ES2224422T3 - Recuperacion de un virus procedente de un cultivo celular utilizando una disolucion salina hipertonica. - Google Patents
Recuperacion de un virus procedente de un cultivo celular utilizando una disolucion salina hipertonica.Info
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Abstract
Un procedimiento para captar un herpesvirus de un cultivo celular infectado por el mismo, comprende tratar dicho cultivo con una disolución salina acuosa hipertónica para obtener una suspensión viral, por ejemplo, para dar un mejor rendimiento de virus para una vacuna de virus vivientes. También puede utilizarse la ruptura de células para captar el virus mediante ruptura de las células infectadas por el virus. A la etapa de captura puede seguir, por ejemplo, un tratamiento con nucleasas, diafiltración y liofilización.
Description
Recuperación de un virus procedente de un cultivo
celular utilizando una disolución salina hipertónica.
Esta invención hace referencia a la producción de
virus y a la recolección de preparaciones víricas procedentes de los
cultivos de células infectadas con dichos virus, por ejemplo con
propósitos experimentales y terapéuticos, p.ej., para la producción
de vacunas víricas. En algunos aspectos, la invención hace
referencia a los procedimientos y a los preparativos para la
producción de virus herpes. Otros aspectos de la invención serán
evidentes a partir de la descripción siguiente.
Se conocen diversos procedimientos para la
producción de preparaciones de virus vivos, p.ej., preparaciones de
herpes virus, para vacunas y otros propósitos.
Por ejemplo, la patente americana U.S. 3.985.615
(Osaka Res Foundation: T. Kubo y col.) describe la producción
del virus de la varicela atenuado para su utilización como vacunas
mediante su cultivo e incluyendo el pasaje por células de tejido
embrional primario de cobaya; la patente americana U.S. 5.024.836
(Merck; WJ McAleer y col.,) hace referencia a la producción de
preparaciones de vacunas liofilizadas basadas en lo anterior.
La patente DD-209738 (Cent Cerc
Bioprep: IV Patrascu) describe la producción de otro tipo de virus
herpes, para su utilización como vacunas contra la enfermedad de
Marek, la cual se produce mediante (a) cultivo de células
embrionales de pollo y exentas de patógenos específicos sobre
microsferas de dextrano; (b) inoculación del cultivo a una
confluencia del 80% con la cepa FC -126 (clon 1.IIIb) del virus
herpes de pavo; (c) recolección de las células infectadas en medio
SPGA (sacarosa, fosfato, glutamato, fracción V de la albúmina
bovina) cuando el efecto citopático es del 80%; (d) someter la
suspensión a tres pulsos ultrasónicos de 1 minuto durante intervalos
de 2 minutos y centrifugación para recuperar una primera cosecha de
la vacuna: (e) resuspensión del sedimento en medio SPGA y repetición
de la etapa (d) para obtener una segunda cosecha de la vacuna (para
incrementar el rendimiento de la vacuna aproximadamente en un 20%);
(f) congelación de las vacunas combinadas a -100ºC antes de
determinar el título vírico; y (g) dilución en medio SPGA y
criodesecación.
La patente japonesa JP 06234659-A
(ZH Handai Biseibutsubyo Kenkyukai) describe en un ejemplo la
producción de la vacuna del virus herpes en fibroblastos diploides
humanos MRC-5 cultivados en medio MEM a 37ºC. Dicho
procedimiento comprende la inoculación de la cepa Oka del virus de
la varicela a una MOI de 0,03 en células MRC-5 y su
cultivo a 37ºC durante 2 días. El virus se resuspende a continuación
en una solución que contiene 6,4 g de NaCl, 0,16 g de KCl, 2,3 g de
Na_{2}HPO_{4}.12H_{2}O, 0,16 g de KH_{2}PO_{4}, 50,0 g de
sacarosa, 1,0 g de L-glutamato-Na,
2,0 g de gelatina, 25,0 g de hidrolizado de gelatina y 0,1 g de
EDA-3Na por litro.
La patente europea EP 0573107, las patentes
americanas US 5.360.736 y 5.607.852 (Merck; PA Fridman y col.)
describen los procesos de producción de una vacuna del virus zoster
de la varicela atenuado, incluyendo un procedimiento para la
preparación de una vacuna de virus zoster de la varicela sin
células, vivo y atenuado (VZV) que comprende: (a) cultivar las
células susceptibles de infección por VZV y seleccionadas a partir
de células diploides humanas hasta su confluencia en un cultivo de
monocapa, en condiciones de una nutrición lo suficientemente elevada
para lograr un elevado grado de división celular y suplementando con
disacáridos no-metabolizables; (b) infectar las
células cultivadas de acuerdo con la etapa (a) hasta casi
confluencia con la máxima multiplicidad de infección de células
infectadas con VZV posible; (c) mantener el cultivo infectado con
VZV en condiciones de elevada nutrición durante aproximadamente
22-96 horas y cosechar en el momento de mayor pico
de producción de VZV infecciosos; (d) lavar el cultivo infectado con
VZV con una solución fisiológica que contiene opcionalmente un
agente lisosomotrópico, como el cloruro de amonio o la cloroquina,
antes de recoger las células infectadas con VZV; (e) recolectar las
células infectadas con VZV en un volumen mínimo de una solución
estabilizante y romper inmediatamente las células o congelarlas para
su rotura posterior; (f) rotura de las células infectadas con VZV
para lograr una liberación óptima de VZV asociado a las células y
eliminación de los restos celulares, para obtener una preparación
VZV exenta de células. El proceso describe la utilización de
densidades celulares de hasta 500.000 células/cm^{2} en
recipientes de cultivo convencionales. El proceso es propuesto para
la producción masiva de vacunas vivas. El medio nutritivo adecuado
para el crecimiento de las células en cultivos monocapas consistió
en medio SFRE-2 suplementado con 0,2
mg/ml-0,4 mg/ml de lípido de semillas de soja y las
células se seleccionaron a partir de células MRC-5,
células WI-38 y células Vero.
La patente internacional WO 92/05263 (Immunology
Ltd., SC Inglis y col.) y la patente internacional WO 94/21807
(Cantab Pharmaceuticals Research: Inglis y col.) son ilustrativas de
la utilización de células recombinantes y los procedimientos de
cultivo para la producción de virus herpes inactivados genéticamente
con el propósito de utilizarlos como vacunas.
Todavía es necesario proporcionar procedimientos
para el tratamiento de preparaciones que contienen virus, capaces de
contribuir a la fabricación de preparaciones víricas con un buen
rendimiento y pureza.
De acuerdo con uno de los aspectos de la presente
invención, un cultivo de células infectadas con virus herpes puede
tratarse para producir una suspensión vírica tras incubación de las
células recolectadas con una solución salina acuosa hipertónica. A
continuación, la solución salina se pondrá en contacto con el
cultivo celular para producir un líquido que contendrá los virus
útiles, junto con un número mucho más reducido de células o restos
celulares en comparación con (por ejemplo) el producto de rotura por
ultrasonidos. Este procedimiento puede aplicarse, por ejemplo, para
proporcionar un rendimiento mejorado del virus en la fabricación de
la vacuna de virus vivos en el caso en que se utilice una etapa de
rotura celular para la cosecha de virus, mediante rotura de las
células infectadas con el virus de un cultivo de células productoras
de virus.
Para este propósito son adecuadas y aceptables
muchas sales, por ejemplo, el cloruro sódico, el sulfato sódico, el
cloruro potásico y otros. Preferentemente, la solución salina puede
contener cloruro sódico a una concentración de por ejemplo 0,8 a 0,9
M o superior. Si se utiliza sulfato sódico, la concentración puede
ser de aproximadamente 0,4 M o superior. También pueden utilizarse
otras sales, si se desea a una osmolaridad o fuerza iónica similar a
las concentraciones indicadas anteriormente. El virus puede a menudo
resistir concentraciones salinas de 1M o 2M, aunque es preferible no
superar las concentraciones indicadas para evitar una incorporación
excesiva de proteína en el líquido salino. De acuerdo con las la
práctica normal de manipulación de dichos virus, se elegirán los
tampones y otros constituyentes que puedan ser necesarios.
La incubación de la cosecha se puede llevar a
cabo con agitación ligera, y preferentemente sin o con rotura
celular. El cultivo celular a tratar en la incubación de la cosecha
puede ser, por ejemplo, un cultivo en monocapa o un cultivo en
microtransportadores o un cultivo de un frasco rotativo de
cultivo.
La solución salina de la cosecha puede tamponarse
y mantenerse a un pH y temperatura adecuados para el cultivo de
células infectadas con el virus, p.ej., aproximadamente a pH 7 y a
34ºC para el virus herpes simplex.
El tiempo de contacto entre las células
cultivadas y el líquido de la cosecha no es especialmente crítico y
puede por ejemplo hallarse en un intervalo de aproximadamente
2-24 horas. En algunos ejemplos se demostró que es
preferible un tiempo de contacto de aproximadamente 4 horas porque
puede ofrecer un buen rendimiento con niveles aceptablemente bajos
de proteína celular.
Después de contactar las células infectadas
cultivadas con el líquido de cosecha, se puede separar el líquido
que contiene las partículas de virus cosechadas mediante decantación
o cualquier otro procedimiento adecuado; las células cultivadas
pueden permanecer unidas a la superficie sobre la cual se cultivaron
y a continuación ser descartadas tras la separación del líquido de
cosecha.
El líquido de cosecha puede, si se desea,
tratarse mediante filtración y/o centrifugación para eliminar las
células residuales.
Preferentemente, la preparación cosechada puede
diluirse o diafiltrarse con una solución aproximadamente isotónica,
por ejemplo cloruro sódico 138 mM.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, la
preparación de virus cosechada de dicha manera puede tratarse con la
enzima nucleasa para reducir cualquier contenido de ácido nucleico
contaminante hasta unos niveles aceptables.
El líquido diluido puede por ejemplo, tratarse
con la enzima nucleasa Benzonasa™, para degradar ácidos nucleicos
libres (principalmente DNA y también RNA) a aproximadamente 50
unidades/ml en presencia de ión magnesio 2-10 mM,
durante 1 hora a 4ºC-temperatura ambiente.
El nivel de la enzima nucleasa y de la proteína
puede reducirse por ejemplo mediante diafiltración contra un tampón
de formulación adecuada, a través de una membrana con un límite de
exclusión de retención de virus de por ejemplo 500 KD.
Después de estos tratamientos, el virus cosechado
se transfiere a un líquido de transporte adecuado y se congela,
liofiliza o se estabiliza según uno de los muchos procedimientos
adecuados.
Los procedimientos de acuerdo con los ejemplos de
la invención pueden ofrecer una ventaja particular en relación con
los virus altamente asociados con las células, es decir, aquellos
virus que tienen un nivel elevado de asociación celular en cultivo,
por ejemplo, el virus herpes simplex de tipo 2
(HSV-2), el virus de la seudorabia (PRV), el virus
herpes del pavo y el virus zoster de la varicela (VZV). Con algunos
virus herpes y condiciones de cultivo (p.ej., con el virus herpes
simplex de tipo 1 (HSV-1)), puede obtenerse una
liberación espontánea importante del virus de las células infectadas
en el líquido de cultivo, por lo que algunas veces la aplicación de
un proceso de acuerdo con un ejemplo de la presente invención puede
ser innecesaria y en consecuencia dichos ejemplos de la invención
son menos preferidos.
La invención puede aplicarse con cualquier
adaptación que se considere adecuada por los expertos en la materia,
para los diversos tipos de virus herpes, incluyendo por ejemplo el
virus herpes simplex de tipo salvaje y los virus herpes
genéticamente inactivados como el virus herpes simplex, y por
ejemplo otros virus herpes tal como se menciona en los documentos
aquí citados.
Las preparaciones de virus obtenidas mediante la
utilización de las etapas de procesamiento, tal como se describen
aquí, pueden procesarse además y formar parte de las composiciones
farmacéuticas, p.ej., con ingredientes convencionales
per-se de las vacunas víricas.
La invención se describe e ilustra además con el
siguiente ejemplo no limitante.
Proceso de acuerdo con un ejemplo de la
invención, para la cosecha y purificación de partículas víricas, que
utiliza un cultivo de células Vero infectadas con
HSV-2, crecidas esencialmente de manera convencional
en medio de cultivo en frascos rotativos a aproximadamente 100 ml de
medio por frasco. El medio de cultivo, el tipo celular y las
condiciones de cultivo pueden ser por ejemplo las siguientes:
El pasaje de las células Vero a los frascos
rotativos de cultivo se puede realizar a 2x10^{7} células por
frasco de cultivo. El cultivo se puede llevar a cabo utilizando
medio DMEM con 4,5 g/l de glucosa sin piruvato sódico y con
Glutamax-1™
(L-alanil-L-glutamina),
862 mg/l. La incubación puede llevarse a cabo por ejemplo a
aproximadamente 37ºC y durante unas 120 horas (5 días). Los cultivos
de células confluentes se infectan con el HSV-2 a
una multiplicidad de infección de aproximadamente de 0,01 diluyendo
el virus en DMEM, de modo que al final se añade 1 ml de dicha
dilución por cada cultivo en frascos rotativos, devolviéndolo a
continuación al aparato de rotación a 34-37ºC.
Cuando se observa el efecto citopático en un
80-100%, p.ej. al cabo de 65-72
horas después de la infección, ya se pueden tratar los frascos
rotativos para cosechar el virus.
El medio de cultivo puede decantarse de cada
frasco y reemplazarse con 10 ml por botella de una solución de
cloruro sódico tamponada (aproximadamente 0,8-0,9 M)
que contiene citrato sódico 0,01 M a pH 7,0. Las células en el
frasco rotativo en contacto con la solución de cloruro sódico
tamponada puede rotarse e incubarse a 34ºC durante aproximadamente 4
horas.
Las células cultivadas en el frasco rotativo
pueden permanecer largo tiempo unidas a la superficie del frasco de
cultivo y se pueden descartar después de la separación del líquido
que contiene las partículas víricas.
El líquido en la botella, que comprende la
solución salina tamponada y el material del cultivo celular en
suspensión, incluyendo los virus, puede eliminarse mediante pipeteo
y centrifugarse a continuación a aproximadamente 3000 rpm en una
centrífuga Sorvall RT6000™ durante aproximadamente 10 minutos
(p.ej., RCFmax 1876). Las células en el sedimento, y las restantes
en el frasco de cultivo, se descartan (en condiciones adecuadas para
la contención de virus) y el sobrenadante se recoge a la pipeta para
la siguiente etapa, que puede ser una centrifugación continua. La
pre-filtración puede llevarse a cabo con un filtro
de 0,8 micras. El líquido del sobrenadante de la centrifugación
puede diluirse o diafiltrarse a una concentración final (respecto a
la del ión sodio) de 138 mM.
El líquido diluido puede tratarse a continuación
con la enzima nucleasa Benzonasa^{TM}, para degradar los ácidos
nucleicos libres (principalmente la enzima utilizada tiene actividad
DNasa y generalmente también RNasa) a aproximadamente 50 unidades/ml
en presencia de iones magnesio 2-10 mM, p.ej.,
durante 1 hora a una temperatura de 4ºC a temperatura ambiente.
El líquido de reacción puede someterse a la
filtración de paso de flujo tangencial (diafiltración utilizando una
membrana cuyo filtro tenga un límite de exclusión de 500 KD en un
dispositivo Filtron^{TM} u otro dispositivo de paso de flujo
tangencial, utilizando una velocidad de recirculación de 1000
ml/min, una velocidad de filtrado de 100 ml/min y un fluido inverso
de 100 ml de citrato sódico 0,01 M a pH 7,25 con cloruro sódico 138
mM.
El concentrado de la etapa de ultrafiltración de
flujo cruzado se trata mediante diafiltración contra
5-10 volúmenes de tampón
citrato-salino para reducir la cantidad de enzima
nucleasa y el concentrado se somete finalmente a filtración con un
filtro de 0,2 micras (esterilizante). Opcionalmente, se realiza
previamente una filtración con un filtro de aproximadamente 0,45
micras a 5 micras, utilizando de nuevo el mismo tampón. Todo ello,
después de obtener la preparación de los virus a una concentración
de 20 mg/ml con una proteína estabilizante adecuada, preferentemente
la albúmina sérica a aproximadamente 20 mg/ml. Puede ser útil
efectuar un prelavado de los filtros con un líquido que contenga la
misma proteína estabilizante en el mismo tampón, antes de utilizar
los filtros para tratar la preparación de los virus.
El producto resultante puede obtenerse como una
suspensión de las partículas víricas en tampón salino y proteína
estabilizante, en la que el nivel de DNA residual sea
suficientemente bajo.
El rendimiento de dicho procedimiento parece ser
de una gran utilidad en comparación con un procedimiento que
implicaba la rotura celular mediante ultrasonidos para liberar las
partículas víricas, seguido de la separación de partículas víricas
de los restos celulares.
La invención puede ser de gran utilidad, por
ejemplo, en una realización preferida llevada a cabo de acuerdo con
el ejemplo descrito anteriormente, para el cultivo y cosecha de
virus HSV-2 genéticamente inactivados para utilizar
como vacunas. Dicho virus tiene una deleción respecto del gen gH que
es esencial para la producción de partículas víricas nuevas e
infecciosas, y es cultivable en un línea celular derivada de células
Vero, producida de forma recombinante, capaz de expresar el gen gH
viral que está ausente en el genoma viral, p.ej., tal como se
describe en las especificaciones de la patente internacional
WO92/05263 y la patente internacional 94/21807 (véase también A.
Forrester y col., J Viral 66 (1992) 341-348, HE
Farrell y col., J virol 68 (2994) 927-932) y C.
McLean y col., J Infect Dis 170 (1994)
1100-1109).
Según sea conveniente, también puede ser
preferible cultivar las células y los virus en diversas formas de
micro-transportadores conocidos en la materia, en
lugar de en frascos de cultivo rotativos.
Claims (9)
1. Procedimiento de cosecha de un virus herpes a
partir de un cultivo celular infectado con dicho virus, el cual
comprende el tratamiento de dicho cultivo con una solución salina
acuosa hipertónica para obtener una suspensión viral.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde la suspensión vírica se trata, además, para su
formulación como una preparación farmacéutica adecuada para su
utilización como una vacuna vírica.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en donde la sal comprende cloruro sódico a una concentración
de aproximadamente 0,8 M o superior.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, 2 ó 3, en donde la solución salina de la cosecha está tamponada a
un pH de aproximadamente 7 y temperatura de cosecha del virus herpes
simplex es de aproximadamente 34ºC.
5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde la preparación obtenida se diluye o
diafiltra a una concentración aproximadamente isotónica.
6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde la preparación de virus cosechados
se trata con una enzima nucleasa.
7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
6, en donde la preparación después del tratamiento con nucleasa se
diafiltra contra un tampón de formulación, a través de una membrana
con un determinado límite de exclusión de retención de virus.
8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en donde el virus cosechado después de
ser transferido a un líquido transportador adecuado, se congela,
liofiliza o se estabiliza.
9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en donde el virus comprende el virus herpes simplex de tipo 2
(HSV2), el virus de la seudorabia (PRV), el virus herpes del pavo o
el virus zoster de la varicela (VZV).
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