JP5102630B2 - 改変パラミクソウイルスおよびその作製方法 - Google Patents
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Description
また、本発明は、薬剤を部位特異的に送達しうるベクターおよびその作製方法に関する。
ウイルスは変異を繰り返すことにより、最初は宿主を死滅させる病原体であっても、次第に宿主と共存をはかれるように機能を変え、それによって生き延びることが出来ていると考えられる。したがって1つのウイルスに限っても自然界には多くの変異体が存在し、それらの研究によって、ウイルスの持つ機能の分子レベルでの解明がなされてきたと言えるであろう。このことは基礎生物学的な観点から価値があるばかりでなく、抗ウイルスワクチンの開発などの医学的な見地からも重要視されてきた。自然発生的なウイルス変異株の分離は、時間がかかるばかりでなく、全くの偶然によってしか望みの変異株を得ることができない。
HVJ(hemagglutinating virus of Japan;Sendai virus)は、エンベロープを有し、その表面にはヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを有する、パラミクソウイルス科に属するウイルスである。HVJは(−)鎖のRNAをゲノムにもち、宿主細胞に感染後、(−)鎖から(+)鎖RNAが複製され、それからウイルスタンパク質が大量に生産されウイルス粒子が作られて出芽し、新たなウイルス粒子ができあがる。HVJはエーリッヒ腫瘍細胞を融合させるとして注目され(岡田、微研ジャーナル、1、p.103−110、(1958))、細胞膜融合活性(以下融合活性とする)の解析が進められるとともに遺伝子導入ベクターとしての利用が検討されてきた。融合はまずHN(hemagglutinating)タンパク質が細胞表面のアセチル型シアル酸を認識し、シアリダーゼの活性でその糖鎖を分解し、次いでF(fusion)タンパク質が脂質二重層に入り込んで誘発される。このHNタンパク質は赤血球凝集活性、溶血活性を有し、血液中に投与されたときは一時的に血液凝固能の低下を引き起こす。またこのウイルスは遺伝子導入やドラッグデリバリーのベクターとしても開発されているが、標的分子を挿入したHVJを作製してもHNタンパク質が存在すると、特異性が減弱されることも予想される。
従って、このようなHNタンパク質等の受容体タンパク質による毒性が改善された、安全性の高いウイルスベクターの開発が望まれている。
また、HVJ(Hemagglutinating virus of Japan;Sendai virus)は細胞融合をおこすマウスパラインフルエンザウイルスとして有名であり、その機能を利用して組み換えセンダイウイルスベクターやHVJエンベロープベクター、HVJ−リポソームなどの遺伝子導入ベクターやドラッグデリバリーシステムが開発されてきた。その融合はHN(hemagglutinating)タンパク質が細胞表面のアセチル型シアル酸を認識し、シアリダーゼの活性でその糖鎖を分解し、次いでF(fusion)タンパク質が脂質二重層に入り込んで誘発される。したがってシアル酸をもつほとんど全ての細胞が融合の対象となる。ベクターとしては普遍性に富むが、一方では特異性がなく細胞毒性のある分子の導入には適さない。ベクター改良の大きな課題の1つは特異性の増強であり、具体的には標的導入を可能にすることである。すでに本発明者らのグループではアミノ基をもつ脂質を一部用いてリポソームを作製し、そのアミノ基に化学修飾した抗体分子を架橋剤を用いて結合させたimmunoliposomeを作製し、これを不活性化HVJと融合してHVJ−immunoliposomeを開発することに成功した(Tomita,Nら、J.Gene Medicine、vol.4、p.527−535(2002))。ラット腎臟のメサンジウム細胞のThy−1抗原を認識するモノクローナル抗体を用いて作製したHVJ−immunoliposomeを末梢血管から注入すると、本来肝臓や脾臟の網内系に集まるHVJ−liposomeが左右の腎臟のメサンジウムに集積し、90%の糸球体に蛍光オリゴ核酸の導入が可能になった。このことはたとえHNタンパク質が存在していても、標的分子を挿入し、それが最初に認識されて特異的な細胞に結合すれば、そこで融合がおこり、特異的な導入が可能であることを示唆している。しかしこの抗体のようなタンパク質をリポソームに結合させる方法は複雑で、安定な結果を得るためには熟練を要する。
従って、組織・細胞特異性が高いウイルスベクター、および簡便かつ安定して該ウイルスベクターを得る方法の開発が望まれている。例えば、Hallakら、Cancer Res、vol.65(12)、p.5292−5300(2005)には、麻疹ウイルスのHタンパク質のC末端にインテグリンαvβ3に結合するM28Lエチスタチン分子を融合させるべくウイルスゲノムを改変し、インテグリンαvβ3を有する癌細胞をターゲティングするウイルスを作製したことが報告されている。さらにまた、種々のウイルスベクターを改変してターゲティングウイルスベクターを作製する試みがなされている(特表2001−515493号公報、特開2002−320475号公報、特表2005−532075号公報、特開2002−330774号公報)。
本発明の第2の目的は、薬剤を部位特異的に送達しうるパラミクソウイルスベクターおよびその新規作製方法を提供することである。
本発明者らは、上述の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、HVJのHNタンパク質のRNAをsiRNAでノックアウトすれば、その抑制効果が有効である間に作られるウイルスにはHNタンパク質が欠損しており、さらにこのようなHNタンパク質の欠損したウイルスは赤血球凝集活性が低減していることを見出した。
更に、本発明者らは、センダイウイルスのような融合ウイルスは細胞外にウイルス粒子が放出される際、宿主細胞膜上に発現しているウイルス遺伝子由来の表面タンパク質を取り込むことに着目し、ウイルスゲノムではなく宿主細胞を改変して、ターゲティング分子を細胞外ドメインにもつウイルス遺伝子由来の表面タンパク質をその細胞膜上に発現させ、該細胞にウイルスを感染させてウイルス粒子を回収することを発想した。そこで、センダイウイルスの融合(F)タンパク質の膜貫通ドメインをコードする遺伝子と、表皮基底層に発現するタンパク質に対する単鎖抗体フラグメントの遺伝子とを含むキメラ遺伝子を導入した細胞を作製し、該細胞に野生型のセンダイウイルスを感染させると、該抗体フラグメントの抗原結合能を有するキメラFタンパク質をウイルス表面上に提示したセンダイウイルスが得られることを見出した。
以上のような知見に基づき、本発明者らは本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
[1]野生型に比べて、含有する受容体結合タンパク質の量が低減していることを特徴とする、改変パラミクソウイルス。
[2]受容体結合タンパク質がHNタンパク質であり、パラミクソウイルスがHVJである、[1]記載のウイルス。
[3]パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含む、[1]または[2]記載のウイルス。
[4][1]または[2]記載のウイルスから調製される、ウイルスエンベロープベクター。
[5]改変パラミクソウイルスを作製する方法であって、以下のステップ:
(1)パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を動物細胞に導入するステップ、
(2)パラミクソウイルスを該細胞に感染させるステップ、および
(3)該細胞で複製されるパラミクソウイルス粒子を単離するステップ、
を含む、上記方法。
[6]パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が、該タンパク質をコードするmRNAに対するsiRNAである、[5]記載の方法。
[7]パラミクソウイルスがHVJである、[5]記載の方法。
[8]受容体結合タンパク質がHNタンパク質である、[7]記載の方法。
[9]HVJのHNタンパク質の発現を抑制する核酸が、配列番号3、4および5に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなる、HVJのHNmRNAに対するsiRNAである、[8]に記載の方法。
[10][5]記載の方法により得られた、改変HVJ。
[11]パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含む動物細胞。
[12]パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が、配列番号3、4および5に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなる、HVJのHNmRNAに対するsiRNAである、[11]記載の動物細胞。
[13]配列番号3、4および5に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなる、HVJのHNmRNAに対するsiRNA。
[14]パラミクソウイルス由来のFタンパク質の膜貫通ドメインのN末端側に、所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが、直接またはペプチドリンカーを介して連結されている、キメラタンパク質。
[15]Fタンパク質由来のシグナルペプチド、および哺乳動物細胞で機能し得るシグナルペプチドからなる群より選択されるシグナルペプチドがN末端側に、直接またはリンカーペプチドを介して、さらに付加されたものである、[14]記載のキメラタンパク質。
[16]Fタンパク質由来のシグナルペプチドを含む[15]記載のキメラタンパク質であって、該シグナルペプチドが、以下の(1)〜(4)のいずれかのアミノ酸配列からなる、キメラタンパク質。
(1)配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜25で示されるアミノ酸配列
(2)配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜25で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、シグナルペプチドとしての機能を有するアミノ酸配列
(3)配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜29で示されるアミノ酸配列
(4)配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜29で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、シグナルペプチドとしての機能を有するアミノ酸配列
[17]パラミクソウイルスがHVJである[14]記載のキメラタンパク質。
[18]HVJ由来Fタンパク質の膜貫通ドメインが、以下の(1)〜(4)のいずれかのアミノ酸配列からなる、[17]記載のキメラタンパク質。
(1)配列番号11に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号490〜565で示されるアミノ酸配列
(2)配列番号11に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号490〜565で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有するアミノ酸配列
(3)配列番号11に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号487〜565で示されるアミノ酸配列
(4)配列番号11に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号487〜565で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有するアミノ酸配列
[19]細胞表面分子に特異的に結合するペプチドが該分子に対する単鎖抗体である、[14]記載のキメラタンパク質。
[20]単鎖抗体がデスモグレイン3に対する抗体である、[19]記載のキメラタンパク質。
[21]以下の(1)または(2)の、[20]記載のキメラタンパク質。
(1)配列番号21に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(2)配列番号21に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、シグナルペプチド部分がプロセシングにより切断されてウイルス粒子に取り込まれた場合、その粒子表面に存在してデスモグレイン3に結合することができる、タンパク質
[22]細胞表面分子に特異的に結合するペプチドがトランスフェリンである、[14]記載のキメラタンパク質。
[23]以下の(1)または(2)のアミノ酸配列を含む、[22]記載のキメラタンパク質。
(1)配列番号25に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号40〜797で示されるアミノ酸配列
(2)配列番号25に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号40〜797で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、ウイルス粒子に取り込まれた場合、その粒子表面に存在して細胞膜上に発現されてトランスフェリン受容体と結合する機能を有するアミノ酸配列
[24][14]〜[23]のいずれかに記載のキメラタンパク質をコードする核酸。
[25]以下の(1)または(2)の塩基配列からなる、[24]記載の核酸。
(1)配列番号20に示す塩基配列
(2)配列番号20に示す塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有し、デスモグレイン3に結合することができるタンパク質をコードする塩基配列
[26][24]記載の核酸を発現可能な形態で含み、該核酸がコードするキメラタンパク質中の所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドを細胞表面に発現し得る動物細胞。
[27][14]記載のキメラタンパク質中の所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドをウイルス粒子表面に提示する改変パラミクソウイルス。
[28]HVJである、[27]記載の改変パラミクソウイルス。
[29]野生型に比べてHNタンパク質が低減または欠損されていることをさらなる特徴とする、[28]記載の改変パラミクソウイルス。
[30][27]〜[29]のいずれか記載のウイルスから調製される、ウイルスエンベロープベクター。
[31]組織ターゲティングパラミクソウイルスを作製する方法であって、以下の(1)〜(3)のステップを含む方法。
(1)パラミクソウイルス由来のFタンパク質の膜貫通ドメインのN末端側に、0〜30残基からなるリンカーペプチド、さらにそのN末端に所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが連結されている、キメラタンパク質をコードする核酸を、所定の動物細胞の細胞膜上に該キメラタンパク質を発現させ得る形態で該細胞に導入すること
(2)パラミクソウイルスを該細胞に感染させること
(3)該細胞で複製されるパラミクソウイルス粒子を単離すること
[32]核酸が動物細胞で機能し得るプロモーターの制御下に置かれ、且つ該細胞で機能し得るシグナルペプチドをコードする核酸が付加された形態である、[31]記載の方法。
[33]ウイルスがHVJである[31]記載の方法。
本発明の改変パラミクソウイルスは、受容体結合タンパク質の量が低減しており、受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響などを軽減することができるので、安全性の高いベクターとして利用可能である。本発明の改変パラミクソウイルスの作製方法によれば、このような改変パラミクソウイルスを簡便に得ることができる。
本発明のキメラタンパク質を有するパラミクソウイルスは、特定の組織・細胞に対する特異性が高く、薬剤を部位特異的に送達しうるベクターとして有用である。また、該ウイルスの融合関連タンパク質、特に受容体結合タンパク質を欠損させることにより、さらに特異性の高いウイルスベクターとすることも可能である。また、本発明のターゲティングパラミクソウイルスの作製方法によれば、簡便かつ安定して、所望の組織または細胞をターゲティング可能なパラミクソウイルスを得ることができる。
図2は、HNmRNAに対するsiRNAの効果を示す。
図3は、siRNAによるHNノックダウンの経時変化を示す。
図4は、siRNA最適濃度の検討を示す。
図5は、HN−siRNAのHNmRNA特異性を示す。
図6は、siRNAのウイルスタンパク質発現への影響を示す。
図7は、出芽ウイルス粒子数の検討を示す。
図8は、赤血球凝集活性の比較を示す。
図9は、等ウイルス粒子あたりの赤血球凝集活性を示す。
図10は、組織ターゲティングFタンパク質発現ベクターの作製を示す。
図11は、GFP融合Fタンパク質細胞内局在検討を示す(×1800)。
図12は、GFP融合Fタンパク質の発現をウェスタンブロット法により検出した図である(上段)。下段には、それぞれのキメラタンパク質の模式図を示す。
図13は、ウェスタンブロット法によるDsg3−scFv−HVJ上のGFP−Fの検出を示す。
図14は、scFv融合Fタンパク質発現ベクターの作製を示す。
図15は、scFv融合Fタンパク質のstable transformantでの発現を免疫染色により検出した図である。左から順に960倍、1980倍および2460倍で顕微鏡で観察した。
図16は、stable transformantを用いて産生したDsg3−scFv−HVJ上のDsg3−scFv−Fの検出を示す。左図(Myc)は、抗Myc抗体によるウェスタンブロット、中図(TMD)はFタンパク質の膜貫通ドメインを認識する抗体によるウェスタンブロットの結果を示す。右図は電子顕微鏡による観察結果であり、倍率は、左下のパネルは42000倍、および右上のパネルは56000倍である。
図17は、Dsg3−scFv−Fキメラタンパク質のデスモグレイン3に対する結合活性を示すELISAの結果を示す。
図18は、Dsg3−scFv−HVJによるマウスケラチノサイトtargetingを示す。左列はデスモグレインを発現(Dsg3(+))しているPAM細胞、中列および右列は、ともにデスモグレインを発現(Dsg3(−))していないNIH3T3細胞およびLLC−MK2細胞に、野生型のHVJ(上段)またはDsg3−scFv−HVJ(キメラHVJ:下段)を作用させた結果である。PAM細胞においてのみ、野生型に比してキメラHVJの方が多量に細胞表面に存在していることがわかる。
図19は、表皮細胞におけるFタンパク質の免疫染色を示す。7型コラーゲンノックアウトマウスの腹部水疱部分の皮膚断片に、野生型のHVJ(上段)またはDsg3−scFv−HVJ(キメラHVJ:下段)を作用させた結果である。野生型に比してキメラHVJの方が多量に存在していることがわかる。
図20は、皮膚組織切片(断面)におけるFタンパク質の免疫染色を示す(400倍)。
図21は、キメラF/Tf遺伝子発現ベクターの作製を示す。
図22は、F/Tfタンパク質を発現し、且つHNタンパク質を欠損したHVJの作製を示す。
図23は、HNタンパク質及びF/Tfタンパク質の発現をウェスタンブロット法により検出した図である。上段がHNタンパク質を、下段がF/Tfタンパク質を、それぞれ示す。W:野生型ウイルス、C:キメラウイルス、si:siRNA処理。
図24は、HEK293細胞へのHN欠損HVJ又はF/Tf−HN欠損HVJの感染を、Fタンパク質の発現を指標に示した図である。
図25は、Hela細胞へのHN欠損HVJ又はF/Tf−HN欠損HVJの感染を、Fタンパク質の発現を指標に示した図である。
図26は、Hela細胞への野生型HVJ又はF/Tf−HN欠損HVJの感染を、Fタンパク質陽性細胞数を指標に示したグラフである。白カラムは野生型HVJを、黒カラムはF/Tf−HN欠損HVJを、それぞれ示す。
図27は、Hela細胞へのF/Tf−HN欠損HVJウイルス感染のトランスフェリンによる阻害を示す。Tf:トランスフェリン。
図28は、Hela細胞へのF/Tf−HN欠損HVJウイルス感染を、Fタンパク質陽性細胞数を指標に示したグラフである。白カラムは野生型HVJを、黒カラムはF/Tf−HN欠損HVJを、それぞれ示す。
図29は、F/Tf−HN欠損HVJ−エンベロープの癌特異的なターゲティングを示すグラフである。W:野生型HVJウイルスより作製したウイルスエンベロープにQdotを封入したもの。C:F/Tf−HN欠損HVJウイルスエンベロープにQdotを封入したもの。3回の独立した実験を行った。
本発明は、野生型に比べて、含有する受容体結合タンパク質の量が低減していることを特徴とする、改変パラミクソウイルス(以下、本発明の改変パラミクソウイルスIともいう)を提供する。
本発明において用いることのできるパラミクソウイルスとしては、パラミクソウイルス科に属し、受容体結合タンパク質を有するパラミクソウイルスが挙げられる。受容体結合タンパク質を有するパラミクソウイルスとしては、センダイウイルス(HVJ)、シミアンウイルス(SV)、麻疹ウイルス(MeV)、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、おたふく風邪ウイルス(MuV)、ニューカッスル病ウイルス等が挙げられる。特に限定されないが、本発明において用いることのできるパラミクソウイルスは、好ましくはセンダイウイルス(HVJ)である。
受容体結合タンパク質とは、標的細胞への結合に関するタンパク質であり、使用されるパラミクソウイルスの種類に応じて、HN(hemagglutininating)タンパク質、Hタンパク質、Gタンパク質等が挙げられる。本発明において量が低減している受容体結合タンパク質は、好ましくはHNタンパク質である。HNタンパク質は、赤血球凝集活性、溶血活性等を有することが知られており、また、ウイルスの特異性を減弱すると考えられている。
本発明の改変パラミクソウイルスIにおいては、受容体結合タンパク質の量が低減している。受容体結合タンパク質の量の低減とは、本発明の改変パラミクソウイルスIの受容体結合タンパク質の発現レベルが、野生型のパラミクソウイルスのものと比し、多くともおよそ0.6倍(例えば、0.5倍、好ましくは0.3倍、より好ましくは0.2倍、最も好ましくは0.1倍)以下に低減していることを意味する。好ましくは、本発明の改変パラミクソウイルスIにおいては、受容体結合タンパク質が発現していない。本発明の改変パラミクソウイルスIの受容体結合タンパク質の遺伝子は、該タンパク質の発現レベルが低減している限り変異していても変異していなくてもよい。変異している場合、当該変異は受容体結合タンパク質の量の低減に関与していない。
本発明の改変パラミクソウイルスIにおいては、好ましくは、受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を含むことにより、野生型に比べて受容体結合タンパク質の量が低減している。受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸としては、後述の本発明の改変パラミクソウイルスIの作製方法において導入され得る各種核酸が好ましく例示される。
本発明の改変パラミクソウイルスIにおいては、受容体結合タンパク質の量が低減しているので、受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響などが軽減している。受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響とは、例えば、HNタンパク質による赤血球凝集活性、溶血活性等が挙げられる。従って、本発明の改変パラミクソウイルスIは、安全性の高いベクター(ウイルスエンベロープベクター等)として利用可能である。
本発明の改変パラミクソウイルスIをベクターとして用いる場合、標的細胞への感染能力を増強するため、標的細胞表面に発現しているマーカータンパク質に特異的に結合するポリペプチド等の標的分子が該ウイルスに付加していてもよい。
本発明の改変パラミクソウイルスIは、公知のいかなる手法を組み合わせて作製してもよいが、好ましくは以下の方法が例示される。
従って、本発明はまた、以下のステップを含む改変パラミクソウイルスIを作製する方法(以下、本発明の方法ともいう)を提供する:
(1)パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を動物細胞に導入するステップ、
(2)パラミクソウイルスを該細胞に感染させるステップ、および
(3)該細胞で複製されるパラミクソウイルス粒子を単離するステップ。
上記ステップ(1)では、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸が用意される。
パラミクソウイルスとしては、上記と同様のものが挙げられ、好ましくはセンダイウイルス(HVJ)である。また、受容体結合タンパク質としては、上記と同様のものが挙げられ、好ましくはHNタンパク質である。
パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸の好ましい一態様は、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のmRNAもしくは初期転写産物のアンチセンス核酸である。「アンチセンス核酸」とは、標的mRNA(初期転写産物)を発現する細胞の生理的条件下で該標的mRNA(初期転写産物)とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該標的mRNA(初期転写産物)にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はDNAであってもRNAであってもよいし、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明のアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型(リン酸結合のP=OをP=Sに置換)や2’−O−メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成することもできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。
本発明で用いられるアンチセンス核酸の長さは、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のmRNAもしくは初期転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約15塩基程度、長いものでmRNA(初期転写産物)の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、好ましくは約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。アンチセンス核酸が約25merのオリゴDNAの場合、生理条件下でパラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のmRNAとハイブリダイズし得る塩基配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、通常、約80%以上の同一性を有するものであればよい。
本発明のアンチセンス核酸の標的配列は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質もしくはその機能的断片の翻訳が阻害される配列であれば特に制限はなく、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のmRNAの全配列であっても部分配列であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、アンチセンス核酸としてオリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的配列はパラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のmRNAの5’末端からコード領域のC末端コード部位までの間に位置することが望ましい。好ましくは5’末端からコード領域のN末端コード部位までの領域であり、最も好ましくは開始コドン近傍の塩基配列である。また、標的配列は、それに相補的なアンチセンス核酸がヘアピン構造等の二次構造を形成しないようなものを選択することが好ましい。
パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸の別の好ましい一態様は、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のmRNAもしくは初期転写産物を、コード領域の内部(初期転写産物の場合はイントロン部分を含む)で特異的に切断し得るリボザイムである。「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するRNAをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴDNAも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本発明では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する概念として用いるものとする。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーへッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーへッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ(合わせて約10塩基程度)をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイムは、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないというさらなる利点を有する。パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAへリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,98(10):5572−5577(2001)]。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる[Nucleic Acids Res.,29(13):2780−2788(2001)]。
パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する物質のさらに別の一態様は、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のmRNAもしくは初期転写産物のコード領域内の部分配列(初期転写産物の場合はイントロン部分を含む)に相補的なオリゴRNA、いわゆるsiRNAである。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉(RNAi)と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されて以来[Nature,411(6836):494−498(2001)]、リボザイムの代替技術として汎用されている。siRNAは標的となるmRNAの塩基配列情報に基づいて、市販のソフトウェア(例:RNAi Designer;Invitrogen)を用いて適宜設計することができる。
siRNAとしては、後述の通り自ら合成したものを用いることができるが、市販のものを用いてもよい。
本発明で用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機(アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等)を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製することもできる。あるいは、siRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を適当な長さ(例えば約3〜約10塩基)のリンカーを介して連結したRNAとして合成し、導入する動物細胞内のダイサー(dicer)などによってプロセシングされるように設計することもできる。さらには、センス鎖およびアンチセンス鎖をコードするDNAがそれぞれ別個のU6やH1などのPol III系プロモーターの制御下におかれた発現ベクター、あるいは上記センス鎖とアンチセンス鎖とをリンカーを介して連結したRNA鎖をコードするDNAがPol III系プロモーターの制御下におかれた発現ベクターとして調製し、動物細胞内で発現させ、siRNAを形成させてもよい。
好ましくは、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸は、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質のmRNAに対するsiRNAである。より好ましくは、該核酸は、HVJのHNタンパク質のmRNAに対するsiRNAである。具体的に、siRNAとしては、HN−899(配列番号3)、HN−1142(配列番号4)およびHN−1427(配列番号5)で示される配列からなるものが好ましい。
核酸を導入する動物細胞としては、パラミクソウイルスが感染し、細胞内でパラミクソウイルス粒子を再構成する限り、任意の動物に由来する細胞であり得るが、哺乳動物に由来する細胞が好ましい。本明細書中で使用される場合、「哺乳動物」としては、例えば、霊長類、実験用動物、家畜、ペット等が挙げられ特に限定されるものではないが、具体的には、ヒト、サル、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどである。具体的には、サル腎由来のCV−1細胞やLLC−MK2細胞、ハムスター腎由来のBHK細胞などの培養細胞などが挙げられる。
核酸を動物細胞に導入する方法は、細胞の種類により適宜選択することができる。例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、PEG法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
上記ステップ(2)では、パラミクソウイルスを、パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現を抑制する核酸を導入した動物細胞に感染させる。
該感染させるパラミクソウイルスとしては、再構成能を有する限り特に限定されず、野生型パラミクソウイルスであっても改変パラミクソウイルスであっても良い。改変パラミクソウイルスの場合、当該改変は受容体結合タンパク質の量の低減に関与していない。
感染したパラミクソウイルスは、動物細胞内で受容体結合タンパク質の発現の低減したパラミクソウイルスとして再構成する。
複製されたパラミクソウイルス粒子の単離は自体公知の方法で行われ、例えば細胞培養上清を回収・遠心分離するなどの方法によりなされる。
このようにして作製された改変パラミクソウイルスは、受容体結合タンパク質の発現が低減している。受容体結合タンパク質の量の低減とは、本発明の方法により得られた改変パラミクソウイルスの受容体結合タンパク質の発現レベルが、野生型のパラミクソウイルスのものと比し、多くともおよそ0.6倍(例えば、0.5倍、好ましくは0.3倍、より好ましくは0.2倍、特に好ましくは0.1倍)以下に低減していることを意味する。最も好ましくは、本発明の方法により得られた改変パラミクソウイルスは、受容体結合タンパク質が発現していない。
本発明の方法により得られた改変パラミクソウイルスは、受容体結合タンパク質の量が低減しているので、受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響などが軽減している。特に、本発明の改変パラミクソウイルスは、赤血球凝集活性が低減されていることから、生体内に投与した際に、野生型パラミクソウイルスを投与した場合に比べて、赤血球凝集が起こりにくい。
したがって、本発明の改変パラミクソウイルスIは、安全性の高いベクター(ウイルスエンベロープベクター等)として利用可能である。
2.キメラタンパク質およびそれをコードする核酸
本発明で用いられるキメラタンパク質は、パラミクソウイルス由来の表面タンパク質の膜貫通ドメインと所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドとを含むキメラタンパク質である。パラミクソウイルス由来の表面タンパク質としては、パラミクソウイルス由来受容体結合タンパク質および融合(F)タンパク質(以下、これらを包括して融合関連タンパク質という場合がある)等が挙げられ、より好ましくはFタンパク質であり、特に好ましくはセンダイウイルス(HVJ)由来Fタンパク質である。例えば、HVJ由来Fタンパク質の膜貫通ドメインは、配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号490〜565で示されるアミノ酸配列、アミノ酸番号487〜565示されるアミノ酸配列、あるいはアミノ酸番号501〜521で示される膜貫通部位(UniProtKB/Swiss−Prot entry,Primary accession number:P04855参照)を含む、その部分配列である。本明細書において「膜貫通ドメイン」とは、膜貫通部位を含み、かつ、パラミクソウイルスの裏打ちタンパク質と相互作用して該ウイルス粒子表面に取り込まれるのに必要な、該部位の近傍配列をさらに含む、ウイルス表面タンパク質の機能的部分を意味する。膜貫通部位を含むことにより、動物細胞内で発現し、細胞膜に輸送された該キメラタンパク質は、該膜タンパク質の膜外領域(本明細書においては、ウイルス表面タンパク質のウイルス粒子外に露出した領域を膜外領域と称する)を細胞外に提示した状態で細胞膜上にとどまる。本発明に用いる膜貫通ドメインの好ましい例としては、HVJ由来Fタンパク質の膜貫通ドメインである、配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号490〜565に示す配列およびこれに実質的に同一な配列からなるペプチドが挙げられる。また、本発明に用いる膜貫通ドメインとして好ましい別の例としては、HVJ由来Fタンパク質の膜貫通ドメインである、配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号487〜565に示す配列およびこれに実質的に同一な配列からなるペプチドが挙げられる。ここで「実質的に同一な配列」とは、HVJ由来Fタンパク質全長について後述されるのと同様の意味である。具体的には、配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号490〜565又はアミノ酸番号487〜565で示されるアミノ酸配列において、1もしくは複数(例えば1〜10個、好ましくは1〜5、4、3または2個)のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、パラミクソウイルスの裏打ちタンパク質と相互作用して該ウイルス粒子表面に取り込まれる能力を保持するペプチドも、HVJ由来Fタンパク質の膜貫通ドメインに包含される。
本発明で用いられるキメラタンパク質は、所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドをその一部として含む。ここで、「所望の細胞表面分子」とは、後述する本発明の改変パラミクソウイルスをターゲティングしたい細胞表面に存在する分子を意味する。細胞表面分子は、本発明の改変パラミクソウイルスが標的とする細胞の表面に発現している限り、特に限定されず、公知のいかなる細胞表面タンパク質、糖鎖、脂質等も全て含まれる。好ましくは、細胞表面分子は、特定の細胞種に特異的に発現している細胞表面タンパク質である。好ましい細胞表面分子としては、例えば、デスモグレイン3(表皮基底細胞に発現)、β2インテグリン(好中球、マクロファージに発現)、α4インテグリン(リンパ球、線維芽細胞に発現)、αIIbβ3インテグリン(血小板、巨核球に発現)、葉酸受容体(癌細胞に発現)、トランスフェリン受容体(癌細胞に発現)、HER2(転移性乳癌細胞に発現)、EGFR(非小細胞性肺癌細胞に発現)、LDLR(肝細胞に発現)、CD20(悪性リンパ腫に発現)、CEA(膵臓癌に発現)、Gp100(メラノーマに発現)、PSMA(前立腺癌に発現)、AFP(原発性肝癌、卵黄嚢腫瘍に発現)等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはデスモグレイン3又はトランスフェリン受容体である。
細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドとしては、例えば、各種細胞表面レセプターに対するリガンド、例えば、インテグリン類に対するRGD配列を有するペプチド(例:エチスタチン、フィブロネクチン等)、トランスフェリン受容体に対するトランスフェリン等、あるいは各種細胞表面分子に対する抗体(例えば、単鎖抗体等の単一の核酸によりコードされ得る抗体分子が好ましい)等が挙げられる。例えば、細胞表面分子がデスモグレイン3の場合、細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドとしては、デスモグレイン3を認識する単鎖抗体(scFv)が挙げられる。
細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドは、上記表面タンパク質の膜貫通ドメインのN末端に付加される。該ペプチドは、ペプチドリンカーを介して膜貫通ドメインのN末端に付加されてもよい。かかるペプチドリンカーは、任意のアミノ酸残基からなる任意の長さのペプチドであってよく、用いられる表面タンパク質の膜貫通ドメインのN末端側に生来存在するアミノ酸配列を含む、またはこれからなるものであってもよい。好ましくは、1〜30残基、より好ましくは、1〜25、1〜20、1〜15または1〜10残基、さらには1〜5残基の長さのものが最も好ましい。このリンカーは、当業者が、膜貫通ドメインをコードする遺伝子および細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドをコードする遺伝子の塩基配列によって、これらをインフレームに連結するために挿入される場合もある。
本発明で用いられるキメラタンパク質は、該キメラタンパク質をウイルス粒子表面に提示する改変パラミクソウイルスの作製のため、該ウイルス複製の宿主細胞として用いられ得る所定の動物細胞の細胞膜に輸送され得るような形態で、発現することが望ましい。従って、該キメラタンパク質は、好ましくはそのN末端に、該キメラタンパク質を構成するウイルス表面タンパク質由来のシグナルペプチド、好ましくはFタンパク質由来のシグナルペプチドを含むか、あるいは該所定の哺乳動物細胞で機能し得る他のシグナルペプチドが付加されたものである。必要に応じて、該シグナルペプチドは、上記と同様のペプチドリンカーを、好ましくはそのC末端に含むこともできる。かかるペプチドリンカーは、任意のアミノ酸残基からなる任意の長さのペプチドであってよく、Fタンパク質の生来のシグナルペプチドのC末端側に生来存在するアミノ酸配列、すなわち成熟Fタンパク質のN末端部分の配列を含む、またはこれからなるものであってもよい。好ましくは、1〜30残基、より好ましくは、1〜25、1〜20、1〜15または1〜10残基、さらには1〜5残基の長さのものが最も好ましい。公知の表面タンパク質のシグナルペプチドは、種々のタンパク質データベース上で公開されており、また、該タンパク質のアミノ酸配列をもとに、例えばKyte & Doolittleの方法などに基づいて容易に予測することができる(そのような解析ソフトウェアも多数市販されており、ウェブサイト上で一般に利用可能である)。例えば、HVJ由来Fタンパク質のシグナルペプチドは配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜25で示される領域であり(UniProtKB/Swiss−Prot entry,Primary accession number:P04855参照)、本発明のキメラタンパク質は、該領域を少なくとも含んでいることが好ましく、配列番号11に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号1〜25、1〜26、1〜27、1〜28、1〜29、1〜30または1〜35のいずれかで示される領域をN末端側に含んでいるものなどが挙げられる。また、配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜25又はアミノ酸番号1〜29で示されるアミノ酸配列において、1もしくは複数(例えば1〜10個、好ましくは1〜5、4、3または2個)のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、所定の哺乳動物細胞においてシグナルペプチドとしての機能し得るアミノ酸配列からなるペプチドも、HVJ由来Fタンパク質のシグナルペプチドに包含される。
所定の哺乳動物細胞で機能し得る他のシグナルペプチドとしては、例えば、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列、MFαシグナル配列、SUC2シグナル配列、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列、抗体分子シグナル配列などが用いられるが、それらに限定されない。
本発明のキメラタンパク質は、タンパク質の検出や精製等を容易にならしめるためのタグのアミノ酸配列を含んでいてもよい。タグとしては、Flagタグ、His×6タグ、c−Mycタグ、HAタグ、AUlタグ、GSTタグ、MBPタグ、蛍光タンパク質タグ(例えばGFP、YFP、RFP、CFP、BFP等)、イムノグロブリンFcタグ等を挙げることが出来る。タグの位置は、本発明のキメラタンパク質が膜貫通ドメインとしての機能を有し、所望の細胞表面分子に特異的に結合することが出来る限り特に限定されないが、好ましくは、キメラタンパク質のC末端又はシグナルペプチドのC末端である。
好ましい一実施態様において、本発明で用いられるキメラタンパク質は、パラミクソウイルスのような融合ウイルス由来の融合関連タンパク質の膜貫通ドメインを含む。ここで「融合関連タンパク質」は、融合ウイルスの表面に発現し、ウイルスと標的細胞との融合に関連するタンパク質であるかぎり特に制限されないが、例えば、Fタンパク質および受容体結合タンパク質(HNタンパク質、Hタンパク質、Gタンパク質等)が挙げられる。
特に好ましい一実施態様において、本発明は、パラミクソウイルス由来Fタンパク質の膜貫通ドメインのN末端側に、所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが、直接またはペプチドリンカーを介して連結されているキメラタンパク質を提供する。パラミクソウイルスとしては、宿主細胞との融合を介して該細胞に感染する、パラミクソウイルス科に属するウイルスであれば特に制限はなく、例えば、センダイウイルス(HVJ)、麻疹ウイルス(MV)、流行性耳下腺炎ウイルス(MuV)、パラインフルエンザウイルス1(PIV1)、PIV2、PIV3、シミアンウイルス5(SV5)、ニューカッスルウイルス(NDV)、RSウイルス(RSV)等が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、パラミクソウイルス由来融合関連タンパク質として、HVJ由来Fタンパク質が挙げられる。HVJ由来Fタンパク質は、配列番号11に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質である。「配列番号11に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるタンパク質」とは、配列番号11に示されるアミノ酸配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つウイルスと細胞との融合を媒介する活性を有するタンパク質である。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;マトリクス=BLOSUM62;フィルタリング=OFF)にて計算することができる。
また、HVJ由来Fタンパク質としては、例えば、(i)配列番号11に示されるアミノ酸配列中の1〜20個(好ましくは、1〜15個、さらに好ましくは、1〜5個、より好ましくは、1〜3個)のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号11に示されるアミノ酸配列に1〜20個(好ましくは、1〜15個、さらに好ましくは、1〜5個、より好ましくは、1〜3個)のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号11に示されるアミノ酸配列に1〜20個(好ましくは、1〜15個、さらに好ましくは、1〜5個、より好ましくは、1〜3個)のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(iv)配列番号11に示されるアミノ酸配列中の1〜20個(好ましくは、1〜15個、さらに好ましくは、1〜5個、より好ましくは、1〜3個)のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(v)それら欠失・付加・挿入・置換を組み合わせたアミノ酸配列を有するタンパク質も含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が欠失、付加、挿入または置換されている場合、その欠失、付加、挿入または置換の位置は特に限定されない。公知のバリアントとしては、UniProtKB/Swiss−Prot entry,Primary accession number:P04855に示されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
HVJ由来Fタンパク質の膜貫通ドメインとしては、その膜貫通部位(配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号501〜521で示される領域)並びにHVJの裏打ちタンパク質と相互作用して該ウイルス粒子表面に取り込まれるのに必要なその近傍配列を含む限り、いかなるものであってもよい。後述する本発明の改変パラミクソウイルスはウイルスゲノム由来のインタクトなFタンパク質をウイルス粒子表面に発現するので、本発明のキメラFタンパク質は融合ペプチド(配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号117〜141で示される領域)を含んでいる必要はない。特に好ましくは、本発明のキメラFタンパク質に用いられるHVJ由来Fタンパク質の膜貫通ドメインは、配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号490〜565又はアミノ酸番号487〜565で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなる。ここで「実質的に同一」とは上記と同義である。
本発明のキメラFタンパク質に含まれる、細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドは特に制限されず、上述した通りのものを用いることができるが、例えば、好ましい一実施態様において、本発明のキメラFタンパク質は、抗デスモグレイン3単鎖抗体を含む。該抗体は、本発明の改変パラミクソウイルスIIがヒトへの遺伝子導入用ベクターとして好ましく利用されることを考慮すれば、キメラ抗体、より好ましくはヒト化抗体、最も好ましくは完全ヒト抗体であることが望ましい。該抗体ポリペプチドは、HVJ由来Fタンパク質の膜貫通ドメインに連結され得る。特に好ましい一実施態様においては、抗デスモグレイン3単鎖抗体ポリペプチドは、HVJ由来Fタンパク質のF2およびF1領域、より具体的には、配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号30〜489で示されるアミノ酸配列と置換されて、Fタンパク質のシグナルペプチドと膜貫通ドメインの間に挿入される。
また、別の好ましい一実施態様において、本発明のキメラFタンパク質は、トランスフェリンを含む。該抗体は、本発明の改変パラミクソウイルスIIがヒトへの遺伝子導入用ベクターとして好ましく利用されることを考慮すれば、ヒトトランスフェリンであることが望ましい。トランスフェリンは、HVJ由来Fタンパク質の膜貫通ドメインに連結され得る。特に好ましい一実施態様においては、トランスフェリンは、HVJ由来Fタンパク質のF2およびF1領域、より具体的には、配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号30〜486で示されるアミノ酸配列と置換されて、Fタンパク質のシグナルペプチドと膜貫通ドメインの間に挿入される。
本発明のキメラタンパク質の例としては、HVJ由来のFタンパク質フラグメントを含むキメラタンパク質である、配列番号21に示すアミノ酸配列と同一または実質的に同一の配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「実質的に同一」とは上記と同義であるが、実質的に同一の配列からなるタンパク質は、HVJ粒子表面に取り込まれ得ることに加えて、デスモグレイン3を特異的に認識して結合する能力を保持する必要がある。このタンパク質は、デスモグレイン3を認識する単鎖抗体可変部フラグメント(scFv)を膜外領域に含んでおり、かかるタンパク質を有するウイルスは、細胞表面にデスモグレイン3を提示している細胞に特異的にターゲティングすることが可能である。デスモグレイン3は表皮基底層の細胞に選択的に発現しているため、上記ウイルスは表皮基底層に特異的にターゲティングする。
本発明のキメラタンパク質の別の例としては、HVJ由来のFタンパク質フラグメントを含むキメラタンパク質である、配列番号25に示すアミノ酸配列又は配列番号25に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号40〜797で示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の配列からなるタンパク質が挙げられる。ここで「実質的に同一」とは上記と同義であるが、実質的に同一の配列からなるタンパク質は、HVJ粒子表面に取り込まれ得ることに加えて、トランスフェリン受容体を特異的に認識して結合する能力を保持する必要がある。このタンパク質は、トランスフェリンを膜外領域に含んでおり、かかるタンパク質を有するウイルスは、細胞表面にトランスフェリン受容体を提示している細胞に特異的にターゲティングすることが可能である。トランスフェリン受容体は癌細胞に選択的に発現しているため、上記ウイルスは癌細胞に特異的にターゲティングする。
本発明で用いられるキメラタンパク質は、本発明の改変パラミクソウイルスを製造する目的においては、パラミクソウイルスが感染し、ウイルスを複製し得る動物細胞の細胞膜上に発現することが必要である。従って、好ましくは、該キメラタンパク質は、該キメラタンパク質をコードする核酸を発現可能な形態で該動物細胞に導入することにより製造される。それゆえ、本発明はまた、本発明で用いられるキメラタンパク質をコードする核酸(以下、単に「本発明のキメラ核酸」ともいう)を提供する。
本発明のキメラ核酸は、DNA又はRNAあるいは両者のキメラのいずれでもよい。また、該キメラ核酸は1本鎖であっても2本鎖であってもよい。2本鎖の場合、該キメラ核酸は二本鎖DNAでも二本鎖RNAでもよく、DNA/RNAハイブリッドであってもよい。
本発明のキメラ核酸は、表面タンパク質に由来するペプチド部分および細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチド部分をコードする天然の塩基配列、または異なるコドンによりコードされたものを配置通りに連結したもの、あるいは該連結した配列に相補的な塩基配列からなる核酸とハイストリンジェント(highstringent)条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ該キメラタンパク質と同質の活性(即ち、キメラ核酸が導入された動物細胞内で発現して細胞膜上に輸送され、且つ該細胞内で複製し、再構成されたパラミクソウイルス粒子が細胞外に放出される際に該ウイルス粒子表面に取り込まれ、生成する改変パラミクソウイルスを所望の細胞表面分子を発現する標的細胞にターゲティングし得る活性)を保持するタンパク質をコードするものである。
ハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、該連結した配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90%以上、特に好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列などが用いられる。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=3)にて計算することができる。
上記ハイブリダイゼーションの条件は、既報の条件を参考に設定することができる(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,6.3.1−6.3.6,1999)。例えば、ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、6×SSC(sodium chloride/sodium citrate)/45℃の後、0.2×SSC/0.1%SDS/50〜65℃での一回以上の洗浄が挙げられる。また、中程度のストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、2×SSC/30℃の後、1×SSC/0.1%SDS/30〜50℃での一回以上の洗浄が挙げられる。
本発明のキメラ核酸の特に好ましい一例としては、上記した、配列番号21に示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の配列からなるタンパク質をコードする核酸が挙げられる。より好ましくは、該キメラ核酸は、配列番号20に示される塩基配列からなる核酸、あるいは、配列番号20に示される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含み、かつ、HVJ粒子表面に取り込まれ得るとともに、デスモグレイン3を特異的に認識して結合する能力を保持するタンパク質をコードする核酸である。ここでハイストリンジェントな条件とは、上記と同義である。
本発明のキメラ核酸の特に好ましい別の一例としては、上記した、配列番号25に示されるアミノ酸配列又は配列番号25に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号40〜797で示されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一の配列からなるタンパク質をコードする核酸が挙げられる。より好ましくは、該キメラ核酸は、配列番号24に示される塩基配列又は配列番号24に示す塩基配列中塩基番号118〜2391で示される塩基配列を含む核酸、あるいは、配列番号24に示される塩基配列又は配列番号24に示す塩基配列中塩基番号118〜2391で示される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を含み、かつ、HVJ粒子表面に取り込まれ得るとともに、トランスフェリン受容体を特異的に認識して結合する能力を保持するタンパク質をコードする核酸である。ここでハイストリンジェントな条件とは、上記と同義である。
以下、本発明の好ましい一実施態様である、単鎖抗体と表面タンパク質もしくはそのフラグメントとのキメラタンパク質をコードするキメラ核酸について、その調製方法を示すが、当業者は、以下の記載および当該技術分野で周知慣用の技法を適宜組み合わせることにより、容易に他のキメラタンパク質をコードする核酸を製造することができる。
まず、公知の表面タンパク質のコード核酸の配列情報に基づいて、該表面タンパク質の膜貫通ドメインをコードする核酸を、常法に従ってクローニングする。例えば、該核酸は、該表面タンパク質の膜貫通ドメインをコードする塩基配列の一部分を有する合成DNAプライマーを用いてPCR法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだ核酸を、該表面タンパク質の一部あるいは全領域をコードするDNA断片もしくは合成DNAを標識したものとハイブリダイゼーションさせることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)第2版(前述)に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
得られた表面タンパク質の膜貫通ドメインをコードする核酸は、後のキメラ核酸の作製を容易にするために、必要に応じて、リンカーや部位特異的変異誘発等を用いて適当な制限酵素サイトを導入することができる。
単鎖抗体をコードする核酸を得る方法としては、例えば、所望の細胞表面分子もしくはそのフラグメントを抗原として常法によりモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを作製し(ここで免疫動物としてKMマウスTMなどのヒト抗体産生マウスを用いると、ヒト抗体産生ハイブリドーマを容易に得ることができる)、該ハイブリドーマからRNAを抽出して、ヒト抗体の重鎖および軽鎖の各可変領域に特異的なプライマーを用いて、RT−PCRにより可変領域遺伝子をクローニングした後、適当なリンカーを介して重鎖と軽鎖を連結する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。PCRの過程で、単鎖抗体をコードする核酸の末端に、表面タンパク質やシグナルペプチドをコードする核酸とのライゲーションに適した制限酵素サイトを導入することができる。
得られた表面タンパク質をコードする核酸と、単鎖抗体をコードする核酸は、適当な制限酵素、リガーゼ等を用いて連結することができる。
本発明のキメラ核酸は、該キメラ核酸にコードされるキメラタンパク質が所定の動物細胞内で分泌経路に乗って細胞膜上へ輸送されるべく、好ましくはその5’末端に、上述のいずれかのシグナルペプチドをコードする核酸が連結されていることが好ましい。このようなシグナルペプチドをコードする核酸は、例えば、当該シグナルペプチドを含むタンパク質を発現する細胞(ウイルスを含む)から抽出したゲノム核酸もしくはcDNAを鋳型として、PCRによりクローニングすることもできるが、公知の塩基配列情報に基づいて、化学合成することもできる。
得られたシグナルペプチドをコードする核酸は、単鎖抗体をコードする核酸もしくは表面タンパク質をコードする核酸と、適当な制限酵素、リガーゼ等を用いて連結することができる。
本発明のキメラ核酸を動物細胞に導入することにより、本発明のキメラタンパク質をその細胞膜上に発現する動物細胞を得ることができる。
また、上記動物細胞にパラミクソウイルスを感染させることにより、本発明のキメラタンパク質をウイルス粒子表面に発現している改変パラミクソウイルス(本発明の改変パラミクソウイルスII)を得ることもできる。
本発明の改変パラミクソウイルスIIは、そのウイルス表面に、標的細胞の細胞表面分子に特異的に結合するペプチドにウイルス表面タンパク質が連結したキメラタンパク質を発現している。従って、該改変パラミクソウイルスは、標的組織・細胞に対する特異性が高く、薬剤等を部位特異的に送達し得るパラミクソウイルスベクター(ウイルスエンベロープベクター等)として利用可能である。
更に、該改変パラミクソウイルスIIにおいて、上記本発明の改変パラミクソウイルスIと同様の改変を加えることにより、
(1)パラミクソウイルス由来のFタンパク質の膜貫通ドメインのN末端側に、所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが、直接またはペプチドリンカーを介して連結されている、キメラタンパク質をウイルス粒子表面に提示しており、且つ
(2)野生型に比べて、含有する受容体結合タンパク質(HNタンパク質等)の量が低減している、
改変パラミクソウイルスを得ることが出来る。ここで、「細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチド」は「受容体結合タンパク質」とは異なる。該ウイルスにおいては、受容体結合タンパク質がもたらす標的細胞への悪影響が軽減されることにより、高い安定性が達成されているとともに、特定の組織・細胞に対する高い特異性が達成されており、極めて好ましい。
3.ターゲティングパラミクソウイルスの作製方法
本発明は、下記のステップを含む、ターゲティングパラミクソウイルスを作製する方法(以下、本発明の方法ともいう)を提供する:
(1)パラミクソウイルス由来のFタンパク質の膜貫通ドメインのN末端側に、0〜30残基からなるリンカーペプチド、さらにそのN末端に所望の細胞の表面分子に特異的に結合し得るペプチドが連結されている、キメラタンパク質をコードする核酸を、所定の動物細胞の細胞膜上に該キメラタンパク質を発現させ得る形態で該細胞に導入するステップ、
(2)パラミクソウイルスを該細胞に感染させるステップ、および
(3)該細胞で複製されるパラミクソウイルス粒子を単離するステップ。
ステップ(1)では、上記の本発明のキメラ核酸が、動物細胞内で発現しうる形態に調製され、導入される。具体的には、上記のように作製した本発明のキメラ核酸が、適当な発現ベクター中に組み込まれる。
発現ベクターとしては、動物細胞中で本発明のキメラタンパク質を産生できるものであれば特に限定されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター(例えば、アデノウイルス、レトロウイルス)等を挙げることができる。発現ベクターは、少なくとも、プロモーター、開始コドン、本発明のキメラ核酸、終止コドンを含んでいることが好ましい。また、エンハンサー配列、本発明の核酸の5’側および3’側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子(マーカー)を含んでいてもよい。また、プロモーターとしては、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
ターミネーター領域、複製可能単位、エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、自体公知のものを用いることができる。
選択マーカーとしては、自体公知のものを用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。
遺伝子増幅遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
本発明の核酸は、通常の遺伝子工学的手法を用いて適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結されることにより、動物細胞内で発現しうる形態に調製される。
動物細胞としては、上述の核酸を発現し、細胞内でパラミクソウイルスが再構成する限り、特に制限されない。例えば、サル腎由来のCV−1細胞やLLC−MK2細胞、ハムスター腎由来のBHK細胞などの培養細胞などが挙げられる。
動物細胞に核酸を導入する方法は、該動物細胞において核酸が発現する限り特に限定されず、動物細胞の種類などにより適宜選択することができる。例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、PEG法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
動物細胞を培養する際、培地としては、例えば、約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地(Science、122巻、501(1952))、DMEM培地(Virology、8巻、396(1959))、RPMI 1640培地(The Journal of the American Medical Association、199巻、519(1967))、199培地(Proceeding of the Society for the Biological Medicine、73巻、1(1950))などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30〜40℃で約15〜60時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
このようにして、本発明のキメラタンパク質は動物細胞内で発現し、該キメラタンパク質中のシグナルペプチドの作用により分泌経路に乗って、該動物細胞の細胞膜上に輸送される。
上記ステップ(2)では、パラミクソウイルスを、本発明のキメラタンパク質を発現する動物細胞に感染させる。
該感染させるパラミクソウイルスとしては、再構成能を有する限り特に限定されず、野生型パラミクソウイルスであっても改変パラミクソウイルスであってもよい。但し、本発明のキメラタンパク質が自体、細胞との融合活性を有しない場合、改変パラミクソウイルスは、少なくともFタンパク質の融合活性を保持するものであることが望ましい。
感染したパラミクソウイルスは、動物細胞内で再構成されて細胞膜へと運ばれ、細胞膜の一部を取り込む形でエクトサイトーシス様に細胞外へと放出される。そのため、細胞外へ放出されたパラミクソウイルスは、細胞膜上に発現した本発明のキメラタンパク質をウイルス粒子表面上に提示した、改変パラミクソウイルスである。
上記した本発明の改変パラミクソウイルスの形成手順を考慮すれば、本発明のキメラタンパク質を動物細胞内で発現させることなく、適当な脂質(複合体)からなるリポソームに該キメラタンパク質を包埋したプロテオリポソームとして調製し、これを動物細胞と融合させることにより、該動物細胞の細胞膜上にキメラタンパク質を提示させ、これにパラミクソウイルスを感染させて同様にウイルスを複製、再構成させることも可能であることが理解される。
さらに、上記プロテオリポソームの利用を考慮すれば、本発明で用いられるターゲティング用のタンパク質は、細胞表面分子に特異的に結合し得る非ペプチド性成分(本明細書においては、核酸配列(コドン)によりコードされる20アミノ酸以外のアミノ酸を含むペプチド性物質も、ここでいう非ペプチド成分に包含されるものと定義する)をウイルス表面タンパク質とともに含むものであってもよい。例えば、葉酸受容体に特異的に結合する分子として葉酸が挙げられるが、葉酸分子とウイルス表面タンパク質もしくはそのフラグメントのアミノ末端または側鎖のアミノ基と葉酸のカルボキシル基との間でアミド結合を形成させることにより、あるいは側鎖のカルボキシル基と葉酸のアミノ基との間でアミド結合を形成させることによりウイルス表面タンパク質と葉酸とが共有結合したタンパク質コンジュゲートとすることができる。かかるタンパク質コンジュゲートをプロテオリポソームを利用して動物細胞の細胞膜上に提示させて、該動物細胞をパラミクソウイルスで感染させれば、複製し、再構成されて細胞外へ放出されたパラミクソウイルスは、該タンパク質コンジュゲートをウイルス表面に提示した改変パラミクソウイルスであり、葉酸受容体を発現する細胞をターゲティングするのに用いることができる。
細胞表面分子に特異的に結合し得る他の非ペプチド性成分において、ウイルス表面タンパク質のN末端やアミノ酸側鎖上の官能基と共有結合し得る構造でない場合には、例えば、イムノコンジュゲートの作製において通常用いられているような、公知のリンカーを介して結合させることも可能である。
上記ステップ(3)では、改変パラミクソウイルス粒子が単離される。該ウイルス粒子の単離は、自体公知の方法でなされ、例えば、細胞培養上清を回収・遠心分離するなどの方法によりなされる。
本発明の方法により得られた改変パラミクソウイルスは、そのウイルス表面に、標的細胞の細胞表面分子に特異的に結合するペプチドにウイルス表面タンパク質が連結したキメラタンパク質を提示している。従って、該改変パラミクソウイルスは、標的組織・細胞に対する特異性が高い。該改変パラミクソウイルスは、また、薬剤等を部位特異的に送達し得るパラミクソウイルスベクター(ウイルスエンベロープベクター等)として利用可能である。
本明細書において、ウイルスエンベロープベクターとは、ウイルスのゲノムをUV照射、超音波処理、界面活性剤処理など種々の方法により失活させて、ウイルスの複製能を消失させたものをいう。ウイルスエンベロープベクターは、エンベロープ、即ち、ウイルスに存在するヌクレオキャプシドの周囲を取り囲む脂質二重層を基本とする膜構造を含む。かかるウイルスエンベロープベクターは、ウイルス粒子表面に存在するタンパク質を維持しているため、細胞に吸着可能であり、ウイルス粒子内に封入した物質(たとえば、タンパク質、核酸、低分子化合物)を細胞内に送達するベクターとして利用できる。
ウイルスからウイルスエンベロープベクターを調製する方法、およびウイルスエンベロープベクターに物質を封入する方法はいずれも既に公知であり、例えば、Molecular Therapy,2002 vol.6 219−226などに記載されている。
例えば、Fタンパク質の膜貫通ドメインのN末端側にトランスフェリンが融合した融合タンパク質を粒子表面に有するエンベロープベクターは、トランスフェリンの癌細胞特異的な結合能により、癌細胞特異的ターゲティングベクターとして、癌細胞にだけ物質を送達可能である。
また、Fタンパク質の膜貫通ドメインのN末端側にデスモグレイン3を認識する単鎖抗体可変部フラグメント(scFv)が融合した融合タンパク質を粒子表面に有するエンベロープベクターは、該フラグメントの表皮基底層特異的な結合により、表皮基底層特異的ターゲティングベクターとして、表皮基底層にだけ物質を送達可能である。
上記ウイルスエンベロープベクターを用いて、物質を所望の細胞に送達する場合、ウイルス粒子内に物質が封入されたウイルスエンベロープベクターを単独で、または該ベクターと、安定化化合物、希釈剤、担体とを組み合わせて含む薬学的組成物として用いられる。
該薬学的組成物は、上記ウイルスエンベロープベクターが意図される目的を達成するのに有効な量の該ベクターを含む。「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は当業者に十分に認識される用語であり、意図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量をいう。従って、治療的有効量は、処置されるべき疾患の徴候を軽減するのに十分な量である。所定の適用のための有効量(例えば、治療的有効量)を確認する1つの有用なアッセイは、標的疾患の回復の程度を測定することである。実際に投与される量は、処置が適用されるべき個体に依存し、好ましくは、所望の効果が顕著な副作用をともなうことなく達成されるように最適化された量である。治療的有効用量の決定は十分に当業者の能力内にある。
該薬学的組成物は、ウイルスエンベロープが患部の細胞内または目的とする組織の細胞内に取り込まれるような形態で用いられ得る。
該薬学的組成物は、任意の無菌生体適合性薬学的キャリア(生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、それらに限定されない)中で投与され得る。これらの分子のいずれも、適切な賦形剤、および/または薬学的に受容可能なキャリアと混合する薬学的組成物中にて、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて患者に投与され得る。薬学的に受容可能なキャリアは薬学的に不活性であり得る。
該薬学的組成物の投与は、経口または非経口により達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内(例えば、頸動脈を介する)、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内の投与が挙げられる。本発明は、処置部位に到達する経路であれば、どのような経路でもよい。
ウイルスエンベロープベクターの投与量は、年齢その他の投与対象の条件、投与の目的、使用するベクターの種類等により適宜選択される。
本発明のウイルスを、ウイルスエンベロープベクターとしてヒトに投与する場合、1被験体あたり、通常400〜400,000HAU相当の、好ましくは1,200〜120,000HAU相当の、より好ましくは4,000〜40,000HAU相当のウイルスエンベロープベクターが投与され得る。「HAU」とは、ニワトリ赤血球0.5%を凝集可能なウイルスの活性をいう。1HAUは、ほぼ2400万ウイルス粒子に相当する(Okada,Y.ら、Biken Journal 4,209−213、1961)。上記の量は、例えば、1日1回から数回投与することができる。
正確な用量は、ベクターに含まれる物質の種類や治療されるべき患者を考慮して、個々の臨床医によって選択される。用量および投与は、十分なレベルの活性部分を提供するか、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度;患者の年齢、体重、および性別;投与の食餌制限時間、および頻度、薬物組合せ、反応感受性、および治療に対する耐性/応答)が挙げられる。特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、持続作用性薬学的組成物は、3〜4日毎に、毎週、または2週間に1回、投与され得る。
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以下に実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
(1)HNmRNAに対するsiRNAの作製
図1に示す5種類のHN mRNAノックダウン用のsiRNAは、SMART siRNA technologyTM(Dharmacon Research社)を用いてデザイン、合成された。その5種類のsiRNA(HN−223、HN−342、HN−899、HN−1142、HN−1427)は、それぞれHN mRNA上のGCAUUGAACAUGAGCAGCA(223−241:配列番号1)、GAACAAAAACAGCAGGGAU(342−360:配列番号2)、GAACUAAGUCUCACCGGUA(899−917:配列番号3)、GCGUGAUCAUCCAGGUCAA(1142−1160:配列番号4)、GCGUAUACACUGAUGCUUA(1427−1445:配列番号5)を標的としている。また、コントロールとして使用しているscramble siRNAはランダムな配列(GCGCGCUUUGUAGGAUUCG:配列番号6)からなる。
(2)siRNAの効果の検出
合成されたsiRNAは、Lipofectamin Reagent(InvitrogenTM,California,USA)とPlus Reagent(InvitrogenTM)を利用して、それぞれのプロトコールに従って種々の濃度でLLCMK2細胞に導入した。
導入の24時間後に、培養細胞をDulbecco’s Phosphate Buffered Saline(−)(PBS)(Nacalai Tesque Inc.Tokyo,Japan)で洗浄し、multiplicity of infection(MOI)0.02の濃度に調整したHVJを含むOpti−MEM I(GIBCOTM,Invitrogen)を加えて37℃、5%CO2−95%air条件下で1時間インキュベーションし、HVJを感染させた。さらに24時間後、該培養細胞からRNeasy(QIAGEN K.K.Tokyo,Japan)を用いて全RNAを抽出した。30μg全RNAを1%アガロースゲル(Cambrex Bio Science Rockland Inc,Rockland,USA)電気泳動により分画した後、Hybond−N+nylon transfer membrane(Amersham Biosciences UK Ltd.Buckinghamshire,England)にトランスファーした。HN及びG3PDH cDNAをRandom Primers DNA Labeling System(InvitrogenTM)を用いて32P標識し、PerfectHybTM(TOYOBO Co Ltd,Osaka,Japan)の示す方法に従ってハイブリダイゼーションした後、KODAK BioMax MS Film(KODAK,Tokyo,Japan)に露光して解析した。
その結果を図2に示す。上記siRNAのうち、HN−223、HN−342はほとんど効果を示さず、HN−899、HN−1142およびHN−1427は、HNタンパク質の転写を有意に阻害した。
(3)siRNAによるHNノックダウンの経時的変化
HN−899を用いて、図3下段に示すようなタイムスケジュールで、HVJを感染させる時間を変えて、siRNAの効果を経時的に検出した。その結果、図3にしめすように、siRNAの導入から24時間後にHVJを感染させて、その24時間後にRNAを回収するというタイムスケジュールが、最もHNタンパク質の転写が抑制されることがわかった。
(4)siRNA最適濃度の検討
HN−899のsiRNAの濃度を、50〜320pmol/mlで変化させて上記の通り導入後、上記に従ってHVJ感染、RNA回収を行い、siRNAの濃度依存的な効果を検討した。図4に示すとおり、50pmol/mlで充分な効果を示した。
(5)siRNAのHNに対する特異性
図5に示すように、上記と同様の手法により、回収したRNAについて、HNタンパク質mRNA、Fタンパク質mRNAおよびMタンパク質mRNAについて、ノーザンブロットによりそのmRNA量を検出したところ、HN−899のsiRNAは、HNタンパク質特異的に転写を抑制した。
(6)HVJ感染細胞からの新規出芽ウイルス回収およびウェスタンブロット
HVJウイルスを感染させたLLCMK2細胞をPenicillin/Streptomycin含有MEMにて37℃、5%CO2−95%air条件下で48時間培養した。培養上清から100,000×g遠心によりウイルス粒子を回収し、PBSに懸濁した。
HVJを2×サンプルバッファー(125mM Tris−HCl(pH6.8)/10%2−mercaptoethanol/4% sodium dodecilsulfate/10% sucrose/0.004%bromophenol blue)に溶解し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル(12%)で泳動後、ホライズブロット(水平積層式電気泳動転写装置、Atto,Tokyo,Japan)を用いて Immobilon−P Transfer Membrane(Millipore Co,Billerica,USA)にトランスファーした。次いで、メンブレンを5%スキムミルク(Nacalai Tesque Inc.)含有洗浄緩衝液(684mM NaCl/4mM Tris/0.1%Tween20)により室温で1時間ブロッキングした後、一次抗体(抗HN抗体は1,000倍、抗F抗体は200倍、抗M抗体は2,000倍に5%スキムミルクで希釈)を室温で1時間反応させた。後に、洗浄緩衝液でメンブレンを洗浄し、二次抗体(HNとMの場合は抗家兎IgG抗体を、Fの場合は抗マウスIgG抗体を、いずれも2,000倍に5%スキムミルクで希釈)を室温で1時間反応させた。二次抗体反応後、洗浄緩衝液でメンブレンを洗浄して、ECL Western Blotting Detection Reagent(Amersham Biosciences)で検出した。
その結果を図6に示す。HN−899を導入した細胞から回収したHVJでは、HNはほとんど発現されていなかった。その一方、Fタンパク質、Mタンパク質はスクランブルsiRNA導入細胞から回収したHVJより増大していた。
(7)ウイルス粒子数の比較
siRNA導入下でのHVJ感染によるHVJウイルス粒子産生数を検討するために、ウイルス粒子数の比較のためのリアルタイムPCRによるウイルスゲノム定量を行った。HVJゲノム検出用のオリゴヌクレオチドプライマー、及び蛍光ラベルプローブはApplied Biosystems社のPrimer Express(登録商標)Softwarel.5によってデザインされた。プライマーの配列はGGCATAGAAGGTTACTGCCAGAA(HVJ−10769F:配列番号7)、TGTCACGGCTATAGCTTGATTGTC(HVJ−10897R:配列番号8)で、プローブの配列はATCCACCTAGCAGCTGT(配列番号9)である。PURESCRIPI RNA Isolation Kit(Gentra Systems,Inc.Minnesota,USA)を用いて回収した細胞由来HVJからRNAゲノムを抽出し、更にSuperScriptTMIII First Strand Synthesis System(InvitrogenTM)を用いてcDNAを合成した。上記プライマーとプローブ、及びTaqman Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems Co.,Ltd.California,USA)を用いて、Applied Biosystems・7700 Sequence Detector(Applied Biosystems)でリアルタイムPCRアッセイを行いゲノムの量を測定し、粒子数を算出した。結果を図7に示す。スクランブル(scramble)RNA導入、HN−899 siRNA導入ともに、RNAを導入しない場合(normal)に比べて、ウイルス粒子は多量に産生されていた。
(8)赤血球凝集(HA)活性の測定
siRNAの導入、HVJの感染後、その等量の培養上清に存在する全てのウイルス粒子を回収してニワトリ赤血球の凝集活性を測定したところ、HN−899導入群では正常のHVJの約10分の1であった(図8)。なお、ここで、この凝集活性は、HVJ懸濁液の2倍希釈系列をつくり、それぞれに希釈液と等量の1%赤血球含有液を混和して赤血球凝集を観察し、以下の計算式でHVJ懸濁液の力価(HAU/ml)を求めて算出した。
HAU/ml=2n×希釈倍率
n:凝集反応を認める最大希釈数
希釈倍率:元のサンプルが希釈されている場合のその希釈倍率
次に、ウイルス粒子数あたりの赤血球凝集活性を測定した。図9に示すように、やはりHN−899 siRNA導入細胞から得られたウイルスは、その赤血球凝集活性が低減していた。
[実施例2]
(1)HVJ−FとGFPあるいはDsg−3−scFvとのキメラFタンパク質発現ベクターの作製
図10の(i)〜(iv)に示すキメラEGFP−Fタンパク質を発現するためのベクターを作製した。
Mutagenesis(Promega)を用いて、pcDNA3.1−Fプラスミドを、元来有しているBglII認識部位(279−284)を削除し、新たにAgeI認識部位(82−87)およびBglII認識部位(346−351)を作製し、新たなプラスミドベクターを得た(pcDNA3.1−Fmut)。これをHindIII/xhoIで切断し、得られたF断片を同様に切断したpCY4Bに挿入し、pCY4B−Fmutを作製した。pCY4B−Fmut中のBglII切断部位(図10中(i))、AgeI−BglII部位(図1中(ii))、AgeI−Eco47III部位(図10中(iii))、およびAgeI−EcoNI部位(図10中(iv))のそれぞれにEGFPを挿入するために、pEGFP−C1(BD Biosiences Clontech)からPCRにより増幅させてEGFPcDNA断片を得た。
ここで用いたPCRプライマーは以下の通りである:
GFP−BglII−f:5’−CATGGTGAGCAAGGGCGAGG−3’(配列番号12)
GFP−BglII−r:5’−TTCTAGATCCGGTGGATCCG−3’(配列番号13)
GFP−AgeI−f:5’−TATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG−3’(配列番号14)
GFP−Eco47III−r:5’−GCTCTAGATCCGGTGGATCCCG−3’(配列番号15)
GFP−EcoNI−r:5’−ATCTAGATCCGGTGGATCCCG−3’(配列番号16)。
図10中(i)のBglII切断部位挿入EGFPcDNA断片の取得には、GFP−BglII−fとGFP−BglII−rを、図10中(ii)のAgeI−BglII部位挿入EGFPcDNA断片の取得には、GFP−AgeI−fとGFP−Eco47III−rを、図10中(iii)のAgeI−Eco47III部位挿入EGFPcDNA断片の取得には、GFP−AgeI−fとGFP−Eco47III−rを、および図10中(iv)のAgeI−EcoNI部位挿入EGFPcDNA断片の取得には、GFP−AgeI−fとGFP−EcoNI−rとを用いて、PCR増幅を行った。
pCY4B−Fmutを、BglII単独、AgeIとBglII、AgeIとEco47IIIまたはAgeIとEcoNIで切断後、Blunting High(TOYOBO)により平滑末端化した後、上記増幅して得たEGFP cDNAを、Ligation High(TOYOBO)により室温にて5分間反応させることによりライゲーションさせ、図10の(i)〜(iv)に模式的に示すキメラEGFP−Fタンパク質発現ベクターを作製した。
Fタンパク質のcDNA配列を配列番号10に示すが、上記(i)では、345位と346位の間にPCR産物断片が挿入され、上記(ii)では87〜345位が、上記(iii)では87〜455位が、上記(iv)では87〜1465位が、それぞれ対応するPCR産物断片と置換されている。
(2)上記ベクターの細胞内導入(トランスフェクション)とGFP免疫染色
トランスフェクション前日に6wellプレートにカバーガラス(IWAKI)を敷き、2×105のLLCMK2細胞を播種した。
トランスフェクション当日800μlのD−MEM(−)に変えて3時間培養後、Lipofectamin Plus(invitrogen)を用いて1μgのプラスミドDNAを導入し、4時間後に1mLのD−MEM(+)を加え、48時間培養した。
固定は4%パラホルムアルデヒドで4℃・15分間行い、一部は0.1%Triton−Xで2分間インキュベーション後、5%スキムミルク/PBSで1時間ブロッキングした。
1次抗体Anti−Green Fluorescent Protein(GFP)PoAb Purified IgG(MBL):1/2000で1時間インキュベーションし、PBSで3回洗浄し、2次抗体Alexa Fluor 555 goat anti−rabbit IgG(H+L):1/1000で1時間インキュベーションした後、PBSで3回洗浄した。カバーガラスで封入後、共焦点顕微鏡(Nikon)にて観察した。
図11にその結果を示す。上段は、0.1%Triton−Xでのインキュベーションを行わなかった場合であり、下段は0.1%Triton−Xでのインキュベーションを行った場合の結果である。ともに、EGFPは赤色に染色されており、核がHoechst33258により青色に染色されている。
図11より判るとおり、上記(i)〜(iv)のキメラタンパク質は全て細胞内で発現されたが(図11下段)、Triton−Xで細胞を透過化させないとEGFPで染色されるのは(iv)のみであり、(iv)のキメラタンパク質のみが細胞表面に局在していることが判る。
意図したとおりのキメラタンパク質が発現されていることは、抗GFP抗体によるウェスタンブロットによって確認できた(図12)。ウェスタンブロットの方法は以下のとおりである。
トランスフェクション48時間後、2×105個の細胞を20μLのSDSサンプルバッファーに溶解し、サンプルを調製した。サンプルは12%SDSポリアクリルアミドゲルで分離し、PVDFメンブレン(Millipore)へ転写した。メンブレンは5%スキムミルク/wash buffer(2mM Tris−HCl pH8.0,0.02% NaCl,0.05% Tween20);blocking bufferで1時間インキュベーションし、次に1次抗体1:2000 Anti−Green Fluorescent Protein(GFP)PoAb Purified IgG(MBL),1:400 f236(抗F抗体),1:1500抗HN抗体をblocking bufferで希釈し、室温で1時間インキュベーションした。Wash bufferでメンブレンを洗った後、horseradish peroxidase−conjugate anti−rabbit又はanti−mouse secondary antibodies(1:1000,Amersham Pharmacia)で検出した。
図12に示すとおり、意図したキメラタンパク質の分子量の位置にそれぞれのバンドが検出された。
したがって、Fタンパク質のN末端29残基のトランスメンブランドメインのみがGFPと融合したキメラタンパク質のみが細胞表面への局在が可能であることが判った。
(3)キメラGFP−Fタンパク質を有するHVJの産生
上記キメラGFP−Fタンパク質発現ベクターを導入した細胞に、野生型のHVJをm.o.i=0.6で感染させた。MEM培地で48時間培養後、上清を回収し遠心(440g、5分間)により細胞を除去しさらに上清を遠心(100000g、2時間)し、得られたHVJペレットをPBSで洗浄後、適当量に懸濁し、SDS−PAGE後抗GFP抗体によるウェスタンブロットに供した。その結果を図13に示す。図13のレーンは左から、HVJを感染させていない上記キメラGFP−Fタンパク質発現ベクター導入細胞(F−GFP(細胞))、該導入細胞の培養上清(F−GFP(培養上清))、該導入細胞に野生型のHVJを感染させた後その上清から回収されたウイルス(F−GFP+HVJ)、遺伝子導入していないLLC−MK2細胞に野生型HVJを感染させた培養上清から回収されたウイルス(HVJ(LLC−MK2細胞で生産))、およびコントロールとして鶏卵で産生させて精製したHVJである。
図13より、該導入細胞に野生型のHVJを感染させた後その上清から回収されたウイルスは、GFPが検出された。さらに、Fタンパク質の細胞外ドメインを認識する抗体でウェスタンブロットを行ったところ、上記ウイルスでもFタンパク質が検出され、該抗体はキメラGFP−Fタンパク質は認識しないことから、該ウイルスは、野生型とキメラの両方のFタンパク質を発現していることがわかった。さらに、HNタンパク質も発現していた。
(4)scFv融合キメラFタンパク質発現ベクターの作製
上記の結果から、表皮基底層に発現するデスモグレイン(desmogrein)3タンパク質を認識する単鎖抗体(mDsg3−scFv)を用いて、表記基底層ターゲティングHVJの作製を試みた(図14)。デスモグレイン3タンパク質を認識する単鎖抗体のcDNAは配列番号17に示している。これは、pCANTAB5−AK7/scFv(慶應大学医学部皮膚科天谷教授より供与)を鋳型に、
Dsg3−scFv−AgeI−f:5’−TATGGCGGACTACAAAGATATTGTGTTAAC−3’(配列番号18)および
Dsg3−scFv−EcoNI−r:5’−AGGAGACTGTGAGAGTG−3’(配列番号19)
のプライマー対を用いて、PCRで増幅することによって得た。
これを、先述のpCY4B−FmutのAgeI−EcoNI部位に挿入し、さらに検出を容易にするためにC末端にMyc−Tagが付くようにDNAを設計した
(pCAGIpuro−Dsg3−scFv−F)。
(5)恒常的遺伝子導入細胞(stable transformant)の作製
5×106個のLLCMK2細胞を、235μLのMinimum Esential Medium培地(GIBCO)に懸濁した。pCAGIpuro−Dsg3−scFv−F 15μgを、15μlのPBSに溶解した。細胞とDNAを混合し、Gene Pulser Cuvette(BIO−RAD)内でGENE PULSERII(BIO−RAD)を用いて250V、975μFでエレクトロポレーションを行った後、100μLずつ10cmディッシュに分注した。10mL MEMに対し90μg puromycin(ナカライテスク)を加え37℃で培養し、プラスミドDNAの挿入された細胞を選択した。
選択された細胞を、抗Myc抗体で染色したところ、細胞膜上にキメラDsg3−scF−Fタンパク質が局在していた(図15)。またウェスタンブロットによっても該キメラタンパク質のサイズの位置にバンドが確認された。
(6)Dsg3−scFv−Fキメラ分子を持つHVJの産生
次いで、キメラDsg3−scFv−Fタンパク質を持つHVJの産生を試みた。
15cmディッシュにstable formant LLCMK2細胞がconfluent状態で、MOI=0.4でHVJを感染させた。MEM(P/S)で48時間培養後、上清を回収し遠心(440g、5分間)により細胞を除去しさらに上清を遠心(100000g、2時間)し、得られたHVJペレットをPBSで洗浄後、適当量に懸濁した。
得られたウイルスを抗Myc−tag抗体によるウェスタンブロット(図16左図:Myc)、およびFタンパク質の膜貫通ドメインを認識する抗体によるウェスタンブロット(図16中図:TMD)に供したところ、所定のサイズにバンドが検出され、キメラタンパク質が確認された。
さらに、抗Myc抗体にて染色した該ウイルスを電子顕微鏡により観察した。
100HAUのHVJを4μLのMilliQに懸濁し、電顕用グリッドに滴下して乾燥させた。3.7%ホルムアルデヒドで4℃、15分間固定し、PBSで3回洗浄し、0.5%Triton−Xで3分間インキュベーション後、再びPBSで3回洗浄した。1次抗体;Anti−Myc−tag(MBL)1:100で室温、1時間インキュベーションした。PBSで3回洗浄後、PBSで1:100希釈したRabbit anti−Mouse IgG−Gold Colloidal Particles−10nm(EY RABORATORIES)で室温、1時間インキュベーションし、uraniumacetateで染色後、電子顕微鏡により観察した(図16右図)。ウイルス表面にキメラタンパク質が染色された黒点が確認された。
(7)ELISAによるDsg3−scFv−F−HVJのDsg3親和性検討
次に、デスモグレイン3を認識するscFVを持つ変異HVJのデスモグレイン3への結合をELISAで測定した。ELISAの方法は、以下のとおりである。
50μLのassay diluent(MESACUPデスモグレインテスト:MBL)に各濃度のHVJウイルスサンプルが含まれるように調製し、あらかじめmDsg3を固相化した96wellプレート(慶應大学皮膚科天谷教授より供与)にアプライした。室温で1時間インキュベート後wash buffer(MESACUPデスモグレインテスト:MBL)で4回洗浄し、1:10希釈したf236で室温1時間インキュベーションした。Wash bufferで4回洗浄し、conjugate diluent(MESACUPデスモグレインテスト:MBL)で1:9000希釈したhorseradish peroxidase−conjugate anti−mouse secondary antibodies(Amersham Pharmacia)で室温1時間インキュベーションし、substrate solution(MESACUPデスモグレインテスト:MBL)で10分間反応後、stop solution(MESACUPデスモグレインテスト:MBL)で反応を停止させた。Mithras LB940(BERTHOLD)で450nmの吸光度を測定した。
図17に示すように、キメラ分子を有するHVJでは野生型HVJに比べて、有意に結合が増強されていた。
(8)培養細胞へのHVJ感染実験
該キメラタンパク質を有するHVJの培養細胞への感染を試験した。
6wellプレートにカバーガラス(IWAKI)をしき、3×105のLLCMK2、5×105のPAM、または3×105のNIH3T3を播種した。翌日、終濃度4μg/mL Trypsinで37℃、30分間処理したウイルスサンプル(細胞由来野生型HVJ及びキメラHVJ)をMOI=0.6となるようにOpti−MEMで希釈し、各細胞にアプライ後5分間感染させた。PBSで2回洗浄後、D−MEM及びMEMで24時間培養後、f236にて免疫染色した。
図18にその結果を示す。試験した3種の細胞中、マウスケラチノサイト由来のPAM細胞のみで、キメラFタンパク質が野生型に比べて多く発現していた。
(9)器官培養のキメラHVJの感染実験
さらに、マウスの表皮組織への感染を試験した。この試験には、表皮組織の分離が容易であることから、7型コラーゲンノックアウトマウスを用いた。このマウスは、腹部皮膚に水泡があるため、表皮と真皮が分離しやすい。
出生直後の7型コラーゲンノックアウトマウスの水疱部分皮膚を切除し、D−MEMで満たした10cmディッシュ上で器官培養した。Trypsin処理したウイルスサンプル((8)参照)を5×105particles/100μL Opti−MEMとなるように調製し、水疱内に注入。37℃、5分間感染後、表皮と真皮を剥がしPBSで洗浄しD−MEMで培養した。24時間後にPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで固定した後ウイルスのゲノム由来Fタンパク質をf236で免疫染色した。
その結果、図19に示すように、キメラHVJの方が、野生型HVJより有意に表皮細胞に検出された。さらに、組織切片を同様に染色したところ、該キメラタンパク質の発現は、表皮規定細胞に限定的に局在していることがわかった(図20)。
[実施例3]
(1)ウイルス粒子表面にトランスフェリンが提示され、且つHNタンパク質の発現が低減したHVJの作製
図21に示すように、HVJのFタンパク質をコードする遺伝子を改変し、発現プラスミドpCY4Bに挿入した。Fタンパク質の膜貫通ドメイン(TMD)のN末端側にヒトトランスフェリンが連結された該TMDとヒトトランスフェリンとの融合タンパク質を発現するように組換えpCY4Bを構築した。ヒトトランスフェリンのcDNAを配列番号22に示す。この際、その後の解析に便利なようにmycタグが融合タンパク質のN末端につくように挿入部位を設計した。ここで挿入した融合タンパク質の配列を、配列番号25に示す。
配列番号25で示されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号1〜29は、HVJ由来Fタンパク質のシグナル配列に、アミノ酸番号30〜39は、mycタグに、アミノ酸番号40〜718は、ヒトトランスフェリンのアミノ酸配列に、アミノ酸番号719〜797は、HVJ由来Fタンパク質の膜貫通ドメインのアミノ酸配列に、それぞれ相当する。
このmycタグつきFタンパク質TMDおよびヒトトランスフェリン融合タンパク質(F/Tf)発現pCY4BをLLCMK2細胞に導入して、F/Tfタンパク質を恒常的に産生する恒常的形質転換細胞を単離した。
該形質転換細胞に野生型HVJを感染させて複製させることにより、該細胞から産生されて細胞外に放出されるHVJウイルス粒子は、その表面にはネイティブなFタンパク質の他にF/Tfを有しており(F/Tfキメラウイルス)、トランスフェリン部分が粒子外に提示されることとなる(図22)。
さらに、該細胞の産生するHVJウイルスのHNタンパク質を欠損させるために、実施例1に示した方法と同様にHN遺伝子の発現をsiRNA法により抑制した。
このようにして、産生させたウイルスは、ウイルス粒子表面にトランスフェリンが提示され、さらにHNタンパク質の発現が顕著に低減もしくは完全に欠失することとなる。
実際に、該細胞から産生されたウイルスを培地から回収し、常法にしたがって抗HN抗体によるウェスタンブロットに供したところ、siRNA処理をした細胞から回収したウイルスではHNタンパク質は検出されず、HNタンパク質が欠損していた(図23、上のパネル)。
さらに、常法に従って抗myc抗体でのウェスタンブロットに供したところ、F/Tf発現pCY4Bで形質転換したLLCMK2細胞で産生されたHVJウイルスは、期待した通り、抗myc抗体陽性のタンパク質を発現しているのに対し、ネガティブコントロールである野生型LLCMK2細胞で産生させたHVJウイルスでは抗myc抗体陽性のタンパク質は検出されなかった(図23、下のパネル)。
この結果から、F/Tf発現pCY4Bで形質転換したLLCMK2細胞で産生されたHVJウイルスはF/Tfタンパク質を有していることが示された。
(2)培養細胞へのHVJ感染実験
続いて、(1)で産生されたウイルスの感染能力を調べた。
HNタンパク質が欠損したHVJ(HN欠損HVJ)およびHNタンパク質が欠損した上にF/Tfを有するHVJ(F/Tf−HN欠損HVJ)をそれぞれ、非癌細胞であるHEK293細胞に0.05MOIまたは0.4MOIで感染させ、Fタンパク質の発現を抗Fタンパク質抗体で検出した。その結果、いずれのHVJを感染させた場合でも、Fタンパク質ポジティブの細胞は非常に少数の細胞でしか観察されなかった(図24)。
一方、ヒト子宮頚部癌由来Hela細胞に同様に感染させたところ(図25)、F/Tf−HN欠損HVJを感染させた細胞(下のパネル)では、HNタンパク質が欠損しただけでF/Tfを有していないHN欠損HVJ(上のパネル)に比べて、細胞表面にFタンパク質を有する細胞が顕著に多かった。このFタンパク質陽性細胞をカウントしてグラフに示す(図26)。
これらの結果から、HNタンパク質が欠損されてF/Tfを有するF/Tf−HN欠損HVJウイルスは、癌細胞に特異的に感染することがわかった。
(3)トランスフェリン依存性の確認
F/Tf−HN欠損HVJウイルスの癌細胞への感染力の強さが、F/Tfタンパク質が含有するトランスフェリン部分に依存していることを証明するために、トランスフェリン(200μg/ml)存在下で、Tf−HN欠損HVJを0.05MOIでHela細胞に感染させた。その結果、Tf存在下では、Tf非存在下に比べて、Fタンパク質陽性細胞が明らかに減少しており(図27下のパネル、および図28)、トランスフェリンの存在によりF/Tf−HN欠損HVJの感染が阻害されたことが示された。
この結果から、F/Tf−HN欠損HVJの癌細胞への感染力が、F/Tfタンパク質のトランスフェリンに依存していることが示された。
(4)Qdot(登録商標)蛍光粒子を用いたin vivo癌特異的送達試験
F/Tf−HN欠損HVJのゲノムを失活させたF/Tf−HN欠損HVJエンベロープによるin vivoにおける癌細胞特異的なターゲティングを試験した。F/Tf−HN欠損HVJを、UV照射によりゲノムを失活させてF/Tf−HN欠損HVJエンベロープを作製した。これを1000HAU/200μl・PBSに懸濁し、Qdot(登録商標)605ITK(商標)Carboxyl Quantum Dotを最終濃度1μMになるように添加してエレクトロポレーション(250V、950μF)に供し、Qdot(登録商標)蛍光粒子をエンベロープ中に封入した。エレクトロポレーション後すぐに、DMEM 1mlを添加し、軽く遠心し、凝集粒子を除去した後、20400×gで15分高速遠心して、そのペレットを回収し、500μlの生理的食塩水に懸濁した。得られたQdot封入HVJエンベロープをHela細胞培養液中に添加した。これを蛍光検出したところ、細胞膜上にQdotによる蛍光が認められ(データ示さず)、細胞表面にHVJ−Eが吸着していることが示された。
このQdot封入F/Tf−HN欠損HVJ−エンベロープを用いて、in vivoにおけるF/Tf−HN欠損HVJ−エンベロープの癌特異的なターゲティングを調べた。
ヌードマウスにHela細胞(5×106)を皮下注射により移植し、癌組織が直径7〜8mmにまでなったら、Qdot封入F/Tf−HN欠損HVJ−エンベロープ500HAUを尾静脈に注射した。48時間後、マウスをパラホルムアルデヒドで固定し、Qdotの分布を精査した。Qdot封入F/Tf−HN欠損HVJ−エンベロープを注射したマウスの移植癌組織にのみQdotによる蛍光が認められ、F/Tfタンパク質を有していないQdot封入HN欠損HVJ−エンベロープを注射した場合では癌組織に蛍光は認められなかった。癌組織を蛍光顕微鏡にて観察し、一つの視野内のQdot陽性細胞を数えた結果を図29に示す。HVJ−Eを用いず、Qdotのみを注射した場合(Q only)およびF/Tfタンパク質を有していないQdot封入HN欠損HVJ−エンベロープを用いた場合(W1〜3)に比べて、F/Tf−HN欠損HVJ−エンベロープを用いた場合は約30倍以上のQdot陽性細胞が認められた。
この結果から、F/Tf−HN欠損HVJ−エンベロープが癌に特異的にターゲティングされることが示唆された。
また、本発明のキメラタンパク質もしくはタンパク質コンジュゲートを有するパラミクソウイルスは、組織・細胞特異性が高く、薬剤を部位特異的に送達しうるベクターとして有用である。また、他の融合タンパク質を欠損させることにより、さらに特異性の高いウイルスベクターとすることも可能であり、疾病治療への応用が期待される。また、本発明のターゲティングパラミクソウイルスの作製方法によれば、簡便かつ安定して該ターゲティングパラミクソウイルスを得ることができる。
本出願は日本で出願された特願2005−338449(出願日:2005年11月24日)及び特願2005−339474(出願日:2005年11月24日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
[配列表]
Claims (14)
- 野生型に比べてHNタンパク質が低減または欠損されていることを特徴とする改変HVJを作製する方法であって、以下のステップ:
(1)HVJのHNタンパク質の発現を抑制する、HVJのHNタンパク質をコードするmRNAに対するsiRNAを動物細胞に導入するステップ、
(2)HVJを該細胞に感染させるステップ、および
(3)該細胞で複製されるHVJ粒子を単離するステップ、
を含む、上記方法。 - 該siRNAが、配列番号3、4および5に示すヌクレオチド配列からなる群より選択される配列からなるHVJのHN mRNAを標的とするものである、請求項1に記載の方法。
- 該siRNAが、配列番号3に示すヌクレオチド配列からなるHVJのHN mRNAを標的とするものである、請求項2に記載の方法。
- (4)HVJ由来のFタンパク質の膜貫通ドメインのN末端側に、0〜30残基からなるリンカーペプチド、さらにそのN末端に所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが連結されている、キメラタンパク質をコードする核酸を、前記の動物細胞の細胞膜上に該キメラタンパク質を発現させ得る形態で該細胞に導入するステップ
を更に含み、
該改変HVJが、該キメラタンパク質を有し、かつ該キメラタンパク質中の該所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドをウイルス粒子表面に提示することを更なる特徴とする、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 該膜貫通ドメインが、以下の(1)〜(4)のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項4に記載の方法。
(1)配列番号11に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号490〜565で示されるアミノ酸配列
(2)配列番号11に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号490〜565で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有するアミノ酸配列
(3)配列番号11に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号487〜565で示されるアミノ酸配列
(4)配列番号11に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号487〜565で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、膜貫通ドメインとしての機能を有するアミノ酸配列 - 該核酸が該動物細胞で機能し得るプロモーターの制御下に置かれ、かつHVJ由来のFタンパク質由来のシグナルペプチド、および該細胞で機能し得るシグナルペプチドからなる群より選択されるシグナルペプチドをコードする核酸が付加された形態である、請求項4または5に記載の方法。
- 該核酸がHVJ由来のFタンパク質由来のシグナルペプチドをコードする核酸が付加された形態であって、該シグナルペプチドが、以下の(1)〜(4)のいずれかのアミノ酸配列からなる、請求項6に記載の方法。
(1)配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜25で示されるアミノ酸配列
(2)配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜25で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、シグナルペプチドとしての機能を有するアミノ酸配列
(3)配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜29で示されるアミノ酸配列
(4)配列番号11に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号1〜29で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、シグナルペプチドとしての機能を有するアミノ酸配列 - 該所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドが該分子に対する単鎖抗体である、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 該単鎖抗体がデスモグレイン3に対する抗体である、請求項8に記載の方法。
- 該キメラタンパク質が以下の(1)または(2)のいずれかである、請求項9に記載の方法。
(1)配列番号21に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
(2)配列番号21に示すアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、シグナルペプチド部分がプロセシングにより切断されてウイルス粒子に取り込まれた場合、その粒子表面に存在してデスモグレイン3に結合することができる、タンパク質 - 該所望の細胞表面分子に特異的に結合し得るペプチドがトランスフェリンである、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 該キメラタンパク質が以下の(1)または(2)のいずれかである、請求項11に記載の方法。
(1)配列番号25に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号40〜797で示されるアミノ酸配列
(2)配列番号25に示すアミノ酸配列中アミノ酸番号40〜797で示されるアミノ酸配列において1もしくは複数のアミノ酸の置換および/または欠失および/または挿入および/または付加を含み、かつ、ウイルス粒子に取り込まれた場合、その粒子表面に存在して細胞膜上に発現されてトランスフェリン受容体と結合する機能を有するアミノ酸配列 - 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法により得られた、改変HVJ。
- 請求項13に記載の改変HVJから調製される、改変HVJエンベロープベクター。
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EP2345415B1 (en) * | 2008-09-16 | 2015-01-21 | GenomIdea Inc. | Therapeutic/prophylactic agent for prostate cancer |
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08508648A (ja) * | 1993-04-08 | 1996-09-17 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 高等真核細胞へ外来dnaを導入するためのアデノウイルス |
JP2001286282A (ja) * | 2000-02-02 | 2001-10-16 | Japan Science & Technology Corp | 遺伝子導入のためのウイルスエンベロープベクター |
JP2001522871A (ja) * | 1997-11-19 | 2001-11-20 | ジョージタウン・ユニバーシティ | 標的化リポゾーム遺伝子送達 |
JP2002514892A (ja) * | 1995-06-08 | 2002-05-21 | コブラ セラピューティクス リミテッド | 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用 |
JP2004329222A (ja) * | 1999-05-18 | 2004-11-25 | Dnavec Research Inc | エンベロープ遺伝子欠損パラミクソ科ウイルスベクター |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE245703T1 (de) | 1992-09-22 | 2003-08-15 | Biofocus Discovery Ltd | Rekombinante viren, die an ihrer äusseren oberfläche ein nichtvirales polypeptid präsentieren |
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US5962274A (en) * | 1998-03-13 | 1999-10-05 | Wake Forest University | Viral vector directed to predetermined target cells |
CA2341356C (en) | 2000-04-14 | 2011-10-11 | Transgene S.A. | Poxvirus with targeted infection specificity |
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH08508648A (ja) * | 1993-04-08 | 1996-09-17 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 高等真核細胞へ外来dnaを導入するためのアデノウイルス |
JP2002514892A (ja) * | 1995-06-08 | 2002-05-21 | コブラ セラピューティクス リミテッド | 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用 |
JP2001522871A (ja) * | 1997-11-19 | 2001-11-20 | ジョージタウン・ユニバーシティ | 標的化リポゾーム遺伝子送達 |
JP2004329222A (ja) * | 1999-05-18 | 2004-11-25 | Dnavec Research Inc | エンベロープ遺伝子欠損パラミクソ科ウイルスベクター |
JP2001286282A (ja) * | 2000-02-02 | 2001-10-16 | Japan Science & Technology Corp | 遺伝子導入のためのウイルスエンベロープベクター |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6012013452; Journal of Virology vol.79, 200508, p.10467-10477 * |
JPN6012013453; Virus Research vol.102, 2004, p.27-35 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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EP1947181A4 (en) | 2010-09-22 |
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US7858356B2 (en) | 2010-12-28 |
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