶをベクターとして用いた場合も生じうるが、我々は、ＲＳＶ複製がおよそ５００ｂｐを越える挿入物によって強く阻害されることを見出した（Ｂｕｋｒｅｙｅｖら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：２３６７−７２，１９９９）。対照的に、本明細書に記載するように、ＨＰＩＶ２は、しばしば、いくつかの大きい遺伝子挿入物に適応するであろう。組換えＲＳＶが、大きな挿入物を所持するのには不適切である一方、組換えＰＩＶが非常に適切であるという知見は、予期せぬ結果に相当する。
［１６９］いくつかの他のウイルスベクターを鼻内投与して、ＰＩＶベクターに関して示されるのと類似の利点を得ることが可能であると提唱可能であるが、これは現在まで成功していない。例えば、ＨＰＩＶ３の防御抗原を発現するワクシニアウイルスのＭＶＡ株を、ＨＰＩＶ３に対する生弱毒化鼻内免疫原性組成物として評価した。このベクターは、細胞培養においては、非常に効率的な発現系であるように見えたが、不可解なことに、霊長類の上気道で耐性を誘導するには効果がなく（本明細書に援用されるＤｕｒｂｉｎら， Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１３２４−３０，１９９８）、そして不可解なことに、受動血清抗体の存在下で、有効な免疫応答を誘導する際に、効果がなかった（本明細書に援用されるＤｕｒｂｉｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １７９：１３４５−１３５１，１９９９）。対照的に、ＰＩＶ３およびＲＳＶ候補は、受動血清抗体の存在下であっても、非ヒト霊長類の上気道および下気道で防御性であることが見出された（各々、本明細書に援用される、Ｃｒｏｗｅら，Ｖａｃｃｉｎｅ １３：８４７−８５５，１９９５；Ｄｕｒｂｉｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ． １７９：１３４５−５１，１９９９）。
［１７０］上述のように、本発明は、ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノム内に広い範囲の改変を組換えによって産生して、望ましい表現型変化を特定する、定義される突然変異を生じることを可能にする。やはり上に示すように、定義される突然変異は、ゲノムまたはアンチゲノムのｃＤＮＡコピーに、多様な慣用的技術（例えば部位特異的突然変異誘発）によって導入可能である。本明細書に記載するように、完全ゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡを組み立てるため、ゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡ下位断片を使用することは、各領域を別個に操作可能であるという利点を有し、ここで小さいｃＤＮＡ構築物は、大きいｃＤＮＡ構築物より操作がより容易であり、そして次いで、容易に完全ｃＤＮＡに組み立て可能である。したがって、完全アンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡ、あるいは選択される下位断片を、オリゴヌクレオチドが導く突然変異誘発のテンプレートとして使用することも可能である。これは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州リッチモンド）のＭＵＴＡ−ｇｅｎ（登録商標）を用いるなど、一本鎖ファージミド型の中間体を通じた方法、またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホヤ）のＣｈａｍｅｌｅｏｎ（登録商標）突然変異誘発キットなどの、テンプレートとして直接二本鎖プラスミドを用いる方法、または関心が持たれる突然変異（単数または複数）を含有するオリゴヌクレオチドプライマーまたはテンプレートいずれかを使用するポリメラーゼ連鎖反応による方法であることも可能である。その後、突然変異下位断片を完全アンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡに組み立てることも可能である。多様な他の突然変異誘発技術が知られ、そして本発明のＰＩＶアンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡの目的の突然変異の産生に使用するため、日常的に適応させることも可能である。
［１７１］したがって、１つの例示的態様において、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なＭＵＴＡ−ｇｅｎｅ（登録商標）ファージミドｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発キットを用いることによって、突然変異を導入する。簡潔には、ＰＩＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするｃＤＮＡをプラスミドｐＴＺ１８Ｕにクローニングし、そしてＣＪ２３６細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換するのに用いた。製造者に推奨されるように、ファージミド調製を調製する。ゲノムまたはアンチゲノムの望ましい位で改変ヌクレオチドを導入することによる突然変異誘発のために、オリゴヌクレオチドを設計する。次いで、遺伝的に改変されたゲノムまたはアンチゲノムを含有するプラスミドを増幅する。
［１７２］突然変異は、単一ヌクレオチド変化から、１以上の遺伝子またはゲノムセグメントを含有する大きなｃＤＮＡセグメントの導入、欠失または置換まで多様である可能性がある。ゲノムセグメントは、構造ドメインおよび／または機能ドメイン、例えばタンパク質の細胞質ドメイン、膜貫通ドメインまたは外部ドメイン、異なるタンパク質との結合または他の生化学的相互作用を仲介する部位などの活性部位、エピトープ部位、例えば抗体結合および／または体液性免疫応答もしくは細胞仲介免疫応答を刺激する部位などに対応することも可能である。これに関連して、有用なゲノムセグメントは、タンパク質の小さい機能ドメイン、例えばエピトープ部位をコードするゲノムセグメントの場合の約１５〜３５ヌクレオチドから約５０、７５、１００、２００〜５００、および５００〜１，５００またはそれより多いヌクレオチドの範囲である。
［１７３］定義される突然変異を感染性組換えＨＰＩＶ２に導入する能力は、多くの適用を有し、ＰＩＶ病因形成機構および免疫原性機構の操作が含まれる。例えば、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬタンパク質、並びにＶ ＯＲＦの産物を含むＨＰＩＶ２タンパク質の機能を、タンパク質発現を除去するか、またはその発現レベルを減少させるか、あるいは突然変異体タンパク質を生じる突然変異を導入することによって、操作することも可能である。プロモーター、遺伝子間領域、および転写シグナルなどの、多様なゲノムＲＮＡ構造特徴を、本発明の方法および組成物内で、日常的に操作することもまた可能である。トランス作用タンパク質およびシス作用ＲＮＡ配列の効果は、例えば、ＰＩＶミニゲノムを使用する並行アッセイ（本明細書にその全体が援用されるＤｉｍｏｃｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６７：２７７２−８，１９９３）において、完全アンチゲノムｃＤＮＡを用いて、容易に測定可能であり、その救出依存状態は、複製独立感染性ウイルスにおいて回収されるには阻害性でありすぎる可能性がある突然変異体を性質決定するのに有用である。
［１７４］本発明の組換えＨＰＩＶ２内の遺伝子またはゲノムセグメントの特定の置換、挿入、欠失または再編成（例えば選択されるタンパク質またはタンパク質領域をコードするゲノムセグメント、例えば細胞質テール、膜貫通ドメインまたは外部ドメイン、エピトープ部位または領域、結合部位または領域、活性部位または活性部位を含有する領域などの置換）を、同一または異なるＰＩＶまたは他の供給源由来の、現存する「対応物」遺伝子またはゲノムセグメントに、構造的または機能的に関連するように作成する。こうした修飾は、野生型または親ＰＩＶまたは他のウイルス株に比較して、望ましい表現型変化を有する新規組換え体を生じる。例えば、この種の組換え体は、別のＰＩＶの外部ドメインに融合した１つのＰＩＶの細胞質テールおよび／または膜貫通ドメインを有するキメラタンパク質を発現しうる。この種の他の典型的な組換え体は、重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）免疫原性領域などの重複タンパク質領域を発現する。
［１７５］本明細書において、「対応物」遺伝子、ゲノムセグメント、タンパク質またはタンパク質領域は、典型的には、異種供給源由来である（例えば異なるＰＩＶ遺伝子由来であるか、または異なるＰＩＶ種または株の同一（すなわち相同またはアレル）遺伝子またはゲノムセグメントに相当する）。この背景において選択される、典型的な対応物は、全体の構造的特徴を共有し、例えば各対応物は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、外部ドメイン、結合部位または領域、エピトープ部位または領域などの匹敵するタンパク質またはタンパク質構造ドメインをコードする可能性もある。対応物ドメインおよびそのコードするゲノムセグメントは、該ドメインまたはゲノムセグメント変異体の間に共通の生物学的活性によって定義される、あるサイズ範囲および配列変動を有する種の集合を含む。
［１７６］本発明内で組換えＰＩＶを産生するため、本明細書に開示する、対応物遺伝子およびゲノムセグメントとともに他のポリヌクレオチドは、しばしば、選択されるポリヌクレオチド「参照配列」と、例えば別の選択される対応物配列と、実質的な配列同一性を共有する。本明細書において、「参照配列」は、配列比較の基準として用いられる定義される配列、例えば全長ｃＤＮＡまたは遺伝子のセグメント、あるいは完全ｃＤＮＡまたは遺伝子配列である。一般的に、参照配列は、長さ少なくとも２０ヌクレオチド、しばしば、長さ少なくとも２５ヌクレオチド、そしてしばしば少なくとも５０ヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチドは、各々（１）２つのポリヌクレオチド間で類似である配列（すなわち完全ポリヌクレオチド配列の一部）を含んでなり、そして（２）２つのポリヌクレオチド間で多様である配列をさらに含んでなることも可能であるため、２つ（以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」に渡って、２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定し、そして比較することによって、行われる。「比較ウィンドウ」は、本明細書において、少なくとも２０の隣接するヌクレオチド位の概念的セグメントを指し、ここでポリヌクレオチド配列を少なくとも２０の隣接するヌクレオチドの参照配列に比較することも可能であり、そして２つの配列を最適に並列させるため、比較ウィンドウのポリヌクレオチド配列の一部が、参照配列（付加または欠失を含まない）に比較した際、２０パーセント以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでなることも可能である。比較ウィンドウを並列させるための配列の最適並列を、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ． ２：４８２，１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３，１９７０）の相同性並列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：２４４４，１９８８）によって（各々、本明細書に援用される）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（本明細書に援用される、ウィスコンシン遺伝学ソフトウェアパッケージ・リリース７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、または視覚的検査によって、行うことも可能であり、そして多様な方法によって生成した最適並列（すなわち比較ウィンドウにわたって配列類似性の最高の割合を生じるもの）を選択する。用語「配列同一性」は、比較ウィンドウに渡って、２つのポリヌクレオチド配列が同一（すなわちヌクレオチドごとに基づいて）であることを意味する。用語「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウに渡って、２つの最適に並列させた配列を比較して、両方の配列において、同一の核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が生じる位の数を決定して、マッチした位の数を得て、マッチした位の数を比較ウィンドウにおける位の総数（すなわちウインドウサイズ）で割って、そしてその結果に１００を乗じて配列同一性パーセントを得ることによって、計算される。用語「実質的同一性」は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列の特性を示し、ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも２０ヌクレオチド位の比較ウィンドウに渡って、しばしば少なくとも２５〜５０ヌクレオチドのウィンドウに渡って、参照配列に比較した際、少なくとも８５パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５パーセントの配列同一性、より一般的には少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含んでなり、ここで配列同一性パーセントは、比較ウィンドウに渡って、全部で参照配列の２０パーセント以下の欠失または付加を含むことも可能なポリヌクレオチド配列に対して参照配列を比較することによって計算される。参照配列は、より大きい配列のサブセットであることも可能である。
［１７７］これらのポリヌクレオチド配列関係に加えて、本発明の組換えＨＰＩＶ２にコードされるタンパク質およびタンパク質領域は、典型的には、選択される参照ポリペプチドと、保存的関係を有する、すなわち実質的な配列同一性または配列類似性を有するように選択される。ポリペプチドに適用されると、用語「配列同一性」は、ペプチドが対応する位で同一のアミノ酸を共有することを意味する。用語「配列類似性」は、対応する位で、同一または類似のアミノ酸（すなわち保存的置換）を有するペプチドを意味する。用語「実質的な配列同一性」は、デフォルトギャップ荷重を用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによるなどで、最適に並列させた際、２つのペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセントの配列同一性、またはそれより高い配列同一性（例えば９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。用語「実質的類似性」は、２つのペプチド配列が、配列類似性の対応する割合を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位は、保存的アミノ酸置換によって異なる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；そしてイオウ含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。本明細書に用いる２０の天然存在アミノ酸の略語は、慣用的な使用法に従う（本明細書に援用される、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ監修，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９９１）。２０の慣用的なアミノ酸のステレオ異性体（例えばＤ−アミノ酸）、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非慣用的アミノ酸などの非天然アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドの適切な構成要素であることも可能である。非慣用的アミノ酸の例には：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。さらに、アミノ酸は、グリコシル化、リン酸化等によって修飾されることも可能である。
［１７８］本発明にしたがって、候補ウイルスを選択するため、周知の方法にしたがって、生存可能性、弱毒化および免疫原性の基準を決定する。本発明の免疫原性組成物において最も望ましいであろうウイルスは、生存可能性を維持し、安定な弱毒化表現型を有し、免疫宿主において複製を示し（たとえ、より低いレベルであっても）、そしてレシピエントにおいて、望ましい免疫応答を誘発するのに十分な、免疫応答の産生を効果的に誘発しなければならない。本発明の組換えＨＰＩＶ２ウイルスは、生存可能で、そして適切に弱毒化されているだけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝的により安定であり、免疫応答を刺激し、そしていくつかの場合、多数の修飾によって、誘発される免疫応答を拡大する、例えば異なるウイルス株または亜群に対する免疫応答を誘導するか、あるいは異なる免疫学的基礎によって仲介される応答、例えば血清免疫グロブリン、細胞性免疫等に対して分泌免疫グロブリンなどを刺激する能力を維持する。
［１７９］適切な弱毒化、表現型復帰突然変異に対する抵抗性、および免疫原性を確認する、多様な周知のモデルであり、そして一般的に許容されるｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏモデルで、本発明の組換えＨＰＩＶ２ウイルスを試験することも可能である。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは、修飾ウイルス（例えば多重弱毒化された、生物学的に得られるＰＩＶまたは組換えＰＩＶ）を、例えばウイルス複製の温度感受性、すなわちｔｓ表現型に関して、そして小プラークまたは他の望ましい表現型に関して試験する。ＰＩＶ感染の動物モデルにおいて、修飾ウイルスをさらに試験する。多様な動物モデルが記載されてきており、そして本明細書に援用される、多様な参考文献に要約される。ＰＩＶ候補の弱毒化および免疫原性活性を評価する、げっ歯類および非ヒト霊長類を含むＰＩＶモデル系が、当該技術分野に広く認められており、そしてそこから得られるデータは、ヒトにおけるＰＩＶ感染、弱毒化および免疫原性とよく相関する。
［１８０］前述の説明にしたがって、本発明はまた、免疫原性組成物で使用するための単離された感染性組換えＨＰＩＶ２もまた提供する。免疫原性組成物の構成要素である弱毒化ウイルスは、単離され、そして典型的には精製された型である。単離によって、感染個体の鼻咽頭などの、野生型ウイルスの天然環境以外にあるＰＩＶを意味する。より一般的には、「単離された」は、細胞培養または他の人工的培地の構成要素として弱毒化されたウイルスを含むことを意味し、この場合、ウイルスを、調節されたセッティングで増殖させ、そして性質決定することも可能である。例えば、本発明の弱毒化ＨＰＩＶ２を、感染細胞培養によって産生し、細胞培養から分離し、そして安定化剤に添加することも可能である。
［１８１］免疫原性組成物で使用するため、本発明にしたがって産生される組換えＨＰＩＶ２を、配合物において直接用いるか、または望ましいように、当業者に周知の凍結乾燥プロトコルを用いて凍結乾燥することも可能である。凍結乾燥ウイルスは、典型的には、約４℃で維持されるであろう。使用する準備ができたら、以下にさらに記載するように、安定化溶液、例えば生理食塩水またはＳＰＧ、Ｍｇ＋＋およびＨＥＰＥＳを含んでなる生理食塩水に、アジュバントを伴いまたは伴わず、凍結乾燥ウイルスを再構成する。
［１８２］本発明のＨＰＩＶ２に基づく免疫原性組成物は、活性成分として、本明細書に記載するように産生された、免疫原として有効な量の組換えＨＰＩＶ２を含有する。修飾ウイルスを、生理学的に許容しうるキャリアーおよび／またはアジュバントとともに、宿主に導入することも可能である。有用なキャリアーが当該技術分野に周知であり、そしてこれらには、例えば水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等が含まれる。上に言及するように、生じた水性溶液を、そのままで、または凍結乾燥して、使用のためにパッケージングすることも可能であり、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水と組み合わされる。組成物は、必要に応じて、生理学的条件に近づける、薬学的に許容しうる補助物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタン・モノラウレート、トリエタノールアミン・オレエート等を含有することも可能である。許容しうるアジュバントには、当該技術分野に周知の多くの他の適切なアジュバントの中でも、フロイントのアジュバント、ＭＰＬＴＭ（３−Ｏ−脱アセチル・モノホスホリル脂質Ａ；Ｃｏｒｉｘａ、インディアナ州ハミルトン）およびＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）が含まれる。
［１８３］エアロゾル、小滴、経口、局所または他の経路を介した、本明細書に記載するような組換えＨＰＩＶ２組成物での免疫に際して、宿主の免疫系は、ＰＩＶタンパク質、例えばＦ糖タンパク質およびＨＮ糖タンパク質に特異的な抗体を産生することによって、免疫原性組成物に応答する。本明細書に記載するように産生された組換えＨＰＩＶ２の免疫原として有効な量で免疫した結果、宿主は、少なくとも部分的にまたは完全に、標的ＰＩＶまたは非ＰＩＶ病原体による感染に免疫となるか、あるいは、特に下気道で、中程度または重度の感染の発展に対して耐性になる。
［１８４］免疫原性組成物を投与する宿主は、ＰＩＶまたは選択される非ＰＩＶ病原体による感染に感受性であり、そして免疫株の抗原に対する免疫応答を生成することが可能である、いかなる哺乳動物であることも可能である。したがって、本発明は、多様なヒト使用および獣医学的使用のための免疫原性組成物を生成する方法を提供する。
［１８５］ＰＩＶ感染に感受性であるか、またはそうでなければ感染するリスクがある宿主に、本発明の組換えＨＰＩＶ２を含有する組成物を投与して、宿主自身の免疫応答容量を増進する。こうした量は、「免疫原として有効な用量」であると定義される。この使用において、有効用量内で投与される組換えＨＰＩＶ２の正確な量は、宿主の健康状態および体重、投与様式、配合物の性質等に応じるであろうが、一般的に、宿主あたり、約１０３〜約１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）以上のウイルスの範囲であろうし、より一般的には、宿主あたり約１０４〜１０６ＰＦＵウイルスの範囲である。いかなる場合でも、配合物は、対象病原体（単数または複数）に対して宿主患者における検出可能な免疫応答を誘発するのに十分な量の本発明の修飾ＰＩＶを提供しなければならない。
［１８６］本発明にしたがって産生される組換えＨＰＩＶ２を、他のＰＩＶ血清型または株のウイルスと組み合わせて、多数のＰＩＶ血清型または株に対する望ましい免疫応答を誘発することも可能である。あるいは、本明細書に記載するように、多数の血清型または株の防御エピトープを組み合わせて、１つのウイルスになるよう操作することによって、多数のＰＩＶ血清型または株に対する免疫応答を達成することも可能である。典型的には、異なるウイルスを投与する場合、これらは混合物中にあり、そして同時に投与されるが、別個に投与することもまた、可能である。１つの株での免疫は、同一血清型または異なる血清型の異なる株に対して免疫することも可能である。
［１８７］いくつかの例において、本発明の組換えＨＰＩＶ２免疫原性組成物を、他の病原体、特に他の小児期ウイルスに対する免疫応答を誘導する免疫原性組成物と組み合わせることが望ましい可能性もある。本発明の別の側面において、本明細書に記載するように、防御抗原をコードする配列を、感染性ウイルスを産生するのに使用する組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムに取り込むことによって、組換えＨＰＩＶ２を、他の病原体、例えば呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）または麻疹ウイルスの防御抗原のベクターとして使用することも可能である。
［１８８］すべての被験者において、投与する組換えＨＰＩＶ２の正確な量、並びに投与のタイミングおよび反復は、患者の健康状態および体重、投与様式、配合物の性質等に基づいて、慣用的な方法を用いて、決定されるであろう。投薬量は、一般的に、患者あたり、約１０３〜約１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）以上のウイルスの範囲であろうし、より一般的には、患者あたり約１０４〜１０６ＰＦＵウイルスの範囲である。いかなる場合でも、例えば他の方法の中でも、赤血球凝集阻害、補体固定、プラーク中和、および／または酵素連結免疫吸着アッセイによって決定可能であるように、配合物は、抗ＰＩＶまたは他の抗病原性免疫応答を有効に刺激するかまたは誘導するのに十分な量の弱毒化免疫ＨＰＩＶ２を提供しなければならない。これに関連して、上気道疾病の徴候および症状に関してもまた、個体を監視する。チンパンジーに投与した場合のように、弱毒化ウイルスは、レシピエントの鼻咽頭において、野生型ウイルスよりもおよそ１０倍以上低いレベルで、または不完全に弱毒化されたウイルスのレベルに比較して、およそ１０倍以上低いレベルで増殖する。
［１８９］新生児および乳児において、十分なレベルの免疫を誘発するには、多数回の投与が必要である可能性もある。投与は、生後１ヶ月以内に始めなければならず、そして間隔をおいて、天然（野生型）ＰＩＶ感染に対する免疫応答を維持するのに必要とされるように、小児期の間ずっと、２ヶ月、６ヶ月、１年および２年などの間隔で行われる。同様に、再発するかまたは深刻なＰＩＶ感染に特に罹患しやすい成人、例えば医療従事者、保育所職員、幼い子供の家族メンバー、高齢で心肺機能が損なわれている個体は、免疫応答を確立し、そして／または維持するのに、多数回の免疫を必要とする可能性もある。中和分泌抗体および血清抗体の量を測定することによって、誘導される免疫のレベルを監視して、そして投薬量を調整するか、または必要に応じて免疫を反復して、望ましいレベルの免疫応答を維持することも可能である。さらに、異なるレシピエント群への投与のため、異なる候補ウイルスが示されることも可能である。例えば、サイトカインまたはＴ細胞エピトープが豊富なさらなるタンパク質を発現するよう操作されたＨＰＩＶ２は、幼児によりも成人に対して特に好適である。
［１９０］本発明にしたがって産生される、ＨＰＩＶ２に基づく免疫原性組成物を、別の亜群または株のＰＩＶの抗原を発現するウイルスと組み合わせて、多数のＰＩＶ亜群または株に対する免疫応答を誘発することも可能である。あるいは、候補ウイルスは、本明細書に記載するように、多数のＰＩＶ株または亜群の防御エピトープを取り込んで、１つのＰＩＶクローンになるよう操作されることも可能である。
［１９１］本発明の組換えＨＰＩＶ２免疫原性組成物は、個体が続いて野生型ＰＩＶに感染した際、肺炎および細気管支炎などの深刻な下気道疾患を減少させるかまたは軽減させる免疫応答の産生を誘発する。天然に循環するウイルスは、特に上気道で、感染を引き起こすことがなお可能であるが、免疫の結果、鼻炎の可能性は非常に減少する。野生型ウイルスに続いて感染すると、耐性のブーストが起こりうる。免疫後、相同（同一亜群の）野生型ウイルスを、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで中和することが可能な、宿主で生じる血清抗体および分泌抗体は、検出可能レベルである。
［１９２］本発明の好ましい組換えＨＰＩＶ候補は、天然にヒトを感染させる野生型ウイルスと比較して、非常に実質的な毒性減少を示す。大部分の免疫個体において、感染症状が生じないように、ウイルスを十分に弱毒化する。いくつかの場合、弱毒化ウイルスをなお、非免疫個体に播種することも可能である。しかし、その毒性は、免疫された宿主において、深刻な下気道感染が起こらないように、十分に抑止されている。
［１９３］組換えＨＰＩＶ２候補の弱毒化レベルは、例えば、免疫宿主の気道に存在するウイルスの量を定量化し、そして野生型ＰＩＶまたは候補株として評価された他の弱毒化ＰＩＶに産生される量と比較することによって、決定可能である。例えば、本発明の弱毒化ウイルスは、チンパンジーなどの非常に罹患しやすい宿主の上気道において、野生型ウイルスの複製レベルに比較して、例えば１０〜１０００倍少ない、より高い度合いの複製制限を有するであろう。上気道におけるウイルスの複製と関連する、鼻漏の発展をさらに減少させるため、有用な候補ウイルスは、上気道および下気道両方において、制限される複製レベルを示さなければならない。しかし、本発明の弱毒化ウイルスは、ヒトにおいて、十分に感染性で、そして免疫原性であり、免疫個体において、望ましい免疫応答を誘発しなければならない。感染宿主の鼻咽頭において、ＰＩＶのレベルを測定する方法が文献に周知である。
［１９４］本発明の免疫原性組成物に提供される誘導免疫のレベルはまた、中和分泌抗体および血清抗体の量を測定することによっても監視可能である。これらの測定に基づいて、望ましい免疫応答レベルを維持するのに必要であるように、投薬量を調整するか、または免疫を反復することも可能である。さらに、異なる候補ウイルスは、異なるレシピエント群に好適である可能性もある。例えば、Ｔ細胞エピトープが豊富なさらなるタンパク質を発現する、操作された組換えＨＰＩＶ２株は、乳児よりむしろ成人に特に好適である可能性もある。
［１９５］本発明のさらなる別の側面において、組換えＨＰＩＶ２を気道の一過性遺伝子療法のベクターとして使用する。この態様にしたがって、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、目的の遺伝子産物をコードすることが可能な配列を取り込む。目的の遺伝子産物は、ＰＩＶ発現を調節するのと同一のプロモーターまたは異なるプロモーターの制御下にある。組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムと、Ｎ、Ｐ、Ｌおよび他の望ましいＰＩＶタンパク質を同時発現することによって産生され、そして目的の遺伝子産物をコードする配列を含有する、感染性組換えＨＰＩＶ２を、患者に投与する。投与は、典型的には、治療中の患者の気道へのエアロゾル、噴霧器、または他の局所適用による。組換えＨＰＩＶ２は、望ましい遺伝子産物の療法レベルまたは予防レベルの発現を生じるのに十分な量で投与される。この方法内で投与されることも可能な、典型的な遺伝子産物は、好ましくは一過性発現に適しており、例えばインターロイキン−２、インターロイキン−４、ガンマ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、および他のサイトカイン、グルコセレブロシダーゼ、フェニルアラニン加水分解酵素、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、ヒポキサンチン−グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ、細胞毒、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスＲＮＡ、および他の候補抗原が含まれる。
［１９６］以下の例は、例示のために提供され、限定のためではない。これらの実施例は、ｃＤＮＡからのＨＰＩＶ２の回収のための新規逆遺伝学系の開発、および新規組換えＨＰＩＶ２候補の構築のためのこの系の使用を記載する。簡潔には、以下の実施例は、ＨＰＩＶ２の臨床的単離体の完全配列を導く研究を詳述する。完全アンチゲノムｃＤＮＡの構築、感染性組換えＨＰＩＶ２ウイルスの救出、および本発明の組換えＨＰＩＶ２のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの表現型を性質決定する研究もまた、記載する。
（実施例１）
ヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）の配列決定、およびクローニングしたＤＮＡからの組換え野生型ＨＰＩＶ２の生成
［１９７］本実施例は、ヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）の完全ゲノム配列決定を示し、該ウイルスを修飾なしに、組換えによって得られるＨＰＩＶ２に回収することも可能である。この解析のための対象ウイルス株は、Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ／１９９４（Ｖ９４）であり、これは元来、感染した１３ヶ月齢の乳児から１９９４年に単離された。ＨＰＩＶ２／Ｖ９４ゲノムは、本明細書において、長さ１５，６５４ヌクレオチドであることが示され、そしてしたがって「６のルール」に従う。このルールは、パラミクソウイルス科のパラミクソウイルス亜科メンバーによる効率的なＲＮＡ複製が、等しく６で割れるゲノムヌクレオチド長を必要とするという観察に関連する（本明細書に援用されるＫｏｌａｋｏｆｓｋｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：８９１−９，１９９８）。
［１９８］本明細書に開示する完全ｗｔＨＰＩＶ２配列の決定は、定義される配列および増殖特性のＨＰＩＶ２を産生するのに使用可能な、ｃＤＮＡの生成を可能にする。本実施例において、体系的に弱毒化突然変異を導入して、生弱毒化ＨＰＩＶ２候補を得る基質として使用可能な、ｗｔ ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４ ｃＤＮＡを記載し、該ｃＤＮＡのゲノム長および配列はよく定義されている。さらに、外来防御抗原をコードする遺伝子をｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４ゲノムに導入して、ＨＰＩＶ２および他の病原体に対する免疫応答を誘発可能な、生弱毒化候補を産生することも可能である。これらの弱毒化ＨＰＩＶ２ベクターは、典型的には、６のルールに従うゲノム長を有するように設計されるであろう。
細胞株およびウイルス
［１９９］ＨＥｐ−２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２３）およびＬＬＣ−ＭＫ２（ＡＣＣＣ ＣＣＬ ７．１）細胞を、５％ＦＢＳおよびゲンタマイシン硫酸（５０μｇ／ｍｌ）を補ったＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）中で維持した。組換えＨＰＩＶ２および生物学的に得られるＨＰＩＶ２をＬＬＣ−ＭＫ２細胞内で増殖させ、そして先に記載されるように（本明細書に援用されるＨａｌｌら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ２２：１７３−１８４）、モルモット（ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ）赤血球を用いた赤血球吸着によって同定される、ウイルスに感染した培養物の限界希釈によって定量化した。
ウイルス粒子ＲＮＡ単離
［２００］ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）単層を、細胞あたりおよそ１ ＴＣＩＤ５０の感染効率（ｍ．ｏ．ｉ．）でＨＰＩＶ２／Ｖ９４に感染させた。感染４〜６日後、透明になった上清を採取して、そして７．５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ−８０００中で氷上２時間インキュベーションし、その後、１０，８４５ｘｇで１時間遠心分離することによって、ウイルスを沈殿させた。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カールスバッド）およびクロロホルムを用いて、ペレットを抽出することによって、ウイルス粒子ＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を単離した。等体積のイソプロパノールを用いて、ｖＲＮＡを沈殿させた。ｖＲＮＡペレットを７０％エタノール中で洗浄し、そしてジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理Ｈ２Ｏに再懸濁した。
逆転写（ＲＴ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびヌクレオチド配列決定
［２０１］Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびランダム六量体プライマーを用いて、ｖＲＮＡを逆転写した。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を用いて、逆転写したｃＤＮＡ産物に対してＰＣＲを行った。先に公表されたＨＰＩＶ２の株由来の断片に相同なプライマー、または実験経過中に得たＨＰＩＶ２／Ｖ９４配列に基づいたプライマーを用いて、アンチゲノムＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡを６つの重複するＰＣＲ断片においてＲＴおよびＲＡＣＥ産物（以下を参照されたい）から生成した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ３１００配列決定装置とｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、英国ワーリントン）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ産物を直接配列解析することによって、ｃＤＮＡ産物のヌクレオチド配列を決定した。Ａｕｔｏａｓｓｅｍｂｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）プログラムを用いて、６つの重複するＲＴ−ＰＣＲ断片から配列を組み立てた。
［２０２］製造者に明記されるように、ｃＤＮＡ端の迅速増幅のための３’ＲＡＣＥ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、ＨＰＩＶ２の３’末端ゲノム配列をｃＤＮＡに変換した。簡潔には、ポリＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、３’端でｖＲＮＡをポリアデニル化し、その後、オリゴ（ｄＴ）で第一鎖ｃＤＮＡ合成をプライミングし、そしてＨＰＩＶ２特異的逆方向プライマーおよびキットとともに供給される順方向ＡＵＡＰプライマーを用いて、ＰＣＲした。上述のように、ＲＡＣＥ産物を直接配列決定した。３’端の配列を決定するため、２つの独立に得られるＲＡＣＥ産物を配列決定し、そして同一であることを見出した。
［２０３］ＨＰＩＶ２の５’ゲノム末端をｖＲＮＡから増幅し、その後、ｃＤＮＡ ５’端の迅速増幅のための５’ＲＡＣＥ系バージョン２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）に明記されるように、第一鎖ｃＤＮＡ合成、末端トランスフェラーゼテール合成、およびＰＣＲ増幅を行った。増幅されたｃＤＮＡ ＲＡＣＥ産物を直接配列決定した。２つの独立に得られる５’ＲＡＣＥ産物の多数回の配列決定反応を用いて、５’端の配列を決定し、そして配列が同一であることを見出した。
全長ｒＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡアンチゲノムクローンの組み立て
［２０４］ＨＰＩＶ２ゲノム中の以下の制限部位：ＮｈｅＩ（完全アンチゲノム配列のｎｔ８９２位）、ＸｈｏＩ（ｎｔ３６７３）、Ａｓｐ７１８（ｎｔ８１４１）、ＡａｔＩＩ（ｎｔ１０３４２）、およびＢｓｉＷＩ（ｎｔ１５２８０）を用いて、６つのクローニングされた重複するＲＴ−ＰＣＲおよびＲＡＣＥ産物から、ＨＰＩＶ２アンチゲノムＲＮＡをコードする全長ｃＤＮＡクローンを構築した（図３）。簡潔には、３’ＲＡＣＥ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．）およびＨｅｒｃｕｌａｓｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を、特異的ＨＰＩＶ２プライマーおよびＭｌｕＩ部位後にＴ７ポリメラーゼ、２つの非ウイルスＧ残基を含有するプライマー、並びにウイルスゲノムの３’端に対応するアンチゲノムｃＤＮＡとともに用いて、第一の断片を生成した。Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．）を用いて、次の４つの断片（図３）を逆転写し、そしてＨｅｒｃｕｌａｓｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲ増幅した。５’ＲＡＣＥ系を用いて、５’端を含有する最後の断片を逆転写し、そしてＨｅｒｃｕｌａｓｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｂｌｅｎｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて増幅した。ＰＣＲ断片を受け入れるように、制限酵素部位を含有するよう修飾したｐＵＣ１９プラスミドに、個々のＰＣＲ産物をクローニングし、そして、ＢｉｇＤｙｅ配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともにＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ３１００配列決定装置を用いて配列決定し、そして組み立てる前に、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４のコンセンサス配列に比較した。
［２０５］ＭｌｕＩ、ＢｓｐＥＩ、ＸｈｏＩ、Ａｓｐ７１８、ＡａｔＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＣｌａＩおよびＲｓｒＩＩ制限部位を含有するよう修飾したｐＵＣ１９ベクター内に、６つのＰＣＲ産物すべてを組み立てて、ｐＵＣ−ＨＰＩＶ２／Ｖ９４を生成した。ｐＵＣ−ＨＰＩＶ２／Ｖ９４由来の、ＭｌｕＩからＲｓｒＩＩまでのＨＰＩＶ２／Ｖ９４ ｃＤＮＡ断片を、修飾ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにサブクローニングすることによって、ｐＦＬＣ−ＨＰＩＶ２／Ｖ９４と称される感染性全長ｃＤＮＡプラスミドを生成し（本明細書に援用されるＳｃｈｍｉｄｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：８９２２−９，２０００）、そしてこのプラスミドは、以下の要素を含有する：Ｔ７プロモーター、その後２つの非ウイルスグアノシン残基、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４の完全アンチゲノム１５６５４ｎｔ配列、肝炎デルタウイルス・リボザイム、および組換えＨＰＩＶ３、ＢＰＩＶ３、およびＨＰＩＶ１の生成に関して先に記載されるようなＴ７ポリメラーゼ転写ターミネーター（各々、本明細書に援用される、Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７；Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：８９２２−９，２０００）。ＤＮＡ配列解析によって、全長ｃＤＮＡの配列を確認した。コンセンサス配列には存在しておらず、クローンの組み立て中に生じた、２つの点突然変異が、全長ｃＤＮＡのＦおよびＬ ＯＲＦ中、６２６５位（ａｇｔからａｇｃ；サイレント）および１５０７５位（ｇｃｔからｇｔｔ；Ａｌａ−２０９３からＶａｌ）に同定された。これらの突然変異をマーカーとして用いて、生物学的に得られるＨＰＩＶ２／Ｖ９４親ウイルスから組換えＨＰＩＶ２を区別した。
ｃＤＮＡからのＨＰＩＶ２／Ｖ９４の回収のためのＨＰＩＶ２ Ｎ、Ｐ、およびＬ補助（ｓｕｐｐｏｒｔ）プラスミド
［２０６］Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）およびＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、Ｎ ＯＲＦ ＡＴＧ翻訳開始コドン部位に渡るＡｆｌＩＩＩ部位を含有するアンチゲノム・センスオリゴヌクレオチド、およびＥｃｏＲＩ部位を含有するアンチセンスオリゴを用いて、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４（ｐＴＭ−Ｎ２）のＮタンパク質をコードする補助プラスミドをｖＲＮＡから得た。ＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、そしてＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＴＭ１にクローニングした（各々、本明細書に援用される、Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７；Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３４：７４−８３，１９９７；Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ８６：６１２６−３０，１９８９）。
［２０７］２つの重複ＰＣＲ断片（本明細書に援用されるＭｏｅｌｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：７６１２−２０，２００１）から、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４ Ｐタンパク質発現プラスミド（ｐＴＭ−Ｐ２）を生成し、そしてＨＰＩＶ２ Ｐ遺伝子編集部位（ｎｔ２４８１−２４８７）内の２グアノシンｎｔ挿入を含有するように操作して、完全Ｐ ＯＲＦ（これによってＶ ＯＲＦとは区別される）を生成し、これをＮｃｏＩからＥｃｏＲＩの断片としてｐＴＭ１にサブクローニングした。
［２０８］Ｌ遺伝子ＡＴＧ翻訳開始コドンに渡るＮｃｏＩ部位を含有するセンスオリゴ、およびＬ ＯＲＦ中のユニークなＡａｔＩＩ部位（ｎｔ１０３４２）の下流であるアンチセンスオリゴを伴うＰＣＲ増幅によって、ＨＰＩＶ２ Ｌポリメラーゼ発現プラスミド（ｐＴＭ−Ｌ２）を作成した。Ｌ ＯＲＦの残りは、ＨＰＩＶ２全長クローンを構築するのに用いたサブクローンから得られた。ＰＣＲ産物をＡｓｐ７１８およびＡａｔＩＩで消化して、そしてＨＰＩＶ２ ｎｔ１０３４２〜１５６５４、その後のユニークなゲノム外ＲｓｒＩＩ部位を含有するｐＵＣ１９プラスミドにクローニングした。次いで、完全ＨＰＩＶ２／Ｖ９４ Ｌ ＯＲＦを、ＮｃｏＩからＲｓｒＩＩの断片として、修飾ｐＴＭ１にサブクローニングした。
ｃＤＮＡからのウイルスの回収およびウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の配列決定
［２０９］先に記載されるように（本明細書に援用されるＳｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７２：２２５−３４， ２０００）、ＨＥｐ−２細胞にトランスフェクションした全長ＨＰＩＶ２／Ｖ９４アンチゲノムｃＤＮＡの２つの独立のクローンから、組換えＨＰＩＶ２／Ｖ９４を回収した。簡潔には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を用いて、６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州コーニング）中のＨＥｐ−２細胞を、全長ＨＰＩＶ２／Ｖ９４ ｃＤＮＡプラスミドおよび３つのＨＰＩＶ２補助プラスミド（ｐＴＭ Ｎ２、ｐＴＭ Ｐ２、ｐＴＭ Ｌ２）で同時トランスフェクションした。先に記載されるように、ＨＥｐ−２細胞をＭＶＡ−Ｔ７に同時に感染させた（各々、本明細書に援用されるＤｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７；Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：８９２２−９，２０００）。トランスフェクション後、第３日または第４日に上清を採取して、そしてＬＬＣ−ＭＫ２単層上で２回継代した。ウイルスが、生物学的に得られるウイルスの混入に相当するよりも、ｃＤＮＡに由来することを確認するため、ＲＴを行って、そしてウイルスゲノムのセグメントをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物の配列解析によって、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４と称する組換えウイルスのＦ遺伝子およびＬ遺伝子に存在するが、野生型親ウイルスには存在しない、２つの点突然変異の存在が明らかになった。対照として、先にＲＴ工程を伴わないＰＣＲを行った：これは、検出可能な産物を生じず、テンプレートが含有ＤＮＡではなくＲＮＡであったことを示した。次いで、先に記載されるように（本明細書に援用されるＳｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６０：１２５−３５，１９９９）、ＬＬＣ−ＭＫ２単層上でのプラークごとの精製によって、各ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４を生物学的にクローニングし、そしてＬＬＣ−ＭＫ２細胞上でさらに増殖させて、２つの独立のトランスフェクションから得られる、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４の２つのプールを生成した（ｒＡＨＰＩＶ２／Ｖ９４およびｒＢＨＰＩＶ２／Ｖ９４と称する）。
［２１０］上述のように（本明細書に援用されるＳｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６０：１２５−３５，１９９９）、生物学的にクローニングしたｒＡＨＰＩＶ２／Ｖ９４からｖＲＮＡを単離して、そしてオリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のテンプレートとして用いた。ＤＮＡ配列決定によって、増幅産物を解析して、ｒＡＨＰＩＶ２／Ｖ９４の完全ゲノム配列を決定した。
結果
［２１１］精製ｖＲＮＡから増幅したＲＴ−ＰＣＲ産物から、ＨＰＩＶ２株Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ１９９４（ＨＰＩＶ２／Ｖ９４）の完全ゲノム配列（配列を図９Ａ〜Ｆに提供する；本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ５３３０１０）を決定した。クローニング工程を伴わず、ＲＴ−ＰＣＲ産物に対して直接配列解析を行い、そしてこうして信頼しうるコンセンサス配列を得た。ＨＰＩＶ２ゲノムは、長さ１５，６５４ｂｐであることが決定され、そしてしたがって、本明細書に提供される配列は、６のルールに従う。
［２１２］６つの重複するＲＴ−ＰＣＲおよびＲＡＣＥ産物からｐＦＬＣ−ＨＰＩＶ２／Ｖ９４と称する完全ＨＰＩＶ２アンチゲノムｃＤＮＡを構築し、そして該ｃＤＮＡはマーカーとして、それぞれＦ遺伝子およびＬ遺伝子に２つのヌクレオチド変化を含有した（図３）。ＨＥｐ−２細胞にアンチゲノムｃＤＮＡをトランスフェクションし、そして補助ＨＰＩＶ２／Ｖ９４ Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質発現プラスミドおよびＭＶＡ−Ｔ７の同時トランスフェクションを用いて、ウイルスを回収した。ウイルスは、ＨＥｐ−２トランスフェクション上清をＬＬＣ−ＭＫ２サル腎臓細胞単層上に１回だけ継代した後でも、容易に回収され、そしてＨＰＩＶ２ Ｆ遺伝子およびＬ遺伝子中に存在するヌクレオチドマーカーの存在は、ｖＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよび配列解析によって確認された。ＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅は、ＲＴの添加に依存し、これによって、テンプレートが実際にウイルスＲＮＡであり、混入ＤＮＡでないことが示された。
［２１３］経時的なプラークごとの精製によって生物学的にクローニングした組換えウイルスから単離したｖＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ産物から、ｒＡＨＰＩＶ２／Ｖ９４の完全配列を決定した。具体的には、回収したウイルスの単離ゲノム配列は、２つの偶発的な単一ｎｔ置換突然変異を除いて、生物学的に得られるＨＰＩＶ２株Ｖ９４親ウイルスのものと同一であり、前述の２つの突然変異は、アンチゲノムｃＤＮＡに存在し、そして組換えＨＰＩＶ２のマーカーとして働く。Ｆ遺伝子中の６２６５位の第一の突然変異（ＴからＣ）は、翻訳的にサイレントである。ｎｔ１５０７５の第二の突然変異（ＣからＴ）は、Ｌ遺伝子において、アラニン２０９３からバリンへの置換を生じる。このアミノ酸位は、他のパラインフルエンザウイルス間では保存されず、そしてパラミクソウイルス属間で保存される６つのドメインの外にある。これらの点突然変異は、ｃＤＮＡから得られるウイルスのマーカーとして働く。細胞培養におけるウイルスの増殖中に生じる、ｎｔ１３７８６での第三の翻訳的にサイレントなｎｔ置換（ＴからＣ）もまた、同定された。偶発的な突然変異は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖を改変しなかった（以下を参照されたい）。ｒＢＨＰＩＶ２の部分的配列解析は、この偶発的な突然変異が存在しないことを示し、このことは、ウイルス増殖中に獲得された重要でない突然変異であるという考え方に矛盾しない。
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換えＨＰＩＶ２の複製
［２１４］多周期増殖力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって、組換えＨＰＩＶ２および生物学的に得られるＨＰＩＶ２の平均ピーク力価を測定した。６ウェルプレート中のＬＬＣ−ＭＫ２単層に、試験する各ＨＰＩＶ２を、０．０１の感染効率（ｍ．ｏ．ｉ．）、３つ組で接種し、そして先に記載されるように（１６）、培地に添加されるブタ由来トリプシンを伴い、そして伴わず、培養物を３２℃でインキュベーションした。０時間、および感染後、第１日〜第７日に、各ウェルから０．５ｍｌの培地を採取し、そして０．５ｍｌの新鮮な培地と交換した。３２℃で７日間インキュベーションした９６ウェルプレート中のＬＬＣ−ＭＫ２単層上で力価測定することによって、試料に存在するウイルスを定量化した。赤血球吸着によってウイルスを検出し、そしてｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（５０％の組織培養を感染させる用量／ｍｌ）として報告する。
［２１５］ｃＤＮＡから回収したｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４の細胞培養における増殖特性は、生物学的に得られるＨＰＩＶ２／Ｖ９４のものと区別不能であり（図４）、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖は、培地へのトリプシンの添加を必要としなかった（図４、パネルＡおよびＢを比較されたい）。３２℃、３９℃および４０℃での増殖もまた調べ、そしてｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４および生物学的に得られるウイルスは、より高い温度でｔｓではなかった。したがって、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４における偶発的なｎｔ置換は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖特性を改変しなかった。
（実施例３）
ハムスターにおけるｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４および生物学的に得られる野生型ＨＰＩＶ２／Ｖ９４の複製
［２１６］６匹の群の４週齢のゴールデンシリアンハムスター（Ｇｏｌｄｅｎ Ｓｙｒｉａｎ ｈａｍｓｔｅｒ）（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク）に、ウイルス１０６．０ＴＣＩＤ５０を含有するＬ１５培地０．１ｍｌを鼻内（ＩＮ）接種した。感染後、第３日、第４日または第５日、肺および鼻甲介を採取し、そして先に記載されるように（本明細書に援用されるＳｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：１７６２−８，１９９８）、ＬＬＣ−ＭＫ２単層上の組織ホモジネートの連続希釈によって、ウイルスを定量化した。ハムスター各群に対して平均ウイルス力価を計算し、そしてｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／組織グラムとして表す。
［２１７］ハムスターの気道におけるｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４の複製を、生物学的に得られるＨＰＩＶ２／Ｖ９４のものと比較して、回収されたｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４が、ｉｎ ｖｉｖｏでその生物学的な親ウイルスの複製特性を保持するかどうかを決定した。これに関連して、ハムスターは、動物モデルおよびヒト間で弱毒化および免疫原性などの活性に関して、適度に相関する知見を提供する、ヒトにおけるＨＰＩＶ感染の有用な動物モデルとして、当該技術分野に認められており、ここで該モデルは、ヒトよりもより許容性でない宿主と理解されている。
［２１８］２つの異なるｃＤＮＡクローンから得られる、組換えｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４の２つのプールを並行して研究し、同一ウイルスの２つの別個の調製物間の複製の可変性を評価した。これらをＨＰＩＶ２／Ｖ９４の生物学的に得られる調製物と比較した。各ＨＰＩＶ２の１０６．０ＴＣＩＤ５０を、１８匹のハムスターの群に別個に鼻内（ＩＮ）接種した。第３日、第４日、または第５日に、６匹のハムスターから肺および鼻甲介を採取し、そして各ウイルスの複製レベルを測定した（図５）。ｒＨＰＩＶ２の２つの調製物の複製レベルは、試験したすべての日で、生物学的に得られるＨＰＩＶ２のものと類似であり、組換えＨＰＩＶ２／Ｖ９４が生物学的に得られる対応物と、ｉｎ ｖｉｖｏで類似の複製特性を有することが立証され、そしてしたがって真正の組換えｗｔＨＰＩＶ２／Ｖ９４に相当する。明らかに、Ｌポリメラーゼの２０９３位での偶発的なアミノ酸置換は、ｉｎ ｖｉｖｏでｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４の複製レベルに影響を及ぼさなかった。これらの研究に加えて、生物学的に得られるＨＰＩＶ２／Ｖ９４で生じるように、Ｌタンパク質の２０９３位でアラニンをコードする全長アンチゲノムｃＤＮＡもまた生成し、そして生物学的に得られるＨＰＩＶ２／Ｖ９４のコンセンサス配列と同一の配列である、この修飾ＨＰＩＶ２／Ｖ９４ ｃＤＮＡもまた用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換えＨＰＩＶ２／Ｖ９４を回収した。
（実施例４）
ＨＰＩＶ２の３つの株の完全ゲノム配列の決定
［２１９］パラミクソウイルスのパラミクソウイルス亜科のレスピロウイルス属および麻疹ウイルス属のメンバーは、効率的なＲＮＡ複製、そしてしたがってウイルス複製が起こるためには、ゲノムのヌクレオチド長がちょうど６の倍数であるという一般的な必要条件を有すると考えられると報告されている（各々、本明細書に援用される、Ｃａｌａｉｎら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：４８２２−３０，１９９３；Ｃｈａｎｏｃｋら， Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ． Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ中，第４版，Ｋｎｉｐｅら監修，Ｖｏｌ．１，ｐ．１３４１−１３７９，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１；Ｈａｕｓｍａｎｎら，ＲＮＡ ２：１０３３−４５，１９９６；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：８９１−９，１９９８；Ｐｅｅｔｅｒｓら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ． １４５（９），１８２９−４５，２０００）。この「６のルール」は、ミニレプリコンを用いた研究で立証されており、そしてこれらのウイルスの完全ゲノム配列が、ちょうど６ヌクレオチドの倍数であるという観察と一致する。より最近、３型パラインフルエンザウイルスを用いた研究によって、この「６のルール」が、完全感染性ウイルスのレベルで作動する証拠が提供された（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９７：１３６−１５２，２００２）。このルールは、ｖＲＮＡ−核タンパク質複合体において、各Ｎタンパク質サブユニットが正確に６ヌクレオチドと相互作用する結果であると考えられる。
［２２０］しかし、６のルールがパラミクソウイルスのルブラウイルス属に当てはまるかどうかは不明なままであった。例えば、５型サル・ウイルスのミニレプリコンを用いた研究によって、このルールに関してはかなりの柔軟性があることが示唆された（本明細書に援用されるＭｕｒｐｈｙら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３２：１４５−５７，１９９７）。また、ＨＰＩＶ２のＴｏｓｈｉｂａ株に関して決定された完全ゲノム配列は、ちょうど６の倍数ではないが、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４のものは６のルールに従い、そして組換えＴｏｓｈｉｂａ株ＨＰＩＶ２は、ｃＤＮＡにコードされる、６のルールに従わないアンチゲノムＲＮＡから回収された（本明細書に援用されるＫａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８４：９９−１１２，２００１）。
［２２１］本明細書の最初の研究は、ＨＰＩＶ２の天然ゲノム長が６のルールに従うかどうかに重点を置いた。上述のように、生物学的に得られるＨＰＩＶ２株Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ ９４１２−６（ＨＰＩＶ２／Ｖ９４）は、上気道感染および下気道感染、高熱および中耳炎を示す１３ヶ月齢の乳児から、１９９４年に得られ、そしてしたがって、ＨＰＩＶ２の最近の低継代単離体を代表する。精製ｖＲＮＡから増幅されたＲＴ−ＰＣＲ産物から、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４の完全ゲノム配列を決定した。クローニング工程を伴わずに、ＲＴ−ＰＣＲ産物に直接配列解析を行い、そしてこうしてコンセンサス配列を得た。ＨＰＩＶ２／Ｖ９４ゲノムは、長さ１５，６５４ｎｔであることが見出され、そしてしたがって、６のルールに従う（各々、本明細書に援用される、Ｃａｌａｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６７：４８２２−３０，１９９３；Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：８９１−９，１９９８）。２つのさらなるＨＰＩＶ２株もまた配列決定した。原型ＨＰＩＶ２ Ｇｒｅｅｒ株は、元来、感染した１１ヶ月齢乳児から１９９５年に単離され（本明細書に援用されるＣｈａｎｏｃｋ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １０４：５５５−７６，１９５６）、そしてＨＰＩＶ２ Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ ９８１１−１８（Ｖ９８）株は、感染した２０ヶ月齢乳児から１９９８年に単離された。Ｖ９８株およびＧｒｅｅｒ株の配列を、それぞれ図１０Ａ〜Ｆおよび１１Ａ〜Ｆに提供し、そしてそれぞれの参考ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ５３３０１１、ＡＦ５３３０１２に提供する（各々、本明細書に援用される）。ＨＰＩＶ２／ＧｒｅｅｒおよびＨＰＩＶ２／Ｖ９８のゲノムサイズは、どちらも１５，６５４ｎｔと決定され、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４と同じであった。したがって、４０年に渡って間隔をあけて単離されたＨＰＩＶ２の３つの株は、同一のポリ六量体ゲノム長を有する。
ＨＰＩＶ２株の配列比較
Ｇａｐ配列並列プログラム（遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン）によって、Ｇｒｅｅｒ株、Ｖ９４株およびＶ９８株のヌクレオチド配列を比較した。３つの株間の同一性パーセントは、Ｖ９４株およびＶ９８株では９５．０％であり；Ｖ９８株およびＧｒｅｅｒ株では９７．４％であり；そしてＧｒｅｅｒ株およびＶ９４株では９６．２％であった。したがって、ＨＰＩＶ２の最近のＶ９４単離体およびＶ９８単離体は、１９５５ Ｇｒｅｅｒ単離体に非常に関連している。シス作用転写遺伝子開始（ＧＳ）シグナル配列および遺伝子終止（ＧＥ）シグナル配列は非常に保存されていた。さらに、既知のシス作用（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎ）ゲノム配列の六量体相はすべて、これらのウイルス各々の間で、正確に保存されていた。六量体相は、それぞれのゲノム六量体（単数または複数）内の特定の配列モチーフいずれかの位を指す。シス作用シグナルの正しい六量体相は、その最適機能のため重要である可能性があり（Ｋｏｌａｌｏｆｓｋｙら、１９９８）、そして６のルールの別の副次的影響である。予測されるＨＰＩＶ２／Ｖ９４ Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬポリペプチド配列を、Ｇｒｅｅｒ、Ｖ９８およびルブラウイルス属のいくつかの他のメンバーに比較し（各々、本明細書に援用される、ＳＶ５Ｗ３Ａ株、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０５２７５５；ＳＶ４１株Ｔｏｓｈｉｂａ／Ｃｈａｎｏｃｋ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ６４２７５；および流行性耳下腺炎ウイルス単離体８８−１９６１、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ４６７７６７を含む）、そして同一性パーセントを表１に示す。予測されるポリペプチド配列は、３つのＨＰＩＶ２株間でほぼ完全に保存され、最も高い度合いの多様性はＨＮ糖タンパク質で生じる。
表１：ＨＰＩＶ２／Ｖ９４のタンパク質とＨＰＩＶ２ Ｇｒｅｅｒ株及びＶ９８株の類似タンパク質、ＳＶ４１、ＳＶ５及び流行性耳下腺炎ウイルスとの間におけるアミノ酸配列の同一性
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ａ．ＨＰＩＶ２／Ｖ９４と指示されたウイルスの類似タンパク質との間のパーセント同一性はウィスコンシン・パッケージ・バージョン１０．２（遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン）のパイルアッププログラムによって決定した。
ｂ．括弧内の数は指示したＨＰＩＶ２／Ｖ９４タンパク質の予測されるアミノ酸の長さである。
［２２３］ＨＰＩＶ２ Ｔｏｓｈｉｂａ株（本明細書に援用されるＧｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ５７５５９；ＮＣ００３４４３）およびＧｒｅｅｒ株を、ＢＥＳＴＦＩＴ配列並列（本明細書に援用される、ウィスコンシン・パッケージ・バージョン１０．２、遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン）によって比較し、そしてこれらが９９．８％配列同一性を有することを見出した。したがって、Ｔｏｓｈｉｂａ株およびＧｒｅｅｒ株は、総数３４のヌクレオチド相違を有する。Ｔｏｓｈｉｂａ株およびＧｒｅｅｒ株の間の１０の主な配列相違が同定された（図６）。これらには、報告されるＴｏｓｈｉｂａ株配列には欠けており、Ｇｒｅｅｒ株に存在する１３のヌクレオチド、およびＧｒｅｅｒ株には存在せずに、Ｔｏｓｈｉｂａ配列に報告される５つのさらなるヌクレオチドが含まれる。これらには、ＮおよびＰ転写遺伝子開始シグナル配列における、それぞれ１ｎｔの欠失、Ｎ遺伝子終止シグナル配列内の１ｎｔ挿入、ＨＮ遺伝子３’ＮＣＲ中の１ｎｔ欠失、およびＯＲＦにおいてコード変化を生じる、Ｎ、ＰおよびＬ ＯＲＦのｎｔ欠失または挿入が含まれた（図６）。Ｔｏｓｈｉｂａ株のこれらの１８のエラーの修正によって、ＨＰＩＶ２のＶ９４株、Ｖ９８株およびＧｒｅｅｒ株に関して本明細書に報告するのと同じサイズである、１５６５４のゲノム長が生じるであろう。
［２２４］驚くべきことに、Ｔｏｓｈｉｂａ株およびＧｒｅｅｒ株間の相違のほぼ半数は、明らかな挿入または欠失を伴った。これまで、密接に関連するパラミクソウイルス間の最も一般的なヌクレオチド相違は、ヌクレオチド置換を伴う。欠失および挿入ははるかにまれである。シス作用ＲＮＡシグナルに関与するか、またはアミノ酸コード変化を生じる変化のパーセントもまた、異常に高かった。特に欠失および挿入が高頻度であったことから、Ｔｏｓｈｉｂａ株の相違の多くは、天然の真の相違よりむしろ、ｃＤＮＡ合成、クローニングまたは配列解析のエラーに相当することが示唆され、そして６のルールに従わないことが観察されるのもまた、エラーのためである可能性があることが示唆された。しかし、この点は、配列検査のみによっては解決不能であった。
（実施例５）
組換え突然変異体ＨＰＩＶ２は、６のルールに従わない、全長アンチゲノムＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡから生成可能である
［２２５］上述のように、ＨＰＩＶ２のＴｏｓｈｉｂａ株のゲノム長は、１５６４６ｎｔ（６ｎ＋４）であると報告された（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ５７５５９；ＮＣ００３４４３）（各々、本明細書に援用される、Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７８：２８９−９２，１９９０ａ；Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：８５７−６１， １９９０ｂ；Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４：３０８−１３，１９９０ｃ；Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８４：９９−１１２，２００１；Ｋａｗａｎｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：２７３９−４６，１９９１）。この報告される長さは、ちょうど６の倍数であることにゲノムが従う長さより４ｎｔ長く、そして慣例によって、その六量体長は、６ｎ＋４と示される。これらの報告に加えて、６のルールに従わないＨＰＩＶ２ Ｔｏｓｈｉｂａ株ｃＤＮＡ（１５６６５ｎｔ；６ｎ＋５）を、細胞培養物における組換えＨＰＩＶ２の回収に用いて成功したと報告された（Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８４：９９−１１２，２００１）。この情報に基づいて、以前には、ＨＰＩＶ２は、パラミクソウイルス亜科の他のメンバーと異なり（Ｃｈａｎｏｃｋら，Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ中， 第４版，Ｋｎｉｐｅら監修，Ｖｏｌ．１，ｐ．１３４１−１３７９，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００１）、ゲノム長が６のルールに従う、厳密な必要条件を持たないと考えられた（Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８４：９９−１１２，２００１）。最近、突然変異体組換えＨＰＩＶ３が、６のルールに従わないｃＤＮＡから得られうることが報告された（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９７：１３６−１５２，２００２）が、ＨＰＩＶ３は、２つのｗｔ ＨＰＩＶ３ゲノムのミニゲノム複製アッセイおよび配列決定で立証されるように、６量体ゲノム長の必要条件を有する（各々、本明細書に援用される、Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５：３２３−３３２，１９９７ａ；Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３４：７４−８３，１９９７ｂ；Ｇａｌｉｎｓｋｉ，Ｔｈｅ Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ中，Ｄ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ監修ｐｐ．５３７−５６８，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；Ｓｔｏｋｅｓら，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ２５：９１−１０３，１９９２――公開訂正はＶｉｒｕｓ Ｒｅｓ． ２７：９６，１９９３に記載される）。６のルールに従わないｃＤＮＡ由来のＨＰＩＶ３組換え体を配列解析することによって、これらが、６のルールに従うように、ウイルスゲノムの長さを修正するヌクレオチド挿入を含有することが示された（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９７：１３６−１５２，２００２）。これは、ａ）ミニゲノム研究が確認するように、完全感染性ＨＰＩＶ３は６のルールに従い、そしてｂ）ＨＰＩＶ３が、６のルールに従わないアンチゲノムｃＤＮＡから回収される場合、突然変異によって、アンチゲノムのゲノム長を修飾して、６のルールに厳密に従わせる有効な機構があるようであることを示した。
［２２６］ポリ六量体ゲノム長の必要条件は、ＨＰＩＶ２に関して直接調べられたことがなく、そしてＨＰＩＶ２が効率的な複製のため、ポリ六量体ゲノムを必要とするかどうかは明らかでない。ＨＰＩＶ２／Ｖ９４が６のルールに従わない全長ｃＤＮＡから回収されるかどうかを決定し、そしてこれらの回収されるウイルスが、ゲノム長修正突然変異を含有するかどうかをはっきりさせるため、Ｌポリメラーゼ遺伝子の末端近くのＥｃｏＲＶ制限部位に、各々、オリゴヌクレオチド挿入物（図７）を含有するよう修飾されたＨＰＩＶ２／Ｖ９４の全長アンチゲノムｃＤＮＡを生成した。パラミクソウイルスｍＲＮＡの効率的な発現に重要である可能性がある、上流シス作用遺伝子開始（ＧＳ）シグナル配列の六量体相に干渉しないように、この部位を選択した（Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８４：９９−１１２，２００１）。また、この領域は、既知のシス作用配列をまったく含有しない。挿入は、ＬポリメラーゼＯＲＦ配列を維持するように働くが、アンチゲノムＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡ長が４２ｎｔ（六量体間隔に関して６ｎであり、そして６のルールに従う）、４３ｎｔ（６ｎ＋１）、４４ｎｔ（６ｎ＋２）、４５ｎｔ（６ｎ＋３）、４６ｎｔ（６ｎ＋４）、または４７ｎｔ（６ｎ＋５）増加するようにゲノム長を修飾した。これらのｃＤＮＡを、上述のように、ＨＰＩＶ２補助プラスミドとともにＨＥｐ−２細胞にトランスフェクションした。３日後または４日後、上清を採取し、そしてＬＬＣ−ＭＫ２単層培養物上で２回継代した。驚くべきことに、ウイルスは試験したすべてのｃＤＮＡから容易に回収され、ＨＰＩＶ２ゲノムがポリ六量体でなくても、組換えＨＰＩＶ２が、６のルールに従わないｃＤＮＡから生成可能であることが示された。
［２２７］上述のように、ＬＬＣ−ＭＫ２単層培養物上でプラーク精製することによって、６のルールに従わないｃＤＮＡから回収された組換えＨＰＩＶ２（ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋１）、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋２）、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋３）、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋４）、およびｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋５））を生物学的にクローニングし、そしてＬＬＣ−ＭＫ２細胞上の継代によって、さらに増幅した。ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋１）、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋２）、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋３）、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋４）、およびｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋５）は、それぞれ長さ１５，６９７、１５，６９８、１５，６９９、１５，７００、または１５，７０１ｎｔのｃＤＮＡから得られ、これらｃＤＮＡは、６のルールに従うのに必要とされるより、１、２、３、４、または５ヌクレオチド多い（それぞれ、６ｎ＋１、６ｎ＋２、６ｎ＋３、６ｎ＋４または６ｎ＋５）。これらの回収された組換えウイルス単離体各々からｖＲＮＡを単離し、そしてＲＴ−ＰＣＲおよびＲＡＣＥを行うのに用いた。上述のように、クローニングせずにＰＣＲ産物を直接配列決定し、そして各ウイルスゲノムの完全コンセンサス配列を生成した。この解析によって、６のルールに従わないｃＤＮＡから生成されたウイルスのゲノム長は、回収されたウイルス各々が６のルールに従うように、ｎｔ挿入または欠失によって、各場合で修飾されることが示された（図８）。
［２２８］ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋３）ｖＲＮＡ ＲＴ−ＰＣＲ産物の完全ゲノム配列によって、このウイルスが、ＨＮ遺伝子５’非コード領域（ＮＣＲ）に２ｎｔ（ＡＡ、アンチゲノム・センス）挿入、およびＨＮ遺伝子３’ＮＣＲのポリＴ領域内に１ｎｔ（Ｔ、アンチゲノム・センス）挿入を獲得していたことが明らかになった（図８Ａ）。ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋３）のゲノムサイズは１５，７０２ｎｔであり、すなわちこのウイルスが得られたＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡよりも３ｎｔ長かった。したがって、６のルールに従うように、ウイルスゲノム長を修飾するように３ｎｔ挿入が提供された。ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋４）ゲノムの完全配列決定もまた、このウイルスが、ＨＮ遺伝子およびＬ遺伝子間の遺伝子間領域末端で、そしてＬ遺伝子ＧＳシグナル配列のすぐ上流に、２ｎｔ挿入（ＡＴ、アンチゲノム・センス）を維持していたことを示した（図８Ａ）。ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋４）のゲノムサイズは、１５，７０２ｎｔであり、すなわちこのウイルスが得られた６ｎ＋４ ＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡよりも２ｎｔ長かった。したがって、六量体ゲノム長が生成されるように２ｎｔ挿入が提供された。独立に得られ、そして生物学的にクローニングされた２つのｒＨＰＩＶ２が、１５，７０１ｎｔである全長アンチゲノムｃＤＮＡから生成された（６ｎ＋５；ｒＡＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋５）およびｒＢＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋５））。ｒＢＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋５）は完全に配列決定され、そしてＨＮ ３’非翻訳領域に単一ｎｔ挿入を有することが見出された。他方のもの（ｒＡＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋５））は部分的に配列決定され、そして６のルールに従うように、ゲノム長を修正するよう働きうる、ＨＮ ＧＥシグナル配列における単一ヌクレオチドの挿入を含有することが見出された（図８Ａ）。ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋１）およびｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋２）は完全に配列決定され、そしてポリ六量体ゲノムを生成するよう働く、それぞれ１ｎｔおよび２ｎｔの欠失を有することが見出された（図８Ｂ）。ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋２）に見られる２ｎｔ欠失は、ＨＮ遺伝子およびＬ遺伝子間の遺伝子間配列内で生じた。興味深いことに、ｒＨＰＩＶ２／９４（＋１）の単一ｎｔ欠失は、Ｌポリメラーゼのコード領域端近傍で生じ、そしてコドン２２５０の後にコードされる１３のアミノ酸が変化した。したがって、ゲノム長修正の大部分は、非コード領域の部位で生じたが、１つの突然変異体は、ＯＲＦの下流端の改変を含有した。
［２２９］要約すると、前述の実施例は、ＨＰＩＶ２が６のルールに従うことの詳細な立証を提供し、完全感染性組換えウイルスの回収と相関するため、この立証は特に適切である。この発見は、ＨＰＩＶ２の３つの株、すなわち原型Ｇｒｅｅｒ株および２つの最近のＨＰＩＶ２単離体、Ｖ９４およびＶ９８の完全ゲノム配列の決定を伴った。これらの株は各々、ゲノムの長さがポリ六量体の１５，６５４ｎｔであり、ＨＰＩＶ２ゲノム長が保存され、そして６のルールに従うことが立証された。ポリ六量体アンチゲノムＨＰＩＶ２／Ｖ９４ ｃＤＮＡを用いて、組換えＨＰＩＶ２／Ｖ９４を回収し、そして回収されたウイルスの長さもまた１５，６５４であった。６のルールから１ｎｔ〜５ｎｔ分逸脱した全長アンチゲノムＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡは、テンプレートに従わないｎｔ挿入または欠失を含有するウイルスを生じ、こうした挿入または欠失がポリ六量体ゲノムを生成するよう働いた。これらの知見は、ＨＰＩＶ２ポリ六量体ゲノムが、６のルールに従わないｃＤＮＡから生成され、そしてこの背景においてウイルス回収は、ゲノム長を６のルールに従うように修正する自発的な突然変異を伴うことを立証した。これは、ＨＰＩＶ２が回収成功のためにポリ六量体ゲノムを必要とし、そしてＨＰＩＶ２ Ｇｒｅｅｒ株、Ｖ９８株およびＶ９４株のゲノムが６のルールに従うという知見と一致する。したがって、ポリ六量体ゲノムに対する必要条件が、パラミクソウイルス亜科のルブラウイルス属およびレスピロウイルス属のメンバーに関して、ここで立証され、そして６のルールに従うこと、および６のルールからのゲノム長が逸脱する欠陥を修正する能力が、このパラミクソウイルス亜科のすべてのメンバーに普遍的である可能性があることが示唆される。
［２３０］ＨＰＩＶ２ Ｔｏｓｈｉｂａ株およびＧｒｅｅｒ株ゲノム配列の比較によって、これらの株が９９．８％の配列同一性を共有することが明らかになる。Ｔｏｓｈｉｂａ株およびＧｒｅｅｒ株は、全部で３４ヌクレオチド相違を示す。Ｔｏｓｈｉｂａ株およびＧｒｅｅｒ株間のいくつかの配列相違に注目した。これらには、報告されるＴｏｓｈｉｂａ株配列には欠けており、Ｇｒｅｅｒ株に存在する１３ヌクレオチド、およびＧｒｅｅｒ株には存在せずに、Ｔｏｓｈｉｂａ配列に報告される５つのさらなるヌクレオチドが含まれた。特に見かけの欠失および挿入が高頻度であったことから、Ｔｏｓｈｉｂａ株の相違の多くは、天然の真の相違よりむしろ、ｃＤＮＡクローニング、合成または配列解析のエラーに相当することが示唆され、そして以前報告された６のルールに従わない点が、配列決定エラーのためである可能性があることもまた示唆される。Ｔｏｓｈｉｂａ株のこれらの１８のエラーを修正すると、ＨＰＩＶ２のＶ９４株、Ｖ９８株およびＧｒｅｅｒ株に関して本明細書に報告されるのと同じサイズである、１５，６５４のゲノム長が生じるであろう。これらの知見に基づき、６のルールに従わないｃＤＮＡから先に回収された組換えＴｏｓｈｉｂａ株（本明細書に援用されるＫａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８４：９９−１１２，２００１）が、６のルールに従うようにゲノムを修正するであろう１以上のヌクレオチド挿入を、または潜在的に欠失を、同様に維持する可能性がある。
［２３１］６のルールに従わないｃＤＮＡから得られる、本明細書でＨＰＩＶ２に関して観察され、そして以前ＨＰＩＶ３に関して観察された（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９７：１３６−１５２，２００２）、ゲノム長修正の機構は未知であるが、２つの可能性が考慮されうる。第一に、ｎｔ挿入または欠失は、ｃＤＮＡからのウイルス回収の最初の工程の間、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって、トランスフェクションしたアンチゲノムプラスミドから、最初のアンチゲノムＲＮＡが合成される間に、起こりうる。バクテリオファージＴ７ポリメラーゼは、１ｘ４．５ｘ１０７ｎｔのうち１つまでという率で、ホモポリマーＡまたはＴ領域の後で、ｎｔを挿入するかまたは欠失させることが示されてきている（本明細書に援用される、Ｋｒｏｕｔｉｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１０４６−１０５３，１９９６）。
［２３２］第二の可能性は、ｎｔ修飾がＨＰＩＶ２ポリメラーゼに生成されるというものである。これは、ゲノムまたはアンチゲノムの複製中に生じる可能性があるランダムｎｔ挿入／欠失によるか、あるいは核タンパク質複製複合体がどのようにしてかゲノム長の逸脱を検出し、そして適切な数のｎｔを付加するかまたは欠失させて、欠陥を修正し、そしてポリ六量体長を生成する機構によるかいずれかで生じうる。Ｔ７ポリメラーゼまたはウイルスポリメラーゼ複合体いずれかによるランダム挿入／欠失の誤った取り込みは、ゲノム全体のいかなる位でも等しい頻度で起こると期待されるであろう。オープンリーディングフレーム内で初期に起こる修正は、ウイルス複製に致死的であり、そして一般的に非コード領域における挿入を持つゲノムのみが生存可能であろう。ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４の長さを修飾する、本明細書に報告する挿入または欠失の大部分は、ＨＮ遺伝子およびＬ遺伝子間で生じるという知見から、ゲノム長修正は、ランダム挿入／欠失機構によって起こるのではないことが示唆される。さらに、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋３）などのウイルスは、多数の挿入部位を含有した。多数の部位での挿入は、単一部位挿入よりはるかに低い頻度で生じると期待され、再び、ランダム挿入は、６のルールに従わないｃＤＮＡから、ポリ六量体ゲノム長が生成される機構ではないことが示唆される。
［２３３］以前、我々は、６のルールに従わないｃＤＮＡから得られる組換えＨＰＩＶ３もまた、６のルールに従うようにゲノム長を修飾するよう働くｎｔ挿入を含有することを見出した。これらの挿入（ＡまたはＵ）は、ポリアデニル化シグナル配列（ポリＵ）内、またはＨＰＩＶ３ゲノム内に含有される外来遺伝子挿入物のポリＡまたはポリＵ領域内いずれかで起こった。本研究においても、我々はまた、挿入の部位として、ホモポリマーＡまたはＵ領域が優先されることを立証し、これによって、ｎｔ挿入が、ポリメラーゼ・スタッタリング（ｓｔｕｔｔｅｒｉｎｇ）の結果である可能性があることが示唆された。唯一の例外は、それぞれ、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋４）およびｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋２）、それぞれのＨＮ遺伝子およびＬ遺伝子間のＩＧ領域のＡＵＡＵ配列で生じるＡＵ挿入およびＡＵ欠失であるが、これらの修飾もまた、ポリメラーゼのスリップ（ｓｌｉｐｐａｇｅ）およびスタッタリングの結果である可能性もある。興味深いことに、我々は、配列決定されたＨＰＩＶ２構築物またはＨＰＩＶ３構築物のいずれのＧまたはＣ挿入または欠失いずれも観察しなかった。長さが６のルールに従わず、そしてＰ遺伝子編集部位（ポリＧストレッチ）を含有するセンダイウイルスミニゲノムが、編集部位内にｉｎ ｖｉｔｒｏ ｎｔ挿入または欠失を生じて、これがポリ六量体ゲノム長を生成するように働くことが先に示された（Ｈａｕｓｍａｎｎら，ＲＮＡ ２：１０３３−４５，１９９６）。ルブラウイルス属の原型ウイルスであるＳＶ５のＤＩゲノムもまた、ｎｔ挿入によるｉｎ ｖｉｔｒｏゲノム長修飾を経ることが示され、そしてその長さが６のルールに従うＳＶ５ ＤＩゲノムは、修正されないゲノムよりもより効率的に複製した（本明細書に援用されるＭｕｒｐｈｙら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３２：１４５−５７，１９９７）。他のマイナス鎖ＲＮＡウイルスもまた、ｎｔ挿入を含有する修飾ゲノムを生成することが示された。ラブドウイルス科のメンバーであり、そしてパラミクソウイルスと類似のゲノム編成を有するが、６のルールに従わないＶＳＶは、このウイルスが天然に進化する間に、糖タンパク質遺伝子の３’ＮＣＲに多くのｎｔ挿入を集積していることが示されている（本明細書に援用されるＢｉｌｓｅｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：４８７３−８３，１９９０）。同定されるｎｔ挿入には、Ｕおよび／またはＡのホモポリマーストレッチが含まれ、そしてこれらがポリメラーゼ・スタッタリングによって生じることが示唆された。６のルールに従わないパラミクソウイルスであるＲＳＶは、Ｇタンパク質遺伝子中のホモポリマーＡストレッチ内でＡを挿入するかまたは欠失させることによって、中和耐性突然変異体を生成することが可能である（Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６８：５４６０−６８，１９９４；Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏら，ＥＭＢＯ Ｊ． ９：４１８１−８７，１９９０）。
［２３４］本研究からは、ゲノム長の逸脱を修正する能力が、ウイルスの天然の進化中に用いられ、適切なゲノム長を維持するウイルス複製機構の本質的な特性であるか、または逆遺伝学系のアーチファクトであるかは不明である。４０年に渡って、異なる時期に単離された株において、ＨＰＩＶ２ゲノム長が保存されており、ゲノム長を修飾する能力を有するマイナス鎖ＲＮＡウイルスの多くの例があり、そして６のルールに従わないｃＤＮＡから組換えパラインフルエンザを容易に得ることが可能であることから、前者が当てはまる可能性があることが示唆される。
［２３５］前述の実施例を要約すると、全長アンチゲノムＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡ、並びにＨＰＩＶ２／Ｖ９４ Ｎタンパク質、Ｐタンパク質およびＬタンパク質を発現する補助プラスミドをトランスフェクションしたＨＥｐ−２細胞から、真正野生型（ｗｔ）ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４が回収された。組換えＨＰＩＶ２／Ｖ９４のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖性およびｉｎ ｖｉｖｏ増殖特性は、一般的に、生物学的に得られる親のものと区別不能であった。重要なことに、単一ｎｔ置換を除いて、回収されたｒＨＰＩＶ２のゲノム配列が、由来するアンチゲノムｃＤＮＡと正確に一致することが、配列解析によって示された。この置換は、回収されたｒＨＰＩＶ２の第二の単離体には存在せず、ＲＮＡウイルスに一般的に観察されるような、偶発的な点突然変異であることが示された。したがって、ＲＮＡウイルス増殖に特徴的な時折発生する偶発的な突然変異を別にして、ゲノム配列が正確に設計されるとおりであるｒＨＰＩＶ３を得ることが可能である。成功のための１つの必要条件は、以前は、ＨＰＩＶ２に適用されないと考えられていた、６のルールに従うことである。
［２３６］上に論じるように、報告されるＨＰＩＶ２株（Ｔｏｓｈｉｂａ）が先に配列決定され、そしてそのゲノム長（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ５７５５９）が、長さ１５，６４６ｎｔであることが開示された。特に、この報告される配列は、６のルールに従うのに必要とされることがここで示された長さより２ｎｔ短いか、または４ｎｔ長く、そしてＨＰＩＶ２／Ｖ９４に関してここで報告される正しい配列より８ｎｔ短かった。したがって、この報告される配列は、ちょうど６の倍数より４ｎｔ過剰である（６ｎ＋４）（各々、本明細書に援用される、Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７８：２８９−９２，１９９０ａ；Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：８５７−６１，１９９０ｂ；Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７４：３０８−１３，１９９０ｃ；Ｋａｗａｎｏら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８４：９９−１１２，２００１；Ｋａｗａｎｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：２７３９−４６，１９９１）。さらに、６のルールに従わないＨＰＩＶ２ Ｔｏｓｈｉｂａ株ｃＤＮＡは、細胞培養物において、組換えＨＰＩＶ２の回収成功を生じると報告された（Ｋａｗａｎｏら、２０００、上記）。これらの観察は、ＨＰＩＶ２のゲノム長が６のルールに従う必要条件がないことを強く裏付けた（同上）。これらの報告に基づいて、先の研究者らは、ＨＰＩＶ２のゲノム長が６のルールに従う、厳密な必要条件はないと考えた。
［２３７］６のルールは、元来、センダイウイルスとも呼ばれるネズミ１型パラインフルエンザウイルス（ＭＰＩＶ１）に関して提唱されたが、これは（１）ＭＰＩＶ１ゲノムのｎｔ長がちょうど６の倍数であるという観察、および（２）ミニレプリコンのｎｔ長がちょうど６の倍数である場合にのみ、効率的な複製が達成されることを示す、ＭＰＩＶ１ミニレプリコンを用いた研究に基づいた（本明細書に援用される、Ｃａｌａｉｎら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：４８２２−３１，１９９３）。他の報告によって、天然存在ゲノムのｎｔ長およびいくつかの代表的なウイルスを用いたミニゲノム研究に基づいて、パラミクソウイルス科のレスピロウイルス属および麻疹ウイルス属のメンバーが、一般的に、６のルールに従うことが提唱される（各々、本明細書に援用される、Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３４：７４−８３，１９９７ｂ；Ｐｅｌｅｔら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２４：４０５−１４１，１９９６；Ｓｉｄｈｕら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０８：８００−７１，１９９５）。ポリ六量体長のこの必要条件は、各Ｎタンパク質サブユニットが、ｖＲＮＡ核タンパク質複合体中のちょうど６ヌクレオチドと相互作用する結果であると考えられている（各々、本明細書に援用される、Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７２：８９１−８８９，１９９８；Ｖｕｌｌｉｅｍｏｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：４５０６−１８， ２００１）。６のルールは、以前には、完全感染性ウイルスを体系的に操作することによって厳密に試験されてはいないことに注目すべきであり、こうした試験はウイルス生物学に対するルールの妥当性および重要性を決定するための、方向性を決定する設定である。むしろ、入手可能な実験的証拠は、主に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイされた、不完全でヘルパー依存性の非感染性ミニレプリコンに基づいた。
［２３８］６のルールは、ラブドウイルス科およびフィロウイルス科のメンバーなどの、多くの他の非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスには適用されないようである。このルールはまた、ヒトＲＳＶに代表されるパラミクソウイルス科の肺炎ウイルス属には適用されず（本明細書に援用されるＳａｍａｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７０：５０７５−５０８２， １９９６）、そしてまた、おそらくパラミクソウイルス科のメタニューモウイルス属にも適用されない（本明細書に援用されるｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｏｇｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９５：１１９−１３２，２００２）。したがって、大部分の非分節マイナス鎖ウイルスは、６のルールに従わず、そしてゲノムｎｔ長が特定の整数の倍数であるという同様の必要条件は、いかなる他種のウイルスにも存在しない。
［２３９］パラミクソウイルス科の残りの属であるルブラウイルス属もまた、６のルールに従わないようであった。例えば、原型ルブラウイルス、ＳＶ５を用いたミニレプリコン研究によって、効率的なＲＮＡ複製にはポリ六量体は必要とされないことが示された（本明細書に援用されるＭｕｒｐｈｙら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３２：１４５−１５７，１９９７）。
［２４０］他の先の観察は、ルブラウイルス属が、ＨＰＩＶ２に例示されるように、６のルールに従わないという考え方と一致した。例えば、６のルールに従うレスピロウイルス属および麻疹ウイルス属のメンバーにおいて、多様な遺伝子の遺伝子開始（ＧＳ）シグナルの最初のｎｔの位置は、六量体相に関して、大部分保存されており、シス作用シグナルの正しい六量体相が最適な機能に重要であることが示唆された（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙら，１９９８）。また、これらの２つの属のメンバーは、３ヌクレオチド遺伝子間領域で非常に保存されており、その正確でそして不変な長さはまた、シス作用配列の六量体相を維持することと一致した。対照的に、ルブラウイルス属は、ＧＳシグナルの相の保存の度合いが低かった（本明細書に援用されるＫｏｌａｋｏｆｓｋｙら，ＪＶｉｒｏｌ． ７２：８９１−８９９， １９９８）。また、ルブラウイルスは、非常に可変性の遺伝子間領域を有する：ＨＰＩＶ２の場合、これらは、長さ４ｎｔから４５ｎｔに渡る。これらの知見は、シス作用シグナルの六量体相がＨＰＩＶ２には重要でないことを示唆する。
［２４１］したがって、６のルールはパラミクソウイルス科の２つの属：レスピロウイルス属および麻疹ウイルス属に限定されると当該技術分野に一般的に認められてきた。また、上述のように、このルールは主に、ミニレプリコン系を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ研究に基づき、そして完全感染性ウイルスおよびウイルス生物学へのその重要性は、明らかには確立されていなかった。いかなる場合でも、このルールは、ルブラウイルス属には適用されないと考えられた。この見方は、ＨＰＩＶ２のゲノム長がポリ六量体でないことを開示し、そして非ポリ六量体組換えアンチゲノムｃＤＮＡが感染性ＨＰＩＶ２を産生したことをさらに報告する、Ｋａｗａｎｏら、２００１、上記の解説によって、強く裏付けられた。根底にある研究が、単純なミニレプリコンＲＮＡ複製研究と対照的に、完全感染性ウイルスの回収の報告を伴うため、ＨＰＩＶ２に関するこの報告には、特に説得力があった。アンチゲノムｃＤＮＡクローンからの感染性ウイルスの回収は、典型的には比較的効率的でなく、１．５ｘ１０６のトランスフェクション細胞のウェルが、１０以下の細胞からウイルスを生じる程度であった。さらに、わずかな差であっても感染性ウイルスの複製効率を減少させる欠陥はいずれも、多周期ウイルス増殖中に迅速に明らかになる。したがって、感染性ウイルスを回収する、報告される能力は、ｃＤＮＡがコードするアンチゲノムＲＮＡが非常に機能性であるという非常に厳密な試験を提供すると見なされた。したがって、非ポリ六量体アンチゲノムｃＤＮＡからの組換えＴｏｓｈｉｂａ株ＨＰＩＶ２の先の回収は、６のルールがこのウイルスには適用されないという説得力のある証拠を提供するようであった。
［２４２］ウイルス変異体を生成するためのｃＤＮＡに基づく逆遺伝学系の重要な利点の１つは、定義される配列を含有する組換えウイルスを再生可能に回収する能力である。有用な免疫原性組成物の開発のため、定義されるウイルス株を産生する目的は、操作されたアンチゲノム配列が、感染性ウイルスにおいて忠実に回収可能である場合のみ、達成可能である。定義される組換えウイルスの信頼性のある回収は、ウイルス弱毒化および免疫原性のレベルを体系的に調整する研究に必須である。
［２４３］予期せぬことに、本発明は、低継代歴の２つの臨床単離体を含む３つのさらなるＨＰＩＶ２株に関して決定されたコンセンサス配列が、６のルールに従うことを示す。公表されたＴｏｓｈｉｂａ配列との比較によって、後者が多くの予測不能なヌクレオチド（ｎｔ）欠失および挿入を含有する証拠が提供される。これらの挿入／欠失の起源および重要性は未知であるが、こうした突然変異は、この種のウイルスの天然ドリフトに特徴的ではなく、むしろ、クローニングまたは配列決定エラーの特質である。組換えＴｏｓｈｉｂａ株ＨＰＩＶ２が非ポリ六量体アンチゲノムｃＤＮＡから回収されたという先の報告（Ｋａｗａｎｏら、２００１、上記）を考慮して、本明細書において、ポリ六量体相に従わない全範囲に渡って特異的に操作したアンチゲノムｃＤＮＡの一団から、感染性ウイルスを回収する可能性を体系的に調べることに取り組んだ。驚くべきことに、組換えウイルスは各ｃＤＮＡから容易に回収された。これらの結果は、一般的に、上に要約するように、Ｋａｗａｎｏらに報告される結果を実証すると解釈された。しかし、本明細書に提示する、完全コンセンサスゲノム配列の詳細な記載および解析は、回収されたウイルス各々が、それぞれのアンチゲノムｃＤＮＡの忠実なゲノムコピーを含有しなかったことを立証する。その代わり、各々は、ポリ六量体ゲノム長を生じるように働く、１以上のｎｔ挿入または欠失を含有した。これによって、非ポリ六量体アンチゲノムから得られる組換えＨＰＩＶ２ウイルスにおいて、ポリ六量体ゲノムの迅速な出現があることが立証される。
［２４４］これらの知見は、定義される突然変異体ＨＰＩＶ２ウイルスおよび逆遺伝学によってベクター化された免疫原性組成物の開発に、重要な関係を有する。具体的には、ウイルスは、ポリ六量体長でないＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡから容易に回収可能であるが、本発明は、こうしたウイルスが、１以上の予期不能な挿入または欠失を含有することを示す。これらの突然変異の位置は、明らかに予測することは不能であり、そしてこれらの突然変異が、増殖、免疫原性、規定数外の遺伝子挿入物の発現、病原性、および他の特性に関して、ウイルスまたはベクターの特性を改変する潜在能力は、等しく予測不能である。したがって、回収されるウイルスは、１以上の予期不能な挿入または欠失を有するであろうため、非ポリ六量体アンチゲノムＨＰＩＶ３ ｃＤＮＡの使用は、一般的に、既知の配列のゲノムを持つ組換えウイルスの産生を特異的に妨げると見なされるであろう。
［２４５］ＨＰＩＶ２の天然単離体がポリ六量体長ゲノムを有し、ＨＰＩＶ２が感染性ウイルスのレベルで、６のルールに厳密に従い、そして非ポリ六量体アンチゲノムｃＤＮＡが突然変異ウイルスを容易に生成し、そして回避されるべきであるという発見は、予期せぬものであり、そして組換えＨＰＩＶ２に基づく免疫原性組成物および逆遺伝学による定義される配列のウイルスベクターの生成の基礎を提供する。
［２４６］本開示において、６のルールに従わないＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡからウイルスが回収され、そしてこうしたウイルスが６のルールに従うために長さの調整を経ることが立証されたことによって、ＨＰＩＶ２が６のルールに従う必要があることが明確になり、そしてこの服従の機構が自己修正であることがさらに明示される。この背景において、ＨＰＩＶ２に関する当該技術分野における先の理解は、このウイルスが６のルールに従わないことを意図し、非常に複雑な状況を導き、そして大部分の場合、定義される配列のウイルスの産生を妨げる。これは、６のルールに従わない回収ウイルスが、６のルールに従うよう自己修正する強い選択圧下にあるためであり、これは、自己修正が、より効率的な複製を生じ、そして修正されたウイルスが、出発ウイルスより迅速に増殖するのを可能にするためである。こうした自己修正は、ゲノムをちょうど６の倍数にするｎｔ挿入または欠失を伴うであろう。実際、本発明の実施例において、６のルールに従わないアンチゲノムから回収されたウイルスはすべて、突然変異を含有した。
［２４７］さらに、ＨＰＩＶ２ゲノムにおいて、どこでこうした修正変化が起こりうるかを、信頼性を持って予測することは不可能である。例えば、上述のＰＩＶ３系の修正の場合、オープンリーディングフレームの内部および外部両方、並びにシス作用シグナル内で見られた。同様に、こうした変化の表現型結果が何であるかを、信頼性を持って予測することは不可能である。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖に対して最小限の影響しかないが、ｉｎ ｖｉｖｏで複製に対して非常に有害である、突然変異の多くの例がある。これは特に、ｒＨＰＩＶ２をベクターとして使用する場合に問題であり、これはウイルスの複製に必要とされない規定数外の外来防御抗原が、ゲノムを修正するよう働く、ランダム挿入／欠失の優先的な標的であろうためである。ｎｔの挿入または欠失は、リーディングフレームまたはシス作用制御配列を破壊し、そして外来防御抗原の発現を除去する可能性もあるであろう。したがって、６のルールに従わない回収系は、定義される配列のウイルスを、信頼性を持って産生することが不能であり、そして実際、特性を改変する可能性を伴って、ゲノム内のｎｔ欠失または挿入によって長さ修正を維持する突然変異体ウイルスを優先的に産生するであろう。したがって、これは、生弱毒化候補ＨＰＩＶ２免疫原性組成物を生成する望ましい基質ではないであろう。
［２４８］６のルールに従わないｃＤＮＡからのウイルスの回収は、突然変異が起こることを強いる、非常に予測不能な結果を有する。この現象の主な不都合な結果は、どこでこうした長さ修正が起こるかを、信頼性を持って予測することが不能であり、またこうした修正（単数または複数）の位置（単数または複数）を調節し得ないことである。さらに、こうした修正はほぼ常に、遺伝子開始相に影響を及ぼす。したがって、６のルールに対するＨＰＩＶ２の依存性の立証、およびこうして回収されたウイルス株がこのルールを厳守することは、あらかじめ決定された配列のウイルスを産生するのに重要である。逆に、従来、このルールを認識し、そして厳守するのに失敗したことによって、その位置および表現型の重要性が明確には予測し得ない突然変異を有する組換えウイルスと対照的に、定義される、再生可能な配列を有するウイルスの回収が妨げられてきた。
［２４９］前述の研究は、６のルールに従わないｃＤＮＡからウイルスが回収される場合、２つのありうる説明が考慮可能であることを示唆する：（１）６のルールが適用されない、または（２）長さ修正が起こった。パラミクソウイルス挿入および欠失は、ヌクレオチド置換よりはるかにより頻繁でない傾向があるため、そして非服従ｃＤＮＡに関して観察される回収が効率的であることを説明するのに十分な頻度で、どのようにこうした長さ修正が起こりうるのかを想像することが困難であったため、第二の可能性は、以前は起こりそうにないように見えた。したがって、先の報告は、ＨＰＩＶ２が「６のルール」に厳密には従わないという強い結論を提供した。
［２５０］したがって、これらの発見は、長さ修正が実際起こり、そして見かけ上、説明できないほど高頻度で起こることを示すため、注目に値し、そして予測不能である。以前には、非服従ｃＤＮＡの回収が容易なのは、６のルールがＨＰＩＶ２に厳密には適用されないことを意味すると解釈された。この認められたモデルから、当業者は、知らぬまま、未知の表現型特性を生じる、開示されない突然変異を含有する組換えウイルスを開発していた。本発明は、組換えＨＰＩＶ２からのウイルスおよびベクターの開発に対するこの非常に重要な障害を回避する、予期せぬ情報を提供する。
（実施例６）
ＨＰＩＶ２のＬタンパク質への、異種パラミクソウイルスで同定された突然変異の移入
［２５１］本発明の他の側面内で、異種パラミクソウイルスで同定された多様な弱毒化突然変異を、単一で、または組み合わせて、組換えＨＰＩＶ２に導入して、適切な度合いの弱毒化または他の望ましい表現型効果を得ることも可能である。例えば、ＨＰＩＶ３ ｃｐ４５の弱毒化表現型を生じる特定の突然変異を、ｒＨＰＩＶ２の対応する標的部位に導入することも可能である。ＲＳＶおよびＢＰＩＶ３由来の弱毒化点突然変異を組換えＨＰＩＶに「移入する」ことによって、さらなる弱毒化突然変異が開発されてきている。特定の態様において、突然変異を特定するコドンで、１よりも２または３のヌクレオチド変化を用いて、点突然変異を本発明の組換えウイルスに導入し、これは、野生型への復帰突然変異に対して、突然変異を安定化するであろう。
［２５２］弱毒化突然変異は、ＨＰＩＶ２に関して以前には記載されず、または入手不能であったため、異種突然変異の使用は、本発明のｒＨＰＩＶ２を弱毒化するのに特に望ましい。配列並列を指針として用いて、ＨＰＩＶ３ｃｐ４５のＬタンパク質において、そしてｒＨＰＩＶ３−ＬＢと称する新規弱毒化キメラ・ウシ−ヒト組換え体において同定された、いくつかの突然変異を、典型的な突然変異として用いて、免疫原性組成物中で使用する生弱毒化ＨＰＩＶ２を産生した。これらには、Ｌポリメラーゼの４６０位、９４８位、１５６５位、およびアミノ酸１７２４〜１７２５（Δ１７２４）で突然変異を所持する組換え体が含まれた。先に記載されるように、ＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡから回収される組換え体は、生物学的にクローニングされ、そして精製ｖＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｃＤＮＡに特定される適切な突然変異を含有することが確認された。ＨＰＩＶ２ Ｌ突然変異を所持する４つの突然変異組換え体の各々は、高力価に増殖し（７．８ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上）、許容温度（３２℃）で複製が制限されないことが示された。予期せぬことに、Ｌタンパク質中に２アミノ酸欠失を含有する１つの突然変異体、ｒＨＰＩＶ２：Δ１７２４（この突然変異体において、２つのコドンが欠失されて、６のルールに従うが、突然変異を移入する、目的の対応する標的部位が残基１７２４であることに注目されたい）は、ほぼ１０９ＴＣＩＤ５０／ｍｌに増殖し、この突然変異体もまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖が、Ｌタンパク質における突然変異によって影響を受けないことが示された。これらの典型的な突然変異および異種パラミクソウイルスに同定される他の突然変異を、他のヌクレオチド修飾を有するｒＨＰＩＶ、例えば本明細書に記載するようなキメラおよびベクターＨＰＩＶ２構築物に導入することも可能である。
許容温度および制限温度でのＬＬＣ−ＭＫ２細胞における突然変異体ｒＨＰＩＶ２の複製
［２５３］先に記載されるように、３２℃および３８℃および３９℃で、４つの典型的な突然変異体ｒＨＰＩＶ２ウイルス各々の複製レベルをｒＨＰＩＶ２野生型の複製レベルに比較することによって、そのｔｓ表現型を決定した（本明細書に援用されるＳｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １８：５０３−５１０，１９９９）。簡潔には、各ウイルスを、Ｌ−１５培地（Ｑｕａｌｉｔｙ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓまたはＧｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）および抗生物質中の９６ウェルＬＬＣ−ＭＫ２単層培養物中で連続して１０倍希釈した。複製プレートを上に示す温度で６日間インキュベーションし、そしてモルモット赤血球を用いた赤血球吸着によって、ウイルスに感染した培養物を検出した。２〜６の別個の実験で各温度でのウイルス力価を測定し、そしてミリリットルあたりのｌｏｇ１０５０パーセント組織培養物感染性用量として表す（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）。上昇した温度での力価減少を、３２℃での力価に比較して、そして力価の平均減少を測定した。ｒＨＰＩＶ２突然変異体の遮断温度は、３２℃での力価に比較したウイルス力価の減少が、同じ温度の野生型ｒＨＰＩＶ２のものより１００倍高い温度と定義される。突然変異体は、３９℃での複製の減少、すなわち３２℃での力価から３９℃での力価を減じたものが、野生型ｒＨＰＩＶ２のものより１００倍以上高かった場合、温度感受性であると定義される。
［２５４］いくつかの実験の参考値として、トリプシンを増殖培地に添加したことを除いて、上述のように、組換えＨＰＩＶ１ Ｌタンパク質突然変異体、ｒＨＰＩＶ１ Ｌ：Ｙ９４２Ｈｃｐ４５を同時に試験した。ＲＳＶ、ＨＰＩＶ３またはｒＨＰＩＶ３−ＬＢから移入した突然変異を所持する、４つの典型的なｒＨＰＩＶ２ウイルスを、ＬＬＣ−ＭＫ２単層に対する力価測定によって、より高い温度範囲（３８〜３９℃）に対して、許容温度（３２℃）でこれらが複製する能力に関して試験した（表２）。興味深いことに、ＲＳＶまたはＨＰＩＶ３ｃｐ４５から移入したｔｓ突然変異およびａｔｔ突然変異のいずれも、ｒＨＰＩＶ２のｔｓ表現型を特定しなかった。しかし、突然変異が標的とするＬタンパク質の残基１７２４は、３９℃の遮断温度で、ｔｓ表現型を特定した。
表２．許容及び制限温度での生物学的に得られる組換えＨＰＩＶ２の複製
Figure 0004549188
ａ太字体の値は遮断温度で又はそれ以下であり、野生型力価の欠失を修正において３２℃での力価に比較した力価の１００倍以上の減少として定義される。
ハムスター気道における生物学的に得られるウイルスおよびｒＨＰＩＶ２突然変異体ウイルスの複製
［２５５］これらの典型的な突然変異体ＨＰＩＶ２株が、ハムスター気道で複製する能力を、以下のように評価した。４〜５週齢のゴールデンシリアンハムスターに、野生型または突然変異体ＨＰＩＶ２の１０６．０ＴＣＩＤ５０を含有するＬ−１５培地０．１ｍｌを鼻内接種した。肺および鼻甲介を感染後、第４日に採取し、そして先に記載されるようにウイルス力価を測定した（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖａｃｃｉｎｅ １８：５０３−５１０，１９９９）。６匹のハムスターの各群に関して、平均ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｇを計算した。各野生型の生物学的に得られるＨＰＩＶ２株は、ハムスターの上気道および下気道において高力価で複製した。組換えＨＰＩＶ２の複製レベルは、生物学的に得られる親ウイルスのものと類似であった。ＲＳＶ、ＨＰＩＶ３ｃｐ４５、またはｒＨＰＩＶ３−ＬＢから移入した突然変異を含有する４つのｒＨＰＩＶ２突然変異体が、ハムスターの上気道および下気道で複製する能力を調べた。感染したハムスターの上気道（鼻甲介）および下気道（肺）でｒＨＰＩＶ２突然変異体が複製するレベルを、野生型組換えＨＰＩＶ２のものに比較した（表３）。単一アミノ酸突然変異の中で、Ｌタンパク質中のＦ４６０ＬまたはＬ１５６５Ｉ突然変異を所持する組換えＨＰＩＶ２は、ハムスター下気道中の複製において、組換えｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（Ｎｏｔ）親ウイルスに比較して、１００倍以上の複製減少を示した。これらの結果は、２つの対象突然変異が、ｒＨＰＩＶ２のｉｎ ｖｉｖｏ弱毒化表現型を特定することを立証する。
表３．ハムスター気道における生物学的に得られるＨＰＩＶ２及び組換え野生型の株または流行性耳下腺炎ウイルスＨＰＩＶ２／Ｖ９４の複製
Figure 0004549188
ａ６匹または４匹の群のハムスターに指示したウイルスの１０６ ＴＣＩＤ５０でＩＮ投与した。鼻甲介および肺組織を感染４日後に回収し、組織に存在するウイルスを３２℃でインキュベートしたＬＬＣ−ＭＫ２単層上に連続希釈によって定量した。平均ウイルス力価±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を示す。太字の値はｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４の力価に比較した力価の１００倍以上の減少を示す。
非ヒト霊長類におけるｒＨＰＩＶ２の弱毒化
［２５６］ヒトにおける免疫原性組成物中の使用のため、組換えＨＰＩＶの弱毒化を評価する、認められた非ヒト霊長類モデル（ＨＰＩＶ２に関して血清陰性であるアフリカミドリザル）において、ｒＨＰＩＶ２−Ｌ：Δ１７２４組換え体の複製を、野生型ＨＰＩＶ２／Ｖ９４のものに比較した。先に記載されるように（Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１３２４−３０，１９９８）、ウイルス懸濁物１０６ＴＣＩＤ５０を含有するＬ１５培地１ｍｌを、サルに鼻内（ＩＮ）および気管内（ＩＴ）接種した。免疫後、第１日〜第１０日に鼻咽頭スワブ試料を収集し、そして免疫後、第２日、第４日、第６日、第８日、および第１０日に気管洗浄試料を収集した。３２℃でのＬＬＣ−ＭＫ２単層培養上の連続希釈によって、収集された試料に存在するウイルスを定量化し、そしてｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表す（表４）。生物学的に得られるウイルスは、下気道で高レベルに、そして上気道ではより低レベルに複製した（図１２）。ｒＨＰＩＶ２−Ｌ：Δ１７６４突然変異体は、生物学的に得られる親ウイルスに比較して、上気道および下気道両方で複製に関して弱毒化されていた。これによって、Ｌ：Δ１７２４突然変異が、霊長類においてｒＨＰＩＶ２に高レベルの弱毒化を与えるものであることが同定された。この突然変異は、２アミノ酸欠失であるため、対象組換えウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏでの複製後、非常に安定であろうし、これは免疫原性組成物および方法で使用する候補ウイルスに非常に望ましい特性である。
表４．アフリカミドリザルにおける生物学的に得られる組換えＨＰＩＶ２のウイルス複製のレベル
Figure 0004549188
ａ．動物に指示したウイルスの１０６ ＴＣＩＤ５０でＩＮおよびＩＴ投与した。
ｂ．鼻咽頭（ＮＰ）スワブ試料を感染１−１０日後に収集した。気管洗浄（ＴＬ）試料を感染２、４、６、８および１０日後に収集した。サンプリングの日に関係しない各群の動物に対する最大ウイルス力価の平均。Ｓ．Ｅ．＝標準誤差。ウイルス力価の検出の下限は１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌである。
（実施例７）
異種病原体の防御抗原を発現するベクターとしての野生型ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４の使用
［２５７］本発明の他の側面において、例えば置換または規定数外の遺伝子またはゲノムセグメントとして、異種病原体の１以上の防御抗原を発現するベクターとして、多様な組換えＨＰＩＶ２構築物を使用する組成物および方法を提供する。本発明のこれらの側面において興味深い異種病原体には、例えば異種ＰＩＶ、麻疹ウイルス、ヒト・メタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）、およびＲＳＶが含まれる。
［２５８］上述のように、ＨＰＩＶ１、２、および３は、天然には交差防御を提供しない異なる血清型に相当し、そしてしたがって、有効な免疫原性組成物は、各血清型ウイルスに対して、特異的に設計しなければならない。さらに、本発明の組換えＨＰＩＶ２ウイルスは、他のＨＰＩＶを含む、他の微生物病原体の防御抗原を発現するベクターとして、特に有用なものとなる特性を有する。
［２５９］ＨＰＩＶ、並びに麻疹ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）などの特定の他のモノネガウイルス病原体の主要防御抗原は、宿主細胞への付着および浸透を仲介する、２つの主な表面タンパク質である。これらはＰＩＶのＨＮおよびＦ糖タンパク質、麻疹ウイルスのＨＡおよびＦ糖タンパク質、並びにＲＳＶのＧおよびＦタンパク質である。重要なことに、これらのウイルスの各々に関して、単独で発現されるいずれかの糖タンパク質は、中和抗原および防御抗原として機能する。対照的に、これらのウイルスの「内部」タンパク質は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞によって仲介されるようである防御免疫を誘導可能であるが、この防御効果は、せいぜい１ヶ月で減弱し、そして再感染への長持ちする耐性の重要な構成要素ではないようである（Ｃｏｎｎｏｒｓら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：１６３４−７１９９１；Ｋｕｌｋａｒｎｉら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：１０４４−９，１９９３；Ｔａｏら，Ｖａｃｃｉｎｅ １７：１１００−１１０８，１９９９）。多くの研究によって、乳児および幼い子供に存在する母性抗体の中和効果および免疫抑制効果にもかかわらず、単一のモノネガウイルス防御糖タンパク質抗原を発現させた場合であっても、哺乳動物被験者において、高レベルの免疫応答が誘発される可能性があり、これらには局所免疫および全身免疫両方が含まれる可能性があることが示された。予期せぬことに、本発明のＨＰＩＶ２ベクターは、いくつかの病原体、特に小児科集団に対して免疫するためのベクターとして特によく適している。
［２６０］パラミクソウイルス科のいくつかのメンバーは、発現ベクターとして適していることが示されているが、組換えＨＰＩＶ２発現ベクターは、以前には記載されていなかった。多数の病原体に対して免疫を誘導するよう、単一の組換えウイルスを修飾することには、いくつか利点がある。各病原体に対して別個の弱毒化ウイルスを発展させるより、多数の病原体に対してポリ特異的免疫応答を誘発する抗原を発現する、単一の弱毒化キメラウイルス「主鎖」構築物を発展させる方が、より実現可能であり、そして迅速である。各病原体は、操作し、弱毒化し、そして安全性および有効性を示すのに異なる困難を提供し、そして一連の病原体各々の弱毒化型を発展させるのは、手ごわい仕事であろう。いくつかの弱毒化ウイルスを投与するより、単一の免疫原性ウイルスを発展させ、調製し、取り扱い、そして投与するほうが大幅により効率的である。免疫ウイルスの数を減少させることはまた、小児科免疫の込み入ったスケジュールを単純にするであろう。いくつかの弱毒化ウイルスを混合物として投与することも可能であるが、これは、各構成要素が別個に安全であることが示され、そして混合物として安全でそして有効であることが示されなければならないため、臨床的に適用可能な免疫原性組成物の開発を複雑にする。ウイルス混合物投与に伴う、１つの特定の問題は、ウイルス干渉の一般的な現象であり、この中で、混合物中の１以上のウイルスが、１以上の他の構成要素の複製に干渉する。これは、１以上の構成要素に関して、複製および免疫原性の減少を生じる可能性があり、こうした減少は単一ベクター主鎖の使用によって未然に防がれる。また、麻疹ウイルスなどのいくつかのウイルスは、以下に記載するように、特に安全性の懸念を有するため、各々別個に発展させ、そして検証しなければならない、別個の弱毒化ウイルスの混合物と対照的に、多数の規定数外の抗原を所持するベクターとして、ＨＰＩＶ２などの単一で比較的良性のウイルスを使用するほうがより安全である。
［２６１］ＨＰＩＶ２ベクター系は、モノネガウイルス目の一本鎖マイナスセンスウイルスの他のメンバーに勝る、ユニークな利点を有する。まず、ベクターとして使用されてきた他のモノネガウイルスの大部分は、ヒト病原体に由来せず、例えばネズミＨＰＩＶ１（センダイウイルス）（Ｓａｋａｉら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４５６：２２１−６１９９９）、ウシ病原体である水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（Ｒｏｂｅｒｔら、１９９８）、およびイヌＰＩＶ２（ＳＶ５）（Ｈｅら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３７：２４９−６０，１９９７）である。これらの非ヒトウイルスに関しては、ベクター主鎖に提示される抗原によっては、いかなるヒトウイルスに対しても、ほとんどまたは弱くしか免疫が与えられない。したがって、ヒト病原体の規定数外の遺伝子を発現している非ヒトウイルスベクターは、一般的に、単一のヒト病原体に対してしか有効な免疫応答を誘発しないであろう。さらに、ＶＳＶ、ＳＶ５、狂犬病、またはセンダイウイルスなどの非ヒトウイルスをベクターとして使用するには、そうでなければ人生の間に遭遇しない可能性があるウイルスに被験者を曝露することを必要とする。こうした非ヒトウイルスでの感染、およびこうしたウイルスに対する免疫応答は、ヒトにおいてこれらのウイルスでの感染の経験がほとんどないため、さらなる安全性の問題を提起する。
［２６２］ベクターとして使用することが提唱されてきた３つのヒトモノネガウイルスである、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、および狂犬病ウイルスは、さらなる制限を有することから、この目的の劣った候補となっている。例えば、麻疹ウイルスは、Ｂ型肝炎ウイルスの防御抗原のベクターとしての使用が考慮されてきた（Ｓｉｎｇｈら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：４８２３−８，１９９９）。しかし、この組み合わされた麻疹ウイルス−Ｂ型肝炎ウイルスワクチンは、認可された麻疹ウイルスワクチン同様、９ヶ月齢後にのみ投与可能であり、一方、現在のＢ型肝炎ウイルスワクチンは、初期乳児期の使用が推奨されている。これは、現在認可されている麻疹ウイルスワクチンは、非経口投与され、そして母性抗体による中和および免疫抑制に非常に感受性であり、そしてしたがって、９〜１５ヶ月齢より前に投与した場合、有効ではないためである。したがって、初期乳児期に疾患を引き起こす抗原のベクターとして用いることは不可能であり、そしてしたがってＲＳＶおよびＨＰＩＶに対してこれらの被験者における有効な免疫応答を誘発するのに有用でないであろう。麻疹ウイルス感染の別の周知の特徴的影響は、ウイルスに仲介される免疫抑制であり、これは数ヶ月続くこともあり、そしてベクターに望ましい特徴ではない。弱毒化麻疹ウイルスワクチンは、免疫応答改変および増加した用量で投与した際の死亡率増加と関連し、これは少なくとも部分的に、ウイルスが誘導する免疫抑制のためである可能性があり、そして弱毒化麻疹ウイルスであっても、ベクターとしては適切でない可能性があることが示唆される。さらに、ベクターとしての麻疹ウイルスの使用は、この病原体を根絶しようとする世界規模の試みと矛盾するであろう。実際、これらの理由のため、生麻疹ウイルスの使用を終わりにし、そして存在する麻疹ウイルスワクチンを、本明細書に記載するような、麻疹ウイルス防御抗原を発現するＰＩＶベクターと交換することが望ましいであろう。
［２６３］ヒト感染のまれな原因となる狂犬病ウイルスもまた、ベクターとしての使用が考慮されてきた（Ｍｅｂａｔｓｉｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９３：７３１０−４，１９９６）が、特に普遍的なヒト病原体でない狂犬病ウイルスに対する免疫は、一般的な集団には必要でないため、ヒトに１００％致死であるベクターを、生弱毒化ウイルスベクターとして使用するために発展させることは見込みがありそうにない。流行性耳下腺炎ウイルスおよび麻疹ウイルスは、より病原性でないが、いずれのウイルスによる感染も望ましくない特徴を伴いうる。流行性耳下腺炎ウイルスは、耳下腺に感染し、そして精巣に広がる可能性があり、ときに不妊を生じる。麻疹ウイルスはウイルス血症を確立し、そしてその感染は広範囲に渡る性質があり、これは関連する、広範囲に渡る発疹によって例示される。流行性耳下腺炎および麻疹感染中の軽度の脳炎は珍しくない。麻疹ウイルスはまた、亜急性硬化性全脳炎と称する、まれな進行性致死的神経疾患とも関連する。
［２６４］対照的に、正常な個体におけるＰＩＶ感染および疾患は、気道に限定され、この部位は、非経口経路より、はるかに免疫に好適である。ウイルス血症および第二の部位への伝播は、重度の免疫不全実験動物およびヒトにおいては起こりうるが、これは、典型的なＰＩＶ感染の特徴ではない。急性気道疾患が、ＰＩＶに関連する唯一の疾患である。したがって、ベクターとしてのＰＩＶの使用は、生物学的特性に基づいて、免疫抑制につながるウイルスと末梢リンパ球の相互作用などの合併症、または他の合併症につながる、精巣または中枢神経系などの第二の臓器の感染を回避する。
［２６５］ＰＩＶベクター系の重要で、そして特異的な特徴は、これらを鼻内投与することが可能であることであり、これは天然感染を模倣し、そして粘膜および全身免疫応答を誘導する。ＰＩＶベクター系はまた、乳児に存在する母性由来血清ＩｇＧの中和および免疫抑制効果を減少させるであろう。これらの利点に加えて、ＲＳＶおよび麻疹ウイルスなどのウイルスで達成可能であるよりも１０〜１０００倍高いＰＩＶ高力価が、マイクロキャリアー培養で得られる条件が確立されている。ＰＩＶベクター系のさらなる利点は、他の意図されるベクター系に比較して、増殖、輸送、保存および取り扱いが容易なことに関する。
［２６６］本明細書に記載する組換えＨＰＩＶ２ウイルスは、例えば別のパラミクソウイルス属などの異なる病原体の１以上の抗原決定基をコードする規定数外の遺伝子を挿入することによって、異種ヒト病原体の防御抗原を発現するベクターとして使用可能である。例えば、ＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３のＦおよび／またはＨＮタンパク質（単数または複数）、あるいは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＦおよび／またはＧ糖タンパク質（単数または複数）（あるいはそれらの１以上の抗原性ドメイン、セグメントまたはエピトープ）を、組換えＨＰＩＶ２主鎖またはベクターに、置換するか、または規定数外の遺伝子またはゲノムセグメントとして挿入することも可能である。こうしたキメラｒＨＰＩＶ２の典型的な設計を図２に例示する。この例において、ＰＣＲ突然変異誘発によって、ユニークな制限酵素エンドヌクレアーゼ認識配列（ＮｏｔＩ）をＨＰＩＶ２ Ｎ遺伝子（ｎｔ１５８〜１６０）の翻訳開始コドン（ＡＵＧ）のすぐ上流に導入する。次いで、これを用いて、異種ウイルスの抗原または抗原決定基に対応する操作可能なコード配列を挿入することも可能である。典型的な態様において、異種抗原をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＨＰＩＶ２シス作用転写調節要素下に置き、そしてさらなるｍＲＮＡとして転写させる。
ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む規定数外の外来遺伝子の発現ベクターとしての組換えＨＰＩＶ２の使用
［２６７］したがって、本発明の１つの典型的な側面において、ｒＨＰＩＶ２ベクターの優れた特性は、ＲＳＶに対して免疫応答を誘発するのに有効な免疫原性組成物の開発を提供する。本実施例において、Ｎコード配列の上流で、そしてシス作用ＨＰＩＶ２転写シグナルの調節下に挿入された、ＲＳＶサブタイプＡ融合タンパク質（Ｆ）ＯＲＦまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＯＲＦを発現する遺伝子単位を含有する、ＨＰＩＶ２ ｃＤＮＡを構築した。これらのｃＤＮＡ構築物から、ＲＳＶ Ｆタンパク質またはＧＦＰを発現する組換えＨＰＩＶ２ベクターウイルスを回収した。組換え体を生物学的にクローニングし、そして高力価のプールを精製した（７．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上）。蛍光顕微鏡によってＧＦＰの発現を確認し、これによってＨＰＩＶ２ Ｎ遺伝子の上流に挿入された規定数外の遺伝子が、よく許容されることが示された。予期せぬことに、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするさらなる遺伝子を含有する組換え体（ｒＨＰＩＶ２−ＦＲＳＶ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複製が穏やかに弱毒化されていた（図１３）。このウイルスは、細胞培養において、１０７．６ＴＣＩＤ５０に増殖した。しかし、その増殖率は、野生型ＨＰＩＶ２に比較して減少していた。先に記載されるように、ＲＳＶ融合タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いた間接的免疫蛍光によって、ＲＳＶ融合タンパク質の発現を確認した（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：１１１７−２４，１９９６；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９７：１３６−１５２，２００２；Ｓｃｈｍｉｄｔら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：４５９４−６０３，２００１）。したがってこの組換え体は、２つのヒト病原体、ＲＳＶおよびＨＰＩＶ２の防御抗原を発現する。
［２６８］６匹のハムスターの群に、ｒＨＰＩＶ２−ＦＲＳＶまたはｒＨＰＩＶ２ ｗｔの１０６ＴＣＩＤ５０をＩＮ接種し、そして感染後、第４日に、肺および鼻甲介における各ウイルスの複製レベルを測定することによって、ハムスターにおけるｒＨＰＩＶ２−ＦＲＳＶの複製レベルを決定した。表３に示すように、ｒＨＰＩＶ２−ＦＲＳＶは、上気道では複製が１０倍減少し、そして下気道では複製が２５００倍減少した。同様のキメラ・ウシ−ヒトＰＩＶ３、および最初の転写位にＲＳＶ Ｆ遺伝子を所持するＨＰＩＶ１組換え体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで弱毒化されなかったため、この弱毒化レベルは予期せぬものであった。これによって、ｒＨＰＩＶ２−ＦＲＳＶがＨＰＩＶ２突然変異体の新規種類と同定され；これは、Ｎ遺伝子上流の単一遺伝子単位挿入によって弱毒化されたＨＰＩＶ２発現ベクターである。
（実施例８）
免疫原性組成物および方法の開発のためのｒＨＰＩＶ１における弱毒化突然変異のさらなる解析
［２６９］上述のように、本発明はまた、単独でおよび／または本明細書に開示するＨＰＩＶ２組成物および方法と組み合わせて有用な、新規組換えＨＰＩＶ１ウイルス、並びに関連する組成物および方法も提供する。説明を簡潔にするため、これらの態様の基本的な側面は、例えば、２００２年１１月２１日にＭｕｒｐｈｙによって出願された米国特許出願第１０／３０２，５４７号、および２００３年５月３０日に公表された対応するＰＣＴ公報第ＷＯ０３／０４３５８７ Ａ２号（各々、本明細書に援用される）に記載される。本発明のｒＨＰＩＶ１ウイルスに同定され、そして性質決定される突然変異および他の修飾を、本明細書記載のｒＨＰＩＶ２ウイルスに容易に取り込んで、そして評価することも可能であるし、そしてその逆も可能である。
［２７０］典型的な態様において、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、１以上の組換えによって導入された温度感受性（ｔｓ）または宿主範囲（ｈｒ）弱毒化（ａｔｔ）突然変異を取り込む。しばしば、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、生物学的に得られる突然変異体ＰＩＶ株に、または別の突然変異体非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばＲＳＶまたはネズミＰＩＶ（ＭＰＩＶ）に同定された１以上の弱毒化突然変異を取り込むであろう。例えば、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムを修飾するかまたは構築して、ＨＰＩＶ１、または周知の免疫原性組成物候補ＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５などの異種ＰＩＶに同定される突然変異（単数または複数）に対応する突然変異を１以上取り込むことも可能である。ＨＰＩＶ３ ＪＳ ｃｐ４５または別の突然変異体ウイルスの有用な突然変異は、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｃ、Ｆ、またはＨＮから選択されるＨＰＩＶ１タンパク質、あるいは３’リーダーまたはＮ遺伝子開始配列から選択されるＨＰＩＶ１遺伝子外配列における変化を特定することも可能である。突然変異が、特定のアミノ酸残基に関連する場合、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、しばしば、突然変異を特定するコドンに、多数のヌクレオチド変化を取り込んで、復帰突然変異に対して該修飾を安定化させるであろう。
［２７１］巨大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）は、ヒト１型および３型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ３）間で、アミノ酸レベルで非常に保存されている。ＨＰＩＶ３−ｃｐ４５ワクチン候補のＬポリメラーゼに先に同定されたＹ９４２ＨおよびＬ９９２Ｆ温度感受性（ｔｓ）および弱毒化アミノ酸置換突然変異を、組換えＨＰＩＶ１（ｒＨＰＩＶ１）のＬポリメラーゼの相同位に導入した。ｒＨＰＩＶ１において、Ｙ９４２Ｈ突然変異は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｔｓ表現型およびハムスターにおける弱毒化（ａｔｔ）表現型を特定したが、Ｌ９９２Ｆ突然変異は、どちらの表現型も特定しなかった。ＨＰＩＶ３−ｃｐ４５およびｒＨＰＩＶ１両方のこれらの２つの突然変異は各々、単一ヌクレオチド置換によって生成され、そして野生型アミノ酸残基を特定するコドンに容易に復帰突然変異する可能性を有した。本実施例において、本発明のｒＨＰＩＶのありうる弱毒化表現型の遺伝的安定性を増加させ、そして該表現型の範囲を検討する戦略として、どちらかのコドンで、代替アミノ酸割り当てを導入する効果を評価した。
［２７２］ＨＰＩＶ１アンチゲノムｃＤＮＡを分子的に操作して、Ｌタンパク質の９４２位で他の１８アミノ酸各々を、または９９２位で１８の他のアミノ酸のうち１７の各々を特定した。９４２位での代替アミノ酸置換を持つ１３のｒＨＰＩＶ１コドン置換突然変異体、および９９２位での１０の突然変異体が、生存可能であることが示された。９４２位では、温度感受性および弱毒化がＹ９４２Ｈウイルスと同様のレベルであるいくつかの突然変異体が同定され、このうちいくつかは、Ｔｙｒの野生型割り当てをコードする２つのコドンのいずれかの３ヌクレオチドが異なっていた。こうした突然変異体の１つ、Ｙ９４２Ａウイルスは、比較的不安定な単一ヌクレオチド置換を伴うＹ９４２Ｈウイルスに比較して、逐次的に上昇する制限温度で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで連続継代した際、高レベルの遺伝的安定性および表現型安定性を所持することが、直接確認された。９９２位では、Ｌ９９２Ｆウイルスと対照的に、ｔｓ表現型およびａｔｔ表現型を所持する３つの置換突然変異体、Ｌ９９２Ｖ、Ｌ９９２ＣおよびＬ９９２Ｎが得られた。これらの知見は、遺伝的安定性増加および／または弱毒化増加を特定するコドン置換突然変異を同定し、こうした特性は、生弱毒化ＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ２における突然変異には非常に望ましい。
［２７３］ＨＰＩＶ３主鎖において、Ｙ９４２ＨおよびＬ９９２Ｆ突然変異は、各々、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｔｓ表現型を、そしてハムスターにおいてａｔｔ表現型を特定する。本実施例の１つの目的は、ＨＰＩＶ１主鎖において、各突然変異の影響を決定し、そして生弱毒化ＨＰＩＶにおけるｔｓおよびａｔｔアミノ酸点突然変異の遺伝的安定性および表現型安定性を増加させる、一般的な戦略を認証することである。ＲＮＡウイルスの高い突然変異率は、一般的に、単一ヌクレオチド変化を遺伝的にそして表現型的に不安定にする。ｔｓ表現型喪失の１つの機構は、ヌクレオチド置換を野生型割り当てに復帰突然変異させることであるため、野生型アミノ酸コード割り当てを回復するのに２または３のヌクレオチド変化が必要とされるようなｒＨＰＩＶ１コドンの修飾を求めた。この戦略は、以前、Ｅ２ウイルス粒子タンパク質のいくつかの部位で、コドン置換突然変異を所持する、一組の弱毒化組換えシンドビスウイルスを生成するのに使用された（Ｐｏｌｏら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６５：６３５８−６１，１９９１；Ｓｃｈｏｅｐｐら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９３：１４９−５９，１９９３）。これらの組換えウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏで異なるレベルの弱毒化を示したが、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの表現型安定性は検討されなかった。したがって、我々は、ｒＨＰＩＶ１コドン９４２および９９２で突然変異誘発を用いて、各位での可変アミノ酸コード割り当ての範囲を検討し、そして各々、９４２位で異なるアミノ酸を持つ１３のｒＨＰＩＶ１ウイルス、および各々、９９２位で置換を有する１０のウイルスを回収した。これらのコドン置換突然変異体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの複製の温度感受性に関して、そしてハムスター気道における複製能力に関して、アッセイした。両コドンで、弱毒化または遺伝的安定性が増加したｒＨＰＩＶ１ウイルスを同定した。これらの突然変異は、有効な免疫原性組成物および方法の開発のため、ｒＨＰＩＶ１およびｒＨＰＩＶ２における弱毒化突然変異として有用であろう。
ウイルスおよび細胞
［２７４］５％ＦＢＳ、ゲンタマイシン硫酸（５０μｇ／ｍｌ）、および２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州グランドアイランド）を補ったＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中で、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７．１）およびＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２３）を維持した。先に記載されるように（Ｎｅｗｍａｎら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７−９２，２００２）、組換えＨＰＩＶ１（ｒＨＰＩＶ１）およびｒＨＰＩＶ１突然変異体をＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で増殖させた。
［２７５］アンチゲノムＨＰＩＶ１ ｃＤＮＡの点突然変異の構築。Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）を用いて、別の箇所に記載される修飾ＰＣＲ突然変異誘発プロトコル（Ｍｏｅｌｌｅｒら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：７６１２−２０，２００１）を用いて、適切なｒＨＰＩＶ１サブゲノムクローンに、突然変異を導入した（Ｎｅｗｍａｎら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７−９２，２００２）。次いで、ＰＣＲ増幅された領域全体に渡って、ＢｉｇＤｙｅ配列決定キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、英国ワーリントン）とともにＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ３１００配列決定装置を用いて、突然変異を含有するサブゲノムクローンを配列決定して、サブクローンが、導入された突然変異を含有するが、ＰＣＲ増幅中に導入された偶発的ないかなる突然変異も含有しないことを確認した。標準的な分子クローニング技術を用いて、突然変異を含有する全長ＨＰＩＶ１ ｃＤＮＡクローン（ＦＬＣ）を組み立て（Ｎｅｗｍａｎら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７−９２，２００２）、そして上述のように、各ＦＬＣに導入された突然変異を含有する領域を配列決定して、ＦＬＣが、導入された突然変異を含有することを確実にした。
ｒＨＰＩＶ１突然変異体ウイルスの回収
［２７６］先に記載されるように（Ｎｅｗｍａｎら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７−９２，２００２）、ｒＨＰＩＶ１突然変異体の回収を行った。ウイルスが適切な突然変異を含有することを確認するため、Ｑｕｉａｑｕｉｃｋ ｖＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を感染細胞上清液から単離し、そして先に記載されるように（Ｎｅｗｍａｎら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７−９２，２００２）、ＲＴ−ＰＣＲによって、各々の適切な領域を増幅し、そして配列決定によって解析した。この研究におけるウイルスＲＮＡの配列解析はすべて、クローニングされていないＲＴ−ＰＣＲ産物の直接解析を伴った。ＲＴ酵素が省略された、対照ＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、ＲＴ−ＰＣＲ産物が混入ＤＮＡでなく、ＲＮＡから生成されることを確認した。コドン置換突然変異を含有するＦＬＣに関しては、上述のように、ＨＰＩＶ１野生型Ｌタンパク質配列を含有するｐＴＭ（Ｌ１）補助プラスミドを用いて、最初のウイルス回収の試みを行った（Ｎｅｗｍａｎら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７−９２，２００２）。９４２コドンまたは９９２コドンを伴ういくつかの例では、回収されたウイルスは、野生型Ｌコードタンパク質コード配列を含有したことから、ｐＴＭ（Ｌ１）補助プラスミドおよび突然変異体ＦＬＣ（１１）間で、組換えが起こったことが示された。したがって、続いて、野生型ｐＴＭ（Ｌ１）補助プラスミドを、救出しようとするＦＬＣに存在する適切なＬ突然変異を含有するものと交換して、回収の試みを行った。回収されたｒＨＰＩＶ１ウイルスは、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）においてＬＬＣ−ＭＫ２単層を用いた最終希釈（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）を２回連続した周期で行うことによって、生物学的にクローニングした。ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列解析によって、生物学的にクローニングされたウイルス各々に導入された突然変異が存在することを確認した。
［２７７］許容温度および制限温度でのＬＬＣ−ＭＫ２細胞におけるｒＨＰＩＶ１突然変異体の複製。先に記載されるように（３４）、３２℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、および３９℃で、ｒＨＰＩＶ１野生型ウイルスのものと各ｒＨＰＩＶ１突然変異体ウイルスの複製レベルを比較することによって、該突然変異体ウイルス各々のｔｓ表現型を決定した。ミリリットルあたりの平均ｌｏｇ１０５０パーセント組織培養感染用量として表すウイルス力価（ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を、１〜３の別個の実験で測定した。３２℃の許容温度での力価に比較することによって決定される、各制限温度での力価（ｌｏｇ）の減少を、各実験に関して記録して、そして平均減少を計算した。ｔｓ表現型は、野生型ウイルスに比較して、１００倍以上の力価減少と定義された。
ハムスター気道におけるｒＨＰＩＶ１突然変異体ウイルスの複製
［２７８］４週齢ゴールデンシリアンハムスターに、野生型または突然変異体ＨＰＩＶ１ １０６．０ＴＣＩＤ５０を含有するＬ−１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州グランドアイランド）０．１ｍｌを鼻内接種した。４日後、先に記載されるように、鼻甲介および肺を収集した（Ｎｅｗｍａｎら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：７７−９２，２００２）。３２℃でＬＬＣ−ＭＫ２単層上で力価測定することによって、試料中に存在するウイルスを定量化した。感染後、第６日に、モルモット赤血球を用いた赤血球吸着によって、感染細胞を検出した。６匹のハムスターの各群に関して、平均力価（ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｇ）を計算した。ａｔｔ表現型は、野生型に比較して、どちらかのまたは両方の解剖学的位置での、ウイルス力価の１００倍以上の減少と定義された。
［２７９］制限温度での継代による、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞におけるｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２ＨおよびｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ａの遺伝的安定性および表現型安定性の決定。細胞あたりおよそ０．０１ＴＣＩＤ５０の投入接種物とともに、元来のＹ９４２Ｈ突然変異またはＹ９４２Ａ突然変異を伴うｒＨＰＩＶ１突然変異体を、細胞病理が可視になるまで（およそ５〜７日間）、ＬＬＣ−ＭＫ単層上、３２℃で増殖させた。上清のウイルスを１／１０００に希釈し、そしてＬＬＣ−ＭＫ２単層上、３２℃で再び継代した。これを全部で１０継代反復した。あるいはまた、２つのウイルスを、以下のように、次第に制限していく温度でも継代した：２継代（上述のとおり）３２℃、２継代３５℃、２継代３６℃、そして２継代３７℃、その後、２回目の３７℃継代から未希釈で採取した上清を、ＬＬＣ−ＭＫ２単層に３８℃で継代し、そして次いで３９℃で１回継代し、全部で１０継代とした。
［２８０］各継代レベルで、表現型解析および遺伝子型解析のため、アリコットを凍結した。ｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２ＨおよびｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ａ両方の複製レベルおよび温度感受性を決定し、そして上述のようにｒＨＰＩＶ１に比較した。上述のように、各ウイルスの配列解析を行った。
結果
Ｌタンパク質におけるアミノ酸９４２位でのコドン置換突然変異を所持するｒＨＰＩＶ１の回収
［２８１］逆遺伝学によって、ｒＨＰＩＶ１の相同位に、弱毒化ＨＰＩＶ３−ｃｐ４５ウイルスのＬタンパク質中でＹ９４２Ｈ突然変異を導入し、ｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ｈと称する生存可能ウイルスを生じた（表５）。元来のＨＰＩＶ３−ｃｐ４５ウイルスにおけるように、ｒＨＰＩＶ１のこの突然変異は、単一ヌクレオチド置換を伴った（ＴＡＣからＣＡＣ、置換を下線で示す）。Ｔｙｒ（ＴＡＴおよびＴＡＣ）およびＨｉｓ（ＣＡＴおよびＣＡＣ）のありうるコドンの配列を考慮すると、このアミノ酸置換は、単一のヌクレオチド変化より多くを伴うようには設計不能であった。このアミノ酸遺伝子座を伴う、ありうる表現型の全範囲を評価するため、９４２位が、１８の他のありうるアミノ酸割り当ての各々に変化した、さらなる突然変異体ｃＤＮＡを調製した。可能な場合は常に、野生型Ｔｙｒ割り当ての２つのありうるコドンに比較して、ヌクレオチド変化の数を最大にするようにコドンを選択した（表５）。
表５．Ｌタンパク質におけるアミノ酸９４２位でのコドン置換突然変異を所持するｒＨＰＩＶ１の回収
Figure 0004549188
ａ．野生型の場合、チロシン（Ｙ）に対する野生型アミノ酸を生ずる２つの可能なコドンを示す；各突然変異体に対してｒＨＰＩＶ１への導入に選択されるコドンを示す。
ｂ．ｎｄ．は実行せず：ウイルスが以前に配列決定した野生型あるか、またはウイルスが収集されなかったためにＬ遺伝子配列を確かめられなかった。
ｃ．指示したコドン置換を含むｐＴＭＬでウイルスを収集した。その他のウイルスは野生型ｐＴＭＬを用いて収集した。
ｄ．−は回収せず。
［２８２］これらの１８のさらなるコドン置換突然変異体のうち、１３が感染性ウイルス中に回収された。望ましいｒＨＰＩＶ１組換え体が、３〜５回の試みの後、回収されなかった場合、その突然変異体は生存不能とみなした。回収されたウイルスを各々、生物学的にクローニングし、そして全Ｌ遺伝子を配列決定して、各場合で、導入した突然変異の存在を確認した。１４の回収されるｒＨＰＩＶ１コドン置換突然変異体のうち、元来のＹ９４２Ｈ突然変異体を含めて、３つが各々、Ｌ中で、１つのさらなる偶発的なコード突然変異を有することが見出された（表５）。徹底的な配列解析を行うのに、余分な便法が関与する場合、クローニングした生物学的に得られるウイルスまたは組換えウイルスにおいて、しばしば表現型的にサイレントである、偶発的な突然変異が発見されることは珍しいことではない。これらの３つの突然変異体に示される表現型に対する、これらの偶発的な突然変異のありうる寄与について、さらに研究はしなかったが、これは、Ｌ ＯＲＦにおける偶発的な突然変異を欠く１１の突然変異体が、本研究の目的の解析には十分すぎるためであった。１４のｒＨＰＩＶ１−９４２コドン置換突然変異体の各々は、３２℃、ｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に複製し、そして少なくとも１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価を達成した（表６）。
表６．ｒＨＰＩＶ１タンパク質コドン９４２置換突然変異体の温度感受性および弱毒化表現型
Figure 0004549188
ａ．減少を３２℃での力価に対して比較する。値は３回の実験の平均を表す。
ｂ．太字の値はウイルスの力価がｒＨＰＩＶ１の力価より１００倍以上減少した際の温度である。
ｃ．下線の値はｒＨＰＩＶ１と比較して１００倍より大きな減少を表す。
ｒＨＰＩＶ１コドン９４２置換突然変異体の温度感受性および弱毒化表現型
［２８３］ＨＰＩＶ３−ｃｐ４５から移入されたＹ９４２Ｈ突然変異を所持するｒＨＰＩＶ１ウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで強くｔｓであり、３２℃に比較して３５℃で、ウイルス収量に２．６ｌｏｇ１０の減少を示した（表６）。これは、この「移入」突然変異が、ｒＨＰＩＶ１主鎖において、ｔｓ突然変異として有効に機能することを立証する。驚くべきことに、１３の他の回収されたｒＨＰＩＶ１突然変異体の各々もまたｔｓであり、そして温度感受性のある範囲が、突然変異体に共通して見られた。５つのｒＨＰＩＶ１突然変異体、すなわちＹ９４２Ｄ、Ｙ９４２Ｍ、Ｙ９４２Ａ、Ｙ９４２Ｖ、またはＹ９４２Ｌ突然変異を持つものは、ｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ｈと同程度にｔｓであることが見出され、そして残りの４つは、９４２位のＴｙｒを回復するのに、各々、３ヌクレオチド変化を必要とするであろうコドンを伴った。したがって、本明細書の解説にしたがって、９４２位で野生型Ｔｙｒ残基を回復するのに３ヌクレオチド変化を必要とする、ｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ｈのものに匹敵するｔｓ表現型を持つウイルスが容易に生成可能であった。
［２８４］コドン置換ウイルスが感染ハムスターの上気道（鼻甲介）および下気道（肺）で複製する能力を、野生型ｒＨＰＩＶ１のものに比較した（表６）。ＨＰＩＶ３−ｃｐ４５から移入されたＹ９４２Ｈ突然変異を所持するｒＨＰＩＶ１は、そのｒＨＰＩＶ１親ウイルスのものに比較して、ハムスター上気道および下気道両方で非常に弱毒化されていた（表６）。これによって、このＨＰＩＶ３から得られる突然変異が、ＨＰＩＶ１主鎖においてａｔｔ突然変異として効率的に機能することが立証される。ＨＰＩＶ１野生型に比較して上気道または下気道いずれかにおいてウイルス力価の１００倍以上の減少を示すことによって定義される（表６の下線で示した値）ように、１３のｒＨＰＩＶ１突然変異体のうち１１がハムスターにおいて弱毒化されていた。野生型アミノ酸を回復するのに、コドン９４２において、３ヌクレオチド変化を必要とするであろう、６つのｒＨＰＩＶ１突然変異体の各々（Ｙ９４２Ｍ、Ｙ９４２Ａ、Ｙ９４２Ｔ、Ｙ９４２Ｇ、Ｙ９４２ＶおよびＹ９４２Ｌ）は、ｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ｈと同程度に弱毒化されていた。したがって、本発明にしたがって、９４２位で、野生型Ｔｙｒを回復するのに３ヌクレオチド変化を必要とする、ｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ｈと匹敵するａｔｔ表現型を持つウイルスを産生可能である。
制限温度での元来のＹ９４２Ｈ突然変異または「安定化」Ｙ９４２Ａコドンを持つｒＨＰＩＶ１突然変異体の継代
［２８５］ｔｓウイルスに関して、制限温度でのウイルスの継代は、ｔｓ表現型の安定性レベルを測定する、有効な方法である（Ｂｅｌｓｈｅら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ２４：８−１２，１９７７；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら，Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ５４：５３−６０， １９９７；Ｔｒｅａｎｏｒら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：７６８４−８，１９９４）。したがって、この方法を使用して、コドン９４２に単一ヌクレオチド置換を含有する元来の突然変異体（ｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ｈ）のｔｓ表現型の安定性と、このコドンに３ヌクレオチド置換を含有するｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ａのものとを比較した。２つのウイルスを、（ｉ）３２℃の許容温度で１０回継代するか、または（ｉｉ）以下のように、次第に制限していく温度でも継代した：３２℃２回、３５℃２回、３６℃２回、３７℃２回、３８℃１回、そして３９℃１回、全部で１０継代。多様な継代レベル由来のウイルスアリコットをｔｓ表現型に関して解析し、そしてＬ遺伝子の部分的配列解析または完全配列解析に供した（表７）。
表７．制限温度での継代に続くＬタンパク質Ｙ９２４Ｈ突然変異（１ヌクレオチド置換）又はＹ９４２Ａ突然変異（３ヌクレオチド置換）を有するｒＨＰＩＶ１の温度感受性および配列解析
Figure 0004549188
シリーズ１および２はそれぞれ許容温度および制限温度処方でのＹ９４２Ｈ突然変異体に関する（材料および方法）。シリーズ３は許容処方でのＹ９４２Ａ突然変異体に関し、一方、シリーズ４および５は制限処方での独立したパラレルなシリーズである。
試料はシリーズ１−５内で様々な継代レベルから解析された：各継代レベルはその数（ｐ１−ｐ１０）およびその温度（３２−３９、３２℃−３９℃を表す）によって同定される。
コンセンサス配列をクローニングしないＲＴ−ＰＣＲ産物から決定した。
配列決定したＬ遺伝子の要旨は：Ｆ（全長）、全体のＬ遺伝子ＯＲＦ；Ｐ、部分、ヌクレオチド１０，０００−１３，３００、Ｃ、コドン−隣接、コドン９４２を即座に取り囲む領域であった。
太字の値はウイルス力価がｒＨＰＩＶ１野生型ウイルスの力価より１００倍以上減少した温度である。
検出できないウイルス。
電気泳動図はコドン１１２５におけるヌクレオチド１２１４３での各ヌクレオチド（ＡまたはＧ）の５０％を示した。
［２８６］２つの突然変異体ウイルス、ｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２ＨおよびｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ａの各々のｔｓ表現型は、３２℃で１０継代（それぞれ、表７の継代シリーズ１および３）まで不変であり、そして各Ｌ遺伝子の配列解析によって、それぞれの突然変異体コドンが不変であることが示され、そしてさらなる突然変異は検出されなかった。対照的に、制限温度でのｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ｈ突然変異体の継代（表７の継代シリーズ２）からのアリコットの解析は、継代レベルｐ６−３６（３６℃）によって、ウイルスがそのｔｓ表現型を失い、そしてコドン９４２でのコンセンサス配列は、Ｔｙｒの野生型割り当てのものに直接復帰突然変異した（ＣＡＣからＴＡＣ）ことを示した。この単一ヌクレオチド変化は、Ｙ９４２Ｈ−ｐ６が制限温度で複製する能力を回復し、これに関連して、ｒＨＰＩＶ１野生型ウイルスと区別不能となった。継代レベルｐ９−３８およびｐ１０−３９（それぞれ３８℃および３９℃、継代シリーズ２、表３）由来のウイルスの全Ｌ遺伝子の配列解析によって確認されるように、次第に制限していく温度でのさらなる継代の後でさえ、このウイルスのＬ遺伝子に、他の突然変異はなかった。
［２８７］継代の２つの独立のシリーズにおいて、Ｙ９４２Ａ突然変異体は、３８℃または３９℃の非常に制限する温度であっても、コドン９４２を復帰突然変異させず（表７、継代シリーズ４および５）、すなわちコドン９４２の配列は、配列決定したすべての継代で、ＧＣＧのままであった。継代レベルｐ８−３７およびｐ９−３８（それぞれ３７℃および３８℃、表７、継代シリーズ４）由来のウイルスの温度感受性レベルは、３８℃および３９℃両方で非常にｔｓのままであった。しかし、ｔｓ表現型の部分的喪失があり、これらの単離体の複製は、元来のＹ９４２Ａ突然変異体に比較して、３８℃で約２０倍増加した（表３、継代シリーズ４）。ｔｓ表現型のこのシフトは、Ｌタンパク質における２つの第二の部位のアミノ酸の点突然変異、Ｖ１０１６ＬおよびＮ１１２５Ｄの獲得と関連した。にもかかわらず、ｐ８−３７およびｐ９−３８ウイルスは、野生型ｒＨＰＩＶ１よりも３８℃での複製が２００倍制限されたままであり、そしてどちらのウイルスも、ｔｓアッセイにおいて、３９℃での複製に失敗した。これによって、Ｌ中の２つの第二の部位の突然変異の獲得が、Ｙ９４２Ａ突然変異によって特定される温度感受性レベルを部分的に抑制したことが示唆された。完全Ｙ９４２Ａ ｐ９−３８ゲノムは配列決定されていないため、１以上の遺伝子外抑制突然変異もまた存在する可能性もある。同様に、独立継代シリーズ（表７、継代シリーズ５）のｐ１０−３９（３９℃）継代レベル由来のウイルスは、３８℃で、野生型ｒＨＰＩＶ１および出発Ｙ９４２Ａウイルスの間の中間レベルの温度感受性を示したが、十分にｔｓのままであり、３９℃で複製するのに失敗した（表７）。この温度感受性の部分的喪失は、Ｌ中の三番目の第二の部位の突然変異、すなわちＳ１３２８Ｐの発展に関連した。したがって、単一ヌクレオチド置換を伴うｔｓ突然変異は、容易に野生型割り当てに復帰突然変異し、そして制限温度での継代中、迅速に主なウイルス種になった。対照的に、野生型と３ヌクレオチド異なるコドンを伴う場合、復帰突然変異は観察されないが、次第に制限していく温度で８回継代した後、ｔｓ表現型の部分的喪失が観察され、そして推定上の第二の部位の遺伝子内抑制突然変異が検出された。
Ｌタンパク質のアミノ酸９９２位でのコドン置換突然変異を所持するｒＨＰＩＶ１の回収
［２８８］逆遺伝学によって、ＨＰＩＶ３−ｃｐ４５ Ｌ由来の第二のＬタンパク質突然変異、Ｌ９９２Ｆを、ｒＨＰＩＶ１の相同位に導入し、ｒＨＰＩＶ１−Ｌ９９２Ｆと称する生存可能ウイルスを生じた（表８）。９９２位が、１８の他のありうるアミノ酸割り当てのうちの１７に変化したさらなる突然変異体も構築した（Ｓｅｒのみを欠く、表８）。Ｌｅｕの野生型割り当てに関してありうるコドンに比較して、ヌクレオチド相違の数を最大にするようにコドンを選択したが、これは、Ｌｅｕに６つの異なるコドンが存在するため、困難であった。にもかかわらず、置換突然変異のうち９つは、いかなるＬｅｕコドンに比較しても２つのヌクレオチド相違を伴うように設計可能であった（表８）。これらの１７のさらなる突然変異のうち、適切な突然変異を所持する１０の組換えウイルスを回収し、そしてこれらはｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に増殖し、そしてこれらを生物学的にクローニングした。７つの残ったｒＨＰＩＶ１突然変異のうち、３つ（Ｌ９９２Ｒ、Ｌ９９２Ｐ、およびＬ９９２Ｑ）をトランスフェクション採取物中に回収したが、これらは生物学的クローニングの間に野生型に復帰突然変異し、２つの他のもの（Ｌ９９２ＥおよびＬ９９２Ｄ）は、トランスフェクション採取物中に回収されたが、非常に非効率的にしか複製せず、そして増殖不能であった。２つの他のもの（Ｌ９９２ＧおよびＬ９９２Ｔ）は、ｗｔ ｐＴＭ（Ｌ１）と組換えられ、そしてさらには研究されなかった。回収された安定突然変異体ウイルス各々において、突然変異部位の周囲でＬ遺伝子を配列決定し、そして導入された各突然変異の存在を確認した。回収されたコドン９９２置換突然変異体は各々、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、３２℃で効率的に複製し、そして１０７ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上の力価を達成した（表９）。
表８．Ｌタンパク質におけるアミノ酸９９２位でのコドン置換突然変異を所持するｒＨＰＩＶ１の回収
Figure 0004549188
ａ．野生型の場合、ロイシン（Ｌ）に対する野生型アミノ酸を生じる６つの可能なコドンを示す；各突然変異体に対してｒＨＰＩＶ１への導入に選択されるコドンを示す。Ｌ９９２Ｓ突然変異を所持するｃＤＮＡは構築されなかった。
ｂ．突然変異体を収集したが、３２℃で継代中に野生型に復帰し、さらに試験しなかった。
ｃ．野生型ｐＴＭＬ１で組換えた突然変異体はさらに試験しなかった。
ｄ．ウイルスをトランスフェクションから収集したが、力価は低く、ウイルスをその後の継代で消失した。
表９．ｒＨＰＩＶ１タンパク質コドン−９９２置換突然変異体の温度感受性および弱毒化
Figure 0004549188
ａ．３２℃での力価に対して減少を比較した。値は２−３回の実験の平均を表す。
ｂ．太字の値はウイルスの力価がｒＨＰＩＶ１の力価より１００倍以上減少した際の温度である。
ｃ．下線の値は同じ肺のコンパートメントにおけるｒＨＰＩＶ１と比較して１００倍より大きく減少したものを表す。
ｄ．このウイルスの他の調製物は≧１０７の力価を有し、許容温度での効率的な増殖を示す。
ｒＨＰＩＶ１コドン９９２置換突然変異体の温度感受性および弱毒化表現型
［２８９］ＨＰＩＶ３−ｃｐ４５から移入したＬ９９２Ｆ突然変異を所持するｒＨＰＩＶ１ウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｔｓではなかった（表９）。回収された１０のさらなるｒＨＰＩＶ１突然変異体のうち６つはｔｓであり、そしてある範囲の温度感受性が、該突然変異体に共通して見られた。１つのウイルス、ｒＨＰＩＶ１−Ｌ９９２Ｃは、温度感受性の最大レベルを示し、３６℃での複製は１００倍減少していた。したがって、本明細書の解説にしたがって、元来の非ｔｓ ｒＨＰＩＶ１−Ｌ９９２Ｆ突然変異体と対照的に、実質的にｔｓである、ｒＨＰＩＶ１コドン９９２置換突然変異体を生成した。
［２９０］ハムスターの上気道および下気道におけるコドン９９２置換突然変異体の複製レベルを、ｒＨＰＩＶ１のものと比較した（表９）。ｒＨＰＩＶ１−Ｌ９９２Ｆウイルスは、ハムスターにおいては弱毒化されなかった：したがって、Ｌ９９２Ｆ突然変異は、ＨＰＩＶ３中で弱毒性である（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：１７６２−８，１９９８）がＨＰＩＶ１中ではそうではなかった。しかし、１０の他の回収されたコドン９９２置換突然変異のうち３つ（Ｌ９９２Ｖ、Ｌ９９２Ｎ、およびＬ９９２Ｃ）は、野生型ウイルスに比較して、その複製が１００倍以上減少した。したがって、本明細書の解説にしたがって、ａｔｔ表現型を持つ、いくつかのｒＨＰＩＶ１コドン９９２置換突然変異体を提供した。興味深いことに、ｒＨＰＩＶ１−Ｌ９９２Ｖ突然変異体は、わずかにｔｓであったのみであり、Ｌ９９２Ｖ突然変異が、主に非ｔｓ−弱毒化表現型を与えることが示唆された。
［２９１］ｃＤＮＡから組換えマイナス鎖ＲＮＡウイルスを回収する能力によって、野生型ウイルスに弱毒化突然変異を計画して導入することにより、免疫原性組成物で使用する生弱毒化ウイルス候補を開発することが可能になる。これは、進行中の前臨床および臨床評価に応じて、弱毒化および免疫原性の間の望ましいバランスが達成されるまで、経時的な方式で、行うことも可能である（Ｃｏｌｌｉｎｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９６：２０４−１１，２００２；Ｍｕｒｐｈｙら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１０：２１−７，２００２）。本発明内で、製造中、およびヒトにおけるこれらの呼吸器系ウイルスの短期間の複製中、弱毒化表現型の喪失の可能性を少なくするため、十分な数の弱毒化突然変異の集積によって、ｒＨＰＩＶ１およびｒＨＰＩＶ２の遺伝的安定性を達成することも可能である（Ｃｏｌｌｉｎｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９６：２０４−１１，２００２；Ｍｕｒｐｈｙら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１０：２１−７，２００２）。さらに、遺伝子全体の欠失、または現在の研究におけるような、点突然変異の「安定化」など、安定性が改善された弱毒化突然変異を設計することも可能である。部分的に弱毒化されたウイルスに、ｔｓ表現型およびａｔｔ表現型を特定する点突然変異を付加することは、呼吸器合胞体ウイルスおよびＨＰＩＶ３などのウイルスの弱毒化増加に有用である（Ｃｏｌｌｉｎｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９６：２０４−１１，２００２；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６０：１２５−３５，１９９９）。しかし、上に示すように、これらの突然変異に特定されるａｔｔ表現型は、ｉｎ ｖｉｖｏでの複製中、直接復帰突然変異または他の突然変異による修飾にさらされる可能性もある（Ｔｏｌｐｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １１２：５０５−５１７，１９８１；Ｗｒｉｇｈｔら，Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １８２：１３３１−１３４２，２０００）。分子操作は、ｔｓ表現型およびａｔｔ表現型を特定するコドンを改変することを可能にするため、本研究は、既定の遺伝子座で、選択した代替コドンが、ｔｓ−ａｔｔ突然変異の遺伝的安定性を増進し、そして弱毒化レベルを増大させるのに使用可能であるかどうかを解明するのに有用であった。
［２９２］ＨＰＩＶ３−ｃｐ４５のＬ遺伝子のＹ９４２Ｈ突然変異を、対応するｒＨＰＩＶ１の位に導入することによって、ｔｓ表現型およびａｔｔ表現型を所持するウイルスを生じた。しかし、これらの表現型は、コドン９４２の単一ヌクレオチド置換の結果であり、そしてしたがって不安定性の対象になりうる。コドン９４２の多様な代替アミノ酸割り当てを含有し、そしてすべてｔｓである、１３のさらなる生存可能ｒＨＰＩＶ１突然変異体を生成した。５アミノ酸置換突然変異体を回収するのに失敗したことが注目され、これは、コドン９４２のこれらのアミノ酸を特定する突然変異が行き止まりの突然変異（ｄｅａｄ−ｅｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ）である、すなわちこれらが生存不能であることを示す。にもかかわらず、１３の回収された生存可能突然変異体のうち１１が、ハムスター気道における複製に関して弱毒化していることが首尾よく立証された。コドン９４２で野生型Ｔｙｒ残基を特定するコドンを生成するのに、３ヌクレオチド変化が起こることを必要とする、６の非常に弱毒化した突然変異体（９４２位でＭｅｔ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＬｅｕ置換を持つもの）が同定された。しかし、１３の回収されたｒＨＰＩＶ１突然変異体の２つの他の突然変異体（９４２位でＣｙｓまたはＰｈｅを持つもの）は、ハムスターにおいて、野生型ＨＰＩＶ１と同程度に効率的に複製した。したがって、天然存在Ｔｙｒ−９４２割り当ては、野生型様表現型を与える唯一のものではなく：Ｃｙｓ−９４２およびＰｈｅ−９４２も同様であった。
［２９３］したがって、本発明は、（ｉ）適切なレベルの弱毒化を特定し、そして（ｉｉ）Ｔｙｒ、ＣｙｓおよびＰｈｅのすべてのありうるコドンとは、２または好ましくは３ヌクレオチド異なるという、９４２割り当てを選択するさらなる指示および指針を提供する。６つの非常に弱毒化されたウイルスのうち４つ（Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはＬｅｕ置換を持つもの）に関しては、９４２位でＴｙｒ、Ｃｙｓ、またはＰｈｅを持つウイルスを生じさせるのに、そのコドンの２つのヌクレオチド置換しか必要でないであろう。残る２つの非常に弱毒化されたウイルス（ＡｌａまたはＴｈｒ割り当てを持つもの）は、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、またはＰｈｅのコドンを生成するのに３つのヌクレオチド置換を必要とするであろう。したがって、１３の生存可能コドン９４２置換突然変異のｔｓ表現型およびａｔｔ表現型のこの体系的調査において、非常に弱毒化され、そして野生型様表現型を持つウイルスを生じるのに、３つのヌクレオチド変化が起こることを必要とするであろう、コドン９４２置換として、Ｙ９４２ＡおよびＹ９４２Ｔ突然変異が同定された。幸運なことに、これらのウイルスはどちらも、Ｌ遺伝子における偶発的な突然変異なしに回収された１１の突然変異体の中にあり、そしてしたがって、これらの知見は明確であった。
［２９４］制限温度での複製後、これらの２つのｒＨＰＩＶ１ウイルスのうちの１つ、Ｙ９４２Ａウイルスの遺伝的安定性および表現型安定性を調べた。これは、野生型と１ヌクレオチドしか異ならない、元来のＹ９４２Ｈウイルスと並行して行った。Ｙ９４２Ｈウイルスは、３５〜３６℃で４回しか継代しなくても、野生型表現型に容易に復帰突然変異し、一方、「コドン安定化」Ｙ９４２Ａウイルスは、上昇した温度で８回継代しても、ｔｓ表現型の部分的な喪失しか示さなかった。Ｙ９４２Ｈウイルスの表現型不安定性には、コドン９４２での野生型配列への直接復帰突然変異が伴った。この変化は、上昇した温度での複製の後に初めて起こり、ｔｓ ｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ｈ復帰突然変異体に関して選択する際に、上昇した温度が果たす役割が重要であることを立証した。
［２９５］配列解析によって、「安定化」Ｙ９４２Ａウイルスが、上昇した温度での継代の間、ＧＣＧ Ａｌａコドンを保持したことが確認された。しかし、上に言及されるｔｓ表現型の部分的喪失は、Ｌの３つの異なる位を伴う、１つまたは２つの第二の部位のアミノ酸置換の獲得と関連した。これによって、これらが、３８℃でｒＨＰＩＶ１−Ｙ９４２Ａが複製する能力を部分的に回復する、シストロン内抑制因子突然変異であることが示唆される。上昇した温度で突然変異体の複製を部分的に回復するのに寄与する、例えばＰまたはＮにおける、シストロン外抑制因子突然変異が発展した可能性もある（Ｍｕｃｋｅｅｔら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５８：１１２−７，１９８７；Ｔｒｅａｎｏｒら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：７６８４−８，１９９４）。「安定化」Ｙ９４２Ａウイルスが、非常に制限する温度での継代後であっても、高い度合いの温度感受性を保持するという知見から、該ウイルスが、「非安定化」Ｙ９４２Ｈウイルスよりも、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで表現型的にもまた、より安定であることが示唆される。ＨＰＩＶ１ Ｌタンパク質の残基９４２でのコドン置換のこの解析によって、生弱毒化ウイルスに含まれることが望ましい弱毒化および表現型安定性／遺伝的安定性両方を含む一組の特性を示す突然変異をどのように同定するかの例が提供される。この特定の例は、「安定化」突然変異体割り当ての選択を容易にするいくつかの利点を有することがわかった：（ｉ）Ｔｙｒの野生型割り当ては２つのありうるコドンしか持たず、そして（ｉｉ）代替アミノ酸割り当てを持つ突然変異体の中で、２つのみが非常に弱毒化されており、そして（ｉｉｉ）これらの２つの割り当ては各々、２つのありうるコドンしか持たない。
［２９６］野生型ＨＰＩＶ３主鎖にＨＰＩＶ３−ｃｐ４５ Ｌ９９２Ｆ Ｌタンパク質突然変異を導入すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｔｓ表現型が、そしてハムスターにおいてａｔｔ表現型が生じることが先に報告され（３０）、Ｌ９９２Ｆは、独立ｔｓ ａｔｔ突然変異と同定された。しかし、本研究において、この突然変異を、ＨＰＩＶ１バックグラウンドで相同位に導入しても、どちらの表現型も生じなかった。コドン９９２で代替アミノ酸割り当てを導入すると、１７の突然変異体のうち１０しか回収されず、この部位が実際に突然変異に感受性であることが示された。ｒＨＰＩＶ１野生型ウイルスに比較して、ハムスターの上気道または下気道における複製が１０〜１００倍制限されている、３つのコドン置換突然変異体、ｒＨＰＩＶ１−Ｌ９９２Ｖ、ｒＨＰＩＶ１−Ｌ９９２Ｎ、およびｒＨＰＩＶ１−Ｌ９９２Ｃを同定した。したがって、これらの知見は、コドン置換突然変異の第二の使用、すなわちｉｎ ｖｉｖｏで弱毒化レベルが増進した突然変異体を生成する使用を例示する。３つの弱毒化組換え体（ｒＨＰＩＶ１−Ｌ９９２Ｃ、ｒＨＰＩＶ１−Ｌ９９２ＶおよびｒＨＰＩＶ１−Ｌ９９２Ｎ）の各々がまた、温度感受性であることが見出されたことも興味深かった。しかし、温度感受性レベルおよび弱毒化レベルの間には、解離があった。例えば、Ｌ９９２Ｃ突然変異は、３６〜３７℃でｉｎ ｖｉｔｒｏ複製を制限し、そして主に下気道で弱毒性であり、一方、Ｌ９９２Ｖ突然変異は、３９℃でのみｉｎ ｖｉｔｒｏ複製を制限したが、上気道および下気道両方で、非常に弱毒性であった。したがって、Ｌ９９２Ｖ突然変異体は、主に、非ｔｓ型である。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの温度感受性レベルおよびｉｎ ｖｉｖｏでの弱毒化レベルの間に、概して強い関連があった、本研究で調べた、コドン９４２置換突然変異での状況とは対照的である。
［２９７］非ｔｓ弱毒化突然変異を付加することによって、ｔｓ弱毒化突然変異を含有する生弱毒化ウイルスを安定化させることも可能である（Ｍｕｒｐｈｙら，Ｖａｃｃｉｎｅ １５：１３７２−１３７８，１９９７）。また、ｔｓ突然変異は、その弱毒化効果を、気道のより暖かい領域の下気道で、より顕著に発揮し、一方、非ｔｓ突然変異は、この温度勾配とは関係なく弱毒化する。したがって、両方の種類の突然変異の混合が、深刻な下気道疾患を防止し、そして上気道うっ滞（ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）を減少させる二重の目的を達成するのに最適であろう。この報告で同定されるｔｓおよび非ｔｓコドン置換突然変異をここで、さらなる非ｔｓ弱毒化突然変異と組み合わせて、申し分なく弱毒化され、免疫原性組成物中で有効であり、そして遺伝的に安定であるｒＨＰＩＶ１ウイルスを生成する。
（実施例９）
組換えＨＰＩＶ１ Ｐ／Ｃ遺伝子欠失突然変異体の産生および性質決定
［２９８］本発明のさらなる側面において、組換えＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、増殖特性、弱毒化、温度感受性、低温適応、プラークサイズ、宿主範囲制限の変化、または免疫原性の変化から選択される表現型変化を特定する、さらなるヌクレオチド修飾を含んでなる。例えば、ＨＰＩＶ１において、これらのさらなる修飾は、ＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノム内のＮ、Ｐ、Ｃ、Ｃ’、Ｙ１、Ｙ２、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよび／またはＬ遺伝子、並びに／あるいは３’リーダー、５’トレーラー、遺伝子開始（ＧＳ）配列または遺伝子終止（ＧＥ）配列などのシス作用配列、および／または遺伝子間領域の１以上を改変することも可能である。例えば、１以上のＨＰＩＶ１遺伝子を全体でまたは部分的に欠失させることも可能であるし、あるいはＲＮＡ編集部位における突然変異によって、フレームシフト突然変異によって、翻訳開始部位を改変する突然変異によって、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に１以上の停止コドンを導入することによって、または転写シグナルにおける突然変異によって、該遺伝子の発現が減少するかまたは除去されることも可能である。特定の態様において、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、１以上のＣ、Ｃ’、Ｙ１、および／またはＹ２ ＯＲＦまたは他の補助遺伝子の部分的または完全欠失によって、あるいは１以上のＣ、Ｃ’、Ｙ１、および／またはＹ２ ＯＲＦまたは他の補助遺伝子の発現を減少させるかまたは除去する１以上のヌクレオチド変化によって、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムを修飾する。他の態様において、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、サイトカイン、Ｔヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、または哺乳動物宿主において免疫応答を誘発可能な微生物病原体のタンパク質から選択される非ＰＩＶ分子をコードするように修飾される。
［２９９］ウイルス感染に反応して産生される宿主細胞タンパク質であるインターフェロン類は、インターフェロン処理細胞において、ウイルスの複製を制限する、細胞における抗ウイルス状態を誘導する。これは、宿主の自然免疫の強力な構成要素であり、多くのウイルスがインターフェロンの抗ウイルス活性と対抗する、精緻な戦略を発展させてきていることは驚くべきことではない（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７９：３７５−３８４，２００１；Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ． ８１：２３４１−２３６４，２０００；Ｓａｍｕｅｌ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ． １４：７７８−８０９， ２００１）。パラミクソウイルスのＰ遺伝子における代替翻訳オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）にコードされる、多くのパラミクソウイルスのＣタンパク質およびＶタンパク質（Ｃｈａｎｏｃｋら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ中１：１３４１−１３７９，２００１）は、１型および２型インターフェロン両方に対する宿主細胞反応の阻害に関与する。ＰＩＶ１またはＰＩＶ２ウイルスのＣ ＯＲＦまたはＶ ＯＲＦに影響を及ぼす突然変異は、しばしば、この抗インターフェロン活性の除去を生じ（Ｄｉｄｃｏｃｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９；Ｇａｒｃｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：６８００−６８０７，２００１；Ｇａｒｃｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９５：２５６−２６５，２００２；Ｐａｒｉｓｉｅｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８３：２３０−２３９，２００１）、そしてこうした突然変異を持つウイルスは、インターフェロンの抗ウイルス作用に感受性となり、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏでインターフェロン適格細胞において、そしてｉｎ ｖｉｖｏでインターフェロン適格動物において、複製減少を示す（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７９：３７５−３８４，２００１）。こうした突然変異を持つウイルスは、生弱毒化ウイルスワクチンとしての使用が考慮され（Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７９：３７５−３８４，２００１）、これは、これらが既知のインターフェロン陰性細胞において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで容易に調製可能であるためである。Ｖタンパク質およびＣタンパク質は、単なる推定上のインターフェロン機能以外の機能を有し（Ｃｈａｎｏｃｋら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ中 １：１３４１−１３７９，２００１）；Ｌａｍｂら，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ中 １：１３０５−１３４０，２００１）、したがって、導入された突然変異が、付属タンパク質の機能の１以上に影響を及ぼすことも可能である。付属タンパク質の機能の完全な組は定義されていないため、ウイルスを弱毒化する、付属タンパク質における突然変異は、抗インターフェロン特性に関連しない機構によって弱毒化している可能性もある。したがって、本発明の免疫原性組成物を発展させる目的には、弱毒化がもっぱら、または部分的に、ウイルスが宿主のインターフェロン反応に完全に感受性であるようにする突然変異の存在に基づく、生弱毒化ＨＰＩＶ１の産生が含まれる。
［３００］ＨＰＩＶ１はＶ ＯＲＦを欠くため（Ｎｅｗｍａｎら，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ２４：１，７７−９２，２００２）、このウイルスの抗インターフェロンタンパク質は、１以上のＣタンパク質であることも可能である（Ｃ、Ｃ’、Ｙ１、およびＹ２タンパク質の組を含む）。インターフェロンの抗ウイルス活性と干渉し、そしてマウスに対するこのウイルスの複製を弱毒化する、センダイウイルスのＣタンパク質の突然変異が記載されてきている（Ｇａｒｃｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：６８００−６８０７，２００１；Ｇａｒｃｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９５：２５６−２６５，２００２）。組換えＨＰＩＶ３において、Ｃタンパク質に影響を及ぼすが、Ｐタンパク質には及ぼさない、単一ヌクレオチド置換突然変異が報告されてきている（Ｄｕｒｂｉｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６１：３１９−３３０，１９９９；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７３：１３７４−１３８１，１９９９ａ）。ＨＰＩＶ３ｃｐ４５ Ｃ突然変異（Ｉ９６Ｔ）またはＦ１７０Ｓ突然変異を所持するＨＰＩＶ３組換え体は、ｉｎ ｖｉｖｏで複製が制限されているが、ｉｎ ｖｉｔｒｏではされていないと報告され、そして同様に、ＣにおいてＦ１７０ＳＭＰＩＶ１突然変異を所持するｒＨＰＩＶ１は、ハムスターにおいて弱毒化されていると報告された。これらの突然変異体は、ｔｓでなく、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に複製された。これらの種類の非ｔｓ弱毒化突然変異は、本明細書に概説するように、本発明の表現型的に安定な生弱毒化ウイルスを産生する、重要な要素である。しかし、単一ヌクレオチド置換のみが、Ｆ１７０Ｓ突然変異を特定し、そしてこうした突然変異はしたがって、野生型悪性表現型に復帰突然変異するのに、単一のヌクレオチド置換しか必要としないであろう。本実施例に要約される知見は、機能上の欠失をＣタンパク質に含有する、生弱毒化ｒＨＰＩＶ１サブウイルス粒子を産生する方法を提示し、この欠失は、ｉｎ ｖｉｖｏで弱毒化表現型のより高い安定性を示すであろう。やはり記載されるのは、これらの欠失突然変異体を所持する、ｒＨＰＩＶ１ウイルスの回収である。
［３０１］ｗｔに復帰突然変異する可能性が非常に減少している生弱毒化ＨＰＩＶ１組換え体を生成するため、Ｐ ＯＲＦおよびＣ ＯＲＦの重複領域において、ＨＰＩＶ１のＰ／Ｃ遺伝子内に、欠失突然変異を導入した。細胞のインターフェロン反応（Ｇａｒｃｉｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７５：６８００−６８０７，２００１）経路と相互作用して、そして該反応を無効にする、ＨＰＩＶ１ Ｃタンパク質のＮ末端に位置する領域の突然変異を誘発した。ＰＣＲ突然変異誘発によって、この領域に突然変異を導入し、Ｃ ＯＲＦのコドン１０〜１５を欠失させた。この突然変異はまた、Ｐ ＯＲＦのコドン１３〜１９も欠失させた。Ｃ ＯＲＦコドン１０〜１１、１２〜１３、および１４〜１５を欠失させる突然変異のサブセットもまた、ＰＣＲ突然変異誘発によって生成した（各々、本明細書に援用される、Ｍｕｒｐｈｙらによって２００２年１１月２１日に出願された米国特許出願第１０／３０２，５４７号の図１３；および２００３年５月３０日に公表された、対応するＰＣＴ公報第ＷＯ０３／０４３５８７ Ａ２を参照されたい）。好ましい突然変異体は、Ｐの機能に影響を及ぼさずにＣの機能が改変されているものであり、これはＰが生存可能ＨＰＩＶ１に必要な必須タンパク質であるためである。したがって、我々はまず、これらの突然変異を含有するＰ遺伝子が、トランスフェクション細胞において、全長ｒＨＰＩＶ１アンチゲノムｃＤＮＡからｒＨＰＩＶ１を回収するのを補助する能力を評価した。これは、機能するＰ補助プラスミドが、トランスフェクションされた感染性パラインフルエンザウイルスｃＤＮＡから感染性ウイルスを回収するのに用いられる３つの補助プラスミドセットの必須構成要素であるため、Ｐ機能の適切なアッセイである。示した５つの欠失突然変異の各々を、ｐＴＭ−（Ｐ１）補助プラスミドに導入した。ＨＥｐ−２細胞を、ｐＴＭ（Ｎ１）、ｐＴＭ（Ｌ１）、全長野生型ＨＰＩＶ１アンチゲノムｃＤＮＡ、および示した欠失を含有する各ｐＴＭ（Ｐ１）でトランスフェクションし、そして上述のように、ＭＶＡ−Ｔ７に同時感染させた。驚くべきことに、各Ｐ欠失突然変異体は、ｃＤＮＡからのｒＨＰＩＶ１の回収を補助した。重要なことに、感染性ｒＨＰＩＶ１は、Ｐ補助プラスミドを欠く対照トランスフェクション反応からは回収されないことから、欠失を含有するｐＴＭ（Ｐ１）が機能することが示された。
［３０２］Ｎ末端のアミノ酸１０〜１５、またはＣタンパク質のアミノ酸１６８〜１７０の欠失を特定するＰ／Ｃ遺伝子欠失突然変異を、全長アンチゲノムＨＰＩＶ１ ｃＤＮＡに導入し、そしてこれらのｃＤＮＡを用いて、Ｐ／Ｃ遺伝子欠失を含有する突然変異体組換えＨＰＩＶ１を回収した。現在までに２つのウイルスが回収されてきており、そしてこれらは、細胞培養中で高力価に増殖したことから、導入した突然変異が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで弱毒性でないことが示される。ＨＰＩＶ１ Ｎ ＯＲＦの上流に挿入された規定数外の遺伝子からＲＳＶ Ｆタンパク質を発現し、そしてＣタンパク質アミノ酸１０〜１５の欠失をコードする組換えＨＰＩＶ１、ｒＨＰＩＶ１Ｃ：Δ１０−１５（ＦＲＳＶ）は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において、７．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌに増殖した。したがって、このｒＨＰＩＶ１は、Ｐにおける６アミノ酸欠失、Ｃにおける６アミノ酸欠失、およびＣ’における６アミノ酸欠失にもかかわらず、組織培養において、効率的に複製する。生存可能で、そして組織培養細胞において、効率的に複製可能であることを示した、この突然変異を所持するｒＨＰＩＶ１ウイルスの弱毒化は、ここで、ハムスターおよびアフリカミドリザルにおいて、容易に測定可能である。この突然変異を所持するｒＨＰＩＶ１ウイルスが適切に弱毒化され、そして免疫原性である場合、この突然変異を単独で、または他のｔｓおよび非ｔｓ弱毒化突然変異とともに、ｒＨＰＩＶ１いずれかに導入して、表現型的に安定な生弱毒化ｒＨＰＩＶを生成することも可能である。
［３０３］さらなる２コドン欠失突然変異を、Ｐ／Ｃ遺伝子の中央に導入した。この突然変異は、アミノ酸Ｆ１７０に渡り、ｒＨＰＩＶ１ Ｃタンパク質のアミノ酸残基１６８〜１７０のその置換は、非ｔｓ弱毒化表現型を生じることが示された。突然変異はまた、ｐＴＭ（Ｐ１）にも導入され、そしてこの補助プラスミドが、上述の救出アッセイで機能した（図１５、パネルＢ）ことから、Ｐタンパク質の機能が不都合に影響を受けていないことが示された。先に記載するように、ｒＨＰＩＶ１ Ｃ：ΔＦ１７０と称する、Ｐ／Ｃ遺伝子に欠失を所持するｒＨＰＩＶ１ウイルスが、トランスフェクション細胞から回収された。この欠失突然変異は、５つの既知のＰ／Ｃ遺伝子タンパク質（Ｐ、Ｃ、Ｃ’、Ｙ１、およびＹ２）の各々を修飾し、これにはＰタンパク質のアミノ酸１７２および１７３の欠失、並びにＣタンパク質のアミノ酸１６８〜１７０の欠失が含まれる。この突然変異体は、欠失を含む５つのタンパク質をコードしたが、細胞培養において、よく複製した。本発明の免疫原性組成物および方法で使用するため、この欠失突然変異を、単独で、または他の弱毒化突然変異と組み合わせて所持する、十分に弱毒化され、そして表現型的に安定なｒＨＰＩＶウイルスが生成可能である。
ハムスターおよび非ヒト霊長類における、組換えＨＰＩＶ１ Ｃタンパク質欠失突然変異体の複製レベル、および野生型ＨＰＩＶ１曝露に対する有効性の性質決定
［３０４］上述のＦ１７０で単一Ｃタンパク質アミノ酸置換を所持するｒＨＰＩＶ１ Ｃ：Ｆ１７０Ｓ、およびＰ／Ｃ遺伝子欠失突然変異を含有するｒＨＰＩＶ１ Ｃ：ΔＦ１７０のｉｎ ｖｉｖｏ増殖特性を、ヒトにおけるＨＰＩＶ複製能力および免疫原性活性を予測すると一般的に認められる動物モデル、すなわちゴールデンシリアンハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｔｕｓ Ａｕｒａｔｕｓ）およびアフリカミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）で調べた。感染ハムスターの上気道および下気道におけるｒＨＰＩＶ１ Ｃ：Ｆ１７０ＳおよびｒＨＰＩＶ１ Ｃ：ΔＦ１７０複製レベルを、未修飾の生物学的に得られる対照ウイルス（ＨＰＩＶ１ＬＬＣ１）および組換えＨＰＩＶ１対照ウイルス（ｒＨＰＩＶ１ＬＬＣ４）のものに比較した。表１０に示すように、ｒＨＰＩＶ１−ΔＦ１７０の複製レベルは、ハムスターの上気道および下気道両方で非常に制限されており、そしてＦ１７０Ｓ置換突然変異を所持するｒＨＰＩＶ１ Ｃ：Ｆ１７０Ｓのものとほぼ同一であったことから、Ｆ１７０アミノ酸の欠失が、Ｆ１７０のセリンへの置換突然変異と類似の弱毒化表現型を生じることが示された。この弱毒化表現型は、上気道および下気道両方で複製制限レベルが類似であることに特徴付けられ、この表現型はヒトにおいてこのウイルスが引き起こす上気道疾患（鼻炎および中耳炎）および下気道疾患（クループ）の抑止を生じるはずであり、非常に望ましい。ｒＨＰＩＶ１ Ｃ：Ｆ１７０Ｓ、ｒＨＰＩＶ１ Ｃ：ΔＦ１７０、およびｒＨＰＩＶ１ Ｃ：Δ１０−１５（ＦＲＳＶ）は各々、Ｃタンパク質中のＲ８４Ｇアミノ酸置換およびＨＮタンパク質中のＴ５５３Ａ置換を含有し、これはｒＨＰＩＶ１ＬＬＣ４に宿主範囲弱毒化表現型を与えるため、この観察は、Ｃタンパク質残基１７０およびＣの残基１０〜１５での置換および欠失突然変異が、宿主範囲弱毒化突然変異、すなわちＣタンパク質中のＲ８４Ｇアミノ酸置換およびＨＮタンパク質中のＴ５５３Ａ置換と、生存可能性に関して、適合することを示す。したがって、これらの弱毒化突然変異セットを含有するｒＨＰＩＶ１突然変異体の弱毒化表現型は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで表現型的に非常に安定であるはずである。
表１０．ハムスターにおけるｒＨＰＩＶ１ｗｔおよび突然変異体ウイルスの複製
Figure 0004549188
ａＳ．Ｅ．標準誤差
ｂハムスターに指示したウイルスの１０６ＴＣＩＤ５０をＩＮ投与した。各群の６匹の動物からの鼻甲介および肺組織を第４日に回収した。組織に存在するウイルスを３２℃でＬＬＣ−ＭＫ２単層上に連続希釈することによって定量し、感染した培養物を６日後にモルモット赤血球を用いて赤血球吸着によって検出した。
ｃ太字の値は野生型ＨＰＩＶ１ＬＬＣ１の力価と比較して力価が約１００倍以上を示す。
［３０３］先に記載するように、各部位１０６ＴＣＩＤ５０のウイルスの鼻内（ＩＮ）投与および気管内（ＩＴ）投与によって、ＨＰＩＶ１血清陰性アフリカミドリザルにおいてもまた、ｒＨＰＩＶ１ Ｃ：ΔＦ１７０組換え体の複製レベルを、生物学的に得られるＨＰＩＶ１（ｒＨＰＩＶ１ＬＬＣ１）および組換えＨＰＩＶ１（ｒＨＰＩＶ１ＬＬＣ４）に比較した。表１１に示すように、ΔＦ１７０またはＦ１７０Ｓ Ｃタンパク質突然変異を含む突然変異体ｒＨＰＩＶ１の平均ピークウイルス力価は、野生型ＨＰＩＶ１ＬＬＣ１ウイルスの複製に比較して、感染したサルの上気道および下気道における複製に関して、それぞれ、およそ１００倍および４０倍、弱毒化されていた。Ｃタンパク質突然変異体の一日平均ウイルス力価もまた、野生型ＨＰＩＶ１ＬＬＣ１ウイルスおよびｒＨＰＩＶ１ＬＬＣ４に比較して、減少していた（図１６）。Ｃタンパク質のΔＦ１７０またはＦ１７０Ｓ突然変異を含有する組換え体はまた、親ｒＨＰＩＶ１ＬＬＣ４ウイルスに比較して、下気道における複製に関して、より弱毒化されていたことから、Ｃタンパク質の残基１７０での突然変異に特定される弱毒化は、アフリカミドリザルの下気道に対して、ｒＨＰＩＶ１ＬＬＣ４のＣタンパク質またはＨＮタンパク質に見られる突然変異に特定される弱毒化に付加的である。したがって、ＨＰＩＶ１抗インターフェロンＣタンパク質における欠失突然変異および置換突然変異はどちらも、アフリカミドリザルの気道において、複製表現型の弱毒化を与える。この弱毒化にもかかわらず、どちらのウイルスも野生型ウイルスに対して、高レベルの防御を誘導した（表１１）。重要なことに、ΔＦ１７０突然変異は、野生型ＨＰＩＶ１配列に復帰突然変異するのに６ヌクレオチドの挿入を必要とするであろう。この組換え突然変異体ウイルスは、６のルールに従うように設計されているため、これらのＰ遺伝子欠失突然変異体などの突然変異体ＰＩＶへの修正の挿入は、非常に起こりにくいと予測される。さらに、本明細書に記載するものなどのＣタンパク質欠失突然変異体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの複製後、並外れて安定な弱毒化表現型を与え、これは標的乳児集団における免疫ウイルスの安全性に、そして免疫原性組成物の大規模製造に、重要な検討材料である。必要であれば、Ｃタンパク質に同定される多様な弱毒化突然変異を、互いに、またはゲノムの他の部分に同定される弱毒化突然変異と組み合わせて、本発明の組換えＨＰＩＶの弱毒化レベルを修飾することも可能である。
表１１．生物学的に得られるかまたは組換えＨＰＩＶ１で感染した血清反応陰性のアフリカグリーンザルにおけるウイルス複製のレベル
Figure 0004549188
ａサルを指示したウイルスの１０６ＴＣＩＤ５０で鼻腔内および気管内に投与した。データは３回の試験から集めた。
ｂサンプリング日とは関係ない各群における動物に対する最大ウイルス力価の平均。ＳＥ、標準誤差。ウイルス滴下をＬＬＣ−ＭＫ２細胞上で３２℃で行い、感染した細胞をモルモット赤血球を用いて赤血球吸着によって７日後に検出した。検出限界は１．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
ｃ鼻咽頭試料を感染０−１０日後に収集した。第０日の力価は≦０．５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
ｄ気管洗浄試料を感染２、４、６、８、及び１０日後に収集した。第０日の力価は≦０．５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。
ｅ各動物を野生型Ｗａｓｈ／６４株、ＨＰＩＶ１ＬＬＣ１でチャレンジした。ＮＰおよびＴＬ試料を第２、４、６、および８日後に収集した。試料に存在するウイルスの力価は上述したように決定した。
（実施例１０）
規定数外の外来遺伝子の発現ベクターとしての組換えＨＰＩＶ１の使用
［３０５］本発明のさらなる側面において、組換えＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムは、１以上の異種病原体の１以上の抗原決定基をコードする１以上の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わされて、キメラＨＰＩＶ１ゲノムまたはアンチゲノムを形成する、部分的または完全ＨＰＩＶ１「ベクター」ゲノムまたはアンチゲノムを含んでなる。抗原決定基（単数または複数）をコードする異種遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）は、部分的または完全ＨＰＩＶ１ベクターゲノムまたはアンチゲノムの非コード領域に隣接するかまたは該領域内にある、規定数外の遺伝子またはゲノムセグメントとして付加されることも可能であるし、あるいは部分的ＨＰＩＶ１ベクターゲノムまたはアンチゲノムにおける１以上の対応する遺伝子またはゲノムセグメントを置換することも可能である。異種遺伝子（単数または複数）またはゲノムセグメント（単数または複数）には、１以上の異種コード配列、並びに／あるいは遺伝子外３’リーダーまたは５’トレーラー領域、遺伝子開始シグナル、遺伝子終止シグナル、編集領域、遺伝子間領域、あるいは３’または５’非コード領域を含んでなる１以上の異種制御要素が含まれることも可能である。
［３０６］本発明の関連する態様において、ベクターゲノムが、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス亜群Ａおよび亜群Ｂ、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト・パピローマウイルス、１型および２型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、フィロウイルス、ブンヤウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、ヒト・メタニューモウイルス、およびインフルエンザウイルスから選択される異種病原体の１以上の異種抗原決定基と組み合わされている、キメラＨＰＩＶ１ウイルスを提供する。典型的な側面において、異種抗原決定基（単数または複数）は、麻疹ウイルスＨＡおよびＦタンパク質、呼吸器合胞体ウイルス亜群Ａおよび亜群ＢのＦ、Ｇ、ＳＨおよびＭ２タンパク質、流行性耳下腺炎ウイルスＨＮおよびＦタンパク質、ヒト・パピローマウイルスＬ１タンパク質、１型または２型ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０タンパク質、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ、およびｇＭタンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、エプスタイン・バーウイルスｇｐ３５０タンパク質、フィロウイルスＧタンパク質、ブンヤウイルスＧタンパク質、フラビウイルス、プレＭ、Ｅ、およびＮＳ１タンパク質、ヒト・メタニューモウイルスＧおよびＦタンパク質、並びにアルファウイルスＥタンパク質、並びにその抗原性ドメイン、断片およびエピトープから選択される。
［３０７］ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において４回継代し、そしてＣおよびＨＮタンパク質において、２つの推定上の宿主範囲アミノ酸置換を獲得した、生物学的に得られるＨＰＩＶ１／Ｗａｓｈ／６４株の完全ゲノム配列を決定し（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ４５７１０２）、そして全長アンチゲノムＨＰＩＶ１ ｃＤＮＡを生成した。このｃＤＮＡに由来する組換えウイルス（ｒＨＰＩＶ１ＬＬＣ４）は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において１回継代した、生物学的に得られるＨＰＩＶ１（ＨＰＩＶ１ＬＬＣ１）に比較して、複製に関して弱毒化されていた。Ｃタンパク質Ｒ８４Ｇ置換およびＨＮタンパク質Ｔ５５３Ａ置換をコードするこのアンチゲノムｃＤＮＡを用いて、以下に記載する組換えウイルスを得た。
［３０８］ベクターとして使用可能なアンチゲノムＨＰＩＶ１ ｃＤＮＡを生成するため、先に記載されるように（各々、本明細書に援用される、Ｍｕｒｐｈｙらによって２００２年１１月２１日に出願された米国特許出願第１０／３０２，５４７号；および２００３年５月３０日に公表された、対応するＰＣＴ公報第ＷＯ０３／０４３５８７ Ａ２号）、ＰＣＲ突然変異誘発によって、全長アンチゲノムＨＰＩＶ１ ｃＤＮＡ（ｎｔ１１３〜１１８）のＨＰＩＶ１ Ｎ遺伝子翻訳開始コドンのすぐ上流に、ユニークなＭｌｕＩ制限部位を導入した。異種パラミクソウイルスに対する類似によって予測される、仮定されるＨＰＩＶ１複製および転写シス作用要素のいずれも破壊しないように、ベクターにおける規定数外の遺伝子の挿入部位を設計した。本実施例は、Ｎタンパク質ＯＲＦの上流のＭｌｕＩ部位（ｎｔ１１３〜１１８）へのさらなる転写単位の挿入を記載する（図１４）。しかし、本明細書に記載する成功結果に基づいて、別のユニークな制限部位を使用することもまた可能であり、そしてこれらを他の遺伝子接合部、例えばＮ−Ｐ、Ｐ−ＭまたはＨＮ−Ｌ接合部に導入することも可能である。例えば、ユニークなＮｏｔＩ部位を、Ｐ−Ｍ接合部のアンチゲノムＨＰＩＶ１ ｃＤＮＡに導入して、そしてこれを用いて、ＨＭＰＶ ＣＡＮ８３株Ｇタンパク質を発現する遺伝子単位を導入した。
［３０９］ＨＰＩＶ１に基づくＨＭＰＶ糖タンパク質発現ベクターを生成するため、先に記載される（米国特許出願第１０／３０２，５４７号；ＰＣＴ公報第ＷＯ０３／０４３５８７号）ｒＨＰＩＶ１のＭｌｕＩ部位に挿入するために、ＨＭＰＶ ＣＡＮ８３株（本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＹ２９７７４９）Ｆ糖タンパク質ＯＲＦを修飾した。この戦略は、さらなる別個のｍＲＮＡとして異種ＯＲＦを発現するためのものであり、そしてしたがって機能するＨＰＩＶ１遺伝子開始シグナルが先行し、そして機能するＨＰＩＶ１遺伝子終止シグナルが続くように、該ＯＲＦをｒＨＰＩＶ１ゲノムに導入することが重要である。全挿入遺伝子単位が「６のルール」に従い、そしてＨＰＩＶ１遺伝子開始シグナル相が維持されるように、ｃＤＮＡを設計した。ＭｌｕＩ挿入部位が、Ｎ遺伝子の推定上の遺伝子開始シグナルに続いた。したがって、この部位で挿入するためには、ＨＭＰＶ Ｆ ＯＲＦを、その上流端でのＭｌｕＩの挿入、並びにその下流端でのＨＰＩＶ１遺伝子終止シグナル、遺伝子間領域、遺伝子開始シグナル、ＭｌｕＩ部位の付加によって修飾する必要があった（図１４）。挿入された配列は、長さ１６５６ヌクレオチドであり、そしてしたがって、修飾ＨＰＩＶ１アンチゲノムｃＤＮＡの長さは、レスピロウイルス属の他のメンバーに適用され（Ｃｈａｎｏｃｋら， Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ中 １：１３４１−１３７９， ２００１）、そしてまた、ＨＰＩＶ１にも適用されるようである、６のルールに従う。
［３１０］組換えウイルス（ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３）は、ＨＰＩＶ１ Ｎ、ＰおよびＬタンパク質発現プラスミドおよびＭＶＡ−Ｔ７感染を用いてトランスフェクションしたＨＥｐ−２細胞から容易に回収された。次いで、３２℃で増殖させたＬＬＣ−ＭＫ２細胞上で、ウイルス上清を数回継代した。ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３に感染させたＬＬＣ−ＭＫ２細胞から単離したｖＲＮＡを用いて、規定数外の遺伝子が隣接したＲＴ−ＰＣＲ産物を生成し、そして配列解析によって、ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３に存在する規定数外の遺伝子の配列が、設計どおりであることを確認した。したがって、推定上の転写シグナルおよび本実施例に同定される挿入戦略を用いて、外来抗原をコードするさらなる遺伝子を組換えＨＰＩＶ１に容易に挿入することも可能であり、そしてこの挿入された配列は、組織培養細胞において、続く長期の複製を安定して維持する。
［３１１］同様の戦略を用いて、ＨＭＰＶ Ｇタンパク質を発現するＨＰＩＶ１ベクターを生成した。この実施例では、Ｐ遺伝子非コード領域内のＨＰＩＶ１ Ｐ ＯＲＦおよびＭ ＯＲＦの間のｎｔ３６０９〜３６１６で、ＰＣＲ突然変異誘発によって、ユニークなＮｏｔＩ部位を導入した。次いで、ｒＨＰＩＶ１のＮｏｔＩ部位に挿入するため、ＨＭＰＶ ＣＡＮ８３株Ｇ糖タンパク質ＯＲＦ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ４５７１０２）を修飾した。この戦略は、さらなる別個のｍＲＮＡとして異種ＯＲＦを発現するためのものであり、そしてしたがって機能するＨＰＩＶ１遺伝子開始シグナルが先行し、そして機能するＨＰＩＶ１遺伝子終止シグナルが続くように、該ＯＲＦをｒＨＰＩＶ１ゲノムに導入することが重要である。全挿入遺伝子単位が「６のルール」に従い、そしてＨＰＩＶ１遺伝子開始シグナル相が維持されるように、ｃＤＮＡを設計した。したがって、この部位で挿入するためには、ＮｏｔＩ部位、続いて、推定上のＨＰＩＶ１遺伝子終止シグナル、遺伝子間領域、遺伝子開始シグナル、ＨＭＰＶ Ｇ ＯＲＦ、そしてその下流端としてのＮｏｔＩ部位の挿入によって、ＨＭＰＶ Ｇ ＯＲＦを修飾する必要があった。挿入された配列は、長さ７０２ヌクレオチドであり、そしてしたがって、修飾ＨＰＩＶ１アンチゲノムｃＤＮＡの長さは、６のルールに従った。組換えウイルス（ｒＨＰＩＶ１−Ｇ８３）は、上述のように、ＨＰＩＶ１ Ｎ、ＰおよびＬタンパク質発現プラスミドおよびＭＶＡ−Ｔ７感染を用いてトランスフェクションしたＨＥｐ−２細胞から容易に回収された。次いで、３２℃で増殖させたＬＬＣ−ＭＫ２細胞上で、ウイルス上清を数回継代した。ｒＨＰＩＶ１−Ｇ８３に感染させたＬＬＣ−ＭＫ２細胞から単離したｖＲＮＡを用いて、規定数外の遺伝子が隣接したＲＴ−ＰＣＲ産物を生成し、そして配列解析によって、ｒＨＰＩＶ１−Ｇ８３に存在する規定数外の遺伝子の配列が、設計どおりであることを確認した。
［３１２］規定数外の遺伝子からＨＭＰＶ Ｆタンパク質またはＨＭＰＶ Ｇタンパク質を発現する組換えｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３およびｒＨＰＩＶ１−Ｇ８３を単離し、生物学的にクローニングし、そしてそれぞれ、７．７ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ以上、および９．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌの高力価に複製することが見出された。ＨＭＰＶ糖タンパク質およびＨＰＩＶ１糖タンパク質の発現は、ＨＰＩＶ１、ＨＭＰＶ、ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３またはｒＨＰＩＶ１−Ｇ８３いずれかに感染したＬＬＣ−ＭＫ２細胞の間接的免疫蛍光によって確認された。ガラススライド上で増殖させたＬＬＣ−ＭＫ２細胞をウイルスに感染させ、そして感染のおよそ７２時間後、細胞を固定し、そして透過処理した。マウス・モノクローナル抗ＨＰＩＶ１ ＨＮおよびハムスター・ポリクローナル抗ＨＭＰＶ抗体を用いて、それぞれ、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において、ＨＰＩＶ１ ＨＮおよびＨＭＰＶ糖タンパク質を検出した。ＨＭＰＶまたはＨＰＩＶ１糖タンパク質の間接的免疫蛍光に、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート化抗マウスまたは抗ハムスターＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ペンシルバニア州）を用いた。こうして、ＨＭＰＶ Ｆ糖タンパク質またはＧ糖タンパク質の発現を確認し（表１２）、ＨＰＩＶ１ Ｎ遺伝子上流、またはＰ遺伝子およびＮ遺伝子間いずれかに挿入された、ＨＰＭＶ Ｆ糖タンパク質およびＧ糖タンパク質を発現する規定数外の遺伝子は、それぞれ、よく許容され、そして効率的に翻訳されたことが示される。したがって、これらの組換えＨＰＩＶ１ウイルスは、２つのヒト病原体、ＨＭＰＶおよびＨＰＩＶ１の防御抗原を発現する。
［３１３］本明細書に概説する方法を用いて、欠失および／または点突然変異を体系的に導入して、２つの主要な小児期呼吸器病原体、例えばＨＰＩＶ１およびＨＭＰＶに対して防御するであろう生弱毒化ウイルスを生成することによって、本明細書に記載するＨＰＩＶ１ベクターおよびＨＰＩＶ２ベクターをここで弱毒化することも可能である。これらのｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３およびｒＨＰＩＶ１−Ｇ８３ウイルスをベクターとして用いて、ＨＰＭＶに対する一次抗体反応を誘導するか、あるいはＨＭＰＶでの以前の感染、またはＨＰＩＶ３などの別のＰＩＶベクターでの以前の感染によって誘導された反応をブーストすることも可能である。
表１２．間接免疫蛍光によるＨＭＰＶ糖タンパク質を発現する組換えｒＨＰＩＶ１ベクターで感染したＬＬＣ−ＭＫ２細胞におけるＨＭＰＶまたはＨＰＩＶ１抗原の検出
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ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を感染するために使用されるウイルスを示した。ＬＬＣ−ＭＫ２単層を共焦点顕微鏡を用いて調べた。ＨＭＰＶ感染細胞対ｒＨＰＩＶ１ Ｆ８３、又はｒＨＰＩＶ１ Ｇ８３感染細胞から得られる免疫蛍光シグナルの強度のレベルは均等であった。「０」はシグナルが検出されなかったことを示す。「＋＋＋」は強い免疫蛍光シグナルを示す。
［３１４］組換え生弱毒化ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２ウイルスは、他のヒト呼吸器病原体、特に乳児期に疾患を引き起こすものの防御抗原を発現するベクターとして非常に有用であろう。ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２野生型ウイルスは、主に、より後期の乳児期、すなわち６ヶ月齢より大きい乳児において疾患を引き起こすため、これらを４〜６ヶ月齢で投与して、ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２が仲介する疾患を防御することも可能である。対照的に、ＲＳＶ、ＨＭＰＶ、およびＨＰＩＶ３は各々、初期とともに後期乳児期に疾患を引き起こし、そしてこれらのウイルスに対するワクチン接種は、生後１ヶ月に開始する必要があるであろう。したがって、ＲＳＶ、ＨＭＰＶ、ＨＰＩＶ１、およびＨＰＩＶ２に対する経時的免疫は、ＲＳＶ、ＨＭＰＶ、およびＨＰＩＶ３免疫原性組成物を投与した数ヵ月後に、二価ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２免疫原性組成物を投与することを伴うであろう。このため、ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２ワクチン投与は、ユニークに位置づけられて、先に投与されたＲＳＶ、ＨＭＰＶ、またはＨＰＩＶ３免疫原性組成物に対する免疫応答をブーストする機会を提供する。ＲＳＶおよびＨＰＩＶ３に引き起こされる疾患は、ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２に引き起こされるものより重症で、そしてより頻繁であるため、ＨＰＩＶ１ワクチンおよびＨＰＩＶ２ワクチンがＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２に対して防御する能力、およびＲＳＶに対する（またはＨＭＰＶもしくはＨＰＩＶ３に対する）免疫応答をブーストする能力は、ＨＰＩＶ１候補およびＨＰＩＶ２候補を開発する、別の推進力を提供し、すなわちその二重の潜在能力によって、これらは、産業にとっては開発するのに、そして監督官庁にとっては認可するのに、より魅力的な免疫原性組成物となるであろう。本実施例は、ＲＳＶに対する免疫応答をブーストするＲＳＶ Ｆ糖タンパク質を発現するｒＨＰＩＶ１ウイルスの能力を例示し、この免疫応答は、弱毒化ＲＳＶでの先の感染によって初回抗原刺激されたものである。
［３１５］生弱毒化ＲＳＶ、ＲＳＶ２４８／４０４をハムスターに投与し、そして１ヵ月後、この動物にＨＰＩＶ１野生型ウイルス（対照ウイルス）、ＨＰＩＶ１−Ｆ（ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質を発現するＨＰＩＶ１）、または第二の用量のＲＳＶ２４８／４０４を投与した（表１３）。ｒＨＰＩＶ１−Ｆでブーストされた動物は、ＥＬＩＳＡおよびＲＳＶに対する中和抗体力価において、４倍以上の上昇を示したが、ＲＳＶ２４８／４０４またはＨＰＩＶ１野生型対照ウイルスでブーストされた動物は、上昇を示さなかった。したがって、ＨＰＩＶ１−Ｆは、ＲＳＶに対する免疫応答をブースト可能であったが、第二の用量のＲＳＶ２４８／４０４はブースト不能であり、これはおそらく、該ウイルスが、ＲＳＶ免疫動物に感染不能であったためであろう。したがって、ｒＨＰＩＶ−ＦＲＳＶがＲＳＶに対する応答をブーストするユニークな能力は、ＲＳＶ免疫の存在下で複製する能力によるものであり、一方、この免疫は、第二の用量の生弱毒化ＲＳＶ２４８／４０４の複製および免疫原性両方を制限した。ｒＨＰＩＶ１−ＦＲＳＶで免疫した動物は、予期されるように、ＨＰＩＶ１に対する免疫応答を発展させた。
［３１６］ｒＨＰＩＶ２−Ｆベクターは、ＲＳＶまたは他のこうしたウイルスに対する免疫応答をブーストする際、ｒＨＰＩＶ１−Ｆベクターと同様に有用であるはずである。さらに、これらの２つのウイルスは各々、ＲＳＶ、ＨＭＰＶおよびＨＰＩＶ３の他の防御抗原のベクターとなって、比較的少数の生弱毒化ウイルスを用いて、防御可能なヒト病原体の数を拡大することも可能であるはずである。
表１３．ＲＳＶ２４８／４０４を用いる免疫化に続くＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するｒＨＰＩＶ１を用いるハムスターの免疫化はＲＳＶ Ｆに対するブースト血清抗体を誘導する
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ａ．ハムスターを指示したウイルスの１０６ＴＣＩＤ５０で鼻腔内に免疫した。
ｂ．２８日後、ハムスターを１０６ＴＣＩＤ５０で気管内に免疫した。
ｃ．最初の感染から２８日および５６日後に血清を収集した。血清ＨＰＩＶ３血球凝集阻害力価（ＨＡＩ）、ＨＰＩＶ１中性化力価、ＲＳＶ Ｆ及びＧ ＥＬＩＳＡ、および中性化力価を決定した。各群の平均力価（ｌｏｇ２）を示す。
［３１７］前述の発明は、理解を明確にする目的のため、例によって詳細に記載されているが、当業者には、付随する請求項の範囲内で、特定の変化および修飾を実施することも可能であり、これらが限定のためではなく、例示のために示されることが明らかであろう。この背景において、多様な刊行物および他の参考文献が、説明を簡潔にするため、先の開示内で引用されている。これらの参考文献は各々、すべての目的のため、本明細書に援用される。
［５４］図１（パネルＡ〜Ｅ）は、本発明の組換えＨＰＩＶ２候補に取り込まれて、弱毒化または他の望ましい表現型変化を生じることも可能な異種マイナス鎖ＲＮＡウイルスに同定される多様な突然変異を例示する。ＨＰＩＶ２野生型（ｗｔ）、ＨＰＩＶ３ｗｔ、ＨＰＩＶ１ｗｔ、またはＢＰＩＶ３ｗｔ間で、既知の弱毒化突然変異を含有する、示したタンパク質の領域に関して、部分的アミノ酸配列並列を提供する。これらの比較および他の類似の比較に基づいて、本発明の組換えＨＰＩＶ２に移入する異種ＰＩＶウイルスまたは非ＰＩＶウイルスにおける突然変異を同定する。異種ウイルスにおいて、表現型変化を与えることが先に示されたアミノ酸位および置換を各配列並列の上に示し、そして野生型割り当てを配列並列中に太字フォントで示す。ＨＰＩＶ２中の対応するアミノ酸位をＨＰＩＶ２配列の後に示す。並列中、すべての種のＬタンパク質間で保存されているアミノ酸位を下線で示し、これは突然変異誘発のさらなる標的に相当する。 ［５５］図２は、他のウイルス抗原のベクターとして使用するＨＰＩＶ２の修飾を例示する。パネルＡ：ユニークなプロモーター近位ＮｏｔＩ制限部位の配置を例示するＨＰＩＶ２ゲノムの図（縮尺は正しくない）。完全ゲノム図中のＨＰＩＶ２／Ｖ９４ ｎｔ５６〜１６０の位置を囲んで示し、そして配列を上に示す。ＨＰＩＶ２ Ｎ遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧ、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４ ｎｔ１５８〜１６０）の１ヌクレオチド前にＮｏｔＩ制限部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を含有するように、野生型配列から配列を修飾した。ＨＰＩＶ２配列ＡＧＧＴＴＣＡＡ（ＨＰＩＶ２／Ｖ９４ ｎｔ１４９〜１５６）をＧＣＧＧＣＣＧＣ（ＮｏｔＩ認識配列）に変化させることによって、ＮｏｔＩ部位を導入した。２つの潜在的なＮ遺伝子開始シグナルの位置を影の領域として示す。プロモーター要素（白抜きの囲み）は、他のパラミクソウイルス属において、ウイルス複製および転写に重要と立証された配列である。パネルＢ：ＮｏｔＩ部位における、規定数外の遺伝子としてのＨＰＩＶ１ ＨＮオープンリーディングフレームまたはＲＳＶ（亜群Ａ）Ｇオープンリーディングフレームの挿入。ＨＰＩＶ２ Ｎ遺伝子およびＰ遺伝子（ＨＰＩＶ２／Ｖ９４ ｎｔ１９０９〜１９３８）間に見られるものと同一の遺伝子開始配列、遺伝子間配列、および遺伝子終止配列を、各規定数外のＯＲＦの後に挿入する。これらのシグナルは、それぞれ、外来ＯＲＦの転写を終結させ、そして下流ＨＰＩＶ２ Ｎ遺伝子の転写を開始するように働く。ＮｏｔＩ制限部位を含むセンスオリゴ、並びにそれぞれ、挿入された遺伝子の転写を終結させ、そしてＨＰＩＶ２ Ｎ遺伝子の転写を促進するであろう遺伝子終止（ＧＥ）配列および遺伝子開始（ＧＳ）配列を含有するアンチセンスオリゴを用いるＰＣＲを用いて、各規定数外の遺伝子カセットを生成する。第二の規定数外ＯＲＦの場合による挿入を可能にするであろうユニークなＢｓｔＥＩＩ部位もまた含む。６のルールに従うのに必要であるように、矢印が示す位で配列の長さ（ｎ）を調整することによって、全配列を修飾する。各ウイルスの下部セクションは、ＯＲＦを挿入しようとするＨＰＩＶ２主鎖の配列を詳述する。この戦略を用いて、遺伝子接合部のいずれか１つで、他のユニークな制限部位を操作して、多数の外来遺伝子の挿入を可能にしうる。 ［５６］図３は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼに転写された際、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４のアンチゲノムＲＮＡを生じる、組み立てたｃＤＮＡクローン、ｐＦＬＣ ＨＰＩＶ２／Ｖ９４の図を提供する（縮尺は正しくない）。全長アンチゲノムｃＤＮＡを組み立てるのに用いた６つの重複ＰＣＲ断片を示す（Ａ〜Ｆ）。ウイルスゲノムの囲んだ図の上に、クローンを組み立てるのに用いたヌクレオチド位に沿って制限部位を示す。Ｔ７ポリメラーゼプロモーター（Ｔ７）および転写を増進する２つの非ウイルスＧ残基が、アンチゲノムの上流端に隣接し、そして肝炎デルタウイルス・リボザイム配列（Δ）が下流端に隣接する。各ＨＰＩＶ２ ＯＲＦの相対的な位置を示す。生物学的に得られるＨＰＩＶ２／Ｖ９４のコンセンサス配列からのヌクレオチド変化を示し（＊）、そしてタンパク質中に生じるアミノ酸変化を示す。 ［５７］図４は、ＨＰＩＶ２の多段階増殖曲線を提供する。ＬＬＣ−ＭＫ２単層を、示したＨＰＩＶ２に感染効率０．０１、３２℃で、３つ組で感染させた。培地上清のアリコットを２４時間間隔で採取し、そしてウイルス力価に関して３２℃でアッセイした。ウイルス力価を平均ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌ±標準誤差で表す。パネルＡ：トリプシンの非存在下でウイルスを増殖させそして力価測定した。パネルＢ：ブタ・トリプシン（５μｇ／ｍｌ）を添加してウイルスを増殖させ、そしてトリプシン添加を伴い、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞上でウイルスを定量化した。 ［５８］図５は、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４のｉｎ ｖｉｖｏ性質決定を例示する。ヒト宿主における増殖および弱毒化特性を予測すると認められた動物モデル系であるハムスターにおいて、組換えウイルスの複製を研究した。ハムスターに、示したウイルスを１０６ＴＣＩＤ５０で、経鼻接種した。感染後、第３日、第４日、および第５日に、各群６匹の動物から鼻甲介および肺組織を採取した。３２℃で、ＬＬＣ−ＭＫ２単層上で連続希釈することによって、組織中に存在するウイルスを定量化した。ｒＡＨＰＩＶ２／Ｖ９４およびｒＢＨＰＩＶ２／Ｖ９４は、別個のトランスフェクションから得たＨＰＩＶ２の調製である。 ［５９］図６は、ＨＰＩＶ２ Ｔｏｓｈｉｂａ株およびＧｒｅｅｒ株のヌクレオチド配列の選択した領域の比較を提供する。ＢＥＳＴＦＩＴ並列プログラム（ウィスコンシン・パッケージ・バージョン１０．２、遺伝学コンピュータグループ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、Ｔｏｓｈｉｂａ配列およびＧｒｅｅｒ配列を並列させた。失われているｎｔを（．）で示す。報告されたＴｏｓｈｉｂａ株配列中の配列エラーに相当する可能性がある１０の領域を同定した（Ａ〜Ｊ）。これらの配列（アンチゲノム配列）は（Ａ）１ｎｔを欠くＴｏｓｈｉｂａ株Ｎ遺伝子開始シグナル配列、（Ｂ）コドン１９５（Ａｒｇ）を欠くＴｏｓｈｉｂａ株Ｎ ＯＲＦ、（Ｃ）Ｔｏｓｈｉｂａ株Ｎ遺伝子末端（過剰な１ｎｔを含有する）およびＰ遺伝子開始シグナル（１ｎｔを欠く）、（Ｄ）Ｐ ＯＲＦ（１ｎｔを欠く）、（Ｅ）Ｐ ＯＲＦ（過剰な１ｎｔを含有する）、Ｐのａａ３１６〜３１９のミスセンスを生じる（ＧＳＤＭからＱＶＩＬに変化）、（Ｆ）ＨＮ ３’ＮＣＲ（１ｎｔを欠く）、（Ｇ）Ｌ ＯＲＦ（コドン３７８（Ａｌａ）を欠く）、（Ｈ）Ｌ ＯＲＦ（コドン７４１（Ｐｒｏ）を欠く）、（Ｉ〜Ｊ）Ｌ ＯＲＦ（過剰な３ｎｔを含有する）、Ｌポリメラーゼａａ１７３５〜１７４３のミスセンスを生じる（ＴＬＴＫＦＤＬＳＬからＮＳＮＫＶＲＦＩＰＦに変化）に見られる。 ［６０］図７は、６のルールに従わないＨＰＩＶ２アンチゲノムｃＤＮＡを作成するのに用いたヌクレオチド挿入物の構造を例示する。パネルＡ。Ｌ ＯＲＦの末端近傍のＥｃｏＲＶ制限部位周囲のｗｔ ｎｔ配列を示す。パネルＢ。ＨＰＩＶ２ ｎｔ１５５５４〜１５５５９に渡るＥｃｏＲＶ制限部位に挿入された６つのアンチゲノム・センスオリゴヌクレオチドの配列を示す。ｎｔ１５５５６および１５５５７の間にオリゴヌクレオチド二重鎖を挿入した。各オリゴヌクレオチド二重鎖は、サイレントなＡＴＣからａｔｔの突然変異を含有し、この突然変異はＥｃｏＲＶ部位を破壊して、そしてＬ ＯＲＦの最後の１１コドン、およびＴＧＡ停止コドン（太字）を含む１２のＨＰＩＶ２ ｎｔ後、さらに０〜５のさらなるｎｔを再生成する。該ｃＤＮＡから生成される組換えウイルスの名称を左に示す：ｒＨＰＩＶ２Ｎ９４（＋６）と称するウイルスは、６のルールに対応し、一方、他のウイルスは、示した数のさらなるｎｔ（＋１〜＋５）を含有する。各オリゴヌクレオチド挿入物の長さを、６のルールの長さとともに右に示し、そしてアンチゲノムｃＤＮＡの全長を括弧内に示す。 図８は、６のルールに従わないｃＤＮＡから得た組換えＨＰＩＶ２のゲノムＲＮＡ内に検出されるヌクレオチド挿入および欠失を例示する（配列はアンチゲノム・センスである）。パネルＡ。６のルールに従わない４つの組換えウイルス、ｒＨＰＩＶ２Ｎ９４（＋３）、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋４）、ｒＡＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋５）、およびｒＢＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋５）を産生し、これらは、ポリ六量体ゲノム長を生じるｎｔ挿入を含有した。総数３ｎｔを含有する２つの挿入が、ｒＨＰＩＶ２Ｎ９４（＋３）のＨＮ ５’および３’非コード領域（５’ＮＣＲおよび３’ＮＣＲ）に同定された。ＨＮ遺伝子およびＬ遺伝子間の遺伝子間（ＩＧ）領域内の２ｎｔ挿入が、ｒＨＰＩＶ２Ｎ９４（＋４）で同定された。ｒＡＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋５）およびｒＢＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋５）の各クローンに、一方の場合は、ＨＮ ＧＥシグナルの末端に、そして他方では、ＨＮ ３’ ＮＣＲ中に、１ｎｔ挿入が見られた。パネルＢ。６のルールに従わないｃＤＮＡから産生された２つの組換えウイルス、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４（＋２）およびｒＨＰＩＶ２Ｎ９４（＋１）は、ポリ六量体ゲノム長を生じるｎｔ欠失を含有した。ｒＨＰＩＶ２Ｎ９４（＋２）は、ＨＮ遺伝子およびＬ遺伝子間のＩＧ領域内に２ｎｔ欠失（下線）を有することが見出された。ｒＨＰＩＶ２Ｎ９４（＋１）は、ＬポリメラーゼＯＲＦの末端近傍に１ｎｔ欠失（下線）を有することが見出された。これは、Ｌコード配列にフレームシフトを生じ、示すように、Ｌの最後の１３アミノ酸を欠失させ、そしてこれらを関連しない２１アミノ酸の配列で置換した。挿入領域のｎｔ配列（アンチゲノム・センス）を下向きの矢印で示す。欠失したｎｔを示し、そして欠失の位置を上向きの矢印で示す。ＨＮ ５’または３’非コード領域（ＮＣＲ）、転写遺伝子終止（ＧＥ）、および遺伝子開始（ＧＳ）（太字）並びにＨＰＩＶ２ ＨＮ ＯＲＦおよびＬ ＯＲＦ間の遺伝子間領域（ＩＧ）を示す。Ｌポリメラーゼ翻訳開始コドン（ＡＴＧ）および翻訳終結コドン（ＴＧＡ）を下線で示す。ＨＰＩＶ２ Ｌポリメラーゼのｗｔおよび突然変異体型に関して、ｎｔ配列の下に、一文字アミノ酸命名を示す。 ［６２］図９Ａは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６２］図９Ｂは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６２］図９Ｃは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６２］図９Ｄは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６２］図９Ｅは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６２］図９Ｆは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６３］図１０Ａは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９８株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６３］図１０Ｂは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９８株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６３］図１０Ｃは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９８株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６３］図１０Ｄは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９８株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６３］図１０Ｅは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９８株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６３］図１０Ｆは、ＨＰＩＶ２／Ｖ９８株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６４］図１１Ａは、ＨＰＩＶ２ Ｇｒｅｅｒ株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６４］図１１Ｂは、ＨＰＩＶ２ Ｇｒｅｅｒ株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６４］図１１Ｃは、ＨＰＩＶ２ Ｇｒｅｅｒ株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６４］図１１Ｄは、ＨＰＩＶ２ Ｇｒｅｅｒ株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６４］図１１Ｅは、ＨＰＩＶ２ Ｇｒｅｅｒ株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６４］図１１Ｆは、ＨＰＩＶ２ Ｇｒｅｅｒ株のヌクレオチド配列を提供する。 ［６５］図１２は、生物学的に得られるＨＰＩＶ２、またはＬポリメラーゼタンパク質の１７６４位および１７６５位で２アミノ酸欠失を含有する組換えＨＰＩＶ２いずれかに感染したアフリカミドリザルの上気道および下気道におけるウイルス脱落（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）レベルを例示する。この「移入」された突然変異は、組換えヒト−ウシ・キメラＨＰＩＶ３（ｒＨＰＩＶ３−ＬＢと称する）で最初に同定され、そしてＨＰＩＶ２における突然変異の対応する標的部位は、残基１７６４である。この標的部位での置換および欠失は、弱毒化ＨＰＩＶ２構築物を生成するよう意図される。この例では、第二の残基とともに対象の標的残基を欠失させて、ｃＤＮＡ構築物を「６のルール」に従わせるように、２残基欠失を操作したが、１７６５残基を改変することなく、他の１７６４欠失または置換構築物を容易に生成可能である。本アッセイの検出下限を示す。 ［６６］図１３は、サルＬＬＣ−ＭＫ２細胞における、ｒＨＰＩＶ２−ＦＲＳＶおよび組換え親ウイルス、ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４の多周期複製を例示する。野生型組換えＨＰＩＶ２、およびＲＳＶ融合タンパク質を発現する組換えＨＰＩＶ２ベクターを用いて、細胞あたり０．０１ＴＣＩＤ５０の投入感染効率で、３つ組単層培養物を感染させた。ウイルス力価を３つ組試料の平均ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表す。 ［６７］図１４は、本発明にしたがって、異なるＰＩＶおよび非ＰＩＶ病原体の異種防御抗原のベクターとして使用する、本発明の組換えＨＰＩＶ１の修飾を例示する。パネルＡは、野生型から、Ｎタンパク質の翻訳開始コドン（ＨＰＩＶ１ ｎｔ１１３から始まる）の１ヌクレオチド前にＭｌｕＩ制限部位を、またはＰ ＯＲＦおよびＭ ＯＲＦ間のＰ遺伝子３’非コード領域（ＨＰＩＶ１ ｎｔ３６０９から始まる）内にＮｏｔＩ制限部位を含有するように修飾された、ＨＰＩＶ１ゲノムの図を提供する。各ＨＰＩＶ１遺伝子の遺伝子開始シグナルおよび遺伝子停止シグナルを、それぞれ、灰色および黒で示す。パネルＢにおいて、ＭｌｕＩ部位周囲の長方形で囲んだ領域を拡大し、そしてＨＭＰＶ株ＣＡＮ８３ Ｆタンパク質ＯＲＦの挿入を例示する（完全Ｆ ＯＲＦは長さ１６２０ｎｔであり、そして５３９ａａポリペプチドをコードする。挿入された規定数外の遺伝子単位配列の全長は１６５６ｎｔである）。パネルＢに例示する組換えウイルス、ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３に関しては、上部配列は、ＭｌｕＩ制限部位を含むセンスオリゴ、並びにそれぞれ挿入遺伝子の転写を終結させ、そしてＮ遺伝子の転写を促進するのに用いる遺伝子停止配列および遺伝子開始配列を含有するアンチセンスオリゴを用いたＰＣＲを用いて生成された挿入物を示す。全挿入配列を６のルールに従わせ、そしてＨＰＩＶ１遺伝子開始シグナル配列相を維持するのに必要な、さらなるヌクレオチド（Ｒ６で示す）を挿入する（本明細書に援用される、Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：８９１−８９９， １９９８）。パネルの下部セクションは、ＯＲＦを挿入するＨＰＩＶ１主鎖の配列を詳述する。天然存在遺伝子開始配列を囲む。プロモーター要素は、ウイルス複製および転写に重要であると立証された配列である。パネルＣにおいて、ＮｏｔＩ部位周囲の長方形に囲まれた領域を拡大し、そしてＨＭＰＶのＣＡＮ８３株由来のＨＭＰＶ ＣＡＮ８３株Ｇタンパク質ＯＲＦの挿入を例示する（完全Ｇ ＯＲＦは長さ６６０ｎｔであり、そして１７９ａａポリペプチドをコードする。挿入された規定数外の遺伝子単位配列の全長は７０２ｎｔである）。パネルＣに例示する組換えウイルス、ｒＨＰＩＶ１−Ｇ８３に関しては、上部配列は、ＮｏｔＩ制限部位、それぞれ、上流Ｐ遺伝子の転写を終結させ、そして挿入された規定数外の遺伝子単位の転写を促進するのに用いる遺伝子停止配列および遺伝子開始配列を含むセンスオリゴ、並びにＮｏｔＩ部位を含有するアンチセンスオリゴを用いたＰＣＲを用いて生成された挿入物を示す。全挿入配列を６のルールに従わせ、そしてＨＰＩＶ１遺伝子開始シグナル配列相を維持するのに必要な、さらなるヌクレオチド（Ｒ６で示す）を挿入する。パネルの下部セクションは、ＯＲＦを挿入したＰ−Ｍ接合部でのＨＰＩＶ１主鎖の配列を詳述する。天然存在遺伝子終止配列および遺伝子開始配列を囲む。この戦略を用いて、望ましいように、ゲノムまたはアンチゲノムの遺伝子接合部のいずれか１つ、あるいは３’または５’部分が他のユニークな制限部位を含むように操作して外来遺伝子の挿入を可能にしうる。

Claims (13)

  1. 単離された感染性自己複製組換えヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）であって、ＰＩＶ主要ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ＰＩＶヌクレオカプシド・リンタンパク質（Ｐ）、ＰＩＶ巨大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、および部分的または完全ポリ六量体組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムを含んでなり、ポリ六量体組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムが、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質のアミノ酸残基４６０、９４８、１５６６、または１７２４に弱毒化突然変異をコードしている、前記ＨＰＩＶ２。
  2. コードされた弱毒化突然変異が、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質の残基４６０にアミノ酸置換を含んでなる、請求項１のＨＰＩＶ２。
  3. コードされた弱毒化突然変異が、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質の残基４６０にフェニルアラニンからロイシンへのアミノ酸置換を含んでなる、請求項１のＨＰＩＶ２。
  4. コードされた弱毒化突然変異が、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質の残基９４８にアミノ酸置換を含んでなる、請求項１のＨＰＩＶ２。
  5. コードされた弱毒化突然変異が、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質の残基９４８にチロシンからヒスチジンへのアミノ酸置換を含んでなる、請求項１のＨＰＩＶ２。
  6. コードされた弱毒化突然変異が、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質の残基１５６６にアミノ酸置換を含んでなる、請求項１のＨＰＩＶ２。
  7. コードされた弱毒化突然変異が、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質の残基１５６６にロイシンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含んでなる、請求項１のＨＰＩＶ２。
  8. コードされた弱毒化突然変異が、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質の残基１７２４にアミノ酸置換を含む欠失を含んでなる、請求項１のＨＰＩＶ２。
  9. コードされた弱毒化突然変異が、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質の残基１７２４及び１７２５にアミノ酸欠失を含んでなる、請求項１のＨＰＩＶ２。
  10. 請求項１〜９のいずれか１項の感染性自己複製組換えヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）であって、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムが、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、または哺乳動物宿主において免疫応答を誘発可能な微生物病原体のタンパク質から選択される非ＰＩＶ分子をコードするように修飾されている、前記ＨＰＩＶ２。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項の感染性自己複製組換えヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）を産生する方法であって：細胞または細胞不含系において、ＨＰＩＶ２ Ｌタンパク質のアミノ酸残基４６０、９４８、１５６６、または１７２４に弱毒化突然変異をコードする部分的または完全ポリ六量体組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子を含んでなる１以上の発現ベクターを同時発現させることを含んでなる、前記方法。
  12. ポリ六量体組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆ）を更にコードしている、請求項１のＨＰＩＶ２。
  13. 請求項１〜１０及び１２のいずれか１項の感染性自己複製組換えヒト２型パラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ２）を含む、免疫原性組成物。
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