CN107849558A - 2型人副流感病毒载体和疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种病毒载体以及利用了该载体的疫苗。该病毒载体能够使大分子抗原肽维持着作为抗原所必须的三维结构的状态被有效地导入至靶细胞中。具体而言，公开了一种病毒载体，其中，编码抗原多肽的核酸被整合到F基因缺陷型副粘病毒科病毒基因的HN基因的5'上游紧邻处，并且，该抗原多肽以与源自该病毒的TM序列和/或CT序列融合的130个以上氨基酸残基的融合蛋白的形式被表达。
Description
本说明书包含日本专利申请号2015-119097(2015年6月12日提交)和日本专利申请号2016-63315(2016年3月28日提交)的说明书中描述的内容，本申请的优先权是基于这些申请。
技术领域
本发明涉及非传播性2型人副流感病毒载体和利用该载体制备的疫苗。
背景技术
为了制备高效的中和抗体诱导重组疫苗，适合的是使用具有膜融合活性的包膜蛋白(RSV F、埃博拉GP等)的全长作为疫苗抗原。然而，已经报道：该蛋白在与靶细胞或类似物融合前和融合后改变了其三维结构；具有与细胞融合之前的结构的、融合前蛋白诱导有效的中和抗体；该蛋白在融合前(prefusion)状态下具有不稳定结构；并且，使处于融合前状态的蛋白结构稳定并将其用作疫苗抗原的尝试已经进行(非专利文献1至4)。
RS病毒(RSV)是具有包膜的病毒，分类为副粘病毒科的肺病毒属，并具有直径为80至350nm的球状或细丝形状，并且它具有主要亚型A和B，且引起呼吸感染。RSV的初次感染展现不同症状，包括诸如流感样症状的温和症状到诸如严重的细支气管炎或肺炎等下呼吸道疾病。虽然存在针对RSV的母传抗体，但是它们逐渐减少并在出生后七个月检测不到。初次感染明显，并且发展成下呼吸道疾病的风险高，出生后六个月内感染为最严重。一项流行病学研究(2009年)表明，5岁以下的婴儿住院人数在美国每年为7.5万至12.5万，在欧洲五国为8万，在日本为3万至8万；65岁的老年住院人数在美国为20万，在欧洲五国为20万，在日本为14万。
现在不存在控制RSV感染的有效疫苗，并且仅存在基于抗RSV人源化单克隆抗体的帕利珠单抗(Synagis)的对症治疗法。在RSV开始流行之前到流行期间通过每个月一次的15mg/kg的剂量肌内注射，从而期待帕利珠单抗的预防效果。然而，人源化单克隆抗体相当昂贵，并且日本的保险覆盖对象限于早产儿、有慢性肺病的儿童和唐氏综合征儿童。抗体的高成本使得难以扩大意欲给药的患者。
因此，亟需开发用于控制RSV感染的廉价疫苗。然而，以下所述的过去的疫苗灾难造成了与用于其他感染性疾病的疫苗相比在开发疫苗方面的显著延迟。
在1965年至1966年间，将以与流感或脊髓灰质炎疫苗相同的方式用福尔马林处理RSV而制备的灭活疫苗(命名为批次100)与铝佐剂一起用于临床试验，对没有RSV感染史的婴儿进行了接种。疫苗接种后的RSV自然感染造成了不幸的结果，其中疫苗接种组的入院率是非接种组的16倍(疫苗接种组中的80％婴儿入院)，并且两人死亡(RSV感染重症化ERD：enhanced respiratory disease)。从那以后，进行了深入调查来确定ERD的原因。
在由普通RSV引起的细支气管炎中未观察到嗜酸性粒细胞或嗜中性粒细胞浸润到肺中。然而，在接种福尔马林灭活的RSV疫苗(批次100)后由RSV自然感染引起的婴儿死亡中，观察到了嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞等明显浸润到肺中，并且由于IL-4/IL-5细胞因子的产生的增加而过度诱导2型T辅助细胞(Th-2)。当时，据报道，观察到了针对RSV的抗体滴度增加，但是对针对RSV具有高中和活性滴度的抗体的诱导较低。据报道，RSV的膜蛋白之一的F蛋白作为疫苗抗原是重要的，但也应理解，F蛋白依赖于环境改变其三维构象。据动物试验报道，福尔马林处理不仅改变RSV F的三维结构，而且还大大增加蛋白中的羰基含量并且诱导Th2反应；结果很有可能导致ERD(非专利文献5)。此文献描述了与福尔马林处理的RSV疫苗相比，热处理的RSV(仅三维结构被改变)疫苗导致较低的嗜中性粒细胞向肺组织的浸润，并且认为福尔马林处理的RSV疫苗的ERD诱导不仅仅由于抗原的三维结构的改变。
对于中和RSV的抗体诱导，作为RSV的膜蛋白的F蛋白作为抗原是重要的。F蛋白被翻译为F0或蛋白前体。F0具有存在于其中的两个弗林蛋白酶切割位点，并且通过成熟过程，它被切割成F1和F2，F1和F2通过S-S键交联(成熟的F蛋白)。弗林蛋白酶切割使得被称为p27的27个多肽缺失。已知成熟的F蛋白在感染的细胞和病毒包膜上形成三聚体，并且根据环境不同而采用两种不同的三维结构即融合前F(prefusion F)和融合后F(postfusion F)。F蛋白在RSV-细胞融合前通常采用融合前F结构，但是这种结构是热力学不稳定的，并且容易通过细胞融合、加热、变性剂、负责将F蛋白锚定到细胞和包膜上的跨膜序列的缺失而变为热力学稳定的融合后F结构。通过X射线晶体学分析发现了融合前F和融合后F的三维结构，并且已经详细报道了它们各自结合的抗体及它们的结合位点(非专利文献1)。
帕利珠单抗(一种单克隆抗体)结合到被称为RSV F蛋白的位点II的位点。从而，该序列结构域在融合前F和融合后F两者中维持三维结构，帕利珠单抗与具有两种结构的F蛋白结合而展现出中和活性。
同时，已经报道了一种与具有融合前F的三维结构的抗原表位的被称为位点φ(零，zero)的氨基酸序列结合的抗体。在融合前F中，该表位附近的结构域采用由两个β片和四个α螺旋构成的弯曲结构，而融合后F中的该结构域则采用具有一个α螺旋结构的线性结构。如上所述，融合前F和融合后F在位点φ(零)结构方面存在差异，并且命名为5C4、Am22和D25的抗体仅与融合前F结构结合而不与融合后的F蛋白结合。
此外，已知融合前F的位点φ(零)结合抗体针对RSV的中和活性比位点II结合抗体高10至100倍，并且为了有效开发疫苗，重要的是开发一种可通过修饰而提供采用不稳定的融合前结构的F蛋白作为抗原的疫苗技术。
用于提供融合前F蛋白作为抗原的可能方法包括：(i)使融合前F蛋白结构稳定；(ii)开发使融合前F的三维结构维持的抗原递送系统；以及具有以上两者的组合的方法。
用于(i)使结构稳定的可能方法包括通过如下方法进行的对融合前F蛋白的结构稳定修饰：使两个弗林蛋白酶识别位点的部分/全部氨基酸位点缺失或取代、或使位于弗林蛋白酶识别位点之间的p27肽缺失或取代。关于RSV F的其他位点处的氨基酸取代，现有技术认为RSV的p27-缺失突变体是通过分别由Ile(I)和Pro(P)取代RSV F的位置67处的Asn(N)和位置251处的Ser(S)而稳定的(非专利文献4)。现有技术还认为RSV F是通过由Cys(C)取代位置155处的Ser(S)和位置290处的Ser(S)这两者而在半胱氨酸之间提供S-S键交联而稳定(参考文献7)。另外，还有的认为该结构是通过使直接位于F蛋白的两个弗林蛋白酶识别位点的后部序列(rear sequence)之后的细胞融合结构域的一部分或整个缺失而消除融合能力来稳定的。
当F蛋白用作抗原时，常使用其中留下了N-末端侧存在的分泌信号序列且缺失了C-末端侧的跨膜(TM)序列和胞质尾区(CT)序列的可溶性F蛋白(可溶形式F蛋白)。如果将携带有这些序列的F蛋白在细胞中表达，则锚定在膜中发生，从而使得回收困难。因此，采用这些序列的缺失是为了使F蛋白分泌到培养基中从而易于回收。另一方面，具有TM和CT序列的F蛋白会形成三聚体而锚定在细胞膜或病毒包膜上，使融合前结构稳定。当具有融合前结构的F蛋白用作抗原时，缺失F蛋白的TM和CT序列导致易于回收但不稳定结构。另一方面，如果留下TM和CT序列，则结构是稳定的，但回收却变得困难。
那么，对于(ii)，可能采取以下措施：用以开发如下递送系统的措施，即该递送系统使保留有TM和CT序列的F蛋白结合到细胞膜或病毒包膜、载体等上以结构稳定的状态运载至接受者，或采取将该系统与(i)组合的措施。
诸位发明人正在开发一种用于通过将外源抗原基因与非传播性hPIV2病毒载体的膜蛋白基因融合，从而产生一种携带抗原的非传播性病毒载体并将其用作疫苗的方法；以及一种用于以浓度为普通治疗浓度的1/10至1/100的低浓度的β-丙内酯灭活该病毒以抑制病毒复制并将其用作疫苗的方法(专利文献1)。这些方法已经使得通过将具有两个串联连接的万能型流感抗原M2e的48个氨基酸与hPIV2 F蛋白的TM和CT序列融合制备的基因(113个氨基酸残基)能够克隆到在F缺陷型hPIV2载体中具有最高转录水平的NP基因的5'上游NotI限制性位点中，从而成功回收到足以进行动物测试的病毒。
RSV F蛋白、埃博拉病毒GP蛋白等是具有500个以上氨基酸残基的抗原，并且它们需要严格的三维结构以作为抗原发挥作用。需要开发能够使这些大分子蛋白保持着三维结构的状态下被递送的载体和疫苗。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO 2014/103310
非专利文献
非专利文献1：MaLellan,JS.et al.,Science:2013:340,6136,1113-1117
非专利文献2：MaLellan,JS.et al.,Science:2013:342,6158-8,592-598
非专利文献3：Bale,S.et al.,Viruses,2012:(4),447-470
非专利文献4：Krarup,A.et al.,Nat.Commun.2015:3,6:8143-54
非专利文献5：Moghaddam,A.et al.,Nat Med 2006(12)905-907
非专利文献6：Bukreyev,A.et al.,Virogy；2009:383(2),348-361
非专利文献7：Liang,B.et al.,J Virol；2015,(89):9499-9510
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非专利文献15：Martinez.O,et al.,J Virol:2013(87)3324-3334
发明内容
本发明要解决的问题是提供能够使大分子抗原肽(包括蛋白和肽)维持着作为抗原所必须的三维结构的状态下被有效地递送至靶细胞的病毒载体；以及利用该载体的疫苗。
诸位发明人发现，具有几百个氨基酸残基的大分子抗原肽可以在维持其三维结构的状态下被有效地递送至靶细胞，这是通过将抗原肽基因整合到缺乏膜蛋白基因的非传播性副粘病毒科病毒基因组基因的HN基因的5'上游紧邻处，使抗原肽与病毒载体的包膜蛋白TM和CT序列彼此融合并使融合后的基因表达。
具体而言，本发明涉及以下(1)至(9)项：
(1)一种非传播性病毒载体，其中，编码抗原多肽的核酸被整合到F基因缺陷型副粘病毒科病毒基因组基因的HN基因的5'上游紧邻处，并且，该抗原多肽以与源自于所述病毒的TM序列和/或CT序列融合的130个以上氨基酸残基的融合蛋白的形式被表达。
(2)根据(1)所述的病毒载体，其中，所述副粘病毒科病毒是非传播性2型人副流感病毒。
(3)根据(1)或(2)所述的病毒载体，其中，所述抗原多肽表达于载体包膜的表面上。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的病毒载体，其中，所述抗原多肽以维持着天然三维结构或作为疫苗抗原所必须的三维结构的状态被表达。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的病毒载体，其中，所述病毒为经核酸灭活处理的病毒。
所述核酸灭活处理是指，例如，用低浓度的β-丙内酯进行处理，但未实质上改变病毒包膜结构。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的病毒载体，其中，以抗原多肽基因的TM序列和/或CT序列或GPI样锚定蛋白被源自2型人副流感病毒的TM序列和/或CT序列取代的核酸形式整合。
(7)根据(1)至(6)中任一项所述的病毒载体，其中，所述抗原多肽是选自以下任一种或两种以上的抗原肽或其片段：
选自以下项的病毒的抗原肽：包括高毒性流感病毒的流感病毒、3型副流感病毒、RS病毒、亨德拉病毒、SARS病毒、MERS病毒、尼帕病毒、拉沙病毒、登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、人偏肺病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、艾滋病病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、风疹病毒、轮状病毒、诺如病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、寨卡病毒、马尔堡病毒、HIV和乳头瘤病毒；选自A组β-溶血性链球菌、结核分枝杆菌、霍乱弧菌的细菌的抗原肽、以及支原体的抗原肽；疟原虫的抗原肽；以及选自以下各项组成的组的抗原肽：癌抗原gp100、MUC1、NY-ESO-1、MelanA/MART1、TRP2、MAGE、CEA、CA125、HER2/neu、WT1、PSA和新抗原(neoantigen)。
(8)根据(7)所述的病毒载体，其中，所述抗原多肽是选自以下的任一种：具有流感病毒的三个以上的连续M2e的抗原；RSV F蛋白或G蛋白、或其突变体或其片段；埃博拉病毒GP蛋白、或其突变体或其片段；以及疟疾CSP蛋白、或其突变体或其片段；以及寨卡病毒prM/E蛋白、或其突变体或其片段。
该抗原多肽是以如下形式整合至病毒载体中：
a)含有抗原基因和2型人副流感病毒F蛋白的TM和CT序列的核酸，其中，所述抗原基因具有流感病毒的三个以上的连续M2e；
b)对全长RSV F蛋白进行编码的基因；或该蛋白的TM和/或CT序列被2型人副流感病毒F蛋白的TM和/或CT序列取代的核酸；或对被2型人副流感病毒F蛋白的TM和/或CT序列取代的、且导入有增加融合前F的稳定性的氨基酸突变的F蛋白进行编码的核酸；
c)对用2型人副流感病毒F蛋白的TM和/或CT序列取代以下的F蛋白基因的TM和/或CT序列后的蛋白进行编码的核酸：对使全长RSV F蛋白的细胞融合结构域序列(SEQ ID NO:5)部分缺失的F蛋白进行编码的基因、或对导入有增加融合前F的稳定性的氨基酸突变的F蛋白进行编码的基因；
d)对用2型人副流感病毒F蛋白的TM和/或CT序列取代以下的F蛋白基因的TM和/或CT序列后的蛋白进行编码的核酸：对从RSV的全长F蛋白中将两个弗林蛋白酶切割结构域之间的p27肽序列和该p27的第一弗林蛋白酶切割识别序列的RR去除而形成的RSV F蛋白或其突变体进行编码的基因、或对将第一弗林蛋白酶切割识别序列RARR用QAQQ取代的RSV F蛋白或其突变体进行编码的基因；
e)编码以下基因的核酸：在以上b)至d)中所述的核酸的RSV F膜外序列基因的3'-末端侧，插入T4噬菌体的Fibritin三聚化序列基因或GCN三聚化序列基因而成的基因；或者为了形成S-S键以稳定三聚化而将氨基酸用Cys取代后的基因；
f)在埃博拉病毒的全长GP蛋白或其突变体中，该GP蛋白的TM和CT序列被2型人副流感病毒F蛋白的TM和CT序列或GP蛋白的TM和CT序列取代或者该GP蛋白的TM和CT序列被维持的核酸(该埃博拉病毒突变体的实例包括：埃博拉病毒GP蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号(accession No.)KJ660346)中的位置88处的Phe(F)和位置535处的Phe(F)都被Ala(A)取代的突变体GP蛋白、从该突变体GP蛋白中将位于位置313以后的粘蛋白结构域序列去除而形成的突变体GP1蛋白、或者将粘蛋白结构域序列从GP序列中去除而形成的突变体GP蛋白)；
g)编码疟疾CSP蛋白的核酸；或者对该蛋白的GPI型锚定序列被2型人副流感病毒F蛋白的TM和/或CT序列取代后的蛋白进行编码的核酸；
h)对寨卡病毒prM/E蛋白进行编码的核酸；以及
i)编码以下蛋白的核酸：使位于寨卡病毒E蛋白的C-末端区的两个干序列(EH1和EH2)以及两个TM序列(TM1和TM2)中的EH1和EH2缺失、或EH2缺失但附加了2型人副流感病毒F蛋白的TM和/或CT序列的蛋白。
(9)一种疫苗，其含有根据(1)至(8)中任一项所述的病毒载体和药学上可接受的载剂。
本发明的有益效果
本发明的病毒载体能够使大分子肽(具有几百以上的氨基酸残基)维持着其三维结构的同时作为抗原被递送。这使得对RSV和埃博拉病毒、疟原虫或寨卡病毒有效的许可疫苗的生产成为可能。
本发明的病毒载体能够以使抗原多肽展示在病毒粒子上的状态高效地回收。另外，本发明的病毒载体经历了通过使用低浓度的β-丙内酯或类似物进行的核酸灭活，所以仅病毒基因组被灭活，而病毒包膜蛋白和装载的抗原的三维结构被维持。因此，在具有预先存在(pre-existence)抗体的重组病毒载体中，载体被抗体中和，接受者中抗原的量由于基因沉默而减少。然而，本发明的载体则不具有这样的问题，并且它具有在接受者中不发生抗原基因突变的优点。另外，此载体具有与活病毒近似的细胞吸附特性和免疫原性，并且同时，装载的抗原能够维持用于诱导高效中和抗体的抗原表位的三维结构。因此，能够期待其在不添加佐剂或添加减少量的佐剂的情况下有效的疫苗效果。基于以上优点，通过使用本发明的病毒载体而能够期待其对人的优异的效果和安全性，并且使得对RSV、埃博拉病毒、疟疾或寨卡病毒有效的许可疫苗的开发成为可能。
附图说明
图1示出了将3xM2e基因与hPIV2的TM/CT序列克隆到Mlu限制性酶切位点处的构建示意图。
图2示出了：(A)具有回收载体的感染细胞中的M2e表达的确认结果；以及(B)通过蛋白质印迹确认的载体粒子上的抗原装载的结果。
图3示出了RSV病毒F抗原的导入示意图。
图4示出了：(A)在经由hPIV2ΔF感染的细胞中突变体RSV F的表达；以及(B)通过蛋白质印迹确认的突变体表达的结果。
图5示出了埃博拉病毒GP抗原的导入示意图。
图6示出了：(A)携带有引入了两个氨基酸突变的埃博拉GP的hPIV2ΔF载体在感染细胞中的表达、携带有具有hPIV2 TM/CT序列的埃博拉GP的hPIV2ΔF载体在感染细胞中的表达；以及(B)蛋白质印迹的结果，其表明GP整合至载体粒子中。
图7示出了以GFP荧光作为指示物，在表达hPIV2 F的Vero细胞中和亲本Vero细胞中，携带有在两个位点引入了的氨基酸突变的埃博拉GP和GFP蛋白的hPIV2ΔF病毒的感染性粒子产生与否的确认结果。
图8示出了通过向小鼠给予该载体而产生的针对埃博拉GP抗体诱导的结果。
图9示出了约氏疟原虫的CSP抗原的导入示意图。
图10示出了通过蛋白质印迹确认的CSP抗原表达的结果。
图11示出了通过向小鼠给予该载体而产生的针对CSP抗体诱导的结果。
图12示出了寨卡病毒prM/E抗原的导入示意图。
具体实施方式
本发明涉及一种病毒载体，其中，编码抗原多肽的核酸被整合到F基因缺陷型副粘病毒科病毒基因组基因的HN基因的5'上游紧邻处，并且，该抗原多肽以与源自该病毒的TM序列和/或CT序列融合或被其取代的130个以上氨基酸残基的融合蛋白的形式表达。
在一个方面，本发明提供了一种病毒载体，其中，编码抗原多肽的基因(也包括与副粘病毒科病毒F基因的TM序列和/或CT序列基因融合/被其取代的形式)以表达于病毒表面的方式整合，其中大分子抗原多肽以维持着希望的三维结构(能够作为疫苗抗原的三维结构)的方式被表达，作为并且该载体是不使用佐剂或添加减少量的佐剂就能够实现与活病毒相同的免疫诱导的灭活载体。
诸位发明人已报道他们成功构建了通过融合/置换与作为向抗原与病毒的包装信号(packaging signal)而发挥作用的膜蛋白的TM序列和CT序列，从而将抗原整合到载体上的类型(WO 2014/103310)。此方法能够高效表达具有约120个氨基酸残基的抗原。具有130个以上氨基酸残基的、维持着希望的三维结构的抗原则难以被导入。
例如，在具有两个串联连接的M2e的株系中可以回收足够量的病毒，但在用于hPIV2构建体的质粒的NP基因的上游的NotI限制性酶切位点处克隆有三个串联连接的M2e的基因的株系中，回收的病毒的量不足以提供动物试验。在大分子量的RSV F蛋白被引入的情况下，回收的病毒显示低滴度，并且不能回收到具有实际用作疫苗的足够滴度的病毒。
在这样的病毒表达系统中，融合有hPIV2 F蛋白的TM和CT序列的外源抗原基因被插入到重组非传播性hPIV2中以将外源抗原装载到载体粒子上。预期在高水平表达抗原蛋白的情况下，具有相同TM和CT序列的hPIV2 F蛋白在通过M蛋白组装(assembly)到病毒粒子时会竞争而抑制高效病毒形成，因此难以回收到高滴度的病毒。事实上，现有技术已经报道当CT序列被PIV3的CT序列取代(TM序列仍为埃博拉病毒GP的原本的TM序列)的埃博拉病毒GP蛋白被导入至F和HN基因缺陷型PIV3载体中时，PIV3病毒的回收效率极低(非专利文献6)。因此，认为当具有TM和CT序列的、较大的外源抗原通过将该外源抗原的TM和CT序列用hPIV2 F的TM和CT序列取代而被导入至hPIV2/ΔF中时，回收病毒将会更困难。另外，在位于具有最高转录水平的NP基因5'上游的位点处导入有抗原基因的PIV3中，在导入的抗原基因中发现突变，这成为当将作为抗原的外源基因导入至表达水平高于病毒构成基因群的这种位点时出现的问题(非专利文献8和9)。诸位发明人也已确认，当流感病毒M2基因被引入hPIV2 NP基因的5'上游位点处并回收病毒时，在回收的病毒的M2基因中发现了突变，发生了氨基酸取代。
在本发明中，MluI限制性酶切位点被引入F基因缺陷型hPIV2载体的F基因缺陷位点，从而抗原基因被整合到HN基因的5'上游紧邻处的F基因缺陷位点，使具有130个以上氨基酸残基的大分子抗原成功表达。如以下实施例中具体显示，诸位发明人导入了以下基因并在病毒载体的回收水平及其表达水平方面进行了比较：3×M2e与hPIV2载体的F蛋白基因的TM序列和/或CT序列基因融合后的基因；RSV F蛋白基因的膜外序列结构域是完整的或经修饰的多个RSV F蛋白基因；以及这些多个RSV F蛋白的TM序列和CT序列基因被hPIV2 TM和/或CT序列取代后的RSV F蛋白基因。另外，针对在RSV F的膜外序列的C末端侧插入T4噬菌体的Fibritin三聚化序列或GCN三聚化序列而形成的RSV F突变体、或导入对为了形成S-S键以稳定三聚化而将氨基酸用Cys取代后的基因进行编码的核酸而形成的RSV F突变体，诸位发明人也研究了其效果。另外，诸位发明人对四种修饰被添加到埃博拉病毒GP蛋白基因中而成的基因、以及将上述四个GP基因的TM序列和CT序列基因用hPIV2 TM和CT序列基因取代而成的埃博拉GP基因进行了导入，并且在病毒载体的回收水平及其表达水平方面进行了比较。另外，诸位发明人导入了：对疟疾CSP蛋白进行编码的基因、以及对其中CSP蛋白的GPI样锚定序列被hPIV2 TM和CT序列取代的CSP蛋白进行编码的基因，并且研究了载体的回收水平及抗原的表达。另外，诸位发明人导入了：对寨卡病毒prM/E蛋白(部分包括突变体)进行编码的基因、以及对prM/E蛋白的干序列(stem sequence)和TM序列被hPIV2 TM和CT序列取代的prM/E蛋白进行编码的基因，研究了载体的回收水平及抗原的表达水平。以此方式，诸位发明人确认了本发明的效果。
特别优选地，在本发明中使用的“副粘病毒科的病毒”是具有大约15,000个碱基的单顺反子反义单链RNA作为基因组的“2型人副流感病毒”。在该基因组上，NP蛋白、P(磷)蛋白、M(基质)蛋白、F(融合)蛋白、HN(血球凝集素-神经氨酸酶)蛋白、以及L(大)蛋白以此顺序被编码为病毒结构基因产物。此外，V蛋白是通过RNA编辑产生。核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，NP)与RNA基因组结合以形成螺旋对称的核糖核苷-蛋白复合物(核衣壳，RNP)。在病毒基因组编码的蛋白中，NP蛋白、P(磷)蛋白和L(大)蛋白对于形成RNP是必需的。F(融合)蛋白和HN(血球凝集素-神经氨酸酶)蛋白存在于病毒包膜上并负责吸附和融合到受体上。M(基质)蛋白与F和HN蛋白的胞质内结构域、包膜脂质双层和RNP相互作用，并且对于病毒粒子的出芽是重要的。
由于“2型人副流感病毒(hPIV2)”是在细胞质中增殖的RNA病毒，其基因不整合到宿主细胞的染色体中。已知此病毒感染人呼吸道粘膜，并诱导主要由IgA组成的粘膜免疫以及由IgG介导的体液免疫和细胞免疫。先前已经报道此病毒没有严重的人(成人)感染案例。因此认为该病毒作为治疗用病毒载体是非常有用的。
在本发明中，使用了“F基因缺陷型副粘病毒科病毒”。优选地，使用了“F基因缺陷型(非传播性)2型人副流感病毒”。2型人副流感病毒的F蛋白是将病毒包膜与细胞膜融合并将病毒核衣壳导入到宿主中所需的蛋白质。F基因缺陷型2型人副流感病毒是非传播性病毒，其在包装细胞中产生携带F基因的感染性hPIV2，但在不表达F蛋白的细胞中不产生感染性病毒。因此，此病毒不能构成具有在感染受试者的细胞后自主增殖的能力的病毒粒子，不感染其他细胞。因此，该病毒作为疫苗用病毒是高度安全的。
为了制备F基因缺陷型2型人副流感病毒载体，在表达hPIV2 F蛋白的细胞中培养F基因缺陷型病毒。由此，在从细胞反式提供的F蛋白的存在下，该F蛋白能够保持在病毒包膜上，以产生具有感染能力的病毒粒子。
在本发明的优选实施例中，使用Vero细胞作为能够通过F基因缺陷型病毒的感染而产生病毒粒子的包装细胞。Vero细胞对2型人副流感病毒F蛋白是特别高度容许的。此外，即使2型人副流感病毒F基因不断被表达，这些细胞也不表达干扰素，并能够稳定生长且能够高效地产生病毒粒子。
在本发明的优选实施例中，本发明的病毒载体已经历“核酸灭活处理”。“核酸灭活处理”指的是，在维持着包膜蛋白(如F蛋白和HN蛋白)以及导入的抗原多肽的三维结构，且导入抗原多肽具有中和抗体诱导能力(这需要这些包膜蛋白的功能和三维结构)的状态下仅灭活病毒基因组。核酸灭活处理可以通过例如核酸烷化剂处理、过氧化氢处理、UV照射、放射线照射或热处理来进行。特别优选地，用核酸烷化剂β-丙内酯处理该病毒载体。可以将β-丙内酯添加到病毒培养液中并在4℃下一起孵育约17小时。以最终浓度计，β-丙内酯的浓度优选是0.001％至0.05％，更优选是0.004％至0.01％。
在本发明的病毒载体中，将抗原基因整合到载体上，这消除了在上述核酸灭活后导入抗原的需要，可以规避与灭活后抗原导入相关联的问题(低抗原导入效率，包膜和抗原结构的破坏等)。另外，通过使用F基因缺陷型病毒，即使在药物治疗后残留了活病毒，该病毒也缺乏增殖能力而不能在接受者中增殖；因此可以保持灭活疫苗的高安全性。
“病毒载体”意指，将有待在感染的细胞中表达的基因与病毒基因组包装在一起的病毒粒子、以及不含有能够产生具有感染能力的病毒的基因组的载体。在本说明书中，后者具体地被称为“灭活载体”并且可以通过用药物或类似物处理使核酸灭活而获得。
“抗原多肽”是指具有130个以上的氨基酸残基的多肽，且能够在已经接受给予本发明的病毒载体的受试者中引起免疫应答。其实例包括流感、RS病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒或其一部分、原虫蛋白或其一部分、以及细菌或病毒来源的蛋白或其一部分。例如，用于流感疫苗的抗原多肽是流感病毒HA蛋白、NA蛋白、M2蛋白、或M2e蛋白、或它们的片段。此外，可用于RSV疫苗的抗原多肽是RSV F蛋白或G蛋白或它们的片段；可用于埃博拉病毒疫苗的抗原多肽是埃博拉病毒GP蛋白或其片段；寨卡病毒疫苗的抗原多肽prM/E蛋白或其片段；疟原虫疫苗的抗原多肽CSP蛋白或其片段。只要抗原多肽具有足以作为疫苗的免疫原性，则它可以是如上所述的片段，并且可以包括适当的突变。这样的突变体的实例包括：使RSV F蛋白的p27或者p27及其邻近序列缺失，去除了弗林蛋白酶切割后的突变体RSV F蛋白(也包括位置61处的Asn(N)被Ile(I)取代以及位置251处的Ser(S)被Pro(P)取代后的突变体(非专利文献4))；使RSV F蛋白的融合结构域序列的一部分缺失后的突变体RSV F蛋白(也包括位置155和290处的Ser(S)被Cys(C)取代后的突变体(非专利文献7))；在前述RSV F蛋白突变体中导入了T4噬菌体的Fibritin三聚化序列、GCN三聚化序列而形成的RSV F突变体、或者在前述RSV F蛋白突变体中导入了对为了形成S-S键以稳定三聚化而将氨基酸用Cys取代后的基因进行编码的核酸而形成的RSV F突变体；埃博拉病毒GP蛋白的氨基酸序列(GenBankAccession No.KJ660346)中位置88处的Phe(F)和位置535处的Phe(F)都被Ala(A)取代的突变体GP蛋白；从前述突变体GP蛋白中，进一步去除位于位置313以后的粘蛋白结构域序列的突变体GP1蛋白；或粘蛋白结构域序列从该GP序列缺失的突变体GP蛋白。
待导入的感染性疾病相关抗原多肽的实例包括：病毒如流感病毒(包括高毒性流感病毒)、3型副流感病毒、RS病毒、亨德拉病毒、SARS病毒、MERS病毒、尼帕病毒、拉沙病毒、登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、人偏肺病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、风疹病毒、轮状病毒、诺如病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、乳头瘤病毒、寨卡病毒、马尔堡病毒和HIV的抗原肽，以及细菌如A组β-溶血性链球菌、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、霍乱弧菌的抗原肽和支原体的抗原肽，以及疟原虫的抗原肽。
在本发明中，“抗原多肽”作为与载体病毒的TM和/或CT序列或者GPI样锚定蛋白融合的蛋白/被它们取代的蛋白而在病毒包膜上表达。这使得在产生病毒的细胞中表达的抗原多肽被吸收到病毒粒子中并递送至接受者。也就是说，在本发明中，不仅整合到病毒基因中的抗原多肽基因在感染细胞中被转录和翻译，而且病毒粒子本身也具有抗原多肽；这使得大量的抗原多肽能够可靠地递送给接受者。
为了使抗原多肽作为融合蛋白高效表达在病毒包膜上，将编码抗原多肽的基因与编码载体病毒的F蛋白的TM序列和/或CT序列的基因或编码GPI样锚定蛋白的基因连接，由此整合到病毒基因中。编码病毒的F蛋白的TM序列和/或CT序列的基因的实例包括hPIV2 F基因。构建这样的载体可以使用常规的重组DNA技术通过标准方法进行。
编码抗原多肽的核酸(基因)被插入到上述载体病毒的结构基因中的“HN基因5'上游紧邻处”的F基因缺陷位点处(参见图1)。应该注意，“HN基因的5'上游紧邻处”意指，NH基因的5'-末端的上游紧邻处，但在编码抗原多肽的核酸与HN基因的5'-末端之间也可含有不影响表达的序列。在本发明中，使用了原本就具有存在于HN基因上游紧邻处的核酸的F基因缺陷型病毒，因此“HN基因5'上游紧邻处”也可以称为F基因缺陷位点。
当该蛋白基因作为融合基因或完整基因整合到反式提供结构基因产物的包装细胞中时，大量抗原会在缺陷型hPIV2的包膜上表达。
若用比通常低的低浓度的β-丙内酯处理本发明的病毒载体，则能够仅灭活基因组，而同时病毒载体保持了其红细胞凝集活性、细胞吸附能力和使树突细胞成熟的能力(即载体膜上蛋白的三维结构维持在与活病毒相似的状态)。能够用比通常低的浓度(即，仅能够灭活基因组的最低浓度)的β-丙内酯进行处理的原因在于使用了不产生次级粒子的非增殖性(非传播性)病毒载体。即使有微量感染性病毒残存，也不会产生次级感染粒子，因为该病毒是非传播性的。关于β-丙内酯的处理浓度导致的hPIV2载体对树突状细胞的成熟的影响，已经报道了较低浓度的处理有利于树突细胞的成熟或细胞因子的诱导(非专利文献10)。另外，通过用低浓度的β-丙内酯处理，许多片段化的、没有转录/复制能力的RNA链保留在载体中，通过RIGI、IFIT等的作用激活天然免疫。此方法具有以下优点：病毒粒子本身具有佐剂活性，因此消除了与引起针对抗原的免疫性的佐剂组合使用的需要，或者可以降低佐剂浓度。
本发明的病毒载体经由唾液酸受体而感染细胞。由于唾液酸存在于许多细胞或组织的表面上，载体可能的给予途径是鼻腔喷雾、经肺、口服、舌下、皮内或皮下给予、或者直接给予到静脉、离体给予到致免疫细胞如树突状细胞。
本发明的病毒载体可用作哺乳动物(包括人)的疫苗。本发明的疫苗含有病毒载体和药学上可接受的载剂。
典型地，该疫苗可以作为气雾剂给予到哺乳动物(包括人)的细胞。该气雾剂可以通过标准方法制备。例如，将含有病毒载体的培养上清液根据需要浓缩，并与药学上可接受的载剂一起悬浮在缓冲溶液(如PBS)、病毒载体稳定溶液或生理盐水中。然后，可以根据需要通过过滤器或类似物对悬浮液过滤灭菌，并随后装入无菌容器中以制备气雾剂。该气雾剂可以根据需要补充添加有稳定剂、防腐剂等。由此获得的表达载体可通过吸入给予到受试者。
典型地，本发明的病毒载体也可以作为注射剂(皮下、皮内、或肌内注射)给予到哺乳动物(包括人)的细胞。该注射剂可以通过标准方法制备。例如，将含有病毒载体的培养上清液根据需要浓缩，并与药学上可接受的载剂一起悬浮在缓冲溶液(如PBS)或生理盐水中。然后，可以根据需要通过过滤器或类似物对悬浮液过滤灭菌，并随后装入无菌容器中以制备注射剂。该注射剂可以根据需要补充添加有稳定剂、防腐剂等。由此获得的表达载体可作为注射剂给予到受试者。
待给予的疫苗的量是每次正常给予0.01μg至100,000μg抗原，并且这取决于待治疗的受试者、受试者免疫系统中的抗体合成能力以及所希望的预防水平，并且还取决于给药途径如口服、皮下、经鼻、皮内、肌内或静脉内给药。
本发明的疫苗可以以单次给药方案(single administration schedule)提供，或者优选以多次给药方案提供。在多次给药方案中，可以在接种的初始阶段进行1至10次分开的给药，随后可以以维持和/或加强免疫应答所需的时间间隔进行另一次给药(例如1至4个月后)作为第二次给药。如果必要，可以在几个月后继续给药。该方案也至少部分地取决于个体的需要，这取决于医生的决定。
对于RSV、埃博拉病毒、寨卡病毒和疟原虫感染，还没有已得到许可的疫苗。疫苗的抗原已被明确，但对于高效中和抗体诱导，需要不稳定抗原的严格的三维结构；并且尚存在难以使大分子肽(几百个氨基酸残基)保持着其三维结构的状态作为抗原被递送这样的缺点。对于这个缺点，本发明的病毒载体则能够使大分子肽(几百个氨基酸残基)保持着其三维结构的状态作为抗原被递送。
常规地，这样的载体具有如下缺点：在将具有130个以上的氨基酸残基的抗原多肽展示在病毒粒子上的状态下，难以高效地回收病毒载体。根据本发明，具有500个以上氨基酸残基的抗原多肽被展示在病毒粒子上，并能够高效回收病毒载体。
本发明通过使用低浓度的β-丙内酯等进行核酸灭活，所以仅灭活病毒基因组，而同时维持了病毒包膜蛋白和导入的抗原的三维结构。因此，此载体具有类似于活病毒的细胞吸附特性和免疫原性，并且导入的抗原能够维持用于诱导高效中和抗体的抗原表位的三维结构，从而允许期待有效的疫苗效果。
关于抗原的导入，由于制备了预先装载有抗原的病毒载体，因此消除了在核酸灭活后导入抗原的需要，可以规避与灭活后导入抗原相关的问题(常规方法导致的低抗原导入效率、包膜和抗原结构的破坏等)。
从上述优点可以看出，本发明的病毒载体可期待在人体内的优异的效果，不像常规病毒载体那样不能期待在人体内具有足够的效果。
本发明的病毒载体可以这样构建，使抗原位于载体包膜外部或内部，或者同时位于载体包膜外部和内部。这使得多个抗原以各种方式导入至载体。
如上所述，本发明通过高效病毒灭活处理，能够提供一种灭活载体，其能够诱导几乎等于活病毒载体的免疫性，并能够在维持着不稳定大分子抗原蛋白的结构的状态下进行递送抗原；并为利用了副粘病毒科病毒的灭活载体的疫苗化做好准备。
实施例
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。
[实施例1]
将3×M2e与hPIV2 F蛋白的TM序列和CT序列融合并引入MluI限制性位点处的hPIV2/ΔF的构建
在编码TM序列和CT序列(N端-YSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS-C端)(SEQ IDNO:1)：65个氨基酸残基)的基因的上游处添加：对具有三个万能型流感病毒的M2e抗原肽(N端-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDD-C端(SEQ ID NO:2))的序列(3×M2e)进行编码的基因与起始密码子(ATG)连接而成的基因、以及在hPIV2病毒中进行表达所必须的基因，以构建基因。构建出两端附加有MluI限制性酶切序列的hPIV2/ΔF的质粒构建体(图1)。MluI限制性酶切序列的插入位点位于hPIV2/ΔF的HN基因的5’上游紧邻处。此构建体是基于规则6(rule of6)来构建，该规则据报道对于该构建体是重要的，使得hPIV2基因组的总数是6的倍数。根据先前报道(非专利文献11)，通过反向遗传学方法回收该病毒。另外，将该流感抗原导入到HN蛋白与M2e抗原融合后的hPIV2/ΔF的MluI限制性酶切位点处(图1)。
结果是，万能型流感病毒的3×M2e抗原肽与hPIV2 F蛋白的TM序列和CT序列融合的hPIV2/ΔF得以高效地回收；M2e高效地表达于感染的细胞中(图2A)，并且确认了M2e蛋白已整合到载体粒子(图2B)上。如图2A中所示，当将3×M2e基因插入hPIV2/ΔF的NP上游的NotI限制性酶切位点处时，则不能够像将2×M2e插入NotI限制性酶切位点处时那样高效地回收病毒。当将3×M2e抗原基因插入MluI限制性酶切位点处时，则即使在HN蛋白与M2e融合的情况下也能够高效地回收病毒并使得抗原整合到载体上(图2B)。
使用被低浓度的β-丙内酯灭活M2e表达载体而制备的疫苗，确认到在小鼠中诱导了针对M2e的抗体。
[实施例2]
在MluI限制性位点导入了以下基因的hPIV2/ΔF的构建：RSV的完整F蛋白基因(密码子优化基因)、或RSV的TM序列和/或CT序列被hPIV2 F蛋白TM序列和/或CT序列取代的基因、以及导入有提高了融合前F稳定性的突变的基因
对于RSV F疫苗的抗原的氨基酸序列，使用accession number P03420的RSV F蛋白。作为编码该氨基酸序列的基因，则使用了可从Sino Biological公司获得的、针对人用而优化了各氨基酸的表达密码子的RSV F DNA序列(目录号：VG40042-UT)。并导入到以下质粒载体的MluI限制性序列中以介由hPIV2/ΔF表达抗原基因(图3A和3B)。通过常规方法将具有hPIV2的基因起始序列、间插序列和基因终止端序列的基因附加到以下基因上：RSV的完整F蛋白基因(图3A和3C)；或对为了使RSV F蛋白含有在hPIV2/DF载体上而将RSV F蛋白TM和CT序列(IMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO:3))用hPIV2 TM和CT序列(YSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:1))取代或者将RSV F蛋白CT序列(KARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ IDNO:9))用hPIV2 CT序列(KLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:10))取代的序列进行编码的基因(图3B和3C)。还制备了具有部分修饰的基因起始序列等的构建体(未向该导入基因的5'上游添加基因起始序列，而是通过从在前基因连读(read through)的方式来表达导入的基因的构建体；或在导入基因的3'下游的终止序列的下游处导入起始序列，在HN基因的5'上游处导入两组起始序列而成的构建体)。现有技术已经报道了RSV F突变体的稳定性是通过将RSV F的位置155和290处的Ser(S)用Cys(C)取代而在半胱氨酸之间产生S-S键交联而增强(参考文献7)。因此，制备了具有S155C和S290C的F突变体基因(图3B和3C)，并导入hPIV2/ΔF表达用质粒载体的MluII位点。基于规则6来插入该序列(基因长度为6的倍数)。另外，还构建了：将T4噬菌体的Fibritin三聚化序列、GCN三聚化序列、或对为了形成S-S键以稳定三聚化而将氨基酸用Cys取代后的基因进行编码的核酸导入前述RSVF突变体而形成的RSV F突变体。根据先前报道(非专利文献11)，回收该病毒。所有类型的病毒均在感染的细胞中提供了细胞病变效应(cytopathogenic effect，CPE)，并回收了具有足够滴度的病毒。根据先前报道(非专利文献11)，回收该病毒。所有类型的病毒均在感染的细胞中提供了细胞病变效应(cytopathogenic effect，CPE)，并回收了具有足够滴度的病毒。
通过回收的病毒来感染表达F基因的Vero细胞，使用针对RSV F的抗体(RSV的抗F单克隆抗体[2F7]，可从Abcam plc.公司获得)通过免疫染色来确认RSV F表达。在2天感染后，用100％冷甲醇进行固定，通过使用Alexa488-标记的二级抗体用荧光显微镜来确认表达。在未导入RSV F的hPIV2/ΔF的细胞以及hPIV2 F的表达细胞中没有观察到对抗体的应答。然而，含有RSV的完整F蛋白基因、RSV F TM序列和/CT序列被hPIV2 F TM序列和/或CT序列取代的RSV F蛋白基因的hPIV2/ΔF则展现出针对RSV F的抗F抗体的阳性反应(图4(A))。另外，通过使用了抗F单克隆抗体[2F7]的蛋白质印迹分析(western blot analysis)确认了目标蛋白的表达(图4(B))。
[实施例3]
在MluI限制性位点插入了以下基因的hPIV2/ΔF的构建：RSV的两个弗林蛋白酶切割结构域肽序列基因被去除了的RSV F蛋白基因、或具有将该RSV F蛋白TM序列和/或CT序列用hPIV2 F蛋白TM序列和/或CT序列取代的基因
如图3D所示，在RSV F中存在两个弗林蛋白酶识别序列位点(图3C)。在弗林蛋白酶识别序列之间的被称为p27的氨基酸(N端-ELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRR-C端(SEQ IDNO:4))被去除，并使前部的弗林蛋白酶识别序列(108处的Arg(R)和109处的Arg(R))缺失，从而构建了RSV F(FΔp27+2)(图3D)。将hPIV2的基因起始序列、间插序列和基因终止序列附加到FΔp27+2、或附加到编码为了使RSV F蛋白含在hPIV2/ΔF载体上而将RSV F蛋白TM序列(图3A和3D)以及CT序列(IMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO:3))用hPIV2 TM序列和CT序列(YSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:1))取代或将RSV F蛋白CT序列(KARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ ID NO:9))用hPIV2 CT序列(KLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:10))取代的序列的基因(图3B和3D)上，将由此形成的基因插入hPIV2/ΔF表达用载体的Mlu位点。另外，通过将RSV F的第一弗林蛋白酶识别序列取代(位置106、107、108和109处的Arg(R)Ala(A)Arg(R)Arg(R)被Gln(Q)Ala(A)Gln(Q)Gln(Q)取代)，构建了p27序列缺失的突变体(FΔp27：图3D)，并将具有RSV F蛋白TM序列和/或CT序列被hPIV2 TM序列和/或CT序列取代的突变体基因插入至hPIV2/ΔF表达用载体的MluII位点。制备这些突变体的目的在于，试图通过引入突变来稳定融合前F的三维结构以诱导具有针对融合前抗原的高中和活性的抗体，从而开发具有高效力的RSV疫苗。现有技术报道了RSV F中位置67处的Asn(N)和位置251处的Ser(S)分别被Ile(I)和Pro(P)取代，则增强了RSV F突变体的稳定性(非专利文献4)。制备了含有N61I和S251P的FΔp27的突变体基因(图3B和3D)并将其插入至hPIV2/ΔF表达用质粒载体的MluI位点。基于规则6来插入该序列。根据先前报道(非专利文献11)，回收了该病毒。另外，还制备了在前述RSV突变体中导入了编码如下基因的核酸而形成的RSV F突变体：T4噬菌体的Fibritin三聚化序列；GCN三聚化序列；或为了形成S-S键以稳定三聚化而将氨基酸用Cys取代后的基因。所有类型的病毒均在感染的细胞中提供了细胞病变效应(CPE)，并回收了具有足够滴度的病毒。
通过回收的病毒来感染表达F基因的Vero细胞，使用针对RSV F的抗体(RSV的抗F单克隆抗体[2F7]，可从Abcam plc.公司获得)通过免疫染色来确认RSV F表达。在2天感染后，用100％冷甲醇进行固定，通过使用Alexa488-标记的二级抗体用荧光显微镜来确认表达。含有RSV FΔp27+2蛋白基因的hPIV2/ΔF、以及含有将RSV FΔp27+2蛋白TM序列和/或CT序列用hPIV2 F TM序列和/或CT序列取代后的RSV FΔp27+2蛋白基因的hPIV2/ΔF展现出针对RSV F的抗F抗体的阳性反应(图4(A))。通过使用了抗F单克隆抗体[2F7]的蛋白质印迹分析确认了目标蛋白的表达(在图4(B)的#5中，还示出了通过将FΔp27的RSV F TM/PIV2F CT插入至TM和CT序列获得的结果)。
[实施例4]
在MluI限制性位点插入了以下基因的hPIV2/ΔF的构建：RSV膜融合序列的八个氨基酸被去除了的F蛋白基因、将编码该RSV F蛋白基因的TM序列和/或CT序列的基因或具有导入了提高融合前F的稳定性的突变的基因用hPIV2 F蛋白TM序列和CT蛋白基因取代的序列的基因
如图3C所示，在RSV F中，从位置137至151的氨基酸序列(FLGFLLGVGSAIASG(SEQID NO:5)称为融合结构域(fusion domain,FD)，为与细胞等的融合相关的结构域。在此实施例中，构建了从RSV F蛋白去除八个氨基酸(FLGFLLGV(SEQ ID NO:6))的RSV F蛋白(图3E)。去除FD序列的一部分进行构建的原因在于，由于hPIV2/ΔF缺少F基因，虽然在F表达包装细胞以外不会产生增殖性病毒；然而，已经报道了RSV F蛋白单独可以附着于细胞并与细胞融合，为了确保安全性，将融合序列的一部分从FD去除以消除该可能性。将hPIV2的基因起始序列、间插序列和基因终止序列附加到编码RSV F蛋白的基因(图3A、3E)上、或者附加到编码为了使RSV F蛋白含在hPIV2/ΔF载体上而将该RSV F蛋白的TM序列和CT序列(IMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGIN NIAFSN(SEQ ID NO:3))用hPIV2 TM序列和CT序列(YSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:1))取代后的序列或将RSV F蛋白CT序列(KARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN(SEQ IDNO:9))用hPIV2 CT序列(KLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:10))取代后的序列的基因(图3B和3E)上，将由此形成的基因插入至hPIV2/ΔF表达用质粒载体的Mlu位点。报道了在RSV F中将两个位置155和290处的Cyc(C)用Ser(S)取代而通过半胱氨酸之间的S-S键的交联增强了RSV F突变体的稳定性(非专利文献7)。制备了含有S155C和S290C的F突变体基因(图3B和3E)并将其插入至hPIV2/ΔF表达用质粒载体的MluII位点。基于规则6来插入该序列。根据先前报道(非专利文献11)，回收该病毒并成功完成病毒回收。另外，还制备了将编码T4噬菌体的Fibritin三聚化序列；GCN三聚化序列；或为了形成S-S键以稳定三聚化而将氨基酸用Cys取代后的基因的核酸导入前述RSV F突变体而形成的RSV F突变体。
通过回收的病毒来感染表达F基因的Vero细胞，使用针对RSV F的抗体(RSV的抗F单克隆抗体[2F7]，可从Abcam plc.公司获得)通过免疫染色来确认RSV F表达。在2天感染后，用100％冷甲醇进行固定，通过使用Alexa488-标记的二级抗体用荧光显微镜来确认表达。在含有将RSV F的FD的一部分结构域除去了的蛋白基因和含有RSV的F蛋白的TM序列和CT序列被hPIV2 F TM序列和CT序列取代的RSV FΔp27蛋白基因的、hPIV2/ΔF展现出针对RSV F的抗F抗体的阳性反应(图4(A))。另外，通过使用了抗F单克隆抗体[2F7]的蛋白质印迹分析确认了目标蛋白的表达(图4(B))。
[实施例5]
在MluI限制性位点插入了以下基因的hPIV2/ΔF的构建：含有两个氨基酸突变的埃博拉病毒GP蛋白基因、或具有将该GP蛋白基因的TM序列和CT序列用hPIV2 F蛋白TM序列和CT序列取代的基因
埃博拉病毒GP蛋白是负责将病毒结合到细胞表面受体、以及病毒包膜与宿主细胞膜之间的膜融合的蛋白(图5C)。对于cDNA，使用了可商购的质粒(Sino Biological公司，登录号：KJ660346，cDNA长：2031bp)。GP蛋白的部分序列被取代为据报道对细胞不具有进入能力(entry capability)的序列(F88A和F535A；JVI:2013(87)3324-3334：非专利文献15)。另外，为了不发生RNA编辑，进行了基因取代(没有氨基酸序列的取代)。在埃博拉病毒GP蛋白基因(图5A和5C)、或在该GP蛋白基因的TM序列和CT序列(WIPAGIGVTGVIIAVIALFCICKFVF(SEQ ID NO:7))被hPIV2 TM序列和CT序列(YSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:1))(图5B和5C)取代的序列上附加hPIV2的基因起始序列、间插序列和基因终止序列，将由此形成的基因插入至hPIV2/ΔF表达用质粒载体的Mlu位点。基于规则6来插入该序列。根据先前报道(非专利文献11)，回收该病毒。
在所有情况下，病毒都能成功回收。通过回收的病毒来感染表达PIV2 F基因的Vero细胞2天，确认了GP的表达(图6)。为了确认GP蛋白表达，使用了抗GP小鼠单克隆抗体(4F3：IBT BIOSEVICES公司)。在感染的细胞中，GP蛋白和被hPIV2 TM序列和CT序列取代的GP蛋白以相同水平表达(图6A)。去除了后述的粘蛋白结构域的GP蛋白没有反应。(该抗体的表位序列虽未特定，但是从未对去除了粘蛋白结构域的GP发生反应来看，该粘蛋白结构域的表位被识别。)
接下来，通过以141,000×g超速离心35分钟从表达病毒的细胞上清液回收病毒，通过蛋白质印迹(WB)检查载体中所含的GP蛋白(图6B)。结果，与最初的预测相反，发现与已被hPIV2 TM序列和CT序列取代的GP蛋白相比，更多的携带源自埃博拉GP蛋白的TM序列和CT序列的GP蛋白结合到载体上(图6B)(但二者均具有相同的PIV2的NP和P表达水平)。图6中的感染的细胞的WB结果显示，当携带GP和hPIV2 F中任一方的TM/CT序列时，102kDa附近的GP蛋白(在ER和高尔基体中糖基化之前的GP蛋白)具有类似的GP表达水平。然而，发现对于具有较高分子量的、4F3阳性的GP蛋白(糖基化GP蛋白)，则携带埃博拉病毒GP的TM/CT序列的这种蛋白具有更高的表达水平。确认了被hPIV2 F TM/CT序列取代的GP蛋白经过糖基化并结合到载体上。作为整合有携带了与原始病毒不同的TM/CT序列的蛋白的病毒的例子，有埃博拉GP蛋白(非专利文献6)、VSV G蛋白(非专利文献12)等的报告例。
如上所述，发现埃博拉GP蛋白整合到hPIV2/ΔF的效率极高。在期待未来的实际应用时，为了确认携带埃博拉GP蛋白(上述两个氨基酸取代)的hPIV2/ΔF在正常细胞中不增殖，构建了将GFP基因表达序列插入至含有该埃博拉GP基因的hPIV2/ΔF质粒的NP基因上游的NotI限制性酶切位点的质粒并制备了该病毒。Vero细胞和组成型表达(constitutivelyexpressing)PIV2F的Vero细胞分别被病毒和仅携带GFP基因的hPIV2/ΔF载体感染，使得它们具有0.01的MOI(图7)。就像携带GFP基因的hPIV2/ΔF载体(其已被确认在表达hPIV2 F的Vero细胞以外的细胞中没有出现感染性粒子)一样，在不表达hPIV2 F的Vero细胞中也没有发现该病毒的感染性粒子，仅在表达hPIV2 F的Vero细胞中发现了感染性粒子增殖。也就是说，确认了该病毒在正常细胞中不产生感染性粒子，具有高水平的安全性。
[实施例6]
在MluI限制性位点插入了以下基因的hPIV2/ΔF的构建：埃博拉病毒的GP1蛋白基因与埃博拉病毒GP的TM序列和CT序列基因融合的GP1蛋白质基因、或者埃博拉病毒的GP1蛋白基因与hPIV2 F蛋白的TM序列和CT序列融合的基因
在实施例5中构建的埃博拉病毒的GP蛋白基因的弗林蛋白酶切割识别序列的前部的GP1蛋白(GP蛋白被弗林蛋白酶切割为GP1和GP2而获得的GP1蛋白结构域)(弗林蛋白酶切割位点被消除)上，附加上GP蛋白基因的TM和CT序列(WIPAGIGVTGVIIAVIALFCICKFVF(SEQID NO:7))(图5A和5D)或hPIV2 TM和CT序列(YSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:1))(图5B和5D)，由此构建出埃博拉病毒的GP1蛋白基因。将附加了hPIV2的基因起始序列、间插序列和基因终止序列的基因插入至hPIV2/ΔF表达用质粒载体的Mlu位点。基于规则6来插入该序列。根据先前报道(非专利文献11)，回收该病毒。
[实施例7]
在MluI限制性位点插入了以下基因的hPIV2/ΔF的构建：从含有两个氨基酸突变的埃博拉病毒GP蛋白去除了粘蛋白结构域基因的GP基因、或该GP蛋白基因的TM序列和CT序列被hPIV2 F蛋白TM序列和CT序列取代的基因
埃博拉病毒GP的氨基酸序列的从位置313至454的结构域是被称为粘蛋白结构域的序列，粘蛋白结构域蛋白以覆盖由其他结构域形成的结构域的形式配置，且具有许多个糖基化的氨基酸残基。已知它是与GP蛋白吸附、进入细胞不太相关的结构域，构建了将此结构域去除了的埃博拉病毒GP(Δ粘蛋白GP)。在该Δ粘蛋白GP(图5A和5E)中置换为埃博拉病毒的TM和CT序列(YSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:1))(图5B和5E))后的序列上，附加hPIV2的基因起始序列、间插序列和基因终止序列，将由此形成的基因插入至hPIV2/ΔF表达用质粒载体的Mlu位点。基于规则6来插入该序列。根据先前报道(非专利文献11)，回收该病毒。在所有情况下都成功回收了病毒。然后，进行蛋白质印迹分析。然而，此处使用的抗GP抗体很有可能以粘蛋白结构域作为表位(图6)，因此在蛋白质印迹分析中，关于表达是否发生未能分析出来(但hPIV2的NP和P被表达)。
[实施例8]
在MluI限制性位点插入了以下基因的hPIV2/ΔF的构建：从含有两个氨基酸突变的埃博拉病毒GP1蛋白去除了粘蛋白结构域基因后的基因、或具有该GP1蛋白基因的TM序列和CT序列被hPIV2 F蛋白TM序列和CT序列取代的基因
从实施例5中构建的埃博拉病毒GP1蛋白基因中去除粘蛋白编码区序列，并向该序列附加GP蛋白基因的TM和CT序列(WIPAGIGVTGVIIAVIALFCICKFVF(SEQ ID NO:7))(图5A和5F)或hPIV2 TM和CT序列(YSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:1))(图5B和5F)来构建埃博拉病毒GP1蛋白基因，并向其中附加hPIV2的基因起始序列、间插序列和基因终止序列，将由此形成的基因插入至Mlu位点。基于规则6来插入该序列。根据先前报道(非专利文献11)，回收该病毒。
[实施例9]
在小鼠中进行针对GP蛋白的抗体滴度的评价：利用在实施例5中构建的携带埃博拉病毒GP蛋白基因(含有两个氨基酸突变)的hPIV2/ΔF和被0.01％β-丙内酯处理而灭活的该载体来评价。
制备该载体和灭活载体(不添加佐剂)，使得病毒数目为108个/mL。将100μl的各载体样品和对照样品以两周的间隔两次注射到5周龄的BALB/c小鼠(雌性)后肢的大腿肌肉中，并在给药后两周回收血清。使用该血清，并且通过ELISA使用埃博拉病毒GP蛋白(SinoBiological公司目录号：40442-V08H2)评价抗体(IgG1+IgG2a)的增加。将50ng的GP蛋白施加到96孔板的一个孔中，并将上述血清以两倍频率从50倍稀释到6400倍，并用通常的ABC法评价抗体的存在。如图8的结果所示，确认了携带埃博拉病毒GP蛋白基因的hPIV2/ΔF和被0.01％β-丙内酯处理而灭活的该载体均有效增加了针对埃博拉病毒GP的IgG抗体。也确认了具有中和活性的抗体被诱导出来。
[实施例10]
携带疟疾抗原CSP(环子孢子蛋白(circumsporozoite protein)；疟原虫子孢子表面蛋白)的hPIV2/ΔF的构建
将源自约氏疟原虫(Plasmodium yoelli)的CSP插入至hPIV2/ΔF中。在完整CSP基因、以及GPI样锚定序列(CSSIFNIVSNSLGFVILLVLVFFN(SEQ ID NO:8))被hPIV2 CT序列(YSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:1))取代后的CSP基因上，附加对于hPIV2表达必要的序列。将得到的CSP基因插入至hPIV2/ΔF表达用质粒载体的MluI限制性酶切位点(图9)。根据先前报道(非专利文献11)回收病毒，并在两种情况下都成功回收病毒。使病毒感染表达F的Vero细胞，并且通过蛋白质印迹分析来分析CSP蛋白的表达。使用针对约氏疟原虫的QQPP重复序列的单克隆抗体(2F6)作为针对CSP的抗体。使用10,000个约氏疟原虫子孢子作为阳性对照。
如图10所示，CSP蛋白通过该载体表达。一般来说，据报道CSP蛋白的表达并不容易。然而，hPIV2使得CSP蛋白能够容易表达。因此，期待会将其用作表达其他疟疾相关基因的手段。此外，期待会将其用作表达其他疟疾相关基因的手段。另外，确认通过超速离心(141,000g持续35分钟)从培养上清液回收的病毒载体能够使携带GPI样锚定序列的完整CSP与GPI样锚定序列被hPIV2 TM取代的CSP以同等水平保持在hPIV2/ΔF载体粒子上。可以理解为，关于CSP蛋白，GPI样锚定蛋白具有与hPIV2 TM蛋白相同水平的使CSP蛋白保持在载体上的能力。然而，就跨膜结构域而言，具有原始GPI的CSP对QQPP抗原的抗体反应的分子量与hPIV2 TM/CT取代的CSP对QQPP抗原的抗体反应的分子量不同。被hPIV2 TM/CT取代的CSP展现出与阳性对照的子孢子CSP蛋白相同的分子量，但具有原始GPI的CSP展现了分子量不同的阳性条带。被hPIV2 TM/CT取代的CSP能够以与原始(子孢子CSP)相似的形式整合到载体中。
[实施例11]
通过携带有疟疾抗原CSP的hPIV2/ΔF来评价针对CSP的抗体滴度
制备携带CSP基因(该CSP基因的GPI样锚定序列被hPIV2 TM取代)的hPIV2/ΔF，使得病毒数目为109个/mL。将100μl的各载体样品和对照样品以两周的间隔两次注射到5周龄的BALB/c小鼠(雌性)后肢的大腿肌肉中，并在给药后两周回收血清。使用血清来评价针对约氏疟原虫CSP的抗体滴度。为了进行ELISA评价，使用了将重复存在于约氏疟原虫CSP中的B细胞表位的QGPGAP序列三次重复的(QGPGAP)3肽。制备该肽，使得它为5μg/mL，并将其100μl施加到96孔板的一个孔中过夜，进而评价针对CSP的抗体(IgG1+IgG2a)的增加。将上述血清以四倍频率从10倍稀释到2560倍，并用通常的ABC法评价抗体的存在。结果(图11)显示，给予该载体使得针对CSP的抗体增加。
[实施例12]
使用prM/E抗原制备寨卡病毒疫苗
在编码寨卡病毒的prM/E结构域(KU321639)的基因(部分包括氨基酸突变)的prM基因的5'-端附加起始密码子，进一步附加带有或者不带有编码分泌信号的基因，并在该基因前后附加hPIV2的基因起始序列、间插序列和基因终止序列，将由此形成的基因插入至hPIV2/ΔF表达用质粒载体的MluI位点(图12A和12C)。基于规则6来插入该序列。根据先前报道(非专利文献11)，回收该病毒。
[实施例13]
制备具有寨卡病毒E蛋白的C-末端区的干序列(EH1和EH2)和TM序列的取代或缺失的疫苗
在具有与实施例14中相同结构的寨卡病毒prM基因上，构建对以下蛋白进行编码的基因：该蛋白是在以下序列缺失了的E蛋白上附加了hPIV2 TM/CT序列(hPIV2的TM序列和/或CT序列(YSLSAIALILSVITLVVVGLLIAYIIKLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS(SEQ ID NO:1))后的蛋白。在此提及的“以下序列”是指，E蛋白的EH1和EH2序列及TM1和TM2序列、EH2序列及TM1和TM2序列、或TM1和TM2序列。制备了在该基因前后附加了hPIV2的基因起始序列、间插序列和基因终止序列的基因，并插入至hPIV2/ΔF表达用质粒载体的MluI位点(图12B、12D、12E和12F)。基于规则6来插入该序列。根据先前报道(非专利文献11)，回收该病毒。
[实施例14]
疫苗对寨卡病毒的效果
将实施例15中制备的、携带prM/E或E蛋白的载体用低浓度的β-丙内酯灭活，由此制备的载体被用来评价针对寨卡病毒的疫苗效果。
[实施例15]
回收不含遗传信息的prM/E蛋白或M/E蛋白颗粒(存活颗粒)
关于属于黄病毒属的病毒，已经报道了其他黄病毒不仅从ER释放感染性病毒粒子，还释放不含有遗传信息的prM/E蛋白或M/E蛋白的蛋白粒子(存活粒子)(非专利文献13和14)。制备了将寨卡病毒的prM/E基因插入至非传播性hPIV2/ΔF中的载体(图12A和12C)。使该载体感染不表达hPIV2的F基因的细胞(Vero细胞、CHO细胞等)，从培养上清液中有效地回收了该颗粒并用作寨卡疫苗的病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)。
实用性
本发明的病毒载体可以在维持着大分子抗原肽(具有几百个氨基酸残基)的三维结构的状态下在病毒颗粒上呈递该大分子抗原肽。本发明的病毒载体即使在核酸灭活处理之后也具有与活病毒类似的细胞吸附特性和免疫原性，并在维持三维结构的状态下呈递抗原表位，并能够诱导有效的中和抗体。因此，本发明可用于生产对RSV、埃博拉病毒等有效的许可疫苗。
SEQUENCE LISTING
<110> 国立大学法人三重大学
生物科莫公司
<120> F基因缺陷2型人副流感病毒载体和疫苗
<130> PMU-9014WO
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<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 64
<212> PRT
<213> 2型人副流感病毒
<400> 1
Tyr Ser Leu Ser Ala Ile Ala Leu Ile Leu Ser Val Ile Thr Leu Val
1 5 10 15
Val Val Gly Leu Leu Ile Ala Tyr Ile Ile Lys Leu Val Ser Gln Ile
20 25 30
His Gln Phe Arg Ser Leu Ala Ala Thr Thr Met Phe His Arg Glu Asn
35 40 45
Pro Ala Phe Phe Ser Lys Asn Asn His Gly Asn Ile Tyr Gly Ile Ser
50 55 60
<210> 2
<211> 24
<212> PRT
<213> A型流感病毒
<400> 2
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Asp
20
<210> 3
<211> 50
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 3
Ile Met Ile Thr Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ile Ala Val Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro
20 25 30
Val Thr Leu Ser Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe
35 40 45
Ser Asn
50
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 4
Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr
1 5 10 15
Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg
20 25
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 5
Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly
1 5 10 15
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 6
Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val
1 5
<210> 7
<211> 26
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 7
Trp Ile Pro Ala Gly Ile Gly Val Thr Gly Val Ile Ile Ala Val Ile
1 5 10 15
Ala Leu Phe Cys Ile Cys Lys Phe Val Phe
20 25
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 约氏疟原虫17X
<400> 8
Cys Ser Ser Ile Phe Asn Ile Val Ser Asn Ser Leu Gly Phe Val Ile
1 5 10 15
Leu Leu Val Leu Val Phe Phe Asn
20
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 9
Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser Lys Asp Gln Leu Ser Gly
1 5 10 15
Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn
20
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<211> 38
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<213> 呼吸道合胞病毒
<400> 10
Lys Leu Val Ser Gln Ile His Gln Phe Arg Ser Leu Ala Ala Thr Thr
1 5 10 15
Met Phe His Arg Glu Asn Pro Ala Phe Phe Ser Lys Asn Asn His Gly
20 25 30
Asn Ile Tyr Gly Ile Ser
35
Claims (9)
1.一种非传播性病毒载体，其中，编码抗原多肽的核酸被整合到F基因缺陷型副粘病毒科病毒基因的HN基因的5'上游紧邻处，并且，该抗原多肽以与源自所述病毒的TM序列和/或CT序列融合的130个以上氨基酸残基的融合蛋白的形式被表达。
2.根据权利要求1所述的病毒载体，其中，所述副粘病毒科病毒是非传播性2型人副流感病毒。
3.根据权利要求1或2所述的病毒载体，其中，所述抗原多肽表达于载体包膜的表面上。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的病毒载体，其中，所述抗原多肽以维持着天然三维结构或作为疫苗抗原所必须的三维结构的状态被表达。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的病毒载体，其中，所述病毒为经核酸灭活处理的病毒。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的病毒载体，其中，以抗原多肽基因的TM序列和/或CT序列或者GPI样锚定蛋白被源自2型人副流感病毒的TM序列和/或CT序列取代的核酸的形式整合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的病毒载体，其中，所述抗原多肽是选自以下任一种或两种以上的抗原肽或其片段：
选自以下的病毒的抗原肽：包括高毒性流感病毒的流感病毒、3型副流感病毒、RS病毒、亨德拉病毒、SARS病毒、MERS病毒、尼帕病毒、拉沙病毒、登革病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、人偏肺病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、风疹病毒、轮状病毒、诺如病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、寨卡病毒、马尔堡病毒、HIV和乳头瘤病毒；
选自A组β-溶血性链球菌、结核分枝杆菌、霍乱弧菌的细菌的抗原肽、以及支原体的抗原肽；
疟原虫的抗原肽；以及
选自以下各项组成的组的抗原肽：癌抗原gp100、MUC1、NY-ESO-1、MelanA/MART1、TRP2、MAGE、CEA、CA125、HER2/neu、WT1、PSA和新抗原。
8.根据权利要求7所述的病毒载体，其中，所述抗原多肽是选自以下的任一种：具有流感病毒的三个以上的连续M2e的抗原；RSV F蛋白或G蛋白、或其突变体或其片段；M2e抗原和RSV F蛋白或其片段；以及埃博拉病毒GP蛋白、或其突变体或其片段；以及疟疾CSP蛋白、或其突变体或其片段；以及寨卡病毒prM/E蛋白、或其突变体或其片段。
9.一种疫苗，其含有根据权利要求1至8中任一项所述的病毒载体和药学上可接受的载剂。
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