CN104968782B - 利用人副流感2型病毒载体的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种病毒载体及其制造方法，所述病毒载体是在人副流感2型病毒基因中整合有编码抗原多肽的基因的病毒载体，所述病毒载体中，抗原多肽以与病毒的结构蛋白质融合的融合蛋白质的形式表达。本发明的病毒载体中，在病毒颗粒上定量地大量包含抗原肽，能够高效地将抗原多肽运送至靶细胞。

Description

利用人副流感2型病毒载体的疫苗
技术领域
本发明涉及可作为用于预防或治疗疾病的疫苗使用的RNA病毒载体及灭活疫苗。
背景技术
副粘病毒科的病毒具有负单链RNA作为基因组，已制作出了能够利用逆向遗传学方法高度表达外源基因的载体，认为其具有作为基因治疗用载体或基因重组疫苗用载体的优异特性。由于病毒的生命周期不包含DNA期(DNA phase)，并且转录·复制全部在处于核外的细胞质中进行，因此，与染色体DNA发生同源性重组的概率极小，由于对染色体的基因重组而致癌的风险小。
目前为止，本申请的发明人试图将人副流感2型病毒(其为负单链RNA病毒，属于副粘病毒科副粘病毒亚科腮腺炎病毒(Rubulavirus)属，下文记作hPIV2)载体化，研究了其作为疫苗及基因治疗用载体的应用。
在研究过程中，构建了F基因(病毒的结构蛋白质)完全缺失了的、hPIV2的F基因缺失型载体。该载体具有非传播性(non-transmissible)或单轮感染性(single-round-infectious)的特性。此外，还成功获得了具有高效价(high titer)的载体产生能力的稳定表达F基因的包装细胞，该细胞可用于F基因缺失型载体的生产。缺失F基因的该载体，仅能在表达有F基因的包装细胞中产生将F蛋白质保持于病毒被膜上的感染性载体。另一方面，在不表达F基因的细胞·组织中，尽管发生所谓的自身复制(self-replication)，但不能产生感染性的载体，因此，载体不会在受体中无穷尽地增殖，可以认为其安全性较高(专利文献1)。
已报道了许多使用基因重组RNA活病毒载体或弱毒化RNA重组病毒的疫苗或基因治疗在非临床试验、临床研究、临床试验等中显示出有效性的结果(非专利文献1～9)。但是，目前还没有报道被美国食品药品监督管理局及欧州药品厅批准为药品的基因重组活(live)RNA病毒载体制剂。推测其理由为：使用基因重组的活RNA病毒作为载体时，虽然采取了利用弱毒化病毒以降低病原性、或利用非传播型载体等安全层面上的对策，但在感染细胞内仍大量产生病毒及外源基因产物，因此不能彻底消除对恒常性(homeostasis)的影响或外源基因的突变等的忧虑。
因此，可以说将基因组灭活或分解为组分(component)从而使病毒不进行转录·复制的疫苗的安全性较高。灭活疫苗的制作多采用使用福尔马林的处理方法。
但是，被认为安全性较高的灭活疫苗也存在安全性上的问题。20世纪60年代开发出了针对属于副粘病毒科的RSV的、利用福尔马林获得的灭活RSV疫苗，接种该疫苗后，由于RSV的自然感染，导致婴幼儿中出现了重症患者和2名死亡者。之后全力进行了对其原因的阐明。发现了利用福尔马林对病毒进行灭活处理导致F膜蛋白质的立体结构发生变化。发现：通过接种该疫苗，产生的是不具有对改性后的F膜蛋白质的中和活性的抗体，而由于经过福尔马林处理而不存在正常结构的F膜蛋白质，却没有产生对该蛋白质具有中和活性的抗体。并且，认为在接种该疫苗后，由于RSV病毒的自然感染，使得机体反应欲要抑制病毒的增殖时，将过量产生没有中和活性的抗体。结果，在通常的RSV感染中观察不到的那样多数的嗜酸性粒细胞浸润至肺组织，随之IL-4、IL-5等细胞因子升高，也不能诱导局部IgA抗体、细胞免疫，从而引起了重症化。
此外，已知福尔马林灭活RSV使树突状细胞(其为抗原呈递细胞)成熟的能力比活RSV差，故研究了利用不使用福尔马林的UV处理、热处理等进行的灭活，但无论采用哪种处理，将树突状细胞活化的能力均较低，并且还诱导炎症反应，因此未实现实用化。同 样地，对于属于副粘病毒科的麻疹病毒的福尔马林灭活疫苗，也报道了嗜酸性粒细胞的浸润和异型麻疹。
另一方面，有报道称在动物试验中设法使其能够诱导Th1型免疫的灭活RSV疫苗具有能预防病毒感染的效果，认为能诱导Th1的灭活疫苗具有可解决上述问题的可能性。
虽然认为由病毒载体引起的导入基因在体内的表达较高，但报道了病毒感染细胞·组织中的导入基因的表达没有定量性或表达量低、作为基因治疗用载体的实效性不高的例子。此外，还报道了先前存在的抗体对导入的病毒载体的表达的抑制或伴随多次的病毒载体施予而发生的抗体对该载体的表达的抑制。在需要基因表达达到某一定量以上(即使仅为暂时达到)的基因治疗中使用抗体诱导能力高的病毒载体的困难程度从这些报道例可见一斑。
向病毒载体中导入外源基因并使其表达时，由于外源基因产物不具有包装信号，因此外源基因产物通常不被包含于载体中，病毒载体在体内施予后感染受体细胞，由此发生转录·复制，才能产生外源基因产物。因此，病毒载体的感染、转录·复制等被中和抗体等阻碍时，外源基因的表达将被抑制或降低。
此外，在体内，病毒对细胞·组织的感染效率低，或者病毒即使感染也不发生转录复制或效率非常差、外源基因几乎不表达的情况也很多。认为其原因是：在体内的感染细胞中，病毒的转录复制被由病毒感染诱导的干扰素等抑制为较低水平，细胞外基质等使得病毒载体无法到达靶细胞，等等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2012/108195
非专利文献
非专利文献1：Virology.377(2),225(2008)
非专利文献2：Virology.362(1),139(2007)
非专利文献3：Molecular therapy.16(11),21883(2008)
非专利文献4：Vaccine.28,2271,(2010)
非专利文献5：J Virol.6521,(2011)
非专利文献6：J Virol.1089,(2002)
非专利文献7：Vaccine.29,8557,(2011)
非专利文献8：J Virol.584,(2009)
非专利文献9：Vet Immunol Immunopathol.146(1),92(2012)
发明内容
本发明的目的在于提供能够高效地向靶细胞中导入抗原多肽(包括蛋白质和肽)的病毒载体及灭活载体，其是作为预防或治疗疾病用的疫苗有用的副粘病毒科的病毒载体。
本申请的发明人发现，通过使病毒载体的结构基因与抗原蛋白质或肽的基因以融合的方式表达，能够高效且定量地将抗原蛋白质或肽运送至靶细胞。
此外，发明人成功构建了以下4种类型的载体：类型1)，将抗原基因配置于膜蛋白质HN基因的3’末端侧(以下记作编码链)，由此以使得抗原处于在载体被膜的外部的形式使抗原肽表达；类型2)，将抗原基因配置于F包装细胞的F基因的3’末端侧，由此使得抗原肽在载体被膜的内部表达；类型3)，组合上述1)和2)，由此使得抗原肽在载体被膜的内部和外部两处均表达；以及类型4)，将抗原与作为向病毒的包装信号发挥作用的膜蛋白质的膜·细胞内结构域融合，由此在载体上整合进抗原。由此，向多个抗原的载体中进行各种各样的导入成为可能。
即，本发明涉及能够将抗原多肽高效地传递至靶细胞中的病毒载体，具体而言提供如下所述的发明：
[1]病毒载体，是在副粘病毒科病毒的基因中整合有编码抗原多肽的基因的病毒载体，在所述病毒载体中，所述抗原多肽以与病毒的结构蛋白质或它们的一部分融合的融合蛋白质的形式表达。
[2]如[1]所述的病毒载体，其中，融合蛋白质是与病毒的HN蛋白质、F蛋白质及M蛋白质中的一种或两种以上或它们的一部分融合的融合蛋白质。
[3]如[1]或[2]所述的病毒载体，其特征在于，
1)编码抗原多肽的基因配置于HN基因的3’末端侧，抗原多肽在载体被膜的外部表达；
2)编码抗原多肽的基因配置于F基因的3’末端侧，抗原多肽在载体被膜的内部表达；或
3)编码抗原多肽的基因分别配置于HN基因的3’末端侧及F基因的3’末端侧，抗原多肽在载体被膜的外部和内部两方表达。
[4]如[1]或[2]所述的病毒载体，其特征在于，使抗原多肽与作为病毒包装信号的F膜蛋白质或HN膜蛋白质的膜·细胞内结构域融合，将抗原多肽保持在载体被膜上。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的病毒载体，其中，病毒为F蛋白质缺失型副粘病毒科病毒。
[6]如[1]～[5]中任一项所述的病毒载体，其中，病毒为经核酸灭活处理的病毒。
[7]如[6]所述的病毒载体，其中，核酸灭活处理尽量不改变(不实质性地改变)病毒被膜的结构。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的病毒载体，其中，抗原多肽为流感病毒的M2e蛋白质或其片段。
[9]如[1]～[7]中任一项所述的病毒载体，其中，抗原多肽为选自由下述病毒的抗原肽、下述细菌的抗原肽、或RSV的F蛋白质、癌抗原gp100、MUC1、NY-ESO-1、MelanA/MART1、TRP2、MAGE、CEA、CA125、HER2/neu、WT1及PSA组成的组中的任一种或两种以上、或它们的片段，所述病毒选自包括强毒型流感病毒在内的流感病毒、副流感3型病毒、RS病毒、亨德拉病毒(Hendra virus)、SARS病毒、尼帕病毒(Nipah virus)、拉沙病毒(Lassa virus)、登革病毒(Dengue virus)、西尼罗病毒(West Nile virus)、人偏肺 病毒(humanmetapneumovirus)、埃博拉病毒(Ebola virus)、汉坦病毒(Hantavirus)、艾滋病病毒、C型肝炎病毒、拉沙病毒、人乳头瘤病毒(human papillomavirus)、风疹病毒、轮状病毒(Rotavirus)、诺如病毒(Norovirus)、刚果-克里米亚出血热病毒(Crimean-Congohemorrhagic fever virus)、疱疹病毒(herpes virus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)及乳头瘤病毒(papilloma virus)，所述细菌选自A组β型溶血性链球菌、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、霍乱弧菌及支原体。
[10]制造副粘病毒科的病毒载体的方法，所述病毒载体以与病毒的结构蛋白质或它们的一部分融合的融合蛋白质的形式表达抗原多肽，所述方法包括下述各工序：
将在病毒基因中整合有编码融合蛋白质的基因的副粘病毒科的病毒与Vero细胞共培养；
然后从培养上清液中分离病毒颗粒。
[11]如[10]所述的方法，其中，融合蛋白质为与病毒的HN蛋白质、F蛋白质及M蛋白质中的一种或两种以上或它们的一部分融合的融合蛋白质。
[12]如[10]或[11]所述的方法，融合蛋白质为选自病毒的HN蛋白质或F蛋白质的细胞内区域中的融合蛋白质。
[13]如[10]～[12]中任一项所述的方法，其特征在于，抗原多肽如下进行表达，
1)以融合于HN蛋白质的C末端侧的方式在载体被膜的外部表达，
2)以融合于F蛋白质的N或C末端侧或HN蛋白质的N末端侧的方式在载体被膜的内部表达，或
3)以分别融合于HN蛋白质的C末端侧及F蛋白质的N或C末端侧或HN蛋白质的N末端侧的方式在载体被膜的外部和内部两方表达。
[14]如[10]～[12]中任一项所述的方法，其特征在于，抗原多肽 与病毒的HN蛋白质或F蛋白质的膜·细胞内区域融合，抗原多肽被包含于载体被膜上。
[15]如[10]～[14]中任一项所述的方法，包括下述工序：
将缺失F基因的副粘病毒科病毒与Vero细胞共培养，所述Vero细胞表达副粘病毒科病毒的F基因或已与抗原融合的F基因；
然后从培养上清液中分离病毒颗粒。
[16]如[10]～[15]中任一项所述的方法，还包括对病毒进行核酸灭活处理的工序：
[17]如[16]所述的方法，其中，核酸灭活处理尽量不改变(不实质性地改变)病毒被膜的结构。
[18]如[10]～[17]中任一项所述的方法，其中，抗原多肽为流感病毒的M2e蛋白质或其片段。
[19]如[10]～[18]中任一项所述的方法，其中，抗原多肽为选自由下述病毒的抗原肽、下述细菌的抗原肽、或RSV的F蛋白质、癌抗原gp100、MUC1、NY-ESO-1、MelanA/MART1、TRP2、MAGE、CEA、CA125、HER2/neu、WT1及PSA组成的组中的任一种或两种以上、或它们的片段，所述病毒选自包括强毒型流感病毒在内的流感病毒、副流感3型病毒、RS病毒、亨德拉病毒、SARS病毒、尼帕病毒、拉沙病毒、登革病毒、西尼罗病毒、人偏肺病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、艾滋病病毒、C型肝炎病毒、拉沙病毒、人乳头瘤病毒、风疹病毒、轮状病毒、诺如病毒、刚果-克里米亚出血热病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒及乳头瘤病毒，所述细菌选自A组β型溶血性链球菌、结核分枝杆菌、霍乱弧菌及支原体。
[20]Vero细胞，其包含已与抗原基因融合的副粘病毒科病毒的F基因，并表达上述抗原与F蛋白质的融合蛋白质。
发明的效果
1)使用以往的平台(platform)型灭活病毒载体时，每个载体的抗原导入量低，因此存在抗体产生效率低的问题。而与之相对， 若使用本发明的病毒载体，则能够在病毒颗粒上定量地包含大量的抗原肽。
2)本发明中，融合后的病毒载体的结构蛋白质、特别是膜蛋白质本身具有免疫原性，因此，能够诱导对与该蛋白质融合的低免疫原性的抗原多肽的高度免疫。即，载体自身具有佐剂活性，施予时无需添加佐剂，或添加少于通常的量的佐剂。
3)本发明的病毒载体中，抗原与佐剂被导入同一细胞中，因此，能够降低由于混合施予肽和佐剂时二者分别被摄入不同的细胞而导致的无效率的免疫诱导。
4)本发明中使用的人副流感病毒为负单链病毒，且末端经三磷酸修饰(5’-PPP)。该末端三磷酸和与之相连的数个碱基的单链RNA部分成为被称为IFIT的细胞内信号的基质，诱导具有抗病毒活性的1型干扰素等，有助于DC细胞成熟等(Abbas YT.,Nature,Vol.494,Issue 7435,pp60-64(2013)；Saito T.et al.,J.Exp.Med.Vol.205,No.7,pp1523-1527(2008))。
5)本发明中，使用低浓度的β-丙内酯等进行核酸灭活，因此，病毒被膜蛋白质的立体结构得以维持，并且在使得这些蛋白质的功能得以维持的状态下仅灭活病毒基因组。因此，载体具有类似活病毒的细胞吸附性，能够发挥由上述结构产生的免疫诱导能力·DC细胞成熟化能力。
6)根据上述优点，本发明的病毒载体与以往的病毒载体(不能期待其在人中获得充分的效果)不同，能够期待其在人中也具有高的效果。
7)通过在基因水平上进行抗原导入，无需在灭活后进行抗原导入，能够避免伴随灭活后的抗原导入而产生的问题(抗原导入效率低、被膜结构的破坏等)。
8)本发明的病毒载体能够以在载体被膜的外部、内部或这两方配置抗原的方式构成，由此向复数个抗原的载体的各种各样的导入成为可能。
如上所述，根据本发明，通过高效的病毒灭活处理，可获得能够以不逊色于活病毒载体的方式针对树突状细胞等进行免疫诱导的灭活载体，能够为利用副粘病毒科病毒的灭活载体的疫苗化开启道路。
附图说明
图1表示人副流感2型病毒在小鼠细胞(NIH-3T3细胞)和猴细胞(Vero细胞)中的基因表达效率。小鼠细胞中，直至稀释至104也可确认到GFP表达，猴细胞中，直至稀释至107也可确认到GFP表达。
图2表示人和小鼠树突状细胞中的hPIV2/ΔF的拷贝数。
图3表示hPIV2/ΔF对小鼠树突状细胞的感染效率。
图4表示感染活hPIV2/ΔF/GFP后的人树突状细胞中的成熟标志物表达。
图5表示感染活hPIV2/ΔF/GFP后的人树突状细胞中的MHC和细胞因子表达。
图6表示利用β-丙内酯的病毒灭活处理的结果。(A)表示第5天及第10天时的载体的GFP荧光，(B)表示红细胞凝集反应(HA效价)。(C)-(E)表示施予活的hPIV2/ΔF/GFP、经β-丙内酯处理的hPIV2/ΔF/GFP及经福尔马林处理的hPIV2/ΔF/GFP后的肺泡清洗液中的抗体值(IgG1、IgG2及IgA)。
图7表示由活的和β-丙内酯(BPL)灭活的hPIV2/ΔF引起的小鼠树突状细胞的成熟化以及MHC表达和细胞因子的诱导。
图8表示用于制造hPIV2的HN与抗原的融合蛋白质的载体的构建。(A)是使抗原与HN融合而得到的hPIV2(ΔF)基因组图(融合抗原例：M2e肽、gp-100肽、WT-1肽)。(B)是使抗原与HN融合而得到的灭活hPIV2(ΔF)的概念图。(C)是通过Western印迹得到的、向HN中导入了抗原的病毒的抗原的确认结果(HN-M2e为导入了抗原的病毒，HN为未导入抗原的病毒，仅在HN-M2e中观察到了抗 M2抗体阳性反应)。
图9(A)表示用于制造抗原与hPIV2和包装细胞中的F蛋白质的融合蛋白质的包装细胞建立用质粒载体图(融合抗原例：M2e肽、gp-100肽、WT-1肽)。图9(B)表示通过Western印迹得到的、回收载体的抗原的导入结果。Western印迹中，自左侧起，hPIV2wt是未导入抗原的病毒，HN-M2e hPIV2ΔF是向HN中导入了抗原的病毒，F-M2e串联(tandem)hPIV2ΔF是向F中导入了抗原的病毒。
图10表示(A)向hPIV2中导入抗原的样式(载体与抗原的配置图)、及(B)向HN及F中同时导入了抗原的载体中的抗原导入结果(Western印迹)。Western印迹中，自左侧起，hPIV2wt是未导入抗原的病毒，HN-M2e hPIV2ΔF是向HN中导入了抗原的病毒，F M2e串联hPIV2ΔF是向F中导入了抗原的病毒，4F M2e串联+HN M2e hPIV2ΔF是向F及HN两者中导入了抗原的病毒。
图11表示hPIV2/ΔF/HN-M2e对流感病毒的疫苗效果。
图12表示hPIV2/ΔF/HN-gp-100对黑素瘤细胞的疫苗效果。
图13表示移植了黑素瘤细胞的小鼠中的、hPIV2/ΔF/HN-gp-100/WT-1的治疗效果。
图14(A)表示向hPIV2/ΔF质粒的NotI区域中导入使M2e抗原或RSV的F(包括改性的F)的细胞外区域与F膜蛋白质(其作为向病毒的包装信号而发挥作用)的膜·细胞内结构域融合而成的基因的图。图14(B)表示对回收的载体的感染细胞中的M2e的表达的确认。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2012-283421号的说明书中记载的内容。
具体实施方式
就一个观点而言，本发明提供一种病毒载体及为该载体且能进行与活(live)病毒同样的免疫诱导的灭活载体，所述病毒载体是在副粘病毒科病毒的结构基因中整合有编码抗原多肽的基因的病毒载体，其特征在于，该抗原多肽以与病毒的结构蛋白质融合的融合蛋 白质的形式表达。
如下文所述实施例中具体所示，本发明中分别构建了在F基因缺失型hPIV2载体的HN基因和/或F基因中以融合型表达万能型流感病毒的M2e肽基因、黑素瘤抗原的gp100肽基因、或WT-1癌抗原基因的F基因缺失型hPIV2载体。此外，构建了在F基因缺失型hPIV2载体的外源基因导入部分融合有M2e抗原和包含包装信号的F膜蛋白质的膜·细胞内结构域的F基因缺失型hPIV2载体。
进而，通过β-丙内酯处理，在保持该载体的红细胞凝集活性和使树突状细胞成熟的能力的状态下对基因组进行了灭活处理。利用由此得到的灭活的或活的载体，确认到了对流感病毒的极高的疫苗效果及对黑素瘤的增殖抑制效果。
作为可在本发明中使用的副粘病毒科病毒，特别优选的是人副流感2型病毒，其基因组为约15,000个碱基的单顺反子单链负RNA。作为病毒结构基因产物，NP蛋白质、P(磷酸)蛋白质、M(基质)蛋白质、F(融合)蛋白质、HN(血细胞凝集素·神经氨酸酶)蛋白质及L(大，Large)蛋白质依次编码于基因组上。此外，通过RNA编辑产生V蛋白质。核壳蛋白质(NP)结合至RNA基因组，形成螺旋对称核糖核苷蛋白复合物(核壳RNP)。病毒基因组编码的蛋白质中，NP蛋白质、P(磷酸)蛋白质及L(大)蛋白质是RNP的形成所必需的。病毒·被膜上存在F(融合)蛋白质、HN(血细胞凝集素·神经氨酸酶)蛋白质，负责向受体的吸附和融合。M(基质)蛋白质与F蛋白质和HN蛋白质的细胞质内结构域、被膜脂双层膜及RNP相互作用，对病毒颗粒的萌芽是重要的。
人副流感2型病毒是在细胞质中增殖的RNA病毒，因此基因不被引入宿主细胞的染色体中。此外，已知该病毒会感染人气管粘膜，诱导以IgA为中心的粘膜免疫、利用IgG的体液免疫及细胞免疫。并且，迄今为止没有使人(成人)感染时的重症报道病例，因此可以认为其作为治疗用病毒载体是极为有用的。
所谓“病毒载体”，是指：在已感染的细胞中应当表达的基因 与病毒基因组基因一起被包装而成的病毒颗粒，以及不包含可产生具有感染能力的病毒的病毒基因组的载体。本说明书中，特别将后者称为“灭活载体”，可通过试剂等的处理将核酸灭活。
“抗原多肽”是可在施予了本发明的病毒载体的受试者中诱发免疫反应的多肽，作为例子，可举出癌抗原或其一部分、来自细菌或病毒的蛋白质或其一部分。例如，作为对于可用作流感用疫苗的抗原多肽，有流感病毒的HA蛋白质、NA蛋白质、M2蛋白质或M2e蛋白质、或它们的片段。
进而，作为感染症相关的导入性抗原多肽，可举出流感病毒(包括强毒型流感病毒)、副流感3型病毒、RS病毒、亨德拉病毒、SARS病毒、尼帕病毒、拉沙病毒、登革病毒、西尼罗病毒、人偏肺病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、艾滋病病毒、C型肝炎病毒、拉沙病毒、人乳头瘤病毒、风疹病毒、轮状病毒、诺如病毒、刚果-克里米亚出血热病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒等病毒的抗原肽，A组β型溶血性链球菌、结核分枝杆菌、霍乱弧菌、支原体等细菌的抗原肽。
此外，作为可用作癌治疗用疫苗的抗原多肽，可举出gp100、MUC1、NY-ESO-1、MelanA/MART1、TRP2、MAGE、CEA、CA125、HER2/neu、WT1、PSA等。所谓片段，是具有应当成为抗原的蛋白质的部分序列的多肽，是指在施予至受试者时能够诱发免疫反应。需要说明的是，免疫反应包括体液免疫和细胞免疫两者。
本发明中，抗原多肽以与病毒的结构蛋白质或结构蛋白质的一部分融合的融合蛋白质的形式表达。由此，在病毒中表达的抗原多肽被摄入病毒颗粒中，从而被传递至病毒感染的细胞。即，本发明中，不仅被引入病毒基因上的抗原多肽的基因在感染细胞中转录·翻译，而且病毒颗粒本身具有抗原多肽，由此，能够向受体细胞可靠地传递大量的抗原多肽。
为了使抗原多肽以融合蛋白质的形式表达，将编码抗原多肽的基因以与编码病毒的结构蛋白质或结构蛋白质的一部分的基因连接 的方式引入病毒基因中。作为编码病毒的结构蛋白质的基因，可举出hPIV2的HN基因、F基因、M基因、NP基因、P基因及L基因。抗原基因可以为1种，也可以连接2种以上的抗原基因。由此，能够诱发针对2种以上抗原的免疫反应。此外，也可以向HN基因、F基因、M基因、NP基因、P基因、L基因中的复数个基因中同时导入复数个抗原。上述那样的载体的构建，可采用既有方法利用惯用的重组DNA技术进行。
特别优选地，抗原多肽以与HN蛋白质、F蛋白质及M蛋白质中的一种或两种以上融合的融合蛋白质的形式表达。若抗原多肽以融合于HN蛋白质的C末端侧的形态引入，则能够使抗原多肽在病毒的被膜上表达。此外，若以融合于HN蛋白质的N末端侧的形态、融合于F蛋白质的N或C末端侧或的形态与M蛋白质融合的形态引入，则能够使抗原多肽在病毒颗粒内部表达。若构建在F蛋白质的C末端侧融合有抗原肽的F蛋白质，将其组合至可反式供给该蛋白质的包装细胞，则能够在F缺失型hPIV2的被膜内部表达大量的抗原。进而，将抗原肽与病毒的HN蛋白质或F蛋白质的膜·细胞内区域融合，能够使载体被膜上包含抗原。此外，HN蛋白质、F蛋白质本身具有抗原性，即使对于免疫原性低的抗原多肽，也能够通过与HN蛋白质、F蛋白质融合来赋予更高的免疫原性。
在本发明的一种优选实施方式中，使用F基因缺失(称为ΔF)病毒作为人副流感2型病毒。人副流感2型病毒的F蛋白质，是被认为在病毒的复制·转录工序中、使病毒被膜与细胞膜融合从而向宿主内导入病毒核壳蛋白时所必需的蛋白质。F基因缺失的人副流感2型病毒，在包装细胞中产生保持有F基因的感染性的hPIV2，但在不表达F蛋白质的细胞中则不产生感染性的病毒。因此，在感染受试者的细胞后，不能构成具有自主增殖能力的病毒颗粒，不存在感染其他细胞的情况，因此，作为疫苗用病毒的安全性高。
为了制备F基因缺失的人副流感2型病毒载体，通过在表达hPIV2的F蛋白的细胞中培养F基因缺失病毒，在从该细胞反式供 给的F蛋白存在的情况下，使F蛋白保持于病毒被膜上，由此可制造具有感染能力的病毒颗粒。
在本发明的一种优选实施方式中，使用Vero细胞作为可感染F基因缺失病毒从而产生病毒颗粒的包装细胞。Vero细胞对人副流感2型病毒F蛋白的容许性特别高，并且不表达干扰素，即使在使得人副流感2型病毒的F基因恒常性表达的情况下也能够稳定增殖，并且能够效率良好地产生病毒颗粒。
此外，代替表达F基因的Vero包装细胞，将保持融合有抗原多肽的F基因的Vero细胞作为包装细胞，由此可制造反式供给F基因的、具有感染能力的缺失病毒颗粒。
就其他观点而言，本发明提供制造以与病毒的结构蛋白质的融合蛋白质的形式表达抗原多肽的人副流感2型病毒载体的方法。该方法包括下述各工序：将人副流感2型病毒(其是向病毒基因中引入编码融合蛋白质的基因而得的)与Vero细胞共培养，然后从培养上清液中分离病毒颗粒。
在一种优选实施方式中，对本发明的病毒载体实施了核酸灭活处理。所谓核酸灭活处理，是指在保持F蛋白质、HN蛋白质等被膜蛋白质的立体结构、具有这些蛋白质的功能的状态下仅将病毒基因组灭活。核酸灭活处理可通过例如核酸烷基化剂处理、过氧化氢处理、UV照射、放射线照射或热处理进行。特别优选地，使用作为核酸烷基化剂的β-丙内酯对病毒载体进行处理。可向病毒培养液中加入β-丙内酯，于4℃下孵育24小时左右。关于β-丙内酯的优选浓度，以终浓度计为0.004％～0.05％，更优选为0.004％～0.01％。
通过使用F基因缺失病毒，即使万一通过药剂处理后仍残存有活病毒，该病毒也缺乏增殖能力，没有在受体内增殖的可能，能够保证灭活疫苗的高安全性。
用β-丙内酯处理本发明的病毒载体时，能够在保持病毒载体的红细胞凝集活性及使树突状细胞成熟的能力的情况下将基因组灭活。通过该方法，病毒颗粒本身保持佐剂活性，因此存在无需并用 引起对抗原的免疫的佐剂、或可降低佐剂浓度的优点。
本发明的病毒载体介由唾液酸受体感染细胞。唾液酸存在于许多细胞·组织的表面，因此，作为载体的施予途径，除可以考虑经鼻喷雾、经肺、经口、舌下、皮内、皮下、向静脉的直接施予以外，也可以考虑向树突状细胞等引发免疫的细胞的离体(ex vivo)施予等。
典型地，本发明的病毒载体可以以喷雾剂的形式施予至包括人在内的哺乳动物细胞。喷雾剂可采用既有方法进行制备。例如，可如下制备：将包含病毒载体的培养上清液根据需要浓缩，与适当的载体或赋形剂一起悬浮在PBS等缓冲液、病毒载体稳定溶液或生理盐水中后，根据需要用过滤器等过滤灭菌，然后填充至无菌容器中，由此进行制备。也可以根据需要向喷雾剂中加入稳定剂、防腐剂等。可以将由此得到的表达载体吸入施予至受试者。
此外，典型地，可以以注射剂(皮下、皮内、肌肉注射剂)的形式施予至包括人在内的哺乳动物细胞。该注射剂可采用既有方法进行制备。例如，可如下制备：将包含病毒载体的培养上清液根据需要浓缩，与适当的载体或赋形剂一起悬浮在PBS等缓冲液或生理盐水中后，根据需要用过滤器等过滤灭菌，然后填充至无菌容器中，由此进行制备。也可以根据需要向注射剂中加入稳定剂、防腐剂等。可以将由此得到的表达载体以注射剂的形式施予至受试者。
以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。
[实施例]
实施例1由hPIV2/ΔF引起的、导入基因在非洲绿猴细胞(Vero细胞)及小鼠细胞 (NIH3T3细胞)中的表达的确认
在96孔板中以Vero细胞和NIH3T3细胞在载体感染时成为单层的方式进行培养。将导入了GFP基因的hPIV2/ΔF从原液稀释至108。由于该载体不产生感染性载体，因此只在单轮感染的细胞中呈现 GFP的荧光。以细胞培养液的十分之一量添加该稀释病毒，培养3天。
结果，在Vero细胞和NIH3T3细胞中，分别可在添加10的1次方至7次方的载体稀释液和10的1次方至4次方的载体稀释液时观察到GFP的荧光(图1)。
实施例2由hPIV2/ΔF引起的、人和小鼠树突状细胞中的增殖载体拷贝数的确认
(人树突状细胞的回收)根据伦理规定从健康人的外周血回收CD14阳性细胞，在细胞培养的第1天、第4天、第7天，向培养液中添加GM-CSF使其成为50ng/mL，添加IL-4使其成为25ng/mL，进行细胞培养。使导入有GFP基因的hPIV2/ΔF以感染复数(MOI)为25、50、100的方式感染培养8天的细胞，针对感染3天后的细胞中的hPIV2的N基因区域部分进行定量PCR，测定基因组的拷贝数。
(小鼠树突状细胞的回收)
以遵循伦理规定的方式，从B57BL/6和BALB/c小鼠的大腿骨回收骨髓，除去残渣后进行培养(RPM-1640培养基，10％FBS)。每培养2天向培养液中更换培养基，添加GM-CSF(20ng/mL)和IL-4(20ng/mL)。使导入有GFP基因的hPIV2/ΔF以感染复数(MOI)为25、50、100的方式感染培养8天的细胞，针对感染3天后的细胞中的hPIV2的N基因区域部分进行定量PCR，测定基因组的拷贝数。根据使用N区域部分的定量PCR的结果可知，N区域部分的每个细胞的拷贝数，在人树突状细胞中比在小鼠的树突状细胞中最大约多5倍(图2)。
根据实施例1和2可以确认，hPIV2可能感染小鼠细胞而使导入基因增殖。其中，与人·猴的细胞相比，在小鼠细胞中的导入表达量少，增殖的病毒数也少(图1及图2)。
实施例3由hPIV2/ΔF引起的、在树突状细胞中的感染效率的确认
以遵循伦理规定的方式，从健康人的外周血回收CD14阳性细胞，在细胞培养的第1天、第4天、第7天，向培养液中添加GM-CSF使其终浓度为50ng/mL，添加IL-4使其终浓度为25ng/mL，进行细胞培养。使导入有GFP基因的hPIV2/ΔF以感染复数(MOI)为25、50、100的方式感染培养8天的细胞。
以遵循伦理规定的方式，从B57BL/6的大腿骨回收骨髓，除去残渣后进行培养(RPM-1640培养基，10％FBS)。每培养2天向培养液中更换培养基，添加GM-CSF使其终浓度为20ng/mL，并且添加IL-4使其终浓度为20ng/mL。使导入有GFP基因的hPIV2/ΔF以感染复数(MOI)为25、50、100的方式感染培养8天的细胞。
在感染2天后，以GFP的荧光为指标，使用流式细胞仪调查对树突状细胞的感染效率。将CD11c阳性细胞视为树突状细胞。
小鼠的结果示于图3。MOI＝25时在27.5％的小鼠树突状细胞中为GFP荧光阳性，MOI＝50时在51.0％的小鼠树突状细胞中为GFP荧光阳性，MOI＝100时在68.0％的小鼠树突状细胞中为GFP荧光阳性(图3)。在人中，MOI＝25时在59.9％的树突状细胞中为GFP荧光阳性，MOI＝50时在73.1％的树突状细胞中为GFP荧光阳性，MOI＝100时在77.8％的树突状细胞中为GFP荧光阳性。
根据以上结果可知，hPIV2/ΔF能够感染人的树突状细胞及小鼠的树突状细胞从而表达基因，与小鼠的树突状细胞相比，人的树突状细胞的感染效率更高。
实施例4由hPIV2/ΔF引起的人树突状细胞的成熟化
实施例3中确认到了hPIV2/ΔF能够效率良好地向人树突状细胞中导入基因。对于树突状细胞作为免疫呈递细胞有效地发挥功能、诱导高效的免疫而言，该细胞成熟化并向淋巴器官归巢是极为重要的。因此，以MOI＝25的条件使hPIV2/ΔF感染人树突状细胞2天，针对作为抗原呈递细胞的辅助刺激因子的CD40、CD80、CD86的表达，调查了树突状细胞的成熟化能力。对于向次级淋巴器官的归巢能力，以CCR7的表达升高为指标进行了评价。作为阳性对照，将 LPS(脂多糖，已知其可活化TRL4，效率非常良好地引起成熟化及向淋巴器官的归巢)以成为1μg/mL的量添加在培养基中。利用指标抗体使用流式细胞仪进行评价。
结果，通过hPIV2/ΔF的感染，树突状细胞能够以与LPS相匹敌的程度诱导辅助刺激因子的表达，CCR7的表达升高(图4)。
实施例5由hPIV2/ΔF引起的、人树突状细胞中的主要组织相容基因复合体(MHC， 人中为HLA)的表达和细胞因子的诱导
对于抗原特异性的免疫诱导而言，抗原向MHC上的呈递是重要的。为此，需要MHC I类分子或II类分子被呈递至抗原。CD8阳性T细胞识别MHC I类分子上的抗原，诱导细胞障碍性T细胞等。CD4阳性T细胞识别MHC II类分子上的抗原并将其活化。
树突状细胞能够通过MHC I类分子和MHC II类分子来呈递抗原。对于hPIV2/ΔF，针对人树突状细胞的MHC I类分子(人中为HLA-A分子)和MHC II类分子(人中为HLA-DR分子)的表达升高进行了调查，即，在与实施例3和4相同的条件下，以人HLA-A分子为指标调查了MHC I类分子的表达升高，以人HLA-DR分子为指标调查了MHC II类分子的表达升高。结果，HLA-A分子和HLA-DR分子也与阳性对照的LPS同等程度地使表达升高(图5)。
进而，调查了对培养上清液中的IL-6和IL-12细胞因子的诱导。对于人树突状细胞而言，观察到了hPIV2/ΔF使得IL-6的表达与LPS同等程度的升高，尽管IL-12的表达低于LPS，但仍观察到了其表达的升高(图5)。
实施例6hPIV2/ΔF的灭活和红细胞凝集活性及由灭活hPIV2/ΔF引起的免疫诱导
为了在保持hPIV2/ΔF的蛋白质的结构和功能的情况下仅将基因组灭活，研究了利用烷基化剂β-丙内酯(BPL)的灭活。向经无血清培养基培养的保持有GFP基因的hPIV2/ΔF的培养液中，以成为0.004％、0.005％、0.0075％、0.009％、0.01％、0.012％、0.025％、0.05％的量添加BPL，于4℃下处理24小时。然后，于37℃下处理30分 钟，将BPL灭活。通过超速离心回收hPIV2/ΔF。作为对照，将相同体积的hPIV2/ΔF也通过超速离心进行浓缩，将最终体积的hPIV2/ΔF悬浮在等量的PBS溶液中。使灭活载体和对照载体感染hPIV2的F表达细胞，培养10天。进一步地，使上清液感染新的hPIV2的F表达细胞，培养10天。进一步地，实施相同操作。在F表达细胞中培养载体共计3次。利用TCID50对病毒进行测定，也获得了同样的结果。
结果，对照载体显示出了强荧光和细胞变性，但是以0.004％、0.005％、0.0075％、0.009％、0.01％、0.01％、0.012％、0.025％、0.05％的量实施了灭活的载体，均未显示出GFP的荧光，也未观察到细胞变性。即，确认了经过BPL处理，基因组被完全灭活(图6A)。
接着，调查了经灭活的载体与对照载体的红细胞凝集反应。加入等量的1％豚鼠红细胞溶液载体稀释用液，调查红细胞凝集反应。
结果，经灭活的载体显示出了与未进行灭活处理的活hPIV2/ΔF对照载体相同的512HA值(图6B)。这表明：经灭活的载体的HN蛋白质完全失去了红细胞凝集能力，即保持了立体结构，失去了功能。因此，推测经过灭活处理，载体中仅基因组被灭活。
为了调查灭活的效果，通过0.012％的BPL及利用常规方法的福尔马林处理对该载体进行灭活，将活hPIV2/ΔF/GFP、经BPL灭活的hPIV2/ΔF/GFP及经福尔马林处理的hPIV2/ΔF/GFP的各载体颗粒(particle)2×107个通过经鼻施予B6小鼠2次(间隔1周)，在施予后1周后回收肺泡清洗液，调查载体的抗体价(IgG1、IgG2及IgA)。在96孔板上涂覆4μg/mL的灭活hPIV2，测定抗体价。结果，在肺泡清洗液中，尽管经BPL灭活处理的hPIV2/ΔF/GFP不如hPIV2/ΔF/GFP，但IgG1、IgG2及IgA的抗体也被诱导。在肺泡清洗液中几乎未观察到对应于经福尔马林处理的hPIV2/ΔF/GFP的抗体的升高(图6C、D及E)。这表明，经过福尔马林处理，在肺泡清洗液中，对应于具有通常的立体结构的hPIV2蛋白质的抗体的诱导较低。另一方面，使用脾细胞长期用抗原进行刺激时，经福尔马林处 理的hPIV2/ΔF也观察到了抗体的升高。结果可确认，相对于福尔马林处理而言，低浓度的BPL处理能够针对载体诱导与活病毒近似的抗体。根据上述结果可推测，与福尔马林处理相比，利用低浓度的BPL的灭活处理能够维持更近似活病毒的膜蛋白质结构。
实施例7由hPIV2/ΔF引起的、小鼠树突状细胞的成熟化及主要组织相容基因复合 体(MHC，人中为HLA)的表达和细胞因子的诱导
从B57BL/6小鼠的大腿骨回收骨髓，在细胞培养的第1天、第4天、第7天，向培养液中添加GM-CSF使其成为25ng/mL，进行细胞培养。针对培养8天的细胞，以感染复数(MOI)为25的方式感染保持有GFP基因、经0.05％的BPL处理过的灭活载体的hPIV2/ΔF，调查了由感染2天后的细胞中的CD40和CD80的表达升高引起的树突状细胞的成熟化、由H-2Kb和I-A/I-E引起的MHC I类或II类的升高、培养液中的IL-6和IL-12的表达。对照组使用了未进行灭活的(活)hPIV2/ΔF。
结果，通过hPIV2/ΔF对小鼠树突状细胞的感染，尽管CD40和CD86的成熟标志物的表达量比活hPIV2/ΔF少，但仍确认到了表达升高(图7)。此外，以感染复数(MOI)为25的方式感染经0.012％的BPL处理过的灭活载体hPIV2/ΔF时，其效果与(活)hPIV2/ΔF等同。
相当于MHC I类分子的小鼠H-2Kb分子和相当于MHC II类分子的I-A/I-E分子也同样地有所升高。尽管细胞因子的分泌也不如活hPIV2/ΔF，但各自有所升高(图7)。进而，以感染复数(MOI)为25的方式感染经0.012％的BPL处理过的灭活载体hPIV2/ΔF时，其效果与(活)hPIV2/ΔF等同。
根据以上结果，可判断活的和灭活的载体hPIV2/ΔF均可用于载体评价，因此进行了以下试验。
实施例8使hPIV2的HN基因与抗原基因融合而成的hPIV2/ΔF的构建
构建下述载体的质粒构造，所述构造为：在hPIV2的HN蛋白质的C末端尾部插入了万能型流感病毒的M2e抗原肽(N末端-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDD-C末端(序列号1))或皮肤癌恶性肿瘤的gp-100抗原肽(N末端-KVPRNQDWL-C末端(序列号2))。基于“规则6”(其在hPIV2的构造方面被认为是重要的)进行该构建，使得基因组的总数成为6的倍数。采用逆向遗传学方法实现病毒的回收。
其结果，能够回收将万能型流感病毒的M2e抗原肽或皮肤癌恶性肿瘤的gp-100抗原肽融合于HN基因而成的hPIV2/ΔF/HN-M2e和hPIV2/ΔF/HN-gp-100(图8)。还进行了编码M2e抗原肽(N末端-SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDD-C末端(序列号7))、(N末端-SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSDD-C末端(序列号8))、WT-1的N末端-ALLPAVPSL-C末端(序列号3)、N末端-CYTWNQMNL-C末端(序列号4)、N末端-CMTWNQMNL-C末端(序列号5)、N末端-RMPNAPYL-C末端(序列号6)的基因的导入。但是，也确认到与通常的缺失型hPIV2/ΔF的回收相比，导入有N末端-CYTWNQMNL-C末端(序列号4)那样高疏水性的肽的载体的回收较难。没有关于副粘病毒科的缺失型病毒载体表达融合型抗原的例子的报道。
实施例9表达F基因与抗原基因的融合产物的包装细胞的构建和hPIV2/ΔF的构建
在为制作包装细胞而构建的F表达用质粒上的hPIV2F基因的3’末端侧导入编码万能型流感病毒的M2e抗原肽(N末端-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDD-C末端：序列号1)、WT-1抗原肽(N末端-ALLPAVPSL-C末端(序列号3))、WT-1抗原肽(N末端-CYTWNQMNL-C末端(序列号4))或WT-1抗原肽(N末端-RMPNAPYL-C末端(序列号6))的基因，构建包装细胞。导入一个或复数个抗原。使用该细胞，利用常规方法即逆向遗传学方法回收F缺失型hPIV2。
结果，如图9所示，能够回收在载体内部保持抗原的载体。也能够回收表达复数个抗原的载体。此外，还确认到了与载体被膜的外部相比，在内部表达抗原的体系中的载体的回收更容易。还进行了编码M2e抗原肽(N末端-SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSDD-C末端(序列号7))、(N末端-SLLTEVETLTRNGWGCRCSDSSDD-C末端(序列号8))、或WT-1肽(N末端-CMTWNQMNL-C末端(序列号5))的基因的导入。
实施例10可在F缺失型hPIV2被膜的内部和外部两方表达抗原的载体的构建
在实施例8和9中显示出了可载体被膜的内部和外部表达抗原的载体的回收。本实施例中，针对在载体的内部和外部两个部位保持抗原的F缺失型hPIV2的回收进行了研究。使实施例8中回收的载体(保持M2e抗原(序列号1))感染实施例9中所述的在F基因中融合有2个M2e基因的F包装细胞，调查是否能够回收载体。
结果，如图10所示，通过从3mL病毒感染培养上清液中回收的载体的Western印迹，检测到了与抗M2抗体反应的2种蛋白质。它们的分子量相当于在F蛋白质(断裂的F蛋白质)和HN蛋白质上加入了M2e抗体的分子量，确认到了能够回收在被膜的外部和内部保持抗原的载体。此外，根据图10还可知，与HN蛋白质相比，融合于F蛋白质的M2e的条带更密，载体上存在更多的从包装细胞反式供给的F蛋白质和抗原。
实施例11hPIV2/ΔF/HN-M2e对流感病毒的疫苗效果
调查了hPIV2/ΔF/HN-M2e(其以与HN蛋白质的融合型表达流感M2e抗原(序列号1))对流感病毒RP8株的预防效果。作为hPIV2/ΔF/HN-M2e，使用活hPIV2/ΔF/HN-M2e和经0.05％BPL处理而得的灭活hPIV2/ΔF/HN-M2e。进而，还将单独表达M2整体的活hPIV2/ΔF/M2用作为比较对象。与HN融合的M2e中，HN存在于N末端区域的病毒被膜的膜内，C末端区域存在于膜外。
在上述实验中，针对hPIV2/ΔF/HN-M2e型中的与HN构建为融 合型的M2e，调查了其是否作为抗原被识别，并且调查了灭活后的hPIV2/ΔF/HN-M2e作为疫苗是否有效。
以遵循伦理规定的方式，使用5周龄的雌性BALB/c进行试验。在麻醉下通过经鼻施予的方式施予20μl的2×108个的下述载体(TCID50换算)，所述载体为：活hPIV2/ΔF/HN-M2e、灭活hPIV2/ΔF/HN-M2e、活hPIV2/ΔF/M2、灭活hPIV2/ΔF/GFP。2周后再次实施该施予。再施予2周后，在麻醉下向载体施予组和对照组的小鼠经鼻施予20μl的流感病毒PR8株16,000个(LD50为1,000个以下)。自施予日起连日进行体重测定和外观观察。对于小鼠，将死亡或体重较之接种流感病毒时而言减少了30％的小鼠视为死亡小鼠。
图11示出接种流感病毒后10天的体重变化(百分率)和死亡例的结果。极为惊讶的是，就灭活hPIV2/ΔF/HN-M2e组(4例)而言，全部试验例中在施予流感病毒后也完全没有体重的减少，也完全没有观察到立毛，活动、摄食与施予病毒前几乎无变化。
另一方面，就活hPIV2/ΔF/M2而言，3例中有1只恢复，其他死亡。尤其是就活hPIV2/ΔF/M2而言，施予流感病毒时的平均体重较之其他小鼠而言有所减少(最多减少将近2g)。这也可能是受下述情况影响，所述情况为：比较活hPIV2/ΔF和灭活hPIV2/ΔF时，被分泌至小鼠的肺泡清洗液中的蛋白质总量在活hPIV2/ΔF中高10倍以上，与hPIV2/ΔF/HN-M2e感染细胞相比，体外的hPIV2/ΔF/M2感染细胞的细胞变性效果高，对细胞的毒性高。M2是由97个氨基酸残基形成的膜蛋白质，可形成4倍体，作为质子通道而发挥作用，因此，通过活hPIV2/ΔF/M2导入M2蛋白质的全长时，存在发挥该功能从而使小鼠的体重较之感染流感前有所减少的可能性。另一方面，灭活hPIV2/ΔF/HN-M2e中，采取了在HN膜蛋白质上融合表达M2e的形式，认为通过诱导高免疫原性的HN膜蛋白质，针对M2e的抗原性增高，获得了更高的疫苗效果。实际上，对于融合于脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白复合物(Neisseria Meningitidisouter membrane complex，OMPC)的M2e的抗原性亢进的例子已有报道。经鼻施予灭活hPIV2/ΔF/HN-M2e时，针对M2e优先诱导了IgA抗体，肌肉内施予时，优先诱导了IgG2。
此外，活hPIV2/ΔF/HN-M2e中也未观察到对流感病毒的疫苗效果。
灭活hPIV2/ΔF/HN-M2e显示出了极高的疫苗效果，证明了该灭活载体系统作为针对流感病毒的疫苗用系统极为有效地发挥功能。确认到了下述结果：保持红细胞凝集活性的灭活hPIV2可在不添加佐剂的情况下诱导疫苗效果；与病毒的结构蛋白质融合的M2e作为疫苗用抗原充分发挥功能；通过使M2e与hPIV2膜蛋白质融合，能够对M2e赋予高的免疫效果；由于不伴随病毒结构蛋白质的转录·复制，所以具有对受体的毒性小等的可能性。
实施例12hPIV2/ΔF/HN-gp-100对B-16黑素瘤细胞的疫苗效果
调查了hPIV2/ΔF/HN-gp-100对B-16黑素瘤细胞的离体预防性肿瘤抑制效果。
从小鼠大腿骨回收DC细胞，调查了离体(在体外进行培养，添加载体，施用回小鼠)的肿瘤抑制效果。如实施例2所述，从B57BL/6小鼠的大腿骨回收骨髓，除去残渣后进行培养(RPMI-1640培养基，10％FBS)。每培养2天向培养液中更换培养基，添加GM-CSF(20ng/mL)和IL-4(20ng/mL)。培养8天后确认向DC的分化。清洗细胞，用RPMI-1640培养基、10％FBS进行培养，将活hPIV2/ΔF/GFP和经0.05％的BPL处理过的hPIV2/ΔF/GFP以相当于MOI＝50的量添加至培养液中。培养2天。回收该细胞，以1周的间隔向6周龄的B57BL/6的鼠蹊部近旁的皮下(Subcutaneous：SC)施予3×106个的细胞3次。距离最后的施予1周后，向小鼠背部皮内(Intradermal：ID)施予5×105个/100μl的小鼠黑素瘤细胞(在施予前用PBS清洗3次)，测定施予后的肿瘤直径，计算肿瘤体积。肿瘤体积通过肿瘤的短径×短径×长径×0.5的式子进行计算。
结果示于图12。对照组的肿瘤体积变得最大。效果最高的是活 hPIV2/ΔF/HN-gp-100处理组，在计测期间内均未观察到肿瘤增殖。在活hPIV2/ΔF/GFP组中，也没有在一部分小鼠中观察到的肿瘤的生长。预测这是由通过活hPIV2/ΔF/GFP的感染使得DC的免疫功能整体增高的效果引起的。
根据上述试验的结果可知，与活hPIV2/ΔF/GFP相比，活hPIV2/ΔF/HN-gp-100显示出了较高的抑制肿瘤增殖的效果。
另一方面，对灭活hPIV2/ΔF/HN-gp-100和灭活hPIV2/ΔF/GFP及对照进行比较时，与灭活hPIV2/ΔF/GFP和对照相比，灭活hPIV2/ΔF/HN-gp-100显示出了明显的对肿瘤的增殖抑制效果。与活的相比时，灭活hPIV2的肿瘤抑制效果低，认为较之上皮系的细胞而言向DC的hPIV2的基因导入效率低、并且较之人细胞而言小鼠细胞的感染·基因导入效率差是其主要原因，预测若增加载体的添加量，则该效果将变高。
与活的和灭活的hPIV2/ΔF/GFP相比，活的和灭活的hPIV2/ΔF/HN-gp-100更好地抑制了肿瘤增殖，因此，可认为通过hPIV2/ΔF/HN-gp-100将作为抗原的gp-100肽呈递至抗原呈递细胞，诱导了CTL等的肿瘤抑制免疫。并且，可知不添加佐剂即可发挥肿瘤抑制效果。
实施例13hPIV2/ΔF/HN-gp-100和WT-1对B-16黑素瘤细胞的疫苗效果
接着，调查了灭活hPIV2/ΔF/HN-gp-100和灭活hPIV2/ΔF/WT-1(WT-1的导入序列：N末端-RMPNAPYL-C末端(序列号6))的治疗效果。剃除B57BL/6小鼠背部的毛，将2×106个B-16黑素瘤细胞移植至小鼠皮内。4天后当移植的B-16黑素瘤的直径变为3mm左右时，于细胞移植后第4天、第7天、第10天、第13天(共4次)向肿瘤内施予已调整至70μL的各7.0×106个的灭活hPIV2/ΔF/HN-gp-100和灭活hPIV2/ΔF/WT-1。分别测定肿瘤直径。作为对照，施予灭活hPIV2/ΔF/GFP。在施予初期，70μL的体积是超过了肿瘤体积的体积。
结果，关于肿瘤体积，与PBS施予组相比，在灭活hPIV2/ΔF/GFP施予组及灭活hPIV2/ΔF/HN-gp-100和灭活hPIV2/ΔF/WT-1施予组中，观察到了抑制肿瘤的效果(图13)。在灭活hPIV2/ΔF/GFP施予组与灭活hPIV2/ΔF/HN-gp-100和灭活hPIV2/ΔF/WT-1施予组这两组之间，没有观察到大的差异。认为直接向肿瘤施予载体时，较之免疫激发所产生的肿瘤抑制效果而言，由载体施予本身引起的肿瘤细胞的溶解等产生的肿瘤的抑制更高。有报道称通过通过向肿瘤内施予不保持肿瘤抗原的病毒载体和灭活病毒载体、病毒的组分显示出抗肿瘤效果，可认为观察到了此次向肿瘤施予灭活载体而产生的肿瘤抑制效果。
实施例14对hPIV2/ΔF的各部位的外源基因的插入
连接2个M2e基因(序列号1)，在其C末端侧连接hPIV2的F膜锚钩区域和编码膜·细胞内区域的蛋白质的基因，亦即构建与向载体的包装信号的连接产物，插入至hPIV2/ΔF中，研究了外源基因产物是否被引入至载体中。
利用常规方法在上述基因构建物的3’侧附加hPIV2的R1、介在序列及R2，在其两端配置Not I序列。通过插入至hPIV2/ΔF的Not I部位，连接2个M2e，构建引入了F膜锚钩区域与膜内区域的蛋白质的融合蛋白质的载体质粒(图14A)。在hPIV2/ΔF的NP基因上游区域导入有Not I限制点，向该区域中插入外源基因，能够单独表达外源基因。
利用常规方法在F表达细胞中回收该载体。使从培养上清液回收的试样感染F表达Vero细胞(1×106个细胞)。在感染8天后回收细胞，使用抗M2抗体进行Western印迹。
结果，如图14B所示，在感染细胞中发现了针对抗M2抗体的阳性反应。这意味着回收了保持目标基因的载体。通过将上述工序中制作的载体与该载体组合，能够制作可导入更多的抗原的灭活载体。采用同样的方法进行导入有RSV病毒的F膜蛋白质的膜外区域肽或改性F膜蛋白质的膜外区域肽的hPIV2/ΔF的构建。
采用与上述同样的方法，构建将外源基因的插入部位设为了N基因前部以及NP-P之间、P-M之间、M-HN之间、HN-L之间的载体质粒。进一步，构建作为导入基因使用了RSV的F蛋白质、RSV的改性F蛋白质基因的载体质粒。
本说明书中引用的所有出版物、专利及专利申请均通过引用原样并入本说明书中。
产业上的可利用性
本发明作为用于预防或治疗疾病的疫苗是有用的。
序列表
[FINAL]PMU-9003WOseq.txt

Claims (12)

1.病毒载体，是在副粘病毒科的缺失了F基因的人副流感2型病毒的基因中整合有编码抗原多肽的基因的病毒载体，其特征在于，
所述病毒载体获得来自Vero细胞的F蛋白质的供给，所述Vero细胞表达副流感2型病毒的F基因或与抗原融合的F基因，所述抗原多肽以与病毒的选自HN蛋白质和F蛋白质中的任一种或两种以上的结构蛋白质或它们的一部分融合的融合蛋白质的形式而表达，并且，
1)所述编码抗原多肽的基因配置于HN基因的正义链的3’末端侧，抗原多肽在载体被膜的外部表达；
2)所述编码抗原多肽的基因配置于F基因的正义链的3’末端侧，抗原多肽在载体被膜的内部表达；或
3)所述编码抗原多肽的基因分别配置于HN基因的正义链的3’末端侧及F基因的正义链的3’末端侧，抗原多肽在载体被膜的外部和内部两方表达。
2.病毒载体，是在副粘病毒科的缺失了F基因的人副流感2型病毒的基因中整合有编码抗原多肽的基因的病毒载体，其特征在于，
所述编码抗原多肽的基因配置于编码F基因的膜内区域的序列的正义链的5’末端侧，获得来自表达副流感2型病毒的F基因的Vero细胞的F蛋白质的供给，使抗原多肽与作为病毒包装信号的F膜蛋白质的膜·细胞内结构域融合并表达，将抗原多肽保持在载体被膜上。
3.如权利要求1或2所述的病毒载体，其中，病毒为经核酸灭活处理的病毒。
4.如权利要求3所述的病毒载体，其中，核酸灭活处理不实质性地改变病毒被膜的结构。
5.如权利要求1或2所述的病毒载体，其中，抗原多肽为流感病毒的M2e蛋白质或其片段。
6.如权利要求1或2所述的病毒载体，其中，抗原多肽为选自由下述病毒的抗原肽、下述细菌的抗原肽、支原体的抗原肽或癌抗原gp100、MUC1、NY-ESO-1、MelanA/MART1、TRP2、MAGE、CEA、CA125、HER2/neu、WT1及PSA组成的组中的任一种或两种以上、或它们的片段，所述病毒选自包括强毒型流感病毒在内的流感病毒、副流感3型病毒、RS病毒、亨德拉病毒、SARS病毒、尼帕病毒、拉沙病毒、登革病毒、西尼罗病毒、人偏肺病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、艾滋病病毒、C型肝炎病毒、拉沙病毒、人乳头瘤病毒、风疹病毒、轮状病毒、诺如病毒、刚果-克里米亚出血热病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒及乳头瘤病毒，所述细菌选自A组β型溶血性链球菌、结核分枝杆菌及霍乱弧菌。
7.制造缺失了F基因的人副流感2型病毒载体的方法，其特征在于，所述病毒载体中，抗原多肽以与病毒的选自HN蛋白质和F蛋白质中的任一种或两种以上的结构蛋白质或它们的一部分融合的融合蛋白质的形式表达，所述方法包括下述各工序：
将在不表达内源性F蛋白质基因的人副流感2型病毒中整合有编码所述抗原多肽的基因的病毒载体与Vero细胞共培养，所述Vero细胞表达副粘病毒科病毒的F基因或已与抗原融合的F基因；
然后从培养上清液中分离病毒颗粒，
其中，抗原多肽如下进行表达，
1)以融合于HN蛋白质的C末端侧的方式在载体被膜的外部表达，
2)以融合于F蛋白质的C末端侧的方式在载体被膜的内部表达，或
3)以分别融合于HN蛋白质的C末端侧及F蛋白质的C末端侧或HN蛋白质的N末端侧的方式在载体被膜的外部和内部两方表达。
8.制造缺失了全长F基因的人副流感2型病毒载体的方法，所述病毒是在副粘病毒科的缺失了F基因的人副流感2型病毒的基因中整合有编码抗原多肽的基因的病毒载体，
其特征在于，抗原多肽与病毒的F蛋白质的膜·细胞内区域融合，所述抗原多肽在载体被膜上表达，
所述方法包括下述工序：
将在不表达内源性F蛋白质基因的人副流感2型病毒中整合有编码所述抗原多肽的基因的病毒载体与Vero细胞共培养，所述Vero细胞表达人副流感2型病毒的F基因，
然后从培养上清液中分离病毒颗粒。
9.如权利要求7或8所述的方法，其中，还包括通过0.004％～0.05％的β-丙内酯对病毒进行核酸灭活处理的工序。
10.如权利要求9所述的方法，其中，核酸灭活处理不实质性地改变病毒被膜的结构。
11.如权利要求7或8所述的方法，其中，抗原多肽为流感病毒的M2e蛋白质或其片段。
12.如权利要求7或8所述的方法，其中，抗原多肽为选自由下述病毒的抗原肽、下述细菌的抗原肽、支原体的抗原肽或癌抗原gp100、MUC1、NY-ESO-1、MelanA/MART1、TRP2、MAGE、CEA、CA125、HER2/neu、WT1及PSA组成的组中的抗原肽的任一种或两种以上、或它们的片段，所述病毒选自包括强毒型流感病毒在内的流感病毒、副流感3型病毒、RS病毒、亨德拉病毒、SARS病毒、尼帕病毒、拉沙病毒、登革病毒、西尼罗病毒、人偏肺病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、艾滋病病毒、C型肝炎病毒、拉沙病毒、人乳头瘤病毒、风疹病毒、轮状病毒、诺如病毒、刚果-克里米亚出血热病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒及乳头瘤病毒，所述细菌选自A组β型溶血性链球菌、结核分枝杆菌及霍乱弧菌。
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