KR20020014786A - 엔벨로프 유전자 결손 파라믹소과 바이러스 벡터 - Google Patents

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Abstract

F 유전자를 결실시킨 센다이바이러스 게놈 cDNA를 사용하여, F 유전자를 결손한 바이러스 비리온을 회수하는 것에 성공했다. 더욱이, F 발현세포를 헬퍼세포로서 사용하여, F 유전자 결손형 감염성 바이러스입자를 제작하는 것에 성공했다. 또한, F 및 HN 유전자 양쪽을 결실시킨 바이러스 게놈 cDNA를 사용하여, F 및 HN 유전자를 결손한 바이러스 비리온을 회수하는 것에 성공했다. 또한, F 및 HN 발현세포를 헬퍼세포로서 사용하여, F, HN 유전자 결손형 감염성 바이러스입자를 제작하는 것에 성공했다. 또한, F 발현세포를 헬퍼세포로서 사용하여, F 단백질을 갖는 F, HN 유전자 결손형 바이러스의 작출도 행했다, VSV-G 발현세포를 사용하여, VSV-G 슈도타입 바이러스를 제작하는 것에도 성공했다. 이들 결손형 바이러스 생산기술은, 파라믹소바이러스에 있어서의 유전자치료용 벡터의 개발에 길을 여는 것이다.

Description

엔벨로프 유전자 결손 파라믹소과 바이러스 벡터{Paramyxoviridae virus vector defective in envelope gene}
지금까지의 유전자치료 임상연구의 어프로치의 대부분은 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 수반 바이러스 등의 바이러스 벡터가 이용되고 있다. 이들 유전자치료용 벡터는, 도입효율 및 지속발현에 제한이 있어, 벡터 자체에 세포독성 및 면역원성이 있는 등, 의학 응용상의 커다란 문제가 존재한다(Lamb,R.A. & Kolakofsky,D., Paramyxoviridae: the viruses and their replication.inFields Virology, 3rd edn, (Edited by B.N.Fields, D.M. Knipe & P.P Howley) pp.1177-1204(Philadelphia, Lippincott-Raven.(1996)). 이들의 대책으로서 렌티바이러스(lentivirus)나 HSV를 베이스로 하는 새로운 벡터가 제안되어 있고, 또한 기존 벡터의 개량연구가 정력적으로 행해지고 있다. 그러나, 이들 벡터는 어느 것도 생활환에 있어서, 핵내에서 DNA의 형태로 존재한다. 따라서, 환자의 염색체와의 랜덤한 상호작용에 관한 안전성으로의 위험성은 완전히 회피하는 것은 어렵다.
최근의 리버스 제네텍스(reverse genetics)기술의 급속한 진보에 의해, 종래개발이 뒤쳐졌던 RNA 바이러스를 베이스로 한 벡터의 개발이 가능해지고 있다. 재조합 RNA 바이러스는 높은 유전자도입 효율과 발현능력을 나타내, 유전자치료용 벡터로서의 높은 가능성을 보여준다(Roberts, A. & Rose, J.,K., Virology 247, 1-6(1998);Rose, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14998-15000(1996); Palese, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11354-11358(1996)). 그러나, 실용적으로 이용 가능한 약독바이러스(attenuated virus)의 결손형 게놈 유래의 파라믹소바이러스 벡터는 아직 보고되어 있지 않다.
음성가닥 RNA를 게놈에 갖는 파라믹소바이러스 벡터는, 레트로바이러스, DNA 바이러스, 또는 양성가닥 RNA 바이러스 벡터와는 크게 다른 몇 가지 특징을 가지고 있다. 그 게놈 또는 안티게놈은 직접 mRNA로서는 기능하지 않아, 바이러스의 단백질합성이나 게놈복제를 개시시킬 수는 없다. 바이러스의 RNA 게놈도 안티게놈도 항상 리보핵산 단백질복합체(ribonucleoprotein complex;RNP)의 형태로 존재하여, 양성가닥 RNA 바이러스에 보여지는 바와 같은, mRNA가 상보적인 나출(naked) 게놈 RNA에 하이브리다이즈하여 게놈의 RNP로의 어셈블리를 방해한다고 하는 안티센스의 문제가 거의 일어나지 않는다. 이들 바이러스는 자신의 RNA 폴리머라아제를 가지고 있어, RNP 복합체를 주형으로 하여 바이러스 mRNA의 전사 또는 바이러스 게놈의 복제를 행한다. 특필할 만한 사항에 음성가닥 RNA(nsRNA)바이러스는 숙주세포의 세포질에서만 증식하여, DNA 페이즈(phase)를 갖지 않기 때문에 염색체로의 함입(integration)은 일어나지 않는다. 더 나아가서는 RNA끼리의 상동 재조합도 인정되고 있지 않다. 이들 성질은 음성가닥 RNA 바이러스의 유전자 발현벡터로서의안정성과 안전성에 크게 기여할 것으로 생각된다.
본 발명자 등은 음성가닥 RNA 바이러스 중에서도 센다이바이러스(Sendaivirus;SeV)에 주목해 왔다. SeV는 비분절형 음성가닥 RNA 바이러스로, 파라믹소바이러스(paramyxovirus)에 속하고, murine parainfluenza virus의 일종이다. 이 바이러스는 2개의 엔벨로프 당단백질인 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(hemagglutinin-neuraminidase;HN)와 퓨젼단백질(fusion protein;F)을 매개로 하여 숙주세포막에 접착, 막융합을 일으켜, 효율적으로 자신의 RNA 폴리머라아제와 리보뉴클레오프로틴(RNP)복합체의 형태로 존재하는 RNA 게놈을 세포질로 방출하여, 거기에서 바이러스의 mRNA의 전사 및 게놈의 복제를 행한다(Bitzer, M. et al., J. Virol. 71(7):5481-5486, 1997). 바이러스 엔벨로프 단백질 F는 활성이 없는 전구단백(F0)으로서 합성되고, 트립신에 의한 단백질분해(proteolytic cleavage)로 F1과 F2로 나뉘어져(Kido, H. et al., Biopolymers(Peptide Science) 51(1):79-86, 1999), 활성형 단백질로 되어 막융합을 일으킨다. 이 바이러스는 인간에 대해 병원성이 없다고 말하여지고 있다. 또한, attenuated laboratory strain(Z strain)도 분리되어 있어, 자연숙주인 설치류에 대해 가벼운 정도의 폐렴을 유발할 정도이다. 이 주는 파라믹소바이러스의 전사복제기구 등의 분자레벨에 있어서의 연구모델로서 널리 사용되고 있고, 또한 하이브리도마(hybridoma)의 제작에도 사용되어 왔다. 이러한 높은 안전성 외에 이 바이러스는 세포주 또는 계란에서 109~11pfu/ml라는 높은 생산 타이터를 나타낸다. 최근 성공한 음성가닥 RNA 바이러스 벡터의 cDNA로부터의 회수시스템 속에서, 센다이바이러스의 경우는 특히 높은 재구성효율을 나타내고 있다. 외래유전자를 도입한 재조합형 야생 바이러스에서는 효율적이고 또한 안정적으로 도입 외래유전자를 발현하는 능력이 주목받고 있다.
이와 같이, 음성가닥 RNA 바이러스는 유전자도입 벡터로서 많은 잇점을 갖지만, 유전자치료에 응용하기 위해서는, 세포에 감염시킨 경우, 감염성 입자가 방출되지 않는 안전성이 높은 벡터를 개발하는 것이 요망된다. 이를 위해서는, 야생형 바이러스 생산능을 결손시킨 결손형 바이러스를 대량 생산하는 기술이 필요하다. 그러나, 지금까지 응용 가능한 엔벨로프 유전자 결손형 게놈을 베이스로 한 벡터의 개발은 아직 성공하지 못했다.
발명의 개시
본 발명은, 엔벨로프 유전자를 결손한 파라믹소바이러스 벡터를 제공하는 것을 과제로 한다.
전파성이 결여된 유전자치료에 의해 적합한 파라믹소바이러스 벡터를 구축하기 위해, 본 발명자 등은, SeV의 F 유전자를 게놈상으로부터 결손시키고, GEP 유전자를 리포터로서 도입한 cDNA를 사용하여, 센다이바이러스의 F 단백을 발현하는 세포주에서 감염성 바이러스입자를 회수하는 방법을 확립했다. 이 F 유전자 결손 바이러스 벡터는, 1차배양한 래트의 신경세포, 최초(primitive) 마우스의 혈액간세포, 인간의 정상세포 등 다양한 세포에 높은 효율로 유전자도입되어, 높은 유전자발현을 나타냈다. 더욱이, 인 비보에서는 래트의 뇌에 투여하여 높은 발현이 얻어졌다. 이 F 유전자 결손형 SeV 벡터는 감염된 세포에서 비교적 길게 지속적으로 또한 강력하게 유전자를 발현하고, 2차적으로 감염성 바이러스입자를 생산하지 않아, 인접한 세포로도 전파하지 않기 때문에, 유전자치료용 벡터로서의 유용성이 시사되었다.
또한 본 발명자 등은, F 유전자와 HN 유전자 양쪽을 결손시킨 SeV 벡터 cDNA를 제작하여, 센다이바이러스의 F 단백질 및 HN 단백질을 발현하는 세포주에서 감염성 바이러스입자를 회수하는 방법을 확립했다. 또한, 이 SeV 벡터 cDNA를 F 발현세포에 도입함으로써, HN 단백질을 결실한 SeV 벡터를 제작하는 것에도 성공했다.
이와 같이 본 발명은, 음성가닥 RNA 바이러스를 기본골격으로 한 실용화 가능한 새로운 엔벨로프 유전자 결손형 벡터시스템을 처음 확립하는 것이다. F 유전자 결손, 또는 FHN 유전자 결손 게놈 cDNA로부터, 헬퍼세포를 이용하여 감염성 결손 바이러스입자의 회수에 성공한 것은, 센다이바이러스의 우수한 특징을 살린 신규한 유전자치료용 벡터의 연구개발에 길을 여는 것이다.
본 발명의 결손형 센다이바이러스 벡터는 유전자도입 효율도 광범위한 세포종에 대해 지극히 높고 외래유전자를 경이적으로 발현하는 능력을 가지고 있다. 더욱이, 감염세포에서 지속적으로 발현하고, 2차적인 감염성 바이러스입자를 방출하지 않는 것으로부터, 바이러스의 전파성을 완전히 없앤 안전성이 높은 벡터인 것이 판명되었다.
RNA 바이러스에서는 게놈의 안정성 문제가 지적될 수 있지만, SeV 벡터에 의한 이종유전자 발현의 결과에서는 바이러스를 연속 다대 계대하더라도 거의 염기의변이가 나타나지 않아, 함입 이종유전자를 장기간에 걸쳐 안정하게 발현하고 있음이 나타나 있다(Yu, D. et al. Genes cells 2, 457-466(1997)). 이 음성가닥 RNA 바이러스 레플리콘(replicon)을 베이스로 한 벡터는, 이미 성공하고 있는 양성가닥(positive strand)RNA 바이러스인 세믈리키 삼림 바이러스(Semliki forest virus) 또는 신드비스 바이러스(Sindbis viruses)의 레플리콘을 베이스로 한 바이러스 벡터에 비해, 게놈의 안정성이나, 켑시드구조 단백질을 갖지 않는 것에 의한 도입유전자의 사이즈 또는 팩키징의 유연성(flexibility) 등 성질상 몇 가지 장점이 있다. 야생형 센다이바이러스 벡터는, 외래 DNA를 적어도 4 kbp까지 도입 가능하고, 결실형 벡터에서는 더욱 도입 사이즈가 커진다. 전사 유닛을 부가함으로써 2종류 이상의 유전자를 동시에 발현하는 것이 가능할지도 모른다. 이 센다이바이러스의 레플리콘을 베이스로 한 벡터는 이론적으로는 세포질에서 다 카피로 복제된 RNP가 세포의 분열에 동반하는 딸세포에도 분배되기 때문에 지속발현이 기대된다. 실제 어느 한 종류의 혈액계 세포에서는 인 비트로 실험에 의해 그것이 증명되고 있다. 더욱이, 본 발명자 등은, 센다이바이러스 벡터가 혈구계의 세포, 특히 과립구계 세포에 높은 효율로 유전자도입되어, c-kit 양성의 초기(primitive)세포에도 도입되는 것을 확인하고 있는 것으로부터, 이 벡터는 대단히 넓은 조직적용범위를 갖는 응용 가능성이 높은 벡터가 될 수 있는 것이 시사된다.
즉, 본 발명은, 엔벨로프 유전자 결손 센다이바이러스에 관한 것이고, 보다 구체적으로는,
(1) (a)파라믹소과 바이러스의 적어도 하나의 엔벨로프 단백질을 발현하지않도록 개변된 파라믹소바이러스에 유래하는 음성가닥 단일가닥 RNA 및 (b) 해당 음성가닥 단일가닥 RNA와 결합하는 단백질로 된 복합체를 포함하는 파라믹소과 바이러스 벡터,
(2) (1)에 있어서, 음성가닥 단일가닥 RNA가 NP 단백질, P 단백질 및 L 단백질을 발현하고, F 단백질 및/또는 HN 단백질을 발현하지 않도록 개변되어 있는 벡터,
(3) (1) 또는 (2)에 있어서, 음성가닥 단일가닥 RNA로부터 발현하지 않도록 개변된 엔벨로프 단백질의 적어도 하나를 포함하는 벡터,
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, VSV-G 단백질을 포함하는 벡터,
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 음성가닥 단일가닥 RNA가 센다이바이러스에 유래하는 벡터,
(6) (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, 음성가닥 단일가닥 RNA가 외래 유전자를 더 코드하고 있는 벡터,
(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 벡터에 포함되는 음성가닥 단일가닥 RNA 또는 그 상보사슬을 코드하는 DNA,
(8) (1) 내지 (6)중 어느 하나의 벡터의 제조방법으로서,
(a) 파라믹소과 바이러스의 적어도 하나의 엔벨로프 단백질을 발현하지 않 도록 개변된 파라믹소바이러스에 유래하는 음성가닥 단일가닥 RNA 또는 그 상보사슬을 코드하는 벡터 DNA를, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포에 도입하여 발현시키는 공정 및
(b) 상기 세포를 배양하여, 그 배양상청으로부터 바이러스 입자를 회수하는 공정을 포함하는 방법,
(9) (1) 내지 (6) 중 어느 하나의 벡터의 제조방법으로서,
(a) 파라믹소과 바이러스의 적어도 하나의 엔벨로프 단백질을 발현하지 않 도록 개변된 파라믹소바이러스에 유래하는 음성가닥 단일가닥 RNA 및 상기 음성가닥 단일가닥 RNA와 결합하는 단백질로 된 복합체를, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포에 도입하는 공정 및
(b) 상기 세포를 배양하여, 그 배양상청으로부터 바이러스 입자를 회수하는 공정을 포함하는 방법,
(10) (8) 또는 (9)에 있어서, 공정 (b)에 있어서의 세포의 배양이, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포와의 공배양인 방법,
(11) (8) 또는 (9)에 있어서, 공정 (b)에 있어서의 세포배양에 있어서, 상기 세포에, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포를 중층하여 배양을 행하는 방법,
(12) (8) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 세포가 발현하는 엔벨로프 단백질의 적어도 하나가, 상기 음성가닥 단일가닥 RNA로부터 발현하지 않도록 개변된 엔벨로프 단백질의 적어도 하나와 동일한 방법,
(13) (8) 내지 (12) 중 어느 하나에 있어서, 세포가 발현하는 엔벨로프 단백질의 적어도 하나가 VSV-G 단백질인 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명에 있어서「벡터」란, 숙주내에서 외래유전자를 발현시키기 위한 핵산분자를 팩키징한 바이러스 입자를 가리킨다.
또한, 파라믹소바이러스과 바이러스의 「NP, P, M, F, HN 및 L 유전자」란, 각각 뉴클레오켑시드(nucleocapsid), 포스포(phospho), 매트릭스(matrix), 퓨젼(fusion), 헤마글루티닌-뉴라미니다아제(hemagglutinin-neuraminidase) 및 라지(large)단백질을 코드하는 유전자를 가리킨다. 파라믹소바이러스아과에 속하는 각 바이러스에 있어서의 각 유전자는, 일반적으로 다음과 같이 표기된다. 또한, 일반적으로, NP 유전자는「N유전자」라고 표기되는 경우도 있다.
레스피로바이러스속 N P/C/V M F HN - L
루블라바이러스속 N P/V M F HN (SH) L
모빌리바이러스속 N P/C/V M F H - L
예를 들면 파라믹소과(Paramyxoviridae)의 레스피로바이러스(Respirovirus)로 분류되는 센다이바이러스의 각 유전자 염기서열의 데이터베이스의 액세션번호(accession number)는, NP 유전자에 대해서는 M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P 유전자에 대해서는 M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M 유전자에 대해서는 D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F 유전자에 대해서는 D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN 유전자에 대해서는 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, L 유전자에 대해서는 D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886를 참조할 것.
본 발명은, 엔벨로프 유전자 결손형의 파라믹소과 바이러스 벡터에 관한 것이다. 상기 바이러스 벡터는, 적어도 하나의 엔벨로프 단백질을 발현하지 않도록 개변된 파라믹소바이러스에 유래하는 음성가닥 단일가닥 RNA를 포함하는 것을 특징으로 한다. 파라믹소바이러스는, 일반적으로, 엔벨로프의 내부에 RNA와 단백질로 된 복합체(리보뉴클레오프로틴; RNP)를 포함하고 있다. RNP에 포함되는 RNA는 파라믹소바이러스의 게놈인 음성가닥(음성가닥)의 단일가닥 RNA이고, 단백질은 이 RNA에 결합하여 복합체를 형성하고 있다. 본 발명의 파라믹소과 바이러스 벡터는, (a) 파라믹소과 바이러스의 적어도 하나의 엔벨로프 단백질을 발현하지 않 도록 개변된 파라믹소바이러스에 유래하는 음성가닥 단일가닥 RNA 및 (b) 상기 음성가닥 단일가닥 RNA와 결합하는 단백질 된 복합체를 그 바이러스입자내에 포함하고 있다. 음성가닥 단일가닥 RNA와 결합하는 단백질이란, 상기 음성가닥 단일가닥 RNA와 직접 및/또는 간접 결합하여, 상기 음성가닥 단일가닥 RNA와 복합체를 형성하는 단백질을 말한다. 일반적으로, 파라믹소바이러스의 음성가닥 단일가닥 RNA(게놈 RNA)에는, NP 단백질, P 단백질 및 L 단백질이 결합하고 있다. 이 RNP에 포함되는 RNA가 바이러스 게놈의 전사 및 복제를 위한 주형으로 된다(Lamb,R.A.,and D.Kolakofsky, 1996,Paramyxoviridae: The viruses and their replication. pp.1177-1204.InFields Virology, 3rd edn. Fields, B. N., D. M. Knipe, and P. M. Howley et al. (ed.), Raven Press, New York, N. Y.). 본 발명의 복합체에는, 파라믹소바이러스에 유래하는 음성가닥 단일가닥 RNA 및 그것에 결합하는 파라믹소바이러스에 유래하는 단백질로 된 복합체가 포함된다. 본 발명의 벡터는, 예를 들면 파라믹소바이러스의 음성가닥 단일가닥 RNA에 이들의 단백질(NP, P 및 L 단백질)이 결합한 RNP를 포함하는 것이다. 일반적으로, 파라믹소바이러스의 RNP 복합체는, 세포내에서 자립적으로 RNP 복합체를 복제하는 능력을 갖는다. 이와 같이, 세포에 도입된 벡터는 세포내에서 RNP를 증폭시킴으로써, 유전자(복합체에 포함되는 RNA)의 카피수를 늘린다. 이것에 의해, 외래유전자를 갖는 벡터로부터의 외래유전자의 높은 발현이 초래된다. 본 발명의 벡터는, 바람직하게는, 세포내에서 복합체(RNP)에 포함되는 RNA를 복제하는 능력을 갖는 것이다.
본 발명을 적용 가능한 파라믹소과 바이러스로서는, 센다이바이러스에 더하여, 예를 들면, 홍역바이러스, 원숭이 파라인플루엔자바이러스(SV5), 인간 파라인플루엔자바이러스의 3가지 형태을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
바이러스 벡터 중 음성가닥 단일가닥 RNA는, 전형적으로는, NP 단백질, P 단백질 및 L 단백질을 발현하고, F 단백질 및/또는 HN 단백질을 발현하지 않도록 개변되어 있다.
센다이바이러스(Sendai virus;SeV)의 경우, 천연 바이러스의 게놈 사이즈는 약 15,000염기이고, 음성가닥은 3'의 짧은 리더영역(leader region)에 연결되어, NP(뉴클레오켑시드), P(포스포), M(매트릭스), F(퓨젼), HN(헤마글루티닌-뉴라미니다아제) 및 L(라지)단백질을 코드하는 6개의 유전자가 늘어서 있고, 짧은 5'트레일러영역(trailer region)을 다른쪽 끝에 갖는다. 본 발명에 있어서는, 이 중 F, HN 및 M 유전자 중 어느 하나, 또는 그들의 조합을 결손하는 게놈을 설계함으로써, 엔벨로프 단백질을 발현하지 않도록 개변할 수 있다. 바람직하게는 F 유전자 또는 HN 유전자, 또는 F 유전자와 HN 유전자 양쪽을 결손하고 있다. RNP의 형성에는 이들단백질은 필요 없기 때문에, NP, P 및 L 단백질의 존재하에서 이 게놈 RNA(양성가닥 또는 음성가닥)를 전사시킴으로써, 본 발명의 RNP를 제조할 수 있다. RNP의 형성은, 예를 들면 LLC-MK2 세포 등에서 행하게 할 수 있다. NP, P 및 L 단백질의 공급은, 각 유전자를 코드하는 발현벡터를 세포에 도입함으로써 행해질 수 있다(실시예 참조). 또한, 각 유전자는 숙주세포의 염색체에 함입(incorporation)되어 있더라도 좋다. RNP를 형성시키기 위해 발현시키는 NP, P 및 L 유전자는, 벡터의 게놈에 코드되는 NP, P 및 L 유전자와 완전히 동일할 필요는 없다. 즉, 이들 유전자가 코드하는 단백질의 아미노산서열은, RNP 게놈이 코드하는 단백질의 아미노산서열 그대로가 아니더라도, 게놈 RNA와 결합하여, 세포내에서 RNP의 복제를 행하는 활성을 갖는 한, 변이를 도입하거나, 또는 다른 바이러스의 상동유전자로 대용하더라도 좋다. 일단(一端) RNP가 형성되면, 이 RNP로부터 NP, P 및 L 유전자가 발현되고, 세포내에서 자립적으로 RNP를 복제하여, 바이러스벡터가 생산된다.
세포내에서 벡터를 재구성시킬 때에 엔벨로프 단백질을 세포에 발현시키면, 이 엔벨로프 단백질이 바이러스 벡터에 함입되어, 엔벨로프 단백질에 의한 감염성을 유지하는 바이러스 벡터를 생산할 수 있다. 이러한 벡터는, 한번 세포에 감염하면, 세포내에서 RNP를 증식시킬 수는 있어도, 그 자신은 엔벨로프 유전자를 갖지 않기 때문에, 처음과 동일한 엔벨로프 단백질을 갖는 바이러스를 다시 생산할 수는 없다. 이러한 벡터는, 특히 유전자치료 등 높은 안전성이 요구되는 분야에 지극히 유용하다.
바이러스 재구성시에, 음성가닥 단일가닥 RNA에 있어서 발현하지 않도록 개변된 엔벨로프 단백질, 즉 게놈에 있어서 결손시킨 엔벨로프 유전자를 발현시키면, 야생형 바이러스와 동등한 감염성을 갖는 바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 또한, 게놈에 있어서 결손시킨 엔벨로프 유전자의 일부를 발현시키는 것도 생각할 수 있다. 예를 들면, F 유전자와 HN 유전자 양쪽을 결손하는 게놈에 대해 F 단백질만을 발현시키면, F 단백질을 엔벨로프에 갖는 바이러스 벡터가 생산된다. HN 단백질을 갖지 않고 F 단백질만을 갖는 바이러스는, 아시알로당단백 리셉터 (asialoglycoprotein receptor)(ASG-R)를 매개로 하여 간장의 세포에 특이적으로 감염하는 벡터로서 이용될 수 있다. 이와 같이, 음성가닥 단일가닥 RNA에 있어서 발현하지 않도록 개변된 엔벨로프 단백질의 적어도 하나를 포함하는 파라믹소과 바이러스 벡터도, 본 발명에 포함된다.
또한, 음성가닥 단일가닥 RNA에 있어서 발현하지 않도록 개변된 엔벨로프 단백질과는 다른 엔벨로프 단백질을 사용하여 본 발명의 벡터를 재구성시키는 것도 가능하다. 이러한 엔벨로프 단백질에 특별히 제한은 없다. 예를 들면, 다른 바이러스의 엔벨로프 단백질, 예를 들면 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 G 단백질(VSV-G)을 들 수 있다. 본 발명의 파라믹소과 바이러스 벡터는, VSV-G 단백질 등과 같이, 게놈이 유래하는 바이러스 이외의 바이러스에 유래하는 엔벨로프 단백질을 포함하는 슈도타입 바이러스(pseuotype virus)벡터가 포함된다.
본 발명의 바이러스 벡터는, 통상, (a) 파라믹소과 바이러스의 적어도 하나의 엔벨로프 단백질을 발현하지 않도록 개변된 파라믹소바이러스에 유래하는 음성가닥 단일가닥 RNA 또는 그 상보사슬을 코드하는 벡터 DNA를, 엔벨로프 단백질을발현하는 세포(헬퍼세포)에 도입하여 발현시키고, (b) 상기 세포를 배양하여, 그 배양상청(supernatant)으로부터 바이러스입자를 회수함으로써 조제할 수 있다. 벡터 DNA를 발현시킬 때에, NP, L 및 P 단백질을 공발현시켜 둠으로써 RNP가 형성되고, 엔벨로프 단백질을 갖는 바이러스가 구축된다.
헬퍼세포에서 발현시키는 벡터 DNA는, 본 발명의 벡터에 포함되는 음성가닥 단일가닥 RNA(음성가닥) 또는 그 상보사슬(양성가닥)을 코드하고 있다. 예를 들면, 음성가닥 단일가닥 RNA 또는 그 상보사슬을 코드하는 DNA를 T7 프로모터의 하류에 연결시켜, T7 RNA 폴리머라아제에 의해 RNA에 전사시킨다. 벡터 DNA는, 대장균에서 증폭할 수 있도록 플라스미드에 클로닝되어 있더라도 좋다. 세포내에서 전사시키는 사슬은, 바이러스의 양성가닥이더라도 음성가닥이더라도 좋지만, 포지티스사슬이 전사되도록 하는 것이 재구성의 효율을 올리기 위해서는 바람직하다.
헬퍼세포로서는, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포가 사용된다. 상기와 같이, 헬퍼세포는, 바이러스 벡터에 있어서 결손하고 있는 모든 엔벨로프 유전자의 단백질을 발현하는 세포에 한정되지 않고, 예를 들면, F, HN 유전자 결손 센다이바이러스 벡터 DNA에 대해서는, F 단백질만을 발현하는 세포를 헬퍼세포로서 사용하는 것도 가능하다. 또한, 상기 바이러스 벡터에 있어서 결손하고 있는 엔벨로프 유전자가 코드하는 단백질과는 다른 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포일 수 있다. 예를 들면, 상기와 같이 엔벨로프 단백질로서, 파라믹소과 바이러스의 엔벨로프 단백질이 아닌 엔벨로프 단백질(예를 들면, VSV-G 단백질)을 사용하는 것도 가능하다.
예를 들면, 엔벨로프 유전자가 결손된 재조합 센다이바이러스 게놈을 발현하는 플라스미드를, 결손한 엔벨로프 단백질을 발현하는 벡터 및 NP, P/C 및 L 단백질의 발현벡터와 함께 숙주세포에 트랜스펙션(transfection)함으로써, 바이러스 벡터의 재구성을 행할 수 있다. 또한, 예를 들면, F 유전자가 염색체에 함입된 숙주세포를 사용하여 제조하는 것도 가능하다. 바이러스 게놈 이외로부터 공급되는 이들 단백질군은, 그 아미노산서열은 바이러스 유래의 서열 그대로가 아니더라도, 핵산의 도입에 있어서의 활성이 천연형의 그것과 동등하거나 그 이상이라면, 변이를 도입하거나, 또는 다른 바이러스의 상동유전자로 대용하더라도 좋다. 일반적으로, 엔벨로프 단백질은, 세포독성을 나타내는 것이 많기 때문에, 유도성 프로모터 제어하에 벡터의 재구성시에만 발현시키는 것도 가능하다(실시예 참조).
RNP 또는 바이러스가 형성되면, 이 RNP 또는 바이러스를 상기의 헬퍼세포에 재도입하여 배양함으로써, 본 발명의 벡터를 증폭할 수 있다. 이 과정은, (a) 파라믹소과 바이러스의 적어도 하나의 엔벨로프 단백질을 발현하지 않도록 개변된 파라믹소바이러스에 유래하는 음성가닥 단일가닥 RNA 및 상기 음성가닥 단일가닥 RNA와 결합하는 단백질로 된 복합체를, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포에 도입하는 공정 및 (b) 상기 세포를 배양하고, 그 배양상청으로부터 바이러스입자를 회수하는 공정을 포함한다.
RNP를 세포에 도입하기 위해서는, 예를 들면 리포펙트아민(lipofectamine)이나 폴리양이온리포솜(polycationic liposome)등과 함께 복합체를 복합체를 형성시켜 도입하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 여러 가지 트랜스펙션시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, DOTMA(Boehringer), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE,DOSPER(Boehringer #1811169) 등을 들 수 있다. 엔도솜(endosome)속에서의 분해를 막기 위해, 클로로퀸(chloroquine)을 가하는 것도 가능하다(Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015).
상기와 같이 하여 세포에 있어서 바이러스 벡터가 구축되면, 이 세포를, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포와 공배양함으로써, 바이러스 벡터를 더욱 증폭할 수 있다. 이러한 방법으로서는, 예를 들면 실시예 12에 기재한 바와 같이, 바이러스를 생산하는 세포에 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포를 중층하는 방법이 적합하다.
엔벨로프 단백질로서는, 바이러스의 엔벨로프 단백질 이외에도, 예를 들면, 특정 세포에 접착할 수 있는, 접착인자, 리간드, 수용체 등 유래의 폴리펩티드를 세포외영역에 가지고, 바이러스 엔벨로프 유래의 폴리펩티드를 세포내 영역에 갖는 키메라단백질(chimeric protein)등을 사용하는 것이 가능하다. 이것에 의해, 특정 조직을 표적으로 하는 벡터를 만들어내는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 바이러스 벡터는, 예를 들면, 면역원성을 저하시키기 위해, 또는, RNA의 전사효율이나 복제효율을 높이기 위해, 벡터에 포함되는 바이러스유전자가 개변된 것이더라도 좋다.
본 발명의 바이러스 벡터는, 음성가닥 단일가닥 RNA 중에 외래유전자를 코드하는 RNA를 포함할 수 있다. 외래유전자로서는, 표적세포속에서 발현시키고자 하는 유전자를 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 유전자치료 등을 목적으로 하는 경우에는, 상기 바이러스 벡터 DNA에 대상이 되는 질환의 치료용 유전자를 함입한다.바이러스 벡터 DNA에 외래유전자를 도입하는 경우는, 예를 들면, 센다이바이러스 벡터 DNA에 있어서는, 전사종결(E)서열과 전사개시(S)서열 사이 등에, 6의 배수의 염기수를 갖는 서열을 함입하는 것이 바람직하다(Journal of Virology, Vol. 67, No.8, 1993, p.4822-4830). 외래유전자는, 바이러스의 각 유전자(NP, P, M, F, HN 및 L 유전자)의 앞 또는 뒤에 함입할 수 있다(실시예 참조). 앞뒤 유전자의 발현을 방해하지 않도록 하기 위해, 외래유전자의 앞 또는 뒤에 적절히 E-I-S서열(전사개시서열-개재서열-전사종결서열) 또는 그 부분을 함입한다. 함입한 외래성 유전자의 발현량은, 외래유전자의 상류에 부가하는 전사개시서열의 종류에 따라 조절할 수 있다. 또한, 유전자함입의 위치, 또한 유전자의 앞뒤 염기서열에 따라 조절할 수 있다. 예를 들면, 센다이바이러스에 있어서는, 함입위치가 음성가닥 RNA의 3'말단에 가까울수록(야생형 바이러스의 게놈상의 유전자배치에 있어서는, NP 유전자에 가까울수록), 함입된 유전자의 발현량이 높다. 외래유전자의 높은 발현을 얻기 위해서는, 외래유전자를 NP 유전자의 상류(음성가닥에 있어서는 3'측) 또는 NP 유전자와 P 유전자 사이 등, 음성가닥 게놈에 있어서 상류영역에 함입하는 것이 바람직하다. 반대로, 함입위치가 음성가닥 RNA의 5'말단에 가까울수록(야생형 바이러스의 게놈상의 유전자배치에 있어서는, L 유전자에 가까울수록), 함입된 유전자의 발현량이 낮아진다. 외래유전자의 발현을 낮게 억제하기 위해서는, 예를 들면 음성가닥의 가장 5'측, 즉 야생형 바이러스 게놈에 있어서는 L 유전자의 하류(음성가닥에 있어서는 L 유전자의 5'인접부위), 또는 L 유전자의 상류(음성가닥에 있어서는 L 유전자의 3'인접부위)에 외래유전자를 함입한다. 외래유전자를 용이하게 함입할 수있도록 하기 위해, 함입부위에 클로닝사이트를 설계할 수 있다. 클로닝사이트는, 예를 들면 제한효소의 인식서열로 할 수 있다. 게놈을 코드하는 벡터 DNA 중의 해당 제한효소부위에 외래유전자 단편을 함입할 수 있다. 클로닝사이트는, 복수의 제한효소 인식서열을 갖는, 소위 멀티클로닝사이트로 하여도 된다. 본 발명의 벡터는, 상기에서 언급한 이외의 외래유전자를 삽입위치에 유지하고 있더라도 좋다.
외래유전자를 갖는 재조합 센다이바이러스 벡터는, 예를 들면, Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587 및 Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466의 기재에 준하여, 다음과 같이 하여 구축할 수 있다.
먼저, 목적으로 하는 외래유전자의 cDNA 염기서열을 포함하는 DNA 시료를 준비한다. DNA 시료는, 25 ng/㎕ 이상의 농도에서 전기영동적으로 단일의 플라스미드임을 확인할 수 있는 것이 바람직하다. 이하, 외래유전자를 NotI 부위를 이용하여 바이러스 게놈을 코드하는 DNA에 함입하는 경우를 예로 들어 설명한다. 목적으로 하는 cDNA 염기서열 속에 NotI 인식부위가 포함되는 경우는, 부위특이적 변이함입법(site-specific mutagenesis)등을 사용하여, 코드하는 아미노산서열을 변화시키지 않도록 염기서열을 개변하여, NotI 부위를 미리 제거해 두는 것이 바람직하다. 이 시료로부터 목적으로 하는 유전자단편을 PCR에 의해 증폭 회수한다. 증폭된 단편의 양끝을 NotI 부위로 하고, 더욱이 한쪽 끝에 센다이바이러스의 전사종결서열(E), 개재서열(I) 및 전사개시서열 (S)(EIS서열)의 카피를 부가하기 위해, NotI 제한효소 절단부위서열 및 전사종결서열(E), 개재서열(I) 및 전사개시서열(S)과 목적유전자 일부의 서열을 포함하는 한쌍의 프로아머로서, 포워드측 합성 DNA서열 및 리버스측 합성 DNA서열(안티센스사슬)을 작성한다.
예를 들면, 포워드측 합성 DNA서열은, NotI에 의한 절단을 보증하기 위해 5'측에 임의의 2 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 GCG, GCC의 NotI 인식부위 유래의 서열이 포함되지 않는 4염기, 더욱 바람직하게는 ACTT)를 선택하여, 그 3'측에 NotI 인식부위 gcggccgc를 부가하고, 더욱이 그 3'측에 스페이서 서열로서 임의의 9염기 또는 9에 6의 배수를 가한 수의 염기를 부가하고, 더욱이 그 3'측에 목적으로 하는 cDNA의 개시코돈 ATG로부터 이것을 포함하여 ORF의 약 25염기 상당의 서열을 부가한 형태로 한다. 마지막 염기는 G 또는 C가 되도록 상기 목적으로 하는 cDNA로부터 약 25염기를 선택하여 포워드측 합성 올리고 DNA의 3'의 말단으로 하는 것이 바람직하다.
리버스측 합성 DNA서열은 5'측으로부터 임의의 2 이상의 뉴클레오티드(바람직하게는 GCG, GCC의 NotI 인식부위 유래의 서열이 포함되지 않는 4염기, 더욱 바람직하게는 ACTT)를 선택하여, 그 3'측에 NotI 인식부위 gcggccgc를 부가하고, 더욱이 그 3'측에 길이를 조절하기 위한 함입단편의 올리고 DNA를 부가한다. 이 올리고 DNA의 길이는, NotI 인식부위 gcggccgc를 포함하고, cDNA의 상보사슬 염기서열과 후술하는 센다이바이러스에 유래하는 센다이바이러스 게놈의 EIS 염기서열의 합계가 6의 배수가 되도록 염기수를 설계한다(소위 「6의 룰(rule of six)」; Kolakofski, D. et al., J. Virol. 72:891-899, 1998). 또한 함입단편의 3'측에 센다이바이러스 S서열의 상보사슬서열, 바람직하게는 5'-CTTTCACCCT-3', I서열, 바람직하게는 5'-AAG-3', E서열의 상보사슬서열, 바람직하게는 5'-TTTTTCTTACTACGG-3',더욱이 그 3'측에 목적으로 하는 cDNA 서열의 종결코돈으로부터 반대로 세어서 약 25염기 상당의 상보사슬의 마지막 염기가 G 또는 C가 되도록 길이를 선택해 서열을 부가하여, 리버스측 합성 올리고 DNA의 3'의 말단으로 한다.
PCR은, 예를 들면, ExTaq 폴리머라아제(Takara)를 사용하는 통상의 방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는 Vent 폴리머라아제(NEB)를 사용하여 행하고, 증폭한 목적단편은 NotI로 소화한 후, 플라스미드 벡터 pBluescript의 NotI 부위에 함입한다. 얻어진 PCR 산물의 염기서열을 서열판독기(sequencer)로 확인하여, 바른 서열의 플라스미드를 선택한다. 이 플라스미드로부터 함입단편을 NotI로 잘라내어, 엔벨로프 유전자를 결손하는 게놈 cDNA를 포함하는 플라스미드의 NotI 부위에 클로닝한다. 또한 플라스미드 벡터 pBluescript의 매개 없이 NotI 부위에 직접 함입하여, 재조합 센다이바이러스 cDNA를 얻는 것도 가능하다.
본 발명의 바이러스 벡터 DNA는, 이것을 시험관내 또는 세포내에서 전사시키고, 바이러스의 L, P, NP 단백질에 의해, RNP를 재구성시켜, 이 RNP를 포함하는 바이러스 벡터를 생성시킬 수 있다. 바이러스 벡터 DNA로부터의 바이러스의 재구성은, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포를 사용하여, 공지의 방법에 따라 행할 수 있다(국제공개 97/16539호; 국제공개 97/16538호; Durbin, A.P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S.P. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392; Schnell. M.J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481; Garcin, D. et al., 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato,A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M.D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R.M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404). 바이러스 벡터 DNA에 있어서, F 유전자, HN 유전자 및/또는 M 유전자를 결실시킨 경우에는, 그대로는 감염성 바이러스입자를 형성하지 않지만, 숙주세포에, 이들 결실시킨 유전자나 다른 바이러스의 엔벨로프 단백질을 코드하는 유전자 등을 별도로 도입하여 발현시킴으로써, 감염성 바이러스입자를 형성시키는 것이 가능하다.
바이러스 벡터 DNA를 세포내에 도입하는 방법에는, 다음과 같은 방법, ① 목적세포에 의해 함입될 수 있는 DNA 침전물을 만드는 방법, ② 목적세포에 의한 함입에 적합하고, 또한 세포독성이 적은 양전하특성을 갖는 DNA를 포함하는 복합체를 만드는 방법, ③ 목적 세포막에, DNA 분자가 빠져나갈 수 있을 만큼 충분한 구멍을 전기펄스에 의해 순간적으로 뚫는 방법 등이 있다.
②로서는, 여러 가지 트랜스펙션시약을 이용할 수 있다. 예를 들면, DOTMA(Boehringer), Superfect(QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER(Boehringer #1811169) 등을 들 수 있다. ①로서는 예를 들면 인산칼슘을 사용한 트랜스펙션법을 들 수 있고, 이 방법에 의해 세포내에 들어간 DNA는 빈식소포(phagosome)에 함입되지만, 핵내에도 충분한 양의 DNA가 들어 가는 것이 알려져 있다(Graham, F.L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S., 1977, Cell 11: 223). Chen 및 Okayama는 트랜스퍼기술의 최적화를 검토하여, 1)세포는 2∼4% CO2, 35℃, 15∼24시간의 조건하에서 DNA와 인큐베이션하며, 2) DNA는 직쇄상 보다 고리상의 것이 활성이 높고, 3) 침전혼합물 중 DNA 농도가 20∼30 ㎍/ml일 때 최적의 침전이 얻어진다고 보고하고 있다(Chen, C. and Okayama, H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745). ②의 방법은, 일과적인(transient)트랜스펙션에 적합하다. 더 오래된 것으로서는 DEAE-덱스트란(dextran)(Sigma #D-9885 M.W. 5 ×105)혼액을 목적으로 하는 DNA 농도비로 조제하여, 트랜스펙션을 행하는 방법이 알려져 있다. 복합체의 대부분은 엔도솜 속에서 분해되어 버리기 때문에, 효과를 높이기 위해 클로로퀸을 가하는 것도 가능하다(Calos, M.P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015). ③의 방법은 전기천공법(electroporation)이라 불리는 방법으로, 세포선택성이 없다는 점에서 ①이나 ②의 방법에 비해 범용성이 높다. 효율은 펄스전류의 지속시간, 펄스의 형태, 전계(전극간의 갭, 전압)의 강도, 완충제의 도전률, DNA 농도, 세포밀도의 최적 조건하에서 좋다고 한다.
이상, 3개의 범주중에서 ②의 방법은 조작이 간편하고 다량의 세포를 사용하여 다수의 검사시료를 검토할 수 있기 때문에, 본 발명에 있어서는, 트랜스펙션시약이 적합하다. 적합하게는 Superfect Transfection Ragent(QIAGEN, Cat No. 301305), 또는 DOSPER Liposomal Transfection Reagent(Boehringer Mannheim, Cat No. 1811169)가 사용된다.
cDNA로부터의 재구성은 구체적으로는 다음과 같이 하여 행할 수 있다.
24웰~6웰 정도의 플라스틱 플레이트 또는 100 mm 페트리접시 위에서, 10% 소태아혈청(FCS) 및 항생물질(100 units/ml 페니실린 G 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신)을 포함하는 최소필수배지(MEM)를 사용하여 원숭이신장 유래 세포주 LLC-MK2를 70∼80% 콘플루언트가 될 때까지 배양하여, 예를 들면 1 ㎍/ml psoralen(소랄렌)존재하 20분간 UV조사 처리하여 불활성화시킨, T7 폴리머라아제를 발현하는 재조합 백시니아바이러스(vaccinia virus) vTF7-3(Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)로 2 PFU/cell 만큼 감염시킨다. 소랄렌의 첨가량 및 UV 조사시간을 적절히 조정할 수 있다. 감염 1시간 후, 2∼60 ㎍, 보다 바람직하게는 3∼5 ㎍의 상기의 재조합 센다이바이러스 cDNA를, 전장(full-length)센다이바이러스 게놈의 생성에 요구되는 트랜스로 작용하는 바이러스 단백질을 발현하는 플라스미드(24-0.5 ㎍의 pGEM-N, 12-0.25 ㎍의 pGEM-P 및 24-0.5 ㎍의 pGEM-L, 보다 바람직하게는 1 ㎍의 pGEM-N, 0.5 ㎍의 pGEM-P 및 1 ㎍의 pGEM-L)(Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579,1996)와 함께 Superfect(QIAGEN사)를 사용한 리포펙션법 등에 의해 트랜스펙션한다. 트랜스펙션을 행한 세포는, 목적에 따라 100 ㎍/ml의 리팜피신(rifampicin)(Sigma) 및 시토신아라비노시드(cytosine arabinoside) (AraC), 보다 바람직하게는 40 ㎍/ml의 시토신아라비노시드(AraC)(Sigma)만을 포함하는 혈청 불함유의 MEM에서 배양하여, 백시니아바이러스에 의한 세포독성을 최소한으로 억제하고, 바이러스의 회수율을 최대로 하도록 약제의 최적농도를 설정한다(Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579). 트랜스펙션한 후 48~72시간 정도 배양 후, 세포를 회수하여, 동결융해를 3회 반복하여 세포를 파쇄한 후, 엔벨로프 단백질을 발현하는 LLC-MK2 세포에 트랜스펙션하여 배양한다. 배양 3~7일 후에 배양액을 회수한다. 또는, NP, L, P 발현 플라스미드를 처음부터 엔벨로프 단백질을 발현하는 LLC-MK2 세포에 트랜스펙션하거나, 또는 엔벨로프 발현 플라스미드를 함께 트랜스펙션하면, 감염성 바이러스 벡터를 보다 효율 좋게 얻을 수 있다. 이 세포는 엔벨로프 단백질을 발현하는 LLC-MK2 세포에 중층하여 배양함으로써 바이러스 벡터를 증폭할 수 있다(실시예 참조). 배양상청에 포함되는 바이러스 역가는 적혈구 응집활성(HA)을 측정함으로써 결정할 수 있다. HA는 「endo-point 희석법」(Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579)에 의해 결정할 수 있다. 얻어진 바이러스 스톡(stock)은 -80℃에서 보존할 수 있다.
본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터는, 예를 들면 생리식염수나 인산완충생리식염수(PBS) 등으로 적절히 희석하여 조성물로 할 수 있다. 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터를 계란에서 증식시킨 경우 등에 있어서는 장뇨액을 포함하는 것도 가능하다. 본 발명의 재조합 센다이바이러스 벡터 함유 조성물에는, 탈이온수, 5% 덱스트로스수용액 등의 생리학적으로 허용할 수 있는 매체를 포함하고 있더라도 좋다. 더욱이, 그 밖에도, 안정제, 항생물질 등이 함유되어 있더라도 좋다.
바이러스 벡터가 재구성하는 한, 재구성에 사용하는 숙주세포는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 센다이바이러스 벡터의 재구성에 있어서는, 원숭이신장 유래의 CV-1 세포나 LLC-MK2 세포, 햄스터신장 유래의 BHK 세포 등의 배양세포를 사용할 수 있다. 이들 세포에 적당한 엔벨로프 단백질을 발현시킴으로써, 그 엔벨로프를 갖는 감염성 바이러스입자를 얻는 것도 가능하다. 또한, 대량으로 센다이바이러스 벡터를 얻기 위해, 예를 들면 엔벨로프 유전자를 발현하는 벡터와 함께 상기의 숙주로부터 얻어진 바이러스 벡터를 발육계란에 감염시켜, 상기 벡터를 증폭할 수 있다. 또는, 엔벨로프 단백질 유전자가 함입된 트랜스제닉(transgenic)계란을 사용하여 바이러스 벡터를 생산하는 것도 가능하다. 계란을 사용한 바이러스 벡터의 제조방법은 이미 개발되어 있다(Nakanishi, et al.(des), 1993, "Shinkei-kagaku Kenkyu-no Sentan-gizutu Protocol III (High Technology Protocol III of Neuroscience Research), Molecular Neurocyte Physiology, Koseisha, Osaka, pp.153-172). 구체적으로는, 예를 들면, 수정란을 배양기에 넣고 9~12일간 37~38℃에서 배양하여 배(胚)를 성장시킨다. 엔벨로프 단백질을 발현하는 벡터와 함께 센다이바이러스 벡터를 장뇨막강(chorioallantoic cavitiy)으로 접종하고, 수일간 난을 배양하여 바이러스 벡터를 증식시킨다. 배양시간 등의 조건은, 사용하는 재조합 센다이바이러스에 따라 변할 수 있다. 그 후, 바이러스를 포함한 장뇨액을 회수한다. 장뇨액으로부터의 센다이바이러스 벡터의 분리 ·정제는 일반적인 방법에 의해 따라 행할 수 있다(Tashiro, M., "Virus Experiment Protocols", Nagai and Ishihama (eds.), Medicalview, pp. 68-73(1995)).
본 발명의 바이러스 벡터 자체를 엔벨로프 단백질을 발현하는 벡터로서 사용할 수 있다. 예를 들면 게놈상에서 결손하고 있는 엔벨로프 유전자가 다른 2종의 벡터를 동일한 세포에 도입하면, 각각에서 결손하는 엔벨로프 단백질이, 다른 한쪽의 복합체로부터의 발현에 의해 공급되기 때문에, 서로 상보하여 감염력이 있는 바이러스입자가 형성되어, 복제사이클이 돌아 바이러스가 증폭된다. 즉, 2종류 또는그 이상의 본 발명의 벡터를, 엔벨로프 단백질을 상보하는 조합으로 접종하면, 각각의 엔벨로프 유전자 결손형 바이러스 벡터의 혼합물을 대량으로 또한 저비용으로 생산할 수 있다. 이와 같이 하여 생산된 혼합 바이러스는, 백신 등에도 유용하다. 또한, 이들 바이러스는, 엔벨로프 유전자가 결손하고 있는 만큼, 엔벨로프 유전자를 결손하고 있지 않은 바이러스에 비해 게놈 사이즈가 작아져, 긴 외래유전자를 유지할 수 있다. 또한, 원래 감염성이 없는 이들 바이러스는 세포외에서 희석되어 공감염(coinfection)의 유지가 어려워져 멸균화되는 바, 실패화 하기 때문에 환경방출 관리상의 잇점이 있다.
외래유전자로서 질환의 치료용 유전자를 사용하여 바이러스 벡터를 조제하면, 이 벡터를 투여하여 유전자치료를 행하는 것이 가능해진다. 본 발명의 바이러스 벡터의 유전자치료로의 응용으로서는, 직접투여에 의한 유전자발현, 간접(ex vivo)투여에 의한 유전자발현 중 어느 하나의 방법에 의해서도, 치료효과를 기대할 수 있는 외래유전자 또는 환자의 체내에서 공급이 부족한 내재유전자 등을 발현시키는 것이 가능하다. 외래유전자로서는 특별히 제한은 없고, 단백질을 코드하는 핵산에 더하여, 예를 들면, 안티센스 또는 리보자임(ribozime)등의 단백질을 코드하지 않는 핵산이더라도 좋다. 또한, 외래유전자로서, 감염증에 관한 세균 또는 바이러스의 항원을 코드하는 유전자를 사용하면, 이것을 동물에 투여함으로써, 상기 동물에 있어서 면역을 유도할 수 있다. 즉 백신으로서 이용할 수 있다.
백신으로서 사용하는 경우, 예를 들면 종양, 감염증 및 그 밖의 일반적인 질환에 대해 본 발명의 바이러스 벡터를 적용하는 것을 생각할 수 있다. 예를 들면종양치료로서는, 종양세포, 또는 DC세포 등의 항원제시세포(APC)에 본 발명의 벡터를 사용하여 치료효과를 갖는 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 유전자로서는, 암항원 Muc-1 또는 Muc-1양 무틴 탄뎀 리피트 펩티드(mutin tandem repeat peptide)(미국특허 제 5,744,144호), 멜라노마(melanoma) gp100 항원 등을 들 수 있다. 이러한 유전자에 의한 치료는, 유방암, 결장암, 췌장암, 전립선암, 폐암 등 폭 넓게 응용될 수 있다. 또한, 아쥬반트 효과를 높이는 사이토카인류를 조합시키는 것도 유효하다. 이러한 유전자로서는, 예를 들면 i) IL-2와 단일가닥 IL-12와의 조합(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15): 8591-8596, 1999), ii) IL-2와 인터페론-γ(미국특허 제5,798,100호), iii) 단독으로 사용되는 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony-stimulating factor)(GM-CSF), iv) 뇌종양을 치료대상으로 한 GM-CSF와 IL-4의 조합(J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124(1999) 등을 들 수 있다.
감염증의 치료로서는, 인플루엔자에 있어서는, 예를 들면 강독주(virulent strain) H5N1형 엔벨로프, 일본뇌염에 있어서는, 예를 들면 엔벨로프 키메라(chimera)(Vaccine, vol. 17, No. 15-16, 1869-1882(1999)), 에이즈에 있어서는, 예를 들면 HIV gag 또는 SIV gag 단백질(J. Immunology(2000) vol. 164, 4968-4978), 폴리아세테이트-글리콜 공중합체 미세입자에 싸여진 경구투여용 백신으로서 함입되는 HIV 엔벨로프 단백질(Kaneko, H. et al., Virology 267: 8-16(2000)), 콜레라에 있어서는, 예를 들면 콜레라독소의 B 서브유닛(CTB)(Arakawa T, et al., Nature Biotechnology(1998)16(10):934-8, Arakawa T, et al., NatureBiotechnology(1998)16(3):292-7), 광견병에 있어서는, 예를 들면 광견병 바이러스의 당단백(Lodmell DL et al., 1998, Nature Medicine 4(8):949-52), 자궁경암에 있어서는, 인간 파필로마바이러스의 6형(papilloma virus 6)의 켑시드단백(capsid protein)L1(J. Med. Virol, 60, 200-204(2000)) 등을 들 수 있다.
또한, 일반병으로의 적용도 생각할 수 있다. 당뇨병에 있어서는, 예를 들면 I형 당뇨병 모델동물에게 있어서, 인슐린단편의 펩티드의 발현이 행해지고 있다(Coon, B. et al., J. Clin. Invest., 1999, 104(2):189-94).
도면의 간단한 설명
도1은, Cre-loxP 유도발현계에 의한 F 단백질의 발현을 해석한 웨스턴 블로팅(western blotting)해석의 결과를 나타내는 사진이다. 화학발광법에 의해 항SeV-F항체와 교차가 보이는 상기 전사막상의 단백질의 검출을 행한 결과를 나타낸다.
도2는, Cre-loxP계에 의해 발현을 유도한 F 단백질의 세포표면으로의 디스플레이를 해석한 결과를 나타내는 도이다. 항SeV-F항체를 사용하여 LLC-MK2/F7의 플로사이트메트리(flow cytometry)해석을 행한 결과를 나타낸다.
도3은, 발현된 F 단백질의 트립신에 의한 절단(cleavage)을 웨스턴 블로팅법에 의해 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도4는, 세포표면에 있어서의 HN의 발현을 적혈구의 세포표면으로의 흡착실험에서 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도5는, 결실단백질 발현세포를 사용하여 결실형 바이러스의 회수를 시도한결과를 나타내는 사진이다. F 결손 SeV의 재구축시에 사용한 백시니아바이러스에 의해 헬퍼세포주로부터의 F 단백발현이 신속하게 중지된 것이 판명되었다.
1. LLC-MK2 및 CV-1은 각각의 세포주만의 세포 라이세이트(lysate)를 가리킨다.
2. LLC-MK2/F+ad 및 CV-1/F+ad는 아데노바이러스(adenovirus) AxCANCre를 가한 각각의 유도발현세포 라이세이트를 가리킨다.
3. LLC-MK2/F-ad 및 CV-1/F-ad는 아데노바이러스 AxCANCre를 가하지 않은 각각의 F 유전자도입주의 세포 라이세이트를 가리킨다.
4. LLC-MK2/F+ad 3rd는 아데노바이러스 AxCANCre로 유도발현한 세포를 3회 더 계대한 세포의 라이세이트를 가리킨다.
5. 1d 및 3d는 각각 유도발현 후 1일 및 3일을 가리킨다.
6. Vac1d 및 Vac3d는 각각 백시니아바이러스 감염 후 1일 및 3일된 세포를 가리킨다.
7. AraC1d 및 AraC3d는 각각 AraC를 첨가하여 1일 및 3일된 세포를 가리킨다.
8. CHX 1d 및 CHX 3d는 각각 단백합성 저해제 사이클로헥시미드(cycloheximide)를 첨가하여 1일 및 3일된 세포를 가리킨다.
도6은, GFP 도입 F 결실 SeV cDNA(pSeV18+/△F-GFP)를 F 비발현 LLC-MK2 세포에 트랜스펙션하여 GFP의 발현(RNP의 검출)을 관찰한 결과를 나타내는 사진이다. 대조군으로서 F 유전자를 NP 유전자의 3'말단에 셔플(shuffle)하여, F 결실부위에 GFP를 도입한 SeV cDNA(F 셔플형 SeV)를 사용했다. 「all」은 SeV cDNA 외에, NP,P, L 유전자를 발현하는 플라스미드(pGEM/NP, pGEM/P 및 pGEM/L)도 동시에 트랜스펙션한 것을 나타낸다. 「cDNA」는 cDNA(pSeV18+/△F-GFP) 만의 트랜스펙션을 나타낸다. RNP 트랜스펙션은 GFP를 발현하고 있는 P0 세포를 회수하여, OptiMEM(GIBCO BRL)에 현탁하고(107세포/ml), 동결융해 3회 반복한 라이세이트 100 ㎕를 양이온성 리포솜 DOSPER(Boehringer Mannheim) 25 ㎕와 혼합하여, 실온에 15분간 방치한 후, F 발현유도세포(+ad)에 첨가하여, RNP 트랜스펙션을 행했다. 세포의 대조군으로서 Cre DNA 리콤비나아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스 비첨가(-ad)세포를 사용했다. 그 결과, P0의 LLC-MK2 세포에서는 GFP는 SeV 바이러스 RNP의 형성에 의존적으로 발현하는 것이 판명되고, P1에서는, F 결실 바이러스는 F 유도발현에 의존적으로 증폭되는 것이 판명되었다.
도7은, F 결실 게놈 cDNA에서 재구축된 기능적인 RNP가, F 발현 헬퍼세포로 레스큐(resque)되어, 감염성을 갖는 결실형 바이러스 비리온을 형성할 수 있는 지를 조사한 결과를 나타내는 사진이다. RNP/o는 RNP를 중층(overlay)한 세포를 가리키고, RNP/t는 RNP를 트랜스펙션한 세포를 가리킨다.
도8은, F 결실 바이러스가, F 발현세포에 특이적으로 증폭되는 것을 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 유전자 결실형 게놈으로부터 구축한 기능적 RNP를 포함하는 라이세이트를 실시예 2에 기재의 F 발현세포에 리포펙션(lipofection)하여, 배양상청을 회수했다. 이 배양상청을 F 발현세포의 배지에 가하여 감염시키고, 3일째에 회수된 배양상청을, F 발현세포와 F 비발현세포에 동시에 첨가하여, 트립신존재와 비존재하에서 3일간 배양했다. 그 결과를 나타낸다. F 발현세포에서는, 트립신 존재하에서만 바이러스가 증폭되었다.
도9는, F 발현세포에 도입한 경우에 특이적으로 F 결실 바이러스가 배양상청으로 방출되는 것을 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 유전자결실형 게놈으로부터 구축한 기능적 RNP를 포함하는 라이세이트를 실시예 2에 기재된 F 발현세포에 리포펙션하여, 배양상청을 회수했다. 이 배양상청을 F 발현세포의 배지에 가하여 감염시키고, 3일째에 회수된 배양상청을, F 발현세포와 F 비발현세포에 동시에 첨가하여, 트립신 존재와 비존재하에서 3일간 배양했다. 하단은 F 비발현세포의 상청의 경우의 결과를 나타낸다.
도10은, F 결실 cDNA로부터 회수된 비리온의 게놈구조를 확인하기 위해, F 발현세포의 배양상청중의 바이러스를 회수하여, total RNA를 추출하고, F와 HN을 프로브(probe)로 하여 노던 블롯(nothern blot)해석을 행한 결과를 나타내는 사진이다. F 발현세포로부터 회수된 바이러스는 HN 유전자는 검출되었지만 F 유전자는 검출되지 않아, F 유전자가 바이러스 게놈상에 존재하지 않는 것이 명백해졌다.
도11은, GFP의 유전자는 cDNA의 구축시와 동일한 F의 결실부위에 존재하는 것을 나타내는 RT-PCR의 결과를 나타내는 사진이다. 1:+18-NP, +18 Not I 사이트 존재의 확인. 2:M-GFP, GFP 유전자가 F 유전자 결손부위에 존재하는 것의 확인. 3:F 유전자, F 유전자의 존재 확인. 야생형 SeV와 F 결손 GFP 발현 SeV의 게놈구조를 위에 나타냈다. GFP 유전자가 F 결손부위에 존재하고, NP의 3'말단에 +18 유래의 NotI 사이트가 있어, F 유전자가 RNA 게놈의 어디에도 존재하지 않는 것이 확인되었다.
도12는, 바이러스의 F와 HN에 특이적으로 반응하는 금콜로이드결합(gold colloid-bound)IgG(antiF, antiHN)를 사용한 면역전자현미경에 의해 조사한 결과를 나타내는 사진이다. 바이러스의 엔벨로프의 스파이크양(spike-like)구조는 F와 HN의 단백질로부터 된 것이 명백해졌다.
도13은, GFP의 유전자 이외의 다른 유전자의 구조는 야생형과 동일한 것을 확인한 RT-PCR의 결과를 나타내는 도이다.
도14는, F 결실 바이러스입자를 전자현미경에 의해, 그 형태를 조사한 결과를 나타내는 사진이다. F 결실 바이러스입자는 야생형 바이러스와 동일하게 내부에 나선형(helical)RNP 구조와 스파이크양 구조를 가지고 있었다.
도15는, F 결실형 SeV 벡터에 의한 인 비트로에서의 다양한 세포로의 고효율 유전자도입의 결과를 나타내는 사진이다.
도16은, 마우스 1차(primary)골수세포(BM c-kit+/-)로의 F 결실형 SeV 벡터의 도입을 해석한 결과를 나타내는 도이다. 흰 바는 PE 양성/GFP 음성을 가리키고, 검은 바는 PE 양성/GFP 양성을 가리킨다.
도17은, 래트 뇌실로의 벡터의 인 비보 투여 결과를 나타내는 사진이다.
도18은, F 발현세포로부터 회수한 F 결손 SeV 바이러스를 포함하는 배양상청을 F 비발현 LLC-MK2 세포에 감염시켜, 트립신 존재하 또는 비존재하에서 3일간 배양하여 상청중의 바이러스의 존재를 HA assay로 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도19는, 도18B에 있어서 발육계란에서 HA 양성이었던 장뇨액(lane 11 및lane 12)을 발육계란에 재접종하여 배양 2일 후의 장뇨액의 HA assay를 행한 결과를 나타내는 사진이다.
도20은, HA 양성으로 감염성이 없는 바이러스액을 면역전자현미경으로 조사한 결과를 나타내는 사진이다. 바이러스입자의 존재가 확인되고, 비리온의 엔벨로프는 금콜로이드로 표지한 HN 단백을 인식하는 항체에서는 반응했지만, 금콜로이드로 표지한 F 단백을 인식하는 항체에서는 반응하지 않았다.
도21은, F 결손 바이러스입자의 세포로의 트랜스펙션의 결과를 나타내는 사진이다.
도22는, F, HN 공발현세포의 조성을 웨스턴 블로팅에 의해 조사한 결과를 나타내는 사진이다. LLC/VacT7/pGEM/FHN은 LLC-MK2 세포에 백시니아 감염 후, pGEM/FHN 플라스미드를 트랜스펙션한 세포. LLC/VacT7은 백시니아 감염된 LLC-MK2 세포. LLCMK2/FHNmix는 F, HN 유전자가 도입된 LLC-MK2 세포로서 클로닝되지 않은 세포. LLC/FHN은 LLC-MK2 세포에 F, HN 유전자를 도입하여 아데노바이러스로 발현유도 후(3일 후)의 세포, 1-13, 2-6, 2-16, 3-3, 3-18, 3-22, 4-3, 5-9는 클로닝했을 때의 세포주의 번호(이름)를 가리킨다.
도23은, pGEM/FHN의 첨가 유무의 차이에 의한 바이러스의 형성을 확인한 결과를 나타내는 사진이다. FHN 결손 GFP 발현 SeV cDNA, pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L, pGEM/FHN을 각각 혼합하여 LLC-MK2 세포에 유전자도입했다. 유전자도입 3시간 후 배지를 AraC, 트립신이 든 MEM로 교환하여, 3일간 더 배양했다. 유전자도입 후 2일째에서 형광 입체현미경(stereoscopic fluorescence microscope)으로 관찰하고,pGEM/FHN의 첨가 유무의 차이를 검증하여, GFP 발현세포의 확산으로 바이러스의 형성을 확인했다. 그 결과를 나타낸다. 재구축시에 pGEM/FHN을 첨가한 경우는 GFP 발현세포의 확산이 확인되고, pGEM/FHN의 첨가가 없는 경우는 GFP 발현은 싱글세포에서만 관찰되었다.
도24는, RNP 트랜스펙션에 의한 F, HN 결손 바이러스의 재구축과 증폭을 나타내는 사진이다. 발현유도 후 3일째의 F HN 공발현세포(12well)에 P0 RNP를 중층 또는 DOSPER를 사용하여 리포펙션하고, 4일 후에 GFP를 관찰했다. RNP 트랜스펙션의 경우는 F 결손과 동일하게 P1의 FHN 발현세포에서 바이러스의 회수에 성공했다(위). Ade/Cre를 감염하고 6시간 이후에 FHN 단백이 유도발현된 세포에 FHN 결손 바이러스액을 감염하여 증폭을 할 수 있었던 것을 확인했다(아래).
도25는, FHN 결손 GFP를 발현하는 cDNA로부터 재구축된 바이러스액을 LLC-MK2, LLC-MK2/F, LLC-MK2/HN, LLC-MK2/FHN에 주입하고 트립신의 첨가 유무로 배양한 결과를 나타내는 사진이다. 배양 3일 후에 GFP 단백 발현세포의 확산을 확인했다. 그 결과를 나타낸다. LLC-MK2/FHN에서만 GFP의 확산이 관찰되어, 이 바이러스액은 FHN 공발현에 특이적이고 또한 트립신 의존적으로 증폭되는 것이 확인되었다.
도26은, FHN 발현세포의 배양상청 유래 RNA의 게놈구조를 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도27은, FHN 결손 바이러스로 감염된 F 발현세포의 배양상청 유래 RNA의 게놈구조의 확인 결과를 나타내는 사진이다.
도28은, 소랄렌 ·UV조사에 있어서의 소랄렌의 농도를 변화시켰을 때의, 백시니아바이러스의 불활성화와 T7활성을 나타내는 도이다.
도29는, 소랄렌 ·UV조사에 있어서의 UV조사시간을 변화시켰을 때의, 백시니아바이러스의 불활성화와 T7 RNA 폴리머라아제활성을 나타내는 도이다.
도30은, 소랄렌 ·UV조사한 백시니아바이러스의 세포상해성(CPE)을 나타내는 사진이다. 3 ×105의 LLC-MK2 세포를 6웰 플레이트에 뿌렸다. 세포를 하룻밤 배양 후, 백시니아바이러스를 moi=2에서 감염시켰다. 24시간 후, CPE를 측정했다. 위처리(mock-treatment)백시니아바이러스에 의한 CPE는 A, 15, 20 및 30분간 처리한 백시니아바이러스에 의한 CPE는, 각각 B, C 및 D에 나타냈다.
도31은, 백시니아바이러스의 UV 처리시간의 센다이바이러스 재구성효율에 대한 영향을 나타낸 도이다.
도32는, 센다이바이러스 재구성실험에 사용한 세포에 잔존하는 복제 가능한 백시니아바이러스의 역가를 나타내는 도이다.
도33은, 항VSV-G항체에 의한 웨스턴 블로팅의 해석결과를 나타내는 사진이다.
도34는, 항VSV-G항체를 사용한 플로사이트메트리의 해석결과를 나타내는 도이다. AxCANCre 감염 4일째의 LLC-MK2 VSV-G 유도발현주(L1)(moi=0, 2.5, 5)의 해석결과를 나타낸다. 1차항체는 항VSV-G항체(MoAb I-1), 2차항체는 FITC 표지된 항마우스 Ig를 사용했다.
도35는, AxCANCre의 감염량(MOI=0, 1.25, 2.5, 5, 10)을 바꿔, 일정량의 F유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입(pseudotype)센다이바이러스를 감염 후 상청을 회수하고, 더욱이 VSV-G 유도 전(-), 유도 후(+)의 세포에 감염시켜, 5일째의 GFP가 발현하고 있는 세포를 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도36은, 경시적으로 바이러스 생산량을 조사한 결과를 나타내는 사진이다.
도37은, VSV-G 발현주를 사용하여 얻어진 F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스 및 FHN 결손 센다이바이러스를 항VSV항체로 처리하여, 감염성이 영향받는지를 조사한 결과를 나타내는 사진이다.
도38은, GFP 유전자를 포함하는 F, HN 결실형 센다이바이러스를 VSV-G 유전자 발현세포 LLCG-L1에 감염시키고, VSV-G를 외피에 갖는 슈도타입 바이러스의 생산이 보여지는지를 GFP 유전자의 발현을 지표로 조사한 결과를 나타내는 사진이다.
도39는, VSV-G 유전자 발현세포에서 증식한 바이러스가 F 및 HN 결실형인 것을, 감염세포 추출액의 단백질의 웨스턴 해석에 의해 조사한 결과를 나타내는 사진이다.
도40은, 형광현미경하에서 GFP 발현세포를 관찰한 결과를 나타내는 사진이다.
도41은, 엔벨로프 발현 플라스미드와 세포중층의 조합에 의한 SeV/△F-GFP의 재구성효율의 향상을 나타내는 도이다. P0(계대 전)의 d3∼d4(3일째∼4일째)에 있어서, 현저한 개선이 인정되었다.
도42는, 엔벨로프 발현 플라스미드와 세포중층의 조합에 의한 SeV/△F-GFP의 재구성 처리조건의 검토결과를 나타내는 도이다. GFP 양성세포는 재구성된 바이러스량을 나타낸다.
도43은, cDNA으로부터의 F 결손 센다이바이러스의 레스큐의 검토결과를 나타내는 도이다. 엔벨로프 발현 플라스미드와 세포중층의 조합에 의한 SeV/△F-GFP의 재구성효율의 향상을 나타낸다. 7일째는 전 챌린지 모두 양성으로 되지만, 성공확률이 중간정도 영역인 3일째에 착안하여, 효율의 검토를 행했다.
도44는, GFP를 포함하지 않는 LacZ 탑재 F 결실형 센다이바이러스 벡터의 lacZ의 발현을 나타내는 사진이다.
도45는, 센다이바이러스 게놈 cDNA 단편의 서브클로닝(A)과 새롭게 NotI 사이트를 도입하여 구축한 5종류의 센다이바이러스 게놈 cDNA의 구조(B)를 나타내는 도이다.
도46은, SEAP에 NotI 사이트, 전사개시시그날, 개재서열, 전사종결 시그날을 부가하기 위한 클로닝용 플라스미드의 구조를 나타내는 도이다.
도47은, 각 센다이바이러스 벡터의 플라크 어세이(plaque-assay)의 결과를 나타내는 사진이다. LAS1000에 의해 얻어진 플라크 어세이의 형광화상의 일부를 나타낸다.
도48은, 각 센다이바이러스 벡터 사이에 있어서의 리포터유전자(SEAP)의 발현량의 차이를 비교한 결과를 나타내는 도이다. SeV18+/SEAP의 데이터를 100으로 하여 각각 상대값을 나타냈다. SEAP 유전자가 하류에 위치함에 따라 그 활성 즉 발현량이 저하되어 가는 것을 알 수 있었다.
도49는, P1 FHN 공발현세포에 있어서의 GFP 발현을 나타내는 현미경 사진이다.
도50은, VSV-G 슈도타입 SeV/△F:GFP 감염세포의 추출액을, 항F항체(anti-F), 항HN항체(anti-HN), 항센다이바이러스항체(anti-SeV)를 사용하여 웨스턴 블로팅해석을 행한 결과를 나타내는 사진이다.
도51은, 중화항체(neutralizing antibody)(VGV항체)의 존재하 또는 비존재하에서 F 및 HN을 결손한 VSV-G 슈도타입 SeV를 감염시킨 세포의 GFP의 형광을 나타내는 사진이다.
도52는, 밀도구배 초원심법을 사용하여 분획한 F 유전자 또는 F, HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 VSV-G 슈도타입 센다이바이러스의 웨스턴 해석 결과를 나타내는 사진이다.
도53은, F 유전자를 결손한 게놈을 갖는 센다이바이러스, 또는 F 유전자 또는 F, HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 VSV-G 슈도타입 센다이바이러스에 의한 적혈구 응집반응을 나타내는 사진이다.
도54는, F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 센다이바이러스 또는 VSV-G 슈도타입 센다이바이러스에 의한 배양세포로의 감염 특이성을 나타내는 도이다.
도55는, NGF 발현을 탑재한 F 결실형 센다이바이러스(NGF/SeV/△F)의 구조 확인을 나타내는 사진이다.
도56은, NGF 탑재 F 결실형 SeV 감염세포로부터 발현되는 NGF의 활성을 나타내는 도이다. 닭의 후근신경절의 1차 신경세포 분산배양계에, 배양개시와 동시에 SeV 감염세포의 배양상청 희석액 또는 대조군으로서의 NGF 단백을 첨가하고, 3일후에 미토콘드리아에 의한 환원활성을 지표로서 생세포를 정량했다(n=3). 배양상청은 1/1000 희석상당량 첨가했다.
도57은, NGF 탑재 F 결실형 SeV 감염세포로부터 발현되는 NGF의 활성을 나타내는 사진이다. 닭의 후근신경절의 1차 신경세포 분산배양계에, 배양개시와 동시에 SeV 감염세포의 배양상청 희석액 또는 대조군으로서의 NGF 단백을 첨가하고, 3일 후에 현미경으로 관찰했다.
A) 대조군(NGF 첨가 없음),
B) NGF 단백 10 ng/mL 첨가,
C) NGF/SeV 감염세포 배양상청 1/100희석 첨가,
D) NGF/SeV 감염세포 배양상청 1/100희석 첨가,
E) NGF/SeV/△F 감염세포 배양상청 1/100희석 첨가,
F) NGF/SeV/△F-GFP 감염세포 배양상청 1/100희석 첨가
도58은, Ad-Cre의 moi와 F 단백의 발현량을 나타내는 사진이다.
도59는, Adeno-Cre에 의한 LLC-MK2/F의 발현을 나타내는 사진이다.
도60은, 계대에 의한 발현의 지속성을 나타내는 사진이다.
도61은, 계대에 의한 F 단백의 국재화(localization)를 나타내는 사진이다.
도62는, GFP-CIU와 항SeV-CIU와의 상관관계를 나타내는 도이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] F 결실형 센다이바이러스의 구축
<1> F 결실형 SeV 게놈 cDNA 및 F 발현 플라스미드의 구축
센다이바이러스(SeV) 전장의 게놈 cDNA, pSeV18+b(+)(Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820)(「pSeV18+b(+)」는「pSeV18+」이라고도 한다)의 cDNA를 SphI/KpnI로 소화하여 프래그먼트(fragment)(14673 bp)를 회수하여, 플라스미드 pUC18/KS라고 불리는 pUC18에 클로닝 했다. F 결손부위의 구축은 이 pUC18/KS상에서 행했다. F 유전자의 결손은, PCR-라이게이션(PCR-ligation)방법의 조합으로 행하고, 결과로서 F 유전자의 ORF(ATG-TGA=1698 bp)를 제거하고 atgcatgccggcagatga(서열번호: 1)로 연결하여, F 결실형 SeV 게놈 cDNA(pSeV18+/△F)를 구축했다. PCR은, F의 상류에는(forward: 5'-gttgagtactgcaagagc/서열번호: 2, reverse: 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/서열번호: 3), F 유전자의 하류에는 (forward: 5'-atgcatgccggcagatga/서열번호: 4, reverse: 5'-tgggtgaatgagagaatcagc/서열번호: 5)의 PCR 산물을 EcoT22I에서 연결했다. 이와 같이 얻어진 플라스미드를 SacI와 SalI로 소화하고, F 결손부위를 포함하는 영역의 단편(4931 bp)을 회수하고 pUC18에 클로닝하여, pUC18/dFSS를 얻었다. 이 pUC18/dFSS를 DraIII으로 소화하고, 단편을 회수하여 pSeV18+의 F 유전자를 포함하는 영역의 DraIII 단편과 치환하고, 라이게이션하여 플라스미드 pSeV18+/△F를 얻었다.
더욱이, F 결실부위에 EGFP 유전자를 탑재한 cDNA(pSeV18+/△F-GFP)를 구축하기 위해, PCR에 의해, EGFP 유전자의 증폭을 행했다. EGFP 유전자를 6의 배수(Hausmann, S. et al., RNA 2, 1033-1045(1996))에 맞추기 위해 5'는 NsiI-tailed 프라이머(5'-atgcatatggtgatgcggttttggcagtac 서열번호: 6), 3'는 NgoMIV-tailed 프라이머(5'-Tgccggctattattacttgtacagctcgtc 서열번호: 7)를 사용하여 PCR을 행했다. PCR 산물을 제한효소 NsiI와 NgoMIV로 소화하여 겔로부터 단편을 회수하고, pUC18/dFSS의 F 결실부위에 있는 NsiI와 NgoMIV라는 제한효소부위에 연결하여, 시퀀스를 확인했다. 여기로부터, EGFP 유전자를 포함하는 DraIII 단편을 회수하여, pSeV18+의 F 유전자를 포함하는 영역의 DraIII 단편과 치환하고, 라이게이션하여 플라스미드 pSeV18+/△F-GFP를 얻었다.
한편, F 유전자를 발현하는 Cre/loxP 유도형 발현플라스미드의 구축은 SeV F 유전자를 PCR로 증폭하여, 시퀀스를 확인한 후, Cre DNA 리콤비나아제(recombinase)에 의해 유전자산물이 유도발현될 수 있도록 설계된 플라스미드 pCALNdlw(Arai 등 J. Virology 72, 1998, p1115-1121)의 유니크사이트 SwaI 부위에 삽입하여, 플라스미드 pCALNdLw/F를 얻었다.
<2> SeV-F 단백을 유도발현하는 헬퍼세포의 제작
F 결손 게놈으로부터 감염 바이러스입자를 회수하기 위해, SeV-F 단백을 발현하는 헬퍼세포주를 수립했다. 세포는 SeV의 증식에 자주 사용되고 있는 원숭이신장 유래 세포주, LLC-MK2 세포를 사용했다. LLC-MK2 세포는, 10%의 열처리한 부동화 소태아혈청(FBS), 페니실린 G 나트륨 50 단위/ml 및 스트렙토마이신 50 ㎍/ml를 첨가한 MEM로 37℃, 5% CO2로 배양했다. SeV-F 유전자산물은 세포상해성을 갖기 때문에, Cre DNA 리콤비나아제에 의해 F 유전자산물을 유도발현할 수 있도록 설계된 상기 플라스미드 pCALNdLw/F를, 인산칼슘법(mammalian transfection kit (Stratagene))에 의해, 그 프로토콜에 따라 LLC-MK2 세포에 유전자도입을 행했다.
10 cm 플레이트를 사용하여, 40% 콘플루언트까지 생육한 LLC-MK2 세포에 10 ㎍의 플라스미드 pCALNdLw/F를 도입 후, 10 ml의 10% FBS를 포함하는 MEM 배지로, 37℃의 5% CO2인큐베이터속에서 24시간 배양했다. 24시간 후에 세포를 떼어내어, 10 ml 배지에 현탁 후, 10 cm 샬레(dish) 5장을 사용하여, 5 ml 1장, 2 ml 2장, 0.2 ml 2장에 뿌려, G418(GIBCO-BRL)을 1200 ㎍/ml를 포함하는 10 ml의 10% FBS를 포함하는 MEM 배지로 배양을 행하여, 2일마다 배지를 교환하면서 14일간 배양하여, 유전자의 안정도입주의 선택을 행했다. 상기 배지에 의해 생육해 온 G418에 내성을 나타내는 세포는 클로닝링(cloning ring)을 사용하여 30주를 회수했다. 각 클론은 10 cm 플레이트에서 콘플루언트가 될 때까지 확대배양을 계속했다.
각 클론에 대해서 Cre DNA 리콤비나아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스 AxCANCre로 감염 후, 항SeV-F 단백질 단일클론 IgG(f236, J. Biochem. 123: 1064-1072)를 사용하여 SeV-F 단백의 발현을 웨스턴 블로팅법에 의해 아래와 같이 조사했다.
각 클론은 6 cm 샬레에서 콘플루언트까지 생육시킨 후, 아데노바이러스 AxCANCre를 사이토 등의 방법(Saito et al., Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T.et al., J Virol 72,1115-1121(1998))에 의해 moi=3으로 감염 후, 3일간 배양했다. 상기 세포는 배양상청을 제거한 후, PBS 완충액으로 2회 세척하여, 스크래퍼(scraper)로 세포를 떼어내고, 1500 ×g으로 5분간 원심하여, 세포를 모았다.
상기 세포는 -80℃에서 보존하고, 필요에 따라 해동하여 사용할 수 있다. 모은 세포는 150 ㎕ PBS 완충액에 현탁 후, 동량의 2 ×Tris-SDS-BME sample loading buffer(0.625 M Tris, pH 6.8, 5% SDS, 25% 2-ME, 50% glycerol, 0.025% BPB, Owl사제)를 가하여, 98℃ 3분간 가열처리 후 전기영동용 시료에 사용했다. 상기 시료(1 lane당 1 ×105세포)를 SDS-폴리아크릴아미드겔(SDS-polyacrylamide gel)(멀티겔 10/20, 다이이치화학사제)을 사용하여, 전기영동에 의해 분획하고, 분획된 단백은 세미드라이블로팅법(semi-dry blotting)에 의해 PVDF 전사막(Immobilon-P transfer membranes, Millipore사제)에 전사했다. 전사는 100% 메탄올에 30초, 물에 30분간 담근 전사막을 사용하여, 1 mA/cm2정전류의 조건에서 1시간 행했다.
상기 전사막을 0.05% Tween20, 1% BSA를 첨가한 블로킹용액(BlockAce; Snow Brand Milk Products)속에서 1시간 진탕 후, 0.05% Tween20, 1% BSA를 첨가한 블로킹용액으로 1/1000희석한 항SeV-F항체(f236)로 실온에서 2시간 반응시켰다. 상기 전사막을 3회 20 ml의 PBS-0.1% Tween20에 5분간 진탕하여 세척한 후, PBS 완충액으로 5분간 진탕하고 세척했다. 상기 전사막을 0.05% Tween20, 1% BSA를 첨가한 블로킹용액으로 1/2000희석한 퍼옥시다아제(peroxidase)로 표지한 항마우스 IgG항체(Goat anti-mouse IgG, Zymed사제) 10 ml를 실온에서 1시간 반응시켰다. 상기 전사막을 3번 20 ml의 PBS-0.1% Tween20에 5분간 진탕하여 세척한 후, PBS 완충액으로 5분간 진탕하여 세척했다.
화학발광법(chemiluminescence method)(ECL western blotting detection reagents, Amersham사제)에 의해 항SeV-F항체와 교차가 보이는 상기 전사막상의 단백질의 검출을 행했다. 결과는 도1에 나타낸다. AxCANCre 감염 특이적인 SeV-F의 발현이 검출되어, SeV-F 유전자산물을 유도발현하는 LLC-MK2세포가 얻어지는 것이 확인되었다.
얻어진 여러 세포주 중 하나인 LLC-MK2/F7 세포를 항SeV-F항체를 사용하여 플로사이트메트리 해석을 행했다(도2). 즉, 1 ×105세포를 15,000 rpm 4℃에서 5분간 원심하여 침전을 얻고(precipitation), PBS 200 ㎕로 세척하여, 100배 희석한 항F 단일클론항체(f236), 0.05% 아지화 나트륨(sodium azide), 2% FCS를 포함하는 FACS용 PBS(NIKKEN CHEMICALS)로 4℃, 1시간 차광하여 반응시켰다. 다시 15,000 rpm 4℃에서 5분간 원심하여 침전을 얻고, PBS 200 ㎕로 세척하여, FITC 표지한 항마우스 IgG(CAPPEL사) 1 ㎍/ml와 30분간 빙상에서 반응시키고, 다시 PBS 200 ㎕로세척하여, 15,000 rpm 4℃에서 5분간 원심하여 세포를 원심하여 침전을 얻고, 1 ml의 FACS용 PBS에 현탁했다. EPICS ELITE(Clulter) 아르곤 레이저를 사용하여, 여기파장 488 nm, 형광파장 525 nm으로 해석했다. 그 결과, LLC-MK2/F7에서는 SeV-F 유전자 유도발현시 특이적으로 항체와의 높은 반응성이 검출되어, SeV-F 단백질이 세포표면에 발현되는 것이 확인되었다.
[실시예 2] 헬퍼세포에서 발현된 SeV-F 단백질의 기능확인
헬퍼세포에서 유도발현된 SeV-F 단백질은 종래의 단백기능이 유지되고 있는 지를 조사했다.
LLC-MK2/F7 세포를 6 cm 샬레에 뿌려, 콘플루언트까지 생육시킨 후, 아데노바이러스 AxCANCre를 사이토 등의 방법(상기)에 의해 moi=3으로 감염 후, 트립신(7.5 ㎍/ml, GIBCOBRL)을 포함하는 MEM(serum free)에서 37℃ 5% CO2인큐베이터에서 3일간 배양했다.
상기 세포는 배양상청을 제거한 후, PBS 완충액으로 2회 세척하여, 스크래퍼로 세포를 떼어내고, 1500 ×g으로 5분간 원심하여, 세포를 모았다. 상술한 웨스턴 블로팅법에 의해 발현된 F 단백질의 트립신에 의한 절단을 확인했다(도3). SeV-F 단백질은 비활성형 전구단백인 F0으로서 합성되어, 트립신의 단백 분해작용에 의해, F1과 F2의 2개의 서브유닛으로 절단하여 활성화된다. 이와 같이 F 단백이 유도발현 후의 LLC-MK2/F7 세포는 보통의 세포와 동일하게 계대하더라도 F 단백이 지속적으로 발현하고, 발현된 F 단백에 의한 세포상해성이 관찰되지 않아, F 단백 발현세포끼리에서의 세포융합도 관찰되지 않았다. 그러나, 이 F 발현세포에 SeV-HN 발현 플라스미드(pCAG/SeV-HN)를 트랜스펙션하여 트립신을 포함하는 MEM로 3일간 배양하자, 세포간의 융합이 많이 관찰되었다. 세포표면에 있어서의 HN의 발현은 적혈구의 세포표면으로의 흡착실험(Hematoadsorption assay; Had assey)으로 확인했다(도4). 즉, 배양세포에 1% 닭적혈구를 1 ml/dish를 가하여, 4℃에서 10분간 가만히 방치한 후, 세포를 PBS 완충액으로 3회 세척한 바, 세포표면의 적혈구의 콜로니가 관찰되었다. 적혈구가 응집한 세포에서 세포융합이 관찰되어, F 단백은 HN과 상호작용하여 세포융합을 일으킨 것이 판명되고, LLC-MK2/F7에서 지속 발현하고 있는 F 단백은 종래의 기능을 유지하고 있는 것이 나타났다.
[실시예 3] F 결실형 게놈을 갖는 기능적 RNP 및 비리온의 형성
결실형 바이러스로부터 비리온을 회수하기 위해서는 결실 단백질 발현세포를 사용할 필요가 있다. 그러나, 결실 단백질 발현세포를 사용하여 결실형 바이러스의 회수를 시도한 바, F 결손 SeV의 재구축시에 사용한 백시니아바이러스에 의해 헬퍼세포주로부터의 F 단백발현이 신속히 정지한 것이 판명되어(도5), 헬퍼세포주로부터 직접 F 단백의 공급에 의한 바이러스의 재구성에 성공하지 못했다. 백시니아바이러스에 대한 소랄렌(psoralen)첨가로 장파장 자외선(long-waveUV)으로의 처리(PLWUV 처리)는, 백시니아바이러스의 복제능력을 불활성화시켜, T7 발현활성이 손상되지 않는 것이 보고되어 있다(Tsung 등, J Virol 70,165-171,1996). 따라서, 이 PLWUV 처리한 백시니아바이러스(PLWUV-VacT7)를 사용하여 바이러스의 재구축을 시도했다. 자외선 조사장치는, 15 와트 벌브(watt-bulb) 5개가 장비된 UVStratakinker 2400(카탈로그번호 400676(100V), 스트라타진사, La Jolla, CA, USA)을 사용했다. 그 결과, 재구축에 사용한 F 발현세포로부터 F 단백의 발현은 저해되었지만, 이 PLWUV-VacT7로 재구축한 세포의 라이세이트를 헬퍼세포로 감염하더라도 araC의 존재하에서는 백시니아가 거의 증식하지 않아, 헬퍼세포주로부터의 F 단백발현에도 거의 영향을 주지 않는 것이 판명되었다. 더욱이, 이 PLWUV-VacT7을 사용한 재조합 야생형 SeV의 재구축에서는 종래가 105이상의 세포가 없으면 바이러스가 회수되지 않았던 것에 비해, 103의 세포로부터도 바이러스 회수가 가능해져, 바이러스의 재구축 효율이 크게 개선되었다. 이 방법을 사용하여, F 결실 SeV 바이러스의 재구축을 시도했다.
<F 결실 SeV 바이러스의 재구축 및 증폭>
F 결손부위에 enhanced green fluorescent protein(EGFP)유전자를 리포터로서 6 n 룰에 따라 도입한 상기 pSeV18+/△F-GFP를 아래와 같이 하여 LLC-MK2 세포에 트랜스펙션하여 GFP의 발현을 관찰했다. 이 때 RNP 형성에 필요한 구성요소인, 3개의 바이러스 유래 유전자 NP, P, L의 유무에 의한 영향도 검토했다.
LLC-MK2 세포를 5 ×106cells/dish로 100 mm 페트리접시에 뿌려, 24시간 배양 후, 소랄렌과 장파장 자외선(365 nm)으로 20분간 처리하여, T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 리콤비넌트 백시니아바이러스(Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126(1986))에 실온에서 1시간감염시켰다(moi=2)(moi=2~3, 바람직하게는 moi=2가 사용된다). 세포를 3회 세척한 후 플라스미드 pSeV18+/△F-GFP, pGEM/NP, pGEM/P 및 pGEM/L(Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579(1996))을 각각 12 ㎍, 4 ㎍, 2 ㎍ 및 4 ㎍/dish의 양비로 OptiMEM(GIBCO)에 현탁하여, SuperFect transfection reagent(1 ㎍ DNA/5 ㎕의 SuperFect, QIAGEN)를 넣고 혼합하여, 실온에서 10분간 방치 후, 최종적으로 3% FBS를 포함하는 OptiMEM 3 ml에 넣고, 세포에 첨가하여 배양했다. pSeV18+/△F-GFP 대신에 대조로서 야생형 SeV 게놈 cDNA(pSeV(+))(Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579(1996))를 사용하여 동일한 실험을 행했다. 3시간 배양 후, 세포를, 혈청을 포함하지 않는 MEM로 2회 세척하여, 시토신β-D-아라비노후라노시드(cytosineβ-D-arabinohuranoside)40 ㎍/ml(AraC, Sigma), 트립신 7.5 ㎍/ml(GIBCO)를 포함하는 MEM로 70시간 배양했다. 이들 세포를 회수하여, 펠렛을 OptiMEM에 현탁했다(107cells/ml). 동결융해를 3회 반복하여 lipofection reagent DOSPER(Boehringer mannheim)와 혼합하여(106cells/25 ㎕ DOSPER) 실온에서 15분 방치한 후, F 발현 LLC-MK2/F7 세포주에 트랜스펙션(106cells/well in 12-well-plate)하여, 혈청을 포함하지 않는 MEM(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/ml 트립신을 포함한다)에서 배양했다.
그 결과, 바이러스 유래의 3개의 구성요소, NP, P, L이 전부 갖추어졌을 때에만 GFP의 발현이 인정되어, 외래유전자를 발현하는 결실 바이러스 RNP를 형성할수 있는 것이 판명되었다(도6).
<F 결실형 비리온의 확인>
상기와 같이 하여 F 결실 게놈 cDNA에서 재구축된 기능적인 RNP가, F 발현 헬퍼세포로 레스큐되어, 감염성을 갖는 결실형 바이러스 비리온을 형성할 수 있는지를 조사했다. 상술한 바와 같이 기능적 RNP가 형성되는 조건(pSeV18+/△F-GFP, pGEM/NP, pGEM/P 및 pGEM/L을 동시에 트랜스펙트하는 조건)과 형성되지 않는 조건(pSeV18+/△F-GFP, pGEM/NP의 2종의 플라스미드만을 트렌스펙트하는 조건)으로 재구축을 행한 세포를 동결/융해하여 얻은 라이세이트를 양이온리포솜과 혼합하여 F 발현세포와 비발현세포에 각각 리포펙션하여, 이들 세포에 있어서의 GFP 발현세포의 확산으로 바이러스입자의 형성을 관찰했다. 그 결과, 기능적 RNP가 재구축된 조건의 라이세이트를 사용하여, F 발현세포에 도입했을 때에만 GFP 발현세포의 확산이 관찰되었다(도7). 또한, 플라크 어세이에 있어서도, 동일한 조건에서만 플라크의 형성이 관찰되었다. 이들 결과로부터, F 결손 바이러스 게놈으로부터 형성된 기능적 RNP가 F 발현세포 유래의 F 단백질의 존재하에서, 감염성 바이러스입자로서 더 형성되어, 세포밖으로 방출된 것이 판명되었다.
배양상청중의 감염성 F 결실형 비리온의 존재는 아래의 실험에 의해 증명되었다. F 유전자 결실형 게놈으로부터 구축한 기능적 RNP를 포함하는 라이세이트를 실시예 2에 기재의 F 발현세포에 리포펙션하여, 배양상청을 회수했다. 이 배양상청을 F 발현세포의 배지에 가하여 감염시키고, 3일째에 회수된 배양상청을, F 발현세포와 F 비발현세포에 동시에 첨가하여, 트립신 존재와 비존재하에서 3일간 배양했다. F 발현세포에서는, 트립신 존재하에서만 바이러스가 증폭되었다(도8). F 비발현세포의 상청(도9 하단), 또는 트립신 비존재하에서 배양한 F 발현세포로부터는 감염성을 갖지 않는 바이러스입자가 방출되고 있는 것이 명백해졌다. 이상의 것을 정리하면, F 결손 GFP 발현 바이러스는 F 발현세포에 특이적이고 또한 트립신 절단에 의존적으로 증폭되는 것이 명백해졌다. 이와 같이 증폭된 감염성 F 결실형 센다이바이러스의 역가는 0.5 ×107∼1 ×107CIU/ml의 범위에 있었다.
[실시예 4] F 결실형 GFP 발현 바이러스의 해석
F 결실 cDNA로부터 회수된 비리온의 게놈구조를 확인하기 위해, F 발현세포의 배양상청중의 바이러스를 회수하고, total RNA를 추출하여, F와 HN을 프로브로 하여 노던 블로팅 해석을 행했다. 그 결과 F 발현세포로부터 회수된 바이러스는 HN 유전자는 검출되었지만 F 유전자는 검출되지 않아, F 유전자가 바이러스 게놈상에 존재하지 않는 것이 명백해졌다(도10). 더욱이 RT-PCR에 의해 GFP의 유전자는 cDNA의 구축시와 동일한 F의 결실부위에 존재하는 것(도11), 또한, 다른 유전자의 구조는 야생형과 동일한 것을 확인했다. 이상의 것으로부터 바이러스 재구성중에 게놈의 재편성은 일어나지 않고 있지 않은 것이 나타났다. 또한, 회수된 F 결실 바이러스입자를 전자현미경에 의해, 그 형태를 조사했다. F 결실 바이러스입자는 야생형 바이러스와 동일하게 내부에 나선형 RNP 구조와 스파이크양 구조를 가지고 있었다(도14). 더욱이, 바이러스의 F와 HN에 특이적으로 반응하는 금콜로이드 결합IgG(antiF, antiHN)를 사용한 면역전자현미경에 의해 조사한 바, 바이러스 엔벨로프의 스파이크양 구조는 F와 HN의 단백질로 된 것이 명백해지고(도12), 헬퍼세포가 생산하는 F 단백질이 이 비리온에 효율적으로 함입되어 있는 것을 알 수 있었다. 아래에 상세하게 기술한다.
<Total RNA의 추출, 노던 블로팅 해석 및 RT-PCR>
F 발현세포 LLC-MK2/F7에 바이러스 감염하고 3일째의 배양상청으로부터 QIAamp Viral RNA mini kit(QIAGEN)를 사용하여, 그 프로토콜에 따라 total RNA의 추출을 행했다. 정제한 total RNA(5 ㎍)를 포름알데히드를 포함하는 1% 변성 아가로우즈겔(agarosegel)로 영동분리한 후, 버큠블로팅장치(vacuum blotting device)(Amersham Pharmacia사)를 사용하여 Hybond-N+멤브랜에 트랜스퍼했다. 작성한 멤브랜은 0.05 M의 NaOH로 고정하여, 2배 희석한 SSC 완충액(Nacalai tesque)으로 헹군 후, 하이브리다이제이션(Boehringrer Mannheim)으로 30분간 프레하이브리다이제이션(pre-hybridization)을 행했다. 디곡시게닌(digoxigenin)(DIG)-dUTP(알칼리감수성)를 사용한 랜덤 프라임 DNA 표지법(random prime DNA labeling)(DIG DNA Labeling Kit, Boehringer mannheim)에 의해 작성한 F 또는 HN 유전자의 프로브를 첨가하여 16시간 하이브리다이즈시켰다. 그 후, 멤브랜을 세척하고, 알칼리포스파타아제(alkaline phosphatase) 표지 항DIG항체(anti-digoxigenin-AP)와 반응시켜, DIG ditection kit를 사용하여 해석했다. 그 결과 F 발현세포로부터 회수된 바이러스는 HN 유전자는 검출되었지만 F 유전자는 검출되지 않아, F 유전자가 바이러스 게놈상에 존재하지 않는 것이 명백해졌다(도10).
더욱이 RT-PCR에 의해 상세한 해석을 행했다. RT-PCR은 정제한 바이러스 RNA를 SUPERSCRIPTII Preamplification System(Gibco BRL)을 사용하여, 그 프로토콜에 따라 first strand cDNA를 합성하여, LA PCR kit(TAKARA ver2.1)를 사용하여 다음과 같은 조건으로 PCR을 행했다. 94℃/3분 반응 후, 94℃/45초, 55℃/45초, 72℃/90초를 1사이클로서 30사이클을 증폭하여 72℃에서 10분간 두고, 2% 아가로우즈겔로 100v/30분 전기영동하여 에티디움브로마이드(ethidium bromide)염색하여, 촬영했다. M 유전자와 F 결실부위에 삽입한 EGFP의 확인에 사용한 프라이머는 forward 1 : 5'-atcagagacctgcgacaatgc(서열번호: 8), reverse 1 : 5'-aagtcgtgctgcttcatgtgg(서열번호: 9), F 결실부위에 삽입한 EGFP와 HN 유전자의 확인에 사용한 프라이머는 forward 2 : 5'-acaaccactacctgagcacccagtc(서열번호: 10), reverse 2 : 5'-gcctaacacatccagagatcg(서열번호: 11), 또한, M 유전자와 HN 유전자 사이는 forward 3: 5'-acattcatgagtcagctcgc(서열번호: 12)와 reverse2 프라이머(서열번호: 11)로 행했다. 그 결과, GFP의 유전자는 cDNA의 구축시와 동일한 F의 결실부위에 존재하는 것(도11), 또한, 다른 유전자의 구조는 야생형과 동일한 것을 확인했다(도13). 이상의 것으로부터 바이러스 재구성중에 게놈의 재편성은 일어나고 있지 않은 것이 나타났다.
<금콜로이드 면역표지 전자현미경 해석>
회수된 F 결실 바이러스입자를 전자현미경에 의해, 그 형태를 조사했다. 먼저, 결손형 바이러스 감염세포의 배양상청을 28,000 rpm, 30분간 원심하여 바이러스를 펠렛(pellet)으로 한 후에, 1 ×109HAU/ml가 되도록 10배 희석한 PBS에 재현탁하여, 그 한 방울을 지지막이 부착된 마이크로그리드(microgrid)상에 적하하여 실온에서 건조시켰다. 3.7% 포르말린을 포함하는 PBS로 15분간 고정처리 후, 0.1% BSA를 포함하는 PBS 용액으로 30분 전처리를 행하고, 더욱이 같은 용액으로 200배 희석한 항F 단일클론항체(f236),또는 항HN 단일클론항체(Miura, N. et al., Exp. Cell Res. (1982) 141: 409-420)를 적하하여 보습상태에서 60분간 반응시켰다. 그 후 글릿을 PBS로 세척하고, 200배 희석한 금콜로이드 표지 항마우스 IgG항체를 적하하여 마찬가지로 보습상태에서 60분간 반응시켰다. 계속해서 글릿을 PBS, 멸균증류수의 순으로 세척하여 실온에서 공기로 건조한 후, 그리드 위에 4%의 초산우라늄용액(uranium acetate solution)으로 2분간 염색하여 건조시킨 다음, JEM-1200EXII 전자현미경(JEOL.)을 사용하여 관찰, 촬영했다. 그 결과, 바이러스 엔벨로프의 스파이크양 구조는 F와 HN의 단백질로 된 것이 명백해져(도12), 헬퍼세포가 생산하는 F 단백질이 이 비리온에 효율적으로 함입되어 있는 것을 알 수 있었다. 또한, F 결실 바이러스입자는 야생형 바이러스와 동일하게 내부에 나선형 RNP 구조와 스파이크양 구조를 가지고 있었다(도14).
[실시예 5] F 결실형 SeV 벡터에 의한 인 비트로에서의 다양한 세포로의 고효율 유전자도입
<래트 대뇌피질 신경세포의 1차 배양세포로의 도입>
래트 대뇌피질 신경세포의 1차 배양세포를, 아래와 같이 하여 조제하여 배양했다. 임신 18일 SD 래트(SPF/VAF Crj: CD, 암컷, 332 g,∼9주 Charles River)를 디에틸에테르에 의해 깊게 마취하여, 액하동맥 방혈(bloodletting from axillary arteries)에 의해 안락사시켰다. 개복하여 자궁으로부터 태아를 적출하여 피부두개를 절개하고 뇌를 꺼냈다. 입체현미경하에서 대뇌반구를 작업액(5% 말혈청과 5% 송아지혈청, 10% DMSO를 포함한다) DMEM에 옮기고, 슬라이스하여 빙온냉각한 파파인(papain)용액(1.5 U, 시스테인 0.2 mg, 소혈청알부민 0.2 mg, 글루코오스 5 mg, DNase 0.1 mg/ml)을 가하여, 32℃에서 5분마다 전도교반하여 15분간 인큐베이션했다. 현탁액이 충분히 탁해져, 조직편이 반투명해진 것을 확인하고 조직편이 뿔뿔이 흩어질 때까지 피페팅을 반복했다. 32℃에서 1200 rpm 5분간 원심한 후, 세포를 B27 supplement 첨가된 neural basal medium(GibcoBRL, Burlington, Ontario, Canada)에 재현탁하고, 폴리-d-리진(lysine)(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA, U.S.A.)으로 코팅된 플레이트상에 1 ×105cells/dish 뿌려, 37℃, 5% CO2에서 배양을 행했다.
그 대뇌피질 1차 배양 신경세포 5 ×105/well을 5일간 배양 후, F 결실형 SeV 벡터를 감염시키고(moi=5), 3일간 더 배양했다. 1% 파라포름알데히드, 5% 염소혈청, 0.5% Triton-X를 포함하는 고정액에서 5분간 실온에서 고정하고, BlockAce(Snow Brand Milk Products)로 실온에서 2시간 블로킹하여 500배로 희석된 염소 항래트 microtubule-associated protein 2(MAP-2)(Boerhinger) IgG과 실온에서 1시간 인큐베이션했다. PBS(-)로 15분마다 3회 세척 후, 5% 염소혈청/PBS로 100배 희석된 cys3-결합 항마우스 IgG와 실온에서 1시간 인큐베이션했다. 더욱이 PBS(-)로 15분마다 3회 세척 후, 세포에 Vectashield mounting medium(Vector Laboratories, Burlingame, U.S.A.)을 가하여, 공초점현미경(confocal microscope)(Nippon Bio-Rad MRC 1024, Japan)으로 470-500-nm 또는 510-550-nm의 excitation band-pass filter를 부착한 Nikon Diaphot 300 도립(倒立)현미경으로 MAP-2의 면역염색과 GFP의 형광에 의한 2중염색의 형광관찰을 행했다. 그 결과, MAP2 양성 신경세포에는 GFP가 거의 100% 도입된 것이 명백해졌다(도15).
<정상 인간세포로의 도입>
정상 인간 평활근세포, 정상 인간 간세포, 정상 인간 폐모세혈관 내피세포(Cell Systems)는 다이니폰제약으로부터 구입하여, SFM CS-C 배지 키트(Cell Systems)에서 37℃, 5% CO2로 배양했다.
정상 인간 평활근세포(도15, Muscle), 정상 인간 간세포(도15, Liver), 정상 인간 폐모세혈관 내피세포(도15, Lung) 등의 인간 정상세포에 F 결실형 SeV 벡터를 감염하여(m.o.i=5), GFP 발현을 관찰했다. 어느 세포에 있어서도 거의 100%의 도입효율로 강력한 GFP 유전자발현을 하고 있는 것이 확인되었다(도15).
<마우스 1차 골수세포로의 도입>
더욱이, 마우스 1차 골수세포를 린네지마커(lineage marker)로 분리하여, F 결실형 SeV 벡터를 감염시키는 실험을 행했다. 먼저, C57BL 마우스(6주된 수컷)에 150 mg/kg이 되도록 5-fluorouracil(5-FU, Wako Pure Chemical Industries)을 복강내 주사(IP injection)하여, 투여 2일 후, 대퇴골로부터 골수세포를 회수했다. Lympholyte-M(Cedarlane)을 사용한 밀도 구배원심에 의해 단핵세포를 분리했다. 3 ×106의 단핵세포에 대해, 바이오틴(biotin) 표지된 항CD45R(B220), 항Ly6G(Gr-1), 항Ly-76(TER-119), 항1(Thy1.2), 항Mac-1을 결합시킨 스트렙트아비딘 자기비드(streptavidine-magnetic beads)(Pharmingen; Funakoshi)의 혼합물 3 ×107을 가하여 4℃에서 1시간 반응시키고, 자석에 의해, Lin+의 세포를 제외한 분획을 회수했다(Lin-세포)(Erlich, S. et al., Blood 1999. 93(1), 80-86). Lin-세포 4 ×105세포에 대해, 2 ×107HAU/ml의 SeV를 가하고, 더욱이, 재조합 래트 SCF(100 ng/ml, BRL), 재조합 인간 IL-6(100 U/ml)을 가했다. 또한 8 ×105의 토탈 골수세포에 대해 F 결손 SeV 4 ×107HAU/ml, 1 ×106의 세포에 대해 5 ×107HAU/ml의 GFP-SeV를 가했다. 또한, GFP-SeV는, SeV 전사유닛 pUC18/T7HVJRz.DNA(+18)(Genes Cells, 1996,1:569-579)의 제한효소 NotI 절단부위에, 녹색형광 단백질(GFP)유전자(구조유전자 길이 717 bp)에 전사개시(R1)와 종결(R2)시그날, 개재(IG)서열을 부가한 NotI 단편을 PCR에 의해 증폭시키고, 도입하여 제작했다. 알려진 방법(Genes Cells, 1996,1:569-579)에 따라, LLC-MK2 세포 및 발육계란을 사용하여 GFP 유전자를 포함하는 바이러스의 재구축을 행하여, 목적 유전자를 포함하는 바이러스를 회수했다. GFP-SeV를 감염하여 48시간 배양한 후, 세포를 각각 2군으로 나눠, 하나에는 피코에리쓰린(phycoerythrin)(PE)표지 항-CD117(c-kit, Pharmingen)을 1시간 반응시키고, 다른 한 군은 대조군으로 했다. PBS로 3회 세척한 후, 플로사이트미터(EPICS Elite ESP; Coulter, Miami, FL)에 의한 해석을 행했다.
그 결과, 혈액의 1차 간세포의 마커(marker)인 항c-kit 항체로 엔리치(enrich)한 골수세포에도 F 결실형 SeV 벡터는 감염되어, GFP 유전자발현이 관찰되었다(도16). 배양상청중의 감염성 입자의 확인은, 세포배양상청을 트립신으로 처리 후, LLC-MK2 세포에 첨가하고, 3일 후에 GFP 발현세포의 존재 유무에 따라 행했다. 이들 세포 중 어느 것에 있어서도 감염성이 있는 바이러스입자가 방출되고 있지 않은 것이 확인되었다.
[실시예 6] 래트 뇌실로의 벡터의 투여
래트(F334/Du Crj, 6주된, 암컷, Charles River)에 생리식염수(Otsuka Pharmaceutical co., Ltd.)로 10배 희석한(5 mg/ml)넴부탈나트름용액(Nembutal sodium solution)(Dainabot)을 복강내 주사에 의해 마취하고, 소동물용 뇌정위 고정장치(brain stereotaxic apparatus)(DAVID KOPF사)를 사용하여 바이러스의 투여를 행했다. 투여부위는 interaural line으로부터 브레그마(bregma)로 5.2 mm, 람다(lambda)로부터 오른쪽 모서리로 2.0 mm, 뇌표면에서 2.4 mm의 위치에 30 G 의 교환침(exchangeable needle)(Hamilton사)으로 20 ㎕(108CIU)주입했다. 그러자 뇌실의 상의세포(ependymal cell)에 GFP의 높은 발현이 관찰되었다(도17). 더욱이, F결실형 SeV 벡터에서는 주사부위 주변의 바이러스를 접촉할 수 있는 상의세포 또는 신경세포에만 GFP 단백질의 발현이 관찰되지 않고, 이들 부위에 병변(lesion)이 관찰되지 않았다. 투여된 래트에서는 해부될 때까지 외견적인 행동 이상이나 체중변화 등이 관찰되지 않고, 해부 후 각 장기, 뇌 외에, 간장, 폐, 신장, 심장, 비장, 위, 장 등의 조직기관 중 어디에서도 병변이 관찰되지 않았다.
[실시예 7] F 결손 SeV 게놈으로부터의 F-less 바이러스입자의 형성
<1>
F 비발현 LLC-MK2 세포 및 F 발현 LLC-MK2 세포(LC-MK2/F7)에 F 결손 SeV 바이러스를 감염하고, 트립신 존재하(+)와 비존재하(-)에서 배양하여 3일 후의 세포배양상청의 HA assay의 결과를 나타냈다(도18 A). 이들 배양상청을 각각 발육계란에 접종하고, 2일 배양 후의 계란 장뇨액의 HA assay 결과를 나타냈다(도18 B). 패널 상부의「C」는 대조군으로서 사용한 PBS를 나타낸다. Dilution(희석)의 숫자는 바이러스액의 희석배율을 나타낸다. 더욱이, 발육계란에서 HA 양성이었던 장뇨액(lane 11 및 lane 12)을 발육계란에 재접종하여 배양 2일 후의 장뇨액의 HA assay를 행했다(도19 C). 이 결과, F 결손 SeV 바이러스를 감염한 F 비발현세포 또는 발육계란에서는 HA가 양성임에도 불구하고, 발육계란에 재접종하더라도 바이러스가 전혀 증폭되지 않아, 이 HA 양성 바이러스액이 2차감염성이 없는 것으로 판명되었다.
<2>
F 비발현세포에서 증폭된 비감염성 바이러스액에 바이러스입자가 존재하는지에 대해 검토했다. F 발현세포의 배양상청, HA 양성으로 비감염성 장뇨액 및 야생형 SeV로부터 QIAamp viral RNA mini kit(QIAGEN)에 의해 조제한 total RNA를 F 유전자와 HN 유전자를 프로브로서 사용하여 노던 블로팅을 행했다. 그 결과, 장뇨액, 또는 F 발현세포의 배양상청 바이러스 유래의 RNA 중 어느 것도 HN 유전자의 프로브에서 밴드가 검출되었지만, F 유전자의 프로브에서 밴드가 검출되지 않았다(도10). 이 HA 양성이며 감염성이 없는 액에는 F 결손 게놈을 가지고 있는 비감염성 바이러스양(virus-like)입자가 존재하는 것이 판명되었다. 더욱이, 이 HA 양성이며 감염성이 없는 바이러스액을 면역전자현미경으로 조사한 바, 바이러스입자가 확인되어, 비리온의 엔벨로프는 금콜로이드 표지한 HN 단백을 인식하는 항체에서는 반응했지만, 금콜로이드 표지한 F 단백을 인식하는 항체에서는 반응하지 않았다(도20). 이것은 F-less의 비리온의 존재를 나타내고, F 단백이 없더라도 HN 단백 단독으로 바이러스가 비리온으로서 형성되는 것이 판명되었다. F 단독으로 SeV 비리온을 형성할 수 있는 것은 이미 보고되어 있고(Leyer, S. et al., J Gen. Virol 79, 683-687(1998)), 이번 결과는 HN 단백 단독에 SeV 비리온을 형성할 수 있는 것이 처음으로 명백해졌다. 이러한 F-less 비리온을 발육계란에서 일과적으로 대량 조제할 수 있는 것은, SeV F 결손 RNP를 싸는 비리온을 대량으로 생산할 수 있는 것을 나타내고 있다.
<3>
상술한 바와 같이 발육계란에서 일과적으로 증폭된 F-less 바이러스 비리온은, 센다이바이러스가 감염 가능한 세포에는 전혀 감염성을 나타내지 않는다. 따라서 기능적인 RNP 구조는 엔벨로프에 싸여 있는 것을 확인하기 위해, 양이온리포솜(DOSPER, Boehringer mannheim)과 혼합하여, 실온에서 15분간 인큐베이션하여 F 발현세포와 비발현세포에 트랜스펙션했다. 그 결과, 양이온리포솜과 혼합하지 않는 경우는 전혀 GFP 발현세포가 관찰되지 않았던 것에 비해, 양이온리포솜과 혼합한 경우는 GFP의 발현이 어느 쪽 세포에 있어서도 관찰되었다. F 비발현세포에서는 GFP는 단세포에서 발현하고, 이웃세포로 확산되지 않는 것에 비해, F 발현세포에서는 GFP 발현세포는 확산되어, 콜로니가 형성되는 것이 관찰되었다(도21). 이것으로부터, 발육계란에서 일과적으로 증폭된 감염성이 없는 비리온을 트랜스펙션 등의 방법을 사용하여 세포에 도입하면, 유전자를 발현할 수 있는 것이 명백해졌다.
[실시예 8] FHN 결손 SeV 게놈으로부터 바이러스의 재구축 및 증폭
<FHN 결손 게놈 cDNA의 구축>
FHN 결실형 SeV 게놈 cDNA(pSeV18+/△FHN)의 구축은 먼저 pUC18/KS를 EcoRI로 소화하여 pUC18/Eco를 구축하고, F 유전자의 개시코돈으로부터 HN 유전자의 종지코돈까지 사이의 전서열을(4866-8419)을 결실시키고, BsiwI 부위(cgtacg)에서 연결하여 구축했다. FHN 결손부위의 서열을 염기시퀀싱에 의해 확인한 후, EcoRI 프래그먼트(4057 bp)를 겔로부터 회수하여 pUC18/KS의 EcoRI 프래그먼트와 치환하여 구축했다. 이 FHN 결손영역을 포함하는 KpnI/SphI 프래그먼트(14673 bp)를 겔회수하여 pSeV18+의 KpnI/SphI 프래그먼트와 치환하여, 플라스미드 pSeV18+/△FHN이 얻어졌다.
한편, GFP를 도입한 FHN 결손 SeV cDNA의 구축은 다음과 같이 행했다. pSeV18+/△FHN으로부터 SalI/XhoI 프래그먼트(7842 bp)를 회수하여 pGEM11Z(Promega)에 클로닝하여, 플라스미드 pGEM11Z/SXdFHN으로 했다. FHN 결실부위에 d2EGFP(Clontech)의 ATG-TAA(846 bp)의 양단에 BsiwI 부위를 부가한 PCR 산물을 BsiwI 효소로 소화하여, pGEM11Z/SXdFHN의 FHN 결손부위의 BsiwI 부위에 연결했다. 얻어진 플라스미드는 pSeV18+/△FHN-d2GFP로 했다.
<FHN 결손 단백 공발현세포의 작성>
F 유전자를 발현하는 플라스미드는 상술한 F 결손 단백 발현세포주의 제작에 사용한 것과 동일한 것으로, HN 유전자를 발현하는 플라스미드는 그것과 동일한 방법으로 구축하고, HN의 ORF를 포함하는 프래그먼트를 pCALNdlw(Arai 등, 상기)의 유니크한 SwaI 부위에 삽입하여, 플라스미드 pCALNdLw/HN으로 했다.
LLC-MK2 세포에 pCALNdLw/F와 pCALNdLw/HN을 동량 또는 다른 양비로 혼합하여, mammalian transfection kit(Stratagene)를 사용하여 그 프로토콜에 따라 유전자도입을 행했다. G418에서 3주간 선택한 후 클로닝했다. 얻어진 약제 내성 클론은 각각 Cre DNA 리콤비나아제를 발현하는 재조합 아데노바이러스(Ade/Cre)(사이토 등, 상기)로 감염하여(moi=10), F와 HN 단백질의 유도발현 3일 후 세포를 PBS(-)로 3회 세척하여 회수하고, 웨스턴 블로팅법을 사용하여 항SeV F와 항SeV HN 단백질의 단일클론 IgG에 의해 검출했다(도22).
<pGEM/FHN의 구축>
pCALNdLw/F와 pCALNdLw/HN을 구축에 사용한 F와 HN 프래그먼트를 각각 pGEM4Z, pGEM3Z(Promega사)에 클로닝하여, pGEM4Z/F와 pGEM3Z/HN을 얻었다. pGEM3Z/HN의 T7 프로모터와 HN을 포함하는 영역을 PvuII 효소로 소화하여 얻어진 프래그먼트를 회수하여, pGEM4Z/F의 F 유전자 하류의 SacI 유니크사이트에서 절단하여 평단화한 부위에 라이게이션했다. F 유전자와 HN 유전자를 동일방향으로 늘어 놓은 것은, 항F 또는 항HN 단일클론항체에서 웨스턴 블로팅을 행하여, F와 HN 양쪽 단백질은 동시에 발현할 수 있는 것을 확인했다.
<FHN 결손 바이러스의 재구축>
FHN 결손 바이러스의 재구축(P0)은 2가지 방법으로 행했다. 하나는 F 결손 바이러스의 재구축과 마찬가지로 RNP 트랜스펙션법을 사용했다. 또 하나는 T7으로 FHN 단백을 공발현 플라스미드를 공급하여 재구축을 행했다. 즉, T7 프로모터의 제어하에서 F, HN 단백질을 발현하는 플라스미드를 별도 제작하고, 이것에 의해 F 및 HN 단백질을 공급하여 재구축을 행했다. 어느 방법에 있어서도 재구축한 것은 FHN 공발현세포에서 증폭을 행했다. FHN 결손 GFP 발현 SeV cDNA(pSeV18+/△FHN-d2GFP), pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L, pGEM/FHN을 각각, 12 ㎍/10 cm dish, 4 ㎍/10 cm dish, 2 ㎍/10 cm dish, 4 ㎍/10 cm dish, 4 ㎍/10 cm dish의 양비로 혼합하여(최종 용량, 3 ml/10 cm dish), 상술한 F 결손 SeV의 재구축과 동일한 방법으로 LLC-MK2 세포에 유전자도입했다. 유전자도입 3시간 후 배지를 AraC(40 ㎍/ml, SIGMA),트립신(7.5 ㎍/ml, GIBCO)이 들어 있는 MEM로 교환하여, 3일간 더 배양했다. 유전자도입 후 2일째에서 형광 입체현미경으로 관찰하여, pGEM/FHN의 첨가 유무의 차이를 검증하여, GFP 발현세포의 확산으로 바이러스의 형성을 확인했다. 그 결과, 재구축시에 pGEM/FHN을 첨가한 경우는 GFP 발현세포의 확산이 확인되고, pGEM/FHN의 첨가가 없는 경우는 GFP 발현은 단일세포에서만 관찰되었다(도23). FHN 단백 재구축시에 첨가함으로써 바이러스의 비리온이 형성된 것을 나타냈다. 한편, RNP 트랜스펙션의 경우는 F 결손과 동일하게 P1의 FHN 발현세포에서 바이러스의 회수에 성공했다(도24 위).
Ade/Cre를 감염하고 6시간 이후에 FHN 단백이 유도발현된 세포에 FHN 결손 바이러스액을 감염하여 증폭할수 있었던 것을 확인했다(도24 아래).
FHN 결손 GFP를 발현하는 cDNA으로부터 재구축된 바이러스액은 LLC-MK2, LLC-MK2/F, LLC-MK2/HN, LLC-MK2/FHN에 감염하여 트립신의 첨가 유무로 배양했다. 배양 3일 후에 GFP 단백 발현세포의 확산을 확인한 바, LLC-MK2/FHN에서만 GFP의 확산이 관찰되어, 이 바이러스액은 FHN 공발현에 특이적이고 또한 트립신 의존적으로 증폭되는 것이 확인되었다(도25).
FHN 결손 바이러스 게놈을 확인하기 위해, LLC-MK2/FHN 세포로부터 회수된 배양상청을 원심한 후, QIAamp Viral RNA mini kit(QIAGEN)로 그 프로토콜에 따라 RNA 추출을 행했다. 이 RNA를 Superscript Preamplification System for first Strand Synthesis(GIBCO BRL)에 의해 RT-PCR의 템플레이트합성(template synthesis)을 행하고, TAKARA Z-Taq(Takara)를 사용하여 PCR을 행했다. 대조군은 F결손 바이러스를 사용했다. PCR 프라이머는 M 유전자와 GFP 유전자의 조합, 또는 M 유전자와 L 유전자의 조합을 사용하여 행했다(M 유전자와 GFP 유전자의 조합(M-GFP)에 대해서는 forward: 5'-atcagagacctgcgacaatgc/서열번호: 13, reverse: 5'-aagtcgtgctgcttcatgtgg/서열번호: 14; M 유전자와 L 유전자의 조합(M-L)에 대해서는 forward: 5'-gaaaaacttagggataaagtccc/서열번호: 15, reverse: 5'-gttatctccgggatggtgc/서열번호: 16). 그 결과, M과 GFP 유전자를 프라이머에 사용한 경우는 RT 조건하에서 F 결손과 FHN 결손 바이러스 공히 특이적인 밴드가 검출되었다. M과 L 유전자를 프라이머에 사용한 경우는, FHN 결손은 GFP를 포함한 소정 사이즈의 밴드가 검출되고, F 결손의 경우는 HN 유전자를 포함한 사이즈에서 길어진 밴드가 관찰되었다. 게놈구조는 FHN 결손하고 있는 것은 명백해졌다(도26).
한편, FHN 결손 바이러스를 F 발현세포에 F 결손과 동일하게 감염하여, 배양하고 4일째 배양상청을 회수하여, LLC-MK2, LLC-MK2/F, LLC-MK2/FHN으로의 감염실험을 행했다. 그 결과, 어느 감염세포에 있어서도 GFP 발현세포가 관찰되지 않아, 이들 세포로의 감염성이 없는 것을 나타냈다. 그러나, F 단백 단독으로 바이러스입자를 형성할 수 있는 것이 이미 보고되어(Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579(1996)), 간장에 있는 아시알로당단백 리셉터(asialoglycoprotein receptor)(ASG-R)를 매개로 하여 간세포에 특이적으로 감염할 수 있는 것이 보고되었다(Spiegel 등 J. Virol 72, 5296-5302,1998). 따라서, FHN 결손 RNA 게놈을 가지고, 바이러스 엔벨로프는 F 단백으로만 형성된 비리온이 F 발현세포의 배양상청에 방출될 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, FHN 결손 바이러스를 감염한 F 발현세포의 배양상청을 회수하고, 원심한 후 상기의 방법과 동일하게 RNA 추출을 행하여, 상술한 방법과 동일하게 RT-PCR로 해석했다. 그 결과, 도27에서 나타낸 바와 같이 FHN 결손 게놈을 포함하는 RNA가 존재하는 것이 판명되었다.
이 밖에, VSV-G와 슈도타입화한 바이러스 비리온의 웨스턴 블로팅에 의한 해석에서는, F, HN 단백이 발현하고 있지 않은 것은 명백하다. FHN 결손 바이러스 비리온의 생산계가 확립되었다고도 할 수 있다.
더욱이, F 단백 발현세포로부터 방출된 비리온을 양이온리포솜(50 ㎕의 DOSPER/500 ㎕/well)과의 혼합 유무로 FHN 발현세포 또는 비발현 LLC-MK2 세포에 중층했다. 그 결과, 상술한 F-less 입자의 경우와 동일하게, DOSPER와 혼합하여 세포에 중층한 경우에는 GFP 발현세포의 확산이 관찰되었지만, HN-less의 비리온만에서는 전혀 세포에 감염성이 없고, GFP 발현세포가 관찰되지 않았다. FHN 비발현세포에서는 GFP 발현세포가 관찰되었지만, 바이러스가 재형성되어 확산된 것이 인정되지 않았다.
이러한 F 발현세포로부터 회수되는 바이러스양 입자가 ASG-R 유전자를 지속발현하는 세포주나 비발현세포주, 또는 간세포에 중층하고 감염하여, Spiegel 등의 방법으로 간장특이적, 또는 ASG-R에 특이적으로 감염하는지를 조사할 수 있다.
[실시예 9] 결손 게놈 RNA 바이러스 벡터의 응용성
1. 위에서 기술한 계에서 증폭된 F 결손 RNP는 F-less의 바이러스 엔벨로프에 싸여 있어, 이 엔벨로프를 화학개질법(chemical modification method)등에 의해 목적으로 하는 세포도입능을 부가하거나 유전자도입시약이나 유전자총과 같은 것으로 세포에 도입하여(RNP 트랜스펙션, 또는 RNP 인젝션), 그 재조합 RNA 게놈이 도입세포에서 자율적으로 RNA 복제 또는 단백을 계속해서 생산하는 것이 가능하다.
2. HN의 세포내 도메인을 남기고, 세포외 도메인을 다른 리셉터를 특이적으로 표적할 수 있는 리간드를 융합시켜, 키메라단백을 생산할 수 있는 재조합 유전자를 바이러스 게놈에 함입하면, 특이성이 있는 표적할 수 있는 벡터의 생산이 가능해지고, 또한, 이 재조합 단백의 생산세포에서 벡터를 조제할 수 있다. 이들 벡터는 유전자치료, 백신 등에 응용 가능하다.
3. FHN 모두 결손하는 SeV 바이러스의 재구축에 성공한 것으로부터, GFP 유전자 대신에 타겟팅 가능한 엔벨로프 키메라단백의 유전자를 FHN 결손부위에 도입하여, FHN 결손 벡터와 동일한 방법으로 재구축하고, FHN 발현세포에서 한번 증폭하여, 비발현세포에 감염하고, 바이러스 게놈으로부터 전사된 타겟팅 가능한 키메라 엔벨로프 단백에 의해서만 형성된 비리온을 회수하면, 타겟팅 벡터의 생산이 가능해진다.
4. 지금까지, 센다이바이러스의 미니게놈과 NP, P, L과 F 유전자에서 세포에 동시에 유전자도입하여 미니게놈을 싸는 F 단백 단독으로 형성된 비리온이 보고되고(Leyer등, J Gen.Virol 79,683-687,1998), 또한, 마우스의 백혈병 바이러스를 센다이 F 단백으로 슈도화한 벡터도 보고되어 있다(Spiegel 등 J. Virol 72, 5296-5302,1998). 또한, F 단백질이 트립신으로 절단된 후 ASG-R을 매개로 하여 간장세포에 특이적으로 타겟팅할 수 있다고 보고되어 있다(Bitzer 등 J.Virol.71, 5481-5486, 1997). 앞의 보고된 계는 일과적인 입자형성계로서, 지속적으로 벡터의입자회수가 곤란하다. 또한 Spiegel 등은 센다이 F 단백으로 슈도타입화한 레트로바이러스 벡터를 보고하고 있지만, 레트로바이러스는 분열세포에 외에는 유전자도입할 수 없는 등의 고유의 문제를 안고 있다. 본 발명에서 회수된, FHN 공결손 SeV 바이러스 게놈을 가지고, F 단백만 엔벨로프 단백을 갖는 바이러스입자 등은, 세포분열에 관계없이 효율적인 세포질에서 자율복제 가능한 RNA 벡터이고, 신규 바이러스입자이며, 또한 그 대량생산이 가능한 실용적인 계이다.
[실시예 10] FHN 결손 SeV 게놈으로부터 바이러스의 재구축 및 증폭
센다이바이러스, 홍역 바이러스 등의 대부분의 단일가닥 음성가닥 RNA 바이러스에서, 바이러스 게놈을 클로닝한 cDNA로부터 감염 가능한 바이러스입자를 재구성하는 기술이 확립되었다.
대부분의 계에서, T7 프로모터 하류에 cDNA, NP, P, L 유전자를 도입한 플라스미드를 세포내에 도입하고, T7 폴리머라아제를 사용하여 cDNA, 각 유전자를 발현시킴으로써 재구성을 행하고 있지만, T7 폴리머라아제의 공급에는, T7 폴리머라아제 발현 재조합 백시니아바이러스가 주로 사용되고 있다.
T7 발현 백시니아바이러스는, 거의 모든 세포에 효율적으로 T7 폴리머라아제를 발현시킬 수 있지만, 백시니아바이러스 유래의 세포장애성 때문에, 감염세포를 2, 3일 밖에 생존시킬 수 없다. 대부분의 경우, 항 백시니아약제로서 리팜피신을 사용하고 있지만, 가토 등의 계(Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579 (1996))에서는, 리팜피신 외에, AraC를 병행하여 사용함으로써, 백시니아바이러스의 증식을 최소한으로 억제하여, 센다이바이러스의 재구성을 효율 좋게 행하는 것에 성공했다.
그러나, 센다이바이러스를 비롯한 음성가닥 RNA 바이러스의 재구성은 1 ×105세포중에 재구성된 바이러스가 여러 개의 입자나 그 이하라고 하는 효율로, 레트로바이러스 등의 다른 바이러스에 비하면 아직 상당히 낮은 것이 실정이다. 이 이유로서, 바이러스 자체가 갖는, 재구성까지의 복잡한 과정(누출된 RNA에 별도로 전사, 번역된 단백질이 붙어서 RNP양(RNP-like)구조로 되고, 그 후, 폴리머라아제에 의해 전사, 복제가 행해진다)과 함께, 백시니아바이러스를 사용하는 것에 의한 세포장애성도 들 수 있다.
T7 폴리머라아제를 공급하는 수단으로서, 백시니아 이외에 아데노바이러스의 계도 시도했지만, 좋은 결과는 얻을 수 없었다. 백시니아바이러스는 T7 폴리머라아제 외에 세포질에서 작용하는 RNA 캡핑효소도 자신의 단백으로서 코드하고 있어, 이 효소가, 세포질에서 T7 프로모터에 의해 전사된 RNA를 캡핑하여 안정화함으로써 번역효율을 높이고 있다고 생각된다. 본 발명에서는, 백시니아바이러스를 Psoralen-Long-Wave-UV법으로 처리함으로써, 백시니아바이러스에 유래하는 세포장애를 회피하여, 센다이바이러스의 재구성효율을 높이는 것을 시도했다.
소랄렌과 장파장 자외선에 의한 DNA 크로스 링킹(corsslinking)에 의해, DNA를 게놈에 갖는 바이러스의 복제를 저해하지만, 특히 초기 유전자의 발현에는 영향을 주지 않는 상태를 만들어내는 것이 가능하다. 백시니아바이러스는 게놈 길이가 길기 때문에, 이 계에 의한 바이러스 불활성화의 영향이 현저히 나타난다고 생각된다(Tsung, K. et al., J Virol 70,165-171(1996)).
자립증식 가능한 야생형 바이러스의 경우, 재구성에 의해 한 입자라도 바이러스가 생겨 있으면 트랜스펙션한 세포를 발육계란에 접종하여 센다이바이러스를 증식시키는 것이 가능하기 때문에, 재구성의 효율, 그리고 백시니아바이러스의 잔류에 그다지 신경을 쓰지 않아도 좋다.
그러나, 바이러스의 복제, 입자형성의 기구 등을 조사하기 위해 만드는 여러 가지 변이 바이러스의 재구성에서는, 증식에 발육계란을 사용할 수 없어 바이러스 유래의 단백질을 발현하고 있는 세포주 등을 사용할 수 밖에 없는 경우도 있을 수 있다. 또한, 변이 바이러스 또는 결손 바이러스가 야생형 바이러스에 비해 현저히 증식이 느린 경우도, 충분히 생각할 수 있다.
이러한 변이를 갖는 센다이바이러스를 증식시키기 위해서는, 트랜스펙션 후의 세포를 다음 세대의 세포에 중층하여 장시간 배양하지 않으면 안 된다. 그 때문에, 재구성의 효율과 백시니아바이러스의 잔존 타이터가 문제가 된다. 본 방법에서는, 재구성효율을 상승시킴과 동시에, 잔존 백시니아바이러스의 타이터를 감소시킬 수 있었다.
본 방법을 사용하여, 현재까지의 미처리 백시니아바이러스를 사용한 계에서는 얻어지지 않았던 변이 바이러스를 재구성에 의해 얻을 수 있었다(F, FHN 결손 바이러스). 이 계는, 향후 늘어날 것으로 생각되는 변이 바이러스의 재구성에 큰 도구가 될 것으로 생각된다. 따라서 본 발명자 등은, 소랄렌과 자외선(UV)의 양을 검토하여, 백시니아바이러스의 불활성화 조건을 검토했다.
<실험>
먼저, 조사시간을 2분간으로 정하여, 소랄렌농도를 검사했다. 불활성화의 검사는, 플라크형성에 의한 백시니아바이러스 타이터의 측정과, T7 프로모터 지배하 pGEM-luci 플라스미드, 센다이바이러스 미니게놈에 의한 T7 폴리머라아제 활성의 측정에 의해 행했다. 센다이바이러스 미니게놈에 의한 T7 폴리머라아제 활성의 측정은 센다이바이러스 미니게놈의 플라스미드와, T7로 센다이바이러스 NP, P, L 단백을 발현하는 pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L 플라스미드와 동시에 세포에 트랜스펙션하여, 리보뉴클레오 단백복합체를 형성시키고, 센다이바이러스의 RNA 폴리머라아제에 의해 루시페라아제(luciferase)효소단백의 전사를 조사하는 계이다.
UV조사 2분간에서는, 소랄렌의 농도에 따라 백시니아바이러스 타이터의 감소가 관찰되었다. 그러나, T7 폴리머라아제 활성은, 소랄렌농도가 0, 0.3, 1 ㎍/ml까지는 변화를 보이지 않고, 10 ㎍/ml에서는 10분의 1 정도로 감소되어 있었다(도28).
더욱이, 소랄렌농도를 0.3 ㎍/ml로 고정하여, 자외선 조사시간을 검토했다. 조사시간이 증대함에 따라, 백시니아바이러스의 타이터는 감소했지만, 30분까지의 조사에서는 T7 폴리머라아제 활성에의 영향은 보이지 않았다. 이 때, 0.3 ㎍/ml, 30분조사의 조건으로는, T7 폴리머라아제 활성에 영향을 주지 않고, 타이터를 1000분의 1까지 감소시킬 수 있었다(도29).
그러나, 타이터가 1000분의 1까지 감소한 백시니아바이러스에서도 처리 전의 타이터로 환산하여 moi=2(처리 후의 잔존타이터로 moi=0.002)에서 감염했을 때의24시간 후의 CPE는, 미처리 바이러스를 moi=2에서 감염시켰을 때의 그것과 다르지 않았다(도30).
이 조건으로 처리한 백시니아바이러스를 사용하여, 센다이바이러스 재구성의 효율을 검토했다. 재구성은, 상기 가토 등의 방법을 조금 수정하여, 아래의 순서로 행했다. 6well의 마이크로플레이트에 LLC-MK2 세포를 3 ×105세포/well로 뿌려, 밤새 배양한 후, PLWUV 처리 전의 타이터환산으로 6 ×105pfu/100 ㎕가 되도록 백시니아바이러스를 희석하여, PBS 세척 후의 세포에 감염시켰다. 1시간의 감염 후, 100 ㎕의 OPTI-MEM에 플라스미드, pGEM-NP, P, L, 그리고 cDNA를 각각 1, 0.5, 1, 4 ㎍을 가한 것에, Superfect(QIAGEN)를 10 ㎕ 가하여, 실온에서 15분 방치한 후 1 ml의 OPTI-MEM(GIBCO)(Rif. AraC를 포함한다)을 가하여, 세포에 중층했다.
트랜스펙션 후 2, 3, 4일째에 세포를 회수하여, 원심 후, 300 ㎕/well의 PBS에 현탁했다. 이 현탁액을 원액, 또는 10배, 100배 희석한 세포용액 100 ㎕를 수정 후 10일째의 발육계란에 각 희석 4개씩 접종했다(1 ×105, 1 ×104, 1 ×103세포를 각각 접종). 3일 후 계란으로부터 요액을 회수하여 HA 시험에 의해 바이러스 재구성의 유무를 조사했다(표1). 1 ×105세포를 접종한 계란 중, HA 활성이 있었던 계란을 1점, 104에서는 10점, 103에서는 100점으로 세어, 재구성의 효율(Reconstitute Score)을 구했다(도31). 계산식은 표1과 같다.
표1 백시니아바이러스의 UV 처리시간의 센다이바이러스 재구성효율에 대한 영향
또한, 트랜스펙션 후 2, 3, 4일에서의, 세포에 잔존하는 백시니아바이러스의 타이터를 측정한 바, 트랜스펙션 전에 부여한 타이터에 비례하여, 처리를 한 것이 적어졌다(도32).
백시니아바이러스를 PLWUV로 불활성화함으로써, T7 폴리머라아제 활성에는 영향을 주지 않고, 타이터를 1000분의 1까지 내릴 수 있었다. 그러나, 백시니아바이러스 유래의 CPE는, 현미경관찰에서 미처리의, 1000배의 타이터를 갖는 바이러스의 그것과 다르지 않았다.
이 조건으로 처리를 한 백시니아바이러스를, 센다이바이러스 재구성에 사용함으로써, 센다이바이러스의 재구성효율이, 수십배에서 백배 정도 증대했다(도31). 동시에, 트랜스펙션 후에 남은 백시니아바이러스의 타이터는, 5 pfu/105cells 이상은 아니었다. 따라서, 복제 가능한 백시니아바이러스의 잔류는 0.005% 이하로 억제했다.
[실시예 11] 슈도타입 센다이바이러스의 제작
<1> VSV-G 유전자산물을 유도발현하는 헬퍼세포의 제작
VSV-G 유전자산물은 세포장애성을 가지고 있기 때문에, Cre 리콤비나아제에 의해 VSV-G 유전자산물이 유도발현되도록 설계된 플라스미드 pCALNdLG(Arai T. 등 J.Virology 72(1998) p1115-1121)를 사용하여, LLC-MK2 세포에서의 안정도입주의 작출을 행했다. LLC-MK2 세포로의 플라스미드의 도입은, 인산칼슘법(CalPhosTMMammalian Transfection Kit, Clontech)에 의해, 첨부 매뉴얼에 따라 행했다.
10 cm 플레이트를 사용하여, 60% 콘플루언트까지 생육한 LLC-MK2 세포에 10 ㎍의 플라스미드 pCALNdLG를 도입 후, 10 ml의 MEM-FCS 10% 배지로, 37℃의 5% CO2인큐베이터속에서 24시간 배양했다. 24시간 후에 세포를 떼어내고, 10 ml의 배지에 현탁 후, 10 cm 샬레 5장을 사용하여 5 ml 1장, 2 ml 2장, 0.5 ml 2장에 뿌려, G418(GIBCO-BRL사제) 1200 ㎍/ml를 포함하는 10 ml의 MEM-FCS 10% 배지로 배양을 행하여, 2일마다 배지를 교환하면서 14일간 배양하여, 유전자 안정도입주의 선택을 행했다. 상기 배양에 의해 생육해 온 G418에 내성을 나타내는 세포는, 클로닝링을사용하여 28주를 회수했다. 각 클론은 10 cm 플레이트에서 콘플루언트가 될 때까지 확대배양을 계속했다.
각 클론에 대해, Cre 리콤비나아제를 포함하는 재조합 아데노바이러스 AxCANCre를 감염 후, 항VSV-G 단일클론항체를 사용하여, VSV-G의 발현을 아래의 기재의 웨스턴 블로팅법에 의해 조사했다.
각 클론은 6 cm 샬레에서, 콘플루언트까지 생육시킨 후, 아데노바이러스 AxCANCre를 사이토 등의 방법(상기)에 의해 MOI=10에서 감염 후, 3일간 배양했다. 상기 세포는 배양상청을 제거한 후, PBS 완충액으로 세척하고, 0.05% 트립신, 0.02% EDTA(에틸렌디아민4초산)를 포함하는 PBS 완충액 0.5 ml를 가하여, 37℃, 5분간 인큐베이트함으로써 샬레로부터 떼어냈다. 상기 세포는 3 ml PBS 완충액에 현탁 후, 1,500 ×g으로 5분간 원심하여, 세포를 모았다. 얻어진 세포는 더욱이 2 ml PBS 완충액에 재차 현탁 후, 1,500 ×g으로 5분간 원심분리함으로써, 세포를 모았다.
상기 세포는 -20℃에서 보존하는 것이 가능하여, 필요에 따라 해동하여 사용할 수 있다. 모은 세포는 100 μL의 세포용해액(RIPA 완충액, Boehringer Mannheim사제)에 의해 용해하고, 상기 세포의 전체 단백질(1 lane당 1 ×105세포)을 사용하여 웨스턴 블로팅을 행했다. 세포용해액을 SDS-폴리아크릴아미드겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동용 샘플 완충액[6 mM 트리스-염산(Tris-HCl)(pH 6.8), 2% SDS, 10% 글리세롤, 5% 2-메르캅토에탄올로 된 완충액]에 용해하여, 95℃5분 가열 후 전기영동용 시료에 사용했다. 상기 시료를 SDS-폴리아크릴아미드겔(멀티겔 10/20, Daiichi Pure Chemicals co., Ltd.)을 사용하여, 전기영동에 의해 분획하고, 분획된 단백질을 세미드라이블로팅법(semi-dry blotting method)에 의해 전사막(Immobilon-P TransferMembranes, Millipore사제)에 전사했다. 전사는, 100% 메탄올에 20초, 물에 한시간 담근 전사막을 사용하여, 1 mA/cm2정전류의 조건에서 1시간 행했다.
상기 전사막을, 40 ml의 블로킹용액(Block-Ace, Snow Brand Milk Products co., Ltd.)에서 1시간 진탕시킨 후, PBS 완충액으로 한번 세척했다.
상기 전사막 및 10% 블로킹용액을 포함하는 PBS 완충액으로 1/1000로 희석한 항VSV-G항체(클론 P4D4, Sigma) 5 ml를 비닐백에 넣어 봉하고, 4℃에서 가만히 방치시켰다.
상기 전사막을 2번 40 ml의 PBS-0.1% Tween20에 5분간 침지하고, 세척한 후, PBS 완충액으로 5분간 침지하고, 세척했다.
상기 전사막 및 10% 블로킹용액을 포함하는 PBS 완충액으로 1/2500로 희석한 퍼옥시다아제로 표지된 항마우스 IgG항체(anti-mouseimmunoglobulin, Amersham사제) 5 ml를 비닐백에 넣고 봉한 후, 실온에서 1시간 진탕시켰다.
진탕 후, 상기 전사막을 2번 PBS-0.1% Tween20에 5분간 침지하고, 세척한 후, PBS 완충액에 5분간 침지하고, 세척했다.
발광법(luminescence method)(ECL Western blotting detection reagents,Amersham사제)에 의해, 항VSV-G항체와 교차가 보이는 상기 전사막 상의 단백질의 검출을 행했다. 결과를 도33에 나타낸다. 3클론에서, AxCANCre 감염 특이적인 VSV-G의 발현이 검출되고, VSV-G 유전자산물을 유도발현하는 LLC-MK2 세포의 작출이 확인되었다.
얻어진 세포주의 한주를 LLCG-L1이라고 부르고, 항VSV항체를 사용하여 플로사이트메트리해석을 행했다(도34). 그 결과, LLCG-L1에서는, VSV-G 유전자 유도발현시 특이적으로 항체와의 반응성이 검출되어, VSV-G 단백질이 세포표면에 발현되는 것이 확인되었다.
<2> 헬퍼세포를 사용한 F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스의 제작
F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 센다이바이러스를 VSV-G 유전자 발현세포에 감염시키고, VSV-G를 외피에 갖는 슈도타입 바이러스의 생산이 관찰되는지를, 상기 실시예에 기재의 GFP 유전자를 포함하는 F 결실형 센다이바이러스를 사용하여, GFP 유전자의 발현을 지표로 조사했다. 그 결과, Cre 리콤비나아제를 포함하는 재조합 아데노바이러스 AxCANCre를 감염하지 않는 LLCG-L1에서는, F 결실형 센다이바이러스의 감염에 의해 바이러스유전자가 도입되어, GFP 발현세포는 검출되지만, 그 세포수는 증가하지 않고, VSV-G를 유도발현시킨 세포에서는, 경시적으로 GFP 발현세포의 증가가 인정되었다. 그 상청의 1/5의 양을 새로운 VSV-G를 유도발현시킨 세포에 더 첨가한 바, 전자 유래의 상청에서는, 유전자도입이 전혀 인정되지 않고, 후자 유래의 상청에서는 유전자도입 및 GFP 발현세포의 증가가 인정되었다. 또한, 후자 유래의 상청을 VSV-G를 유도하지 않는 LLCG-L1세포에 첨가했을 때에는, 유전자도입은 되지만, GFP 발현세포의 증가는 인정되지 않았다. 이상의 결과로부터, VSV-G 발현세포 특이적으로 바이러스가 증식하는 것이 인정되어, VSV-G와의 슈도타입의 F 결실형 센다이바이러스의 생성이 인정되었다.
<3> F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스 생산조건의 검토
VSV-G 유전자의 발현량의 영향을 조사하기 위해, AxCANCre의 감염량(MOI=0, 1.25, 2.5, 5, 10)을 바꿔, 일정량의 F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스를 감염 후, 7일째~8일째의 상청을 회수하고, 더욱이 VSV-G 유도 전, 유도 후의 세포에 감염시켜, 5일째의 GFP가 발현하고 있는 세포의 수를 비교한 바, MOI=0으로는 바이러스의 생산이 전혀 인정되지 않고, MOI=10의 조건에서 가장 많은 것을 알 수 있었다(도35). 또한, 경시적으로 바이러스 생산량을 조사한 바, 슈도타입 센다이바이러스 감염 후 5일째 이후부터 생산량이 상승하여, 8일째까지 생산을 확인할 수 있었다(도36). 바이러스 역가의 측정은, VSV-G 유도 전의 세포에, 10배씩 단계적으로 희석한 바이러스액을 첨가하고, 감염 후 5일째의 GFP의 발현세포의 수를 셈으로써, 바이러스액중의 세포로의 감염입자수(CIU)를 구했다. 그 결과, 최고 바이러스 생산량은 5 ×105CIU/ml였다.
<4> F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스의 항VSV항체에 의한 감염성의 영향
VSV-G 발현주를 사용하여 얻어진 F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스가, 외피에 VSV-G 단백질을 갖는지에 관하여, 항VSV항체를 사용하여 감염성의 영향을 받는지 어떤지의 중화활성을 조사했다. 바이러스액과 항체를 혼합하여, 실온에서 30분간 가만히 방치한 후, VSV-G를 유도발현하고 있지 않은 LLCG-L1 세포에 감염하여, 5일째의 유전자도입능을 GFP 발현세포의 유무로 조사했다. 그 결과, 항VSV항체에 의한 감염성의 완전한 억제가 인정되고, 본래의 외피를 갖는 F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 센다이바이러스에서는 억제가 인정되지 않았다(도37). 이것으로부터, 이번에 얻어진 바이러스가, 외피에 VSV-G 단백질을 갖는 슈도타입의 센다이바이러스이며, 항체에 의해 그 감염성이 특이적으로 억제되는 것이 명백해졌다.
<5> 슈도타입 센다이바이러스가 F 결실형 게놈을 갖는지의 학인
이번 VSV-G 유전자발현세포에서 증식한 바이러스가 F 결실형인 것을, 감염세포추출액 단백질의 웨스턴 해석에 의해 조사했다. 웨스턴 해석은, 상기에 기재의 방법으로 행했다. 1차항체로서, 토끼로부터 조제된 항센다이바이러스 다중클론항체, 마우스로부터 조제된 항F 단백질 단일클론항체, 마우스로부터 조제된 항HN 단백질 단일클론항체를 사용하고, 2차항체에 항센다이바이러스 다중클론항체의 경우는 퍼옥시다아제로 표지된 항토끼 IgG항체, 항F 단백질 단일클론항체, 항HN 단백질 단일클론항체의 경우는 퍼옥시다아제로 표지된 항마우스 IgG항체를 사용했다. 그 결과, 센다이바이러스 유래의 단백질 및 HN 단백질은 검출되지만, F 단백질은 검출되지 않은 것으로부터, F 결실형인 것이 확인되었다.
<6> 헬퍼세포를 사용한 F 및 HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스의 제작
F 및 HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 센다이바이러스를 VSV-G 유전자발현세포 LLCG-L1에 감염시켜, VSV-G를 외피에 갖는 슈도타입 바이러스의 생산이 보이는지를, 상기 실시예에 기재된 GFP 유전자를 포함하는 F, HN 결실형 센다이바이러스를 사용하여, 상기 실시예와 동일한 방법으로 GFP 유전자의 발현을 지표로 조사했다. 그 결과, VSV-G 발현세포 특이적으로 바이러스가 증식하는 것이 인정되고, VSV-G와의 슈도타입의 F, HN 결실형 센다이바이러스의 생성이 인정되었다(도38). 바이러스 역가의 측정은, VSV-G 유도 전의 세포에, 10배씩 단계적으로 희석한 바이러스액을 첨가하고, 감염 후 5일째의 GFP의 발현세포를 셈으로써, 바이러스액중의 세포로의 감염입자수(CIU)를 구했다. 그 결과, 최고 바이러스 생산량은 1 ×106CIU/ml였다.
<7> 슈도타입 센다이바이러스가 F 및 HN 결실형 게놈을 갖는지의 확인
이번 VSV-G 유전자발현세포에서 증식한 바이러스가 F 및 HN 결실형인 것을, 감염세포 추출액 단백질의 웨스턴 해석에 의해 조사했다. 그 결과, 센다이바이러스 유래의 단백질은 검출되지만, F 및 HN 단백질은 검출되지 않았기 때문에, F 및 HN 결실형인 것이 확인되었다(도39).
[실시예 12] 바이러스 재구성법의 검토
<종래법>
LLC-MK2 세포를 5 ×106cells/dish로 100 mm 페트리접시에 뿌려, 24시간 배양 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 1회 세척한 후, 3 ㎍/ml의 소랄렌과 장파장 자외선(365 nm)으로 5분간 처리한 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 리콤비넌트 백시니아바이러스(Fuerst, T.R. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 8122-8126 1986)(vTF7-3)에 실온에서 1시간 감염시켰다(moi=2)(moi=2~3, 바람직하게는 moi=2가 사용된다). 세포를, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 2회 세척한 후, 플라스미드 pSeV18+/△F-GFP, pGEM/NP, pGEM/P 및 pGEM/L(Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579(1996))을 각각 12 ㎍, 4 ㎍, 2 ㎍ 및 4 ㎍/dish의 양비로 Opti-MEM 배지(GIBCO)에 현탁하여, SuperFect transfection reagent(1 ㎍ DNA/5 ㎕의 SuperFect, QIAGEN)를 넣고, 실온에서 15분간 방치 후, 최종적으로 3% FBS를 포함하는 Opti-MEM 배지 3 ml에 넣은 DNA-SuperFect 혼합물을 세포에 첨가하여 배양했다. 3시간 배양 후, 세포를, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 2회 세척하고, 시토신β-D-아라비노후라노시드 40 ㎍/ml(AraC, Sigma)를 포함하는 MEM 배지로 70시간 배양했다. 이들 세포와 상청을 회수하여, 각각 P0-d3 샘플로 했다. P0-d3의 펠렛을 Opti-MEM 배지에 현탁했다(107cells/ml). 동결융해를 3회 반복하고 lipofection reagent DOSPER(Boehringer mannheim)와 혼합하여(106cells/25 ㎕ DOSPER) 실온에서 15분간 방치한 후, F 발현 LLC-MK2/F7 세포주에 트랜스펙션(106cells/well in 24-well-plate)하여, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/m 트립신을 포함한다)에서 배양했다. 배양 후 3일째 및 7일째에 상청을 회수하여, 각각 P1-d3 및 P1-d7 샘플로 했다.
<엔벨로프 플라스미드 + F발현세포 중층법>
플라스미드에 엔벨로프 플라스미드 pGEM/FHN을 4 ㎍/dish 가한 것 이외에는, 상기와 동일한 조작을 행하여, 트랜스펙션을 행했다. 3시간 배양 후, 세포를, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 2회 세척하고, 시토신β-D-아라비노후라노시드 40 ㎍/ml(AraC, Sigma)와 트립신 7.5 ㎍/ml를 포함하는 MEM 배지로 48시간 배양했다. 배양상청을 제거하여, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/m 트립신을 포함한다)에 현탁된 100 mm 페트리접시 1장분의 F 발현 LLC-MK2/F7 세포현탁액 5 ml를 중층했다. 배양 48시간 후, 이들 세포와 상청을 회수하여, 각각 P0-d4 샘플로 했다. P0-d4의 펠렛을 Opti-MEM 배지에 현탁하여(2 ×107cells/ml), 동결융해를 3회 반복하고 F 발현 LLC-MK2/F7 세포주에 중층(2 ×106cells/well in 24-well-plate)하여, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/m 트립신을 포함한다)에서 배양했다. 배양 후 3일째 및 7일째에 상청을 회수하여, 각각 P1-d3 및 P1-d7 샘플로 했다. 비교를 위해, 중층을 행하지 않고, 엔벨로프 플라스미드만을 첨가하여, 상기의 종래 법과 완전히 동일한 방법으로도 실험을 행했다.
<GFP 발현세포의 카운트에 의한 CIU의 측정(GFP-CIU)>
LLC-MK2 세포를 2 ×105cells/well으로 12well-plate에 뿌려, 24시간 배양 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 1회 세척한 후, 상기의 샘플(P0-d3 또는 P0-d4, P1-d3 및 P1-d7)을, 양성세포가 10 cm2중에 10~100개 사이의 수가 되도록 적절히 희석하여, 100 ㎕/well로 감염시켰다. 15분 후 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지를 1 ml/well 가했다. 24시간 더 배양 후, 세포를 형광현미경하에서 관찰하여, GFP 발현세포의 카운트를 행했다.
<CIU(Cell-Infected Unit)측정>
LLC-MK2 세포를 2 ×105cells/dish로 12well-plate에 뿌려, 24시간 배양 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 1회 세척한 후, 상기 샘플(포함되는 바이러스 벡터를 SeV/△F-GFP라 칭한다)을 100 ㎕/well로 감염했다. 15분 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지를 1 ml/well 가하여, 24시간 더 배양했다. 배양 후, PBS(-)로 3회 세척한 후, 세포를 건조시키고(약 10분~15분 실온방치), 세포를 고정하기 위해, 아세톤을 1 ml/well 가하여 즉시 제거하고, 다시 건조시켰다(약 10분~15분 실온방치). PBS(-)로 100배 희석한 토끼로부터 조제된 항SeV 다중클론항체(DN-1)를 300 ㎕/well 가하여, 37℃에서 45분간 인큐베이트한 후, PBS(-)로 3회 세척하고, PBS(-)로 200배 희석한 항토끼 IgG(H+L)형광표지 2차항체(AlexaTM568:Molecular Probes사제)를 300 ㎕/well 가하여, 37℃에서 45분간 인큐베이트했다. PBS(-)로 3회 세척한 후, 형광현미경하(Emission:560 nm, Absorption:645 nm 필터: 라이카사제)에서 형광을 발하는 세포를 관찰했다(도40).
대조로서 상기 샘플(SeV/△F-GFP)을 100 ㎕/well로 감염하고 15분 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM을 1 ml/well 가하여, 24시간 더 배양 후, 이후의 조작을 행하지 않고 세포를 형광현미경하(Emission:360 nm, Absorption:470 nm filter: Leica)에서 GFP 발현세포를 관찰했다.
[실시예 13] 결실형 센다이바이러스 벡터의 재구성효율의 향상을 위한 최적의 백시니아바이러스(vTF7-3)의 PLWUV(Psoralen and Long-Wave UV Light)처리조건 검토
LLC-MK2 세포를 5 ×106cells/dish로 100 mm 페트리접시에 뿌려, 24시간 배양 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 1회 세척한 후, 0.3∼3 ㎍/ml의 소랄렌과 장파장 자외선(365 nm)으로 2~20분간 처리한 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 리콤비넌트 백시니아바이러스(vTF7-3)(Fuerst, T.R. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83, 8122-8126(1986)에 실온에서 1시간 감염시켰다(moi=2)(moi=2~3, 바람직하게는 moi=2가 사용된다). 세포를 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 2회 세척한 후, 플라스미드 pSeV18+/△F-GFP, pGEM/NP, pGEM/P 및 pGEM/L(Kato, A. et al., Genes cells 1, 569-579(1996))를 각각 12 ㎍, 4 ㎍, 2 ㎍ 및 4 ㎍/dish의 양비로 Opti-MEM 배지(GIBCO)에 현탁하여, SuperFect transfection reagent(1 ㎍ DNA/5 ㎕의 SuperFect, QIAGEN)를 넣어, 실온에서 15분간 방치 후, 최종적으로 3% FBS를 포함하는 Opti-MEM 배지 3 ml에 넣은 DNA-SuperFect 혼합물을 세포에 첨가하여 배양했다. 3시간 배양 후, 세포를, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 2회 세척하고, 시토신β-D-아라비노후라노시드 40 ㎍/ml(AraC, Sigma)를 포함하는 MEM 배지로 48시간 배양했다. 100 mm 페트리접시의 약 1/20 시야의 세포를 형광현미경하에서 관찰하여, GFP 발현세포를 카운트했다. 백시니아바이러스(vTF7-3) 불활성화의 검사에는 플라크형성에 의한 타이터의 측정(Yoshiyuki Nagai et al., Virus experiment protocols, p291-296, 1995)을 행했다.
더욱이, 트랜스펙션 후의 회수시기를 3일째에 착안하여, 소랄렌과 UV 조사시간의 검토를 행했다. 각 PLWUV 처리를 행한 백시니아바이러스(vTF7-3)를 사용하여, 센다이바이러스 재구성의 효율을 검토했다. 재구성은 가토 등의 방법(상기)을 개변하여, 아래의 순서로 행했다. 6well의 마이크로플레이트에 LLC-MK2 세포를 5 ×105세포/well로 뿌려, 밤새 배양한 후(1 ×106세포/well로 증식하고 있다고 가정), PLWUV 처리 전의 타이터환산으로 2 ×106pfu/100 ㎕가 되도록 백시니아바이러스(vTF7-3)를 희석하여, PBS 세척 후의 세포에 감염시켰다. 1시간의 감염 후, 50 ㎕의 Opti-MEM 배지(GIBCO)에 플라스미드, pGEM/NP, pGEM/P 및 pGEM/L, 그리고 부가형 SeV cDNA(pSeV18+b(+))(Hasan, M. K. et al., J. General Virology 78: 2813-2820, 1997)를 각각 1, 0.5, 1, 4 ㎍을 가한 것에, SuperFect(QIAGEN)를 10 ㎕ 가하여, 실온에서 15분 방치한 후, 1 ml의 Opti-MEM(40 ㎍/ml의 AraC를 포함한다)을 가하여, 세포에 중층했다. 트랜스펙션 후, 3일째에 세포를 회수하고, 원심 후, 100 ㎕/well의 PBS에 현탁했다. 이 현탁액을 10배, 100배, 1000배 희석한 세포용액 100 ㎕를 수정 후 10일째의 발육계란에 각 희석 3개씩 섭취했다(1 ×105, 1 ×104, 1 ×103세포를 각각 섭취). 3일 후 계란으로부터 요액을회수하여 HA시험에 의해 바이러스 재구성의 유무를 조사했다. 1 ×105세포를 섭취한 계란 중, HA 활성이 있었던 계란을 1점, 104에서는 10점, 103에서는 100점으로 세어, 재구성의 효율을 구했다.
<결과>
실시예 12 및 13의 결과를 도40~43 및 표2에 나타낸다. 엔벨로프 발현 플라스미드와 세포중층의 조합에 의한 SeV/△F-GFP의 재구성효율의 향상이 확인되었다. P0(계대 전)의 d3∼d4(3일째∼4일째)에 있어서, 현저한 개선이 인정되었다(도41). 표2에서는, 트랜스펙션 후 3일째의 세포를 난에 접종했다. 0.3 ㎍/ml의 소랄렌농도로 20분간의 처리가, 가장 재구성효율이 높았던(3일째)것으로부터, 이 조건을 최적 조건으로 했다(표2).
표2 센다이바이러스 재구성에 미치는 백시니아바이러스의 PLWUV처리의 영향
[실시예 14] GFP를 포함하지 않는 LacZ 탑재 F 결실형 센다이바이러스 벡터의 제작
<LacZ 유전자를 포함하는 F 결실형 SeV 벡터 cDNA의 구축>
실시예 1 기재의 pSeV18+/△F의 NP 유전자 상류역에 존재하는 Not I 절단부위에 LacZ 유전자를 탑재한 cDNA(pSeV(+18:LacZ)/△F)를 구축하기 위해 PCR에 의해 LacZ 유전자의 증폭을 행했다. LacZ 유전자를 6의 배수(Hausmann, S et al., RNA 2, 1033-1045(1996))에 맞춰, 5'말측에는 NotI 절단부위를 부여한 프라이머(5'-GCGCGGCCGCCGTACGGTGGCAACCATGTCGTTTACTTTGACCAA-3'/서열번호: 17)를, 3'말단에SeV의 전사종결시그날(E), 개재서열(I) 및 전사개시시그날(S)을 부여하고, NotI 절단부위를 부여한 프라이머(5'-GCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGCGTACGCTATTACTTCTGACACCAGACCAACTGGTA-3'/서열번호: 18)를 사용하여, 플라스미드 pCMV-β(클론텍사제)를 주형으로서 PCR 반응을 행했다. 반응조건은, pCMV-β50 ng, 200 μM dNTP(Pharmacia biotechnology사제), 100 pM 프라이머, Vent 폴리머라아제(NEW ENGLAND BIOLABS사제) 4 U를 첨부의 반응 완충액과 동시에 혼합 후, 94℃ 30초, 50℃ 1분, 72℃ 2분의 반응온도 사이클 25회로 행했다. 반응산물을 아가로우즈겔 전기영동으로 영동 후, 3.2 kb의 단편을 말을 잘라내어, 정제 후, NotI로 절단하여, pSeV18+/△F NotI 절단편과 라이게이션하여 pSeV(+18:LacZ)/△F를 얻었다.
<종래법>
LLC-MK2 세포를 5 ×106cells/dish로 100 mm 페트리접시에 뿌려, 24시간 배양 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM로 1회 세척한 후, 3 ㎍/ml의 소랄렌과 장파장 자외선(365 nm)으로 5분간 처리한 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 리콤비넌트 백시니아바이러스(vTF7-3)(Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126(1986)에 실온에서 1시간 감염시켰다(moi=2)(moi=2~3, 바람직하게는 moi=2가 사용된다). 세포를 혈청을 포함하지 않는 MEM로 2회 세척한 후, LacZ 탑재 F 결실형 센다이바이러스 벡터 cDNA(pSeV(+18:LacZ)△F), pGEM/NP, pGEM/P 및 pGEM/L(Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579(1996))를 각각 12 ㎍, 4 ㎍, 2㎍, 4 ㎍/dish 및 엔벨로프 플라스미드 pGEM/FHN을 4 ㎍/dish 가하고, Opti-MEM(GIBCO)에 현탁하여, SuperFect transfection reagent(1 ㎍ DNA/5 ㎕의 SuperFect, QIAGEN)를 넣어, 실온에서 15분간 방치 후, 최종적으로 3% FBS를 포함하는 Opti-MEM 3 ml에 넣은 DNA-SuperFect 혼합물을 세포에 첨가하여 배양했다. 3시간 배양 후, 세포를, 혈청을 포함하지 않는 MEM로 2회 세척하여, 시토신β-D-아라비노후라노시드 40 ㎍/ml(AraC, Sigma)와 트립신 7.5 ㎍/ml를 포함하는 MEM로 24시간 배양했다. 배양상청을 제거하고, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/m 트립신을 포함한다)에 현탁된 100 mm 페트리접시 1장분의 F 발현 LLC-MK2/F7 세포현탁액 5 ml를 중층했다. 더욱이 배양 48시간 후, 이들 세포와 상청을 회수하여, 각각 P0-d3 샘플로 했다. P0-d3의 펠렛을 Opti-MEM 배지에 현탁하여(2 ×107cells/ml), 동결융해를 3회 반복하고 lipofection reagent DOSPER(Boehringer mannheim)와 혼합하여(106cells/25 ㎕ DOSPER) 실온에서 15분간 방치한 후, F 발현 LLC-MK2/F7 세포주에 트랜스펙션(106cells/well in 24-well-plate)하여, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/m 트립신을 포함한다)에서 배양했다. 배양 후 7일째에 상청을 회수하여, P1-d7 샘플로 했다. 더욱이 상청 전량을 12-well-plate에 뿌린 F 발현 LLC-MK2/F7 세포주에 37℃ 1시간 감염 후, MEM 배지로 1회 세척한 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/m 트립신을 포함한다)에서 배양했다. 배양 후 7일째에 상청을 회수하여, P2-d7 샘플로 했다. 더욱이 상청 전량을 6-well-plate에 뿌린 F 발현 LLC-MK2/F7 세포주에 37℃ 1시간 감염 후, MEM 배지로 1회 세척한 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지(7.5 ㎍/m 트립신을 포함한다)에서 배양했다. 배양 후 7일째에 상청을 회수하여, P3-d7 샘플로 했다. 더욱이 상청 전량을 10 cm 플레이트에 뿌린 F 발현 LLC-MK2/F7 세포주에 37℃ 1시간 감염 후, MEM 배지로 1회 세척한 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지(40 ㎍/ml AraC, 7.5 ㎍/m 트립신을 포함한다)에서 배양했다. 배양 후 7일째에 상청을 회수하여, P4-d7 샘플로 했다.
<LacZ 발현세포의 카운트에 의한 CIU의 측정(LacZ-CIU)>
LLC-MK2 세포를 2.5 ×106cells/well로 6well-plate에 뿌리고, 24시간 배양 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 1회 세척한 후, P3-d7의 1/10희석 계열을 MEM 배지로 제작하여, 37℃ 1시간 감염 후, MEM 배지로 1회 세척하고, 10% 혈청을 포함하는 MEM 배지 1.5 ml를 첨가했다. 37℃에서 3일 배양 후, 세포를 β-Gal 염색키트(staining kit)(invitrogen사)에 의해 염색했다. 3회의 실험 결과를 도44에 나타낸다. LacZ염색 양성 세포수를 센 결과, 어느 경우에도 P3-d7 샘플에 있어서 1 ×106CIU/ml의 바이러스가 얻어지고 있는 것을 알 수 있었다.
[실시예 15] 센다이바이러스에 있어서의 극성효과를 이용한 유전자발현량의 제어
<SeV 게놈 cDNA의 구축>
센다이바이러스(SeV) 전장의 게놈 cDNA, pSeV(+)(Kato, A. et al., Genes to Cells 1: 569-579, 1996)의 cDNA에 새로운NotI 사이트를 각 유전자의 스타트시그날과 ATG 번역개시시그날 사이에 도입했다. 도입방법으로서는 먼저, 도45(A)와 같이 pSeV(+)를SphI/SalI로 소화한 단편(2645 bp),ClaI로 소화한 단편(3246 bp) 및ClaI/EcoRI로 소화한 단편(5146 bp)을 각각 아가로우즈 전기영동으로 분리, 해당하는 밴드를 잘라내어, QIAEXII Gel Extraction System(QIAGEN사제)으로 회수 ·정제했다.SphI/SalI로 소화한 단편은 LITMUS38(NEW ENGLAND BIOLABS사제),ClaI로 소화한 단편과ClaI/EcoRI로 소화한 단편은 pBluescriptII KS+(STRATAGENE사제)에 라이게이션하여, 서브클로닝했다. 계속해서NotI 사이트의 도입에는 Quickchange Site-Directed Mutagenesis kit(STRATAGENE사제)를 사용했다. 각각의 도입에 사용한 프라이머는 NP-P 사이에서는 센스사슬: 5'-ccaccgaccacacccagcggccgcgacagccacggcttcgg-3'(서열번호: 19), 안티센스사슬: 5'-ccgaagccgtggctgtcgcggccgctgggtgtggtcggtgg-3'(서열번호: 20), P-M 사이에서는 센스사슬: 5'-gaaatttcacctaagcggccgcaatggcagatatctatag-3'(서열번호: 21), 안티센스사슬: 5'-ctatagatatctgccattgcggccgcttaggtgaaatttc-3'(서열번호: 22), M-F 사이에서는 센스사슬: 5'-gggataaagtcccttgcggccgcttggttgcaaaactctcccc-3'(서열번호: 23), 안티센스사슬: 5'-ggggagagttttgcaaccaagcggccgcaagggactttatccc-3'(서열번호: 24), F-HN 사이에서는 센스사슬: 5'-ggtcgcgcggtactttagcggccgcctcaaacaagcacagatcatgg-3'(서열번호: 25), 안티센스사슬: 5'-ccatgatctgtgcttgtttgaggcggccgctaaagtaccgcgcgacc-3'(서열번호: 26), HN-L 사이에서는 센스사슬: 5'-cctgcccatccatgacctagcggccgcttcccattcaccctggg-3'(서열번호: 27), 안티센스사슬: 5'-cccagggtgaatgggaagcggccgctaggtcatggatgggcagg-3'(서열번호: 28)를 각각 합성하여 사용했다.
주형으로서 NPP 사이는SalI/SphI 단편, PM 사이, MF 사이는ClaI 단편, FHN 사이, HNL 사이는ClaI/EcoRI 단편을 각각 상기에서 서브클로닝한 것을 사용하여 Quickchange Site-Directed Mutagenesis kit의 프로토콜에 따라, 도입을 행했다. 도입한 것을 다시 서브클로닝한 효소로 소화하여 동일하게 회수 ·정제하여, 원래의 센다이게놈 cDNA에 어셈블리했다. 그 결과, 도45(B)와 같이 각 유전자 사이에 새롭게 NotI를 도입한 5종류(pSeV(+)NPP, pSeV(+)PM, pSeV(+)MF, pSeV(+)FHN 및 pSeV(+)HNL)의 센다이바이러스 게놈 cDNA를 구축했다.
유전자발현량을 보기 위한 리포터 유전자로서 인간 분비형 알칼리포스파타아제(human secreted type alkaline phosphatase)(SEAP)를 PCR로 서브클로닝했다. 프라이머에는AscI 제한효소 사이트를 부가한 5' 프라이머: 5'-gcggcgcgccatgctgctgctgctgctgctgctgggcctg-3'(서열번호: 29), 3' 프라이머: 5'-gcggcgcgcccttatcatgtctgctcgaagcggccggccg-3'(서열번호: 30)를 합성하여, PCR을 행했다. 주형에는 pSEAP-Basic(CLONTECH사제), 효소에는Pfutourbo DNA 폴리머라아제(STRATAGENE사제)를 사용했다. PCR 후, 산물을AscI로 소화하여, 전기영동에 의해 정제 ·회수했다. 서브클로닝하는 플라스미드로서 pBluescriptII KS+의NotI 사이트에 멀티클로닝사이트(PmeI-AscI-SwaI)와 종결시그날-개재서열-개시시그날 포함하는 합성 이중가닥 DNA[센스사슬: 5'-gcggccgcgtttaaacggcgcgccatttaaatccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc-3' (서열번호: 31), 안티센스사슬: 5'-gcggccgcgatgaactttcaccctaagtttttcttactacggatttaaatggcgcgccgtttaaacgcggccgc-3' (서열번호: 32)]를 삽입한 것을 제작했다(도46). 이 플라스미드의AscI 사이트에 정제 ·회수한 PCR 산물을 라이게이션하여, 클로닝했다. 이것을NotI로 소화하여 SEAP 유전자단편을 전기영동으로 회수 ·정제하여, 상기 5종류의 센다이바이러스 게놈 cDNA와 pSeV18+의NotI 사이트에 각각 라이게이션하여 삽입했다. 각각의 바이러스 벡터를 pSeV(+)NPP/SEAP, pSeV(+)PM/SEAP, pSeV(+)MF/SEAP, pSeV(+)FHN/SEAP, pSeV(+)HNL/SEAP 및 pSeV18(+)/SEAP로 했다.
<바이러스의 재구축>
LLC-MK2 세포를 2 ×106cells/dish로 100 mm 샬레에 뿌려, 24시간 후 배양 후, 소랄렌과 UV 처리한 T7 폴리머라아제를 발현하는 리콤비넌트 백시니아바이러스(PLWUV-VacT7)(Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,1986, Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)에 실온에서 moi=2로 1시간 감염시켰다. 세포를 세척한 후 SEAP를 삽입한 각 센다이바이러스 cDNA, pGEM/NP, pGEM/P 및 pGEM/L을 각각 12 ㎍, 4 ㎍, 2 ㎍ 및 4 ㎍/dish의 양비로 OptiMEM(GIBOCO BRL사제)에 현탁하여, 110 ㎕의 SuperFect transfection reagent(QIAGEN사제)를 넣고 혼합하여, 실온에서 15분 방치 후, 최종적으로 3% FBS를 포함하는 OptiMEM 3 ml를 가하고, 세포에 첨가하여 3~5시간 배양했다. 배양 후, 세포를 혈청을 포함하지 않는 MEM로 2회 세척하고, 시토신β-D-아라비노후라노시드(AraC)를 포함하는 MEM로 72시간 배양했다. 이들 세포를 회수하여, 펠렛을 1 ml의 PBS으로 현탁하여, 동결융해를 3회 반복했다. 이들을 10일간 부화시킨 계란에 100 ㎕ 접종하여, 35℃에서 3일간 부화시킨 후, 요액을 회수했다. 백시니아바이러스를 제거하기 위해, 이들 회수한 요액을 더욱이 10-5~10-7로 희석하고 계란에 재접종하여, 동일하게 회수하고, 분주하여 -80℃에서 스톡했다. 각각의 바이러스 벡터명을 SeVNPP/SEAP, SeVPM/SEAP, SeVMF/SEAP, SeVFHN/SEAP, SeVHNL/SEAP 및 SeV18/SEAP로 한다).
<플라크 어세이에 의한 타이터의 측정>
CV-1세포를 6well 플레이트에 1well당 5 ×105cells 씩 뿌려, 24시간 배양했다. PBS 세척 후, BSA/PBS(1% BSA in PBS)로 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7로 희석한 재조합 SeV를 1시간 인큐베이션한 후, PBS로 세척, BSA/MEM/아가로우즈(0.2% BSA+2 ×MEM과 같은 양의 2% 아가로우즈를 혼합한 것)를 well당 3 ml 씩 중층하여, 6일간 37℃, 0.5%로 배양했다. 배양 후, 3 ml의 에탄올/초산(에탄올:초산=1:5)을 가하고, 3시간 방치하여, 아가로우즈와 함께 제거했다. PBS로 3회 세척 후, 100배 희석한 토끼 항센다이바이러스항체로 실온에서 1시간 인큐베이션했다. PBS로 3회 세척 후, 200배 희석한 Alexa FlourTM표지 염소 항토끼 Ig(G+H)(Molecular Probe사)를 가하여 실온에서 1시간 인큐베이션했다. PBS로 3회 세척 후, 루미노이메지아나라이저(lumino-image analyzer)LAS1000(후지필름)으로 형광화상을 삽입하여, 플라크를 측정했다. 결과를 도47에 나타낸다. 또한 이것으로부터 얻어진타이터의 결과를 표3에 나타낸다.
표3 플라크 어세이의 결과로부터 측정한 각 재조합 센다이바이러스의 타이터의 결과
<리포터 유전자발현의 비교>
LLC-MK2 세포를 6well 플레이트에 1well당 1~5 ×105cells 씩 뿌려, 24시간 배양한 후, 각 바이러스 벡터를 moi=2로 감염시켜, 24시간 후 배양상청을 100 ㎕ 회수하여, SEAP 어세이를 행했다. 어세이는 Reporter Assay Kit -SEAP-(도요보)로 행하여, 루미노이메지아나라이져 LAS1000(후지필름)으로 측정했다. 측정값은 SeV18+/SEAP의 값을 100으로 하여 각각 상대값으로 나타냈다. 그 결과, 도48에 나타낸 어느 하나의 위치에 SEAP 유전자를 삽입한 경우에도 SEAP 활성이 검출되었다. SEAP 활성은 게놈의 하류에 위치함에 따라 낮아지고, 즉 발현량이 낮아지고 있는 것을 알 수 있었다. 또한, NP 유전자와 P 유전자 사이에 SEAP 유전자를 삽입한 경우에는, NP 유전자의 상류에 SEAP 유전자를 삽입한 벡터와, P 유전자와 M 유전자사이에 SEAP 유전자를 삽입한 벡터의 중간 발현량이 검출되었다.
[실시예 16] 더블 결실 △F-HN 세포중층법에 의한 결실 SeV 증폭효율의 향상
현재 사용하고 있는 SeV 바이러스의 재구축법에서는, T7 RNA 폴리머라아제를 발현하는 재조합 백신(vTF7-3)을 사용하기 때문에, 백시니아의 세포상해성에 의해, 감염세포가 일부분 사멸하고 있어, 재구축을 행한 일부의 세포에서 바이러스를 증폭할 수 있더라도, 더 많은 세포에서 효율 좋고, 지속적으로 증폭할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 그러나, 파라믹소바이러스에서는 동형 바이러스의 F와 HN 단백이 세포표면에 함께 존재하면 세포융합을 일으켜, 신시츔(syncytium)이 형성되는 것이 알려져 있다(Lamb and Kolakofsky, 1996, Fields virology, p1189). 그 때문에 FHN 공발현세포의 계대가 곤란했다. 따라서, 이들 재구축된 세포에 새롭게 결실 단백(F 및 HN)을 발현하는 헬퍼세포를 중층함으로써 결실 바이러스의 회수효율을 향상할 수 있다고 생각했다. FHN 발현유도시간이 다른 세포를 중층하는 것을 검토함으로써 FHN 공결실 바이러스 회수효율을 크게 향상시켰다.
10 cm 세포배양접시에 100% 콘플루언트가 된 LLC-MK2 세포(1 ×107/dish)를 PLWUV-처리 백시니아를 moi=2로 실온에 있어서 감염 1시간 후, d2 EGFP를 탑재하는 FHN 결실 cDNA(pSeV18+/△FHN-d2GFP(실시예 8), pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L, pGEM/FHN을 각각, 12 ㎍/10 cm dish, 4 ㎍/10 cm dish, 2 ㎍/10 cm dish, 4 ㎍/10 cm dish, 4 ㎍/10 cm dish의 양비로 혼합하고(final vol, 3 ml/10 cm dish), 유전자도입시약 SuperFect(QIAGEN)를 사용하여, 상술한 F 결실 바이러스의 재구축과 동일한 방법으로 LLC-MK2 세포에 유전자도입했다. 유전자도입 3시간 후 세포를 무혈청배지로 3회 세척하여, 저속원심(1000 rpm/2 min)으로 떼어낸 세포를 회수하고, 시토신β-D-아라비노후라노시드(AraC) 40 ㎍/ml, SIGMA), 트립신(7.5 ㎍/ml, GIBCO)을 포함하는 무혈청 MEM 배지에 현탁하고, 세포에 가하여, 하룻밤 배양했다. 별도로 준비한 10 cm 샬레에서 100% 콘플루언트가 된 FHN 공발현세포를 아데노바이러스 AxCANCre를 MOI=10으로 발현유도 후, 4시간, 6시간, 8시간, 2일째, 3일째의 세포를 각각 5 ml PBS(-)로 1회 세척하여, cell dissociation solution(SIGMA)에 의해 세포를 떼어내고, 저속원심(1000 rpm/2 min)으로 세포를 모아, AraC(40 ㎍/ml, SIGMA), 트립신(7.5 ㎍/ml, GIBCO)을 포함하는 무혈청 MEM 배지에 현탁하여, FHN 공결실 바이러스의 재구축한 세포(P0)에 가하여 하룻밤 배양했다. 세포중층 후 2일째에서 형광현미경으로 세포를 관찰하여, 세포에 있어서의 GFP의 발현으로 바이러스의 확산을 확인했다. 그 결과를, 도49에 나타냈다. 세포중층하지 않는 종래의 경우(왼쪽)에 비해, 세포를 중층한 경우(오른쪽)는 중층된 세포쪽이 GFP 발현세포가 현저히 많이 인정되었다. 이들 세포를 회수하여, 107세포/ml의 Opti-MEM 배지(Gibcol)에 현탁하여, 3회 동결융해한 라이세이트를 조제하고, 발현유도하여 2일 후의 FHN 공발현세포에 106cells/100 ㎕/well 감염하여, AraC(40 ㎍/ml, SIGMA), 트립신(7.5 ㎍/ml, GIBCO)을 포함하는 무혈청 MEM 배지로, 37℃ 5% CO2인큐베이터로 2일간 배양한 P1세포 배양상청의 바이러스 역가를 CIU-GFP로 측정했다(표4). 그 결과, FHN 발현유도 후 4시간에서는 바이러스의 증폭효과가 인정되지 않고, 유도 6시간 이후의 세포중층에 의한 증폭효과가 현저히 인정되었다. 특히, P1세포 상청중에 방출된 바이러스는 6시간 후의 세포중층하는 쪽이 세포중층하지 않는 쪽에 비해 약 10배로 올랐다.
표4 더블 결실 △F-HN 세포중층법에 의한 결실 SeV 증폭
[실시예 17] 슈도타입 센다이바이러스가 F 결실형 게놈을 갖는지의 확인
VSV-G 유전자발현으로 증식한 상기 바이러스가 F 결실형인 것을, 감염세포 추출액 단백질의 웨스턴 해석에 의해 조사했다. 그 결과, 센다이바이러스 유래의 단백질은 검출되지만, F 단백질은 검출되지 않았던 것으로부터, F 결실형인 것이 확인되었다(도50).
[실시예 18] F 및 HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스의 항VSV항체에 의한 감염성의 영향
VSV-G 발현주를 사용하여 얻어진 F 및 HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스가, 외피에 VSV-G 단백질을 갖는지에 관하여, 항VSV항체를 사용하여 감염성이 영향을 받는지 어떤지의 중화활성을 조사했다. 바이러스액과 항체를 혼합하여, 실온에서 30분 가만히 방치한 후, VSV-G를 유도발현하지 않은 LLCG-L1세포에 감염하여, 4일째의 유전자도입능을 GFP 발현세포의 유무로 조사했다. 그결과, F 및 HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스(도중 VSV-G)는, 항VSV항체에서 감염성의 완전한 억제가 인정되었지만, 본래의 외피를 갖는 센다이바이러스(도중 F, HN)에서는 억제가 인정되지 않았다(도51). 이것으로부터, 본 실시예에서 얻어진 바이러스가, 외피에 VSV-G 단백질을 갖는 슈도타입의 센다이바이러스이며, 항체에 의해 그 감염성이 특이적으로 억제되는 것이 명백해졌다.
[실시예 19] F 유전자와 F 및 HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스의 밀도구배 초원심법(density gradient ultracentrifugation)을 사용한 정제
바이러스감염세포의 배양상청을 사용하여, 수크로오스밀도 구배원심을 행하여, F 유전자와 F 및 HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스의 분획정제를 행했다. 20~60%의 그라디언트(gradient)를 형성시킨 수크로오스용액에 바이러스액을 상층시키고, SW41 로터(rotor)(Beckman)로 29000 rpm, 15~16시간 초원심을 행했다. 초원심 후 튜브의 바닥에 구멍을 뚫어, 프랙션 콜렉터로 300 ㎕ 씩 분획했다. 각 획분에 대해서, F 유전자 또는 F 및 HN 유전자를 결실한 게놈을 가지고, 외피에 VSV-G 단백질을 갖는 슈도타입의 센다이바이러스인 것을 웨스턴 해석에 의해 조사했다. 웨스턴 해석은, 상기 기재의 방법에 의해 행했다. 그 결과, F 결실형 슈도타입 센다이바이러스에서는, 센다이바이러스 유래의 단백질 및 HN 단백질, VSV-G 단백질은 동 프랙션에 검출되지만, F 단백질은 검출되지 않은 것으로부터, F 결실형 슈도타입의 센다이바이러스인 것이 확인되었다. 한편, F 및 HN 결실형 슈도타입 센다이바이러스에서는, 센다이바이러스 유래의 단백질, VSV-G 단백질은 동 프랙션에 검출되지만, F 및 HN 단백질은 검출되지 않은 것으로부터, F 및 HN 결실형 슈도타입의 센다이바이러스인 것이 확인되었다(도52).
[실시예 20] F 유전자와 F 및 HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스에 의한 적혈구 응집반응의 회피
F유전자, 또는 F, HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스, 또는 본래의 외피를 갖는 센다이바이러스를 LLC-MK2 세포에 감염시키고, 3일째에 1% 새 적혈구 부유액을 가하여 4℃에서 30분 가만히 방치한 후, GFP를 발현한 감염세포 표면을 관찰했다. 그 결과, F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 바이러스(SeV/△F 및 VSV-G로 슈도화한 SeV/△F(VSV-G)) 슈도타입 센다이바이러스는 본래의 외피를 갖는 센다이바이러스와 함께, 감염세포의 표면에 응집반응이 일어나고 있는 것이 확인되었다. 한편, F 및 HN 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스(SeV/△F-HN(VSV-G))에서는, 감염세포상에 응집은 전혀 일어나고 있지 않은 것이 명백해졌다(도53).
[실시예 21] F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 VSV-G 슈도타입 센다이바이러스에 의한 배양세포로의 감염특이성
배양세포로의 F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 VSV-G 슈도타입 센다이바이러스의 감염효율은, 세포에 감염 후 3일째의 생세포에 발현한 GFP량을 플로사이트메트리를 사용하여 측정했다. F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 슈도타입 센다이바이러스와 본래의 외피를 갖는 센다이바이러스에서, 거의 동일한 감염효율을 나타내는 LLC-MK2 세포를 대조군으로서 비교를 행했다. 그 결과, 인간 난소암세포 HRA에서의감염효율은, LLC-MK2 세포와 거의 차이는 없지만, T세포계의 Jurkat 세포에서는, 대조군과 비교하여 F 유전자를 결실한 게놈을 갖는 VSV-G 슈도타입 센다이바이러스의 감염효율이 2배정도로 상승됨이 관찰되었다(도54).
[실시예 22] NGF 발현을 탑재한 F 결실형 센다이바이러스 벡터의 제작
<NGF/SeV/△F의 재구성>
NGF/SeV/△F의 재구성은 상기「엔벨로프 플라스미드 + F 발현세포 중층법」에 따라 행했다. 또한, 타이터의 측정은, 항SeV 다중클론항체를 사용한 방법에 따라 행했다.
<NGF/SeV/△F의 바이러스 게놈 확인(RT-PCR)>
NGF/SeV/△F 바이러스 게놈(도55 위)을 확인하기 위해, LLC-MK2/F7 세포로부터 회수된 배양상청을 원심한 후, QIAamp Viral RNA mini kit(QIAGEN)로 그 프로토콜에 따라 RNA 추출을 행했다. 이 RNA를 SUPERSCRIPTTMONE-STEPTMRT-PCR SYSTEM(GIBCO BRL)에 의해 RT-PCR의 템플레이트 합성 및 PCR을 행했다. 대조군은, 부가형 SeV cDNA(pSeV18+b(+))(Hasan, M. K. et al., J. General Virology 78: 2813-2820, 1997)를 사용했다. PCR 프라이머는 NGF-N과 NGF-C를 사용하여 행했다. NGF-N에 대해서는, forward: ACTTGCGGCCGCCAAAGTTCAGTAATGTCCATGTTGTTCTACACTCTG(서열번호: 33), NGF-C에 대해서는, reverse: ATCCGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTACTACGGTCAGCCTCTTCTTGTAGCCTTCCTGC(서열번호: 34)를 사용했다. 그 결과, NGF-N과 NGF-C를 프라이머에 사용한 경우는, RT조건하에서 NGF/SeV/△F는 NGF에 특이적인 밴드가 검출되었다. 대조군에는 밴드는 검출되지 않았다(도55 아래).
[실시예 23] NGF 유전자를 탑재한 F 결실형 SeV의 세포감염 후에 발현하는 NGF 단백의 정량과 인 비트로 활성 측정
감염 및 NGF 단백의 발현은, 직경 10 cm 또는 직경 6 cm 플레이트에 거의 콘플루언트로 증식시킨 LLC-MK2/F 또는 LLC-MK2 세포를 사용하여 행했다. NGF/SeV/△F, NGF/SeV/△F-GFP는 LLCMK2/F 세포에, NGF/SeV 및 GFP/SeV는 LLC-MK2 세포에 m.o.i.0.01로 감염시키고, 7.5 ㎍/mL의 Trypsin(GIBCO)을 포함하고 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 3일간 배양했다. 3일 후 거의 100%의 세포가 감염한 후에, Trypsin 및 혈청을 모두 포함하지 않는 MEM 배지로 교환하여 3일간 더 배양했다. 각각의 배양상청을 회수하여, 48,000 ×g으로 60분 원심 후, 상청에 대해서 NGF 단백의 정량 및 인 비트로 활성측정을 행했다. 본 실시예에서는, F 결실형 SeV(NGF/SeV/△F, NGF/SeV/△F-GFP)(도55 참조)를 LLC-MK2/F 세포에 감염시키고 있지만, 높은 m.o.i.(예를 들면 1 또는 3)를 감염하면, 즉 처음부터 100% 가까운 세포에 감염하면, 당연한 것이겠지만 F 비발현세포에서도 동일한 결과를 나타내는 실험을 행할 수 있다.
NGF 단백의 정량은 ELISA Kit인 NGF Emax Immuno Assay System(Promega)을 이용했다. 프로토콜은 첨부문서의 지시에 따랐다. NGF/SeV/△F, NGF/SeV/△F-GFP 및 NGF/SeV의 감염세포 배양상청중에는 각각 32.4 ㎍/mL, 37.4 ㎍/mL 및 10.5 ㎍/mL의 NGF 단백의 존재가 확인되었다. NGF/SeV/△F, NGF/SeV/△F-GFP의 감염세포배양상청중에는, 고농도의 NGF 단백이 존재하여 NGF/SeV의 감염세포 배양상청중의 NGF 단백량과 동일한 정도로, F 결실형 SeV에 의해서도 충분한 양의 NGF의 발현이 있는 것이 확인되었다.
NGF 단백의 인 비트로 활성측정은, 닭의 감각신경인 후근신경절의 1차 신경 세포 분산배양계에서의 생존유지활성(survival activity)을 지표로 행했다(Nerve Growth Factors (Wiley, New York), pp.95-109(1989)). 태어난지 10일 된 닭 배(胚)로부터 후근신경절을 꺼내, 0.25% Trypsin(GIBCO)으로 37℃에서 20분 처리 후 분산했다. 100 units/mL의 penicillin(Gibco), 100 units/mL의 streptomycin(Gibco), 250 ng/mL의 amphotericin B(Gibco), 20 μM의 2-deoxyuridine(Nakarai), 20 μM의 5-fluorodeoxyuridine(Nakarai), 2 mM L-glutamine(Sigma) 및 5%의 혈청을 포함하는 고 글루코오스의 D-MEM 배지를 사용하여, 96-well 플레이트에 1well당 약 5000개의 세포밀도로 배양을 개시했다. 플레이트는 96-well 플레이트(Iwaki)를 polylysin으로 먼저 코팅한 후 laminin(Sigma)으로 다시 코팅하여 준비했다. 배양개시시에 대조군인 NGF 단백 또는 먼저 조제한 SeV 감염 후의 배양상청을 첨가했다. 3일 후, 현미경하에서 세포를 관찰함과 동시에, Alamer blue(CosmoBio)를 첨가하여 미토콘드리아에 의한 환원활성(reduction activity)을 지표로서(530 nm에서 여기한 590 nm의 형광강도를 측정)생세포의 정량을 행했다. 대조군(NGF 첨가 없음) 및 SeV/부가형-GFP(GFP/SeV)의 감염세포 배양상청의 첨가(1/1000희석)에서는 동일한 정도의 생세포를 나타내는 형광강도였지만, NGF/SeV/△F, NGF/SeV/△F-GFP 및 NGF/SeV의 감염세포 배양상청을 첨가(1/1000희석)함으로써, 현저한 형광강도의 상승이 보여 생세포수가 많이 생존유지활성을 갖고 있다고 판단되었다(도56). 그리고, 그 값은 ELISA에 의해 구한 NGF 단백량의 첨가에 필적하는 효과였다. 동일한 것이 현미경하에서 시각적으로도 관찰되어, NGF/SeV/△F, NGF/SeV/△F-GFP 및 NGF/SeV의 감염세포 배양상청을 첨가함으로써, 생세포수의 증가와 현저한 돌기신장(neurite elongation)이 관찰되었다(도57). 즉, NGF 탑재 F 결실형 SeV의 감염에 의해 발현되는 NGF는 활성형으로서 발현하고 있음이 확인되었다.
[실시예 24] F 발현세포의 상세한 해석
1) Adeno-Cre의 moi와 유도시간
다른 Adeno-Cre의 moi를 사용하여 LLC-MK2/F에 감염시켜 F 단백의 발현을 유도한 후, 단백의 발현량과 세포의 형태변화를 조사했다.
moi=1의 경우에 비해 moi=10의 경우 발현량이 약간 높았지만(도58), 유도 후 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 후의 발현량을 조사한 바, 어느 것도 유도 후 48시간 째에 F 단백의 발현량이 높은 것을 알 수 있었다.
또한, moi=1, 3, 10, 30, 100으로 세포에 감염하여 세포의 형태변화를 경시적으로 관찰했지만, moi=10까지 세포 사이에 현저한 차이가 인정되지 않았지만, moi=30 이상이 되면 세포상해성이 관찰되었다(도59).
2) 계대수
LLC-MK2/F에 대하여 Adeno-Cre 사용하여 F 단백의 발현을 유도한 후 7대까지 계대하여, 세포 F의 발현량과 세포의 형태를 현미경관찰로 조사했다. 한편, F 단백의 발현을 유도한 후 20대까지 계대한 세포내 F 단백의 존재상태를 레이저현미경을 사용하여 조사했다.
레이저현미경 관찰에 있어서는, 챔버유리에 F 단백의 발현을 유도한 LLC-MK2/F 세포를 넣고, 하룻밤 배양한 후, 배지를 제거하고 PBS로 1회 세척한 후, 3.7%의 Formalin-PBS로 5분간 고정했다. 그 후, PBS로 세포를 1회 세척한 후, 0.1% Triton X100-PBS로 5분간 처리하여, 항F단백 단일클론항체(γ-236)(100배 희석)와 FITC 표지 산양 항토끼 IgG항체(200배)의 순으로 세포를 처리하고, 마지막으로 PBS로 세척하여 레이저현미경으로 관찰했다.
그 결과, 7대째까지 계대한 세포의 F 단백의 발현량에 차이는 없었다(도60). 형태적으로도, 그리고 SeV의 감염성과 생산성에도 현저한 차이가 관찰되지 않았다. 한편, 20대째까지 계대한 세포를 면역항체법으로 세포내의 F 단백의 존재상황을 조사한 바, 15대까지 큰 차이가 없지만, 그 이상 계대한 세포내에 F 단백의 국재화 경향이 관찰되었다(도61).
이상의 결과로부터, F 결실형 SeV의 생산에는 계대 후 15대째까지의 세포가 바람직하다고 판단된다.
[실시예 25] GFP-CIU와 항SeV-CIU의 상관관계
2종류의 방법에 의한 CIU(Cell-Infected Unit)의 측정결과의 상관관계를 조사했다. LLC-MK2 세포를 2 ×105cells/dish로 12well-plate에 뿌려, 24시간 배양 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지로 1회 세척한 후, SeV/△F-GFP를 100 ㎕/well로 감염했다. 15분 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM 배지를 lm1/well 가하여, 24시간 더 배양했다. 배양 후, PBS(-)로 3회 세척한 후, 세포를 건조시키고(약 10분~15분 실온방치), 세포를 고정하기 위해, 아세톤을 1 ml/well 가하여 즉시 제거하고, 다시 건조시켰다(약 10분∼15분 실온방치). PBS(-)로 100배 희석한 토끼로부터 조제된 SeV 다중클론항체(DN-1)를 300 ㎕/well 가하여, 37℃에서 45분간 인큐베이트한 후, PBS(-)로 3회 세척하고, PBS(-)로 200배 희석한 항토끼 IgG(H+D)형광표지 2차항체(AlexTM568: Molecular Probes사제)를 300 ㎕/well 가하여, 37℃에서 45분간 인큐베이트했다. PBS(-)로 3회 세척한 후, 형광현미경하(Emission: 560 nm, Absorption: 645 nm 필터: 라이카사제)에서 형광을 발하는 세포를 관찰했다.
대조로서 SeV/△F-GFP를 100 ㎕/well로 감염하고 15분 후, 혈청을 포함하지 않는 MEM을 1 ml/well 가하여, 24시간 더 배양 후, 이후의 조작을 행하지 않고 세포를 형광현미경하(Emission: 360 nm, Absorption: 470 nm 필터: 라이카사제)에서 GFP 발현세포를 관찰했다.
양자의 형광강도를 정량화하여 관계를 평가한 바, 양호한 상관관계를 나타냈다(도62).
[실시예 26] 멀티클로닝사이트의 제작
멀티클로닝사이트를 SeV 벡터에 부가시켰다. 방법은 아래의 2종류.
1) 센다이바이러스(SeV) 전장의 게놈 cDNA, pSeV18+의 cDNA의 게놈 중 몇 개의 제한효소사이트를 파괴한 제한효소사이트를 포함하는 새로운 제한효소사이트를 각 유전자의 스타트시그날과 ATG 번역개시시그날 사이에 도입했다.
2) 이미 구축한 SeV 벡터 cDNA에 멀티클로닝사이트서열과 전사개시시그날-개재서열 -종결시그날을 부가시켜 NotI 사이트에 삽입한다.
1)의 경우, 도입방법으로서는 먼저, pSeV18+을 Eag I로 소화한 단편(2644 bp), Cla I로 소화한 단편(3246 bp), ClaI/Eco RI로 소화한 단편(5146 bp) 및 Eco RI로 소화한 단편(5010 bp)을 각각 아가로우즈 전기영동으로 분리, 해당하는 밴드를 잘라내어, QIAEXII Gel Extraction System(QIAGEN사제)으로 회수 ·정제했다. Eag I로 소화한 단편은 LITMUS38(NEW ENGLAND BIOLABS사제), Cla I로 소화한 단편, ClaI/Eco RI로 소화한 단편 및 Eco RI로 소화한 단편은 pBluescriptII KS+(STRATAGENE사제)에 라이게이션하여, 서브클로닝했다. 제한효소사이트의 파괴 및 도입에는 Quickchange Site-Directed Mutagenesis kit(STRATAGENE사제)를 사용했다.
제한효소사이트의 파괴에는 Sal I:(센스사슬)5'-ggagaagtctcaacaccgtccacccaagataatcgatcag-3'(서열번호: 35), (안티센스사슬)5'-ctgatcgattatcttgggtggacggtgttgagacttctcc-3'(서열번호: 36), Nhe I:(센스사슬)5'-gtatatgtgttcagttgagcttgctgtcggtctaaggc-3'(서열번호: 37), (안티센스사슬)5'-gccttagaccgacagcaagctcaactgaacacatatac-3'(서열번호: 38), Xho I: (센스사슬)5'-caatgaactctctagagaggctggagtcactaaagagttacctgg-3'(서열번호: 39), (안티센스사슬)5'-ccaggtaactctttagtgactccagcctctctagagagttcattg-3'(서열번호:40) , 또한 제한효소도입에는 NP-P 사이:(센스사슬)5'-gtgaaagttcatccaccgatcggctcactcgaggccacacccaaccccaccg-3'(서열번호: 41), (안티센스사슬)5'-cggtggggttgggtgtggcctcgagtgagccgatcggtggatgaactttcac-3'(서열번호: 42), P-M 사이:(센스사슬)5'-cttagggtgaaagaaatttcagctagcacggcgcaatggcagatatc-3'(서열번호: 43), (안티센스사슬)5'-gatatctgccattgcgccgtgctagctgaaatttctttcaccctaag-3'(서열번호: 44), M-F 사이:(센스사슬)5'-cttagggataaagtcccttgtgcgcgcttggttgcaaaactctcccc-3'(서열번호: 45), (안티센스사슬)5'-ggggagagttttgcaaccaagcgcgcacaagggactttatccctaag-3'(서열번호: 46), F-HN 사이:(센스사슬)5'-ggtcgcgcggtactttagtcgacacctcaaacaagcacagatcatgg-3'(서열번호: 47), (안티센스사슬)5'-ccatgatctgtgcttgtttgaggtgtcgactaaagtaccgcgcgacc-3'(서열번호: 48), HN-L 사이:(센스사슬)5'-cccagggtgaatgggaagggccggccaggtcatggatgggcaggagtcc-3'(서열번호: 49), (안티센스사슬)5'-ggactcctgcccatccatgacctggccggcccttcccattcaccctggg-3'(서열번호: 50)를 각각 합성하여 반응에 사용했다. 도입후, 각각의 단편을 상기와 동일하게 회수 ·정제하여, cDNA를 어셈블리했다.
2)의 경우, (센스사슬)5'-ggccgcttaattaacggtttaaacgcgcgccaacagtgttgataagaaaaacttagggtgaaagttcatcac-3'(서열번호: 51), (안티센스사슬)5'-ggccgtgatgaactttcaccctaagtttttcttatcaacactgttggcgcgcgtttaaaccgttaattaagc-3'(서열번호: 52)를 합성하고, 각각의 합성 DNA를 인산화하여, 85℃ 2분, 65℃ 15분,37℃ 15분, 실온에서 15분 어닐링시켜, SeV cDNA로 함입한다. 또는 pUC18 또는 pBluescriptII 등의 멀티클로닝사이트를 종결시그날-개재서열-개시시그날을 포함하는 프라이머로 PCR하여 서브클로닝하고, 이것을 SeV cDNA로 삽입한다. 생긴 cDNA에서의 바이러스 재구성은 상기와 같이 행한다.
본 발명은, 엔벨로프 유전자 결손형 파라믹소바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 의해, 엔벨로프 유전자를 결손한 파라믹소과 바이러스 벡터가 제공되었다. 본 발명은, 음성가닥 RNA 바이러스를 기본골격으로 한 실용화 가능한 새로운 엔벨로프 유전자 결손형 벡터 시스템을 처음으로 확립하는 것이다. 헬퍼세포를 사용한 F 유전자 결손, FHN 유전자 결손 게놈 cDNA로부터의 감염성 결손 바이러스입자 회수의 성공은, 센다이바이러스의 우수한 특징을 살린 신규한 유전자치료용 벡터의 연구개발에 길을 열었다. 본 발명의 결손형 센다이바이러스 벡터는 유전자도입효율도 광범위 세포종에 대해 지극히 높게 외래유전자를 경이적으로 발현하는 능력을 가지고 있다. 더욱이, 감염세포에서 지속적으로 발현되고, 2차적인 감염성 바이러스입자를 방출하지 않는 것으로부터, 바이러스의 전파성을 완전히 없앤 안전성이 높은 벡터이다.

Claims (13)

  1. (a) 파라믹소과 바이러스의 적어도 하나의 엔벨로프 단백질을 발현하지 않도록 개변된 파라믹소바이러스에 유래하는 음성가닥 단일가닥 RNA 및 (b) 상기 음성가닥 단일가닥 RNA와 결합하는 단백질로 된 복합체를 포함하는 파라믹소과 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 음성가닥 단일가닥 RNA가 NP 단백질, P 단백질 및 L 단백질을 발현하고, F 단백질 및/또는 HN 단백질을 발현하지 않도록 개변되어 있는 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 음성가닥 단일가닥 RNA에서 발현하지 않도록 개변된 엔벨로프 단백질의 적어도 하나를 포함하는 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, VSV-G 단백질을 포함하는 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 음성가닥 단일가닥 RNA가 센다이바이러스에 유래하는 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 음성가닥 단일가닥 RNA가 외래유전자를 더 코드하고 있는 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터에 포함되는 음성가닥 단일가닥 RNA 또는 그 상보사슬을 코드하는 DNA.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터의 제조방법으로서,
    (a) 파라믹소과 바이러스의 적어도 하나의 엔벨로프 단백질을 발현하지 않도록 개변된 파라믹소바이러스에 유래하는 음성가닥 단일가닥 RNA 또는 그 상보사슬을 코드하는 벡터 DNA를, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포에 도입하여 발현시키는 공정, 및
    (b) 상기 세포를 배양하여, 그 배양상청으로부터 바이러스입자를 회수하는 공정을 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터의 제조방법으로서,
    (a) 파라믹소과 바이러스의 적어도 하나의 엔벨로프 단백질을 발현하지 않도록 개변된 파라믹소바이러스에 유래하는 음성가닥 단일가닥 RNA 및 상기 음성가닥 단일가닥 RNA와 결합하는 단백질으로 된 복합체를, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포에 도입하는 공정, 및
    (b) 상기 세포를 배양하여, 그 배양상청으로부터 바이러스입자를 회수하는 공정을 포함하는 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 공정 (b)에 있어서의 세포의 배양이, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포와의 공배양인 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 공정 (b)에 있어서의 세포의 배양에 있어서, 상기 세포에, 엔벨로프 단백질을 발현하는 세포를 중층하여 배양을 행하는 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 발현하는 엔벨로프 단백질의 적어도 하나가, 상기 음성가닥 단일가닥 RNA에서 발현하지 않도록 개변된 엔벨로프 단백질의 적어도 하나와 동일한 방법.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 발현하는 엔벨로프 단백질의 적어도 하나가 VSV-G 단백질인 방법.
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