JP2001286282A - 遺伝子導入のためのウイルスエンベロープベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ウイルスエンベロープを使用する、安全、安
定、かつ広範囲の生体内組織に遺伝子導入可能な、高遺
伝子導入活性を有する遺伝子導入ベクターが必要とされ
る。 【解決手段】 ウイルスエンベロープに対して、凍結融
解処理または界面活性剤との混合によって、外来遺伝子
を導入し、遺伝子導入ベクターを調製する。この遺伝子
導入ベクターを含む遺伝子治療のための薬学的組成物、
この遺伝子導入ベクターを含むキット、およびこの遺伝
子導入ベクターを用いた遺伝子導入方法もまた提供され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インビトロおよび
生体内での遺伝子導入のための安全かつ高効率のベクタ
ーに関する。特に、本発明は、ウイルス、不活性化ウイ
ルス、特に不活性化ＨＶＪ（センダイウイルス）を用い
て調製する遺伝子導入ベクターに関する。また、本明細
書の遺伝子導入ベクターは、遺伝子治療および高スルー
プットスクリーニングにも使用され得る。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子治療のために、遺伝子導入のため
の多くのウイルスおよび非ウイルス（合成）法が開発さ
れている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６
０、９２６〜９３２（１９９３）およびＬｅｄｌｅｙ、
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、第６巻、１１
２９〜１１４４（１９９５））。一般に、細胞への遺伝
子送達のために、ウイルス法は、非ウイルス法より効果
的である。しかし、ウイルスベクターは、親ウイルスか
らの必須遺伝子要素の同時導入、ウイルス遺伝子のリー
キーな発現、免疫原性、および宿主ゲノム構造の改変の
ため安全性での問題を生じ得る。一般に、非ウイルスベ
クターは、細胞傷害性および免疫原性がより少ない。し
かし、大部分の非ウイルス法は、ウイルスベクターのい
くつかに比べ、特に生体内への遺伝子導入効率はより悪
い。

【０００３】従って、ウイルスおよび非ウイルスベクタ
ーの両方は、制限とともに長所を持っている。それ故、
高効率および低毒性を持つ生体内への遺伝子導入ベクタ
ーを開発することで、１つのタイプのベクターシステム
の制限を、別のタイプのシステムの有利な点を導入する
ことにより補償すべきである。

【０００４】一方、ＨＶＪは免疫原性が高く、特にＮＰ
タンパク質が大量に産生されるとＣＴＬを誘導すること
が知られている（Ｃｏｌｅ、Ｇ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ １５８、４３０１〜４３０９（１９９
７））。また宿主のタンパク質合成が阻害される懸念も
ある。

【０００５】ＨＶＪについて、ウイルス融合タンパク質
を遠心やカラム操作で融合タンパク質を精製して脂質膜
に再構成する方法で作成された粒子は、再構成させるこ
とによってウイルスの持つ他のタンパク質（主としてＭ
タンパク質）が失われることにより、融合活性に必要な
ＦｌとＨＮタンパク質の比率が野生型のウイルスと同様
には保たれないために、融合活性が低くなるという欠点
もある。また再構成したときに融合タンパク質が脂質膜
に挿入される方向性が野生型ウイルスと同様であるとは
限らないために未知の抗原提示がなされる可能性もあ
る。

【０００６】また、新たな分子を加えて再構成する方法
も報告されているが（Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｂｉｏｌ．８０、１０〜２０、１９７９）、この
方法では完成粒子の膜組成は本来のウイルス粒子とは大
きく異なるために本来のウイルス機能が喪失される危険
性は大きい。

【０００７】従来のＨＶＪ−リポソームに代表されるよ
うに遺伝子やタンパク質をリポソームに封入し、これと
不活性化ＨＶＪを融合して作成される融合粒子を用いる
方法は、培養細胞や生体組織への非侵襲の遺伝子導入を
可能とし、世界的にもこの手法が動物実験レベルでは頻
用されるようになった（Ｄｚａｕ，Ｖ．Ｊ．ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１１
４２１〜１１４２５（１９９６）およびＫａｎｅｄａ，
Ｙ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏ
ｄａｙ、５、２９８〜３０３（１９９９））。しかしウ
イルスとリポソームという２つの異なるベシクルを準備
する必要があり手法が複雑であること、リポソームと融
合することによってウイルス粒子より平均直径が１．３
倍大きくなった粒子は融合活性がウイルスの１０％以下
に落ちてしまうことなどの欠点も合わせ持つことがわか
った。

【０００８】さらに、従来のＨＶＪに基づくベクターで
は、遺伝子導入が不可能な組織や極めて効率の低い組織
も存在した。このことは、従来法に基づく遺伝子治療の
対象となる組織を限定し得ることを示す。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】ヒト遺伝子治療のため
に、安全、高効率かつ簡便に調製でき、かつ広範囲の生
体内組織に対して遺伝子導入が可能なウイルスベクター
の開発が望まれている。

【００１０】従って、本発明の目的は、従来の再構成Ｈ
ＶＪベクター法またはＨＶＪ−リポソーム法の欠点を克
服し、広範囲の培養細胞や生体組織に対する、安全、高
効率かつ簡便なウイルスベースの遺伝子導入ベクターを
開発することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明の１つの局面にお
いて、不活性化ウイルスを使用する安全かつ高効率な遺
伝子導入ベクターが提供される。ウイルスのゲノムが不
活性化されている不活性化ウイルスでは、ウイルスタン
パク質の複製がないため安全で細胞毒性・抗原性も低
い。不活性化ウイルスを用いる遺伝子導入ベクターであ
るウイルスエンベロープベクター中に遺伝子を封入する
ことにより、培養細胞や生体組織に対する、安全、高効
率かつ簡便な遺伝子導入ベクターが調製される。

【００１２】本発明のさらなる局面において、広範囲の
生体内組織に遺伝子導入が可能であるウイルスエンベロ
ープベクターが提供される。１つの実施態様において、
使用されるウイルスは、ＨＶＪである。本発明のウイル
スエンベロープベクターによって生体内で遺伝子導入さ
れる組織としては、肝臓、骨格筋、子宮、脳、眼部、頚
動脈、皮膚、血管、肺、心臓、腎臓、脾臓、癌組織、神
経、Ｂリンパ球、および呼吸器官の組織が挙げられる
が、これらに限定されない。

【００１３】本発明の別の局面において、浮遊細胞に簡
便に遺伝子導入する方法が提供される。本発明のウイル
スエンベロープベクターを使用する、好ましい浮遊細胞
への遺伝子導入方法としては、浮遊細胞とウイルスエン
ベロープベクターとを硫酸プロタミン存在下で混合する
工程、およびその混合液に遠心力を加える工程を包含す
る、遺伝子導入方法が挙げられる。

【００１４】本発明の１つの局面において、本発明の遺
伝子導入ベクターを用いて、大量の遺伝子を短時間で封
入することによる、高効率で迅速な培養細胞及び生体組
織への遺伝子導入が可能となる。従って、本発明のさら
なる局面において、本発明の遺伝子導入ベクターを用い
るゲノムの高スループットの大量迅速解析システムが可
能となる。

【００１５】本発明の特定の局面において、遺伝子導入
ベクターは、−２０℃で凍結した状態で長期間（少なく
とも２〜３ヶ月以上）の保存が可能である。そしてこの
遺伝子導入ベクターは、例えば凍結状態で密封し、貯蔵
し、輸送することができる。

【００１６】本発明の別の局面において、インビトロに
おいて好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以
上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは
９５％以上の細胞に遺伝子導入活性を有する遺伝子導入
ベクターが提供される。

【００１７】本発明のある局面において、不活性化ウイ
ルスの調製の２ヶ月後に遺伝子導入ベクターであるウイ
ルスエンベロープベクターを形成した場合に、６０％以
上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以
上、最も好ましくは９０％以上の遺伝子導入活性を保持
する遺伝子導入ベクターが提供される。

【００１８】本発明の別の局面において、生体内での局
所投与において好ましくは３０％以上、より好ましくは
４０％以上、さらにより好ましくは５０％以上、最も好
ましくは６０％以上の組織中の細胞に対して遺伝子導入
活性を有する遺伝子導入ベクターが提供される。

【００１９】本発明の局面において、不活性化ウイルス
エンベロープを含む遺伝子導入ベクターが提供される。

【００２０】本発明の１つの局面において、遺伝子導入
ベクターの調製のために使用されるウイルスは、野生型
ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよ
い。

【００２１】本発明のさらなる局面において、使用され
るウイルスは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コ
ロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイル
ス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラ
ブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイル
ス科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科
からなる群から選択される科に属するウイルスである。
また、本発明の特定の局面において、使用されるウイル
スは、ＨＶＪである。また、本発明のさらなる局面にお
いて、Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７８、２８１３
〜２８２０（１９９７））またはＹｏｎｅｍｉｔｓｕ，
Ｙ．ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１８、９７０〜９７３（２０００））に記載される組換
え型センダイウイルスを用いて、遺伝子導入ベクターが
調製される。

【００２２】本発明の別の局面において、動物生体内の
組織に遺伝子導入するための遺伝子導入ベクターが提供
される。

【００２３】本発明の遺伝子導入ベクターを調製する方
法において、ウイルスを不活性化する工程は必ずしも必
要ではない。従って、本発明の１つの局面において、ウ
イルスを不活性化する工程を行わずに、 １）ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および ２）この混合液を凍結融解するか、もしくはこの混合液
を、さらに界面活性剤と混合する工程、を包含する方法
によって遺伝子導入ベクターを作成し得る。

【００２４】本発明の別の局面において、遺伝子導入の
ための不活性化ウイルスエンベロープベクターの調製方
法であって、以下；ウイルスを不活性化する工程、不活
性化ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および混合
液を凍結融解する工程、を包含する、方法が提供され
る。

【００２５】本発明のさらなる局面において、遺伝子導
入のための不活性化ウイルスエンベロープベクターの調
製方法であって、以下；ウイルスを不活性化する工程、
および不活性化ウイルスを界面活性剤の存在下で外来遺
伝子と混合する工程、を包含する、方法が提供される。

【００２６】本発明のさらなる局面において、使用され
る界面活性剤は、オクチルグルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ−
Ｘ１００、ＣＨＡＰＳおよびＮＰ−４０からなる群から
選択される。

【００２７】本発明の特定の局面において、不活性化ウ
イルスエンベロープとの混合前に、硫酸プロタミンを外
来遺伝子に添加する工程をさらに包含する、不活性化ウ
イルスエンベロープベクターの調製方法が提供される。

【００２８】本発明のさらなる局面において、単離され
た動物組織に遺伝子を導入する方法であって、以下；所
望の遺伝子を含有する遺伝子導入ベクターを調製する工
程、遺伝子導入ベクターによって、該動物組織に遺伝子
を導入する工程、を包含する、方法が提供される。

【００２９】本発明の別の局面において、浮遊細胞に外
来遺伝子を導入する方法が提供され、この方法は、以
下：浮遊細胞と遺伝子導入ベクターとを、硫酸プロタミ
ン存在下で混合する工程、混合液を遠心する工程を包含
する。

【００３０】本発明のさらに別の局面において、本発明
の遺伝子導入ベクターを含有する、遺伝子治療のための
薬学的組成物が提供される。

【００３１】

【発明の実施の形態】（定義）本明細書で使用される場
合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにお
いて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の
遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機
能を維持するように、導入することをいう。本発明にお
いて導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列
を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログで
ある核酸を包含する。また、本明細書において使用され
る場合、遺伝子導入、トランスフェクション、およびト
ランスフェクトは、互換可能に使用される。

【００３２】本明細書で使用される場合、「遺伝子導入
ベクター」、「遺伝子ベクター」または「ウイルスエン
ベロープベクター」とは、ウイルスエンベロープ中に外
来遺伝子を封入したベクターをいう。遺伝子導入ベクタ
ーの調製のために使用されるウイルスとしては、野生型
ウイルスであっても、組換え型ウイルスであってもよ
い。

【００３３】本発明の１つの局面において、使用される
ウイルスは、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロ
ナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス
科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブ
ドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス
科、バキュロウイルス科、およびヘパドナウイルス科か
らなる群から選択される科に属するウイルスである。ま
た、本発明の特定の局面において、使用されるウイルス
は、ＨＶＪである。

【００３４】本明細書で使用される場合、「遺伝子導入
活性」とは、ベクターによる「遺伝子導入」の活性をい
い、導入された遺伝子の機能（例えば、発現ベクターの
場合、コードされるタンパク質の発現および／またはそ
のタンパク質の活性など）を指標として検出され得る。

【００３５】本明細書で使用される場合、「不活性化」
とは、ゲノムを不活性化したウイルスをいう。この不活
性化ウイルスは、複製欠損である。好ましくは、この不
活性化は、ＵＶ処理またはアルキル化剤による処理によ
って、なされる。

【００３６】本明細書で使用される場合、「外来遺伝
子」とは、遺伝子導入ベクター内に含まれる、ウイルス
以外の起源の核酸配列をいう。本発明の１つの局面にお
いて、この外来遺伝子は、遺伝子導入ベクターによって
導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例
えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ター
ミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳
に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドン
など）と作動可能に連結される。本発明の別の局面にお
いて、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調
節配列を含まない。本発明のさらなる局面において、外
来遺伝子は、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸であ
る。

【００３７】遺伝子導入ベクター内に含まれる外来遺伝
子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子である
が、導入される核酸分子は、核酸アナログ分子を含んで
もよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単
一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子
種であってもよい。

【００３８】本明細書で使用される場合、「遺伝子ライ
ブラリー」とは、天然より単離された核酸配列または合
成の核酸配列を含む、核酸ライブラリーである。天然よ
り単離された核酸配列の供給源としては、真核生物細
胞、原核生物細胞、またはウイルス由来の、ゲノム配
列、ｃＤＮＡ配列が挙げられるが、これらに限定されな
い。天然より単離された配列に、任意の配列（例えば、
シグナル、タグなど）を付加したライブラリーもまた、
本発明の遺伝子ライブラリーに含まれる。１つの実施態
様において、遺伝子ライブラリーは、その中に含まれる
核酸配列の、転写および／または翻訳をもたらすプロモ
ーターなどの配列を含む。

【００３９】本明細書において、「ＨＶＪ」および「セ
ンダイウイルス」は、互換可能に用いられ得る。

【００４０】本明細書において、「ＨＡＵ」とは、ニワ
トリ赤血球０．５％を凝集可能なウイルスの活性をい
い、１ ＨＡＵは、ほぼ２４００万ウイルス粒子に相当
する（Ｏｋａｄａ，Ｙ．ら、Ｂｉｋｅｎ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ４、２０９〜２１３、１９６１）。

【００４１】（遺伝子治療）治療的な核酸構築物は、本
発明の遺伝子導入ベクターを用いて局所的にまたは全身
的にのいずれかで投与され得る。そのような核酸構築物
がタンパク質のコード配列を包含する場合、そのタンパ
ク質の発現は、内因性の哺乳類のプロモーターまたは異
種のプロモーターの使用により誘導され得る。コード配
列の発現は、構成的であり得るか、または調節され得
る。

【００４２】本発明の遺伝子導入ベクターを遺伝子治療
のための組成物として使用する場合、本発明のベクター
の投与は、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）または生
理食塩水などに懸濁したベクター懸濁液の局所（例え
ば、癌組織内、肝臓内、筋肉内および脳内など）への直
接注入か、または血管内（例えば、動脈内、静脈内およ
び門脈内）への投与によりなされる。

【００４３】１つの実施態様において、遺伝子導入ベク
ターは、一般には、この遺伝子導入ベクターを単位用量
注入可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学
的に受容可能なキャリア（すなわち、使用された投薬量
および濃度においてレシピエントに対して非毒性であ
り、そして処方物の他の成分と適合性であるもの）とを
混合することによって処方され得る。例えば、処方物
は、好ましくは、酸化剤および遺伝子導入ベクターにと
って有害であることが公知である他の化合物を含まな
い。

【００４４】キャリアは、等張性および化学的安定性を
増強する物質のような微量の添加物を適宜含む。このよ
うな物質は、使用された投薬量および濃度においてレシ
ピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン
酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの
塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；
低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、
ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例
えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブ
リン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリド
ン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、ア
スパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖および
他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコー
ス、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレー
ト剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マ
ンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、
ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤
（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、またはＰ
ＥＧを含み得る。

【００４５】遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物
は、代表的には、単位または多用量容器、例えば、密封
アンプルまたはバイアルにおいて、水溶液として貯蔵さ
れ得る。

【００４６】本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１
以上の成分を満たした１以上の容器を含む薬学的パック
またはキットを提供する。さらに、本発明のポリペプチ
ドは、他の治療化合物とともに使用され得る。

【００４７】本発明の遺伝子導入ベクターを含む薬学的
組成物は医療実施基準（ｇｏｏｄｍｅｄｉｃａｌ ｐｒ
ａｃｔｉｃｅ）に一致した様式で、個々の患者の臨床状
態（例えば、予防または処置されるべき状態）、遺伝子
導入ベクターを含む組成物の送達部位、標的組織、投与
方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮し
つつ処方され、そして投与される。従って、本明細書の
遺伝子導入ベクターの「有効量」または適切な投与量
は、このような考慮事項によって決定される。

【００４８】例えば、マウスに本発明の遺伝子ベクター
を投与する場合、マウス一匹あたり、２０〜２０，００
０ＨＡＵ相当の、好ましくは６０〜６，０００ＨＡＵ相
当の、より好ましくは２００〜２，０００ＨＡＵ相当の
遺伝子ベクターが投与される。投与される遺伝子ベクタ
ー中に含有される外来遺伝子の量は、マウス一匹あた
り、０．１〜１００μｇ、好ましくは０．３〜３０μ
ｇ、より好ましくは１〜１０μｇである。

【００４９】また、ヒトに本発明の遺伝子ベクターを投
与する場合、被験体あたり、４００〜４００，０００Ｈ
ＡＵ相当の、好ましくは１，２００〜１２０，０００Ｈ
ＡＵ相当の、より好ましくは４，０００〜４０，０００
ＨＡＵ相当の遺伝子ベクターが投与される。投与される
遺伝子ベクター中に含有される外来遺伝子の量は、被験
体あたり、２〜２，０００μｇ、好ましくは６〜６００
μｇ、より好ましくは２０〜２００μｇである。

【００５０】以下の実施例は、例示であって、本発明を
限定しないことが意図される。

【００５１】

【実施例】（１．凍結融解を使用する遺伝子導入ベクタ
ーの調製およびその使用） （実施例１：凍結融解によるＨＶＪエンベロープベクタ
ーの調製）外来遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を用
い、組換えＨＶＪウイルスを様々な回数で凍結融解した
後、培養細胞に遺伝子導入した。

【００５２】ＴＥ５００μ１に、７５０μｇのルシフェ
ラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃ（Ｓａｅｋｉお
よびＫａｎｅｄａら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
ａｐｙ、１１、４７１〜４７９（２０００））と様々な
濃度のＨＶＪウイルスを混合した。ＨＶＪウイルス濃度
は、１０、２５、５０、１００ＨＡＵ／μｌに調製し
た。この溶液を１２分割し、それぞれをドライアイスに
よって４℃に保存して凍結させた後、融解することを最
大３０回まで繰り返した。所定回数の凍結融解を終えた
溶液を、ＢＨＫ−２１細胞（２４ウェルディッシュ、４
×１０⁴細胞／ディッシュ、０．５ｍｌ ＤＭＥＭ，１
０％ＦＣＳ）の培地に添加し、３７℃、５％ＣＯ₂にて
２０分間反応後、ＰＢＳにより洗浄し、新たに培養液を
０．５ｍｌ加えて２４時間培養した。

【００５３】培地を除去し、１×Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ
社）５００μｌを細胞上に加えて細胞を溶解した後、マ
イクロチューブに移して遠心し、得られた上清２０μｌ
から、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓ
ａｙ ＳｙｓｔｅｍとＬｕｍａｔ ＬＢ９５０１ Ｌｕ
ｍｉｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いてルシフェラーゼ
活性を測定した。測定は各溶液について３回行い、平均
値を求めた。

【００５４】結果は図１に示したとおりである。組換え
ＨＶＪウイルスの凍結融解の回数が増加するに従ってル
シフェラーゼ活性が上昇し、３回の凍結融解に比べ２０
回の凍結融解では１０倍以上のルシフェラーゼ発現が観
察された。この結果から、この実施例に用いた条件で
は、組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数は好ましく
は５回以上、さらに好ましくは１５〜２０回程度である
ことが確認された。

【００５５】（実施例２：凍結融解により調製されたＨ
ＶＪエンベロープベクターの遺伝子導入効率）実施例１
と同様の組換えＨＶＪウイルスを３０回凍結融解した
後、宿主細胞に添加するウイルス数を同一条件として、
細胞への遺伝子導入効率を調べた。

【００５６】結果は図２に示したとおりである。この図
２において、例えばＸ軸が５００ＨＡＵの場合では、ウ
イルス濃度１０ＨＡＵ／μｌの溶液の添加量は５０μｌ
であり、１００ＨＡＵ／μｌの溶液は５μｌとなる。こ
の図２に示したとおり、ウイルス濃度が１００ＨＡＵ／
μｌの溶液は１０〜５０ＨＡＵ／μｌ濃度の場合に比較
して遺伝子発現の効率が約５０％低下した。この結果か
ら、この実施例の条件では、組換えウイルス濃度はｌ０
〜５０ＨＡＵ／μｌの範囲とすることが好ましいことが
確認された。

【００５７】また、組換えＨＶＪウイルスを２９回凍結
融解した後、３０回目の凍結を行い、その凍結状態で１
週間保存した後、融解して細胞に添加した。その結果、
この１週間冷凍保存した組換えＨＶＪウイルスも、３０
回の凍結融解を連続で行ったウイルスと同程度のルシフ
ェラーゼ遺伝子発現を示した。

【００５８】（実施例３：ルシフェラーゼ発現ベクター
を用いる遺伝子導入効率の測定）ルシフェラーゼ発現ベ
クターの量を様々に変えてＨＶＪエンベロープベクター
を調製し、宿主細胞への遺伝子導入効率を調べた。

【００５９】ＨＶＪウイルス量は１μｌ ＴＥ当たり５
０ＨＡＵとした。ルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒ
ｉＰＬｕｃの量は、１μｌのＴＥ当たり０．０５、０．
１、０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０、３．
０、５．５μｇとした。最終溶液量を１００μｌとして
２０回の凍結融解を行った後、実施例１と同一の方法に
よりルシフェラーゼ活性を測定した。

【００６０】結果は図３に示したとおりである。外来遺
伝子である発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃ（約９．５
ｋｂ）の添加量が１．５μｇまでは量依存的に発現量が
増加し、これ以降は発現量にはほとんど変化はなかっ
た。以上の結果から、この実施例で用いた条件では、
１．５μｇ／μｌ以上の外来遺伝子ＤＮＡを遺伝子導入
に用いることが好ましいことが確認された。

【００６１】（実施例４：遺伝子導入効率に対する緩衝
液の種類の影響）ＨＶＪエンベロープベクター調製に用
いる緩衝液の種類を変えて、宿主細胞への遺伝子導入効
率を調べた。

【００６２】ＨＶＪウイルス量は緩衝液１μｌ当たり５
０ＨＡＵ、ルシフェラーゼ発現ベクターｐｃＯｒｉＰＬ
ｕｃ量は１５μｇ／μｌとした。緩衝液はＴＥ、ＰＢ
Ｓ、ＢＳＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣ
ｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）、並び
にこれらの緩衝液に最終濃度０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍ
Ｍ、６０ｍＭのショ糖を添加したものを使用した。最終
溶液量を１００μｌとして２０回の凍結融解を行った
後、実施例１と同一の方法によりルシフェラーゼ活性を
測定した。

【００６３】結果は図４に示したとおりであり、この実
施例で用いた条件では、組換えＨＶＪウイルスの調製の
ための緩衝液としてはＴＥ単独が好ましいことが確認さ
れた。

【００６４】（実施例５：ＡＶＥ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａ
ｌ Ｖｉｒａｌ Ｅｎｖｅｌｏｐ）型のベクターと本願
発明のＨＶＪエンベロープベクターとの比較）従来の遺
伝子導入ベクターである不活性化ＨＶＪ−リポソーム
（最も遺伝子導入効率の優れたＡＶＥ型（Ｓａｅｋｉ，
Ｙ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、８、
２１３３〜２１４１（１９９７））を用いた遺伝子導入
と、この発明の方法とを比較した。

【００６５】ＨＶＪ一リポソームまたはＨＶＪウイルス
量はＴＥ １μｌ当たり５０ＨＡＵ、ルシフェラーゼ発
現ベクターｐｃＯｒｉＰＬｕｃの量は１．５μｇ／μｌ
とした。また、組換えＨＶＪウイルスの凍結融解の回数
は２回または１５回とした。その他の条件は、宿主細胞
をヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３とした以外は実施例１
と同様とした。

【００６６】結果は図５に示したとおりである。ＨＶＪ
エンベロープベクターの凍結融解を１５回繰り返すこの
発明の方法は、遺伝子導入効率においてＨＶＪ一リポソ
ームを用いた従来方法よりはるかに優れていることが確
認された。

【００６７】（実施例６：合成オリゴヌクレオチドの導
入効率）ＦＩＴＣ（イソチオシアン酸フルオレッセイ
ン）で蛍光標識した合成オリゴヌクレオチド（２０ｂ
ｐ）を１ｍｇ／ｍ１の濃度で不活性化ＨＶＪウイルスと
混合し、この溶液を２０回凍結融解した後、ＢＨＫ−２
１細胞と２０分間反応させた。１７時間後に蛍光シグナ
ルを観察した結果、ほぼ１００％の細胞の核内に蛍光の
集積が認められた。この結果から、この発明の方法は、
合成核酸の細胞内導入にも有効であることが確認され
た。

【００６８】（実施例７：ＧＦＰ遺伝子の導入効率）Ｇ
ＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）遺伝子と不活性化ＨＶ
Ｊウイルスの混合溶液を２０回凍結融解した後、２ｎｇ
−５μ１をラット大脳に注入した。その結果、注入部位
に蛍光シグナルが観察された。また、ＧＦＰ遺伝子によ
るＨＶＪエンベロープベクターを凍結して３ヶ月保存し
た後、ラット大脳に注入したが、同じく注入部位にＧＦ
Ｐ遺伝子発現による蛍光シグナルが観察された。

【００６９】以上の結果から、この発明の方法は、生体
内においても確実に遺伝子導入が可能であることが確認
された。また、ＨＶＪエンベロープベクターの凍結保存
が可能であることも確認された。

【００７０】（２．界面活性剤を使用する遺伝子導入ベ
クターの調製およびその使用） （実施例８：界面活性剤を用いる不活性化ＨＶＪエンベ
ロープベクターの調製）界面活性剤を用いる不活性化Ｈ
ＶＪエンベロープベクターの調製方法の概略を図６に示
す。

【００７１】（１：ＨＶＪの増殖）ＨＶＪは鶏の受精卵
への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使
用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へ
のウイルスの持続感染系（トリプシンなどの加水分解酵
素を培養液中に添加）を利用して増殖させたもの、クロ
ーニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持
続感染をおこさせて増殖させたもの、全てが利用可能で
ある。

【００７２】本実施例において、ＨＶＪの増殖を以下の
ようにおこなった。

【００７３】ＨＶＪの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｆｒｅｅ）の受精卵を使
って増殖させ分離・精製したＨＶＪ（Ｚ種）を細胞保存
用チューブに分注し、１０％ ＤＭＳＯを加えて液体窒
素中に保存し、調製した。

【００７４】受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュ
ベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩ Ｐ−０３型；
約３００鶏卵収容）にいれ、３６．５℃，湿度４０％以
上の条件で１０〜１４日飼育した。暗室中で、検卵器
（電球の光が口径約１．５ｃｍの窓を通して出るように
なっているもの）を用いて、胚の生存及び気室と漿尿膜
を確認し、漿尿膜の約５ｍｍ上方に鉛筆でウイルス注入
箇所の記しをつけた（太い血管を除いた場所を選定す
る）。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％
ＮａＣｌを混合し、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ７．２に調
整してオートクレーブ滅菌し、４℃保存したもの）で種
ウイルス（液体窒素からとりだしたもの）を５００倍に
希釈し、４℃においた。卵をイソジン及びアルコールで
消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希
釈した種ウイルス０．ｌｍｌを２６ゲージの針付き１ｍ
ｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入した。
溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツール
ピペットを用いて孔の上に置きこれをふさいだ。卵をイ
ンキュベーターにいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の
条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩４℃におい
た。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲー
ジの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中にいれ
て、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、４℃に保存し
た。

【００７５】（２：ＨＶＪの精製）ＨＶＪは、遠心分離
による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分
野において公知のその他の精製方法によって、精製され
得る。 （２．１：遠心分離による精製方法）手短には、増殖さ
せたウイルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の
組織・細胞片を除去した。その上清を高速遠心（２７，
５００×ｇ，３０分間）とショ糖密度勾配（３０〜６０
％ｗ／ｖ）を利用した超遠心（６２，８００×ｇ，９０
分間）により精製した。精製の間にウイルスをできるだ
け穏和に扱い、４℃で保存することに注意すべきであ
る。

【００７６】本実施例において、具体的には、以下の方
法によってＨＶＪを精製した。

【００７７】ＨＶＪ含有漿尿液（ＨＶＪ含有のニワトリ
卵の漿尿液を集め４℃にて保存）の約１００ｍ１を広ロ
の駒込ピペットで５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ
（Ｓａｅｋｉ，Ｙ．，およびＫａｎｅｄａ，Ｙ：Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｅｄｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ＨＶ
Ｊ−１ｉｐｏｓｏｍｅｓ）ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖ
ｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ，ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ；Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｈａｎｄｂ
ｏｏｋ（第２版）Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（Ａｃａｄｃｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ）第４
巻、１２７〜１３５，１９９８を参照のこと）、低速遠
心機で３０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心し（ブレー
キはオフ）、卵の組織片を除去した。

【００７８】遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本
（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０
００ｇ，３０分遠心した（アクセル、ブレーキはオ
ン）。上清を除き、沈殿にＢＳＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ ＮａＣ１、５．
４ｍＭ ＫＣ１；オートクレーブし、４℃保存）（ＢＳ
ＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍ
ｌ加え、そのまま４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペ
ットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし１本
のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０
００ｇ、３０分遠心した。上清をのぞき沈殿にＢＳＳ約
１０ｍｌを加え、同様に４℃で一晩静置した。広ロの駒
込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐ
し、低速遠心機で３０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心
し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイ
ルスの凝集塊をのぞいた。上清を新しい滅菌済みチュー
ブに入れ精製ウイルスとして４℃で保存する。

【００７９】このウイルス液０．ｌｍｌにＢＳＳを０．
９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸収を測定し、
ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算した。
５４０ｎｍの吸収値１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当
した。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例すると考えられる。
また実際にニワトリ赤血球液（０．５％）を用いて、赤
血球凝集活性を測定してもよい（動物細胞利用実用化マ
ニュアル、ＲＥＡＬＩＺＥ ＩＮＣ．（内田、大石、古
沢編集）Ｐ２５９〜２６８、１９８４を参照のこと）。

【００８０】さらにショ糖密度勾配を用いたＨＶＪの精
製も必要に応じて行い得る。具体的には、ウイルス懸濁
液を６０％、３０％のショ糖溶液（オートクレーブ滅
菌）を重層した遠心チューブにのせ、６２，８００×ｇ
で１２０分間密度勾配遠心を行う。遠心後、６０％ショ
糖溶液層上にみられるバンドを回収する。回収したウイ
ルス懸濁液をＢＳＳもしくはＰＢＳを外液として４℃で
透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない
場合は、ウイルス懸濁液にグリセロール（オートクレー
ブ滅菌）と０．５Ｍ ＥＤＴＡ液（オートクレーブ滅
菌）をそれぞれ最終濃度が１０％と２〜１０ｍＭになる
ように加えて−８０℃で穏やかに凍結し、最終的に液体
窒素中で保存する（凍結保存はグリセロ一ルと０．５Ｍ
ＥＤＴＡ液の代わりに１０ｍＭ ＤＭＳＯでも可
能）。 （２．２：カラムおよび限外濾過による精製方法）遠心
分離による精製方法に代えて、カラムによるＨＶＪの精
製も本発明に適用可能である。

【００８１】手短には、分子量カットオフが５０，００
０のフィルターによる限外濾過による濃縮（約１０倍）
とイオン交換クロマトグラフィー（０．３Ｍ〜ｌＭ Ｎ
ａＣｌ）による溶出を用いて精製した。

【００８２】具体的には、本実施例において、以下の方
法を使用して、ＨＶＪをカラムによって精製した。

【００８３】漿尿液を採集した後、８０μｍ〜１０μｍ
のメンブランフィルターにてろ過した。０．００６〜
０．００８％ ＢＰＬ（最終濃度）を漿尿液に加え（４
℃、１時間）、ＨＶＪを不活性化した。漿尿液を３７
℃、２時間インキュベートすることによって、ＢＰＬを
不活性化した。

【００８４】５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔ
ｓ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法により
約１０倍濃縮した。緩衝液として、５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２％マンニトール、２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）を用いた。ＨＡＵアッセイ
により、ほぼ１００％のＨＶＪ回収率であり優れた結果
がえられた。

【００８５】ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムフ
ァルマシアバイオテクＫＫ、Ｔｏｋｙｏ）によるカラム
クロマトグラフィー法（緩衝液：２０ｍＭ ＴｒｉｓＨ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．２〜１Ｍ ＮａＣｌ）でＨＶ
Ｊを精製した。４０〜５０％の回収率であり、純度は９
９％以上であった。

【００８６】５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法
によりＨＶＪの画分を濃縮した。

【００８７】（３：ＨＶＪの不活性化）ＨＶＪの不活性
化が必要な場合、以下に記載するように、紫外線照射ま
たはアルキル化剤処理により行った。

【００８８】（３．１：紫外線照射法）ＨＶＪ懸濁液１
ｍｌを３０ｍｍ径のシャーレにとり、９９または１９８
ミリジュール／ｃｍ²を照射した。ガンマー線照射も利
用可能である（５〜２０グレイ）が完全な不活性化がお
こらない。

【００８９】（３．２：アルキル化剤による処理）使用
直前に、１０ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ中に０．０１％ β−プ
ロピオラクトンの調製をした。作業中は低温下に保ち素
早く作業を行った。

【００９０】精製直後のＨＶＪの懸濁液に最終０．０１
％になるようにβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で
６０分間でインキュベートした。その後２時間、３７℃
でインキュベートした。エッペンドルフチューブにチュ
ーブあたり１０，０００ＨＡＵ分ずつ分注し、１５，０
００ｒｐｍ，１５分遠心し、沈殿を−２０℃で保存す
る。上記の不活性化法によらず、沈殿を−２０℃で保存
せず、そのまま界面活性剤処理によりＤＮＡを取り込ま
せ、ベクターを作成することも可能である。

【００９１】（４：ＨＶＪエンベロープベクターの作
成）保存してあったＨＶＪに外来ＤＮＡ２００〜８００
μｇを含む溶液９２μｌを加えてピペッティングでよく
懸濁した。この溶液は、−２０℃で、少なくとも、３ヶ
月保存可能である。ＨＶＪとの混合前にＤＮＡに硫酸プ
ロタミンを添加すると、発現効率が２倍以上増強した。

【００９２】この混合液を氷上に１分間置き、オクチル
グルコシド（１０％）を８μｌ加えて１５秒氷上でチュ
ーブを振盪し、４５秒氷上に静置した。界面活性剤での
処理時間は、１〜５分間が好ましい。オクチルグルコシ
ド以外に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ｔ−オクチルフェ
ノキシポリエトキシエタノール）、ＣＨＡＰＳ（３−
［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−
１−プロパンスルホン酸）、ＮＰ−４０（ノニルフェノ
キシポリエトキシエタノール）などの界面活性剤も使用
し得る。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＮＰ−４０およびＣ
ＨＡＰＳの好ましい最終濃度は、それぞれ、０．２４〜
０．８０％、０．０４〜０．１２％および１．２〜２．
０％である。

【００９３】冷ＢＳＳを１ｍｌ添加し、すぐに１５，０
００ｒｐｍで１５分遠心した。生じた沈殿にＰＢＳまた
は生理食塩水などを３００μｌ加えて、ボルテックス、
ピペッティングで懸濁した。懸濁液は直接遺伝子導入に
使用することも、−２０℃で保存後に遺伝子導入に使用
することも可能である。このＨＶＪエンベロープベクタ
ーは、少なくとも２ヶ月間の保存後、同程度の遺伝子導
入効率を維持した。

【００９４】（実施例９：ＨＶＪエンベロープベクター
におけるＦｌとＨＮタンパク質の比率） （１：サンプルの調製） （ｉ）精製ＨＶＪ １０，０００ＨＡＵ相当を１５，０
００ｒｐｍ，１５分間遠心し、沈殿を３００μｌのＰＢ
Ｓに懸濁し−２０℃に保存した。 （ｉｉ）精製ＨＶＪ １０，０００ＨＡＵ相当を紫外線
照射（１９８ミリジュール／ｃｍ²）後、１５，０００
ｒｐｍ，１５分間遠心し、沈殿を３００μｌのＰＢＳに
懸濁し−２０℃で保存した。 （ｉｉｉ）精製ＨＶＪ １０，０００ＨＡＵ相当を紫外
線照射（１９８ミリジュール／ｃｍ²）後、１５，００
０ｒｐｍ，１５分間遠心し、沈殿にｐｃＬｕｃｉＤＮＡ
２００μｇ（溶液９２μｌ）を加えて、ピペッテングで
懸濁した。氷上に置き、オクチルグルコシド（１０％）
を８μ１加えて、１５秒間、手でチューブを振盪し、４
５秒間氷上静置し、冷ＢＳＳを１ｍｌ加えて、すぐに１
５，０００ｒｐｍ、１５分間遠心後、３００μｌのＰＢ
Ｓに懸濁し−２０℃で保存した。

【００９５】（２：タンパク質電気泳動）３種類のサン
プルの５、１０、２０μｌに×５のＬａｅｍｌｉサンプ
ル緩衝液を加え１０％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行った。泳動終了後、クマシーブルーで染
色し、脱染色後、セロファン紙に張り付けて乾燥させ
た。

【００９６】（３：タンパク質同定）電気泳動し、染色
したサンプルをＬＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ、
Ｔｏｋｙｏ）に取り込ませ（図７）、Ｆ１，ＨＮ相当の
タンパク質バンドの濃度を測定した。１種類のサンプル
につき、３つの異なる量を泳動し、各々のＦ１／ＨＮ密
度を算出し、サンプル毎に平均と標準偏差を求めた。

【００９７】（４：結果）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉ
ｉ）のサンプルでＦ１／ＨＮは、ほぼ１．７で一致し
た。Ｆ１ ５１ｋＤ、ＨＮ ６８ｋＤａの分子量を考慮
すれば、モル比は約２．３となる。Ｆ１、ＨＮを用いた
再構成リポソームでの融合の最適値が、Ｆ１／ＨＮが約
２で与えられるという報告（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅ
ｓ．１４２、９５〜１０１、１９８５）とも矛盾しな
い。他の研究者から報告のある再構成型ではこの比が野
生型ウイルスのものと異なる（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、
３３１２〜３３１８、１９９３）。その他のタンパク質
組成もＨＶＪとＨＶＪエンベロープベクターではほぼ同
じであった。

【００９８】（実施例１０：ＨＶＪエンベロープベクタ
ーへのＤＮＡの封入及び封入率） （１：ＨＶＪエンベロープベクター（ＤＮＡ封入、未封
入）の電子顕微鏡像）前述のようにしてｐＳＦＶ−Ｌａ
ｃＺ（１４．５ｋｂ）１３０μｇを１０，０００ＨＡＵ
のＨＶＪ（紫外線不活性化）に封入しＨＶＪエンベロー
プベクターを作成した。

【００９９】封入後のＨＶＪエンベロープベクターを３
００μｌのＰＢＳに懸濁し−２０℃で保存した。１０日
後、１μｌの懸濁液をグリッド上にのせ、陰性染色法に
て電子顕微鏡を用いて観察した。コントロールとしてＤ
ＮＡ未封入のＨＶＪエンベロープベクターを用いた。

【０１００】（結果）結果を、図８に示す。ＨＶＪエン
ベロープベクターは、かつて観察されたＨＶＪウイルス
そのものとほぼ外郭は同型のものが多かった。ＤＮＡ未
封入のものに比較し、ＤＮＡを用いたものはＨＶＪエン
ベロープベクター内に電子密度の濃い構造物を認めた。
一方、未封入のものは内部の透過性は高く、ウイルスゲ
ノムが破壊されたか、喪失されたと推定された。

【０１０１】（２：ＨＶＪエンベロープベクターへのＤ
ＮＡ封入率）前述のようにしてｐｃＬｕｃｉ（７．４ｋ
ｂ）１５７μｇを６，７００ＨＡＵのＨＶＪ（紫外線不
活性化）に封入して、ＨＶＪエンベロープベクターを作
成した。ＨＶＪエンベロープベクターを、３００μｌの
ＢＳＳに懸濁し、ミクロコッカルヌクレアーゼ１５単
位、ＣａＣｌ₂ ２ｍＭ、ＲＮａｓｅＡ ２０μｇ／ｍ
ｌ、２０℃、３０分間処理し、ＰＢＳ １リットルに対
して透析した（４℃、オーバーナイト）。１％ＳＤＳ、
３７℃で、ｌ分間処理した。５００μｌのフェノール、
５００μｌクロロホルム−イソアミルアルコールで処理
し、その後、エタノール沈殿した。１００μｌのＢＳＳ
に懸濁し、分光光度計で２６０ｎｍ，２８０ｎｍを測定
した。

【０１０２】（結果）回収率が８５．７％であったの
で、換算すると、ＨＶＪエンベロープベクター中へのＤ
ＮＡの取り込み効率は、３．８％であった。１０，００
０ＨＡＵのＨＶＪに、２７９μｇのｐｃＬｕｃｉを取り
込ませた場合の取り込み効率は、７．２％であった。

【０１０３】以上より１０，０００ＨＡＵのＨＶＪへの
ＤＮＡ取り込み効率は、オクチルグルコシドを用いた場
合約６〜７％であろうと推定されるが、用いるＤＮＡ量
によって多少変化する可能性がある。また硫酸プロタミ
ンをＤＮＡ、ＨＶＪエンベロープベクターと共存させる
と導入効率が上昇することがわかっているが、これはＨ
ＶＪエンベロープベクターへのＤＮＡ封入効率が上昇し
たためではないかと考えられる。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１０
０，ＮＰ−４０ではさらに効率が上がり１０〜４０％程
度と推定される。

【０１０４】（実施例１１：ＨＶＪエンベロープベクタ
ーによる細胞内への遺伝子導入） （１：遺伝子導入方法）１，０００ＨＡＵ分をエッペン
ドルフチューブにとり（３０μｌ）、硫酸プロタミン
（１ｍｇ／ｍｌ）５μ１を加えた。ＢＨＫ−２１細胞
（前日に、ウェルあたり２００，０００個で、６つのウ
ェルにまいたもの）の培地を交換し、１ウェルあたり
０．５ｍｌの培地（１０％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）を添加し
た。各ウェルに、上記のベクター（１，０００ＨＡＵ相
当）と硫酸プロタミンの混合液を加え、プレートを前後
左右にふってベクターと細胞を良く混ぜ合わせ、３７℃
で、５％ＣＯ₂インキュベーター中に１０分間放置し
た。

【０１０５】培地交換し、３７℃で、５％ＣＯ₂インキ
ュベーター中でオーバーナイト（１６ｈｒ〜２４ｈｒ）
放置し、遺伝子発現を調べた。ルシフェラーゼ（ｐｃＬ
ｕｃｉ；ＣＭＶプロモーターを有するルシフェラーゼ遺
伝子）の場合は、ＣｅｌｌＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ
（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．５ｍｌで細胞を溶解し、その２
０μｌ溶液中の活性をルシフェラーゼアッセイキット
（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。グリーン蛍光タ
ンパク質（ｐＣＭＶ−ＧＦＰＥ；Ｐｒｏｍｅｇａ）の場
合は、そのまま蛍光顕微鏡で観察し、４００倍率で５〜
８視野を観察し、蛍光を発する細胞の割合を算出した。

【０１０６】（２：培養細胞における導入効率に与える
条件の検討）培養細胞はＢＨＫ−２１細胞を用いた。

【０１０７】（２．１：ＨＶＪエンベロープベクター作
成におけるオクチルグルコシド（ＯＧ）濃度の検討）
（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＨＶ
Ｊエンベロープベクターによる遺伝子導入に対する、各
濃度（ＨＶＪエンベロープベクターの作成時に用いたＯ
Ｇの最終濃度）のオクチルグルコシド（ＯＧ）の影響を
調べた： （Ａ）オクチルグルコシド濃度：１、２、３％； ＨＶＪエンベロープベクター作成時に、不活性化ＨＶＪ
をＯＧによって処理した時間：１分間、５分間、１０分
間； 超音波処理を行ったか（ｓｏｎｉｃ）、または行わなか
った。 （Ｂ）オクチルグルコシド濃度：０．１２５〜１．２５
％； トランスフェクションに用いたベクターの容量：１０μ
ｌ、１００μｌ。 （Ｃ）オクチルグルコシド：０．５５〜０．８％； トランスフェクションの時間：３０分間、オーバーナイ
ト（Ｏ／Ｎ）。 結果を図９に示す。

【０１０８】（２．２：細胞への遺伝子導入条件、硫酸
プロタミン（ＰＳ）の濃度・処理時間） （１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＨＶ
Ｊエンベロープベクターによる遺伝子導入に対する、硫
酸プロタミンの影響を調べた： （Ａ）硫酸プロタミン：０〜１００μｇ／ｍｌ培地； トランスフェクションの時間：２０、４０、６０分間。 （Ｂ）硫酸プロタミン：０〜４０μｇ／ｍｌ培地； トランスフェクションの時間：５、１０、２０分間。 結果を図１０に示す。

【０１０９】（２．３：ＨＶＪエンベロープベクターに
封入するＤＮＡ濃度の遺伝子発現量に対する効果）
（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＨＶ
Ｊエンベロープベクターによる遺伝子発現量に対する、
実験に使用したＤＮＡ量の影響を調べた： （Ａ）ＤＮＡ量：２０〜２００μｇ；ＨＶＪエンベロー
プベクターを−２０℃または−８０℃で５日間保存し
た。 （Ｂ）ＤＮＡ量：１８０〜３６０μｇ／ＨＶＪ １０，
０００ＨＡＵ。 結果を図１１に示す。

【０１１０】（２．４：遺伝子導入に用いるＨＶＪ力価
の、遺伝子発現量に対する影響）（１）の遺伝子導入方
法に、以下の変更を加えて、ＨＶＪエンベロープベクタ
ーによる遺伝子発現量に対する、遺伝子導入に用いるＨ
ＶＪ力価の影響を調べた：５，０００、１０，０００、
２０，０００ＨＡＵの力価のＨＶＪを用いてＨＶＪエン
ベロープベクターを調製し、その各々の、２５０、５０
０、１，０００、２，０００ＨＡＵに相当する量を用い
て、ＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクションした。結
果を図１２に示す。

【０１１１】（２．５：ＨＶＪエンベロープベクター遺
伝子導入効率に対する、ＨＶＪ不活性化条件の影響）
（１）の遺伝子導入方法に、以下の変更を加えて、ＢＨ
Ｋ−２１細胞中でのルシフェラーゼ遺伝子発現に対す
る、ＨＶＪの不活性化方法（ＵＶまたはβ−プロピオラ
クトン）の効果を調べた。 （Ａ）ＵＶ不活性化のための照射量：０〜２３１ミリジ
ュール／ｃｍ²。 （Ｂ）ＨＶＪ処理に用いたβ−プロピオラクトン（ＢＰ
Ｌ）濃度：０〜０．０２５％。 結果を図１３に示す。

【０１１２】（実施例１２：ＨＶＪエンベロープベクタ
ーの各種細胞への遺伝子導入）ヒト舌部の扁平上皮癌
（ＳＡＳ）へ、実施例１１に記載の方法により遺伝子導
入を行った。結果を図１４に示す。遺伝子導入の際の、
硫酸プロタミン濃度およびトランスフェクション時のイ
ンキュベーション時間を、図１４に記載のように変化さ
せ、遺伝子導入の効率を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現
によって測定した。トランスフェクションを行った条件
の範囲内では、２００μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを使
用し、６０分間のトランスフェクション処理をした場合
に遺伝子導入効率が最大であったが、硫酸プロタミン濃
度をさらに増加させれば、遺伝子導入効率のさらなる増
加が予測される。

【０１１３】ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）へ、実施
例１１に記載の方法により遺伝子導入を行った。結果を
図１５に示す。遺伝子導入の際の、硫酸プロタミン濃度
およびトランスフェクション時のインキュベーション時
間を、図１５に記載のように変化させ、遺伝子導入の効
率を、ルシフェラーゼ遺伝子の発現によって測定した。
トランスフェクションを行った条件の範囲内では、１０
０μｇ／ｍｌの硫酸プロタミンを使用し、６０分間のト
ランスフェクション処理をした場合に遺伝子導入効率が
最大であったが、硫酸プロタミン濃度をさらに増加させ
れば、遺伝子導入効率のさらなる増加が予測される。

【０１１４】（実施例１３：ＨＶＪエンベロープベクタ
ーの各種生体組織内への遺伝子導入）本実施例では、実
施例１１に記載のＨＶＪエンベロープベクターを用い
る、種々の生体内組織への遺伝子導入を例示する。

【０１１５】（１３．１：マウス肝臓）ＨＶＪエンベロ
ープベクターを、０．８％のオクチルグルコシドおよび
２００μｇのｐｃＬｕｃｉを氷上に１分間放置し、そし
て３００μｌのＰＢＳに懸濁することによって調製し
た。調製懸濁液の１／１０量（１，０００ＨＡＵに相
当）３０μｌを、７０μｌのＰＢＳで希釈し（全量１０
０μｌ）、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）肝臓の葉（ｌｏｂ
ｅ）の１つに注入した。

【０１１６】ＨＶＪ−ＡＶＥ（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
Ｖｉｒａｌ Ｅｎｖｅｌｏｐ）リポソームを、２００μ
ｇのｐｃＬｕｃｉを用いて、ボルテックス／排出（ｖｏ
ｒｔｅｘｉｎｇ／ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）、その後のスク
ロース勾配遠心分離（６２，０００ｇ、９０分間）によ
って調製した。次に、この調製物を、遠心分離（２７，
０００ｇ、３０分間）によってペッレトとし、そして５
００μｌのＰＢＳ中に懸濁した。このサンプルの１００
μｌをマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）肝臓の葉（ｌｏｂｅ）
の１つに注入した。

【０１１７】２４時間後、注入された肝臓葉を単離し
て、その葉のルシフェラーゼ活性をＰｒｏｍｅｇａ社の
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍを用
いてアッセイした。結果を図１６Ａに示す。この結果か
ら、明らかなように、本発明のＨＶＪエンベロープベク
ターは、従来のＨＶＪ−ＡＶＥリポソームと比べて約２
倍の顕著に高い遺伝子導入効率を示した。

【０１１８】（１３．２：マウス子宮）１３．１と同様
にＨＶＪエンベロープベクターを調製した。５０μｌと
１００μｌのサンプルを、ＰＢＳで希釈して５００μｌ
とし、マウスのファローピウス管に注入し、子宮頸を１
０分間結紮した。２４時間後、マウス子宮を単離して、
葉および子宮のルシフェラーゼ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ
社のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ
を用いてアッセイした。結果を図１６Ｂに示す。本発明
のＨＶＪエンベロープベクターによって、マウス子宮へ
の遺伝子導入が可能であったが、ＨＶＪ−ＡＶＥリポソ
ームを用いた方法では、検出可能な程度の子宮組織への
遺伝子導入が見出されなかった。

【０１１９】ｐｃＬｕｃｉを含有するＨＶＪエンベロー
プベクターを１３．１と同様に調製した。ＬａｃＺ発現
のために、ｐＥＢ−ＣＭＶ−ＬａｃＺ（１３ｋｂ）を含
有するＨＶＪエンベロープベクターを、２００μｇのプ
ラスミドを使用して調製した。これら各ベクターを含有
するＨＶＪエンベロープベクターを上記のように子宮に
注入した。結果を、図１６Ｃに示す。ＬａｃＺ染色によ
って、主に子宮内膜の腺上皮でのＬａｃＺ遺伝子の発現
が検出された。

【０１２０】（１３．３：ラット脳）上記に記載のｐｃ
Ｌｕｃｉを含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製
したのと同様の方法によって、ｐＥＧＦＰ−１（クラゲ
のグリーン蛍光タンパク質遺伝子（約０．７ｋｂ）を、
サイトメガロウイルスプロモーターを有する発現ベクタ
ーに組み込んだベクター；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ，ＣＡより入手可能）を含有するＨＶＪエ
ンベロープベクターを調製した。３０μｌのベクター
（調製物の１／１０であり、１，０００ＨＡＵに相当）
をＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）
に、頸動脈注入、または大槽より髄腔内注入した。遺伝
子導入の３〜４日後、ラットを屠殺し、脳切片を固定化
することなく調製し、そして蛍光顕微鏡下で蛍光を観察
した。図１６Ｄに示される結果のように、頚動脈注入及
び大槽より髄腔内注入のいずれの場合も、脳内における
グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現が認められ
た。これに対して、ＨＶＪ−ＡＶＥリポソームを用い
て、同様の遺伝子導入をラット頚動脈より行った場合、
脳内でのＧＦＰ発現は、認められなかった。

【０１２１】（１３．４：ウサギ眼）ｐＣＤＮＡ３（Ｉ
ｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）の
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位にヒトＨＧＦ（肝細胞増
殖因子）遺伝子の変異体であるＮＫ４ ｃＤＮＡ（１．
４ｋｂ）をクローニングして構築されたｐＣＭＶ−ＮＫ
４を、大阪大学医学系研究科の中村敏一教授らより分与
していただいた。

【０１２２】４００μｇまたは８００μｇいずれかのｐ
ＣＭＶ−ＮＫ４を用いて、１０，０００ＨＡＵの不活性
化ＨＶＪを用いた以外は、上記に記載のｐｃＬｕｃｉを
含有するＨＶＪエンベロープベクターを調製したのと同
様の方法によって、ＨＶＪエンベロープベクターを調製
した。ｐＣＭＶ−ＮＫ４は、ＨＧＦ機能を阻害する変異
型ＨＧＦを発現するベクターである。５０μｌのベクタ
ー（調製物の１／６）を、新血管形成を誘導するために
組換えＶＥＧＦのペレットで処理した、ウサギの角膜組
織中に注入した。処置の７日後、ウサギを、屠殺し、目
の中の新血管形成を観察した。結果を図１６Ｅに示す。
ｐＣＭＶ−ＮＫ４が容量依存的にＶＥＧＦによって誘導
された血管新生を抑制した。

【０１２３】（１３．５：ラット肺動脈）上記に記載の
ｐｃＬｕｃｉを含有するＨＶＪエンベロープベクターを
調製したのと同様の方法によって、ＳＶ４０プロモータ
ーの制御下のＬａｃＺ遺伝子を有するｐＳＶ−ＬａｃＺ
（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含有す
るＨＶＪエンベロープベクターを調製した。５０μｌの
ベクター（調製物の１／６）をラットの気管に注入し
た。遺伝子導入の３日後、ラットを屠殺し、組織を１％
のグルタルアルデヒドを用いて固定化し、動脈中のＬａ
ｃＺの発現を、Ｘ−ｇａｌを用いて可視化した。結果を
図１６Ｆに示す。気管支上皮にＬａｃＺ染色を認めた。
また、肺動脈からＨＶＪエンベロープベクターを導入し
たときも気管支上皮に遺伝子発現を認めた（データを示
さず）。

【０１２４】（実施例１４：ウイルスエンベロープベク
ターのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）としての
機能）本発明の遺伝子導入ベクターは、オリゴヌクレオ
チドまたはデコイ核酸治療のためのドラッグデリバリー
システムとしても有用である。

【０１２５】（１４．１：蛍光オリゴヌクレオチドの導
入）本発明のウイルスエンベロープベクターを使用し
て、細胞への蛍光標識オリゴヌクレオチドの導入を行っ
た。

【０１２６】ＦＩＴＣで５’をラベルした２０マーのオ
リゴヌクレオチド（５’−ＣＣＴＴｇＡＡＧＧＧＡＴＴ
ＴＣＣＣＴＣＣ−３’）１９４μｇ／９２μ１ ＢＳＳ
を１０，０００ＨＡＵのＨＶＪ（紫外線１９８ミリジュ
ール／ｃｍ²で不活性化）の沈殿と混合し、Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００（０．２４％、最終濃度）を添加し、氷上
で１分間処理し、１ｍｌのＢＳＳを加えて、遠心（１
５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。沈殿に１００
μｌのＰＢＳを加えて、−２０℃保存した。１ヶ月後、
融解し、１０μｌ分を５μｇの硫酸プロタミンと混合
し、５００万個のＢＨＫ−２１細胞（０．５ｍｌ倍地
中）とインキュベート（１０分、６０分）した。導入翌
日に蛍光顕微鏡で細胞の蛍光を観察したところ、図１７
Ｂに示すように、１０分では１０％程度のオリゴヌクレ
オチド導入効率であったが、図１７Ａに示すように、６
０分では８０％以上の細胞にオリゴヌクレオチドが導入
されていた。

【０１２７】（１４．２：Ｓｔａｔ６デコイ核酸による
接触性皮膚炎の治療）本発明のウイルスエンベロープベ
クターを使用して、細胞へのデコイ核酸の導入を行っ
た。

【０１２８】Ｓｔａｔ６のＤＮＡ結合配列をもつ二重鎖
核酸（５’−ＧＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＣＣＡＡ
ＧＡＡＴＣＴＡＴ−３’および３’−ＣＡＴＧＴＴＣＴ
ＧＧＡＡＡＡＧＧＧＴＴＣＴＴＡＧＡＴＡ−５’、（Ｗ
ａｎｇ，ＬＨら、：Ｂｌｏｏｄ ９５、１２４９〜１２
５７、 ２０００））２５０μｇ／３００μｌ ＢＳＳ
を３０，０００ＨＡＵのＨＶＪ（紫外線９９ミリジュー
ル／ｃｍ²で不活性化）の沈殿と混合し、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００（最終濃度 ０．２４％）を添加し、氷上で
１分間処理し、ｌｍｌのＢＳＳを加えて、遠心（１５，
０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）した。沈殿に３００μ
ｌのＰＢＳを加えて−２０℃保存した。このＨＶＪエン
ベロープベクターを、マウスの皮下注入に用いたとこ
ろ、ＩｇＥ誘発のアレルギーと遅延型皮膚反応を抑制し
た。

【０１２９】（実施例１５：浮遊系細胞への遺伝子導
入）ヒト白血病細胞様であるＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＮＡＬ
Ｍ−６、Ｋ−５６２を対象として遺伝子導入実験を行っ
た。

【０１３０】ｐＣＭＶ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ２００
μｇ（９２μｌ）を１０，０００ＨＡＵの不活性化ＨＶ
Ｊ（紫外線９９ミリジュール／ｃｍ²）の沈殿と混合
し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．２４％、最終濃度）
を加え、氷上で１分間処理し、１ｍｌのＢＳＳを加え
て、遠心（１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）した。
沈殿に３００μｌのＰＢＳを加えてＨＶＪエンベロープ
ベクターを調製した。ベクター６０μｌ（２，０００Ｈ
ＡＵ相当）、硫酸プロタミン、および４００万個の浮遊
系細胞を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で混
合し、１０，０００〜１５，０００ｒｐｍ、１０分、２
０℃の遠心を行った。その後、沈殿に培養液を加え、培
養皿に移し、１日後に細胞のルシフェラーゼ活性を測定
した。

【０１３１】使用した細胞株は、ＨＶＪ−リポソームや
既存のリポソーム試薬（ＧｉｂｃＢＲＬのＬｉｐｏｆｅ
ｃｔｉｎ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅなど）を用いた
場合には導入効率が極めて低い細胞株（特にＣＣＲＦ−
ＣＥＭ、ＮＡＬＭ−６）であるが、図１８に示すよう
に、これら細胞株に対する高効率の遺伝子導入が観察さ
れた。

【０１３２】好ましい遺伝子導入の条件は、硫酸プロタ
ミン６００〜１，０００μｇ／ｍｌを添加し、遠心は１
０，０００ｒｐｍまたは１５，０００ｒｐｍで、１０分
間、２０℃での遠心をする条件であった。ＨＶＪエンベ
ロープベクターによる有意な細胞毒性は認められなかっ
た。また、遠心と硫酸プロタミンの添加の両方が、遺伝
子導入に必要であった。

【０１３３】（実施例１６：癌組織への遺伝子導入）ｐ
ＣＭＶ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ３５４μｇ（９２μｌ）
を３４，０００ＨＡＵの不活性化ＨＶＪ（紫外線９９ミ
リジュール／ｃｍ²）の沈殿と混合し、ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００（０．２４％、最終濃度）を添加して、氷上で
１分間処理し、１ｍｌのＢＳＳを加えて、遠心（１０，
０００〜１５，０００ｒｐｍ、１０分間、２０℃）し
た。沈殿に３００μｌのＰＢＳを加えて、−２０℃で保
存した。１日後、硫酸プロタミン５００μｇ／ｍｌ、ま
たは１０００μｇ／ｍｌと混合し、その１００μ１をマ
ウスメラノーマＢ１６−Ｆｌの腫瘍塊（径７〜８ｍｍ）
に注入し、１日後にルシフェラーゼ活性を測定した。図
１９に示すように、腫瘍塊での遺伝子発現がみられた。
好ましい硫酸プロタミン濃度は、５００μｇ／ｍｌであ
った。しかし、これより低い硫酸プロタミン濃度では、
遺伝子発現を検出できなかった。

【０１３４】（実施例１７：ヘルペスウイルスエンベロ
ープベクターの調製） （１７．１：不活性化ウイルスの調製）１型単純疱疹ウ
イルス（ＨＳＶ−１）（１０¹⁰プラーク形成単位／ｍ
１）を大阪大学医学系研究科細菌学講座の山西教授より
供与された。このウイルスの不活性化条件を培養サル細
胞（Ｖｅｒｏ細胞）におけるウイルスのプラーク形成に
より検討した。β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）０．０
５％を用いたウイルスの不活性化では、Ｖｅｒｏ細胞で
のプラークの出現頻度が、９．ｌ×ｌ０^-4（プラーク／
Ｖｅｒｏ細胞）であった。一方、紫外線２００および４
００ミリジュール／ｃｍ²照射でのウイルスの不活性化
は、それぞれ４．３×１０^-4、２．２×１０^{- 6}（プラー
ク／Ｖｅｒｏ細胞）であった。

【０１３５】（１７．２：不活性化ウイルスを用いる遺
伝子導入）１００μ１のＨＳＶ−１（１０⁹粒子）を６
２０μ１のＰＢＳで希釈後、紫外線４００ミリジュール
／ｃｍ²照射し、その１０％量（７２μ１）とＤＮＡ
（ｐＣＭＶ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ８．８３μｇ／μ
ｌ）と混合し、氷上で３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を８
μ１加え（最終濃度、０．２４％）、その１、２、３、
４、５、６分後に１ｍｌのＰＢＳを添加して希釈した。
各サンプルの１００μ１をそのままＢＨＫ−２１細胞
（６ウェルプレート中）に導入した。細胞は１０％のウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）含有ダルベッコ最少必須培地（Ｄ
ＭＥ）０．５ｍ１／ウェルで培養した。また、別の実験
において、各サンプルの１００μｌを硫酸プロタミン５
μｇと混合後、ＢＨＫ−２１に導入した。３７℃、５％
ＣＯ₂のインキュベーター中で６０分問放置後、培養
液を１０％ＦＣＳ−ＤＭＥと交換した。２２時間後にル
シフェラーゼ活性を測定した。図２０に示すように、本
発明の方法を用いて調製されたヘルペスウイルスエンベ
ロープベクターによる高効率の遺伝子導入が確認され
た。各サンプルとも形態学的な観察による細胞毒性は認
められなかった。

【０１３６】次に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で５分間処
理したヘルペスウイルスエンベロープベクターを−８０
℃で２日間保存後、解凍し、再度ＢＨＫ−２１細胞に添
加して導入効率を測定した。今回は導入６０分後に１０
％ＦＣＳ−ＤＭＥ ２．５ｍｌ／ウェルを加えて一晩培
養して活性を測定した。血清の影響、ベクター量につい
て検討した。

【０１３７】図２１に示すように、−８０℃で２日間保
存後であっても、なお高効率の遺伝子導入が確認され
た。血清１０％を加えた培地を用いたものが、無血清培
地よりも導入効率が高く、ベクター溶液２００μ１（推
定量：２．８×１０⁷ウイルス粒子／ウェル）が１００
μ１溶液（推定量：１．４×１０⁷ウイルス粒子／ウェ
ル）より遺伝子導入活性が高かった。

【０１３８】（１７．３：不活性化ウイルスを用いる遺
伝子導入）上記の開示より、この界面活性剤を用いてエ
ンベロ一プベクターを作成する技術はＨＶＪのみでな
く、広く脂質膜を有するエンベロープウイルスに適用可
能であることが当業者に明らかである。従って、当業者
が本発明の開示に従って、他のエンベロープウイルスを
用いて、容易に遺伝子導入のためのエンベロ一プベクタ
ーを調製し得ることが明らかである。従って、レトロウ
イルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビ
ウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイ
ルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポック
スウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス
科、ヘパドナウイルス科などのウイルスのエンベロープ
ベクターが作成可能である。これによりウイルスの有す
る組織指向性を利用した特定の臓器への標的導入が実現
可能と考えられる。たとえば単純疱疹ウイルスのエンベ
ロープベクターは神経指向性のベクターとして、エプス
タイン−バーウイルスのエンベロープベクターはＢリン
パ球指向性のベクターとして、インフルエンザのエンベ
ロープベクターは呼吸器指向性ベクターとして応用し得
る。

【０１３９】上記から、本発明の特定の実施態様が例示
の目的について本明細書に記載されるが、種々の改変
が、本発明の意図および範囲から逸脱せずに行われ得る
ことは、明らかである。具体的には、本明細書の実施例
は、不活性化ＨＶＪを用いた遺伝子導入ベクターについ
て記載されてきたが、同様の調製方法を用いて、ＨＶＪ
以外のウイルスを不活性化して本発明の遺伝子導入ベク
ターを調製すること、および不活性化工程を行わずに本
発明の遺伝子導入ベクターを調製することは、本明細書
の開示から当業者に明らかである。したがって、本発明
は、添付の請求の範囲以外によっては限定されない。

【０１４０】

【発明の効果】操作が簡便で、しかも遺伝子導入効率の
優れた新しい遺伝子導入方法が提供される。これによ
り、遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングが可能
になると考えられる。本発明のウイルスエンベロープベ
クターを含む、高スループットスクリーニングのための
キットもまた提供される。また、本出願によって提供さ
れるウイルスエンベロープベクターは長期間の凍結保存
が可能であり、要事調製の必要がないため、作業工程が
大幅に簡略化できるとともに、導入ベクターの大量調製
による均質な遺伝子導入が可能となる。さらに、本発明
の遺伝子導入ベクターは、従来のＨＶＪを基に調製され
たベクターよりも、高効率の遺伝子導入を可能にし、か
つ従来の方法よりもより広範囲の生体内組織に対する遺
伝子導入を可能とする。

【０１４１】本発明の遺伝子導入ベクターを含む、医薬
品投与のためのドラッグデリバリーシステム、薬物のス
クリーニング系、および遺伝子治療用ベクターも提供さ
れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＨＶＪエンベロープベクターを様々な
回数で凍結融解し、培養細胞にトランスフェクションし
て外来遺伝子（ルシフェラーゼ遺伝子）の発現（ルシフ
ェラーゼ活性）の程度を測定した結果である。

【図２】図２は、培養細胞に添加するＨＶＪエンベロー
プベクターの調製に使用したウイルス数を同一として培
養細胞にトランスフェクションした場合のルシフェラー
ゼ活性を測定した結果である。

【図３】図３は、ＨＶＪエンベロープベクターの外来遺
伝子（ルシフェラーゼ発現ベクター）の量を様々に変え
た場合のルシフェラーゼ活性を測定した結果である。

【図４】図４は、ＨＶＪエンベロープベクター調製のた
めの緩衝液の種類を変えた場合のルシフェラーゼ活性を
測定した結果である。

【図５】図５は、従来の遺伝子導入ベクター不活性化Ｈ
ＶＪ−リポソームを用いた遺伝子導入と、この発明の方
法とを比較した結果である。

【図６】図６は、界面活性剤を用いる不活性化ＨＶＪエ
ンベロープベクターの調製方法の概略を示す図である。

【図７】図７は、界面活性剤を用いて調製したＨＶＪエ
ンベロープベクター中に含まれるタンパク質の、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥパターンを示す図である。

【図８】図８は、ＨＶＪエンベロープベクターの陰性染
色法を用いた電子顕微鏡写真である。（１）未処理のＨ
ＶＪ；（２）ＤＮＡを含まないオクチルグルコシド処理
したＨＶＪ；（３）オクチルグルコシド処理した、ＤＮ
Ａを含有するＨＶＪ。

【図９Ａ】図９Ａ〜Ｃは、図面に示した各オクチルグル
コシド濃度、オクチルグルコシドによるＨＶＪの各処理
時間、超音波処理有り（ｓｏｎｉｃ）または超音波処理
なし、および各使用したベクター容量における遺伝子導
入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。

【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｃは、図面に示した各オクチルグル
コシド濃度、オクチルグルコシドによるＨＶＪの各処理
時間、超音波処理有り（ｓｏｎｉｃ）または超音波処理
なし、および各使用したベクター容量における遺伝子導
入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。

【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｃは、図面に示した各オクチルグル
コシド濃度、オクチルグルコシドによるＨＶＪの各処理
時間、超音波処理有り（ｓｏｎｉｃ）または超音波処理
なし、および各使用したベクター容量における遺伝子導
入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラフである。

【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、図面に示した各
硫酸プロタミン（ＰＳ）の濃度および各トランスフェク
ト時間における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性
で示したグラフである。

【図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、図面に示した各
硫酸プロタミン（ＰＳ）の濃度および各トランスフェク
ト時間における遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性
で示したグラフである。

【図１１Ａ】図１１Ａおよび１１Ｂは、図面に示した各
ＤＮＡ量（実験に使用した量）、および各保存温度にお
ける遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグ
ラフである。

【図１１Ｂ】図１１Ａおよび１１Ｂは、図面に示した各
ＤＮＡ量（実験に使用した量）、および各保存温度にお
ける遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグ
ラフである。

【図１２】図１２は、図面に示した各ＨＡＵの力価のＨ
ＶＪを用いてＨＶＪエンベロープベクターを調製し、遺
伝子導入を行った場合の遺伝子導入効率を、ルシフェラ
ーゼ活性で示したグラフである。

【図１３Ａ】図１３Ａは、図面に示した各ＵＶ照射量に
おける遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示した
グラフである。

【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図面に示した各β−プロピオ
ラクトン（ＢＰＬ）濃度における遺伝子導入効率を、ル
シフェラーゼ活性で示したグラフである。

【図１４】図１４は、ヒト舌部の扁平上皮癌（ＳＡＳ）
に対する、図面に示した各硫酸プロタミン濃度および各
トランスフェクションのインキュベーション時間におけ
る遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラ
フである。

【図１５】図１５は、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）
に対する、図面に示した各硫酸プロタミン濃度および各
トランスフェクションのインキュベーション時間におけ
る遺伝子導入効率を、ルシフェラーゼ活性で示したグラ
フである。

【図１６Ａ】図１６Ａは、マウス肝臓に対する、本発明
のＨＶＪエンベロープベクターおよびＨＶＪ−ＡＶＥ
（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｖｉｒａｌ Ｅｎｖｅｌｏ
ｐ）リポソームを用いた遺伝子導入効率を、ルシフェラ
ーゼ活性で示したグラフである。

【図１６Ｂ】図１６Ｂは、マウス子宮に対する、本発明
のＨＶＪエンベロープベクターおよびＨＶＪ−ＡＶＥ
（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｖｉｒａｌ Ｅｎｖｅｌｏ
ｐ）リポソームを用いた遺伝子導入効率を、ルシフェラ
ーゼ活性で示したグラフである。

【図１６Ｃ】図１６Ｃは、マウス子宮に対する、本発明
のＨＶＪエンベロープベクターを用いたｐＥＢ−ＣＭＶ
−ＬａｃＺの遺伝子導入後に、子宮組織のＬａｃＺ染色
を行った結果である。ＬａｃＺ染色によって、主に子宮
内膜の腺上皮でのＬａｃＺ遺伝子の発現が検出された。

【図１６Ｄ】図１６Ｄは、ＳＤラット（雄性、体重３０
０〜４００ｇ）に対して、１０，０００ＨＡＵのｐＥＧ
ＦＰ−１を含むＨＶＪエンベロープベクターを、大槽経
由、頚動脈経由で投与した結果である。投与後３〜４日
目に屠殺し、生切片を作製し、蛍光顕微鏡下で観察し
た。 大槽経由での投与 脳の表面への、遺伝子導入が確認された。一方、脳深部
への遺伝子導入は、確認されなかった。脈絡叢への遺伝
子導入も確認されなかった。 、頚動脈経由での投与 投与を行った左側において、有意に高い発現が確認され
た。脳表面部分のみではなく、基底核部にも、発現が確
認された。また、対脳の脳表にも、確認された。対脳の
脳表での発現は、側副流（ｃｏｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏ
ｗ）によって、対側に流れたものと考えられた。

【図１６Ｅ】図１６Ｅは、ＨＧＦ機能を阻害する変異型
ＨＧＦを発現するベクターであるｐＣＭＶ−ＮＫ４が、
容量依存的にＶＥＧＦによって誘導された血管新生を抑
制した結果を示す図である。

【図１６Ｆ】図１６Ｆは、ＨＶＪエンベロープベクター
を気管に注入して行った遺伝子導入の結果を示す図であ
る。

【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、細胞へのオリゴヌ
クレオチド導入の翌日に、蛍光顕微鏡で細胞の蛍光を観
察した結果を示す。１０分間のインキュベーションでは
１０％程度のオリゴヌクレオチド導入効率であった（図
１７Ｂ）。一方、６０分間のインキュベーションでは８
０％以上の細胞にオリゴヌクレオチドが導入されていた
（図１７Ａ）。

【図１８Ａ】図１８は、ヒト白血病細胞株であるＣＣＲ
Ｆ−ＣＥＭ、ＮＡＬＭ−６、Ｋ−５６２を対象として導
入実験を行った結果である。これら細胞株は、ＨＶＪ−
リポソームや既存のリポソーム試薬（Ｇｉｂｃ ＢＲＬ
のＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
など）では導入効率が極めて低い細胞株（特にＣＣＲＦ
−ＣＥＭ、ＮＡＬＭ−６）である。硫酸プロタミン６０
０〜１０００μｇ／ｍｌを添加し、遠心は１００００ｒ
ｐｍまたは１５０００ｒｐｍで、１０分間、２０℃での
遠心をする条件において、高いルシフェラーゼ活性が得
られた。有意な細胞毒性は認められなかった。また、遠
心と硫酸プロタミンはどちらも導入に必要であった。

【図１８Ｂ】図１８は、ヒト白血病細胞株であるＣＣＲ
Ｆ−ＣＥＭ、ＮＡＬＭ−６、Ｋ−５６２を対象として導
入実験を行った結果である。これら細胞株は、ＨＶＪ−
リポソームや既存のリポソーム試薬（Ｇｉｂｃ ＢＲＬ
のＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
など）では導入効率が極めて低い細胞株（特にＣＣＲＦ
−ＣＥＭ、ＮＡＬＭ−６）である。硫酸プロタミン６０
０〜１０００μｇ／ｍｌを添加し、遠心は１００００ｒ
ｐｍまたは１５０００ｒｐｍで、１０分間、２０℃での
遠心をする条件において、高いルシフェラーゼ活性が得
られた。有意な細胞毒性は認められなかった。また、遠
心と硫酸プロタミンはどちらも導入に必要であった。

【図１８Ｃ】図１８は、ヒト白血病細胞株であるＣＣＲ
Ｆ−ＣＥＭ、ＮＡＬＭ−６、Ｋ−５６２を対象として導
入実験を行った結果である。これら細胞株は、ＨＶＪ−
リポソームや既存のリポソーム試薬（Ｇｉｂｃ ＢＲＬ
のＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
など）では導入効率が極めて低い細胞株（特にＣＣＲＦ
−ＣＥＭ、ＮＡＬＭ−６）である。硫酸プロタミン６０
０〜１０００μｇ／ｍｌを添加し、遠心は１００００ｒ
ｐｍまたは１５０００ｒｐｍで、１０分間、２０℃での
遠心をする条件において、高いルシフェラーゼ活性が得
られた。有意な細胞毒性は認められなかった。また、遠
心と硫酸プロタミンはどちらも導入に必要であった。

【図１９】図１９は、癌組織への遺伝子導入の結果を示
す。癌組織である腫瘍塊における遺伝子発現がみられ、
特に、硫酸プロタミン５００μｇ／ｍｌの時に高い遺伝
子導入活性が得られた。これより低い濃度の硫酸プロタ
ミンを用いた場合、遺伝子発現を検出できなかった。

【図２０】図２０は、ヘルペスウイルスエンベロープベ
クターを用いる細胞への遺伝子導入の結果を示す。総ル
シフェラーゼ活性は低いが、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で
の５分間の処理によって、最も導入効率の高いベクター
が作製できたと判断された。また硫酸プロタミンを用い
ない調製方法が、導入効率が高かった。各サンプルとも
形態学的な観察によって細胞毒性は認められなかった。

【図２１】図２１は、−８０℃での保存後のヘルペスウ
イルスエンベロープベクターを用いる細胞への遺伝子導
入の結果を示す。血清１０％を加えた培地を用いた場
合、無血清培地よりも導入効率が高く、ベクター溶液２
００μ１（推定量：２．８×１０⁷ウイルス粒子／ウェ
ル）が１００μ１溶液（推定量：１．４×１０⁷ウイル
ス粒子／ウェル）より活性が高かった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルスエンベロープを含む、遺伝子導
   入ベクター。
2. 【請求項２】 前記ウイルスが、野生型ウイルスまたは
   組換え型ウイルス由来である、請求項１に記載の遺伝子
   導入ベクター。
3. 【請求項３】 前記ウイルスが、レトロウイルス科、ト
   ガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、
   パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニ
   ヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス
   科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科、および
   ヘパドナウイルス科からなる群から選択される科に属す
   るウイルス由来である、請求項１または２に記載の遺伝
   子導入ベクター。
4. 【請求項４】 前記ウイルスがＨＶＪである、請求項３
   に記載の遺伝子導入ベクター。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のベ
   クターであって、；該ウイルスを外来遺伝子と混合する
   工程、および該混合液を２回以上凍結融解する工程、を
   包含する方法によって調製される、遺伝子導入ベクタ
   ー。
6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のベ
   クターであって、該ウイルスを界面活性剤の存在下で外
   来遺伝子と混合する工程を包含する方法によって調製さ
   れる、遺伝子導入ベクター。
7. 【請求項７】 前記方法が、ウイルスを不活性化する工
   程をさらに包含する、請求項５または６に記載の遺伝子
   導入ベクター。
8. 【請求項８】 前記界面活性剤が、オクチルグルコシ
   ド、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＣＨＡＰＳおよびＮＰ−
   ４０からなる群から選択される、請求項７に記載の遺伝
   子導入ベクター。
9. 【請求項９】 前記界面活性剤が、オクチルグルコシド
   である、請求項８に記載の遺伝子導入ベクター。
10. 【請求項１０】 硫酸プロタミンを前記外来遺伝子に添
    加する工程をさらに包含する、請求項１〜９のいずれか
    １項に記載の遺伝子導入ベクター。
11. 【請求項１１】 動物生体内の組織に遺伝子導入するた
    めの、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の遺伝子導
    入ベクター。
12. 【請求項１２】 前記組織が、肝臓、骨格筋、子宮、
    脳、眼部、頚動脈、皮膚、血管、肺、心臓、腎臓、脾
    臓、癌組織、神経、Ｂリンパ球、および呼吸器官の組織
    からなる群から選択される、請求項１１に記載の遺伝子
    導入ベクター。
13. 【請求項１３】 遺伝子治療のための、請求項１〜１２
    に記載の遺伝子導入ベクターを含有する薬学的組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１〜１２に記載の遺伝子導入ベ
    クターを含有する、遺伝子ライブラリーのスクリーニン
    グのためのキット。
15. 【請求項１５】 遺伝子導入のためのウイルスエンベロ
    ープを含む遺伝子導入ベクターの調製方法であって、以
    下；該ウイルスを外来遺伝子と混合する工程、および該
    混合液を２回以上凍結融解する工程、を包含する、方
    法。
16. 【請求項１６】 遺伝子導入のためのウイルスエンベロ
    ープを含む遺伝子導入ベクターの調製方法であって、該
    ウイルスを界面活性剤の存在下で外来遺伝子と混合する
    工程、を包含する、方法。
17. 【請求項１７】 ウイルスを不活性化する工程をさらに
    包含する、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 単離された動物組織に遺伝子を導入す
    る方法であって、以下；所望の外来遺伝子を含有する請
    求項１〜１２のいずれか１項に記載の遺伝子導入ベクタ
    ーを調製する工程、 該遺伝子導入ベクターによって、該単離された動物組織
    に遺伝子を導入する工程、を包含する、方法。
19. 【請求項１９】 浮遊細胞に外来遺伝子を導入する方法
    であって、以下：該浮遊細胞と請求項１〜１２のいずれ
    か１項に記載の遺伝子導入ベクターとを、硫酸プロタミ
    ン存在下で混合する工程、 該混合液を遠心する工程を包含する、方法。