CN1355851A - 副粘病毒科的包膜基因缺陷型病毒载体 - Google Patents

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Abstract

通过使用F基因缺陷型仙台病毒基因组cDNA成功地回收了F基因缺陷型病毒的病毒颗粒。而且,通过使用表达F的细胞作辅助细胞成功地构建了F基因缺陷型感染性病毒颗粒。通过使用F基因和HN基因均有缺陷的病毒基因组cDNA也成功地回收了F基因和HN基因缺陷型病毒的病毒颗粒。而且,通过使用表达F和HN的细胞作辅助细胞成功地生产了F基因和HN基因缺陷型感染性病毒颗粒。通过使用表达F的细胞作辅助细胞构建了F基因和HN基因有缺陷且含有F蛋白的病毒。而且,使用表达VSV－G的细胞成功地构建了VSV－G假型病毒。构建这些缺陷型病毒的技术可用于开发基因治疗中所用的副粘病毒科的载体。

Description

副粘病毒科的包膜基因缺陷型病毒载体
                   技术领域
本发明涉及一种副粘病毒的包膜基因缺陷型病毒载体。
                   背景技术
到目前为止，在基因治疗的许多临床方法中，已经使用了来源于逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒的病毒载体。这些基因治疗载体在基因导入效率和持续表达方面存在限制，并且还具有细胞毒性和免疫原性，在这些载体应用于临床时，这些都是重要的问题(Lamb，R.A.和Kolakofsky，D.，病毒学领域，副粘病毒科：病毒及其复制.第三版，(B.N.Fields、D.M.Knipe和P.P.Howley编)pp.1177-1204(费城，Lippincott-Raven〔1996〕)。已经提出基于慢病毒属和HSV的新载体作为解决此问题的对策，并且还在进行广泛的研究以改善现存的载体。但是，所有这些载体在整个生命周期中为胞核中的DNA形式。因此难以完全克服这些载体与患者染色体随机相互作用的安全性问题。
最近反向遗传学技术快速发展，这使已延迟了很久的基于RNA病毒的载体的开发成为可能。重组RNA病毒载体的基因导入效率和表达能力较高，因此充当基因治疗载体的潜力很大(Roberts，A.和Rose，J.K.，《病毒学》247，1-6(1998)；Rose，J.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，14998-15000(1996)；Palese，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11354-11358(1996))。然而仍未有来源于减毒病毒的缺陷型基因组的副粘病毒载体实际应用的报道。
具有负链RNA作为基因组的副粘病毒载体，它具有几种明显不同于逆转录病毒、DNA病毒或正链RNA病毒载体的特性。负链RNA病毒的基因组或反基因组不具备直接充当mRNA的功能，所以它们不能启动病毒蛋白的合成和基因组的复制。这些病毒的RNA基因组和反基因组总是以核糖核蛋白复合体(RNP)的形式存在，因此它们几乎不会产生由反义链产生的问题，诸如因为mRNA与互补的裸基因组RNA杂交而妨碍基因组装配为RNP，这在正链RNA病毒中常出现。这些病毒含有它们自己的RNA聚合酶，可应用RNP复合体充当模板，进行病毒mRNA的转录或病毒基因组的复制。值得注意的是，因为负链RNA(nsRNA)病毒不具有DNA相，所以它们仅在宿主细胞的胞质中增殖，并不整合至染色体中。而且已经认识到在RNA之间没有同源重组。有人认为这些特性非常利于负链RNA病毒作为基因表达载体的稳定性和安全性。
在负链RNA病毒中，本发明人已经将注意力集中到仙台病毒(SeV)上。仙台病毒是一种非分节段型负链RNA病毒，属于副粘病毒属，并且是鼠源副流感病毒的一种类型。这种病毒通过两种包膜糖蛋白，即血凝素-神经氨酸酶(HN)和融合蛋白(F)，粘附于宿主细胞膜，引起膜融合，并且有效地将它们自己的RNA聚合酶和核糖核蛋白(RNP)复合体形式的RNA基因组释放到胞质中，并在此部位进行病毒mRNA的转录和基因组复制(Bitzer，M.等，《病毒学杂志》71(7)：5481-5486，1997)。此病毒包膜蛋白F被合成为一种无活性前体蛋白(F0)，然后通过胰蛋白酶切割为F1和F2(Kido，H.等，《生物高分子》(肽科学)51(1)：79-86，1999)，从而成为可引起膜融合的活性蛋白。据称这种病毒对人无致病性。另外，已经分离出仙台病毒的一种减毒实验室株(Z株)，它仅在其自然宿主啮齿动物中引起轻度肺炎。此减毒株已经广泛地用作副粘病毒转录-复制机制的分子水平研究的一种研究模型，并用于杂交瘤的制备。除了上述较高安全性外，此病毒在细胞系或鸡胚中具有较高的制备滴度，为109-11pfu/ml。在最近一个成功的从cDNA回收负链RNA病毒载体系统中，已经发现仙台病毒的重建效力尤其高。导入了外源基因的重组野生型病毒有效并稳定地表达外源导入的基因的能力受到广泛的关注。
因此，负链RNA病毒充当基因导入载体具有许多优势。然而就基因治疗的应用而言，需要开发安全性较高的载体，当此载体感染细胞时，并不释放感染性颗粒。为了达到此目的，需要一种技术，此技术可大量生产在野生型病毒生产能力方面有缺陷的病毒。但是，开发可利用的基于包膜基因-缺陷型基因组的载体仍未成功。
                   发明内容
本发明的目的是提供一种包膜基因缺陷型副粘病毒载体。
为构建适宜基因治疗的完全缺乏传播能力的副粘病毒载体，本发明人利用引入了GFP基因充当报道基因的cDNA从SeV的基因组中删除了F基因，以建立一种在表达仙台病毒F蛋白的细胞中回收感染性病毒颗粒的方法。通过这种F基因缺陷型病毒载体，可将基因高效地导入原代大鼠神经细胞培养物、小鼠原始造血干细胞、人正常细胞和各种其它类型的细胞，并高表达。而且针对大鼠脑的体内给药也获得了较好的表达。此F基因缺陷型SeV载体可在感染细胞中比较持久和强烈地表达基因，而不产生次生感染病毒颗粒，并且不在邻近细胞中增殖。因此提示这种载体可用于基因治疗。
另外本发明人生产一种F基因和HN基因均有缺陷的SeV载体cDNA，以建立一种可在表达仙台病毒F蛋白和HN蛋白的细胞系中回收感染性病毒颗粒的方法。另外，通过将这种SeV载体cDNA导入F表达细胞，本发明人成功地构建了HN蛋白缺陷型SeV载体。
因此本发明首次建立了一种新的可应用的基于负链RNA病毒的包膜基因缺陷型载体系统。在应用辅助细胞从F基因缺陷或FHN基因缺陷基因组cDNA回收感染性缺陷病毒颗粒方面的成功为研究和开发利用仙台病毒显著特征的新的基因治疗载体铺平了道路。
本发明的缺陷型仙台病毒载体对各种类型细胞具有相当高的基因导入效率，而且在表达外源基因方面具有很强的能力。另外它在感染细胞中可持续表达，而且不释放次代感染病毒颗粒，这证明它是一种完全不具备病毒传播能力的安全性较高的载体。
当应用RNA病毒时，基因组的稳定性是一个难题。在连续多次传代后，通过SeV载体的异源基因表达几乎没有任何碱基突变，这表明它可长期稳定地表达所插入的异源基因(Yu，D.等《基因细胞》2，457-466(1997))。与基于塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)或新培斯病毒(Sindbis virus)的复制子相比，基于负链RNA病毒复制子的载体具有几种有利的特性，诸如所导入或包装的基因的基因组稳定性或基因大小的柔性，因为它们没有衣壳结构蛋白。所述塞姆利基森林病毒是一种已经成功的正链RNA病毒。可将至少4kbp外源DNA插入野生型仙台病毒载体，可将比这长得多的外源DNA插入所述缺陷型载体。通过加入一个转录单位，可同时表达两种或多种基因。因为理论上，在胞质中复制的多拷贝RNP在细胞分裂时将分布至子代细胞中，所以预计基于仙台病毒复制子的载体中可有持续的表达。实际上，这种情况已经在某种血细胞的体外研究中得到证明。另外因为本发明人已经证实可将仙台病毒载体高效地导入血细胞，尤其是粒细胞，而且也证实可将它导入c-kit阳性原代(primitive)始细胞，所以认为此载体是一种组织应用范围很广泛的利用价值极高的载体。
因而本发明涉及包膜基因缺陷型仙台病毒载体，特别涉及：
(1)一种副粘病毒科的病毒载体，它包含一种复合体，此复合体包含(a)源自副粘病毒的负链单链RNA，它被修饰而不能表达副粘病毒科病毒的至少一种包膜蛋白，和(b)一种与所述负链单链RNA结合的蛋白；
(2)按照(1)的载体，其中的负链单链RNA表达NP蛋白、P蛋白和L蛋白，而且它被修饰而不能表达F蛋白和/或HN蛋白；
(3)按照(1)或(2)的载体，其包含至少一种包膜蛋白，此蛋白的表达在修饰的负链单链RNA中受到抑制；
(4)按照(1)至(3)中任意一种的载体，它包含VSV-G蛋白；
(5)按照(1)至(4)中任意一种的载体，其中的负链单链RNA源自仙台病毒；
(6)按照(1)至(5)中任意一种的载体，其中的负链单链RNA还编码一种外源基因；
(7)一种编码负链单链RNA的DNA或者它的互补链，它包含在按照(1)至(6)中任意一种的载体中；
(8)一种生产按照(1)至(6)中任意一种的载体的方法，它包含以下步骤：
(a)通过编码经修饰不能表达副粘病毒科病毒的至少一种包膜蛋白的副粘病毒衍生性负链单链RNA或其互补链，导入表达所述包膜蛋白的细胞中，以便表达所述载体DNA，
(b)培养所述的细胞，以及，
(c)从培养物上清液中回收病毒颗粒；
(9)一种生产按照(1)至(6)中任意一种的载体的方法，它包含以下步骤：
(a)一种复合体包含源自副粘病毒且已被修饰而不能表达副粘病毒属病毒的至少一种包膜蛋白的负链单链RNA和一种与所述负链单链RNA结合的蛋白，将此复合体导入表达所述包膜蛋白的细胞，
(b)培养所述的细胞，以及，
(c)从培养物上清液中回收病毒颗粒；
(10)按照(8)或(9)的方法，其中(b)中的细胞培养物与表达包膜蛋白的细胞共培养；
(11)按照(8)或(9)的方法，其中将表达包膜蛋白的细胞置于(b)的细胞培养物所述细胞的上层；
(12)按照(8)至(11)任意一种的方法，其中由细胞表达的至少一种包膜蛋白与在上述负链单链RNA中表达受抑制的至少一种包膜蛋白相同；
(13)按照(8)至(12)任意一种的方法，其中由细胞表达的至少一种包膜蛋白为VSV-G蛋白。
在本发明中，名词“载体”指包裹可在宿主中表达外源基因的核酸分子的病毒颗粒。
属于副粘病毒科的病毒的“NP、P、M、F、HN和L基因”分别指编码核衣壳、磷、基质、融合体、血凝素-神经氨酸酶和大分子蛋白的基因。属于副粘病毒科的亚科的各个病毒基因通常表示如下。NP基因通常也描述为“N基因”。
呼吸道病毒(Respirovirus)属    N   P/C/V   M    F   HN    -     L
风疹病毒(Rubullavirus)属      N   P/V     M    F   HN    (SH)  L
麻疹(Morbillivirus)属         N   P/C/V   M    F   H     -     L
副粘病毒科呼吸道病毒属仙台病毒的NP基因的核苷酸序列的数据库录入号是M29343、M30202、M30203、M30204、M51331、M55565、M69046和X17218，对于P基因，是M30202、M30203、M30204、M55565、M69046、X00583、X17007和X17008，对于M基因，是D11446、K02742、M30202、M30203、M30204、M69046、U31956、X00584和X53056，对于F基因，是D00152、D11446、D17334、D17335、M30202、M30203、M30204、M69046、X00152和X02131，对于HN基因，是D26475、M12397、M30202、M30203、M30204、M69046、X00586、X02808和X56131以及对于L基因，是D00053、M30202、M30203、M30204、M69040、X00587和X58886。
本发明涉及副粘病毒科包膜基因缺陷型病毒载体。此病毒载体包含来源于副粘病毒的负链单链RNA，此RNA已被修饰而不能表达至少一种包膜蛋白。副粘病毒在包膜中通常包含一个由RNA和蛋白组成的复合体(核糖核蛋白，RNP)。RNP中所包含的RNA是负链单链RNA，它是副粘病毒的基因组。该蛋白与RNA结合形成复合体。也就是，本发明的副粘病毒科的病毒载体包含一种复合体，此复合体包含(a)一种来源于副粘病毒的负链单链RNA，此RNA已被修饰而不能表达副粘病毒科病毒的至少一种包膜蛋白，和(b)一种与所述负链单链RNA结合的蛋白。结合负链单链RNA的蛋白指直接或间接结合负链单链RNA，并与此负链单链RNA一起形成RNP复合体的蛋白。通常副粘病毒的负链单链RNA(基因组RNA)与NP、P和L蛋白结合。在这种RNP中所包含的RNA充当病毒基因组转录和复制的模板(Lamb，R.A.和D.Kolakofsky，1996，《副粘病毒科：病毒及其复制》，1177-1204，《病毒学领域》，第3版，Fields，B.N.，D.M.Knipe和P.M.Howley等(主编)，Raven出版社，纽约，N.Y.)。本发明的复合体包括那些包含来源于副粘病毒的负链单链RNA，也包含来源于副粘病毒的与所述RNA结合的蛋白的那些复合体。本发明的载体包含RNP，此RNP包含例如与这些蛋白(NP、P和L蛋白)结合的副粘病毒负链单链RNA。通常副粘病毒RNP复合体能在宿主细胞中自我复制。因而转移到细胞的载体在胞内增殖RNP从而增加基因(复合体中包含的RNA)的拷贝数，由此导致对RNP所携带的外来基因的高水平表达。本发明的载体优选那些能够在转染细胞中复制复合体(RNP)中所含RNA的载体。
除了仙台病毒外，本发明可应用的副粘病毒科病毒还有：麻疹病毒、猴副流感病毒(SV5)和人副流感病毒3，但不局限于此。
通常，修饰病毒载体中所包含的负链单链RNA，以表达NP、P和L蛋白，但不表达F和/或HN蛋白。
对于仙台病毒(SeV)，天然病毒基因组的大小大约为15000个核苷酸，其负链包含编码NP(核衣壳)、P(磷)、M(基质)、F(融合蛋白)、HN(血凝素-神经氨酸酶)和L(大)蛋白的6个基因，它们排成一排，一端紧随3′-短前导区，另一端连接短5′-尾随区。在本发明中，通过在基因组中设计F、HN和M基因中的任一缺陷或它们的组合，可以修饰这个基因组，以使它不能表达包膜蛋白。优选是在F基因和/或HN基因中有缺陷。因为这些蛋白并非RNP形成所必需，所以可通过在有NP、P和L蛋白的情况下转录该基因组RNA(正链或负链)来生产本发明的RNP。例如可在LLC-MK2细胞或类似细胞中形成RNP。通过将分别携带这些蛋白的基因的表达载体导入细胞，可提供NP、P和L蛋白(参看实施例)。也可将每个基因掺入宿主细胞的染色体内。为形成RNP而被表达的NP、P和L基因不需要与载体基因组中编码的那些基因完全相同。也就是说，由这些基因编码的蛋白质的氨基酸序列可能不与由RNP基因组编码的蛋白质的氨基酸序列完全相同，只要它们可结合基因组RNA、并能够在细胞中复制RNP即可。可诱导这些基因发生突变、或用其它病毒的同源基因替换。一旦形成RNP，此RNP的NP、P和L基因将被表达、从而在细胞内自主复制RNP，并产生病毒载体。
如果在细胞内重组一个载体时，一种包膜蛋白感染至细胞，这种包膜蛋白将掺入细胞内，并因其而导致感染性病毒载体的生产。这种载体一旦感染至细胞，虽然它能够在细胞内增殖RNP，但它将不能象来源病毒那样生产包含包膜蛋白的病毒，因为它没有包膜基因。这种载体在诸如基因治疗等安全性要求特别高的领域非常有用。
当一种包膜蛋白因在病毒重组时修饰了负链单链RNA，即基因组包膜基因缺陷而表达受抑制时，通过表达这种包膜蛋白可生产与野生型病毒感染能力相同的病毒载体。表达基因组中缺陷的包膜基因的一部分也是想得到的。例如，对于F和HN基因均有缺陷的基因组，当只表达F蛋白时，可生产以F蛋白为包膜的病毒载体。仅含F蛋白，不含HN蛋白的病毒可作为载体通过唾液酸糖蛋白受体(ASG-R)的介导特异性感染肝细胞。因此，本发明包括副粘病毒科的包含至少一种包膜蛋白的病毒载体，这种包膜蛋白的表达在修饰的负链单链RNA中被抑制。
另外，也可通过应用与那些表达通过修饰负链单链RNA而抑制的包膜蛋白不同的包膜蛋白重建本发明的载体。对这些包膜蛋白的类型没有特别限定。其它病毒包膜蛋白的一个实例是水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白(VSV-G)。本发明副粘病毒科的病毒的载体包括假型病毒载体，其包膜蛋白和基因组来自不同病毒，其包膜蛋白可以是如VSV-G蛋白等。
通常可通过如下方法制备本发明的病毒载体：(a)将编码副粘病毒衍生性负链单链RNA或其互补链的载体DNA引入表达包膜蛋白的细胞(辅助细胞)，以表达所述的RNA，此负链单链RNA已经修饰而不能表达副粘病毒科病毒的至少一种包膜蛋白，以及(b)培养这些细胞、以便从培养物上清液中回收病毒颗粒。通过在载体DNA表达的同时共表达NP、L和P蛋白，形成了RNP，并构建含有包膜蛋白的病毒。
在辅助细胞中所表达的载体DNA编码本发明复合体中所包含的负链单链RNA(负链)或其互补链(正链)。例如，将编码负链单链RNA或其互补链的DNA连接在T7启动子的下游，通过T7 RNA聚合酶转录为RNA。可将载体DNA克隆至质粒中、以在大肠杆菌中进行扩增。尽管在细胞内部转录的链既可是正链、也可是负链，但是为了提高复合体重建效率，可优选安排转录正链。
作为辅助细胞，使用可表达包膜蛋白的细胞。如上所述，辅助细胞并不局限于表达病毒载体中缺陷的包膜基因的各种蛋白，例如，对于F、HN基因-缺陷型仙台病毒载体DNA，仅表达F蛋白的细胞可用作辅助细胞。另外，也可应用表达其它包膜蛋白的细胞，所述其它包膜蛋白与在病毒载体中缺陷的包膜基因所编码的蛋白不同。例如，如上所述，除副粘病毒科病毒的包膜蛋白以外的包膜蛋白，诸如VSV-G蛋白也可作为包膜蛋白使用。
例如，通过将一种表达包膜基因缺陷型重组仙台病毒载体基因组的质粒与表达所述缺陷的包膜蛋白的载体、以及NP、P/C和L蛋白表达载体一起转染至宿主细胞，可重建一种病毒载体。或者，例如可应用其染色体中掺入了F基因的宿主细胞生产RNP复合体。病毒基因组以外的来源所提供的这些蛋白组的氨基酸序列不需要与来源于此病毒的序列完全相同。在将核酸转移到细胞内的方面，只要这些蛋白比那些天然蛋白具有相同或更高活性，那么编码这些蛋白的基因可通过插入某些突变或用其它病毒的同源基因置换来修饰。因为通常情况下许多包膜蛋白具有细胞毒作用，因此可使它们仅在诱导型启动子控制下重建此载体时表达(参看实施例)。
一旦形成了RNP或包含RNP的病毒，将这种RNP或病毒再次导入上述辅助细胞并进行培养，从而扩增本发明的复合体。这种方法包括下面步骤：(a)将包含源自副粘病毒的负链单链RNA和与所述负链单链RNA结合的蛋白的复合体导入可表达包膜蛋白的细胞，此处的负链单链RNA经过修饰而不能表达副粘病毒科病毒的至少一种包膜蛋白，(b)培养这种细胞，并从培养上清液中回收病毒颗粒。
可将RNP与例如脂质转染胺和一种聚阳离子脂质体形成一种复合体，然后导入细胞。尤其是可应用各种转染试剂。这些试剂例如为DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN #301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer #1811169)等。可加入氯喹以防止RNP在内体中分解(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl. Acad.Sci.USA 80：3015)。
一旦在宿主细胞内如此构建了一种病毒载体，可通过使表达包膜蛋白的细胞与这些细胞共培养而进一步增殖所述载体。如实施例12所述，优选的实施例是将表达包膜蛋白的细胞置于生产病毒之上层的细胞的方法。
包膜蛋白除了病毒包膜蛋白外，还可应用嵌合蛋白，此嵌合蛋白在其胞外区包含来源于粘附分子、配体、受体蛋白的多肽并因此可粘附于特定细胞，其胞内区可包含来源于病毒包膜的多肽。因此可生产针对于特定组织的载体。例如，本发明的病毒载体可包含此载体中所含的病毒基因，此基因经修饰能降低抗原性，或提高RNA转录和复制效力。
本发明的病毒载体在它们的负链单链RNA中可包括编码外源基因的RNA。需要在靶细胞中表达的任意基因可用作外源基因。例如，当要进行基因治疗时，可将治疗目标疾病的基因插入病毒载体DNA中。在将外源基因插入病毒载体DNA，例如，仙台病毒载体DNA的情况中，优选在转录终止序列(E)和转录起始序列(S)之间插入一个所含核苷酸数是6的倍数的序列，等等(《病毒学杂志》，第67卷，第8期，1993：4822-4830)。外源基因可插入每个病毒基因(NP、P、M、F、HN和L基因)之前或之后(参看实施例)。将E-I-S序列(转录起始序列-间插序列-转录终止序列)或其部分适当插入到外源基因的前面或后面，以便不干扰外源基因前面或后面的基因的表达。外源基因上游所加入的转录起始序列的类型，基因插入位点和此基因前面或后面的核苷酸序列均可调控所插入的外源基因的表达水平。例如在仙台病毒中，插入位点距负链RNA的3′-端越近(在野生型病毒基因组的基因排列中，距NP基因越近)，此插入基因的表达水平则越高。为了确保外源基因高水平的表达，优选在负链基因组的上游区，诸如在NP基因的上游(负链的3′-端)或NP和P基因之间插入此外源基因。相反，插入位置距负链RNA的5′-端越近(在野生型病毒基因组的基因排列中，距L基因越近)，此插入基因的表达水平则越低。为了将外源基因的表达抑制在低水平，可将外源基因插入到负链的5′-端最远的地方，即野生型病毒基因组中L基因的下游(负链中邻近L基因的5′-端)或L基因的上游(负链中邻近L基因的3′-端)。为了便于外源基因的插入，可在插入位置设计一个克隆位点。例如，可将这个克隆位点安排为限制酶的识别序列。可将外源基因片段插入编码此基因组的载体DNA中的限制酶位点。可将此克隆位点安排为一种所谓的多克隆位点，它包含多个限制酶识别序列。本发明的载体可在除上述以外的插入位点包含外源基因。
例如可根据“Kato，A.等，1997，EMBO J.16：578-587”和“Yu，D.等，1997，《基因细胞》2：457-466”的如下描述构建包含外源基因的重组仙台病毒载体。
首先，制备包含所需外源基因的cDNA核苷酸序列的DNA样品。优选在浓度为25ng/μl或更高时，这个DNA样品可通过电泳确认为单一质粒。下面描述一个实例，其中应用NotI位点将外源基因插入编码病毒基因组的DNA中。当目标cDNA核苷酸序列中包括NotI识别位点时，优选事先通过定点诱变等方法修饰这个核苷酸序列来删除此NotI位点，以便能不改变cDNA编码的氨基酸序列。所需的基因片段可由该DNA样品通过PCR方法扩增和回收。为了使所扩增DNA片段的两个末端均具有NotI位点，并进一步其中一个末端添加仙台病毒的一个拷贝的转录终止序列(E)、间插序列(I)和转录起始序列(S)(EIS序列)，可制备正向合成DNA序列和反向侧合成DNA序列(反义链)作为一对引物，此引物包含NotI限制酶裂解位点序列、转录终止序列(E)、间插序列(I)、转录起始序列(S)和目标基因的一部分序列。
例如，为确保被NotI裂解，可将正向合成DNA序列安排为，在其5′-侧选择任意2个或多个核苷酸(优选除GCG和GCC，即NotI识别位点的起始序列以外的4个核苷酸，更优选ACTT)，在其3′-侧添加NotI识别位点“gcggccgc”，然后在其3′-侧添加任意所需的9个核苷酸或9个核苷酸加上6的倍数的核苷酸作为间隔序列，再于它们的3′侧添加含所需cDNA的起始密码子ATG的大约25个核苷酸的ORF。优选从所需cDNA选择约25个核苷酸作为正向合成DNA序列以便在其3′-端有G或C作为末端核苷酸。
在反向合成DNA序列中，在其5′-侧选择任意2个或多个核苷酸(优选除GCG和GCC，即NotI识别位点的起始序列以外的4个核苷酸，更优选ACTT)，在其3′-侧添加NotI识别位点“gcggccgc”，并进一步在3′-侧添加一种寡DNA作为插入片段以调节长度。该寡DNA应设计为能使总核苷酸数为6的倍数，其中包括NotI识别位点“gcggccgc”、cDNA的互补序列和起始于下面所述病毒的仙台病毒基因组的EIS核苷酸序列(所谓“六的规则”；Kolakofski，D.等，《病毒学杂志》72：891-899，1998)。进一步在所插入片段的3′侧添加仙台病毒S序列的互补序列，优选为5′-CTTTCACCCT-3′；I序列、优选为5′-AAG-3′；和与E序列互补的序列，优选为5′-TTTTTCTTACTACGG-3′；而且从所需cDNA序列的终止密码子起沿其反方向选择含约25个核苷酸的序列的互补序列，调节该互补序列的长度以使G和C为其最后的核苷酸，并将此序列加至所插入片段的3′-端，作为反向侧合成DNA的3′-端。
可应用ExTaq聚合酶(Takara Shuzo)以常规方法进行PCR反应。优选应用Vent聚合酶(NEB)进行PCR，并用NotI酶切消化如此扩增的所需片段，然后将它插入质粒载体pBluescript的NotI位点。用测序仪确定由此获得的PCR产物的核苷酸序列，以选择具有正确序列的质粒。应用NotI从此质粒中切除所插入的片段，并将此片段克隆至携带包膜基因缺陷型基因组cDNA的质粒的NotI位点。或者，也可不经质粒载体pBluescript，直接将此片段插入NotI位点，而获得重组仙台病毒cDNA。
也可在试管或细胞中转录本发明的病毒载体DNA，重建具有病毒L、P和NP蛋白的RNP，和生成包含这种RNP的病毒载体。按照本领域技术人员所熟知的方法、应用表达包膜蛋白的细胞，可由病毒载体DNA重建病毒(WO97/16539和97/16538：Durbin，A.P.等，1997，《病毒学》235：323-332；Whelan，S.P.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392；Schnell，M.J.等，1994，EMBO J.13：4195-4203；Radecke，F.等，1995，EMBO J.14：5773-5784；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.等，1995，EMBO J.14：6087-6094；Kato，A.等，1996，基因细胞1：569-579；Baron，M.D.和Barrett，T.，1997，J.Virol.71：1265-1271；Bridgen，A.和Elliott，R.M.等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：15400-15404)。当使病毒载体DNA在F、HN和/或M基因中有缺陷时，这种缺陷载体不能形成感染性病毒颗粒。然而，也可分别将这些缺陷基因、编码其它病毒包膜蛋白的基因等等转移至宿主细胞中，并在此宿主细胞中对它们进行表达，来形成感染性病毒颗粒。
将病毒载体DNA转移至细胞中的方法包括：1)制备目标细胞可吸收的DNA沉淀物的方法；2)制备含复合体的DNA的方法，所述复合体适于被目标细胞吸收、细胞毒性不是很强并带正电荷；3)即刻间在目标细胞膜上钻孔、通过电脉冲其宽度足以使DNA分子通过的方法。
在方法2)中，可应用各种转染试剂，例如：DOTMA(Boehringer)、Superfect(QIAGEN#301305)、DOTAP、DOPE、DOSPER(Boehringer#1811169)等。方法1)的实例是一种应用磷酸钙的转染方法，在此方法中，将进入细胞的DNA掺入吞噬体中，在核中也掺入足够量(Graham，F.L.和Van Der Eb，J.，1973，《病毒学》52：456；Wigler，M.和Silverstein，S.，1977，《细胞》11：223)。Chen和Okayama研究了转移技术的最佳方法，他们报道最佳DNA沉淀物可在下面条件下获得：1)在35℃、大气中CO2比例为2至4％的条件下，将细胞与DNA一起培养15至24小时，2)应用比线性DNA具有更高沉淀物形成活性的环形DNA，和3)沉淀物混合物中DNA浓度为20至30μg/ml(Chen，C.和Okayama，H.，1987，《分子细胞生物学》7：2745)。方法2)适宜于瞬间转染。本领域技术人员熟知一种旧方法，在这种方法中，按照所需DNA浓度的比率制备DEAE-葡聚糖(Sigma #D-9885，M.W.5×105)混合物以进行转染。因为大部分复合体在内体中分解，所以可加入氯喹以提高转染效果(Calos，M.P.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015)。方法3)是指电穿孔法，它比方法1)和方法2)更通用，因为它没有细胞选择性。方法3)在脉冲电流时间、脉冲形状、电场电位(两电极间的电位差，电压)、缓冲剂的导电性、DNA浓度和细胞密度的最佳条件下是高效的。
在上述3类中，转染试剂(方法2))适宜于本发明，这是因为方法2)易于操作，且易于用大量细胞进行多个检验样品的检测。优选应用Superfect转染试剂(QIAGEN，产品编号301305)或DOSPER脂质体转染试剂(Boehringer Mannheim，产品编号1811169)。
尤其是，可按照下面所述由cDNA重建病毒载体。
在24孔至6孔塑料培养板或直径100mm的培养皿上，应用含有10％胎牛血清(FCS)和抗生素(100单位/ml青霉素G和100μg/ml链霉素)的极限必需培养基(MEM)培养猴肾源LLC-MK2细胞，使其铺满率达70％-80％，并例如用表达T7聚合酶的重组痘苗病毒vTF7-3以2PFU/细胞进行感染。该病毒已在1μg/ml补骨脂素存在下，应用UV照射处理20分钟而灭活(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8122-8126，1986；Kato，A.等，《基因细胞》1：569-579，1996)。可以适当调节补骨脂素的加入量和UV照射时间。感染1小时后，应用质粒(24至0.5μg的pGEM-N、12至0.25μg的pGEM-P和24至0.5μg的pGEM-L，优选1μg的pGEM-N、0.5μg的pGEM-P和1μg的pGEM-L)(Kato，A.等，《基因细胞》1：569-579，1996)与Superfect(QIAGEN)一起通过脂质转染法以2至60μg、优选3至5μg上述重组仙台病毒cDNA转染这些细胞，所述质粒能表达全长仙台病毒基因组的产生所需要的反式作用病毒蛋白。在无血清MEM中培养转染的细胞，如果需要，无血清MEM中可含有利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC)各100μg/ml，优选仅含有40μg/ml阿糖胞苷(AraC)(Sigma)，而且将试剂的浓度设定在最佳、以使痘苗病毒的细胞毒性最小，并且使病毒的回收率最大(Kato，A.等，1996，《基因细胞》1：569-579)。转染后培养约48至72小时以后，回收这些细胞，反复冻融3个循环以破坏细胞，将它们转染至表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞，并且培养。培养3至7天后，收集培养液。或者，通过用表达NP、L和P蛋白的质粒转染已表达了包膜蛋白的LLC-MK2细胞，或者与包膜表达质粒一起转染，可更高效地获得感染性病毒载体。通过培养铺在表达包膜蛋白的LLC-MK2细胞上的这些细胞，可扩增病毒载体(参见实施例)。通过“内点稀释法”测定血凝素(HA)活性可测定培养上清液中所含病毒的滴度(Kato，A.等，1996，《基因细胞》1：569-579)。可在-80℃下储存由此获得的病毒贮存物。
本发明的重组仙台病毒载体可应用例如生理盐水和磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)适当稀释以制备一种组合物。当本发明重组仙台病毒载体在鸡胚等中增殖时，此组合物可包括绒毛尿囊液。含有本发明重组仙台病毒载体的组合物可含有生理上可接受的介质，诸如去离子水、5％葡萄糖水溶液等等，而且还可进一步含有稳定剂和抗生素。
对用于病毒重建的宿主细胞类型不做特别地限制，只要病毒载体可在其中重建即可。例如，在仙台病毒载体的重建中，可应用诸如猴肾源CV-T细胞和LLC-MK2细胞、仓鼠肾源BHK细胞等培养细胞。通过在这些细胞中表达相应包膜蛋白还可获得具有包膜的感染性病毒颗粒。为了获得大量仙台病毒载体，可以扩增此载体，例如通过用从上述宿主细胞中获得的病毒载体与表达包膜基因的载体一起感染鸡胚。或者，可应用掺入包膜蛋白基因的转基因鸡胚生产病毒载体。已经开发了应用鸡胚生产病毒载体(Nakanishi，等(eds.)，1993，神经学研究的高技术协议III，《分子神经细胞生理学》，厚生社，大阪，153-172)。具体是，例如将受精卵放在孵化器中，37℃至38℃孵化9至12天以使胚胎发育。将仙台病毒载体与表达包膜蛋白的载体一起接种到鸡胚的绒毛尿囊腔中，并将它们培养几天以增殖病毒。可根据所用重组仙台病毒类型的不同改变培养时间的长短等条件。随后，回收含有病毒的绒毛尿囊液。按照常规方法进行仙台病毒载体的分离和纯化(Tashiro，M.，“病毒实验方案”，Nagai和Ishihama(编)，Medicalview，68-73页，(1995))。
作为表达包膜蛋白的载体，可以使用本发明病毒载体本身。例如，当将病毒基因组中包膜基因有不同缺陷的两类载体转移至同一个细胞时，一种RNP复合体中缺陷的包膜蛋白可由与此互补的另一种复合体的表达来提供，由此导致感染性病毒颗粒的形成和复制循环的激活从而扩增病毒载体。也就是，当两种或多种载体联合接种至细胞使得彼此互补包膜蛋白时，分别有包膜蛋白缺陷的病毒载体的混合物可大量产生且成本较低。由此生产的混合的病毒可用于疫苗等的生产。由于包膜基因的缺陷，这些病毒比完整病毒的基因组小，所以它们可包含一个长的外源基因。此外，由于这些原本为非感染性的病毒在胞外被稀释，以及由于难以保持它们的共感染，使它们变得不育，因而有利于控制它们不对环境造成污染。
所制备的病毒载体利用治疗性基因充当外源基因时，通过给予此病毒载体可以进行基因治疗。在本发明病毒载体的基因治疗应用中，通过将复合体直接或间接(来自体内)给药，可以表达具有所要疗效的外源基因，或在患者体内供应不足的内源基因。对于外源基因的类型没有特别的限制，除了编码蛋白的核酸外，它们还可为不编码蛋白的核酸，诸如反义核酸或核酶。另外，当将编码与感染性疾病有关的细菌或病毒的抗原的基因充当外源基因时，通过将这些基因给药至动物，可在这些动物中诱导免疫力。也就是说，这些基因可用作疫苗。
当用作疫苗时，本发明的病毒载体可以应用于例如癌症、感染性疾病和其他一般疾病。例如，当治疗癌症时，通过使用本发明的载体，可以在肿瘤细胞或抗原提呈细胞(APC)例如DC细胞上表达具有治疗作用的基因。这样的基因的实例是那些编码肿瘤抗原Muc-1或Muc-1样突变子(mutin)串联重复肽的基因(美国专利第5,744,144)、编码黑素瘤gp100抗原等的基因。这样的基因治疗已经广泛应用于乳腺、结肠、胰腺、前列腺、肺等部位的癌症。在基因治疗中联合使用细胞因子以增强佐剂作用也是有效的。这样的基因的实例是i)单链IL-12和IL-2联用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(15)：8591-8596，1999)，ii)干扰素-γ与IL-2联用(美国专利第5,798,100)，iii)单独使用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，和iv)针对脑肿瘤治疗的GM-CSF与IL-4联用(《神经外科杂志》，90(6)，1115-1124(1999))等。
用于治疗感染性疾病的基因实例是编码以下蛋白的基因，所述蛋白有流感病毒毒力株H5N1的包膜蛋白、日本脑炎病毒的包膜嵌合蛋白(《疫苗》，第17卷，第15-16期，1869-1882(1999))、AIDS病毒的HIV gag或SIV gag蛋白(《免疫学杂志》(2000)，第164卷，4968-4978)、HIV包膜蛋白(其已掺入聚乳酸-乙二醇共聚物微粒中作为口服疫苗给药)(Kaneko，H.等，《病毒学》267，8-16(2000))、霍乱毒素B亚单位(CTB)(Arakawa，T.等，《自然生物工程》(1998)16(10)：934-8；Arakwa，T.等，《自然生物工程》(1998)16(3)：292-297)、狂犬病毒的糖蛋白(Lodmell，D.L.等，1998，《天然药物》4(8)：949-52)和引起宫颈癌的人乳头瘤病毒6型的衣壳蛋白L1(《医学病毒学杂志》，60，200-204(2000)。
基因治疗还可以应用于一般疾病。例如，在糖尿病的情况下，已在I型糖尿病动物模型上通过接种编码胰岛素肽片段的质粒DNA完成了此肽的表达(Coon，B.等，《临床研究杂志》，1999，104(2)：189-94)。
                    附图说明
附图1的照片显示通过F蛋白Cre-Loxp-诱导型表达系统的表达的Western印迹结果。它显示了在与抗Sev-F抗体交叉反应的转移膜上通过化学发光方法检测蛋白的结果。
附图2显示F蛋白的细胞表面展示的分析结果，此蛋白的表达通过Cre-Loxp系统诱导。它表明了用抗SeV-F抗体对LLC-MK2/F7的流式细胞仪的分析结果。
附图3的照片显示通过Western印迹证实所表达的F蛋白被胰蛋白酶裂解的结果。
附图4的照片显示在红细胞表面吸附实验中证实的HN的细胞表面表达。
附图5的照片显示使用表达缺陷蛋白的细胞收获缺陷型病毒的实验所获得的结果。它揭示了：用于F-缺陷型SeV重建的痘苗病毒可以快速阻止辅助细胞系的F蛋白表达。
1.LLC-MK2和CV-1代表相应的细胞系的细胞裂解物。
2.LLC-MK2/F+ad和CV-1/F+ad代表已进行表达诱导并已加入了腺病毒AxCANCre的相应细胞的细胞裂解物。
3.LLC-MK2/F-ad和CV-1/F-ad代表已导入F基因但不含腺病毒AxCANCre的相应细胞系的细胞裂解物。
4.LLC-MK2/F+ad 3rd代表一种细胞裂解物，所述细胞已由腺病毒AxCANCre诱导表达并已再传代3次。
5.1d和3d分别表示诱导表达后1天和3天。
6.Vac1d和Vac3d分别表示痘苗病毒感染后1天和3天的细胞。
7.AraC1d和AraC3d分别表示添加了AraC后1天和3天的细胞。
8.CHX 1d和CHX 3d分别表示添加了蛋白合成抑制剂环己酰亚胺后1天和3天的细胞。
附图6的照片显示将含有GFP的F-缺陷型SeV cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP)转染未表达F的LLC-MK2细胞后观察GFP表达(RNP检测)的结果。在对照组中，F基因在3′端用NP基因改组，然后使用SeV cDNA(F改组型SeV)，其中已将GFP引入F缺陷位点。标志“all”表示用指导NP基因、P基因和L基因表达的质粒(pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L)和SeV cDNA同时转染的细胞；“cDNA”表示仅用cDNA(pSeV18+/ΔF-GFP)转染的细胞。在RNP转染中，收集表达GFP的P0细胞；将所述细胞(107细胞/ml)悬浮在Opti-MEM(GIBCO BRL)中；冻-融3次所得裂解物取100μl与25μl阳离子脂质体DOSPER(Boehringer Mannheim)混合，室温静置15分钟；将该混合物加入已经诱导了F表达的细胞(+ad)中，以实现RNP转染。表达Cre DNA重组酶的细胞(其中未引入重组腺病毒〕用作对照细胞(-ad)。结果显示：GFP的表达取决于LLC-MK2的P0细胞中Sev RNP的生成；F缺陷型病毒的扩增取决于F在P1中表达的诱导。
附图7的照片显示F-缺陷型基因组cDNA重建的功能性RNP是否可以通过表达F的辅助细胞来拯救并形成该缺陷病毒的感染性病毒颗粒的研究结果。RNP/o代表包覆了RNP的细胞；RNP/t代表用RNP转染的细胞。
附图8的照片显示F表达细胞中F缺陷病毒的特异性生长证据。如实施例2所述将含有由从缺乏该基因的基因组构建的功能性RNP的裂解物脂质转染至表达F的细胞中；然后回收此培养物上清液。将此培养物上清液加入表达F的细胞的培养基中以完成感染；在第三天，回收培养物上清液，并同时加入表达F的细胞和没有表达F的细胞；然后在有或没有胰蛋白酶存在的条件下将这些细胞培养3天。结果显示于此。病毒仅在有胰蛋白酶存在的条件下在F表达细胞中扩增。
附图9的照片显示F缺陷病毒在引入表达F的细胞后向培养物上清液中的特异性释放。如实施例2所述，将含有从缺乏所述基因的基因组中构建的功能性RNP的裂解物脂质转染至表达F的细胞中，然后回收培养物上清液。将此培养物上清液加入表达F的细胞的培养基中以实现感染；在第三天，回收培养物上清液，并同时加入表达F的细胞和没有表达F的细胞；然后在有或没有胰蛋白酶存在下将这些细胞培养3天。下图显示未表达F的细胞的上清液的结果。
附图10的照片显示从表达F的细胞的培养物上清液中回收病毒、提取总RNA并用F和HN作为探针进行Northern印迹分析以检验从F缺陷型cDNA中回收的病毒颗粒的基因组结构的结果。在从表达F的细胞所回收的病毒中，检测出HN基因，但F基因检测不到；因此可以明显看出：F基因不存在于病毒基因组中。
附图11的照片显示RT-PCR结果，它说明GFP基因位于F缺失的基因座上，如在cDNA的构建中一样。1：+18-NP，证实了+18NotI位点的存在。2：M-GFP，证实了GFP基因存在于F基因缺陷位点上。3：F基因，证实了F基因的存在。野生型SeV和F缺陷的表达GFP的SeV的基因组结构显示于上图。它证实了：GFP基因存在于F缺陷基因座中，来源于+18的NotI位点存在于NP的3′端，F基因在RNA基因组的任何部分均不存在。
附图12显示了如下照片，它是通过使用胶体金结合型IgG(抗-F、抗-HN)与病毒的F或HN进行特异性反应后，经免疫电镜检查而获得的。可以明显地看出：病毒包膜的刺突样结构含有F和HN蛋白。
附图13显示RT-PCR结果，它说明：除GFP基因外的其他基因的结构均与野生型相同。
附图14的照片显示用电子显微镜检查F缺陷病毒颗粒的形态的结果。象野生型病毒颗粒一样，F缺陷病毒颗粒内部具有螺旋状RNP结构和刺突样结构。
附图15的照片显示用高效F缺陷型SeV载体体外基因转移至各种细胞的结果。
附图16显示将F缺陷型SeV载体引入小鼠(BM c-kit+/-)的原代骨髓细胞的分析结果。空心柱代表PE+/GFP-；实心柱代表PE+/GFP+。
附图17的照片显示载体向小鼠脑室体内给药的结果。
附图18的照片显示使用从表达F的细胞中回收的含有F缺陷SeV病毒的培养物上清液感染没有表达F的LLC-MK2细胞，在有或没有胰蛋白酶存在下将这些细胞培养3天、通过HA试验证实病毒在上清液中的存在。
附图19的照片显示用来自附图18B的HA阳性鸡胚的绒毛尿囊液(泳道11和12)接种鸡胚，培养2天后取绒毛尿囊液进行HA试验的结果。
附图20的照片显示用免疫电镜检查HA阳性无感染性病毒液的结果。证实了病毒颗粒的存在，并发现病毒体包膜与识别胶体金标记型HN蛋白的抗体反应，但不与识别胶体金标记型F蛋白的抗体反应。
附图21的照片显示将F缺陷病毒颗粒转染入细胞的结果。
附图22的照片显示共表达F和HN的细胞的产生，它是用蛋白质印迹评价的。LLC/VacT7/pGEM/FHN代表用pGEM/FHN质粒转染已被痘苗病毒感染的LLC-MK2细胞而获得的细胞；LLC/VacT7代表痘苗病毒感染的LLC-MK2细胞。LLCMK2/FHNmix代表引入F和HN基因但未对其克隆的LLC-MK2细胞。LLC/FHN代表引入了F和HN基因并且通过腺病毒诱导其表达(3天后)的LLC-MK2细胞；1-13、2-6、2-16、3-3、3-18、3-22、4-3和5-9是克隆中细胞系的序号(命名)。
附图23的照片显示对病毒的产生取决于pGEM/FHN的存在的证实结果。混合FHN-缺陷的表达GFP的SeV cDNA、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和pGEM/FHN，并将其引入LLC-MK2细胞中。基因转移的3小时后，用含有AraC和胰蛋白酶的MEM更换培养基，然后进一步培养细胞3天。基因转移的2天后，用体视荧光显微镜进行观察以评价因pGEM/FHN存在与否而产生的差异，并根据GFP表达细胞的扩散证实病毒的产生。此结果显示于此。当在重建时加入pGEM/FHN，可以观察到GFP表达的细胞的扩散；但当没有加入pGEM/FHN时，仅仅在单个细胞中可以观察到GFP的表达。
附图24的照片显示通过RNP转染的重建结果和FHN缺陷病毒增殖的结果。在诱导表达后的第3天，用P0 RNP上层或者DOSPER对共表达FHN的细胞(12个孔)进行脂转染，4天后观察到GFP。当进行RNP转染时，表达FHN的P1细胞成功收获了病毒，与F缺陷细胞(最上图)一样。细胞用ADe/Cre感染，6小时或更长时间后，诱导FHN蛋白质的表达，然后将含有FHN-缺陷型表达的液体接种至所述细胞，检验这种病毒的增殖。
附图25的照片显示将含有从FHN缺陷但表达GFP的cDNA重建的病毒的液体接种至LLC-MK2、LLC-MK2/F、LLC-MK2/HN和LLC-MK2/FHN，并在有或没有胰蛋白酶存在下培养它们的结果。培养3天后，证实了表达GFP蛋白的细胞的扩散。结果显示于此。仅LLC-MK2/FHN可以观察到GFP的扩散，因此可以证实：在液体中所含的病毒以一种特异于FHN共表达且依赖于胰蛋白酶的方式生长。
附图26的照片显示对来源于FHN表达细胞上清液的RNA的基因组结构进行证实的结果。
附图27的照片显示对来源于已被FHN缺陷病毒感染的F表达细胞上清液的RNA的基因组结构进行证实的结果。
附图28显示当在补骨脂素/UV照射中补骨脂素浓度发生变化时痘苗病毒的灭活及T7活性。
附图29显示在补骨脂素/UV照射中UV照射时间发生变化时痘苗病毒的灭活及T7RNA聚合酶活性。
附图30的照片显示补骨脂素/UV照射后痘苗病毒的细胞毒性(CPE)的照片。将3×105LLC-MK2细胞置于6孔平板上。培养过夜后，用痘苗病毒以感染复数(moi)＝2感染细胞。24小时后，测定CPE。痘苗病毒伪(mock)处理后的CPE显示于A中；用痘苗病毒处理15分钟、20分钟或30分钟后的CPE分别显示于B、C和D中。
附图31显示痘苗病毒UV照射的时间对仙台病毒重建效率的影响。
附图32显示仙台病毒重建实验后在细胞中所残留的具有复制能力的痘苗病毒的滴度。
附图33显示利用抗VSV-G抗体进行的Western印迹分析结果。
附图34显示利用抗VSV-G抗体进行的流式细胞计量术分析结果。它显示了在AxCANCre感染(moi＝0、2.5、5)后第4天LLC-MK2细胞系(L1)中对VSV-G表达的诱导作用的分析结果。所用的第一抗体是抗VSV-G抗体(MoAbI-1)；第二抗体是FITC标记的抗小鼠Ig。
附图35的照片显示以下结果，其中用不同量的AxCANCre(MOI＝0、1.25、2.5、5、10)和恒定量的具有F基因缺陷型基因组的假型仙台病毒感染后，回收上清液，再将此上清液用于在VSV-G诱导前(-)和诱导后(+)感染细胞，5天后可以观察到表达GFP的细胞。
附图36显示病毒产生量随时间的变化。
附图37显示用表达VSV-G的细胞系建立的具有F缺陷型基因组的假型仙台病毒用抗VSV抗体处理的FHN缺陷型仙台病毒所进行的处理对感染性是否具有影响的检查结果。
附图38显示以下结果，其中测定GFP基因的表达并将其作为一种指标以确定在用含有GFP基因的F和HN缺陷型仙台病毒感染VSV-G基因表达细胞LLCG-L1后，在衣壳中携有VSV-G的假型病毒的产生。
附图39显示，通过对感染的细胞提取物中蛋白质的Western分析，证实了在表达VSV-G基因的细胞中所增殖的病毒在F和HN基因上具有缺陷。
附图40显示荧光显微镜下GFP表达细胞的观察结果。
附图41显示通过联合使用包膜表达质粒和细胞上层使SeV/ΔF-GFP的重建效力提高。P0代(传代前)在第3天至第4天可以观察到显著的提高。
附图42显示以下结果，其中对通过联合使用表达包膜的质粒和细胞复层进行的SeV/ΔF-GFP重建的处理条件进行评价。阳性GFP细胞代表了重建病毒的数量。
附图43显示以下结果，其中对cDNA中的F缺陷仙台病毒的拯救作用进行评价。它表明：通过联合使用表达包膜的质粒和细胞复层、提高了SeV/ΔF-GFP的重建效力。在第7天所有实验均为阳性。在第3天(其成功的可能性是适中范围)对其效力进行评价。
附图44表示通过用携带LacZ而不含有GFP的F缺陷仙台病毒载体LacZ表达的结果。
附图45显示亚克隆仙台病毒基因组cDNA片段(A)和用新导入的NotI位点(B)构建的5种类型仙台病毒基因组cDNA的结构。
附图46显示质粒结构，此质粒是为了克隆以增加NotI位点、转录起始信号、插入序列和将转录终止信号转录入SEAP所使用的。
附图47显示每种仙台病毒载体的噬斑测定结果。在由LAS1000获得的噬斑测定中显示了部分荧光图。
附图48表示在每种仙台病毒中对报道基因(SEAP)表达水平之差异的比较。SeV18+/SEAP的数据取作100，它们分别表示相对值。我们发现：当SEAP基因被放置于更下游时，此活性，即表达水平，降低。
附图49表示GFP在共表达FNH的P1细胞中表达的显微照片。
附图50表示使用了抗F抗体(抗-F)、抗HN抗体(抗-HN)和抗仙台病毒抗体(抗-SeV)对VSV-G假型SeV/ΔF：GFP感染的细胞提取物进行蛋白质印迹分析的结果。
附图51表示在中和抗体(VGV抗体)存在或不存在下用VSV-G假型SeV感染的F和HN缺陷细胞的GFP荧光照片。
附图52为具有F基因缺陷或F基因和HN基因缺陷基因组的VSV-G假型仙台病毒所作的蛋白质分析照片，它是通过密度梯度超速离心分级分离的。
附图53显示具有F基因缺陷基因组的仙台病毒、或具有F基因缺陷或F基因和HN基因缺陷基因组的VSV-G假型仙台病毒介导的血凝试验的照片。
附图54表示对具有F基因缺陷基因组的仙台病毒或VSV-G假型仙台病毒的培养细胞感染特异性。
附图55证实表达NGF的F缺陷型仙台病毒(NGF/SeV/ΔF)结构的照片。
附图56表明通过用F缺陷SeV感染的携带NGF的细胞所表达的NGF的活性。在培养的开始，将SeV感染细胞的稀释上清液或NGF蛋白(对照)加入初生鸡背根神经节(DRG)神经原的分离的培养物中。3天后，通过用线粒体还原活性作为指标(n＝3)计算生长发育的细胞数。所加的培养物上清液的稀释量相当于1/1000。
附图57表明通过用F缺陷型SeV感染的携带NGF的细胞所表达的NGF的活性。在培养的开始，将SeV感染细胞的稀释上清液或NGF蛋白(对照)加入初生鸡背根神经节(DRG)神经原的分离的培养物中。3天后，在显微镜下观察样品。
(A)对照(不含NGF)；
(B)添加NGF蛋白质(10ng/mL)；
(C)添加NGF/SeV感染细胞的培养物上清液(100倍稀释)；
(D)添加NGF/SeV感染细胞的培养物上清液(100倍稀释)；
(E)添加NGF/SeV/ΔF感染细胞的培养物上清液(100倍稀释)，
(F)添加NGF/SeV/ΔF-GFP感染细胞的培养物上清液(100倍稀释)。
附图58显示Ad-Cre感染复数和F蛋白质表达水平。
附图59表明用Adeno-Cre表达LLC-MK2/F。
附图60表明传代期间表达的持久性。
附图61表明传代期间F蛋白的定位。
附图62表明GFP-CIU和抗SeV-CIU之间的相互关系。
               本发明的最佳实施方式
结合下面实施例对本发明详细说明，但并不限制于此。
[实施例1]F缺陷型仙台病毒的构建
<1>F缺陷型SeV基因组cDNA和表达F的质粒的构建
用SphI/KpnI消化仙台病毒(SeV)全长基因组cDNA，pSeV18+b(+)(Hasan，M.K.等，1997，《普通病毒学杂志》78：2813-2820)(“pSeV18+b(+)”也被称作“pSeV18+”)，回收所得的片段(14673bp)并克隆入pUC18，名为质粒pUC18/KS。在此pUC18/KS上构建F缺陷的位点。通过联合使用PCR连接反应的方法，完成F基因的缺陷，结果，去掉了F基因(ATG-TGA＝1698bp)的ORF；因此将如此的atgcatgccggcagatga(SEQ ID NO：1)在EcoT22I位点连接于其上以构建F缺陷型SeV基因组cDNA(pSeV18+/ΔF)。在PCR中，将通过使用一个引物对(正向：5′-gttgagtactgcaagagc/SEQ ID NO：2，反向：5′-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/SEQ ID NO：3)所产生的一种PCR产物连接于F的上游，将通过使用一个引物对(正向：5′-atgcatgccggcagatga/SEQ ID NO：4，反向：5′-tgggtgaatgagagaatcagc/SEQ IDNO：5)所产生的另一种PCR产物连接于F基因的下游。所得质粒用SacI和SalI消化，然后回收此片段(4931bp)，此片段含有F缺陷位点区域，并克隆入pUC18以产生pUC18/dFSS。用DraIII消化此pUC18/dFSS。回收所得片段，并用一个来自于含有pSeV18+的F基因的区域的DraIII片段取代；进行连接反应以产生质粒pSeV18+/ΔF。
再者，为了构建一个其中已经在F缺陷位点上携带EGFP基因的cDNA(PSeV18+/ΔF-GFP)，通过PCR将EGFP基因扩增。为了建立6的倍数的EGFP基因(Hausmann，S.等，RNA 2，1033-1045(1996))，对5′端，用一种NsiI尾的引物(5′-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac：SEQ序列号：6)、而对3′端用一种NgoMIV尾的引物(5′-Tgccggctattattacttgtacagctcgtc：序列号：7)进行PCR。PCR产物用限制酶NsiI和NgoMIV消化，然后从凝胶中回收此片段；将此片段连接于pUC18/dFSS的F缺陷位点，此位点为NsiI和NgoMIV限制酶位点，并对该序列进行测定。去掉含有EGFP基因的DraIII片段，并从此位点回收，并在含有PSeV18+F基因的区域替代一种DraIII片段；然后进行连接以获得质粒PSeV18+/ΔF-GFP。
另一方面，为了获得质粒pCALNdLw/F，通过用PCR扩增SeVF基因、确定序列、并插入质粒pCALNdlw的唯一位点SwaI，来构建用于F基因表达的Cre/loxP诱导型表达质粒(Arai等，《病毒学杂志》72，1998，p1115-1121)，其中将基因产物的表达设计为通过Cre DNA重组酶诱导。
<2>诱导SeV-F蛋白质表达的辅助细胞的制备
为了从F缺陷基因组中回收感染的病毒颗粒，建立表达SeV-F蛋白质的辅助细胞菌株。所采用的细胞为LLC-MK2细胞，此细胞通常用于SeV的增殖、并且是一种来源于猴肾的细胞菌株。在37℃，5％CO2下，在含有10％热处理过的固定的胎牛血清(FBS)、青霉素G钠(50单位/ml)和链霉素(50μg/ml)的MEM中培养LLC-MK2细胞。由于SeV-F基因产物具有细胞毒性，按照基因转移方案用磷酸钙方法(哺乳动物转染试剂盒(Stratagene))将上述质粒pCALNdLw/F导入LLC-MK2细胞，此质粒pCALNdLw/F是为通过Cre DNA重组酶诱导F基因产物的表达所设计的。
将10μg质粒pCALNdLw/F导入在一个10cm的平板上已增殖为40％融合的LLC-MK2细胞中，用10ml含有10％FBS的MEM于培养箱中，在37℃，5％CO2下，培养该细胞。24小时后，刮掉该细胞，并悬浮于10ml介质中；然后将此细胞置于5个MEM(此MEM含有10ml10％FBS和1200μg/ml G418(GIBCO-BRL)皿中直径10cm(一个皿含有5ml；两个皿含有2ml；两个皿含有0.2ml)以进行培养。每隔2天换一次培养基，连续培养14天，以选择其中基因稳定转染细胞系。采用克隆环回收30个细胞菌株作为介质中所生长的G418抗性细胞。所得每个克隆在10cm平板上连接培养至细胞融合。
用表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒AxCANCre对每一个克隆感染后，如下所述，通过蛋白质印迹用抗SeV-F蛋白单克隆IgG(f236；《生物化学杂志》123：1064-1072)检验细胞的SeV-F蛋白质表达。
在一个6cm皿中增殖融合后，按照Saito等的方法以感染复数＝3的腺病毒AxCANCre对每一个克隆进行感染(Saito等，《核酸研究》23：3816-3821(1995)；Arai，T.等，《病毒学杂志》72，1115-1121(1998))。感染后，对细胞进行培养3天。弃去培养物上清液，用PBS缓冲液冲洗细胞两次，用一刮刀刮掉细胞，并通过以1500xg离心5分钟收集。
细胞在-80℃下保存，当使用时将其融化。将所收集的细胞悬浮于150μlPBS缓冲液中，然后将同等数量的装有缓冲液(0.625 M Tris，pH6.8，5％SDS，25％2-ME，50％甘油，0.025％BPB；Owl)的2x Tris-SDS-BME样品加入其中。在98℃下热处理该混合物3分钟，然后用作电泳样品。将样品(1×105细胞/泳道)通过电泳在SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Multi Gel 10/20，第一化学)中分级分离。通过半干印迹将分级分离的蛋白质转移至一个PVDF转移膜(Immobilon-P转移膜；Millipore)上。转移所使用的转移膜是在已经在100％甲醇中浸泡30秒并且在水中浸泡30分钟的转移膜，以1mA/cm2不变的电流下进行转移1小时。
将转移膜在含有0.05％吐温20和1％BSA的封闭溶液(BlockAce；雷印产品)中振荡1小时，然后用一种抗SeV-F抗体(f236)在室温下培养2小时，此抗体已经用一种含有0.05％吐温20和1％BSA的封闭溶液稀释了1000倍。将转移膜用20ml的PBS-0.1％吐温20振荡5分钟，冲洗3次，然后在PBS缓冲液振荡5分钟再冲洗。将转移膜在室温下在10ml过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体(山羊抗小鼠IgG；Zymed)中培养1小时，此抗体用含有0.05％吐温20和1％BSA的封闭溶液稀释了2000倍。将转移膜用20ml的PBS-0.1％吐温20振荡5分钟冲洗3次，然后用PBS缓冲液振荡5分钟再冲洗。
通过化学发光方法(ECL蛋白质印迹检测试剂；Amersham)在转移膜上对与抗SeV抗体交叉反应的蛋白质进行检测。结果如图1所示。对AxCANCre特异性感染的SeV-F表达进行了检测、以证实能够诱导产生一种SeV-F基因产物表达的LLC-MK2细胞。
通过流式细胞计数用一种抗SeV-F抗体、对几种所得细胞系中的一种LLC-MK2/F7细胞，进行了分析(附图2)。也就是说，通过以15,000rpm在4℃下离心5分钟沉淀1×105个细胞，并用200μlPBS冲洗，然后使之在PBS中、4℃下与含有100倍稀释的抗F单克隆抗体(f236)、0.05％叠氮化钠、2％FCS的FACS(日研化学)避光反应1小时。将此细胞再以15,000rpm在4℃下沉淀5分钟，用200μlPBS冲洗，然后在冰上使之与1μg/ml的FITC标记的抗小鼠IgG(CAPPEL)反应30分钟。然后再用200μlPBS冲洗细胞，并接着通过以15,000rpm在4℃下离心5分钟沉淀。将此细胞悬浮于1mlFACS的PBS中，然后通过使用EPICS ELITE(Couter)氩激光在488nm的激发波长和525nm的荧光波长对细胞进行分析。结果显示：LLC-MK2/F7以特异性诱导SeV-F基因表达的方式对抗体具有高的反应性，因此证实了：SeV-F蛋白质在细胞表面的表达。
[实施例2]对由辅助细胞表达的SeV-F蛋白质功能的确认
对由辅助细胞诱导的SeV-F蛋白质是否保持原来的蛋白质功能进行试验。
在将LLC-MK2/F7细胞播种于一个6cm皿并增殖至融合后，按照Saito等的方法以感染复数＝3用腺病毒AxCANCre感染(如上所述)。然后，在一个培养箱中，在37℃、5％CO2条件下，在含有胰蛋白酶(7.5μg/ml；GIBCOBRL)的MEM(不含血清)中培养该细胞3天。
弃去培养物上清液，将细胞用PBS缓冲液冲洗两次，用一刮刀刮掉，并通过以1500xg离心5分钟收集。如上所述(附图3)通过蛋白质印迹证实：表达F的蛋白质通过胰蛋白酶发生了裂解。合成SeV-F蛋白质作为F0，F0是一种没有活性的蛋白质前体，然后在通过胰蛋白酶发生酶解被消化为两个亚单位F1和F2后，此前体被活化。在如此诱导F蛋白质表达后，LLC-MK2/F2细胞象普通细胞一样连续表达F蛋白质，甚至在传代后，观察到：没有出现由表达F蛋白质介导的细胞毒性，表达F蛋白质的细胞也没有出现细胞融合。然而，当SeV-HN表达质粒(pCAC/SeV-HN)被转染至表达F的细胞并且将该细胞在含有胰蛋白酶的MEM中培养3天后，可以频繁地观察到细胞融合。红细胞在细胞表面的吸收实验(血吸收测定；Had测定)中证实了HN在细胞表面上的表达(附图4)。也就是说，以1ml/皿的浓度向培养物细胞中加入1％鸡红细胞，并将该混合物在4℃下静置10分钟。用PBS缓冲液冲洗细胞三次，然后观察到红细胞菌落在细胞表面上。对于红细胞聚集于其上的细胞，可以观察到细胞融合；我们发现细胞融合是通过F蛋白质与HN的相互作用诱导的；因此它说明：F蛋白质(它的表达在LLC-MK2/F7中持续)保持有其原有的功能。
[实施例3]具有F缺陷型基因组的功能性RNP和病毒颗粒的形成
为了从缺陷型病毒中回收病毒颗粒，有必要使用表达缺陷蛋白质的细胞。因此，尝试用表达缺陷蛋白质的细胞回收此缺陷病毒时，但是我们发现：通过辅助细胞系的F蛋白质的表达由于在F缺陷SeV中所用的痘苗病毒而很快停止(附图5)，因此基于从辅助细胞系中直接供应F蛋白质的病毒重建失败了。曾经有报道：痘苗病毒的复制能力丧失，但是通过在所加入的补骨脂素(PLWUV处理)的存在下用长波长的紫外光(长波长UV)处理痘苗病毒(Tsung等，《病毒学杂志》70，165-171，1996)，T7表达的活性没有减弱。因此，尝试通过使用PLWUV处理的痘苗病毒(PLWUV-VacT7)进行病毒的重建。装有5个15瓦灯泡的UV Stratalinker 2400(商品目录编号400676(100V)；Stratagene，La Jolla，CA，美国)用于紫外光照射。结果表明：重建中所用的表达F的细胞抑制了F蛋白质的表达，但是用此PLWUV-VacT7重建的细胞的裂解物被感染至辅助细胞后，痘苗在araC存在下几乎不生长，我们还发现：通过辅助细胞系的F蛋白质的表达几乎不受影响。再者，使用此PLWUV-VacT7的重组野生型SeV的重建，可以从甚至103的细胞中回收病毒，然而通过以前的方法，这是不可能的，除非具有105或更多的细胞，这样大大提高了病毒重建的效力。因此，使用此方法尝试了F缺陷SeV病毒的重建。
<F缺陷SeV病毒的重建和扩增>
按照6n原则以下述的方式用上面提到的增强的绿荧光蛋白质(EGFP)基因被导入其中作为报道基因的pSeV18+/ΔF-GFP，将LLC-MK2细胞转染入其中F缺陷位点后，观察了GFP的表达。我们还评价了：病毒来源的基因NP、P和L(它们是形成RNP所需要的三种成分)所产生的影响。
以5×106细胞/皿的浓度，将LLC-MK2细胞播种于一个100mm的培养皿上，并培养24小时。培养完成后，用补骨脂素处理细胞，并用长波长(365nm)的紫外光照射20分钟，在室温下，用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国83，8122-8126(1986))感染细胞1小时(感染复数＝2)(感染复数＝2至3；优选感染复数＝2)。冲洗细胞三次后，将质粒pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A.等，《基因细胞》1，569-579(1996))分别悬浮于数量为12μg、4μg、2μg和4μg/皿的最适MEM(GIBCO)中；向其中加入SuperFect转染试剂(1μgDNA/5μl SuperFect；QIAGEN)，在室温下静置混合物10分钟；最后将其加入3ml含有3％FBS的最适MEM中，将细胞加入其中并培养。使用野生型SeV基因组cDNA(p SeV(+))进行相同实验(Kato，A.等，《基因细胞》1，569-579(1996))作为代替pSeV18+/ΔF-GFP的对照。培养3小时后，用不含血清的MEM冲洗细胞两次，然后在含有胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，40μg/ml；Sigma)和胰蛋白酶(7.5μg/ml；GIBCO)的MEM中培养70小时。收集这些细胞，并将此粒状沉淀悬浮于最适MEM(107细胞/ml)中。冻融处理重复三次后，将细胞与脂转染试剂DOSPER(Borhringer Mannheim)(106细胞/25μl DOSPER)混合，并在室温下静置15分钟。然后转染至能够表达F的LLC-MK2/F7细胞系(在12孔的平板中，106细胞/孔)，然后在不血清的(含有40μg/ml AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶MEM中培养细胞。
结果表明：只有当所有的三种来源于病毒的成分NP、P和L均存在时，才可以证实GFP的表达，才能够产生表达外源基因的缺陷病毒RNP(附图6)。
<F缺陷型病毒颗粒的确认>
我们研究可通过上述方法由F缺陷基因组cDNA重组的功能性RNP，是否可以由表达F的辅助细胞拯救并形成F缺陷病毒的感染性病毒颗粒。将细胞裂解物与阳离子脂质体混合；在其中功能性RNP已经形成的条件(其中pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L被同时转染的条件)下，或在功能性RNP没有形成的条件(其中两种质粒pSeV18+/ΔF-GFP和pGEM/NP被转染的条件)下，如上所述，通过冷冻/融化从重建的细胞中制备裂解物；将此裂解物质脂质转染入表达F的细胞和无表达细胞中；基于表达GFP细胞破坏的扩展，可以观察到病毒颗粒的产生。结果显示：只有当通过使用一种在其中功能性RNP被重建的条件下所获得的裂解物导入表达F的细胞时，才可识别表达GFP细胞的分布扩展(附图7)。再者，甚至在噬斑测定中，仅仅在此相同条件下，观察到噬斑的形成。从这些结果中可以发现：从F缺陷病毒基因组中产生的功能性RNP、在来源表达F细胞蛋白质的存在下，还可以进一步转化为感染性病毒颗粒，并且此颗粒可以从细胞中释放。
下列实验证实了感染性F缺陷病毒颗粒存在于培养物上清液中。如实施例2所述，将含有从F基因缺陷型基因组中构建的功能性RNP的裂解物脂质转染至表达F的细胞，并回收培养物上清液。将此培养物上清液加入表达F细胞的培养基中以达到感染；在第三天，回收此培养物上清液，同时加入表达F细胞和非表达F细胞中；然后在有或没有胰蛋白酶存在下对此细胞进行培养三天。在表达F的细胞中，病毒仅仅在胰蛋白酶存在下被扩增(附图8)。还发现：没有感染的病毒颗粒被释放到非表达F的细胞的上清液中(在附图9的底面)或从没有胰蛋白酶所培养的表达F的细胞中释放。上述总结如下：F缺陷表达GFP病毒的增殖对表达F的细胞具有特异性，并且取决于胰蛋白酶的蛋白酶解。如此增殖的感染性F缺陷型的仙台病毒的滴度范围为0.5×107至1×107CIU/ml。
[实施例4]F缺陷型表达GFP病毒的分析
为了证实从F缺陷cDNA中回收的病毒颗粒基因组结构，从表达F细胞的培养物上清液中回收病毒，提取总RNA，然后用F和HN作为探针进行RNA印迹分析。结果显示：在从表达F的细胞中收集的病毒中，可以检测到HN基因，但是检测不到F基因，而且F基因在病毒的基因组中不存在(附图10)。再者，通过RT-PCR的GFP基因，可以证实：该基因存在于F缺陷基因座中，正如在cDNA的构建中所示(附图11)。其他基因的结构与那些来源于野生型的相同。基于以上发现，表明：在病毒的重建中，没有发生基因组的重排。另外，通过电子显微镜研究了回收的F缺陷病毒颗粒的形态。象野生型病毒一样，F缺陷病毒颗粒其内部具有螺旋RNP结构和突起样结构(附图14)。而且，通过用特异性地与F或HN反应的胶体金共轭IgG(抗F、抗HN)对此病毒进行免疫电镜检检测。结果表明：病毒包膜的突起样结构由F和HN蛋白组成(附图12)，它表明：由辅助细胞产生的F蛋白质被有效地掺入病毒颗粒。此结果将详细描述于下。
<总RNA的提取、RNA印迹分析和RT-PCR>
使用OIAamp病毒RNA迷你试剂盒(QIAGEN)在病毒感染表达F的细胞LLC-MK2/F7 3天后所获得的培养物上清液中按照方案提取总RNA。在一种含有甲醛的1％变性的琼脂糖凝胶中通过电泳分离提纯总RNA(5μg)，然后转移至一个真空印迹装置中的一个Hybond-N+膜(Amersham-Pharmacia)上。用0.05M NaOH固定所制备的膜，用2倍稀释的SSC缓冲液漂洗(Nacalai tesque)，然后在一种杂交溶液(Boehringrer Mannheim)中进行预杂交30分钟；将一个通过使用毛地黄毒苷(DIG)-dUTP(碱敏感性)的随机原始DNA标记(DIG DNA标记试剂盒；Boehringrer Mannheim)所制备的F或HN基因的探针加入其中，然后进行杂交16小时。然后，冲洗此膜，并使之与碱性磷酸酶标记抗DIG抗体(抗毛地黄毒苷-AP)反应；通过使用一个DIG检测试剂盒进行分析。结果表明：在从表达F的细胞中收集的病毒中，可以检测出FN基因，但检测不到F基因；F基因不存在于病毒基因组中(附图10)。
再者，通过RT-PCR进行详细的分析。在RT-PCR中，按照方案通过使用SUPERSCRIPTII预扩增系统(Gibco BRL)从纯化的病毒RNA中合成第一链cDNA；对于LA PCR试剂盒(TAKARA ver2.1)使用下面的PCR的条件：94℃/3分钟；94℃/45秒、55℃/45秒、72℃/90秒的扩增30个循环；在72℃下培养10分钟；然后将样品在2％琼脂糖凝胶上以100v电泳30分钟，用溴乙锭染色并照相。用于证实M基因和EGFP被插入F缺陷位点所用的引物是正向1：5′-atcagagacctgcgacaatgc(SEQ ID NO：8)和反向1：5′-aagtcgtgctgcttcatgtgg(SEQ ID NO：9)；用于证实EGFP被插入F缺陷位点和HN基因是正向2：5′-acaaccactacctgagcacccagtc(SEQ ID NO：10)和反向2：5′-gcctaacacatccagagatcg(SEQ ID NO：11)；M基因和HN基因之间的连接通过使用正向3：5′-acattcatgagtcagctcgc(SEQ ID NO：12)和反向2引物(SEQ IDNO：11)而证实。结果表明：GFP基因存在于F的缺陷基因座中，如cDNA的构建中所示(附图11)，其他基因的结构均与那些来源于野生型的相同(附图13)。从上面可以明显地看出：在病毒重建期间，基因组没有发生重排。
<用胶体金免疫标记的IgG进行的电镜分析>
通过电镜研究回收的F缺陷病毒颗粒的形态。首先，将用缺陷型病毒感染细胞的培养物上清液以28,000rpm离心30分钟获得病毒的粒状沉淀；将此粒状沉淀以1×109HAU/ml的浓度再悬浮于10倍稀释的PBS中；将一滴悬浮液滴入具有支持滤膜的微栅极上，然后在室温下将此栅极干燥；为固定，用含有3.7％福尔马林的PBS固定15分钟，然后用含有0.1％BSA的PBS溶液预处理30分钟；而且，将用相同的溶液稀释200倍的抗F单克隆抗体(f236)或抗HN单克隆抗体(Miura，N.等，《实验研究》(1982)141：409-420)滴在栅级上，同样使之在一种潮湿的条件下反应60分钟。然后，用PBS冲洗栅级，然后滴进稀释了200倍的胶体金标记的抗小鼠IgG抗体，并使之在一种潮湿的条件下反应60分钟。先用PBS然后用无菌蒸馏水冲洗栅级，并在室温下空气干燥；将4％乙酸铀溶液置于栅级上染色2分钟，并将栅级干燥；用JEM-1200EXII电子显微镜(日本电子)观察照相。结果表明：可以明显地看出：病毒包膜的突起样结构由F和HN蛋白组成(附图12)，这说明由辅助细胞产生的F蛋白质被有效地掺入至病毒颗粒中。另外，象野生型病毒一样，F缺陷病毒颗粒内部具有螺旋RNP结构和突起样结构(附图14)。
[实施例5]体外经F-缺陷型SeV载体将基因高效转移至各种细胞
<导入大鼠大脑皮层神经细胞的原代培养细胞>
按照如下方法制备和培养大鼠大脑皮层神经细胞的原代培养细胞：用乙醚深度麻醉怀孕18天的一个SD大鼠(SPF/VAF Crj：CD，雌性，332g，约9周；Charles River)，然后从腋窝动脉放血将其处死。将其腹部剖开，然后从子宫内取出胎儿。切开颅部皮肤和骨头，取其大脑。在立体显微镜下将大脑半球转移至工作液DMEM(含有5％马血清、5％小牛血清和10％DMSO)中；切片，并在其中加入一种冰冻木瓜蛋白酶溶液(1.5U，0.2mg半胱氨酸、0.2mg牛血清白蛋白、5mg葡萄糖、0.1mg/ml DNase)；在32℃将含有这种切片组织的溶液培育15分钟，同时每5分钟颠倒小瓶以摇动此溶液。在证实了悬浮液变得足够混浊、且组织切片变得半透明后，通过移液将这些组织切片压成小碎片。在32℃以1200rpm将此悬浮液离心5分钟，然后在B27-补充神经基本培养基(GibcoBRL，Burlington，Ontario，加拿大)中将这些细胞进行再悬浮。将这些细胞用聚-d-赖氨酸(Becton DickinsonLabware，Bedford，MA，USA)于平板上，其密度为1细胞/皿，然后在37℃、5％CO2下进行培养。
将大脑皮层的神经细胞(5×105/孔)进行原代培养5天后，用F缺陷型SeV载体感染这些细胞(感染复数＝5)，然后再培养3天。于室温下，在含有1％低聚甲醛、5％山羊血清和0.5％Triton-X的固定溶液中将这些细胞固定5分钟。室温下，应用BlockAce(雪印乳业)对这些细胞进行封闭反应2小时，然后在室温下用500倍稀释的山羊抗大鼠微管相关蛋白2(MAP-2)(Boehringer)IgG将这些细胞培育1小时。接着，每15分钟用PBS(-)将这些细胞冲洗3遍，然后在室温下，用经5％山羊血清/PBS稀释100倍的cys3-共轭抗小鼠IgG培育此细胞1小时。接着，每15分钟用PBS(-)将这些细胞冲洗3遍后，将Vectashield固定介质(载体实验室，Burlingame，美国)加入这些细胞中；对已经用MAP-2免疫染色和GFP荧光进行了双-染色的细胞，用共焦显微镜(Nippon Bio-Rad MRC 1024，日本)和安装有470-500-nm或510-550-nm的激发带状-通过滤片倒置显微镜Nikon Diaphot 300观察这些细胞。结果显示，几乎100％GFP被导入MAP2阳性的神经细胞中(附图15)。
<引入正常人细胞>
从日本制药公司(DAINPPON PHARMACEUTICAL)购买正常人平滑肌细胞、正常人肝细胞和正常人肺毛细血管内皮细胞(细胞体系)，在37℃、5％CO2下用SFM CS-C培养基试剂盒(细体系)培养这些细胞。
用F缺陷型SeV载体感染正常人细胞，诸如正常人平滑肌细胞(附图15，肌肉)、正常人肝细胞(附图15，肝)和正常人肺毛细血管内皮细胞(附图15，肺)(感染复数＝5)，然后观察GFP的表达。这证实了导入效力几乎为100％，而且GFP基因在所有细胞中的表达水平非常高(附图15)。
<引入小鼠初级骨髓细胞>
另外，进行了一项实验，在此实验中利用谱系标记物分离小鼠初级骨髓细胞，并用F缺陷型SeV载体感染此细胞。首先，经腹腔内注射(IP注射)将5-氟尿嘧啶(5-FU，Wako Pure chemical Industries)给予C57BL小鼠(6周大，雄性)，剂量为150mg/kg；给药2天后，从股骨采集骨髓细胞。应用淋巴细胞-M(Cedarlane)通过密度梯度离心分离这种单核细胞。将已经包被有生物素标记的抗-CD45R(B220)、抗Ly6G(Gr-1)、抗-Ly-76(TER-119)、抗1(Thy1.2)和抗Mac-1的链霉亲和素-磁珠(Pharmingen；Funakoshi)的一种混合物(3×107)加入此单核细胞中(3×106细胞)，并让所得混合物在4℃反应1小时；回收已用磁体除去了其中的Lin+细胞的一部分(Lin-细胞)(Erlich，S.等，《血液《1999.93(1)，80-86)。将2×107HAU/ml的SeV加入4×105的Lin-细胞，然后再将重组大鼠SCF(100ng/ml，BRL)和重组人IL-6(100U/ml)加入其中。另外，将4×107HAU/ml的F缺陷的SeV加入8×105的全部骨髓细胞中，并将5×107HAU/ml的GFP-SeV加入1×106细胞中。通过在SeV转录单位PUC18/T7HVJRzd.DNA(+18)(《基因细胞》，1996，1：569-579)的限制酶NotI-切割位点插入一个PCR-扩增的NotI片段制备GFP-SeV，这个片段含有加入了一个转录起始信号(R1)、一个终止(R2)信号和一个间插(IG)序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因(结构基因的长度为717bp)。使用LLC-MK2细胞和发育的鸡胚、按照公知方法(《基因细胞》，1996，1：569-579)进行含有GFP基因病毒的重建，然后回收含有目标基因的病毒。用GFP-SeV感染后培养48小时，再把细胞分成两组：让一组与藻红蛋白(PE)标记的抗CD117(c-试剂盒；Pharmingen)反应1小时；另一组是对照组。用PBS冲洗3次，然后将其在流式细胞计数器(EPICS Elite ESP；Coulter，Miami，FL)中分析。
结果表明，F缺陷型Sev载体也被感染至抗c-试剂盒抗体富集的骨髓细胞中，该抗体用作血液原干细胞标志，并且观察到了GFP基因的表达(图16)。用胰蛋白酶处理细胞培养物上清液，加入LLC-MK2细胞中后三天测定表达GFP细胞的存在，由此证实了培养物上清液中感染性颗粒的存在。很清楚这些细胞中没有一个释放感染性病毒颗粒。
[实施例6]对大鼠脑室进行载体给药
通过腹腔内注射用生理盐水(大冢制药公司)稀释10倍的戊巴比妥钠溶液(Dainabot)(5mg/ml)来麻醉大鼠(F334/Du Crj，6周龄，雌性，Charles River)。用大脑立体定位仅对小动物(DAVID KOPE)给予病毒。在内耳线到前囟5.2mm、从人字缝尖到右耳2.0mm、大脑表面下2.4mm处使用30G可交换针(Hamilton)注射20μl(108CIU)。在脑室的室管膜细胞中观察到了GFP蛋白的高水平表达(图17)。而且，在F缺陷型SeV载体中，只在注射部位周围的室管膜细胞或神经细胞中观察到GFP蛋白的表达，并且在这些区域没有发现损伤。给药大鼠直到解剖也没有发现行为异常或体重变化。解剖后，在所分析的大脑或任何组织和器官如肝、肺、肾、心、脾、胃、肠等都没有发现损伤。
[实施例7]由F缺陷SeV基因组形成F-缺陷病毒颗粒
<1>
用F-缺陷SeV病毒感染不表达F的LLC-MK2细胞和表达-F的LLC-MK2细胞(LC-MK2/F7)，并且用(+)而不用(-)胰蛋白酶进行培养。在图18A中显示了3天后对细胞培养物上清液的HA测定的结果。把培养物上清液分别接种至发育的鸡胚，在图18B中显示了2天培养后绒毛尿囊液的HA测定的结果。在平面顶部的“C”表明用作对照组的PBS。在“稀释”下所示的数字表示病毒溶液的稀释倍数。而且，再把发育鸡胚中的HA-阳性绒毛尿囊液(通路11和12)接种到发育鸡胚中，并且在培养两天后、用HA测定法检测绒毛尿囊液(图19C)。结果，发现用F缺陷SeV病毒感染的不表达F的细胞或发育的鸡胚不管HA为阳性，即使再接种到发育鸡胚后病毒没有扩散，证实了HA-阳性病毒溶液不会有二级感染性。
<2>
检测在不表达F的细胞中扩增的非感染病毒溶液中病毒颗粒的存在。用F基因和HN基因作探针，通过QIAamp病毒RNA微型试剂盒(QIAGEN)对从表达F细胞的培养物上清液、HA-阳性非感染的绒毛尿囊液和野生型SeV制备的总RNA、进行RNA印迹分析。结果，当用HN基因作探针时，对来自绒毛尿囊液或表达F的细胞的培养物上清液中的病毒的RNA测定了条带，反之，当使用F基因探针时测定不到条带(图10)。这证实了HA-阳性非感染液具有含F缺陷基因组的非感染性类病毒颗粒。而且，用免疫电子显微镜分析该HA阳性非感染病毒溶液发现有病毒颗粒的存在，并且病毒颗粒的包膜与识别胶体金标记的HN蛋白抗体反应，但是不与识别胶体金标记的F蛋白抗体反应(图20)。该结果显示了F缺陷病毒颗粒的存在，证实了病毒能够单独与HN蛋白形成病毒颗粒，甚至没有F蛋白的存在。这就已经表明单独用F能形成SeV病毒颗粒(Leyer，S.等，J Gen.Virol 79，683-687(1998))，并且当前的结果首次证实了单独用HN蛋白可形成SeV病毒颗粒。这样，在发育鸡胚中可瞬时批量生产F缺陷病毒颗粒的事实表明能够批量生产包裹有SeV F-缺陷RNP的病毒颗粒。
<3>
如上所述，相对于仙台病毒感染的细胞来说，在发育鸡胚中瞬时扩增的F-缺陷病毒颗粒根本没有被感染。为了证实功能性RNP结构包裹在包膜中，把表达F的细胞和不表达F的细胞与阳离子型脂质体(DOSPER，Boehringer mannheim)混合并通过在室温接种15分钟来转染。当该细胞没有与阳离子脂质体混合时，根本没有观察到表达GFP的细胞，而当与阳离子型脂质体混合时，所有的细胞都表达GFP。在不表达F的细胞中，仅在单一细胞中看到GFP的表达并且没有扩展到相邻细胞，相反，在表达F的细胞中，表达GFP的细胞扩展形成集落(图21)。所以，在发育鸡胚中瞬时扩增的非感染的病毒颗粒当用诸如转染的方法把它们接种到细胞中时，能够表达基因。
［实施例8]从FHN-缺陷的SeV基因组重建和扩增病毒
<FHN-缺陷基因组cDNA的构建>
为了构建FHN-缺陷型基因组的cDNA(pSeV18+/ΔFHN)，首先用EcoRI消化pUC18/KS以构建pUC18/Eco，然后把从F基因的起始密码子到HN基因的终止密码子的全部序列(4866-8419)缺失，再在BsiwI位点(cgtacg)连接。在用测序法确认FHN缺陷位点的序列后，从凝胶中回收EcoRI片段(4057bp)来取代pUC18/KS的EcoRI片段从而完成构建。从凝胶中回收含有FHN缺失区域的KpnI/SphI片段(14673bp)来取代pSeV18+的KpnI/SphI片段得到质粒pSeV18+/ΔFHN。
另一方面，按照下列方法实现用GFP引导的FHN-缺陷SeV cDNA的构建。从pSeV18+/ΔFHN中回收SalI/XhoI片段(7842bp)，并克隆到pGEM11Z(Promega)中。把所得到的质粒命名为pGEM11Z/SXdFHN。通过用BsiwI酶消化的方法把带有d2EGFP(Clontech)的ATG-TAA(846bp)两端的BsiwI部位的PCR产物与pGEM11Z/SXdFHN的FHN-缺陷部位相连接。把所得到的质粒命名为pSeV18+/ΔFHN-d2GFP。
<FHN-缺陷、蛋白共表达的细胞系的建立>
表达F基因的质粒与用来建立F-缺陷的、蛋白共表达的细胞系的质粒相同，并且用同样的反复构建表达HN基因的质粒，把含有HN的ORF片段插入pCALNdlw的独特的SwaI位点上(Arai等，如上所述)得到命名为pCALNdLw/HN的质粒。
按照产品手册，把LLC-MK2细胞与相同量或不同比率的pCALNdLw/F和pCALNdLw/HN混合以用哺乳动物转染试剂盒(Stratagene)引导基因。在用G418进行3周选择后克隆细胞。把所得到的抗药克隆各自用重组腺病毒感染(Ade/Cre，Saito等，如上所述)(感染复数＝10)，其中的重组腺病毒能够表达Cre DNA重组酶。然后在用PBS(-)冲洗3次后，在诱导表达F和HN蛋白后3天收集细胞，并且通过使用蛋白质印迹法用抗SeV F蛋白和抗SeV HN蛋白的单克隆IgG对它们进行探查(图22)。
<pGEM/FHN的构建>
把用于构建pCALNdLw/F和pCALNdLw/HN的F和HN的片段克隆到pGEM4Z和pGEM3Z(Promega)以分别得到pGEM4Z/F和pGEM3Z/HN。回收被PvuII消化的含有T7启动子和pGEM3Z/HN的HN的区域所得到的片段，并且连接到pGEM4Z/F的F基因的下游的独特SacI部位处的钝化部位切口。通过使用抗F和抗HN单克隆抗体的蛋白质印迹法确认当F和HN的基因在相同方向连接时，它们的蛋白被同时表达。
<FHN-缺陷病毒的重建>
有两种方法可以进行FHN-缺陷病毒(P0)的重建。一种方法是使用RNP转染方法用于FHN-缺陷病毒的重建，另一种是使用T7来提供FHN蛋白共表达的质粒。也就是说，在调节T7启动子的前提下，分别构建表达F和HN蛋白的质粒，并且使用那些质粒重建F和HN蛋白。在两种方法中，用FHN共表达细胞扩增重建的病毒。为了按如上述F-缺陷SeV重建相同的方法把基因导入到LLC-MK2细胞中，以12μg/10cm平皿、4μg/10cm平皿、2μg/10cm平皿、4μg/10cm平皿和4μg/10cm平皿(最后总量，3ml/10cm平皿)的比率混合FHN-缺陷、GFP-表达的SeV cDNA(pSeV18+/ΔFHN-d2GFP)、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和pGEM/FHN。基因转染3小时后，把培养基换成含有AraC(40μg/ml，SIGMA)和胰蛋白酶(7.5μg/ml，GIBCO)的MEM，并且再培养3天。在基因转染2天后用立体荧光光学显微镜进行观察。分析加入pGEM/FHN的作用，并且通过扩散表达GFP的细胞来证实病毒的形成。结果，在重建中加入pGEM/FHN时，观察到了扩散的表达-GFP的细胞，相反，在没有加入pGEM/FHN时，仅在单一细胞中观察到了GFP的表达(图23)。这证实了在FHN蛋白重建中的这种加入会引起病毒的病毒颗粒的形成。另一方面，在RNP转染时，在P1的表达FHN的细胞中成功地完成了病毒的回收，就象在F缺陷的情况中一样(图24，较上平面部位)。
在Ade/Cre感染后6小时或更长时间，把FHN缺陷病毒感染给诱发了表达FHN蛋白的细胞后证实了病毒的扩增(图24，较低的平面)。
把重建于FHN缺陷GFP表达的SeV cDNA的病毒溶液感染给LLC-MK2、LLC-MK2/F、LLC-MK2/HN和LLC-MK2/FHN细胞，并且加入或不加胰蛋白酶进行培养。培养3天后，分析表达GFP蛋白的细胞扩散。结果，仅在LLC-MK2/FHN中观察到GFP的扩散，这证实了通过FHN共表达和以依赖于胰蛋白酶的方式可特异性地扩增病毒溶液(图25)。
为了确认FHN-缺陷病毒基因组，将从LLC-MK2/FHN中回收的培养物上清液离心，按照厂家手册用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(QIAGEN)提取RNA。使用第一链合成的Superscript预扩增系统将RNA用于RT-PCR的模板合成(GIBCO BRL)，并且使用TAKARA Z-Taq(Takara)进行PCR。把F-缺陷病毒用作对照组。选择PCR引物组合作为M基因和GFP基因的结合，或者作为M基因和L基因的结合(对M基因和GFP基因(M-GFP)的结合来说，正向：5′-atcagagacctgcgacaatgc/SEQ ID NO：13，反向：5′-aagtcgtgctgcttcatgtg/SEQ ID NO：14；对M基因和L基因的结合(M-L)，正向：5′-gaaaaacttagggataaagtccc/SEQ ID NO：15，反向：5′-gttatctccgggatggtgc/SEQID NO：16)。结果，当使用M和GFP基因作引物时，在RT条件下，F-缺陷和FHN-缺陷病毒都得到特殊的条带。在使用M和L基因作引物时，对FHN缺陷样品测定了含有给定的GFP大小的条带，并且对F缺陷样品测定了含有HN基因的一定大小的加长条带。这样，证明了在基因组结构中的FHN缺陷(图26)。
另一方面，同F缺陷病毒一样，把FHN-缺陷的病毒感染给表达-F的细胞，并且在4天后回收培养物上清液以进行LLC-MK2、LLC-MK2/F和LLC-MK2/FHN的感染实验。结果，在任何感染细胞中都没有观察到表达GFP的细胞，这表明病毒没有对这些细胞感染。但是，现在已有报导，单独的F蛋白足以形成病毒颗粒(Kato，A.等，《基因细胞》1，569-579(1996))并且肝脏中的唾液酸糖蛋白缺乏受体(ASG-R)能够调节肝细胞的特异感染(Spiegel等，《病毒学杂志》72，5296-5302，1998)。这样，带有仅用F蛋白形成的病毒包膜的、含有FHN-缺陷的RNA基因组的病毒颗粒可以释放到表达F细胞的培养物上清液。所以，回收用FHN-缺陷病毒感染的表达F细胞的培养物上清液，并且在离心后，如上所述提取RNA并且根据上述方法用RT-PCR分析。结果，如图27所示证明了含有FHN-缺陷基因组的RNA的存在。
对用VSV-G转化为假型病毒的病毒颗粒的蛋白质印迹法分析清楚地表明不表达F和HN蛋白。可以认为本发明建立了FHN-缺陷病毒的病毒颗粒的生产体系。
而且，把从表达F蛋白的细胞中释放出的病毒颗粒涂在表达FHN或不表达FHN的LLC-MK2细胞上，其中的LLC-MK2细胞可以混合或没有混合阳离子型脂质体(50μl DOSPER/500μl/孔)。结果，当用DOSPER包覆成混合物时，可以观察到表达GFP细胞的扩散，而只有HN-缺陷病毒颗粒根本没有感染，没有观察到表达GFP的细胞，这些正如在上述F-缺陷颗粒的情况中所看到的。在没有表达FHN的细胞中，观察到了表达GFP的细胞，但没有发现病毒的再形成和扩散的迹象。
从表达F细胞中回收的这些病毒样颗粒能够持续感染表达ASG-R基因的细胞、不表达ASG-R的细胞或肝细胞，用Spiegel等的方法能够检测出感染是肝特异性的还是ASG-R特异性的。
[实施例9]缺陷基因组RNA病毒载体的应用
1.用F-缺陷病毒包膜包裹在上述系统中扩增的F-缺陷的RNP。把该包膜引入细胞中，它是用化学修饰等方法或者通过基因导入试剂或基因枪等(RNP转染或RNP注射)给该包膜加入任何所需的具有导入能力的细胞而实现的，并且重组RNA基因组能够复制并在细胞中连续产生蛋白质。
2.保留HN的细胞内的结构域，而HN的细胞外的结构域是以特殊方式与能够以定向其他受体的配体融合并且能够产生嵌合体蛋白的重组基因包裹进病毒的基因组中时，能够产生具有特殊目标的载体。另外，在产生重组蛋白的细胞中能够制备该载体。这些载体能够适用于基因治疗，如疫苗等。
3.由于已经成功地完成了FHH缺陷的SeV病毒的重建，所以通过以下方法生产导向载体，即通过把能够导向包膜的嵌合体蛋白基因导入至FHN缺失部位替代GFP基因，按与FHN缺陷载体情况中的相同方法进行重建，在表达FHN的细胞中扩增一次所得物，将其感染给不表达的细胞，并且回收仅用能够导向的嵌合体包膜蛋白包裹从病毒基因组中转录形成的病毒颗粒。
4.现在已经制备了仙台病毒的小基因组和通过把NP、P、L和F基因同时导入细胞仅用F蛋白包装的小基因组的病毒颗粒(Leyer等，《基因病毒学杂志》79，683-687，1998)。现在已经报导了一种载体，其中由仙台F蛋白把小鼠白血病病毒转变成假型(Spiegel等，《病毒学杂志》72，5296-5302，1998)。至今为止也报导了对肝细胞特异性导向的胰蛋白酶切割的F蛋白可以通过ASG-R调节(Bitzer等，《病毒学杂志》71，5481-5486，1997)。在前面报导中的系统是瞬间形成颗粒的系统，它很难连续回收载体颗粒。尽管Spiegel等已经报导了逆转录病毒载体被仙台F蛋白转化成假型，但是该方法存在本质的问题，如逆转录病毒只能把基因导入有丝分裂的细胞。在本发明中所回收的含有FHN共缺陷SeV病毒基因组和仅有F蛋白包膜的病毒颗粒是有效的RNA载体，该载体能够不考虑细胞分裂而在细胞质中自我复制。它们是新的病毒颗粒，并且是容易大量生产的颗粒系统。
[实施例10]来自FHN-缺陷的SeV基因组的病毒重建和扩增
对许多单链负链RNA病毒如仙台病毒、麻疹病毒来说，已经建立了来自能够克隆病毒基因组的cDNA的感染性病毒颗粒的重建技术。
在大多数系统中，重建是通过以下进行的，即使用T7聚合酶、在T7启动子的下游将导入有cDNA、NP、P和L基因的质粒引入细胞内并表达cDNA和每个基因。为了提供T7聚合酶，主要使用表达T7聚合酶的重组痘苗病毒。
表达T7的痘苗病毒能够在大多数细胞中有效地表达T7聚合酶。但是，因为痘苗病毒会诱导细胞毒性、被感染的细胞仅能存活2或3天。在多数情况下，利福平用作抗疫苗药物。在kato等的系统中(Kato，A.等，《基因细胞》1，569-579(1996))，AraC与利福平一起用于抑制痘苗病毒的增殖至最低水平，并且有益于仙台病毒的重建。
尽管如此，由仙台病毒所代表的最小负链RNA病毒的重建效率是1×105个细胞中有几个颗粒或更少，远远低于其他病毒如逆转录病毒。痘苗病毒引起的细胞毒性和复杂的重建步骤(转录和翻译蛋白分别与无修饰的RNA形成RNP样结构，之后，由聚合酶发生转录和翻译)是这种重建低效率的原因。
除了痘苗病毒外，还按提供T7聚合酶的方法检测了腺病毒系统，但是也没有获得好结果。痘苗病毒能够编码在细胞质中起作用的RNA加帽酶作为除了T7聚合酶外其自身的酶，人们认为该酶在细胞质中通过加帽使之稳定由T7启动子转录的RNA促进了翻译效力。本发明试图通过用补骨脂素-长波长-UV方法处理痘苗病毒提高仙台病毒的重建效力来避免由痘苗病毒所引起的细胞毒性。
通过DNA与补骨脂素的交联和长波长的紫外光，能够达到这样一种状态，即抑制含有DNA基因组的病毒的复制，而尤其不会过早地影响基因的表达。在系统中病毒失活所看到的显著效果归因于具有长基因组的痘苗病毒(Tsung，K.等，《病毒学杂志》70，165-171(1996))。
在能够自我增殖的野生型病毒的情况下，甚至是重建所形成的病毒的单一颗粒也可能通过接种转染的细胞到发育鸡胚来增殖仙台病毒。所以，人们不能不认真考虑重建效率和剩余痘苗病毒。
但是，在用于研究病毒复制、颗粒形成机理等的各种突变体病毒的重建情况中，为了增殖病毒有时不得不使用表达来自于病毒等的蛋白的细胞系、而不是发育中的鸡胚。而且，最大的可能是突变体病毒或缺陷病毒的增殖显著性迟于野生型病毒的增殖。
为了用这种突变增殖仙台病毒，应当把转染的细胞涂在下一代细胞上并培养较长时间。在这种情况下，痘苗病毒的重建效率和剩余滴度可能是有问题的。在本发明的方法中，一方面提高重建效力，另一方面还要降低剩余痘苗病毒的滴度。
使用本发明的方法，在前述系统中使用未处理的痘苗病毒可能未曾获得的突变体病毒通过重建(F、FHN-缺陷病毒)成功获得。本系统对突变体病毒的重建是一个最好的工具，突变体病毒在将来可以得到更多。所以，本发明人检测了补骨脂素和紫外光(UV)的量，并评价了痘苗病毒失活的条件。
<试验>
首先，用2分钟的固定照射时间测定补骨脂素浓度。通过以下方法检测失活，即通过噬斑形成测定痘苗病毒的滴度，并且通过pGEM-luci质粒在T7启动子和仙台病毒的小基因组控制下测定T7聚合酶活性。仙台病毒的小基因组的T7聚合酶活性的测定是一个系统，其中细胞被仙台病毒的小基因组质粒和pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L质粒共同感染，它们由T7表达仙台病毒的NP-、P-和L-蛋白，在形成核糖核酸蛋白复合体后通过仙台病毒的RNA聚合酶测定荧光素酶蛋白的转录。
2分钟紫外照射后，可以看到痘苗病毒的滴度随着补骨脂素浓度而下降。但是，当补骨脂素浓度达到0、0.3和1μg/ml时，T7聚合酶的活性不变，但在10μg/ml时，下降至大约十分之一(图28)。
而且，固定补骨脂素浓度为0.3μg/ml时，测定紫外照射时间。随着照射时间的增加，痘苗病毒的滴度会下降，然而发现达到30分钟照射对T7聚合酶没有作用。在这种情况下，在0.3μg/ml和30分钟照射的条件下，滴度降低到1/1000不影响T7聚合酶的活性(图29)。
但是，在降低滴度为1/1000的痘苗病毒中，以感染复数＝2感染后24小时换算为预处理滴度(感染复数＝0.002作为处理后剩余滴度)的CPE相同于以感染复数＝2感染的未处理的病毒(图30)。
使用在上述条件下处理过的痘苗病毒，评价仙台病毒的重建效力。通过修改上述Kato等方法进行以下步骤的重建。以3×105细胞/孔把LLC-MK2细胞接种到6孔微型平板上，培养一夜后，在PLWUV处理之前把痘苗病毒稀释到6×105pfu/100μl的校准滴度，并且感染至PBS冲洗过的细胞。感染1小时后，向100μl分别加有1、0.5、1和4μg的质粒pGEM-NP、P、L和cDNA的最适MEM再加入10μlSuperfect(QIAGEM)并在室温放置15分钟，加入1ml的最适MEM(GIBCO)(含有Rif.和AraC)后，将其涂在细胞上。
在转染后2、3和4天，把细胞回收、离心并悬浮在300μl/孔的PBS中。在受精后10天，把100μl含有从悬浮液本身或通过稀释悬浮液10或100倍制得的含有溶液的细胞接种到发育鸡胚中，每种稀释液接种至4个鸡胚(分别为1×105、1×104和1×103个细胞)。3天后，从鸡胚中回收尿囊液并通过HA试验检测病毒的重建(表1)。对分别用1×105、1×104和1×103个细胞接种的鸡胚来说，在接种105个细胞鸡胚中有HA活性的鸡胚为1分、104个细胞为10分、103个细胞为100分，计算重建效力(图31)。公式如表1所示。
                                         表1.紫外线处理痘苗病毒的时间对仙台病毒的重建效率的作用
 接种细胞数    分数(a)                                                   HA阳性卵数(b)
                2天                3天                   4天
  0′    15′    20′   30′   0′   15′    20′   30′   0′     15′     20′     30′
    105     1(a1)   1    2    4   4   0   2    4   4   1     3     4     4
    104     10(a2)   0    1    3   2   0   2    3   4   0     0     4     0
    103     100(a3)   0    0    0   1   0   1    0   2   0     0     0     0
    重建效力     (a1+a2+a3)×b   1    12    24   124   0   122    34   244   1     3     44     4
重建效力＝(a1+a2+a3)×b
与转染前所给定滴度相比，感染后2、3和4天所测定的痘苗病毒的残余滴度更小(图32)。
就PLWUV所失活的痘苗病毒而言，滴度可能会降低到1/1000，而不影响T7聚合酶的活性。但是，来自痘苗病毒的CPE与用显微镜观察所发现的滴度高1000倍的未处理的病毒的CPE没有不同。
对仙台病毒的重建来说，使用上述条件处理的痘苗病毒，重建效率增加了几十倍到上百倍(图31)。同时，转染后痘苗病毒的剩余滴度不是5pfu/105个细胞或更多。这样，可复制的痘苗病毒的存活保持在0.005％或更低。
[实施例11]假型仙台病毒的构建
<1>其中诱导了VSV-G基因产物的辅助细胞的制备
因为VSV-G基因产物具有细胞毒性，使用质粒pCALNdLG在LLC-MK2细胞中进行稳定的转化(Arai T.等，《病毒学杂志》72(1998)p1115-1121)，其中VSV-G基因产物可以由Cre重组酶诱导。把质粒引入LLC-MK2细胞是通过说明书中的磷酸钙方法实现的(CalPhos TMM哺乳动物转染试剂盒，Clontech)。
在10cm培养平皿中把10微克质粒pCALNdLG导入增殖为60％融合的LLC-MK2细胞中。在5％二氧化碳培养箱中37℃下用10ml MEM-FCS10％培养液把细胞培养24小时。24小时后，刮去细胞并悬浮在10ml培养液中，然后使用5个10cm培养平皿，1、2和2平皿分别用5ml、2ml和0.5ml接种。然后将它们在10ml含有1200μg/ml G418(GIBCO-BRL)的MEM-FCS10％培养液中培养14天，每隔一天改变培养液来选择基因稳定的转染系。用克隆环回收生长在培养基中的抗G418的28个克隆。在10cm培养平皿中将各克隆扩展融合。
对每个克隆来说，在用含有Cre重组酶的重组腺病毒AxCANCre感染后，使用抗VSV-G单克隆抗体通过下列所述的蛋白质印迹法检测VSV-G的表达。
在6cm的培养平皿中使各克隆生长融合，之后，用Saito等的方法(见上述)以感染复数＝10感染腺病毒AxCANCre，并培养3天。除去培养物上清液后，用PBS冲洗细胞，并通过加入0.5ml含有0.05％胰蛋白酶和0.02％EDTA(乙二胺四乙酸)PBS将其从培养平皿上脱离并在37℃温育5分钟。把该细胞悬浮在3ml的PBS中后，以1500×g离心5分钟回收细胞。把所得到的细胞再悬浮于2ml的PBS中，然后再以1500×g离心5分钟来回收细胞。
把细胞储存在-20℃下，并且能够按照需要融化使用。把所回收的细胞溶解于100μl的细胞溶菌溶液(RIPA缓冲液，Boehringer Mannheim)，并且使用细胞的全部蛋白(1×105个细胞/泳道)，进行蛋白质印迹法。把细胞裂解物溶于SDS聚酰胺凝胶电泳样品缓冲液(含有6mM Tris-HCl(pH6.8)，2％SDS，10％丙二醇，5％2-巯基乙醇的缓冲液)并且使样品在95℃加热后电泳5分钟。使用SDS-聚酰胺凝胶(Multigel 10/20，第一化学公司)通过电泳方法分离样品，然后通过半干燥印迹法把所分离的蛋白转移到转移膜上(Immobilon-P转移膜，Millipore)。使用在100％甲醇浸泡过20秒并且在水中浸泡过1小时的转移膜在1mA/cm2固定电流下进行转移1小时。
在40ml封闭溶液(Block-Ace，雪印奶产品公司)中把转移膜振摇1小时并在PBS冲洗1次。
在乙烯袋中密封转移膜和用含有10％封闭溶液的PBS稀释成1/1000的抗VSV-G抗体(克隆P4D4，Sigma)并在4℃下放置。
把转移膜在40ml的PBS-0.1％Tween 20中浸泡两次5分钟，冲洗后，在PBS中浸泡5分钟以冲洗。
把转移膜和5ml用过氧化酶标记的并用含有10％封闭溶液的PBS稀释成1/2500的抗小鼠IgG抗体(抗小鼠免疫球蛋白，Amersham)密封在乙烯袋中并在室温下振荡1小时。
振荡后，把转移膜在PBS-0.1％Tween 20中浸泡两次5分钟，冲洗后，在PBS中浸泡5分钟以冲洗。
用发光方法(ECL蛋白质印迹法测定试剂，Amesham)测定与抗VSV-G抗体交联反应的膜上蛋白。结果在图33中显示。这3种克隆表明AxCANCre感染特异性VSV-G表达，证实了能够诱发VSV-G基因产物的LLC-MK2细胞的建立。
把命名为LLCG-L1的所得到的克隆中的一个克隆使用抗VSV抗体进行流式细胞术分析(图34)。结果，在LLCG-L1中检测出对VSV-G基因诱导特异性的抗体的反应性，证实在细胞表面表达了VSV-G蛋白。
<2>使用辅助细胞制备含有缺陷F基因的基因组假型仙台病毒
把含有缺陷F基因的基因组假型仙台病毒感染到表达VSV-G基因的细胞，并且使用含有上述实施例中所述的GFP基因F型缺陷仙台病毒检测是否能够看到用VSV-G作衣壳体的假型病毒的产生，并且把GFP基因的表达作为一个指标。结果，在没有感染含有Cre重组酶的重组腺病毒AxCANCre的LLCG-L1中，通过F缺陷型仙台病毒的感染引入病毒基因并测定表达GFP的细胞，尽管表达细胞的数目没有增加。在VSV-G诱导的细胞中，发现在表达GFP的细胞随着时间增加。当再加入1/5的上清液至VSV-G诱导的新细胞时，在前面的上清液中没有看到基因的转染，同时在后面的上清液中发现表达GFP细胞的增加以及基因的转染。在把后面的上清液加给没有VSV-G诱导的LLCG-L1细胞时，尽管有转染，但是也没有看到表达GFP的细胞的增加。综合起来，发现了病毒的增殖对表达VSV-G的细胞具有特异性，并且发现了具有VSV-G的假型F缺陷型病毒的形成。
<3>对生产含有F基因缺陷基因组的假型仙台病毒条件的评价
在改变AxCANCre感染量(感染复数＝0、1.25、2.5、5和10)的情况下，感染一定量的含有F基因缺陷基因组的假型仙台病毒并且在第7天或第8天回收培养物上清液。然后，在用VSV-G诱导前后，把该上清液感染给细胞，5天后，比较表达GFP的细胞数以观察VSV-G基因表达量的作用。结果，在感染复数＝0没有发现病毒产生而在感染复数＝10时产生量最大(图35)。此外，当分析随着时间的增加病毒的生产量，产生量从第5天或之后开始增加并持续到第8天(图36)。通过计算在病毒溶液(CIU)中感染给细胞的颗粒数，来完成病毒滴度的测定，通过在连续(每次10倍)稀释的病毒溶液添加给VSV-G诱发前的细胞感染后第5天对表达GFP的细胞计数。结果，发现病毒产生的最大值是5×105CIU/ml。
<4>抗VSV抗体对含有F基因缺陷的基因组的假型仙台病毒感染性的作用
就使用表达VSV-G细胞所获得的含有F基因缺陷的基因组的假型仙台病毒是否在衣壳体中含有VSV-G蛋白而言，使用抗VSV抗体评价是否影响感染性的中和活性。混合病毒溶液和抗体并在室温下放置30分钟，然后感染给LLCG-L1细胞而没有VSV-G诱导。在第5天，通过表达GFP细胞的存在来检测基因的转染能力。结果，用抗VSV抗体可以看到对感染的最好抑制，相反在含有带原始衣壳体的F基因缺陷基因组的仙台病毒中，没有看到抑制(图37)。所以，清楚地说明本发明所获得的病毒是在其衣壳体中含有VSV-G蛋白的假型仙台病毒，其中该病毒的感染能够被抗体特异性地抑制。
<5>对假型仙台病毒具有F缺陷的基因组的确认
对感染细胞的细胞提取物进行蛋白质印迹法分析以检测在表达VSV-G基因的细胞中增殖的本发明病毒是否是F缺陷型。用上述方法完成蛋白质印迹法分析。使用从兔中制备的抗仙台病毒的多克隆抗体、从小鼠中制备的抗F蛋白的单克隆抗体和从小鼠中制备的抗HN蛋白的单克隆抗体作为第一抗体。在抗仙台病毒多克隆抗体中，用过氧化酶标记的抗-兔IgG抗体作第二抗体，并且在抗F蛋白的单克隆抗体和抗-HN蛋白的单克隆抗体中，用过氧化酶标记的抗小鼠IgG抗体作第二抗体。结果，没有测定到F蛋白，相反测定到了来自仙台病毒的蛋白和HN蛋白，证实了它是F缺陷型。
<6>使用辅助细胞制备含有F和HN基因缺陷的基因组的假型仙台病毒
使用作为指示剂的GFP基因表达和含有上述实施例中所述的GFP基因的F和HN基因缺陷的仙台病毒按照上述实施例中所述的相似方法分析含F和HN基因缺陷基因组的仙台病毒对表达VSV-G基因的LLCG-L1细胞的感染后，观察了在其衣壳体中是否产生了含有VSV-G的假型病毒。结果，观察到了病毒增殖对表达VSV-G的细胞具有特异性，并且观察到了含有VSV-G的假型的F和HN缺陷的仙台病毒的产生(图38)。通过计算在病毒溶液(CIU)中感染给细胞的颗粒数，以测定病毒滴度，通过在连续(每次10倍)稀释的病毒溶液添加给VSV-G诱发前的细胞感染后第5天对表达GFP的细胞计数，结果，发现病毒产生的最大值是1×106CIU/ml。
<7>对假型仙台病毒具有F和HN缺陷的基因组的确认
对感染细胞的细胞提取物进行蛋白质印迹法分析以检测在表达VSV-G基因的细胞中增殖的本发明病毒是否是F和HN缺陷型。结果，没有测定到F和HN蛋白，相反测定到了来自仙台病毒的蛋白，证实了它是F和HN缺陷型(图39)。
[实施例12]病毒重建方法的分析
<现有方法>
以5×106个细胞/平皿把LLC-MK2细胞接种到100mm培养平皿上。培养24小时后，用不含血清的MEM培养基冲洗一次细胞，然后在室温用表达重组痘苗病毒的T7 RNA的聚合酶感染(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126 1986)(vTF7-3)1小时(感染复数＝2)(感染复数＝2到3，优选使用感染复数＝2)。把本文所用的病毒用3μg/ml补骨脂素和长波紫外光(365nm)处理5分钟。用不含血清的MEM培养基把细胞冲洗两次，分别以12μg、4μg、2μg和4μg/平皿的比率把质粒pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A.等，《基因细胞》1，569-579(1996))悬浮在最适-MEM培养基(GIBCO)中。然后，加入SuperFect转染试剂(1μgDNA/5μl，QIAGEN)并在室温下放置15分钟，并且加入3ml含有3％FBS的最适-MEM培养基。之后，加入DNA-SupeFect混合物。3小时培养后，用不含血清的MEM培养基把细胞冲洗两次，并且在含有40μg/ml的胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)的MEM培养基中培养70小时。收集细胞和培养物上清液作各自为P0-d3样品。把P0-d3的粒状沉淀悬浮在最适-MEM培养基(107个细胞/ml)中。将其冻融三次，然后与脂质转染试剂DOSPER(Boehringer Mannheim)(106个细胞/25μlDOSPER)并将其在室温放置15分钟。然后，用该混合物(在24孔的平板中106个细胞/孔)转染表达F的LLC-MK2/F7细胞，并用不含血清的MEM培养基(含有40μg/mlAraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培养。在第3天和第7天回收培养物上清液并分别定义为P1-d3和P1-d7样品。
<包膜质粒+表达F的细胞的涂层方法>
类似于上述方法进行转染，不同的是加入4μg/平皿的包膜质粒pGEM/FHN。培养3小时后，用不含血清的MEM培养基冲洗细胞两次并在含有40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM培养基中培养48小时。除去培养物上清液后，用5ml的100mm平皿的悬浮于不含血清的MEM培养基(含有40μg/mlAraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)的表达-F的LLC-MK2/F7细胞的细胞悬浮液涂布细胞。48小时培养后，回收细胞和上清液并各自定义为P0-d4样品。把P0-d4样品的粒状沉淀悬浮于最适-MEM培养基(2×107个细胞/ml)中并冻融三次。然后用该悬浮液(2×106个细胞/孔，24孔平板)涂布表达-F的LLC-MK2/F7细胞，并且在不含血清的MEM培养基(含有40μg/mlAraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)中培养。在培养的第3天和第7天回收培养物上清液，分别定义为P1-d3和P1-d7样品。作为对照组，用如上相同方法进行实验，但是没有涂布只是加入包膜质粒。
<通过对表达-GFP的细胞计数来测定CIU(细胞感染单位)(GFP-CIU)>
以2×105个细胞/孔把LLC-MK2细胞接种到12孔平板上，培养24小时后，用不含血清的MEM培养基冲洗一次孔。然后，用100μl/孔适当稀释的上述样品(P0-d3或P0-d4、P1-d3和P1-d7)感染该细胞，其中样品为在10cm2中稀释至含有10到100阳性细胞数。15分钟后，加入1ml/孔的不含血清的MEM培养基，再培养24小时后，在荧光显微镜下观察细胞来计测表达-GFP的细胞数。
<CIU(细胞感染单位)的测定>
以2×105个细胞/孔把LLC-MK2细胞接种到12孔平板上，培养24小时后，用不含血清的MEM培养基冲洗一次孔。然后，用100μl/孔上述样品感染该细胞，其中把所含的病毒载体定义为SeV/ΔF-GFP。15分钟后，加入1ml/孔不含血清的MEM培养基并再培养24小时。培养后，用PBS(-)把细胞冲洗三次并通过放置在室温下大约10分钟到15分钟来干燥。为了固定细胞，加入1ml/孔丙酮并迅速除去，然后再将其在室温下放置10分钟到15分钟来干燥细胞。以300μl/孔向细胞中加入用PBS(-)稀释100倍的从兔制备的抗SeV多克隆抗体(DN-1)并在37℃温育45分钟。然后，用PBS(-)将其冲洗三次并且以300μl/孔加入用PBS(-)稀释200倍的抗兔IgG(H+L)荧光标记的第二抗体(AlexaTM568，分子探针)并在37℃温育45分钟。再用PBS(-)冲洗三次后，在荧光显微镜(发射：560nm，吸收：645nm滤膜，Leica)下观察荧光细胞(图40)。
作为对照组，以100μl/孔感染上述样品(SeV/ΔF-GFP)，15分钟后，加入1ml/孔的不含血清的MEM培养基，培养24小时后，不进行后序步骤，在荧光显微镜(发射：360nm，吸收：470nm滤膜，Leica)下观察表达-GFP的细胞。
[实施例13]对痘苗病毒(vTF7-3)增加缺陷型仙台病毒载体的重建效率所最适合的PLWUV(补骨脂素和长波紫外光)处理条件的评价
以5×106个细胞/平皿把LLC-MK2细胞接种到100mm培养平皿上。培养24小时后，用不含血清的MEM培养基冲洗一次细胞，然后在室温用表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒(vTF7-3)(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))感染细胞1小时(感染复数＝2)(感染复数＝2到3，优选使用感染复数＝2)。把本文所用的病毒用0.3到3μg/ml补骨脂和长波紫外光(365nm)处理2到20分钟。分别以12μg、4μg、2μg和4μg/平皿的比率把质粒pSeV18+/ΔF-GFP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A.等，《基因细胞》1，569-579(1996))悬浮在最适MEM培养基(GIBCO)。然后，加入SuperFect转染试剂(1μgDNA/5μl，QIAGEN)并在室温下放置15分钟并且最后加入3ml含有3％FBS的最适MEM培养基。之后，用不含血清的MEM培养基把细胞冲洗两次，然后加入DNA-SuperFect混合物。3小时培养后，用不含血清的MEM培养基把细胞冲洗两次，并且在含有40μg/ml的胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)的MEM培养基中培养48小时。用荧光显微镜观察100mm培养平皿中大约1/20视野，并对表达GFP的细胞计数。为了检测痘苗病毒(vTF7-3)的失活，通过噬斑形成(YoshiyukiNaqai等，《病毒实验手册》，第291-296页，1995)进行滴度测定。
进一步，把转染后回收的时间固定到3天，测定补骨脂和紫外照射时间。使用用各种PLWUV处理痘苗病毒(vTF7-3)，测定仙台病毒的重建效率。重建过程通过修改Kato等的方法(如上所述)，也就是通过以下所述的步骤。以5×105个细胞/孔把LLC＝MK2细胞接种到6孔微型平板上，过夜培养后(认为细胞增殖到1×106个细胞/孔)，在PLWUV处理前在2×106pfu/100μl的滴度校正用稀释的痘苗病毒(vTF7-3)感染PBS冲洗过的细胞。感染1小时后，分别把1、0.5、1和4μg的质粒pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和另外类型的SeV cDNA(pSeV18+b(+))加入50μl的最适MEM培养基(GIBCO)(Hasan，M.K.等，J.General Virology 78：2813-2820，1997)。再加入10μlSuperFect(QIAGEN)并在室温下放置15分钟。然后，加入1ml的最适MEM(含有40μg/ml的AraC)并涂在细胞上。在转染后3天回收细胞，然后将其离心并悬浮于100μl/孔PBS中。把悬浮液稀释10、100、和1000倍并且把稀释的100μl所得到的细胞溶液接种到受精后10天的发育鸡胚中，每种稀释液使用3个鸡胚(分别是1×105、1×104和1×103个细胞)。3天后，从鸡胚中回收绒毛尿囊液并且通过HA试验测定病毒的重建。分别用1×105、1×104和1×103个细胞接种的显示HA活性的鸡胚打分为1、10和100分，以来计算重建效率。
<结果>
实施例12和13的结果在图40到43中和表2中显示。表达质粒的包膜和细胞涂布的组合增加了SeV/ΔF-GFP的重建效率。在P0(继代培养前)的d3到d4(第3天到第4天)得到显著改善(图41)。在表2中，在转染后3天用细胞接种鸡胚。当用0.3μg/ml补骨脂处理20分钟时在第3天达到最高重建效率。这样，把这些条件看作是最适条件(表2)。
                              表2：痘苗病毒的PLWUV处理对仙台病毒的重建的作用
                                            (转染后3天用细胞接种卵)
   接种细胞数     分数(a)                               HA-阳性卵的数目(b)
 0μg/ml  0.3μg/ml             1μg/ml            3μg/ml
    0′     20′     5′     10′     20′     2′     5′     10′
    105     1(a1)     0     3     3     3     3     3     3     3
    104     10(a2)     0     3     2     3     3     1     3     1
    103     100(a3)     0     3     0     1     1     0     1     0
    重建效力     (a1+a2+a3)×b     0     333     43     133     133     13     133     13
重建效力＝(a1+a2+a3)×b
[实施例14]携带不含GFP的LacZ、F-缺陷型仙台病毒载体的制备
<含LacZ基因的F-缺陷型SeV载体cDNA的构建>
为了构建实施例1中所述的pSeV18+/ΔF的NP基因的上游区存在的NotI限制位点上含有LacZ基因的cDNA(pSeV(+18：LacZ)/ΔF)，进行PCR以扩增LacZ基因。通过以下进行PCR，即通过把LacZ基因调整到6的多倍(Hausmann，S等，RNA 2，1033-1045(1996))并且使用含有5′端的Not I限制位点的引物(5′-GCGCGGCCGCCGTACGGTGGCAACCATGTCGTTTACTTTGACCAA-3′/SEQ ID NO：17)和含有SeV(E)的转录终止信号、间插序列(I)、转录起始信号(S)和3′端的Not I限制位点的引物(5′-GCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGCTATTACTTCTGACACCAGACCAACTGGTA-3′/SEQ ID NO：18)，使用pCMV-β(Clontech)作模板。反应条件如下。把50ng pCMV-β、200μMdNTP(Pharmacia Biotech)、100pM引物、4U Vent聚合酶(新英格兰生物实验室)与伴随的缓冲液混合，并且使用25个反应温度循环即94℃30秒、50℃1分钟、72℃2分钟。所得到的产物用琼脂凝胶电泳进行电泳。然后，切割3.2kb的片段并在纯化后用Not I消化。连接Not I消化过的pSeV18+/ΔF的片段得到pSeV(+18：LacZ)/ΔF。
<常规方法>
以5×106个细胞/平皿把LLC-MK2细胞接种到100mm培养平皿上，在培养24小时后，用不含血清的MEM培养基冲洗一次细胞。然后，用表达T7 RNA的聚合酶的重组痘苗病毒(vTF7-3)(Fuerst，T.R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，8122-8126(1986))在室温下感染该细胞1小时(感染复数＝2)(感染复数＝2到3，优选使用感染复数＝2)。本文所用的病毒用3μg/ml补骨脂和长波长紫外光(365nm)预处理5分钟。分别以12μg、4μg、2μg和4μg/平皿的比率把含有LacZ的F-缺失型的仙台病毒载体cDNA(pSeV(+18：LacZ)/ΔF)、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L(Kato，A等，《基因细胞》，569-579(1996))悬浮于最适MEM培养基(GIBCO)中，加入4μg/平皿包膜质粒pGEM/FHN和SuperFect的转染试剂(1μg DNA/5μl，QIAGEN)，并在室温下放置15分钟。然后，加入3ml的含有3％FBS的最适-MEM培养基，并用不含血清的MEM培养基冲洗细胞两次，然后加入DNA-SuperFect混合物。培养3小时后，用不含血清的MEM培养基冲洗细胞两次，并且在含有40μg/ml的胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC，Sigma)和7.5μg/ml胰蛋白酶的MEM培养基中培养24小时。除去培养物上清液并把不含血清的MEM培养基(含有40μg/ml的AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)中表达F的LLC-MK2/F7的细胞100mm培养平皿的5ml悬浮液涂在细胞上。再培养48小时，回收细胞和上清液并定义为P0-d3样品。把P0-d3粒状沉淀悬浮于最适MEM培养基(2×107个细胞/ml)并在3次冻融后，与脂质试剂DOSPER(BoehringerMannheim)(106个细胞/25μl)混合并在室温下放置15分钟。然后，用混合物(106个细胞/孔，24-孔平板)转染表达F的LLC-MK2/F7细胞并用不含血清的MEM培养基(含有40μg/ml的AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)培养。在第7天回收培养上清液并定义为P1-d7样品。而且，在37℃把全部的上清液都感染给接种到12孔平板上的表达F的LLC-MK2/F7细胞1小时。然后，用MEM培养基冲洗一次后，在不含血清的MEM培养基(含有40μg/ml的AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)中培养细胞。在第7天回收培养物上清液并定义为P2-d7样品。另外，在37℃把全部的上清液都感染给接种到6孔平板上的表达F的LLC-MK2/F7细胞1小时。然后，用MEM培养基冲洗一次后，在不含血清的MEM培养基(含有7.5μg/ml胰蛋白酶)中培养细胞。在第7天回收培养物上清液并定义为P3-d7样品。进一步，在37℃把全部的上清液都感染给接种到10cm平板上的表达F的LLC-MK2/F7细胞1小时。然后，用MEM培养基冲洗一次后，在不含血清的MEM培养基(含有40μg/ml的AraC和7.5μg/ml胰蛋白酶)中培养细胞。在第7天回收培养物上清液并定义为P4-d7样品。
<通过给表达LacZ的细胞的计数来测定CIU(LacZ-CIU)>
以2.5×106个细胞/孔把LLC-MK2细胞接种到6孔平板上，培养24小时后，用不含血清的MEM培养基冲洗一次细胞并且在37℃用MEM培养基连续稀释1/10倍的P3-d7感染1小时。然后，用MEM培养基把这些细胞冲洗一次并加入1.5ml的含有10％血清的MEM培养基。在37℃培养3天后，用β-Gal染色试剂盒(Invitrogen)染色该细胞。图44显示了重复三次的实验结果。由于对LacZ染色阳性的细胞计数，在任何情况下在P3-d7样品中都得到1×106CIU/ml病毒。
[实施例15]用仙台病毒中的极性作用调节基因表达量
<SeV基因组cDNA的构建>
在各基因的起始信号和ATG翻译起始信号之间，把另外新的NotI位点引入仙台病毒(SeV)全长基因组cDNA，即pSeV(+)中(Kato，A.等，《基因细胞》1：569-579，1996)。尤其是，用琼脂凝胶电泳分离用SphI/SalI消化的pSeV(+)的片段(2645bp)、ClaI消化的pSeV(+)的片段(3246bp)和ClaI/EcoRI消化的pSeV(+)的片段(5146bp)并且切取相应的条带，然后将其回收并用QIAEXII凝胶提取系统(QIAGEN)纯化，如图45(A)所示。为了亚克隆，把SphI/SalI消化的片段、ClaI消化的片段和ClaI/EcoRI消化的片段分别连接于LITMUS38(新英格兰生物实验室)、pBluescriptII KS+(STRATAGENE)和pBluescriptII KS+(STRATAGENE)。使用快速变化的位点指示诱变试剂盒(STRATAGENE)以引入NotI位点。对每次引入所合成和使用的引物，对NP-P来说，为有义链：5′-ccaccgaccacacccagcggccgcgacagccacggcttcgg-3′(SEQ IDNO：19)，反义链：5′-ccgaagccgtggctgtcgcggccgctgggtgtggtcggtgg-3′(SEQ IDNO：20)，对P-M来说，有义链为：5′-gaaatttcacctaagcggccgcaatggcaga tatctatag-3′(SEQ ID NO：21)，反义链为：5′-ctatagatatctgccattgcggccgcttaggtg aaatttc-3′(SEQID  NO：22)，对M-F来说，有义链为5′-gggataaagtcccttgcggccgcttggttgcaaaactctccc-3′(SEQ ID NO：23)，反义链为5′-ggggagagttttgcaaccaagcggccgcaagggactttatccc-3′(SEQ ID NO：24)，对F-HN来说，有义链为5′-ggtcgcgcggtactttagcggccgcctcaaacaagcacagatcatgg-3′(SEQ ID NO：25)，反义链为5′-ccatgatctgtgcttgtttgaggcggccgctaaagtaccgcgcgacc-3′(SEQ ID NO：26)，对HN-L来说，有义链为5′-cctgcccatccatgacctagcggccgcttcccattcaccctggg-3′(SEQID NO：27)，反义链为5′-cccagggtgaatgggaagcggccgctaggtcatggatgggcagg-3′(SEQ ID NO：28)。
使用SalI/SphI片段作NP-P的模板，ClaI片段作P-M和M-F的模板并且用ClaI/EcoRI片段作F-HN和HN-L的模板，如上所述将其亚克隆，并且按照可快速变化的位点指示诱变试剂盒所附的说明进行引入。用亚克隆所用的相同酶再消化所得物、回收并纯化。然后，将它们装配成仙台病毒基因组cDNA。结果，如图45(B)所示构建了5种仙台病毒的基因组cDNA(pSeV(+)NPP、pSeV(+)PM、pSeV(+)MF、pSeV(+)FHN和pSeV(+)HNL)，其中把NotI位点引入每个基因之间。
作为测试基因表达量的报道基因，通过PCR亚克隆人分泌型的碱性磷酸酶(SEAP)。作为引物，合成了加有AscI限制酶位点的5′引物：5′-gcggcgcgccatgctgctgctgctgctgctgctgggcctg-3′(SEQ ID NO：29和3′引物：5′-gcggcgcgcccttatcatgtctgctcgaagcggccggccg-3′(SEQ ID NO：30)，并进行PCR。用pSEAP-Basic(CLONTENCH)作模板并用Pfu tourbo DNA聚合酶(STRATAGENE)作酶。PCR之后，用AscI消化所得物，然后回收并用电泳法纯化。构建了在其NotI位点掺有含多克隆位点(PmeI-AscI-SwaI)和终止信号-间插序列-起始信号的合成双链DNA[有义链：5′-gcggccgcgtttaaacggcgcgccatttaaatccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc-3′(SEQ ID NO：31，反义链：5′-gcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggatttaaatggcgcgccgtttaaacgcggccgc-3′(SEQ ID NO：32]的pBluescriptII KS+作为亚克隆的质粒(图46)。把回收和纯化的PCR产物连接到质粒的AscI位点并克隆。用NotI消化所得物并回收SEAP基因片段，通过电泳法纯化以分别连接到5种类型的仙台病毒基因组的cDNA和pSeV18+的NotI位点。把所得到的病毒载体分别命名为pSeV(+)NPP/SEAP、
pSeV(+)PM/SEAP、pSeV(+)MF/SEAP、pSeV(+)FHN/SEAP、pSeV(+)HNL/SEAP和pSeV18(+)/SEAP。
<病毒的重建>
以2×106个细胞/平皿把LLC-MK2细胞接种到100cm的培养平皿上，培养24小时后，在室温下用表达T7聚合酶的重组痘苗病毒(PLWUV-VacT7)(Fuerst，T.R.等，Pro.Natl.Acad.Sci.美国83：8122-8126，1986，Kato，A.等，《基因细胞》1：569-579，1996)感染该细胞1小时(感染复数＝2)。其中把病毒用补骨脂和UV预处理。分别以12μg、4μg、2μg和4μg/平皿的比例把每种掺有SEAP、pGEM/NP、pGEM/P和pGEM/L的仙台病毒cDNA悬浮于最适MEM培养基(GIBCO)中，加入110μlSuperfect转染试剂(QIAGEN)，将其在室温下放置15分钟并加入3ml含有3％FBS的最适MEM。然后，冲洗细胞并加入DNA-SuperFect混合物。培养3到5小时后，用不含血清的MEM培养基把这些细胞冲洗两次，并在含有胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖甙(AraC)的MEM培养基中培养72小时。回收这些细胞并将粒状沉淀悬浮于1mlPBS中，冻融三次。把100μl所得物接种到鸡胚中，该鸡胚预接种了10天，再在35℃温育3天，然后回收绒毛尿囊液。把所收集的绒毛尿囊液稀释到10-5到10-7并给鸡胚再接种使其成为不含病毒的疫苗，然后同样地回收并在-80℃储存一小份。将该病毒载体命名为SeVNPP/SEAP、SeVPM/SEAP、SeVMF/SEAP、SeVFHN/SEAP、SeVHNL/SEAP和SeV18/SEAP。
<用噬斑测定法进行滴度测定>
以5×105个细胞/孔把CV-1细胞接种到6孔平板上并培养24小时。用PBS冲洗后，用BSA/PBS(PBS中含1％BSA)稀释为10-3、10-4、10-5、10-6和10-7的重组SeV给细胞接种1小时，再用PBS冲洗，然后以3ml/孔的BSA/MEM/琼脂(0.2％BSA+2×MEM，混有等体积的2％琼脂)涂布并在37℃0.5％二氧化碳下培养6天。培养后，加入3ml乙醇/醋酸(乙醇∶醋酸＝1∶5)并放置3小时，然后用琼脂去除。用PBS冲洗三次后，在室温用稀释100倍的兔抗仙台病毒抗体温育细胞1小时。然后，用PBS冲洗三次后，在室温用稀释了200倍的Alexa FlourTM标识的山羊抗兔Ig(G+H)(分子探针)把细胞接种1小时。用PBS冲洗三次后，通过荧光图象分析仪LAS1000(富士胶片)得到荧光图象并测定噬斑。结果显示在图47中。另外，所得到的滴度结果显示在表3中。
    表3：从噬斑测定法测得的各重组仙台病毒的滴度结果
    重组病毒     滴度(pfu/ml)
    SeV18/SEAP      3.9×109
    SeVNPP/SEAP      4.7×108
    SeVPM/SEAP      3.8×109
    SeVMF/SEAP      1.5×1010
    SeVFHN/SEAP      7.0×109
    SeVHNL/SEAP      7.1×109
<报导基因表达的比较>
分别以1-5×105个细胞/孔把LLC-MK2细胞接种到6孔平板上并培养24小时，在感染复数＝2感染各病毒载体。24小时后，回收100μl培养物上清液并进行SEAP测定。用报导测定试剂盒-SEAP-(东洋纺)完成检测并用荧光图象分析仪LAS1000(富士胶片)测定。通过把SeV18+/SEAP的值指定为100，以相对值来显示所测值。结果，如图48中所示，不管插入SEAP基因的位置如何都测定到了SEAP的活性。发现趋于基因组的下游SEAP的活性下降，即表达量下降。另外，当把SEAN基因插入NP和P基因之间时，与当把SEAP插入NP基因上游时并且把SEAP基因插入P和M基因之间时相比，测定到中等表达量。
[实施例16]用双倍缺陷的ΔF-HN的涂布方法增加缺陷SeV的增殖效率
由于现在所用的SeV病毒重建方法使用了表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗蛋白(vTF7-3)，痘苗病毒的细胞毒性杀灭了部分感染的细胞。另外，病毒增殖可能仅仅在部分细胞中并且如果在更多细胞中有效和持久地进行病毒增殖这是优选的。但是，在副粘病毒情况中，当相同类型病毒的F和HN蛋白同时存在于细胞表面时，会发生合胞体形成(Lamb和Kolakofsky，1996，Fields virology，第1189页)。因此，难以对FHN共表达的细胞进行传代培养。所以，本发明人考虑到了缺陷病毒的回收效率可以通过在重建细胞上涂布表达缺陷蛋白(F和HN)辅助细胞的方法来增加。通过检测具有不同FHN表达时间的涂布细胞，FHN共缺陷病毒的病毒回收效率显著增加。
在室温用PLWUV处理的痘苗病毒在感染复数＝2感染在10cm培养基平皿上生长成100％融合的LLC-MK2细胞(1×107个细胞/平皿)1小时。之后，分别(3ml/10cm平皿作最终体积)混合12μg/10cm平皿、4μg/10cm平皿、2μg/10cm平皿、4μg/10cm平皿的含有d2EGFP FHN缺陷的cDNA(pSeV18/ΔFHN-d2GFP(实施例8))、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/L和pGEM/FHN，并且使用基因导入试剂SuperFect(QIAGEN)，采用类似于重建F缺陷病毒的上述方法用基因引入LLC-MK2细胞中。3小时后，用不含血清的培养液冲洗细胞三次，然后，低速离心(1000rpm/2分钟)回收脱离细胞并悬浮于含有40μg/ml胞嘧啶β-D-阿拉伯呋喃糖苷的AraC(Sigma)和7.5μg/ml的胰蛋白酶(GIBCO)的无血清的MEM培养基中，并加到细胞中培养一夜。将分离制备的FHN共表达的细胞，它们在10cm培养平皿中为100％融合，在感染复数＝10用腺病毒AxCANCre诱导，并且用5ml的PBS(-)在第4小时、第6小时、第8小时、第2天和第3天分别对细胞冲洗一次，并用细胞解离溶液(Sigma)剥离。通过低速离心(1000rpm/2分钟)回收细胞并悬浮于含有40μg/ml的AraC(Sigma)和7.5μg/ml的胰蛋白酶(GIBCO)的无血清的MEM培养基中。然后将其加给重建了FHN共缺陷病毒(P0)的细胞中并培养一夜。细胞涂布后两天，使用荧光显微镜观察细胞以确认通过细胞内GFP表达的病毒的扩散。结果显示在图49中。当与没有细胞涂布的通常情况(左边平面)相比，当细胞涂布在细胞上(右边)时观察到明显多的表达GFP的细胞。回收这些细胞，将其悬浮于107个细胞/ml的最适MEM培养基(GIBCO)中并且冻融三次来制备细胞裂解物。然后，用该裂解物以106个细胞/100μl/孔感染诱导后2天的FHN共表达的细胞，并且在37℃5％二氧化碳培养箱中在含有40μg/ml的AraC(Sigma)和7.5μg/ml的胰蛋白酶(GIBCO)的无血清的MEM培养基中培养2天，通过CIU-GFP测定P1细胞的培养物上清液的病毒滴度(表4)。结果，FHN感染后4小时，没有测定到病毒扩增的作用，并且由于细胞的涂布在感染后6小时或更长时间测定到显著的扩增作用。尤其是，在进行细胞涂布6小时后释放到P1细胞培养物上清液中的病毒比没有进行细胞涂布时多10倍。
表4：用双倍缺陷的ΔF-HN的细胞涂布方法扩增缺陷SeV
GFP-CIU×103/ml
FHNccll+ad/cre
FIIN细胞4小时6小时8小时2天3天
8-106-980-10070-10060-10020-50
[实施例17]对假型仙台病毒具有F缺陷的基因组的确认
对感染细胞的细胞提取物进行蛋白质印迹法分析以证实通过上述表达VSV-G基因增殖的病毒是否是F缺陷型。结果，测定到了来自仙台病毒的蛋白，相反没有测定到F蛋白，证实了它是F缺陷型(图50)。
[实施例18]抗VSV抗体对含有F和HN基因缺陷的基因组的假型仙台病毒感染性的作用
为了发现通过VSV-G表达系所获得的含有F和HN基因缺陷的基因组的假型仙台病毒是否在其衣壳体中含有VSV-G蛋白，使用抗VSV抗体检测是否影响感染性的中和活性。把病毒溶液和抗体混合并在室温下放置30分钟。然后，用该混合物感染没有诱导VSV-G表达的LLCG-L1细胞，并且通过表达GFP细胞是否存在分析第4天的基因导入能力。结果，通过在含有F和HN基因缺陷的基因组的假型仙台病毒(在图中VSV-G)中的抗VSV抗体看到对感染性的显著抑制，相反在含有衣壳体的仙台病毒(在图中F、HN)中没有测定到抑制(图51)。这样，证实了本发明实施例所得到的病毒是含有VSV-G蛋白作为其衣壳体的假型仙台病毒，并且抗体能够特异性抑制其感染。
[实施例19]采用密度梯度超离心法纯化含有F基因缺陷的和F和HN基因缺陷的基因组的假型仙台病毒
使用病毒感染细胞的培养物上清液进行蔗糖密度梯度超离心，以分级分离和纯化含有F基因和F和HN基因的缺陷基因组的假型仙台病毒。用20到60％的梯度把病毒溶液加到蔗糖溶液之上，然后使用SW41转头(Beckman)以29000rpm超离心15到16小时。超离心后，在试管底部作孔，然后使用分级收集器收集300μl馏分。对每个馏分，进行Western分析以试验病毒是含有缺陷F基因或F和HN基因的基因组的假型仙台病毒，并且用VSV-G蛋白作衣壳体。用上述方法完成Western分析。结果，在F缺陷的假型仙台病毒中的相同馏分里测得源自仙台病毒的蛋白、HN蛋白和VSV-G蛋白，但没有测得F蛋白，这证实了它是F缺陷的假型仙台病毒。另一方面，在F和HN缺陷的假型仙台病毒中，在相同馏分里测得了源于仙台病毒的蛋白和VSV-G蛋白，相而没有测得F和HN蛋白，这证实了它是F和HN缺陷的假型仙台病毒(图52)。
[实施例20]通过含有F基因缺陷的以及F和HN基因缺陷的基因组的假型仙台病毒来克服血细胞凝集作用
或者用含有F基因缺陷的和F或HN基因缺陷的基因组的假型仙台病毒或者用含有正常衣壳体的仙台病毒感染LLC-MK2细胞，并在第3天，加入1％鸡红血细胞悬浮液，并在4℃放置30分钟。之后，观察感染的表达GFP细胞的细胞表面。结果，对含有F基因缺陷的基因组的病毒和F缺陷的假型仙台病毒(Sev/ΔF和带SVS-G的假型Sev/ΔF(VSV-G))来说，在感染的细胞表面观察到了凝集反应，对含有原始衣壳体的仙台病毒也是一样。另一方面，对含有F和HN基因缺陷的基因组的假型仙台病毒(Sev/ΔF-HN(VSV-G))来说，在感染细胞表面没有观察到凝集反应(图53)。
[实施例21]含有F基因缺陷基因组的VSV-G假型仙台病毒对培养的细胞的感染特异性
通过用流式细胞计量术感染后3天的存活细胞中的表达GFP的程度来测定含有F基因缺陷基因组的VSV-G假型仙台病毒对培养的细胞的感染特异性。使用在含有F基因缺陷的基因组的假型仙台病毒的LLC-MK2细胞中几乎显示出相同感染效率，含原始衣壳体的仙台病毒用作对照组。结果，在人卵巢癌HRA细胞中没有发现感染效率的差异，而相对于对照组，在T细胞谱系中的Jurkat细胞中含有F基因缺陷的基因组的VSV-G假型仙台病毒的感染效率增加了约2倍(图54)。
[实施例22]含有NGF的F缺陷型仙台病毒载体的构建
<NGF/SeV/ΔF的重建>
按照上述“包膜质粒+表达F的细胞涂布方法”完成NGF/SeV/ΔF的重建。通过使用抗SeV多克隆抗体的方法完成滴度的测定。
<NGF/SeV/ΔF病毒基因组的确认(RT-PCR)>
为了证实NGF/SeV/ΔF(RT-PCR)病毒基因组(图55，较上平面)，离心从LLC-MK2/F7细胞中回收的培养物上清液，并按照厂商手册用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(QIAGEN)提取RNA。使用RNA模板，用SUPERSCRIPTTMONE-STEPTMRT-PCR系统(GIBCO BRL)进行RT-PCR的合成和PCR。使用另外类型的SeV cDNA(pSeV18+b(+))(Hasan，M.K.等，J.GeneralVirology78：2813-2820，1997)作为对照组。把NGF-N和NGF-C用作PCR引物。对NGF-N来说，使用正向：ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAGTAATGTCCATGTTGTTCTACACTCTG(SEQ ID NO：33)，并且对NGF-C来说，使用反向：ATCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGCCTCTTCTTGTAGCCTTCCTGC(SEQ ID NO：34)。结果，当使用NGF-N和NGF-C作引物时，在RT条件下对NGF/SeV/ΔF测定NGF特殊条带。对对照组来说，没有测得条带(图55，底部平面)。
[实施例23]NGF蛋白定量和感染含有NGF基因的F缺陷型SeV后体外表达活性的测定
使用在直径为10cm或6cm的培养平板上生长至几乎融合的LLC-MK2/F或LLC-MK2细胞完成感染和NGF蛋白的表达。在感染复数为0.01时，把NGF/SeV/ΔF和NGF/SeV/ΔF-GFP感染给LLC-MK2/F细胞，并且把NGF/SeV和GFP/SeV感染给LLC-MK2细胞，用不含血清含有7.5μg/ml的胰蛋白酶(GIBCO)的MEM培养基培养3天。培养3天后，其中几乎100％的细胞被感染，把培养基更换成不含胰蛋白酶和血清的MEM培养基并且再培养3天。然后，回收每个培养物上清液并在48,000×g离心60分钟。然后，进行NGF蛋白定量和感染含有NGF基因的F缺陷型SeV后体外表达活性的测定。尽管在本实施例中，把F缺陷型SeV(NGF/SeV/ΔF，NGF/SeV/ΔF-GFP)(见图55)感染给LLC-MK2/F细胞，如果用较高的感染复数(如1或3)感染，即，从开始几乎感染了100％细胞，也能用不表达F的细胞进行得出相似结果的试验。
对NGF蛋白定量来说，使用ELISA试剂盒NCF Emax免疫测定系统(Promega)和所附的手册。分别在NGF/SeV/ΔF、NGF/SeV/ΔF-GFP和NGF/SeV感染的细胞培养物上清液中测得32.4μg/ml、37.4μg/ml和10.5μg/ml的NGF蛋白。在NGF/SeV/ΔF和NGF/SeV/ΔF-GFP感染的细胞的培养物上清液中，存在高浓度的NGF蛋白，类似于NGF/SeV感染的细胞的培养物上清液，证实了F缺陷型SeV能够表达足够的NGF。
完成NGF蛋白体外活性的测定是通过使用鸡背部根神经节的解离培养物(DRG；鸡的感觉神经元)，该神经节是鸡的感觉神经元，并且使用维持存活活性作指标(神经生长因子(Wiley，纽约)，第95-109页(1989))。从第10天的鸡胚胎中取出背根部神经节，并在37℃0.25％胰蛋白酶(GIBCO)处理20分钟后将其分散。使用含有100单位/ml青霉素(GIBCO)、100单位/ml链霉素(GIBCO)、250ng/ml的两性霉素B(GIBCO)、20μM 2-脱氧尿苷(Nakarai)、20μM5-氟脱氧尿苷(Nakarai)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)和5％血清的高葡萄糖D-MEM培养基，以大约5000个细胞/孔把细胞接种到96孔平板上。使用前再用层粘素(Sigma)包被已用聚赖氨酸预包被的96孔平板(Iwaki)。在开始培养时，加入对照的NGF蛋白或提前制备好的SeV感染后培养物上清液。3天后，在显微镜下观察细胞以及通过加入Alamer兰(CosmoBio)并使用线粒体的还原活性作指标(测定590nm荧光，具有530nm激发)进行存活细胞的定量。在对照组(没有加入NGF)中得到等价荧光信号，并且加入用SeV/附加型GFP(GFP-SeV)感染的稀释1/1000的培养物上清液，而用NGF/SeV/ΔF、NGF/SeV/ΔF-GFP和NGF/SeV感染的细胞的1/1000稀释的培养物上清液引起显著的荧光密度的增加，并且判断为含有较高数量的存活细胞和存活活性(图56)。作用值与从ELISA中计算出的NGF蛋白的加入量具有可比性。在显微镜下的观察证实了相似作用。即，通过加入用NGF/SeV/ΔF、NGF/SeV/ΔF-GFP和NGF/SeV感染的细胞的培养物上清液，能够观察到存活细胞的增长和显著的轴突延伸(图57)。这样，证实了感染含有NGF的F缺陷型SeV后所表达的NGF是具有活性。
[实施例24]表达F细胞的详细分析
1.Adeno-Cre的感染复数和诱导时间
通过使用Adeno-Cre的不同感染复数、感染LLC-MK2/F细胞并在F蛋白诱导后，分析蛋白表达的量和细胞形状的变化。
在感染复数＝10的表达量微微高于感染复数＝1(图58)的量。当在诱导后6小时、12小时、24小时和48小时分析表达量时，在所有情况下都测定到在诱导后48小时F蛋白的高表达量。
此外，当用感染复数＝1、3、10、30和100感染细胞时，一直监控细胞形状的变化。尽管细胞在达到感染复数＝10发现显著差异，但在感染复数＝30或更高时观察到细胞毒性(图59)。
2.传代数
用Adeno-Cre把F蛋白诱导入LLC-MK2/F后，将细胞传代7次，用显微镜观察分析F蛋白的表达和细胞的形态学。另一方面，在传代到第20代的细胞中的F蛋白诱导后，使用激光显微镜来分析细胞内F蛋白的定位。
用于激光显微镜的观察，把用F蛋白表达诱导的LLC-MK2/F细胞倒入玻璃室内并且在培养一夜后，除去培养基并用PBS冲洗一次，然后用3.7％福尔马林-PBS固定5分钟。再用PBS冲洗细胞一次后，用0.1％TritonX100-PBS把细胞处理5分钟，并用抗F蛋白单克隆抗体(γ-236)(稀释100倍)和FITC所标记的山羊抗兔IgG抗体(稀释200倍)依次处理，最后用PBS冲洗并用激光显微镜观察。
结果，在传代7次的细胞中没有发现F蛋白表达量的差异(图60)。在形态学上、sev感染性和生产率方面也没有观察的显著差异。另一方面，当使用免疫-抗体方法分析细胞传代到20次的细胞F蛋白的细胞内定位时，到第15代未发现大的差异，但在传代多于15次的细胞中观察到F蛋白的定位趋向(图61)。
总之，我们认为在15代前的细胞对F缺陷SeV的生产是理想的。
[实施例25]GFP-CIU与抗-SeV-CIU之间的联系
分析两种方法测定的感染细胞的单位(CIU)结果之间的关系。以2×105个细胞/平皿把LLC-MK2细胞接种到12孔平板上，培养24小时后，用不含血清的MEM培养基冲洗一次细胞并且用100μl/孔SeV/ΔF-GFP感染。15分钟后，以1ml/孔加入不含血清的MEM培养基并且再培养24小时。培养后，用PBS(-)冲洗三次细胞并干燥(在室温下放置大约10到15分钟)并加入1ml/孔丙酮以固定细胞，并立刻去除。把细胞再干燥(在室温下放置10到15分钟)。然后，以300μl/给细胞加入从兔制备并用PBS(-)稀释100倍的抗SeV多克隆抗体(DN-1)并在37℃温育45分钟，并用PBS(-)冲洗三次。然后，以300μl/孔向细胞中加入用PBS(-)稀释了200倍的荧光标记的第二抗体抗兔IgG(H+D)(AlexTM568，分子探针)，在37℃温育45分钟并用PBS(-)冲洗三次。然后，在荧光显微镜下观察带荧光的细胞(发射：560nm，吸收：645nm，滤膜：Leica)。
作为对照组，用100μl/孔的SeV/ΔF-GFP感染细胞，并在15分钟后，以1ml/孔加入不含血清的MEM。再培养24小时后，在荧光显微镜下观察表达GFP的细胞(发射：360nm，吸收：470nm，滤膜：Leica)。
通过定量评价荧光密度得出良好的关系(图62)。
[实施例26]多克隆位点的构建
把多克隆位点加到SeV载体中。如下是所使用的两种方法。
1.破坏仙台病毒(SeV)全长基因组cDNA和pSeV18+的基因组cDNA上的几个限制位点，把含有所破坏的限制酶位点的其他新的限制酶位点引入每个基因的起始信号和ATG翻译起始信号之间。
2.向已经构建好的SeV载体cDNA中加入多克隆位点序列和转录起始信号-间插序列-终止信号并掺入NotI位点。
在作为引入方法的方法1中，通过琼脂电泳分离pSeV18+的EagI-消化的片段(2644bp)、ClaI-消化的片段(3246bp)、ClaI/EcoRI-消化的片段(5146bp)和EcoRI-消化的片段(5010bp)并截取相应的条带，然后将其回收并用QIAEXII凝胶提取系统(QIAGEN)纯化。连接EagI-消化的片段并亚克隆到LITMUS38(新英格兰生物实验室)中，并且把ClaI-消化的片段、ClaI/EcoRI-消化的片段和EcoRI-消化的片段连接并亚克隆到pBluescriptIIKS+(STRATAGENE)中。使用快速变化的位点指示诱变试剂盒(STRATAGENE)来破坏并引入限制位点。
对破坏限制酶位点来说，合成Sal I：(有义链)5′-ggagaagtctcaacaccgtccacccaagataatcgatcag-3′(SEQ ID NO：35)，(反义链)5′-ctgatcgattatcttgggtggacggtgttgagacttctcc-3′(SEQ ID NO：36)，Nhe I：(有义链)5′-gtatatgtgttcagttgagcttgctgtcggtctaaggc-3′(SEQ ID NO：37)，(反义链)5′-gccttagaccgacagcaagctcaactgaacacatatac-3′(SEQ ID NO：38)，Xho I：(有义链)5′-caatgaactctctagagaggctggagtcactaaagagttacctgg-3′(SEQ ID NO：39)，(反义链)5′-ccaggtaactctttagtgactccagcctctctagagagttcattg-3′(SEQ ID NO：40)，并且为了导入限制酶，合成NP-P：(有义链)5′-gtgaaagttcatccaccgatcggctcactcgaggccacacccaaccccaccg-3′(SEQ ID NO：41)，(反义链)5′-cggtggggttgggtgtggcctcgagtgagccgatcggtggatgaactttcac-3′(SEQ IDNO：42)，P-M：(有义链)5′-cttagggtgaaagaaatttcagctagcacggcgcaatggcagatatc-3′(SEQ ID NO：43)，(反义链)5′-gatatctgccattgcgccgtgctagctgaaatttctttcaccctaag-3′(SEQ ID NO：44)，M-F：(有义链)5′-cttagggataaagtcccttgtgcgcgcttggttgcaaaactctcccc-3′(SEQ ID NO：45)，(反义链)5′-ggggagagttttgcaaccaagcgcgcacaagggactttatccctaag-3′(SEQ ID NO：46)，F-FH：(有义链)5′-ggtcgcgcggtactttagtcgacacctcaaacaagcacagatcatgg-3′(SEQ ID NO：47)，(反义链)5′-ccatgatctgtgcttgtttgaggtgtcgactaaagtaccgcgcgacc-3′(SEQ ID NO：48)，HN-L：(有义链)5′-cccagggtgaatgggaagggccggccaggtcatggatgggcaggagtcc-3′(SEQ ID NO：49)，(反义链)5′-ggactcctgcccatccatgacctggccggcccttcccattcaccctggg-3′(SEQ ID NO：50)，并用于反应。引入后，回收各片段并如上类似地纯化，并装配cDNA。
在用方法2时，合成(有义链)5′-ggccgcttaattaacggtttaaacgcgcgccaacagtgttgataagaaaaacttagggtgaaagttcatcac-3′(SEQ ID NO：51)和(反义链)5′-ggccgtgatgaactttcaccctaagtttttcttatcaacactgttggcgcgcgtttaaaccgttaattaagc-3′(SEQ ID NO：52)，磷酸化后，通过85℃退火2分钟、65℃退火15分钟、37℃退火15分钟和室温退火15分钟来掺入SeV cDNA。或者，使用含有终止信号-间插序列-起始信号的引物通过PCR亚克隆pUC18或pBluescriptII等的多克隆位点，然后把所得物掺入SeV cDNA。如上所述通过重组cDNA进行病毒重建。
                     工业实用性
本发明提供了副粘病毒科的包膜基因缺陷型病毒载体。本发明首次建立了新的实用的基于负链RNA病毒的包膜基因缺陷型载体系统。利用仙台病毒的优异特性，使用辅助细胞实现了从F基因缺陷型、FHN基因缺陷型基因组cDNA中回收感染缺陷型病毒颗粒，为研究和开发基因治疗的新载体铺平了道路。本发明的缺陷型仙台病毒载体能够高效地把基因引入各种类型的细胞中，并非凡地高水平表达外源基因。而且，在持续感染细胞中能够表达这种载体，并且由于该载体不能释放二级感染病毒的颗粒，所以它是一个完全失去了引起病毒增殖的能力的高度安全的载体。
                 序列表<110>株式会社载体研究所(DNAVEC Research Inc.)<120>副粘病毒科的包膜基因缺陷型病毒载体<130>D3-103PCT<140><141><150>JP 1999-200739<151>1999-05-18<160>52<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>1atgcatgccg gcagatga                                            18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>2gttgagtact gcaagagc                                           18<210>3<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>3tttgccggca tgcatgtttc ccaaggggag agttttgcaa cc                    42<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>4atgcatgccg gcagatga                                               18<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>5tgggtgaatg agagaatcag c                                           21<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>6atgcatatgg tgatgcggtt ttggcagtac                                  30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>7tgccggctat tattacttgt acagctcgtc                                  30<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>8atcagagacc tgcgacaatg c                                           21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>9aagtcgtgct gcttcatgtg g                                           21<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>10acaaccacta cctgagcacc cagtc                                       25<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>11gcctaacaca tccagagatc g                                            21<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>12acattcatga gtcagctcgc                                              20<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>13atcagagacc tgcgacaatg c                                            21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>14aagtcgtgct gcttcatgtg g                                            21<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>15gaaaaactta gggataaagt ccc                                           23<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>16gttatctccg ggatggtgc                                               19<210>17<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>17gcgcggccgc cgtacggtgg caaccatgtc gtttactttg accaa                  45<210>18<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>18gcgcggccgc gatgaacttt caccctaagt ttttcttact acggcgtacg ctattacttc  60tgacaccaga ccaactggta                                              80<210>19<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>19ccaccgacca cacccagcgg ccgcgacagc cacggcttcg g                   41<210>20<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>20ccgaagccgt ggctgtcgcg gccgctgggt gtggtcggtg g                    41<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>21gaaatttcac ctaagcggcc gcaatggcag atatctatag                      40<210>22<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>22ctatagatat ctgccattgc ggccgcttag gtgaaatttc                      40<210>23<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>23gggataaagt cccttgcggc cgcttggttg caaaactctc ccc                   43<210>24<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>24ggggagagtt ttgcaaccaa gcggccgcaa gggactttat ccc                   43<210>25<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>25ggtcgcgcgg tactttagcg gccgcctcaa acaagcacag atcatgg               47<210>26<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>26ccatgatctg tgcttgtttg aggcggccgc taaagtaccg cgcgacc               47<210>27<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>27cctgcccatc catgacctag cggccgcttc ccattcaccc tggg                   44<210>28<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>28cccagggtga atgggaagcg gccgctaggt catggatggg cagg                   44<210>29<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>29gcggcgcgcc atgctgctgc tgctgctgct gctgggcctg                        40<210>30<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>30gcggcgcgcc cttatcatgt ctgctcgaag cggccggccg                        40<210>31<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>31gcggccgcgt ttaaacggcg cgccatttaa atccgtagta agaaaaactt agggtgaaag                 60ttcatcgcgg ccgc                                                                   74<210>32<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>32gcggccgcga tgaactttca ccctaagttt ttcttactac ggatttaaat ggcgcgccgt                 60ttaaacgcgg ccgc                                                                   74<210>33<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>33acttgcggcc gccaaagttc agtaatgtcc atgttgttct acactctg                              48<210>34<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的序列<400>34atccgcggcc gcgatgaact ttcaccctaa gtttttctta ctacggtcag cctcttcttg                 60tagccttcct gc                                                                     72<210>35<211>40<21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Claims (13)

1.一种含有复合体的副粘病毒科病毒载体，所述复合体包含：(a)副粘病毒衍生的负链单链RNA，其已被修饰为不表达副粘病毒科的病毒的至少一种包膜蛋白，和(b)与该负链单链RNA结合的蛋白。
2.权利要求1的载体，其中所述负链单链RNA表达NP蛋白、P蛋白和L蛋白，并且已被修饰为不表达F蛋白和/或HN蛋白。
3.权利要求1或2的载体，它至少含有一种包膜蛋白，该蛋白的表达在修饰的负链单链RNA中受到抑制。
4.权利要求1到3中任何一项的载体，其含有VSV-G蛋白。
5.权利要求1到4中任何一项的载体，其中所述负链单链RNA源于仙台病毒。
6.权利要求1到5中任何一项的载体，其中所述负链单链RNA还编码一种外源基因。
7.一种DNA，其编码权利要求1到6中任何一项的载体中所含的负链单链RNA或其互补链。
8.一种生产权利要求1到6中任何一项所述载体的方法，该方法含有下列步骤：
(a)通过将载体DNA导入细胞而使其表达，其中所述载体编码副粘病毒衍生的负链单链RNA或其互补链且经修饰而不表达副粘病毒科病毒的至少一种包膜蛋白，而所述细胞则表达所述包膜蛋白，
(b)培养所述细胞，并且
(c)从培养上清中回收病毒颗粒。
9.一种生产权利要求1到6中任何一项所述载体的方法，该方法含有下列步骤：
(a)将一种复合体导入细胞，其中所述复合体含有经修饰不表达副粘病毒科病毒的至少一种包膜蛋白的副粘病毒衍生性负链单链RNA和能与所述负链单链RNA结合的蛋白，而所述细胞能表达所述包膜蛋白，
(b)培养所述细胞，并且
(c)从培养上清中回收病毒颗粒。
10.权利要求8或9的方法，其中步骤(b)的细胞培养是与表达包膜蛋白的细胞共培养。
11.权利要求8或9的方法，其中在步骤(b)的细胞培养中将表达包膜蛋白的细胞置于所述细胞的上层。
12.权利要求8到11中任何一项所述的方法，其中细胞所表达的至少一种包膜蛋白与在上述负链单链RNA中表达受到抑制的至少一种包膜蛋白相同。
13.权利要求8到12中任何一项所述的方法，其中由细胞表达的至少一种包膜蛋白是VSV-G蛋白。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102573897A (zh) * 2009-11-02 2012-07-11 国立大学法人三重大学 使用副粘病毒载体的经鼻喷雾型结核疫苗
CN1934260B (zh) * 2004-01-22 2013-03-13 株式会社载体研究所 利用含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的杂合启动子制造负链RNA病毒载体的方法
CN103189508A (zh) * 2010-08-30 2013-07-03 生物载体株式会社 用于诱导多能性干细胞的组合物及其用途
CN107849558A (zh) * 2015-06-12 2018-03-27 国立大学法人三重大学 2型人副流感病毒载体和疫苗

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7241617B2 (en) 1998-07-03 2007-07-10 Dnavec Research, Inc. Sendai viral vectors comprising foreign genes inserted between the R1 and R2 Loci
CN1249248C (zh) * 1998-07-03 2006-04-05 株式会社载体研究所 用于神经细胞转移基因的负链rna病毒载体
US7226786B2 (en) 1999-05-18 2007-06-05 Dnavec Research Inc. Envelope gene-deficient Paramyxovirus vector
CN1418252A (zh) * 2000-01-19 2003-05-14 株式会社载体研究所 副粘病毒属载体在血管内基因转移中的用途
EP1270016A4 (en) 2000-03-30 2005-10-19 Dnavec Research Inc VACCINE AGAINST AIDS VIRUS CONTAINING A VECTOR OF SENDAI VIRUS
JP2002142770A (ja) 2000-11-08 2002-05-21 Dnavec Research Inc 循環系への遺伝子送達用パラミクソウイルスベクター
WO2002042481A1 (fr) 2000-11-27 2002-05-30 Dnavec Research Inc. Vecteur paramyxovirus codant pour un gene d'angiogenese et son utilisation
US8715922B2 (en) 2001-01-19 2014-05-06 ViroNovative Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
US8927206B2 (en) 2001-01-19 2015-01-06 Vironovative B.V. Virus causing respiratory tract illness in susceptible mammals
FR2826010B1 (fr) * 2001-06-14 2005-02-25 Mahmood Salman Al Oligonucleotides antisens capables d'inhiber la formation des tubes capillaires par les cellules endotheliales
CN1633599A (zh) * 2001-09-18 2005-06-29 株式会社载体研究所 检查和制造降低了粒子形成能力的(－)链rna载体的方法
MXPA04008088A (es) 2002-02-21 2005-09-30 Medimmune Vaccines Inc Sistema de expresion del virus de parainfluenza recombinante y vacunas que comprenden antigenos heterologos derivados del metapneumovirus.
US7402427B2 (en) 2002-04-30 2008-07-22 Dnavec Research Inc. Vectors with modified protease-dependent tropism
KR100587388B1 (ko) * 2003-02-14 2006-06-08 주식회사 효성 고강도 폴리비닐알코올 섬유의 제조방법 및 그로부터수득되는 고강도 폴리비닐알코올 섬유
KR101187955B1 (ko) * 2003-04-25 2012-10-08 비로노바티브 비브이 메타뉴모바이러스 유래 이종 항원을 포함하는 재조합파라인플루엔자 바이러스 발현 시스템 및 백신
EP1636371B1 (en) * 2003-06-13 2012-04-25 Apath, LLC Negative strand rna virus replicon
AU2004286144A1 (en) * 2003-11-04 2005-05-12 Dnavec Research Inc. Method for producing gene transferred dendritic cells
KR20060129013A (ko) 2004-01-13 2006-12-14 가부시키가이샤 디나벡크 겐큐쇼 면역자극성 사이토카인을 코드하는 마이너스 가닥 ｒｎａ 바이러스 벡터를 사용하는 종양의 유전자 치료
JPWO2005071085A1 (ja) * 2004-01-22 2007-09-06 株式会社ディナベック研究所 ウイルスベクターの製造方法
JPWO2005097988A1 (ja) * 2004-03-23 2008-02-28 株式会社ディナベック研究所 組織の維持および／または修復に関連する骨髄関連細胞
CN101006172B (zh) * 2004-06-24 2012-09-05 株式会社载体研究所 包含导入了rna病毒的树突状细胞的抗癌剂
JP2008105946A (ja) * 2005-02-08 2008-05-08 Dnavec Corp 遺伝子導入造血細胞から血液細胞を再構築させる方法
DE102005015005A1 (de) * 2005-04-01 2006-10-05 Qiagen Gmbh Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe
CA2612168A1 (en) 2005-06-14 2006-12-21 Dnavec Corporation Methods for producing antibodies
WO2006137517A1 (ja) * 2005-06-24 2006-12-28 Dnavec Corporation 幼少個体への遺伝子導入用ベクター
ES2561060T3 (es) 2005-10-28 2016-02-24 Id Pharma Co., Ltd. Transferencia génica en citoblastos epiteliales de las vías respiratorias mediante el uso de vectores de lentivíricos pseudotipados con una proteína espina de virus de ARN
WO2007061141A1 (ja) * 2005-11-24 2007-05-31 Genomidea, Inc. 改変パラミクソウイルスおよびその作製方法
CN101405389A (zh) 2006-01-17 2009-04-08 生物载体株式会社 新型蛋白质表达系统
US20090246170A1 (en) 2006-05-31 2009-10-01 Dnavec Corporation Therapeutic Agent For Alzheimer's Disease
CA2658266A1 (en) 2006-07-13 2008-01-17 Dnavec Corporation Non-replicating paramyxoviridae virus vector
KR20090114431A (ko) 2007-02-07 2009-11-03 디나벡크 가부시키가이샤 약독화 마이너스 가닥 ｒｎａ 바이러스
JP4936482B2 (ja) * 2007-04-13 2012-05-23 独立行政法人産業技術総合研究所 改良された持続感染型センダイウイルスベクター
WO2008136438A1 (ja) 2007-04-27 2008-11-13 Kyushu University, National University Corporation 遺伝子治療用ウイルスベクター
EP2322611B1 (en) 2008-07-16 2016-06-01 IP Pharma Co., Ltd. Method for production of reprogrammed cell using chromosomally unintegrated virus vector
EP2363472B1 (en) 2008-10-31 2014-12-10 Dnavec Corporation Method for enhancing expression of recombinant protein
EP2401372A4 (en) 2009-02-27 2012-09-19 Univ Kyoto NEW NUCLEAR REPROGRAMMING SUBSTANCE
CA2770412C (en) 2009-08-07 2018-09-11 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
EP2480657B1 (en) 2009-09-24 2018-01-17 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
US8945576B2 (en) 2010-01-08 2015-02-03 Kyoto University Vaccine for treatment of tautopathy
US9005967B2 (en) 2010-01-22 2015-04-14 Kyoto University Myc variants improve induced pluripotent stem cell generation efficiency
AU2011241514A1 (en) 2010-04-16 2012-12-06 Dnavec Corporation Method for producing induced pluripotent stem cells
US9447408B2 (en) 2010-09-14 2016-09-20 Kyoto University Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
US20130302367A1 (en) 2010-10-22 2013-11-14 Hisatoshi Shida Virus vector for prime/boost vaccines, which comprises vaccinia virus vector and sendai virus vector
JP6029137B2 (ja) 2010-12-03 2016-11-24 国立大学法人京都大学 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法
EP2647698A4 (en) 2010-12-03 2015-10-07 Univ Kyoto PROCESS FOR PRODUCING EOSINOPHILES FROM PLURIPOTENT STEM CELLS
US8911975B2 (en) 2011-02-08 2014-12-16 Mie University Method for producing virus vector for gene transfer
WO2014103310A1 (ja) * 2012-12-26 2014-07-03 バイオコモ株式会社 ヒトパラインフルエンザ２型ウイルスベクターを利用したワクチン
DK3050961T3 (da) 2013-09-24 2023-08-14 Id Pharma Co Ltd Fremgangsmåde til forbedring af effektiviteten ved inducering af pluripotente stamceller
WO2018092887A1 (ja) 2016-11-17 2018-05-24 国立感染症研究所長が代表する日本国 非感染性パラミクソウイルス粒子を用いた感染症ワクチン
AU2018302668A1 (en) 2017-07-21 2020-02-06 I'rom Group Co., Ltd. Polynucleotide for modifying target sequence and use thereof
WO2019142933A1 (ja) 2018-01-22 2019-07-25 国立感染症研究所長が代表する日本国 選択的ｃｄ８陽性ｔ細胞誘導ワクチン抗原
KR20220129567A (ko) 2019-12-31 2022-09-23 엘릭서젠 쎄라퓨틱스, 인크. 핵산 및 단백질의 세포 및 조직으로의 온도-기반 일시적 전달
WO2022050419A1 (ja) 2020-09-04 2022-03-10 Ｈｅａｒｔｓｅｅｄ株式会社 ｉＰＳ細胞の品質改善剤、ｉＰＳ細胞の製造方法、ｉＰＳ細胞、及びｉＰＳ細胞製造用組成物
JPWO2022138964A1 (zh) 2020-12-25 2022-06-30

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5512421A (en) * 1991-02-19 1996-04-30 The Regents Of The University Of California Generation, concentration and efficient transfer of VSV-G pseudotyped retroviral vectors
KR100754091B1 (ko) * 1995-10-31 2007-08-31 가부시끼가이샤 디나벡 겡뀨쇼 자율 복제 능력을 갖는 (-)쇄 ｒｎａ 바이러스 벡터
CA2236378C (en) * 1995-11-01 2011-01-25 Dnavec Research Inc. Recombinant sendai virus
JP3992200B2 (ja) * 1995-11-01 2007-10-17 株式会社ディナベック研究所 組換え体センダイウイルスを利用した膜融合性リポソーム
ATE399206T1 (de) * 1999-05-18 2008-07-15 Dnavec Research Inc Ribonukleoproteinkomplex aus paramyxovirus

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1934260B (zh) * 2004-01-22 2013-03-13 株式会社载体研究所 利用含有巨细胞病毒增强子和鸡β-肌动蛋白启动子的杂合启动子制造负链RNA病毒载体的方法
CN102573897A (zh) * 2009-11-02 2012-07-11 国立大学法人三重大学 使用副粘病毒载体的经鼻喷雾型结核疫苗
CN103189508A (zh) * 2010-08-30 2013-07-03 生物载体株式会社 用于诱导多能性干细胞的组合物及其用途
US9090909B2 (en) 2010-08-30 2015-07-28 Dnavec Corporation Composition for inducing pluripotent stem cell, and use thereof
CN103189508B (zh) * 2010-08-30 2016-08-10 生物载体株式会社 用于诱导多能性干细胞的组合物及其用途
CN107849558A (zh) * 2015-06-12 2018-03-27 国立大学法人三重大学 2型人副流感病毒载体和疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
DE60035589T2 (de) 2008-04-17
DK1186667T3 (da) 2007-10-22
KR100739938B1 (ko) 2007-07-16
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EP1186667A1 (en) 2002-03-13
CA2368948A1 (en) 2000-11-23
ATE367445T1 (de) 2007-08-15
WO2000070070A1 (fr) 2000-11-23
KR20020014786A (ko) 2002-02-25
HK1044352A1 (en) 2002-10-18
AU4614600A (en) 2000-12-05
ES2288473T3 (es) 2008-01-16
CN1330767C (zh) 2007-08-08
CA2368948C (en) 2013-12-24
EP1186667B1 (en) 2007-07-18
JP2004329222A (ja) 2004-11-25
EP1186667A4 (en) 2004-06-30
JP3602058B2 (ja) 2004-12-15
DE60035589D1 (de) 2007-08-30

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